CN110251686B - 一种淀粉基两亲性自组装载体材料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种淀粉基两亲性自组装载体材料及其制法与应用。该淀粉基载体材料的分子结构如下所示，该淀粉基载体材料的分子量在1.25×106～1.01×108g/mol，羧甲基基团取代度为0.20～0.27，脂肪酸取代度为0.007～0.21，M细胞靶向肽CKSTHPLSC的含量为0.04～11.97％。本发明的淀粉基载体材料在胃部pH(pH＝1.2)条件下质子化不溶于水，在小肠pH(pH＝6.8)条件下去质子化缓慢溶于水，具有良好的胃肠道pH响应性；能在水溶液中通过亲疏水相互作用自发形成稳定的胶束，并高效包埋疏水活性物质；且能够与M细胞特异性识别并结合，实现功能因子的口服M细胞靶向递送。

Description

一种淀粉基两亲性自组装载体材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种淀粉基两亲性自组装载体材料及其制备方法与应用，具体涉及一种淀粉基两亲性自组装载体材料具有在水溶液中自发形成胶束、pH响应以及M细胞靶向特性，能够实现对疏水性营养功能因子的装载、控释和M细胞靶向递送。
背景技术
随着社会发展和人民生活水平的不断提高，以及膳食结构与疾病谱的演变，人们对营养与健康的关注度与日俱增。人们对食品的消费除了基本的营养功能外，更加注重膳食营养功能补充、生理调节、促进健康等内在品质。因此，大量的功能性蛋白质和肽类、多糖和寡糖、脂质和脂肪酸、益生菌、多酚类物质等具有重要生理活性的食品功能因子被广泛应用到食品体系中。食品营养功能因子在小肠内营养特性的发挥，遵循特定的递呈途径并最终通过肠道上皮细胞摄取、吸收、转运调控机制来实现。然而，人体小肠中不同部位的微环境差异及不同种类肠道上皮细胞的定位分布，使得外源性营养功能因子进入人体消化道后面临一系列的生理屏障。因此，必须通过特定的载体材料将其包埋，一方面保护其在人体消化道内的生理活性，另一方面使之能够靶向到特定的功能细胞，实现营养功能因子的稳态话活性保持及高效吸收利用。
小肠是人体主要的营养物质吸收场所，其对营养物质的吸收主要通过肠道上皮细胞摄取、吸收、转运调控机制来实现。小肠中分布着不同种类和功能的肠道上皮细胞。其中，M细胞是位于小肠回肠段Peyer区淋巴滤泡上皮中的转运细胞，其表面具有糖残基、细胞黏附因子和膜蛋白等受体，可特异性识别并摄取外源生物活性物质，并引发适当的免疫应答。同时，M细胞特殊的细胞结构可以缩短含有抗原的吞饮小泡跨越M上皮的距离，有利于抗原快速进入上皮下的淋巴组织诱导粘膜免疫应答。然而，由于M细胞在肠道中的分布极少，故需要能够特异性识别并黏附M细胞的配体来引导营养功能因子到达M细胞的位置。因此，开发具有M细胞靶向性的载体材料十分必要。
M细胞表面有多种特异性识别受体，如蛋白质多肽类、糖蛋白以及磷脂类，研究表明，与具有M细胞靶向作用的配体进行混合或接枝，可提高M细胞对聚合物颗粒的转运效率。Garinot等人在PEGylated PLGA-based nanoparticles targeting M cells for oralvaccination(Journal of Controlled Release,2007,120(3):195-204)中用具有M细胞靶向功能的RGD短肽接枝PCL-PEG，合成了两亲性的M细胞靶向载体材料。该两亲性载体材料通过水包油包水的方法构建双层脂质体微囊包埋亲水性的蛋白，但需要加入PEG以稳定纳米颗粒，且载体材料对目标蛋白的包封率比较低，仅为30～50％。而且PEG本身良好的水溶解性和吸水性，在药片制剂中可提高片剂释放药物的能力，难以实现药物的控缓释；PEG分子可改变各类细胞的生物膜结构，对细胞有一定的损伤。Yoo等人在Targeted delivery ofchitosan nanoparticles to Peyer’s patch using M cell-homing peptide selectedby phage display technique(Biomaterials,2010,31(30):7738-7747)中，用NHS/EDC催化酰化的方法，将CKS9短肽接枝到壳聚糖分子链上，合成亲水性的M细胞靶向载体材料，但由于壳聚糖在酸性环境下易于溶解，故不利于在胃肠道中保护活性物质的功能活性。
