CN109701034B - 一种cagw多肽和tat-nls多肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CAGW多肽和TAT‑NLS多肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用，制备方法包括：制备聚乙二醇‑聚乙丙交酯共聚物mPEG‑b‑PLGA；制备聚乙丙交酯‑g‑聚乙烯亚胺共聚物PLGA‑g‑PEI；以PLGA‑g‑PEI为原料制备PLGA‑g‑PEI‑g‑CAGW共聚物；将PLGA‑g‑PEI‑g‑CAGW和mPEG‑b‑PLGA自组装制备靶向共聚胶束；向靶向共聚胶束中加入pDNA和TAT‑NLS，制得载基因复合物。本发明制得的载基因复合物对细胞有特异选择性，且具有很好的穿透能力和进核能力，且转染效率较高。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种CAGW多肽和TAT-NLS多 肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用。
背景技术
心血管疾病是由于内皮功能紊乱或损伤而发生，因此重建或修复血管内皮层 对心血管疾病的治疗是一个有效的策略。许多研究将ECs细胞培养后种植在内 皮层损伤的血管上，从而达到改善和修复内皮功能的目的。Wilson等用重组逆 转录病毒将LacZ基因导入犬内皮细胞。细胞经LacZ基因转染后，种植在人造 血管上植入犬大颈动脉，五周后扫描电镜结果证实内皮细胞完全包覆血管腔面。 虽然ECs再生性强又位于血管内侧，基因表达产物可经血液循环分布全身。但 是内皮细胞作为心血管疾病基因治疗中较理想的靶细胞，其固有的对外源基因 的抑制以及对毒性的高敏感，被认为是较难转染的细胞之一。基因治疗技术的 成功应用很大程度上取决于载体的发展，因此合成安全、高效的基因递送载体， 是实现基因治疗应用于临床的首要前提。
在过去几十年，阳离子聚合物这类基因载体具有安全性相对较好、可多次利 用、制备过程较简单、易于修饰等优点。然而，由于其细胞毒性不耐受及较低 的转染效率，使得阳离子聚合物的应用受到极大的限制。本课题组以前的研究 中设计不同的可生物降解的阳离子聚合物作为基因载体，递送pEGFP-ZNF580 (pDNA)质粒转染内皮细胞，以达到人工血管快速内皮化的目的。我们的研究 结果证明不同的以聚乙烯亚胺(PEI)为基本结构的基因载体可以不同程度的促 进内皮细胞增殖和迁移，但仍然存在转染效率低、细胞毒性较大的缺点。虽然 靶向多肽(REDV、CAG)修饰后对ECs的转染效率有提高的表现。但依然存 在载体进细胞困难；内涵体/溶酶体逃逸困难；以及pDNA进入细胞核较难的问 题。
TAT多肽(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)因富含精氨酸片 段而带有正电荷，可携载pDNA直接通过跨细胞膜进入细胞，且对细胞膜无损 伤。核定位信号NLS(Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val)是通过核膜上的核孔复合 物(NPC)转运小分子物质(40-60kDa)进入细胞核。有研究证实NLS修饰 PEI(1.8kDa)携带基因可以提升载体对细胞的转染效率。但是TAT和NLS在单独 使用时都不能达到令人满意的转染效率。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种CAGW多肽和TAT-NLS 多肽修饰的载基因复合物及其制备方法和应用，可有效提高现有的载基因复合 物进入细胞困难和转染效率低的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物，其制备方法包括 以下步骤：
(1)采用mPEG作为大分子引发剂，辛酸亚锡作为催化剂，引发DL-LA 和GA开环共聚，制得聚乙二醇-聚乙丙交酯共聚物mPEG-b-PLGA；
(2)采用山梨醇作为引发剂，Sn(Oct)2甲苯溶液作为催化剂，引发DL-LA 和GA开环共聚，制得聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，然后将其羧基化后与PEI 进行接枝反应，制得乳酸-羟基乙酸-g-聚乙烯亚胺共聚物PLGA-g-PEI；
(3)将PLGA-g-PEI和三乙胺溶解于DMF中，在0℃条件下，向其中滴加 二烯丙基氨基甲酰氯溶液，反应过夜，最后过滤，浓缩，冷冻干燥得到接有双 键的产物；
(4)将接有双键的产物溶于DMSO中，随后依次加入2,2-二甲氧基-2-苯基 苯乙酮和CAGW的DMSO溶液，用紫外光照射10-15min，最后过滤，透析， 冷冻干燥，制得PLGA-g-PEI-g-CAGW共聚物；
其中，CAGW是Cys-Ala-Gly-Trp的简称；
(5)将PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA分别溶于DMSO中，按照 PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA质量比为2-4:0.8-1.2混合，然后加入pH ＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，搅拌，使其自组装形成 PLGA-g-PEI-g-CAGW/mPEG-b-PLGA靶向共聚物胶束；
