CN106086079B - 多重靶向修饰的载基因复合物及制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了多重靶向修饰的载基因复合物及制备方法及应用，其方法为：制备膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)；将TAT‑NLS多肽水溶液与核酸水溶液混匀；得混合液；将基因载体(I)配成悬浮液；(4)悬浮液和混合液混匀，静置，得到多重靶向修饰的载基因复合物；本发明的多重靶向修饰的载基因复合物。通过膜靶向肽中的REDV肽与内皮细胞表面的整合素受体特异性识别，提高细胞对其摄取。进入细胞后的复合物位于溶酶体/内涵体结构中，通过聚乙烯亚胺与TAT共同作用，提高该复合物的内涵体逃逸能力，促进目的基因进入细胞质中。通过核定位信号NLS与核膜的相互作用，促进目的基因的核内在化。目的基因在内皮细胞中的转染效率强。

Description

多重靶向修饰的载基因复合物及制备方法及应用
技术领域
本发明涉及多重靶向修饰的载基因复合物及制备方法及应用，属于具有生物靶向识别功能的基因载体技术领域。
背景技术
目前，心血管疾病日益盛行。由于临床治疗效果不佳以及巨额的治疗费用，心血管疾病是全球造成死亡的主要原因之一。基因疗法是很有前景的治疗先天和后天性心血管疾病的方法。随着心力衰竭及相关心血管疾病的病理生理学分子途径的识别，基因治疗的预临床试验在小型和大型动物模型上纷纷展开，并逐步走向临床，然而，最初的临床效果并没有达到预期的目标。病毒载体因其固有的致命性免疫原性，虽然转染效果较好，但仍备受争议。非病毒基因载体很好地避免了病毒载体的这一问题，但是转染效率差、基因表达水平低以及无法在目标组织或细胞累积是其面临的主要问题。
为了促进载基因复合物在内皮细胞的传递，增强目的基因的表达，本课题组采用内皮细胞靶向性肽REDV(Arg-Glu-Asp-Val)修饰的方法，特异性增强载基因复合物与内皮细胞的相互作用，进而促进细胞摄取实现高转染。然而，载基因复合物实现基因的表达需要经历复杂的细胞内运输途径，其中最关键的两步就是内涵体/溶酶体逃逸和核内在化。载基因复合物通过内吞途径进入细胞后形成小泡进而发育成内涵体、溶酶体。溶酶体内pH值急剧下降，富含的各种酸性水解酶达到最佳活性，降解质粒DNA而使载基因复合物丧失转染能力，因此实现载基因复合物的内涵体逃逸很重要。穿膜肽是一类具有特定功能的、可以与细胞的膜结构作用并促进穿透的短链分子。因此，穿膜肽可用于载基因复合物的细胞摄取及内涵体逃逸。TAT是最常用的细胞穿膜肽，其内部富含带正电荷的精氨酸片段。正是由于TAT聚阳离子的特点，可通过共价键将TAT多肽与寡核苷酸连接，也可以通过正负电荷的相互作用形成TAT/DNA复合物而用于基因转染。但是，TAT在不同细胞和组织的细胞摄取不具有特异性，且单独TAT/DNA复合物的转染效率很低，因此，能否通过TAT与靶向纳米粒协同作用，进一步赋予靶向载基因复合物穿膜性能来促进核酸在内皮细胞中的特异性转染。
另外，基因的表达是在细胞核内经转录形成mRNA来实现。研究表明，当在细胞质中注射基因时，其表达只有不到10％。而直接向细胞核内注射可实现高达50％的基因表达。因此核内在化是增强基因表达，提高治疗效果的又一关键。细胞核表面的核膜只允许小颗粒自由穿行，而对于粒径大于10nm的颗粒(如蛋白和DNA)需要经核膜上的核定位信号(NLS)来传送，因此可利用NLS来提高核酸向核内运送的能力。
目前对于这种多重靶向修饰的载基因复合物在促进内皮细胞转染方面的研究还较少。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种生物靶向识别性能好，转染效率高，生物毒性低的多重靶向修饰的载基因复合物。
本发明的第二个目的是提供一种多重靶向修饰的载基因复合物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种多重靶向修饰的载基因复合物在制备修复血管内皮细胞药物的应用。
本发明的技术方案概述如下：
多重靶向修饰的载基因复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)在氮气保护下，将重均分子量为26000-30000的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物、重均分子量为2000-7500的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇，在混合溶剂中溶解，在室温、避光条件下反应2-4h，加入膜靶向肽，反应4-8h，产物在蒸馏水中透析48-72h，冷冻干燥，得到膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)；
