JP7051906B2 - ペクチン－ドキソルビシン共役化合物及びその調製方法と用途 - Google Patents

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Description

本発明は薬学分野に関し、特にペクチン－ドキソルビシン共役化合物及びその調製方法と用途に関する。
「ペクチン－ドキソルビシン共役化合物」標的指向性ドラッグデリバリーシステム（ＰＡＣ）は、多くの予備的研究と文献調査に基づいて、ペクチンを高分子抗がんプロドラッグの担体として選定し、さらにペクチンの構造を修飾することにより、ポリペプチド－ドキソルビシンと共有結合させて水溶性の高い薬剤担持力を有するペクチン－ドキソルビシン共役化合物を形成させている。
ＰＡＣは高分子の共役化合物で、粒径は２００ｎｍ前後であり、注射後循環系に入った薬物の一部は、腫瘍組織の高分子物質に対する透過性・滞留性亢進効果（ＥＰＲ）を利用して腫瘍組織に蓄積し、受動的標的指向性の目的を達成することができる。ＰＡＣは腫瘍組織の中で次第に腫瘍細胞に飲み込まれ、リソソーム中で加水分解してドキソルビシンを放出し、腫瘍を殺傷する役割を果たす。既存のペクチン－ドキソルビシン共役化合物はすべてペクチンとドキソルビシンが直接アミド結合又はアシルヒドラゾン結合によって結合され、水に溶解しにくいため、ナノ粒子懸濁液又は凍結乾燥粉薬にする必要があり、局部限定の薬としてしか利用できない。全身薬の場合、網状内皮系に飲み込まれやすいため、標的指向性が制限され、高濃度で悪性腫瘍組織内に長時間蓄積できず、腫瘍に対する治療効果がよくない。
本発明の目的は、従来技術の欠点に対して、高濃度かつ標的指向性で悪性腫瘍組織内に長時間蓄積できるペクチン－ドキソルビシン共役化合物を提供することにあり、効果を高め毒性を軽減する目的を達成することができる。本発明はまた上記ペクチン－ドキソルビシン共役化合物の調製方法を提供する。
上記の目的を実現するために本発明が採用する技術的手段は、式（Ｉ）ａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ（Ｉ）の構造を有するペクチン－ドキソルビシン共役化合物である。
ここで、ａはペクチン又は修飾ペクチンであり、ｂはＰＥＧｎ（ＰＥＧｎはポリエチレングリコール）であり、ｃは酵素的切断基、ポリペプチド又はポリペプチド誘導体であり、ｄは自己分解基であり、ｅはドキソルビシンである。
前記ペクチンはポリガラクツロン酸脱エステル化ペクチンであり、前記ａの分子量は１－４ＫＤであり、さらに好ましくは、前記ポリガラクツロン酸脱エステル化ペクチンのポリガラクツロン酸の含有量は９５%以上である。さらに、前記修飾ペクチンは、ポリガラクツロン酸脱エステル化ペクチンのカルボニル基と、ヒドロキシ基置換されたＣ２-Ｃ４のアルキルアミンで形成したアミドであり、さらにペクチン炭酸エステルに活性化される。
さらに、式（Ｉ）において、ｂはＰＥＧｎであり、ｎは１－２０の整数であり、ｃはジペプチド、ジペプチド誘導体、トリペプチド、トリペプチド誘導体、テトラペプチド、テトラペプチド誘導体のいずれかであり、好ましくは、ｎは６－１２の整数であり、好ましくは、ｃはｖａｌ－ａｌａである。
さらに、ｄはp‐アミノベンジルオキシカルボニル基（ＰＡＢＣ）である。
本発明はまた、式（１３）の化合物と式（９）の化合物をアルカリ性試薬の存在下で反応させる、上記のペクチン－ドキソルビシン共役化合物の調製方法を開示する。
Figure 0007051906000001
式（１３）において、ａは２-４から選択された整数であり、ｍは１-６０であり、式（９）の化合物はｂ-ｃ-ｄ-ＡＤＭであり、ＡＤＭはドキソルビシンであり、ｂはＰＥＧｎであり、ｃはポリペプチドである。好ましくは、ｃはジペプチド、ジペプチド誘導体、トリペプチド、トリペプチド誘導体、テトラペプチド、テトラペプチド誘導体であり、好ましくは、ｎは６-１２の整数であり、好ましくは、ｃはｖａｌ-ａｌａであり、好ましくは、ｄはＰＡＢＣであり、ＰＥＧｎはポリエチレングリコールであり、ｎは重合度である。
