CN108379595A - 多功能靶向性基因载体及制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多功能靶向性基因载体及制备方法及用途，多功能靶向性基因载体，是用P(LA‑co‑GA)‑PEI‑PEG‑NLS‑G‑TAT‑G‑REDV所示的聚合物；本发明的多功能靶向性基因载体，具备穿膜功能和核定位功能、对内皮细胞的靶向功能，通过REDV肽与内皮细胞表面的整合素受体的特异性识别，以及TAT的穿膜作用，提高多功能靶向性多肽修饰的基因载体制备的基因复合物的细胞摄取。通过核定位信号NLS与核膜的相互作用，促进基因的核内在化，从而提高基因递送效果，实现提高转染效率和促进细胞迁移增殖的目的。以解决目前非病毒载体面临的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及到多功能靶向性基因载体及制备方法及用途。
背景技术
基因治疗是很有前景的治疗先天和后天心血管疾病的方法。它是通过载体将治疗性基因有效地传递到靶细胞内，通过基因的表达，调节细胞的行为，从而达到治疗的目的。基因疗法对于治疗心血管疾病的核心问题在于如何提高治疗性基因在内皮细胞的表达效率，而基因载体则在基因传递系统中起着重要的作用。为促进基因复合物在内皮细胞中的传递，增强目的基因的表达，研究表明，Arg-Glu-Asp-Val(REDV)是纤维粘连蛋白衍生的四肽，能特异性的被内皮细胞表面的α4β1整合素识别。而此类整合素在内皮细胞表面表达丰富，但在平滑肌细胞上几乎没有表达。因此，REDV多肽经常用于修饰人工血管表面，实现对内皮细胞的特异性识别和粘附。但是基因复合物实现基因在细胞内的表达需要经历复杂的胞内运输途径，例如在内涵体逃逸和核内在化等方面会存在一定的障碍。
聚阳离子基因载体，例如聚乙烯亚胺(PEI)，含有大量氨基，正电荷较多，进入细胞后可以通过质子海绵效应促进载体实现内涵体逃逸的能力，提高转染效率。然而，较高的电荷密度使得其毒性较高。与阳离子聚合物基因载体相比，多肽载体具有低毒性和高生物相容性。穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPP)是近年来发现的一类具有高效细胞膜穿透能力而且不损伤细胞膜结构和功能的多肽。多数研究己经证明穿膜肽不仅自身能透过多种细胞膜，而且还可有效携带亲水性蛋白、多肽、基因、药物等外源物质，快速穿过细胞膜进入胞质或胞浆，而细胞膜却完好无损，对细胞没有显著毒副作用。YGRKKRRQRRR(TAT)是最常用的细胞穿膜肽，含有丰富的精氨酸片段可以促进细胞内在化。但是，TAT在不同细胞中的细胞摄取不存在特异性。
细胞核是细胞的控制中心，包含蛋白质合成所需的基因信息。细胞核膜只允许粒径小于10纳米的颗粒在细胞核与细胞质之间自由穿行，而较大的颗粒需要经由核膜上核孔的核定位信号(NLS)来传送，因此，可利用NLS提高核酸向核内运送的能力。
目前，尚未有利用多功能靶向多肽(REDV-G-TAT-G-NLS)修饰聚(丙交酯-co-乙交酯)-聚乙烯亚胺及用途的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种对内皮细胞具有靶向识别能力，高转染效率且低毒的多功能靶向性基因载体。
本发明的第二个目的是提供多功能靶向性基因载体的制备方法。
本发明的第三个目的是提供多功能靶向性基因载体的用途。
本发明的技术方案概述如下：
多功能靶向性基因载体，是用P(LA-co-GA)-PEI-PEG-NLS-G-TAT-G-REDV所示的聚合物；
其中，P(LA-co-GA)-PEI为聚(丙交酯-co-乙交酯)-聚乙烯亚胺的简称；
PEG为聚乙二醇的简称；
REDV-G-TAT-G-NLS为多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