所述聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的所接枝的支化聚乙烯亚胺的重均分子量相同，且为10000。
所述混合溶剂由体积比为1：(2-4)的pH为8.0-9.0的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和二甲基亚砜组成；
所述聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物、所述的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇以及膜靶向肽的摩尔比为1：(1-20)：(0.5-20)；
所述膜靶向肽为Cys-X-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，所述X为0-5个Gly、或0-5个Ala、或0-5个Gly和Ala的任意组合；
(2)室温下，按简写为TAT-NLS多肽与核酸的质量比为(0.5-1.2)：1的比例，将TAT-NLS多肽水溶液与核酸水溶液混合均匀，静置20-40分钟；得到混合液；
(3)将所述基因载体(I)配成浓度为0.1-0.8mg/mL的基因载体(I)纳米粒悬浮液；
(4)将所述基因载体(I)纳米粒悬浮液和步骤(2)获得的混合液混合均匀，静置20-40分钟，得到多重靶向修饰的载基因复合物；所述基因载体(I)的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的氮与混合液中核酸的磷的摩尔比为10-30：1。
上述方法制备的多重靶向修饰的载基因复合物。
上述的多重靶向修饰的载基因复合物在制备修复血管内皮细胞基因药物的应用。
本发明的多重靶向修饰的载基因复合物集多重靶向识别与基因于一身。通过膜靶向肽中的REDV肽与内皮细胞表面的整合素受体特异性识别，提高细胞对多重靶向修饰的载基因复合物的摄取。进入细胞后的多重靶向修饰的载基因复合物位于溶酶体/内涵体结构中，通过聚乙烯亚胺与细胞穿膜肽TAT的共同作用，提高多重靶向修饰的载基因复合物的内涵体逃逸能力，促进目的基因进入细胞质中。通过核定位信号NLS与核膜的相互作用，促进目的基因的核内在化。目的基因在内皮细胞中的转染效率也就随之增强。
附图说明
图1为膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体荧光图：图中1为0.45mg/mL的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物的荧光发射光谱图；2为0.65mg/mL膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)的荧光发射光谱图；3为0.10mg/mL的CREDVW多肽的发射光谱图。
图2为多重靶向修饰的载基因复合物(TAT-NLS/pGFP/REDV-NP)(B)和对照(pGFP/REDV-NP)(A)，在不同氮磷摩尔比(N/P)结合时的流体力学直径分布图。
图3为多重靶向修饰的载基因复合物(TAT-NLS/pGFP/REDV-NP)(B)和对照(pGFP/REDV-NP)(A)，在不同氮磷摩尔比(N/P)结合时的Zeta电位分布图。
图4为多重靶向修饰的载基因复合物(TAT-NLS/pGFP/REDV-NP)(B)和对照(pGFP/REDV-NP)(A)在不同N/P比时的琼脂糖凝胶电泳成像图。
图5为膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(REDV-NP纳米粒)(A)、pGFP/REDV-NP(B)、多重靶向修饰的载基因复合物(TAT-NLS/pGFP/REDV-NP)(C)和pGFP/PEI10000(D)复合物(N/P＝20)对人脐静脉内皮细胞的细胞毒性考察效果图。(PEI10000指代重均分子量为10000的支化聚乙烯亚胺)。
图6为人脐静脉内皮细胞被不同的载基因复合物转染24h后的荧光图(A、B、C、D)及
其对应的明场图(A’、B’、C’、D’)：
A和A’为单独pGFP在脐静脉内皮细胞的转染结果(空白对照)；
B和B’为pGFP/REDV-NP在脐静脉内皮细胞的转染结果(阴性对照)；
C和C’为TAT-NLS/pGFP/REDV-NP在人脐静脉内皮细胞的转染结果；
D和D’为pGFP/PEI25000在人脐静脉内皮细胞的转染结果(阳性对照)。
(PEI25000是指重均分子量为25000的支化聚乙烯亚胺)。标尺＝100μm。
图7为人脐静脉内皮细胞对不同载基因复合物的摄取：
图7(1)为不同荧光强度的细胞统计，其中：
A为对pGFP/Cy5-REDV-NP的摄取；
B为对TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP的摄取；
C为未处理的细胞。