(6)将步骤(5)所得共聚物胶束与pDNA溶液按照混匀，静置20-40min， 然后加入TAT-NLS溶液，混匀，超声振荡10-15s，最后静置20-40min，制得CAGW 多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物(TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复 合物)；
其中，步骤(5)所得物与pDNA的质量比为2-4:1-3；TAT-NLS上伯胺的 摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数比为0.1-30:1尤其是2-30:1。
进一步地，步骤(1)的具体过程为：将mPEG、GA和DL-LA混匀，然后 加入Sn(Oct)2甲苯溶液，密封，抽真空，通氮气，然后放入油浴锅中，于105-120℃ 反应22-26h，所得产物采用三氯甲烷溶解，正己烷沉出，最后进行真空干燥， 制得；其中，mPEG、GA、DL-LA和Sn(Oct)2的摩尔比为 0.35-0.45:6.5-7.5:22-23:0.08-0.12。
进一步地，步骤(2)的具体过程为：于125℃的油浴中反应24h，制得PLGA 共聚物；将PLGA共聚物溶于1,4-二氧六环中，在氮气环境下，加入三乙胺、 DMAP和琥珀酸酐，于25℃油浴反应24-26h，制得羧基化的PLGA聚合物；将 羧基化的PLGA聚合物溶于DMSO中，加入NHS搅拌2-3h，再加入含PEI的DMSO溶液，在氮气气氛下，反应24h，制得PLGA-g-PEI共聚物；其中，山梨 醇、DL-LA、GA和Sn(Oct)2的摩尔比为0.1-0.2:31-32:4-5:0.08-0.12；PLGA共聚物和琥珀酸酐的摩尔比为0.05-0.1:3-4；羧基化的PLGA聚合物、NHS和PEI的 摩尔比为0.004-0.005:0.1-0.15:0.08-0.12。
进一步地，步骤(3)中二烯丙基氨基甲酰氯溶液的浓度为0.045mol/L， 滴加时间控制在2h以内。
进一步地，步骤(4)中接有双键的产物、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和 CAGW的质量比为20-30:0.8-1.2:12-18。
进一步地，步骤(5)中PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA的质量比 为3:1。
进一步地，步骤(6)中步骤(5)所得物与pDNA的质量比为3:2。
进一步地，步骤(6)中TAT-NLS上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩 尔数比为5:1。
上述制得的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物可用于制备 修复血管内皮细胞基因药物。
本发明提供的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物及其制备 方法和应用，具有以下有益效果：
本发明中TAT-NLS(细胞穿膜肽TAT与核定位信号NLS结合)功能性多肽， 可以有效地将其携带的货物运送到HeLa和Cos7细胞系中，并且可以积极地表 达外源DNA实现基因治疗目的。然而，TAT-NLS的弊端在于对不同细胞缺乏特 异性。而选用的CAGW多肽对血管内皮细胞具有特异选择性，PEG可以提高生 物相容性，聚乙烯亚胺与细胞穿膜肽TAT的共同作用，可以提高基因载体的内 涵体逃逸能力，促进目的基因进入细胞质中，通过核定位信号NLS与核膜的相 互作用，促进目的基因的核内在化，目的基因在内皮细胞中的转染效率也就随 之增强。
本发明将CAGW多肽接枝于载体的最外表面可以赋予载体具有靶向内皮细 胞的功能，其可以通过受体-配体结合能力选择性地黏附于内皮细胞上。在此基 础上，为了提高转染效率，本发明采用既具有穿透细胞能力又具有进核能力的 TAT-NLS多肽与PLGA-g-PEI-g-CAGW/PLGA-b-mPEG(PC/mP)两亲聚合物复 合胶束纳米粒协同缩和pDNA。研究表明TAT-NLS的加入增强了EA.hy926内 皮细胞对TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物的摄取，TAT-NLS组合肽与PEI 以及CAGW多肽的协同作用赋予载体具有多功能性，能够促进EA.hy926内皮 细胞增殖。
附图说明
图1为PP/mP非靶向基因复合物、PC/mP/pDNA靶向基因复合物的粒径和 电位结果图。
图2为TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物粒径和电位结果图。
图3为不同N/P摩尔比的基因复合物的凝胶琼脂糖电泳图。
图4为EA.hy926内皮细胞在不同PEI浓度下的相对细胞活力。
图5为EA.hy926内皮细胞被不同的基因复合物转染24h后的明场(A1、 B1、C1、D1)和暗场(A2、B2、C2、D2)图。
图6为EA.hy926内皮细胞12h迁移过程和12h时相对迁移面积结果图。
图7为EA.hy926内皮细胞对不同基因复合物的细胞摄取结果。
图8为TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物基因递送示意图。
具体实施方式
实施例1
