CN115838409A - 一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法与应用，其制备方法包括，S1.在缚酸剂及催化剂的条件下，以2，3‑二甲基马来酸酐与1‑羟基苯并三唑为原料，进行反应，得到开环缩合产物；S2.以开环缩合产物与天蚕素B为原料，进行接枝反应，而后经纯化、透析，即得pH响应性Cecropin B抗菌多肽，该pH响应性Cecropin B抗菌多肽可在长循环后定点释放Cecropin B抗菌多肽，稳定性高且不产生耐药性。

Description

一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及抗菌技术领域，尤其涉及一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法与应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophitus parasuis，HPS)又称副猪格拉瑟杆菌属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属，具有15个血清型，其中血清4型和5型在我国最为流行，是猪上呼吸道的常在菌。副猪嗜血杆菌是一种机会致病菌，可以并发或继发于猪的蓝耳病、伪狂犬病、细小病毒病、圆环病毒病、猪瘟等疫病，使疫情复杂化，经济损失加重。各种年龄的猪都可感染，临床上主要感染断奶前后和保育期的猪，特别是4～8周龄的小猪，感染高峰通常见于保育期的4～6周龄仔猪，发病率一般在10％～15％，死亡率可达到50％～90％。随着副猪嗜血杆菌病在全世界范围流行，其对养猪业带来巨大危害和经济损失，抗菌药如磺胺类、氨基糖苷类、大环内酯类是目前治疗副猪嗜血杆菌病的主要手段。近年来由于抗菌药物的不全理使用导致副猪嗜血杆菌耐药性及多重耐药性的呈现逐年上升趋势。大量的基础和临床研究表明，大部分抗菌药已经不能很好地治疗副猪嗜血杆菌病。自瑞士和丹麦发现并分离出对磺胺类药物耐药的HPS以来，我们于2013-2017年对国内各省份16个猪场的448株HPS进行耐药监测分析，发现副猪嗜血杆菌对8类抗生素的耐药率分别为：氨基糖苷类抗生素(21.0％-55.6％)、大环内酯类抗生素(26.6％-57.2％)、林可霉素类抗生素(31.9％-86.7％)、四环素类抗生素(9.0％-32.5％)、多粘菌素类抗生素(3.4％-54.4％)，磺胺类抗生素(62.1％-88.0％)，β-内酰胺类抗生素(8.4％-23.9％)和喹诺酮类抗生素(21.0％-48.9％)。西班牙和英国分离的HPS对β-内酰胺类药物：头孢喹肟和头孢噻呋药物耐药率为10％。德国地区分离的HPS对氨基糖苷类药物如链霉素耐药情况严重，耐药率高达60％，然而欧洲分离株对氟喹诺酮类药物耐药率较低，如麻保沙星耐药率仅为1.4％。表明HPS的耐药率随着地区、国家以及药物用量的不同而呈现不同程度的差异。

抗菌肽是生物体内产生的一种具有生物活性的小分子多肽，这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌、抗病毒等特点。分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。目前已从微生物、植物、昆虫、节肢动物、两栖动物、哺乳动物甚至人体内鉴定出上千种抗菌肽，抗菌肽在合成机制、氨基酸组成和作用机制等方面不同于传统的微生物(包括细菌、真菌和链霉菌等)产生的多肽类抗生素。随着病原微生物对传统抗菌药物耐受现象的日趋严重，更是使抗菌肽在兽医临床中作为候选药物和饲料添加剂具有广阔的应用前景。

Cecropins(天蚕素)是从罗普斯蚕蛾中发现的一类阳离子抗菌肽，主要包括Cecropin A、Cecropin B、Cecropin C、Cecropin D、Cecropin E和Cecropin P1，其中Cecropin B的抗菌活性最强，其由35个氨基酸残基和两个高度折叠的α-螺旋组成，两个螺旋之间被一个铰链区分隔开，C-端酰胺化。在Cecropin B的结构基础上，Cecropin B的衍生物有Cecropin B1、Cecropin B2和Cecropin B3，研究发现除具有较强的抗菌活性，对癌细胞也具有杀灭作用。

