KR101570300B1 - 핵산 물질 및 약물의 다중 전달을 위한 온도 감응형 마이셀을 포함하는 약물 전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

핵산 물질 및 약물의 다중 전달을 위한 온도 감응형 마이셀을 포함하는 약물 전달체 및 이의 제조방법 Download PDF

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단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
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Abstract

본 발명은 핵산 물질 및 약물의 다중 전달을 위한 온도 감응형 마이셀을 포함하는 약물 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 소수성 중합체성 블록, 친수성 중합체성 블록 및 그래프트 중합체성 블록을 포함하는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체로서, 상기 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀의 소수성 내핵에 소수성 약물이 담지되어 있고 그래프트 중합체성 쉘에 핵산 물질이 회합되어 있어 소수성 약물과 핵산 물질을 동시에 전달할 수 있는 다중 약물 전달능을 갖는 약물 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

핵산 물질 및 약물의 다중 전달을 위한 온도 감응형 마이셀을 포함하는 약물 전달체 및 이의 제조방법{A drug delivery system comprising temperature-triggered micelles for multi-delivery of a drug and nucleic acid}
본 발명은 핵산 물질 및 약물의 다중 전달을 위한 온도 감응형 마이셀을 포함하는 약물 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
자극-유발되는 마이셀 전달체의 사용은 특정 자극에 반응하는 특유의 특성과 담지된 생체분자의 악 영향으로부터 정상 조직 또는 세포를 보호하는 능력으로 인하여 능동적 표적지향 치료법에서 큰 관심을 받고 있다. 자극-유발되는 전달 시스템은 온도, pH, 이온 강도, 자성, 글루타치온(glutathione) 및 빛과 같은 지정된 자극에 의해 작용하도록 설계된다.
이들 자극 중에, 온도는 고형 종양의 온열 치료법과 같은 의학적인 응용에서 용이한 조작과 안전성으로 인하여 가장 우수한 시그널 중 하나로서 오랫동안 사용되어 왔다. 예를 들어, 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)(poly(N-isopropylacrylamide, PNIPAAm) 및 플루로닉(Pluronic)은 수용성 용액 중에서 자가 조립된 마이셀을 형성하는 특성 때문에 국소적 온열요법과 함께 표적 치료법을 위해 널리 사용되어 왔다.
나노 저장소(nanoreservoir) 구조를 갖는 자가 조립된 마이셀은 임계 마이셀 농도(CMC) 이상에서 소수성 코어 내에 난 수용성 약물을 캡슐화할 수 있어, 수용해도와 치료 약물의 방출 효능을 향상시킨다.
수용액에서 코로나를 형성하는 친수성 폴리에틸렌 옥사이드(poly(ethylene oxide), PEO) 블록 및 소수성 폴리프로필렌 옥사이드(poly(propylene oxide), PPO) 블록을 포함하는 비 이온성 플루로닉 삼중 블록 공중합체는 약물의 부작용을 감소시키면서 수용해도 및 소수성 약물의 방출 효율을 증가시킬 수 있다. 이러한 고유 특성으로 인해, 약물이 담지된 플루로닉 마이셀은 생체 내에서 세망내피계 시스템(reticuloendothelial system, RES)에 의해 자가 응집, 단백질 흡착 및 인식을 막으면서 치료적인 역할을 할 수 있다.
그러나, 이런 장래성에도 불구하고, PNIPAAm 또는 플루로닉으로 구성된 마이셀은 혈액에서 순환하는 동안 체액에 의해 희석시 CMC 이하 저 농도에서 고분자 단위로 해리되어 콜로이드 안정성이 줄어들 수 있고, 결과적으로 마이셀의 약물 담지 능력을 잃을 수 있다. 게다가, 마이셀의 코어-쉘 구조는 비 이온성 구조 때문에 유전자 복합체를 형성하는데 적합하지 않다.
콜로이드 안정성을 촉진하고 유전자 복합체를 형성하는 기능을 제공하기 위해, 마이셀의 쉘에 양이온성 고분자를 가교결합시키는 접근법이 제안되어 왔다. 예를 들어, PNIPAAm 또는 플루로닉 마이셀을 키토산(chitosan) 또는 폴리-L-라이신(poly-L-lysine)과 가교결합하여 콜로이드 안정성을 향상시키거나 유전자 복합체를 가능하게 하는 시도가 있었다. 이러한 다수의 시도에도 불구하고, 다중 기능적인 전달체에 적합한 특성화는 거의 보고된 바 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 소수성 중합체성 블록, 친수성 중합체성 블록 및 그래프트 중합체성 블록을 포함하는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체로서, 상기 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀의 소수성 내핵에 소수성 약물이 담지되어 있고 그래프트 중합체성 쉘에 핵산 물질이 회합되어 있는 형태의 약물 전달체를 제조하고 이의 다중 전달능 및 콜로이드 안정성을 조사한 결과 상기 약물 전달체가 소수성 약물과 핵산 물질을 동시에 전달할 수 있는 다중 약물 전달능을 가질 뿐만 아니라 우수한 콜로이드 안정성을 가짐을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다중 약물 전달능 및 우수한 콜로이드 안정성을 갖는 약물 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 다중 약물 전달능 및 우수한 콜로이드 안정성을 갖는 약물 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은
소수성 중합체성 블록, 친수성 중합체성 블록 및 그래프트 중합체성 블록을 포함하는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체에 있어서,
상기 마이셀이 소수성 내핵, 친수성 외핵 및 그래프트 중합체성 쉘을 갖고, 상기 소수성 내핵에 소수성 약물이 담지되어 있으며, 상기 그래프트 중합체성 쉘에 핵산 물질이 회합되어 있어, 약물 및 핵산물질의 다중전달능을 나타내며,
상기 다중블록 공중합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것인 약물 전달체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014094096311-pat00001
상기 식에서,
n은 2 내지 130의 정수이고,
m은 15 내지 67의 정수이고,
p는 1 내지 100의 정수이다.
이하 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "마이셀(micelle)"은 양친성, 즉 코어 영역의 소수성기와 쉘 영역의 친수성기를 동시에 갖는 열역학적으로 안정하고 균일한 구형 구조를 의미한다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀의 소수성 내핵에 소수성 약물이 담지되어 있고 그래프트 중합체성 쉘에 핵산 물질이 회합되어 있어 소수성 약물과 핵산 물질을 동시에 전달할 수 있는 다중 약물 전달능을 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 약물 전달체를 형성하는 마이셀은 친수성 외핵에 그래프트 중합체성 쉘이 결합되어 있어 마이셀의 콜로이드 안정성이 향상되어 체내에 투여되었을 때 체내에서 급속히 해리되는 것이 방지되어 약물의 효과적인 전달이 가능하다는 장점을 갖는다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체는 온도 감응성인 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체는 35℃ 내지 45℃ 온도 범위에 감응하여 마이셀 내핵과 소수성 약물의 소수성 상호작용에 의해 마이셀이 스퀴징(squeezing) 되어 약물 방출 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “소수성 약물”은 마이셀의 소수성 내핵 내에 담지될 수 있는 소수성 특성을 갖는 약물이다.
본 발명에서, 상기 소수성 약물은 증식억제 또는 화학치료 약물, 진통제, 항염증제, 구충제, 항부정맥제, 항세균제, 항바이러스제, 항응고제, 우울증치료제, 당뇨병치료제, 간질치료제, 항곰팡이제, 항통풍제, 고혈압치료제, 말라리아치료제, 편두통 치료제, 항-무스카린제, 항신생물제, 발기부전 개선제, 면역억제제, 항원충제, 갑상선 치료제, 항불안제, 진정제, 최면제, 신경이완제, β-차단제, 강심제, 코르티코스테로이드, 이뇨제, 파킨슨병치료제, 위장관제, 히스타민 수용체 길항제, 각질용해제, 지질 조정제, 협심증 치료제, Cox-2 억제제, 류코트리엔 억제제, 매크로라이드, 근육이완제, 영양제, 마약성 진통제, 단백질분해제 억제제, 성호르몬, 자극제, 근육 이완제, 항삼투제, 비만치료제, 인지기능 항진제, 요실금치료제, 양성 전립선 비대 치료제, 필수 지방산 및 비-필수 지방산으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서, 상기 소수성 약물은 아바렐릭스(Abarelix), 알데스류킨(aldesleukin), 알데스류킨(Aldesleukin), 알렘투주맵(Alemtuzumab), 알리트레티노인(Alitretinoin), 알로푸리놀(Allopurinol), 알트레타민(Altretamine), 아미포스틴(Amifostine), 아나스트로졸(Anastrozole), 삼산화비소(Arsenic trioxide), 아스파라기나아제(Asparaginase), 아자시티딘(Azacitidine), BCG 라이브(BCG Live), 베바시주맵(Bevacuzimab), 아바스틴(Avastin), 플루오로우라실(Fluorouracil), 벡사로텐(Bexarotene), 블레오마이신(Bleomycin), 보르테조밉(Bortezomib), 부설팬(Busulfan), 칼루스테론(Calusterone), 카페시타빈(Capecitabine), 캠토테신(Camptothecin), 카보플라틴(Carboplatin), 카머스틴(Carmustine), 셀레콕시브(Celecoxib), 세툭시맵(Cetuximab), 클로람부실(Chlorambucil), 시스플라틴(Cisplatin), 클라드리빈(Cladribine), 클로파라빈(Clofarabine), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 사이타라빈(Cytarabine), 댁티노마이신(Dactinomycin), 다베포에틴 알파(Darbepoetin alfa), 다우노루비신(Daunorubicin), 데니류킨(Denileukin), 덱스라족산(Dexrazoxane), 도세택셀(Docetaxel), 독소루비신(Doxorubicin) 중성, 독소루비신 염산, 드로모스태놀론(Dromostanolone) 프로피오네이트, 에피루비신(Epirubicin), 에포에틴 알파(Epoetin alfa), 에를로티닙(Erlotinib), 에스트라머스틴(Estramustine), 에토포시드(Etoposide) 포스페이트, 에토포시드, 엑세메스탄(Exemestane), 필그라스팀(Filgrastim), 플록수리딘 플루다라빈(floxuridine fludarabine), 풀베스트란트(Fulvestrant), 게피티니브(Gefitinib), 겜시타빈(Gemcitabine), 겜투주맵(Gemtuzumab), 고세렐린(Goserelin)아세테이트, 히스트렐린(Histrelin) 아세테이트, 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 이브리투모맵(Ibritumomab), 이다루비신(Idarubicin), 이포스파미드(Ifosfamide), 이마티닙(Imatinib) 메실레이트, 인터페론 알파-2a(Interferon Alfa-2a), 인터페론 알파-2b(Interferon Alfa-2b), 이리노테칸(Irinotecan), 레날리도미드(Lenalidomide), 레트로졸(Letrozole), 류코보린(Leucovorin), 류프로리드(Leuprolide) 아세테이트, 레바미솔(Levamisole), 로머스틴(Lomustine), 메게스트롤(Megestrol) 아세테이트, 멜팔란(Melphalan), 머캅토퓨린(Mercaptopurine), 6-MP, 메스나(Mesna), 메토트렉세이트(Methotrexate), 메톡살렌(Methoxsalen), 미토마이신C(Mitomycin C), 미토탄(Mitotane), 미토크산트론(Mitoxantrone), 난드롤론(Nandrolone), 네라라빈(Nelarabine), 노페투모맵(Nofetumomab), 오프렐베킨(Oprelvekin), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리택셀(Paclitaxel), 팰리퍼민(Palifermin), 패미드로네이트(Pamidronate), 페가데마제(Pegademase), 페가스파르가제(Pegaspargase), 펙필그래스팀(Pegfilgrastim), 페메트렉세드 디소디움(Pemetrexed Disodium), 펜토스타틴(Pentostatin), 피포브로맨(Pipobroman), 플리카마이신(Plicamycin), 포르피머 소디움(Porfimer Sodium), 프로카바진(Procarbazine), 퀴나크린(Quinacrine), 라스부리케이스(Rasburicase), 리툭시맵(Rituximab), 사그라모스팀(Sargramostim), 소라페닙(Sorafenib), 스트렙토조신(Streptozocin), 수니티닙 말레에이트(Sunitinib Maleate), 활석(Talc), 타목시펜(Tamoxifen), 템졸로미드(Temozolomide), 테니포시드(Teniposide), VM-26, 테스토락톤(Testolactone), 티오구아닌(Thioguanine), 6-TG, 티오테파(Thiotepa), 토포테칸(Topotecan), 토레미펜(Toremifene), 토시투모맵(Tositumomab), 트라스투주맵(Trastuzumab), 트레티노인(Tretinoin), ATRA, 우라실머스타드(Uracil Mustard), 발루비신(Valrubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 비노렐빈(Vinorelbine), 졸레드로네이트(Zoledronate), 졸레드론산(Zoledronic acid), 아세트레틴, 알벤다졸, 알부테롤, 아미노글루테티미드, 아미오다론, 암로디핀, 암페타민, 암포테리신 B, 아토바스타틴, 아토바쿠온, 아지트로마이신, 바클로펜, 베클로메타손, 베네제프릴, 벤조나테이트, 베타메타손, 비칼루타니드, 부데소니드, 부프로피온, 부설판, 부테나핀, 칼시페디올, 칼시포트리엔, 칼시트리올, 캄토테신, 칸데사르탄, 캡사이신, 카바메제핀, 카로텐, 셀레콕시브, 세리바스타틴, 세티리진, 클로페니라민, 콜레칼시페롤, 실로스타졸, 시메티딘, 시나리진, 시프로플록사신, 시사프리드, 클라리트로마이신, 클레마스틴, 클로미펜, 클로미프라민, 클로피도그렐, 코데인, 코엔자임 Q10, 사이클로벤자프린, 사이클로스포린, 다나졸, 단트롤렌, 덱스클로르페니라민, 디클로페낙, 디쿠마롤, 디곡신, 데하이드로에피안드로스테론, 디하이드로에르고타민, 디하이드로타키스테롤, 디리트로마이신, 도네제필, 에파비렌즈, 에프로사탄, 에르고칼시페롤, 에르고타민, 필수 지방산원, 에토독락, 에토포시드, 파모티딘, 페노피브레이트, 펜타닐, 펙소페나딘, 피나스테리드, 플루코나졸, 플루비프로펜, 플루바스타틴, 포스페니토인, 프로바트립탄, 푸라졸리돈, 가바펜틴, 겜피브로질, 글리벤클라미드, 글리피지드, 글리부리드, 글리메피리드, 그리세오풀빈, 할로판트린, 이부프로펜, 이르베사탄, 이리노테칸, 이소소르비드, 디니트레이트, 이소트레티노인, 이트라코나졸, 이버멕틴, 케토코나졸, 케토롤락, 라모트리긴, 란소프라졸, 레플루노미드, 리시노프릴, 로페라미드, 로라타딘, 로바스타틴, L-트리록신, 루테인, 라이코펜, 메드록시프로게스테론, 미페프리스톤, 메플로퀸, 메게스트롤 아세테이트, 메타돈, 메톡살렌, 메트로니다졸, 미코나졸, 미다졸람, 미글리톨, 미녹시딜, 미토크산트론, 몬테르캐스트, 나부메톤, 날부핀, 나라트립탄, 넬피나비르, 니페디핀, 닐솔리디핀, 닐루타니드, 니트로푸란토인, 니자티딘, 오메프라졸, 오프레벨킨, 오에스트라디올, 옥사프로진, 파클리택셀, 파라칼시톨, 파록세틴, 펜타조신, 피오글리타존, 피조페틴, 프라바스타틴, 프레드니솔론, 프로부콜, 프로게스테론, 슈도에페드린, 피리도스티그마인, 라베프라졸, 라록시펜, 로페콕시브, 레파글리니드, 리파부틴, 리파펜틴, 리멕솔론, 리타노비르, 리자트립탄, 로시글리타존, 사퀴나비르, 세르트랄린, 시부트라민, 실데나필, 시트레이트, 심바스틴, 시로리머스, 스피로노락톤, 서마트립탄, 타크린, 타크로리머스, 타목시펜, 탐술로신, 타르그레틴, 타자로텐, 텔미사탄, 테니포시드, 터비나핀, 테라조신, 테트라하이드로칸나비놀, 티아가빈, 티클로피딘, 티로피브란, 티자니딘, 토피라메이트, 토포테칸, 토레미펜, 트라마돌, 트레티노인, 트로글리타존, 트로바플록사신, 유비데카레논, 발사탄, 벤라팍신, 베르테포르핀, 비가바트린, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 자피르루카스트, 질레우톤, 졸미트립탄, 졸피뎀, 및 조피클론으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서, 상기 핵산 물질은 RNA, DNA, 플라스미드 DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme), 미스센스 뉴클레오티드, 단백질생산 뉴클레오티드 및 단백질 또는 핵산의 생산속도제어용 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체는 온열 치료용일 수 있다. 