目前，关于M细胞靶向载体材料多为亲水性或可以构建双层脂质体的两亲性载体材料，适合包埋亲水性的物质，而针对疏水性活性物质的M细胞靶向载体材料较少。除此之外，为使活性物质能够顺利通过胃肠道到达M细胞，载体除了具备M细胞靶向功能外，还应能够在胃肠道中保护活性物质不被释放而失活。因此，为实现疏水性活性物质的口服M细胞靶向，进而提高其生物利用率，M细胞载体材料需具备以下特征：(1)对疏水性活性物质有较好的包埋效果，能够与疏水性活性物质形成稳定的传输体系；(2)在胃肠道生理环境中，能够抵抗强酸、pH变化以及酶水解的影响，以实现在胃肠道环境中对活性物质的控制释放；(3)具有M细胞靶向功能，通过与M细胞表面特异性受体识别达到靶向M细胞的功能，提高M细胞对疏水性活性物质的转运效率。在M细胞靶向载体领域研究较多的合成高分子材料(如聚乳酸、聚乙二醇)以及天然高分子(壳聚糖、葡聚糖)等，由于其自身的潜在毒性、水溶解性、抗酶解性差等问题，而难以同时达到以上要求，故需要开发新的载体材料用以在靶向M细胞递送活性物质的同时达到高效包埋和控制释放的目的。
淀粉广泛存在于大自然中，是重要的天然高分子聚合物，其分子链上含有大量的羟基基团，有利于对其进行修饰改性，以不同的功能基团取代葡萄糖单元上的羟基，可使其同时具备不同的功能性质。除此之外，淀粉作为食物的主要成分，还具有安全无毒、生物相容性好、生物可降解、无免疫源性等特点。因此，淀粉基载体材料在口服控缓释领域有广泛的应用。本发明针对疏水性活性物质的M细胞靶向递送的问题，发明一种具有M细胞靶向功能的淀粉基两亲性载体材料，这对于实现食品功能因子的口服M细胞靶向递送意义重大。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种淀粉基两亲性自组装载体材料。
本发明另一目的在于提供上述淀粉基两亲性自组装载体材料的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述淀粉基两亲性自组装载体材料的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种淀粉基两亲性自组装载体材料，其分子结构式如下所示：
Figure BDA0002112084050000031
所述的淀粉基两亲性自组装载体材料的分子量在1.25×106～1.01×108g/mol之间，羧甲基基团取代度为0.20～0.27，脂肪酸取代度为0.007～0.21，M细胞靶向肽CKSTHPLSC的含量为0.04～11.97％(以N元素含量计算)，M细胞靶向肽CKSTHPLSC的含量优选为0.61～11.97％(以N元素含量计算)。
所述的R为H或R1或R2或R3并不代表分子结构中R同时为H或者R同时为R1或者R同时为R2或者R同时为R3的情况，而是代表M细胞靶向和pH响应性的淀粉基载体材料的分子结构中多个R一部分为H、一部分为R1、一部分为R2、一部分为R3。
一种上述淀粉基两亲性自组装载体材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用一氯乙酸通过醚化反应将羧甲基基团引入淀粉分子链，得到羧甲基淀粉；
(2)通过酯化反应将脂肪酸接枝到羧甲基淀粉分子链上，透析除去未反应的催化剂和脂肪酸，冻干得到两亲性淀粉；
(3)通过酰化反应将M细胞靶向肽CKSTHPLSC接枝到上述两亲性淀粉分子链上，经透析除去未反应的催化剂和M细胞靶向肽CKSTHPLSC，透析液冻干后得到具有M细胞靶向功能的淀粉基两亲性载体材料。
步骤(1)中所述的淀粉的分子量为1.0×106～1.0×108g/mol；步骤(1)中所述的淀粉和一氯乙酸的摩尔比为1：0.3～0.4；步骤(1)中所述的醚化反应是指在45℃反应4h。
步骤(2)中所述的酯化反应是指在30℃反应24h；酯化反应中所用的催化剂为N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)；
步骤(2)中所述的脂肪酸为含有12～18个碳原子的脂肪酸；
步骤(2)中所述的羧甲基淀粉分子和脂肪酸的摩尔比为1:0.01～0.5；所述的催化剂的量满足DIC与脂肪酸的摩尔比为1:1；
步骤(3)中所述的酰化反应是在溶剂二甲基亚砜(DMSO)中进行的；酰化反应的催化剂为N,N’-羰基二咪唑(CDI)，催化剂在催化酰化反应之前优选为先加入到两亲性淀粉的二甲基亚砜溶液中在15～35℃活化1～4h后再加入M细胞靶向肽CKSTHPLSC进行酰化反应，酰化反应是指在15～35℃反应4～48h；其中两亲性淀粉在酰化反应体系中的浓度为2％～6％(g/mL，溶剂为DMSO)。
步骤(3)中所述的两亲性淀粉、催化剂和M细胞靶向肽CKSTHPLSC的摩尔比为10:1:1～2:1:1；优选为8:1:1～4:1:1。
上述的淀粉基两亲性自组装载体材料在制备口服制剂中的应用；
所述的口服制剂中的活性物质优选为疏水性营养功能因子。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明所提供的淀粉基两亲性自组装载体材料，其在胃部pH(pH＝1.2)条件下质子化不溶于水，在小肠pH(pH＝6.8)条件下去质子化缓慢溶于水，因此具有良好的胃肠道pH响应性，能够较好地保护活性物质在胃肠道中不被破坏而失活；
