DE102022202099B3

DE102022202099B3 - Gemisch, wässrige lösung enthaltend das gemisch und verwendungen der wässrigen lösung

Info

Publication number: DE102022202099B3
Application number: DE102022202099.5A
Authority: DE
Inventors: Raphael Thiermann; Regina Bleul; Ruben Rosencrantz; Sany Chea
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2022-03-01
Filing date: 2022-03-01
Publication date: 2023-08-24
Anticipated expiration: 2042-03-02
Also published as: WO2023165904A1

Abstract

Es wird ein Gemisch bereitgestellt, das ein erstes Polymer und ein zweites Polymer enthält. Das erste Polymer und zweite Polymer weisen jeweils mindestens sechs Nukleobasen auf, wobei je eine Nukleobase kovalent mit je einem Monomer des jeweiligen Polymers verbunden ist. Die mindestens sechs Nukleobasen des zweiten Polymers sind zu den mindestens sechs Nukleobasen des ersten Polymers komplementär. Die beiden Polymere sind über ihre zueinander komplementären Nukleobasen dazu geeignet, bei einer Temperatur von ≤ 37°C zu Mizellen oder Vesikeln (bevorzugt zu Vesikeln) zu assemblieren und bei einer Temperatur von > 37°C nicht zu Mizellen und nicht zu Vesikeln zu assemblieren. Erfindungsgemäß wird ferner eine wässrige Lösung enthaltend das erfindungsgemäße Gemisch bereitgestellt und Verwendungen der wässrigen Lösung vorgeschlagen.

Description

Es wird ein Gemisch bereitgestellt, das ein erstes Polymer und ein zweites Polymer enthält. Das erste Polymer und zweite Polymer weisen jeweils mindestens sechs Nukleobasen auf, wobei je eine Nukleobase kovalent mit je einem Monomer des jeweiligen Polymers verbunden ist. Die mindestens sechs Nukleobasen des zweiten Polymers sind zu den mindestens sechs Nukleobasen des ersten Polymers komplementär. Die beiden Polymere sind über ihre zueinander komplementären Nukleobasen dazu geeignet, bei einer Temperatur von ≤ 37°C zu Mizellen oder Vesikeln (bevorzugt zu Vesikeln) zu assemblieren und bei einer Temperatur von > 37°C nicht zu Mizellen und nicht zu Vesikeln zu assemblieren. Erfindungsgemäß wird ferner wird eine wässrige Lösung enthaltend das erfindungsgemäße Gemisch bereitgestellt und Verwendungen der wässrigen Lösung vorgeschlagen.
Eine temperaturgesteuerte Freisetzung von Stoffen kann in vielen Anwendungsfeldern eine wichtige Rolle spielen. Diese reichen von medizinischen Anwendungen (z.B. der Tumorbehandlung) über kosmetische Anwendungen bis hin zu technischen Prozessen zur Freisetzung von Kühl- oder Schmiermitteln.
Stimuli-responsive Wirkstoffträgersysteme sollen helfen, ihren Wirkstoff in einer räumlich-, zeitlich- und Dosis-kontrollierten Weise freizusetzen. Die Steuerung der Freisetzung kann dabei endogen erfolgen, d.h. durch Gegebenheiten am Zielort (z.B. pH, Enzymkonzentrationen, Redoxgradienten) ausgelöst werden oder exogen erfolgen, d.h. durch einen externen Stimulus ausgelöst werden (z.B. Temperaturänderung, Magnetfeld, Ultraschall, Lichtbehandlung).
Thermoresponsive Systeme basieren im Allgemeinen auf einer temperaturabhängigen, möglichst scharfen, nicht-linearen Änderung der physikochemischen Eigenschaften von mindestens einer Komponente des Trägermaterials, die zur Freisetzung des eingeschlossenen Wirkstoffs führt.
Im Stand der Technik sind polymerbasierte, thermoresponsive Wirkstofftransporter basierend auf sog. UCST-Polymeren (engl:. upper critical solution temperature polymers) bekannt. Das UCST-Polymer Poly-2-oxazoline ist prinzipiell für den Wirkstofftransport einsetzbar, eignet sich jedoch nicht für eine gezielte Wirkstofffreisetzung in Lebewesen, die eine Körpertemperatur von 37°C aufweisen, da dessen Schalttemperatur (Freisetzungstemperatur) bereits bei 30°C liegt (Hoogenboom, R. et al., Soft Matter, 2009, Bd. 5, S. 3590-3592).. Vom UCST-Polymer Poly(AAm-co-AN)-g-PEG) ist bekannt, dass es in wässriger Lösung Vesikel ausbildet, die mit dem Wirkstoff Doxorubicin beladen werden können. Die Vesikel weisen jedoch eine temperaturabhängige Freisetzung von Doxorubicin in einem sehr breiten Temperaturbereich zwischen 4°C und 43°C auf, wodurch diese ebenfalls nicht zur gezielten Wirkstofffreisetzung in Lebewesen geeignet sind, die eine Körpertemperatur von 37°C aufweisen (Li, W.S. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2015, Bd. 54, S. 3126-3131).
Mit den bekannten UCST-Polymersystemen ist bislang keine präzise Einstellung einer scharfen Schaltgrenze möglich, um ein sicheres und empfindliches Freisetzungsverhalten unter in-vivo-Bedingungen zu erzielen.
Idealerweise sollte bei thermoresponsiven Systemen als Wirkstoffträger die Schalttemperatur sehr nah oberhalb der physiologischen Körpertemperatur von 37°C liegen, so dass keine unspezifische Freisetzung im gesunden Gewebe, d.h. bereits bei 37°C, erfolgt. Andererseits sollte jedoch idealerweise bereits eine geringe lokale Temperaturerhöhung um wenige Kelvin (z.B. auf ca. 40-42 °C) ausreichen, um die Wirkstofffreisetzung zu induzieren, da bei zu hohen nötigen Schalttemperaturen eine sehr hohe Aufheizung von Körpergewebe erforderlich ist, was auf erwünschte Weise auch bestimmtes gesundes Gewebe im Körper (z.B. Nachbargewebe eines Tumors) schädigen kann.
Im Stand der Technik ist bereits ein DNA-basiertes Wirkstofffreisetzungssystem bekannt, bei dem mesoporöse Silika-Partikel kovalent an einzelsträngige DNA gebunden werden und diese einzelsträngige DNA an eine komplementäre einzelsträngige DNA hybridisiert, die kovalent an Eisenoxid-Nanopartikel gebunden ist, wodurch die Poren der mesoporösen Silika-Partikel verschlossen werden (Ruiz-Hernandez, E. et al., ACS Nano, 2011, Bd. 5, S. 1259-1266). Ein Aufschmelzen der Hybridisierung der DNA durch Anheben der Temperatur erlaubt dann ein Öffnen der Poren der mesoporösen Silika-Partikel und eine Freisetzung eines darin eingeschlossenen Wirkstoffs. Dieses DNA-basierte Wirkstofffreisetzungssystem ist jedoch aufwändig in der Herstellung, erlaubt nur eine verhältnismäßig geringe Wirkstoffbeladung relativ zum Gesamtgewicht des Systems und weist einen relativ breiten Temperaturbereich der Wirkstofffreisetzung auf.
Die KR 10-1570300 B1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittelabgabesystems und offenbart ein Arzneimittelsystem, das ein Nukleinsäurematerial und eine temperaturempfindliche Mizelle zur Mehrfachabgabe eines Arzneimittels umfasst.
Die WO 2019/034597 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung mechanisch reagierender Polymersomenmembranen und offenbart mechanisch reagierende Polymersomenmembranen, bei denen Adenin- und Thymin-funktionalisierte komplementäre amphiphile Blockcopolymere selbständig zu Polymersomen zusammengesetzt sind und die sich für die Verabreichung von Medikamenten, als Nanoreaktoren und für die selektive Freisetzung von Aushärtungsmitteln für den 3D-Druck oder von Duftstoffen eignen.
Qin, S. et al. (Advanced Materials, 2006, 18:2905-2909) offenbaren eine temperaturkontrollierte Assemblierung von Polymervesikeln aus Poly(ethylenoxid)-Block-Poly(N-isopropylacrylamid) und eine temperaturkontrollierte Freisetzung eines Wirkstoffs aus diesen Polymervesikeln.
Ilhami, F.B. et al. (Mater. Chem. Front., 2021, 5:5442) offenbaren selbstorganisierte Nanopartikel, die durch komplementäre Nukleobasenpaar-Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und Nanoträgern gebildet werden und schlägt deren Verwendung in der selektiven Tumor-Chemotherapie vor.
Ilhami, F.B. et al. (Pharmaceutics, 2021, 13:1929) offenbaren, dass sich komplementäre Nukleobasen-Wechselwirkungen für den einen Zusammenbau von Arzneimitteln und Nanoträgern eignen, und dieser Zusammenbau für eine selektive Krebs-Chemotherapie genutzt werden kann.
Ausgehend hiervon war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Wirkstofffreisetzungssystem (bzw. ein Gemisch) bereitzustellen, das die Nachteile aus dem Stand der Technik nicht aufweist. Insbesondere sollte das Wirkstoffsystem einfach und ökonomisch im industriellen Maßstab herstellbar sein, eine hohe Wirkstoffbeladung relativ zum Gesamtgewicht des Systems erlauben und ermöglichen, Wirkstoffe in einem möglichst schmalen Temperaturbereich bei einer Temperatur von > 37°C freizusetzen.
Die Aufgabe wird gelöst durch das Gemisch mit den Merkmalen von Anspruch 1, die wässrige Lösung mit den Merkmalen von Anspruch 12 und die Verwendung mit den Merkmalen von Anspruch 15. Die abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf.
Erfindungsgemäß wird ein Gemisch bereitgestellt, enthaltend

