CN109735572A - 一种靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体及制备方法和应用，制备方法包括：制备PCLMD‑g‑PEI共聚物；靶向多肽接枝PCLMD‑g‑PEI制备基因载体。该载体与pDNA溶液混合，制得基因复合物。本发明制得的基因载体具有较低的细胞毒性，当靶向多肽为逐级靶向多肽REDV‑G‑TAT‑G‑NLS时，可赋予载体兼具ECs黏附功能、细胞膜靶向功能和细胞核靶向功能，结合PEI特有的质子化效应促使基因复合物同时具有内涵体/溶酶体逃逸功能，从而提高基因递送效果，提高转染效率和促进细胞迁移增殖的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体及制备方法和应用。
背景技术
基因疗法已成为治疗各种疾病的最有前途的治疗方法之一，尤其是对心血管疾病的治疗。然而，开发高生物相容性、高效基因递送的基因载体以克服多重障碍仍是一项艰巨的任务。具有核-壳结构的纳米粒基因递送系统，疏水核保持了结构的稳定性，亲水壳减少了载体与血浆蛋白的相互作用，从而防止载体的聚集。另外将遗传物质定位到特定的作用位点比没有针对性的递送具有许多优点。在载体表面带有特异性靶向配体能够显著提高基因转染效率。这种基因递送载体通过受体介导的胞吞作用进入细胞，靶向部分在基因递送中发挥不同的重要作用。
理想的基因载体不仅要有细胞黏附能力，而且要实现有效的穿透细胞膜，内涵体/溶酶体逃逸和核定位能力。细胞穿透肽(TAT)是一种能够传递药物、蛋白质、RNA和基因的功能性多肽，其优异的穿透细胞膜能力被认为是一种重要的功能肽。此外，核定位信号肽(PKKKRKV，NLS)是一系列具有功能多肽，具有良好的细胞核靶向功能。经证实TAT能够转导大分子物质穿过细胞膜，与其他非病毒载体相比具有与细胞膜亲和性高、穿膜速度快、可迅速被降解以及对细胞膜没有破坏性。TAT和阳离子脂质体能够浓缩DNA，保护DNA免受核酸酶降解，将DNA传递到细胞质或细胞核。张先正教授课题组将不同的NLS引入TAT，制备了TAT-PV/DNA、TAT/DNA/PV和TAT/DNA/HMGB1基因复合物。结果发现，核定位信号的引入可以提高TAT-基肽的转染效率。因此，在基因传递方面具有很好的应用前景。但现有的TAT-NLS组合肽修饰过后基因复合物的粒径会明显的增大，不利于细胞摄取。因此，研究一种基因载体，可有效降低细胞毒性，与较好的生物相容性，并且能促进内皮细胞增殖和迁移是及其重要的。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体及制备方法和应用，该基因载体能有效降低细胞毒性，与较好的生物相容性，并且能促进内皮细胞增殖和迁移。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体，其制备方法包括以下步骤：
(1)以1,8-辛二醇为引发剂，辛酸亚锡作为催化剂，引发己内酯与3-甲基-吗啉-2,5-二酮开环聚合，制得聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)共聚物；
(2)将聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)共聚物与丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺混合，在氮气环境下进行反应，制得羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)共聚物；
(3)将羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)与EDC和NHS混合，活化反应2-4h，然后加入PEI，置于20-30℃油浴中反应22-26h，透析，提纯，冷冻干燥，制得聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-g-聚乙烯酰亚胺共聚物；其中，羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)、EDC、NHS和PEI的重量比为4-8:0.5-1:0.4-0.8:1-3；
(4)以邻二硫吡啶聚乙二醇活性酯为连接剂，将靶向多肽接枝到聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-g-聚乙烯酰亚胺共聚物上，制得靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体；
其中，靶向多肽为CREDVW有活性多肽、CREVDW无活性多肽或REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽；
CREDVW有活性多肽为Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp的简称；CREVDW无活性多肽为Cys-Arg-Glu-Val-Asp-Trp的简称；REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽为Arg-Glu-Asp-Val-Gly-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Cys的简称。
进一步地，步骤(1)具体过程为：将1,8-辛二醇、己内酯和3-甲基-吗啉-2,5-二酮混匀，然后加入Sn(Oct)2甲苯溶液，密封，抽真空，通氮气，然后放入油浴锅中，于120-140℃反应22-26h，所得产物采用采用三氯甲烷溶解，正己烷沉出，最后进行真空干燥，制得；其中，1,8-辛二醇、己内酯、3-甲基-吗啉-2,5-二酮和Sn(Oct)2的摩尔比为0.1-0.2:10-12:1:0.02-0.04。
进一步地，步骤(2)具体过程为：将羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)溶于二氧六环溶剂，接着加入丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺，混匀，在氮气环境下，密封，置于20-30℃油浴中反应22-26h，制得羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)共聚物；其中，羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的重量比为2-4:0.2-0.4:0.2-0.4，和羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)和三乙胺的质量体积比为2-4:0.2-0.3g/ml。
