CN104707149B - 一种自杀基因纳米胶束及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种自杀基因纳米胶束，包括两亲性三嵌段聚合物和自杀基因，所述自杀基因纳米胶束为具有三层结构的复合体，所述聚亮氨酸构成所述复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述氨基聚乙二醇羧酸构成所述复合体的外层；其中，所述复合体的中间层还包括自杀基因质粒，所述自杀基因质粒分散在中间层的所述聚赖氨酸中。该自杀基因纳米胶束采用生物相容性和稳定性较好的三嵌段聚合物为载体材料制备自杀基因载体，该载体能很好的负载自杀基因质粒，转染效率较高，能提高自杀基因质粒在体内的稳定性，延长自杀基因质粒在体内的半衰期；本发明还提供了一种自杀基因纳米胶束的制备方法和应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种自杀基因纳米胶束及其制备方法和应用。
背景技术
自杀基因(suicide gene)治疗，是指将某些病毒或细菌的基因导入靶细胞中，其表达的酶可催化无毒的药物前体转变为细胞毒物质，从而导致携带该基因的受体细胞被杀死。这类基因称为自杀基因，又称药物敏感性基因。目前，具有较好临床应用前景的自杀基因主要有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-tk)，胞嘧啶脱氨酶基因(E,colicytocine deaminase,CD)。但是由于自杀基因本身穿透细胞膜的能力极差，且易被血清中的酶迅速降解而难以表达。
因此，有必要提供一种携带自杀基因进入细胞，并提高其在体内的稳定性，从而提高基因表达效率的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种自杀基因纳米胶束，包括两亲性三嵌段聚合物和自杀基因，该自杀基因纳米胶束采用生物相容性和稳定性较好的三嵌段聚合物为载体材料制备自杀基因载体，该载体能很好的负载自杀基因质粒，转染效率较高，能提高自杀基因质粒在体内的稳定性，延长自杀基因质粒在体内的半衰期；本发明还提供了一种自杀基因纳米胶束的制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种自杀基因纳米胶束，包括两亲性三嵌段聚合物，所述两亲性三嵌段聚合物为线性高分子化合物，包括为氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述氨基聚乙二醇羧酸相连，另一端通过肽键与所述聚异亮氨酸相连，
所述自杀基因纳米胶束为具有三层结构的复合体，所述聚异亮氨酸构成所述复合体的内层，所述氨基聚乙二醇羧酸构成所述复合体的外层；
所述复合体的中间层包括所述聚赖氨酸，还包括自杀基因质粒，所述自杀基因质粒分散在中间层的所述聚赖氨酸中；
所述两亲性三嵌段聚合物和自杀基因质粒的质量比为1～20:1。
优选地，所述自杀基因纳米胶束中，所述氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸的摩尔比为1:10～40:30～50。
优选地，所述两亲性三嵌段聚合物中，所述氨基聚乙二醇羧酸的数均分子量为2000Da。
优选地，所述两亲性三嵌段聚合物中，所述聚赖氨酸的聚合度为10～100。
优选地，所述两亲性三嵌段聚合物中，所述聚异亮氨酸的聚合度为10～200。
优选地，所述自杀基因质粒为含有胞嘧啶脱氨酶CD基因或单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-TK基因的真核重组质粒载体。
进一步优选地，所述真核重组质粒载体为pIRES2-EGFP或pcDNA3.1。
进一步优选地，所述CD基因插入pIRES2-EGFP质粒的XhoI和BamHI位点。
进一步优选地，所述胞嘧啶脱氨酶CD基因的表达由HE4启动子控制。
本发明优选以HE4为启动子构建对卵巢癌具有特异识别功能的CD自杀基因质粒。
优选地，所述HE4启动子的GeneBank序列号为10406。
优选地，PCR引物扩增所述HE4启动子的上游引物和下游引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的DNA。其中，
