CN111067865B - 一种tpgs2000-dox纳米胶束及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物制造领域，具体涉及一种TPGS2000‑DOX纳米胶束及其制备方法。本发明提供的TPGS2000‑DOX纳米胶束是一种阿霉素前药胶束，是采用聚乙二醇2000与维生素E琥珀酸酯为原料，合成聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯(TPGS2000)，然后TPGS2000与丁二酸酐合成羧基TPGS2000(CTPGS2000)，CTPGS2000与阿霉素(DOX)合成TPGS2000‑DOX偶联物，然后，TPGS2000‑DOX偶联物与Solutol HS15通过薄膜分散的方法制备得到纳米胶束。所述纳米胶束能够改变DOX在大鼠体内的组织分布、高效靶向于肿瘤部位，同时逆转肿瘤对DOX的多药耐药性，从而达到增强疗效、减少DOX毒副作用的目的。

Description

一种TPGS2000-DOX纳米胶束及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物制造领域，具体涉及一种TPGS2000-DOX纳米胶束及其制备方法。
背景技术
癌症严重威胁着人类的生命健康，如今癌症在全世界已成为引发死亡的主要诱因。每年全球大约有700万人因患癌症而死亡，研究者们为治疗这一重大疾病付出了极大的努力。截止目前为止，针对癌症的治疗方法有多种，比如手术、化疗、生物疗法、光疗、放射治疗等。其中化疗因其高效性而成为治疗肿瘤(癌症即为恶性肿瘤)的重要方式，但是会因为诸如化疗小分子药物进入体内因血液/肾清除率过高而会被机体快速代谢，非特异性的细胞毒性、组织分布较差等因素难以在肿瘤部位聚集，且选择性差，会对正常组织造成损失，导致不良反应的产生，而且长期服用还容易引发肿瘤的多药耐药，这些因素严重限制了化疗药物在临床上的使用。肿瘤的多药耐药以及化疗所带来的的不良反应是当前亟待解决的一大难题。
阿霉素作为蒽环类抗生素中的一员，具备较强的抗肿瘤活性。但因其组织分布较差，毒副作用较大，并且长期服用易导致多药耐药性等影响其药效的发挥，这些不良因素严重限制了其临床的应用。
聚合物胶束作为纳米载药系统中的一员，近年来备受关注，与其他的载体比较，它表现出明显的优势：(1)临界胶束浓度低，抗血液稀释性强；(2)粒径小，分布范围窄，可以利用ERP效应(实体瘤的高通透性和滞留性效应)达到被动靶向；(3)具备特殊的核壳结构，亲水性外壳可避免RES(网状内皮系统)的识别实现长循环，疏水性药物进入内核能够增加药物溶解度的同时降低毒副作用；(4)表面有修饰功能性配体，达到主动靶向作用。基于此，前药胶束的研究也层出不穷。
TPGS2000由亲水性聚乙二醇(PEG2000)以及亲酯性维生素E琥珀酸酯(VES)组成。PEG长链可以增加药物在体内的循环时间，避免小分子药物与血液中的成分相互作用。VES能够通过活氧簇(ROS)来诱导细胞凋亡，由于肿瘤细胞内pH比正常细胞低，这就使得VES可以选择性的抑制肿瘤细胞而对正常组织无不良作用。有研究显示TPGS对线粒体有一定的抑制作用，可以减缓其呼吸速率以及ATP的产生，从而使其具备抑制P糖蛋白(P-gp)的作用。
发明内容
本发明的目的在于为了解决现有技术问题的不足，本发明提供一种TPGS2000-DOX纳米胶束及其制备方法。TPGS2000-DOX纳米胶束是一种阿霉素前药胶束，首先将TPGS2000与阿霉素合成TPGS2000-DOX做为前药，然后制备为纳米胶束，利用其特殊的结构通过被动靶向作用提高药物在肿瘤组织的分布，降低其对心脏及其他器官毒性的作用，并借助TPGS2000的作用逆转阿霉素肿瘤多药耐药性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明提供了一种TPGS2000-DOX纳米胶束，所述胶束通过以下方法制备得到：首先合成TPGS2000-DOX偶联物：采用聚乙二醇2000(PEG2000)与维生素E琥珀酸酯(VES)为原料，合成聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯(TPGS2000)，然后由TPGS2000与丁二酸酐合成羧基TPGS2000(CTPGS2000)，CTPGS2000与阿霉素(DOX)合成TPGS2000-DOX偶联物；然后，TPGS2000-DOX偶联物与Solutol HS15通过薄膜分散的方法制备得到TPGS2000-DOX纳米胶束，所述TPGS2000-DOX偶联物结构通式为I所示。
