CN113082222A - 一种靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物及其制备方法与应用。它是将疏水性抗癌药物‑氯尼达明（LND）和亲水性‑轮环藤宁(Cyclen)，通过共价修饰连接到自组装短肽序列上制得的多肽衍生物LND‑GFFYK‑cyclen。该产物能够通过分子间非共价相互作用自组装形成肽基纳米药物，并用于肿瘤特异性及协同性放化疗治疗，其特点是：合成简单，可重复性高，生物相容性好，临床转化潜力大。同时，与游离LND相比，本发明得到自组装肽基纳米药物能够通过靶向线粒体，显著提高LND对肿瘤细胞的选择性杀伤作用及放化疗协同治疗的效果，具有良好的临床转化和应用前景。

Description

一种靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于纳米生物医药材料领域，涉及一种靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物的制备方法及其在增强氯尼达明体内外抗癌活性中的应用。
背景技术
目前，放化疗联合治疗仍然是临床治疗大多数癌症的常用方法。相比于单一的化疗或放疗，放化疗联合治疗能够在一定程度上提高治疗疗效，避免肿瘤耐药及转移。但是，受限于小分子化疗药物或放疗增敏剂缺少对肿瘤细胞的选择性，放化疗治疗仍然无法避免对正常组织及细胞带来的严重的毒副作用。因此，如何最大化提高放化疗抗肿瘤疗效并同时降低其毒副作用，是临床放化疗治疗面临的主要难题之一。
线粒体是癌细胞内的重要细胞器，在肿瘤生长、繁殖及凋亡方面发挥着不可或缺的作用。线粒体膜电位去极化将会导致细胞色素C及Smac蛋白的释放，从而激活Caspase-9、Caspase-3等凋亡蛋白的表达，并启动线粒体凋亡途径最终诱导癌细胞凋亡。另外，线粒体功能紊乱引起的氧化应激升高也与放射敏感性密切相关。因此，设计新型的线粒体靶向纳米药物，对于最大化提高放化疗的特异性及协同性显得十分必要。然而，由于线粒体致密的双层脂质膜结构以及其较高的负电位，一般的小分子药物很难靶向作用于线粒体。基于多肽自组装形成的肽基纳米载体，由于具有容易设计合成、生物相容性好、易降解等优势在抗癌药物递送方面展现出了较好的应用前景。假设将疏水性自组装短肽链与带正电荷的轮环藤宁共价结合，得到的肽基纳米载体将同时具有亲脂性和阳离子两大属性，从而有望作为一种新型的纳米载体体系用于抗癌药物的线粒体靶向性递送。
氯尼达明（LND），作为一种糖酵解抑制剂，其能通过选择性抑制癌细胞能量代谢发挥抗癌疗效。目前，LND已经被用于临床前多种癌症的治疗研究，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌以及脑瘤等。但是，由于它的小分子属性，LND到达肿瘤部位的量很少，表现出较低的生物利用度和较强的肝脏毒性，从而限制了其在临床的推广与应用。因此，通过合理的设计使LND形成能够靶向到线粒体的肽基纳米药物，有望显著提高其肿瘤选择性及抗癌疗效，对于加快推进其临床癌症治疗应用具有重要的意义。
发明内容
本发明旨在开发一种靶向肿瘤细胞线粒体的自组装肽基纳米药物，并将其应用于特异性及协同性放化疗治疗以提高氯尼达明的抗肿瘤效果。
本发明的自组装肽基纳米药物将具备以下一些优势：1）肽基纳米载体基本由氨基酸构成，具有良好的生物相容性和生物可降解性；2）提高疏水性药物氯尼达明的溶解性和生物利用度；3）能够通过靶向线粒体在肿瘤细胞内更多富集滞留，增强氯尼达明对肿瘤细胞的选择性作用；4）兼具化疗和放疗增敏的作用，实现放化疗协同治疗。
为实现上述目的，本发明公开了如下技术内容：
一种靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物，其特征在于它是将氯尼达明和轮环藤宁分别共价结合在疏水性短肽的两端，得到的多肽衍生物能够在水溶液中通过分子间非共价键相互作用自组装形成微观形貌为纳米纤维的纳米药物，其化学结构如下：
