CN111467322B - Vb12靶向型西地那非纳米药物的合成方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了VB12靶向型西地那非纳米药物的合成方法及应用，合成方法包括将丝胶蛋白与VB12混合于无水溶剂A中，加入CDI和DMAP催化，反应制备VB12靶向型丝胶蛋白；将得到的VB12靶向型丝胶蛋白与α‑氨基酸‑N‑羧基环内酸酐混合溶解在的无水溶剂B中，充分反应；加入西地那非，充分反应后将混合溶液装入透析袋中，得到所述VB12靶向型西地那非纳米药物。本发明所需原料廉价，操作方便，工艺简单，高效实用，可以在温和的条件下将VB12偶联到纳米药物载体上。得到的VB12靶向型西地那非纳米药物，性质稳定，具有高度生物组织相容性，可在水溶液中分散良好，同时具有肿瘤靶向性，可被肿瘤细胞快速摄取，具有更高效、安全的免疫治疗增敏效果。

Description

VB12靶向型西地那非纳米药物的合成方法及应用
技术领域
本发明涉及一种新型的西地那非靶向制剂，特别涉及一种VB12靶向型西地那非纳米药物的合成方法。
背景技术
肿瘤的免疫治疗因能激活人体自身免疫系统，长期有效清除体内肿瘤细胞受到业界关注。其中，PD-1免疫检查点阻断疗法已在临床部分肿瘤中得以应用，其原理为通过利用PD-1抗体(A-PD-1)结合肿瘤细胞表面的PD-L1配体，重新激活T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。但临床上，针对实体肿瘤，尤其是胃癌的A-PD-1免疫治疗效果并不理想。特异性阻断PD-1/PD-L1在不同类型实体瘤的治疗中应答率为20-40％，在胃癌中更只有11.5％-15％。这可能与实体肿瘤本身形成的炎症微环境的形成，招募、异常扩增并活化的骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)相关。由于实体肿瘤细胞及肿瘤基质细胞可以通过分泌炎症因子(IFN-y、IL-1b、IL-6、IL-8等)到肿瘤微环境中，形成肿瘤炎性微环境。肿瘤炎性微环境一方面能够通过上调MDSCs增殖相关的靶基因如c-myc及迁移相关分子S100A8和S100A9蛋白的表达，促进MDSCs的异常扩增及招募。另一方面，炎症因子可通过激活MDSCs的JAK-STAT1及JAK-STAT6通路，上调精氨酸酶1(AG1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达，催化L-精氨酸分别产生尿素和一氧化氮，耗竭了T细胞增殖与活化的必需物质L-精氨酸，抑制T细胞的增殖与活化，从而起到抑制T细胞抗肿瘤反应。因此，抑制调控MSSCs相关炎症因子的分泌，是恢复T细胞抗肿瘤反应、增强免疫治疗效果的有效途径。
西地那非是5型磷酸二酯酶(PDE-5)抑制剂，既往用于治疗男性勃起功能障碍与肺动脉高压。部分临床研究发现：相对于无口服西地那非的群体，口服西地那非的人群可能对A-PD-1的敏感性更高。部分研究亦提示：西地那非可以激活肿瘤细胞内的c-GMP/PKG通路，而通路被认为与肿瘤细胞炎症因子的分泌具有高度相关性；通过激活c-GMP/PKG通路有望改善肿瘤炎症微环境，从而抑制MDSCs的异常扩增、募集和活化，最终恢复肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的增殖活性。该现象提示：西地那非可能具有一定的增敏免疫治疗效果。但传统的西地那非剂型缺乏肿瘤靶向性，如若通过大治疗剂量给药达到提高免疫治疗疗效的目的，则有可能因人体全身不良反应的发生，如心肌梗死、血管闭塞、视网膜出血等，最终导致患者依从性降低。因此，靶向增强肿瘤细胞对西地那非的摄取，减少治疗剂量下西地那非的毒副作用，是利用西地那非免疫增敏作用的有效途径。
纳米材料载体(Nanometer Materials)如丝胶蛋白纳米胶束，具有低免疫原性、可生物降解性能和高生物相容性等优点，在生物医学领域中应用广泛。但目前该类纳米药物在血液循环中，主要通过肿瘤的透过性增强及滞留效应(permeability and retention，EPR)被动到达肿瘤病灶，缺乏主动靶向性。为增加靶向性，可利用肿瘤组织高度表达某些受体特性，在纳米药物表面进行标记。