(2)本发明所提供的淀粉基两亲性自组装载体材料，在水溶液中通过亲疏水相互作用自发形成稳定的胶束，并高效包埋疏水活性物质。所形成的胶束稳定性好，无需额外添加乳化剂来稳定胶束结构；
(3)本发明所提供的淀粉基两亲性自组装载体材料，通过所接枝的M细胞靶向肽，能够与M细胞特异性识别并结合，有助于提高M细胞对活性物质的生物利用率，增强免疫应答。
(4)本发明所提供的淀粉基两亲性自组装载体材料，可通过调节羧甲基基团取代度、脂肪酸取代度、脂肪酸种类以及M细胞靶向肽接枝量，来调节该载体材料的胃肠道控释效果、胶束稳定性、胶束包埋能力和M细胞靶向能力，以适用于不同结构的活性物质的口服免疫功能。
附图说明
图1为实施例1～3制备的淀粉基两亲性自组装载体材料的红外光谱图。
图2为实施例1～3制备的淀粉基两亲性自组装载体材料核磁共振氢谱图。
图3为实施例1～3制备的淀粉基两亲性自组装载体材料在不同pH条件下的ζ-电位。
图4为实施例1～3制备的淀粉基两亲性自组装载体材料对活性物质的控制释放行为图。
图5为实施例1～3制备的淀粉基两亲性自组装载体材料所构建的淀粉基自组装胶束的储藏稳定性。
图6为实施例2制备的淀粉基两亲性载体材料的M细胞靶向性。
图7为实施例3制备的淀粉基两亲性载体材料的M细胞靶向性。
图8为M细胞对实施例2～3制备的淀粉基两亲性载体材料的转运个数图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
实施例中所用M细胞靶向肽CKSTHPLSC(CKS9)购自上海吉尔生化科技有限公司，实施例中所用细胞为人体结肠癌细胞Caco-2细胞(ATCC：HTB37)和人淋巴瘤细胞Raji B细胞(ATCC：CCL-86)，均购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。淀粉基载体材料所包埋的活性物质为TRP2多肽，购自上海吉尔生化科技有限公司。
实施例中各种性能测试方法和条件分别如下所示：
1、实施例中ζ-电位的测试参考文献“Zhang Y,Chi C,Huang X,et al.Starch-based nanocapsules fabricated through layer-by-layer assembly for oraldelivery of protein to lower gastrointestinal tract[J].Carbohydrate polymers,2017,171:242-251.”，具体测试条件为：样品浓度1mg/mL，溶剂为不同pH的磷酸盐缓冲液(0.01M)，测试仪器为纳米激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)，测试温度为25℃，测试次数为3次，平衡时间为2min，平衡温度为25℃。
2、淀粉基两亲性自组装载体材料包埋活性物质TRP2多肽构建自组装微囊：将2mg淀粉基两亲性自组装载体材料加入20mL磷酸盐缓冲液中(0.01M，pH＝6.8)，85℃水浴加热30min，冷却至室温，加入0.2mL的TRP2多肽(5mg/mL，溶剂为磷酸盐缓冲液，0.01M，pH＝6.8)，将混合体系超声处理10min(超声频率100Hz)后，在25℃下持续搅拌24h(200r/min)，将组装液超速离心(4℃，15000rpm/min，30min)，除去上清液，沉淀物即为包埋有TPR2多肽的淀粉基自组装胶束。利用分光光度计测定上清液中TPR2多肽的含量，计算淀粉基两亲性自组装载体材料对TPR2多肽的包封率，计算公式如下，
Figure BDA0002112084050000071
其中，m0—投入体系内TPR2多肽的总质量，m1—上清液中TPR2多肽的质量。
3、淀粉基载体材料对活性物质的控制释放行为的测定：
(1)模拟消化道及细胞环境溶液的配制：(模拟是指模拟相应的pH及酶解环境)
模拟胃液(SGF)：将7mL浓盐酸溶于800mL去离子水中，摇匀后稀释定容到1L配制成pH＝1.2的模拟胃液。
模拟小肠液(SIF)(含胰酶，pH＝6.8)：取磷酸二氢钾6.8g，加500mL蒸馏水溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶(购自Singma-Aldrich科技有限公司)10g，加适量PBS溶解，最终用蒸馏水将溶液定容至1000mL。
模拟细胞内环境(SCF)：配置0.02mol/L的磷酸二氢钾溶液，随后用醋酸将溶液pH调至5.5。
模拟组织液(STF)：首先配置pH＝7.4的缓冲溶液，并按照组织液离子浓度比例(Na+，K+，Ca2+，Mg2+离子浓度分别为145.1mM，4.10mM，3.40mM，1.30mM)加入缓冲液中配置模拟组织液。
