WO2002000162A2 - Drug-delivery-systeme - Google Patents

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WO2002000162A2
WO2002000162A2 PCT/DE2001/002360 DE0102360W WO0200162A2 WO 2002000162 A2 WO2002000162 A2 WO 2002000162A2 DE 0102360 W DE0102360 W DE 0102360W WO 0200162 A2 WO0200162 A2 WO 0200162A2
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WO
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particles
molecules
polymer material
polyvinyl alcohol
polyethylene glycol
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PCT/DE2001/002360
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English (en)
French (fr)
Inventor
Gert Fricker
Rüdiger Marcus FLAIG
Original Assignee
Gert Fricker
Flaig Ruediger Marcus
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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)

Definitions

  • the invention relates to solid particles for transporting active pharmaceutical ingredients, processes for their production, medicaments containing these particles and the use of these particles in various selected indications.
  • a main goal of pharmaceutical research is to intensify the desired effects of known active substances and to minimize the systemic side effects, which is particularly important for substances with high intrinsic and thus unavoidable toxicity (e.g. cytostatics).
  • This can be achieved both by reducing the total dose required for the therapeutic effect and by accumulating the effectors at the desired site of action, both of which are achieved by the controlled, spatially specific release of effector molecules in the broadest sense (proteins, peptides, nucleic acids or low-molecular substances) in the desired manner
  • Target tissue can be accomplished.
  • An efficient way to do this is to store the substances in question in colloidal carrier particles, which are linked to antibodies against or natural ligands for characteristic molecular structures of the target and at the same time are protected against the immune system by inert coating of their surface.
  • a widely used method for the colloidal packaging of pharmaceuticals is to enclose the effectors in lipid membrane-enveloped vesicles (liposomes).
  • liposomes lipid membrane-enveloped vesicles
  • anti-immunogenic coatings e.g. polyethylene glycol
  • the thermal and temporal stability of the vesicles consisting of a single lipid bilayer is limited, as is that Tightness.
  • the permeability of the membranes for hydrophilic substances can be reduced, but the required modified (e.g. fluorinated) lipids are not biologically harmless.
  • a single “hit” of the complement system is sufficient to leak a complete vesicle.
  • the liposomes are loaded (apart from a few special cases) by simply enclosing part of the aqueous phase and are accordingly inefficient: Typically ⁇ 0.5% of the effector substance is enclosed in the vesicles. The substance is exposed to considerable thermal and chemical stresses (the working temperature must be above the critical phase transition temperature of the lipid mixture for a long time, and the reactive groups required for the covalent modification only survive this at a very low pH).
  • Nanoparticles Solid colloidal particles
  • Particles in the micrometer and submicron range made of hydrophobic polymers can in principle be produced by finely dispersing the polymer taken up in a non-polar solvent: by removing the solvent, the polymer precipitates in the form of particles whose diameter is below that of the droplets; loading with hydrophobic substances (in which category most pharmaceuticals fall) can be accomplished by simply adding the substance to the non-polar solvent: after removing the solvent, the active substance is approximately 100% associated with the polymer and remains when the particles are in a aqueous phase are introduced by Van der Waals forces and steric "entrapment" non-covalently, but in the long term stably bound to the particle matrix.
  • AI describes colloidal polymer-active substance associates with a property-optimized branched polyol ester for use in particular on mucosal tissues.
  • No. 5,641,515 describes polymolecular nanoparticles made of polycyanoacrylate containing insulin, which release the complex-bound insulin in a controlled manner.
  • the previously known nanoparticles and methods for their production often have problems in the stability and manufacturability as well as in the degree and extent of the loading and have so far only been used to a very limited extent.
  • the problem of the targeted application of the active ingredient at the desired site of action and the stability of the nanoparticles after administration until the site of action has been reached, the “drug targeting” is only inadequately solved.
  • a central problem is the surface modification of nanoparticles.
  • the particles according to the invention are particularly suitable forms with which an enhancement of the effect and minimization of the side effects is achieved by the controlled and / or spatially specific release of the effector molecule.
  • the particles encompassed by the invention are preferably solid, colloidal and / or lipid-free particle systems.
  • hydrophobized active substances are understood, originally more hydrophilic active substances which have become more hydrophobic due to chemical modification.
  • hydrophobic absorption esters of hydrophilic active substances are understood, originally more hydrophilic active substances which have become more hydrophobic due to chemical modification.
  • hydrophobic absorption esters of hydrophilic active substances are understood, originally more hydrophilic active substances which have become more hydrophobic due to chemical modification.
  • hydrophobic absorption esters of hydrophilic active substances are understood, originally more hydrophilic active substances which have become more hydrophobic due to chemical modification.
  • the organic solvent or solvents are dissolved in water in the ratio solvent: water between 1:10 and 1:50, preferably between 1:20 and 1:40, in particular solve between 1:20 and 1:30 and / or are preferably selected from:
  • Methylene chloride or benzyl alcohol preferably benzyl alcohol.
  • a suitable solvent is by no means restricted to methylene chloride or benzyl alcohol.
  • the water-insoluble organic polymer material is dissolved together with the hydrophobic pharmaceutical active substance (s) and the amphiphilic organic polymer material is first separated therefrom, optionally with the supplementary substance (s) and only then are the solutions for preparing the solution after step (a) mixed.
  • a further preferred form of production of the particles according to the invention comprises that the separately dissolved amphiphilic organic polymer material and / or a supplement, if appropriate also dissolved, before mixing with the non-polar polymer material in a concentration of between 10 and 45% (w / v), preferably between 20 and 40% (w / v), in particular 35% (w / v).
  • the water-insoluble organic polymer material before step (b) in a concentration of between 3 and 0.1% (w / v), preferably between 2 and 0.5% (w / v), in particular 1.7% (w / v).
  • the particles according to the invention are produced by a process in which the solution in step (b) is ultrasonically between 1 h and 15 h, preferably 4 h or 5 h to 10 h, in particular 5 h to 6 h is treated.
  • the ultrasound treatment preferably takes place at maximum power.
  • the concentration ratio in% (w / v) between the water-insoluble organic polymer material from step (a) and the amphiphilic polymer material from step (b) after the completion of step (b) is between 1: 2 and 1:32, is preferably between 1: 4 and 1:28, in particular between 1: 8 and 1:20, preferably between 1:12 and 1:16, in particular 1:14.
  • step (a) is selected from
  • Polyesters preferably polylactic acid (polylactide), polyglycolide or polylactide / polyglycolide copolymers (PLGA), in particular pure polylactide, pure polypropylene glycol, or polylactide polyglycolide copolymer
  • biocompatible, degradable synthetic polymers such as, for example, Corresponding polyanhydrides, polyamino acids, polycyanoacrylates, polyacrylamides or polyurethanes can be used.
  • amphiphilic organic polymer material from step (a) is selected from
  • Polyvinyl alcohol or derivatives of polyvinyl alcohol preferably pure polyvinyl alcohol, esters of polyvinyl alcohol and a hydrophobic carboxylic acid (preferably fatty acid) or coesters, in which each molecule of the polyvinyl alcohol contains at least one hydrophobic
  • Carboxylic acid (preferably fatty acid) and a second, different carboxylic acid is esterified.
  • Alkali or alkaline earth metal salts of organic acids especially magnesium salts, preferably magnesium acetate.
  • process steps (a) to (c) take place at physiological temperatures, preferably between 35 and 40 ° C., in particular at 37 ° C.
  • Another object of the invention that fulfills the object of the invention is solid particles for transporting hydrophobic or hydrophobized pharmaceutical active substances, which comprise a core contain organic, water-insoluble polymer material and an outer layer of non-covalently bound to the molecules of the core amphiphilic polymer material and in which the amphiphilic polymer material is selected from
  • the particles contain non-covalently bound, hydrophobic or hydrophobized pharmaceutical active ingredient.
  • amphiphilic polymer material is selected from among these particles according to the invention
  • amphiphilic organic polymer material used is selected from polyesters of polyvinyl alcohol in which each molecule of the polyvinyl alcohol is esterified with at least one hydrophobic carboxylic acid (preferably fatty acid) and a second, different carboxylic acid, wherein the hydrophobic carboxylic acid is preferably selected from fatty acids with a length between 10 and 24 carbon atoms, which are preferably not or not substituted with COOH, OH, SH or NH 2 , in particular not substituted with COOH or OH, preferably selected from
  • Cio-Ciö fatty acids especially lauric acid
  • the second, different carboxylic acid is selected from carboxylic acids, which are preferably not substituted with COOH or OH and preferably with SH or NH 2 , preferably NH2, in particular
  • Amino acids preferably alanine
  • Polyvinyl alcohol is esterified with at least one fatty acid and at least one amino acid, in particular polyvinyl laurate-co-ß-alanate, preferably polyvinyl laurate (25%) - co-ß-alanate (7%).
  • the particles are nanoparticles and / or accordingly have a length in at least two dimensions of between 10 and 500 nm, preferably ⁇ 150 nm, in particular 50 to 100 nm.
  • Nanoparticles are understood in the narrower sense of this invention to mean particles which have a length of less than 1 ⁇ m in each dimension and, in a broader sense, particles which have a length of less than 1 ⁇ m in at least two dimensions. Among the closer In particular, the definition also includes all particles which have a volume of less than 1 ⁇ m, preferably 0.01 ⁇ m, in particular 0.0001 ⁇ m. Nanoparticles are solid colloidal particles.
  • the invention therefore furthermore relates to particles for transporting pharmaceutical active substances to which linker molecules which have an amino- and / or thiol-reactive, preferably an amino-reactive, group are covalently above (ie before modification by linking the particle to the linkers) free NH 2 or SH groups, preferably NH 2 groups, are bound on the surface of the particle.
  • Linker molecules are understood to mean polymers, in particular unbranched polymers, which change the properties, in particular the surface properties, of the particle, but in particular serve for the sterically favorable attachment of other bioactive compounds to the particles or, if appropriate, also sterically protect the particles from degradation.
  • Reactive group is to be understood in particular as groups known in the prior art which bind easily to amino, thiol or hydroxyl groups, and also epoxy or vinyl groups.
  • linker molecules are bifunctional and, in addition to an amino- or thiol-reactive, preferably amino-reactive, grouping at another end of the molecule also have a further, differently reactive functional grouping, preferably a thiol-reactive grouping.
  • linker molecules are a mixture of bifunctional molecules - as described above - and monofunctional molecules which only carry either the amino-reactive or the thiol-reactive, preferably the amino-reactive, grouping.
  • Another preferred object of the invention are particles for the transport of pharmaceutical active substances, in which a mixture of two types of linker molecules is present on the surface of the particle, which are covalently bonded to the surface of the particle at one end of the linker molecule via a reactive grouping , wherein one type of linker molecule (bi-functional) carries at least one other end of the molecule a further reactive grouping, while the other type of linker molecule (monofunctional) carries no other reactive groupings at any other end of the molecule.
  • linker molecules are polyglycolides, preferably polyethylene glycol derivatives, in particular NHS ester polyethylene glycol or NHS ester / vinyl sulfone polyethylene glycol.