钴胺素(Cobalamin)，也称为维生素B12，作为一种人体必需的水溶性维生素，参与人体细胞代谢的甲基化、脱氧核酸(DNA)的合成、细胞内核酸与蛋白质的合成。有研究显示，在快速增殖的肿瘤细胞表面，钴胺素受体数目显著上调，表现出肿瘤细胞对钴胺素摄取的增加。将维生素B12偶联在纳米材料载体上，有望提高纳米载体的靶向性。然而VB12的稳定性差，对光、热都很敏感，如何在温和的反应条件下将VB12偶联到纳米载体上是一项具有挑战性的工作。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一种不足，提供一种维生素B12靶向型西地那非纳米药物的合成方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种VB12靶向型西地那非纳米药物的合成方法，包括：
1)维生素B12靶向型丝胶蛋白的制备：将丝胶蛋白与维生素B12混合于无水溶剂A中，加入CDI和DMAP催化，15～40℃反应制备维生素B12靶向型丝胶蛋白；
2)维生素B12靶向型西地那非纳米药物的制备：
a)将得到的维生素B12靶向型丝胶蛋白与α-氨基酸-N-羧基环内酸酐混合溶解在的无水溶剂B中，充分反应；
b)加入西地那非，充分反应后将混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析，得到所述维生素B12靶向型西地那非纳米药物。
在一些实例中，维生素B12与丝胶蛋白的质量混合比为1：(5～20)。
在一些实例中，维生素B12与CDI的摩尔投料比为1：(5～10)。
在一些实例中，维生素B12与DMAP的摩尔投料比为1：(0.1～0.2)。
在一些实例中，所述透析袋的截留分子量为3500KD。
在一些实例中，所述无水溶剂A选自丁烯氧化物溶液。
在一些实例中，所述无水溶剂B选自DMSO、二甲基乙酰胺。
在一些实例中，所述透析的时间为12～36h。
在一些实例中，维生素B12靶向型丝胶蛋白与α-氨基酸-N-羧基环内酸酐反应的时间不短于48h。
本发明的第二个方面，提供：
一种VB12靶向型西地那非纳米药物，按本发明第一个方面的合成方法制备得到。
本发明的有益效果是：
本发明的一些实例，所需原料廉价，操作方便，工艺简单，高效实用，可以在温和的条件下将VB12偶联到纳米药物载体上。
本发明一些实例制备得到的维生素B12靶向型西地那非纳米药物，性质稳定，具有高度生物组织相容性，可负载的免疫治疗增敏剂西地那非，优化西地那非水溶性较差、缺乏肿瘤靶向性、性质不稳定等缺点，在水溶液中形成分散良好、性质稳定的纳米药物，同时具有肿瘤靶向性，可被肿瘤细胞快速摄取，产生比单纯西地那非具有更高效、安全的免疫治疗增敏效果。
本发明一些实例制备得到的维生素B12靶向型西地那非纳米药物，不仅表面具有丰富的基团，同时也有高度携带能力，可与其他药物、核素、染料等分子反应，进行多重化疗、光动力热疗等多功能化衍生，可用作性能优良的新型药物控释载体。
附图说明
图1是实施例1维生素B12靶向型西地那非纳米药物的粒径、zeta电位、电镜图；
图2是实施例2维生素B12靶向型丝胶蛋白对胃正常上皮细胞(GES-1)毒性图；
图3是实施例3胃癌细胞摄取维生素B12靶向型西地那非纳米药物的共聚焦图；
图4是维生素B12靶向型西地那非纳米药物对胃癌细胞毒性(MTT)图；
图5是维生素B12靶向型西地那非纳米药物增强A-PD-1在小鼠中的疗效；
图6是维生素B12靶向型西地那非纳米药物提高c-GMP浓度及降低肿瘤中炎症因子含量；
图7是维生素B12靶向型西地那非纳米药物抑制肿瘤细胞释放炎症因子；
图8是维生素B12靶向型西地那非纳米药物影响肿瘤中MDSCs数量及功能表达；
图9是维生素B12靶向型西地那非纳米药物对肿瘤中T细胞功能的影响。
具体实施方式