さらに、式（１３）の化合物の調製方法としては、ペクチンのカルボキシ基とアルコール（メタノール）を縮合させてエステル化ペクチンを得た後、さらにヒドロキシ基置換されたＣ２-Ｃ４のアルキルアミンとアミドを形成した後に炭酸ビス(４-ニトロフェニル)と反応して式（１３）の化合物を得る。
さらに、式（９）の化合物の調製方法として、式（５）の化合物をドキソルビシンとアルカリ性試薬の存在下で反応させて式（６）の化合物を得、式（６）の化合物をピペリジンの存在下で脱保護することにより式（７）の化合物を得、さらにＲ１-ｂ-ＣＯＯＨと反応させて式（８）の化合物を得、式（８）の化合物をピペリジンの存在下で脱保護することにより式（９）の化合物を得る。式（５）の化合物はＲ１-ｃ-ＰＡＢＣであり、式（６）の化合物はＲ１-ｃ-ＰＡＢＣ-ｅであり、式（７）の化合物はｃ-ＰＡＢＣ-ｅであり、式（８）の化合物はＲ１-ｂ-ｃ-ＰＡＢＣ-ｅであり、Ｒ１は保護基であり、好ましくは、Ｒ１はフルオレニルメトキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)である。
さらに、式（５）の化合物の調製方法は、式（３）の化合物を酸結合剤の存在下でp-アミノベンジルアルコールと反応させて式（４）の化合物を得、式（４）の化合物をアルカリ試薬の存在下で炭酸ビス(４-ニトロフェニル)と反応させて式（５）の化合物を得る方法であり、式（３）の化合物はＲ１-ｃ-ＯＨであり、式（４）の化合物はＲ１-ｃ-ＰＡＢＯＨであり、ＰＡＢＯＨは４-（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ基である。
さらに、式（３）の化合物の調製方法として、式（I）の化合物をＮＨＳとＤＣＣの存在下で反応させて式（２）の化合物を得、式（２）の化合物をアルカリ性試薬の存在下でアミノ酸と反応させて式（３）の化合物を得る。式（I）の化合物はＲ１-ｃ１-ＯＨであり、式（２）の化合物はＲ１-ｃ１-ＯＳｕであり、ｃ１はアミノ酸であり、好ましくは、ｃ１はｖａｌである。
本発明はまた、上記のペクチン－ドキソルビシン共役化合物を用いて、がん治療薬を調製する用途を開示している。
本発明のペクチン－ドキソルビシン共役化合物は、新規な化学構造を有しており、標的指向性・高濃度で悪性腫瘍組織内に長時間蓄積し、効果を高め、毒性を軽減する目的を達成し、適応症は様々な固形悪性腫瘍の化学療法である。
化合物６の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 化合物７の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 化合物８の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 化合物８の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。 化合物９の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 化合物１３の１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 最終生成物であるドキソルビシン－ペクチン共役化合物の１ＨＮＭＲスペクトルである。 最終生成物であるドキソルビシン－ペクチンと対照化合物（ペクチンとドキソルビシンは直接アミド結合により結合したもの）のＨ２２肝臓がんマウス腫瘍モデルに対する抑制作用を示す図である。 最終生成物のドキソルビシン－ペクチンと対照化合物（ペクチンとドキソルビシンは直接アミド結合により結合したもの）の４Ｔ１乳がんマウス腫瘍モデルに対する抑制作用を示す図である。
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
実施例１