Figure 252397DEST_PATH_IMAGE001
其中，LND为氯尼达明，cyclen为轮环藤宁，GFFYK为甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸残基构成的短肽链。其中，多肽衍生物LND-GFFYK-cyclen的制备方法，其特征在于步骤如下：首先通过Fmoc固相合成法合成LND-GFFYK, 称取0.1-0.3 mmol粗品溶解在1-3 mL DMSO中，加入0.15-0.45 mmol的轮环藤宁活化酯，用DIEA调节反应液pH至8~9。室温反应6-12h后，加入95%的三氟乙酸反应0.5-2 h脱去轮环藤宁上的保护基基团。通过反相HPLC分离纯化得到目的产物。其中，所述的轮环藤宁活化酯制备方法如下：
1）将轮环藤宁(6 g, 34.8 mmol)和DIEA (24 mL, 104.5 mmol)溶于40 mL DCM中，室温滴加二碳酸二叔丁酯（24 mL, 104.5 mmol），滴加完毕室温搅拌5-8小时。将反应液浓缩得粗品。粗品硅胶柱层析得无色油状物（中间产物1）；
2）将中间产物1（14.1 g, 29.8 mmol）、溴乙酸甲酯（2.9 mL, 29.8 mmol）、碳酸钾（8.3 g, 59.7 mmol）溶于50 mL DMF中，升至70-80℃搅拌过夜。减压蒸去溶剂得粗品。粗品硅胶柱层析得无色油状化合物（中间产物2）；
3）将中间产物2（14.2 g, 26.1 mmol）溶于30 mL THF中，加入30 mL 2N氢氧化 钠溶液，升至60-80℃搅拌过夜。减压蒸去THF后，用1N盐酸将反应液调pH至5~6左右。乙酸乙酯萃取3-5次后合并有机相。将有机相用饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥后减压浓缩得粗品。将粗品溶于50 mL DMF中，加入HBTU（7.7 g, 20.2 mmol）和NHS（2.3 g, 20.2 mmol），室温搅拌过夜。减压蒸去DMF后，将粗品溶于乙酸乙酯中，用饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥后减压浓缩得目的产物。
Figure 58679DEST_PATH_IMAGE002
本发明更进一步公开了所述靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物在提高肿瘤治疗疗效中的应用。其中提高肿瘤治疗疗效指的是提高游离LND对肿瘤的特异性及协同性放化疗治疗。
本发明同时也公开了所述靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物在提高对乳腺癌放化疗协同治疗效果发明的应用。实验结果显示，与单独肽基纳米药物介导的化疗或γ射线介导的放疗相比，肽基纳米药物与放疗联合应用具有更显著的肿瘤抑制效果。肿瘤抑制率提高至80%左右，表现出了高效的放化疗协同治疗效果。
本发明更加详细的描述如下：
通过将氯尼达明和轮环滕宁共价结合在疏水性肽链的两端，得到的多肽衍生物LND-GFFYK-cyclen能够在纯水中能够通过加热-冷却的方法自组装形成微观结构为纳米纤维的肽基纳米药物。该纳米药物能够借助疏水性肽基载体的亲脂性以及轮环藤宁的正电荷特性，有效靶向到肿瘤细胞线粒体并破坏线粒体的超微结构，从而与放疗有效协同实现对肿瘤的高效杀伤。因此，发明的肽基纳米药物能够有效提高LND的生物利用度，以达到增强抗癌活性的效果。