图7(2)不同荧光强度的细胞统计。左边为平均荧光强度，右边为细胞摄取率。
A为对pGFP/Cy5-REDV-NP的摄取；
B为对TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP的摄取；
C为未处理的细胞。
图8为转染4h(1)和24h(2)后，Cy5-Oligo/REDV-NP和TAT-NLS/Cy5-Oligo/REDV-NP中Cy5-Oligo的细胞内分布。标尺＝20μm。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg的多肽简称为TAT委托上海吉尔生化有限公司制备。
Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val的多肽简称为NLS，委托上海吉尔生化有限公司制备。
两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇(OPSS-PEG-NHS)购于北京键凯科技有限公司。
聚乙烯亚胺购于Sigma试剂公司。
聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物为实验室自制，制备方法参阅Juan Lv,Jing Yang,Xuefang Hao,Xiangkui Ren,Yakai Feng,WenchengZhang.Biodegradable PEI modified complex micelles as gene carriers withtunable gene transfection efficiency for ECs.Journal of Materials ChemistryB,2016,4,997-1008论文。
REDV-NP指代膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)。
pGFP指代含绿色荧光蛋白基因的质粒,购自科域新程(天津)科技开发有限公司。
Cy5荧光染料购自天津希恩思生化科技有限公司。
Cy5标记的核苷酸序列(GAATGAATTCTGACTGTACTGACTCGACTG)，简称为Cy5-Oligo，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
Lyso Tracker可将活细胞的内涵体/溶酶体标记为红色，购自Invitrogen。
Hoechst 33342可将活细胞的细胞核标记为蓝色，购自Lifetechnology。
Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp的多肽简称为CREDVW。
实施例1：膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)的制备方法，包括如下步骤：
在氮气保护下，将重均分子量为30000的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物,所述聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的所接枝的支化聚乙烯亚胺的重均分子量相同，且为10000、重均分子量为2000的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇(OPSS-PEG-NHS)，在混合溶剂中溶解，在室温、避光条件下反应3h，加入膜靶向肽，反应6h，产物在蒸馏水中透析48h，每隔2h换一次蒸馏水，冷冻干燥，得到膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)；
混合溶剂由体积比为1：3的pH为8.0的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和二甲基亚砜组成；
所述聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物、所述的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇以及膜靶向肽的摩尔比为1：20：20；
所述膜靶向肽为Cys-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，简称CREDVW；
通过聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的聚乙烯亚胺上的氨基与邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇末端的琥珀酰亚胺发生酯化反应，将两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇引入聚合物分子链上，再通过CREDVW中半胱氨酸的巯基与吡啶二硫基反应，从而将CREDVW肽连接到大分子上，得到膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)。