(2)具体测试条件：
按上述方法制备包埋TPR2多肽的淀粉基自组装胶束，将获得的淀粉自组装胶束用1.5mL的pH＝6.8的PBS清洗后，高速离心将上清液除去后，取离心后的沉淀物，用5mL的模拟胃液重新分散，随后转移至透析袋中，37℃下于模拟胃液中进行模拟释放。在模拟释放过程中，按一定的时间间隔分别取0.2mL的释放液，取样后分别补充加入0.2mL的模拟胃液，利用紫外分光光度计测285nm处的吸光度计算TRP2多肽在不同释放时间下的释放率，以模拟胃液为空白对照，并作三次平行实验。
经过2h模拟胃液浸泡后，将样品从透析袋中取出，并用超速离心(4℃，15000rpm，30min)除去上清液，用5mL模拟小肠液进行分散，随后转移至透析袋中，37℃下于模拟小肠液中进行模拟释放，期间保持透析袋一定时间间隔的震荡。在模拟释放过程中，按一定的时间间隔分别取0.2mL的释放液，取样后分别补充加入0.2mL的模拟小肠液。利用紫外分光光度计测285nm处的吸光度计算TRP2多肽的释放率，以模拟小肠液为空白对照，并作三次平行实验。
将经过模拟小肠液浸泡后的样品从透析袋中取出，并用超速离心(4℃，15000rpm，30min)除去上清液，随后用5mL模拟细胞内环境溶液分散，转移至透析袋中，37℃下于一定体积的模拟细胞内环境溶液中进行模拟释放，期间保持透析袋一定时间间隔的震荡。浸泡30min后，取0.2mL的释放液，取样后补充加入0.2mL的模拟模拟细胞内环境溶液。利用紫外分光光度计测285nm处的吸光度计算TRP2多肽的释放率，以模拟细胞内环境溶液为空白对照，并作三次平行实验。
将经过模拟细胞内环境溶液浸泡处理的样品从透析袋中取出，在超速离心条件下(4℃，15000rpm，30min)除去上清液，随后用5mL模拟组织液进行分散，并转移至透析袋中，37℃下于一定体积的模拟组织液中于37℃进行模拟释放，期间保持透析袋一定时间间隔的震荡。在模拟释放过程中，按一定的时间间隔分别取0.2mL的释放液，取样后分别补充加入0.2mL的模拟组织液。利用紫外分光光度计测285nm处的吸光度计算TRP2多肽的释放率，以模拟组织液为空白对照，并作三次平行实验。
4、Raji B细胞与Caco-2细胞共培养构建体外模型M细胞参照文献“des Rieux A,Fievez V,Théate I,et al.An improved in vitro model of human intestinalfollicle-associated epithelium to study nanoparticle transport by M cells[J].European journal of pharmaceutical sciences,2007,30(5):380-391.”，具体方法为：选取对数生长期的Caco-2细胞，利用0.25％胰蛋白酶对细胞进行消化，经无菌离心(800rpm/min，3min)，用高糖DMEM培养基(其中含有10％牛血清，1％非必需氨基酸)将细胞重悬成1×106个/mL Caco-2细胞悬浮液。以每孔0.5mL的量将Caco-2细胞悬浮液置于12孔聚碳酸酯Transwell小室底部的滤膜上(Corning，USA，3μm，滤膜表面积1.12cm2)，在37℃、5％CO2以及饱和水蒸气条件下培养14天。培养过程中在内室(滤膜上方)加入0.5mL高糖DMEM培养基，在小室底侧(滤膜下侧)加入1mL高糖DMEM培养基，并每两天更换一次培养基。单层培养结束后，利用跨膜细胞电阻仪对单层细胞电阻进行测试，选取细胞电阻大于300Ω/cm的小室细胞进行进一步的共培养。共培养时，选取对数生长期的Raji B细胞，以DMEM/RPMI 1640＝2：1混合培养基将细胞分散成5×105个/mL的细胞悬浮液，以每孔1mL的量加入到小室底侧进行共培养。共培养时小室内加入0.5mL DMEM/RPMI 1640混合培养基，小室底侧加入1.5mL混合培养基，培养基需每天更换，共培养持续4～5天后在Transwell小室底部滤膜上端形成一层分布有M细胞和Caco-2细胞的细胞单分子层。