进一步地，步骤(3)中羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)、EDC、NHS和PEI的重量比5:0.737:0.443:1.62。
进一步地，步骤(4)具体过程为：将聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-g-聚乙烯酰亚胺共聚物加入含邻二硫吡啶聚乙二醇活性酯的DMSO溶液中，搅拌反应2-3h后加入含有靶向多肽的DMSO溶液，继续搅拌过夜，透析，冷冻干燥，制得靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体；其中，聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-g-聚乙烯酰亚胺共聚物、靶向多肽和靶向多肽邻二硫吡啶聚乙二醇活性酯的重量比为4-6:1.3:1-3。
靶向多肽修饰的阳离子共聚物胶束，，通过以下方法制备得到：将上述靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体溶于DMSO中，再滴加到pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌，使其自组装形成共聚物胶束。
靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因复合物，通过以下方法制备得到：将上述靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体与pDNA溶液混合，搅拌孵育20-40min，制得基因复合物。
上述制得的靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体可用于制备修复血管内皮细胞基因药物。
本发明提供的靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体及制备方法和应用，具有以下有益效果：
本发明以辛二醇为引发剂，辛酸亚锡为催化剂，开环聚合制备了聚(己内酯-co-吗啉-2,5-二酮)-g-聚乙烯酰亚胺)阳离子共聚物，最后通过异端双官能团PEG将功能正常的有活性的REDV多肽、功能失调的无活性的REVD多肽以及REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽接枝在PCLMD-g-PEI(CP)共聚物末端。在水溶液中自组装制备了共聚物胶束。这些共聚物胶束粒径均具有适合细胞内吞的粒径和zeta电位，具有较低的细胞毒性且均能促进EA.hy926的增殖。其中CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物作用于细胞效果尤为突出。
逐级靶向多肽REDV-G-TAT-G-NLS修饰以PEI为基本结构的阳离子共聚物作为基因载体，赋予载体兼具ECs黏附功能、细胞膜靶向功能和细胞核靶向功能，结合PEI特有的质子化效应促使基因复合物同时具有内涵体/溶酶体逃逸功能。这种接枝修饰的方法能够有效减小基因复合物的粒径，降低细胞毒性，使载体具有较好的生物相容性，促进EA.hy926内皮细胞增殖和迁移，提高细胞对载体的摄取能力。
附图说明
图1为PCLMD-g-PEI(CP)共聚物的合成反应过程。
图2为PCLMD-OH共聚物、PCLMD-COOH共聚物和PCLMD-g-PEI共聚物的1H NMR表征图谱。
图3为CP-CREDVW共聚物的1H NMR表征谱图。
图4为透析后CP-CREDVW共聚物胶束的荧光发射光谱曲线。
图5为CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物1H NMR表征图谱。
图6为透析后CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物胶束的荧光发射光谱曲线。
图7为不同N/P摩尔比下基因复合物的粒径(1)和zeta电位(2)结果图。
图8为不同N/P摩尔比下基因复合物的凝胶琼脂糖电泳图像。
图9为不同共聚物胶束和基因复合物作用于EA.hy926内皮细胞的相对细胞活力结果。
图10为不同的基因复合物转染EA.hy926内皮细胞24h后的明场和暗场图像。
图11为EA.hy926内皮细胞12小时迁移图像和相对迁移面积。
图12为流式细胞分析测定EA.hy926内皮细胞对不同基因复合物的细胞摄取结果。
具体实施方式
实施例1
一种靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体，其制备方法包括以下步骤：
1、PCLMD-g-PEI共聚物的制备(g为graft的缩写，代表接枝共聚)
(1)聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)(PCLMD-OH)共聚物的制备
以1,8-辛二醇0.07g(0.47mmol)为引发剂，Sn(Oct)2(0.4ml，0.25mol/l)甲苯溶液为催化剂，引发己内酯(CL)4.5g(39.4mmol)与3-甲基-吗啉-2,5-二酮(MMD)0.5g(3.9mmol)开环聚合制备PCLMD-OH共聚物，具体过程为：将1,8-辛二醇、己内酯和3-甲基-吗啉-2,5-二酮混匀，然后加入Sn(Oct)2甲苯溶液，密封，抽真空，通氮气，然后放入油浴锅中，于120-140℃反应22-26h，所得初产物溶于三氯甲烷中，在冰冷的正己烷中沉淀，重复溶解和沉淀操作过程提纯产物，在25℃下真空干燥48小时，收集白色产物。
(2)羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)(PCLMD-COOH)共聚物的制备