在激发波长为290nm时，CREDVW肽与膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)在360nm处有明显的荧光发射峰,而聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物则没有，据此可以判断CREDVW多肽已经连接到聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物上了。见图1。
实验证明，分别采用重均分子量为26000、27000、28000、29000的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物，替代本实施例的重均分子量为30000的支化聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物，其它同本实施例，制备出：膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)。
实验证明，分别采用重均分子量为3500、5000、7500的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇分别替代本实施例的重均分子量为2000的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇，其它同本实施例，制备出：膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)。
实验证明，本实施例中，在室温、避光条件下反应2h或4h替代本实施例的反应3h；加入膜靶向肽后反应4h或8h，产物在蒸馏水中透析60h或72h，依次替代本实施例的反应时间和透析时间，其它同本实施例，制备出：膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)。
实验证明，混合溶剂还可以由体积比为1：4的pH为9.0的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和二甲基亚砜组成；或由体积比为1：2的pH为9.0的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和二甲基亚砜组成。
实验证明，所述聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物、所述两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇以及膜靶向肽的摩尔比还可以是：1：1：0.5或1：10：10；
实验证明：膜靶向肽还可以是：
Cys-Gly-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，
Cys-Ala-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，
Cys-Ala-Ala-Ala-Ala-Ala-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，
Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，
或Cys-Gly-Gly-Gly-Ala-Ala-Arg-Glu-Asp-Val-Trp。
实施例2:REDV-NP、pGFP/REDV-NP复合物及TAT-NLS/pGFP/REDV-NP复合物的制备：
(1)室温下，将简写为TAT-NLS多肽溶于适量水中，(水的量以能溶解TAT-NLS多肽即可)；
将核酸(本实施例采用的核酸是含绿色荧光蛋白的质粒)溶于适量水中，(水的量以能溶解绿色荧光蛋白的质粒即可)；
按简写为TAT-NLS多肽与核酸的质量比为1：1的比例，将TAT-NLS多肽水溶液与核酸水溶液混合均匀，静置30分钟；得到混合液；
(2)采用透析法制备膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)(REDV-NP)纳米粒悬浮液：
称取5mg膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)，用1mL的N,N-二甲基甲酰胺溶解，在磁力搅拌下逐滴滴加到5mL的PBS缓冲液中(pH＝7.4)，液体在蒸馏水中透析2天后得到浓度为0.5mg/mL的基因载体(I)纳米粒悬浮液(REDV-NP纳米粒悬浮液)；