a) ein erstes Polymer, das mindestens sechs Nukleobasen aufweist, wobei je eine Nukleobase kovalent mit je einem Monomer des Polymers verbunden ist; und
b) ein zweites Polymer, das mindestens sechs Nukleobasen aufweist, wobei je eine Nukleobase kovalent mit je einem Monomer des Polymers verbunden ist, wobei die mindestens sechs Nukleobasen des zweiten Polymers zu den mindestens sechs Nukleobasen des ersten Polymers komplementär sind;

Die Selbstassemblierung der Polymerkomponenten des Gemisches bei einer Temperatur von < 37°C basiert auf der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den einzelnen komplementären Nukleobasen der beiden Polymere, die eine Mizellenbildung oder Vesikelbildung der beiden Polymere bewirkt. Wird die Schmelztemperatur der Bindung zwischen den komplementären Nukleobasen bei einer Temperatur von > 37°C überschritten, geht die Bindung zwischen den beiden Polymeren verloren, d.h. die beiden Polymere dissoziieren und gehen in einen nicht-mizellären bzw. einen nicht-vesikulären Zustand über. Die Mizellen bzw. Vesikel lösen sich dabei auf. Falls in den Mizellen bzw. Vesikeln ein Wirkstoff eingeschlossen war, wird dieser freigesetzt. Ist der Temperaturbereich des Aufschmelzens der Wasserstoffbrückenbindungen schmal, d.h. nur wenige Kelvin breit, kann bereits ein Temperaturunterschied von wenigen Kelvin über 37 °C (z.B. ein Temperatursprung von 37 °C auf 40 °C) eine Freisetzung von Wirkstoff bewirken.
Das erfindungsgemäße Gemisch hat den Vorteil, dass eine Freisetzung von Wirkstoffen in einem Temperaturbereich von > 37° möglich ist, insbesondere in einem schmalen Temperaturbereich über 37°C möglich ist (z.B. 1 K bis 5 K, bevorzugt 1 K bis 3 K, über 37°C). Ferner ist das Gemisch einfach und ökonomisch im industriellen Maßstab herstellbar. Zudem erlaubt das Gemisch eine relativ hohe Wirkstoffbeladung, wenn das erste und zweite Polymer Vesikeln als Wirkstoffträger ausbilden. Vesikel stellen einen großen Innenraum für die Beladung mit Wirkstoff zur Verfügung und die Polymere, welche die Vesikel ausbilden, nehmen in Relation zu diesem großen Innenraum ein nur geringes Volumen und damit ein nur geringes Gewicht ein. Folglich ist es bevorzugt, dass das erste und zweite Polymer Vesikeln ausbilden. Wenn das erste und zweite Polymer Mizellen ausbilden, ist auch eine gewisse, aber kleinere, Wirkstoffbeladung möglich (v.a. mit hydrophoberen Wirkstoffen).
Diese Eigenschaft macht das erfindungsgemäße Gemisch besonders nützlich für eine thermisch induzierte Schaltung im Körper eines Lebewesens mit einer Körpertemperatur von 37 °C, da es hier besonders vorteilhaft ist, wenn die zur Schaltung nötige Temperatur nicht zu hoch über 37 °C liegt (Grund: weniger unerwünschte thermisch bedingte Schäden am Gewebe treten auf). Beispielsweise ist zudem bekannt, dass ein Krebstumor im Körper eine um 1 K bis 2 K erhöhte Temperatur gegenüber dem umliegenden Körpergewebe (das bei 37 °C liegt) aufweisen kann, wodurch über das erfindungsgemäße Gemisch ein Wirkstofffreisetzung im Körper gezielt am Ort des Tumors erfolgen kann.
Eine Bildung von Vesikeln ist bevorzugt, da Vesikeln einen größeren Innenraum für die Beladung mit einem Wirkstoff zur Verfügung stellen und somit eine Beladung mit größeren Wirkstoffmolekülen bzw. einer größeren Menge an kleineren Wirkstoffmolekülen erlauben. Es ist somit bevorzugt, dass das erste Polymer und das zweite Polymers über ihre zueinander komplementären Nukleobasen dazu geeignet sind, in einer wässrigen Lösung bei einer Temperatur von ≤ 37°C durch Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen ihren komplementären Nukleobasen zu Vesikeln zu assemblieren (d.h. Vesikel auszubilden bzw. als Vesikel vorzuliegen), und bei einer Temperatur von > 37°C durch Fehlen von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen ihren komplementären Nukleobasen nicht zu Vesikeln zu assemblieren (d.h. keine Vesikel auszubilden bzw. nicht als Vesikel vorzuliegen).
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform enthält das Gemisch ein Magnesiumsalz (z.B. MgCl₂) und/oder einen Magnesiumkomplex, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 10 bis 30 mM. Die Gegenwart von Magnesium kann vorteilhaft für die Ausbildung von Vesikeln oder Mizellen sein, falls das erste Polymer und/oder zweite Polymer mindestens ein Monomer aufweisen, das einen Phosphat-Rest (z.B. einen Ribose-5-Phosphat-Rest) enthält.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform enthält das Gemisch einen Wirkstoff, wobei der Wirkstoff bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus medizinisch wirksamen Stoffen, kosmetischen Stoffen, Sensorstoffen, Schmierstoffen, Kühlmitteln, Klebstoffen und Kombinationen hiervon. Der Wirkstoff ist besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus medizinisch wirksamen Stoffen, Duftstoffen, Antitranspirantien, UV-Schutzstoffen, Kühlmitteln, Schmiermitteln, Klebstoffen und Kombinationen hiervon. Der Vorteil hierbei ist, dass der Wirkstoff in einem Innenraum der Mizellen oder Vesikel eingeschlossen werden kann, die aus den beiden Polymeren des erfindungsgemäßen Gemisches bei einer Temperatur von ≤ 37 °C in wässriger Lösung ausgebildet werden.
In einer weiteren optionalen Ausgestaltungsform ist das erste Polymer und/oder das zweite Polymer ein lineares (d.h. unverzweigtes) Polymer. Alternativ ist das erste Polymer und/oder das zweite Polymer ein nicht-lineares (d.h. verzweigtes) Polymer. Hierbei kann das erste Polymer und/oder das zweite Polymer mindestens eine Verzweigung, optional zwei Verzweigungen aufweisen. Weist das erste Polymer und/oder zweite Polymer eine oder zwei Verzweigungen auf, so kann es sich um ein modifiziertes 3-Arm-PEG oder modifiziertes 4-Arm-PEG (z.B. mit einer mittleren molaren Masse von 1000 bis 6000 g/mol, bevorzugt 2000 g/mol bis 5000 g/mol) handeln, das an mindestens zwei Armen des PEG, bevorzugt an mindestens drei Armen des PEG (optional an vier Armen des PEG bei 4-Arm-PEG) Monomere aufweist, die jeweils kovalent mit jeweils einer Nukleobase verbunden sind (bevorzugt an jeweils einem Ende der Arme). Entscheidend ist, dass das 3-Arm-PEG oder 4-Arm-PEG mindestens sechs Nukleobasen aufweist, wobei je eine Nukleobase kovalent mit je einem Monomer des Polymers verbunden ist. In einem Arm des 3-Arm-PEG oder des 4-Arm-PEG können beispielsweise mindestens vier oder sechs solcher Monomere vorhanden sein und in einem zweiten Arm dieses PEG können beispielsweise vier oder sechs solcher Monomere vorhanden sein. Es ist möglich, dass die anderen Arme des 3-Arm-PEG oder4-Arm-PEG keine solchen Monomere aufweisen, d.h. keine Monomere aufweisen, die mit einer Nukleobase verbunden sind (Nukleobasen-freie Monomere).
Das erste Polymer kann mindestens 20, bevorzugt mindestens 50, besonders bevorzugt mindestens 100, ganz besonders bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 500, Monomere enthalten oder daraus bestehen. Ferner kann das zweite Polymer mindestens 20, bevorzugt mindestens 50, besonders bevorzugt mindestens 100, ganz besonders bevorzugt mindestens 200, insbesondere mindestens 500, Monomere enthalten oder daraus bestehen. Das erste und/oder zweite Polymer kann maximal 600 Monomere, optional maximal 500 Monomere, aufweisen.
Das erste Polymer kann mindestens zehn, bevorzugt mindestens zwölf, besonders bevorzugt mindestens 14, insbesondere mindestens 16, optional maximal 18, Nukleobasen aufweisen, wobei je eine Nukleobase kovalent mit je einem Monomer des ersten Polymers verbunden ist. Das zweite Polymer kann mindestens zehn, bevorzugt mindestens zwölf, besonders bevorzugt mindestens 14, insbesondere mindestens 16, optional maximal 18, Nukleobasen aufweisen, wobei je eine Nukleobase kovalent mit je einem Monomer des zweiten Polymers verbunden ist, wobei die Nukleobasen des zweiten Polymers zu den Nukleobasen des ersten Polymers komplementär sind. Je mehr Nukleobasen, die zueinander komplementär sind, das erste und zweite Polymer aufweisen, desto höher ist der Schmelzpunkt der hybridisierten Nukleobasen, d.h. desto höher über >37°C ist die Temperatur, bei der die Mizellen und/oder Vesikel disassemblieren.
Es ist möglich, dass das erste Polymer maximal 16, bevorzugt maximal 14, besonders bevorzugt maximal 12, optional maximal 10, Nukleobasen aufweist. Ferner ist möglich, dass das zweite Polymer maximal 16, bevorzugt maximal 14, besonders bevorzugt maximal 12, optional maximal 10, Nukleobasen aufweist. Je weniger Nukleobasen, die zueinander komplementär sind, das erste und zweite Polymer aufweisen, desto niedriger ist der Schmelzpunkt der hybridisierten Nukleobasen, d.h. desto näher bei >37°C ist die Temperatur, bei der die Mizellen und/oder Vesikel disassemblieren.
Bei dem ersten Polymer kann/können zwischen zwei aufeinanderfolgenden, jeweils mit einer Nukleobase verbundenen Monomere maximal drei Monomere, bevorzugt maximal zwei Monomere, besonders bevorzugt maximal ein Monomer, insbesondere kein Monomer, angeordnet sein, das nicht jeweils kovalent mit einer Nukleobase verbunden ist, d.h. das nicht jeweils mit einem Nukleobasen-freien Monomer verbunden ist. Mit dem Begriff „Nukleobasen-freies Monomer“ ist ein Monomer gemeint, das selbst (d.h. als isolierter Baustein im Polymer betrachtet) keine Verbindung zu einer Nukleobase aufweist. Anders ausgedrückt weisen die Nukleobasen-freien Monomere nur (indirekt) über be-nachbarte Monomere des Polymers (die dann als „Spacer“ angesehen werden können) eine Verbindung zu einer Nukleobase auf. Ferner kann/können bei dem zweiten Polymer zwischen zwei aufeinanderfolgenden, jeweils mit einer Nukleobase verbundenen Monomere maximal drei Monomere, bevorzugt maximal zwei Monomere, besonders bevorzugt maximal ein Monomer, insbesondere kein Monomer, angeordnet sein, das nicht jeweils kovalent mit einer Nukleobase verbunden ist, d.h. das nicht jeweils mit einem Nukleobasen-freien Monomer verbunden ist. Ist kein Nukleobasen-freies Monomer zwischen zwei aufeinanderfolgenden, Nukleobasen-verbundenen Monomeren angeordnet, sind die Nukleobasen an sequentiell aufeinanderfolgenden Monomeren des Polymers gebunden. Eine solche Anordnung der Nukleobasen entlang der Polymerkette hat den Vorteil, dass auf der geringstmöglichen Länge ein reversibler Bindungsmechanismus geschaffen wird, der das erste Polymer und das zweite Polymer reversibel und in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur aneinander binden (T ≤ 37 °C) oder voneinander lösen kann (T > 37 °C).
Das erste Polymer und/oder zweite Polymer können mindestens ein Monomer oder Oligomer (bevorzugt mindestens ein Monomer, besonders bevorzugt genau ein Monomer) aufweisen, das nicht jeweils kovalent mit einer Nukleobase verbunden ist (d.h. das ein Nukleobasen-freies Monomer ist) und das kovalent mit mindestens einem weiteren Polymer (optional zwei weiteren Polymeren wie z.B. in 3-Arm-PEG oder 4-Arm-PEG) verbunden ist. Das weitere Polymer ist bevorzugt dazu geeignet, nach einer Assemblierung des ersten und zweiten Polymers in einem wässrigen Medium eine Phasenseparation zu bewirken. Das weitere Polymer kann Polyethylenglycol enthalten oder daraus bestehen.
Bei den Nukleobasen des ersten Polymers kann es sich um Nukleobasen handeln, die Cytosin, Isocytosin und/oder Adenin, bevorzugt Cytosin, enthalten oder daraus bestehen. Ferner kann es sich bei den Nukleobasen des zweiten Polymers um Nukleobasen handeln, die Guanin, Isoguanin und/oder Thymin, bevorzugt Guanin, enthalten oder daraus bestehen. Die Kombination von Cytosin bzw. Isocytosin (erstes Polymer) und Guanin bzw. Isoguanin (zweites Polymer) ist bevorzugt, da die Cytosin-Guanin-Bindung (bzw. Isocytosin-Isoguanin-Bindung), die durch drei Wasserstoffbrückenbindungen etabliert wird, stärker ist als die Adenin-Thymin-Binding, die nur durch zwei Wasserstoffbrückenbindungen etabliert wird. Die Verwendung von Cytosin, Guanin, Isocytosin und Isoguanin hat damit den Vorteil, dass für das Einstellen einer bestimmten (Dis-)Assemblierungs-Temperatur eine geringere Anzahl an Nukleobasen gebraucht wird als bei der Verwendung von Adenin und Thymin. Folglich kann der reversible Bindungsmechanismus auf einer kürzeren Länge entlang des ersten und zweiten Polymers etabliert werden.
