CN103087311B

CN103087311B - 两亲性三嵌段聚合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103087311B
Application number: CN201210572348.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡林涛; 易虎强; 刘朋; 李萍; 王亚楠; 刘斌
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2012-12-25
Filing date: 2012-12-25
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2032-12-25
Also published as: CN103087311A

Abstract

本发明涉及一种两亲性三嵌段聚合物，该两亲性三嵌段聚合物为由亲水链段、中间链段及疏水链段形成的线性化合物；其中，亲水链段为聚乙二醇衍生物，中间链段是由赖氨酸、亮氨酸与谷氨酸形成的多肽聚合物，疏水链段为聚苯丙氨酸；聚乙二醇衍生物通过酰胺键与中间链段的一端连接，聚苯丙氨酸通过肽键与中间链段的另一端连接。上述两亲性三嵌段聚合物在水溶液中能够自组装形成具有三层结构的聚合物纳米胶束，聚合物纳米胶束作为载体具有稳定性好、生物相容性好等特性；在体内循环过程中不易被免疫系统清除，能同时高效负载疏水性小分子药物、基因物质以及蛋白质分子，具有广泛的应用前景。此外，本发明还提供一种两亲性三嵌段聚合物的制备方法。

Description

两亲性三嵌段聚合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米医学领域，特别是涉及一种两亲性三嵌段聚合物及其制备方法和应用。

背景技术

纳米药物载体作为负载药物的纳米传送系统，主要用于药物的控释、靶向输送以及增加疏水性药物的溶解性和降低药物毒副作用等，其将药物包封于纳米粒中，可以调节释放药物的速率，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布、提高生物利用度等。

随着技术的发展，特别是基因治疗技术的发展，纳米药物载体不但需要负载传统意义上的药物还需要负载基因和蛋白质等新兴意义上的药物。

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，达到治疗疾病的目的。实际应用时，裸体基因进入体内后非常容易降解或失活或立即被体内的蛋白所清除难以到达靶细胞内部，因此，基因治疗的关键问题之一是如何通过合适的载体将基因有效导入体内并使其表达。

而对于蛋白质的传输问题，纳米蛋白质载体主要用于大分子蛋白质药物的传递或用于负载抗体作为疫苗佐剂。一般来讲纳米蛋白质载体需要带有比较强的正电荷，从而可以吸附带负电荷的蛋白质。常见的纳米蛋白质载体有阳离子脂质体、纳米凝胶等。

两亲性嵌段聚合物在水环境下可自组装形成聚合物纳米胶束，聚合物纳米胶束具有疏水性的内核和亲水性的外壳，和小分子胶束相比，聚合物纳米胶束具有较低的临界胶束浓度（CMC），因此，它能高效稳定的负载疏水性小分子药物。同时，聚合物纳米胶束容易进行适当的靶向修饰和性能改进，是一类优良的载体。但传统的两亲性嵌段聚合物通常情况下只能负载疏水性小分子药物，功能单一，限制了其进一步的应用。

发明内容

基于此，有必要提供一种能同时有效负载疏水性药物、基因以及蛋白质的两亲性三嵌段聚合物。

一种两亲性三嵌段聚合物，所述两亲性三嵌段聚合物为由亲水链段、中间链段及疏水链段形成的线性化合物；其中，所述亲水链段为聚乙二醇衍生物，所述中间链段是由赖氨酸、亮氨酸与谷氨酸形成的多肽聚合物，所述疏水链段为聚苯丙氨酸；所述聚乙二醇衍生物通过酰胺键与所述中间链段的一端连接，所述聚苯丙氨酸通过肽键与所述中间链段的另一端连接。

在其中一个实施例中，所述亲水链段的分子量为500~10000，所述中间链段的聚合度为10~100，所述疏水链段的聚合度为10~100。

在其中一个实施例中，所述聚乙二醇衍生物为单甲醚氨基聚乙二醇或氨基聚乙二醇羧酸。

一种两亲性三嵌段聚合物的制备方法，包括如下步骤：

在保护气体氛围下，将氨基酸单体和聚乙二醇衍生物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，得到混合液，然后于30~50℃下恒温反应，其中，所述氨基酸单体是由亮氨酸的N-羧基-环内酸酐、含侧链保护基的赖氨酸的N-羧基-环内酸酐与含侧链保护基的谷氨酸的N-羧基-环内酸酐形成的混合物，混合物各单体的摩尔数与所述聚乙二醇衍生物的摩尔数之比为10:1~200:1，所述混合液中的聚乙二醇衍生物的浓度为1~100mg/mL；