所述的LND-GFFYK-cyclen肽基纳米药物，制备方法：将1mg LND-GFFYK-cyclen 溶于0.5 mL 纯水中，用碳酸钠水溶液调节pH至中性，并通过酒精灯加热使之完全溶解。待室温自然冷却后，即可形成肽基纳米药物。进一步的，所述的LND-GFFYK-cyclen衍生物合成步骤如下：首先通过Fmoc固相合成法合成LND-GFFYK，称取0.1mmol粗品溶解在1ml DMSO中，加入轮环藤宁活化酯（0.1 mmol），用DIEA调节反应液pH至8~9。室温过夜反应后，用95%的三氟乙酸脱去轮环藤宁的保护基基团。通过反相HPLC分离纯化得到目的产物LND-GFFYK-cyclen。
进一步的，所述的轮环藤宁活化酯的合成步骤如下：
1)将轮环藤宁(6 g, 34.8 mmol)和DIEA (24 mL, 104.5 mmol)溶于40 mL DCM中，室温滴加二碳酸二叔丁酯（24 mL, 104.5 mmol），滴加完毕室温搅拌5-8小时。将反应液浓缩得粗品。粗品硅胶柱层析得无色油状物（中间产物1）；
2）将中间产物1（14.1 g, 29.8 mmol）、溴乙酸甲酯（2.9 mL, 29.8 mmol）、碳酸钾（8.3 g, 59.7 mmol）溶于50 mL DMF中，升至70-80℃搅拌过夜。减压蒸去溶剂得粗品。粗品硅胶柱层析得无色油状化合物（中间产物2）；
3）将中间产物2（14.2 g, 26.1 mmol）溶于30 mL THF中，加入30 mL 2N氢氧化 钠溶液，升至60-80℃搅拌过夜。减压蒸去THF后，用1N盐酸将反应液调pH至5~6左右。乙酸乙酯萃取3-5次后合并有机相。将有机相用饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥后减压浓缩得粗品。将粗品溶于50 mL DMF中，加入HBTU（7.7 g, 20.2 mmol）和NHS（2.3 g, 20.2 mmol），室温搅拌过夜。减压蒸去DMF后，将粗品溶于乙酸乙酯中，用饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥后减压浓缩得目的产物。
本发明主要解决了小分子抗癌药物氯尼达明因溶解性差、生物利用度低导致抗癌效果不显著的问题，重点考察了氯尼达明与疏水性短肽及轮环藤宁共价结合后，所得到的纳米药物对线粒体的靶向性能及其在肿瘤特异性及协同性放化疗治疗方面的应用。主要的难点在于，含氯尼达明的多肽衍生物结构的合理设计，使其自组装形成能够靶向线粒体的纳米药物，从而增加氯尼达明的生物利用度和抗癌疗效。
本发明公开的靶向肿瘤细胞线粒体的多肽纳米药物及其制备方法与应用所具有的积极效果在于：能够极大的提高小分子抗癌药物氯尼达明的溶解性和生物利用度，增强其化疗和放疗增敏疗效，为设计线粒体靶向性纳米药物及癌症特异性治疗提供新的方法。
本发明公开LND-GFFYK-cyclen纳米药物以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组成的药物组合物。该药物组合物可以制成固体口服制剂、液体口服制剂、注射剂等剂型。
本发明的LND-GFFYK-cyclen纳米药物还可以通过非肠道形式给药。优选的非肠道给药形式为注射剂给药。所述固体及液体口服制剂包括：片剂、肠溶片、胶囊、糖浆剂、口服溶液剂、注射剂等等。
本发明的LND-GFFYK-cyclen纳米药物组合物制备如下：使用标准和常规的技术，使本发明化合物与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。
本发明制备的靶向肿瘤细胞线粒体的多肽纳米药物具备以下势：
1）原料易得，成本低、产率高并且重复性好，能够为以后的实际应用提供方便；
2）制备方法简单，具有相对稳定的纳米纤维形貌；
3）在体内具有良好的生物相容性，容易临床转化；
4）与游离LND 相比，LND-GFFYK-cyclen纳米药物展现出更优异的抗癌疗效。
附图说明