一种CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物，其制备方法包括 以下步骤：
1、聚乙二醇-聚乙丙交酯共聚物mPEG-b-PLGA(命名为mP)的合成(b 为block的缩写，代表嵌段聚合)
采用mPEG作为大分子引发剂，辛酸亚锡作为催化剂，引发DL-LA和GA 开环共聚，具体过程为：称取1.956g(0.3912mmol)mPEG，0.8078g(6.964mmol) 乙交酯(GA)，3.209g(22.28mmol)DL-型丙交酯(DL-LA)，放入干燥的聚合管中， 加入Sn(Oct)2甲苯溶液(0.4mL，0.25mol/L)，密封，抽真空，通氮气，重复数 次，然后放入油浴锅中，于110℃反应24h。所得产物采用三氯甲烷溶解，正己 烷沉出，重复多次提纯产物，于25℃真空干燥，备用。
2、聚乳酸-羟基乙酸-g-聚乙烯亚胺共聚物PLGA-g-PEI的合成(g为graft 的缩写，代表接枝共聚)
(1)采用山梨醇作为引发剂，Sn(Oct)2甲苯溶液作为催化剂，引发DL-LA 和GA开环共聚，具体过程为：准确称取山梨醇(0.025g，0.14mmol)，DL-LA (4.5341g，31.49mmol)和GA(0.5070g，4.37mmol)加入干燥的Schlenk聚合 管中。氮气吹扫除氧再加入Sn(Oct)2甲苯溶液(0.4mL,0.25mol/L)，密封后重 复进行抽真空充氮气操作数次。浸入125℃的油浴中反应24小时。初产物溶于 三氯甲烷中，在冰冷的正己烷中沉淀，重复溶解和沉淀操作过程提纯产物，在 25℃下真空干燥48小时，收集白色产物，为PLGA共聚物。
(2)称取PLGA共聚物(2.0082g,0.06mmol)溶于20mL 1,4-二氧六环中， 加入干燥和氮气吹扫的Schlenk聚合管中，并依次加入150μL三乙胺、DMAP (0.4282g，3.50mmol)和琥珀酸酐(0.335g，3.35mmol)；密封后重复进行抽真 空充氮气操作数次，置于25℃油浴反应24-26小时，产物在冷己烷中沉淀。将 沉淀后的产物重新溶于二氯甲烷中，然后用饱和的碳酸氢钠溶液、10％盐酸和饱 和NaCl溶液将产物的二氯甲烷溶液分别洗涤3、4、3次。分离有机相，用无水 硫酸镁干燥24小时后过滤。经蒸发浓缩后将有机相在冷正己烷中沉淀，得到羧 基化的PLGA聚合物，然后在25℃下真空干燥至恒重。
(3)在干燥的schlenk聚合管中将羧基化的PLGA聚合物(0.15g， 0.004mmol)共聚物溶解于10mL DMSO中，加入NHS(0.014g，0.123mmol) 25℃下搅拌2h，然后加入PEI(10kDa，0.162g，0.09mmol)的DMSO溶液。 反应体系于25℃在氮气气氛下反应24h。然后将产物进行透析(MWCO＝14 kDa)48小时，以去除DMSO溶液和未反应的PEI，将透析袋中的溶液冻干， 获得PLGA-g-PEI共聚物。
3、PLGA-g-PEI-g-CAGW靶向共聚物(命名为PC)的合成
(1)在干燥的三颈烧瓶中将PLGA-g-PEI(0.20g，0.012mmol)和三乙胺 (Et3N)(28μL)溶解在5.0mL的DMF中。在0℃下，将5mL二烯丙基氨基甲 酰氯溶液(0.045mol/L)经滴液漏斗缓慢加入三颈烧瓶中，滴加时间控制在2.0 小时，反应体系过夜，然后经过滤，浓缩，冷冻干燥得到接有双键的产物。
(2)将步骤(1)所得的接有双键的产物(25.0mg)溶于DMSO(5.0mL) 中，随后依次加入1.0mg 2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)和15mg CAGW (Cys-Ala-Gly)的DMSO溶液，然后将混合溶液用紫外光(365nm UV-lamp) 照射反应10分钟，最后通过过滤、透析纯化和冻干得到PLGA-g-PEI-g-CAGW 共聚物。
3、PC/mP、PP/mP共聚物胶束及PC/mP/pDNA、PP/mP/pDNA基因复合物 的制备
分别配制5mg/ml的PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA的DMSO聚 合物溶液，按质量比3:1共混，然后将2.0mL该共混的聚合物溶液缓慢滴加到含 有5mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)的锥形烧瓶中，不断的搅拌得到复合 胶束溶液，自组装成PLGA-g-PEI-g-CAGW/mPEG-b-PLGA(PC/mP)靶向共聚 物胶束，透析除去DMSO备用。同样的方法制备PLGA-g-PEI/mPEG-b-PLGA (PP/mP)非靶向共聚物胶束，备用。
按照不同N/P(PEI上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数之比)将 pDNA溶液加入PC/mP共聚物胶束制备靶向基因复合物PC/mP/pDNA。同样的 方法制备非靶向基因复合物PP/mP/pDNA。
4、TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物的制备
将30μL 0.2mg/mL的PC/mP溶液与20μL 200μg/mL的pDNA溶液混匀静 置30分钟，然后按照不同的N/P摩尔比(TAT-NLS上伯胺的摩尔数与pDNA 上磷酸根的摩尔数之比)加入TAT-NLS(0.1mg/ml)多肽(TAT-NLS多肽购买 于上海吉尔生物化学有限公司)，三者充分混匀超声10秒钟后静置30分钟，得 到TAT-NLS/pDNA/PC/mP四重复合物。