向所述反应后的混合液中加入苯丙氨酸的环内酸酐，并于30~50℃下恒温反应，得到含侧链保护基的两亲性三嵌段聚合物的中间产物，其中，聚苯丙氨酸的N-羧基-环内酸酐与聚乙二醇衍生物的摩尔比为10:1~200:1；

将所述中间产物溶于0℃的三氟乙酸中，并加入过量的含33wt%氢溴酸的氢溴酸冰醋酸混合液，其中，氢溴酸与所述中间聚乙二醇衍生物产物的摩尔比为2:1~10:1，反应除去中间产物的侧链保护基，分离纯化后得到所述两亲性三嵌段聚合物。

在其中一个实施例中，所述分离纯化的步骤为：

向反应体系中加入乙醚进行沉淀，然后离心，将得到的固体粗产物溶解于非质子有机溶剂中，将得到的溶液置于透析袋中进行透析处理，将经透析处理后的产品冻干，得到提纯后的两亲性三嵌段聚合物。

一种载药聚合物纳米胶束，包括由上述两亲性三嵌段聚合物形成的具有三层结构的聚合物纳米胶束以及包覆在所述聚合物纳米胶束中的疏水性药物、基因物质和蛋白质分子中的至少一种；

所述疏水链段构成所述聚合物纳米胶束的内核，用于负载所述疏水性药物，所述中间链段构成所述聚合物纳米胶束的中间电荷层，用于负载所述基因物质和蛋白质分子中的至少一种；所述亲水链段构成所述聚合物纳米胶束的外部保护层。

在其中一个实施例中，所述疏水性药物为紫杉醇、阿霉素、顺铂、氟尿嘧啶、甲氨喋呤和喜树碱中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述基因物质为抑癌基因、自杀基因、siRNA、mRNA和反义核酸中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述蛋白质分子为血清蛋白、药物蛋白、抗原、治疗肽、生长因子和单克隆抗体中的至少一种。

一种载药聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

按照上述方法制备两亲性三嵌段聚合物；

将疏水性药物和所述两亲性三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，混合均匀，再向所述有机溶剂中加入水，混匀后置于透析袋中进行透析处理，即得到负载有疏水性药物的载药聚合物纳米胶束；

或

将所述两亲性三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，混合均匀，再向所述有机溶剂中加入水，混匀后置于透析袋中，进行水透析处理，得到聚合物纳米胶束水溶液，将基因物质与蛋白质分子中的至少一种加入到所述聚合物纳米胶束水溶液中振荡均匀，于37℃孵化，即得到负载有基因物质与蛋白质分子中至少一种的载药聚合物纳米胶束；

或

将疏水性药物和所述两亲性三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，混合均匀，再向所述有机溶剂中加入水，混匀后置于透析袋中进行透析处理，即得到负载有疏水性药物的聚合物纳米胶束，再将基因物质与蛋白质分子中的至少一种加入到载有疏水性药物的聚合物纳米胶束中，振荡均匀，于37℃孵化，即得到负载有基因物质与蛋白质分子中至少一种并负载有疏水性药物的载药聚合物纳米胶束。

在其中一个实施例中，所述有机溶剂为四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺与二甲基亚砜中的至少一种。

上述两亲性三嵌段聚合物在水溶液中能够自组装形成具有三层结构的聚合物纳米胶束；疏水链段为聚苯丙氨酸，构成聚合物纳米胶束的内核，可以用于负载疏水性药物；而且聚苯丙氨酸具有α-螺旋的二级结构，从而使得聚合物纳米胶束更加稳定。中间链段构成聚合物纳米胶束的中间电荷层，可以用于负载基因物质和带电荷蛋白质分子中的至少一种。亲水链段为聚乙二醇衍生物，构成聚合物纳米胶束的外部保护层，用于保护聚合物纳米胶束，以增加其在生物体内的循环时间和减少非特异性吸附。由于聚乙二醇衍生物无毒无免疫原性，能全部通过肝肾排出体内；而中间链段和疏水链段中的物质的基本单元都是氨基酸，其降解产物属于人体内源性物质，能够避免许多不良效应。因此，上述两亲性三嵌段聚合物作为载体具有稳定性好、生物相容性好等特性；在体内循环过程中不易被免疫系统清除，能同时高效负载疏水性小分子药物、基因物质与蛋白质分子，具有广泛的应用前景。

且上述两亲性三嵌段聚合物的制备方法，以聚乙二醇衍生物作为引发剂，通过NCA开环聚合的方法合成具有亲水链段-中间链段-疏水链段结构、且含有带侧链保护基的氨基酸的两亲性三嵌段聚合物，然后脱去侧链保护基，即得到两亲性三嵌段聚合物。上述制备方法工艺步骤简单、反应易于控制、稳定性良好、便于操作推广、适合大规模工业化生产。