(3)将所述基因载体(I)纳米粒悬浮液和步骤(1)获得的混合液混合均匀，静置30分钟，得到多重靶向修饰的载基因复合物；所述基因载体(I)的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的氮与混合液中核酸的磷的摩尔比为0、2、5、10、20、30、40。
用同样的方法配制不含TAT-NLS的pGFP/REDV-NP复合物。
图2，图3分别为pGFP/REDV-NP(A)和TAT-NLS/pGFP/REDV-NP(B)在不同N/P下的流体力学直径和Zeta电位分布图。随着N/P比的增大，两种载基因复合物的粒径表现出降低的趋势。当N/P≥20时，复合物的粒径约为150nm且逐渐趋于稳定。在N/P＝5-40范围内，两种复合物的Zeta电位均为正值，这为其进入细胞提供了必要条件。
实验证明：
用TAT-NLS多肽与核酸的质量比为0.5：1或1.2：1替代本实施例的1：1，其它同本实施例，可以制备多重靶向修饰的载基因复合物。
将TAT-NLS多肽水溶液与核酸水溶液混合均匀，静置的时间为20分钟或40分钟，其它同本实施例，可以制备多重靶向修饰的载基因复合物。
将基因载体(I)配成浓度为0.1或0.8mg/mL的基因载体(I)纳米粒悬浮液替代本实施例的0.5mg/mL的基因载体(I)纳米粒悬浮液；其它同本实施例，可以制备多重靶向修饰的载基因复合物。
实验证明，用基因载体(I)纳米粒悬浮液和步骤(2)获得的混合液混合均匀，静置20或40分钟替代本实施例的静置30分钟，其它同本实施例，可以制备多重靶向修饰的载基因复合物。
实施例3:TAT-NLS/pGFP/REDV-NP及pGFP/REDV-NP的琼脂糖凝胶电泳分析：
将制备好的不同N/P比的TAT-NLS/pGFP/REDV-NP、pGFP/REDV-NP和纯的pGFP基因分别加到0.8％的琼脂糖凝胶孔中，100V下在1×TAE缓冲液中电泳30min。紫外线照射下观察pGFP的位置并拍照分析纳米粒与pGFP的结合能力。从图4中可以看出，REDV-NP在N/P比≥20时可完全压缩负载pGFP。加入TAT-NLS后，TAT-NLS/pGFP/REDV-NP在N/P比≥10时即可完全阻滞质粒的迁移，这表明TAT-NLS有助于REDV-NP纳米粒更好地结合并压缩pGFP。
实施例4:TAT-NLS/pGFP/REDV-NP及pGFP/REDV-NP对人脐静脉内皮细胞(购自美国AllCells澳赛尔斯生物技术(上海))的细胞毒性考察：
通过四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)对REDV-NP、pGFP/REDV-NP及TAT-NLS/pGFP/REDV-NP的细胞相容性进行测试。首先，接种在96-孔细胞培养板内的人脐静脉内皮细胞，无血清饥饿12h后，加入不同浓度的样品(N/P＝20，纳米粒中PEI的浓度为3.3，8.3，16.6，24.9，33.2μg/mL)，48h后测定细胞的相对活力。从图5中可以看出，经载基因复合物转染后的人脐静脉内皮细胞仍保持良好的活性，REDV-NP对细胞活性的影响与负载DNA后形成的pGFP/REDV-NP复合物类似，这表明制备的复合物细胞毒性都很小，可能是由于加入了大量的PEG链段，其屏蔽效应对人脐静脉内皮细胞起到了有效的保护作用。TAT-NLS的引入对细胞活力几乎无影响。
实施例5:TAT-NLS/pGFP/REDV-NP及pGFP/REDV-NP对人脐静脉内皮细胞的体外转染实验：
在6-孔细胞培养板中，人脐静脉内皮细胞融合达50％-70％后饥饿过夜，加入新配制的TAT-NLS/pGFP/REDV-NP及pGFP/REDV-NP(基因载体(I)的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的氮与混合液中核酸的磷的摩尔比＝20，2μg DNA/well)。培养24h后通过倒置荧光显微镜考察不同复合物在细胞中的转染效果。
图6(A和A’)单独pGFP基因在人脐静脉内皮细胞的转染结果(空白对照)；
图6(B和B’)pGFP/REDV-NP在人脐静脉内皮细胞的转染结果(阴性对照)；
图6(C和C’)TAT-NLS/pGFP/REDV-NP在人脐静脉内皮细胞的转染结果；
图6(D和D’)pGFP/PEI25000在人脐静脉内皮细胞的转染结果(阳性对照)。(PEI25000指重均分子量为25000的支化聚乙烯亚胺)标尺＝100μm。
通过体外转染人脐静脉内皮细胞，考察不同的载基因复合物传递目的基因到靶细胞的效率。从图6(A)中我们可以看到，没有基因载体只加入质粒的空白对照组中观察不到含GFP的细胞。其他三组中均有GFP的表达，表明这三种载基因纳米粒体系都可以成功地将pGFP运送到人脐静脉内皮细胞中，并实现pGFP的表达。加入TAT-NLS后，TAT-NLS/pGFP/REDV-NP的转染效果最好(图6(C))。这表明，体系中加入TAT-NLS后确实能提高载基因纳米粒在人脐静脉内皮细胞中的传递和表达。