Die Nukleobasen des ersten Polymers können über einen Riboserest mit dem Monomer des ersten Polymers verbunden sein, wobei bevorzugt die Nukleobase mit dem C1-Atom des Riboserestes verbunden ist und das Monomer mit dem C5-Atom des Riboserestes verbunden ist. Ferner können die Nukleobasen des zweiten Polymers über einen Riboserest mit dem je einem Monomer des ersten Polymers verbunden sein, wobei bevorzugt die Nukleobase mit dem C1-Atom des Riboserestes verbunden ist und das Monomer mit dem C5-Atom des Riboserestes verbunden ist. Vorteil an der Verbindung über einen Riboserest ist, dass der Riboserest verhältnismäßig hydrophil ist und damit die Wasserlöslichkeit des ersten und/oder zweiten Polymers verbessern kann.
Die Monomere des ersten Polymers und/oder zweiten Polymers, die jeweils mit einer Nukleobase verbunden sind, können jeweils einen Rest enthalten oder daraus bestehen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminosäure-Rest, Zucker-Rest, Ribosephosphat-Rest, Methacrylamid-Rest und Kombinationen hiervon. Der Rest ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ribosephosphat-Rest, Methacrylamid-Rest und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ribose-5-phosphat-Rest, N-(3-Aminopropyl)-methacrylamid-Rest und Kombinationen hiervon. Vorteil des Ribose-5-phosphat-Restes und des N-(3-Aminopropyl)-methyacrylamid-Restes ist, dass diese verhältnismäßig hydrophil sind und damit die Wasserlöslichkeit des ersten und/oder zweiten Polymers verbessern kann.
Ferner können die Monomere des ersten Polymers und/oder zweiten Polymers, die jeweils mit einer Nukleobase verbunden sind, ein Homopolymer ausbilden. Das Homopolymer ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypeptid, Polysaccharid, Polyribosephosphat, Polymethacrylamid und Kombinationen hiervon. Besonders bevorzugt ist das Homopolymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly-Ribosephosphat, Polymethacrylamid und Kombinationen hiervon. Insbesondere ist das Homopolymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly-Ribose-5-phosphat, Poly-(N-(3-Aminopropyl)-methacrylamid und Kombinationen hiervon. Vorteil ist, dass diese Homopolymere verhältnismäßig hydrophil sind und damit die Wasserlöslichkeit des ersten und/oder zweiten Polymers verbessern können.
Ferner können die Monomere des ersten Polymers und/oder zweiten Polymers, die jeweils mit einer Nukleobase verbunden sind, über eine Bindung kovalent mit der Nukleobase verbunden sein (optional über eine Riboserest), die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend Esterbindung, Thioesterbindung, Etherbindung und Amidbindung. Bevorzugt ist die Bindung eine Amidbindung, besonders bevorzugt eine Amidbindung zu einem Riboserest, der kovalent mit der Nukleobase verbunden ist. Insbesondere ist die Bindung eine Amidbindung zu einem C5-Atom eines Riboserestes, der kovalent an dem C1-Atom des Riboserestes mit der Nukleobase verbunden ist. Die Amidbindung ist vorteilhaft, da sie eine in wässriger Umgebung verhältnismäßig stabile Bindung ist.
Ferner ist bevorzugt, dass das erste Polymer und zweite Polymer die Nukleobasen, die jeweils kovalent mit je einem Monomer des Polymers verbunden sind, an einem ersten Ende des Polymers, an einem ersten Ende des Polymers und an einem zweiten Ende des Polymers, oder in der Mitte des Polymers, aufweisen. Anders ausgedrückt kommen die Nukleobasen entlang der Polymerkette nur in diesem jeweiligen Abschnitt (bzw. Bereich oder Block) des Polymers vor und in einem von diesem Abschnitt (bzw. Bereich oder Block) des Polymers verschiedenen Abschnitt (bzw. Bereich oder Block) des Polymers nicht vor.
Sind die Nukleobasen beispielsweise an einem ersten Ende des Polymers angeordnet, würde jedes Monomer an einem zweiten Ende des Polymers jeweils keine angebundene Nukleobase aufweisen, d.h. am zweiten Ende lägen nur Nukleobasen-freie Monomere vor. Sind die Nukleobasen beispielsweise an einem ersten Ende des Polymers und an einem zweiten Ende des Polymers angeordnet, würde jedes Monomer in der Mitte des Polymers jeweils keine angebundene Nukleobase aufweisen, d.h. in der Mitte lägen nur Nukleobasen-freie Monomere vor. Sind die Nukleobasen beispielsweise in der Mitte des Polymers angeordnet, würde jedes Monomer am Anfang und am Ende des Polymers (d.h. in beide Richtungen weg von der Mitte des Polymers) jeweils keine angebundene Nukleobase aufweisen, d.h. in diesen Abschnitten lägen nur Nukleobasen-freie Monomere vor. Die unterschiedlichen Abschnitte (Bereiche oder Blocks) des Polymers können damit unterschiedliche physikalische und/oder chemische Eigenschaften aufweisen. Beispielsweise weisen die Abschnitte des ersten und/oder zweiten Polymers, deren Monomere nicht jeweils mit einer Nukleobase verbunden sind (Abschnitte mit Nukleobasen-freien Monomeren), bei einer Temperatur von ≤ 37 °C einen höheren Freiheitsgrad auf, da diese Bereiche nicht an der Hybridisierung der beiden Polymere beteiligt sind, d.h. dies Abschnitte erfahren durch die Hybridisierung keine „Immobilisierung“. Je länger dieser Abschnitt mit Nukleobasen-freien Monomeren des ersten und/oder zweiten Polymers ist, desto stärker bestimmt er die chemischen und physikalischen Eigenschaften der aus den beiden Polymeren assemblierten Mizellen oder Vesikel.
Monomere des ersten Polymers und/oder zweiten Polymers, die jeweils nicht mit einer Nukleobase verbunden sind (Nukleobasen-freie Monomere), können jeweils einen Rest enthalten oder daraus bestehen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid-Rest, Vinylamin-Rest, Butadien-Rest, Ethylenoxid-Rest, Acrylsäure-Rest, Aminosäure-Rest (z.B. Glutaminsäure-Rest und/oder Lysin-Rest), Zucker-Rest und Kombinationen hiervon. Bevorzugt enthalten diese Monomere einen (N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid-Rest und/oder einen Ethylenoxid-Rest, oder bestehen daraus, da diese Monomere eine gute Wasserlöslichkeit aufweisen und damit eine gute Wasserlöslichkeit des ersten und/oder zweiten Polymers bereitstellen können.
Monomere des ersten Polymers und/oder zweiten Polymers, die jeweils nicht mit einer Nukleobase verbunden sind (Nukleobasen-freie Monomere), können ein Homopolymer ausbilden, bevorzugt ein Hompolymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly-(N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid, Polyvinylamin, Polyethylenoxid, Polypeptid (z.B. Polyglutaminsäure und/oder Polylysin), Polysaccharid, und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt Poly-(N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid. Die Ausbildung von Poly-(N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid (pHPMA) und/oder Polyethylenoxid ist vorteilhaft, da es eine gute Wasserlöslichkeit aufweist und damit eine gute Wasserlöslichkeit des ersten und/oder zweiten Polymers bereitstellen kann. Ferner können Monomere des ersten Polymers und/oder zweiten Polymers, die jeweils nicht mit einer Nukleobase verbunden sind (Nukleobasen-freie Monomere), ein Block-Copolymer ausbilden, bevorzugt ein Block-Copolymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polybutadien-Polyethylenoxid, Polyvinylamin-Polyethylenoxid, Polyglutaminsäure-Polyethylenoxid, Polyacrylsäure und Kombinationen hiervon. Ferner können Monomere des ersten Polymers und/oder zweiten Polymers, die jeweils nicht mit einer Nukleobase verbunden sind (Nukleobasen-freie Monomere), ein Heteropolymer ausbilden, bevorzugt ein Heteropolymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypeptid, Polysaccharid, und Kombinationen hiervon.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform enthält das Gemisch kein organisches Lösungsmittel. Folglich kann das Gemisch mit einem geringeren Sicherheitsrisiko, mit geringeren Kosten und auf umweltfreundlichere Art und Weise bereitgestellt werden als bekannte Gemische aus dem Stand der Technik, die ein organisches Lösungsmittel einsetzen. Ferner wird eine Verkapselung von Wirkstoffen ermöglicht, die durch organische Lösungsmittel geschädigt oder sogar zerstört werden (z.B. bestimmte makromolekulare Biotherapeutika wie bestimmte Proteine).
Das erfindungsgemäße Gemisch wird ferner zur Verwendung in der Medizin, bevorzugt zur thermischen Freisetzung eines Wirkstoffs, besonders bevorzugt zur thermischen Freisetzung eines Wirkstoffs zur Behandlung von Krebs, bereitgestellt.
Erfindungsgemäß wird zudem eine wässrige Lösung bereitgestellt, die ein erfindungsgemäßes Gemisch enthält, wobei das erste Polymer und das zweite Polymer zumindest teilweise (bevorzugt vollständig) zu Mizellen oder Vesikeln assembliert sind. Unter dem Begriff „Lösung“ wird erfindungsgemäß auch eine Emulsion und Suspension verstanden, da die Mizellen und/oder Vesikel auch in dem Wasser der Lösung emulgiert und/oder suspendiert vorliegen können.
Die wässrige Lösung kann beispielsweise bereitgestellt werden, indem einem erfindungsgemäßen Gemisch Wasser bei Raumtemperatur (25°C) zugegeben wird, das resultierende Gemisch bei einer Temperatur von über 37 °C (z.B. 40 bis 100 °C) für einen bestimmten Zeitraum (z.B. 10 bis 100 Minuten) inkubiert wird und anschließend auf eine Temperatur von ≤ 37 °C abgekühlt wird. Alternativ kann dem erfindungsgemäßen Gemisch Wasser mit einerTemperaturvon über 37 °C (z.B. 40 bis 100 °C) zugegeben werden, für einen bestimmten Zeitraum (z.B. 10 bis 100 Minuten) inkubiert werden und anschließend auf eine Temperatur von ≤ 37 °C abgekühlt werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform enthält die wässrige Lösung kein organisches Lösungsmittel. Der Vorteil ist, dass die wässrige Lösung physiologisch verträglicher ist und bei einer Verabreichung der wässrigen Lösung an ein Lebewesen keine Schäden durch organische Lösungsmittel hervorgerufen werden.
Die Mizellen und/oder Vesikel der wässrigen Lösung können einen durchschnittlichen hydrodynamischen Radius, bestimmt über dynamische Lichtstreuung, im Bereich von 30 nm bis 300 nm, bevorzugt im Bereich von 50 nm bis 200 nm, optional im Bereich von 100 nm bis 150 nm, aufweisen. Ein hydrodynamischer Radius in diesem Bereich hat sich als vorteilhaft für die Verkapselung und den Transport von Wirkstoffen herausgestellt.
Die Mizellen und/oder Vesikeln der wässrigen Lösung können in einem Innenraum (der Mizellen und/oder Vesikel) einen Wirkstoff enthalten, wobei der Wirkstoff bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus medizinisch wirksamen Stoffen, kosmetischen Stoffen, Sensorstoffen, Schmierstoffen, Kühlmitteln und Kombinationen hiervon, wobei der Wirkstoff besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus medizinisch wirksamen Stoffen, Duftstoffen, Antitranspirantien, UV-Schutzstoffen, Kühlmitteln, Schmiermitteln und Kombinationen hiervon.
Erfindungsgemäß wird ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung zur thermischen Freisetzung eines Wirkstoffs vorgeschlagen, bevorzugt zur Freisetzung eines Wirkstoffs ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus medizinisch wirksamen Stoffen, kosmetischen Stoffen, Sensorstoffen, Schmierstoffen, Kühlmitteln und Kombinationen hiervon, wobei der Wirkstoff besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus medizinisch wirksamen Stoffen, Duftstoffen, Antitranspirantien, UV-Schutzstoffen, Kühlmitteln, Schmiermitteln, Klebstoffen und Kombinationen hiervon.
Anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier dargestellten, spezifischen Ausführungsformen einschränken zu wollen.