上述多功能靶向性基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将1,8-辛二醇、LA和GA放入干燥的聚合管中，加入辛酸亚锡作为催化剂，密封；对聚合管抽真空，充氮气，重复8-12次，升温至140-150℃反应24-28小时，得到P(LA-co-GA)粗品；精制，得到P(LA-co-GA)；
LA为丙交酯的简称；
GA为乙交酯的简称；
P(LA-co-GA)为聚(丙交酯-co-乙交酯)的简称；
所述1,8-辛二醇、LA、GA和辛酸亚锡的摩尔比为5：140-560：43-132：1-2；
(2)按摩尔比为1：10-20：10-20的比例，将P(LA-co-GA)、丁二酸酐和二甲氨基吡啶，以及三乙胺溶解在干燥的1，4-二氧六环中，在25-30℃、氮气保护下反应20-25小时，得到溶液1，将溶液1滴加入搅拌下的0-10℃的乙醇中，有沉淀生成；固液分离，固体溶解到三氯甲烷中，依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤2-3次，稀盐酸洗涤3-4次，饱和氯化钠水溶液洗涤4-5次，向油相中加入无水硫酸钠干燥至恒重，得到端基为羧基的P(LA-co-GA)，所述三乙胺为P(LA-co-GA)质量的1-3倍；
(3)按摩尔比为1：15-30：15-30的比例，将端基为羧基的P(LA-co-GA)、EDC和NHS溶解在DMSO中，室温搅拌1-2小时，加入PEI的DMSO溶液中，使得端基为羧基的P(LA-co-GA)和PEI的摩尔比为1：5-15，室温搅拌反应20-24小时，置于截留分子量为3500-14000的透析袋中，用超纯水透析2-3天，透析液冷冻干燥得P(LA-co-GA)-PEI；
EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的简称；
NHS为N-羧基丁二酰亚胺的简称；
DMSO为二甲基亚砜的简称；
PEI为聚乙烯亚胺的简称；
P(LA-co-GA)-PEI为聚(丙交酯-co-乙交酯)-聚乙烯亚胺的简称；
(4)在氮气保护下，将P(LA-co-GA)-PEI溶解于DMSO中得到溶液2，向溶液2中逐滴滴入OPSS-PEG-NHS的DMSO溶液，在室温、避光条件下，反应2-4小时，加入REDV-G-TAT-G-NLS多肽的DMSO溶液，反应4-8小时，产物置于截留分子量为3500的透析袋中，在超纯水中透析48-72小时，透析液冷冻干燥，得到P(LA-co-GA)-PEI-PEG-NLS-G-TAT-G-REDV多功能靶向性基因载体；
P(LA-co-GA)-PEI，OPSS-PEG-NHS和REDV-G-TAT-G-NLS的摩尔比为1：10-20：10-20；
OPSS-PEG-NHS为邻二硫吡啶聚乙二醇活性酯的简称；
REDV-G-TAT-G-NLS是REDV-G-YGRKKRRQRRR-G-PKKKRKV-C的简称。
所述聚乙烯亚胺的重均分子量为1800或10000。
上述多功能靶向性多肽修饰的基因载体在制备提高内皮细胞转染效率药物中的应用。
本发明的优点：
(1)本发明的多功能靶向性基因载体，以聚合物聚(丙交酯-co-乙交酯)-聚乙烯亚胺为基础，通过OPSS-PEG-NHS接枝大量REDV-G-TAT-G-NLS多肽，其中聚(丙交酯-co-乙交酯)作为疏水核心，聚合物在自组装过程中形成纳米胶束，其结构稳定性高于单独的多肽基因载体，有利于内涵体逃逸，并且提高了基因复合物的转染效率。
(2)本发明的多功能靶向性基因载体，具备穿膜功能和核定位功能、对内皮细胞的靶向功能，通过REDV肽与内皮细胞表面的整合素受体的特异性识别，以及TAT的穿膜作用，提高多功能靶向性多肽修饰的基因载体制备的基因复合物的细胞摄取。通过核定位信号NLS与核膜的相互作用，促进基因的核内在化，从而提高基因递送效果，实现提高转染效率和促进细胞迁移增殖的目的。以解决目前非病毒载体面临的问题。
附图说明
图1为内皮细胞的相对细胞活力图。
图2内皮细胞摄取图。