图1为制备的两种肽基纳米纤维的表征: A. LND-GFFYK-cyclen (缩写为 LND-Pep-cyclen) 形成的水凝胶照片；B. NBD-GFFYK-cyclen (缩写为 NBD-Pep-cyclen)形成的水凝胶照片；C. LND-Pep-cyclen水凝胶微观形貌，D. LND-Pep-cyclen水凝胶微观形貌，E. 圆二色谱结果；F. Zeta电位结果；以及G. NBD-Pep-cyclen纳米纤维靶向肿瘤细胞MCF-7线粒体的共聚焦照片；
图2 为肽基纳米药物与游离药物分子体外对乳腺癌细胞（MCF-7和4T1）及正常细胞（L929和3T3）的生长抑制效果：A. 不同剂型及浓度的药物分子对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制效果；B. 不同剂型及浓度的药物分子对小鼠乳腺癌细胞4T1的生长抑制效果；C.不同剂型及浓度的药物分子对小鼠成纤维细胞L929的生长抑制效果；D. 不同剂型及浓度的药物分子对小鼠成纤维细胞3T3的生长抑制效果；
图3 为肽基纳米药物与游离药物分子体外诱导乳腺癌细胞（MCF-7）及正常细胞（L929）产生ROS的效果；
图4 为肽基纳米药物与游离药物分子体外放疗增敏效果：A. 不同剂量射线照射后的克隆形成实验结果；B. 不同剂量射线照射后的细胞存活曲线；
图5 为肽基纳米药物与游离药物分子与放联合在裸鼠体内抑制MCF-7乳腺癌生长的效果：A.肿瘤体积生长曲线；B. 小鼠体重变化曲线；C.不同药物处理后肿瘤光学照片；D.各组肿瘤的重量结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施例应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施例中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所用原料氯尼达明、轮环藤宁、Fmoc氨基酸、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、N,N-二异丙基乙胺（DIEA）、三氟乙酸、三异丙基硅烷均有市售。
实施例1
靶向肿瘤细胞线粒体的多肽纳米纤维LND-GFFYK-cyclen和NBD-GFFYK-cyclen的制备，后者即用荧光分子NBD取代LND，以期借助NBD的荧光证明自组装短肽对线粒体的靶向性，以LND-GFFYK-cyclen纳米纤维为例，具体制备步骤如下：
（一）通过Fmoc固相合成法合成LND-GFFYK, 称取0.1mmol粗品溶解在1ml DMSO中，加入液相合成得到的轮环藤宁活化酯（0.1 mmol），用DIEA调节反应液PH至8~9。室温过夜反应后，用95%的三氟乙酸脱去轮环藤宁的保护基基团。通过反相HPLC分离纯化得到目的产物LND-GFFYK-cyclen。其中轮环滕宁活化酯的合成步骤如下：
（1）将轮环藤宁(6 g, 34.8 mmol)和DIEA (24 mL, 104.5 mmol)溶于40 mL DCM中，室温滴加二碳酸二叔丁酯（24 mL, 104.5 mmol），滴加完毕室温搅拌5-8小时。将反应液浓缩得粗品。粗品硅胶柱层析得无色油状物（中间产物1）
（2）将中间产物1（14.1 g, 29.8 mmol）、溴乙酸甲酯（2.9 mL, 29.8 mmol）、碳酸钾（8.3 g, 59.7 mmol）溶于50 mL DMF中，升至70-80℃搅拌过夜。减压蒸去溶剂得粗品。粗品硅胶柱层析得无色油状化合物（中间产物2）；