본 발명의 약물 전달체는 온도 감응성 약물 전달체로서 35℃ 내지 45℃ 온도 범위에 감응하여 마이셀 내핵과 소수성 약물의 소수성 상호작용에 의해 스퀴징되어 약물 방출 특성을 나타낼 수 있으며, 특히 온도가 상승함에 따라 소수성 약물의 방출 속도가 증가될 수 있어 온열 치료시 사용할 경우 치료 부위에 소수성 약물을 빠르게 방출시켜 치료 효율을 높일 수 있다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체는 소수성 내핵 내에 담지되어 있는 소수성 약물을 전달하는 역할을 하면서 동시에 상기 그래프트 중합체성 쉘에 회합되어 있는 핵산 물질에 의한 표적 지향 특성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.
하기 화학식 2로 표시되는 중합체를 4-니트로페닐 클로로포르메이트와 반응시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 중합체를 제조하는 단계(단계 1);
상기 화학식 3으로 표시되는 중합체를 하기 화학식 4로 표시되는 중합체와 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체를 제조하는 단계(단계 2);
상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체를 물에 첨가하여 마이셀을 형성시켜 마이셀을 포함하는 수분산액을 얻는 단계(단계 3);
상기 마이셀을 포함하는 수분산액에 소수성 약물을 첨가하고 교반하는 단계(단계 4); 및
상기 단계 4)의 교반액에 핵산 물질을 첨가하고 인큐베이션시키는 단계(단계 5).
[화학식 1]
Figure 112014094096311-pat00002
[화학식 2]
Figure 112014094096311-pat00003
[화학식 3]
Figure 112014094096311-pat00004
[화학식 4]
Figure 112014094096311-pat00005
상기 식에서,
n은 2 내지 130의 정수이고,
m은 15 내지 67의 정수이고,
p는 1 내지 100의 정수이다.
상기 단계 1은, 화학식 2로 표시되는 중합체를 4-니트로페닐 클로로포르메이트와 반응시킴으로써, 화학식 4로 표시되는 중합체와 결합시킬 수 있도록, 화학식 2로 표시되는 중합체의 말단을 활성화시켜 화학식 3으로 표시되는 중합체를 제조하는 단계이다.
본 발명에서, 상기 화학식 2로 표시되는 중합체와 4-니트로페닐 클로로포르메이트의 반응은 당량비로 1:1 내지 1:5의 범위에서 수행될 수 있다. 만일 상기 화학식 2로 표시되는 중합체와 4-니트로페닐 클로로포르메이트의 반응 당량비가 상기 범위 밖이면 화학식 2로 표시되는 중합체의 말단의 활성화가 부족하거나 과량의 4-니트로페닐 클로로포르메이트가 남아 비효율적일 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 1)의 용매는 벤젠일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 단계 1)의 반응온도는 바람직하기로 5℃ 내지 35℃일 수 있다. 만일 상기 반응온도가 5℃보다 낮으면 미반응물이 존재하여 생성물의 수율이 낮아지는 단점이 있고, 35℃보다 높으면 부반응이 존재하게 되어 수득률이 낮아지는 단점이 있다.
본 발명에서, 상기 단계 1)의 반응시간은 6시간 내지 48시간 일 수 있다. 만일 상기 반응시간이 6시간보다 짧으면 미반응물이 존재하여 생성물의 수율이 낮아지는 단점이 있고, 48시간보다 길면 부반응이 존재하여 수득률이 낮아지는 단점이 있다.
상기 단계 2는, 화학식 3으로 표시되는 중합체를 화학식 4로 표시되는 중합체와 반응시켜 본 발명의 마이셀을 형성하는 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체를 제조하는 단계이다.
본 발명에서, 상기 화학식 3으로 표시되는 중합체와 화학식 4로 표시되는 중합체의 반응은 당량비로 1:1 내지 1:2의 범위에서 수행될 수 있다. 만일 반응 당량비가 상기 범위를 벗어나면 과량으로 넣은 화합물이 미반응으로 다량이 남아 있기 때문에 경제적인 면에서 효율적이지 못한 단점이 있다.
본 발명에서, 상기 단계 2)는 바람직하기로 염기성 조건 하에서 수행될 수 있다. 이때 염기성 조건을 위하여 NaOH, KOH 등을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 단계 2)의 용매는 물일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, 상기 물은 상기한 바와 같이 NaOH, KOH 등을 사용하여 염기성 조건으로 조절하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 2)의 반응시간은 2시간 내지 24시간 일 수 있다. 만일 상기 반응시간이 2시간보다 짧으면 미반응물이 존재하여 생성물의 수율이 낮아지는 단점이 있고, 24시간보다 길면 부반응이 존재하여 수득률이 낮아지는 단점이 있다.
상기 단계 3은, 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체를 물에 첨가하여 마이셀을 형성시켜 마이셀을 포함하는 수분산액을 얻는 단계이다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 임계 마이셀 농도(CMC)는 0.013 mg/ml이다. 즉, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체는 0.013 mg/ml 이상의 농도에서 마이셀을 형성할 수 있으므로, 본 발명에서, 상기 단계 3)의 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 농도는 바람직하기로 0.013 mg/ml 이상, 더욱 바람직하기로 0.013 mg/ml 내지 1.3 mg/ml일 수 있다. 만일 본 발명에서, 상기 단계 3)의 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 농도가 0.013 mg/ml 미만이면 마이셀의 형성이 어려울 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 3)은 바람직하기로 5℃ 내지 45℃에서 수행할 수 있다. 만일 상기 단계 3)의 온도가 5℃이하이면 마이셀의 콜로이드 안정성이 떨어질 수 있다.
상기 단계 4는, 마이셀을 포함하는 수분산액에 소수성 약물을 첨가하고 교반하여 마이셀의 소수성 내핵 내에 소수성 약물을 담지시키는 단계이다.
본 발명에서, 상기 단계 4)의 소수성 약물의 의미 및 종류는 상기 약물전달체에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에서, 상기 단계 4)의 소수성 약물의 농도는 바람직하기로 0.1 내지 5 ㎍/ml일 수 있다. 만일 상기 단계 4)의 소수성 약물의 농도가 0.1 ㎍/ml 미만이면 소수성 약물의 담지량이 떨어질 수 있으며 5 ㎍/ml 초과이면 과량의 소수성 약물이 남을 수 있어 경제적인 면에서 효율적이지 못한 단점이 있다.
본 발명에서, 상기 단계 4)는 바람직하기로 5℃ 내지 35℃에서 수행할 수 있다. 만일 상기 단계 4)의 온도가 5℃이하이면 마이셀의 콜로이드 안정성이 떨어질 수 있다.
상기 단계 5는, 단계 4)의 교반액에 핵산 물질을 첨가하고 인큐베이션시켜 상기 그래프트 중합체성 쉘에 핵산 물질을 회합시키는 단계이다.
본 발명에서, 상기 단계 5)의 핵산 물질의 종류는 상기 약물전달체에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에서, 상기 단계 5)에서 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체와 핵산 물질의 질소/인산염(N/P) 비는 바람직하기로 3 이상, 더욱 바람직하기로 3 내지 30일 수 있다. 만일 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체와 핵산 물질의 N/P 비가 3 미만이면 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체와 핵산 물질 간의 결합 능력이 떨어질 수 있고 30 초과이면 결합력이 너무 강해서 저효율의 핵산이 방출될 수 있는 단점이 있을 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 5)는 바람직하기로 5℃ 내지 35℃에서 수행할 수 있다. 만일 상기 단계 5)의 온도가 5℃이하이면 마이셀의 콜로이드 안정성이 떨어질 수 있으며, 특히 35℃를 초과하면 마이셀의 소수성 내핵 내에 담지되어 있는 소수성 약물이 방출되어 소수성 약물이 소실될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 Pluronic F127(sigma-Aldrich, USA)을 활성화 시키기 위해 4-나이트로페닐 클로로포르메이트(4-nitrophenyl chloroformate, 4-NPC; Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. 간략하게, 1 내지 2 중량%의 4-NPC 벤젠 용액에 0.2 내지 0.5 g/mL의 Pluronic F127 벤젠 용액을 천천히 첨가하였다. 12 내지 36시간 교반 후, 생성물을 적어도 2회 이상 석유 에테르의 8배 과량을 사용하여 침전 시키고, 진공 하에서 밤새 잔여 용매를 증발시켜 제거하고, 여과에 의해 회수하였다. 파라-나이트로페놀레이트(para-nitrophenolate) 이온의 치환 정도는 알카리성 용액, 바람직하게 0.1N NaOH에서 402 nm의 분광 측정을 통해 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 활성화된 Pluronic F127를, 0.08 g/mL의 PEI(MW: 1,800 Da, Polysciences, Inc. USA)가 용해된 0.1N NaOH 용액에 Pluronic F127과 PEI의 혼합 비율을 중량 기준으로 바람직하기로 1:1 내지 3, 더욱 바람직하기로 1:2로 첨가한 다음, 상기 혼합물을 상온에서 4 내지 8시간 동안 교반한 후, 동결 건조하기 위해 탈 이온수에서 3일 동안 3,500의 분자량 컷-오프(MWCO)를 갖는 투석막을 통해 정제하여 본 발명의 화학식 1로 표시되는 다중 블록 공중합체인 FPEI 공중합체를 제조하였다. FPEI 공중합체의 합성은 푸리에-변환 적외선 현미경(FT-IR, Perkin Elmer, Spectrum BXII spectrometer, USA)으로 확인하였다. 컨쥬게이트된 PEI 함량은 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS) 분석을 통해 계산할 수 있다.
도 1a는 상기 합성된 FPEI 공중합체의 분자구조, 및 핵산 물질과 FPEI의 마이셀 복합체의 스퀴징 효과에 의한 온도 감응 약물 방출을 개략적으로 나타내는 개념도의 보여준다.
본 발명에서 상기 FPEI 약물전달체는 온도에 따른 크기, 약물 담지 및 방출 거동, DNA 결합 능력, 및 표면 전하 등의 일련의 측정을 수행함으로써 특성 분석되었다. 그 결과, 상기 FPEI 약물전달체가 소수성 약물과 핵산물질의 다중 전달 능력을 갖는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명은
소수성 중합체성 블록, 친수성 중합체성 블록, 그래프트 중합체성 블록 및 표적화 블록을 포함하는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체에 있어서,
상기 마이셀이 소수성 내핵, 친수성 외핵 및 그래프트 중합체성 쉘을 갖고, 상기 그래프트 중합체성 쉘의 외부에 상기 표적화 블록이 위치하고, 상기 소수성 내핵에 소수성 약물이 담지되어 있으며, 상기 그래프트 중합체성 쉘에 핵산 물질이 회합되어 있어, 약물 및 핵산물질의 다중전달능 및 표적화능을 나타내며,
상기 다중블록 공중합체는, 하기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 것인 약물 전달체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014094096311-pat00006
상기 식에서,
n은 2 내지 130의 정수이고,
m은 15 내지 67의 정수이고,
p는 1 내지 100의 정수이다.
구체적으로, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체는, 하기 화학식 5로 표시되는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않고 폴리에틸렌이민 블록의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산, 즉 1개, 2개, 3개 또는 4개의 엽산이 결합되어 있는 것이면 모두 가능하다.
[화학식 5]
Figure 112014094096311-pat00007
상기 식에서,
n은 2 내지 130의 정수이고,
m은 15 내지 67의 정수이고,
p는 1 내지 100의 정수이다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체는, 소수성 중합체성 블록, 친수성 중합체성 블록 및 그래프트 중합체성 블록 이외에 표적화 블록을 추가로 포함하며, 상기 표적화 블록으로서 엽산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “엽산(folic acid)”은 비타민의 일종으로, 비타민 B9 또는 비타민 M 이라고도 불리며, 구체적으로 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물을 의미한다.
[화학식 6]
Figure 112014094096311-pat00008