图3内皮细胞转染图以及转染效率。
具体实施方式
ZNF580基因来源：ZNF580是由中国人民武装警察部队后勤学院生理与病理实验室张文成课题组首先克隆并于Genbank注册的C2H2型转录因子新基因，注册号为AF184939，其核苷酸序列是SEQ ID NO.2所示。
pEGFP为市售。
内皮细胞(EA.hy926)购自中国科学院细胞库(上海研发公共服务平台)。
Cy5标记的核苷酸序列(GAATGAATTCTGACTGTACTGACTCGACTG,SEQ ID NO.3),简称Cy5-oligonucleotide，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
OPSS-PEG-NHS为邻二硫吡啶聚乙二醇活性酯的简称，购自北京键凯科技有限公司。
PEI为聚乙烯亚胺的简称，购自Sigma试剂公司。
REDV-G-TAT-G-NLS是REDV-G-YGRKKRRQRRR-G-PKKKRKV-C(SEQ ID NO.1)的简称，委托上海吉尔生化有限公司制备。
各实施例中：
P(LA-co-GA)-PEI为聚(丙交酯-co-乙交酯)-聚乙烯亚胺的简称；
PEG为聚乙二醇的简称；
LA为丙交酯的简称；
GA为乙交酯的简称；
P(LA-co-GA)为聚(丙交酯-co-乙交酯)的简称；
EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的简称；
NHS为N-羧基丁二酰亚胺的简称；
DMSO为二甲基亚砜的简称；
P(LA-co-GA)-PEI1.8为聚(丙交酯-co-乙交酯)-聚乙烯亚胺的简称(其中聚乙烯亚胺的重均分子量为1800)；
P(LA-co-GA)-PEI10为聚(丙交酯-co-乙交酯)-聚乙烯亚胺的简称(其中聚乙烯亚胺的重均分子量为10000)；
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，应理解，该实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做改动或修改，该等价形式同样落于本申请的权利要求所限定的范围。
实施例1
多功能靶向性基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将1,8-辛二醇、LA和GA放入干燥的聚合管中，加入辛酸亚锡作为催化剂，密封；对聚合管抽真空，充氮气，重复8次，升温至140℃反应28小时，得到P(LA-co-GA)粗品；将P(LA-co-GA)粗品用三氯甲烷溶解，得到溶液，将溶液加入搅拌下的正己烷中，有沉淀生成，固液分离，重复2次，三氯甲烷和正己烷的体积比为1：8；得到的沉淀在真空干燥箱中干燥至恒重，得到精制后的P(LA-co-GA)；所述1,8-辛二醇、LA、GA和辛酸亚锡的摩尔比例为5：140：43：1；
(2)按摩尔比为1：10：10的比例，将P(LA-co-GA)、丁二酸酐和二甲氨基吡啶，以及三乙胺溶解在干燥的1，4-二氧六环中，在25℃、氮气保护下反应25小时，得到溶液1，将溶液1滴加入搅拌下的0℃的乙醇中，有沉淀生成；固液分离，固体溶解到三氯甲烷中，依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤2次，稀盐酸洗涤3次，饱和氯化钠水溶液洗涤4次，向油相中加入无水硫酸钠干燥至恒重，得到端基为羧基的P(LA-co-GA)，所述三乙胺为P(LA-co-GA)质量的1倍；
(3)按摩尔比为1：15：15的比例，将端基为羧基的P(LA-co-GA)、EDC和NHS溶解在DMSO中，室温搅拌1小时，加入重均分子量为1800的PEI的DMSO溶液中，使得端基为羧基的P(LA-co-GA)和PEI的摩尔比为1：5，室温搅拌反应20小时，置于截留分子量为3500的透析袋中，用超纯水透析2天，透析液冷冻干燥得P(LA-co-GA)-PEI1.8；