一种含上述载药聚合物纳米胶束的制剂。

在其中一个实施例中，所述制剂的剂型为冻干粉针剂或水溶液针剂。

在其中一个实施例中，所述制剂的剂型为水溶液针剂，所述制剂的纳米粒径范围是10~200nm；所述制剂的Zeta电位大小为-50mv～+50mv。

上述制剂无毒无免疫原性，既可以用于药物治疗，又可以用于基因治疗，应用范围广；而且上述制剂的粒径可以通过调节两亲性三嵌段聚合物的结构和聚合物纳米胶束电荷层的电荷强度简易的控制。

附图说明

图1为一实施方式的两亲性三嵌段聚合物的示意图；

图2为图1中两亲性三嵌段聚合物形成的具有三层结构的聚合物纳米胶束的示意图。

图3为一实施方式的载药聚合物纳米胶束的示意图；

图4为实施例1制备的两亲性三嵌段聚合物的¹H NMR谱图（溶剂：CF₃COOD）；

图5为实施例4制备的两亲性三嵌段聚合物形成的聚合物纳米胶束负载阿霉素后的粒径及分布图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对两亲性三嵌段聚合物及其制备方法和应用进行进一步的说明。

如图1所示，一实施方式的两亲性三嵌段聚合物为由亲水链段、中间链段及疏水链段形成的线性化合物。

其中，亲水链段为聚乙二醇衍生物，中间链段是由赖氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）与谷氨酸（Glu）形成的多肽聚合物，疏水链段为聚苯丙氨酸；聚乙二醇衍生物通过酰胺键与中间链段的一端连接，聚苯丙氨酸通过肽键与中间链段的另一端连接。

在本实施方式中，两亲性三嵌段聚合物的分子量为1000~60000。其中，亲水链段聚乙二醇衍生物的分子量为500~10000，聚乙二醇衍生物为单甲醚氨基聚乙二醇（MPEG）或氨基聚乙二醇羧酸（NH₂-PEG-COOH）；中间链段的聚合度为10~100；疏水链段聚苯丙氨酸的聚合度为10~100。

聚乙二醇（PEG）无毒无免疫原性，其降解产物能全部通过肝肾排出体内，是FDA批准的能用于静脉、口腔和皮下的聚合物之一，纳米材料经聚乙二醇表面修饰以后，能够最大程度的逃避人体内蛋白的吞噬和细胞的吸收，作为亲水部分修饰在其它聚合物表面，帮助其逃避体内各种蛋白或者细胞的识别，显著增加纳米材料在体内循环的时间，广泛应用于生物材料和纳米医学领域。

氨基酸类聚合物是一类由一种或者多种氨基酸形成的多肽聚合物，其降解产物氨基酸属于人体内源性物质，能够避免许多不良效应。由于氨基酸的种类很多，可以通过选择不同的氨基酸聚合得到各种性质不同的聚氨基酸材料（亲水、疏水、电正性、电负性等），所以氨基酸类聚合物是一种非常有潜力的生物材料。

上述两亲性三嵌段聚合物结合了聚乙二醇和氨基酸类聚合物的优势，具有生物相容性好、毒性低、在生物体内可降解、降解产物无毒无害可吸收或代谢等特性。而且上述两亲性三嵌段聚合物在水溶液中能够自组装形成具有三层结构的聚合物纳米胶束，如图2所示。聚合物纳米胶束能作为各种疏水性药物、基因物质、蛋白质分子、多肽等物质的载体。

图3所示的为本实施方式的载药聚合物纳米胶束。其中，疏水链段为聚苯丙氨酸，构成聚合物纳米胶束的内核，可以用于负载疏水性药物；而且聚苯丙氨酸具有α-螺旋的二级结构，从而使得聚合物纳米胶束更加稳定。

中间链段是由赖氨酸、亮氨酸与谷氨酸形成的多肽聚合物，构成聚合物纳米胶束的中间电荷层，中间电荷层带正电或者负电，可以用于负载基因物质（DNA和RNA）、带相反电荷的蛋白质分子、带相反电荷的多肽等；而且这种中间电荷层结构能够使赖氨酸和谷氨酸的电荷得到很好的聚集，从而形成一个较大的电荷层，增强其负载基因物质、蛋白质分子和多肽的能力，具有较高的负载效率。此外，中间链段是由赖氨酸、亮氨酸与谷氨酸形成的多肽聚合物，三种氨基酸的比例可调，从而可以实现对聚合物纳米胶束的粒径和电位大小的控制。