1 zeigt schematisch eine Polymerisation und Selbst-Assemblierung (Selbstorganisation) von linearen ersten Polymeren und zweiten Polymeren, die von komplementären Nukleosid-Blockcopolymeren (C und G) gebildet werden und die das erfindungsgemäße Gemisch enthalten kann.
2A zeigt in einem Reaktionsschema die Synthese von Nukleobase (NB)-Monomerderivaten: (i) TEMPO, BAIB, CH₃CN/H₂O, rt, über Nacht (3: 44 %, 4: 98 %); (ii) APMA*HCl, CDMT, NMM, MeOH, rt, über Nacht (1: 44 %, 2: 52 %).
2B zeigt die chemische Strukturen von Ribonukleosid-Methacrylamiden, speziell von einem Cytidin-Methacrylamid-Derivat (1) und einem Guanosin-Methacrylamin-Derivat (2), die polymerisiert werden können, um ein Ende des ersten Polymers (z.B. Polymerisierung des Cytidin-Methacrylamid-Derivats) und ein Ende des zweiten Polymers (z.B. Polymerisierung des Guanosin-Methacrylamin-Derivats) herzustellen, wobei das erste Ende jeweils Monomere aufweist, die jeweils kovalent mit je einer Nukleobase verbunden sind (= Nukleobasen-aufweisender Bereich des ersten und/oder zweiten Polymers).
2C zeigt in einem Reaktionsschema die Synthese von pHPMA 9 und nukleosidbasierten Blockcopolymeren pHPMA-b-piCPMA 11 und pHPMA-b-piGPMA 12: (i) ACVA, Acetatpuffer (pH 5)/ EtOH, 70 °C, 24 h; (ii) ACVA, DMF/H₂O oder 1,4-Dioxan/H₂O, 75 °C, 24 h. pHPMA kann ein zweites Ende des ersten Polymers und ein zweites Ende des zweiten Polymers darstellen, wobei das zweite Ende jeweils Monomere aufweist, die nicht jeweils kovalent mit je einer Nukleobase verbunden sind (= Nukleobasen-freier Bereich des ersten und des zweiten Polymers). Das nukleosidbasierte Blockcopolymer pHPMA-b-piCPMA 11 kann ein erstes Polymer darstellen und das nukleosidbasierte Blockcopolymer pHPMA-b-piGPMA 12 kann ein zweites Polymer des erfindungsgemäßen Gemisches darstellen.
2D zeigt in einem Reaktionsschema eine saure Entschützung der Acetonidfunktion von pHPMA-b-piCPMA 11 und pHPMA-b-piGPMA 12: (i) TFA, H₂O, rt, 2 h (11: 53 %, 12: 81 %), um am C2-Atom und am C3-Atom des Riboserestes OH-Gruppen zu etablieren. Diese Maßnahme kann die Löslichkeit von pHPMA-b-piCPMA 11 und pHPMA-b-piGPMA 12 in Wasser erhöhen.
3 zeigt analytische Daten von piCPMA 5 und piGPMA 6, also von einem Abschnitt (z.B. piCPMA 5) eines ersten Polymers (z.B. pHPMA-b-piCPMA) und von einem Abschnitt (z.B. piGPMA 6) eines zweiten Polymers (z.B. pHPMA-b-piGPMA) eines erfindungsgemäßen Gemisches.
4 zeigt analytische Daten von pHPMA-b-piCPMA 11 und pHPMA-b-piGPMA 12, also von einem ersten Polymer (z.B. pHPMA-b-piCPMA) und von einem zweiten Polymer (z.B. pHPMA-b-piGPMA) eines erfindungsgemäßen Gemisches.
5A zeigt SEM-Bild, Größenverteilung und hydrodynamische Größenverteilung mittels DLS von pHPMA-b-pCPMA 13.
5B zeigt SEM-Bild, Größenverteilung und hydrodynamische Größenverteilung mittels DLS von pHPMA-b-pGPMA 14.
6A zeigt SEM-Bild, Größenverteilung und hydrodynamische Größenverteilung mittels DLS einer Mischung von pHPMA-b-pCPMA 13 und pHPMA-b-pGPMA 14 bei Raumtemperatur (25 °C) vor einem Erhitzen auf > 37 °C (100 °C).
6B zeigt SEM-Bild, Größenverteilung und hydrodynamische Größenverteilung mittels DLS derselben Mischung aus 5A, nur nach einem Erhitzen auf > 37 °C (100 °C) für 30 Minuten und einem anschließendem Abkühlen auf Raumtemperatur (25 °C).
7 zeigt ein UV-Vis-Spektrum des Durchschnitts des einzelnen Polymers 13 und Polymers 14 (Linienform:
), einem Gemisch von Polymer 13 und Polymer 14 bei Raumtemperatur (25 °C) vor einem Erhitzen auf > 37 °C (100 °C) (Linienform:
) und dem Gemisch von Polymer 13 und Polymer 14 nach einem Erhitzen auf > 37 °C (100 °C) für 30 Minuten und einem anschließendem Abkühlen auf Raumtemperatur (25 °C) (Linienform:
).
8 zeigt in einem Reaktionsschema eine weitere mögliche RAFT-Polymerisation zur Erzeugung eines ersten Polymers bzw. eines zweiten Polymers eines erfindungsgemäßen Gemisches.
9 zeigt schematisch eine Selbst-Assemblierung von verzweigten ersten Polymeren und zweiten Polymeren, die das erfindungsgemäße Gemisch enthalten kann.