在利用PD-1抗体治疗包括胃癌、前列腺癌的多种恶性肿瘤治疗过程中，由于肿瘤自身形成的炎症微环境将激活MDSCs对TILs的抗肿瘤抑制作用，达到降低肿瘤免疫反应，削弱肿瘤治疗效果。利用西地那非能减少肿瘤细胞炎症因子的释放，破坏肿瘤自身炎症微环境，削弱MDSCs功能对并恢复TILs抗肿瘤作用，起到增敏肿瘤免疫治疗的效果。但由于西地那非缺乏肿瘤靶向性，在高治疗剂量下，会增加严重不良反应，如心肌梗死、血管闭塞、视网膜出血的发生，导致患者难以耐受治疗。本发明提供一种钴胺素靶向型西地那非纳米药物(Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos)的制备方法及提高A-PD-1治疗实体肿瘤免疫应答的应用。我们利用丝胶蛋白(Sericin)与钴胺素混匀于丁烯氧化物溶液中，并在EDC和DMAP的催化下，完成二者间羟氨基化反应与酯化反应，形成钴胺素靶向型丝胶蛋白(Cobalamin-Sericin)，并进一步修饰、载入西地那非得到所述钴胺素靶向型西地那非纳米药物(Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos)，从而高效进入恶性肿瘤病灶内产生免疫治疗增敏作用。该纳米药物可以通过保留西地那非增敏免疫治疗特性的同时，从水溶性、稳定性及肿瘤靶向性等多个方面优化西地那非原药，赋予其高效、靶向的免疫治疗增敏作用。
本发明的名词缩写如下：
CDI：N,N′-羰基二咪唑
DMAP：中文名是4-二甲氨基吡啶，英文名：4-dimethylaminopyridine
本发明的第一个方面，提供：
一种VB12靶向型西地那非纳米药物的合成方法，包括：
1)维生素B12靶向型丝胶蛋白的制备：将丝胶蛋白与维生素B12混合于无水溶剂A中，加入CDI和DMAP催化，15～40℃反应制备维生素B12靶向型丝胶蛋白；
2)维生素B12靶向型西地那非纳米药物的制备：
a)将得到的维生素B12靶向型丝胶蛋白与α-氨基酸-N-羧基环内酸酐混合溶解在的无水溶剂B中，充分反应；
b)加入西地那非，充分反应后将混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析，得到所述维生素B12靶向型西地那非纳米药物。
维生素B12靶向型丝胶蛋白的制备过程中，反应温度优选为室温(20～25℃)，避免对温度进行调控。
在一些实例中，维生素B12与丝胶蛋白的质量混合比为1：(5～20)。这样可以保证丝胶蛋白均可以有效地被修饰上VB12。
在一些实例中，维生素B12与CDI的摩尔投料比为1：(5～10)。
在一些实例中，维生素B12与DMAP的摩尔投料比为1：(0.1～0.2)。
这样既能保证反应充分，又可以有效提高原料的使用效率。
在一些实例中，所述透析袋的截留分子量为3500KD。
在一些实例中，所述无水溶剂A选自丁烯氧化物溶液。
在一些实例中，所述无水溶剂B选自DMSO、二甲基乙酰胺。
这些溶剂可以有效的溶解或分散反应物，促进反应的进行。
在一些实例中，所述透析的时间为12～36h。
在一些实例中，维生素B12靶向型丝胶蛋白与α-氨基酸-N-羧基环内酸酐反应的时间不短于48h。进一步的，反应时间为48～72h。
本发明的第二个方面，提供：
一种VB12靶向型西地那非纳米药物，按本发明第一个方面的合成方法制备得到。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
丝胶蛋白可以购买得到，或按如下方法制备得到。
丝胶蛋白的制备：
将剪碎的蚕茧加入0.02mol/L的碳酸钠溶液中煮沸60min，过滤除去不溶的丝素蛋白和其他不溶物；
将滤液装入截留分子量为8000-14000Da的纤维素透析袋，纯水中透析三天除去离子盐，冷冻干燥得到丝胶蛋白。
实施例1：
1)称取0.5g丝胶蛋白，0.2g维生素B12加入到丁烯氧化物溶液中，同时加入0.2gCDI及0.02g DMPA对进行双重活化，室温下搅拌反应4小时，完成温和条件下二者的羟氨基化反应及酯化反应，冷冻干燥得到维生素B12靶向型丝胶蛋白(Cobalamin-Sericin)；