Figure BDA0002260385490000021
本发明提供了一种TPGS2000-DOX纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)TPGS2000的制备：用溶剂将一定量VES溶解后加入EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和DMAP(4-二甲氨基吡啶)，保护气氛下在冰浴条件下搅拌1h后，加入PEG2000(聚乙二醇2000)，升温至30℃后继续搅拌反应48h，反应结束后经过后处理得到TPGS2000粗品；
(2)CTPGS2000的制备：用溶剂1将一定量步骤(1)制备的TPGS2000粗品和SA(丁二酸酐)溶解后，加入DMAP和催化量的三滴TEA(三乙胺)，保护气氛下在室温下搅拌反应24h，反应结束后，将除去溶剂的反应液溶解于溶剂2中，过滤除去未参与反应的SA后将滤液滴加至溶剂3中，于-20℃冰箱中沉淀过夜，离心后收集沉淀，干燥后得到CTPGS2000粗品，纯化后得到CTPGS2000纯品；
(3)TPGS2000-DOX偶联物的制备：用溶剂将一定量步骤(2)制备的CTPGS2000溶解后，加入EDCI和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，保护气氛下，在冰浴条件下避光反应12h，得到反应液1；将一定量的DOX·HCl溶于上述溶剂中，加入200μL TEA，保护气氛下，室温下避光搅拌反应1h，使DOX完全脱盐，得到反应液2，将反应液2加入到反应液1中，保护气氛下，继续于室温下避光反应48h；反应结束后将所得的料液在上述溶剂中进行透析，每间隔一定时间更换透析外液，透析至外液不再变红为止，然后再更换蒸馏水作为透析外液继续透析24h以除去溶剂，每间隔一定时间更换透析外液，然后将透析袋内液冷冻干燥即得TPGS2000-DOX偶联物；
(4)TPGS2000-DOX纳米胶束的制备：将一定量的Solutol HS 15在35～50℃下加热成熔融状态，加入TPGS2000-DOX偶联物用溶剂溶解后的溶液，再加入一定量所述溶剂使两者混合均匀，除去溶剂后得到干燥的含药薄膜；将含药薄膜加入预热至60℃的纯化水中，在60℃搅拌至少1h，离心，上清液经过滤后得到澄清的载药胶束溶液；
其中TPGS2000-DOX偶联物的合成路线如图1所示。
优选的，本发明中所述的保护气氛为常见的惰性气氛，包括氮气和氩气。
优选的，步骤(1)中所述的溶剂为有机溶剂，更优选为DCM(二氯甲烷)。
优选的，步骤(1)中所述的VES、EDCI、DMAP和PEG2000的质量比为5.3:3.8:1.2:20。
优选的，步骤(1)中所述的后处理为常规后处理操作，包括萃取、干燥、抽滤、浓缩和重结晶；更优选的，所述萃取操作为将反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液，水，2mM稀盐酸溶液，饱和氯化钠溶液各萃取三次；所述干燥操作为将萃取后的有机层溶液用无水硫酸钠干燥3h；所述浓缩操作为将干燥并过滤后的滤液与旋转蒸发仪上除去有机溶剂；所述重结晶操作为将除去有机溶剂后得到的淡黄色油状液体滴加至预冷的冰乙醚中重结晶，并于4℃冰箱中放置24h后离心后收集沉淀物，40℃真空干燥。
优选的，步骤(2)中所述的溶剂1为有机溶剂，更优选为无水的1,4-二氧六环；所述的溶剂2为有机溶剂，更优选为无水二氯甲烷；所述的溶剂3为有机溶剂，更优选为无水乙醚。
优选的，步骤(2)中所述的过滤为0.45μm微孔滤膜过滤除去未参与反应的SA。
优选的，步骤(2)中所述的离心后的沉淀用冰乙醚洗涤3次。
优选的，步骤(2)中所述的干燥方式为40℃真空干燥。
优选的，步骤(2)中所述的TPGS2000粗品、SA和DMAP的质量比为15:2.4:0.72。
优选的，步骤(2)所得的CTPGS2000经纯化后使用，所述纯化操作为柱层析法，洗脱剂为甲醇/水；更优选的，具体纯化操作为将一定量CGTPS2000粗品用甲醇溶解后，加入适量RP-18(十八烷基键合的反相硅胶)混匀，减压旋蒸除去有机溶剂即得到含CTPGS2000的RP-18粉末，采取反向柱进行分离，以甲醇:水＝17:20→16:20梯度洗脱，以氯仿:甲醇:甲酸＝7:1:0.1为展开剂，TLC监测分离情况，收集产物减压旋蒸，真空干燥24h得淡黄色蜡状固体。
