DE69930642T2

DE69930642T2 - Mikropartikel mit adsorbenten oberflächen, verfahren zu ihrer herstellung und ihrer verwendung

Info

Publication number: DE69930642T2
Application number: DE69930642T
Authority: DE
Inventors: Derek Berkeley O'HAGEN; Manmohan Hercules SINGH; S. Gary Oakland OTT; John San Leandro BARACKMAN; Jina San Rafael KAZZAZ
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1998-07-29
Filing date: 1999-07-29
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2019-07-30
Also published as: ES2260923T3; EP1100468A1; DK1100468T3; JP4601168B2; DE69930642D1; NZ509853A; JP2010168392A; AU5245299A; CA2338646A1; AU763975B2; PT1100468E; JP2002521425A; CY1107326T1; EP1100468B1; HK1035862A1; CA2338646C; WO2000006123A1; ATE321535T1

Description

Technischer Hintergrund
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Arzneimittel. Insbesondere betrifft die Erfindung Mikropartikel mit adsorbierenden Oberflächen, Verfahren zur Herstellung solcher Mikropartikel und deren Verwendung. Die Erfindung betrifft außerdem Zusammensetzungen, umfassend biologisch abbaubare Mikropartikel, wobei biologisch aktive Mittel wie therapeutische Polynucleotide, Polypeptide, Antigene und Adjuvanzien auf der Oberfläche der Mikropartikel adsorbiert sind.
Hintergrund
Partikuläre Träger sind verwendet worden, um eine kontrollierte, parenterale Verabreichung von therapeutischen Verbindungen zu erreichen. Solche Träger sind derart konstruiert, daß der Wirkstoff in dem Zuführungssystem über einen längeren Zeitraum zurückgehalten wird. Beispiele für partikuläre Träger schließen solche ein, welche von Polymethylmethacrylatpolymeren abgeleitet sind, sowie Mikropartikel, welche von Poly(Lactiden) (vgl. z.B. US-Patent Nr. 3,773,919), Poly(Lactid-co-Glycoliden), bekannt als PLG (vgl. z.B. US-Patent Nr. 4,767,628) und Polyethylenglykol, bekannt als PEG (vgl. z.B. US-Patent Nr. 5,648,095) abgeleitet sind. Polymethylmethacrylatpolymere sind nicht abbaubar, während PLG-Partikel durch eine ungerichtete, nicht-enzymatische Hydrolyse der Esterbindungen biologisch zu Milch- und Glycolsäuren die über normale Stoffwechselwege ausgeschieden werden, abgebaut werden.
Zum Beispiel beschreibt US-Patent Nr. 5,648,095 die Verwendung von Mikrokügelchen mit eingekapselten Arzneimitteln als Wirkstoffzuführungssysteme für die nasale, orale, pulmonale und orale Verabreichung. Formulierungen mit einer langsamen Wirkstofffreisetzung, welche verschiedene Polypeptid-Wachstumsfaktoren enthalten, sind ebenfalls beschrieben worden. Vgl. z.B. Internationale Ver öffentlichung Nr. WO 94/12158; US-Patent Nr. 5,134,122; und Internationale Veröffentlichung Nr. WO 96/37216.
Fattal et al., Journal of Controlled Release 53 (1998), 137–143, beschreiben aus Polyalkylcyanoacrylaten (PACA) hergestellte Nanopartikel mit adsorbierten Oligonucleotiden.
Partikuläre Träger sind auch zusammen mit adsorbierten oder eingeschlossenen Antigenen bei Versuchen, adäquate Immunantworten auszulösen, verwendet worden. Solche Träger präsentieren dem Immunsystem multiple Kopien eines ausgewählten Antigens und begünstigen das Abfangen und die Retention der Antigene in lokalen Lymphknoten. Die Partikel können durch Makrophagen phagozytiert werden und können die Antigenpräsentation durch eine Cytokinfreisetzung verbessern. Zum Beispiel beschreibt die gleichzeitig anhängige Anmeldung Nr. 09/015,652, eingereicht am 29. Januar 1998, vom gleichen Inhaber die Verwendung von Mikropartikeln mit einem adsorbierten Antigen und einem eingekapselten Antigen, um zellvermittelte Immunantworten zu stimulieren, sowie Verfahren zur Herstellung der Mikropartikel.
In der vorläufigen Patentanmeldung 60/036,316 vom gleichen Inhaber wird zum Beispiel ein Verfahren zur Bildung von Mikropartikeln offenbart, welches das Kombinieren eines Polymers mit einem organischen Lösungsmittel, dann das Zugeben eines Emulsionsstabilisators wie Polyvinylalkohol (PVA) und anschließend das Abdampfen des organischen Lösungsmittels, wodurch Mikropartikel gebildet werden, umfaßt. Die Oberfläche der Mikropartikel umfasst das Polymer und den Stabilisator. Im Anschluß daran können Makromoleküle wie eine DNA, Polypeptide und Antigene an solche Oberflächen adsorbiert werden.
Es ist auch gezeigt worden, daß kationische, lipidbasierte Emulsionen als Genträger verwendet werden können. Vgl. z.B. Yi et al., Cationic Lipid Emulsion; A Novel Non-Viral, and Non-Liposomal Gene Delivery System, Proc. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24 (1997), 653–654; Kim et al., In Vivo Gene Transfer Using Cationic Lipid Emulsion-Mediated Gene Delivery System by Intranasal Administration, Proc. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 25 (1998), 344–345; Kim et al., In Vitro and In Vivo Gene Delivery Using Cationic Lipid Emulsion, Proc. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 26 (1999), #5438.
Obwohl PLG-Mikropartikel mit einem adsorbierten Antigen gegenüber von Systemen, welche toxischer sind, wesentliche Vorteile bieten, kann sich die Adsorption von biologisch aktiven Mitteln an die Mikropartikeloberfläche als schwierig erweisen. Zum Beispiel ist es oft schwierig oder unmöglich, geladene oder voluminöse, biologisch aktive Mittel wie Polynucleotide, große Polypeptide und dergleichen an die Mikropartikeloberfläche zu adsorbieren. Folglich besteht weiterhin ein Bedarf an flexiblen Verabreichungssystemen für solche Mittel und insbesondere für Wirkstoffe, welche sehr empfindlich und schwer zu formulieren sind.
WO 97/02810 offenbart lamellare Partikel aus einem biologisch abbaubaren Polymer, welche mindestens zum Teil kristallin sind, wobei an die Oberfläche davon ein biologisch aktives Mittel adsorbiert sein kann.
WO 96/20698 offenbart Nanopartikel für die verzögerte Freisetzung von biologisch aktiven Mitteln. Die Nanopartikel werden aus einem Gemisch von einem Polymer und einem biologisch aktiven Mittel in einem organischen Lösungsmittel gebildet, wobei die biologisch aktiven Mittel in die Polymermatrix eingeschlossen, eingebettet oder darin mitgeführt werden oder sonst einen Teil davon ausmachen.
WO 98/33487 offenbart Verfahren für die Adsorption eines Antigens an vorher hergestellte Mikropartikel, welche die Verwendung von Detergenzien einschließen. Die Detergenzien werden nach der Adsorption des Antigens an das Mikropartikel entfernt, um die endgültige Mikropartikelzusammensetzung herzustellen. Dialysierbare Detergenzien werden verwendet, um die Entfernung des Detergens zu erleichtern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die hierin genannten Erfinder haben ein Verfahren zur Bildung von Mikropartikeln mit adsorbierenden Oberflächen, welche in der Lage sind, eine große Vielzahl von Makromolekülen zu adsorbieren, erfunden. Die Mikropartikel umfassen sowohl ein Polymer als auch ein Detergens. Die erfindungsgemäßen Mikropartikel adsorbieren solche Makromoleküle effizienter als andere gegenwärtig erhältliche Mikropartikel.
Die Mikropartikel sind von einem Polymer wie einer Poly(α-hydroxysäure), einer Polyhydroxybuttersäure, einem Polycaprolacton, einem Polyorthoester, einem Polyanhydrid, einem PACA, einem Polycyanacrylat und dergleichen abgeleitet und werden zusammen mit Detergenzien wie kationischen, anionischen oder nichtionischen Detergenzien, wobei die Detergenzien in Kombination miteinander verwendet werden können, gebildet. Die Erfinder haben außerdem entdeckt, daß diese Mikropartikel eine verbesserte Adsorption von viralen Antigenen hervorbringen und für stärkere Immunantworten sorgen, verglichen mit Mikropartikeln, welche durch ein Verfahren unter Verwendung von PVA allein gebildet werden. Obgleich Mikropartikel, welche unter Verwendung von PVA allein hergestellt werden, einige Makromoleküle adsorbieren können, adsorbieren die erfindungsgemäßen Mikropartikel eine große Vielzahl von Makromolekülen, wobei andere Detergenzien allein, in Kombination miteinander oder in Kombination mit PVA verwendet werden. Demgemäß betrifft die Erfindung folglich vorwiegend derartige Mikropartikel sowie Verfahren zur Herstellung der Mikropartikel.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Mikropartikel mit einer adsorbierenden Oberfläche, wobei das Mikropartikel umfaßt:
ein biologisch abbaubares Polymer;
ein ionisches Detergens; und
ein erstes biologisch aktives Makromolekül, welches an die Oberfläche davon adsorbiert ist,
wobei das erste biologisch aktive Makromolekül mindestens ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid, einem Polynucleotid, einem Polynucleosid, einem Antigen, einem Arzneimittel, einem Hormon, einem Enzym, einem Transkriptions- oder Translationsmediator, einem Zwischenprodukt in einem Stoffwechselweg, einem Immunmodulator und einem Adjuvans.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Mikropartikelzusammensetzung, welche ein erfindungsgemäßes Mikropartikel und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Mikropartikels mit einer adsorbierenden Oberfläche, an welche ein biologisch aktives Makromolekül adsorbiert worden ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Emulgieren eines Gemisches aus einer Polymerlösung und einem ionischen Detergens zur Bildung einer Emulsion, wobei die Polymerlösung ein Polymer umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Poly(α-hydroxysäure), einer Polyhydroxybuttersäure, einem Polycaprolacton, einem Polyorthoester, einem Polyanhydrid und einem Polycyanacrylat, wobei das Polymer in einer Konzentration von 1 % bis 30 % in einem organischen Lösungsmittel vorliegt, und wobei das Detergens in dem Gemisch in einem Gewicht zu Gewicht-Detergens zu Polymer-Verhältnis von 0,00001:1 bis 0,1:1 vorliegt;
(b) Entfernen des organischen Lösungsmittels aus der Emulsion zur Bildung des Mikropartikels mit der adsorbierenden Oberfläche; und
(c) Adsorbieren des Makromoleküls an die Oberfläche des Mikropartikels.