化合物１（１５０ｇ、０.４４ｍｏｌ）を１.５ＬのＴＨＦに溶解し、順にＮＨＳ（５６ｇ、０.４９ｍｏｌ）、ＤＣＣ（１３７ｇ、０.６６ｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌し、濾過し、固体をジクロロメタンで２回洗浄し、濾液を濃縮乾固し、再結晶して、化合物２の純品を得た。
実施例２
Figure 0007051906000002
化合物２(１４７ｇ、０.３４ｍｏｌ)を１.５ＬのＴＨＦに溶解し、Ｌ-アラニン(３２ｇ、０.３５ｍｏｌ)、ＮａＨＣＯ３(３０ｇ、０.３５ｍｌ)を順に加え、さらに５００ｍｌの水を加えた。ＴＨＦと水の割合を調節して液体を単相（難しい）にする。室温で一晩撹拌しながら反応させた後、ＴＨＦを濃縮除去し、水で希釈して、ＨＣｌでpＨを３-４に調節し、固体を析出させて水洗し、真空乾燥し、酢酸エチルで洗浄して、生成物３（少量の不純物を含む）１３０ｇを得て、結晶を精製した。
実施例３
Figure 0007051906000003
化合物３(３０ｇ、７３ｍｍｏｌ)をジクロロメタン５００ｍｌに懸濁させ、４-アミノベンジルアルコール(１１ｇ、９０ｍｍｏｌ)、ＥＥＤＱ(２７ｇ、１１３ｍｍｏｌ)を順に加え、最後にメタノールを透明になるまで加え、室温で一晩撹拌して、濾過し、固体をジクロロメタンで洗浄し、濾液を濃縮乾固して粗化合物４を得て、さらにメチルtｅrt-ブチルエーテルで洗浄して純品２０ｇを得た。
実施例４
Figure 0007051906000004
化合物４（２１ｇ、４１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン５００ｍｌに懸濁させ、順にＤＩＰＥＡ（１６ｇ、１２６ｍｍｏｌ）、炭酸ビス(ｐ-ニトロフェニル)（１８.５ｇ、６９ｍｍｏｌ）を加え、最後に溶液が透明になるまでＤＭＦを加えて、室温で一晩撹拌した。減圧蒸留でＤＭＦを除去し、粘稠状の固体をまず少量のメタノールで洗浄し、さらに石油エーテルと酢酸エチル（又はメチルtｅrt-ブチルエーテル）で複数回再結晶し、７ｇの純化合物５を得た。
実施例５
Figure 0007051906000005
ドキソルビシン塩酸塩６９０ｍｇ、化合物５を１.０３６ｇ秤量し、丸底フラスコに入れた後、ＤＭＦ１０ｍｌを加えた。撹拌しながらＤＩＰＥＡを０.２１ ｍｌ添加し、室温で５ｈ反応させた後、反応液をメチルtｅrt-ブチルエーテルにゆっくりと滴下し、遠心分離して粗生成物を得た。少量のＤＭＦに溶解して、二回目の再結晶を行った。収量は１.０７６ｇであり、収率=７８%であった。
実施例６
Figure 0007051906000006
化合物６を４００ｍｇ秤量し、丸底フラスコに入れた後、ＤＭＦ１０ｍｌを加えた。室温で撹拌しながらピペリジン１.８ｍｌを素早く添加し、室温で７０ｓを反応させた後、反応液を素早く氷浴中のメチルtｅrt-ブチルエーテルに流し込み、遠心分離して粗生成物を得た。さらに少量のＤＭＦに溶解し、室温でメチルtｅrt-ブチルエーテルにゆっくりと滴下して二回目の再結晶を行った。製品収量は２１０ｍｇであり、収率=６６％であった。
実施例７
Figure 0007051906000007
５６５ｍｇのＰＥＧ８を秤量して丸底フラスコに入れ、ＤＭＦを５ｍｌ加えた後、室温で撹拌しながらＨＡＴＵを４４０ｍｇ、ＤＩＰＥＡを０.１３ｍｌ加えた。少量のＤＭＦに化合物７を溶解し、ピペットで反応フラスコ（溶剤５ｍｌ使用）に移した。室温で１.５ｈ撹拌しながら反応させ後、反応液をメチルtｅrt-ブチルエーテルにゆっくり加え、遠心分離して、粗生成物を得た。さらに少量のＤＭＦに溶解し、メチルtｅrt-ブチルエーテルに滴下して二回目の再結晶を行った。カラムクロマトグラフィーで精製した。Ｅａ:ＭｅＯＨ=２０:１。収率は５５%であった。


化合物８の確認：
Figure 0007051906000008
ＲＰ-ＨＰＬＣ(Ａｇiｌｅｎt １２６０) ２０.６４１ ｍiｎ,ピーク面積：９２.４０３８%.