(4)在氮气保护下，将P(LA-co-GA)-PEI1.8溶解于DMSO中得到溶液2，向溶液2中逐滴滴入重均分子量为2000的OPSS-PEG-NHS的DMSO溶液，在室温、避光条件下，反应2小时，加入REDV-G-TAT-G-NLS多肽的DMSO溶液，反应4小时，产物置于截留分子量为3500的透析袋中，在超纯水中透析48小时，透析液冷冻干燥，得到P(LA-co-GA)-PEI1.8-PEG-NLS-G-TAT-G-REDV多功能靶向性基因载体；
所述P(LA-co-GA)-PEI1.8，OPSS-PEG-NHS和REDV-G-TAT-G-NLS的摩尔比为1：10：10。
实施例2
多功能靶向性基因载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将1,8-辛二醇、LA和GA放入干燥的聚合管中，再加入辛酸亚锡作为催化剂，密封；对聚合管抽真空，充氮气，重复12次，升温至150℃反应24小时，得到P(LA-co-GA)粗品；将P(LA-co-GA)粗品用三氯甲烷溶解，得到溶液，将溶液加入搅拌下的正己烷中，有沉淀生成，固液分离，重复4次，三氯甲烷和正己烷的体积比为1：12；得到的沉淀在真空干燥箱中干燥至恒重，得到精制后的P(LA-co-GA)；
所述1,8-辛二醇、LA、GA和辛酸亚锡的摩尔比例为5：560：132：2；
(2)按摩尔比为1：20：20的比例，将P(LA-co-GA)、丁二酸酐和二甲氨基吡啶，以及三乙胺溶解在干燥的1，4-二氧六环中，在30℃、氮气保护下反应20小时，得到溶液1，将溶液1滴加入搅拌下的10℃的乙醇中，有沉淀生成；固液分离，固体溶解到三氯甲烷中，依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3次，稀盐酸洗涤4次，饱和氯化钠水溶液洗涤5次，向油相中加入无水硫酸钠干燥至恒重，得到端基为羧基的P(LA-co-GA)，所述三乙胺为P(LA-co-GA)质量的3倍；
(3)按摩尔比为1：30：30的比例，将端基为羧基的P(LA-co-GA)、EDC和NHS溶解在DMSO中，室温搅拌2小时，加入重均分子量为1800的PEI的二甲基亚砜溶液中，使得端基为羧基的P(LA-co-GA)和PEI的摩尔比为1：15，室温搅拌反应24小时，置于截留分子量为3500的透析袋中，用超纯水透析3天，透析液冷冻干燥得P(LA-co-GA)-PEI1.8；
(4)在氮气保护下，将P(LA-co-GA)-PEI1.8溶解于DMSO中得到溶液2，向溶液2中逐滴滴入重均分子量为2000的OPSS-PEG-NHS的DMSO溶液，在室温、避光条件下，反应4小时，加入REDV-G-TAT-G-NLS多肽的DMSO溶液，反应8小时，产物置于截留分子量为3500的透析袋中，在超纯水中透析72小时，透析液冷冻干燥，得到P(LA-co-GA)-PEI1.8-PEG-NLS-G-TAT-G-REDV多功能靶向性基因载体。
所述P(LA-co-GA)-PEI1.8，OPSS-PEG-NHS和REDV-G-TAT-G-NLS的摩尔比为1：20：20。
实施例3
多功能靶向性基因载体的制备方法
(1)同实施例1步骤(1)；
(2)同实施例1步骤(2)；
(3)按摩尔比为1：15：15的比例，将端基为羧基的P(LA-co-GA)、EDC和NHS溶解在DMSO中，室温搅拌1小时，加入重均分子量为10000的PEI的DMSO溶液中，使得端基为羧基的P(LA-co-GA)和PEI的摩尔比为1：5，室温搅拌反应20小时，置于截留分子量为14000的透析袋中，用超纯水透析2天，透析液冷冻干燥得P(LA-co-GA)-PEI10；
(4)在氮气保护下，将P(LA-co-GA)-PEI10溶解于DMSO中得到溶液2，向溶液2中逐滴滴入重均分子量为2000的OPSS-PEG-NHS的DMSO溶液，在室温、避光条件下，反应2小时，加入REDV-G-TAT-G-NLS多肽的DMSO溶液，反应4小时，产物置于截留分子量为3500的透析袋中，在超纯水中透析48小时，透析液冷冻干燥，得到P(LA-co-GA)-PEI10-PEG-NLS-G-TAT-G-REDV多功能靶向性基因载体；