关于Cecropin B的杀菌机制的研究主要集中在改变细胞膜的渗透性方面，Chen等通过透射电镜观察到，大肠杆菌经Cecropin B作用后细胞膜发生了明显的膨胀，运用免疫金染色法并未发现细胞质排出细胞膜的现象，表明Cecropins主要是通过破坏细胞膜导致细菌死亡。随着Cecropin B的抗菌活性逐渐被人们重视，细菌对其耐受性的研究也日渐重要。鳗弧菌、鲁氏耶尔森菌等水产细菌性病原菌可经诱导对Cecropin B产生耐受现象。研究表明Cecropin B对猪源性革兰氏阴性菌如HPS、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、猪霍乱沙门菌、波氏杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.5-16μg/mL，抑菌效果明显和其他类型α螺旋抗菌肽moricin或青霉素相当。

尽管作为抗生素替代品，抗菌肽有低耐药性的优点，然而，在亚MIC浓度CecropinB持续诱导条件下，HPS仍可以由敏感株突变为耐药株，且多肽类药物不稳定、易水解，在体内生物利用度低，易代谢。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法与应用，该pH响应性Cecropin B抗菌多肽可在长循环后定点释放Cecropin B抗菌多肽，稳定性高且不产生耐药性。

为达到上述技术目的，本申请采用以下技术方案：

第一方面，本申请提供一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1.在缚酸剂及催化剂的条件下，以2，3-二甲基马来酸酐与1-羟基苯并三唑为原料，进行反应，得到开环缩合产物；

S2.以开环缩合产物与天蚕素B为原料，进行接枝反应，而后经纯化、透析，即得pH响应性Cecropin B抗菌多肽。

优选的，2，3-二甲基马来酸酐与天蚕素B的摩尔量比为1-20:1。

优选的，催化剂与2，3-二甲基马来酸酐的摩尔量比为0.8-1.5:1。

优选的，步骤S1中，反应的pH值为7-10。

优选的，步骤S2中，透析用的透析液为pH值为7.4-9的磷酸盐缓冲液。

优选的，步骤S2中，纯化依次包括步骤重沉淀、离心除上清。

优选的，缚酸剂为三乙胺、吡啶中的一种或几种。

优选的，催化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。

第二方面，本申请提供一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽。

第三方面，本申请提供一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽在抗副猪嗜血杆菌中的应用，pH响应性Cecropin B抗菌多肽的应用pH范围为5-7.4。

本申请的有益效果如下：本发明采用2，3-二甲基马来酸酐通过pH敏感的酰胺键接枝在天蚕素B(Cecropin B)多肽的侧链活性氨基上，改变了原多肽的荷电性质，增强了其逃避网状内皮系统监控的能力，赋予了其长循环、定点释放的能力，使其成为了一种极具潜力的响应性抗菌多肽新剂型，不产生耐药性；本发明运用pH敏感键构建Cecropin B纳米颗粒，仅pH为5-7.4时精准靶向治疗耐药的副猪嗜血杆菌感染，稳定性高、不易水解，为治疗耐药细菌感染提供新的思路，为兽医临床用药提供新剂型。

附图说明

图1为Cecropin B的分子结构式；

图2为pH响应性Cecropin B抗菌多肽(CBD)的核磁共振氢谱(1HNMR)图谱；

图3为pH响应性Cecropin B抗菌多肽(CBD)的体外抗菌活性图；

图4为pH响应性Cecropin B抗菌多肽(CBD)的细胞毒性图；

图5为pH响应性Cecropin B抗菌多肽(CBD)的pH响应性体外释放图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

抗菌多肽由于其较低药效浓度、良好的生物相容性和环境友好性，在医药领域被广泛关注，但是其低循环期、高降解性以及较高的制备成本阻碍了其在耐药菌治疗方面的应用。为解决以上难题，可以通过对多肽修饰从而提高生物利用度；特别是对于耐药菌株或者高MIC的菌株感染，可以通过以上策略精准靶向治疗，从而达到治疗耐药性细菌感染的目的。