実施例８
Figure 0007051906000009
２００ｍｇ化合物８を秤量し丸底フラスコに入れ、ＤＭＦを６ｍｌ加えた後、室温で撹拌しながらピペリジン６６０μlを素早く添加し、室温で１４０ｓ反応させた後、反応液を素早く氷浴中のメチルtｅrt-ブチルエーテルに流し込み、遠心分離して粗生成物を得た。さらに少量のＤＭＦに溶解し、室温でメチルtｅrt-ブチルエーテルにゆっくりと滴下して二回目の再結晶を行った。
実施例９
柑橘系のペクチン（市販の原料）２ｇを２００ｍｌ（０.２ｍｏｌ/Ｌ）の希硝酸溶液に溶かし、８５℃（内温８３℃、外温９０℃）に昇温し、８５℃（内温は８３℃）になった時点で時間計測を開始し、約２ｈ後に加熱を停止し、室温に冷却した後、反応液を８００ｍｌの無水エタノールに滴下し、膜ろ過、洗浄、真空乾燥して化合物１０を得た。
化合物１０の確認：
Figure 0007051906000010
実施例１０
Figure 0007051906000011
化合物１０を２ｇ秤量して片口フラスコに入れ、メタノール２０ｍｌと濃ＨＣｌを２ｍｌ加え、内温が５５℃に上昇した時点から時間を計測し、７ｈ反応した後撹拌を中止し、温度を下げて反応液を無水エタノールに滴下し、撹拌、濾過、洗浄、真空乾燥して化合物１１を得た。
実施例１１
６００ｍｇの化合物１１を丸底フラスコに入れ、３-アミノ-１-プロパノール（粘稠状液体）３.１６ｇを加えて２日間撹拌し、反応時間が４８ｈを超えた後、澄んだ粘稠状反応液をゆっくりと無水エタノールに滴下し、撹拌、濾過、洗浄、真空乾して化合物１２を得た。
実施例１２
Figure 0007051906000012
化合物１２の１ｇを１５ｍｌのＤＭＳＯに完全に溶解し、炭酸ビス(ｐ-ニトロフェニル)１.２９ｇを加え、さらにＤＩＥＡ０.７ｍｌを加えて一晩反応（１２ｈ以上）させ、最後に反応液をゆっくりとＥＡ溶液（２００ｍｌ）に滴下し、素早くろ過して、洗浄、真空乾燥して化合物１３を得た。
化合物１３の確認：
Figure 0007051906000013
実施例１３
化合物１３を秤量し、ＤＭＦとＤＭＳＯの混合溶液に完全に溶解し、化合物９を加えて、撹拌して均一になった後、ＤＩＥＡを加え、室温で２４ｈ反応させた後、ＨＰＬＣでドキソルビシンとその誘導体が検出されなくなるまで、溶液を直接ＤＭＳＯ－水勾配で透析した後、透析液を凍結乾燥してペクチン－ドキソルビシン共役化合物を得た。
ペクチン－ドキソルビシン共役化合物の確認：
Figure 0007051906000014
実施例１４
本実施例では、ペクチン－ドキソルビシン共役化合物（実施例１－１３により調製したものであってもよい）は、以下の構造を有する。
Figure 0007051906000015
体外細胞毒性試験：対数増殖期のＨＴ-２９結腸がん細胞、ＨｅｐＧ-２肝臓がん細胞、ＳＭＭＣ ７７２１肝臓がん細胞、ＳＫＯＶ３卵巣がん細胞及びＭＣＦ-７乳がん細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を調整し、各ウェルに１００μlを入れて、測定対象細胞密度を４０００個/ウェル（エッジウェルを無菌ＰＢＳで充填する）となるようにプレーティングする。５%ＣＯ２、３７℃で２４ｈインキュベーションした後、培地を取り除いて濃度勾配（ドキソルビシン含有量０.１２５、０.２５、０.５、１.０、２.０、４.０、８.０、１６.