In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Mikropartikelzusammensetzung, umfassend ein Mikropartikel mit einer adsorbierenden Oberfläche, an welche ein biologisch aktives Makromolekül adsorbiert worden ist, wobei das Verfahren die Schritte (a) bis (c), wie vorstehend definiert, umfaßt, und weiterhin den Schritt (d) des Kombinierens des Mikropartikels mit dem adsorbierten Makromolekül von Schritt (c) mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Bildung der Mikropartikelzusammensetzung umfaßt.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Mikropartikel, welches durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wird.
Die Erfindung ermöglicht ein Verfahren zur Herstellung einer adsorbierenden Mikropartikelzusammensetzung, umfassend das Kombinieren eines adsorbierenden Mikropartikels mit einem Makromolekül, welches an der Oberfläche davon adsorbiert ist, und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers.
Die Erfindung ermöglicht auch ein Verfahren zur Verabreichung eines Makromoleküls an ein Wirbeltier, welches die Verabreichung der vorstehenden Zusammensetzung an ein Wirbeltier umfaßt.
Die Erfindung ermöglicht auch ein Verfahren für das Auslösen einer zellulären Immunantwort in einem Wirbeltier, welches die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines ausgewählten Makromoleküls, welches an ein erfindungsgemäßen Mikropartikel adsorbiert ist, an ein Wirbeltier umfaßt.
Die Erfindung ermöglicht auch ein Verfahren zur Immunisierung, welches die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der vorstehenden Mikropartikelzusammensetzung an ein Wirbeltier umfaßt. Die Zusammensetzung kann wahlweise ungebundene Makromoleküle enthalten und kann auch wahlweise Adjuvanzien, einschließlich Aluminiumsalze wie Aluminiumphosphat, enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Mikropartikel aus einer Poly(α-hydroxysäure), mehr bevorzugt einem Poly(D,L-Lactid-co-Glycolid); und am meisten bevorzugt einem Poly(D,L-Lactid-co-Glycolid) gebildet.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Mikropartikel zur Verwendung bei der Diagnose einer Erkrankung bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Mikropartikel zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Mikropartikel zur Verwendung in einem Impfstoff bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Mikropartikel zur Verwendung bei der Auslösung einer Immunantwort bestimmt.
Jedes der adsorbierenden Mikropartikel, welche vorher unvollständig beschrieben wurden, kann auch wahlweise darin eingeschlossene Makromoleküle aufweisen.
Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden für Fachleute im Hinblick auf die Offenbarung hierin ohne weiteres deutlich.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Durchführung der vorliegenden Erfindung beinhaltet, falls nicht anders angegeben, herkömmliche Verfahren der Chemie, Polymerchemie, Biochemie, Molekularbiologie, Immunologie und Pharmakologie, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind. Derartige Techniken sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Vgl. z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods in Enzymology (Colowick S. und Kaplan N., Hrsg., Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Bd. I-IV (Weir D.M. und Blackwell C.C., Hrsg., Blackwell Scientific Publications, 1986); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi K.S., Hrsg., CRC Press, 1997); und Seymour/Carraher's Polymer Chemistry (4. Auflage, Marcel Dekker Inc., 1996).
Die Singularformen "ein", "eines" und "der/die/das", so wie in der Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen verwendet, schließen die Bezugnahme auf die Pluralform ein, sofern aus dem Inhalt keine andere Bedeutung abgeleitet werden kann. So verweist zum Beispiel der Begriff "ein Mikropartikel" auf ein oder mehrere Mikropartikel und dergleichen.
A. Definitionen
Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet, welche, wie nachstehend angegeben, definiert sind.
Der Begriff "Mikropartikel", so wie hierin verwendet, verweist auf ein Partikel mit einem Durchmesser von 100 nm bis 150 μm, mehr bevorzugt mit einem Durchmesser von 200 nm bis 30 μm und am meisten bevorzugt mit einem Durchmesser von 500 nm bis 10 μm. Vorzugsweise weist das Mikropartikel einen Durchmesser auf, der eine parenterale oder mucosale Verabreichung ohne eine Verstopfung von Kanülen und Kapillaren ermöglicht. Die Mikropartikelgröße wird ohne weiteres durch Techniken, welche auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind, wie Photonenkorrelationsspektroskopie, Laserdiffraktometrie und/oder Rasterelektronenmikroskopie, bestimmt.
Die Mikropartikel zur Verwendung hierin werden aus Materialien gebildet, welche sterilisierbar, nicht toxisch und biologisch abbaubar sind. Solche Materialien schließen, ohne Begrenzung, Poly(α-hydroxysäure), Polyhydroxybuttersäure, Polycaprolacton, Polyorthoester, Polyanhydrid, PACA und Polycyanacrylat ein. Vorzugsweise sind die Mikropartikel zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung von einer Poly(α-hydroxysäure), insbesondere von einem Poly(lactid) ("PLA") oder einem Copolymer von D,L-Lactid und Glycolid oder Glycolsäure, wie Poly(D,L-Lactid-co-Glycolid) ("PLG" oder "PLGA""), oder einem Copolymer von D,L-Lactid und Caprolacton abgeleitet. Die Mikropartikel können von irgendeinem der verschiedenen polymeren Ausgangsmaterialien, welche eine Vielzahl von Molekulargewichten und, im Falle der Copolymeren wie PLG, eine Vielzahl von Lactid:Glycolid-Verhältnissen aufweisen, abgeleitet sein, wobei die Auswahl hiervon größtenteils Ermessensache ist und zum Teil von dem gleichzeitig verabreichten Makromolekül abhängt. Diese Parameter werden nachstehend ausführlicher besprochen.
Der Begriff "Detergens", so wie hierin verwendet, schließt Tenside und Emulsionsstabilisatoren ein. Anionische Detergenzien schließen, aber sind nicht begrenzt auf, SDS, SLS, sulfatierte Fettalkohole und dergleichen ein. Kationische Detergenzien schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Cetrimid (CTAB), Benzalko niumchlorid, DDA (Dimethyldioctodecylammoniumbromid), DOTAP und dergleichen ein. Nichtionische Detergenzien schließen, aber sind nicht begrenzt auf, Sorbitester, Polysorbate, polyoxyethylierte Glykolmonoether, polyoxyethylierte Alkylphenole, Poloxamere und dergleichen ein.
Der Begriff "positive Nettoladung", so wie hierin verwendet, bedeutet, daß die Ladung auf der Oberfläche des Mikropartikels positiver ist als die Ladung auf der Oberfläche eines entsprechenden Mikropartikels, welches unter Verwendung von PVA hergestellt wurde. Desgleichen bedeutet der Begriff "negative Nettoladung", so wie hierin verwendet, daß die Ladung auf der Oberfläche des Mikropartikels negativer ist als die Ladung auf der Oberfläche eines entsprechenden Mikropartikels, welches unter Verwendung von PVA hergestellt wurde. Die Nettoladung kann durch den Vergleich des Zeta-Potentials (auch bekannt als elektrokinetisches Potential) des unter Verwendung eines kationischen oder anionischen Detergens hergestellten Mikropartikels mit einem entsprechenden Mikropartikel, welches unter Verwendung von PVA hergestellt wurde, abgeschätzt werden. Folglich weist eine Mikropartikeloberfläche mit einer "positiven Nettoladung" ein Zeta-Potential auf, welches größer ist als das Zeta-Potential der Oberfläche eines Mikropartikels, das unter Verwendung von PVA hergestellt wurde, und ein Mikropartikel mit einer "negativen Nettoladung" weist ein Zeta-Potential auf, welches geringer ist als das Zeta-Potential der Oberfläche eines Mikropartikels, welches unter Verwendung von PVA hergestellt wurde. Es ist ersichtlich, daß die Nettoladungen für die Mikropartikel der Erfindung relativ zu dem Zeta-Potential eines entsprechenden PVA-Mikropartikels berechnet werden.
Der Begriff "Zeta-Potential", so wie hierin verwendet, verweist auf das elektrische Potential, welches entlang der Grenzfläche aller Feststoffe und Flüssigkeiten vorhanden ist, d.h. das Potential entlang der diffusen Schicht von Ionen, welche ein geladenes kolloidales Partikel umgeben. Das Zeta-Potential kann aus den elektrophoretischen Beweglichkeiten, d.h. den Geschwindigkeiten, mit denen kolloidale Partikel zwischen geladenen Elektroden, welche mit der zu messenden Substanz in Kontakt gebracht werden, wandern, unter Anwendung von Techniken, welche auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind, berechnet werden.
Der Begriff "Makromolekül", so wie hierin verwendet, verweist ohne eine Begrenzung auf ein Arzneimittel, ein Polynucleotid, ein Polypeptid, ein Hormon, ein Enzym, einen Transkriptions- oder Translationsmediator, ein Zwischenprodukt in einem Stoffwechselweg, einen Immunmodulator, ein Antigen, ein Adjuvans oder Kombinationen davon. Bestimmte Makromoleküle zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
Der Begriff "Arzneimittel" bezieht sich auf biologisch aktive Verbindungen wie Antibiotika, antivirale Mittel, Wachstumsfaktoren, Hormone und dergleichen, wie nachstehend ausführlicher besprochen wird.
Ein "Polynucleotid" ist ein Nucleinsäuremolekül, welches ein biologisch aktives (z.B. immunogenes oder therapeutisches) Protein oder Polypeptid codiert. Abhängig von der Art des Polypeptids, welches durch das Polynucleotid codiert wird, kann ein Polynucleotid weniger als 10 Nucleotide einschließen, z.B., falls das Polynucleotid ein Antigen codiert. Außerdem kann ein "Polynucleotid" sowohl doppel- als auch einzelsträngige Sequenzen einschließen und kann sich auf eine cDNA einer viralen, prokaryontischen oder eukaryontischen mRNA, genomische RNA- und DNA-Sequenzen einer viralen (z.B. RNA- und DNA-Viren sowie Retroviren) oder prokaryontischen DNA und insbesondere synthetische DNA-Sequenzen beziehen, aber ist nicht darauf begrenzt. Der Begriff umfaßt auch Sequenzen, welche irgendeines der bekannten DNA- und RNA-Basenanaloga einschließen, und schließt Modifikationen wie Deletionen, Additionen und Substitutionen (im Allgemeinen konservativer Natur) in der nativen Sequenz ein, solange das Nucleinsäuremolekül ein therapeutisches oder antigenes Protein codiert. Diese Modifikationen können absichtlich sein, wie durch ortsspezifische Mutagenese, oder können zufällig sein, wie durch Mutationen von Wirten, welche die Antigene herstellen.
Die Begriffe "Polypeptid" und "Protein" beziehen sich auf ein Polymer von Aminosäureresten und sind nicht auf eine Mindestlänge des Produkts begrenzt. Folglich sind Peptide, Oligopeptide, Dimere, Multimere und dergleichen in dieser Definition eingeschlossen. Per Definition sind sowohl Proteine vollständiger Länge als auch Fragmente davon eingeschlossen. Die Begriffe schließen auch Modifikationen wie Deletionen, Additionen und Substitutionen (im Allgemeinen konservativer Natur) in der nativen Sequenz ein, solange das Protein die Fähigkeit beibehält, eine Immunantwort auszulösen, oder eine therapeutische Wirkung auf ein Individuum hat, an welches das Protein verabreicht wird.
Mit "Antigen" ist ein Molekül gemeint, das ein oder mehrere Epitope enthält, welche in der Lage sind, das Immunsystem eines Wirtes zu stimulieren, um eine zelluläre antigenspezifische Immunantwort, wenn das Antigen gemäß der vorliegenden Erfindung präsentiert wird, oder eine humorale Antikörperantwort hervorzurufen. Ein Antigen kann fähig sein, selbst, oder wenn es in Kombination mit einem anderen Molekül präsentiert wird, eine zelluläre oder humorale Antwort auszulösen. Normalerweise schließt ein Epitop etwa 3 bis 15, im Allgemeinen etwa 5 bis 15 Aminosäuren ein. Epitope eines bestimmten Proteins können mittels einer Reihe von Epitopkartierungstechniken, welche auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind, identifiziert werden. Vgl. z.B. Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Bd. 66 (Glenn E. Morris, Hrsg., 1996), Humana Press, Totowa, New Jersey. Beispielsweise können lineare Epitope durch z.B. das gleichzeitige Synthetisieren einer großen Anzahl von Peptiden auf festen Trägern, wobei die Peptide Teilen des Proteinmoleküls entsprechen, und das Umsetzen der Peptide mit Antikörper, während die Peptide noch an die Träger gebunden sind, bestimmt werden. Derartige Techniken sind auf dem Fachgebiet bekannt und z.B. in US-Patent Nr. 4,708,871; bei Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 3998–4002; und Geysen et al., Molec. Immunol. 23 (1986), 709–715, beschrieben. In ähnlicher Weise werden Konformationsepitope ohne weiteres durch Bestimmung der räumlichen Konformation der Aminosäuren, wie z.B. mittels Röntgenkristallographie und eine zweidimensionale Kernmagnetresonanz, identifiziert. Vgl. z.B. Epitope Mapping Protocols, vorstehend.
Der Begriff "Antigen", so wie hierin verwendet, bezieht sich sowohl auf Subunit-Antigene, d.h. Antigene, welche einzeln und getrennt von einem Gesamtorganismus vorliegen, mit dem das Antigen natürlicherweise assoziiert ist, als auch auf abgetötete, attenuierte oder inaktivierte Bakterien, Viren, Parasiten oder andere Mikroorganismen. Antikörper wie Anti-Idiotyp-Antikörper oder Fragmente davon und synthetische Peptidmimotope, welche ein Antigen oder eine Antigendeterminante nachahmen können, sind in der Definition eines Antigens, so wie hierin verwendet, ebenfalls eingeschlossen. Entsprechend ist ein Oligonucleotid oder Polynucleotid, welches ein therapeutisches oder immunogenes Protein oder eine Antigendeterminante in vivo codiert, wie bei der Gentherapie und bei Nucleinsäure-Immunisierungsanwendungen, in der Definition eines Antigens hierin ebenfalls eingeschlossen.
Ferner können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung die Antigene von irgendeinem der mehreren bekannten Viren, Bakterien, Parasiten und Pilzen, sowie von irgendeinem der verschiedenen Tumorantigene abgeleitet sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verweist ein "Antigen" außerdem auf ein Protein, welches Modifikationen wie Deletionen, Additionen und Substitutionen (im Allgemeinen konservativer Natur) in der nativen Sequenz beinhaltet, solange das Protein die Fähigkeit beibehält, eine Immunantwort auszulösen. Diese Modifikationen können absichtlich sein, wie durch ortsspezifische Mutagenese, oder können zufällig sein, wie durch Mutationen von Wirten, welche die Antigene herstellen.
Eine "Immunantwort" auf ein Antigen oder eine Zusammensetzung ist die Ausbildung einer humoralen und/oder zellulären Immunantwort in einem Individuum gegen Moleküle, welche in der Zusammensetzung von Interesse vorhanden sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich eine "humorale Immunantwort" auf eine durch Antikörpermoleküle vermittelte Immunantwort, während eine "zelluläre Immunantwort" eine durch T-Lymphocyten und/oder andere Leukocyten vermittelte Antwort ist. Ein wichtiger Aspekt der zellulären Immunität beinhaltet eine antigenspezifische Antwort durch cytolytische T-Zellen ("CTLs"). CTLs sind für Peptidantigene spezifisch, welche in Assoziation mit Proteinen präsentiert werden, die durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) codiert und auf den Oberflächen von Zellen exprimiert werden. CTLs sind bei der Induktion und Beschleunigung der intrazellulären Zerstörung von intrazellulären Mikroorganismen oder der Lyse von Zellen, welche mit solchen Mikroorganismen infiziert sind, nützlich. Ein anderer Aspekt der zellulären Immunität beinhaltet eine antigenspezifische Antwort durch Helfer-T-Zellen. Helfer-T-Zellen sind wirksam, indem sie dazu beitragen, die Abwehrfunktion zu stimulieren und die Aktivität von unspezifischen Effektorzellen gegen Zellen, welche die Peptidantigene in Assoziation mit MHC-Molekülen auf ihrer Oberfläche zeigen, zu richten. Eine "zelluläre Immunantwort" bezieht sich auch auf die Produktion von Cytokinen, Chemokinen und anderen solchen Molekülen, welche durch aktivierte T-Zellen und/oder andere Leukocyten, einschließlich solche, welche von CD4+- und CD8+-T-Zellen abstammen, produziert werden.
Eine Zusammensetzung, wie eine immunogene Zusammensetzung oder ein Impfstoff, welche eine zelluläre Immunantwort auslöst, kann nützlich sein, um ein Wirbeltier durch die Präsentation eines Antigens in Assoziation mit MHC-Molekülen auf der Zelloberfläche zu sensibilisieren. Die zellvermittelte Immunantwort ist gegen Zellen, welche das Antigen auf ihrer Oberfläche präsentieren, oder die Umgebung davon gerichtet. Außerdem können antigenspezifische T-Lymphocyten gebildet werden, um den zukünftigen Schutz eines immunisierten Wirtes zu ermöglichen.
Die Fähigkeit eines bestimmten Antigens oder einer Zusammensetzung, eine zellvermittelte Immunantwort zu stimulieren, kann durch eine Reihe von Tests, wie durch Lymphoproliferationstests (Lymphocytenaktivierung), CTL-Zellcytotoxizitätstests oder durch Testen auf T-Lymphocyten, welche für das Antigen spezifisch sind, in einem sensibilisierten Individuum nachgewiesen werden. Solche Tests sind in dem Fachgebiet hinreichend bekannt. Vgl. z.B. Erickson et al., J. Immunol. 151 (1993), 4189–4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994), 2369–2376; und die nachstehenden Beispiele.
Folglich kann eine Immunantwort, so wie hierin verwendet, eine Antwort sein, welche die Produktion von CTLs und/oder die Produktion oder die Aktivierung von Helfer-T-Zellen stimuliert. Das Antigen von Interesse kann auch eine Antikörpervermittelte Immunantwort auslösen. Daher kann eine Immunantwort eine oder mehrere der folgenden Wirkungen einschließen: die Produktion von Antikörpern durch B-Zellen; und/oder die Aktivierung von Suppressor-T-Zellen und/oder γδ-T-Zellen, welche spezifisch gegen ein Antigen oder Antigene gerichtet sind, welche in der Zusammensetzung oder dem Impfstoff von Interesse vorhanden sind. Diese Antworten können nützlich sein, um die Infektiosität zu neutralisieren und/oder eine Antikörper-Komplement- oder Antikörper-abhängige Zellcytotoxizität (ADCC) zu vermitteln, um einen Schutz für einen immunisierten Wirt vorzusehen. Solche Antworten können mittels herkömmlicher Immuntests und Neutralisierungstests, welche auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind, nachgewiesen werden.
Eine Zusammensetzung, welche ein ausgewähltes Antigen enthält, das an ein Mikropartikel adsorbiert ist, zeigt eine "erhöhte Immunogenität", wenn sie die Fähigkeit besitzt, eine Immunantwort auszulösen, welche stärker ist als die Immunantwort, die durch eine äquivalente Menge des Antigens ausgelöst wird, wenn es nicht in Assoziation mit dem Mikropartikel verabreicht wird. So kann eine Zusammensetzung eine "erhöhte Immunogenität" zeigen, weil das Antigen aufgrund der Adsorption an das Mikropartikel stärker immunogen ist oder weil eine geringere Dosis des Antigens notwendig ist, um eine Immunantwort in dem Individuum, an das es verabreicht wird, hervorzurufen. Eine solche erhöhte Immunogenität kann durch die Verabreichung der Mikropartikel/Antigen-Zusammensetzung und von Antigen-Kontrollen an Tiere und den Vergleich der Antikörpertiter gegen die beiden Substanzen mittels Standardtests wie einem Radioimmuntest und ELISAs, welche auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind, nachgewiesen werden.
Die Begriffe "wirksame Menge" oder "pharmazeutisch wirksame Menge" eines Makromoleküls/Mikropartikels, so wie hierin angegeben, verweist auf eine nicht toxische, aber ausreichende Menge des Makromoleküls/Mikropartikels, um die gewünschte Antwort wie eine Immunantwort und einen entsprechenden therapeutischen Effekt zu erzielen, oder, im Falle der Verabreichung eines therapeutischen Proteins, auf eine Menge, welche ausreichend ist, um eine Behandlung des Individuums, wie nachstehend definiert, durchzuführen. Wie nachstehend dargelegt wird, variiert die genaue Menge, welche erforderlich ist, von Individuum zu Individuum, abhängig von der Spezies, dem Alter und dem Allgemeinzustand des Individuums, der Schwere des zu behandelnden Zustandes und dem speziellen Makromolekül von Interesse, der Verabreichungsweise und dergleichen. Eine geeignete "wirksame" Menge kann durch den Fachmann mittels Routineversuchen in jedem Einzelfall bestimmt werden.
Mit "Wirbeltier" ist irgendein Vertreter des Unterstamms der Chordata gemeint, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Säugetiere wie Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen, Pferde und Menschen; Haustiere wie Hunde und Katzen; und Vögel, einschließlich domestizierte, wilde und zahme Vögel wie Hähne und Hennen, einschließlich Hühner, Truthähne und andere Hühnervögel. Der Begriff bezieht sich nicht auf ein bestimmtes Alter. Folglich sollen sowohl erwachsene als auch neugeborene Tiere eingeschlossen sein.
Mit "pharmazeutisch verträglich" oder "pharmakologisch verträglich" ist ein Material gemeint, welches biologisch gesehen oder in anderer Hinsicht keine Nachteile aufweist; d.h., das Material kann zusammen mit der Mikropartikelformulierung an ein Individuum verabreicht werden, ohne irgendwelche unerwünschten biologischen Effekte oder eine nachteilige Wechselwirkung mit irgendeiner der Komponenten der Zusammensetzung, in welcher es enthalten ist, hervorzurufen.
Mit "physiologischer pH-Wert" oder einem "pH-Wert im physiologischen Bereich" ist ein pH-Wert im Bereich von 7,2 bis einschließlich 8,0, typischer im Bereich von 7,2 bis einschließlich 7,6, gemeint.
So wie hierin verwendet, bezieht sich "Behandlung" auf entweder (i) die Verhinderung einer Infektion oder Reinfektion, wie bei einem traditionellen Impfstoff, (ii) die Verminderung oder die Beseitigung von Symptomen, oder (iii) die wesentliche oder vollständige Eliminierung des Pathogens oder der fraglichen Erkrankung. Die Behandlung kann prophylaktisch (vor der Infektion) oder therapeutisch (nach der Infektion) erfolgen.
B. Allgemeine Methoden
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß die erfindungsgemäßen PLA- und PLG-Mikropartikel biologisch aktive Makromoleküle effizient adsorbieren. Ferner können diese Mikropartikel eine größere Vielzahl von Molekülen, einschließlich geladenen und/oder voluminösen Makromolekülen, leichter adsorbieren als Mikropartikel, welche aus PVA hergestellt werden. Auf diese Weise kann das Makromolekül/Mikropartikel der vorliegenden Erfindung als ein Zuführungssystem verwendet werden, um die biologisch aktive Komponente zur Behandlung, Verhinderung und/oder Diagnose einer großen Vielzahl von Erkrankungen zuzuführen.
Die vorliegende Erfindung kann angewendet werden, um eine große Vielzahl von Makromolekülen zuzuführen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Arzneimittel wie Antibiotika und antivirale Mittel, nicht-steroidale entzündungshemmende Arzneimittel, Schmerzmittel, Vasodilatatoren, kardiovaskuläre Arzneimittel, Psychopharmaka, Neuroleptika, Antidepressiva, Arzneimittel gegen Parkinson, Betablocker, Kalziumkanalblocker, Bradykinin-Inhibitoren, ACE-Inhibitoren, Vasodilatatoren, Prolactin-Inhibitoren, Steroide, Hormonantagonisten, Antihistamine, Serotoninantagonisten, Heparin, Chemotherapeutika, Antineoplastika und Wachstumsfaktoren, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, PDGF, EGF, KGF, IGF-1 und IGF-2, FGF, Polynucleotide, welche therapeutische oder immunogene Proteine codieren, immunogene Proteine und Epitope davon zur Verwendung in Impfstoffen, Hormone einschließlich Peptidhormone wie Insulin, Proinsulin, Wachstumshormon, GHRH, LHRH, EGF, Somatostatin, SNX-111, BNP, Insulinotropin, ANP, FSH, LH, PSH und hCG, Gonadensteroidhormone (Androgene, Östrogene und Progesteron), Thyroidstimulierendes Hormon, Inhibin, Cholecystokinin, ACTH, CRF, Dynorphine, Endorphine, Endothelin, Fibronectin-Fragmente, Galanin, Gastrin, Insulinotropin, Glucagon, GTP-Bindungsprotein-Fragmente, Guanylin, Leukokinine, Magainin, Mastoparane, Dermaseptin, Systemin, Neuromedine, Neurotensin, Pancreastatin, Pankreaspolypeptid, Substanz P, Secretin, Thymosin und dergleichen, Enzyme, Transkriptions- oder Translationsmediatoren, Zwischenprodukte in Stoffwechselwegen, Immunmodulatoren, wie irgendwelche der verschiedenen Cytokine, einschließlich Interleukin-1, Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4 und Gamma-Interferon, Antigene und Adjuvanzien.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Makromolekül ein Antigen. Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die Mikropartikel mit dem adsorbierten Antigen zellvermittelte Immunantworten in einem Wirbeltier hervorrufen können. Diese Fähigkeit der erfindungsgemäßen Antigen/Mikropartikel, eine zellvermittelte Immunantwort gegen ein ausgewähltes Antigen auszulösen, stellt ein wirkungsvolles Mittel gegen eine Infektion durch eine große Vielzahl von Pathogenen bereit. Demgemäß können die erfindungsgemäßen Antigen/Mikropartikel in Impfstoffzusammensetzungen eingebracht werden.
Folglich kann das hierin beschriebene System zusätzlich zu einer herkömmlichen Antikörperantwort z.B. für die Assoziation der exprimierten Antigene mit Klasse I-MHC-Molekülen sorgen, so daß eine zelluläre Immunantwort in vivo gegen das Antigen von Interesse aufgebaut werden kann, welche die Produktion von CTLs stimuliert, um die zukünftige Erkennung des Antigens zu ermöglichen. Außerdem kann durch diese Verfahren eine antigenspezifische Antwort durch Helfer-T-Zellen ausgelöst werden. Demgemäß sind die erfindungsgemäßen Verfahren auf ein beliebiges Makromolekül, für welches eine zelluläre und/oder humorale Immunantwort gewünscht wird, vorzugsweise Antigene, welche von viralen Pathogenen stammen und Antikörper hervorrufen können, Helfer-T-Zell-Epitope und Epitope cytotoxischer T-Zellen, anwendbar. Solche Antigene schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf, die durch menschliche und tierische Viren codierten Antigene und können entweder strukturellen und/oder nicht-strukturellen Proteinen entsprechen.