所述P(LA-co-GA)-PEI10，OPSS-PEG-NHS和REDV-G-TAT-G-NLS的摩尔比为1：10：10。
实施例4
多功能靶向性基因载体的制备方法
(1)同实施例2步骤(1)；
(2)同实施例2步骤(2)；
(3)按摩尔比为1：30：30的比例，将端基为羧基的P(LA-co-GA)、EDC和NHS溶解在DMSO中，室温搅拌2小时，加入重均分子量为10000的PEI的二甲基亚砜溶液中，使得端基为羧基的P(LA-co-GA)和PEI的摩尔比为1：15，室温搅拌反应24小时，置于截留分子量为14000的透析袋中，用超纯水透析3天，透析液冷冻干燥得P(LA-co-GA)-PEI10；
(4)在氮气保护下，将P(LA-co-GA)-PEI10溶解于DMSO中得到溶液2，向溶液2中逐滴滴入重均分子量为2000的OPSS-PEG-NHS的DMSO溶液，在室温、避光条件下，反应4小时，加入REDV-G-TAT-G-NLS多肽的DMSO溶液，反应8小时，产物置于截留分子量为3500的透析袋中，在超纯水中透析72小时，透析液冷冻干燥，得到P(LA-co-GA)-PEI10-PEG-NLS-G-TAT-G-REDV多功能靶向性基因载体。
所述P(LA-co-GA)-PEI10，OPSS-PEG-NHS和REDV-G-TAT-G-NLS的摩尔比为1：20：20。
实施例5(对照例)：
(1)同实施例1步骤(1)；
(2)同实施例1步骤(2)；
(3)同实施例1步骤(3)。
实施例6
多功能靶向性基因载体(简称基因载体)，基因复合物，对照基因载体，对照基因复合物通过四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)考察细胞毒性。
基因载体(实施例1-4)与pEGFP-ZNF580(pZNF580)制备基因复合物：
步骤为：在搅拌条件下，取浓度为200微克/毫升的pZNF580水溶液，按N/P摩尔比(基因载体中氮含量与pZNF580中磷含量的摩尔比)为20，滴加到基因载体水溶液(0.2毫克/毫升)中，搅拌1小时，得到基因复合物。
对照基因载体(实施例5)与pZNF580制备对照基因复合物：
步骤为：在搅拌条件下，取浓度为200微克/毫升的pZNF580水溶液，按N/P摩尔比为20，滴加到对照基因载体水溶液(0.2毫克/毫升)中，搅拌1小时，得到对照基因复合物。
步骤如下：EA.hy926细胞悬浮于完全培养基(含10％FBS的DMEM)中，然后接种到96孔板(1×104细胞/孔)中，细胞生长到90％后，将完全培养基换为无血清DMEM培养基，进行饥饿处理12小时。之后重新更换为无血清DMEM培养基，将制备的基因载体水溶液，基因复合物水溶液，对照基因载体水溶液，对照基因复合物水溶液加入到无血清DMEM培养基中(得到的基因载体水溶液，基因复合物水溶液，对照基因载体水溶液，对照基因复合物水溶液的终浓度为5，20，40，60，80，100微克/毫升)，混合均匀，4小时后弃去培养基，更换为完全培养基，继续培养48小时。然后向每个孔中加入5毫克/毫升的MTT溶液20微升，继续培养4小时，使甲瓒充分结晶。小心弃去孔内培养基，而后向孔内加入150微升DMSO，置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在490纳米波长处测量各孔的光密度值(OD)。利用如下公式计算相对细胞活性(％)：
其中，OD490’：实验组减去调零组的吸光度值，avg(OD490C’)：矫正后的对照组吸光度平均值。
分析结果：图1为细胞活性，分别测定了对照基因载体、对照基因复合物、实施例1、
实施例2、实施例3和实施例4制备的基因载体及其基因复合物。