称取PCLMD-OH 3.0g加入干燥的Schlenk聚合管中，加入约20ml二氧六环溶剂密封搅拌，待PCLMD-OH聚合物完全溶解后，继续称取0.231g丁二酸酐、0.282g DMAP(4-二甲氨基吡啶)并称量0.2ml三乙胺加入到聚合管中，抽真空补充氮气两到三次即可，密封侵入油浴中，控制反应温度为25℃，聚合24h。反应结束后，产物提纯方法同上，干燥备用。
(3)聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-g-聚乙烯酰亚胺(PCLMD-g-PEI)共聚物的制备
称取PCLMD-COOH共聚物0.5g加入Schlenk聚合管中，加入约20ml DMSO密封搅拌至共聚物溶解，随后加入0.0737g的EDC和0.0443g的NHS到聚合管中，活化反应3h。最后加入PEI(10kDa，0.162g，0.09mmol)的DMSO溶液密封，于油浴中25℃聚合24h。反应结束后产物经透析提纯48小时，冷冻干燥备用。
2、CP-CREDVW和CP-CREVDW共聚物的制备
以OPSS-PEG-NHS为连接剂将CREDVW多肽接枝到PCLMD-g-PEI(以下表示为CP)共聚物，具体过程为：取1ml 5mg/ml的PCLMD-g-PEI共聚物溶液，逐滴加入1ml OPSS-PEG-NHS(2mg/ml)DMSO溶液中，搅拌反应2小时后加入2mg/ml含有CREDVW多肽的DMSO溶液0.5ml，随后在室温下搅拌反应过夜，然后经透析、冷冻干燥后得PCLMD-g-PEI-PGE-CREDVW(以下表示为CP-CREDVW)。
以同样的方法制备PCLMD-g-PEI-PGE-CREVDW(以下表示为CP-CREVDW)聚合物。
上述CREDVW多肽为Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp的简称。
CREVDW多肽为Cys-Arg-Glu-Val-Asp-Trp的简称。
OPSS-PEG-NHS为邻二硫吡啶聚乙二醇活性酯的简称。
3、CP-REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向共聚物的制备
以OPSS-PEG-NHS为连接剂将REDV-G-TAT-G-NLS多肽引入到PCLMMD-g-PEI上制得PCLMD-g-PEI-PGE-REDV-G-TAT-G-NLS(以下表示为CP-REDV-G-TAT-G-NLS)，具体过程为：取1ml 5mg/ml的CP共聚物溶液，逐滴加入1ml OPSS-PEG-NHS(2mg/ml)DMSO溶液，搅拌反应2小时后加入1ml2mg/ml含有REDV-G-TAT-G-NLS多肽的DMSO溶液，随后在室温下搅拌反应过夜，产物经透析冷冻干燥后备用。
上述REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽中氨基酸具体序列如下：
Arg-Glu-Asp-Val-Gly-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Pr o-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Cys。
对上述制得的PCLMD-OH共聚物、PCLMD-COOH共聚物、PCLMD-g-PEI共聚物、CP-CREDVW共聚物和CP-REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向共聚物进行表征：
以四甲基硅烷(TMS)为内标，以氘化氯仿为溶剂，用核磁共振波谱仪记录共聚物的1H NMR谱。采用凝胶渗透色谱法以聚苯乙烯作为标准，四氢呋喃为流动相，测定共聚物溶液的数均分子量(Mn)、平均分子量(MW)和分子量分布指数(PDI)。
(1)PCLMD-g-PEI(CP)共聚物的合成及表征
以辛二醇引发己内酯与MMD开环聚合得到端位为羟基的PCLMD-OH，PCLMD-OH在Sn(Oct)2的催化条件下与丁二酸酐发生酰化反应，得到端位的羧基的PCLMD-COOH，最后PCLMD-COOH中的羧基与PEI上的氨基结合得到PCLMD-g-PEI共聚物(图1)。由于己内酯分子链中的酯键易于受到进攻而断裂的性质，赋予其生物降解性，而MMD中的酯键与酰胺键，使其具有优良的生物相容性和生物降解性能，MMD的引入，可以有效改善聚己内酯的性能。
通过1H NMR对PCLMD-OH、PCLMD-COOH和PCLMD-g-PEI(CP)共聚物结构进行了表征，结果见图2，其中a为PCLMD-OH共聚物，b为PCLMD-COOH共聚物，c为PCLMD-g-PEI共聚物。
如图2所示，己内酯的特征峰-CO-CH2-上的亚甲基氢出现在δ＝2.2ppm处，其相邻的亚甲基峰分别对应图中b-e点；MMD结构中甲基的质子峰出现在δ＝1.7ppm处(图中f点)，-COCH2O-亚甲基的质子峰出现在δ＝4.60ppm处。图中δ＝2.7ppm峰的出现表明PCLMD-OH共聚物被成功羧基化得到了PCLMD-COOH共聚物。PCLMD-g-PEI(CP)共聚物通过活化PCLMD-COOH末端的羧基和PEI上的氨基的酰胺化反应制得，PEI的特征峰分布在δ＝2.5-3.0ppm。
通过GPC测定了PCLMD-OH共聚物和PCLMD-g-PEI共聚物的分子量，结果如表1所示。与PCLMD-OH共聚物相比，PCLMD-g-PEI共聚物的分子量大大增加，PDI也从1.21增大到了1.36。
表1 PCLMD-OH和PCLMD-b-PEI共聚物的分子量
(2)CP-CREDVW共聚物的合成及表征
CREDVW多肽序列中半胱氨酸上的巯基与OPSS-PEG-NHS连接剂中马来酰亚胺基团发生加成反应，从而制得PCLMD-PEI-PEG-CREDVW(CP-CREDVW)共聚物。通过同样的方法，将功能失调的CREVDW肽引入CP共聚物中，得到CP-CREVDW共聚物。以DMSO-d6为溶剂，CP-CREDVW共聚物的核磁测定结果如图3所示，CP-CREDVW共聚物1H NMR图谱上s特征峰属于共聚物结构中CREDVW多肽。
为了能够进一步证明多肽接枝在共聚物上，并同时测定共聚物胶束中接枝的CREDVW多肽含量。本发明通过在CREDVW多肽序列中引入的色氨酸(Tryptophan，W)序列完成表征，因为色氨酸结构中含有吲哚基团，因此将制备的共聚物胶束透析后通过荧光发射光谱能够测定CP-CREDVW胶束溶液中CREDVW多肽的含量。结果如图4所示，与透析后的PCLMD-PEI(CP)胶束溶液相比CP-CREDVW胶束溶液在360nm波长处有明显的发射峰，这说明CREDVW多肽是成功的接枝在CP共聚物上，在水中自组装形成了CP-CREDVW胶束。此外制作CREDVW多肽标准曲线y＝526.48C-42.67(R2＝0.999)，根据标准曲线计算，CP-CREDVW胶束中CREDVW多肽的含量为6.8％。