  • the particles according to the invention provided with linkers are nanoparticles.
  • the particles are particles according to the invention previously described in the preceding sections without mention of linkers.
  • bioactive macromolecules or “searcher” molecules selected from peptides, proteins; preferably antibodies, are attached to the bifunctional linker molecules.
  • Antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as "single-chain”antibodies; hormones, sugars, preferably glycosides; synthetic or natural receptor ligands; proteins or peptides with a free cysteine group or thio sugars, are coupled, coupled or have been coupled before the surface modification
  • the term “finder” molecule in the sense of this invention generally refers to compounds which can be coupled to the particles according to the invention and which are capable, with high affinity for the biological targets of the active substances, as if there were proteins, peptides, polysaccharides, oligosaccharides, lipoproteins , Glycoproteins or other biological molecules that are expressed either in healthy tissue (physiological) or in or near diseased tissue (pathological).
  • Finder molecules can, for example, peptides, proteins, for example antibodies, antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as "single-chain”antibodies; hormones, sugars, for example glycosides; synthetic or natural receptor ligands. Antibodies, derivatives, fragments and glycosides are particularly preferred.
  • bioactive macromolecules or generally “searcher” molecules preferably antibodies, antibody fragments or, are attached to the bifunctional linker molecules
  • Antibody derivatives with target-binding properties such as "Single-chain” antibodies, in particular with a free cysteine group, are coupled, are coupled or were coupled before the surface modification. This applies in particular to particles whose coating contains significantly more monofunctional than bifunctional molecules.
  • bioactive micromolecules or “searcher” molecules are attached to the bifunctional linker molecules
  • any subsequent cleaning or isolation is preferably carried out via dialysis, preferably with selective exclusion membranes.
  • the pharmaceutical active ingredient to be transported is a synthetic or natural active ingredient, a protein, peptide, lipid, sugar or nucleic acid or a low molecular weight organic or high molecular weight organic active ingredient, for example a hormone, an antineoplastic substance, an antibiotic , Antifungal, parasite, virustatic or antihelmintic, a cardiovascular active substance; a central active substance, especially an analgesic, antidepressant or antiepileptic; is.
  • the particle is direct or via a Linker, preferably via bifunctional polyethylene glycol molecules, is linked to a “viewfinder” molecule selected from:
  • Peptides, proteins preferably antibodies, antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as "single-chain" -
  • bifunctional polyethylene glycol molecules for the surface modification of particles for the transport of active pharmaceutical ingredients is an important part of this invention.
  • Another object of this invention is therefore the use of pure bifunctional polyethylene glycol molecules, preferably NHS ester / vinyl sulfone polyethylene glycol; or mixtures of bifunctional and monofunctional polyethylene glycol molecules, preferably NHS ester
  • Polyethylene glycol with NHS ester / vinyl sulfone polyethylene glycol for the production of surface-substituted solid particles for the transport of active pharmaceutical ingredients.
  • “seeker” molecules are selected from the bifunctional polyethylene glycol molecules
  • Peptides, proteins preferably antibodies, antibody fragments or antibody derivatives with target-binding properties such as single-chain antibodies; Hormones, sugars, preferably glycosides; synthetic or natural receptor ligands; Proteins or peptides with a free cysteine group or thio sugars
  • the particles are bound to the particles, preferably when using pure bifunctional polyethylene glycol molecules, gylycosides, especially thiosugar; when using mixtures of bifunctional and monofunctional polyethylene glycol molecules, antibodies,
  • Antibody fragments or antibody derivatives with target binding properties such as single-chain antibodies, preferably antibodies with a free cysteine group.
  • the processes for producing particles according to the invention are also an important part of the invention.
  • the invention therefore furthermore relates to a process for producing a particle according to the invention, in particular the second type of particle with PLGA (polylactide / polyglycolide) described, which comprises the following steps:
  • the particles according to the invention are particularly suitable forms for enhancing the desired effects of known active substances and for minimizing systemic side effects by the controlled and / or spatially specific release of the effector molecule. They are therefore suitable and intended to be used in a wide variety of therapeutic agents.
  • the invention therefore furthermore relates to medicaments which contain particles according to the invention and, if appropriate, suitable additives and / or auxiliaries.
  • the pharmaceuticals according to the invention can be administered as liquid dosage forms in the form of aerosols, injection solutions, drops or juices or as semi-solid dosage forms in the form of granules, tablets, pellets or capsules.
  • Suitable additives and / or auxiliaries are, for example, solvents or diluents, stabilizers, suspending agents, buffer substances, preservatives, and also dyes, fillers and / or binders.
  • the selection of excipients and the amounts to be used depend on whether the medicinal product is inhaled, orally, orally, parenterally, intravascularly, for example. should be administered intravenously, intraperitoneally, rectally, subcutaneously or intramuscularly.
  • Preparations in the form of tablets, dragees, capsules, granules or suspensions such as drops, juices and syrups are suitable for oral applications, suspensions and easily reconstitutable dry preparations are suitable for other applications.
  • the particles according to the invention are particularly suitable forms with which an enhancement of the effect and minimization of the side effects is achieved by the controlled and / or spatially specific release of the effector molecule, so that these particles are and are generally usable for producing therapeutic agents of course generally suitable for an unlimited number of indications. Without wishing to restrict the use of the particles according to the invention to this, their use lends itself to special indications.
  • Another object of the invention is therefore the use of the particles according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer, for the treatment of infectious diseases and parasitoses, for the treatment of diseases and symptoms with a central nervous cause, for use in gene therapy or for genomic targeting.
  • cytostatics on tumor cells in the transport of therapeutically usable substances through the blood-brain barrier and in the treatment of serious infections (in particular by eukaryotes) is also preferred.
  • Further possible uses include, for example, the transfer of plant alkaloids with a microbicidal action in trypanosomes and of antioxidants and anti-inflammatory compounds [vitamin E, gallic acid, N-acetyl-L-cysteine, 2,6-bis (tert-butyl) -4-mercaptophenol, ibuprofen and gentisic acid] in (degenerative) brain diseases, the transfer of substances in hepatocytes, primarily for the treatment of neoplasms, also the increase in the effect of primaquine on the Plasmodiwn-RypnozoitQn that persist in the liver cells.
  • Another object of the method is also the treatment of a person or animal who needs this treatment with or using the particles according to the invention. This treatment is particularly suitable for the aforementioned indications and types of use.
  • Figure 1 shows schematically the general structure and shape of particles according to the invention, simple particles, simple stealth particles, target-seeking actinospheres and target-seeking acanthospheres.
  • Figure 2 shows the uniformity in the size distribution of particles produced according to the invention according to Example 1.
  • the invention encompassed particles, in particular nanoparticles, in which the possibility of incorporating active substances into colloidal carrier particles is realized. These can, for example, with Antibodies against or natural ligands for characteristic molecular structures of the target or other “searcher molecules” are linked. Optionally, the nanoparticles can also be protected against the immune system, for example, at the same time by inert coating of their surface.
  • the particles described by the invention which are described here as examples, are Colloidal, lipid-free particle systems
  • Some of the particles described here, which are encompassed by the invention are referred to below with the general terms actinospheres and acanthospheres (see Fig. 1). These terms, because they denote structural concepts and non-steric basic forms, are independent of the maintain actual geometry.
  • the amphiphilic organic polymer is reactive functional Provide groups that make it possible to chemically couple additional components to it.
  • Polylactic acid polylactide, PLA
  • PLA polylactide
  • Existing literature on the production of particles in the size range of 1-10 ⁇ m proves the suitability of this substance, which has the advantage of biodegradability compared to most other polymers.
  • nanoparticles were based on the substance RG752 (from Boehringer Ingelheim), a block copolymer of 75%
  • the duration of the ultrasound treatment has no discernible influence on the particle size, but it does have an impact on the yield of usable particles: after a treatment of 15 minutes, around 90% of the counted particles, which together, however, only make up - 1% of the total polylactide mass, in the desired size range, while the rest consists of microparticles; after sonication, the nanoparticle fraction comprises ⁇ 10% of the mass; after 5 -6 hours, between 70% and 99% of the total polylactide is converted into nanoparticles.
  • the rest are in two largely discrete microparticle fractions, a smaller one with a diameter of half to whole and a larger one with a diameter of several micrometers, which could reflect a two-phase course of the dispersion process.
  • decomposition (recognizable by the discoloration) and clumping began, until after 24 h the entire reaction mixture had degenerated to a waxy mass.
  • the size distribution observed after filtration is comparable to that of a good preparation of liposomes; the advantage lies in the incomparably higher packaging efficiency.
  • the surface properties of the particles could be changed. Hydrophobization of the polyvinyl alcohol, the water solubility of which is at the upper limit for a coating substance, turned out to be essential, since the exclusive introduction of reactive groups increased the hydrophilicity of the polyvinyl alcohol to such an extent that the same simply went into solution and there was no longer any particle formation , This could be achieved by partial esterification with fatty acids via the acid chlorides.
  • the polyvinyl laurate (20%) obtained in this way showed particle binding properties which were superior to those of the original polyvinyl alcohol: With comparable amounts of protective colloid, somewhat smaller particles were formed with polyvinyl laurate in a significantly shorter sonication time and with a higher yield.
  • polyvinyl alcohol was reacted simultaneously with different amounts of lauryl chloride and ⁇ -alanyl chloride, so that polyvinyl laurate (25%) - co- ⁇ -alanate (7%) was formed.
  • This substance was comparable to polyvinyl laurate in its particle formation properties, but provided large amounts of covalently bonded primary amino groups. Due to the loose surface structure, which allows the charges of NH 4 + groups to be balanced by interposed acetate, no surface potential was observed, but the existence of the was to clearly detect supermolecular structures bound amino groups by chemical means.
  • Polyethylene glycol molecule that carries an amino-reactive group at one end and a different group with a different reactivity at the other end.
  • This bifunctional polyethylene glycol removes the particles from the immune system by sterically blocking the surface with an inert molecule (something similar has been tried out in connection with liposomes under the name "stealth technology") and further stabilizes them; on the other hand, the possibility is offered to add further molecules that convey the actual target specificity to the particles in a spatially favorable and flexible position.
  • These molecules can be micromolecules, e.g.
  • bifunctional polyethylene glycol in which case the bifunctional polyethylene glycol can be used exclusively (actinospheres), or macromolecules such as antibodies (acanthospheres), in which case it is advisable for steric reasons, only one implement small part of the functional groups on the particle surface with bifunctional polyethylene glycol and the rest by Saturate monofunctional polyethylene glycol, which then serves only for the physical and immunological stabilization of the particles.
  • particles coated with polyvinyl laurate (25%) - co-ß-alanate (7%) with NHS ester / vinylsulfone-polyethylene glycol in a weakly basic environment and subsequent purification by dialysis against water particles can accordingly be obtained which are at the distal, largely freely movable end of the polyethylene glycol "spines" bound covalently to the particle surface carry thiol-reactive groups.