亲水链段为聚乙二醇衍生物，构成聚合物纳米胶束的外部保护层，用于保护聚合物纳米胶束，以增加其在生物体内的循环时间和减少非特异性吸附。

因此，上述载药聚合物纳米胶束可以同时有效的负载疏水性药物、基因物质、蛋白质分子以及多肽，是一种多功能的纳米载体。

在本实施方式中，疏水性药物为紫杉醇、阿霉素、顺铂、氟尿嘧啶、甲氨喋呤和喜树碱中的至少一种。

基因物质为抑癌基因、自杀基因、siRNA、mRNA和反义核酸中的至少一种

蛋白质分子为血清蛋白、药物蛋白、抗原、治疗肽、生长因子和单克隆抗体中的至少一种。

此外，在本实施方式中还提供一种两亲性三嵌段聚合物的制备方法，包括如下步骤：

步骤110，在保护气体氛围下，将氨基酸单体和聚乙二醇衍生物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，得到混合液，然后于30~50℃下恒温反应24~120小时，其中，氨基酸单体是由亮氨酸的环内酸酐（Leu-NCA）、含侧链保护基的赖氨酸的环内酸酐与含侧链保护基的谷氨酸的环内酸酐形成的混合物，混合物的总摩尔数与聚乙二醇衍生物的摩尔数之比为10:1~200:1，混合液中的聚乙二醇衍生物的浓度为1~100mg/mL。

步骤120，向反应后的混合液中加入苯丙氨酸的环内酸酐（Phe-NCA），并于30~50℃下恒温反应24~120小时，得到含侧链保护基的两亲性三嵌段聚合物的中间产物，其中，聚苯丙氨酸的环内酸酐与聚乙二醇衍生物的摩尔比为10:1~200:1。

步骤130，将含侧链保护基的两亲性三嵌段聚合物的中间产物溶于0℃的三氟乙酸中，并加入过量的过量的含33wt%（wt%表示重量百分比）氢溴酸的氢溴酸冰醋酸混合液，反应除去中间产物的侧链保护基，分离纯化后得到两亲性三嵌段聚合物。

在本实施方式中，含侧链保护基的赖氨酸的环内酸酐为苄氧羰基赖氨酸的环内酸酐（Lys(Z)-NCA）；含侧链保护基的赖氨酸的谷氨酸的环内酸酐为苄酯（Glu(OBzl)-NCA）。

上述制备方法的其中一种反应过程如下：

其中，

C₃Cl₆O₃为二(三氯甲基)碳酸酯，DMF为N,N-二甲基甲酰胺，。

在本实施方式中，分离纯化的步骤为：

本实施方式还提供一种载药聚合物纳米胶束的制备方法，具体包括如下步骤：

按照上述制备两亲性三嵌段聚合物的制备方法，制备得到的两亲性三嵌段聚合物。

根据需要可以选择下述方法制备负载有各种不同药物的聚合物纳米胶束：

（1）制备负载有疏水性药物的聚合物纳米胶束

将疏水性药物和两亲性三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，混合均匀，再向有机溶剂中加入水，混匀后置于透析袋中进行透析处理，即得到负载有疏水性药物的聚合物纳米胶束。

（2）制备负载有基因物质与蛋白质分子中至少一种的聚合物纳米胶束

将两亲性三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，混合均匀，再向有机溶剂中加入水，混匀后置于透析袋中，进行水透析处理，得到聚合物纳米胶束水溶液，将基因物质与蛋白质分子中的至少一种加入到聚合物纳米胶束水溶液中振荡均匀，于37℃孵化，即得到负载有基因物质与蛋白质分子中至少一种的聚合物纳米胶束。

（3）制备负载有基因物质与蛋白质分子中至少一种并负载有疏水性药物的聚合物纳米胶束

将疏水性药物和两亲性三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，混合均匀，再向有机溶剂中加入水，混匀后置于透析袋中进行透析处理，即得到负载有疏水性药物的聚合物纳米胶束，再将基因物质与蛋白质分子中的至少一种加入到载有疏水性药物的聚合物纳米胶束中，振荡均匀，于37℃孵化，即得到负载有基因物质与蛋白质分子中至少一种并负载有疏水性药物的聚合物纳米胶束。

在本实施方式中，有机溶剂为四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺与二甲基亚砜中的至少一种。