Die erfindungsgemäßen Mikropartikel sind für eine Immunisierung gegen intrazelluläre Viren, welche normalerweise schwache Immunantworten auslösen, besonders nützlich. Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung angewendet werden, um eine Immunantwort gegen eine große Vielzahl von Proteinen aus der Herpesvirus-Familie, einschließlich Proteinen, welche von den Herpes simplex-Virus (HSV)-Typen 1 und 2 stammen, wie die HSV-1- und HSV-2-Glycoproteine gB, gD und gH; Antigenen, welche von dem Varicella zoster-Virus (VZV), dem Epstein-Barr-Virus (EBV) und dem Cytomegalievirus (CMV) stammen, einschließlich CMV-gB und -gH; und Antigenen, welche von anderen menschlichen Herpesviren stammen, wie HHV6 und HHV7, zu stimulieren. (Vgl. z.B. Chee et al., Cytomegaloviruses (McDougall J.K., Hrsg., Springer-Verlag, 1990), S. 125–169, für eine Übersicht über den Protein-codierenden Inhalt des Cytomegalievirus; McGeoch et al., J. Gen. Virol. 69 (1988), 1531–1574, für eine Besprechung der verschiedenen durch HSV-1 codierten Proteine; US-Patent Nr. 5,171,568 für eine Besprechung der gB- und gD-Proteine von HSV-1 und HSV-2, sowie der Gene, welche diese codieren; Baer et al., Nature 310 (1984), 207–211, für die Identifizierung von Protein-codierenden Sequenzen in einem EBV-Genom; und Davison und Scott, J. Gen. Virol. 67 (1986), 1759–1816, für eine Übersicht über VZV.)
Antigene aus der Hepatitis-Virus-Familie, einschließlich das Hepatitis-A-Virus (HAV), Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), Delta-Hepatitis-Virus (HDV), Hepatitis-E-Virus (HEV) und Hepatitis-G-Virus (HGV), können ebenfalls geeigneterweise in den hierin beschriebenen Techniken verwendet werden. Beispielsweise ist die virale Genomsequenz von HCV bekannt, wie auch Verfahren zum Erhalt der Sequenz. Vgl. z.B. die Internationale Veröffentlichung Nr. WO 89/04669; WO 90/11089; und WO 90/14436. Das HCV-Genom codiert mehrere virale Proteine einschließlich E1 (auch bekannt als E) und E2 (auch bekannt als E2/NSI), sowie ein N-terminales Nucleocapsidprotein (bezeichnet als "Kern") (vgl. Houghton et al., Hepatology 14 (1991), 381–388, für eine Besprechung der HCV-Proteine, einschließlich E1 und E2). Sämtliche dieser Proteine sowie Antigen-Fragmente davon sind in den vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren verwendbar.
Entsprechend ist die Sequenz für das δ-Antigen von HDV bekannt (vgl. z.B. US-Patent Nr. 5,378,814), und dieses Antigen kann ebenfalls geeigneterweise in den vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren verwendet werden. Ferner können von HBV stammende Antigene, wie das Kernantigen, das Oberflächenantigen, sAg, sowie die Oberflächen-Präsequenzen prä-S1 und prä-S2 (früher bezeichnet als prä-S), wie auch Kombinationen davon, wie sAg/prä-S1, sAg/prä-S2, sAg/prä-S1/prä-S2 und prä-S1/prä-S2, hierin verwendet werden. Vgl. z.B. "HBV Vaccines – From the Laboratory to Licence: A Case Study" in Mackett M. und Williamson J.D., Human Vaccines and Vaccination, S. 159–176, für eine Besprechung der HBV-Struktur; und US-Patent Nr. 4,722,840; 5,098,704; und 5,324,513, hierin unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen; Beames et al., J. Virol. 69 (1995), 6833–6838; Birnbaum et al., J. Virol. 64 (1990), 3319–3330; und Zhou et al., J. Virol. 65 (1991), 5457–5464.
Antigene, welche von anderen Viren stammen, können in den beanspruchten Zusammensetzungen und Verfahren ebenfalls verwendet werden, wie zum Beispiel, ohne Begrenzung, u.a. Proteine von Mitgliedern der Familien der Picornaviridae (z.B. Polioviren, etc.); Caliciviridae; Togaviridae (z.B. Rubellavirus, Dengue-Virus, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabodoviridae (z.B. Tollwutvirus, etc.); Filoviridae; Paramyxoviridae (z.B. Mumpsvirus, Masernvirus, Respiratory-Syncitial-Virus, etc.); Orthomyxoviridae (z.B. Influenzavirus-Typen A, B und C, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae; und Retroviridae (z.B. HTLV-I; HTLV-II; HIV-1 (auch bekannt als HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc.)), einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Antigene der Isolate HIV_IIIb, HIV_SF2, HIV_LAV, HIV_LAI, HIV_MN, HIV-1_CM235 und HIV-1_US4; HIV-2; oder das Affen-Immunschwächevirus (SIV). Ferner können die Antigene auch von dem menschlichen Papillomavirus (HPV) und den durch Zecken übertragenen Enzephalitisviren stammen. Vgl. z.B. Virology, 3. Auflage (Joklik W.K., Hrsg., 1988); Fundamental Virology, 2. Auflage (Fields B.N. und Knipe D.M., Hrsg., 1991), für eine Beschreibung dieser und anderer Viren.
Insbesondere sind die gp 120-Hüllproteine eines jeden der vorstehenden HIV-Isolate, einschließlich Vertretern der verschiedenen genetischen Subtypen von HIV, bekannt und beschrieben (vgl. z.B. Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico (1992); Myers et al., Human Retroviruses and Aids, 1990, Los Alamos, New Mexico, Los Alamos National Laboratory; und Modrow et al., J. Virol. 61 (1987), 570–578, für einen Vergleich der Hüllproteinsequenzen einer Vielzahl von HIV-Isolaten), wobei Antigene, welche von irgendwelchen dieser Isolate stammen, in den vorliegenden Verfahren verwendet werden können. Außerdem ist die Erfindung in gleicher Weise auf andere immunogene Proteine, welche von irgendeinem der verschiedenen HIV-Isolate stammen, einschließlich beliebige der verschiedenen Hüllproteine wie gp160 und gp41, der gag-Antigene wie p24gag und p55gag, sowie der Proteine aus der pol-Region, anwendbar.
Das Influenzavirus ist ein anderes Beispiel für ein Virus, für welches die vorliegende Erfindung besonders nützlich ist. Insbesondere sind die Hüllglycoproteine HA und NA von Influenza-A für das Auslösen einer Immunantwort von besonderem Interesse. Zahlreiche HA-Subtypen von Influenza-A sind identifiziert worden (Kawaoka et al., Virology 179 (1990), 759–767; Webster et al., "Antigenic Variation Among Type A Influenza Viruses", S. 127–168, in Palese P. und Kingsbury D.W. (Hrsg.), Genetics of Influenza Viruses, Springer-Verlag, New York). Folglich können auch Proteine, welche von irgendeinem dieser Isolate stammen, in den hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren verwendet werden.
Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren finden auch Verwendung für zahlreiche bakterielle Antigene, wie solche, welche von Organismen stammen, welche Diphtherie, Cholera, Tuberkulose, Wundstarrkrampf, Keuchhusten, Hirnhautentzündung und andere pathologische Zustände hervorrufen, einschließlich, ohne Begrenzung, Bordetella pertussis, Neisseria meningitides (A, B, C, Y), Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori und Haemophilus Influenza, insbesondere Haemophilus influenza-Typ B (HIB), Helicobacter pylori und Kombinationen davon. Beispiele für Antigene von Neisseria meningitides B sind in den folgenden Patentanmeldungen vom gleichen Inhaber offenbart: PCT/US99/09346; PCT IB98/01665; PCT IB99/00103; und die vorläufigen US-Anmeldungen mit den Anmeldenummern 60/083,758; 60/094,869; 60/098,994; 60/103,749; 60/103,794; 60/103,796; und 60/121,528. Beispiele für Antigene von Parasiten schließen solche ein, welche von Organismen stammen, die Malaria und die Lyme-Krankheit hervorrufen.
Es ist ohne weiteres ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung angewendet werden kann, um eine große Vielzahl von Makromolekülen zu verabreichen und daher eine große Zahl von Erkrankungen zu behandeln, zu verhindern und/oder zu diagnostizieren. In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Makromolekül/Mikropartikel-Zusammensetzungen für die ortsspezifische, zielgerichtete Verabreichung verwendet werden. Zum Beispiel können die Makromolekül/Mi kropartikel-Zusammensetzungen durch intravenöse Verabreichung zu der Lunge, der Leber, der Milz, dem Blutkreislauf oder dem Knochenmark hingleitet werden.
Die Adsorption von Makromolekülen an die Oberfläche der adsorbierenden Mikropartikel erfolgt über einen Bindung-Wechselwirkung-Mechanismus, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, eine ionische Bindung, eine Wasserstoffbrückenbindung, eine kovalente Bindung, eine Van-der-Waals-Bindung und eine Bindung über hydrophil/hydrophob-Wechselwirkungen. Fachleute sind ohne weiteres in der Lage, Detergenzien auszuwählen, welche für den Typ des zu adsorbierenden Makromoleküls geeignet sind.
Zum Beispiel können Mikropartikel, welche in Gegenwart von geladenen Detergenzien, wie anionischen oder kationischen Detergenzien, hergestellt werden, Mikropartikel mit einer Oberfläche mit einer negativen oder einer positiven Nettoladung ergeben, welche eine große Vielzahl von Molekülen adsorbieren können. Beispielsweise adsorbieren Mikropartikel, welche mit anionischen Detergenzien wie Natriumdodecylsulfat (SDS) hergestellt werden, d.h. SDS-PLG-Mikropartikel, positiv geladene Antigene wie Proteine. Entsprechend adsorbieren Mikropartikel, welche mit kationischen Detergenzien wie Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) hergestellt werden, d.h. CTAB-PLG-Mikropartikel, negativ geladene Makromoleküle wie DNA. Wenn die Makromoleküle, welche adsorbiert werden sollen, Regionen mit einer positiven und einer negativen Ladung aufweisen, können entweder kationische oder anionische Detergenzien geeignet sein.
Biologisch abbaubare Polymere für die Herstellung von Mikropartikel zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung sind ohne weiteres im Handel erhältlich, wie z.B. von Boehringer Ingelheim, Deutschland, und Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, AL. Zum Beispiel schließen nützliche Polymere für die Bildung der Mikropartikel hierin solche ein, welche von Polyhydoxybuttersäure; Polycaprolacton; Polyorthoester; Polyanhydrid; sowie Poly(α-hydroxysäure), wie Poly(L-Lactid), Poly(D,L-Lactid) (beide hierin bekannt als "PLA"), Poly(hydroxybutyrat), Copolymere von D,L-Lactid und Glycolid wie Poly(D,L-Lactid-co-Glycolid) (bezeichnet hierin als "PLG" oder "PLGA") oder ein Copolymer von D,L-Lactid und Caprolacton, abgeleitet sind. Besonders bevorzugte Polymere zur Verwendung hierin sind PLA- und PLG-Polymere. Diese Polymere sind in einer Vielzahl von Molekulargewichten erhältlich, und das geeignete Molekulargewicht für eine bestimmte Ver wendung kann durch einen Fachmann ohne weiteres ermittelt werden. So liegt z.B. ein geeignete Molekulargewicht für PLA in der Größenordnung von 2000 bis 5000. Für PLG liegen die geeigneten Molekulargewichte im Allgemeinen im Bereich von 10.000 bis 200.000, vorzugsweise 15.000 bis 150.000 und am meisten bevorzugt 50.000 bis 100.000.
Falls ein Copolymer wie PLG verwendet wird, um die Mikropartikel zu bilden, ist hierin eine Vielzahl von Lactid:Glycolid-Verhältnissen verwendbar, wobei das Verhältnis größtenteils Ermessenssache ist und zum Teil von dem gleichzeitig verabreichten Makromolekül und der gewünschten Abbaurate abhängt. Zum Beispiel wird durch ein 50:50-PLG-Polymer, enthaltend 50 % D,L-Lactid und 50 % Glycolid, ein schnell resorbierendes Copolymer bereitgestellt, während ein 75:25-PLG-Polymer langsamer abgebaut wird, und ein 85:15- und ein 90:10-PLG-Polymer aufgrund des erhöhten Gehalts an der Lactid-Komponente noch langsamer abgebaut werden. Es ist ohne weiteres ersichtlich, daß das geeignete Verhältnis von Lactid:Glycolid durch einen Fachmann basierend auf der Art des Antigens und der fraglichen Erkrankung ohne weiteres bestimmt werden kann. Außerdem können Gemische von Mikropartikel mit variierenden Lactid:Glycolid-Verhältnissen hierin verwendet werden, um die gewünschte Freisetzungskinetik für ein bestimmtes Makromolekül zu erhalten und um sowohl für eine primäre als auch eine sekundäre Immunantwort zu sorgen. Die Abbaurate der erfindungsgemäßen Mikropartikel kann auch durch solche Faktoren wie das Polymermolekulargewicht und die Polymerkristallinität kontrolliert werden. PLG-Copolymere mit variierenden Lactid:Glycolid-Verhältnissen und Molekulargewichten sind ohne weiteres im Handel von einer Reihe von Bezugsquellen, einschließlich von Boehringer Ingelheim, Deutschland, und Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, AL, erhältlich. Diese Polymere können auch durch eine einfache Polykondensation der Milchsäurekomponente unter Anwendung von Techniken, welche auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind, wie den bei Tabata et al., J. Biomed. Mater. Res. 22 (1988), 837–858, beschriebenen, synthetisiert werden.
Makromolekül/Mikropartikel können unter Anwendung irgendeines von mehreren Verfahren, welche auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind, hergestellt werden. Zum Beispiel können Doppelemulsion/Lösungsmittel-Abdampftechniken, wie die in US-Patent Nr. 3,523,907 und bei Ogawa et al., Chem. Pharm. Bull. 36 (1988), 1095–1103, beschriebenen, zur Herstellung von Mikropartikeln angewendet werden. Diese Techniken beinhalten die Bildung einer ersten Emulsion, bestehend aus Tröpfchen einer Polymerlösung, welche anschließend mit einer kontinuierlichen wäßrigen Phase, enthaltend einen Partikelstabilisator/ein Tensid, gemischt wird.
Vorzugsweise wird ein Wasser-in-Öl-in-Wasser (w/o/w)-Lösungsmittel-Abdampfsystem, wie es durch O'Hagan et al., Vaccine 11 (1993), 965–969, und Jeffery et al., Pharm. Res. 10 (1993), 362, beschrieben wird, verwendet, um die Mikropartikel zu bilden. Bei dieser Technik wird das bestimmte Polymer mit einem organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat, Dimethylchlorid (auch bezeichnet als Methylenchlorid und Dichlormethan), Acetonitril, Aceton, Chloroform und dergleichen kombiniert. Das Polymer wird in Form einer 1-30 %igen, vorzugsweise einer 2–15 %igen, mehr bevorzugt einer 3–10 %igen und am meisten bevorzugt einer etwa 4 %igen Lösung in einem organischen Lösungsmittel bereitgestellt. Die Polymerlösung wird z.B. mittels eines Homogenisators emulgiert. Die Emulsion wird dann wahlweise mit einem größeren Volumen einer wäßrigen Lösung eines Emulsionsstabilisators wie Polyvinylalkohol (PVA) oder Polyvinylpyrrolidon und einem kationischen, anionischen oder nichtionischen Detergens kombiniert. Die Emulsion kann mit mehr als einem Emulsionsstabilisator und/oder Detergens, z.B. einer Kombination aus PVA und einem Detergens, kombiniert werden. Bestimmte Makromoleküle können an Mikropartikel, welche eine Kombination von Stabilisatoren und/oder Detergenzien aufweisen, leichter adsorbiert werden. Falls ein Emulsionsstabilisator verwendet wird, wird er typischerweise in Form einer 2–15 %igen Lösung und mehr bevorzugt einer 4–10 %igen Lösung bereitgestellt. Im Allgemeinen wird ein Gewicht-zu-Gewicht Detergens-zu-Polymer-Verhältnis im Bereich von 0,00001:1 bis 0,1:1, mehr bevorzugt von 0,0001:1 bis 0,01:1, stärker bevorzugt von 0,001:1 bis 0,01:1 und noch mehr bevorzugt von 0,005:1 bis 0,01:1 verwendet. Das Gemisch wird dann homogenisiert, um eine stabile w/o/w-Doppelemulsion zu bilden. Die organischen Lösungsmittel werden dann abgedampft.
Die Formulierungsparameter können beeinflußt werden, um die Herstellung von kleinen Mikropartikeln in der Größenordnung von 0,05 μm (50 nm) bis größeren Mikropartikeln von 50 μm oder noch größer zu ermöglichen. Vgl. z.B. Jeffery et al., Pharm. Res., 10 (1993), 362–368; McGee et al., J. Microencap. (1996). Zum Beispiel resultiert eine verminderte Bewegung in größeren Mikropartikeln, wie auch eine Er höhung des inneren Phasenvolumens. Kleine Partikel werden durch geringe wäßrige Phasenvolumen mit hohen Konzentrationen von Emulsionsstabilisatoren hergestellt.
Mikropartikel können auch mittels Sprühtrocknen und Koazervation, wie z.B. beschrieben bei Thomasin et al., J. Controlled Release 41 (1996), 131; in US-Patent Nr. 2,800,457; und bei Masters K., Spray Drying, 2. Auflage, Wiley, New York (1976); Luft-Suspension-Beschichtungstechniken wie Pfannenbeschichtung und Wurster-Beschichtung, wie beschrieben durch Hall et al. (1980), The "Wurster Process" in Controlled Release Technologies: Methods, Theory, and Applications (Kydonieus, A.F., Hrsg.), Bd. 2, S. 133–154, CRC Press, Boca Raton, Florida, und Deasy P.B., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. (1988), S(2), 99–139; und ionischer Gelatinierung, wie z.B. beschrieben durch Lim et al., Science 210 (1980), 908–910, gebildet werden.
Die Partikelgröße kann z.B. mittels Laserlichtstreuung, zum Beispiel unter Verwendung eines Spektrometers mit einem eingebauten Helium-Neon-Laser, bestimmt werden. Im Allgemeinen wird die Partikelgröße bei Raumtemperatur bestimmt, wobei die Bestimmung mehrere Analysen der fraglichen Probe (z.B. 5–10mal) beinhaltet, um einen Durchschnittswert für den Partikeldurchmesser zu erhalten. Die Partikelgröße kann auch ohne weiteres mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) bestimmt werden.
Nach der Herstellung können die Mikropartikel als solche oder gefriergetrocknet zur weiteren Verwendung gelagert werden. Um Makromoleküle an die Mikropartikel zu adsorbieren, wird das Mikropartikelpräparat mit dem Makromolekül von Interesse einfach gemischt, und die erhaltene Formulierung kann vor der Verwendung wieder gefriergetrocknet werden. Im Allgemeinen werden die Makromoleküle zu den Mikropartikeln zugegeben, um Mikropartikel mit adsorbierten Makromolekülen mit einem Gewicht zu Gewicht-Verhältnis von 0,0001:1 bis 0,25:1 von Makromolekülen zu Mikropartikeln, vorzugsweise 0,001:1 bis 0,1, mehr bevorzugt 0,01 zu 0,05, zu erhalten. Der Makromolekülgehalt der Mikropartikel kann mittels Standardtechniken bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen Mikropartikel können Makromoleküle darin eingeschlossen oder eingekapselt, sowie Makromoleküle daran adsorbiert haben. So kann zum Beispiel ein Fachmann gemäß der Erfindung Mikropartikel, welche Adjuvanzien einkapseln, mit daran adsorbierten Proteinen oder Mikropartikel, welche Proteine einkapseln, mit daran adsorbierten Adjuvanzien herstellen.
Nach Herstellung der Mikropartikel mit adsorbierten Makromolekülen werden sie als Arzneimittel oder Impfstoffe zur Behandlung, Verhinderung und/oder Diagnose einer großen Vielzahl von Erkrankungen, wie vorstehend beschrieben, formuliert. Die Zusammensetzungen schließen im Allgemeinen einen oder mehrere "pharmazeutisch verträgliche Träger oder Vehikel" wie Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Glycerin, Polyethylenglykol, Hyaluronsäure, Ethanol, etc. ein. Zusätzlich können Hilfsmittel wie Benetzungs- oder Emulgiermittel, biologische Pufferungsmittel und dergleichen in solchen Vehikeln vorhanden sein. Ein biologischer Puffer kann praktisch irgendeine Lösung sein, welche pharmakologisch verträglich ist und welche den gewünschten pH-Wert der Formulierung, d.h. einen pH-Wert im physiologischen Bereich, bereitstellt. Beispiele für Pufferlösungen schließen physiologische Kochsalzlösung, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Tris-gepufferte Salzlösung, Hank's gepufferte Salzlösung und dergleichen ein.
Adjuvanzien können verwendet werden, um die Wirksamkeit der Arzneimittel zu erhöhen. Die Adjuvanzien können gleichzeitig mit den erfindungsgemäßen Mikropartikeln, z.B. in derselben Zusammensetzung oder in separaten Zusammensetzungen, verabreicht werden. Alternativ kann ein Adjuvans vor oder nach den erfindungsgemäßen Mikropartikelzusammensetzungen verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Adjuvans, wie ein immunologisches Adjuvans, in das Mikropartikel eingekapselt werden. Adjuvanzien können genauso wie irgendwelche Makromoleküle unter Anwendung irgendeines der mehreren Verfahren, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind, in die Mikropartikel einkapselt werden. Vgl. z.B. US-Patent Nr. 3,523,907; Ogawa et al., Chem. Pharm. Bull. 36 (1988), 1095–1103; O'Hagan et al., Vaccine 11 (1993), 965–969; und Jefferey et al., Pharm. Res. 10 (1993), 362. Alternativ können die Adjuvanzien an das Mikropartikel adsorbiert werden, wie vorstehend für ein Makromolekül beschrieben wurde.
Immunologische Adjuvanzien schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf: (1) Aluminiumsalze (Alaun) wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat, etc.; (2) Öl-in-Wasser-Emulsionsformulierungen (mit oder ohne anderen spezifischen immunstimulierenden Mitteln wie Muramylpeptiden (vgl. nachstehend) oder bakteriellen Zellwandkomponenten), wie zum Beispiel (a) MF59 (Internationale Veröffentlichung Nr. WO 90/14837), enthaltend 5 % Squalen, 0,5 % Teeen 80 und 0,5 % Span 85 (wahlweise enthaltend unterschiedliche Mengen an MTP-PE (vgl. nachste hend), obwohl nicht erforderlich), formuliert in Form von Submikron-Partikeln unter Verwendung eines Mikroverflüssigers wie dem Mikroverflüssiger Modell 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, enthaltend 10 % Squalen, 0,4 % Tween 80, 5 % Pluronic-blockiertes Polymer L121 und thr-MDP (vgl. nachstehend), entweder mikroverflüssigt zu einer Submikron-Emulsion oder mit einem Vortexgerät gemischt, um eine Emulsion mit einer größeren Partikelgröße zu erzeugen, und (c) Ribi^TM-Adjuvanssystem (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), enthaltend 2 % Squalen, 0,2 % Tween 80 und eine oder mehrere bakterielle Zellwandkomponenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Monophosphoryllipid A (MPL), Trehalosedimycolat (TDM) und Zellwandskelett (CWS), vorzugsweise MPL + CWS (Detox^TM) (für eine weitere Besprechung von geeigneten Submikron-Öl-in-Wasser-Emulsionen zur Verwendung hierin vgl. Patentanmeldung Nr. 09/015,736, eingereicht am 29. Januar 1998, vom gleichen Inhaber); (3) Saponin-Adjuvanzien wie QS21 (z.B. Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA)) oder daraus erzeugte Partikel wie ISCOMs (immunstimulierende Komplexe); (4) Komplettes Freundsches Adjuvans (CFA) und Inkomplettes Freundsches Adjuvans (IFA); (5) Cytokine wie Interleukine (IL-1, IL-2, etc.), der Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) der Tumornekrosefaktor (TNF), etc.; (6) entgiftete Mutanten eines bakteriellen ADP-ribosylierenden Toxins wie einem Choleratoxin (CT), einem Pertussistoxin (PT) oder einem hitzelabilen E. coli-Toxin (LT), insbesondere LT-K63 (worin die Wildtyp-Aminosäure an Position 63 durch Lysin substituiert ist), LT-R72 (worin die Wildtyp-Aminosäure an Position 72 durch Arginin substituiert ist), CT-S109 (worin die Wildtyp-Aminosäure an Position 109 durch Serin substituiert ist) und PT-K9/G129 (worin die Wildtyp-Aminosäure an Position 9 durch Lysin ist und die Position 129 durch Glycin substituiert ist) (vgl. z.B. Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/13202 und WO 92/19265); (7) CpG-Oligonucleotide und andere immunstimulierende Sequenzen (ISSs); und (8) andere Substanzen, welche als immunstimulierende Mittel wirksam sind, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung zu erhöhen. Alaun und MF59 werden bevorzugt.
Muramylpeptide schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf, N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1',2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE), etc.
Für weitere Beispiele von Adjuvanzien vgl. Vaccine Design, The Subunit and the Adjuvant Approach, Powell M.F. und Newman M.J., Hrsg., Plenum Press (1995).
Die Zusammensetzungen umfassen eine "therapeutisch wirksame Menge" des Makromoleküls von Interesse. Das heißt, in den Zusammensetzungen ist eine Menge an dem Makromolekül/Mikropartikel eingeschlossen, welche bewirkt, daß das Individuum eine hinreichende Antwort aufbaut, um Symptome zu verhindern, zu vermindern, zu beseitigen oder zu diagnostizieren. Die genaue Menge, welche erforderlich ist, variiert neben anderen Faktoren abhängig von dem zu behandelnden Individuum; dem Alter und dem Allgemeinzustand des zu behandelnden Individuums; der Schwere des zu behandelnden Zustands; im Falle einer immunologischen Antwort, der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren; dem erwünschten Schutzgrad und dem bestimmten ausgewählten Antigen, sowie dessen Verabreichungsweise. Eine geeignete wirksame Menge kann durch einen Fachmann ohne weiteres bestimmt werden. Folglich umfaßt eine "therapeutisch wirksame Menge" einen relativ großen Bereich, welcher durch Routineversuche bestimmt werden kann. Zum Beispiel, wenn das Makromolekül ein Polynucleotid ist, liegt für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eine wirksame Dosis typischerweise im Bereich von 1 ng bis 1 mg, mehr bevorzugt von 10 ng bis 1 μg und am meisten bevorzugt von 50 ng bis 500 ng des pro Dosis verabreichten Makromoleküls. Falls das Makromolekül ein Antigen ist, liegt eine wirksame Dosis typischerweise im Bereich von 1 μg bis 100 mg, mehr bevorzugt von 10 μg bis 1 mg und am meisten bevorzugt von 50 μg bis 500 μg des pro Dosis zugeführten Makromoleküls.
Nach der Formulierung können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen parenteral, z.B. durch Injektion, verabreicht werden. Die Zusammensetzungen können entweder subkutan, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär injiziert werden. Andere Verabreichungsweisen schließen die nasale, orale und pulmonale Verabreichung, Zäpfchen und transdermale oder transkutane Anwendungen ein. Die Dosisbehandlung kann einen Einzeldosis-Zeitplan oder einen Mehrfachdosis-Zeitplan beinhalten. Ein Mehrfachdosis-Zeitplan ist ein Zeitplan, bei dem eine erste Reihe von Verabreichungen mit 1–10 Einzeldosen erfolgen kann, gefolgt von weiteren Dosen in nachfolgenden zeitlichen Abständen, welche derart gewählt werden, daß die therapeutische Antwort aufrechterhalten und/oder verstärkt wird, zum Beispiel in einem Abstand von 1–4 Monaten für eine zweite Dosis, und falls erforderlich eine oder mehrere nachfolgende Dosen nach mehreren Monaten. Das Dosierungsschema wird auch zumindest teilweise durch die Bedürfnisse des Individuums bestimmt und ist von der Beurteilung des Fachmanns abhängig.
Außerdem, falls die Verhinderung einer Erkrankung erwünscht wird, werden die Makromoleküle im Allgemeinen in Impfstoffen vor einer Erstinfektion mit dem Pathogen von Interesse verabreicht. Falls eine Behandlung erwünscht wird, z.B. die Verringerung von Symptomen oder Rückfällen, werden die Makromoleküle im Allgemeinen nach einer Erstinfektion verabreicht.
C. Experimenteller Teil
Die nachstehenden Beispiele sind spezifische Ausführungsformen für die Durchführung der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele dienen ausschließlich veranschaulichenden Zwecken und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise begrenzen.
Es ist versucht worden, die Richtigkeit der angegebenen Werte (z.B. Mengen, Temperaturen, etc.) zu gewährleisten, wobei aber natürlich einige experimentelle Fehler und Abweichungen erlaubt sind.
Beispiel 1
Herstellung von unbeladenen Mikropartikeln unter Verwendung von PVA als Emulsionsstabilisator
Unbeladene Mikropartikel (d.h. ohne adsorbierte oder eingeschlossene Makromoleküle) wurden unter Verwendung von Polyvinylalkohol (PVA) wie folgt hergestellt. Die verwendeten Lösungen waren:

(1) 6 % RG 504-PLG (Boehringer Ingelheim) in Dichlormethan.
(2) 10 % Polyvinylalkohol (PVA) (ICN) in Wasser.

Insbesondere wurden die Mikropartikel hergestellt durch Kombinieren von 10 ml der Polymerlösung mit 1,0 ml destilliertem Wasser und Homogenisieren für 3 Minuten unter Verwendung eines Omni-Tischhomogenisators mit einer 10 mm-Sonde bei 10K UpM, um eine Wasser/Öl (w/o)-Emulsion zu bilden. Die w/o-Emulsion wurde zu 40 ml der 10 %igen PVA-Lösung zugegeben und für 3 Minuten homogenisiert, um eine Wasser/Öl/Wasser (w/o/w)-Emulsion zu bilden. Die w/o/w-Emulsion wurde über Nacht rühren gelassen, um das Lösungsmittel unter Bildung der Mikropartikel zu verdampfen. Die gebildeten Mikropartikel wurden mittels Zentrifugation viermal mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Die Mikropartikel wurden dann für die weitere Verwendung in einer Malvern Master-Sortiervorrichtung der Größe nach sortiert.
Beispiel 2
Herstellung von unbeladenen Mikropartikeln unter Verwendung von CTAB
Unbeladene Mikropartikel wurden unter Verwendung von CTAB wie folgt hergestellt. Die verwendeten Lösungen waren:

(1) 4 % RG 504-PLG (Boehringer Ingelheim) in Dimethylchlorid.
(2) 0,5 % CTAB (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in Wasser.

Insbesondere wurden die Mikropartikel hergestellt durch Kombinieren von 12,5 ml der Polymerlösung mit 1,25 ml destilliertem Wasser und Homogenisieren für 3 Minuten unter Verwendung eines Omni-Tischhomogenisators mit einer 10 mm-Sonde bei 10K UpM, um eine w/o-Emulsion zu bilden. Die w/o-Emulsion wurde zu 50 ml der 0,5 %igen CTAB-Lösung zugegeben und für 3 Minuten homogenisiert, um eine w/o/w-Emulsion zu bilden. Die w/o/w-Emulsion wurde über Nacht rühren gelassen, um das Lösungsmittel unter Bildung der Mikropartikel zu verdampfen. Die gebildeten Mikropartikel wurden dann durch eine Siebweite von 38 u filtriert, mittels Zentrifugation viermal mit Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Die Mikropartikel wurden dann für die weitere Verwendung in einer Malvern Master-Sortiervorrichtung der Größe nach sortiert.
Beispiel 3
Herstellung von unbeladenen Mikropartikeln unter Verwendung von SDS
Unbeladene Mikropartikel wurden unter Verwendung von SDS wie folgt hergestellt. Die verwendeten Lösungen waren:

(1) 6 % RG 504-PLG (Boehringer Ingelheim) in Dimethylchlorid.
(2) 1 % SDS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in Wasser.