(3)CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物的合成与表征
通过REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽链上的巯基与OPSS-PEG-NHS连接剂中马来酰亚胺基团发生加成反应，将REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽引入到PCLMMD-g-PEI共聚物上制得PCLMD-g-PEI-PEG-REDV-G-TAT-G-NLS(CP-REDV-G-TAT-G-NLS)共聚物。以DMSO-d6为溶剂，CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物1H NMR图谱上t特征峰的出现证明了REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽的接枝成功，结果如图5所示。
由于REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽序列中含有酪氨酸，在305nm波长处有特征发射荧光，因此可以通过测定共聚物胶束的荧光发射谱进一步确定多肽接枝是否成功。将CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物胶束透析后，测定荧光发射光谱发现在CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物胶束在305nm波长处有特征吸收，而CP共聚物胶束中没有，说明REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽接枝成功，其结果见图6。通过制作REDV-G-TAT-G-NLS标准曲线，标准曲线方程y＝1480.56C+20.99(R2＝0.999)，定量计算CP-REDV-G-TAT-G-NLS胶束中REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽的含量为6.13％。
4、共聚物胶束的制备
将PCLMD-g-PEI共聚物(CP共聚物)、CP-CREDVW共聚物、CP-CREVDW共聚物以及CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物溶解在DMSO中，分别配制浓度为5mg/mL的共聚物溶液。随后，分别将2.0mL共聚物溶液缓慢滴加到5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)的锥形烧瓶中，不断的搅拌得到CP共聚物胶束、CP-CREDVW共聚物胶束、CP-CREVDW共聚物胶束以及CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物胶束溶液。将胶束溶液在透析袋中透析12小时，每1h交换PBS除去DMSO。将上述胶束样品转入容量瓶定容，使胶束的质量浓度为0.2mg/mL。
5、基因复合物的制备
将pEGFP-ZNF580质粒溶液(pDNA，50μg/mL)按不同N/P摩尔比(PEI的N加多肽的N与DNA中的磷的摩尔比)，在搅拌状态下将pDNA分别缓慢滴加到CP共聚物、CP-CREDVW共聚物、CP-CREVDW共聚物以及CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物胶束中，搅拌卵育30分钟。最终得到CP/pDNA基因复合物、CP-CREDVW/pDNA基因复合物、CP-CREVDW/pDNA基因复合物以及CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物。
对上述共聚物胶束和基因复合物进行如下测试：
1、粒径和电位
共聚物在水中自组装形成以PCLMD为疏水核，PEI为亲水壳层的胶束，通过静电作用与pEGFP-ZNF580(pDNA)质粒相互结合压缩包封pDNA，携带pDNA进入细胞。为了增强共聚物胶束对内皮细胞的特性黏附并提高PEI非病毒基因载体的转染效率，本发明通过双官能度的连接剂OPSS-PEG-NHS将内皮细胞靶向多肽CREDVW连接到PEI末端得到CP-CREDVW共聚物。通过同样的方法将功能失调的无活性CREVDW多肽连接在PEI末端得到CP-CREVDW共聚物。为了克服载体在基因递送中遇到的细胞膜穿透能力差、内涵体/溶酶体逃逸逃逸能力差、基因进入细胞核表达困难等基因递送屏障，通过双官能度的连接剂OPSS-PEG-NHS将逐级靶向多肽REDV-G-TAT-G-NLS连接PEI末端。REDV多肽可以特性黏附内皮细胞；TAT多肽可以携带载体细胞内吞跨越细胞膜；NLS有助于对细胞核进行定位，并通过细胞核膜上的核孔复合体(NPC)转运DNA进入细胞核表达。
粒径和zeta电位是基因载体能否携带质粒进入细胞的首要条件。本发明使用Zetasizer 3000HS(Malvern Instrument，Inc.,Worcestershire,UK)仪器，在677nm的波长处以90°的恒定角度照射测量CP共聚物胶束、CP-CREDVW共聚物胶束、CP-CREVDW共聚物胶束以及CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物胶束、CP/pDNA基因复合物、CP-CREDVW/pDNA基因复合物、CP-CREVDW/pDNA基因复合物以及CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物的粒径和zeta电位，其粒径和电位测定结果如图7所示。图7中每组柱形图从左到右分别为CP/pDNA基因复合物、CP-CREDVW/pDNA基因复合物、CP-CREVDW/pDNA基因复合物以及CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物。
