CN110898230A

CN110898230A - 一种基于三氯生的纳米抗生素水凝胶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110898230A
Application number: CN201911374660.5A
Authority: CN
Inventors: 刘鉴峰; 侯小雪; 黄帆; 杨丽军; 刘金剑; 张玉民; 杨翠红; 任春华; 王忠彦; 张从柔
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-12-27
Also published as: CN110898230B

Abstract

本发明公开了一种基于三氯生的纳米抗生素水凝胶TCS‑GA‑GFFY。它是利用自组装肽化学键合TCS制得多肽衍生物TCS‑GA‑GFFY，通过加热‑冷却的方式形成TCS‑GA‑GFFY超分子水凝胶，并将其作为纳米抗生素用于增强治疗细菌感染效果，其特点是：制备简单，原料易得；良好的生物相容性，易实现临床转化。同时明显改善TCS水溶性差的问题，提高了TCS的生物利用度，特别是与游离TCS相比，TCS‑GA‑GFFY超分子水凝胶通过酸响应性释放TCS，展现出更优异的细菌杀灭能力。

Description

一种基于三氯生的纳米抗生素水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于纳米生物医药材料领域，涉及一种自组装肽化学键合抗生素的超分子水凝胶及其制备方法以及提高细菌感染的治疗效果方面的应用。

背景技术

近年来，抗生素的滥用以及细菌耐药突变率的不断上升导致耐药细菌的种类不断增加。与此同时，治疗细菌感染的新抗生素的研发速度难以跟上细菌的进化速度。因此，对现有的抗生素进行修饰和改良，开发更加有效的抗菌剂治疗细菌感染势在必行。最近，人们在利用各种纳米材料修饰已有抗生素以改善其抗菌效果方面做出了许多努力。形成的“纳米抗生素”不仅能明显改善疏水性小分子抗生素分子在生理环境中稳定性和溶解性差的问题，还能通过控制药物释放、规避抗生素耐药、体内长循环和增强渗透与滞留效应提高抗生素药效，增进对体内细菌感染的治疗效果。

在各种纳米材料中，基于自组装肽的超分子水凝胶因具有易于制备，固有的生物相容性和生物降解性以及低免疫原性等优势而被广泛应用于3D细胞培养、药物输送、生物成像、再生医学和细菌感染治疗等领域中。在治疗细菌感染方面，到目前为止已报道的基于自组装肽的超分子水凝胶作为纳米抗生素的案例均是利用水凝胶的物理包裹作用对小分子抗生素进行修饰，这种方法会不可避免地出现药物泄漏和突释等问题。因此，通过自组装肽化学键合抗生素开发稳定的纳米抗生素体系以增强细菌感染治疗效果的研究非常有必要。

三氯生（Triclosan，TCS）是一种具有广谱抗菌性的疏水抗生素，是化妆品、洗涤剂、医疗消毒及卫生保健产品的常用活性成分。然而，三氯生水溶性较差（约10 µg/mL），在生理环境中易聚集导致抗菌活性大大降低，限制了其在临床上的应用。因此，通过自组装肽化学键合TCS形成的超分子水凝胶作为纳米抗生素，有望在细菌感染治疗领域发挥重要的作用。

发明内容

本发明旨在开发一种自组装肽化学键合TCS的超分子水凝胶并将其作为纳米抗生素用于提高细菌感染的治疗效果。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容;

一种基于三氯生的纳米抗生素水凝胶TCS-GA-GFFY，其结构如下

其中TCS为三氯生；GA为戊二酸酐；GFFY为甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸肽。

本发明进一步公开了所述基于三氯生的纳米抗生素水凝胶的制备方法，其特征在于步骤如下：

将2.5−10 mg TCS-GA-GFFY溶于1−4 mL PBS中，用1M Na₂CO₃水溶液调TCS-GA-GFFY溶液的pH至7.2−7.6，随后将混合溶液加热到澄清状态，在室温静置1−4 h即可形成TCS-GA-GFFY水凝胶；所述的TCS-GA-GFFY的制备方法如下：