优选的，步骤(3)中所述的溶剂为有机溶剂，更优选为N,N-二甲基甲酰胺。
优选的，步骤(3)中所述的CTPGS2000、EDCI、NHS和DOX·HCl的质量比为1:0.46:0.27:0.24。
优选的，步骤(4)中所述的溶解TPGS2000-DOX偶联物的溶剂为乙醇。
优选的，步骤(4)中TPGS2000-DOX偶联物与Solutol HS 15的质量比为6：(110-120)。
优选的，步骤(4)中所述的除去溶剂的操作为旋转蒸发除去溶剂，更优选为在旋蒸后，置于氮吹仪上氮吹30min除去残留溶剂。
优选的，步骤(4)中所述的离心速率为10000r/min，离心时间为10min。
优选的，步骤(4)中所述的过滤为经0.22μm的醋酸纤维素酯膜过滤。
本发明的有益效果是：
(1)本发明所述的TPGS2000-DOX纳米胶束是采用自合成的TPGS2000与DOX形成前药TPGS2000-DOX偶联物，再与Solutol HS15组合成混合纳米胶束，该纳米胶束具有很强的耐稀释性，可在血液中稳定存在，从而保证其可通过EPR效应，大部分以胶束的形态到达肿瘤部位。
(2)本发明所述的TPGS2000-DOX纳米胶束所测粒径为(24.90±0.72)nm，体内小动物活体成像结果显示TPGS2000-DOX纳米胶束可以有效的聚集于肿瘤部位，给药4h后荧光强度最强。24h后，主要集中于肿瘤部位，其他器官中并未检测到荧光，证实了该胶束可以高效靶向于肿瘤部位。
(3)本发明所述的TPGS2000-DOX纳米胶束组对人乳腺癌阿霉素耐药细胞MCF-7/ADR的细胞毒性相显著高于DOX；作用于MCF-7/ADR细胞4h后，TPGS2000-DOX组的荧光强度继续增强，比DOX组高，这说明GS2000-DOX纳米胶束可以绕开P-gp的识别，顺利进入胞内，不被外排；此外，激光共聚焦显微镜显示在MCF-7/ADR中，可以明显观察到DOX被外排于细胞膜上，而TPGS2000-DOX仍然可以位于细胞质中。研究结果均证明TPGS2000-DOX胶束可逆转肿瘤对DOX的多药耐药性。
因此，本发明所述的阿霉素前药胶束TPGS2000-DOX纳米胶束具有改变DOX在体内的组织分布、逆转肿瘤对DOX的多药耐药性的作用，从而能够增强疗效，减少DOX的毒副作用。
附图说明
图1为TPGS2000-DOX偶联物的合成路线；
图2为DOX的1H-NMR图谱；
图3为TPGS2000-DOX偶联物的1H-NMR图谱；
图4为CTPGS2000的IR图谱；
图5为TPGS2000-DOX偶联物的IR图谱；
图6为TPGS2000-DOX纳米胶束的透射电镜图；
图7为DOX原料药、偶联物、胶束以及空白载体对A549的细胞毒性作用；
图8为DOX原料药、偶联物、胶束以及空白载体对MCF-7的细胞毒性作用；
图9为DOX原料药、偶联物、胶束以及空白载体对MCF-7/ADR的细胞毒性作用；
图10为流式细胞仪检测DOX、TPGS2000-DOX纳米胶束在MCF-7(A)以及MCF-7/ADR(B)的荧光强度。
具体实施方式
下面结合附图，并通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1TPGS2000-DOX纳米胶束的制备
(1)TPGS2000的制备：称取VES 5.3g于500mL的干燥的圆底烧瓶中，用100mL的DCM溶解后加入3.8g EDCI和1.2g DMAP，氮气保护，并在冰浴条件下磁力搅拌1h。然后再加入20g的PEG2000，之后升温并于30℃氮气保护下磁力搅拌反应48h。反应过程通过薄层层析(TLC)检测，展开剂为氯仿/甲醇(9:1)。反应结束后，将反应液依次用饱和碳酸氢钠溶液，水，2mM稀盐酸溶液，饱和氯化钠溶液各萃取三次，最后有机层溶液用无水硫酸钠干燥3h，抽滤，滤液于旋转蒸发仪上除去有机溶剂，得到淡黄色油状液体。然后将油状液体滴加至预冷的冰乙醚中重结晶，并于4℃冰箱中放置24h，使得结晶完全。离心后收集沉淀物，40℃真空干燥，即可得到白色蜡状固体TPGS2000的粗品。
(2)CTPGS2000的制备：称取上述制备得到的TPGS2000粗品15g于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入SA 2.4g，然后加入30mL无水1,4-二氧六环溶液，充分溶解后加入0.72g DMAP并且滴加3滴TEA，氮气保护并于室温下磁力搅拌反应24h。TLC监测反应进程，反应结束后，将反应液置于旋转蒸发仪上旋蒸除去有机溶剂，得到淡黄色油状液体。将该液体溶解于5mL预冷的无水DCM中，0.45μm微孔滤膜过滤除去未参与反应的SA，然后将滤液滴加至100mL的无水乙醚中，放置于-20℃冰箱中沉淀过夜，离心后收集沉淀并用冰乙醚洗涤3次，40℃真空干燥后即得TPGS2000-DOX偶联物粗品。