由图7可知，这些基因复合物都具有适合细胞内吞的粒径和zeta电位，且分布较窄。不同N/P下基因复合物的粒径如图7(1)所示，负载包封基因后，基因复合物的粒径较共聚物胶束都有所降低。不同N/P摩尔比时(2、5、10、20、30、40)，CP/pDNA基因复合物粒径从144.48±3.02降低到79.72±1.92。CP-CREDVW/pDNA基因复合物粒径从138.17±1.38降低到80.59±0.72。CP-CREVDW/pDNA基因复合物粒径从155.05±7.37降到76.68±4.39。CP-REDV-G-TAT-G-NLS粒径从139.81±3.08降低到73.86±0.25。这可能是因为强烈的静电作用使复合物更加紧密，再加上复合物粒子表面的静电排斥作用使得粒径进一步降低。
2、琼脂糖凝胶电泳实验
通过琼脂糖凝胶电泳实验来考察上述四种复合胶束对pDNA质粒的压缩阻滞能力，具体过程如下：
将CP共聚物胶束、CP-CREDVW共聚物胶束、CP-CREVDW共聚物胶束以及CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物胶束按不同N/P摩尔比制备CP/pDNA基因复合物、CP-CREDVW/pDNA基因复合物、CP-CREVDW/pDNA基因复合物以及CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物，使胶束中质粒含量达到3μg。以CP/pDNA基因复合物为例，其他复合胶束对pDNA质粒的包封阻滞能力考察实验操作步骤同下。取该基因复合物10μL与0.5μg/ml溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)显色剂混匀卵育。10分钟后将基因复合物与染料的混合物加入0.8％的琼脂糖凝胶孔道中，于100V电压、1×TAE缓冲液中进行实验，实验持续30分钟。结束后在暗箱紫外分析仪中观察实验结果并拍照记录。考察这种胶束对pEGFP-ZNF580质粒的的包封效果。
为了研究四种共聚物胶束对pEGFP-ZNF580质粒的压缩包封能力，本发明进行了凝胶琼脂糖电泳实验。在电场作用下，带有负电荷的pDNA分子能够通过琼脂糖凝胶由负极向正极迁移，没有被带正电荷的胶束完全包封的pNDA分子就会在凝胶上面留下迁移的条带。如图8所示，当N/P摩尔比分别为0、0.5、2、5、10、20、40和60时，考察了CP(图8A)、CP-CREDVW(图8B)、CP-CREVDW(图8C)、CP-REDV-G-TAT-G-NLS(图8D)共聚物胶束对pEGFP-ZNF580质粒的包封能力。CP、CP-CREDVW、CP-CREVDW、CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物胶束分别在N/P摩尔比为10、5、10、5时完全包封pDNA。
3、细胞毒性实验
以人脐静脉内皮细胞株EA.hy926内皮细胞作为体外细胞实验模型，细胞接种密度约为0.8×104cell/cm2，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24小时，丢弃非贴壁细胞，然后补充10％FBS高糖DMEM培养液。重复操作3-4天，用细胞计数板测定细胞密度，使贴壁细胞培养至80-90％汇合。
以PEI(10kDa)/pDNA为对照，考察CP/pDNA基因复合物、CP-CREDVW/pDNA基因复合物、CP-CREVDW/pDNA基因复合物以及CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物的细胞毒性。以CP/pDNA基因复合物MTT实验操作为例，将EA.hy926内皮细胞接种到96孔板(1×104cell/well)中。然后，更换培养基为无血清细胞培养基，37℃、5％CO2下饥饿培养细胞12小时。不同PEI浓度的CP/pDNA基因复合物加入到新鲜的生长培养基(10％FBSDMEM)中混匀。将无血清培养基更换为含有基因复合物(N/P摩尔比为5，2μg pEGFP-ZNF580/well)的生长培养基。37℃，5％CO2下细胞在含有基因复合物的生长培养基中培养48小时后移除该培养基。向每孔中加入5mg/mL的MTT溶液15μL，之后将96孔板重新放回细胞培养箱内37℃、5％CO2下继续孵育放置4小时，充分形成不溶性的甲瓒(Formazan)晶体。轻轻吸除每个孔内培养基后每孔加入150μL的DMSO溶液，轻微震荡溶解甲瓒晶体。最后利用酶标仪读取各孔在490nm波长下的吸收度值(Optical density，OD)，计算细胞存活率，结果如图9所示。图9中每组柱形图从左到右分别为CP、CP-CREDVW、CP-CREVDW、CP-REDV-G-TAT-G-NLS、PEI、CP/pDNA、CP-CREDVW/pDNA、CP-CREVDW/pDNA、CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA、PEI/pDNA。
由图9可知，当N/P摩尔比为10时，PEI(10kDa)/pDAN基因复合物为对照组，测定了不同PEI浓度(3、15、30、45、60、75μg/mL)胶束及相应的基因复合物对EA.hy926内皮细胞的毒性。随着浓度的增加，共聚物胶束CP-CREDVW、CP-CREVDW、CP-REDV-G-TAT-G-NLS以及相应的基因复合物CP-CREDVW/pDNA、CP-CREVDW/pDNA、CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA作用于细胞，相对细胞活力均高于CP共聚物胶束和CP/pDNA基因复合物，均无较大的下降趋势。
当PEI浓度为75μg/mL时，除CP共聚物胶束及CP/pDNA基因复合物其他所有测试组作用于细胞的相对细胞活力均大于98％。此外，由于pEGFP-ZNF580基因对ECs增殖具有促进作用，基因复合物作用于细胞比相应共聚物胶束具有更高的细胞存活率。但期间还是存在一个例外，CP-CREVDW共聚物胶束作用于细胞相比于CP-CREVDW/pDNA基因复合物细胞相对活力更高，考虑是因为REVD无活性的多肽对内皮细胞没有特异的黏附功能，无法促使该基因复合物在细胞表面大量的聚集产生毒性。从表7(2)zeta电位测定结果可以看到，虽说NLS-TAT-REDV逐级靶向多肽的接枝修饰增加了CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物的zeta电位。但通过MTT实验发现，细胞相对活力仍然保持较高的水平。考虑是因为REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽对细胞无毒副作用所致。这说明将靶向多肽和逐级靶向多肽引入到基因载体上可以降低载体的细胞毒性，是一种降低基因载体对细胞产生毒性的有效方法。