实施例6：Cy5标记的载基因复合物(TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP)的细胞摄取
TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP的制备：
(1)同实施例1
(2)同实施例2步骤(1)
(3)同实施例2步骤(2)
将浓度为0.5mg/mL的聚阳离子基因载体(I)纳米粒悬浮液(REDV-NP纳米粒悬浮液)与1.0mg/mL Cy5荧光染料溶于二甲基亚砜溶液，按体积比为50：1的比例混合，反应8h，在蒸馏水中透析除去二甲基亚砜，和步骤(2)获得的混合液混合均匀，静置30分钟，得到多重靶向修饰的载基因复合物(TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP)；所述基因载体(I)的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的氮与混合液中核酸的磷的摩尔比为20。
用同样的方法配制不含TAT-NLS的pGFP/Cy5-REDV-NP。
为了研究TAT-NLS/pGFP/REDV-NP对人脐静脉内皮细胞转染的促进作用，我们对pGFP/REDV-NP和TAT-NLS/pGFP/REDV-NP的细胞摄取进行了测定。首先用Cy5红色荧光染料标记纳米粒，然后将Cy5标记的TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP和pGFP/Cy5-REDV-NP对人脐静脉内皮细胞进行转染。孵育4h后用流式细胞分析仪测定细胞对Cy5标记的TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP和pGFP/Cy5-REDV-NP的摄取。
图7人脐静脉内皮细胞对pGFP/Cy5-REDV-NP(A)和TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP(B)的摄取：
(1)不同荧光强度的细胞统计。(2)不同荧光强度的细胞统计。平均荧光强度(左边)和细胞摄取率(右边)。以未处理的人脐静脉内皮细胞(C)为空白对照。
两种载基因复合物的细胞摄取率都达到99.9％以上，表明细胞中都有载基因纳米粒的进入但其平均荧光强度各不相同，分别为pGFP/Cy5-REDV-NP(170.20±2.8)和TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP(255.10±8.3)。从图7(2)中可以看出，加入TAT-NLS后，TAT-NLS/pGFP/Cy5-REDV-NP的细胞摄取有明显的增加。这表明TAT-NLS的加入，有利于载基因复合物在细胞内富集，对增强人脐静脉内皮细胞的转染是非常有帮助的。
实施例7：Cy5标记的载基因复合物的细胞内分布
以Cy5标记的Cy5-Oligo为模型基因，对Cy5-Oligo/REDV-NP和TAT-NLS/Cy5-Oligo/REDV-NP在人脐静脉内皮细胞内的分布进行了研究。
TAT-NLS/Cy5-Oligo/REDV-NP的制备：
(1)同实施例1
(2)室温下，将简写为TAT-NLS多肽溶于适量水中，(水的量以能溶解TAT-NLS多肽即可)
将核酸(Cy5-Oligo)溶于适量水中，(水的量以能溶解Cy5-Oligo即可)；
按简写为TAT-NLS多肽与Cy5-Oligo的质量比为1：1的比例，将TAT-NLS多肽水溶液与Cy5-Oligo水溶液混合均匀，静置30分钟；得到混合液；
(3)同实施例2的步骤(2)；
(4)将所述基因载体(I)纳米粒悬浮液和步骤(2)获得的混合液混合均匀，静置30分钟，得到多重靶向修饰的载基因复合物(TAT-NLS/Cy5-Oligo/REDV-NP)；所述基因载体(I)的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的氮与混合液中核酸的磷的摩尔比为20。
用同样的方法配制不含TAT-NLS的Cy5-Oligo/REDV-NP复合物。
人脐静脉内皮细胞首先接种在共聚焦平皿内(4×105cell/皿)，然后用TAT-NLS/Cy5-Oligo/REDV-NP和Cy5-Oligo/REDV-NP对细胞进行转染。孵育4h后对细胞进行清洗并换成完全培养基继续培养。在预设时间点4h和24h，加入Lyso Tracker(把活细胞的内涵体/溶酶体标记为红色)，放入培养箱中继续培养15min，再加入Hoechst 33342(把活细胞的细胞核标记为蓝色)。5min后用大量的PBS清洗，除去染料的浮色。随后通过激光共聚焦扫描电镜进行观察、拍照。