CTPGS2000的纯化：称取一定量粗品用甲醇溶解后，加入适量RP-18混匀，减压旋蒸除去有机溶剂即得到含TPGS2000-DOX偶联物的RP-18粉末，采取反向柱进行分离，以甲醇:水＝17:20→16:20梯度洗脱，以氯仿:甲醇:甲酸＝7:1:0.1为展开剂，TLC监测分离情况。收集产物减压旋蒸，真空干燥24h得淡黄色蜡状固体，即为纯CTPGS2000。
(3)TPGS2000-DOX偶联物的合成：称取1g CTPGS2000溶解于60mL DMF溶液中，然后加入457.2mg EDCI和268.8mg NHS，氮气保护，冰水浴条件下避光反应12h，得到反应液1。将236mg的DOX·HCl溶于65mL的DMF中，加入200μL三乙胺，氮气保护，室温下避光搅拌反应1h，使阿霉素完全脱盐，得到反应液2，将反应液2加入到反应液1中，氮气保护，继续于室温下避光反应48h。反应结束后将所得的料液在DMF溶液中进行透析，每隔一定的时间更换透析外液直到外液不再变红为止。此时再更换蒸馏水作为透析外液继续透析24h以除去DMF溶液，每间隔一定时间更换透析外液，后将透析袋内液冷冻干燥即得红色粉末721mg，为TPGS2000-DOX偶联物。
(4)TPGS2000-DOX偶联物验证：偶联物通过核磁、红外、质谱确证：
与阿霉素(DOX)1H-NMR数据(图2)进行比对后，发现合成的TPGS2000-DOX偶联物的1H-NMR数据(图3)存在部分阿霉素特征信号，分别是δH 7.90(d,2H),7.64(d,1H),5.50(s,1H),3.99(s,H)。此外，合成的TPGS2000-DOX偶联物还有PEG的特征峰δH 3.51(brs,176H,OCH2CH2O)，这说明阿霉素已经成功键合于聚合物上；
CTPGS2000与TPGS2000-DOX偶联物的IR图谱如图4和图5所示，将两者的IR图谱进行比较发现，TPGS2000-DOX的IR在1654.1cm-1、1577.4cm-1处出现了明显的吸收峰，说明该偶联物中含有酰胺结构，阿霉素与CTPGS2000发生了酰胺反应形成了TPGS2000-DOX；
此外，高分辨质谱图测得TPGS2000-DOX偶联物的分子量分布在m/z2400～3800之间，平均相对分子质量大约为3131.1868。而CTPGS2000的平均相对分子质量大约为2650.2341，DOX相对分子质量为542，则根据化学反应式推算，TPGS2000-DOX偶联物的分子量应该为2650(CTPGS的平均相对分子质量)+542(阿霉素的相对分子质量)-18(H2O的相对分子质量)±44x(x为PEG中-CH2CH2-的单元结构数量)，理论结果显示TPGS2000-DOX偶联物的平均相对分子质量为3174.2341±44x，MALDI-TOF-TOF的结果为3131.1868，完全与理论值相符，证明偶联成功。
(5)TPGS2000-DOX纳米胶束的制备：利用薄膜分散法制备阿霉素前药混合纳米胶束，精密称取110mg的Solutol HS 15，于40℃下加热使其成熔融状态，然后加入1mL的TPGS2000-DOX乙醇溶液(6mg/mL)，再加入2mL的乙醇使两者混合均匀，旋转蒸发除去有机溶剂，并置于氮吹仪上氮吹30min除去残留溶剂，得到干燥的含药薄膜。加入预热至60℃的纯化水2mL，置于60℃下磁力搅拌1h，10000r/min离心10min，上清液经0.22μm的醋酸纤维素酯膜过滤，即可得到澄清的载药胶束溶液。利用纳米粒度仪测得胶束在水溶液中的粒径大小为(24.90±0.72)nm，PI值为0.259。采用透射电镜观察胶束的形态如图6所示，可以看出胶束呈现球形，表面光滑，粒径大小均一，分散性较好。
实施例2TPGS2000-DOX纳米胶束的制备
制备TPGS2000-DOX纳米胶束时，在35℃下加热Solutol HS 15至熔融状态；TPGS2000-DOX偶联物与Solutol HS 15的质量比为6：115；将预热的含药薄膜置于60℃下磁力搅拌1.5h。其余操作同实施例1。
实施例3TPGS2000-DOX纳米胶束的制备
制备TPGS2000-DOX纳米胶束时，在50℃下加热Solutol HS 15至熔融状态；TPGS2000-DOX偶联物与Solutol HS 15的质量比为6：120；将预热的含药薄膜置于60℃下磁力搅拌2h。其余操作同实施例1。