对实施例所得的复合物进行如下测试：
1、粒径和电位
采用马尔文纳米粒度及zeta电位仪(Malvern Instrument,Inc.,Worcestershire, UK)分别测试PP/mP非靶向复合物、PC/mP/pDNA靶向复合物和 TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物的粒径和电位。
不同N/P摩尔比下PP/mP非靶向基因复合物、PC/mP/pDNA靶向基因复合 物的粒径和电位见图1；其中，图1中(1)为PP/mP非靶向复合物和PC/mP/pDNA 靶向基因复合物的粒径图，左边为PP/mP非靶向复合物，右边为PC/mP/pDNA靶 向基因复合物；图1中(2)为PP/mP非靶向复合物和PC/mP/pDNA靶向基因 复合物的电位图，左边为PP/mP非靶向复合物，右边为PC/mP/pDNA靶向基因 复合物。图1中柱形图从左到右分别代表N/P摩尔比为2、5、10、15、20、25 和30。图2为TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物的粒径和电位图。
基因复合物的粒径和电位不仅影响载体的细胞毒性，对细胞的转染效率也 同样重要。为了增加载体的生物相容性，研究表明在聚合物中引入mPEG链可 以在形成胶束时屏蔽PEI表面的一部分正电荷，从而降低PEI的毒性。因此， 本发明先将mPEG-b-PLGA分别与PLGA-g-PEI和PLGA-g-PEI-g-CAGW按体积 比1:3共混在水中自组装形成胶束，按N/P摩尔比为2、5、10、15、20、25和 30包封pDNA形成PP/mP非靶向复合物和PC/mP/pDNA靶向基因复合物。如 图1(1)所示，随着N/P摩尔比的增加，PP/mP非靶向复合物和PC/mP/pDNA 靶向基因复合物，粒径从180nm降到70nm呈现出逐渐降低趋势，更有利于基 因复合物被细胞摄取。由图1(2)可知，随着N/P摩尔比的增加，PP/mP非靶 向复合物和PC/mP/pDNA靶向基因复合物zeta电位逐渐增加，使得基因复合物 zeta电位在细胞耐受的范围之内，更易于与细胞结合，被其摄取。
当N/P摩尔比为2时，PC/mP/pDNA靶向基因复合物的粒径为177.9± 5.07nm，zeta电位为-1.366±1.58533mV，以这个N/P摩尔比的PC/mP/pDNA靶 向基因复合物与TAT-NLS多肽复合制备TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合 物。如图2(4)所示，随着TAT-NLS加入量的增加，TAT-NLS/pDNA/PC/mP 四元基因复合物粒径从315.2±16.3nm降低到166.4±9.3nm。开始加入 TAT-NLS多肽基因复合物形成粒径较大的纳米粒，可能是由于 TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物没有完全负载包封pDNA，导致了 TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物团聚，随着N/P摩尔比增加至pDNA质 粒被完全负载包封，TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物形成的胶束粒径减 小并逐渐趋于平稳。如图2(3)所示，引入TAT-NLS多肽后 TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物zeta电位表现出逐渐增大的趋势。加入 TAT-NLS多肽后，TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物形成的zeta电位高于 PC/mP/pDNA靶向基因复合物，这可能是由于TAT-NLS自身也带有正电荷所致。
2、琼脂糖凝胶电泳实验
通过琼脂糖凝胶电泳实验用来考察PP/mP复合胶束、PC/mP复合胶束及 TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物复合胶束对pDNA质粒的压缩阻滞能 力，具体实验步骤如下：
按不同N/P摩尔比(0.5/1、2/1、5/1、10/1、20/1、30/1)制备PP/mP/pDNA 非靶向基因复合物、PC/mP/pDNA靶向基因复合物；并参照N/P摩尔比(2/1/0、 2/1/2、2/1/5、2/1/10、2/1/15、2/1/20)制备TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复 合物。以PP/mP复合胶束为例，其他复合胶束对pDNA质粒的包封阻滞能力考 察实验操作步骤同下。取该基因复合物10μL与0.5μg/ml溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)显色剂混匀卵育，10分钟后将基因复合物与染料的混合物加入 0.8％的琼脂糖凝胶孔道中，于100V电压、1×TAE缓冲液中进行实验，实验持续30分钟。结束后在暗箱紫外分析仪中观察实验结果并拍照记录，考察胶束对 pEGFP-ZNF580质粒的的包封效果，结果见图3，图3中A为PP/mP/pDNA非 靶向基因复合物，B为PC/mP/pDNA靶向基因复合物，C为 TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物。