SEQ ID NO:1：5-GCATTAATTTAATAATAAGTGCTATTTCTGTAGC-3，
SEQ ID NO:2：5-TAGCGGGCCTAGGCGACAAGCAGG-3。
优选地，所述胞嘧啶脱氨酶CD基因的GeneBank序列号为1249769。
优选地，PCR引物扩增所述CD基因的上游引物和下游引物分别为核苷酸序列如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示的DNA。其中，
SEQ ID NO:3：
5-ATCCTCGAGATGGTGTCGAATAACGCTTTACAAACAATT-3，
SEQ ID NO:4：
5-AGTGGATCCACGTTTGTAATCGATGGCTTCTG-3。
本发明提供的自杀基因纳米胶束以两亲性三嵌段聚合物(PEG-PLL-PLLeu)为载体，自杀基因质粒分散在所述两亲性三嵌段聚合物中间层，构成三层结构的纳米复合物。
所述两亲性三嵌段聚合物中间层的聚赖氨酸(PLL)带正电荷，可以通过静电作用与带负电的自杀基因质粒的结合，共同构成纳米胶束的中间层；聚异亮氨酸(PLLeu)的疏水作用使其在水中形成纳米胶束的内核，有助于加快纳米胶束的自组装作用；氨基聚乙二醇羧酸(HOOC-PEG-NH2)构成所述纳米胶束的外层，聚乙二醇为亲水性材料，能使纳米胶束表面形成水化层，能够有效保护纳米胶束躲避免疫系统的清除作用，从而增加纳米胶束在生物体内的循环时间；此外，聚乙二醇能增强纳米胶束的膜流动性从而促进纳米胶束的转染效率，进而提高自杀基因质粒在细胞中的表达效率。
本发明提供的自杀基因纳米胶束通过静电吸附或物理吸附的作用吸附自杀基因质粒，包封率较高，形成的纳米粒比较稳定，且具有较高的转染效率。此外，本发明提供的自杀基因纳米胶束具有良好的生物相容性，可生物降解并通过正常的生理途径吸收或排出。
第二方面，本发明提供了一种自杀基因纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供两亲性三嵌段聚合物，所述两亲性三嵌段聚合物为线性高分子化合物，包括氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述氨基聚乙二醇羧酸相连，另一端通过肽键与所述聚异亮氨酸相连；将所述两亲性三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，得到浓度为2～4mg/ml的两亲性三嵌段聚合物溶液；
(2)取步骤(1)制备的两亲性三嵌段聚合物溶液，与水按1:1～5的体积比逐滴加入所述两亲性三嵌段聚合物溶液中，得到两亲性三嵌段聚合物水溶液；
(3)将所得两亲性三嵌段聚合
物混合水溶液用分子截留量为2000～8000Da的透析袋室温透析12～36小时，得到两亲性三嵌段聚合物纳米胶束，所述两亲性三嵌段聚合物纳米胶为具有三层结构的复合体，所述聚异亮氨酸构成所述复合体的内层，所述复合体的中间层包括所述聚赖氨酸，所述氨基聚乙二醇羧酸构成所述复合体的外层；
(4)取自杀基因质粒溶于水中，得到浓度为50～100μg/ml的自杀基因质粒溶液；
(5)取步骤(3)所得两亲性三嵌段聚合物纳米胶束与步骤(4)所得自杀基因质粒溶液混合均匀并静置15～60分钟，得到自杀基因纳米胶束；所述自杀基因纳米胶束为具有三层结构的复合体，所述聚异亮氨酸构成所述复合体的内层，所述氨基聚乙二醇羧酸构成所述复合体的外层；所述复合体的中间层包括所述聚赖氨酸，还包括自杀基因质粒，所述自杀基因质粒分散在中间层的所述聚赖氨酸中；所述两亲性三嵌段聚合物和自杀基因质粒的质量比为1～20:1。
优选地，所述水为超纯水。
优选地，所述步骤(1)中，所述有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
优选地，所述自杀基因纳米胶束中，所述氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸的摩尔比为1:10～40:30～50。
进一步优选地，所述自杀基因纳米胶束中，所述氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸的摩尔比为1:20:40。
优选地，所述两亲性三嵌段聚合物中，所述氨基聚乙二醇羧酸的数均分子量为2000Da。