  • the loading of the nanoparticles was tested by means of the relatively hydrophobic fluorescent dye 4-di-10ASP from the group of dialkylaminostyrenes (from Molecular Probes Inc.), which can be used for staining cell membranes, and met the expectations based on the measured size distributions: about 90% of the used Fluorescent dye was properly packaged in nanoparticles.
  • 4-di-10ASP from the group of dialkylaminostyrenes
  • the structural stability of the particles proved to be remarkably high: without the addition of preservatives or the like. no significant change in size distribution or 4-di-10 ASP loading could be determined after eight weeks of storage at room temperature without the addition of stabilizing substances.
  • Particles for the transport of active pharmaceutical ingredients with a volume ⁇ 1 ⁇ m loaded with tritium-labeled daunomycin were linked via their surface amino groups either to monofunctional polyethylene glycol (PEG) or via bifunctional (NHS-ester / vinylsulfone) PEG with an average molecular weight of 3400 Da with cysteine residues different "seeker" proteins coupled:
  • the acanthospheres were incubated with parasites of the parasitic unicellular type Trypanosoma brucei brucei and binding and cytotoxicity were determined.
  • the results of the binding and cytotoxicity studies show a correlation between cytotoxicity and binding.
  • the acanthospheres provided with "searcher” proteins significantly reduced the cell density of the parasites compared to controls, ie a pronounced cytotoxic effect was observed. In the absence of "searcher” proteins, however, no binding or cytotoxicity was observed at the same Daunomycm concentration ,

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Abstract

Die Erfindung betrifft solide Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, Verfahren zu deren Herstellung, Arzneimittel enthaltend diese Partikel sowie die Verwendung dieser Partikel in verschiedenen ausgewählten Indikationen.

Description

Drug-Delivery-Systeme
Die Erfindung betrifft solide Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, Verfahren zu deren Herstellung, Arzneimittel enthaltend diese Partikel sowie die Verwendung dieser Partikel in verschiedenen ausgewählten Indikationen.
Ein Hauptziel der pharmazeutischen Forschung ist es, die gewünschten Effekte bekannter Wirkstoffe zu verstärken und die systemischen Nebenwirkungen zu minimieren, was insbesondere bei Substanzen mit hoher intrinsischer und damit unvermeidlicher Toxizität (z. B. Cytostatika) von großer Bedeutung ist. Dies kann sowohl über Verringerung der für die therapeutische Wirkung benötigten Gesamtdosis als auch über Ansammlung der Effektoren am gewünschten Wirkort erreicht werden, was beides durch die kontrollierte, räumlich spezifische Freisetzung von Effektormolekülen im weitesten Sinn (Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren oder niedermolekularen Substanzen) im gewünschten Zielgewebe bewerkstelligt werden kann. Darunter ist insbesondere der spezifische Transfer von therapeutisch oder diagnostisch nutzbaren Substanzen in definierte biologische Ziele («drug delivery», «drug targeting») zu verstehen, der ein wichtiges Ziel der gegenwärtigen pharmazeutischen Forschung ist. Die heute verfügbare Antikörpertechnologie erlaubt die Erzeugung von hochaffinen Bindungspartnern für nahezu jede beliebige biologische Struktur; überdies sind zahlreiche natürliche Liganden für zelluläre Rezeptoren charakterisiert und kloniert worden, so dass es kein Problem mehr darstellt, Moleküle mit hoher und spezifischer Affinität zu den gewünschten Zielen zu erzeugen. In vielen Fällen sind auch niedermolekulare Liganden (z. B. Glykoside) bekannt, die auf chemischem Weg imitiert und somit zur Zielsteuerung verwendet werden können. Jedoch üben diese «Suchermoleküle», ob mikro- oder makromolekular, selber im allgemeinen keine pharmazeutisch nutzbare Funktion aus, während die Effektoren selbst nicht zielspezifisch sind. Ein Hauptaugenmerk muss daher darauf liegen, diese Trennung zu überbrücken und das therapeutische Potential der verfügbaren Effektoren mit der Zielspezifität der Suchermoleküle zu verbinden.
Der effizienteste bislang bekannte Ansatz zum Erreichen dieses Ziels besteht in der Verwendung von Trägerstrukturen im kolloidalen (d.h. Submikrometer-) Größenbereich, an deren Oberflächen entsprechende Zielsuchermoleküle gebunden werden können. Auf diese Weise werden sowohl optimales Verhältnis von Zielsucher- zu Effektormolekülen als auch maximale Flexibilität erreicht: Während durch direkte kovalente Kopplung an ein einzelnes Antikörper- oder anderes Ligandenmolekül nur wenige (<10) Effektormoleküle gebunden werden können (was bei einem Molekulargewicht eines Antikörpers von rund 150 kDa bedeutet, dass über 90% der Masse des Konjugats auf den Antikörperteil entfallen) und Konjugate mit niedermolekularen Suchern üblicherweise ein molares Verhältnis von 1 : 1 aufweisen, ist mit kolloidalen Systemen ein Effektor : Zielsucher- Verhältnis von 103 — 104 realisierbar. Überdies wird keine chemische Veränderung des Effektors benötigt, was in jeder Hinsicht vorteilhaft ist.
Eine effiziente Möglichkeit hierzu besteht darin, die betreffenden Substanzen in kolloidale Trägerpartikel einzulagern, welche mit Antikörpern gegen oder natürlichen Liganden für charakteristische Molekularstrukturen des Ziels verknüpft und zugleich durch inerte Beschichtung ihrer Oberfläche gegen das Immunsystem geschützt werden.
Eine vielverwendete Methode zur kolloidalen Verpackung von Pharmaka besteht darin, die Effektoren in lipidmembranumhüllte Vesikel (Liposomen) einzuschließen. Durch Verwendung entsprechender Membrankomponenten ist es möglich, zum einen die gewünschten Zielsuchermoleküle an die Liposomenmembranen zu binden, zum anderen die Träger mit antiimmunogenen Beschichtungen (z. B. Polyethylenglykol) zu überziehen und dadurch vor der unspezifischen Entfernung aus dem Blutstrom durch das retikuloendotheliale System zu schützen. Den Vorteilen dieses Systems stehen folgende gravierende Nachteile gegenüber:
- Die thermische und zeitliche Stabilität der aus einer einzelnen Lipiddoppelschicht bestehenden Vesikel ist begrenzt, ebenso die Dichtigkeit. Die Durchlässigkeit der Membranen für hydrophile Stoffe kann prinzipiell verringert werden, jedoch sind die benötigten veränderten (z. B. fluorierten) Lipide biologisch nicht unbedenklich. Überdies genügt ein einzelner «Treffer» des Komplementsystems zum Auslaufen eines vollständigen Vesikels.
- Die mangelnde Stabilität der Membranvesikel begrenzt ihrerseits die mögliche Variabilität in der Oberflächengestaltung und limitiert dadurch die potentiellen Anwendungen.
- Nur hydrophile Substanzen können in der wässrigen Innenphase der Vesikel in genügender Konzentration transportiert werden.
- Die Beladung der Liposomen erfolgt (von wenigen Spezialfällen abgesehen) durch einfachen Einschluss eines Teils der wäßrigen Phase und ist dementsprechend ineffizient: Typischerweise werden <0.5% der Effektorsubstanz in die Vesikel eingeschlossen. Hierbei wird die Substanz beträchtlichen thermischen und chemischen Belastungen ausgesetzt (die Arbeitstemperatur muss für längere Zeit oberhalb der kritischen Phasenübergangstemperatur des Lipidgemisches liegen, und die für die kovalente Modifikation benötigten reaktiven Gruppen überstehen dies nur bei sehr niedrigem pH- Wert).
- Die Hälfte der membranständigen reaktiven Gruppen, die zur Verknüpfung mit proteinösen Suchmolekülen benötigt wird, befindet sich nach der Vesikelbildung auf der Innenseite und steht nicht zur Bindung zur Verfügung, wird jedoch nach der Auflösung der Liposomen im Organismus freigesetzt und kann zu unvorhersehbaren Reaktionen fuhren.
- Die chemische Kopplung von Proteinen an liposomale Membranen (z. B. über direkt oder über einen Polyethylenglykolarm mit Lipiden verknüpftes SPDP) führt zur Bildung hochimmunogener Strukturen, die bereits zur Vakzinierung erfolgreich eingesetzt wurden, auf dem Gebiet des «drug targeting» jedoch als unbrauchbar angesehen werden müssen, da sie zu einer Immunreaktion gegen die Partikel fuhren.
Als Alternative stehen solide Kolloidpartikel («Nanopartikel») zur Verfügung. Nanopartikel sind prinzipiell bekannt. Partikel im Mikrometer- und Submikrometerbereich aus hydrophoben Polymeren können prinzipiell durch feine Dispergierung des in einem unpolaren Lösungsmittel aufgenommenen Polymers produziert werden: Durch Entfernung des Lösungsmittels fällt das Polymer in Form von Partikeln, deren Durchmesser unter dem der Tröpfchen liegt, aus; eine Beladung mit hydrophoben Substanzen (in welche Kategorie die meisten Pharmaka fallen) kann durch einfachen Zusatz der Substanz zum unpolaren Lösungsmittel bewerkstelligt werden: Nach Entfernen des Lösungsmittels liegt die Wirksubstanz zu annähernd 100% mit dem Polymer assoziiert vor und bleibt, wenn die Partikel in eine wässrige Phase eingebracht werden, durch Van-der-Waals-Kräfte und sterisches „Entrapment" nichtkovalent, aber längerfristig stabil an die Partikelmatrix gebunden. Essentiell ist hierbei, dass eine nachträgliche Koagulation der hydrophoben Partikel (deren große Kontaktfläche mit dem hydrophilen Medium energetisch ungünstig ist) verhindert wird, was beispielsweise durch Herstellung der Partikel in Anwesenheit einer amphiphilen Substanz, welche zwischen hydrophober Partikelmatrix und hydrophilem Medium vermittelt, geschehen kann.
Konventionelle Nanopartikel und deren Herstellung und Möglichkeiten einer Oberflächenvariation sind aus der WO 96/20698 bekannt, wobei das System hier insbesondere für den intravaskulären Einsatz, insbesondere bei der Restenose optimiert wurde. Die Patentamneldung beschreibt polymolekulare Nanopartikel aus natürlichen oder synthetischen Polykondensaten mit einem überwiegend allgemein beschriebenen eigenschaftsmodifizierenden Oberflächenüberzug aus natürlichen oder synthetischen Makromolekülen.
Beispielhaft seien weiter die folgenden Dokumente genannt.
Die DE 198 10 965 AI beschreibt polymolekulare Nanopartikel aus einem Polyelektrolytkomplex aus Polykationen und Polyanionen, der mit einem Vernetzungsmittel behandelt wird.
In der DE 198 39 515 AI werden kolloidale Polymer- Wirkstoffassoziate mit einem eigenschaftsoptimierten verzweigten Polyolester zum Einsatz insbesondere an mucosalen Geweben beschrieben.