由图3可知，PP/mP/pDNA非靶向复合物胶束在N/P摩尔比为5/1时完全 包封pDNA，PC/mP/pDNA靶向复合物胶束在N/P摩尔比为2/1时完全包封 pDNA，而TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物胶束在N/P摩尔比为2/1/2 时就可以包封pDNA。TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物胶束显示出更强 的负载质粒的能力，可能是由于TAT-NLS多肽本身也带有正电荷，TAT-NLS多 肽引入使得胶束表面的zeta电位增大的缘故，从而能够在较低的N/P摩尔比下 完全包封pDNA质粒。
3、细胞毒性实验
以PEI(10kDa)为对照，采用MTT实验考察PP/mP/pDNA非靶向基因复合物、 PC/mP/pDNA靶向基因复合物及TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物的细胞 细胞毒性，具体实验步骤如下：
将EA.hy926内皮细胞接种到96孔板(1×104cell/well)中，将细胞孵育 至80-90％融合。然后，更换培养基为无血清细胞培养基，37℃、5％CO2下饥 饿培养细胞12小时。将基因复合物溶液分别加入到新鲜的生长培养基(10％ FBSDMEM)中混匀。将无血清培养基更换为含有基因复合物(N/P摩尔比为5， 2μg pEGFP-ZNF580/well)的生长培养基。37℃，5％CO2下细胞在含有基因复合 物的生长培养基中培养48小时后移除该培养基。向每孔中加入5mg/mL的MTT 溶液15μL，之后将96孔板重新放回细胞培养箱内37℃、5％CO2下继续孵育放 置4小时，充分形成不溶性的甲瓒(Formazan)晶体。轻轻吸除每个孔内培养基 后每孔加入150μL的DMSO溶液，轻微震荡溶解甲瓒晶体。最后利用酶标仪读取 各孔在490nm波长下的吸收度值(Optical density，OD)。利用如下公式计算细 胞存活百分数(Relative cellviability(％))：
Relative cell viability 公式(1)
OD'：复合胶束或基因复合物实验组减去调零组的吸收度值；
ODC'：矫正后的对照组平均吸收度值。
通过MTT实验考察了PP/mP/pDNA非靶向基因复合物、PC/mP/pDNA靶向 基因复合物和TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物的细胞毒性，结果如图4 所示。图4中的每组柱形图从左到右分别为PP/mP/pDNA非靶向基因复合物、 PC/mP/pDNA靶向基因复合物和TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物。当 N/P摩尔比为5时，以PEI(10kDa)/pDAN基因复合物为对照组，测定了不同PEI 浓度(1、3、6、9、12、15μg/mL)胶束和基因复合物对EA.hy926内皮细胞的毒性。EA.hy926内皮细胞经PP/mP/pDNA非靶向基因复合物转染后，细胞 仍能仍保持较高的活力，与对照组相比PP/mP/pDNA非靶向基因复合物细胞毒 性较低，可能是由于引入的PEG链段，PEG链段的屏蔽效应降低了基因复合物 表面的正电荷从而降低了毒性。
当引入CAGW多肽后，EA.hy926内皮细胞经PC/mP/pDNA靶向基因复合 物转染后反而表现出细胞毒性增大的想象。这一现象可以认为是由于CAGW多 肽对内皮细胞的特异性黏附功能，致使基因复合物在内皮细胞表面大量聚集， 使细胞内外PEI浓度增加，进而表现出较高的细胞毒性。当N/P摩尔比为2时， PC/mP/pDNA靶向基因复合物引入TAT-NLS多肽后，增大了 TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物的zeta电位。但通过MTT实验我们发现，EA.hy926内皮细胞经TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物转染后，细胞活 力仍然较高，且在较低的PEI浓度时(3、6μg/mL)促进EA.hy926内皮细胞的 生长。在所测试的PEI浓度范围内，细胞的相对存活率均高于80％。 TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物的这一低毒性现象，可归结于引入的 TAT-NLS多肽因由天然氨基酸分子构成赋予其的良好生物相容性。TAT-NLS多 肽结构中富含精氨酸和赖氨酸序列，可以促进血管内皮生长因子VEGF165蛋白表达，从而有效地刺激ECs生长。
4、体外转染实验
将EA.hy926内皮细胞接种在6孔细胞培养板(4×105cell/well)上，培养 12小时至细胞达到60％-70％的融合。EA.hy926内皮细胞无血清培养基饥饿培 养12h，丢弃细胞碎片和代谢负产物。然后将新鲜配制的PP/mP/pDNA非靶向 基因复合物、PC/mP/pDNA靶向基因复合物及TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因 复合物加入细胞孔内进行实验。观察24小时后绿色荧光图像，并拍照记录，结 果见图5；其中，A为PP/mP/pDNA非靶向基因复合物转染细胞作为阳性对照； B为PC/mP/pDNA靶向基因复合物转染细胞；C为TAT-NLS/pDNA/PC/mP四重 基因复合物转染细胞；D为PEI(10kDa)/pDNA基因复合物转染细胞作为阴性对 照。