此外，本实施方式还提供一种含有上述载药聚合物纳米胶束的制剂。

制剂可以为冻干粉针剂或水溶液针剂。

在本实施方式中，水溶液针剂型制剂的纳米粒径范围是10~200nm，Zeta电位大小为-50mv~+50mv。

以下为具体实施例部分：

说明：实施例中的b表示分段，P表示聚合，Lys表示赖氨酸，Glu表示谷氨酸，Leu表示亮氨酸，Lys-NCA表示赖氨酸的N-羧基-环内酸酐，Glu-NCA表示谷氨酸的N-羧基-环内酸酐，Leu-NCA表示亮氨酸的N-羧基-环内酸酐，Lys(Z)-NCA为苄氧羰基赖氨酸的N-羧基-环内酸酐，Glu(OBzl)-NCA为谷氨酸苄酯的N-羧基-环内酸酐，MPEG表示单甲醚氨基聚乙二醇。

实施例1

P1两亲性三嵌段聚合物的制备

将封闭的圆底烧瓶抽真空后充入氮气；然后将1g分子量为2000的单甲醚氨基聚乙二醇（MPEG）溶解于20mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，并加入到上述圆底烧瓶内；接着向上述圆底烧瓶中加入Lys(Z)-NCA、Glu(OBzl)-NCA及Leu-NCA三种单体，于氮气保护下，40℃恒温反应72小时；反应结束后，接着向上述圆底烧瓶中加入Phe-NCA单体，于氮气保护下，40℃恒温反应48小时；反应结束后，加入10倍于反应液体积的乙醚进行沉淀、离心、干燥得到含侧链保护基的两亲性三嵌段聚合物，MPEG-b-P[Lys(Z)-co-Leu-co-Glu(OBzl)]-b-PPhe；其中，三种单体的总摩尔数与单甲醚氨基聚乙二醇的摩尔数之比为30:1，Phe-NCA单体与单甲醚氨基聚乙二醇的摩尔比为15:1。

将上述得到的MPEG-b-P[Lys(Z)-co-Leu-co-Glu(OBzl)]-b-PPhe聚合物溶解于20mL 0℃的三氟乙酸中，然后加入氢溴酸重量百分比为33%的氢溴酸冰醋酸混合液，其中，MPEG-b-P[Lys(Z)-co-Leu-co-Glu(OBzl)]-b-PPhe聚合物与氢溴酸的摩尔比为1:5，反应2小时后除去侧链保护基；然后，加入20倍于反应液体积的乙醚进行沉淀、离心，得到粗产物；将得到的粗产物溶解于DMF中，将得到的溶液置于截留分子量为3500的透析袋中进行透析处理48小时，每2小时换透析水一次；将透析袋中的产物冻干，即到得到P1两亲性三嵌段聚合物。测试P1两亲性三嵌段聚合物的分子量，其数均分子量为10000。

图4为实施例1制备的P1两亲性三嵌段聚合物的¹H NMR谱图（溶剂：CF₃COOD）。

实施例2

P2两亲性三嵌段聚合物的制备

将封闭的圆底烧瓶抽真空后充入氮气；然后将0.5g分子量为1000的氨基聚乙二醇羧酸（NH₂-PEG-COOH）溶解于15mL DMF中，并加入到上述圆底烧瓶内；接着向上述圆底烧瓶中加入Lys(Z)-NCA、Glu(OBzl)-NCA及Leu-NCA三种单体，于氮气保护下，30℃恒温反应72小时；反应结束后，接着向上述圆底烧瓶中加入Phe-NCA单体，于氮气保护下，30℃恒温反应72小时；反应结束后，加入15倍于反应液体积的乙醚进行沉淀、离心、干燥得到含侧链保护基的两亲性三嵌段聚合物，HOOC-PEG-b-P[Lys(Z)-co-Leu-co-Glu(OBzl)]-b-PPhe；其中，三种单体的总摩尔数与氨基聚乙二醇羧酸的摩尔数之比为50:1，Phe-NCA单体与氨基聚乙二醇羧酸的摩尔比为30:1。

将上述得到的HOOC-PEG-b-P[Lys(Z)-co-Leu-co-Glu(OBzl)]-b-PPhe聚合物溶解于10mL 0℃的三氟乙酸中；然后加入氢溴酸重量百分比为33%的氢溴酸冰醋酸混合液，其中，HOOC-PEG-b-P[Lys(Z)-co-Leu-co-Glu(OBzl)]-b-PPhe聚合物与氢溴酸的摩尔比为1:7，反应2小时后除去侧链保护基；然后，加入15倍于反应液体积的乙醚进行沉淀、离心，得到粗产物；将得到的粗产物溶解于DMF中，将得到的溶液置于截留分子量为3500的透析袋中进行透析处理12小时，每2小时换透析水一次；将透析袋中的产物冻干，即到得到P2两亲性三嵌段聚合物。测试P2两亲性三嵌段聚合物的分子量，其数均分子量为10800。