实施例4TPGS2000-DOX纳米胶束体外抗肿瘤活性的研究
以肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7以及耐DOX乳腺癌细胞MCF-7/ADR为细胞模型，评价合成的载体材料的抗肿瘤效果，并且研究DOX前药胶束对这三种细胞的细胞毒性以及摄取情况。
细胞的培养：A549、MCF-7接种于直径为10cm的培养皿中，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃，5％CO2(相对湿度为90％)的二氧化碳培养箱中培养。为了确保耐药株细胞MCF-7/ADR的耐药性，在培养过程中需逐级增加DOX浓度，直至终浓度为1000ug/mL，试验前两周停药。
细胞毒性试验：
(1)空白载体以及不同处方含DOX药物浓度的配制
精密称取TPGS2000-DOX纳米胶束冻干粉、DOX原料药(DOX-Sol)用纯化水溶解后配制成1mg/mL(以DOX含量计算)的溶液，通过0.22μm的无菌滤膜过滤。用RPMI-1640培养液稀释至含DOX浓度为40、20、10、2、0.2、0.02μg/mL，用于MCF-7细胞以及A549细胞的毒性试验；用RPMI-1640培养液稀释上述DOX制剂，使得含DOX浓度为160、80、40、20，4、0.4、0.04μg/mL用于MCF-7/ADR细胞的毒性试验。其中TPGS2000-DOX偶联物用DMSO溶解，然后用RPMI-1640培养液配制成与上述DOX浓度含量相同的混悬液，空白载体加入量与前药胶束中所含载体量保持一致，分别作用于以上三种细胞。
(2)MTT试验
取对数生长期的细胞用胰酶消化直至细胞变圆，加入完全培养基终止消化。用枪头吹打细胞使之完全脱落并置于离心机上以1000r/min离心5min，去掉上清液加入适量新鲜完全培养液吹打使其成为均匀的细胞混悬液。并用血球细胞计数板计数，用完全培养液稀释至密度为5×104cell/mL的细胞混悬液，吹匀后取100μL接种于96孔板中，置于培养箱中培养过夜使其贴壁。
按照(1)中设定浓度每孔加入100μL的含药培养液，每个浓度设定5个复孔，同时设定3个空白孔以及3个对照孔，继续培养48h后取出孔板。每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，置于培养箱中继续培养4小时后吸走上清液并将孔板倒扣于滤纸上吸干残留溶剂。每孔加入150μL DMSO并于水平震荡器中震荡十分钟，使紫色结晶物完全溶解。用酶标仪在490nm波长下测定吸光度，计算细胞抑制率，绘制细胞存活率柱状图。
DOX-Sol、TPGS2000-DOX偶联物、TPGS2000-DOX纳米胶束以及空白载体在不同浓度下与A549、MCF-7、MCF-7/ADR细胞孵育48小时后的细胞存活率如图7、8、9所示，各物质的IC50值如表1所示。结果显示，以上药物以及载体对这三株细胞均具有一定的抑制作用。
对于敏感株细胞A549以及MCF-7而言，在浓度为5-20μg/mL(以DOX含量计算)时，TPGS2000-DOX纳米胶束表现出比原料药更高的细胞毒性。尽管在此范围内，载体材料也表现出明显的抑制作用(相对于胶束略弱)，但是当浓度为1μg/mL时，空白载体的抑制作用迅速减弱，仅为15％左右，而纳米胶束仍然表现出较高的抑制率。这说明在较高浓度下，TPGS2000-DOX纳米胶束中的药物可以和载体协同抗肿瘤，即使在较低浓度下，载体已无明显毒性，TPGS2000-DOX纳米胶束仍然具备一定的抗肿瘤活性。
图中结果还显示TPGS2000-DOX偶联物的细胞毒性较弱，这是因为偶联物是以混悬液的形式给药，大部分沉积于孔板中，难以进入肿瘤细胞内，只能在细胞外缓慢释放原药发挥作用。
分析各物质的IC50值，结果表明TPGS2000-DOX纳米胶束的细胞毒性弱于原药，其原因可能为：(1)胶束采用内吞的方式进入细胞，比被动扩散的入胞效率低。(2)采用键合的方式载药，在体内释放药物的速率也比较慢。对于耐药株MCF-7/ADR而言，其对DOX的耐受程度非常明显，即使DOX原药浓度高达80μg/mL，细胞存活率仍接近50％。但在相同浓度条件下，TPGS2000-DOX纳米胶束表现出比原药更好的细胞毒性。偶联物的抗肿瘤效果同敏感株相比，其作用明显降低。推测可能是由于偶联物在胞外缓慢释放出的原药，因耐药株表面P-gp的抑制作用将药物泵出了胞外，使得药效进一步降低。