在相同浓度下，实施例1、实施例2制备的基因载体及其复合物的细胞毒性要远低于对照基因载体，对照基因复合物的细胞毒性，这是由于引入了大量的PEG链段，在胶束表面形成一层亲水保护层，其屏蔽效应对内皮细胞起到了有效的保护作用。在接枝相同PEI分子量下，实施例2制备的基因载体及其复合物的细胞毒性要低于实施例1制备的基因载体及其复合物的细胞毒性；实施例4制备的基因载体及其复合物的细胞毒性要低于实施例3制备的基因载体及其复合物的细胞毒性。这是由于REDV-G-TAT-G-NLS多肽的引入不会降低细胞毒性，同时，引入的REDV-G-TAT-G-NLS多肽越多，细胞活性越高。
实施例7
多功能靶向性基因载体(简称基因载体)与Cy5-oligonucleotide制备Cy5基因复合物的摄取以及平均荧光强度。
多功能靶向性基因载体(简称基因载体)与Cy5-oligonucleotide制备Cy5基因复合物。
步骤为：在搅拌条件下，取浓度为80微克/毫升的Cy5-oligonucleotide水溶液12微升，按N/P摩尔比为20，滴加到基因载体水溶液(0.2毫克/毫升)中，搅拌1小时，得到Cy5基因复合物。
对照基因载体与Cy5-oligonucleotide制备Cy5对照基因复合物。
步骤为：在搅拌条件下，取浓度为80微克/毫升的Cy5-oligonucleotide水溶液12微升，按N/P摩尔比为20，滴加到对照基因载体水溶液(0.2毫克/毫升)中，搅拌1小时，得到Cy5对照基因复合物。
步骤如下：EA.hy926细胞悬浮于完全培养基(含10％FBS的DMEM)中，接种到6孔板(3×105细胞/孔)中，细胞生长到90％后，将完全培养基换为无血清DMEM培养基，进行饥饿处理12小时。之后重新更换为无血清DMEM培养基，将制备的Cy5基因复合物，Cy5对照基因复合物水溶液加入到无血清DMEM培养基中，混合均匀，4小时后弃去培养基，胰酶消化后，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，重悬细胞，用流式细胞仪检测细胞对Cy5基因复合物，Cy5对照基因复合物的细胞摄取。
分析结果：图2为内皮细胞对Cy5基因复合物，Cy5对照基因复合物的细胞摄取。
A内皮细胞对Cy5对照基因复合物的平均荧光强度；
B内皮细胞对实施例1制备的Cy5基因复合物的平均荧光强度；
C内皮细胞对实施例2制备的Cy5基因复合物的平均荧光强度；
D内皮细胞对实施例3制备的Cy5基因复合物的平均荧光强度；
E内皮细胞对实施例4制备的Cy5基因复合物的平均荧光强度。
如图2所示，实施例1和实施例2制备的Cy5基因复合物的平均荧光强度要略高于Cy5对照基因复合物的平均荧光强度，这是由于引入了REDV-G-TAT-G-NLS多肽的原因。REDV-G-TAT-G-NLS多肽中特异性内皮细胞靶向多肽REDV和穿膜肽TAT的协同作用，有利于载基因复合物在细胞内富集，这对增强内皮细胞的转染非常有帮助。在相同PEI含量下，实施例2制备的Cy5基因复合物的平均荧光强度(822.3±167.0)高于实施例1制备的Cy5基因复合物的平均荧光强度(793.3±49.0)，实施例4制备的Cy5基因复合物的平均荧光强度(3783.0±363.7)高于实施例3制备的Cy5基因复合物的平均荧光强度(3345.1±306.0)，这表明，接入的REDV-G-TAT-G-NLS多肽含量越多，越有利于基因复合物在细胞内富集。
实施例8
基因复合物，对照基因复合物对内皮细胞的体外转染实验。
步骤如下：EA.hy926细胞悬浮于完全培养基(含10％FBS的DMEM)中，接种到24孔板(1×105细胞/孔)中，细胞生长到90％后，将完全培养基换为无血清DMEM培养基，进行饥饿处理12小时。之后重新更换为无血清DMEM培养基，加入新配制的基因复合物、对照基因复合物，每孔的DNA含量为3微克。4小时后更换为完全培养基，培养24小时后，通过倒置荧光显微镜观察不同复合物在细胞中的转染效果。之后，转染的细胞用胰酶消化，用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，重悬细胞，用流式细胞仪检测转染效率。