作为纳米药物的新兴领域，智能响应型的纳米载体种类繁多，包括pH响应型、氧化还原响应型、温度响应型等载体。这些智能响应型聚合物作为药物释放体系，可通过对病灶部位某些环境信息的感应自身发生相应变化。由于抗癌药物从纳米载体的可控释放在癌症治疗中非常重要，考虑到溶酶体和内涵体的弱酸性环境(pH 5-6)，低于血液(pH 7.4)，pH敏感的聚合物能够实现包载药物在细胞内的可控释放。pH敏感的聚合物作为载体主要有两种方式。一种是通过pH响应型的化学键如缩醛和腙键进行设计，胶束在溶酶体和内涵体的弱酸性条件下，pH响应的化学键发生断裂，释放药物分子，从而达到治疗的目的。另一种是通过聚合物中含有的酸性或碱性基团的质子化-去质子化，达到pH响应的目的，从而实现药物的释放。

基于此，创立了本发明。

为弥补Cecropin B抗菌多肽无法实现长循环后定点释放的缺点，通过pH敏感键键合小分子形成自组装负离子纳米粒新剂型的制备方法，从而制得从而制得具有体内长循环、逃逸网状内皮系统监控、定点靶向的响应性药用抗菌多肽，该制备方法可以用于更合理使用抗菌肽作为耐药性控制工具，同时为其他抗菌多肽的递送与剂型开发提供一定的思考方向。

本申请提供一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1.在缚酸剂及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的条件下，以2，3-二甲基马来酸酐与1-羟基苯并三唑为原料，进行反应，得到开环缩合产物，其结构式如式A所示，其中，R₁、R₂代表EDCl的侧链基团，R₁为(CH₃)₂-N-(CH₂)₃-，R₂为-CH₂-CH₃，反应过程如下所示：

S2.以开环缩合产物与天蚕素B(Cecropin B，CAS No.203265-23-0，分子式如图1所示)为原料，进行接枝反应，而后经纯化、透析，即得pH响应性Cecropin B抗菌多肽，其分子结构如式B所示，其中，R₃为Cecropin B多肽的主链结构，反应式如下所示：

在本方案的条件选取方面，2，3-二甲基马来酸酐与天蚕素B的摩尔量比为1-20:1，催化剂与2，3-二甲基马来酸酐的摩尔量比为0.8-1.5:1，该范围内，可实现2，3-二甲基马来酸酐与天蚕素B的侧链氨基进行成功接枝；上述反应的溶剂均为DMSO，缚酸剂为三乙胺、吡啶中的一种或几种，通过调整缚酸剂的用量，控制步骤S1中反应的pH值为7-10，用于2，3-二甲基马来酸酐开环；优选的，步骤S2还包括添加脱水剂，例如氯化钙等，以增大反应得率。

具体的，步骤S2中，接枝反应结束后，对产物进行纯化、透析，纯化依次包括步骤重沉淀、离心除上清，具体步骤如下：

S21.在接枝反应产物的混合物中加入二氯甲烷与石油醚进行重沉淀，出现絮状沉淀或溶液变浑浊后进行离心；

S22.将离心后的产物除去上清，沉淀在30-40℃温度下用旋转蒸发仪旋干可挥发性溶剂；

S23.将S22所得的沉淀用pH＝7.4-9的磷酸盐缓冲液溶解后，并以100-300倍体积该缓冲液对其进行透析，室温下1-7d。

值得注意的是，步骤S2中，透析用的透析液为pH值为7.4-9的磷酸盐缓冲液，不适当的ph将会使得多肽上配体提前脱去，致使该新药回退成原药，在此范围的pH值可保证产物的得率高且接枝率高。

下面以缚酸剂为三乙胺为例，对本方案的制备机理进行阐述：

在二甲亚砜中，适量的三乙胺作为缚酸剂使得二甲基马来酸酐开环，EDCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)作为催化剂连接到开环后羧基上，加入HoBt(1-羟基苯并三唑)后，替换EDCl，使得步骤S2的酰胺缩合反应条件更加温和，天蚕素B的赖氨酸残基侧链氨基更容易进攻羧基端，同时HoBt的空间位阻致使多肽的消旋不容易发生，保持构象，得到pH响应性Cecropin B抗菌多肽。