1）称取0.8−1.2 g二氯树脂加入固相反应器，随后加入二氯甲烷（DCM）溶剂使二氯树脂溶胀5−10 min，用吸耳球挤压出固相反应器中的溶剂；

2）称取0.8−1.2 mmol 的N-(9-芴甲氧羰基)-O-叔丁基-L-酪氨酸（Fmoc-Tyr(tBu)-OH）和1.6−2.4 mmol催化剂二异丙基乙基胺（DIEA）加入二氯甲烷（DCM）溶剂中充分溶解后加入到固相反应器中室温反应1−3 h；

3）挤压出反应液后，用二氯甲烷（DCM）清洗4−6次后加入CH₃OH溶液反应0.5−1.5 h以封闭未反应完全的活性氯原子；所述的CH₃OH溶液指的是：体积比为DCM：CH₃OH：DIEA=17：2：1；

4）溶剂换为N,N-二甲基甲酰胺（DMF）并用20%，10−20 mL哌啶脱除N-(9-芴甲氧羰基)-O-叔丁基-L-酪氨酸（Fmoc-Tyr(tBu)-OH）的氨基保护基9-芴甲氧羰基（Fmoc），裸露出活性氨基；

5）用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）清洗残余的哌啶后，称取N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸（Fmoc-Phe-OH），偶联剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）和催化剂二异丙基乙基胺（DIEA）用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）充分溶解后加入固相反应器中反应1−3 h；

6）重复上述4）和5）的步骤，依次化学键合N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸（Fmoc-Phe-OH），N-(9-芴甲氧羰基)-甘氨酸（Fmoc-Gly-OH）和TCS-GA。用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗净未反应的原料，换溶剂为二氯甲烷（DCM）后加入95%三氟乙酸（TFA）将多肽衍生物从树脂上切下；所述的三氟乙酸（TFA）指的是：体积比：H₂O：三异丙基硅烷（TIS）：三氟乙酸（TFA）=1：1：38；

7）旋蒸除去三氟乙酸（TFA），得到的粘稠液体加入无水乙醚得到沉淀物，弃掉上层无水乙醚后，沉淀物经真空干燥得到多肽衍生物粗品，随后通过高效液相色谱（HPLC）（Shimadzu，LC-6AD）纯化得到纯品TCS-GA-GFFY。所述的TCS-GA的制备方法，步骤如下：

1）将GA（4.8−7.2 mmol）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）（0.1−0.2 mmol）加入到10−30 mL无水二氯甲烷（DCM）溶液中，随后在混合溶液中加入TCS（3.2−4.8 mmol），室温下搅拌过夜；

2）反应结束后将超纯水加入反应液中并将反应液置于分液漏斗中作分液处理，收集难溶于水的有机层后加入无水硫酸钠干燥，经旋蒸去除有机溶剂二氯甲烷（DCM）、硅胶层析纯化后得到纯品TCS-GA。

本发明更进一步公开了所述基于三氯生的纳米抗生素水凝胶在制备提高细菌感染治疗效果方面的应用。其中的提高细菌感染治疗效果指的是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的治疗效果。革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、破伤风杆菌、链球菌、白喉杆菌、炭疽杆菌，典型的是金黄色葡萄球菌。革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、绿脓杆菌、布氏杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌，典型的是大肠杆菌。实验结果显示所制备的基于三氯生的纳米抗生素水凝胶具有广谱的抗菌活性，能够高效地抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌的增值。

本发明更加详细的描述如下：

通过酯化反应合成TCS-GA。通过常规的固相合成法合成多肽衍生物TCS-GA-GFFY。多肽衍生物TCS-GA-GFFY通过加热-冷却的方法自组装形成具有稳定纳米纤维微观结构的超分子水凝胶。该水凝胶纳米抗生素在弱酸性环境中通过酯键水解释放TCS。TCS的释放可抑制细菌的细胞膜和细胞壁的必需组成成分—脂肪酸的合成。因此，该水凝胶纳米抗生素可以改善TCS的生物利用度，以达到增强抗菌活性的效果。基于三氯生的新型纳米抗生素的制备方法：