2)在惰性气体保护下，将2g谷氨酸单体溶于无水四氢呋喃中，加入1.4g三聚光气，55℃下反应1h，冷却至室温，减压蒸馏除去四氢呋喃，将得到的油溶物溶解于100ml乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，分出有机相，干燥，减压蒸馏除去溶剂，得到α-氨基酸-N-羧基环内酸酐；
3)将0.5g维生素B12靶向型丝胶蛋白和0.5gα-氨基酸-N-羧基环内酸酐混合溶解在的DMSO中，25℃反应48-96小时后得到维生素B12靶向型丝胶蛋白纳米胶束(Cobalamin-Sericin nanos)；
4)加入西地那非0.2g，搅拌1h，然后在磁力搅拌下将其滴入去离子水，将混合溶液装入截留分子量为3500的透析袋中，在25℃下用去离子水透析24h，经0.45μm的针式过滤器过滤，得到Cobalamin-Sericin-Sildenafil nanos药物。
对获得的维生素B12靶向型丝胶蛋白纳米胶束进行粒径、zeta电位、电镜检测，见图1。
实施例2
1)将人源性胃正常上皮细胞(GES-1)消化重悬后细胞浓度调整为2×104/L，在96孔培养板内每孔加入培养液体积为200μL；
2)待细胞贴壁后分别加入不同浓度梯度的Sericin或Cobalamin-Sericin(即丝胶蛋白胶束)；
3)加药后的24h，在各组孔内加入20μL MTT工作液(5g/L)，继续37℃孵育2h；
4)吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200μL，置平板摇床震荡至结晶完全溶解后，酶标仪测定490nm波长各孔的吸光度(A)值。
实验重复3次。结果如图2所示。
图2的MTT图中，不同浓度Sericin或Cobalamin-Sericin对正常胃上皮的毒性影响，不同浓度下胃上皮细胞的存活率均高于75％。这提示Cobalamin-Sericin蛋白胶束的低毒性。
实施例3
1)将实施例1中的Cobalamin-Sericin nanos负载Sildenafil的同时加入FITC荧光剂，进而合成FITC标记的Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos；
2)在共聚焦皿中培养人源性胃癌细胞(AGS)至70-80％的密度，加入Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos或者Cobalamin+Cobalamin-Sericin@Sildenafilnanos孵育，利用共聚焦显微镜观察维生素B12靶向型西地那非纳米药物在细胞内的积聚能力。
结果如图3所示。图3的共聚焦图证明，相对Sericin-Sildenafil nanos，胃癌细胞对Cobalamin-Sericin-Sildenafil nanos的吸收效应更加明显。这提示基于维生素B12受体吸收通路可进一步增加肿瘤细胞对维生素B12靶向型西地那非纳米药物的吸收。
实施例4
1)将人源性胃癌细胞(AGS)消化、重悬后细胞浓度调整为2×104/L，在96孔培养板内每孔加入培养液体积为200μL；
2)待细胞贴壁后分别加入不同浓度梯度的Sildenafil、Sericin@Sildenafilnanos、Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos、Cobalamin+Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos；
3)加药后的24h，在各组孔内加入20μL MTT工作液(5g/L)，继续37℃孵育2h；
4)吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200μL，置平板摇床震荡至结晶完全溶解后，酶标仪测定490nm波长各孔的吸光度(A)值。