本申请提供一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽。

本申请提供一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽在抗副猪嗜血杆菌中的应用。

下面通过具体的实施例对本申请进行进一步说明。

实施例1

一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1.将2，3-二甲基马来酸酐与三乙胺溶于DMSO中，室温搅拌，得第一溶液；将1-羟基苯并三唑的DMSO溶液与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的DMSO的溶液混合，而后注入至第一溶液中，利用三乙胺调节pH值为8，室温下搅拌反应30min，得开环缩合产物，；

S2.将Cecropin B多肽的DMSO溶液注入S1所得的开环缩合产物中，并加入无水CaCl₂，37℃水浴搅拌24h，得到混合物；

S21.在混合物中加入二氯甲烷以及石油醚进行重沉淀，充分震荡混悬后，室温静置，直至出现絮状沉淀或溶液变浑浊。

S22.将S21的产物置入高速冷冻离心机，离心，去除上清液，沉淀在30-40℃温度下用旋转蒸发仪旋干可挥发性溶剂；

S23.取pH为8的磷酸盐缓冲液溶解步骤S22中沉淀，并以100-300倍体积该缓冲液对其进行透析，室温下2d，而后冷冻干燥，即得到pH响应性Cecropin B抗菌多肽(CBD)。

其中，2，3-二甲基马来酸酐与天蚕素B的摩尔量比为10:1，催化剂与2，3-二甲基马来酸酐的摩尔量比为1:1。

对本方案的产物进行鉴定，结果如图2所示，在CBD上有CB(天蚕素B)及DA(2，3-二甲基马来酸酐)的对应核磁共振氢种类峰，说明结合成功。

实施例2

一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，包括以下步骤：

S1.将2，3-二甲基马来酸酐与三乙胺溶于DMSO中，室温搅拌，得第一溶液；将1-羟基苯并三唑的DMSO溶液与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的DMSO的溶液混合，而后注入至第一溶液中，利用三乙胺调节pH值为10，室温下搅拌反应30min，得开环缩合产物，；

S2.将Cecropin B多肽的DMSO溶液注入S1所得的开环缩合产物中，37℃水浴搅拌24h，得到混合物；

S21.在混合物中加入二氯甲烷以及石油醚进行重沉淀，充分震荡混悬后，室温静置，直至出现絮状沉淀或溶液变浑浊。

S22.将S21的产物置入高速冷冻离心机，离心，去除上清液，沉淀在30-40℃温度下用旋转蒸发仪旋干可挥发性溶剂；

S23.取pH为7.4的磷酸盐缓冲液溶解步骤S22中沉淀，并以100-300倍体积该缓冲液对其进行透析，室温下2d，而后冷冻干燥，即得到pH响应性Cecropin B抗菌多肽。

其中，2，3-二甲基马来酸酐与天蚕素B的摩尔量比为1:1，催化剂与2，3-二甲基马来酸酐的摩尔量比为0.8:1。

实施例3

一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，其他步骤与实施例1相同，所不同的是2，3-二甲基马来酸酐与天蚕素B的摩尔量比为20:1，催化剂与2，3-二甲基马来酸酐的摩尔量比为1.5:1，步骤S23的pH值为9。

评价与测试

以实施例1制备得到的pH响应性Cecropin B抗菌多肽(CBD)为研究对象，对副猪嗜血杆菌的抗菌活性、细胞毒性试验和pH响应性能研究，具体测试方法如下：

抗菌活性：将副猪嗜血杆菌(HPS)复苏后，在TSA培养基中传代培养二次，挑取单菌落至TSB肉汤中振荡培养16h～24h至对数生长期。采用麦氏比浊法将菌液用TSB肉汤稀释至0.5麦氏浊度，此时的菌液浓度约为1×108CFU/mL，然后用TSB肉汤进行10倍稀释，使细菌浓度达到1×10⁷CFU/mL。Cecropin B、CBD和2，3-二甲基马来酸酐(DA)用TSB肉汤依次倍比稀释为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125ppm后与细菌孵育，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养，24h左右后观察结果，记录数据，结果如图3所示。