实施例3

P3两亲性三嵌段聚合物的制备

将封闭的圆底烧瓶抽真空后充入氮气；然后将0.2g分子量为5000的氨基聚乙二醇羧酸（NH₂-PEG-COOH）溶解于20mL DMF中，并加入到上述圆底烧瓶内；接着向上述圆底烧瓶中加入Lys(Z)-NCA、Glu(OBzl)-NCA及Leu-NCA三种单体，于氮气保护下，35℃恒温反应72小时；反应结束后，接着向上述圆底烧瓶中加入Phe-NCA单体，于氮气保护下，35℃恒温反应48小时；反应结束后，加入20倍于反应液体积的乙醚进行沉淀、离心、干燥得到含侧链保护基的两亲性三嵌段聚合物，HOOC-PEG-b-P[Lys(Z)-co-Leu-co-Glu(OBzl)]-b-PPhe；其中，三种单体的总摩尔数与氨基聚乙二醇羧酸的摩尔数之比为200:1，Phe-NCA单体与氨基聚乙二醇羧酸的摩尔比为100:1。

将上述得到的HOOC-PEG-b-P[Lys(Z)-co-Leu-co-Glu(OBzl)]-b-PPhe聚合物溶解于8mL 0℃的三氟乙酸中；然后加入氢溴酸重量百分比为33%的氢溴酸冰醋酸混合液，其中，HOOC-PEG-b-P[Lys(Z)-co-Leu-co-Glu(OBzl)]-b-PPhe聚合物与氢溴酸的摩尔比为1:5，反应2小时后除去侧链保护基；然后，加入20倍于反应液体积的乙醚进行沉淀、离心，得到粗产物；将得到的粗产物溶解于DMF中，将得到的溶液置于截留分子量为5000的透析袋中进行透析处理48小时，每4小时换透析水一次；将透析袋中的产物冻干，即到得到P3两亲性三嵌段聚合物。测试P3两亲性三嵌段聚合物的分子量，其数均分子量为23200。

实施例4

P4两亲性三嵌段聚合物的制备

将封闭的圆底烧瓶抽真空后充入氮气；然后将0.1g分子量为10000的单甲醚氨基聚乙二醇（MPEG）溶解于20mL DMF中，并加入到上述圆底烧瓶内；接着向上述圆底烧瓶中加入Lys(Z)-NCA、Glu(OBzl)-NCA及Leu-NCA三种单体，于氮气保护下，50℃恒温反应48小时；反应结束后，接着向上述圆底烧瓶中加入Phe-NCA单体，于氮气保护下，50℃恒温反应120小时；反应结束后，加入20倍于反应液体积的乙醚进行沉淀、离心、干燥得到含侧链保护基的两亲性三嵌段聚合物，MPEG-b-P[Lys(Z)-co-Leu-co-Glu(OBzl)]-b-PPhe；其中，三种单体的总摩尔数与单甲醚氨基聚乙二醇的摩尔数之比为100:1，Phe-NCA单体与单甲醚氨基聚乙二醇的摩尔比为100:1。

将上述得到的MPEG-b-P[Lys(Z)-co-Leu-co-Glu(OBzl)]-b-PPhe聚合物溶解于5mL 0℃的三氟乙酸中；然后加入氢溴酸重量百分比为33%的氢溴酸冰醋酸混合液，其中，MPEG-b-P[Lys(Z)-co-Leu-co-Glu(OBzl)]-b-PPhe聚合物与氢溴酸的摩尔比为1:3，反应4小时后除去侧链保护基；然后，加入50倍于反应液体积的乙醚进行沉淀、离心，得到粗产物；将得到的粗产物溶解于DMF中，将得到的溶液置于截留分子量为8000的透析袋中进行透析处理96小时，每6小时换透析水一次；将透析袋中的产物冻干，即到得到P4两亲性三嵌段聚合物。测试P4两亲性三嵌段聚合物的分子量，其数均分子量为28200。

实施例5

负载有紫杉醇的聚合物纳米胶束的制备

将3mg紫杉醇与10mg实施例1制备得到的P1两亲性三嵌段聚合物溶解于10mL二甲基亚砜中，并于室温下超声20分钟，使药物和聚合物充分溶解，形成均一、透明的有机相溶液；将制得的二甲基亚砜溶液置于截留分子量为3500透析袋中，然后在1L水中透析24小时，每2小时换水一次；透析结束后，收集透析袋中形成的载药胶束水溶液，即得到的负载有紫杉醇的聚合物纳米胶束。DLS测得其粒径大小为121.5nm，分布系数（PDI）为0.180。