０μｇ/ｍｌ）のペクチン－ドキソルビシン又はドキソルビシンを加え、各濃度に３つのダブルウェルを設ける。そして５%ＣＯ２、３７℃のインキュベーターで４８ｈをインキュベーションする。各ウェルにＣＣＫ-８溶液１０μlを入れた後さらに２ｈ培養した。マイクロプレート分光光度計で４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を測定し、ペクチン－ドキソルビシンとドキソルビシンの種々のがん細胞に対するＩＣ５０値を計算した。
[表１] 体外細胞毒性試験
Figure 0007051906000016
表１に示した体外細胞毒性試験の結果から、本発明によって調製されたペクチン－ドキソルビシン共役化合物の様々ながん細胞に対する阻害率は陽性対照薬ドキソルビシンと明らかな差がなく、良好な体外細胞毒性作用を有することがわかった。
実施例１５
本発明によって調製されたペクチン－ドキソルビシン共役化合物（実施例１－１３により調製したもの）は、体内でＥＰＲ効果によって腫瘍組織内に蓄積される。受動的な標的指向性目的を達成するため、本発明によって調製されたペクチン－ドキソルビシン共役化合物のマウス移植モデルに対する体内薬効を考察した。
体内薬効試験：対数増殖期のＨ ２２肝臓がん細胞、４Ｔ１乳がん細胞、ＥＭＴ６乳がん細胞及びＨＴ-２９結腸がん細胞を収集し、細胞懸濁液の濃度を３Ｘ１０７個細胞/ｍｌとなるように調整し、Ｂａｌｂ/ｃマウス又は裸マウスの右上肢皮下に０. ｍｌ/匹（細胞数は約３×１０７個）を接種し、接種したマウスの腫瘍体積が平均１００ｍｍ３に達した時に、マウス移植モデルをランダムに陰性対照グループ（０.９%塩化ナトリウム注射液）、ドキソルビシン対照グループ（５ｍｇ/kｇ）、ペクチン－ドキソルビシン実験グループ（ドキソルビシンの量は５ｍｇ/kｇ）に分けて、各グループの８匹のマウスに上記の薬物を静脈注射し、全部で４回投薬し、腫瘍の体積変化と体重を記録した。体積の計算式は、体積=(長さ×幅２)/２である。
体内薬効実験において、本発明によって調製されたペクチン－ドキソルビシン共役化合物はＨ ２２肝臓がん、４Ｔ１乳がん、ＥＭＴ６乳がん及びＨＴ-２９結腸がんに対する治療効果はいずれもドキソルビシン対照より優れている。本発明によって調製されたペクチン－ドキソルビシン共役化合物は、Ｈ ２２肝臓がん、４Ｔ１乳がん、ＥＭＴ６乳がんマウス移植モデルの腫瘍の成長を著しく抑制でき、抑制率が高く、それぞれ７２.９８%、７８.１%、７１.６８%であった。それに対して対照のドキソルビシンは、Ｈ ２２肝臓がん、４Ｔ１乳がん、ＥＭＴ６乳がんマウス移植モデルに対する抑制率は本発明で調製されたペクチン－ドキソルビシン共役化合物の抑制率より低く、それぞれ５３.４２%、５０.６１%、５６.９５%であった。また、実験において、本発明によって調製されたペクチン－ドキソルビシン共役化合物を投入したグループにおいてマウスの体重の減少がほとんどみられず、マウスの死亡も確認されていない。一方、ドキソルビシン群のマウスは大幅に体重を減らし、体重の１５％以上を減らし、一部のマウスは死亡した。体内薬効実験の結果から、本発明によって調製されたペクチン－ドキソルビシン共役化合物は、ドキソルビシンに比べて、効果を高め、毒性を軽減する効果があることが明らかになった。Ｈ ２２肝臓がんマウス移植モデルを殺して、腫瘍組織を採取して小動物生体蛍光イメージングシステムで組織内のドキソルビシンイメージング強度を観察したところ、本発明で作製したペクチン－ドキソルビシン共役化合物を投入したクループにおいてマウスの腫瘍にドキソルビシンの強い蛍光が認められており、本発明で作製したペクチン－ドキソルビシン共役化合物が長時間、高濃度で腫瘍組織に蓄積できることがわかった。