表1 DOX原料药、偶联物、胶束以及空白载体对A549、MCF-7、MCF-7/ADR细胞的IC50值
Figure BDA0002260385490000101
利用GraphPad Prism5.0软件计算各物质的IC50值，并通过耐药指数(ResistantIndex，RI)来评价所制备制剂以及药物的多药耐药性。通过逆转耐药因子(Reversalfactor,RF)来评价纳米胶束逆转肿瘤多药耐药的程度。PGS2000-DOX纳米胶束逆转肿瘤多药耐药性结果如表2所示。与DOX-Sol进行比较，TPGS2000-DOX纳米胶束对MCF-7/ADR的逆转耐药因子为35.76，说明该胶束有较好的逆转肿瘤多药耐药的作用。
表2 TPGS2000-DOX纳米胶束对MCF-7/ADR细胞的耐药指数和逆转耐药因子
Figure BDA0002260385490000111
细胞摄取实验
(1)流式细胞仪测定在MCF-7以及MCF-7/ADR细胞摄取
取对数生长期的MCF-7、MCF-7/ADR细胞，胰酶消化后用RPMI1640完全培养液制备成细胞混悬液。将两种细胞以2×105个/孔的密度接种于6孔板中，让细胞贴壁过夜后弃去培养液，用无血清的RPIM1640洗涤三次，置于37℃培养箱中培养30min。吸走培养液，按2μg/mL MCF-7、4μg/mL MCF-7/ADR的DOX当量浓度加入DOX溶液以及纳米胶束溶液，每个浓度平行三份。另取三个孔不加药物，作为阴性对照，分别孵育1、4h。孵育结束后吸走药液，加入4℃遇冷的PBS终止细胞摄取，用PBS润洗2-3次。然后每孔加入300μL胰酶消化，用含10％血清的培养液终止消化并将细胞吹打均匀转移至离心管中，1200r/min离心5min，弃去上清液。加入300μL冰的PBS把细胞重悬，上机检测，FL2通道下收集信号，测定10000个细胞中DOX的摄取量(DOX激发波长486nm，发射波长593nm)。
DOX原料药、TPGS2000-DOX纳米胶束在MCF-7以及MCF-7/ADR荧光强度结果如图6所示，DOX组表现出的荧光强度约为纳米胶束组的1.2倍，仍然比之前所测的1.8倍低，所以根据以上分析，在MCF-7细胞中，药物作用4h后，TPGS2000-DOX纳米胶束的摄取量比DOX组更高。
这说明由于P-gp的抑制作用，DOX被外排，使得其在胞内的荧光强度减弱，而TPGS2000-DOX纳米胶束可以绕开P-gp的识别，顺利进入胞内，说明制备的TPGS2000-DOX纳米胶束可以逆转肿瘤的多药耐药性。
(2)激光共聚焦显微镜观察DOX-Sol、TPGS2000-DOX纳米胶束在肿瘤亚细胞器中的分布情况
盖玻片用75％乙醇洗净，放于6孔板中，于紫外灯下照射进行消毒处理。取生长状况良好的MCF-7以及MCF-7/ADR细胞，以3×105个/孔的密度接种于上述6孔板中，培养箱孵育过夜使其贴壁。用无血清RPMI1640培养液洗涤2次，放回培养箱使其稳定30min。弃掉培养液，加入5μg/mL含DOX当量浓度的原药溶液以及TPGS2000-DOX纳米胶束溶液，分别培养1、4h后弃掉培养液。用4℃PBS缓冲液终止摄取并润洗2～3次，加入50μL 500ng/mL的DAPI染料，37℃染色5min。染色结束后用4℃PBS清洗3遍，用4％的多聚甲醛固定20min，吸走固定液，甘油封片，于激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察。
DOX、TPGS2000-DOX纳米胶束在MCF-7肿瘤细胞亚细胞器中的分布结果显示，加药1h后，DOX布满整个细胞但主要位于细胞核中。而TPGS2000-DOX纳米胶束主要位于肿瘤细胞的细胞质。加药4h后，DOX主要分布于肿瘤细胞细胞核中。TPGS2000-DOX纳米胶束主要分布于细胞质中。
DOX、TPGS2000-DOX纳米胶束在MCF-7/ADR肿瘤细胞亚细胞器中的分布结果显示，加药1h后，DOX主要位于细胞膜上，并未进入胞内。而TPGS2000-DOX纳米胶束进入肿瘤细胞后主要位于细胞质中，未被P-gp识别排出胞外。加药4h后，DOX更多的被排出胞外，TPGS2000-DOX纳米胶束仍然能顺利进入胞内，且主要位于细胞质中。结果表明TPGS2000-DOX纳米胶束能有效地逆转肿瘤的多药耐药，避免P-gp外排。
实施例5TPGS2000-DOX纳米胶束体内组织分布的研究。