（3）将中间产物2（14.2 g, 26.1 mmol）溶于30 mL THF中，加入30 mL 2N氢氧化钠溶液，升至60-80℃搅拌过夜。减压蒸去THF后，用1N盐酸将反应液调pH至5~6左右。乙酸乙酯萃取3-5次后合并有机相。将有机相用饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥后减压浓缩得粗品。将粗品溶于50 mL DMF中，加入HBTU（7.7 g, 20.2 mmol）和NHS（2.3 g, 20.2 mmol），室温搅拌过夜。减压蒸去DMF后，将粗品溶于乙酸乙酯中，用饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥后减压浓缩得目的产物。
Figure 352DEST_PATH_IMAGE003
（二）将1mg LND-GFFYK-cyclen 溶于0.5 mL 纯水中，用碳酸钠水溶液调节pH至中性，并通过酒精灯加热使之完全溶解。待室温自然冷却后，即可形成肽基纳米药物。采取相同的方法制备NBD-GFFYK-cyclen纳米组装体。在浓度较高时（大于2 mg/mL）， 两种多肽衍生物均可形成宏观可见的水凝胶（图1A和1B）。
实施例2
对上述实施例1制备的两种多肽纳米组装体进行表征及线粒体靶向性评价，结果参见附图1， 步骤如下：
1）分别吸取20 μL 实施例1制备得到的纳米组装体于300 目铜网上，静置1~2min，用滤纸吸除多余液体，在铜网上滴加20 μL醋酸铀染色1~2 min，滤纸吸走多余液体后置于干燥器中过夜干燥，用透射电子显微镜观察微观形貌检测。结果（附图1 A和1B）显示，实施例1所制备的两种纳米组装体的微观形貌均为纳米纤维；
2）用圆二色谱（CD）测定实施例1所制备的两种纳米组装体的二级结构，附图1C 显示两种纳米组装体具有相同的二级结构，即均由β片层构成；
3）用动态光散射仪（DLS）测定实施例1所制备的两种纳米组装体的zeta电位值，图1D显示没有轮环藤宁的肽链均带负电荷，而轮环藤宁修饰后得到的多肽衍生物均带正电荷；
4）用共聚焦显微镜测定实施例1所制备的NBD-Pep-cyclen纳米组装体对肿瘤细胞线粒体的靶向性：取对数生长期MCF-7细胞，以每孔10万的密度接种于共聚焦小皿中，培养18 h后加入50 μM NBD-Pep-cyclen纳米纤维共孵育4 h；吸除药物，加入1mL 200 nM 线粒体红色荧光探针，37 ℃细胞培养箱内避光孵育15 min；染色结束后，用PBS洗涤细胞5次，用新鲜配制且预热的4 %多聚甲醛固定20 min；固定结束后，用PBS洗3次，加入600 μL DAPI染液，室温染20 min，用PBS洗3次后，在显微镜下观察。结果（图1D）显示纳米组装体NBD-Pep-cyclen能够较好的靶向到肿瘤细胞内的线粒体。由于上述表征结果表明，NBD-Pep-cyclen与LND-Pep-cyclen具有几乎一致的微观形貌、二级结构以及zeta电位，所以这一结果也就证明了LND-Pep-cyclen对线粒体的靶向性。
实施例 3
对实施例1制备得到的LND-GFFYK-cyclen纳米药物和游离药物在体外对癌细胞和正常细胞的生长抑制效果进行评价，具体实施步骤如下：
1)取对数生长期的MCF-7, 4T1, L929 和3T3细胞，以每孔5000个的密度接种到96孔板中，置于培养箱中培养18 h；
2)用培养基将LND-Pep-cyclen纳米药物, LND, cyclen, LND 和cyclen 混合物稀释到预先设定好的浓度并与细胞共孵育48 h；
3)在避光条件下向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，置于培养箱中继续培养4 h后，用酶标仪检测450 nm 处的吸光值，计算出各组不同浓度药物作用后各个细胞的存活率；
4）图2表明，肽基纳米药物LND-Pep-cyclen能够显著提高LND对癌细胞的生长抑制能力，同时在一定程度上降低LND对正常细胞的毒副作用，从而增强LND对肿瘤细胞的选择性杀伤。
实施例 4
对实施例1制备得到的肽基纳米药物和游离药物在体外诱导癌细胞（MCF-7）和正常细胞（L929）产生ROS的效果进行定量分析，具体步骤如下：