Die US 6,117,454 beschreibt insbesondere polymolekulare Nanopartikel, die durch einen Überzug aus Fettsäurederivaten zum Durchdringen der Blut-Hirnschranke geeignet sind. In der US 5,840,674 werden fest über einen „Linker" kovalent gebundene Komplexe aus Wirkstoff und Mikropartikel insbesondere zum Einsatz gegen Mikroorganismen beschrieben.
Die US 5,641,515 beschreibt polymolekulare Nanopartikel aus Polycyanacrylat enthaltend Insulin, die das komplex gebundene Insulin kontrolliert f eisetzen.
Die bisher bekannten Nanopartikel und Methoden zu deren Herstellung weisen häufig Probleme in der Stabilität und Herstellbarkeit wie auch im Grad und Umfang der Beladung auf und sind bisher nur sehr begrenzt einsetzbar. Insbesondere ist auch das Problem der gezielten Applikation des Wirkstoffes am gewünschten Wirkort und der Stabilität der Nanopartikel nach Gabe bis zum Erreichen des Wirkortes, das „Drug Targeting" nur unzureichend gelöst. Ein zentrales Problem besteht in der Oberflächenmodifikation von Nanopartikeln. Wie oben bereits angeführt, stellen konventionelle solid-nanopartikuläre Systeme (im Gegensatz zu Liposomen) aufgrund ihrer extrem hohen spezifischen Interphase zwischen hydrophober Partikelmatrix und hydrophilem Medium ein energetisch ungünstiges System dar, das in Abwesenheit von Stabilisatoren instabil ist: Durch Zusammenlagerung von Partikeln wird die energetisch ungünstige Berührungsfläche minimiert, eine Ausfällung des hydrophoben Partikelmaterials ist die Folge.
Aus diesem Grund benötigen konventionelle Nanopartikel einen Überzug, beispielsweise aus amphiphilen Molekülen, die die Grenzflächenenergie herabsetzen und auf diese Weise die Partikel stabilisieren. Dieser Überzug deckt die Partikelmatrix vollständig ab und entzieht sie so dem Zugang modifizierender Agentien. Eine Modifikation gerade der amphiphilen Moleküle führt aber andererseits zu einer drastischen Veränderung der physikalischen Eigenschaften und damit zu einer Destabilisierung des Überzugs. Aus diesem Grund ist es kaum möglich, konventionelle Nanopartikel so zu modifizieren, dass Bindung von Liganden und damit ein Einsatz im Gebiet des „drug targeting" möglich ist. Die bisher im Stand der Technik angebotenen Lösungen behandeln die Oberflächenmodifikation entweder nur generell oder so spezifisch an einem Problem ausgerichtet, dass eine generellere Anwendung nicht möglich ist oder die vorgelegte Lösung an sich schon nachteilig ist.
Aufgabe der Erfindung war es daher, Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, die die geschilderten Nachteile nicht aufweisen und insbesondere in der Lage sind, eine spezifische Freisetzung am Wirkort zu erreichen.
Die Lösung dieser Aufgabe wird durch solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe erreicht, die durch ein Verfahren mit folgenden Schritten herstellbar sind:
(a) Herstellung einer Lösung in einem oder einem Gemisch von organischen Lösungsmitteln) enthaltend mindestens einen hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff, wasserunlösliches organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial sowie gegebenenfalls
Ergänzungsstoffe,
(b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
(c) Dialyse der Lösung gegen H20
(d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.
Die erfindungsgemäßen Partikel, sind besonders geeignete Formen, mit denen eine Verstärkung der Wirkung und Minimierung der Nebenwirkungen durch die kontrollierte und/oder räumlich spezifische Freisetzung des Effektormoleküls erreicht wird. Generell handelt es sich bei den von der Erfindung umfassten Partikeln vorzugsweise um solide, kolloidale und/oder lipidfreie Partikelsysteme.
Dabei versteht man unter hydrophobisierten Wirkstoffen, ursprünglich hydrophilere Wirkstoffe, die durch chemische Modifikation hydrophober geworden sind. Ein Beispiel sind hydrophobe Resorptionsester hydrophiler Wirkstoffe.
Bei Herstellung der vorstehenden erfindungsgemäßen Nonopartikel ist es besonders bevorzugt, wenn das oder die organischen Lösungsmittel sich in Wasser im Verhältnis Lösungsmittel : Wasser zwischen 1:10 und 1:50, vorzugsweise zwischen 1:20 und 1:40, insbesondere zwischen 1 :20 und 1 :30 lösen und/oder vorzugsweise ausgewählt sind aus:
Methylenchlorid oder Benzylalkohol, vorzugsweise Benzylalkohol.
Dabei ist die Wahl des geeigneten Lösungsmittels aber keinesfalls auf Methylenchlorid oder Benzylalkohol beschränkt.
Weiter ist es bevorzugt, wenn bei der Herstellung der erfindungsgemässen Partikel das wasserunlösliche organische Polymermaterial zusammen mit dem oder den hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff(en) gelöst und das amphiphile organische Polymermaterial davon zunächst getrennt, gegebenenfalls mit dem oder den Ergänzungsstoff(en), gelöst wird und die Lösungen zur Herstellung der Lösung nach Schritt (a) erst dann gemischt werden.
Eine weitere bevorzugte Form der Herstellung der erfindungsgemäßen Partikel beinhaltet, dass das separat gelöste amphiphile organische Polymermaterial und/oder ein gegebenenfalls mitgelöster Ergänzungsstoff vor der Mischung mit dem unpolaren Polymermaterial in einer Konzentration von zwischen 10 und 45 % (w/v), vorzugsweise zwischen 20 und 40 % (w/v), insbesondere von 35 % (w/v) vorliegt.
Genauso bevorzugt ist es, wenn das wasserunlösliche organische Polymermaterial vor dem Schritt (b) in einer Konzentration von zwischen 3 und 0,1 % (w/v), vorzugsweise zwischen 2 und 0,5 % (w/v), insbesondere von 1,7 % (w/v) vorliegt.
Weiter bevorzugt ist es, wenn die erfindungsgemäßen Partikel nach einem Verfahren hergestellt werden, bei dem die Lösung in Schritt (b) zwischen 1 h und 15 h, vorzugsweise 4 h oder 5 h bis 10 h, insbesondere 5 h bis 6 h, mit Ultraschall behandelt wird. Dabei die Ultraschallbehandlung bevorzugt bei maximaler Leistung statt.
Genauso bevorzugt ist es, wenn das Konzentrationsverhältnis in % (w/v) zwischen dem wasserunlöslichen organischen Polymermaterial aus Schritt (a) und dem amphiphilen Polymermaterial aus Schritt (b) nach Abschluss von Schritt (b) zwischen 1 : 2 und 1 : 32, vorzugsweise zwischen 1 : 4 und 1 : 28, insbesondere zwischen 1 :8 und 1 :20, vorzugsweise zwischen 1 : 12 und 1 : 16, insbesondere 1 : 14 beträgt.
Bei Herstellung der vorstehenden erfindungsgemäßen Partikel ist es besonders bevorzugt, wenn das wasserunlösliche, organische Polymermaterial aus Schritt (a) ausgewählt ist aus
Polyestern, vorzugsweise Polymüchsäure (Polylaktid), Polyglykolid oder Polylaktid/Polyglykolid Copolymeren (PLGA), insbesondere reinem Polylaktid, reinem Polypropylenglykol, oder Polylaktid Polyglykolid Copolymer
(beispielsweise im Verhältnis 3 :1).
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Partikel kann allerdings auch auf andere biokompatible, abbaubare synthetische Polymere wie z.B. entsprechende Polyanhydride, Polyaminosäuren, Polycyanoacrylate, Polyacrylamide oder Polyurethane zurückgegriffen werden.
Bei Herstellung der vorstehenden erfindungsgemäßen Partikel ist es bevorzugt, wenn das amphiphile organische Polymermaterial aus Schritt (a) ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol bzw. Derivaten des Polyvinylalkohols, vorzugsweise reinem Polyvinylalkohol, Estern aus Polyvinylalkohol und einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) oder Coestern, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben
Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist.
Bei Herstellung der vorstehenden erf ndungsgemäßen Partikel ist es besonders bevorzugt, wenn der oder die Ergänzungsstoffe ausgewählt ist/sind aus
Alkali- oder Erdalkalisalzen organischer Säuren, insbesondere Magnesiumsalzen, vorzugsweise Magnesiumacetat.
Ebenso bevorzugt ist es, wenn die Verfahrensschritte (a) bis (c) bei physiologischen Temperaturen, vorzugsweise zwischen 35 und 40°C, insbesondere bei 37°C stattfinden.
Ein weiterer, die Aufgabe der Erfindung erfüllender Gegenstand der Erfindung sind solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe, die einen Kern aus organischem, wasserunlöslichen Polymermaterial und eine Außenschicht aus nichtkovalent an die Moleküle des Kerns gebundenen amphiphilen Polymermaterial enthalten und bei denen das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol bzw. Estern des Polyvinylalkohols.
Dabei ist es besonders bevorzugt, dass die Partikel nichtkovalent gebundenen, hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff enthalten.
Ebenso bevorzugt ist es, wenn bei diesen erfindungsgemäßen Partikeln das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus
reinem Polyvinylalkohol, Estern aus Polyvinylalkohol und einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) oder Coestern, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist.
Es ist für alle vorstehend genannten erfindungsgemäßen Partikel eine ausgewählte Ausfuhrungsform, wenn das verwendete amphiphile organische Polymermaterial ausgewählt ist aus Coestern des Polyvinylalkohols, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist, wobei die hydrophobe Carbonsäure vorzugsweise ausgewählt ist aus Fettsäuren einer Länge zwischen 10 und 24 C-Atomen, die vorzugsweise nicht oder nicht mit COOH, OH, SH oder NH2, insbesondere nicht mit COOH oder OH substituiert sind, vorzugsweise ausgewählt ist aus
Cio-Ciö-Fettsäuren, insbesondere Laurinsäure,
wobei die zweite, davon verschiedene Carbonsäure ausgewählt ist aus Carbonsäuren, die vorzugsweise nicht mit COOH oder OH und vorzugsweise mit SH oder NH2, vorzugsweise NH2, substituiert sind, insbesondere
Aminosäuren, vorzugsweise Alanin,
vorzugsweise ausgewählt ist aus Coestern, bei denen der
Polyvinylalkohol mit mindestens einer Fettsäure und mindestens einer Aminosäure verestert ist, insbesondere Polyvinyllaurat-co- ß -Alanat, vorzugsweise Polyvinyllaurat (25%)-co-ß-Alanat(7%).
Für alle vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Partikel ist es eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung, wenn die Partikel Nanopartikel sind und/oder entsprechend in mindestens zwei Dimensionen eine Länge von zwischen 10 und 500 nm, vorzugsweise < 150 nm, insbesondere 50 bis 100 nm aufweisen.