Beispiel 1 - Grundlagen zur Assemblierung der Polymere des Gemisches
Israelachvili et al. präsentierten im Jahr 1976 ihre Theorie zur Selbstorganisation von amphiphilen Molekülen und führten das Konzept des kritischen Packungsparameters (P_c) ein, um die Bildung supramolekularer Strukturen aus amphiphilen Molekülen vorherzusagen (Israelachvili, J.N. et al., Theory of selfassembly of hydrocarbon amphiphiles into micelles and bilayers., Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions, 72:1525-1568 (1976).
Der kritische Packungsparameter ist definiert als $P_{c} = {v/a}_{0} I_{c}$
wobei

v: Volumen des hydrophoben Anteils,
a0: Fläche, die durch die hydrophile Kopfgruppe eingenommen wird,
Ic: Konturlänge des Moleküls.

Der kritische Packungsparameter beschreibt damit die Form des Moleküls, welche mit der Krümmung an der hydrophob-hydrophilen Grenzfläche in Zusammenhang steht und somit eine Vorhersage der selbstorganisierten Struktur ermöglicht
P_c-Werte unterhalb 0,5 (insbesondere ≤ 0,33) resultieren in stark gekrümmten Aggregaten wie kugelförmigen und zylindrischen Mizellen (Einzelschicht-Anordnung). P_c-Werte von 0,5 bis 1 resultieren in der Ausbildung von Vesikeln (Doppelschicht-Anordnung). P_c-Werte von >1 resultieren in der Ausbildung Inverser Mizellen.
Im vorliegenden Fall liegen bei dem ersten Polymer und dem zweiten Polymer des erfindungsgemäßen Gemisches nicht ein hydrophiler Bereich (Anteil) und ein hydrophober Bereich (Anteil) vor, sondern zwei hydrophile Bereiche (Anteile). Streng genommen ist das erste Polymer und das zweite Polymer des erfindungsgemäßen Gemisches daher kein amphiphiles Molekül.
Dennoch ist die von Israelachvili et al. entwickelte Theorie zur Selbst-Assemblierung auch auf das erste Polymer und das zweite Polymer des erfindungsgemäßen Gemisches übertragbar (siehe z.B, Polymer Vesicles, D.E. Discher & A. Eisenberg; Science, 297:967-973). Der „hydrophobe“ Bereich in den amphiphilen Molekülen der Theorie entspricht in den Polymeren des erfindungsgemä-ßen Gemisches dann einem Bereich des ersten Polymers und des zweiten Polymers, der die Monomere aufweist, die jeweils kovalent mit jeweils einer Nukleobase verbunden sind. Denn ist dieser Bereich des ersten Polymers und des zweiten Polymers, der über Hybridisierung komplementärer Nukleobasen zwischen dem ersten und dem zweiten Polymer in einem wässrigen Medium bei einer Temperatur von ≤ 37°C zu einer Assemblierung des ersten und zweiten Polymers zu Mizellen oder Vesikeln führt. Durch diese favorisierte Interaktion kommt es zu einer Mikrophasenseparation des nicht-funktionalisierten hydrophilen Anteils und des mit seinem komplementären Gegenpart durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen und pi-stacking assemblierenden anderen hydrophilen Anteils, wodurch die beiden Polymeranteile nicht gleichmäßig mischbar sind, sondern durch Entmischung eine Phasentrennung hervorrufen, die für die supramolekulare Strukturbildung verantwortlich ist.
Diese Art Assemblierung ist vergleichbar zur Assemblierung des hydrophoben Bereichs von Lipiden, der durch den hydrophoben Effekt getrieben wird. Anders als bei der Assemblierung von Lipiden über den hyrophoben Effekt lässt sich die Assemblierung der Polymere im erfindungsgemäßen Gemisch jedoch durch Anhebung der Temperatur auf eine Temperatur im Bereich von > 37°C lösen, wodurch assemblierte Mizellen oder Vesikel disassemblieren, d.h. ihre mizelläre bzw. vesikuläre Struktur verlieren.
Der Bereich (Anteil) des ersten Polymers und des zweiten Polymers, der keine an Nukleobasen gebundenen Monomere aufweist (z.B. ein Bereich, der PEG enthält oder daraus besteht), kann dazu geeignet sein, die Phasenseparation zu begünstigen. Vorteilhafterweise ist dieser Bereich (Abteil) hydrophiler als der Bereich (Anteil) des ersten und des zweiten Polymers, der die Nukleobasenverknüpften Monomere aufweist.
Da die von Israelachvili et al. entwickelte Theorie zur Selbst-Assemblierung auch auf das erste Polymer und das zweite Polymer des erfindungsgemäßen Gemisches übertragbar ist, lässt sich der kritische Packungsparameter für das erste Polymer bzw. das zweite Polymer des erfindungsgemäßen Gemisches definieren als: $P_{c} = {v/a}_{0} I_{c}$
wobei

v: Volumen des Bereichs des Polymers, der Monomere aufweist, die jeweils an je eine Nukleobase gebunden sind (Nukleobasen-aufweisender Bereich),
a0: Fläche, die durch den Bereich des Polymers gebildet wird, der keine an Nukleobasen gebundenen Monomere aufweist (d.h. Nukleobasenfreier Bereich)
Ic: Konturlänge des Polymer-Moleküls.