图8通过激光共聚焦扫描电镜表征Cy5标记的Cy5-Oligo/REDV-NP和TAT-NLS/Cy5-Oligo/REDV-NP转染人脐静脉内皮细胞4h(1)和24h(2)后的细胞内分布。从图8(1)可以明显地观察到，加入TAT-NLS的TAT-NLS/Cy5-Oligo/REDV-NP在4h时就有部分从内涵体/溶酶体中逃出到细胞质中，而Cy5-Oligo/REDV-NP仍大部分处在内涵体/溶酶体结构中，表明TAT-NLS确实能促进TAT-NLS/Cy5-Oligo/REDV-NP的内涵体逃逸。这可能是由于TAT-NLS也可以负载，复合物中PEI和TAT产生增强的“质子海绵效应”，促进了基因向细胞质的释放。从载基因复合物在24h时的细胞分布图(图8(2))可以更加明显地观察到加入TAT-NLS组，即TAT-NLS/Cy5-Oligo/REDV-NP组，有明显增多的Cy5-Oligo进入到细胞核中。而不含TAT-NLS组，即Cy5-Oligo/REDV-NP复，只有少量的Cy5-Oligo进入到细胞核中。这表明TAT-NLS有助于TAT-NLS/Cy5-Oligo/REDV-NP中基因的核内在化，提高了载基因纳米粒的转染效率。
本发明多重靶向修饰的载基因复合物仅以pGFP和Cy5-Oligo为例，但并不对基因进行限定，凡可以作为药物的基因都可以用本发明的方法制成多重靶向修饰的载基因复合物。

Claims (3)

1.多重靶向修饰的载基因复合物的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)在氮气保护下，将重均分子量为26000-30000的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物、重均分子量为2000-7500的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇，在混合溶剂中溶解，在室温、避光条件下反应2-4h，加入膜靶向肽，反应4-8h，产物在蒸馏水中透析48-72h，冷冻干燥，得到膜靶向肽修饰的聚阳离子基因载体(I)；
所述聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的所接枝的支化聚乙烯亚胺的重均分子量相同，且为10000；
所述混合溶剂由体积比为1：(2-4)的pH为8.0-9.0的0.1mol/L磷酸缓冲溶液和二甲基亚砜组成；
所述聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物、所述的两端分别为邻二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基修饰的聚乙二醇以及膜靶向肽的摩尔比为1：(1-20)：(0.5-20)；
所述膜靶向肽为Cys-X-Arg-Glu-Asp-Val-Trp，所述X为0-5个Gly、或0-5个Ala、或0-5个Gly和Ala的任意组合；
(2)室温下，按简写为TAT-NLS多肽与核酸的质量比为(0.5-1.2)：1的比例，将TAT-NLS多肽水溶液与核酸水溶液混合均匀，静置20-40分钟；得到混合液；
(3)将所述基因载体(I)配成浓度为0.1-0.8mg/mL的基因载体(I)纳米粒悬浮液；
(4)将所述基因载体(I)纳米粒悬浮液和步骤(2)获得的混合液混合均匀，静置20-40分钟，得到多重靶向修饰的载基因复合物；所述基因载体(I)的聚乙烯亚胺-聚(乙交酯-co-己内酯)-聚乙烯亚胺共聚物中的氮与混合液中核酸的磷的摩尔比为10-30：1。
2.权利要求1所述的方法制备的多重靶向修饰的载基因复合物。
3.权利要求2所述的多重靶向修饰的载基因复合物在制备修复血管内皮细胞基因药物的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Elastic biodegradable poly(glycolide-co-caprolactone) scaffold for tissue engineering;Soo-Hong Lee et al.;《J Biomed Mater Res A.》;20030701;第66卷(第1期);第29-37页 *
Regulation of the endothelialization by human vascular endothelial cells by ZNF580 gene complexed with biodegradable microparticles;Changcan Shi et al.;《Biomaterials》;20140522;第35卷;第7133-7145页 *
靶向性载体/基因复合物促进内皮细胞增殖;刘雯 等;《化学进展》;20160615;第28卷(第6期);第954-960页 *

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