実施例１６
本発明によって調製されたペクチン－ドキソルビシン共役化合物（実施例１－１３により調製したもの）と既存の対照化合物（ペクチンとドキソルビシンは直接アミド結合によって結合されたもの）の治療効果を比較するために、Ｈ ２２肝臓がんと４Ｔ１乳がんのマウスモデルを選択して比較した。
[表２] 本発明によって調製されたペクチン－ドキソルビシン共役化合物と対照化合物（ペクチンとドキソルビシンがアミド結合によって結合されているもの）の性質相違の比較
Figure 0007051906000017
その結果、本発明によって調製されたペクチン－ドキソルビシン共役化合物は、Ｈ ２２肝臓がん及び４Ｔ１乳がんマウス腫瘍モデルに対する抑制率が既存の対照化合物（ペクチンとドキソルビシンは直接アミド結合によって結合されたもの）に比べていずれも高く、抑制率はそれぞれ７０.８３%、７６.２０%であったが、既存の対照化合物（ペクチンとドキソルビシンは直接アミド結合によって結合されたもの）の抑制率はわずか４８.６４%、４７.００%であった。図８及び図９に示すように、発明者は、実験中にまた本発明によって調製されたペクチン－ドキソルビシン共役化合物は、腫瘍に対する抑制率が高いだけでなく、高い抑制率を長時間維持することができることを見出した。すなわち同じ量を投与しても、ペクチン－ドキソルビシンの共役化合物の抑制作用が長く維持されていることが分かった。
上記の実施例は、単に本発明の技術的思想及び特徴を説明するためのものであり、その目的は当業者が本発明の内容を理解し実施するためであり、そのため本発明及びその合成方針の最適化された保護範囲を制限することはできない。本発明の内容の本質に基づいてなされる等価な変化又は修飾は、すべて本発明の保護範囲内に含まれるべきである。

Claims (9)

  1. 式（Ｉ）の構造を有することを特徴とするペクチン－ドキソルビシン共役化合物。
    ａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ （Ｉ）
    ここで、ａはペクチン又は修飾ペクチンであり、前記ペクチンは、ポリガラクツロン酸の含有量が９０％以上であり、分子量が１－６０ＫＤの脱エステル化ペクチンであり、前記修飾ペクチンは、ポリガラクツロン酸脱エステル化ペクチンのカルボニル基と、ヒドロキシ基置換されたＣ２－Ｃ４のアルキルアミンで形成したアミドを、さらにペクチン炭酸エステルに活性化したものであり、
    ｂはポリエチレングリコールＰＥＧｎであり、ｎは６－１２の整数であり、
    ｃはｖａｌ－ａｌａであり、
    ｄはアミノベンジルオキシカルボニル基であり、
    ｅはドキソルビシンである。
  2. ａは修飾ペクチンであり、前記ａの分子量は１－４ＫＤであることを特徴とする請求項１に記載のペクチン－ドキソルビシン共役化合物。
  3. ｄはｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル基、すなわちＰＡＢＣであることを特徴とする請求項１に記載のペクチン－ドキソルビシン共役化合物。