엽산은 퓨린(purine) 합성에 관여한다. 대부분의 세포들은 엽산에 대하여 낮은 친화성을 가진, 감소된 엽산 수송체(reduced folate carrier)라고 불리는 음이온 채널을 통해서 엽산을 얻는다. 이에 따라, 대부분의 정상 세포들에는 엽산 수용체가 매우 적게 발현되거나 발현되지 않는다. 그러나, 암세포들과 배아 발달에 관여하는 세포들과 같이 많은 엽산을 필요로 하는 세포들은 정상 세포에 비해 높은 친화도를 가진 엽산 수용체를 사용하고, 이에 따라 엽산 수용체들은 암 세포들에서 정상 세포에 비해 크게 발현된다. 따라서, 표적화 블록으로서 엽산을 포함하는 다중블록 공중합체는 정상 세포에 비해 암 세포에 대해 더욱 큰 친화도를 가져 결과적으로 암 표적지향성을 갖게 된다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀의 소수성 내핵에 소수성 약물이 담지되어 있고 그래프트 중합체성 쉘에 핵산 물질이 회합되어 있어 소수성 약물과 핵산 물질을 동시에 전달할 수 있는 다중 약물 전달능을 가질 뿐만 아니라 상기 그래프트 중합체성 쉘에 회합되어 있는 핵산 물질에 의한 표적 지향 특성과 더불어 상기 표적화 블록에 의한 표적 지향 특성을 포함하는 다중 표적 지향 특성을 갖는 것을 특징으로 한다. 즉, 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀은 다중 약물 전달능과 다중 표적 지향능을 동시에 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀은 친수성 외핵에 그래프트 중합체성 쉘이 결합되어 있어 마이셀의 콜로이드 안정성이 향상되어 체내에 투여되었을 때 체내에서 급속히 해리되는 것이 방지되어 약물의 효과적인 전달이 가능하다는 장점을 갖는다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체는 온도 감응성인 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 약물 전달체는 35℃ 내지 45℃ 온도 범위에 감응하여 마이셀 내핵과 소수성 약물의 소수성 상호작용에 의해 마이셀이 스퀴징(squeezing) 되어 약물 방출 특성을 나타낼 수 있다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체에 있어서, 소수성 약물의 종류 및 핵산 물질의 종류는 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체에서 설명한 바와 동일하다.
또한, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체는 온열 치료용일 수 있다. 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체는 온도 감응성 약물 전달체로서 35℃ 내지 45℃ 온도 범위에 감응하여 마이셀 내핵과 소수성 약물의 소수성 상호작용에 의해 스퀴징되어 약물 방출 특성을 나타낼 수 있으며, 특히 온도가 상승함에 따라 소수성 약물의 방출 속도가 증가될 수 있어 온열 치료시 사용할 경우 치료 부위에 소수성 약물을 빠르게 방출시켜 치료 효율을 높일 수 있다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체는 소수성 내핵 내에 담지되어 있는 소수성 약물을 전달하는 역할을 하면서 동시에, 상기 그래프트 중합체성 쉘에 회합되어 있는 핵산 물질에 의한 표적 지향 특성과 상기 표적화 블록에 의한 표적 지향 특성을 포함하는 다중 표적 지향 특성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.
하기 화학식 2로 표시되는 중합체를 4-니트로페닐 클로로포르메이트와 반응시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 중합체를 제조하는 단계(단계 1a);
상기 화학식 3으로 표시되는 중합체를 하기 화학식 4로 표시되는 중합체와 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체를 제조하는 단계(단계 2a);
상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체를 엽산과 반응시키는 단계(단계 2b);
상기 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체를 물에 첨가하여 마이셀을 형성시켜 마이셀을 포함하는 수분산액을 얻는 단계(단계 3a);
상기 마이셀을 포함하는 수분산액에 소수성 약물을 첨가하고 교반하는 단계(단계 4a); 및
상기 단계 4a)의 교반액에 핵산 물질을 첨가하고 인큐베이션시키는 단계(단계 5a).
[화학식 1]
Figure 112014094096311-pat00009
[화학식 2]
Figure 112014094096311-pat00010
[화학식 3]
Figure 112014094096311-pat00011
[화학식 4]
Figure 112014094096311-pat00012
상기 식에서,
n은 2 내지 130의 정수이고,
m은 15 내지 67의 정수이고,
p는 1 내지 100의 정수이다.
상기 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1a 및 단계 2a는 각각 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체의 제조방법의 단계 1 및 단계 2와 동일하다.
상기 단계 2b는, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체를 엽산과 반응시켜 말단에 표적화 블록으로서 엽산을 포함하는 다중블록 공중합체를 얻는 단계이다.
본 발명에서, 상기 단계 2b)는 에틸(디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC) 가교를 통해 수행할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 2b)는 MES 버퍼 용액 중에서 수행될 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 2b)의 반응온도는 바람직하기로 5℃ 내지 35℃일 수 있다. 만일 상기 반응온도가 5℃보다 낮으면 미반응물이 존재하여 생성물의 수율이 낮아지는 단점이 있고, 35℃보다 높으면 부반응이 존재하게 되어 수득률이 낮아지는 단점이 있다.
본 발명에서, 상기 단계 2b)의 반응시간은 6시간 내지 48시간 일 수 있다. 만일 상기 반응시간이 6시간보다 짧으면 미반응물이 존재하여 생성물의 수율이 낮아지는 단점이 있고, 48시간보다 길면 부반응이 존재하여 수득률이 낮아지는 단점이 있다.
상기 단계 3a는, 상기 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체를 물에 첨가하여 마이셀을 형성시켜 마이셀을 포함하는 수분산액을 얻는 단계이다.
본 발명에서, 상기 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체의 임계 마이셀 농도(CMC)는 0.11 mg/ml이다. 즉, 본 발명의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체는 0.11 mg/ml 이상의 농도에서 마이셀을 형성할 수 있으므로, 본 발명에서, 상기 단계 4)의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체의 농도는 바람직하기로 0.11 mg/ml 이상, 더욱 바람직하기로 0.11 mg/ml 내지 2 mg/ml일 수 있다. 만일 본 발명에서, 상기 단계 3a)의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체의 농도가 0.11 mg/ml 미만이면 마이셀의 형성이 어려울 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 3a)는 바람직하기로 5℃ 내지 45℃에서 수행할 수 있다. 만일 상기 단계 3a)의 온도가 5℃이하이면 마이셀의 콜로이드 안정성이 떨어질 수 있다.
상기 단계 4a는, 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 수분산액에 소수성 약물을 첨가하고 교반하여 마이셀의 소수성 내핵 내에 소수성 약물을 담지시키는 단계이다.
본 발명에서, 상기 단계 4a)의 소수성 약물의 의미 및 종류는 상기 약물전달체에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에서, 상기 단계 4a)의 소수성 약물의 농도는 바람직하기로 0.1 내지 5 ㎍/ml일 수 있다. 만일 상기 단계 4a)의 소수성 약물의 농도가 0.1 ㎍/ml 미만이면 소수성 약물의 담지량이 떨어질 수 있으며 5 ㎍/ml 초과이면 과량의 소수성 약물이 남을 수 있어 경제적인 면에서 효율적이지 못한 단점이 있다.
본 발명에서, 상기 단계 4a)는 바람직하기로 5℃ 내지 35℃에서 수행할 수 있다. 만일 상기 단계 4a)의 온도가 5℃이하이면 마이셀의 콜로이드 안정성이 떨어질 수 있다.
상기 단계 5a는, 단계 4a)의 교반액에 핵산 물질을 첨가하고 인큐베이션시켜 상기 그래프트 중합체성 쉘에 핵산 물질을 회합시키는 단계이다.
본 발명에서, 상기 단계 5a)의 핵산 물질의 종류는 상기 약물전달체에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에서, 상기 단계 5a)에서 상기 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체와 핵산 물질의 질소/인산염(N/P) 비는 바람직하기로 5 이상, 더욱 바람직하기로 5 내지 30일 수 있다. 만일 상기 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체와 핵산 물질의 N/P 비가 5 미만이면 상기 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체와 핵산 물질 간의 결합 능력이 떨어질 수 있고 30 초과이면 결합력이 너무 강해서 저효율의 핵산이 방출될 수 있는 단점이 있을 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 5a)는 바람직하기로 5℃ 내지 35℃에서 수행할 수 있다. 만일 상기 단계 5a)의 온도가 5℃이하이면 마이셀의 콜로이드 안정성이 떨어질 수 있으며, 특히 35℃를 초과하면 마이셀의 소수성 내핵 내에 담지되어 있는 소수성 약물이 방출되어 소수성 약물이 소실될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 3단계 반응으로 PF127-PEI-FA를 합성하였다. 먼저, PF127를 PEI로 반응이 가능하도록 4-NPC로 반응시켜 활성화하였다. 그 다음, NPC로 활성화된 PF127을 저 분자량(Mw 1.8k)의 PEI로 반응 시키고, 반응되지 않은 PEI를 제거하기 위해 투석하였다. 마지막으로, PF127-PEI에 EDC 가교를 통해 FA를 컨쥬게이션시켰고, 투석법으로 정제하였다. 난 수용성 FA는 DMSO에 용해시켰으며, 이어서 FA 용액은 PF127-PEI가 용해된 MES 버퍼 용액에 격렬한 교반 하에 떨어뜨려 첨가하였다.
도 7은 상기 합성된 PF127-PEI-FA 공중합체의 분자구조, 핵산 물질과 FPEI의 마이셀 복합체의 스퀴징 효과에 의한 온도 감응 약물 방출, 및 FA에 의한 암 세포 표적지향능을 개략적으로 나타내는 개념도의 보여준다.