通过体外转染EA.hy926内皮细胞，考察PP/mP/pDNA非靶向基因复合物、 PC/mP/pDNA靶向基因复合物和TAT-NLS/pDNA/PC/mP四重基因复合物递送目 的基因的效率。虽然有报道称亲水性PEG能够在材料表面形成水合屏蔽层，可 以有效的抑制蛋白质和血小板在材料表面的吸附聚集。PEG屏蔽层能够显著提 高基因载体的生物相容性，延长基因载体的循环时间。但如图5转染实验结果 所示，A实验组不含CAGW多肽组分的PP/mP/pDNA非靶向基因复合物对EA. hy926内皮细胞具有较好的转染效果，但在MTT实验中发现其细胞毒性较高， 细胞经其共培养后相对存活率较低。因此，可以判断此类基因复合物无法达到 低毒高效转染EA.hy926内皮细胞的目的。与A实验组PP/mP/pDNA非靶向基 因复合物相比，因为CAGW多肽具有特殊的ECs黏附能力，B实验组 PC/mP/pDNA靶向基因复合物转染细胞确实提高了对EA.hy926内皮细胞的转 染效率。TAT-NLS/pDNA/PC/mP四重基因复合物是采取将质粒优先与PC/mP复 合胶束复合后再加入TAT-NLS多肽而制备的，PEI与pEGFP-ZNF580质粒的N/P 摩尔比固定为2，改变TAT-NLS多肽与pEGFP-ZNF580质粒的N/P摩尔比从0 到30，以这样的方式引入TAT-NLS，使得TAT-NLS多肽可以包裹在胶束的外层， 有利于载体表面的正电荷与细胞膜表面的负电荷相互作用，可以提高 TAT-NLS/pDNA/PC/mP四重基因复合物对细胞膜的穿透能力。如图5(C1、C2) 细胞转染结果所示，TAT-NLS/pDNA/PC/mP四重基因复合物转染EA.hy926内 皮细胞的转染效率显著提高，TAT-NLS多肽的加入确实能提高基因载体在EA. hy926内皮细胞中的传递和表达。这一现象正好体现了TAT-NLS多肽的特有的 穿膜特性和靶向细胞核的特性有助于高效转染。PEI(10kDa)/pDNA基因复合物 对照组虽然也有表达绿色荧光的细胞，但是明显少于测试组(图5(D1、D2))， 结合MTT实验结果，进一步说明对PEI进行疏水化改性，引入PEG链并采用 特异性多肽对其进行功能化，不仅可以降低PEI的毒性还可以促进EA.hy926 内皮细胞增殖。
5、伤口愈合实验
EA.hy926内皮细胞经PP/mP/pDNA非靶向基因复合物、PC/mP/pDNA靶 向基因复合物及TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物转染后，利用无菌枪头 在每孔细胞表面内轻轻地划出一条均匀的划痕而产生创面，观察EA.hy926内皮 细胞的迁移过程的变化，并计算相对恢复面积。
以PEI(10kDa)/pDNA基因复合物组为对照，本发明获取了0小时和12小 时的细胞划痕创面图像，来验证细胞增殖和迁移的过程，划痕实验结果如图6 (1)所示。12h时的细胞的相对迁移面积如图6(2)所示。图6中A为 PP/mP/pDNA非靶向基因复合物转染细胞，B为PC/mP/pDNA靶向基因复合物 转染细胞，C为TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物转染细胞，D为PEI(10 kDa)/pDNA基因复合物转染细胞作为对照。
以PEI(10kDa)/pDNA基因复合物组为对照，PP/mP/pDNA非靶向基因复合 物、PC/mP/pDNA靶向基因复合物和TAT-NLS/pDNA/PC/mP四重基因复合物实 验组均呈现较明显的细胞迁移能力。没有引入CAGW功能多肽的PP/mP/pDNA 非靶向基因复合物转染细胞虽然能提高EA.hy926内皮细胞的迁移能力，但是 引入CAGW功能多肽后PC/mP/pDNA靶向基因复合物呈现了更大的迁移面积。 在引入CAGW功能多肽的同时再与TAT-NLS多肽复合，TAT-NLS/pDNA/PC/mP 四重基因复合物转染细胞实验组相对迁移面积最大。EA.hy926内皮细胞经PP/mP/pDNA非靶向基因复合物、PC/mP/pDNA靶向基因复合物和 TAT-NLS/pDNA/PC/mP四重基因复合物转染12h后产生划痕创伤，相对迁移面 积分别为48.9％±6.3、76.3％±7.2和83.6％±4.5。由此表明CAGW多肽功能化的 PC/mP/pDNA靶向基因复合物有利于内皮细胞的迁移，CAGW多肽与TAT-NLS 多肽两者协同作用可以进一步促进内皮细胞的迁移。
6、细胞摄取实验
首先用Cy5荧光染料标记pDNA，然后将负载被Cy5标记的基因的 PP/mP/pDNA非靶向基因复合物、PC/mP/pDNA靶向基因复合物及 TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物加入到EA.hy926内皮细胞中进行转 染，4h后用PBS清洗细胞三次，除去多余的基因复合物及其他杂质。细胞经胰 蛋白酶消化后反复多次离心。最后用流式细胞分析仪对基因复合物的细胞摄取 进行分析，结果见图7。