将2.5−10 mg TCS-GA-GFFY溶于1−4mL PBS中，用Na₂CO₃水溶液（1M）调TCS-GA-GFFY溶液的pH至7.2−7.6。随后将混合溶液加热到澄清状态，在室温静置1−4h即可形成TCS-GA-GFFY水凝胶。进一步的，所述的TCS-GA-GFFY的制备，步骤如下：

1）称取0.8−1.2 g二氯树脂加入固相反应器，随后加入DCM溶剂使二氯树脂溶胀5−10min，用吸耳球挤压出固相反应器中的溶剂。

2）称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH（0.8−1.2mmol，368−552mg）和催化剂DIEA（1.6−2.4mmol，206.4−309.6mg）加入DCM溶剂中充分溶解后加入到固相反应器中室温反应1−3 h。

3）挤压出反应液后，用DCM清洗4−6次后加入CH₃OH溶液（DCM：CH₃OH：DIEA=17：2：1）反应0.5−1.5 h以封闭未反应完全的活性氯原子。

4）溶剂换为DMF并用20%哌啶（10−20mL）脱除Fmoc-Tyr(tBu)-OH的氨基保护基Fmoc，裸露出活性氨基。

5）用DMF清洗残余的哌啶后，称取Fmoc-Phe-OH，偶联剂HBTU和催化剂DIEA用DMF充分溶解后加入固相反应器中反应1−3 h。

6）重复上述4）和5）的步骤，依次化学键合Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Gly-OH和TCS-GA。用DMF洗净未反应的原料，换溶剂为DCM后加入95%TFA（H₂O：TIS：TFA=1：1：38）将多肽衍生物从树脂上切下。

7）旋蒸除去TFA，得到的粘稠液体加入无水乙醚得到沉淀物。弃掉上层无水乙醚后，沉淀物经真空干燥得到多肽衍生物粗品。随后通过高效液相色谱（HPLC）（Shimadzu，LC-6AD）纯化得到纯品TCS-GA-GFFY。进一步的，所述的TCS-GA的制备步骤如下：

1）将GA（4.8−7.2mmol，547.2−820.8mg）和DMAP（0.1−0.2mmol，12.2−24.4mg）加入到10−30 mL无水DCM溶液中，随后在混合溶液中加入TCS（3.2−4.8mmol，926.4−1389.6mg），室温下搅拌过夜。

2）反应结束后将超纯水加入反应液中并将反应液置于分液漏斗中作分液处理，收集难溶于水的有机层后加入无水硫酸钠干燥，经旋蒸去除有机溶剂DCM、硅胶层析纯化后得到纯品TCS-GA。

所述的超分子水凝胶TCS-GA-GFFY在不同pH（7.4或5.5）下对TCS的释放能力，步骤如下：

1）在37°C下，将不同pH值（7.4或5.5）的PBS分别加入到底部装有TCS-GA-GFFY水凝胶（0.2 mL）的小瓶中。

2）在每个预定时间点，取出0.2 mL上层溶液用于LC-MS（Shimadzu，LC-20AD）分析，随后再加入等量的新鲜PBS。

3）根据TCS的标准药物浓度曲线计算药物的累积释放度。

所述的超分子水凝胶TCS-GA-GFFY和游离TCS对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌能力评估，步骤如下：

1）将具有相同药物浓度（TCS的浓度为1 μg/mL）的TCS、TCS-GA-GFFY水凝胶分别与150μL金黄色葡萄球菌或大肠杆菌悬液（1×10⁵bacterial/mL）混合。