  4. 式（１３）の化合物と式（９）の化合物をアルカリ性試薬の存在下で反応させることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載のペクチン－ドキソルビシン共役化合物の調製方法。

    Figure 0007051906000018
    式（１３）において、ａは２－４から選択された整数であり、ｍは１－６０であり、式（９）の化合物はｂ－ｃ－ｄ－ＡＤＭであり、ＡＤＭはドキソルビシンであり、ｂはＰＥＧｎであり、ｃはｖａｌ－ａｌａであり、ｄはｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル基、すなわちＰＡＢＣであり、ｎは６－１２の整数である。
  5. 式（１３）の化合物の調製方法として、ペクチンとアルコールを反応させてエステル化ペクチンを得、さらにアミノ置換されたＣ２－Ｃ４のアルコールと反応させてアミドを形成した後、さらに炭酸ビス（４－ニトロフェニル）と反応させて式（１３）の化合物を得ることを特徴とする請求項４に記載のペクチン－ドキソルビシン共役化合物の調製方法。
  6. 式（９）の化合物の調製方法として、式（５）の化合物をドキソルビシンとアルカリ性試薬の存在下で反応させて式（６）の化合物を得、式（６）の化合物をピペリジンの存在下で脱保護することにより式（７）の化合物を得、さらに式（７）の化合物をＲ１－ｂ－ＣＯＯＨと反応させて式（８）の化合物を得、式（８）の化合物をピペリジンの存在下で脱保護することにより化合物（９）を得ることを特徴とする請求項４に記載のペクチン－ドキソルビシン共役化合物の調製方法。
    ここで、式（５）の化合物はＲ１－ｃ－ＰＡＢＣであり、式（６）の化合物はＲ１－ｃ－ＰＡＢＣ－ｅであり、式（７）の化合物はｃ－ＰＡＢＣ－ｅであり、式（８）の化合物はＲ１－ｂ－ｃ－ＰＡＢＣ－ｅであり、Ｒ１はフルオレニルメトキシカルボニル基Ｆｍｏｃである。
  7. 式（５）の化合物の調製方法として、式（３）の化合物を酸結合剤の存在下でｐ－アミノベンジルアルコールと反応させて式（４）の化合物を得、式（４）の化合物をアルカリ試薬の存在下で炭酸ビス（４－ニトロフェニル）と反応させて式（５）の化合物を得ることを特徴とする請求項６に記載のペクチン－ドキソルビシン共役化合物の調製方法。
    ここで、式（３）の化合物はＲ１－ｃ－ＯＨであり、式（４）の化合物はＲ１－ｃ－ＰＡＢＯＨであり、ＰＡＢＯＨは４－（ヒドロキシメチル）フェニルアミノ基である。
  8. 前記式（３）の化合物の調製方法として、式（Ｉ）の化合物をＮ－ヒドロキシスクシンイミドとジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で反応させて式（２）の化合物を得、式（２）の化合物をアルカリ試薬の存在下でアミノ酸と反応させて式（３）の化合物を得ることを特徴とする請求項７に記載のペクチン－ドキソルビシン共役化合物の調製方法。
    ここで、式（Ｉ）の化合物はＲ１－ｃ１－ＯＨであり、式（２）の化合物はＲ１－ｃ１－ＯＳｕであり、Ｓｕはスクシンイミド基であり、ｃ１はアミノ酸である。
  9. 請求項１－３のいずれか一項に記載のペクチン－ドキソルビシン共役化合物のがん治療薬の調製に使用する方法。
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