본 발명에서 상기 PF127-PEI-FA 약물전달체는 온도에 따른 크기, 약물 담지 및 방출 거동, DNA 결합 능력, 표면 전하, 및 암세포 타겟팅 등의 일련의 측정을 수행함으로써 특성 분석되었다. 그 결과, 상기 PF127-PEI-FA 약물전달체가 소수성 약물과 핵산물질의 다중 전달 능력을 갖는 동시에 핵산물질과 엽산에 의한 다중 표적지향능도 갖는 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 온도감응형 약물전달체는 소수성 내핵 내에 소수성 약물을 담지하고 그래프트 중합체성 쉘에 핵산물질이 회합되어 있어 소수성 약물과 핵산물질을 동시에 전달할 수 있는 다중 전달 능력을 나타낼 수 있는 효과가 있다. 또한, 인간을 포함한 항온동물에게 장시간 약물을 효과적으로 전달할 수 있는 약물전달 시스템을 제공할 뿐만 아니라, 동시에 유전자 형질 주입이 가능하므로 고형 종양의 발열 치료법 및 활성 타겟팅 치료법과 같은 의학적인 응용에서 쉬운 조작성 및 향상된 안정성을 제공한다.
도 1a는 분자구조를 포함하는 온도 감응형 FPEI 마이셀 시스템의 개념도이다.
도 1b는 F127 및 FPEI 공중합체에 대한 FT-IR 스펙트럼 분석 결과이다.
도 2a는 상온에서의 F127 및 FPEI 공중합체에 대한 CMC 측정 결과이다. 이때 화살표는 각각의 CMC를 나타낸다.
도 2b는 FPEI, NR이 담지된 FPEI, NR이 담지된 DNA와의 FPEI 복합체의 온도 의존적 크기 측정 결과이다(n=3).
도 3a는 FPEI 마이셀(1, 5, 10 mg/ml)에서의 NR 담지 효율 측정 결과를 나타낸다.
도 3b는 상기 NR 담지 효율에 기초한 25℃, 37℃ 및 40℃에서 FPEI 마이셀 시스템으로부터 방출된 누적 NR 양을 측정한 결과를 나타낸다(n=3).
도 4a는 N/P 비의 증가에 따른 FPEI 공중합체의 DNA 결합 거동을 조사하기 위한 겔 위상차 분석 결과이다.
도 4b는 N/P 비의 증가에 따른 FPEI 공중합체의 DNA 결합 거동을 조사하기 위한 제타 포텐셜 측정 결과이다.
도 5는 37℃ 및 40℃에서 HeLa 세포에 접촉한 F127, FPEI 및 PEI의 시험관내 세포독성 결과이다. 결과 값은 평균 ±SD로 나타냈다(n=5).
도 6은 1시간 및 36시간 배양 후, 37℃ 및 40℃에서 최적화된 FPEI 전달 시스템 하에 GFP 형질주입 및 NR 방출이 처리된 HeLa 세포의 형광 사진이다.
도 7은 PF127-PEI-FA 공중합체의 분자구조, 핵산 물질과 FPEI의 마이셀 복합체의 스퀴징 효과에 의한 온도 감응 약물 방출, 및 FA에 의한 암 세포 표적지향능을 개략적으로 나타내는 개념도의 보여준다.
도 8a는 PF127, FA, PF127-PEI, 및 PF127-PEI-FA 공중합체의 FT-IR 분석 결과이다.
도 8b는 상온에서의 PF127-PEI-FA 공중합체에 대한 CMC 측정 결과이다. 이때 화살표는 CMC를 나타낸다.
도 9a는 NR이 담지된 PF127-PEI-FA 마이셀 및 마이셀 단독의 온도 의존적 크기 측정 결과이다(n=3).
도 9b는 25℃, 37℃ 및 40℃에서 PF127-PEI-FA 마이셀로부터 방출된 누적 NR 양을 측정한 결과를 나타낸다(n=3).
도 10a는 N/P 비의 증가에 따른 DNA-결합된 PF127-PEI-FA 마이셀의 제타 포텐셜 측정 결과이다(n=3).
도 10b는 N/P 비의 증가에 따른 DNA-결합된 PF127-PEI-FA 마이셀의 겔 위상차 분석 결과이다(n=3).
도 11은 37℃에서 HeLa 세포에 접촉한 PF127-PEI-FA 및 PEI의 시험관내 세포독성 결과이다. 결과 값은 평균 ±SD로 나타냈다(n=5).
도 12a는 PF127-PEI-FA의 FR-매개된 세포 흡수의 경쟁적 분석 결과를 나타내는 형광 이미지이다.
도 12b는 NR이 담지된 PF127-PEI-FA와 pGFP의 복합체를 HeLa 세포와 함께 배양한 후 세포의 GFP 발현 및 세포 내부의 NR 방출 거동을 측정한 결과를 나타내는 형광 이미지이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: FPEI 의 합성
1) 4- 니트로페닐 클로로포르메이트를 사용한 플루로닉 F127의 활성화
먼저, Pluronic F127(sigma-Aldrich, USA)을 활성화 시키기 위해 4-나이트로페닐 클로로포르메이트(4-nitrophenyl chloroformate, 4-NPC; Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다.
간략하게 설명하면, 먼저 3 ml 벤젠 중에 용해시킨 F127(1 g)의 용액을 3 ml 벤젠 중의 4-NPC(0.05 g)의 교반 용액에 서서히 첨가하였다. 24시간 교반 후, 상기 반응물을 적어도 2회 이상 석유 에테르의 8배 과량을 사용하여 침전 시키고, 여과하여 침전물을 회수한 후 하룻밤 동안 진공 하에서 잔여 용매를 증발 제거하였다. 파라-니트로페놀레이트(para-nitrophenolate) 이온의 치환 정도는 0.1N NaOH에서 402 nm의 분광광도 측정을 통해 확인하였다.
2) FPEI 의 합성
먼저, 상기 활성화된 F127를, 15 ml의 0.1N NaOH 중의 1.2 g의 PEI(MW: 1,800 Da, Polysciences, Inc. USA)에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 6시간 동안 교반한 후, 탈 이온수에서 3일 동안 3500의 분자량 컷-오프를 갖는 투석막을 통해 정제하고 동결 건조하였다. FPEI 공중합체의 합성은 푸리에-변환 적외선 현미경(FT-IR, Perkin Elmer, Spectrum BXII spectrometer, USA)으로 확인하였다. FPEI 결합물에서 PEI 함량은 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)분석을 통해 계산하였다.
Pluronic F127와의 PEI 결합은 도 1b에서 보여준 것처럼 Pluronic F127과 FPEI 공중합체에 대해 400-4000 cm-1 범위의 FT-IR 스펙트럼으로 분석되었다. FPEI 스펙트럼을 통해 3,450 cm- 1 에서 특유의 아민 (-NH-) 스트레칭과 1,630 cm-1에서 아민 (-NH-) 벤딩을 확인할 수 있어 PEI가 결합되었음을 알 수 있었다. 이는 PEI와 Pluronic F127 간의 공유 결합을 나타낸다. TNBS 분석법에 의해 산출한 FPEI 공중합체의 총 질소 분자의 중량함량은 7.5 %였다.
실험예 1: 자가 조립된 FPEI 공중합체의 임계 마이셀 농도( CMC ) 측정
CMC는 이전에 보고된 방법을 변형하여 측정하였다(S. Seo et al., Carbohydr. Polym., 2012, 87, 1105-1111).
아세톤 중의 나일 레드(Nile Red, NR) 형광체(Sigma-Aldrich, USA) 1 mg/ml 스톡 용액을 준비하고, 사용 전까지 4℃에서 보관하였다. NR은 난 수용성이고 적은 양으로도 강한 형광 강도를 보여줄 수 있다. FPEI 용액은 0.01 mg/ml의 NR을 포함하여 0.0001 mg/ml로부터 1 mg/ml까지의 범위의 농도로 준비하였다. 그 후, 혼합물 용액은 아세톤을 증발시키기 위해 1시간 동안 60℃에서 인큐베이션시키고 마이셀의 평형을 위해 상온에서 1시간 동안 냉각시켰다. 상기 시료를 임의의 유리 NR 염료와 이의 응집물을 제거하기 위해서 0.45 ㎛ 시린지 필터로 여과하고, 형광 플레이트 리더기(Spectramax M2, Molecular Devices, USA)에서 λex=584 nm 및 λem= 612 nm로 상온에서 형광 측정하기 위해 96-웰 플레이트 내에 넣었다. CMC는 농도 의존적 섹션과 농도 비의존적 섹션의 플롯을 피팅하는 두 직선의 교점으로 결정하였다. 외형적인 변화를 보여주는 농도에서 FPEI, NR이 담지된 FPEI, 및 NR이 담지된 FPEI와 DNA의 복합체의 유체역학적 크기는 Zetasizer(Malvern, Worcestershire, UK)를 사용하여 동적 레이저 산란(DLS) 방법으로 측정하였다.
CMC는 수용액 중에서 자가 정렬된 마이셀 응집물의 상대적인 열역학적 안정성을 나타내는 결정 매개 변수이다. 고분자의 CMC는 고분자 농도가 증가함에 따른 형광 측정에 의해 측정된다. 구형의 코어-쉘 구조를 갖는 자기 조립된 마이셀은 CMC 이상에서 형성되고 형광 프로브는 CMC를 측정할 수 있다. FPEI 공중합체의 CMC는 형광 프로브로서 NR 형광체를 사용하는 진보된 방법으로 측정하였다. 도 2a는 공중합체 농도의 함수로서 NR 형광 인덱싱 임의 단위의 형광 강도에 의한 CMC 측정 결과를 보여준다. FPEI와 Pluronic F127의 마이셀 형성은 각각의 CMC를 나타내는 0.013과 0.03 mg/ml 이상의 농도에서 각각 이루어졌다. FPEI 마이셀의 CMC는 Pluronic F127의 CMC보다 대략 2.3배 더 낮았다. 이는 쉘 가교시 콜로이드 안정성의 증가를 보여준다.
그 다음, 유리 FPEI, NR이 담지된 FPEI, 및 NR이 담지된 DNA와 FPEI의 복합체의 유체역학적 크기는 FPEI 마이셀의 온도 감응 거동을 이해하기 위해 증가하는 온도에서 DLS로 측정되었다(도 2b).
온도 의존적 크기 감소는 온도가 증가함에 따라 모든 종류의 시료에서 관찰되었다. FPEI 마이셀의 크기는 상온에서 수백 나노미터으로부터 체온 이상에서 수십 나노미터로 크기가 줄어들었다. 반대로, NR이 담지된 FPEI 마이셀 및 이의 DNA와의 복합체의 크기 감소 정도는 마이셀 코어에 담지된 NR의 존재로 인하여 유리 FPEI 마이셀보다 적었다. 온도 감응 경향은 온도가 증가함에 따라 증가된 소수성 상호작용 및 FPEI 공중합체의 PPO 사슬의 강도에 기인하며, 소수적으로 응축된 마이셀은 효과적으로 NR 분자를 방출할 수 있다.
실험예 2: 열민감성 FPEI 마이셀의 시험관내 약물 담지 효율 및 방출 측정
0.1-10 ㎍/ml 농도 범위의 NR을 포함하는 FPEI 용액(1, 5 및 10 mg/ml)을 NR 담지 효율을 측정하기 위해 준비하였다. 혼합물 용액을 1시간 동안 60℃에서 인큐베이션하고, 마이셀 평형을 위해 상온에서 1시간 동안 냉각한 후, 0.45 ㎛ 시린지 필터로 여과 후 형광 측정을 위해 96-웰 플레이트 내에 넣았다. 담지 효율은 마이셀 용액 중 NR의 형광 강도를 측정하여 분석했다.
온도-의존적인 마이셀 방출 거동을 평가하기 위해, NR 방출 조사를 투석 법을 사용하여 실시하였다. 간략하게, 3 ㎍/ml NR 형광체를 담지한 10 mg/ml의 FPEI 용액을 6 내지 8 kDa의 MWCO를 갖는 D-tubeTM Dialyzer 미니 튜브(EMD Millipore, Damstadt, Germany) 안에 넣었다. 그 후, 각 시료 그룹을 25, 37 및 40℃에서 인큐베이션하고, 주어진 기간의 인큐베이션 시간 후에 NR 추출물을 모으고 새로운 물로 교체했다. 추출물로부터 각 NR 농도는 1% 아세톤에 용해된 분자의 형광 표준곡선에 상응하여 구하였다. 투석 튜브 내 방출되지 않은 NR 함량은 추가적으로 정밀하게 총 NR 양을 분석하기 위해 측정했다. 누적 NR 방출(%)은 공급된 총 NR 양의 중량에 대한 방출된 NR의 중량 비로 계산했다.
주어진 농도 (1, 5 및 10 ㎎/㎖)에서 FPEI 마이셀 내 NR의 담지 효율은 FPEI 마이셀의 소수성 약물 담지 거동을 이해하기 위해 NR 농도의 함수로서 조사하였다. 도 3a는 NR의 최대 유효담지량에 대한 FPEI 농도의 영향을 나타내는 NR 담지 효율을 보여준다. 담지 효율은 FPEI 마이셀이 담지할 수 있는 NR 양의 형광 강도 정량을 통해 구하였다.
상당한 손실 없이 달성할 수 있는 최대 NR 유효담지량은 정제 과정 이후 3-5 ㎍/ml인 것으로 확인되었다. 즉, 가장 우수한 수용성 안정성은 FPEI 시스템 내 NR 유효담지량의 최대로 달성 가능한 농도에서 나타났다. FPEI 마이셀의 NR 담지 효율은 NR 농도 정도(3-5 ㎍/ml)까지 급격하게 향상되었지만, 담지 능력의 한계 때문에 FPEI 마이셀에 담지될 수 없는 수용성 매질 내에서의 불용성 NR 응집물의 침전이 생길 수 있는 농도 이상에서 현저하게 감소했다. 이러한 결과는 FPEI 마이셀의 약물 담지 용량이 최대 약물 유효담지량을 측정하여 얻은 최적의 약물 농도 정도까지 유의적으로 증가하는 것을 나타낸다.