Der P_c sollte für das erste Polymer und das zweite Polymer im Wesentlichen gleich groß sein (Abweichung bevorzugt maximal 10%). Gemeinsame P_c-Werte unterhalb 0,5 (insbesondere ≤ 0,33) bewirken eine Assemblierung des ersten und zweiten Polymers zu kugelförmigen und zylindrischen Mizellen, wogegen gemeinsame P_c-Werte im Bereich von 0,5 bis 1 eine Assemblierung des ersten und zweiten Polymers zu Vesikeln bewirken. Gemeinsame P_c-Werte von >1 können eine Assemblierung zu Inversen Mizellen bewirken. Erfindungsgemäß werden P_c-Werte im Bereich 0,5 bis 1 bevorzugt, da es in diesem Bereich zur Ausbildung von Vesikeln kommt und die Ausbildung von Vesikeln eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellt.
Beispiel 2 - Verknüpfung von Nukleobasen mit Monomeren
Als Nukleobasen wurden Nukleoside als geschützte 2',3'-Acetonidformen verwendet, um die 5'-Position zu adressieren. Aus Stabilitätsgründen wurden Methacrylamid-funktionalisierte Ribonukleoside gegenüber Methacrylat-Derivaten bevorzugt, die enzymatisch synthetisiert werden können. Die Synthese der Cytidin- (1) und Guanosin-basierten Monomere (2) (siehe 2B) erfolgte in einem zweistufigen Verfahren, das die Oxidation der primären Hydroxylgruppe und eine anschließende Amid-Kopplung mit N-(3-Aminopropyl)-Methacrylamid einschließt (siehe 2A). Trotz der höheren Nukleophilie der exozyklischen -NH₂-Gruppe war im Gegensatz zur enzymatischen Veresterung kein Schutzschritt dieser Funktionalität erforderlich.
Zur Oxidation von handelsüblichem 2',3'-Isopropyliden-Cytidin und 2',3'-Isopropyliden-Guanosin zu deren Carbonsäurederivaten wurden die acetalgeschützten Ribonukleoside kurz mit TEMPO und BAIB in Gegenwart von NaHCO₃ oxidiert. Nach Filtration des Niederschlags wurde oxidiertes Cytidin (3) in einer Ausbeute von 44 % erhalten, während die Ausbeute an oxidiertem Guanosin (4) als weißes Pulver quantitativ war (siehe 1A). Verbindungen 1 und 2 (siehe 2B) wurden nach der Amidkupplung von Verbindungen 3 und 4 (siehe 2A) mit N-(3-Aminopropyl)-methacrylamidhydrochlorid unter Verwendung von 2-Chlor-4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin (CDMT) und N-Methylmorpholin (NMM) mit einer Ausbeute von 44 % bzw. 52 % erhalten (siehe 2A). Die chemische Struktur wurde durch NMR-Spektroskopie und ESI-MS-Analysen bestätigt.
Die Verbindung 2 zeigte eine geringere Löslichkeit als die Verbindung 1, aber beide Ribonukleosid-Methcrylamid-basierten Monomere zeigten eine angemessene Löslichkeit in unpolaren Lösungsmitteln wie Chloroform und Diethylether sowie in polaren Lösungsmitteln wie Dichlormethan, Aceton und Dimethylformamid als aprotische Lösungsmittel, und Wasser, Methanol und Ethanol als protische Lösungsmittel. Diese Löslichkeitseigenschaft lässt sich durch die gleichzeitige Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophoben Teilen in einem Molekül erklären. Aufgrund der hohen Löslichkeit der beiden Monomermoleküle wurde von einer weiteren Entschützung der Nukleosidmonomere für die Polymerisationen abgesehen.
Beispiel 3 - Herstellung eines Nukleobasen-aufweisenden Abschnitts der Polymere
Die RAFT-vermittelte Polymerisation gehört zu den wichtigsten und bekanntesten Polymerisationstechniken, die einen radikalischen Initiator und ein Kettenübertragungsmittel (CTA) umfassen. Hier wurde das auf Dithioester basierende CTA4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentansäure (CPADB) ausgewählt, da es für die Polymerisation von Monomeren auf Methacrylamidbasis beschrieben ist.
Die Verbindungen 1 und 2 (siehe 2B) wurden mittels RAFT-Polymerisation mit ACVA als thermischem Initiator bei 75 °C homopolymerisiert. Polymerisationen von Monomeren auf Nukleosidbasis wurden mit einem Verhältnis von [M0]:[CTA0]:0] von 75:3:1 durchgeführt. Die Beobachtung von Lösungsmittelmischungen aus 8:2 DMF/H₂O und 9:1 1,4-Dioxan/H₂O zeigte je nach Nukleosidtyp unterschiedliche Auswirkungen. Die Verwendung einer 9:1 1,4-Dioxan/H₂O-Mischung führte zu einem hohen Umsatz (94 %) des G-basierten Polymers (piGPMA), während der Umsatz des Cytidin-basierten Polymers (piCPMA) mit derselben Lösungsmittelmischung auf 34 % gesenkt wurde. Andererseits wurde in 8:2 DMF/H₂O die Umwandlung von piCPMA auf 40 % erhöht und von piGPMA auf nur 70 % gesenkt.
Die Polymerisationen der Nukleosidhomopolymere und ihre Monomerumwandlungen wurden durch Vergleich der Integrale der typischen C-4-Protonen von piCPMA (δ 4,43 ppm) und piGPMA (δ 4,50 ppm) mit den Integralen der monomeren Vinylpeaks von iCPMA (δ 5,64 ppm und 5,30 ppm) und iGPMA (δ 6,39 ppm und 5,61 ppm) bestimmt. Die theoretischen Molekulargewichte (Mn, Theorie, NMR) sind in 3 zusammengefasst.
Die Acetonid-Schutzgruppen der Homopolymere beider Ribonukleoside wurden unter sauren Bedingungen mit Trifluoressigsäure entfernt (siehe 2D), um die Hydrophilie aufgrund der anspruchsvollen Löslichkeitseigenschaften zu verbessern.
Beispiel 4 - Herstellung von Polymeren erfindungsgemäßer Gemische
Erfindungsgemäße Polymere, hier speziell Blockcopolymere mit Nukleosiden (pHPMA-b-piCPMA 11 und pHPMA-b-piGPMA 12), wurden mit Hilfe der RAFT-vermittelten Polymerisationstechnik hergestellt.
Speziell wurde zunächst ein Nukleobasen-freies Polymer hergestellt. Aufgrund seiner Biokompatibilität wurde Poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamid) (pHPMA) ausgewählt. Hierfür wurde zunächst ein HPMA-Makroinitiator über RAFT-vermittelte Polymerisation gemäß S. Perrier (50th Anniversary Perspective, RAFT Polymerization-A User Guide, Macromolecules, 2017, 50, 7433-7447) hergestellt. Der Monomerumsatz zu pHPMA lag bei 75 %, was zu einem theoretischen Mn von 7,8 kDa führte.
Anschließend wurde über die RAFT-vermittelte Polymerisation die Verbindung 1 bzw. die Verbindung 2 (siehe 2B) an das pHPMA polymerisiert, um erfindungsgemäße Polymere (Blockcopolymere) herzustellen. Diese wurden mit einer niedrigen „Lebendigkeits“-Rate" synthetisiert. „Lebendigkeit“ ist eine Eigenschaft, die die Kettenverlängerung ermöglicht. Sie gibt an, wie viele „lebende“ Ketten für weitere Blockcopolymerisationen intakt bleiben. Eine geringe „Lebendigkeit“ führt zu hohen Mengen an toten Enden, die zu Polymeren auf Nukleobasenbasis ohne die phenylische Z-Gruppe führen, die bei einer UV-Vis-Spektroskopie-Analyse stören können. Die berechneten „Lebendigkeits“-Raten wurden niedrig gehalten und liegen bei dem Polymer 11 bei 36,0 %, während sie bei dem Polymer 12 bei 15,6 % lagen.
Die Polymerisation der Verbindung 1 bzw. Verbindung 2 wurde in dem Lösungsmittelsystem durchgeführt, das für die Homopolymere am besten geeignet war: Verbindung 1 in 8:2 DMF/H₂O, Verbindung 2 in 9:1 1,4-Dioxan/H₂O. Die Pyrimidin-basierte Verbindung 2 führte zu einem höheren Umsatz und damit zu einem höheren Molekulargewicht als die Purin-basierte Verbindung 1 (siehe 4). Die Monomerumwandlung wurde durch Vergleich der Integrale des Monomerpeaks (1: δ 5,30 ppm; 2: δ 5,61 ppm) mit dem Peak des nukleosidbasierten Polymers (b-piCPMA δ 4,37 ppm oder b-piGPMA δ 6,14 ppm) bestimmt. Der Monomerumsatz bei Polymer 11 betrug 68 %, während er bei Polymer 12 bei 78 % lag (siehe 4).
Die beiden nukleosidbasierten Blockcopolymere 11 und 12 wiesen aufgrund der integrierten Nukleobasen geringe Löslichkeiten in Wasser auf.
Die Blockcopolymere wurden durch eine saure Entschützung der Acetalfunktionalitäten mit Trifluoressigsäure entfernt (2D). Die erfolgreiche Entschützung wurde durch das Verschwinden der beiden Singletts im Upfield, die von den Acetalschutzgruppen von Polymer 11 (δ 1,46 ppm und 1,28 ppm) und Polymer 12 (δ 1,48 und 1,33 ppm) stammen, in der 1H-NMR-Spektroskopieanalyse bestätigt. Durch Schütteln für insgesamt 2 Stunden wurde Polymer 13 und Polymer 14 erhalten (4D), die erfindungsgemäße Polymere darstellen und die eine verbesserte Löslichkeit in Wasser aufweisen.