4、体外细胞转染实验
以PEI(10k)/pDNA基因复合物为对照，考察CP/pDNA基因复合物、CP-CREDVW/pDNA基因复合物、CP-CREVDW/pDNA基因复合物以及CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物对EA.hy926内皮细胞的转染效率。以CP/pDNA基因复合物转染实验操作为例，具体过程如下：
将EA.hy926内皮细胞接种到96孔板(1×104cell/well)中，按照上述细胞培养过程将细胞孵育至80-90％融合，细胞经胰蛋白酶消化传代培养。首先将EA.hy926内皮细胞接种在6孔板(4×105cell/well)上，培养12小时至细胞达到60％-70％的融合。EA.hy926内皮细胞的体外转染实验开始时，EA.hy926内皮细胞先用无血清培养基饥饿培养12小时，丢弃细胞碎片和代谢负产物。然后将CP/pDNA基因复合物加入细胞孔内(2μg pDNA/well)，37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育4h后取出，清洗丢弃残留的基因复合物以及细胞碎片和代谢负产物，再次将培养基更换为10％FBS DMEM生长培养基，细胞继续培养。通过倒置荧光显微镜在设定的时间点(12小时和24小时)观察细胞内绿色荧光蛋白(Green fluorescenceprotein，GFP)表达的情况，观察时拍照记录。转染效率定义为一个视野下显绿色荧光细胞数/该视野下总细胞数。结果见图10所示，图10中A为PC/pDNA基因复合物转染细胞，B为CP-CREDVW/pDNA基因复合物转染细胞，C为CP-CREVDW/pDNA基因复合物转染细胞，D为CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物转染细胞，E为PEI(10kDa)/pDNA基因复合物转染细胞作为对照。
从图10中绿色荧光图像来看，CP/pDNA基因复合物实验组绿色荧光点最少，对EA.hy926内皮细胞转染效果最差。CP-CREDVW/pDNA和CP-CREVDW/pDNA两种基因复合物的区别在于CREDVW多肽是具有活性的，CREVDW多肽是无活性的。从荧光图像结果可以看到CP-CREDVW/pDNA基因复合物比CP-CREVDW/pDNA基因复合物绿色荧光点较多转染效果稍稍较好。说明有活性的多肽的引入，增加了基因复合物对细胞的黏附从而增强了基因复合物对细胞的转染效率。CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物与CP-CREDVW/pDNA基因复合物的区别在于前者除了具有对内皮细胞特性黏附功能以外还具有穿透细胞膜能力和细胞核定位能力。因此从绿色荧光图像结果看，CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物比CP-CREDVW/pDNA基因复合物绿色荧光亮点多转染效果更好。这四种基因复合物的转染效果均高于PEI(10kDa)/pDNA基因复合物。细胞毒性试验和细胞转染实验结果表明，将CREDVW多肽接枝在PEI的氨基上在可以降低胶束和基因复合物的细胞毒性的同时提高基因复合物的转染效率，尤其是REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽的引入更有益于胶束负载ZNF580基因、降低基因复合物的毒性且提高转染效率。
5、划痕实验
划痕实验可以直观的评价经基因复合物转染细胞后，细胞的迁移能力。以CP/pDNA基因复合物划痕实验操作为例，转染实验48小时后，待细胞生长基本形成单层细胞层。利用无菌枪头在每孔内轻轻地划出一条均匀的划痕痕迹。用D-hanks缓冲液(pH＝7.4)冲洗丢弃孔内由于划痕产生的细胞碎屑。在0小时和12小时这两个时间节点时用倒置显微镜观察划痕处细胞的迁移情况并拍照记录，利用Image J 2.0软件计算照片中细胞的迁移面积，结果如图11所示。
图11(1)为EA.hy926内皮细胞12小时迁移图像，(2)为由Image-Pro Plus(6.0)计算的12小时EA.hy926内皮细胞相对迁移面积；其中A为PC/pDNA基因复合物转染细胞，B为CP-CREDVW/pDNA基因复合物转染细胞，C为CP-CREVDW/pDNA基因复合物转染细胞，D为CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物转染细胞，E为PEI(10kDa)/pDNA基因复合物转染细胞作为对照。
以PEI(10kDa)/pDNA基因复合物组为对照，三个实验组CP/pDNA、CP-CREDVW/pDNA和CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物转染细胞的迁移能力显著强于对照组，24小时后相对迁移面积分别为52.36±3.26、62.96±6.35、83.95±5.51。CP-CREVDW/pDNA无活性多肽基因复合物转染细胞能力最差，相对迁移面积仅为35.67±7.25。这说明靶向多肽的引入有益于细胞的增殖与迁移，而REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽的引入更有利于增强基因复合物对细胞的黏附，促进细胞增殖和迁移。
6、细胞摄取分析
为了促进细胞对基因复合物的摄取，本发明采用接枝的方法将具有靶向细胞功能、膜透功能和核定位功能的REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽引入PCLMD-g-PEI共聚物末端，以Cy5标记的寡核苷酸为报告基因，自组装形成CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物。通过流式细胞分析技术考察了EA.hy926内皮细胞对CP/pDNA、CP-CREDVW/pDNA、CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物的摄取能力，具体过程如下：