누적 NR 방출 실험을 위하여, NR 담지된 FPEI 마이셀은 NR 담지 효율의 결과에 기초하여 25, 37 및 40℃의 세 지점의 온도에서 인큐베이션하였다. 도 3b는 방출 기간의 함수로서 수용성 매질 내 NR 담지된 FPEI 마이셀의 온도 의존적 방출 거동을 보여준다. 온도의 증가와 함께 FPEI 마이셀로부터 누적 NR 방출이 향상되었다. 이것은 코어 내 PPO 사슬과 NR 사이의 더욱 강한 소수성 상호작용이 더욱 높은 온도에서 마이셀이 더욱 함께 스퀴징(squeezing) 되도록 야기하기 때문이다. 이에 의해 NR 방출이 가속화되는 결과를 가져온다. 이러한 결과는 또한 FPEI 마이셀이 소수성 약물의 온도 감응 전달을 위해 사용될 수 있음을 보여준다.
실험예 3: FPEI 공중합체와 유전자의 복합체 형성 및 분석
플라스미드 DNA와 FPEI의 복합체는 아가로스 겔 이동(agarose gel retardation)에 의해 확인되었다. 7.5까지의 N/P 비 범위의 FPEI/DNA 복합체가 0.1 ㎍/ml의 Red Safe(Intron, South Korea)를 포함하는 1.5% 아가로스 겔에 담지되었다.
DNA 이동 패턴 결과를 UV 조사를 통해 확인하였다. 100까지의 N/P 비 범위의 FPEI/DNA 복합체의 표면 전하를 Zetasizer(Malvern, Worcestershire, UK)를 사용하여 DLS 방법으로 측정하였다.
효율적인 약물 및 유전자 방출을 위해, FPEI 마이셀은 약물을 캡슐화하는 능력과 유전자 복합체를 형성하는 능력을 가져야 한다. 따라서, FPEI와 DNA의 결합능력을 측정하기 위해, NR 담지된 pDNA와 FPEI의 복합체 형성은 아가로스 겔 이동 분석법을 통해 다양한 N/P 비에서 확인하였고(도 4a), 이들의 표면 전하는 제타 포텐셜 측정을 통해 분석하였다(도 4b). 이들 DNA 복합체들은 1.5의 N/P 비에서는 전기영동 되었지만, 3.0의 N/P 비 이상에서는 그렇지 않았다. 마찬가지로, 복합체의 표면 전하는 N/P 비가 증가할수록 증가했다. 이러한 결과는 이들의 DNA 결합능력이 N/P 비가 증가할수록 증가한다는 것을 나타낸다.
실험예 4: FPEI 마이셀의 세포독성 분석
FPEI 공중합체의 시험관내 세포독성 조사를 위해, 인간 자궁경부 암세포주(HeLa)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 입수하였다. 모든 세포는 5% CO2의 대기에서 37℃로 10% 우태아혈청(FBS, Gibco, USA)과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에서 유지되었다. 배지는 정기적으로 교체되었고 세포는 합류 지점에서 계대 되었다. 세포는 96-웰 플레이트에 웰당 5 x 103 세포 밀도로 100 ㎕ 배양 배지와 함께 접종하였고 24시간 동안 배양되었다. 멸균된 F127, FPEI 및 PEI 시료를 다양한 농도로 플레이트의 각 웰에 첨가하였고, 37℃와 40℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 40℃에서 인큐베이션시킨 플레이트는 37℃ 인큐베이터에 넣었다. 시료의 처리 후 48시간째에 배양 배지는 10% 세포 카운팅 키트-8 (CCK-8, Dojindo, Japan) 용액을 포함하는 새로운 배지로 교체되었고 37℃에서 추가적으로 4시간 동안 인큐베이션시켰다. CCK-8 처리 종점에서 각 세포 배양 상층액의 100 ㎕ 앨리쿼트를 수집하고, iMark 마이크로플레이트 리더기(BioRad, USA)를 사용하여 450 nm로 측정했다.
CCK-8 분석법은 도 5에서 보여주는 것처럼 37℃ 및 40℃에서 HeLa 세포의 넓은 농도 범위에 대한 FPEI 마이셀의 시험관내 세포독성을 평가하기 위해 활용됐다. 1 시간 후, 두 플레이트는 37℃에서 이틀 동안 인큐베이션시켰다. 배양된 두 플레이트는 F127 세포독성 결과와 비교하여, 대략 250 ㎍/ml 이하의 FPEI 시료에서는 세포 독성이 나타나지 않았으나, 그 이상에서는 세포독성을 보여주기 시작했다. 또한, 두 온도에서 모두 비슷한 경향을 보였다. 이 결과는 배양 온도보다, F127이 컨쥬게이트된 PEI의 아민기에 의해 발생 된 것으로 보였다. 따라서, PEI 단독 세포독성 실험은 FPEI 공중합체에 포함된 PEI의 농도와 동일한 농도 범위인 0.5-50 ㎍/ml 범위에서 수행했다. 그 결과, PEI 세포독성은 FPEI 시료에서 보여준 결과와 유사한 경향을 보였다. 이는 CMC로부터 대략 250 ㎍/ml까지의 FPEI 마이셀의 농도 범위가 시험관내 전달에 사용되는데 안전할 것을 시사한다.
실험예 5: 시험관내 세포 감염 및 온도-의존적 약물 방출 분석
세포는 웰 당 2.5 x 104 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 0.5 ml씩 접종되었다. 플라스미드 녹색형광단백질(GFP) (1 ㎍)을 NR(5 ng) 담지된 FPEI 마이셀(0.04 mg) 내로 첨가하고, 30분 동안 상온에서 인큐베이션시켰다. 그 후, 상기 복합체를 각 웰로 첨가하고 37℃와 40℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 40℃에서 인큐베이션된 플레이트는 37℃ 인큐베이터에 넣었다. 시료 처리 후 최대 36시간까지 배양 배지는 새로운 배지로 교체되었고, 세포는 도립형광현미경(IX-71, Olympus, Japan)에 의해 관찰되었다.
예비 실험으로부터 가장 우수한 유전자 형질주입을 위한 최적의 N/P 비가 20-30인 것으로 확인되었으며(데이터 미도시), 37℃와 40℃ 사이에서 염색 차이가 나는 NR 농도는 FPEI 시스템에서 약 10 ng/ml인 것으로 확인되었다. 따라서, pGFP (1 ㎍)가 5 ng NR 담지된 FPEI 마이셀 (80 ㎍/ml) 내에 첨가되고, 안정적인 유전자 복합체를 형성하기 위해 30분 동안 인큐베이션되었다. 그 후, 복합체는 HeLa 세포가 있는 플레이트로 첨가됐다. 전달 1시간 후에, 소수의 빨간 형광을 띄는 세포들이 40℃의 배양조건에서는 약하게 관찰되었지만, 같은 노출 시간에도 불구하고 37℃에서는 관찰되지 않았다(도 6). 그러나, 36시간째에 각각 NR-염색 및 GFP 발현을 나타내는 붉은색과 녹색 형광 강도는 두 배양온도 사이에서 거의 비슷하게 되었다. 이러한 결과는 누적 NR 방출 실험과 일치하는 결과로서 FPEI 시스템이 세포 내로 온도 감응 NR 방출을 일으키면서 더불어 FPEI 공중합체의 PEI에 의한 엔도시토시스(endocytosis) 작용에 따라 pGFP 형질주입이 가능하다는 것을 나타낸다.
실시예 2: PF127 - PEI - FA 의 합성
1) 4- 니트로페닐 클로로포르메이트(4-NPC)를 사용한 플루로닉 PF127 의 활성화
먼저, Pluronic F127(sigma-Aldrich, USA)을 활성화 시키기 위해 4-나이트로페닐 클로로포르메이트(4-nitrophenyl chloroformate, 4-NPC; Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다.
간략하게 설명하면, 먼저 3 ml 벤젠 중에 용해시킨 F127(1 g)의 용액을 3 ml 벤젠 중의 4-NPC(0.05 g)의 교반 용액에 서서히 첨가하였다. 24시간 교반 후, 상기 반응물을 적어도 2회 이상 석유 에테르의 8배 과량을 사용하여 침전 시키고, 여과하여 침전물을 회수한 후 하룻밤 동안 진공 하에서 잔여 용매를 증발 제거하였다. 파라-니트로페놀레이트(para-nitrophenolate) 이온의 치환 정도는 0.1N NaOH에서 402 nm의 분광광도 측정을 통해 확인하였다.
2) PF127 - PEI 및 PF127 - PEI - FA 의 합성
PF127-PEI 및 PF127-PEI-FA는 이전에 보고된 방법을 수정하여 합성하였다. 간략하게 설명하면, 먼저 상기 단계 1에서 활성화 된 PF127 (600 mg)을 15 ml의 0.1N NaOH 중의 1.2 g의 PEI(MW: 1,800 Da, Polysciences, Inc. USA)에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 상온에서 6시간 동안 교반한 후, 탈 이온수에서 3일 동안 3500의 분자량 컷-오프를 갖는 투석막을 통해 정제하고 동결 건조하였다. 결합된 PEI 함량은 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS) 분석을 통해 계산하였다. TNBS 분석으로 계산된 PF127-PEI 공중합체의 대비 전체 아민기의 중량 비는 12%였다.
PF127-PEI (500 mg)은 500 ml의 MES 버퍼(0.1 M)에 용해시켰다. 격렬한 교반 하에, 3 ml의 다이메틸 설폭시드(DMSO) 중의 FA (0.1 mmol, 50 mg)를 떨어뜨려 첨가하고, FA에 대한 EDC 및 NHS의 등분자량을 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물은 실온에서 24시간 동안 자력 교반하였고, 상기 설명된 바와 같은 투석 방법으로 정제하여 PF127-PEI-FA를 얻었다. 50% DMSO에서 300 nm의 특이적 UV 흡수파장으로 측정된 PF127-PEI-FA 중의 FA의 중량은 0.8%였다. 합성된 PF127-PEI-FA는 푸리에-변환 적외선 현미경(FT-IR, Perkin Elmer, Spectrum BXII spectrometer, USA)으로 확인하였다.
도 8a는 FA, PF127-PEI, 및 PF127-PEI-FA의 성공적인 합성을 보여주는 FT-IR 스펙트럼이다. PF127-PEI-FA 스펙트럼에서 PEI 아민기에 해당하는 3450 cm-1에서의 아민(-NH-) 스트레칭 및 1560-630 cm-1에서의 아민(-NH-) 벤딩이 나타났다. 이는 PF127뿐 아니라 FA와 PEI의 공유적인 컨쥬게이션을 암시한다.
실험예 6: 자가 조립된 PF127 - PEI - FA 의 임계 마이셀 농도( CMC ) 측정
CMC는 이전에 보고된 방법을 변형하여 하기와 같이 측정하였다(S. Seo et al., Carbohydr. Polym., 2012, 87, 1105-1111).
먼저, 아세톤 중의 0.5 mg/ml의 나일 레드(Nile Red, NR) 형광체(Sigma-Aldrich, USA) 스톡 용액을 준비하고, 사용 전까지 4℃에서 보관하였다. NR은 난 수용성이고 적은 양으로도 강한 형광 강도(FI)를 보여줄 수 있다. 0.0001 mg/ml부터 1 mg/ml까지 범위의 PF127-PEI-FA 용액을 CMC 측정을 위해 준비하였다. 이들 중합체 용액에 NR을 마지막 농도가 5 ㎍/ml가 되도록 첨가하였다. 혼합물 용액은 아세톤을 증발시키기 위해 10분 동안 60℃에서 인큐베이션시키고, 1분 동안 10,000 rpm으로 원심분리 시켰다. 상기 분리된 혼합물은 형광 플레이트 리더기(Spectramax M2, Molecular Devices, USA)에서 λex=584 nm 및 λem= 612 nm로 상온에서 형광 측정하기 위해 96-웰 플레이트 내에 넣었다. CMC는 농도 의존적 섹션과 농도 비의존적 섹션의 플롯을 피팅하는 두 직선의 교점으로 결정하였다.
코어-쉘 구조를 가진 자가 조립된 PF127-PEI-FA 공중합체 마이셀은 CMC 이전에 형성된다. CMC는 수용성 매질에서 마이셀의 콜로이드적인 안정성을 나타내는 중요한 파라미터이며, 마이셀 용액에서 NR 형광의 형광 측정은 NR이 담지된 마이셀의 농도가 증가할 때, CMC를 확인할 수 있다. 도 8b는 공중합체 농도의 함수로서, NR의 FI 플롯을 피팅하는 두 직선의 교점을 확인하여 PF127-PEI-FA의 CMC가 0.11 mg/ml인 것을 보여준다. PF127-PEI-FA 공중합체의 마이셀 형성은 농도 의존적으로 형성되는 PF127 삼중블록 공중합체의 특이적 특성에 기인한다.