实施例6

负载有阿霉素的聚合物纳米胶束的制备

将5mg阿霉素与80mg实施例4制备得到的P4两亲性三嵌段聚合物溶解于100mL DMF中，并于室温下超声20分钟，使药物和聚合物充分溶解，形成均一、透明的有机相溶液；将制得的DMF溶液置于截留分子量为3500透析袋中，然后在2L水中透析12小时，每4小时换水一次；透析结束后，收集透析袋中形成的载药胶束水溶液，即得到的负载有紫杉醇的聚合物纳米胶束。DLS测得其粒径大小为119nm，PDI为0.178。

图5为实施例4制备的P4两亲性三嵌段聚合物形成的聚合物纳米胶束负载阿霉素后的粒径及分布图。

实施例7

负载有P53基因的聚合物纳米胶束的制备

将1mg实施例1制备得到的P1两亲性三嵌段聚合物溶解于4mL DMF中，并于室温下超声10分钟，使聚合物充分溶解，形成均一、透明的有机相溶液；将制得的DMF溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在1.5L水中透析60小时，每6小时换水一次；透析结束后，收集透析袋中形成的聚合物纳米胶束水溶液；吸取含0.05mg P53基因的水溶液加入至制得的聚合物纳米胶束水溶液中涡旋振荡2小时，然后于37℃条件下放置1小时，即得到的负载有P53基因的聚合物纳米胶束。DLS测得其粒径大小为155.3nm，PDI为0.256，分散比较均匀。

实施例8

负载有siRNA基因的聚合物纳米胶束的制备

将10mg实施例4制备得到的P4两亲性三嵌段聚合物溶解于15mL二甲基亚砜中，并于室温下超声10分钟，使聚合物充分溶解，形成均一、透明的有机相溶液；将制得的二甲基亚砜溶液置于截留分子量为3500透析袋中，然后在1.5L水中透析60小时，每6小时换水一次；透析结束后，收集透析袋中形成的聚合物纳米胶束水溶液，将其稀释到1mg/mL；吸取含5μg siRNA基因的水溶液置于离心管中，然后向离心管中加入100μL上述制得的聚合物纳米胶束水溶液，并涡旋振荡2小时，然后于37℃条件下放置0.5小时，即得到的负载有siRNA基因的聚合物纳米胶束。DLS测得其粒径大小为91.75nm，PDI为0.197，分散比较均匀。

实施例9

负载有BSA蛋白的聚合物纳米胶束的制备

将1mg实施例4制备得到的P4两亲性三嵌段聚合物溶解于4mL DMF中，并于室温下超声10分钟，使聚合物充分溶解，形成均一、透明的有机相溶液；将制得的DMF溶液置于截留分子量为3500透析袋中，然后在1.5L水中透析60小时，每6小时换水一次；透析结束后，收集透析袋中形成的聚合物纳米胶束水溶液；量取0.05mg牛血清蛋白（BSA）水溶液加入至上述制得的聚合物纳米胶束水溶液，并涡旋振荡2小时，然后于37℃条件下放置1小时，即得到的负载有BSA蛋白的聚合物纳米胶束。DLS测得其粒径大小为136.5nm，PDI为0.175，分散比较均匀。

实施例10

负载有BSA蛋白，siRNA以及阿霉素的聚合物纳米胶束的制备

将2mg阿霉素与80mg实施例4制备得到的P4两亲性三嵌段聚合物溶解于10mL DMF中，并于室温下超声20分钟，使药物和聚合物充分溶解，形成均一、透明的有机相溶液；将制得的DMF溶液置于截留分子量为3500透析袋中，然后在2L水中透析12小时，每4小时换水一次；透析结束后，收集透析袋中形成的载药胶束水溶液，即得到的负载有阿霉素的聚合物纳米胶束，然后将其稀释到1mg/mL；吸取含0.05mg牛血清蛋白（BSA）的水溶液与含5μg siRNA基因的水溶液置于同一离心管中，然后向离心管中加入400μL上述制得的聚合物纳米胶束水溶液，并涡旋振荡1小时，然后于37℃条件下放置0.5小时，即得到负载有阿霉素，牛血清蛋白，siRNA基因的聚合物纳米胶束。DLS测得其粒径大小为155.7nm，PDI为0.278，分散比较均匀。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种载药聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