用Cy5荧光染料标记pDNA，然后将负载被Cy5标记的基因的CP/pDNA基因复合物、CP-CREDVW/pDNA基因复合物及CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物加入到EA.hy926内皮细胞中进行转染实验，4h后用PBS清洗细胞三次，除去多余的基因复合物及其他杂质，细胞经胰蛋白酶消化后反复多次离心，最后用流式细胞分析仪对基因复合物的细胞摄取进行分析。结果见图12，图12(1)为流式细胞术测定荧光强度及相应的细胞数目，(2)为平均荧光强度(柱状图)及细胞摄取率(线形图)；其中，A为CP/pDNA基因复合物转染细胞，B为CP-CREDVW/pDNA基因复合物转染细胞，C为CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物转染细胞，D为PEI(10kDa)/pDNA基因复合物转染细胞作为阳性对照，E为Cy5标记的寡核苷酸转染细胞作为阴性对照。
由图12可知，CP/pDNA、CP-CREDVW/pDNA及CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA三组基因复合物测试组细胞摄取率均高于99.9％，这表明各种基因复合物度能够进入EA.hy926内皮细胞中。但是从平均荧光强度来看，三种基因复合物较组较对照组有显著差异，CP/pDNA基因复合物组平均荧光强度为869.20±10.39，CP-CREDVW/pDNA基因复合物组平均荧光强度为1079.22±39.28，而CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物组平均荧光强度为1516.36±49.25。这也说明了REDV靶向多肽修饰PCLMD-g-PEI共聚物作为基因载体较未修饰的有利于细胞摄取，而逐级靶向多肽REDV-G-TAT-G-NLS修饰PCLMD-g-PEI共聚物作为基因载体进一步提高了细胞的摄取，对增强EA.hy826细胞的转染是有益的。
综上所述，TAT-NLS组合多肽的修饰有益于细胞摄取且提高了载体的细胞相容性。但是TAT-NLS组合肽修饰过后基因复合物的粒径会明显的增大，不利于细胞摄取。因此，本发明以辛二醇为引发剂，辛酸亚锡为催化剂，开环聚合制备了聚(己内酯-co-吗啉-2,5-二酮)-g-聚乙烯酰亚胺)(PCLMD-g-PEI)阳离子共聚物，最后通过异端双官能团PEG将功能正常的有活性的REDV多肽、功能失调的无活性的REVD多肽以及REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽接枝在PCLMD-g-PEI(CP)共聚物末端。在水溶液中自组装制备了PCLMD-g-PEI-CREDVW(CP-CREDVW)、PCLMD-g-PEI-CREVDW(CP-CREVDW)和PCLMD-g-PEI-REDV-G-TAT-G-NLS(CP-REDV-G-TAT-G-NLS)共聚物胶束。包括PCLMD-g-PEI(CP)共聚物胶束在内，这四种共聚物胶束粒径均具有适合细胞内吞的粒径和zeta电位。琼脂糖凝胶电泳实验证明这些共聚物胶束均能够在N/P摩尔比大于等于10以后包封负载pEGFP-ZNF580(pDNA)基因。MTT实验和转染实验表明CP/pDNA、CP-CREDVW/pDNA、CP-CREVDW/pDNA和CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA四种基因复合物均具有较低的细胞毒性且均能促进EA.hy926的增殖。CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物作用于细胞效果尤为突出。划痕实验结果表明，经CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物转染细胞迁移能力最强，相对迁移面积达到了83.95±5.51。CP-CREDVW/pDNA基因复合物转染细胞，24小时后相对迁移面积为62.96±6.35。CP-CREVDW/pDNA基因复合物转染细胞，24小时后相对迁移面积仅为35.67±7.25。细胞摄取实验也证明REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽修饰基因载体确能够提高细胞的摄取能力。
总之，本发明的实验结果证明，通过逐级靶向多肽REDV-G-TAT-G-NLS修饰以PEI为基本结构的阳离子共聚物作为基因载体，赋予载体兼具ECs黏附功能、细胞膜靶向功能和细胞核靶向功能，结合PEI特有的质子化效应促使基因复合物同时具有内涵体/溶酶体逃逸功能。这种接枝修饰的方法能够有效减小基因复合物的粒径，降低细胞毒性，使载体具有较好的生物相容性，促进EA.hy926内皮细胞增殖和迁移，提高细胞对载体的摄取能力。
为了解决基因递送过程中载体负载DNA进细胞困难；内涵体溶酶体逃逸困难以及转运DNA进细胞核困难的问题。本发明采用自组装的方法制备了CP-REDV-G-TAT-G-NLS共聚物胶束，作为基因载体赋予其具有内皮细胞靶向功能、内涵体/溶酶体逃逸功能及细胞核靶向功能。相比于不具备这些功能的CP/pDNA基因复合物和只具备内皮细胞靶向功能的CP-CREDVW/pDNA基因复合物，转染pEGFP-ZNF580质粒后在荧光显微镜下可清晰地观察到CP-REDV-G-TAT-G-NLS/pDNA基因复合物具有更好的转染效率。由此推测这种具有逐级靶向功能的基因复合物转染ECs能够解决传统的无靶向或靶向功能单一的基因载体转染ECs转染效率低的问题，在实现人工血管的快速内皮化方面，具有潜在的应用价值。
Claims (10)
1.一种靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以1,8-辛二醇为引发剂，辛酸亚锡作为催化剂，引发己内酯与3-甲基-吗啉-2,5-二酮开环聚合，制得聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)共聚物；