Dabei versteht man unter Nanopartikel im engeren Sinne dieser Erfindung Partikel, die in jeder Dimension eine Länge unter 1 μm aufweisen, in einem weiteren Sinne Partikel, die in mindestens zwei Dimension eine Länge unter 1 μm aufweisen. Unter die engere Definition fallen insbesondere auch alle Partikel, die ein Volumen unter 1 μm , vorzugsweise 0,01 μm , insbesondere 0,0001 μm , aufweisen. Bei Nanopartikeln handelt es sich um solide kolloidale Partikel.
Speziell oberflächenmodifizierte Partikel sind ein zentraler Gegenstand dieser Erfindung und lösen in hervorragender Weise die Aufgabe der Erfindung. Daher sind ein weiterer Gegenstand der Erfindung Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, an die Linker-Moleküle, die eine amino- und/oder thiolreaktive, vorzugsweise eine aminoreaktive, Gruppierung aufweisen, kovalent über vorher (d.h. vor Modifikation durch Verknüpfung des Partikels mit den Linkern) auf der Oberfläche des Partikels frei vorliegende NH2- oder SH-Gruppen, vorzugsweise NH2-Gruρpen, gebunden sind.
Dabei versteht man unter Linker-Molekülen Polymere, insbesondere unverzweigte Polymere, die die Eigenschaften, insbesondere die Oberflächeneigenschaften, des Partikels verändern, insbesondere aber zur sterisch günstigen Anbindung von anderen bioaktiven Verbindungen an die Partikel dienen oder gegebenenfalls auch die Partikel sterisch vor Abbau schützen.
Unter „reaktiver Gruppe" sind insbesondere im Stand der Technik bekannte Gruppenn zu verstehen, die leicht an Amino-, Thiol- oder Hydroxygruppen binden, sowie Epoxy- oder Vinyl-Gruppen.
Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die Linker-Moleküle bifunktionell sind und neben einer amino- oder thiolreaktiven, vorzugsweise aminoreaktiven, Gruppierung an einem anderen Ende des Moleküls auch eine weitere, anders reaktive funktionelle Gruppierung, vorzugsweise eine thiolreaktive Gruppierung, aufweisen.
Ebenso bevorzugt ist es, wenn die Linker-Moleküle eine Mischung bifunktioneller Moleküle - wie oben beschrieben - und monofunktioneller Moleküle, die nur entweder die aminoreaktive oder die thiolreaktive, vorzugsweise die aminoreaktive, Gruppierung tragen, sind.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, bei denen auf der Oberfläche des Partikels eine Mischung aus zwei Arten Linker-Molekülen vorliegt, die an einem Ende des Linker-Moleküls über eine reaktive Gruppierung kovalent an die Oberfläche des Partikels gebunden sind, wobei die eine Art der Linker-Moleküle (bifiinktionell) an mindestens einem anderen Ende des Moleküls eine weitere reaktive Gruppierung trägt, während die andere Art der Linker-Moleküle (monofunktionell) an keinem anderen Ende des Moleküls weitere reaktive Gruppierungen trägt.
Beide vorgenannte Gruppen an Partikeln sind sehr günstig, da damit sperrige Reste wie Antikörper an den biftinktionellen Resten ungehindert angelagert werden können, während die monofunktionellen Linker einen Abbau sterisch hindern. Diese Partikel werden auch als Akanthoshären bezeichnet. Dabei ist es wieder besonders bevorzugt, wenn an der Oberfläche der beiden vorgenannten Partikel-Arten (Akanthosphären) deutlich mehr, vorzugsweise mindestens 100 % mehr, monofunktionelle als bifunktionelle Moleküle kovalent gebunden sind.
Insbesondere bevorzugt ist es, wenn die Linker-Moleküle Polyglykolide sind, vorzugsweise Polyethylenglykol-Derivate, insbesondere NHS-Ester-Polyethylenglykol oder NHS- Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol.
Bevorzugt ist es auch, wenn die mit Linkern versehenen erfindungsgemäßen Partikel Nanopartikel sind.
Weiter ist es bevorzugt, wenn es sich bei den Partikeln um bisher in den vorstehenden Abschnitten ohne Erwähnung von Linkern beschriebene erfindungsgemäße Partikel handelt.
Es ist bevorzugt, wenn an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder „Sucher"-Moleküle, ausgewählt aus Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern,
Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden. Unter dem Begriff „Sucher"-Molekül im Sinne dieser Erfindung verstellt man allgemein an die erfindungsgemäßen Partikel ankoppelbare Verbindungen, die in der Lage sind, mit hoher Affinität an die biologischen Ziele der Wirkstoffe, als da wären Proteine, Peptide, Polysaccharide, Oligosaccharide, Lipoproteine, Glykoproteine oder andere biologische Moleküle, die entweder in gesundem Gewebe (physiologisch) oder in oder nahe krankem Gewebe (pathologisch) exprimiert werden, zu binden. „Sucher"- Moleküle können beispielsweise Peptide, Proteine, beispielsweise Antikörper, Antikörperfragmente oder Antikörperderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antikörper; Hormone, Zucker, beispielsweise Glykoside; synthetische oder natürliche Rezeptor-Liganden sein. Besonders bevorzugt sind Antikörper, -derivate, -fragmente und Glykoside.
Es ist weiter bevorzugt, wenn an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder allgemein „Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Antikörper, Antikörperfragmente oder
Antikörperderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie z.B. „Single- chain"-Antikörper, insbesondere mit freier Cysteingruppe, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden. Das gilt insbesondere für Partikel, deren Beschichtung deutlich mehr monof nktionelle als bifunktionelle Moleküle enthält.
Bevorzugt ist es auch, wenn an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Mikromoleküle oder „Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Zucker, insbesondere Thiozucker, Hormone oder Proteine, insbesondere mit freier Cysteingrappe, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden. Das gilt insbesondere für Partikel, deren Beschichtung überwiegend oder vollständig aus bifunktionellen Molekülen besteht.
Bevorzugt ist es weiter, wenn an den erfindungsgemäßen Partikel nach Bindung der bioaktiven Mikromoleküle oder „Sucher"-Moleküle noch freie reaktive Gruppen abgesättigt werden, vorzugsweise mit Cystein.
Generell erfolgt eine gegebenenfalls anschließende Reinigung oder Isolierung vorzugsweise über eine Dialyse vorzugsweise mit selektiven Ausschlussmembranen.
Für alle erfindungsgemäßen Partikel ist es bevorzugt, wenn der zu transportierende pharmazeutische Wirkstoff ein synthetischer oder natürlicher Wirkstoff, ein Protein, Peptid, Lipid, Zucker oder Nukleinsäure bzw. ein niedermolekularer organischer oder hochmolekularar organischer Wirkstoff, beispielsweise ein Hormon, eine antineoplastische Substanz, ein Antibiotikum, Antimykotikum, Parasitzid, Virustatikum oder Antihelmintikum, eine cardiovaskulär- aktive Substanz; eine zentralwirksame Substanz, insbesondere ein Analgetikum, Antidepressivum oder Antiepileptikum; ist.
Generell ist es eine bevorzugte Ausfuhrungsform aller erfindungsgemäßen Partikel, wenn das Partikel direkt oder über einen Linker, vorzugsweise über bifunktionelle Polyethylenglykol- Moleküle, verknüpft ist mit einem „Sucher"-Molekül ausgewählt aus:
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-
Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern.
Gerade die Verwendung der bifunktionellen Polyethylenglykol- Moleküle zur Oberflächenmodifikation von Partikeln zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe ist ein wichtiger Teil dieser Erfindung. Daher ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung die Verwendung von reinen bifunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen, vorzugsweise NHS-Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol; oder Mischungen aus bifunktionellen und monofunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen, vorzugsweise NHS-Ester-
Polyethylenglykol mit NHS-Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol; zur Herstellung von oberflächensubstituierten soliden Partikeln zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe.
Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn über die bifunktionellen Polyethylenglykol-Moleküle „Sucher"-Moleküle ausgewählt aus
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie z.B. single-chain- Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern
an die Partikel gebunden werden, vorzugsweise bei Verwendung von reinen bifunktionellen Polyethylenglykol- Molekülen Gylykoside, insbesondere Thiozucker; bei Verwendung von Mischungen aus bifunktionellen und monofunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen Antikörper,
Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie z.B. single-chain- Antikörpern, vorzugsweise Antikörper mit freier Cysteingruppe.
Auch die Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Partikel sind ein wichtiger Teil der Erfindung. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Partikels, insbesondere der zweiten beschriebenen Art der Partikel mit PLGA (Polylaktid/Polyglykolid), das folgende Schritte aufweist:
(a) Herstellung einer Lösung in einem oder in einem Gemisch von organischen Lösungsmitteln) enthaltend mindestens einen hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff, wasserunlösliches, organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial, (b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
(c) Dialyse der Lösung gegen H20
(d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.
Die erfindungsgemäßen Partikel sind besonders geeignete Formen zur Verstärkung der gewünschten Effekte bekannter Wirkstoffe und zur Minimierung systemischer Nebenwirkungen durch die kontrollierte und/oder räumlich spezifische Freisetzung des Effektormoleküls erreicht wird. Damit sind sie geeignet und vorgesehen in Therapeutika verschiedenster Art eingesetzt zu werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Arzneimittel, die erfindungsgemäße Partikel sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe enthalten.
Prinzipiell können die erfindungsgemäßen Arzneimittel als flüssige Arzneiformen in Form von Aerosolen, Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte oder als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets oder Kapseln verabreicht werden.
Geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe sind z.B. Lösungs- oder Verdünnungsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsvermittler, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, sowie Farbstoffe, Füllstoffe, und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel z.B. inhalativ, oral, peroral, parenteral, intravasal, intravenös, intraperitoneal, rektal, subkutan oder intramuskulär appliziert werden soll. Für orale Applikationen eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten oder Suspensionen wie Tropfen, Säften und Sirupen, für andere Applikationen Suspensionen sowie leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen.
Wie oben ausgeführt, sind die erfindungsgemäßen Partikel besonders geeignete Formen mit denen eine Verstärkung der Wirkung und Minimierung der Nebenwirkungen durch die kontrollierte und/oder räumlich spezifische Freisetzung des Effektormoleküls erreicht wird, so dass eine generelle Verwendbarkeit dieser Partikel zur Herstellung von Therapeutika vorliegt und sie sind natürlich generell für eine unbeschränkte Zahl von Indikationen geeignet. Ohne die Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel darauf beschränken zu wollen, bietet sich deren Verwendung für besondere Indikationen an. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel zur Herstellung eines Arzneimittel zur Krebsbehandlung, zur Behandlung von Infektionskrankheiten und Parasitosen, zur Behandlung von Krankheiten und Symptomen mit zentralnervöser Ursache, zur Verwendung in der Gentherapie oder für genomisches Targeting. Weiter ist beispielsweise der Einsatz beim Targeting von Cytostatika auf Tumorzellen, beim Transport von therapeutisch nutzbaren Substanzen durch die Blut-Hirn-Schranke und bei der Behandlung von schweren Infektionen (namentlich durch Eukaryonten) auch bevorzugt. Weitere Anwendungsmöglichkeiten umfassen z.B. den Transfer von pflanzlichen AJkaloiden mit mikrobicider Wirkung in Trypanosomen und von Antioxydantien und antiinflammatorischen Verbindungen [Vitamin E, Gallsäure, N-Acetyl-L-Cystein, 2,6-bis(tert-butyl)-4- Mercaptophenol, Ibuprofen und Gentisinsäure] bei (degenerativen) Gehirnerkrankungen, den Transfer von Substanzen in Hepatozyten, primär für die Behandlung von Neoplasmen, auch die Erhöhung der Wirkung von Primaquin auf die in den Leberzellen überdauernden Plasmodiwn-RypnozoitQn.