其中图7(1)为平均荧光强度(柱状图)及细胞摄取率(线形图)，(2)为 流式细胞术测定荧光强度及相应的细胞数目。图7中A为PP/mP/pDNA非靶向 基因复合物转染细胞，B为PC/mP/pDNA靶向基因复合物转染细胞，C为 TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物转染细胞，D为PEI(10kDa)/pDNA基因 复合物转染细胞作为阳性对照，E为Cy5标记的寡核苷酸转染细胞。
由图7可知，三种基因复合物测试组细胞摄取均高于99％，而平均荧光强 度(meanfluorescence intensity，MFI)较Cy5标记的寡核苷酸对照组有显著差 异，分别为PP/mP/pDNA非靶向基因复合物(1164.74±30.35)、PC/mP/pDNA靶 向基因复合物(1208.05±24.69)及TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物 (1619.75±35.336)。PC/mP/pDNA靶向基因复合物比PP/mP/pDNA非靶向基因 复合物更有利于细胞的摄取，这是由于CAGW靶向多肽的接枝引起的，可以进 一步的说明CAGW多肽对内皮细胞的靶向性有利于基因复合物的细胞摄取。而 引入TAT-NLS功能多肽后，平均荧光强度更进一步的增大。这表明TAT-NLS的 引入，由于其赋予基因复合物具有细胞膜穿透功能而表现出最高的平均荧光强 度。靶向多肽CAGW对EA.hy926内皮细胞的特异性黏附与TAT-NLS多肽对细 胞膜穿透功能的协同作用。相比于PP/mP/pDNA非靶向基因复合物和 PC/mP/pDNA靶向基因复合物，使得TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物更 倾向于黏附在EA.hy926内皮细胞上，故对增强EA.hy926内皮细胞的转染是非 常有利的。
TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物基因递送示意图见图8所示。综上 所述，本发明采用既具有穿透细胞能力又具有进核能力的TAT-NLS多肽与 PLGA-g-PEI-g-CAGW/PLGA-b-mPEG(PC/mP)两亲聚合物复合胶束纳米粒协 同缩和pDNA。首先将PC/mP复合胶束与pDNA按不同的N/P摩尔比复合，然 后加入TAT-NLS多肽。研究表明，TAT-NLS的加入使得PC/mP/pDNA靶向基因 复合物的粒径增大，由于TAT-NLS本身带正电，提高了TAT-NLS/pDNA/PC/mP 四元基因复合物的zeta电位，增强了该四元基因复合缩合pDNA的能力。MTT 结果表明TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物较PP/mP/pDNA非靶向基因复 合物和PC/mP/pDNA靶向基因复合物具有较理想的细胞相容性。体外转染实验 表明加入TAT-NLS多肽后能够稍稍提高细胞的转染效率，也可以明显的促进EA. hy926内皮细胞迁移。随后利用流式细胞术考察了PP/mP/pDNA非靶向基因复 合物、PC/mP/pDNA靶向基因复合物和TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物 的细胞摄取分析，结果表明TAT-NLS的加入增强了EA.hy926内皮细胞对TAT-NLS/pDNA/PC/mP四元基因复合物的摄取，TAT-NLS组合肽与PEI以及 CAGW多肽的协同作用赋予载体具有多功能性，能够促进EA.hy926内皮细胞 增殖。
Claims (11)
1.一种CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用mPEG作为大分子引发剂，辛酸亚锡作为催化剂，引发DL-LA和GA开环共聚，制得聚乙二醇-聚乙丙交酯共聚物mPEG-b-PLGA；
(2)采用山梨醇作为引发剂，Sn(Oct)2甲苯溶液作为催化剂，引发DL-LA和GA开环共聚，制得聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA，然后将其羧基化后与PEI进行接枝反应，制得乳酸-羟基乙酸-g-聚乙烯亚胺共聚物PLGA-g-PEI；
(3)将PLGA-g-PEI和三乙胺溶解于DMF中，在0℃条件下，向其中滴加二烯丙基氨基甲酰氯溶液，反应过夜，最后过滤，浓缩，冷冻干燥得到接有双键的产物；
(4)将接有双键的产物溶于DMSO中，随后依次加入2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和CAGW的DMSO溶液，用紫外光照射10-15min，最后过滤，透析，冷冻干燥，制得PLGA-g-PEI-g-CAGW共聚物；
其中，CAGW是Cys-Ala-Gly-Trp的简称；
(5)将PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA分别溶于DMSO中，按照PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA质量比为2-4:0.8-1.2混合，然后加入pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，搅拌，使其自组装形成PLGA-g-PEI-g-CAGW/mPEG-b-PLGA靶向共聚物胶束；