(2)将聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)共聚物与丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺混合，在氮气环境下进行反应，制得羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)共聚物；
(3)将羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)与EDC和NHS混合，活化反应2-4h，然后加入PEI，置于20-30℃油浴中反应22-26h，透析，提纯，冷冻干燥，制得聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-g-聚乙烯酰亚胺共聚物；其中，羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)、EDC、NHS和PEI的重量比为4-8:0.5-1:0.4-0.8:1-3；
(4)以邻二硫吡啶聚乙二醇活性酯为连接剂，将靶向多肽接枝到聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-g-聚乙烯酰亚胺共聚物上，制得靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体；
其中，靶向多肽为CREDVW有活性多肽、CREVDW无活性多肽或REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽；
CREDVW有活性多肽为Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp的简称；CREVDW无活性多肽为Cys-Arg-Glu-Val-Asp-Trp的简称；REDV-G-TAT-G-NLS逐级靶向多肽为Arg-Glu-Asp-Val-Gly-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Cys的简称。
2.根据权利要求1所述的靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体过程为：将1,8-辛二醇、己内酯和3-甲基-吗啉-2,5-二酮混匀，然后加入Sn(Oct)2甲苯溶液，密封，抽真空，通氮气，然后放入油浴锅中，于120-140℃反应22-26h，所得产物采用采用三氯甲烷溶解，正己烷沉出，最后进行真空干燥，制得；其中，1,8-辛二醇、己内酯、3-甲基-吗啉-2,5-二酮和Sn(Oct)2的摩尔比为0.1-0.2:10-12:1:0.02-0.04。
3.根据权利要求1所述的靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体过程为：将羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)溶于二氧六环溶剂，接着加入丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺，混匀，在氮气环境下，密封，置于20-30℃油浴中反应22-26h，制得羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)共聚物；其中，羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的重量比为2-4:0.2-0.4:0.2-0.4，和羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)和三乙胺的质量体积比为2-4:0.2-0.3g/ml。
4.根据权利要求1所述的靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中羧基化聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)、EDC、NHS和PEI的重量比5:0.737:0.443:1.62。
5.根据权利要求1所述的靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体的制备方法，其特征在于，步骤(4)具体过程为：将聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-g-聚乙烯酰亚胺共聚物加入含邻二硫吡啶聚乙二醇活性酯的DMSO溶液中，搅拌反应2-3h后加入含有靶向多肽的DMSO溶液，继续搅拌过夜，透析，冷冻干燥，制得靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体；其中，聚(己内酯-co-3(S)-甲基-吗啉-2,5-二酮)-g-聚乙烯酰亚胺共聚物、靶向多肽和靶向多肽邻二硫吡啶聚乙二醇活性酯的重量比为4-6:1.3:1-3。
6.采用权利要求1-5任一项所述的方法制得的靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体。
7.靶向多肽修饰的阳离子共聚物胶束，其特征在于，通过以下方法制备得到：将权利要求6所述的靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体溶于DMSO中，再滴加到pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌，使其自组装形成共聚物胶束。
8.靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因复合物，其特征在于，通过以下方法制备得到：将权利要求6所述的靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体与pDNA溶液混合，搅拌孵育20-40min，制得基因复合物。
9.权利要求6所述的靶向多肽修饰的阳离子共聚物基因载体在制备修复血管内皮细胞基因药物中的应用。
10.一种修复血管内皮细胞的基因药物，其特征在于，包括权利要求6所述的基因载体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190510 |
|
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