Unter den möglichen Anwendungen für die erfindungsgemäßen Partikel sind besonders weiter zu nennen:
- Transport von sonst nicht gehirngängigen Pharmaka (z. B. Cytostatika, Psychopharmaka, Schmerzmittel, M' Alzheimer- Therapeutika) mit antikörper-konjugierten Trägern durch die Blut- Hirn-Schranke
- Zielgerichtetes Einbringen von Pharmaka (z. B. Virustatika, Cytostatika, Plasmodizide) mit glykosid-konjugierten Trägern in Hepatozyten
- Orale Verabreichung von sonst nur parenteral verfügbaren Pharmaka durch Targeting auf Darmepithelien
- Erhöhung der Wirkung von antiparasitischen Therapeutika durch Targeting auf parasiten-spezifische Oberflächenmoleküle Ein weiterer Gegenstand des Verfahrens ist auch die Behandlung eines Menschen oder Tieres, der oder das diese Behandlung benötigt, mit oder unter Verwendung der erfindungsgemäßen Partikel. Besonders geeignet ist diese Behandlung bei den vorgenannten Indikationen und Anwendungsarten.
Im folgenden Abschnitt wird die Erfindung weiter durch Beispiele erläutert, ohne sie darauf zu beschränken.
Beispiele und Abbildungen:
Abbildungen:
Abbildung 1 zeigt schematisch den generellen Aufbau und die Gestalt von erfindungsgemäßen Partikeln, einfachen Partikeln, einfachen Stealth-Partikeln, zielsuchenden Aktinosphären und zielsuchenden Akanthosphären.
Abbildung 2 zeigt die Einheitlichkeit in der Größenverteilung erfindungsgemäß hergestellter Partikel nach Beispiel 1.
Beispiele
Allgemeine Bemerkungen:
Die nachfolgend ausgeführten Beispiele beschreiben von der
Erfindung umfasste Partikel, insbesondere Nanopartikel, in denen die Möglichkeit realisiert ist, Wirksubstanzen in kolloidale Trägerpartikel einzulagern. Diese können gegebenenfalls beispielsweise mit Antikörpern gegen oder natürlichen Liganden für charakteristische Molekularstrukturen des Ziels oder andereren „Suchermolekülen" verknüpft. Optional können die Nanopartikel beispielsweise zugleich durch inerte Beschichtung ihrer Oberfläche gegen das Immunsystem geschützt werden. Generell handelt es sich bei den hier beispielhaft beschriebenen, von der Efindung umfassten Partikel um kolloidale, lipidfreie Partikelsysteme. Einige der hier beschriebenen, von der Erfindung umfassten Partikel werden nachfolgend mit den allgemeinen Begriffen Aktinosphären und Akanthosphären bezeichnet (s. Abb. 1). Diese Bezeichnungen werden, da sie strukturelle Konzepte und nicht sterische Grundformen bezeichnen, unabhängig von der tatsächlichen Geometrie beibehalten.
Beispiel 1:
Allgemeine Nanopartikel:
Es handelt sich hier um Partikel im Größenbereich zwischen 10 nm und 500 nm mit einem kompakten Innenteil aus organischem wasserunlöslichem Polymermaterial, das mit einer Schicht aus einem amphiphilen organischen Polymer überzogen ist, das aufgrund seiner Eigenschaften nichtkovalent, aber fest an die wasserunlösliche Partikelmatrix gebunden ist und die Partikel sowohl gegen das wässrige Milieu stabilisiert als auch vor dem Zusammenkleben und der sich daraus ergebenden Flocculation schützt. Ferner ist das amphiphile organische Polymer mit reaktionsfähigen funktionellen Gruppen versehen, die es ermöglichen, weitere Komponenten daran chemisch anzukoppeln.
Als Material für die Herstellung der Nanopartikel dieses Beispiels wurde Polymilchsäure (Polylaktid, PLA) gewählt. Vorhandene Literatur über die Herstellung von Partikeln im Größenbereich von 1- 10 μm (zu anderen Zwecken verwendet) belegt die Eignung dieser Substanz, die gegenüber den meisten anderen Polymeren den Vorteil der biologischen Abbaubarkeit hat. Ferner ist es möglich, PLA mit hydrophileren Endgruppen zu versehen, welche sich dann während der Herstellung an der Grenzschicht zum wässrigen Medium orientieren und entweder selbst als niedermolekulare Zielsucher fungieren oder als Ankerpunkt für proteinöse Zielsucher verwendet werden können.
Die Herstellung von Nanopartikeln wurde anhand der Substanz RG752 (Fa. Boehringer Ingelheim), eines Block-Copolymers aus 75%
Polylaktid und 25 % Polyglykolid mit einem MW von durchschnittlich 12 kDA, etabliert und auf das reine Polylaktid R202H
(Boehringer) und Polypropylenglykol 26000 (Sigma; bei
Raumtemperatur flüssig) erfolgreich angewendet. Das jeweilige Polymer wird - ggf. in Anwesenheit der darin zu transportierenden
Substanz - in Benzylalkohol gelöst (Endkonzentration 5%) und diese
Lösung mit dem doppelte Volumen eines hochosmotischen
Schutzkolloids (35% Polyvinylalkohol und 35% Magnesiumacetat) vermischt. Durch mehrstündige Ultraschallbehandlung wird das gelöste Polymer feinst dispergiert. Durch Dialyse des entstehenden milchigen Produktes gegen einen großen Überschuss an Wasser werden Magnesiumazetat und Benzylalkohol (in Wasser 1 :25 löslich) sowie überschüssiger Polyvinylalkohol entfernt, so dass eine wässrige Suspension von polyvinylalkoholbeschichteten Nanopartikeln zurückbleibt.
Evaluation des Herstellungsprozesses erfolgte nach dem Prinzip der „quasielastischen Lichtbrechung" (QELS) in einem Zetasizer-Gerät (Zetasizer 3000 HS, Fa. Malvern). Es konnte gezeigt werden, dass nach der einfachen Vermischung von gelöstem Polymer und Schutzkolloid (Rührer, Vortex) noch Flüssigpartikel im Mikrometerbereich vorliegen, die erst unter der Ultraschallbehandlung in Nanopartikel übergehen. In Übereinstimmung mit dem Modell, wonach der Polyvinylalkohol die Grenzflächen stabilisiert, ist die Polyvinylalkoholkonzentration der ausschlaggebende Faktor für den Durchmesser der entstehenden Nanopartikel: 10% Polyvinylalkohol führte zur Bildung von Partikeln im Bereich von 300-400 nm, 35% zu Partikeln von 50. - 100 nm. (Die kritische Größe für kolloidale Systeme liegt bei ~ 150 nm; Partikel unterhalb dieser Größe können prinzipiell d.h. bei Verknüpfung mit geeigneten Suchmolekülen, die Blut-Hirnschranke durchqueren.) Die Temperatur wurde bei allen Versuchen weitgehend im physiologischen Bereich, bzw. zwischen 25° und 45°C gehalten.
Die Dauer der Ultraschallbehandlung hat keinen erkennbaren Einfluss auf die Partikelgröße, wohl aber auf die Ausbeute an brauchbaren Partikeln: Nach einer Behandlung von 15 min sind rund 90% der gezählten Partikel, die zusammen jedoch nur - 1% der gesamten Polylaktidmasse ausmachen, im gewünschten Größenbereich, während der Rest aus Mikropartikeln besteht; nach lh Beschallung umfasst die Nanopartikel-Fraktion ~ 10% der Masse; nach 5 -6h sind zwischen 70% und 99% des gesamten Polylaktids in Nanopartikel umgesetzt. Der Rest liegt in zwei weitgehend diskreten Mikropartikelfraktionen vor, einer kleineren mit einem Durchmesser von einem halben bis ganzen und einer größeren mit einem Durchmesser von mehreren Mikrometern, was einen zweiphasigen Verlauf des Dispersionsprozesses widerspiegeln könnte. Nach ca. 15- 18h begannen Zersetzung (an der Verfärbung erkennbar) und Verklumpung, bis schließlich nach 24h das gesamte Reaktionsgemisch zu einer wachsartigen Masse degeneriert war.
Bei manchen Messungen trat ein sekundärer Peak im Bereich von 250 - 300 mn auf; durch Verdünnungsversuche konnte jedoch gezeigt werden, dass es sich hierbei lediglich um Aggregate der relativen hydrophoben Partikel handelte. Höhere Partikeldichten führen überdies bei allen getesteten Substanzen zu einem scheinbaren
Durchmesser der Einzelpartikel, der um 20-30% über dem realen Durchmesser liegt, da offenbar Interaktionen der Partikel deren als
Grundlage für die QUELS-Messung dienende Bewegung hemmen.
Erwartungsgemäß waren beide Manifestationen dieser
Aggregationstendenz bei den stärker hydrophoben Substanzen R202H und Polypropylenglykol sowohl bei hoher als auch bei geringer Verdünnung erheblich deutlicher ausgeprägt als bei den korrespondierenden Proben von Nanopartikeln aus dem glykolidhaltigen Copolymer RG752.
Nachfolgend die Ergebnisse einer typische Messung (IVol. 5% RG752 in Benzylalkohol mit 2 Vol. 35% Magnesiumazetat/35% Polyvinylalkohol für 6 Stunden bei maximaler Leistung und 42°C beschallt, danach für 48 Stunden gegen 600 Vol. Wasser dialysiert [Ausschlussgröße der Membran 25 - 30 kDa, nach 24 Stunden Erneuern des Dialysewassers]; Proben vor der Messung jeweils 1:36 mit Wasser verdünnt):
-ungefiltert:
Figure imgf000031_0001
nach Filtration durch 800 nm-Filter (s. auch Abb. 2):
Die nach der Filtration beobachtete Größenverteilung ist mit der einer guten Präparation von Liposomen vergleichbar, der Vorteil liegt in der ungleich höheren Verpackungseffizienz. Durch Verknüpfung des als Schutzkolloid verwendeten Polyvinylalkohols mit verschiedenen organischen Säuren konnten die Oberflächeneigenschaften der Partikel verändert werden. Hierbei erwies sich eine Hydrophobisierung des Polyvinylalkohols, dessen Wasserlöslichkeit an der oberen Grenze für eine Beschichtungssubstanz liegt, als essentiell, da die ausschließliche Einführung reaktiver Gruppen die Hydrophilie des Polyvinylalkohols in solchem Maße steigerte, dass derselbe einfach in Lösung ging und es zu keiner Partikelbildung mehr kam. Dies konnte durch partielle Veresterung mit Fettsäuren auf dem Weg über die Säurechloride erreicht werden. Das so erhaltene Polyvinyllaurat (20%) zeigte Partikelbindungseigenschaften, die denen des ursprünglichen Polyvinylalkohols überlegen waren: Bei vergleichbaren Mengen Schutzkolloid wurden mit Polyvinyllaurat in wesentlich kürzerer Beschallungszeit und mit höherer Ausbeute etwas kleinere Partikel gebildet.