优选地，所述两亲性三嵌段聚合物中，所述聚赖氨酸的聚合度为10～100。
优选地，所述两亲性三嵌段聚合物中，所述聚异亮氨酸的聚合度为10～200。
优选地，所述步骤(3)中，所述将两亲性三嵌段聚合物进行透析的操作为将混合水溶液转入分子截留量在2000～8000Da的透析袋中，采用混合水溶液体积的1000～2000倍的超纯水室温透析12～36小时。
优选地，所述步骤(3)中，所述将两亲性三嵌段聚合物进行透析的操作为将混合水溶液转入分子截留量在3000Da的透析袋中。
优选地，所述自杀基因质粒为含有胞嘧啶脱氨酶CD基因或单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-TK基因的真核重组质粒载体。
进一步优选地，所述真核重组质粒载体为pIRES2-EGFP或pcDNA3.1。
进一步优选地，所述CD基因插入pIRES2-EGFP质粒的XhoI和BamHI位点。
进一步优选地，所述胞嘧啶脱氨酶CD基因的表达由HE4启动子控制。
本发明优选以HE4为启动子构建对卵巢癌具有特异识别功能的CD自杀基因质粒。
优选地，所述HE4启动子的GeneBank序列号为10406。
优选地，PCR引物扩增所述HE4启动子的上游引物和下游引物分别为核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的DNA。
优选地，所述胞嘧啶脱氨酶CD基因的GeneBank序列号为1249769。
优选地，PCR引物扩增所述CD基因的上游引物和下游引物分别为核苷酸序列如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示的DNA。
本发明采用透析的方法使聚合物在水溶液中自组装，形成具有输送CD自杀基因质粒能力的三层结构的复合体。
第三方面，本发明提供了如第一方面所述的自杀基因纳米胶束或如第二方面所述的自杀基因纳米胶束的制备方法在制备预防或治疗卵巢癌药物中的应用。
本发明提供了的自杀基因纳米胶束及其制备方法和应用具有如下有益效果：
(1)本发明提供的自杀基因纳米胶束由通过静电吸附或物理吸附的作用包覆自杀基因质粒，包封率较高，形成的纳米粒比较稳定，能提高自杀基因质粒在体内的半衰期；
(2)本发明提供的自杀基因纳米胶束能提高转染效率和自杀基因质粒的表达效率，且细胞毒性很小，使用更加安全；
(3)本发明提供的自杀基因纳米胶束的制备方法简单、低成本；
(4)本发明提供的自杀基因纳米胶束可用于预防或治疗卵巢癌药物免疫佐剂药物。
附图说明
图1为本发明实施例5提供的自杀基因纳米胶束的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为本发明实施例6提供的自杀基因纳米胶束的细胞转染实验结果；
图3为本发明实施例6提供的自杀基因纳米胶束的细胞转染效率的流式定量检测结果。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
若无特别说明，本发明实施例采用的试剂皆为市售商品。
实施例1
一种自杀基因纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
(1)、取PEG-PLL-PLLeu溶于DMSO中，得到PEG-PLL-PLLeu溶液，浓度为2mg/ml，其中，所述PEG-PLL-PLLeu中，所述述氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸的摩尔比为1:10:40，所述聚赖氨酸的聚合度为10，述聚异亮氨酸的聚合度为10，所述氨基聚乙二醇羧酸的数均分子量为2000Da；
(2)、将PEG-PLL-PLLeu溶液1ml，取1ml超纯水逐滴加至所述的聚合物溶液中，混合水溶液；
(3)、将所述的混合水溶液转至分子截留量在3000Da的透析袋中，于2000ml超纯水中室温透析24h，每4～6小时换一次透析水，得到纳米胶束；
(4)、采用常规分子克隆技术将CD自杀基因与HE4启动子插入pIRES2-EGFP质粒的多克隆位点，所述多克隆位点为XhoI和BamHI位点，得到CD自杀基因质粒，其中，所述HE4启动子由核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物扩增得到，所述CD基因由核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物扩增得到，所述HE4启动子的GeneBank序列号为10406，所述胞嘧啶脱氨酶CD基因的GeneBank序列号为1249769；