实验重复3次。结果如图4所示。图4指的是胃癌细胞在相同Sildenafil浓度的条件下，细胞存活率为：Sildenafil组＞Sericin@Sildenafil nanos＞Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos。而在Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos内加入游离Cobalamin，形成竞争性拮抗后，该组细胞存活率再次升高。这提示基于维生素B12受体吸收通路可进一步增加肿瘤细胞对维生素B12靶向型西地那非纳米药物的吸收，进而抑制胃癌细胞增殖。
实施例5
使用细胞量为1×106的鼠源性胃癌细胞(MFC)对4周龄的Balb/c雌鼠进行皮下荷瘤，成瘤后予生理盐水(Saline)，Cobalamin-Sericin,Sildenafil,Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos，A-PD-1，A-PD-1+Sildenafil,A-PD-1+Cobalamin-Sericin，A-PD-1+Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos行尾静脉注射，2天/次，药物剂量：Cobalamin-Sericin 50ug/g，Cobalamin-Sericin-Sildenafil nanos 60ug/g，A-PD-1 3ug/g。治疗2周后处死小鼠，对肿瘤大小、重量进行测量。结果如图5。
图5显示，在小鼠体内成瘤实验中，相对于空白对照组，Sildenafil、Cobalamin-Sericin、Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos三个组小鼠的肿瘤体积及肿瘤重量无明显差异，A-PD-1，A-PD-1+Cobalamin-Sericin，A-PD-1+Sildenafil，A-PD-1+Cobalamin-Serocom@Sildenafil nanos能缩小肿瘤体积。这提示维生素B12靶向型西地那非纳米药物能增敏免疫治疗，增加A-PD-1对肿瘤的杀伤作用。
提取小鼠肿瘤组织，用PBS冲洗3次后，置于冰上进行匀浆，加入适量完全提取缓冲液(60ul/mg)，将匀浆物以5000g离心5分钟，取上清液。按cGMP免疫酶联吸附试剂盒的使用说明，按顺序加入工作液A、B孵育后，加入上清液，最后使用酶标仪于450nm波长下测量各孔OD值。测量炎症因子(IL-1B,IL-8、IFN-γ)方法基本同上。最终结果见图6。
图6显示，在不同的处理条件下，小鼠肿瘤内cGMP及炎症因子含量的变化。相对于空白对照组，Cobalamin-Sericin组的肿瘤组织中，cGMP及炎症因子(IL-1B,IL-8、IFN-γ)的浓度无显著变化，在Sildenafil，Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos两个组中，cGMP及炎症因子(IL-1B,IL-8、IFN-γ)的浓度显著下降。这提示维生素B12靶向型西地那非纳米药物能上调c-GMP浓度，激活c-GMP/PKG通路，减少肿瘤中炎症因子含量(IL-1B、IL-8、IFN-γ)。
将各组的小鼠肿瘤经PBS冲洗3次后于冰上剪碎，100um滤网过滤，使用胰酶、分散酶(10×)制备单细胞悬液。取部分单细胞悬液，使用流式细胞学检测各组单细胞悬液中MDSCs细胞比例。取部分单细胞悬液，使用磁珠分选技术，将分选得到的MDSCs细胞，进行二氨基荧光素-2-双乙酸盐染色，检测各组MDSCs中NO含量；将单细胞悬液与ARG-1单克隆抗体4度条件下孵育20分钟，行流式细胞学检测，检测各组MDSCs中表达ARG-1的细胞比例。结果见图7。
图7显示，经不同药物处理后，不同组别肿瘤内MDSCs数量及ARG-1表达量、NO含量变化。相对于空白对照组，Cobalamin-Sericin组的MDSCs细胞含量及MDSCs细胞的ARG-1表达量、NO含量无明显差异；Sildenafil及Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos两组肿瘤组织中的MDSCs细胞含量及MDSCs细胞的ARG-1表达量、NO含量显著下降，这提示维生素B12靶向型西地那非纳米药物能有效减少MDSCs数量，同时抑制MDSCs的精氨酸酶1(AG1)表达和一氧化氮(NO)的产生。