5、激光共聚焦显微镜观察淀粉基两亲性自组装载体材料的M细胞靶向性方法参考文献“des Rieux A,Fievez V,Théate I,et al.An improved in vitro model of humanintestinal follicle-associated epithelium to study nanoparticle transport byM cells[J].European journal of pharmaceutical sciences,2007,30(5):380-391.”，具体步骤为：在上述具有M细胞和Caco-2细胞的细胞单分子层的Transwell小室底部滤膜上加入淀粉基自组装胶束分散液，通过采用激光共聚焦显微镜来观察淀粉基自组装胶束的M细胞靶向性来验证淀粉基两亲性自组装载体材料的M细胞靶向性。实验前，首先用异硫氰酸荧光素(美仑生物技术有限公司)对TRP2多肽进行荧光标记，然后与淀粉基两亲性自组装载体材料自组装即可获得荧光标记的淀粉基自组装胶束，将该荧光标记的淀粉基自组装胶束用DMEM(2％FBS)培养液稀释至浓度为5×108个/mL，37℃下平衡一段时间后，取0.5mL加入已构建好的具有M细胞和Caco-2细胞的细胞单分子层的Transwell小室的内室，外室加1.5mL DMEM(2％FBS)培养液。将培养板放入37℃、5％CO2孵箱中孵育4h，吸除培养基，用PBS清洗Transwell板孔内室底部的滤膜，加入4％多聚甲醛溶液对Caco-2细胞和M细胞进行固定处理15min，固定后吸除多聚甲醛，使用PBS于低温下清洗细胞，随后加入M细胞单抗(NKM16-2-4)(Medical&Biological Laboratories Co.,LTD)溶液，4℃下处理24h。处理结束后用PBS清洗细胞，然后加入相应的二抗(Anti rat IgG-488)(Jackson ImmunoRasearchLaboratories,INC.)，于37℃下处理1h。结束后用PBS清洗干净，最后加入Hoechst 33342染色剂(碧云天生物技术有限公司)对全部细胞核进行染色处理2min。用PBS清洗干净后，将小室的滤膜揭下置于载玻片上，盖上盖玻片，用激光共聚焦显微镜进行测试，观察淀粉基自组装胶束对M细胞的靶向性。若荧光标记的淀粉基自组装胶束和M细胞的荧光位置发生重合即可表示淀粉基自组装载体材料具有M细胞靶向性。
6、M细胞靶向转运实验参考文献“Garinot M,Fiévez V,Pourcelle V,etal.PEGylated PLGA-based nanoparticles targeting M cells for oral vaccination[J].Journal of Controlled Release,2007,120(3):195-204.”的方法并稍作修改，具体操作如下：在上述具有M细胞和Caco-2细胞的细胞单分子层的Transwell小室底部滤膜上进行M细胞靶向转运实验。首先用异硫氰酸荧光素(美仑生物技术有限公司)对TRP2多肽进行荧光标记，然后与淀粉基两亲性自组装载体材料自组装即可获得荧光标记的淀粉基自组装胶束，将该荧光标记的淀粉基自组装胶束用DMEM(2％FBS)培养液稀释至样品浓度为5×108个/mL，37℃下平衡一段时间后，取0.5mL加入已构建好的具有M细胞和Caco-2细胞的细胞单分子层的Transwell小室的内室，外室加1.5mLDMEM(2％FBS)培养液。将培养板放入37℃、5％CO2孵箱中孵育4h，经M细胞靶向转运后的荧光标记的淀粉基自组装胶束进入外室培养液中。通过测定外室培养液中的荧光标记的淀粉基自组装胶束的荧光粒子数量，可评价M细胞对淀粉基两亲性自组装载体材料的转运效果。
实施例1
(1)以淀粉(分子量为1×106g/mol)和一氯乙酸(淀粉:一氯乙酸＝1:0.3，mol/mol)于45℃下进行醚化反应4h制得羧甲基取代度为0.20的羧甲基淀粉；
(2)以月桂酸(链长为12C)为原料(淀粉:月桂酸＝1:0.3，mol/mol)，通过DIC催化(DIC:脂肪酸＝1:1，mol/mol)，与羧甲基淀粉在30℃反应24h发生酯化反应，反应结束后通过透析、冻干，获得疏水侧链为月桂酸的两亲性淀粉，脂肪酸取代度为0.21；
(3)称取5g疏水侧链为月桂酸的两亲性淀粉溶于100mL DMSO中，加入摩尔比为淀粉:CDI＝8:1的CDI，于15℃下持续搅拌2h以活化淀粉羟基，按摩尔比淀粉:多肽＝8:1加入相应质量的M细胞靶向肽CKSTHPLSC。15℃下反应4h。反应结束后用透析袋除去未反应的靶向肽及CDI。处理结束后样品经真空冷冻干燥后粉粹处理。获得靶向肽接枝量为0.04％(以N元素含量计)的淀粉基两亲性自组装载体材料，此时淀粉基两亲性自组装载体材料的分子量为1.25×106g/mol。
实施例1所制备的淀粉基两亲性自组装载体材料的红外光谱图如图1所示，在1750cm-1处新峰为淀粉分子与脂肪酸形成的酯中羰基的红外特征峰，2925cm-1和2856cm-1处峰分别为亚甲基反对称伸缩振动和对称伸缩振动特征峰。1750cm-1处新峰的出现表明脂肪酸与淀粉分子上的羟基发生了酯化反应，淀粉羟基被脂肪酸基团取代，引入了脂肪酸酯侧链。该淀粉基载体材料的核磁共振氢谱如图2所示，在0.90ppm、1.28ppm处出现了甲基位置12号氢原子和正构长链亚甲基位置3～10号氢原子的化学位移特征峰，在1.54ppm和2.20ppm处出现了月桂酸分子中亚甲基位子11号和2号氢原子的化学位移特征峰，证明该淀粉基两亲性自组装载体材料中引入了月桂酸侧链。由于靶向肽接枝量较少，红外谱图和核磁氢谱图中无明显相关信号，通过元素分析得知靶向肽接枝量为0.04％(以N元素含量计)。