在保护气体氛围下，将氨基酸单体和聚乙二醇衍生物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，得到混合液，然后于30～50℃下恒温反应，其中，所述氨基酸单体是由亮氨酸的N-羧基-环内酸酐、含侧链保护基的赖氨酸的N-羧基-环内酸酐与含侧链保护基的谷氨酸的N-羧基-环内酸酐形成的混合物，混合物各氨基酸单体的摩尔数与所述聚乙二醇衍生物的摩尔数之比为10:1～200:1，所述混合液中的聚乙二醇衍生物的浓度为1～100mg/mL；

向所述反应后的混合液中加入苯丙氨酸的环内酸酐，并于30～50℃下恒温反应，得到含侧链保护基的两亲性三嵌段聚合物的中间产物，其中，聚苯丙氨酸的N-羧基-环内酸酐与聚乙二醇衍生物的摩尔比为10:1～200:1；

将所述中间产物溶于0℃的三氟乙酸中，并加入过量的含33wt％氢溴酸的氢溴酸冰醋酸混合液，其中，氢溴酸与所述中间聚乙二醇衍生物产物的摩尔比为2:1～10:1，反应除去中间产物的侧链保护基，分离纯化后得到两亲性三嵌段聚合物，其中，所述两亲性三嵌段聚合物为由亲水链段、中间链段及疏水链段依次相连形成的线性化合物，所述亲水链段为聚乙二醇衍生物，所述中间链段是由赖氨酸、亮氨酸与谷氨酸形成的多肽聚合物，所述疏水链段为聚苯丙氨酸，所述聚乙二醇衍生物通过酰胺键与所述中间链段的一端连接，所述聚苯丙氨酸通过肽键与所述中间链段的另一端连接；

将疏水性药物和所述两亲性三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，混合均匀，再向所述有机溶剂中加入水，混匀后置于透析袋中进行透析处理，得到负载有疏水性药物的载药聚合物纳米胶束，其中，所述疏水链段构成载药聚合物纳米胶束的内核，所述中间链段构成载药聚合物纳米胶束的中间电荷层，所述亲水链段构成载药聚合物纳米胶束的外部保护层，所述疏水性药物负载于所述内核上；

或

将所述两亲性三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，混合均匀，再向所述有机溶剂中加入水，混匀后置于透析袋中，进行水透析处理，得到聚合物纳米胶束水溶液，将基因物质与蛋白质分子中的至少一种加入到所述聚合物纳米胶束水溶液中振荡均匀，于37℃孵化，即得到负载有基因物质与蛋白质分子中至少一种的载药聚合物纳米胶束，其中，所述疏水链段构成载药聚合物纳米胶束的内核，所述中间链段构成载药聚合物纳米胶束的中间电荷层，所述亲水链段构成载药聚合物纳米胶束的外部保护层，所述基因物质与蛋白质分子中至少一种负载于所述中间电荷层上；

或

将疏水性药物和所述两亲性三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，混合均匀，再向所述有机溶剂中加入水，混匀后置于透析袋中进行透析处理，即得到负载有疏水性药物的聚合物纳米胶束，再将基因物质与蛋白质分子中的至少一种加入到载有疏水性药物的聚合物纳米胶束中，振荡均匀，于37℃孵化，即得到负载有基因物质与蛋白质分子中至少一种并负载有疏水性药物的载药聚合物纳米胶束，其中，所述疏水链段构成载药聚合物纳米胶束的内核，所述中间链段构成载药聚合物纳米胶束的中间电荷层，所述亲水链段构成载药聚合物纳米胶束的外部保护层，所述疏水性药物负载于所述内核上，所述基因物质与蛋白质分子中至少一种负载于所述中间电荷层上。

2.如权利要求1所述的载药聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述分离纯化的步骤为：

3.如权利要求1所述的载药聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺与二甲基亚砜中的至少一种。

4.如权利要求1所述的载药聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述亲水链段的分子量为500～10000，所述中间链段的聚合度为10～100，所述疏水链段的聚合度为10～100。

5.如权利要求1所述的载药聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇衍生物为单甲醚氨基聚乙二醇或氨基聚乙二醇羧酸。

6.如权利要求1所述的载药聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述疏水性药物为紫杉醇、阿霉素、顺铂、氟尿嘧啶、甲氨喋呤和喜树碱中的至少一种。

7.如权利要求1所述的载药聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述基因物质为抑癌基因、自杀基因、siRNA、mRNA和反义核酸中的至少一种。

8.如权利要求1所述的载药聚合物纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述蛋白质分子为血清蛋白、药物蛋白、抗原、治疗肽、生长因子和单克隆抗体中的至少一种。