获得各组小鼠的肿瘤组织，经PBS冲洗3次后于冰上剪碎，100um滤网过滤，使用胰酶、分散酶(10×)制备单细胞悬液，将单细胞悬液与anti-CD3-cy5.5和anti-CD4-FITC流式抗体共孵育，用流式细胞术测定肿瘤组织中CD4+T细胞的含量；与anti-CD3-cy5.5和anti-CD8-PE流式抗体共孵育，用流式细胞术测定肿瘤组织中CD8+T细胞的含量。将上述分离的两组细胞(CD3+CD4+，CD3+CD8+)与TCRζ-chain流式抗体共孵育，用流式细胞术测定肿瘤组织中不同T细胞组的ζ链表达量。结果见图8。
图8显示经不同药物处理后，对T细胞功能影响。从各组小鼠肿瘤中利用流式细胞仪分析CD3+CD4+及CD3+CD8+T细胞的数量，及各自的ζ链表达量。相比空白对照组，Cobalamin-Sericin组的T细胞数量无明显差异，T细胞的ζ链表达无明显差异。Sildenafil及Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos两组中，T细胞增殖较空白对照组明显增加，T细胞的ζ链表达上调。这提示维生素B12靶向型西地那非纳米药物能有效增加肿瘤中T细胞数量，并恢复T细胞抗肿瘤功能。
实施例6
(1)体外培养AGS细胞至70～80％密度，加入TNF-α(10μg/ml)37度孵育5小时，加入分别加入PBS，10nM的Sildenafil,Cobalamin-Sericin以及Cobalamin-Sericin@Sildenafil nanos，37℃孵育1小时后取上清，使用IL-8免疫酶联吸附试剂盒进行测定，结果见图9。
图9显示在不同药物的刺激下，对IFN-α促IL-8分泌的影响。相对于空白对照组，IFN-α能有效促进肿瘤细胞分泌IL-8，在Sildenafil，Cobalamin-Sericin-Sildenafilnanos两组中，IFN-α介导的促肿瘤细胞IL-8分泌作用被显著抑制。这提示维生素B12靶向型西地那非纳米药物能有效抑制肿瘤细胞释放炎症因子(IL-8)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种VB12靶向型西地那非纳米药物的合成方法，包括：
1)维生素B12靶向型丝胶蛋白的制备：将0.5g丝胶蛋白与0.2g维生素B12混合于无水溶剂A中，加入CDI和DMAP催化，15～40℃反应制备维生素B12靶向型丝胶蛋白，所述无水溶剂A选自丁烯氧化物溶液；
2)维生素B12靶向型西地那非纳米药物的制备：
a)将得到的0.5g维生素B12靶向型丝胶蛋白与0.5g α-氨基酸-N-羧基环内酸酐混合溶解在的无水溶剂B中，充分反应；
b)加入0.2g西地那非，充分反应后将混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析，得到所述维生素B12靶向型西地那非纳米药物。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：维生素B12与CDI的摩尔投料比为1：(5～10)。
3.根据权利要求1~2任一项所述的合成方法，其特征在于：维生素B12与DMAP的摩尔投料比为1：(0.1～0.2)。
4.根据权利要求1~2任一项所述的合成方法，其特征在于：所述透析袋的截留分子量为3500KD。
5.根据权利要求1~2任一项所述的合成方法，其特征在于：所述无水溶剂B选自DMSO、二甲基乙酰胺。
6.根据权利要求1~2任一项所述的合成方法，其特征在于：所述透析的时间为12～36h。
7.根据权利要求1~2任一项所述的合成方法，其特征在于：维生素B12靶向型丝胶蛋白与α-氨基酸-N-羧基环内酸酐反应的时间不短于48h。
8.如权利要求1～7任一项所述的合成方法制备得到的VB12靶向型西地那非纳米药物。
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