(6)将步骤(5)所得共聚物胶束与pDNA溶液混匀，静置20-40min，然后加入TAT-NLS溶液，混匀，超声振荡10-15s，最后静置20-40min，制得CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物；
其中，步骤(5)所得物与pDNA的质量比为2-4:1-3；TAT-NLS上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数比为0.1-30:1。
2.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)的具体过程为：将mPEG、GA和DL-LA混匀，然后加入Sn(Oct)2甲苯溶液，密封，抽真空，通氮气，然后放入油浴锅中，于105-120℃反应22-26h，所得产物采用三氯甲烷溶解，正己烷沉出，最后进行真空干燥，制得；其中，mPEG、GA、DL-LA和Sn(Oct)2的摩尔比为0.35-0.45:6.5-7.5:22-23:0.08-0.12。
3.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)的具体过程为：将山梨醇、DL-LA和GA混合，在氮气环境下，加入Sn(Oct)2甲苯溶液，于125℃的油浴中反应24h，制得PLGA共聚物；将PLGA共聚物溶于1,4-二氧六环中，在氮气环境下，加入三乙胺、DMAP和琥珀酸酐，于25℃油浴反应24-26h，制得羧基化的PLGA聚合物；将羧基化的PLGA聚合物溶于DMSO中，加入NHS搅拌2-3h，再加入含PEI的DMSO溶液，在氮气气氛下，反应24h，制得PLGA-g-PEI共聚物；其中，山梨醇、DL-LA、GA和Sn(Oct)2的摩尔比为0.1-0.2:31-32:4-5:0.08-0.12；PLGA共聚物和琥珀酸酐的摩尔比为0.05-0.1:3-4；羧基化的PLGA聚合物、NHS和PEI的摩尔比为0.004-0.005:0.1-0.15:0.08-0.12。
4.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中二烯丙基氨基甲酰氯溶液的浓度为0.045mol/L，滴加时间控制在2h以内。
5.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中接有双键的产物、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮和CAGW的质量比为20-30:0.8-1.2:12-18。
6.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)中PLGA-g-PEI-g-CAGW和mPEG-b-PLGA的质量比为3:1。
7.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤(6)中步骤(5)所得物与pDNA的质量比为3:2；TAT-NLS上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数比为2:1。
8.根据权利要求1所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物的制备方法，其特征在于，步骤(6)中TAT-NLS上伯胺的摩尔数与pDNA上磷酸根的摩尔数比为5:1。
9.采用权利要求1-8任一项所述的方法制得的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物。
10.权利要求9所述的CAGW多肽和TAT-NLS多肽修饰的载基因复合物在制备修复血管内皮细胞基因药物中的应用。
11.一种修复血管内皮细胞的基因药物，其特征在于，包括权利要求9所述的载基因复合物。
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| CAGW Peptide- and PEG-Modified Gene Carrier for Selective Gene Delivery and Promotion of Angiogenesis in HUVECs in Vivo.;Yang J等;《ACS Appl Mater Interfaces.》;20170124;第9卷(第5期);4485-4497 * |
| CREDVW-Linked Polymeric Micelles As a Targeting Gene Transfer Vector for Selective Transfection and Proliferation of Endothelial Cells.;Hao X等;《ACS Appl Mater Interfaces.》;20150526;第7卷(第22期);第12130页实验部分和Scheme1-2 * |
| Multitargeting Gene Delivery Systems for Enhancing the Transfection of Endothelial Cells.;Yang J等;《Macromol Rapid Commun.》;20160928;第37卷(第23期);1926-1931 * |
| 靶向多肽修饰在促进内皮细胞增殖方面的研究;杨静;《中国博士学位论文全文数据库》;20171115;第五章，图5-1 * |
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