Insbesondere wurden die Mikropartikel durch Kombinieren von 12,5 ml der Polymerlösung mit 50 ml der SDS-Lösung und Homogenisieren für 3 Minuten unter Verwendung eines Omni-Tischhomogenisators mit einer 10 mm-Sonde bei 10K her gestellt. Die Emulsion wurde über Nacht rühren gelassen, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Die gebildeten Mikropartikel wurden durch eine Siebweite von 38 u filtriert, mittels Zentrifugation viermal mit Wasser gewaschen und zur weiteren Verwendung gefriergetrocknet. Die Mikropartikel wurden dann für die weitere Verwendung in einer Malvern Master-Sortiervorrichtung der Größe nach sortiert.
Beispiel 4
Adsorption eines Proteins an unbeladene Mikropartikel
Das Protein wurde an die Mikropartikel wie folgt adsorbiert.
A. Theoretische Beladung mit 1 % und 3 % p55gag
Um theoretische Beladungen von 1 % und 3 % zu erreichen, wurden 50 mg der gefriergetrockneten, unbeladenen SDS/PLG-Mikropartikel, welche in Beispiel 3 hergestellt wurden, in ein Nalgen-Zentrifugenröhrchen eingebracht, und 10 ml 25 mM Boratpuffer, pH 9, mit 6 M Harnstoff, enthaltend das p55gag-Protein (Chiron Corporation, Berkeley, CA), wurden zugegeben, wobei: (a) für die 1 %ige theoretische Beladung 10 ml einer 50 μg/ml p55gag-Lösung verwendet wurden; und (b) für die 3 %ige theoretische Beladung 10 ml einer 150 μg/ml p55gag-Lösung verwendet wurden. Das Gemisch wurde unter Schütteln über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Mikropartikel abzentrifugiert, und der Überstand wurde durch einen Bicinchonin-Test (BCA; Pierce, Rockford, IL) auf die gag-Konzentration untersucht, um die adsorbierte Menge zu bestimmen. Die Mikropartikel wurden zweimal mit 10 ml Borat/6 M Harnstoff-Puffer und zweimal mit 30 ml Wasser gewaschen und zur weiteren Verwendung gefriergetrocknet.
B. Theoretische Beladung mit 1 % des HCV-Kernantigens
Um eine theoretische Beladung von 1 % zu erreichen, wurden 50 mg der gefriergetrockneten, unbeladenen SDS/PLG-Mikropartikel in ein Nalgen-Zentrifugenröhrchen eingebracht, und 10 ml 30 mM Citratpuffer, pH 6,5, mit 6 M Harnstoff, enthaltend das monomere HCV-Kernprotein (10 ml einer 50 μg/ml HCV-Kernprotein-Lösung; Chiron Corporation, Berkeley, CA), wurden zugegeben. Das Gemisch wurde unter Schütteln über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Mikropartikel abzentrifugiert, und der Überstand wurde durch einen Bicinchonin-Test (BCA; Pierce, Rockford, IL) auf die HCV-Konzentration untersucht, um die adsorbierte Menge zu bestimmen. Die Mikropartikel wurden zweimal mit 30 ml Citrat/6 M Harnstoff-Puffer und zweimal mit 30 ml Wasser gewaschen und zur weiteren Verwendung gefriergetrocknet.
Beispiel 5
Adsorptionseffizienz der Mikropartikel
Die gefriergetrockneten Mikropartikel mit dem adsorbierten Protein aus Beispiel 4 wurden mittels Basenhydrolyse wie folgt auf die Gesamtmenge des adsorbierten Proteins untersucht. 10 mg der gefriergetrockneten, adsorbierenden Mikropartikel wurden für 4 Stunden in 2 ml 0,2 N NaOH mit 5 % SDS hydrolysiert, neutralisiert und 1:10 verdünnt und dann unter Verwendung des MicroBCA-Proteintests (Pierce, Rockford, IL) auf den Proteingehalt untersucht. Wie in Tabelle 1 gezeigt, adsorbierten die beiden Mikropartikel mit den modifizierten Oberflächen, welche mit Detergenzien wie CTAB und SDS hergestellt wurden, das Protein wirksamer als Mikropartikel, welche unter Verwendung von PVA allein hergestellt wurden.
Tabelle 1
Beispiel 6
A. Immunogenität von Mikropartikeln mit einem adsorbierten gag-Protein
Die Mikropartikel mit einem adsorbierten gag-Protein, welche unter Verwendung von PVA oder SDS hergestellt wurden, wie in Beispiel 4 beschrieben ist, sowie p55gag allein, ohne assoziierte Mikropartikel (als eine negative Kontrolle), und Vaccinia-gag-pol-Kontrollen (als eine positive Kontrolle) wurden intramuskulär an Mäuse verabreicht. Die Tiere erhielten an den Tagen 7 und 14 eine Auffrischimpfung. Die verabreichte Gesamtdosis ist in den, Tabellen 2 und 3 angegeben. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurde die Milz entnommen und die CTL-Aktivität untersucht, wie bei Doe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93 (1996), 8578–8583, beschrieben ist.
Die Lymphocytenkulturen wurden wie folgt hergestellt. Milzzellen (SC) aus immunisierten Mäusen wurden in Schalen mit 24 Vertiefungen in 5 × 10⁶ Zellen pro Vertiefung gezüchtet. 1 × 10⁶ Zellen davon wurden mit synthetischen Epitop-Peptiden von HIV-1_SF2-Proteinen in einer Konzentration von 10 μM für 1 Stunde bei 37°C sensibilisiert, gewaschen und gemeinsam mit den restlichen unbehandelten 4 × 10⁶ SCs in 2 ml Kulturmedium [50 % RPMI-1640 und 50 % alpha-MEM (Gibco)], ergänzt mit hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol, Antibiotika und 5 % Interleukin-2 (Rat T-Stim; Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA), gezüchtet. Die Zellen wurden an den Tagen 3 und 5 mit 1 ml frischem Medium versorgt, und die Cytotoxizität wurde am Tag 6 untersucht.
Der Zellcytotoxizitätstest wurde wie folgt durchgeführt. Die SvBALB (H-2^d) (SvB)- und MC57 (H-2^b)-Zielzellen, welche in dem ⁵¹Cr-Freisetzungstest verwendet werden, exprimieren Klasse I-, aber nicht Klasse II-MHC-Moleküle. Etwa 1 × 10⁶ Zielzellen wurden in 200 μl Medium, enthaltend 50 μCi (1 Ci = 37 Gbq) ⁵¹Cr und synthetische HIV-1-Peptide (1 mM), für 60 min inkubiert und dreimal gewaschen. Effektorzellen (E) wurden mit 5 × 10³ Zielzellen (T) in unterschiedlichen E/T-Verhältnissen in 200 μl Kulturmedium in Rundboden-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen für 4 Stunden gezüchtet. Der CpM-Mittelwert von Vertiefungen in doppelter Ausfertigung wurden zur Berechnung der spezifischen ⁵¹Cr-Freisetzung in Prozent verwendet.
Wie in den Tabellen 2 und 3 gezeigt, zeigten die SDS-PLG/p55-Mikropartikel eine mit der Vaccinia-Kontrolle vergleichbare Aktivität und waren aktiver als die PVA-PLG/p55-Mikropartikel und die p55gag-Proteinformulierung. Insbesondere, wie in Tabelle 2 gezeigt, war das p55gag-Protein bei Konzentrationen von 10 μg, 25 μg und 50 μg inaktiv. Ferner, wie in Tabelle 3 gezeigt, waren die SDS-PLG/p55-Formulierungen aktiver als die PVA-PLG/p55- und die p55gag-Proteinformulierungen, was zeigt, daß die Proteine in den SDS-PLG/p55-Formulierungen wirksamer an die Mikropartikel adsorbiert wurden, verglichen mit den PVA-PLG/p55- und den p55gag-Proteinformulierungen.

^a SvB-Zelllinie, nicht peptidgepulst.
^b SvB-Zelllinie, gepulst mit dem p7g-Peptid.
^cMC57-Zelllinie, gepulst mit dem p7g-Peptid.

^a MC57-Zelllinie, nicht peptidgepulst.
^b MC57-Zelllinie, gepulst mit dem gag-b-Peptid.
^c SvB-Zelllinie, gepulst mit dem gag-b-Peptid.

Beispiel 7
Herstellung von pCMV-gp120-DNA-adsorbierenden Mikropartikeln mit modifizierten Oberflächen
Mikropartikel mit einer adsorbierten Plasmid-DNA, codierend gp120, wurden wie folgt hergestellt. 20 mg unbeladene Mikropartikel, welche hergestellt wurden, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben ist, wurden mit ansteigenden Konzentrationen der pCMV-gp120-DNA in einem Volumen von 1,0 ml für 3 Stunden bei 4°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Mikropartikel abzentrifugiert, zweimal mit Tris-EDTA-Puffer gewaschen und über Nacht gefriergetrocknet. Die Mikropartikel wurden hydrolysiert, wie in Beispiel 5 beschrieben ist, und bei A₂₆₀ nm auf die Menge der adsorbierten DNA untersucht.
Tabelle 4 veranschaulicht die Beladungseffizienz von PLG-PVA- und PLG-CTAB-Mikropartikeln. Wie in der Tabelle gezeigt, zeigten die PLG-CTAB-Mikropartikel eine effizientere Adsorption als die entsprechenden PLG-PVA-Partikel.
Tabelle 4
Beispiel 8
HCV-E2-Adsorption
Unter Verwendung von PVA und mehreren verschiedenen Detergenzien wurden, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, Mikropartikel hergestellt. Das E2-Protein des Hepatitis-C-Virus (HCV) wurde wie folgt an die Oberfläche der Mikropartikel adsorbiert: 0,2 mg/ml E2 wurden zu 20 mg der Mikropartikel in PBS zugegeben, um eine Lösung von 0,5 %, Gew./Gew., E2/PLG in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml zu bilden. Die Lösungen wurden für 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert und dann zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und dann durch einen MicroBCA auf den Proteingehalt untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Diese Ergebnisse bestätigen die bessere Adsorption von Makromolekülen durch die erfindungsgemäßen Mikropartikel.
Tabelle 5
Beispiel 9
Adsorption des gp120-Proteins
Unter Verwendung von PVA wurden, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, Mikropartikel hergestellt. Es wurden auch Mikropartikel unter Verwendung von NaOleat, einem anionischen Detergens, wie folgt hergestellt: Eine w/o/w-Emulsion wurde aus 1,67 ml 30 mM NaCitrat bei pH 6 als interne Wasserphase, 16,7 ml 6 % Polymer RG 505-PLG (Boehringer Ingelheim) in Dichlormethan als Lösungsmittel (Ölphase) und 66,8 ml 0,4 % NaOleat als äußere wäßrige Phase hergestellt. Diese Mikropartikel sind in der nachstehenden Tabelle 6 als "NaOleat-PLG (w/o/w)" gekennzeichnet. Zusätzlich wurden Mikropartikel unter Verwendung von NaOleat in einer (Ol-in-Wasser-Formulierung hergestellt, und diese Mikropartikel sind in der nachstehenden Tabelle 6 als "NaOleat-PLG (o/w)" gekennzeichnet. Das gp120-Protein wurde wie folgt an die Oberfläche der hergestellten Mikropartikel adsorbiert: 0,388 mg/ml Protein wurden zu etwa 20 mg der Mikropartikel in PBS zugegeben, um eine Lösung von etwa 1,4 %, Gew./Gew., gp120/PLG in einem Gesamtvolumen von 0,8 ml zu bilden. Die Lösungen wurden für 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert und dann zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und dann durch einen MicroBCA auf den Proteingehalt untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Diese Ergebnisse bestätigen die bessere Adsorption von Makromolekülen durch die erfindungsgemäßen Mikropartikel.
Tabelle 6
Beispiel 10
Adsorption des Listeriolysin-Proteins
Unter Verwendung von PVA und CTAB wurden, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, Mikropartikel hergestellt. Das Listeriolysin-Protein (LLO) von Listeria monocytogenes wurde wie folgt an die Oberfläche der Mikropartikel adsorbiert: 1,0 mg/ml LLO wurden zu 100 mg der Mikropartikel in PBS zugegeben, um eine Lösung von 1 %, Gew./Gew., LLO/PLG in einem Gesamtvolumen von 5 ml zu bilden. Die Lösungen wurden für 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert und dann zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und dann durch einen MicroBCA auf den Proteingehalt untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Diese Ergebnisse bestätigen die bessere Adsorption von Makromolekülen durch die erfindungsgemäßen Mikropartikel.
Tabelle 7
Beispiel 11
Wirkung eines Aluminiumsalzes als ein Adjuvans
Unter Verwendung von CTAB wurden, wie vorstehend beschrieben, PLG-Mikropartikel, welche die p55gag-DNA adsorbieren, hergestellt. Die Mikropartikel wurden in zwei Konzentrationen intramuskulär in Mäuse injiziert, und als eine Kontrolle wurde die DNA allein in denselben zwei Konzentrationen injiziert. Zusätzlich wurden in einem Versuch 50 μg Aluminiumphosphat zu der injizierten CTAB-Zusam mensetzung zugegeben. Jede Formulierung wurde zehn Mäusen injiziert. Die Mäuse erhielten nach 28 Tagen eine Auffrischimpfung. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurde das Serum gewonnen, und der geometrische mittlere Titer (GMT) jedes Serums wurde zusammen mit der Standardabweichung (SE) davon gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefaßt und sowohl als Linearwert als auch als log-Wert angegeben. Jede Zahl entspricht dem Mittelwert der Ergebnisse, welche für die zehn Mäuse erhalten wurden.
Tabelle 8
Um diese Ergebnisse statistisch zu vergleichen, wurden die p-Werte für DNA-CTAB vs. DNA-CTAB + Alaun (p-Wert = 0,0017); DNA-CTAB + Alaun vs. DNA allein (p-Wert < 0,0001); und DNA-CTAB (10 μg) vs. DNA allein (10 μg) (p-Wert < 0,0001) berechnet. Diese p-Werte bestätigen die statistische Signifikanz der Werte in Tabelle B.
Beispiel 12
Messung der Zeta-Potentiale
Die Messung der Zeta-Potentiale wurde mit einem DELSA 440 SX-Zeta-Potential-Meßgerät von Coulter Corp., Miami, FL 33116, durchgeführt. Das System wird unter Verwendung von Beweglichkeitsstandards von Coulter (EMP SL7, eine wäßrige Suspension von Polystyrollatex-Kügelchen) kalibriert. Nach dem Spülen der Probenküvette mit sterilem Wasser werden die Proben in die Probenküvette eingebracht. Die Zählvorrichtung wird dann durch die Ausrichtung des Lichtstrahls auf den niedrigsten Wert davon auf Null eingestellt. Die Stromstärke wird auf 0,7 mA für die Referenz und auf 20 V für die Probe eingestellt. Die Detektorwerte für alle vier Lichtstrahlen werden überprüft, dann wird die Probe durch Auswählen von "Run" in der Software analysiert, und die Häufigkeitsmeßwerte werden abgelesen. Die Lichtstrahlen sollten sich um 20 Hz unterscheiden. Das mittlere Zeta-Potential für jede Probe wird dann abgelesen.
Die Meßwerte für mehrere Mikropartikelformulierungen der vorliegenden Erfindung wurden abgelesen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Wie aus den Ergebnissen deutlich wird, verändert die Adsorption von Makromolekülen an die Oberflächen der Mikropartikel die Zeta-Potentiale der Mikropartikel.
Tabelle 9
Beispiel 13
Mikropartikel mit eingekapselten und adsorbierten Makromolekülen