(5)、将该CD自杀基因质粒溶于水中，得到浓度为50μg/ml的自杀基因质粒溶液；
(6)、取0.5μg所得纳米胶束与0.1μg CD自杀基因质粒在室温下混合均匀，共培育20min，即得自杀基因纳米颗粒。
实施例2
一种自杀基因纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
(1)、取PEG-PLL-PLLeu溶于DMF中，得到PEG-PLL-PLLeu溶液，浓度为3mg/ml，其中，所述PEG-PLL-PLLeu中，所述述氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸的摩尔比为1:10:50，所述聚赖氨酸的聚合度为50，述聚异亮氨酸的聚合度为100，所述氨基聚乙二醇羧酸的数均分子量为2000Da；
(2)、将PEG-PLL-PLLeu溶液1ml，取1ml超纯水逐滴加至所述的聚合物溶液中，混合水溶液；
(3)、将所述的混合水溶液转至分子截留量在3000Da的透析袋中，于3000ml超纯水中室温透析12h，每5小时换一次透析水，得到纳米胶束；
(4)、采用常规分子克隆技术将CD自杀基因插入带HE4启动子的pIRES2-EGFP质粒的多克隆位点，得到CD自杀基因质粒，具体步骤参照实施例1；
(5)、将该CD自杀基因质粒溶于水中，得到浓度为80μg/ml的自杀基因质粒溶液；
(6)、取1μg所得纳米胶束与0.1μg CD自杀基因质粒在室温下混合均匀，共培育30min，即得自杀基因纳米颗粒。
实施例3
一种自杀基因纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
(1)、取PEG-PLL-PLLeu溶于DMSO中，得到PEG-PLL-PLLeu溶液，浓度为4mg/ml，其中，所述PEG-PLL-PLLeu中，所述述氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸的摩尔比为1:40:50，所述聚赖氨酸的聚合度为100，述聚异亮氨酸的聚合度为200，所述氨基聚乙二醇羧酸的数均分子量为2000Da；
(2)、将PEG-PLL-PLLeu溶液1ml，取3ml超纯水逐滴加至所述的聚合物溶液中，混合水溶液；
(3)、将所述的混合水溶液转至分子截留量在3000Da的透析袋中，于4000ml超纯水中室温透析36h，每6小时换一次透析水，得到纳米胶束；
(4)、采用常规分子克隆技术将CD自杀基因插入带HE4启动子的pIRES2-EGFP质粒的多克隆位点，得到CD自杀基因质粒，具体步骤参照实施例1；
(5)、将该CD自杀基因质粒溶于水中，得到浓度为100μg/ml的自杀基因质粒溶液；
(6)、取2μg所得纳米胶束与0.1μg CD自杀基因质粒在室温下混合均匀，共培育40min，即得自杀基因纳米颗粒。
实施例4
一种自杀基因纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
(1)、取PEG-PLL-PLLeu溶于DMF中，得到PEG-PLL-PLLeu溶液，浓度为2mg/ml，其中，所述PEG-PLL-PLLeu中，所述述氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸的摩尔比为1:10:30，所述聚赖氨酸的聚合度为50，述聚异亮氨酸的聚合度为100，所述氨基聚乙二醇羧酸的数均分子量为2000Da；
(2)、将PEG-PLL-PLLeu溶液1ml，取3ml超纯水逐滴加至所述的聚合物溶液中，混合水溶液；
(3)、将所述的混合水溶液转至分子截留量在3000Da的透析袋中，于2000ml超纯水中室温透析24h，每4小时换一次透析水，得到纳米胶束；
(4)、采用常规分子克隆技术将CD自杀基因插入带HE4启动子的pIRES2-EGFP质粒的多克隆位点，得到CD自杀基因质粒，具体步骤参照实施例1；
(5)、将该CD自杀基因质粒溶于水中，得到浓度为50μg/ml的自杀基因质粒溶液；