该淀粉基两亲性自组装载体材料的ζ-电位如图3所示，在pH＝1.2时质子化几乎不带电荷，在pH＝6.8时去质子化带负电荷。
利用该载体材料对TRP2多肽进行自组装包埋，包封率可达90％，淀粉基载体材料对活性物质的控制释放行为如图4所示，从图4中可以看出，在胃和小肠中仅有40.75％的TRP2多肽在到达M细胞之前被释放出来。
将该淀粉基自组装胶束分散于磷酸盐缓冲液中(0.01M，pH＝6.8)并储存一段时间，通过测定其粒径分布变化评价其稳定性(如图5所示)。该淀粉基自组装胶束在储藏过程中的粒径分布均匀且分布范围基本保持不变，说明该淀粉基自组装胶束具有良好的稳定性。
该实施例中接枝靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束被M细胞转运的数量为1.54×105个，与未接枝靶向肽CKS9的淀粉基两亲性胶束差别不大。
实施例2
(1)以淀粉(分子量为1×108g/mol)和一氯乙酸(淀粉:一氯乙酸＝1:0.4，mol/mol)为原料，在45℃反应4h下进行醚化反应，制得羧甲基取代度为0.27的羧甲基淀粉；
(2)以硬脂酸(链长为18C)为原料(淀粉：硬脂酸＝1：0.01，mol/mol)，通过DIC催化(DIC:脂肪酸＝1:1，mol/mol)，在30℃下与羧甲基淀粉进行酯化反应，反应24h后结束实验，通过透析、冻干，获得疏水侧链为硬脂酸的两亲性淀粉，脂肪酸取代度为0.007；
(3)称取2g疏水侧链为硬脂酸的两亲性淀粉溶于100mL DMSO中，加入摩尔比为淀粉:CDI＝4:1的CDI，于35℃下持续搅拌4h以活化淀粉羟基，按摩尔比淀粉:多肽＝4:1加入相应质量的M细胞靶向肽CKSTHPLSC。35℃下反应48h。反应结束后用透析袋除去未反应的多肽及CDI。处理结束后样品经真空冷冻干燥后粉粹处理。获得靶向肽接枝量为11.97％(以N元素含量计)的淀粉基两亲性自组装载体材料，此时淀粉基两亲性自组装载体材料的分子量为1.01×108g/mol。
实施例2所制备的淀粉基两亲性自组装载体材料的红外光谱图如图1所示，在1750cm-1处新峰为淀粉分子与脂肪酸形成的酯中羰基的红外特征峰，2925cm-1和2856cm-1处峰分别为亚甲基反对称伸缩振动和对称伸缩振动特征峰。1750cm-1处新峰的出现表明脂肪酸与淀粉分子上的羟基发生了酯化反应，淀粉羟基被脂肪酸基团取代，引入了脂肪酸酯侧链。图2为该载体材料的核磁共振氢谱图，从图2中可以看出，在0.90ppm、1.28ppm、1.54ppm和2.20ppm附近出现的特征峰分别为脂肪酸甲基、硬脂酸3～16号亚甲基、17号亚甲基、2号亚甲基质子化学位移，表明载体材料分子中引入了硬脂酸酯侧链；而在7.2ppm和7.8ppm附近出现的靶向肽CKSTHPLSC上咪唑环的质子化学位移峰，则证实了在两亲性淀粉分子中成功引入了靶向肽CKSTHPLSC侧链。通过元素分析得知靶向肽接枝量为11.97％(以N元素含量计)。
该淀粉基两亲性自组装载体材料的ζ-电位如图3所示，在pH＝1.2时由于羧甲基基团质子化而几乎不带电荷，pH＝6.8时去质子化，带负电荷。
以此淀粉基两亲性自组装载体材料为载体对TRP2多肽进行自组装包埋，包封率为85％，且在体外模拟释放中能够较好地控制其释放，在胃和小肠中仅有35.70％的TRP2多肽在到达M细胞之前被释放出来(如图4所示)。
将该淀粉基自组装胶束分散于磷酸盐缓冲液中(0.01M，pH＝6.8)并储存一段时间，通过测定其粒径分布变化评价其稳定性(如图5所示)。由于该淀粉基两亲性自组装载体材料中脂肪酸取代度较低，故所构建的胶束稳定性稍差，在储藏过程中部分发生部分聚集，造成粒径尺寸增大，但大部分仍处于均匀分布状态，说明该淀粉基自组装胶束具有一定的的稳定性。