실험예 7: PF127 - PEI - FA 마이셀의 유체역학적 크기 및 온도의존적 약물방출 거동 측정
외형적인 변화를 보여주는 PF127-PEI-FA 및 약물이 담지된 PF127-PEI-FA의 유체역학적(hydrodynamic) 크기는 Zetasizer(Malvern, Worcestershire, UK)를 사용하여 동적 레이저 산란(DLS) 방법으로 측정하였다.
PF127-PEI-FA 마이셀에서 온도 의존적으로 방출되는 약물의 모델로 방출된 NR의 λex=584 nm 및 λem= 612 nm에서의 형광 강도를 측정하여 인산완충식염수(PBS)에서 투석(dialysis) 방법으로 모니터링하였다. 간략하게 5 ㎍/ml 농도 범위의 NR을 25 mg/ml의 PF127-PEI-FA PBS용액에 담지하였다. 담지된 마이셀 용액은 6 내지 8 kDa의 MWCO를 갖는 D-tubeTM Dialyzer 미니 튜브(EMD Millipore, Damstadt, Germany) 안에 밀봉하였다. 각 투석 튜브는 0.5 ml의 PBSL에 담가서, 25, 37 및 40℃에서 인큐베이션하였다. 원하는 시간 간격에서, NR의 FI 값을 위해 상기 추출물를 꺼내고, 각 튜브는 동량의 새로운 PBS로 교체하였다. 추출물에서 NR의 방출 퍼센트를 확인하기 위하여, 투석 튜브의 잔류 NR의 FI을 측정하고, NR의 누적 방출(%)은 공급된 총 NR 양의 중량에 대한 방출된 NR의 중량 비로서 계산했다.
온도 의존적으로 약물이 담지되지 않은, 그리고 약물이 담지된 PF127-PEI-FA 마이셀의 유체역학적 크기는 열에 반응하는 마이셀의 거동을 확인하기 위해 DLS 방법으로 측정되었다(도 9a). 마이셀의 크기에서 온도 의존적 감소는 약물의 담지 여부 없이 모든 마이셀에서 모니터링되었다. 상온에서 약물이 담지되지 않은, 그리고 약물이 담지된 PF127-PEI-FA 마이셀의 크기는 대략 400 nm였지만, 생체온도에서 각각 대략 35 nm 및 220 nm 로 감소하였다. 생체 온도에서 약물이 담지된 마이셀의 크기는 마이셀의 코어에 담지된 약물의 존재때문에, 약물이 담지되지 않은 마이셀에 비해 6배 더 컸다. 약물이 담지되지 않은 마이셀의 크기는 실온에서 40℃ 가까이로 갈 때 가파르게 감소하였다. 이것은 PF127 공중합체의 단단한 PPO 체인들 사이에 소수성 상호작용이 온도 의존적으로 증가했기 때문이다. 이러한 이유로, PF127-PEI-FA 마이셀은 열에 반응하는 약물 방출 거동을 갖을 수 있다. 그 결과로, 약물이 담지된 마이셀의 크기 변화는 앞서 설명된 것처럼 점차 감소된다.
약물 모델로서 NR은 PF127-PEI-FA 공중합체 안에 담지되고 온도의존적 방출 거동은 투석법으로 조사하였다. 도 9b는 3일 동안 PF127-PEI-FA로부터 NR의 온도 의존적 방출 프로파일을 보여준다. NR의 더 높은 방출율은 12시간까지 25, 37, 40℃에서 관찰되었고, 이후, 방출율은 감소하기 시작했다. 이러한 방출 프로파일은 주로 마이셀의 캐리어/약물 상호작용에 기인한다. 즉, 마이셀 담체는 NR을 포함 할 수 있는 소수성 코어를 가지고 있다. NR의 최종 방출량은 25, 37, 및 40℃에서 각 대략 49%, 54%, 및 65%였다. 고온에서 더 높은 방출을 보이는 이유 중에 하나는 마이셀 코어에서 온도에 반응하여 단단한 PPO 체인 간에 소수성 상호작용의 증가한 결과로써 PF127-PEI-FA 마이셀의 스퀴징(squeezing) 효과가 증가했기 때문이다. 상기 결과는 PF127-PEI-FA 마이셀이 온도가 증가함에 따라 더 컴팩트 해지기 때문으로 보여진다.
실험예 8: PF127 - PEI - FA 공중합체와 유전자의 복합체 형성 확인
플라스미드 pDNA와 PF127-PEI-FA의 복합체는 아가로스 겔 이동(agarose gel retardation) 및 제타 포텐셜 분석으로 확인하였다. 5까지의 N/P 비 범위에서 PF127-PEI-FA/pDNA 복합체가 0.1 ㎍/ml의 Red Safe(Intron, South Korea)를 포함하는 1.5% 아가로스 겔에 담지되었다. 상기 pDNA 이동 패턴 결과를 UV 조사를 통해 확인하였다. 5까지의 N/P 비 범위에서 PF127-PEI-FA/pDNA 복합체의 표면 전하를 Zetasizer(Malvern, Worcestershire, UK)를 사용하여 DLS 방법으로 측정하였다.
PF127-PEI-FA 공중합체의 DNA 결합 능력을 확인하기 위하여, 다양한 N/P 비율에서 공중합체 마이셀과 DNA 복합체는 제타 포텐셜 측정으로 분석하였고(도 10a), 아가로스 겔 이동 분석을 하였다(도10b). DNA가 담지된 마이셀 입자의 제타 포텐셜은 N/P 비율이 증가함에 따라 증가하였다. PF127-PEI-FA와 pDNA의 복합체는 N/P 비율 2에서 전기영동되어 내려갔지만, pDNA가 PF127-PEI-FA 공중합체에 의해 지연된 N/P 비율 5에서는 내려가지 않았다. 상기 결과는 PF127-PEI-FA 공중합체에서 PEI 부분의 DNA 결합 능력이 N/P 비율이 증가함에 따라 증가함을 보여준다.
실험예 9: PF127 - PEI - FA 공중합체의 세포독성 분석
PF127-PEI-FA 공중합체의 시험관내 세포독성 연구를 위해, 인간 자궁경부 암세포 주(HeLa)는 ATCC(Rockville, MD, USA)로부터 입수하였다. 모든 세포는 5% CO2의 대기에서 37℃로 10% 우태아혈청(FBS, Gibco, USA)과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에서 유지되었다. 배지는 정기적으로 교체되었고 세포는 합류 지점에서 계대 되었다. 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 5 x 103 세포 밀도로 100 ㎕ 배양 배지와 함께 접종하였고, 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 멸균된 PF127-PEI-FA 및 PEI 시료를 다양한 농도로 플레이트의 각 웰에 첨가하였고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 플레이트를 PBS로 세척 후에, 배양 배지는 10% 세포 카운팅 키트-8 (CCK-8, Dojindo, Japan) 용액을 포함하는 새로운 배지로 교체되었고 37℃에서 추가적으로 4시간 동안 인큐베이션시켰다. CCK-8 처리 종점에서, iMark 마이크로플레이트 리더기(BioRad, USA)를 사용하여 450 nm로 측정했다.
CCK-8 분석은 PF127-PEI-FA 공중합체 및 PEI에 노출된 HeLa 세포의 시험관내 독성을 평가하기 위해 37℃에서 24시간 동안 수행하였다(도 11). 40℃에서 같은 시료를 사용하여 세포 독성 테스트를 수행하였지만 37℃에서의 시료와 큰 차이가 없었다(데이터 미도시). 따라서, 이후 실험은 37℃에서의 시료에 대한 세포독성 분석에 초점을 두었다. 시료의 농도가 증가함에 따라, PF127-PEI-FA의 세포 생존력은 약간 떨어졌다. 이것은 PEI 부분의 독성 아민기 때문일 가능성이 있다. PEI의 독성 효과를 이해하기 위해, PF127-PEI-FA의 PEI 부분과 같은 PEI 함량으로 HeLa 세포에 테스트하였다. 그 결과, PF127-PEI-FA와 유사한 경향이 나타났지만, PEI의 독성이 조금 더 심각했다. 이는 PEI 독성이 생체적합한 PF127에 결합함으로써 향상될 수 있음을 나타낸다.
실험예 10: PF127 - PEI - FA 마이셀의 암세포를 타겟팅한 플라스미드 녹색형광 발현 및 온도 의존적 약물 방출 거동 측정
세포를 웰 당 2.5 x 104 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 0.5 ml씩 접종시켰다. 세포 표면에 FR의 추가적인 활성을 위해, 세포를 FA(0.1 mM)을 포함하는 배양 배지에서 3번 계대 배양시키고, FA가 없는 배양 배지에서 2번 계대 배양시켜 세포 표면에 FR의 과발현을 확인하였다. FR이 블락된 HeLa 세포는 PF127-PEI-FA와 pGFP 복합체의 운반 전에 6시간째에 1 mM의 free FA로 세포를 예비 인큐베이션함으로써 준비하였다. pGFP (5 ㎍)을, PF127-PEI-FA (60 ㎍)을 포함하는 20 ㎕의 PBS 용액에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 pGFP가 담지된 PF127-PEI-FA와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 플레이트는 새로운 배지로 교체하였다. FA가 결핍된 HeLa 세포의 pGFP 발현 및 FR이 블락된 HeLa 세포는 운반 후, 24시간째에 형광현미경(IX-71, Olympus, Japan)에 의해 관찰되었다.
온도에 의존한 약물 방출 및 유전자 발현을 위해, pGFP (2.5 ㎍)를 NR (0.5 ng)이 담지된 PF127-PEI-FA (50 ㎍)의 PBS 용액으로 30분 동안 인큐베이션 시켰고, HeLa 세포는 37℃ 및 40℃에서 4시간 동안 복합체로 배양하였다. 이어서, 40℃에서 인큐베이션시킨 플레이트는 다시 37℃ 인큐베이터에 넣었다. 운반 후 24시간째에, 세포는 도립형 형광 현미경으로 관찰하였다.
pGFP가 담지된 PF127-PEI-FA 공중합체에 의한 HeLa 세포의 FR이 영향을 주는 유전자 형질전환은 경쟁적 저해 분석으로 조사하였다. 형질전환에 앞서, 과발현된 FR과 함께 HeLa 세포를 free FA가 있는 배지 또는 없는 배지에서 인큐베이션시켰다. 37℃에서 세포를 24시간 배양 후에, 형질 전환된 세포는 도립형 형광 현미경을 통해 관찰되었다. free FA가 있거나 없는 상태로 배양된 세포의 형광 이미지는 도 12a에 보여주었다. 처리되지 않는 HeLa 세포에서 녹색 형광은 free FA와 함께 배양된 세포보다 더 강하게 나타났다. 이는 처리되지 않은 세포에서 GFP의 발현수준이 FR이 블락된 세포보다 더 높음을 나타낸다. 적은 GFP 발현은 FR이 과발현된 세포 표면이 FR과 경쟁적으로 결합할 수 있는 1 mM의 free FA와 예비 배양한 세포에 의해 블락되었으며, PF127-PEI-FA 공중합체의 FR 의존적 세포 흡수 효과는 FA의 경쟁적 저해에 의해 낮아질 수 있다. 이런 이유로, FR이 블락된 세포에서 GFP의 발현은 정상적으로 FR이 과발현된 세포보다 더 약했다. 결론적으로, FA를 결합시킨 마이셀 복합체가 FR이 영향을 주는 흡수를 통하여 세포 안으로 이동하였다. FR이 영향을 주는 세포 흡수가 본 발명에서 사용된 FA 컨쥬게이션된 캐리어에 의해 수행되었음을 알 수 있다.
NR이 담지된 PF127-PEI-FA와 pGFP의 복합체는 HeLa 세포와 함께 37℃ 및 40℃에서 4시간 동안 배양되었고, 이어서 40℃에서 인큐베이션된 플레이트는 다시 37℃ 인큐베이터에 넣었다. 운반 후 24시간째에, 세포의 GFP 발현 및 세포 내부의 NR 방출은 형광 현미경으로 관찰했다(도 12b). GFP 발현에 최적화된 N/P 비율은 약 10 내지 20으로 나타났다. 40?에서 배양된 세포의 GFP 발현을 나타내는 녹색 형광 및 세포 내부의 NR 방출을 나타내는 빨간 형광은 37℃에서 배양했을 때와 약간의 차이가 있었다. 이는 24시간 동안 37 및 40℃에서의 NR 방출이 누적 NR 방출에 걸친 상당한 세포 내 분산에 기여하였기 때문으로 보였다. 비록 온도 감응된 방출 프로파일이 시험관 내 방출로 얻어졌더라도, 두 온도 사이에 HeLa 세포 내 NR 분산에 대한 작은 차이를 관찰하기 어렵다. 그러나, 상기 결과를 통해 PF127-PEI-FA 공중합체 마이셀에 대한 치료적 약물 및 유전자의 이중 전달체로서의 가능성을 확인할 수 있다.