纳米胶束的粒径范围一般为1～100nm，可以利用ERP效应达到被动靶向的作用。本实验主要利用DOX自身具备荧光这一特点，采用小鼠活体成像技术，对该胶束在荷瘤小鼠体内的组织分布进行进一步的研究，以此证明其靶向性。
荷瘤小鼠肿瘤模型的建立：取对数生长期的MCF-7细胞，用胰酶消化后，置于低速离心机上离心(1000r/min，5min)，收集离心后的下层细胞，加入PBS缓冲溶液用移液枪吹打使其成细胞悬液，调整细胞悬液浓度为5×108个/mL。然后取200μL注射入小鼠左前肢腋下，每天观察肿瘤变化，并用游标卡尺测量肿瘤的长径、短径，按如下公式计算肿瘤的体积。当肿瘤体积长至150～200mm3时，即可认为造模成功。
Figure BDA0002260385490000131
本试验采用小动物活体成像技术来证明TPGS2000-DOX纳米胶束的靶向性，即将造模成功的荷MCF-7瘤裸鼠分为2组，即游离DOX组、TPGS2000-DOX纳米胶束组，每组三只。游离DOX组以及TPGS2000-DOX组分别通过尾静脉注射200μL的自由DOX溶液以及DOX胶束溶液(DOX浓度均为10mg/Kg)，并且分别于0.5、1、2、4、6、8、12、24h这8个时间点进行活体成像。在成像前3分钟，用易氟烷将小鼠快速麻醉然后上机检测。
对于DOX组，小鼠活体成像结果表明，在注射30min后，DOX组即可在肿瘤部位观察到其自身荧光，在8h时药物出现全身分布的情况。虽然前24h肿瘤部位均可观察到DOX的荧光，但荧光强度并未出现显著增强的现象，且4、8、24h荧光强度明显减弱。荧光强度随时间表现出无规则变化这一现象说明药物在肿瘤部位的作用时间并不长，随着血液循环，又分散于其他组织或者被代谢排出体外，这也证实了DOX溶液的组织分布较差。24h后可以明显观察到药物在体内的荧光强度快速减弱，随着时间的延长，大部分药物在体内逐渐被代谢，肿瘤部位的荧光也随之减弱。在静脉注射TPGS2000-DOX纳米胶束后，肿瘤部位的荧光强度先增强后缓慢减弱，即4h在肿瘤部位的荧光强度达到最大，4h后逐渐减弱。这可能是因为纳米胶束注射入体内后，随着血液循环药物逐渐聚集于肿瘤部位，随着时间的延长，纳米胶束也被逐渐代谢，荧光强度也随之减弱。但是从6h到24h之间，肿瘤部位的荧光强度仍然较为明显，这是因为TPGS2000-DOX纳米胶束在肿瘤内部被破坏，释放出的TPGS2000-DOX前药经过酰胺酶降解可以解离出DOX，维持一定的荧光强度。以上结果说明TPGS2000-DOX纳米胶束进入体内具备一定的靶向性，能有效的聚集于肿瘤部位，且该胶束在肿瘤内部可以有效释放药物，即使经过24小时，药物仍然可以作用于肿瘤部位。
TPGS2000-DOX纳米胶束的组织器官荧光成像：活体成像结束后，将两组的小鼠脱颈椎处死，在超净台中进行解剖，取出心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤，将这些组织器官用生理盐水洗净后，放置于滤纸上将水吸干，按顺序依次摆放于黑色塑料板上，上机成像，曝光时间为400ms，保证每个时间的曝光时间均一致。
TPGS2000-DOX纳米胶束组以及游离DOX组经过尾静脉注射24h后，各器官及肿瘤中的DOX的体外荧光成像结果显示，TPGS2000-DOX纳米胶束组在肿瘤部位的DOX荧光较为明显，肝脏处可观察到微弱的荧光，除此之外其他器官几乎检测不到荧光。而DOX组在肝脏中的荧光很强，在其他部位几乎检测不到荧光，说明此时药物大量聚集于肝脏中被代谢。这一结果进一步证明TPGS2000-DOX纳米胶束可以靶向作用于人乳腺癌裸鼠的肿瘤部位。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (8)

1.一种TPGS2000-DOX纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述TPGS2000-DOX纳米胶束通过以下方法制备得到：聚乙二醇2000与维生素E琥珀酸酯合成聚乙二醇2000维生素E琥珀酸酯，随后与丁二酸酐合成CTPGS2000，CTPGS2000与阿霉素合成TPGS2000-DOX偶联物；TPGS2000-DOX偶联物与Solutol HS15通过薄膜分散方法制备得到TPGS2000-DOX纳米胶束；所述TPGS2000-DOX偶联物结构如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中：