Beispiel 5 - Assemblierung der Polymere zu Vesikeln
Zur Untersuchung einer Vesikelbildung (siehe 1) aufgrund von Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen zwischen den Purin- und Pyrimidinfunktionalitäten wurden REM- und DLS-Analysen durchgeführt (5 und 6).
Die REM-Bilder zeigen, dass pHPMA-b-pCPMA 13 in wässriger Lösung große Netzwerkstrukturen bilden. Diese Strukturen resultieren aus stärkeren C-C-Wechselwirkungen mit einer breiten Größenverteilung und einer durchschnittlichen Größe von 280 nm. Diese breite Größenverteilung wurde auch mittels DLS mit einem Polydispersitätsindex (PDI) von 0,421 festgestellt. Der durchschnittliche hydrodynamische Durchmesser von Polymer 13 liegt bei 507 nm. REM-Bilder von pHPMA-b-pGPMA 14 zeigen jedoch kleine Partikel aufgrund von G-G-Wechselwirkungen mit einer durchschnittlichen Größe von 86 nm. Die Größenverteilung war laut DLS mit einem durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von etwa 144 nm (PDI = 0,213) kleiner (5)
Das Mischen der beiden komplementären Blockcopolymere führte zu Partikeln mit einem durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von etwa 165 nm und einem PDI von 0,3. Das Erhitzen dieser Mischung auf 100 °C für 30 Minuten und das anschließende Abkühlen führte zu einer engeren Größenverteilung und einer kleineren Durchschnittsgröße von 266 nm und einem hydrodynamischen Durchmesser von 136 nm (6).
Diese Beobachtung könnte durch das Aufbrechen der starken C-C- und G-G-Wasserstoffbindung bei höheren Temperaturen und die Wiederherstellung der C-G-Wechselwirkungen beim Abkühlen auf Raumtemperatur (rt) erklärt werden. Die Beschallung der Polymere 13, 14 und dem Gemisch aus beiden Polymeren 13, 14 führte zu keiner Veränderung der Morphologie, was auf eine hohe Stabilität hinweist.
Nukleobasen zeigen aufgrund von Wasserstoffbrückenbindungen und π-π-Wechselwirkungen eine starke UV-Absorption. Basenpaarungswechselwirkungen von Nukleobasenderivaten führen zu Veränderungen in der UV-Vis-Spektroskopie. Zur Untersuchung der Wasserstoffbrückenbindungs-Wechselwirkungen der komplementären nukleosidhaltigen Polymere 13 und 14 wurden spektrophotometrische Messungen wurden durchgeführt (7).
Die UV-Absorptionsspektren der einzelnen Polymere 13 und 14 wurden mit dem Spektrum der Mischung nach dem Erhitzen verglichen. Die Durchschnittswerte der einzelnen Polymere pHPMA-b-pCPMA 13 und pHPMA-b-pGPMA 14 stimmen mit den Absorptionswerten der Mischung beider Polymere bei gleichen Konzentrationen überein, was auf die Wasserstoffbrückenbindungen der einzelnen Polymere zurückzuführen ist.
Nach einem 30-minütigem Erhitzen des Polymergemischs auf eine Temperatur von > 37°C (100 °C) wurde eine Abnahme der Absorption beobachtet (Hypochromie), die sich aus der Reassemblierung der komplementären C-G-Wechselwirkungen nach dem Erhitzen und Abkühlen ergibt.
Die Hypochromie bei einer Wellenlänge von 260 nm wird als Hinweis auf dsDNA-ähnliche Strukturen angesehen, die im Vergleich zu ssDNA eine geringere Absorption aufweisen. Dies zeigt, dass die gezielte Assemblierung der Polymere 13 und 14 zu Vesikeln über eine Hybridisierung von ihren Nukleobasen erfolgreich war.
Beispiel 6 - Alternative Herstellung von Polymeren erfindungsgemäßer Gemische
In Beispiel 4 wurde ein erstes Beispiel gegeben, wie erfindungsgemäße Polymere, d.h. Polymere eines erfindungsgemäßen Gemisches hergestellt werden können. Im Folgenden wird ein alternatives Herstellungsverfahren angegeben, das ebenfalls auf einer RAFT-vermittelten Polymerisation beruht (siehe auch 8).
An ein Homopolymer, dessen Monomere jeweils einen Aktivester aufweisen, werden über RAFT-vermittelte Polymerisation Monomer von (N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid (HPMA) angehängt, sodass ein Block-Copolymer entsteht, dessen erster Block gebildet wird durch das Homopolymer, dessen Monomere jeweils einen Aktivester aufweisen, und dessen zweiter Block gebildet wird durch Poly-(N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid (pHPMA). Erfolgt nun eine Kupplung und ein Entschützen dieses Block-Copolymers mit einer Nukleobase, die an einen hydrophilen Spacer mit einer Aminogruppe gebunden ist, so reagiert der Aktivester der Monomere des ersten Blocks Block-Copolymers mit der Aminogruppe des an die Nukleobase gebundenene Spacers, wodurch jeweils eine Nukleobase über ihren hydrophilen Spacer und über eine Amidbindung an jeweils ein Monomere des ersten Blocks des Block-Copolymers gebunden wird. Es entsteht somit ein Block-Copolymer, dessen erster Block aus Monomeren besteht, die jeweils (über einen hydrophilen Linker) eine Nukleobase gebunden haben und dessen zweiter Block aus pHPMA besteht.
Beispiel 7 - Assemblierung von verzweigten Polymeren
Das erste Polymer und das zweite Polymer können jeweils ein verzweigtes Polymer sein, d.h. ein Polymer mit mindestens drei Armen (z.B. 3-Arm-PEG oder 4-Arm-PEG).
In diesem Fall ist es vorteilhaft, wenn das erste Polymer und das zweite Polymer die mindestens sechs Nukleobasen, die jeweils kovalent mit je einem Monomer des Polymers verbunden sind, verteilt an einem ersten Ende und an einem zweiten Ende des ersten Polymers bzw. des zweiten Polymer aufweisen. Beispielsweise weist das erste Polymer sechs jeweils kovalent an eine Nukleobase gebundene Monomere an einem ersten Ende auf und sechs jeweils kovalent an eine Nukleobase gebundene Monomere an einem zweiten Ende auf (siehe 9: Oligo-Block 1) und das zweite Polymer weist sechs jeweils kovalent an eine Nukleobase gebundene Monomere an einem ersten Ende auf und sechs jeweils kovalent an eine Nukleobase gebundene Monomere an einem zweiten Ende auf (siehe 9: komplementärer Oligo-Block 2).
Die Verzweigung im ersten Polymer und im zweiten Polymer kann dergestalt realisiert sein, dass jeweils ein Monomer des ersten Polymers und des zweiten Polymers, das nicht (direkt) mit einer Nukleobase verbunden ist und sich zwischen dem ersten und zweiten Ende des ersten bzw. zweiten Polymers befindet (insbesondere in deren Mitte), mit einem weiteren Polymer (z.B. PEG), optional über einen Spacer (bzw. Linker, z.B. ein Polymerlinker), verbunden ist. In diesem Fall zweigt von dem ersten und von dem zweiten Polymer jeweils das weitere Polymer ab, sodass das erste und das zweite Polymer eine Art „Gabelstruktur“ ausbilden (siehe 9). Das weitere Polymer ist vorteilhafterweise dazu geeignet, nach einer Anbindung der ersten Polymere an die zweiten Polymere in einer wässrigen Phase bei einer Temperatur im Bereich von ≤ 37°C eine Phasenseparation zu bewirken (siehe 9: Polymerblock für Phasenseparation).
Enthält das erfindungsgemäße Gemisch zwei verzweigte Polymere, ist es vorteilhaft für eine Assemblierung zu Mizellen bzw. Vesikeln, wenn der Volumenanteil des in wässriger Lösung assemblierenden Bereichs des ersten Polymers und des zweiten Polymers (d.h. des Bereichs, der die Monomere aufweist, die jeweils an eine Nukleobase angebunden sind) möglichst ähnlich ist zu dem Volumenanteil des in wässriger Lösung nicht-assemblierenden Bereichs des ersten Polymers und des zweiten Polymers (d.h. des Bereichs, der die Monomere aufweist, die jeweils nicht an eine Nukleobase angebunden sind).
Das erste Polymer und das zweite Polymer können jeweils ein 4-Arm-PEG aufweisen (z.B. mit einer molaren Masse von 5000 g/mol), wobei mindestens zwei Arme des 4-Arm-PEG die Monomere aufweisen (bevorzugt an deren Ende), die jeweils kovalent an je eine Nukleobase gebunden sind. Diese Monomere können ein Oligomer darstellen, das aus sequentiell an Nukleobasen gebundenen Monomeren besteht (z.B. je Arm vier oder sechs solcher Monomere aufweist). Das Oligomer kann als Oligonukleotid ausgestaltet sein.