M细胞靶向性实验结果如图6所示，其中A1、B1为Transwell小室底部滤膜上细胞单分子层中Caco-2细胞和M细胞的细胞核(图中亮点)；A2、B2为细胞单分子层中的M细胞(由M细胞特异性抗体标记观察得到，图中亮点)；A3、B3为荧光标记的该实施例中获得的未接枝靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束和接枝有靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束(图中亮点)；A4、B4分别为各自前3个图的叠加图。从A4可以看出，未接枝靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束与M细胞的荧光位置并未重合(图中不同箭头的位置)，分散开来，因此未接枝靶向肽CKS9的淀粉基自组装载体材料不具有M细胞靶向性。而从B4可以得出，接枝有靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束与Transwell小室底部滤膜上细胞单分子层中M细胞的荧光位置发生部分重合(图中箭头1指向M细胞，箭头2指向荧光标记的淀粉基自组装胶束，M细胞与淀粉基自组装胶束重合部分用圆圈标出)，说明该实施例中获得的接枝有靶向肽CKS9的淀粉基两亲性载体材料呈现较好的M靶向靶向性。
M细胞靶向转运实验结果如图8所示，该实施例中接枝靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束被M细胞转运的数量为2.53×105个，相比于未接枝靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束有很大的提高。
实施例3：
(1)以淀粉(分子量为1×107g/mol)和一氯乙酸(淀粉:一氯乙酸＝1:0.4，mol/mol)为原料，在45℃下进行醚化反应，反应4h，制得羧甲基取代度为0.27的羧甲基淀粉；
(2)以硬脂酸(链长为18C)为原料(淀粉：硬脂酸＝1：0.5，mol/mol)，通过DIC催化(DIC:脂肪酸＝1:1，mol/mol)，在30℃下与羧甲基淀粉进行酯化反应，反应24h后结束实验，通过透析、冻干，获得疏水侧链为硬脂酸的两亲性淀粉，脂肪酸取代度为0.111；
(3)称取6g疏水侧链为硬脂酸的两亲性淀粉溶于100mL DMSO中，加入摩尔比为淀粉:CDI＝6:1的CDI，于30℃下持续搅拌3h以活化淀粉羟基，按摩尔比淀粉:多肽＝6:1加入相应质量的M细胞靶向肽CKSTHPLSC。30℃下反应24h。反应结束后用透析袋除去未反应的多肽及CDI。处理结束后样品经真空冷冻干燥后粉粹处理。获得靶向肽接枝量为0.61％(以N元素含量计)的淀粉基两亲性自组装载体材料，此时淀粉基两亲性自组装载体材料的分子量为1.17×107g/mol。
实施例3所制备的淀粉基两亲性自组装载体材料的红外光谱图如图1所示，在1750cm-1处新峰为淀粉分子与脂肪酸形成的酯中羰基的红外特征峰，2925cm-1和2856cm-1处峰分别为亚甲基反对称伸缩振动和对称伸缩振动特征峰。1750cm-1处新峰的出现表明脂肪酸与淀粉分子上的羟基发生了酯化反应，淀粉羟基被脂肪酸基团取代，引入了脂肪酸酯侧链。图2为该载体材料的核磁共振氢谱图，从图2中可以看出，在0.90ppm、1.28ppm、1.54ppm和2.20ppm附近出现的特征峰分别为脂肪酸甲基、硬脂酸3～16号亚甲基、17号亚甲基、2号亚甲基质子化学位移，表明载体材料分子中引入了硬脂酸酯侧链；而在7.2ppm和7.8ppm附近出现的靶向肽CKSTHPLSC上咪唑环的质子化学位移峰，则证实了在两亲性淀粉分子中成功引入了靶向肽CKSTHPLSC侧链。通过元素分析得知靶向肽接枝量为0.61％(以N元素含量计)。
该淀粉基两亲性自组装载体材料的ζ-电位如图3所示，在pH＝1.2时由于羧甲基基团质子化而几乎不带电荷，pH＝6.8时去质子化，带负电荷。
以此淀粉基两亲性自组装载体材料为载体对TRP2多肽进行自组装包埋，包封率为85％，且在体外模拟释放中能够较好地控制其释放，在胃和小肠中仅有28.02％左右的TRP2多肽在到达M细胞之前被释放出来(如图4所示)。
将该淀粉基自组装胶束分散于磷酸盐缓冲液中(0.01M，pH＝6.8)并储存一段时间，通过测定其粒径分布变化评价其稳定性(如图5所示)。该淀粉基自组装胶束在储藏过程中的粒径分布范围基本保持不变，说明该淀粉基自组装胶束具有良好的稳定性。
M细胞靶向性实验结果如图7所示，其中A1、B1为Transwell小室底部滤膜上细胞单分子层中Caco-2细胞和M细胞的细胞核(图中亮点)；A2、B2为细胞单分子层中的M细胞(由M细胞特异性抗体标记观察得到，图中亮点)；A3、B3为荧光标记的该实施例中获得的未接枝靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束和接枝有靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束(图中亮点)；A4、B4分别为各自前3个图的叠加图。从A4可以看出，未接枝靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束与M细胞的荧光位置并未重合(图中不同箭头的位置)，分散开来，因此未接枝靶向肽CKS9的淀粉基自组装载体材料不具有M细胞靶向性。而从B4可以得出，接枝有靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束与Transwell小室底部滤膜上细胞单分子层中M细胞的荧光位置发生部分重合(图中箭头1指向M细胞，箭头2指向荧光标记的淀粉基自组装胶束，M细胞与淀粉基自组装胶束重合部分用圆圈标出)，说明该实施例中获得的接枝有靶向肽CKS9的淀粉基两亲性载体材料呈现较好的M靶向靶向性。