2）取100μL混合液用涂布棒涂布在Luria-Bertani（LB）琼脂板上，置于37°C下孵育16 h。

3）通过凝胶成像系统（Bio Rad，Gel Doc XR）拍摄经不同材料处理后的细菌菌落形成情况。以PBS处理的细菌形成的细菌菌落数对比不同材料处理后的细菌菌落数，评估材料的抗菌能力。

所述的超分子水凝胶TCS-GA-GFFY通过溶血实验计算溶血率，评价该水凝胶的生物相容性，步骤如下：

1）取4 mL健康SD大鼠血液于1 mL 4%EDTA-3K中，离心（3000 rpm，5 min）后弃上清，再用无菌PBS清洗至上清液无红色或淡黄色。取离心下层液稀释50倍制成2%的红细胞悬液待用。

2）将不同TCS浓度（1、2.5、5、10、20和50μg/mL）的游离TCS、TCS-GA-GFFY水凝胶加入到400μL红细胞悬液并在37℃下培养2-3 h。

3）将混合液离心（3000 rpm，5 min）并用数码相机拍摄照片。

4）取出100μL离心上清液通过酶标仪检测在570nm处的光学吸光度。PBS处理和0.1％TritonX-100处理的红细胞悬液分别作为阴性对照和阳性对照，计算溶血率（溶血率（%）=（实验组吸光度-阴性对照组吸光度）/（阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度）×100%）。

本发明主要解决了传统的小分子抗生素三氯生因生物利用度低导致抗菌效果不显著的问题，重点考察了三氯生与自组装多肽共价结合后所形成的超分子水凝胶的物理化学性质及其在抑制细菌增殖方面的效果，主要的难点在于含三氯生多肽衍生物结构的合理设计，使其能够自组装形成超分子水凝胶，从而提高三氯生的生物利用度。

本发明公开的基于三氯生的纳米抗生素水凝胶及其制备方法与应用所具有的积极效果在于：能够极大地提高小分子抗生素三氯生的生物利用度，增强抗菌效果，为细菌感染提供治疗新方法。

本发明的基于三氯生的纳米抗生素超分子水凝胶系具备以下优势：

1）稳定的三维纳米纤维结构；

2）制备简单，原料易得；

3）良好的生物相容性，易实现临床转化（溶血实验：在TCS浓度高达50μg/mL时，游离TCS和TCS-GA-GFFY水凝胶与红细胞共孵育后，离心所得的上清液均未观察到溶血现象。取上清液通过酶标仪检测吸光度，计算溶血率，发现游离TCS和TCS-GA-GFFY水凝胶均不会引起红细胞溶血，证明TCS-GA-GFFY水凝胶具有良好的生物相容性）；

4）酸响应性释放TCS（药物释放实验：在pH为7.4时，经24 h后TCS-GA-GFFY水凝胶可释放出58%的TCS；而在pH为5.5时，TCS的释放速度明显加快，经24h后TCS-GA-GFFY水凝胶的TCS累积释放率高达86％）。

5）与游离TCS相比，TCS-GA-GFFY水凝胶展现出更优异的细菌杀灭能力（平板计数实验：选用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌为目标细菌，游离TCS治疗组的细菌杀灭率为45.9%，而TCS-GA-GFFY水凝胶治疗组的细菌杀灭率为77.4%；选用革兰氏阴性菌大肠杆菌为目标细菌，游离TCS治疗组的细菌杀灭率为47.2%，而TCS-GA-GFFY水凝胶治疗组的细菌杀灭率为67.0%）。

附图说明

图1为多肽衍生物TCS-GA-GFFY通过加热-冷却的方法自组装形成超分子水凝胶的示意图；

图2为超分子水凝胶TCS-GA-GFFY的性质表征；其中A为水凝胶的流变性能表征（应变为1%的动态频率扫描）；B为水凝胶的流变性能表征（频率为1 rad/s的应变扫描）；C为水凝胶的透射电镜（TEM）照片；D为水凝胶的圆二色光谱；

图3为超分子水凝胶TCS-GA-GFFY在PBS（pH为7.4或5.5）中的TCS释放曲线;