分析结果：图3(1)为内皮细胞被基因复合物、对照基因复合物转染24小时后的荧光图，(2)为内皮细胞被基因复合物、对照基因复合物转染24小时后的转染效率。
A对照基因复合物在内皮细胞的转染效果；
B实施例1制备的基因复合物在内皮细胞的转染效果；
C实施例2制备的基因复合物在内皮细胞的转染效果；
D实施例3制备的基因复合物在内皮细胞的转染效果；
E实施例4制备的基因复合物在内皮细胞的转染效果。
通过体外转染内皮细胞，考察不同的基因复合物传递目的基因到靶细胞的效率。从图3可以看到，基因复合物和对照基因复合物均可以成功的转染内皮细胞。在相同PEI分子量下，实施例2制备的基因复合物的转染效率高于实施例1制备的基因复合物的转染效率，实施例4制备的基因复合物的转染效率高于实施例3制备的基因复合物的转染效率，并且实施例4的转染效果最好(6.48％)。这是由于，当PEI的分子量相同时，加入REDV-G-TAT-G-NLS多肽后，由于REDV-G-TAT-G-NLS多肽中特异性内皮细胞靶向多肽REDV，穿膜肽TAT和核定位信号肽NLS的共同作用，提高转染效率。在连接的多肽数目相同时，实施例3和实施例4制备的基因复合物的转染效率高于实施例1和实施例2制备的基因复合物的转染效率，是因为高分子量PEI具有较高的正电荷，利于转染。
SEQ ID NO.1:REDV-G-YGRKKRRQRRR-G-PKKKRKV-C人工序列
SEQ ID NO.2
ZNF580基因序列，人工序列
SEQ ID NO.3：gaatgaattctgactgtactgactcgactg,人工序列
序列表
<110> 天津大学
<120> 多功能靶向性基因载体及制备方法及用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Glu Asp Val Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10 15
Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Cys
20 25
<210> 2
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgctgctgc tgcctccgcg cccaccgcat ccgcgttctt cttctccaga agcaatggac 60
ccgccgcctc cgaaagcccc accgttcccg aaagctgaag gcccgtcctc tactccgtct 120
agcgccgctg gcccgcgtcc gccacgcctg ggtcgtcacc tgctgatcga tgccaacggt 180
gtaccgtaca cctacactgt tcagctggaa gaggaaccac gtggcccgcc gcaacgtgaa 240
gcacctccgg gtgaaccggg ccctcgtaaa ggttattcct gcccggaatg tgcacgtgtg 300
ttcgcatctc cgctgcgtct gcagagccac cgcgttagcc actccgacct gaagccgttc 360
acctgcggcg cgtgcggtaa agctttcaaa cgtagctccc acctgtctcg tcaccgtgcg 420
acccaccgcg ctcgtgcggg tccgccgcat acgtgcccgc tgtgtccacg tcgctttcag 480
gatgctgcgg agctggcgca gcacgtccgc ctgcattaa 519
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaatgaattc tgactgtact gactcgactg 30