CCk-8试验：收集对数期的RAW264.7细胞并将细胞悬浮在含有1％青链霉素双抗和10％胎牛血清的DMEM培养基中，以1×10⁴的密度接种于96孔培养板中，每孔加入200μL细胞悬液(边缘孔用无菌PBS填充)，置于37℃、5％ CO₂细胞培养箱培养24h之后，弃掉培养板中的细胞培养液，每孔加入200μL含有128、32、8和2μg/mL的CBD和Cecropin B的DMEM基础培养液，每个浓度重复3次。同时设置空白组(含有DMEM培养基、CCk-8)和对照组control(含有细胞、DMEM培养基和CCk-8)。在37℃，5％CO₂细胞培养箱中分别孵育24h后，每孔加入质量分数为10％的CCk-8溶液继续培养1h。置水平摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪450nm处测量各孔的吸光度(OD)值。设置3个平行，取平均值。细胞存活率按下式计算：

细胞存活率(％)＝(试验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％，结果如图4所示。

pH响应性能研究：

以磷酸盐缓冲液为溶剂，按紫外-可见分光光度法，于190-900nm对开环后2，3-二甲基马来酸酐进行全波长扫描，最大波长为205.3nm，在此波长处基本无干扰。以磷酸盐缓冲液为空白对照，将对应浓度开环后2，3-二甲基马来酸酐溶于释放基质中，分别稀释成1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125ppm浓度，以HPLC在205nm测定实时吸光度，并以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线。

将内含2mL缓冲液的截留分子量为1000MW的透析袋完全浸入38mLpH分别为5、6、7的磷酸盐缓冲液中，投入以Cecropin B计为1000ppm于缓冲液的CBD，于37℃恒温摇晃。分别于0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36h取样1mL，同时向释放介质中补液1mL，将取出的透析液离心，过滤后通过高效液相色谱测定实时吸光度，以积分的峰面积带入标准曲线计算浓度，求得累计释放百分率，并绘制释放曲线，如图5所示。

根据测试结果，图3表明对于相同的菌种来说，CBD和CB显示出了接近的最低抑菌浓度，而DA则无抑菌效果，对结果不造成干扰；图4为细胞存活率试验，验证药物对于细胞的毒性大小，通过同图3的实验结果对比，在浓度为最低抑菌浓度十倍以上时，细胞存活率仍然大于80％，这意味着药物毒性可忽略；图5为pH响应性及释放效率研究，通过透析袋法计算累计释放率可以发现，随着pH不断降低，药物释放速率加快。

综上，说明本方案的pH响应性Cecropin B抗菌多肽可以作用于绝大部分革兰氏阴性菌，且作用效果快，且不与细菌生命活动发生反应，基本不能产生耐药性。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.在缚酸剂及催化剂的条件下，以2，3-二甲基马来酸酐与1-羟基苯并三唑为原料，进行反应，得到开环缩合产物；

S2.以所述开环缩合产物与天蚕素B为原料，进行酰胺反应，而后经纯化、透析，即得pH响应性Cecropin B抗菌多肽。

2.根据权利要求1所述的pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，其特征在于，所述2，3-二甲基马来酸酐与所述天蚕素B的摩尔量比为1-20:1。

3.根据权利要求1所述的pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，其特征在于，所述催化剂与所述2，3-二甲基马来酸酐的摩尔量比为0.8-1.5:1。

4.根据权利要求1所述的pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，其特征在于，步骤S1中，反应的pH值为7-10。

5.根据权利要求1所述的pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述透析用的透析液为pH值为7.4-9的磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1所述的pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，纯化依次包括步骤重沉淀、离心除上清。

7.根据权利要求1所述的pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，其特征在于，所述缚酸剂为三乙胺、吡啶中的一种或几种。

8.根据权利要求1所述的pH响应性Cecropin B抗菌多肽的制备方法，其特征在于，所述催化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的pH响应性Cecropin B抗菌多肽。

10.一种如权利要求9所述的pH响应性Cecropin B抗菌多肽在抗副猪嗜血杆菌中的应用。

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