M细胞靶向转运实验结果如图8所示，该实施例中接枝靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束被M细胞转运的数量为2.12×105个，相比于未接枝靶向肽CKS9的淀粉基自组装胶束有很大的提高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种淀粉基两亲性自组装载体材料，其特征在于分子结构式如下所示：
Figure FDA0002112084040000011
R：H或R1或R2或R3 R1：-CH2COOH
Figure FDA0002112084040000012
Figure FDA0002112084040000013
所述的淀粉基两亲性自组装载体材料的分子量在1.25×106～1.01×108g/mol之间，羧甲基基团取代度为0.20～0.27，脂肪酸取代度为0.007～0.21，M细胞靶向肽CKSTHPLSC的含量以N元素含量计算为0.04～11.97％；
所述的R为H或R1或R2或R3代表M细胞靶向和pH响应性的淀粉基载体材料的分子结构中多个R一部分为H、一部分为R1、一部分为R2、一部分为R3。
2.根据权利要求1所述的淀粉基两亲性自组装载体材料，其特征在于：
所述的淀粉基两亲性自组装载体材料中，M细胞靶向肽CKSTHPLSC的含量以N元素含量计算为0.61～11.97％。
3.一种根据权利要求1或2所述的淀粉基两亲性自组装载体材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)利用一氯乙酸通过醚化反应将羧甲基基团引入淀粉分子链，得到羧甲基淀粉；
(2)通过酯化反应将脂肪酸接枝到羧甲基淀粉分子链上，透析除去未反应的催化剂和脂肪酸，冻干得到两亲性淀粉；
(3)通过酰化反应将M细胞靶向肽CKSTHPLSC接枝到上述两亲性淀粉分子链上，经透析除去未反应的催化剂和M细胞靶向肽CKSTHPLSC，透析液冻干后得到具有M细胞靶向功能的淀粉基两亲性载体材料。
4.根据权利要求3所述的淀粉基两亲性自组装载体材料的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的淀粉的分子量为1.0×106～1×108g/mol；步骤(1)中所述的淀粉和一氯乙酸的摩尔比为1：0.3～0.4；步骤(1)中所述的醚化反应是指在45℃反应4h。
5.根据权利要求3所述的淀粉基两亲性自组装载体材料的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的酯化反应是指在30℃反应24h；酯化反应中所用的催化剂为N,N’-二异丙基碳二亚胺；
步骤(2)中所述的脂肪酸为含有12～18个碳原子的脂肪酸；
步骤(2)中所述的羧甲基淀粉分子和脂肪酸的摩尔比为1:0.01～0.5；所用的催化剂的量满足催化剂与脂肪酸的摩尔比为1:1。
6.根据权利要求3所述的淀粉基两亲性自组装载体材料的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的酰化反应是在溶剂二甲基亚砜中进行的；酰化反应的催化剂为N,N’-羰基二咪唑，催化剂在催化酰化反应之前先加入到两亲性淀粉的二甲基亚砜溶液中在15～35℃活化1～4h后再加入M细胞靶向肽CKSTHPLSC进行酰化反应；所述的酰化反应是指在15～35℃反应4～48h。
7.根据权利要求6所述的淀粉基两亲性自组装载体材料的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的两亲性淀粉、催化剂和M细胞靶向肽CKSTHPLSC的摩尔比为10:1:1～2:1:1；两亲性淀粉在酰化反应体系中的浓度满足每100mL的反应体系中两亲性淀粉的质量为2～6g。
8.根据权利要求1或2所述的淀粉基两亲性自组装载体材料在制备口服制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的淀粉基两亲性自组装载体材料在制备口服制剂中的应用，其特征在于所述的口服制剂中的活性物质为疏水性营养功能因子。
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