(A). Unter Verwendung von RG 505-PLG und PVA wurden PLG-Mikropartikel hergestellt, welche das Adjuvans LTK63 einkapseln. 100 mg der Mikropartikel wurden mit 5 ml PBS, enthaltend 400 μg/ml p24gag-Protein, inkubiert. Das Gemisch wurde dann unter Schütteln bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert, mittels Zentrifugation zweimal mit 20 ml PBS und einmal mit Wasser gewaschen und dann gefriergetrocknet. Im Anschluß an eine Basenhydrolyse und eine Neutralisation wurden das adsorbierte Protein in % und das eingekapselte Adjuvans in % gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.
(B). Unter Verwendung von SDS und RG 505-PLG wurden PLG-Mikropartikel, welche CpG-Oligonucleotide als Adjuvans einkapseln, wie folgt hergestellt. 5 ml 6 % RG 505-Polymer in DCM wurden mit 0,5 ml 5 mg/ml CpG in 50 mM Tris/EDTA emulgiert, um eine w/o-Emulsion zu bilden. Die w/o-Emulsion wurde zu 20 ml 1 % SDS zugegeben und dann emulgiert, um eine w/o/w-Emulsion zu bilden. Die Mikropartikel wurden durch das Verdampfen des Lösungsmittels über Nacht gebildet, anschließend gewaschen, abzentrifugiert und gefriergetrocknet. 10 mg der CpG einkapselnden Mikropartikel wurden in 1 ml DCM gelöst. 0,5 ml Wasser wurde zugegeben, um die Oligonucleotide zu extrahieren. Das Gemisch wurde dann zentrifugiert, und die wäßrige Schicht wurde in eine Größenausschlußsäule mit PBS als mobile Phase injiziert. 10 mg Placebo-Mikropartikel wurden mit 100 μg CpG-Oligonucleotiden gemischt und wie vorstehend mit DCM extrahiert und als Standard über die Säule laufen gelassen. Die Menge der vorhandenen CpG-Oligonucleotide in den abgefangenen Partikeln wurde gegen den Standard berechnet.

p55gag wurde wie folgt an die CpG einkapselnden Mikropartikel adsorbiert: 50 mg der gefriergetrockneten, CpG einkapselnden Mikropartikel wurden mit 5 ml 25 mM Borat mit 6 M Harnstoff (pH 9), enthaltend 140 μg p55gag-Protein, über Nacht inkubiert. Das Gemisch wurde unter Schwenken über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, zweimal mit 20 ml Boratpuffer/6 M Harnstoff und zweimal mit 20 ml Wasser gewaschen und dann gefriergetrocknet.
10 mg der CpG einkapselnden/p55gag adsorbierenden Mikropartikel wurden einer Basenhydrolyse unterzogen, und die eingeschlossenen und adsorbierten Makromoleküle in % wurden gemessen. Die Zielbeladung betrug 1,0 %, sofern nicht anders angeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10

* Zielbeladung = 2,0 %

Beispiel 14
Mikropartikel mit zwei adsorbierten Makromolekülen

(A). Gemäß der vorliegenden Erfindung können zwei oder mehrere Makromoleküle in einer Zusammensetzung, umfassend Mikropartikel, welche beide Makromoleküle adsorbiert haben, oder in einer Zusammensetzung, umfassend zwei oder mehrere verschiedene Mikropartikel, welche jeweils ein einzelnes Makromolekül adsorbiert haben, verabreicht werden. Zum Beispiel wurden Mikropartikel, welche sowohl ein E2-Polypeptid als auch CpG-Oligonucleotide als Adjuvans adsorbieren, wie folgt hergestellt: Unbeladene PLG-CTAB-Mikropartikel wurden, wie bereits beschrieben, hergestellt. 20 mg der gefriergetrockneten Mikropartikel wurden für 4 Stunden mit 1 ml 200 μg/ml E2 in physiologischer Kochsalzlösung inkubiert. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden geschwenkt und zweimal mit 20 ml normalem Salzwasser mittels Zentrifugation bei 10.000 G gewaschen. Das Pellet wurde in 1 ml einer CpG-Lösung in TE-Puffer, enthaltend 200 μg/ml CpG, für 4 Stunden bei Raumtemperatur resuspendiert. Die fertige Suspension wurde mittels Zentrifugation zweimal mit TE-Puffer gewaschen und dann gefriergetrocknet. 10 mg der Mikropartikel mit dem adsorbierten CpG und E2 wurden einer Basenhydrolyse unterzogen, und die Proteinkonzentration wurde durch eine BCA bestimmt. Die CpG-Restmenge im Überstand wurde mittels HPLC bestimmt, um die Menge der an die Mikropartikel adsorbierten CpG-Oligonucleotide zu messen. Die in Tabelle 11 gezeigten Ergebnisse veranschaulichen die positive Adsorption für beide Makromoleküle.
(B). Im Einklang mit der Erfindung wurden Mikropartikel hergestellt. Ein Teil davon wurde verwendet, um das E2-Polypeptid zu adsorbieren, während ein anderer Teil davon verwendet wurde, um die CpG-Oligonucleotide als Adjuvans zu adsorbieren. Unbeladene PLG-CTAB-Mikropartikel wurden, wie bereits beschrieben, hergestellt. 20 mg der gefriergetrockneten Mikropartikel wurden für 4 Stunden mit 1 ml 200 μg/ml E2 in physiologischer Kochsalzlösung inkubiert. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden geschüttelt und zweimal mit 20 ml normalem Salzwasser mittels Zentrifugation bei 10.000 G gewaschen und dann gefriergetrocknet. Getrennt davon wurden 20 mg der gefriergetrockneten Mikropartikel für 4 Stunden mit 1 ml 200 μg/ml CpG in TE-Puffer inkubiert. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 4 Stunden geschüttelt, zweimal mit 20 ml TE-Puffer mittels Zentrifugation bei 10.000 G gewaschen und dann gefriergetrocknet. Die Ergebnisse der Messungen der adsorbierten Makromoleküle in Prozent sind in Tabelle 11 angegeben.

Tabelle 11

* Zielbeladung = 1,0 %

Beispiel 15
Unter Verwendung einer Kombination von Detergens und PVA gebildete Mikropartikel
Das folgende Verfahren wurde angewendet, um Mikropartikel zu bilden, welche zwei Tenside, PVA und ein Detergens, umfassen: 10 ml 5 % PLG-Polymer und 0,2 % des Detergens DOTAP in DCM wurden bei 12.000 UpM für 3 Minuten mit 1,0 ml destilliertem Wasser emulgiert, um die erste w/o-Emulsion zu bilden. Die w/o-Emulsion wurde zu, 40 ml 0,8 % PVA zugegeben und für 3 Minuten emulgiert, um die zweite w/o/w-Emulsion zu bilden, die über Nacht gerührt wurde, um das Lösungsmittel zu verdampfen, wobei die Mikropartikel gebildet wurden. Die Mikropartikel wurden zweimal in destilliertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Die Mikropartikel sind dann fertig zur Adsorption von Makromolekülen Gemäß der vorliegenden Erfindung.
Dasselbe Verfahren wurde angewendet, um Mikropartikel zu bilden, welche eine Kombination von PVA und dem Detergens DDA umfassen.
Beispiel 16
Immunogenität von Mikropartikeln mit einer adsorbierten p55-DNA Unter Verwendung des Detergens CTAB oder DDA wurden wie in den vorherigen Beispielen Mikropartikel gebildet An die Mikropartikel wurde eine p55-DNA adsorbiert, und die Immunogenität davon wurde mittels der Verfahren, welche in den vorherigen Beispielen beschrieben wurden, abgeschätzt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 12 zusammengefaßt. Tabelle 12

^a SvB-Zelllinie, gepulst mit dem gag-b-Peptid.

Beispiel 17
In-vivo-Luciferase-Expression unter Verwendung von Mikropartikeln mit einer adsorbierten Luciferase-DNA
Mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren wurden unter Verwendung von PLG und dem Detergens CTAB Mikropartikel gebildet. Die Luciferase-DNA wurde mittels der vorher beschriebenen Verfahren daran adsorbiert. Die In-vitro-Luciferase-Expression wurde unter Verwendung einer 5 μg-Dosis der Luciferase-DNA unter Verwendung der Luciferase-DNA allein (1248 pg) und der Mikropartikel mit der daran adsorbierten Luciferase-DNA (2250 pg) gemessen. Die In-vivo-Luciferase-Expression wurde an den Tagen 1 und 14 nach der Verabreichung im Muskel wie folgt gemessen: Zwei Gruppen von Mäusen (n = 5) wurden jeweils entweder 50 μg Luciferase-Plasmid oder 50 μg PLG-CTAB-Luciferase-DNA-Mikropartikel injiziert. Beide Gruppen von Mäusen erhielten eine intramuskuläre Injektion in den vorderen Schienbeinmuskel (TA) zweier Pfoten. Beide TA-Muskeln einer jeden Maus in den zwei Gruppen wurden entweder am Tag 1 oder am Tag 14 entnommen und in einem Gefrierschrank bei –80°C gelagert. Die Muskeln wurden mit einem Mörser und einem Stößel auf Trockeneis zerkleinert. Die pulverisierten Muskeln wurden in Eppendorf-Röhrchen mit 0,5 ml 1x Reporter-Lysepuffer gesammelt. Die Proben wurden mit Hilfe eines Vortexgeräts für 15 Minuten bei Raumtemperatur gemischt. Nach dreimaligem Einfrieren/Auftauen wurden die Proben bei 14.000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand der TA-Muskeln einer jeden Maus zu jedem Zeitpunkt wurden vereinigt, und 20 μl der Proben wurden unter Verwendung einer ML3000-Vorrichtung (Dynatech) unter Verstärkung des Leuchtsignals auf eine Luciferase-Expression untersucht.
Die Luciferase-Bestimmung wurde unter Verwendung eines Chemilumineszenztests durchgeführt. Der Puffer, enthaltend 1 mg/ml BSA in 1x Reporter-Lysepuffer (Promega), wurde zubereitet. Die Luciferase-Enzym-Stammlösung (Promega) mit 10 mg/ml wurde als ein Standard verwendet und bis zu einer Konzentration von 500 pg/20 μl verdünnt. Dieser Standard wurde auf einer Microlite 2-Platte (Dynatech) 1:2 seriell verdünnt, um eine Standardkurve aufzustellen. 20 μl der Nullprobe und der Proben wurden ebenfalls auf die Platte aufgegeben und 1:2 seriell verdünnt. Die Platten wurde in die ML3000-Vorrichtung eingebracht, worin 100 μl des Luciferase-Test-Reagens (Promega) pro Vertiefung injiziert wurden. Unter Verstärkung des Leuchtsignals wurden die relativen Lichteinheiten für jede Probe gemessen.
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 13 angegeben.
Tabelle 13
Beispiel 18
Immunogenität von Mikropartikeln mit einem adsorbierten Antigen vs. einem eingeschlossenen Antigen
Unter Anwendung der Verfahren, welche in den vorherigen Beispielen besprochen wurden, wurden Mikropartikel hergestellt. Im Anschluß daran wurde das E2-Protein, wie vorstehend beschrieben, daran adsorbiert. Es wurden auch Mikropartikel hergestellt, welche, wie vorstehend beschrieben, das E2-Protein darin eingeschlossen anstatt daran adsorbiert haben. Die Mikropartikel wurden nach ihrer Fähigkeit beurteilt, IgG-Antikörper nach der Immunisierung von 10 Mäusen mit jedem Mikropartikel-Typ zu induzieren. Der geometrische mittlere Titer (GMT) des Serums jeder Maus wurde gemessen und dann für die Gruppe aus 10 Tieren gemittelt. Die Standardabweichung (SE) wurde ebenfalls berechnet. Für den Fischer-PLSD-Test (Signifikanzlevel = 5 %) wurde ein Wert von p = 0,0006 erhalten. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 14 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig die bessere Induktion einer humoralen Immunantwort unter Verwendung der adsorbierenden Mikropartikel der vorliegenden Erfindung.
Tabelle 14
Beispiel 19
Immunogenität von Mikropartikeln mit einem daran adsorbierten HCV-E1E2-Protein
Unter Anwendung der Verfahren, welche in den vorherigen Beispielen besprochen wurden, wurden PLG-CTAB-Mikropartikel hergestellt. Das E1E2-Protein des Hepatitis-C-Virus (HCV) wurde daran adsorbiert. Die Partikel wurden zur Immunisierung von Mäusen, mit oder ohne dem Adjuvans Alaun, verwendet, wobei Dosierungen der Mikropartikel verwendet wurden, für welche berechnet wurde, daß sie entweder 10 μg oder 100 μg Protein bereitstellen. Der geometrische mittlere Titer wurde gemessen, und die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 15 gezeigt.
Tabelle 15
Wie die Ergebnisse zeigen, lösen die Mikropartikel mit dem daran adsorbierten Protein in der Dosis von 10 μg eine sehr starke Immunantwort aus. Dies zeigt, daß die Mikropartikel den Vorteil aufweisen, daß sie beim Auslösen von Immunantworten in niedrigen Dosen, bei denen die freie DNA nicht in der Lage ist solche Antworten hervorzurufen, nützlich sind.
Beispiel 20
Immunogenität von Mikropartikeln mit einem adsorbierten p24gag-Protein
Unter Anwendung der Verfahren, welche in den vorherigen Beispielen besprochen wurden, wurden PLG-PVA-Mikropartikel hergestellt. Das Protein p24gag wurde dann daran adsorbiert, wie vorstehend beschrieben wurde. Die Mikropartikel wurden nach ihrer Fähigkeit beurteilt, IgG-, IgG1- und IgG2a-Antikörper nach der Immunisierung von 10 Mäusen zu induzieren. Der geometrische mittlere Titer (GMT) des Serums, das den Mäusen zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung (2wp2) und zwei Wochen nach der dritten Immunisierung (2wp3) entnommen worden war, wurde gemessen und dann für die Gruppe aus 10 Tieren gemittelt. Die Standardabweichung (SE) wurde ebenfalls berechnet. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 16 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen eindeutig die stärkere Induktion einer humoralen Immunantwort unter Verwendung der adsorbierenden Mikropartikel der vorliegenden Erfindung.
Tabelle 16
Beispiel 21
IM-Immunisierung mit dem p55gag-Protein und verschiedenen Adjuvanzien
PLG/CTAB-, PLG/SDS- und PLG/PVA-Mikropartikel wurden, wie vorstehend in den vorherigen Beispielen beschrieben, gebildet. Es wurden acht Gruppen von Mikropartikeln gebildet, um die unterschiedlichen Wirkungen hinsichtlich der Immunisierung von Mäusen mit einem an Mikropartikel adsorbierten p55gag-Protein als Antigen vs. der Bereitstellung eines freien löslichen p55gag zu untersuchen und um die Auswirkungen der Anwesenheit des Adjuvans CpG (einzelsträngige Oligonucleotide mit einer Länge von 20 Basen mit einem CpG-Motiv), ebenfalls adsorbiert an andere Mikropartikel oder bereitgestellt in einer freien löslichen Form, zu bestimmen. Die verschiedenen Gruppen wurden wie folgt zusammengestellt:

In Gruppe 1 wurde ein lösliches p55gag-Protein (ein rekombinantes HIV-p55gag-Protein, hergestellt in Hefe, in 2 mg/ml in Tris/NaCl-Puffer mit 2 M Harnstoff), gemischt mit PLG/CTAB-Partikeln mit einem adsorbierten CpG, verwendet.
In Gruppe 2 wurden PLG/SDS-Partikel mit einem adsorbierten p55gag, gemischt mit PLG/CTAB-Partikeln mit einem adsorbierten CpG, verwendet.
In Gruppe 3 wurden PLG/SDS-Partikel mit einem adsorbierten p55gag, gemischt mit einem freien CpG, verwendet.
In Gruppe 4 wurden PLG/SDS-Partikel mit einem adsorbierten p55gag ohne einem Adjuvans verwendet.
In Gruppe 5 wurden PLG/PVA-Partikel mit einem darin eingeschlossenen p55gag, gemischt mit PLG/CTAB-Partikeln mit einem adsorbierten CpG, verwendet.
In Gruppe 6, einer Kontrolle, wurde kein Antigen, aber ein lösliches CpG verwendet.
In Gruppe 7, einer anderen Kontrolle, wurden ein lösliches p55gag-Protein, aber keine Adjuvanzien verwendet.
In Gruppe 8, einer weiteren Kontrolle, wurden nur das Vaccinia-Virus (vv-gag), welches das gag-Gen exprimiert, und keine Adjuvanzien verwendet.