Claims (4)
1.多功能靶向性基因载体，其特征是用P(LA-co-GA)-PEI-PEG-NLS-G-TAT-G-REDV所示的聚合物；
其中，P(LA-co-GA)-PEI为聚(丙交酯-co-乙交酯)-聚乙烯亚胺的简称；
PEG为聚乙二醇的简称；
REDV-G-TAT-G-NLS为多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1的多功能靶向性基因载体的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将1,8-辛二醇、LA和GA放入干燥的聚合管中，加入辛酸亚锡作为催化剂，密封；对聚合管抽真空，充氮气，重复8-12次，升温至140-150℃反应24-28小时，得到P(LA-co-GA)粗品；精制，得到P(LA-co-GA)；
LA为丙交酯的简称；
GA为乙交酯的简称；
P(LA-co-GA)为聚(丙交酯-co-乙交酯)的简称；
所述1,8-辛二醇、LA、GA和辛酸亚锡的摩尔比为5：140-560：43-132：1-2；
(2)按摩尔比为1：10-20：10-20的比例，将P(LA-co-GA)、丁二酸酐和二甲氨基吡啶，以及三乙胺溶解在干燥的1，4-二氧六环中，在25-30℃、氮气保护下反应20-25小时，得到溶液1，将溶液1滴加入搅拌下的0-10℃的乙醇中，有沉淀生成；固液分离，固体溶解到三氯甲烷中，依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤2-3次，稀盐酸洗涤3-4次，饱和氯化钠水溶液洗涤4-5次，向油相中加入无水硫酸钠干燥至恒重，得到端基为羧基的P(LA-co-GA)，所述三乙胺为P(LA-co-GA)质量的1-3倍；
(3)按摩尔比为1：15-30：15-30的比例，将端基为羧基的P(LA-co-GA)、EDC和NHS溶解在DMSO中，室温搅拌1-2小时，加入重均分子量为1800的PEI的DMSO溶液中，使得端基为羧基的P(LA-co-GA)和PEI的摩尔比为1：5-15，室温搅拌反应20-24小时，置于截留分子量为3500-14000的透析袋中，用超纯水透析2-3天，透析液冷冻干燥得P(LA-co-GA)-PEI；
EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的简称；
NHS为N-羧基丁二酰亚胺的简称；
DMSO为二甲基亚砜的简称；
PEI为聚乙烯亚胺的简称；
P(LA-co-GA)-PEI为聚(丙交酯-co-乙交酯)-聚乙烯亚胺的简称；
(4)在氮气保护下，将P(LA-co-GA)-PEI溶解于DMSO中得到溶液2，向溶液2中逐滴滴入OPSS-PEG-NHS的DMSO溶液，在室温、避光条件下，反应2-4小时，加入REDV-G-TAT-G-NLS多肽的DMSO溶液，反应4-8小时，产物置于截留分子量为3500的透析袋中，在超纯水中透析48-72小时，透析液冷冻干燥，得到P(LA-co-GA)-PEI-PEG-NLS-G-TAT-G-REDV多功能靶向性基因载体；
P(LA-co-GA)-PEI，OPSS-PEG-NHS和REDV-G-TAT-G-NLS的摩尔比为1：10-20：10-20；
OPSS-PEG-NHS为邻二硫吡啶聚乙二醇活性酯的简称；
REDV-G-TAT-G-NLS是REDV-G-YGRKKRRQRRR-G-PKKKRKV-C的简称。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述聚乙烯亚胺的重均分子量为1800或10000。
4.权利要求1的多功能靶向性多肽修饰的基因载体在制备提高内皮细胞转染效率药物中的应用。
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