Claims (16)

  1. 소수성 중합체성 블록, 친수성 중합체성 블록 및 그래프트 중합체성 블록을 포함하는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체에 있어서,
    상기 마이셀이 소수성 내핵, 친수성 외핵 및 그래프트 중합체성 쉘을 갖고, 상기 소수성 내핵에 소수성 약물이 담지되어 있으며, 상기 그래프트 중합체성 쉘에 핵산 물질이 회합되어 있어, 약물 및 핵산물질의 다중전달능을 나타내며,
    상기 다중블록 공중합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것인 약물 전달체:
    [화학식 1]
    Figure 112014094096311-pat00013

    상기 식에서,
    n은 2 내지 130의 정수이고,
    m은 15 내지 67의 정수이고,
    p는 1 내지 100의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약물 전달체는 35℃ 내지 45℃ 온도 범위에 감응하여 마이셀 내핵과 소수성 약물의 소수성 상호작용에 의해 마이셀이 스퀴징되어 약물 방출 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 소수성 약물은 증식억제 또는 화학치료 약물, 진통제, 항염증제, 구충제, 항부정맥제, 항세균제, 항바이러스제, 항응고제, 우울증치료제, 당뇨병치료제, 간질치료제, 항곰팡이제, 항통풍제, 고혈압치료제, 말라리아치료제, 편두통 치료제, 항-무스카린제, 항신생물제, 발기부전 개선제, 면역억제제, 항원충제, 갑상선 치료제, 항불안제, 진정제, 최면제, 신경이완제, β-차단제, 강심제, 코르티코스테로이드, 이뇨제, 파킨슨병치료제, 위장관제, 히스타민 수용체 길항제, 각질용해제, 지질 조정제, 협심증 치료제, Cox-2 억제제, 류코트리엔 억제제, 매크로라이드, 근육이완제, 영양제, 마약성 진통제, 단백질분해제 억제제, 성호르몬, 자극제, 근육 이완제, 항삼투제, 비만치료제, 인지기능 항진제, 요실금치료제, 양성 전립선 비대 치료제, 필수 지방산 및 비-필수 지방산으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 핵산 물질은 RNA, DNA, 플라스미드 DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme), 미스센스 뉴클레오티드, 단백질생산 뉴클레오티드 및 단백질 또는 핵산의 생산속도제어용 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약물 전달체는 소수성 내핵 내에 담지되어 있는 소수성 약물을 전달하는 역할을 하면서 동시에 상기 그래프트 중합체성 쉘에 회합되어 있는 핵산 물질에 의한 표적 지향 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  6. 하기 단계를 포함하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 약물 전달체의 제조방법:
    하기 화학식 2로 표시되는 중합체를 4-니트로페닐 클로로포르메이트와 반응시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 중합체를 제조하는 단계(단계 1);
    상기 화학식 3으로 표시되는 중합체를 하기 화학식 4로 표시되는 중합체와 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체를 제조하는 단계(단계 2);
    상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체를 물에 첨가하여 마이셀을 형성시켜 마이셀을 포함하는 수분산액을 얻는 단계(단계 3);
    상기 마이셀을 포함하는 수분산액에 소수성 약물을 첨가하고 교반하는 단계(단계 4); 및
    상기 단계 4)의 교반액에 핵산 물질을 첨가하고 인큐베이션시키는 단계(단계 5).
    [화학식 1]
    Figure 112014094096311-pat00014