Im nächsten Schritt wurde Polyvinylalkohol mit unterschiedlichen Mengen von Laurylchlorid und ß-AJanylchlorid gleichzeitig umgesetzt, so dass Polyvinyllaurat(25%)-co- ß -alanat(7%) entstand. Diese Substanz war von ihren Partikelbildungseigenschaften her mit Polyvinyllaurat vergleichbar, aber stellte große Mengen von kovalent gebundenen primären Aminogruppen zur Verfügung. Aufgrund der lockeren Oberflächenstruktur, die einen Ausgleich der Ladungen von NH4 +-Gruppen durch dazwischengelagertes Acetat erlaubt, war kein Oberflächenpotential zu beobachten, doch war die Existenz der an supermolekulare Strukturen gebundenen Aminogruppen mit chemischen Mitteln eindeutig nachzuweisen.
Beispiel 2:
Herstellung der Aktinosphären und Akanthosphären
a) Allgemeine Anmerkungen
Sowohl in Aktinosphären als auch in Akanthosphären bestehen die weiteren Komponenten aus einem bifunktionalen
Polyethylenglykolmolekül, das am einen Ende eine aminoreaktive Gruppe trägt, am anderen Ende eine davon verschiedene Gruppe mit anderer Reaktivität. Durch dieses bifunktionale Polyethylenglykol werden einerseits die Partikel durch sterische Blockade der Oberfläche mit einem inerten Molekül dem Zugriff des Immunsystems entzogen (Ähnliches wurde im Zusammenhang mit Liposomen unter der Bezeichnung «Stealth-Technik» erprobt) und überdies weiter stabilisiert, zum anderen wird die Möglichkeit geboten, weitere Moleküle, die die eigentliche Zielspezifität vermitteln, in räumlich günstiger und flexibler Position an die Partikel anzufügen. Bei diesen Molekülen kann es sich um Mikromoleküle handeln, z.B. Zucker, in welchem Fall eine ausschließliche Verwendung des bifunktionalen Polyethylenglykols möglich ist (Aktinosphären), oder um Makromoleküle wie etwa Antikörper (Akanthosphären), in welchem Fall es aus sterischen Gründen ratsam ist, nur einen kleinen Teil der funktionalen Gruppen auf der Partikeloberfläche mit bifunktionalem Polyethylenglykol umzusetzen und den übrigen durch monofunktionales Polyethylenglykol, das dann alleine der physikalischen und immunologischen Stabilisierung der Partikel dient, abzusättigen.
Weiterhin empfiehlt es sich, nach dem Umsetzen der Nanopartikel- PEG-Konjugate mit den „Sucher"-Molekülen eventuell noch freie Kopplungsgruppen an den distalen Enden der PEG-Stacheln mit einem hohen molaren Überschuss eines geeigneten Reaktionspartners abzusättigen, im Fall von Vinylsulfon z.B. Cystein. Auf diese Weise wird verhindert, dass im Organismus diese Kopplungsgruppen mit körpereigenen Molekülen (z. B. Serumproteinen) reagieren und somit die Zielspezifität verfälscht wird.
b) konkrete Durchführung anschließend an Beispiel 1
Anschließend an die Herstellung der Nanopartikel gemäß Beispiel 1 wurden diese mit Polyethylenglykol auf der Oberfläche modifiziert. Durch Reaktion der mit Polyvinyllaurat(25%)-co-ß-alanat(7%) beschichteten Partikel mit NHS-Ester/Fluorescin-Polyethylenglykol im neutralen bis schwach basischen Milieu, gefolgt von Abtrenmmg des ungebundenen Polyethylenglykols durch Dialyse der Partikelsuspension gegen Wasser, wurden „Proto-Aktinosphären" erhalten, deren Eigenschaften anhand der Fluoreszenz und der physikalischen Eigenschaften der Polyethylenglykolmoleküle untersucht werden konnten. Es konnte gezeigt werden, dass eine kovalent gebundene Schicht aus fluoreszenzmarkiertem Polyethylenglykol die Oberfläche der Nanopartikel in hoher molekularer Dichte („self-quenching" der Fluoreszenz) und mit einer Dicke von 10-15 nm (hydratisiert) bedeckt, wie in der Schemazeiclinung zu „Aktinosphären" dargestellt (Abb. 1). Die Partikelbildungseigenschaften des Polyvinyllaurat-co-ß-alanats waren denen unmodifizierten Polyvinylalkohols deutlich überlegen.
Durch Umsetzen der mit Polyvinyllaurat(25%)-co-ß-alanat(7%) beschichteten Partikel mit NHS-Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol im schwach basischen Milieu und anschließende Aufreinigung durch Dialyse gegen Wasser können dementsprechend Partikel erhalten werden, die am distalen, weitgehend frei beweglichen Ende der kovalent an die Partikeloberfläche gebundenen Polyethylenglykol- „Stacheln" thiolreaktive Gruppen tragen.
Bei Verwendung der langsam reagierenden, relativ wasserstabilen Vinylsulfongruppe als distale Reaktionsgruppe der PEG-Stacheln ist es möglich, diese thiophilen Partikel für alle Anwendungen in einem vereinheitlichten Standardverfahren herzustellen und erst nach der Aufreinigung mit den geeigneten «Suchermolekülen» zu verbinden, welche beliebiger chemischer Natur sein können und lediglich eine Sulfhydrylgruppe besitzen müssen, so dass Aktinosphären und Akanthosphären hergestellt werden können. Bei Akanthosphären ist eine einfache Inprozesskontrolle des letzten Verknüpfimgssclirittes durch Zugabe von fluoreszenzmarkierten oder selber fluoreszierenden Proteinen (GFP) oder durch Western-Blot von Stichproben möglich, bei Aktinosphären durch Nachweis in der Dünnschichtchromatographie. Beispiel 3:
Wirksamkeiten und Eigenschaften von Nanopartikeln hergestellt nach Beispiel 1 oder 2
Die Beladung der Nanopartikel wurde mittels des relativ hydrophoben, zur Anfärbung von Zellmembranen verwendbaren Fluoreszenzfarbstoffes 4-Di-10ASP aus der Gruppe der Dialkylaminostyrole (Fa. Molecular Probes Inc.) getestet und entsprach den auf den gemessenen Größenverteilungen basierenden Erwartungen: Etwa 90% des eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffes wurden ordnungsgemäß in Nanopartikel verpackt. (In wässriger Lösung interferierten uncharakterisierte physikalische Effekte in inverser Abhängigkeit vom Verdünnungsgrad mit der Fluoreszenz, der 4-Di- 10 ASP-Gehalt konnte daher erst nach Auflösen der Partikel in einem Überschuß eines Methanol-Chloroform-Gemischs fluorimetrisch bestimmt werden.)
Die strukturelle Stabilität der Partikel erwies sich als bemerkenswert hoch: ohne Zugabe von erhaltenden Substanzen o.a. konnte nach einer achtwöchigen Lagerung bei Raumtemperatur ohne weiteren Zusatz stabilisierender Substanzen keine signifikante Veränderung der Größenverteilung oder 4-Di- 10 ASP-Beladung festgestellt werden.
Bei über die funktionalen Oberflächengruppen kovalent mit «Stacheln» aus Polyethylenglykol (MW 3400) verknüpften Nanopartikeln, an deren distalen Enden wiederum Antikörper oder andere für das Targeting verwendbare Moleküle angefügt werden können, wurde eine Verringerung der unerwünschten Aufnahme der Partikel durch das retikuloendotheliale System am Rattenmodell gezeigt.
Beispiel 4:
Wirksamkeit von Akanthosphären
Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe mit einem Volumen < 1 μm beladen mit tritiummarkiertem Daunomycin wurden über ihre oberflächenständigen Aminogruppen entweder mit monofunktionalem Polyethylenglykol (PEG) verknüpft oder über bifunktionales (NHS-Ester-/Vinylsulfon-)PEG mit einem mittleren Molekulargewicht von 3400 Da mit Cysteinresten verschiedener „Sucher"-Proteine gekoppelt:
• humanes Transferrin in verschiedenen Konzentrationen,
• Rinderserumalbumin und
• single-chain- Antikörper gegen den Transferrinrezeptor.
Abschließend wurden freie Kopplungsgruppen mit Cystein abgesättigt. Es wurde auch eine Fraktion der Partikel ohne „Sucher"- Molekül hergestellt.
Die Akanthosphären wurden mit Parasiten vom Typ des parasitischen Einzellers Trypanosoma brucei brucei inkubiert und Bindung sowie Cytotoxizität bestimmt. Die Ergebnisse der Bindungs- und Cytotoxizitätsstudien zeigen eine Korrelation zwischen Cytotoxizität und Bindung. Und die mit „Sucher"-Proteinen versehenen Akanthosphären verringerten die Zelldichte der Parasiten deutlich im Vergleich zu Kontrollen, d.h., es wurde ein ausgeprägter cytotoxischer Effekt beobachtet. In Abwesenheit von „Sucher"-Proteinen hingegen waren bei gleicher Daunomycmkonzentration weder Bindung noch Cytotoxizität zu beobachten.

Claims

Patentansprüche
1. Solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe, herstellbar durch ein Verfahren mit folgenden Schritten:
(a) Herstellung einer Lösung in einem oder einem
Gemisch von organischen Lösungsmitteln) enthaltend mindestens einen hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoffes, wasserunlösliches organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial sowie gegebenenfalls Ergänzungsstoffe,
(b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
(c) Dialyse der Lösung gegen H20
(d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.
2. Partikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass das oder die organischen Lösungsmittel sich in Wasser im Verhältnis Lösungsmittel : Wasser zwischen 1 : 10 und 1 :50, vorzugsweise zwischen 1 :20 und 1 :40, insbesondere zwischen 1 :20 und 1 :30 lösen, und/oder vorzugsweise ausgewählt sind aus: Methylenchlorid oder Benzylalkohol, vorzugsweise Benzylalkohol,
und/oder
dass das wasserunlösliche organische Polymermaterial vor dem Schritt (b) in einer Konzentration von zwischen 3 und
0,1 % (w/v), vorzugsweise zwischen 2 und 0,5 % (w/v), insbesondere von 1,7 % (w/v) vorliegt,
und/oder
dass die Lösung in Schritt (b) zwischen 1 h und 15 h, vorzugsweise 4 h oder 5 h bis 10 h, insbesondere 5 h bis 6 h, mit Ultraschall behandelt wird,
und/oder
dass das Konzentrationsverhältnis in % (w/v) zwischen dem wasserunlöslichen organischen Polymermaterial aus Schritt (a) und dem amphiphilen Polymermaterial aus Schritt (b) nach Abschluss von Schritt (b) zwischen 1: 2 und 1: 32, vorzugsweise zwischen 1: 4 und 1: 28, insbesondere zwischen 1:8 und 1:20, vorzugsweise zwischen 1: 12 und 1:16, insbesondere 1: 14 beträgt,
und/oder dass die Verfahrensschritte (a) bis (c) bei physiologischen Temperaturen, vorzugsweise zwischen 35 und 40°C, insbesondere bei 37°C stattfinden,
und/oder
dass das wasserunlösliche organische Polymermaterial zusammen mit dem oder den hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff(en) gelöst und das amphiphile organische Polymermaterial davon zunächst getrennt, gegebenenfalls mit dem oder den Ergänzungsstoff(en), gelöst wird und die Lösungen zur Herstellung der Lösung nach Schritt (a) erst dann gemischt werden, wobei es bevorzugt ist,
dass das separat gelöste amphiphile organische
Polymermaterial und/oder ein gegebenenfalls mitgelöster Ergänzungsstoff vor der Mischung mit dem unpolaren Polymermaterial in einer Konzentration von zwischen 10 und 45 % (w/v), vorzugsweise zwischen 20 und 40 % (w/v), insbesondere von 35 % (w/v) vorliegt.
Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserunlösliche, organische Polymermaterial aus Schritt (a) ausgewählt ist aus Polyestern, vorzugsweise Polymilchsäure (Polylaktid), Polyglykolid oder Polylaktid/Polyglykolid
Copolymeren (PLGA), insbesondere reinem Polylaktid, reinem Polypropylenglykol, oder Polylaktid/Polyglykolid Copolymer (bevorzugt im
Verhältnis 3:1).
und/oder
dass das amphiphile organische Polymermaterial aus Scliritt (a) ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol bzw. Derivaten des
Polyvinylalkohols, vorzugsweise reinem
Polyvinylalkohol, Estern aus Polyvinylalkohol und einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) oder Coestern, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben
Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist,
und/oder
dass der oder die Ergänzungsstoffe ausgewählt ist/sind aus
Alkali- oder Erdalkalisalzen organischer Säuren, insbesondere Magnesiumsalzen, vorzugsweise Magnesiumacetat.
4. Solide Partikel zum Transport hydrophober oder hydrophobisierter pharmazeutischer Wirkstoffe, enthaltend einen Kern aus organischem wasserunlöslichen Polymermaterial und eine Außenschicht aus nichtkovalent an die Moleküle des Kerns gebundenen amphiphilen
Polymermaterial, dadurch gekennzeichnet, dass das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus
Polyvinylalkohol bzw. Estern des Polyvinylalkohols.
5. Partikel gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel nichtkovalent gebundenen, hydrophoben oder hydrophobisierten pharmazeutischen Wirkstoff enthalten.
6. Partikel gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus
reinem Polyvinylalkohol, Estern aus Polyvinylalkohol und einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) oder Coestern, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist.
7. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das amphiphile Polymermaterial ausgewählt ist aus Coestern des Polyvinylalkohols, bei denen jedes Molekül des Polyvinylalkohols mit mindestens einer hydrophoben Carbonsäure (vorzugsweise Fettsäure) und einer zweiten, davon verschiedenen Carbonsäure verestert ist,
wobei die hydrophobe Carbonsäure vorzugsweise ausgewählt ist aus Fettsäuren einer Länge zwischen 10 und 24 C-Atomen, die vorzugsweise nicht oder nicht mit COOH, OH, SH oder NH2, insbesondere nicht mit COOH oder OH substituiert sind, vorzugsweise ausgewählt ist aus Cιo-Ci6-Fettsäuren, insbesondere Laurinsäure, und/oder
wobei die zweite, davon verschiedene Carbonsäure ausgewählt ist aus Carbonsäuren, die vorzugsweise nicht mit COOH oder OH und vorzugsweise mit SH oder NH2, insbesondere NH2, substituiert sind, insbesondere Aminosäuren, vorzugsweise Alanin,
vorzugsweise ausgewählt ist aus Coestern, bei denen der Polyvinylalkohol mit mindestens einer Fettsäure und mindestens einer Aminosäure verestert ist, insbesondere
Polyvinyllaurat-co- ß -Alanat, vorzugsweise Polyvinyllaurat (25%)-co- ß -Alanat(7%).
8. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel Nanopartikel sind und/oder in mindestens zwei Dimensionen eine Länge von zwischen 10 und 500 mn, vorzugsweise < 150 nm, insbesondere 50 bis 100 nm aufweisen.
9. Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, dadurch gekennzeichnet, dass Linker-Moleküle, die eine amino- und/oder thiolreaktive, vorzugsweise eine aminoreaktive, Gruppierung aufweisen, kovalent über vorher auf der Oberfläche des Partikels frei vorliegende NH2- oder SH- Gruppen, vorzugsweise NH2-Gruppen, an die Partikel gebunden sind.
10. Partikel gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Linker-Moleküle bifiinktionell sind und neben einer amino- oder thiolreaktiven, vorzugsweise aminoreaktiven, Gruppierung an einem anderen Ende des Moleküls auch eine weitere, anders reaktive funktioneile Gruppierung, vorzugsweise eine thiolreaktive Gruppierung, aufweisen.
11. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Linker-Moleküle eine Mischung bifunktioneller Moleküle gemäß Anspruch 10 und monofimktioneller Moleküle, die nur entweder die aminoreaktive oder die thiolreaktive, vorzugsweise die aminoreaktive, Gruppierung tragen, sind.
12. Partikel zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche des Partikels eine Mischung aus zwei Arten Linker-Molekülen vorliegt, die an einem Ende des Linker-Moleküls über eine reaktive Gruppierung kovalent an die Oberfläche des Partikels gebunden sind, wobei die eine Art der Linker-Moleküle (bifiinktionell) an mindestens einem anderen Ende des Moleküls eine weitere reaktive Gruppierung trägt, während die andere Art der Linker- Moleküle (monofiinktionell) an keinem anderen Ende des Moleküls weitere reaktive Gruppierungen trägt.
13. Partikel gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass an der Oberfläche der Partikel deutlich mehr, vorzugsweise mindestens 100 % mehr, monofunktionelle als bifunktionelle Linker-Moleküle kovalent gebunden sind.
14. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Linker-Moleküle Polyglykolide sind, vorzugsweise Polyethylenglykol-Derivate, insbesondere NHS-
Ester-Polyethylenglykol oder NHS-Ester/Vinylsulfon- Polyethylenglykol.
15. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel Nanopartikel sind.
16. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel einem der Ansprüche 1 bis 8 entsprechen.
17. Partikel gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder „Sucher"-Moleküle, ausgewählt aus Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor-Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.
18. Partikel gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass an die bifunktionellen Linker-Moleküle bioaktive Makromoleküle oder „Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Antikörper, Antikörperfragmente oder
Antikörperderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antikörper, insbesondere mit freier Cysteingruppe, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.
19. Partikel gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass an die bifunktionellen Moleküle der Beschichtung bioaktive Mikromoleküle oder „Sucher"-Moleküle, vorzugsweise Zucker, insbesondere Thiozucker; Peptide oder Hormone, insbesondere mit freier Cysteingruppe, angekoppelt sind, angekoppelt werden oder vor der Oberflächenmodifikation angekoppelt wurden.
20. Partikel gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass nach Bindung der bioaktiven Mikromoleküle oder „Sucher"-Moleküle noch freie reaktive Gruppen abgesättigt werden, vorzugsweise mit Cystein.
21. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der zu transportierende Wirkstoff ein synthetischer oder natürlicher Wirkstoff, ein Protein, Peptid, Lipid, Zucker oder Nukleinsäure bzw. ein niedermolekularer organischer oder hochmolekularer organischer Wirkstoff, beispielsweise ein Hormon, eine antineoplastische Substanz, ein
Antibiotikum, Antimykotikum, Parasitizid, Virustatikum oder Antihelmintikum, eine cardiovaskulär-aktive Substanz; eine zentralwirksame Substanz, insbesondere ein Analgetikum, Antidepressivum oder Antiepileptikum; ist.
22. Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass er direkt oder über einen Linker; vorzugsweise über bifunktionelle Polyethylenglykol-Moleküle; verknüpft ist mit einem „Sucher"-Molekül ausgewählt aus:
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"- Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern.
23. Verwendung von reinen bifunktionellen Polyethylenglykol- Molekülen; vorzugsweise NHS-Ester/Vinylsulfon- Polyethylenglykol; oder Mischungen aus bifunktionellen und monofunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen; vorzugsweise NHS-Ester-Polyethylenglykol mit NHS- Ester/Vinylsulfon-Polyethylenglykol; zur Herstellung von oberflächenmodifizierten soliden Partikeln zum Transport pharmazeutischer Wirkstoffe.
24. Verwendung gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass über die bifunktionellen Polyethylenglykol-Moleküle „Sucher"-Moleküle ausgewählt aus
Peptiden, Proteinen; vorzugsweise Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Antikörperderivaten mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"- Antikörpern; Hormonen, Zuckern, vorzugsweise Glykosiden; synthetischen oder natürlichen Rezeptor- Liganden; Proteinen oder Peptiden mit einer freien Cysteingruppe oder Thiozuckern
an die Partikel gebunden werden, vorzugsweise bei Verwendung von reinen bifunktionellen Polyethylenglykol- Molekülen Glykoside, insbesondere Thiozucker; bei Verwendung von Mischungen aus bifunktionellen und monofunktionellen Polyethylenglykol-Molekülen Antikörper, Antikörperfragmente oder Antikörperderivate mit zielbindenden Eigenschaften wie „Single-chain"-Antikörper, vorzugsweise solche mit freier Cysteingruppe.
25. Verfahren zur Herstellung eines Partikels gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
(a) Herstellung einer Lösung in einem oder in einem
Gemisch von organischen Lösungsmittel(n) enthaltend mindestens einen hydrophoben pharmazeutischen Wirkstoff, wasserunlösliches, organisches Polymermaterial und amphiphiles organisches Polymermaterial,
(b) Behandlung der Lösung mit Ultraschall,
(c) Dialyse der Lösung gegen H20
(d) Trennung der entstehenden Partikel von der entstehenden wässrigen Lösung.
26. Arzneimittel enthaltend Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 sowie gegebenenfalls geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe.
27. Verwendung von Partikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 zur Herstellung eines Arzneimittel zur Krebsbehandlung, zur Behandlung von Infektionskrankheiten und Parsitosen, zur Behandlung von Krankheiten und Symptomen mit zentralnervöser Ursache, zur Verwendung in der Gentherapie oder für genomisches Targeting.
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