Für jede Gruppe wurden 10 Mäuse mit ausreichenden Mengen der Mikropartikel oder der freien Moleküle immunisiert, so daß die Dosierung des p55gag-Antigens und des CpG-Adjuvans jeweils 25 μg betrug (falls in der Gruppe verwendet), bis auf Gruppe 8, worin das Virus in einer Dosierung von 10 × 10⁷ PFU verwendet wurde. Der Immunisierungsweg war IM, bis auf Gruppe 8, worin der Weg IP war. Nach der Immunisierung wurde der anti-p55-IgG-Titer im Serum gemessen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 17 gezeigt. Die Lyse der Zielzellen durch CTLs wurde ebenfalls für jede Gruppe gemessen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 18 gezeigt. Tabelle 17
Tabelle 18

^a SvB-Zelllinie, gepulst mit einem irrelevanten Peptid.
^b SvB-Zelllinie, gepulst mit dem p7g-Peptid.

Beispiel 22
Adsorption vs. Einschluß einer p55-DNA
PLG/CTAB-Mikropartikel mit einer adsorbierten p55-DNA und PLG/PVA-Mikropartikel mit einer darin eingeschlossenen p55-DNA wurden, wie vorstehend in den vorherigen Beispielen beschrieben, gebildet. Die IM-Immunisierung von Mäusen und die Antikörperinduktion (Gewinnung und Analyse des Serums) erfolgten, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, vier Wochen nach der ersten Immunisierung (4wp1) sowie 2, 4, 6, 13 und 15 Wochen nach der zweiten Immunisierung (2wp2, 4wp2, 6wp2, 13wp2 bzw. 15wp2). Die nachstehend in Tabelle 19 gezeigten Ergeb nisse demonstrieren den eindeutigen Vorteil der Mikropartikel mit der adsorbierten p55-DNA gegenüber sowohl der eingeschlossenen als auch der freien p55-DNA.
Tabelle 19
Beispiel 23
Induktion einer Immunantwort durch Mikropartikel in Meerschweinchen
PLG/CTAB-Mikropartikel mit einer adsorbierten gp120-DNA wurden, wie vorstehend in den vorherigen Beispielen beschrieben, gebildet. Die anderen Proben waren wie nachstehend in Tabelle 20 angegeben und schlossen Mikropartikel mit und ohne Aluminiumphosphat, Kontrollen mit einem freien löslichen gp120, mit und ohne Aluminiumphosphat, und das MF59-Protein, welches durch die gp120-DNA codiert wird, ein. Die IM-Immunisierung von Meerschweinchen und die Antikörperinduktion (Gewinnung und Analyse des Serums) wurden, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 20 gezeigt.
Tabelle 20
Beispiel 24
Intranasale (IN) Immunisierung mit Mikropartikeln mit einer adsorbierten p55-DNA
PLG/CTAB-Mikropartikel mit einer adsorbierten p55-DNA und PLG/DDA-Mikropartikel mit einer adsorbierten p55-DNA wurden, wie vorstehend in den vorherigen Beispielen beschrieben, gebildet. Die IN-Immunisierung von Mäusen mit 25 μg oder 100 μg, die Antikörperinduktion (Gewinnung und Analyse des Serums) und die CTL-Induktion erfolgten, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, zwei und vier Wochen nach der ersten Immunisierung (2wp1 und 4wp1), zwei und vier Wochen nach der zweiten Immunisierung (2wp2 und 4wp2) sowie zwei und vier Wochen nach der dritten Immunisierung (2wp3 und 4wp3). Die Kontrollen schlossen die Immunisierung mit einer löslichen p55-DNA allein oder mit 10 μg Choleratoxin ein. Die Ergebnisse für die Antikörperinduktion sind in Tabelle 21 gezeigt, und die Ergebnisse für die Lyse durch CTLs (vier Wochen nach der vierten Immunisierung) sind nachstehend in Tabelle 22 gezeigt. Tabelle 21
Tabelle 22

Obwohl bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in einigen Einzelheiten beschrieben worden sind, ist selbstverständlich, daß offensichtliche Veränderungen vorgenommen werden können, ohne von der Erfindung, so wie in den beigefügten Patentansprüchen definiert, abzuweichen.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Mikropartikels mit einer adsorbierenden Oberfläche, an welche ein biologisch wirksames Makromolekül adsorbiert wurde, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Emulgieren eines Gemisches einer Polymerlösung und eines ionischen Detergens zur Bildung einer Emulsion, wobei die Polymerlösung ein Polymer umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Poly(α-hydroxysäure), einer Polyhydroxybuttersäure, einem Polycaprolacton, einem Polyorthoester, einem Polyanhydrid und einem Polycyanacrylat, wobei das Polymer in einer Konzentration von etwa 1 % bis etwa 30 % in einem organischen Lösungsmittel vorliegt und wobei das Detergens in dem Gemisch in einem Gewicht zu Gewicht-Detergens zu Polymer-Verhältnis von etwa 0,00001:1 bis etwa 0,1:1 vorliegt; (b) Entfernen des organischen Lösungsmittels aus der Emulsion, zur Bildung des Mikropartikels mit der adsorbierenden Oberfläche; und (c) Adsorbieren des Makromoleküls an die Oberfläche des Mikropartikels.
Verfahren zur Herstellung einer Mikropartikelzusammensetzung, umfassend ein Mikropartikel mit einer adsorbierenden Oberfläche, an welche ein biologisch wirksames Makromolekül adsorbiert wurde, dieses Verfahren umfassend die Schritte (a) bis (c) nach Anspruch 1 und darüber hinaus umfassend den Schritt (d) des Kombinierens des Mikropartikels mit dem adsorbierten Makromolekül von Schritt (c) mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Bildung der Mikropartikelzusammensetzung.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Makromolekül mindestens ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Wirkstoff, einem Polynucleotid, einem Polynucleosid, einem Polypeptid, einem Hormon, einem Enzym, einem Transkriptions- oder Translationsmediator, einem Zwischenprodukt in einem Stoffwechselweg, einem Immunmodulator, einem Antigen und einem Adjuvans.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Makromolekül ein Antigen ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus gp120, p24gag, p55gag und Influenza-A-Hämagglutinin-Antigen.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Makromolekül ein Polynucleotid ist, welches gp120 codiert.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Makromolekül ein Polynucleotid ist, welches ein Tumor-Antigen codiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Detergens in einem Gewicht zu Gewicht-Detergens zu Polymer-Verhältnis von etwa 0,0001:1 bis etwa 0,01:1 vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Detergens in einem Gewicht zu Gewicht-Detergens zu Polymer-Verhältnis von etwa 0,001:1 bis etwa 0,01:1 vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Detergens in einem Gewicht zu Gewicht-Detergens zu Polymer-Verhältnis von etwa 0,005:1 bis etwa 0,01:1 vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Detergens ein anionisches Detergens ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Detergens ein sulfatierter Fettalkohol ist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 1 i, wobei das Makromolekül ein Polypeptid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Detergens ein kationisches Detergens ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Makromolekül ein Polynucleotid ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Polymer eine Poly(α-hydroxysäure) umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly(L-Lactid), Poly(D,L-Lactid) und Poly(D,L-Lactid-co-Glycolid).
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Polymer ein Poly(D,L-Lactid-co-Glycolid) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Polymer ein Poly(D,L-Lactid-co-Glycolid) umfasst, das in einer Konzentration von etwa 3 % bis etwa 10 % vorliegt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Mikropartikel ein Partikel mit einem Durchmesser von etwa 100nm bis etwa 150μm ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Mikropartikel ein Partikel mit einem Durchmesser von etwa 200nm bis etwa 30μm ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Mikropartikel ein Partikel mit einem Durchmesser von etwa 500nm bis etwa 10μm ist.
Mikropartikel, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20.
Mikropartikel mit einer adsorbierenden Oberfläche, wobei das Mikropartikel umfasst ein biologisch abbaubares Polymer; ein ionisches Detergens; und ein erstes biologisch wirksames Makromolekül adsorbiert an die Oberfläche des Mikropartikels, wobei das erste biologisch aktive Makromolekül mindestens ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid, einem Polynucleotid, einem Polynucleosid, einem Antigen, einem Wirkstoff, einem Hormon, einem Enzym, einem Transkriptions- oder Translationsmodulator, einem Zwischenprodukt in einem Stoffwechselweg, einem Immunmodulator und einem Adjuvans.
Mikropartikel nach Anspruch 22, darüber hinaus umfassend ein zweites biologisch aktive Makromolekül, welches in dem Mikropartikel eingekapselt ist, wobei das zweite biologisch aktive Makromolekül mindestens ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polypeptid, einem Polynucleotid, einem Polynucleosid, einem Antigen, einem Wirkstoff, einem Hormon, einem Enzym, einem Transkriptions- oder Translationsmodulator, einem Zwischenprodukt in einem Stoffwechselweg, einem Immunmodulator und einem Adjuvans.
Mikropartikel nach Anspruch 23, wobei das zweite biologisch aktive Makromolekül ein Adjuvans ist.
Mikropartikel nach Anspruch 24, wobei das erste biologisch aktive Makromolekül ein Antigen ist.
Mikropartikel nach Anspruch 23, wobei das zweite biologisch aktive Makromolekül ein Antigen ist.
Mikropartikel nach Anspruch 26, wobei das erste biologisch aktive Makromolekül ein Adjuvans ist.
Mikropartikel nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei das Detergens ein kationisches Detergens ist.
Mikropartikel nach Anspruch 28, wobei das Makromolekül ein Polynucleotid ist.
Mikropartikel nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei das Detergens ein anionisches Detergens ist.
Mikropartikel nach Anspruch 30, wobei das Detergens ein sulfatierter Fettalkohol ist.
Mikropartikel nach Anspruch 30 und 31, wobei das Makromolekül ein Polypeptid ist.
Mikropartikel nach einem der Ansprüche 22 bis 32, wobei das erste biologisch aktive Makromolekül ein Antigen ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus gp120, p24gag, p55gag und Influenza-A-Hämagglutinin-Antigen.
Mikropartikel nach einem der Ansprüche 22 bis 31, wobei das erste biologisch aktive Makromolekül ein Polynucleotid ist, welches gp120 codiert.
Mikropartikel nach einem der Ansprüche 22 bis 31, wobei das Makromolekül ein Polynucleotid ist, welches ein Tumor-Antigen codiert.
Mikropartikel nach einem der Ansprüche 22 bis 35, wobei das Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Poly(α-hydroxysäure), einer Polyhydroxybuttersäure, einem Polycaprolacton, einem Polyorthoester, einem Polyanhydrid und einem Polycyanacrylat.
Mikropartikel nach Anspruch 36, wobei das Mikropartikel eine Poly(α-hydroxysäure) umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Poly(L-Lactid), Poly(D,L-Lactid) und Poly(D,L-Lactid-co-Glycolid).
Mikropartikel nach Anspruch 37, wobei das Mikropartikel ein Poly(D,L-Lactidco-Glycolid) umfasst.
Mikropartikel nach einem der Ansprüche 22 bis 38, wobei das Mikropartikel ein Partikel mit einem Durchmesser von etwa 100nm bis etwa 150μm ist.
Mikropartikel nach Anspruch 39, wobei das Mikropartikel ein Partikel mit einem Durchmesser von etwa 200nm bis etwa 30μm ist.
Mikropartikel nach Anspruch 40, wobei das Mikropartikel ein Partikel mit einem Durchmesser von etwa 500nm bis etwa 10μm ist.
Mikropartikelzusammensetzung, umfassend ein Mikropartikel nach einem der Ansprüche 18 bis 41 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Mikropartikelzusammensetzung, umfassend ein Mikropartikel nach einem der Ansprüche 22 bis 41 oder eine Mikropartikelzusammensetzung nach Anspruch 40, darüber hinaus umfassend ein Adjuvans.
Mikropartikel nach den Ansprüchen 22 bis 41 oder Mikropartikelzusammensetzung nach Anspruch 43, wobei das Adjuvans ein Mitglied ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CpG-Oligonucleotiden, LTK63, LTR72, MPL und einem Aluminiumsalz.
Mikropartikel oder Mikropartikelzusammensetzung nach Anspruch 44, wobei das Adjuvans ein Aluminiumsalz ist.
Mikropartikelzusammensetzung nach Anspruch 45, wobei das Aluminiumsalz Aluminiumphosphat ist.
Mikropartikelzusammensetzung umfassend zwei oder mehrere verschiedene Mikropartikel, welche jeweils unterschiedliche Makromoleküle adsorbiert haben.
Mikropartikelzusammensetzung nach einem der Ansprüche 42 bis 47 zur Verwendung in einer Therapie.
Mikropartikelzusammensetzung nach einem der Ansprüche 42 bis 47 zur Verwendung für die Diagnose einer Krankheit.
Mikropartikelzusammensetzung nach einem der Ansprüche 42 bis 47 zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit.
Mikropartikelzusammensetzung nach einem der Ansprüche 42 bis 47 zur Verwendung als Impfstoff.
Mikropartikelzusammensetzung nach einem der Ansprüche 42 bis 47 zur Verwendung für das Auslösen einer Immunantwort.