    [화학식 2]
    Figure 112014094096311-pat00015

    [화학식 3]
    Figure 112014094096311-pat00016

    [화학식 4]
    Figure 112014094096311-pat00017

    상기 식에서,
    n은 2 내지 130의 정수이고,
    m은 15 내지 67의 정수이고,
    p는 1 내지 100의 정수이다.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단계 3)의 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 농도는 0.013 mg/ml 내지 1.3 mg/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 단계 3)의 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 농도는 0.013 mg/ml 내지 1.3 mg/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 단계 5)에서 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체와 핵산 물질의 N/P 비는 3 내지 30인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 소수성 중합체성 블록, 친수성 중합체성 블록, 그래프트 중합체성 블록 및 표적화 블록을 포함하는 다중블록 공중합체가 형성하는 마이셀을 포함하는 약물 전달체에 있어서,
    상기 마이셀이 소수성 내핵, 친수성 외핵 및 그래프트 중합체성 쉘을 갖고, 상기 그래프트 중합체성 쉘의 외부에 상기 표적화 블록이 위치하고, 상기 소수성 내핵에 소수성 약물이 담지되어 있으며, 상기 그래프트 중합체성 쉘에 핵산 물질이 회합되어 있어, 약물 및 핵산물질의 다중전달능 및 표적화능을 나타내며,
    상기 다중블록 공중합체는, 하기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체의 1차 아민기에 하나 이상의 엽산이 결합되어 있는 것인 약물 전달체:
    [화학식 1]
    Figure 112014094096311-pat00018

    상기 식에서,
    n은 2 내지 130의 정수이고,
    m은 15 내지 67의 정수이고,
    p는 1 내지 100의 정수이다.
  11. 제10항에 있어서, 상기 소수성 약물은 증식억제 또는 화학치료 약물, 진통제, 항염증제, 구충제, 항부정맥제, 항세균제, 항바이러스제, 항응고제, 우울증치료제, 당뇨병치료제, 간질치료제, 항곰팡이제, 항통풍제, 고혈압치료제, 말라리아치료제, 편두통 치료제, 항-무스카린제, 항신생물제, 발기부전 개선제, 면역억제제, 항원충제, 갑상선 치료제, 항불안제, 진정제, 최면제, 신경이완제, β-차단제, 강심제, 코르티코스테로이드, 이뇨제, 파킨슨병치료제, 위장관제, 히스타민 수용체 길항제, 각질용해제, 지질 조정제, 협심증 치료제, Cox-2 억제제, 류코트리엔 억제제, 매크로라이드, 근육이완제, 영양제, 마약성 진통제, 단백질분해제 억제제, 성호르몬, 자극제, 근육 이완제, 항삼투제, 비만치료제, 인지기능 항진제, 요실금치료제, 양성 전립선 비대 치료제, 필수 지방산 및 비-필수 지방산으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  12. 제10항에 있어서, 상기 핵산 물질은 RNA, DNA, 플라스미드 DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme), 미스센스 뉴클레오티드, 단백질생산 뉴클레오티드 및 단백질 또는 핵산의 생산속도제어용 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  13. 제10항에 있어서, 상기 약물 전달체는 소수성 내핵 내에 담지되어 있는 소수성 약물을 전달하는 역할을 하면서 동시에, 상기 그래프트 중합체성 쉘에 회합되어 있는 핵산 물질에 의한 표적 지향 특성과 상기 표적화 블록에 의한 표적 지향 특성을 포함하는 다중 표적 지향 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
  14. 하기 단계를 포함하는 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 약물 전달체의 제조방법:
    하기 화학식 2로 표시되는 중합체를 4-니트로페닐 클로로포르메이트와 반응시켜 하기 화학식 3으로 표시되는 중합체를 제조하는 단계(단계 1a);
    상기 화학식 3으로 표시되는 중합체를 하기 화학식 4로 표시되는 중합체와 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체를 제조하는 단계(단계 2a);
    상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체를 엽산과 반응시키는 단계(단계 2b);
    상기 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체를 물에 첨가하여 마이셀을 형성시켜 마이셀을 포함하는 수분산액을 얻는 단계(단계 3a);
    상기 마이셀을 포함하는 수분산액에 소수성 약물을 첨가하고 교반하는 단계(단계 4a); 및
    상기 단계 4a)의 교반액에 핵산 물질을 첨가하고 인큐베이션시키는 단계(단계 5a).
    [화학식 1]
    Figure 112014094096311-pat00019

    [화학식 2]
    Figure 112014094096311-pat00020

    [화학식 3]
    Figure 112014094096311-pat00021

    [화학식 4]
    Figure 112014094096311-pat00022

    상기 식에서,
    n은 2 내지 130의 정수이고,
    m은 15 내지 67의 정수이고,
    p는 1 내지 100의 정수이다.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단계 3a)의 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체의 농도는 0.11 mg/ml 내지 2 mg/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 단계 5a)에서 상기 엽산이 결합되어 있는 다중블록 공중합체와 핵산 물질의 N/P 비는 5 내지 30인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020140132511A 2014-10-01 2014-10-01 핵산 물질 및 약물의 다중 전달을 위한 온도 감응형 마이셀을 포함하는 약물 전달체 및 이의 제조방법 KR101570300B1 (ko)

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