图4为金黄色葡萄球菌S. aureus经不同材料（A为PBS；B为TCS；C为TCS-GA-GFFY水凝胶）处理后细菌菌落形成情况并D对其定量；大肠杆菌E. coli经不同材料（E为PBS；F为TCS；G为TCS-GA-GFFY水凝胶）处理后细菌菌落形成情况并H对其定量；

图5为超分子水凝胶TCS-GA-GFFY的生物相容性测试。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂来源如下：

戊二酸酐（GA）、4-二甲基氨基吡啶（DMAP）、二异丙基乙胺（DIEA）、三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）、HBTU、哌啶、N,N′-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、二氯甲烷（DCM）、乙醚和Triton X-100均购买于百灵威科技有限公司。二氯树脂及所有的带Fmoc基团的氨基酸均购买于吉尔生化上海有限公司。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有市售。

实施例1

（一）TCS-GA的制备方法，步骤如下：

1）将GA（6 mmol，684.6 mg）和DMAP（0.15 mmol，18.3 mg）加入到20 mL无水DCM溶液中，随后在混合溶液中加入TCS（4 mmol，1158.2 mg），室温下搅拌过夜。

2）反应结束后将超纯水加入反应液中并将反应液置于分液漏斗中作分液处理，收集难溶于水的有机层后加入无水硫酸钠干燥，经旋蒸去除有机溶剂DCM、硅胶层析纯化后得到纯品TCS-GA（已知化合物）。

（二）TCS-GA-GFFY的制备方法，步骤如下：

1）称取1 g二氯树脂加入固相反应器，随后加入DCM溶剂使二氯树脂溶胀10 min，用吸耳球挤压出固相反应器中的溶剂。

2）称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH（1 mmol，459.5 mg）和催化剂DIEA（2 mmol，258.5 mg）加入DCM溶剂中充分溶解后加入到固相反应器中室温反应2 h。

3）挤压出反应液后，用DCM清洗5次后加入CH₃OH溶液（DCM：CH₃OH：DIEA=17：2：1）反应2 h以封闭未反应完全的活性氯原子。

4）溶剂换为DMF并用20%哌啶（15 mL）脱除Fmoc-Tyr(tBu)-OH的氨基保护基Fmoc，裸露出活性氨基。

5）用DMF清洗残余的哌啶后，称取Fmoc-Phe-OH，偶联剂HBTU和催化剂DIEA用DMF充分溶解后加入固相反应器中反应2 h。

7）旋蒸除去TFA，得到的粘稠液体加入无水乙醚得到沉淀物。弃掉上层无水乙醚后，沉淀物经真空干燥得到多肽衍生物粗品。随后通过高效液相色谱（HPLC）（Shimadzu，LC-6AD）纯化得到纯品TCS-GA-GFFY，结构表正如下：

¹H NMR (300 MHz, DMSO) δ 12.69 (s, 1H), 9.20 (s, 1H), 8.17 (dd, J = 13.8,8.0 Hz, 2H), 8.01 – 7.89 (m, 2H), 7.74 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 1.7Hz, 1H), 7.41 – 7.34 (m, 2H), 7.23 (d, J = 3.6 Hz, 4H), 7.19 – 7.07 (m, 7H),7.02 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.96 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 8.0 Hz, 2H),4.59 – 4.44 (m, 2H), 4.38 (dd, J = 12.7, 6.6 Hz, 1H), 3.67 (dd, J = 16.5, 5.5Hz, 1H), 3.53 (dd, J = 16.4, 5.0 Hz, 1H), 3.06 – 2.90 (m, 3H), 2.88 – 2.75(m, 2H), 2.74 – 2.64 (m, 1H), 2.48 – 2.38 (m, 2H), 2.15 (t, J = 6.9 Hz, 2H),1.81 – 1.66 (m, 2H).