所述TPGS2000-DOX纳米胶束的制备方法为，将一定量的Solutol HS 15在35~50℃下加热成熔融状态，加入TPGS2000-DOX偶联物用溶剂溶解后的溶液，再加入一定量所述溶剂使两者混合均匀，除去溶剂后得到干燥的含药薄膜；将含药薄膜加入预热至60℃的纯化水中，在60℃搅拌至少1h，离心，上清液经过滤后得到澄清的载药胶束溶液；
所述TPGS2000-DOX偶联物的制备方法为，用溶剂溶解一定量CTPGS2000后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，保护气氛下，在冰浴条件下避光反应12 h，得到反应液1；用上述溶剂溶解一定量DOX·HCl后加入200 μL三乙胺，保护气氛下，室温避光反应1 h后得到反应液2，将反应液2加入到反应液1中，保护气氛下室温避光反应48 h；反应结束后将所得的料液进行透析并冷冻干燥即得TPGS2000-DOX偶联物；
所述CTPGS2000的制备方法为，用1,4-二氧六环将一定量TPGS2000和丁二酸酐溶解后，加入4-二甲氨基吡啶和三乙胺，保护气氛下室温反应24h，反应结束后，将除去溶剂的反应液溶解于二氯甲烷中，过滤后将滤液滴加至乙醚中，于-20℃冰箱中沉淀过夜，离心后收集沉淀，干燥后得到CTPGS2000。
2.根据权利要求1所述一种TPGS2000-DOX纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述CTPGS2000的纯化方法为，甲醇溶解一定量干燥后得到的CTPGS2000后，加入适量RP-18混匀，减压旋蒸除去有机溶剂得到含CTPGS2000的RP-18粉末，采取反向柱进行分离，以甲醇/水溶剂体系梯度洗脱，收集产物减压旋蒸，真空干燥24 h得到CTPGS2000纯品。
3.根据权利要求1所述一种TPGS2000-DOX纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述的TPGS2000的制备方法为，用溶剂将一定量维生素E琥珀酸酯溶解后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，保护气氛下在冰浴条件下搅拌反应1h后，加入聚乙二醇2000，升温至30℃后继续搅拌反应48h，反应结束后经后处理得到TPGS2000。
4.根据权利要求1-3所述任意一种TPGS2000-DOX纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述TPGS2000-DOX纳米胶束的制备方法中：所述溶解TPGS2000-DOX偶联物的溶剂为乙醇；所述TPGS2000-DOX偶联物与Solutol HS 15的质量比为6：（110-120）；所述除去溶剂的操作为旋转蒸发除去溶剂；所述离心操作的离心速率为10000 r/min，离心时间为10min；所述的过滤为经0.22µm的醋酸纤维素酯膜过滤。
5.根据权利要求1-3所述任意一种TPGS2000-DOX纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述TPGS2000-DOX偶联物的制备方法中：所述溶解CTPGS2000的溶剂为有机溶剂；所述CTPGS2000、EDCI、NHS和DOX·HCl的质量比为1:0.46:0.27:0.24；所述透析操作为将反应后所得料液在反应所用溶剂中进行透析，更换透析外液至外液不再变红后，在蒸馏水中继续透析24h。
6.根据权利要求1-2所述任意一种TPGS2000-DOX纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述CTPGS2000的制备方法中：所述TPGS2000、SA和DMAP的质量比为15:2.4:0.72；所述三乙胺的用量为催化量；所述过滤为0.45 μm微孔滤膜过滤除去未参与反应的SA；所述的离心后的沉淀用冰乙醚洗涤3次。
7.根据权利要求3所述一种TPGS2000-DOX纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述溶剂为有机溶剂，包括二氯甲烷；所述VES、EDCI、DMAP和PEG2000的质量比为5.3:3.8:1.2:20；所述后处理操作为常规后处理操作，包括萃取、干燥、抽滤、浓缩和重结晶。
8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的TPGS2000-DOX纳米胶束。
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