(6)、取0.25μg所得纳米胶束与0.1μg CD自杀基因质粒在室温下混合均匀，共培育15min，即得自杀基因纳米颗粒。
实施例5
一种自杀基因纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
(1)、取PEG-PLL-PLLeu溶于DMSO中，得到PEG-PLL-PLLeu溶液，浓度为2mg/ml，其中，所述PEG-PLL-PLLeu中，所述述氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸的摩尔比为1:40:50，所述聚赖氨酸的聚合度为50，述聚异亮氨酸的聚合度为100，所述氨基聚乙二醇羧酸的数均分子量为2000Da；
(2)、将PEG-PLL-PLLeu溶液1ml，取5ml超纯水逐滴加至所述的聚合物溶液中，混合水溶液；
(3)、将所述的混合水溶液转至分子截留量在3000Da的透析袋中，于2000ml超纯水中室温透析24h，每4小时换一次透析水，得到纳米胶束；
(4)、采用常规分子克隆技术将CD自杀基因插入带HE4启动子的pIRES2-EGFP质粒的多克隆位点，得到CD自杀基因质粒，具体步骤参照实施例1；
(5)、将该CD自杀基因质粒溶于水中，得到浓度为50μg/ml的自杀基因质粒溶液；
(6)、取0.1μg所得纳米胶束与0.1μg CD自杀基因质粒在室温下混合均匀，共培育20min，即得自杀基因纳米颗粒。
为了充分说明本发明的有益效果，本发明采用实施例1～4制备的自杀基因纳米胶束进行琼脂糖凝胶电泳，并以裸露自杀基因质粒为对照，电泳结果如图1所示。其中，泳道1为1000kb marker(公司)，泳道2为对照组，其两亲性三嵌段聚合物与自杀基因质粒的质量比(N/P)为0:1，泳道3～6分别为实施例1～4提供的自杀基因纳米胶束，其N/P分别为2.5:1、5:1、10:1和20:1。
由图1可知，泳道2的裸露自杀基因质粒由于无两亲性三嵌段聚合物的包封作用，由于质粒的负电性质而能在电泳中跑出条带，而泳道3～6的自杀基因纳米胶束带正电，电泳时留在了样品孔。图1证明了当两亲性三嵌段聚合物与自杀基因质粒的质量比不小于2.5:1时，自杀基因质粒能被两亲性三嵌段聚合物吸附，说明本发明提供的自杀基因纳米胶束的包封效果较好。
实施例6
为了进一步说明本发明的有益效果，本发明对自杀基因纳米胶束的细胞转染效率进行检测，包括如下步骤：
(1)取实施例一制备的自杀基因纳米胶束配成浓度为300μg/mL自杀基因纳米胶束溶液；
人卵巢浆液性乳头状囊腺癌SKOV3细胞复苏后，培养于含10％FBS的DMEM培养基中(37℃，5％CO2)，培养24h后，采用脂质体法将自杀基因纳米胶束转染细胞，每孔加入一定量自杀基因纳米胶束溶液，使聚合物的浓度范围为1μg/mL～200μg/mL(每个浓度做三个平行样)，具体方法按照LipofectamineTM 2000试剂说明书进行，同时转染裸露自杀基因质粒(实施例1步骤4制备)作为对照，转染脂质体包裹的自杀基因质粒作为阳性对照(脂质体购自invitrogen公司，自杀基因质粒为本发明实施例1步骤4制备)。待细胞长满后依次转入24孔板，100mm培养皿扩大培养。培养3天后，收集细胞，采用荧光显微镜进行检测，细胞荧光图如图2所示，其中，DNA为裸露自杀基因对照组，DNA-lipo为阳性对照组，DNA-NPs为自杀基因纳米胶束实验组。
由图2可知，裸露自杀基因转染的细胞无荧光蛋白表达，阳性对照有荧光蛋白表达，说明实验结果可信。图3为自杀基因纳米胶束的细胞转染效率的流式定量检测结果图，其中，DNA为裸露自杀基因对照组，DNA-lipo为阳性对照组，DNA-NPs为自杀基因纳米胶束实验组。如图3所示，自杀基因纳米胶束的转染效率约为14％，而裸露自杀基因效率约为0。由图2和图3可知，本发明提供的自杀基因纳米胶束转染的细胞有荧光蛋白表达，且表达荧光蛋白的细胞比例较高；说明本发明提供的自杀基因纳米胶束具有较高的转染效率。
Claims (8)
1.一种自杀基因纳米胶束，包括两亲性三嵌段聚合物，所述两亲性三嵌段聚合物为线性高分子化合物，包括为氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述氨基聚乙二醇羧酸相连，另一端通过肽键与所述聚异亮氨酸相连，其特征在于，
所述自杀基因纳米胶束为具有三层结构的复合体，所述聚异亮氨酸构成所述复合体的内层，所述氨基聚乙二醇羧酸构成所述复合体的外层；