（三）一种基于三氯生的新型纳米抗生素的制备方法，步骤如下：

将2.5 mg TCS-GA-GFFY溶于1 mL PBS中，用Na₂CO₃水溶液（1M）调TCS-GA-GFFY溶液的pH至7.4。随后将混合溶液加热到澄清状态，在室温静置2 h即可形成TCS-GA-GFFY水凝胶。

参见附图2，给出了制备的超分子水凝胶TCS-GA-GFFY的物理化学性质表征结果，步骤如下：

1）将2.5 mg TCS-GA-GFFY溶于1 mL PBS中，用Na₂CO₃水溶液（1M）调TCS-GA-GFFY溶液的pH至7.4。随后将混合溶液加热到澄清状态，在室温静置2 h即可形成TCS-GA-GFFY水凝胶。图2A和2B显示水凝胶的储能模量（G′）和损耗存储（G″）均呈现弱的频率（范围为0.1至100 rad/s）和应变（范围为0.1％至10％）依赖性且G′值总是大于G″值，证实了具有较高弹性的水凝胶的形成。

2）通过圆二色光谱仪（BioLogic，MOS-450）得到TCS-GA-GFFY水凝胶的圆二色光谱（CD）。如图2C所示，TCS-GA-GFFY水凝胶的CD谱图在186 nm处呈正峰，同时在202 nm附近有一个负峰，表明多肽衍生物转变为水凝胶时的二级结构是典型的β-折叠构象。

3）取10μLTCS-GA-GFFY水凝胶滴于300目的碳支持膜铜网上，静置4 min后用滤纸将多余样品吸尽，随后取10μL醋酸双染铀滴于带有水凝胶的碳支持膜铜网上，静置4 min后用滤纸吸尽多余染液，真空干燥以备待用。利用透射电子显微镜（FEI，TALOSF200c）采集TCS-GA-GFFY水凝胶的透射电镜（TEM）图像。图2D显示水凝胶具有微米级长度的纳米纤维形貌且细长的纳米纤维相互缠绕，形成致密的三维网状微观结构。

附图3给出了超分子水凝胶TCS-GA-GFFY在不同pH（7.4或5.5）下对TCS的释放效果，步骤如下：

3）根据TCS的标准药物浓度曲线计算药物的累积释放度。

4）图3即为实验重复三次后得到的TCS-GA-GFFY水凝胶在pH为7.4或5.5时TCS的累积释放曲线。从图中可以看出，随着时间的延长，TCS逐渐从水凝胶中释放出来且释药行为具有明显的pH依赖性。在pH为7.4时，经24 h后TCS-GA-GFFY水凝胶可释放出58%的TCS；而在pH为5.5时，TCS的释放速度明显加速，经相同时间后TCS-GA-GFFY水凝胶的TCS累积药物释放效率高达86％。

附图4通过比较超分子水凝胶TCS-GA-GFFY和游离TCS对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀灭能力，来评估超分子水凝胶TCS-GA-GFFY的抗菌能力，步骤如下：

2）取100 μL混合液用涂布棒涂布在Luria-Bertani（LB）琼脂板上，置于37°C下孵育16h。

3）通过凝胶成像系统（BioRad，GelDocXR）拍摄经不同材料处理后的细菌菌落形成情况。以PBS处理的细菌形成的细菌菌落数对比不同材料处理后的细菌菌落数，评估材料的抗菌能力。

4）由图4A、B、C可知，选用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌为目标细菌，经游离TCS、TCS-GA-GFFY水凝胶处理后的细菌菌落形成数明显少于PBS组。通过图4D的定量图可看出，游离TCS治疗组的细菌杀灭率为45.9%，而TCS-GA-GFFY水凝胶治疗组的细菌杀灭率为77.4%。因此，与游离TCS相比，设计的TCS-GA-GFFY水凝胶对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌具有更优异的抗菌能力。