1)取对数生长期MCF-7、L929细胞，以每孔10万的密度接种于共聚焦小皿中，置于CO2培养箱中培养18 h；
2)加入含有50 μM的LND-Pep-cyclen纳米药物及游离药物组，共孵育作用12 h；
3)吸除药物，加入1 mL的DCFH-DA工作液（10 μM），避光孵育30 min；
4）清洗后用胰酶消化收集细胞于1.5 mL EP管中，用流式细胞仪检测DCF信号；
5）图3表明，相比于本组对照细胞，肽基纳米药物能诱导肿瘤细胞MCF-7产生更多的ROS，而在正常细胞中，肽基纳米药物几乎不能诱导其产生更多的ROS。这一结果也说明了肽基纳米药物对肿瘤细胞具有选择性杀伤作用。
实施例5
对实施例1制备得到的肽基纳米药物和游离药物在体外抑制细胞克隆形成的能力进行检测，以比较其放疗增敏能力，具体步骤如下：
1)取对数生长期的MCF-7细胞，消化后计数，以1000个/孔的密度接种于六孔板中，然后以十字摇匀法摇晃培养板，摇匀后放入细胞培养箱中培养24 h；
2)用培养基将LND-Pep-cyclen纳米药物, LND, cyclen, LND 和cyclen 混合物稀释到10 μM浓度并与细胞共孵育12 h；
3)用PBS小心洗1次，再加入2 mL新鲜培养基，然后进行0，2, 4，6 Gy剂量的 γ射线照射；
4)照射后将细胞置于培养箱中继续培养。观察克隆形成情况，当细胞形成肉眼可见的克隆团（每个克隆细胞在50-150个左右）时终止培养；
5)终止培养后，用PBS小心浸洗1次，每孔加入300 μL左右0.25% 结晶紫染液（纯乙醇配制），固定染色30 min后，弃去染液，在水中浸洗2次，倒扣于桌面上，晾干后，使用凝胶成像系统对克隆板进行扫描并保存图像（背面朝上），肉眼统计克隆数，使用Graphpadprism、Origin软件分析、绘图、计算SER值；
6）图4A表明，相比于游离LND，肽基纳米药物LND-Pep-cyclen具有更显著的抑制细胞克隆团形成的能力。从图4B存活曲线可以看出，在较高剂量（4Gy和6Gy）射线下，肽基纳米药物的放疗增敏能力更为突出。
实施例6
对实施例1制备得到的肽基纳米药物和游离药物在体内联合放疗治疗的效果进行评价，具体实验步骤如下：
1）取70只BALB/c裸鼠，每只胸部皮下注射约1×107个MCF-7细胞，待肿瘤体积长至100–150mm3后，取体重相近，肿瘤大小相近的小鼠56只，随机分成8组：4组照射，4组不照射；
2）根据分组，每组荷瘤小鼠尾静脉分别注射 200 μL 含有等摩尔量的纳米药物或游离药物：LND-Pep-cyclen (20 mg)，LND (5.4 mg)，以及LND和cyclen混合物(cyclen,2.1 mg)；注射12 h 后，所有照射组均进行肿瘤局部给予6 Gy剂量的γ射线照射；
3）从治疗前一天开始至最大肿瘤长至1.5 cm3左右为止，每日测量肿瘤大小和小鼠体重，肿瘤体积按照公式：长×宽2/2进行计算并作出各组体积增长变化曲线；
4）肿瘤生长抑制结果（图5）表明，虽然单独的LND-Pep-cyclen肽基纳米药物本身具有一定的化疗效果，但效果并不理想，与放疗联合应用后可将肿瘤抑制率提高至80%左右，表现出了高效的放化疗协同治疗效果。
实施例7
LND-GFFYK-cyclen；结构式如下：
Figure 866677DEST_PATH_IMAGE004
以LND-GFFYK-cyclen作为活性成分，加入药学可接收的辅料按常规方法可制成各种规格的液体注射剂。
LND-GFFYK-cyclen的给药途径包括多种，如注射给药，腔内给药等。
（1）注射剂的制备：
LND-GFFYK-cyclen200 mg，甘露醇700 mg，PEG3000 10mg，蒸馏水100 ml，使pH值为7.0-7.5过滤滤液浓度为3mg/ml，按每安瓶2毫升分装，冷冻干燥后即得注射剂。
（2）片剂的制备：