Claims

Gemisch, enthaltend a) ein erstes Polymer, das mindestens sechs Nukleobasen aufweist, wobei je eine Nukleobase kovalent mit je einem Monomer des Polymers verbunden ist; und b) ein zweites Polymer, das mindestens sechs Nukleobasen aufweist, wobei je eine Nukleobase kovalent mit je einem Monomer des Polymers verbunden ist, wobei die mindestens sechs Nukleobasen des zweiten Polymers zu den mindestens sechs Nukleobasen des ersten Polymers komplementär sind; dadurch gekennzeichnet, dass das erste Polymer und das zweite Polymer über ihre zueinander komplementären Nukleobasen dazu geeignet sind, in einer wässrigen Lösung bei einer Temperatur von ≤ 37°C durch Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen ihren komplementären Nukleobasen zu Mizellen oder Vesikeln zu assemblieren, und bei einer Temperatur von > 37°C durch Fehlen von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen ihren komplementären Nukleobasen nicht zu Mizellen und nicht zu Vesikeln zu assemblieren.
Gemisch gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch ferner einen Wirkstoff enthält.
Gemisch gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das i) erste Polymer mindestens 20 Monomere enthält oder daraus besteht; und/oder ii) zweite Polymer mindestens 20 Monomere enthält oder daraus besteht.
Gemisch gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das i) erste Polymer mindestens zehn Nukleobasen aufweist, wobei je eine Nukleobase kovalent mit je einem Monomer des ersten Polymers verbunden ist; und ii) zweite Polymer mindestens zehn Nukleobasen aufweist, wobei je eine Nukleobase kovalent mit je einem Monomer des zweiten Polymers verbunden ist, wobei die Nukleobasen des zweiten Polymers zu den Nukleobasen des ersten Polymers komplementär sind.
Gemisch gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem i) ersten Polymer zwischen zwei aufeinanderfolgenden, jeweils mit einer Nukleobase verbundenen, Monomere maximal drei Monomere angeordnet sind, die nicht jeweils kovalent mit einer Nukleobase verbunden sind; und/oder ii) zweiten Polymer zwischen zwei aufeinanderfolgenden, jeweils mit einer Nukleobase verbundenen, Monomere maximal drei Monomere angeordnet sind, die nicht jeweils kovalent mit einer Nukleobase verbunden sind.
Gemisch gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Nukleobasen bei dem i) ersten Polymer um Nukleobasen handelt, die Cytosin, Isocytosin und/oder Adenin enthalten oder daraus bestehen; und/oder ii) zweiten Polymer um Nukleobasen handelt, die Guanin, Isoguanin und/oder Thymin enthalten oder daraus bestehen.
Gemisch gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleobasen des i) ersten Polymers über einen Riboserest mit dem Monomer des ersten Polymers verbunden sind; ii) zweiten Polymers über einen Riboserest mit dem je einem Monomer des ersten Polymers verbunden sind.
Gemisch gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Monomere des ersten Polymers und/oder des zweiten Polymers, die jeweils mit einer Nukleobase verbunden sind, i) jeweils einen Rest enthalten oder daraus bestehen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminosäure-Rest, Zucker-Rest, Ribosephosphat-Rest, Methacrylamid-Rest, und Kombinationen hiervon; und/oder ii) ein Homopolymer ausbilden; und/oder iii) über eine Bindung kovalent mit der Nukleobase verbunden sind, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend Esterbindung, Thioesterbindung, Etherbindung und Amidbindung.
Gemisch gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Monomere des ersten Polymers und/oder zweiten Polymers, die jeweils nicht mit einer Nukleobase verbunden sind, i) jeweils einen Rest enthalten oder daraus bestehen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid-Rest, Vinylamin-Rest, Butadien-Rest, Ethylenoxid-Rest, Acrylsäure-Rest, Aminosäure-Rest, Zucker-Rest, und Kombinationen hiervon; und/oder ii) ein Homopolymer, ein Block-Copolymer oder ein Heteropolymer ausbilden.
Gemisch gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch kein organisches Lösungsmittel enthält.
Gemisch gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der Medizin.
Wässrige Lösung enthaltend ein Gemisch gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste Polymer und das zweite Polymer zumindest teilweise zu Mizellen oder Vesikeln assembliert sind.
Wässrige Lösung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Mizellen und/oder Vesikel einen durchschnittlichen hydrodynamischen Radius, bestimmt über dynamische Lichtstreuung, im Bereich von 30 nm bis 300 nm aufweisen.
Wässrige Lösung gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Mizellen und/oder Vesikeln in einem Innenraum einen Wirkstoff enthalten.
Verwendung einer wässrigen Lösung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 zur thermischen Freisetzung eines Wirkstoffs.