5）由图4E、F、G可知，选用革兰氏阴性菌大肠杆菌为目标细菌，经游离TCS、TCS-GA-GFFY水凝胶处理后的细菌菌落形成数明显少于PBS组。通过图4H的定量图可看出，游离TCS治疗组的细菌杀灭率为47.2%，而TCS-GA-GFFY水凝胶治疗组的细菌杀灭率为67.0%。因此，与游离TCS相比，设计的TCS-GA-GFFY水凝胶对革兰氏阴性菌大肠杆菌展现出更强的抗菌能力。

附图5通过溶血实验计算超分子水凝胶TCS-GA-GFFY的溶血率，从而评价该水凝胶的生物相容性，步骤如下：

1）取4mL健康SD大鼠血液于1mL 4%EDTA-3K中，离心（3000rpm，5min）后弃上清，再用无菌PBS清洗至上清液无红色或淡黄色。取离心下层液稀释50倍制成2%的红细胞悬液待用。

2）将不同TCS浓度（1、2.5、5、10、20和50 μg/mL）的游离TCS、TCS-GA-GFFY水凝胶加入到400 μL红细胞悬液并在37℃下培养2-3h。

3）将混合液离心（3000rpm，5min）并用数码相机拍摄照片。

4）取出100 μL离心上清液通过酶标仪检测在570 nm处的光学吸光度。PBS处理和0.1％Triton X-100处理的红细胞悬液分别作为阴性对照和阳性对照，计算溶血率（溶血率（%）=（实验组吸光度-阴性对照组吸光度）/（阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度）×100%）。

5）通过图5可看出，TCS浓度高达50μg/mL时，游离TCS和TCS-GA-GFFY水凝胶与红细胞共孵育离心后的上清液均未观察到溶血现象。取上清液通过酶标仪检测紫外吸光度计算溶血率，发现游离TCS和TCS-GA-GFFY水凝胶均不能引起红细胞溶血，证明TCS-GA-GFFY水凝胶具有良好的生物相容性。

Claims

1.一种基于三氯生的纳米抗生素水凝胶TCS-GA-GFFY，其结构如下：

2.一种权利要求1所述基于三氯生的纳米抗生素水凝胶的制备方法，其特征在于步骤如下：

1）称取0.8−1.2 g二氯树脂加入固相反应器，随后加入DCM溶剂使二氯树脂溶胀5−10min，用吸耳球挤压出固相反应器中的溶剂；

2）称取0.8−1.2 mmol 的Fmoc-Tyr(tBu)-OH和1.6−2.4 mmol催化剂DIEA加入DCM溶剂中充分溶解后加入到固相反应器中室温反应1−3 h；

3）挤压出反应液后，用DCM清洗4−6次后加入CH₃OH溶液反应0.5−1.5 h以封闭未反应完全的活性氯原子；所述的CH₃OH溶液指的是：体积比为DCM：CH₃OH：DIEA=17：2：1；

4）溶剂换为DMF并用20%，10−20 mL哌啶脱除Fmoc-Tyr(tBu)-OH的氨基保护基Fmoc，裸露出活性氨基；

5）用DMF清洗残余的哌啶后，称取Fmoc-Phe-OH，偶联剂HBTU和催化剂DIEA用DMF充分溶解后加入固相反应器中反应1−3 h；

6）重复上述4）和5）的步骤，依次化学键合Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Gly-OH和TCS-GA;

用DMF洗净未反应的原料，换溶剂为DCM后加入95%TFA将多肽衍生物从树脂上切下；所述的TFA指的是：体积比：H₂O：TIS：TFA=1：1：38；

7）旋蒸除去TFA，得到的粘稠液体加入无水乙醚得到沉淀物，弃掉上层无水乙醚后，沉淀物经真空干燥得到多肽衍生物粗品，随后通过高效液相色谱纯化得到纯品TCS-GA-GFFY。

3.权利要求1所述基于三氯生的纳米抗生素水凝胶在制备提高细菌感染治疗效果方面的应用。

4.权利要求3所述的应用，其中的提高细菌感染治疗效果指的是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的治疗效果。