所述复合体的中间层包括所述聚赖氨酸，还包括自杀基因质粒，所述自杀基因质粒分散在中间层的所述聚赖氨酸中；所述自杀基因质粒为含有胞嘧啶脱氨酶CD基因或单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-TK基因的真核重组质粒载体；所述真核重组质粒载体为pIRES2-EGFP或pcDNA3.1；所述胞嘧啶脱氨酶CD基因的表达由HE4启动子控制；
所述两亲性三嵌段聚合物和自杀基因质粒的质量比为1～20:1。
2.如权利要求1所述的一种自杀基因纳米胶束，其特征在于，所述两亲性三嵌段聚合物中，所述氨基聚乙二醇羧酸的数均分子量为2000Da，所述聚赖氨酸的聚合度为10～100，所述聚异亮氨酸的聚合度为10～200。
3.如权利要求1所述的一种自杀基因纳米胶束，其特征在于，所述自杀基因纳米胶束中，所述氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸的摩尔比为1:10～40:30～50。
4.一种自杀基因纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供两亲性三嵌段聚合物，所述两亲性三嵌段聚合物为线性高分子化合物，包括氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述氨基聚乙二醇羧酸相连，另一端通过肽键与所述聚异亮氨酸相连；将所述两亲性三嵌段聚合物溶于有机溶剂中，得到浓度为2～4mg/ml的两亲性三嵌段聚合物溶液；
(2)取步骤(1)制备的两亲性三嵌段聚合物溶液，与水按1:1～5的体积比逐滴加入所述两亲性三嵌段聚合物溶液中，得到两亲性三嵌段聚合物水溶液；
(3)将所得两亲性三嵌段聚合物混合水溶液用分子截留量为2000～8000Da的透析袋室温透析12～36小时，得到两亲性三嵌段聚合物纳米胶束，所述两亲性三嵌段聚合物纳米胶为具有三层结构的复合体，所述聚异亮氨酸构成所述复合体的内层，所述复合体的中间层包括所述聚赖氨酸，所述氨基聚乙二醇羧酸构成所述复合体的外层；
(4)取自杀基因质粒溶于水中，得到浓度为50～100μg/ml的自杀基因质粒溶液；所述自杀基因质粒为含有胞嘧啶脱氨酶CD基因或单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-TK基因的真核重组质粒载体；所述真核重组质粒载体为pIRES2-EGFP或pcDNA3.1；
(5)取步骤(3)所得两亲性三嵌段聚合物纳米胶束与步骤(4)所得自杀基因质粒溶液混合均匀并静置15～60分钟，得到自杀基因纳米胶束；所述自杀基因纳米胶束为具有三层结构的复合体，所述聚异亮氨酸构成所述复合体的内层，所述氨基聚乙二醇羧酸构成所述复合体的外层；所述复合体的中间层包括所述聚赖氨酸，还包括自杀基因质粒，所述自杀基因质粒分散在中间层的所述聚赖氨酸中；所述两亲性三嵌段聚合物和自杀基因质粒的质量比为1～20:1。
5.如权利要求4所述的一种自杀基因纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述两亲性三嵌段聚合物中，所述氨基聚乙二醇羧酸的数均分子量为2000Da，所述聚赖氨酸的聚合度为10～100，所述聚异亮氨酸的聚合度为10～200。
6.如权利要求4所述的一种自杀基因纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述自杀基因纳米胶束中，所述氨基聚乙二醇羧酸、聚赖氨酸和聚异亮氨酸的摩尔比为1:10～40:30～50。
7.如权利要求4所述的一种自杀基因纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶CD基因的表达由HE4启动子控制。
8.如权利要求1所述的自杀基因纳米胶束在制备预防或治疗卵巢癌药物中的应用。
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| 两亲性聚合物胶束作为药物载体研究进展;沈丹 等;《武警医学院学报》;20080331;第17卷(第3期);第237-240页 * |
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