LND-GFFYK-cyclen10 mg ，微晶纤维素 35 mg，淀粉 45 mg，聚乙烯吡咯烷酮 4mg，羧甲基淀粉钠盐4.5 mg，硬脂酸镁0.5 mg，滑石粉1 mg；将LND-GFFYK-cyclen活性成分，淀粉和纤维素过筛，并充分混合，将聚乙烯吡咯烷酮溶液与上述的粉混合，过筛，制得湿颗粒于50℃干燥，将羧甲基淀粉钠盐，硬脂酸镁和滑石粉预先过筛，然后加入到上述的颗粒中压片。
（3）胶囊的制备
LND-GFFYK-cyclen10 mg，活性成分辅料分别过100目筛，称取处方量的主药和辅料充分混合，加入羟丙甲纤维素溶液适量制软材，过24目筛，制得湿颗粒于50-60℃烘箱中干燥约2-3小时，将硬脂酸镁和滑石粉与颗粒混合均匀，整粒，测定中间体含量，用2号胶囊灌装。

Claims (3)

1.一种靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物LND-GFFYK-cyclen，其特征在于它是将氯尼达明和轮环藤宁分别共价结合在疏水性短肽的两端，得到的多肽衍生物能够在水溶液中通过分子间非共价键相互作用自组装形成微观形貌为纳米纤维的纳米药物，其化学结构如下：
Figure 496794DEST_PATH_IMAGE001
其中LND为氯尼达明，cyclen为轮环藤宁，GFFYK为甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸残基构成的短肽链。
2.权利要求1所述靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物LND-GFFYK-cyclen的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
首先通过Fmoc固相合成法合成LND-GFFYK, 称取0.1-0.3 mmol粗品溶解在1-3 mLDMSO中，加入0.15-0.45 mmol的轮环藤宁活化酯，用DIEA调节反应液pH至8~9；室温反应6-12h后，加入95%的三氟乙酸反应0.5-2 h脱去轮环藤宁上的保护基基团；通过反相HPLC分离纯化得到目的产物；其中，所述的轮环藤宁活化酯制备方法如下：
1）将轮环藤宁(6 g, 34.8 mmol)和DIEA (24 mL, 104.5 mmol)溶于40 mL DCM中，室温滴加二碳酸二叔丁酯（24 mL, 104.5 mmol），滴加完毕室温搅拌5-8小时，将反应液浓缩得粗品；粗品硅胶柱层析得无色油状物（中间产物1）；
2）将中间产物1（14.1 g, 29.8 mmol）、溴乙酸甲酯（2.9 mL, 29.8 mmol）、碳酸钾（8.3g, 59.7 mmol）溶于50 mL DMF中，升至70-80℃搅拌过夜；减压蒸去溶剂得粗品，粗品硅胶柱层析得无色油状化合物（中间产物2）；
3）将中间产物2（14.2 g, 26.1 mmol）溶于30 mL THF中，加入30 mL 2N氢氧化钠溶液，升至60-80℃搅拌过夜；减压蒸去THF后，用1N盐酸将反应液调pH至5~6，乙酸乙酯萃取3-5次后合并有机相，将有机相用饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥后减压浓缩得粗品；将粗品溶于50mL DMF中，加入HBTU（7.7 g, 20.2 mmol）和NHS（2.3 g, 20.2 mmol），室温搅拌过夜；减压蒸去DMF后，将粗品溶于乙酸乙酯中，用饱和氯化钠、无水硫酸钠干燥后减压浓缩得目的产物。
3.权利要求1所述靶向肿瘤细胞线粒体的肽基纳米药物LND-GFFYK-cyclen在制备提高肿瘤治疗疗效中的应用；其中提高肿瘤治疗疗效指的是：提高游离LND对肿瘤的特异性杀伤及放疗增敏效应。
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