JP2006502228A - Hivワクチン処方物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、広く免疫原性のHIV組成物、特にHIVワクチンならびにこれらワクチンの処方および投与の方法に関する。
後天性免疫不全症候群(AIDS)は、現代の医学が直面している最も大きな健康の脅威の1つとして認識される。現在もなお、この疾患についての療法は存在しない。
1つの側面において、本発明は少なくとも1つのHIV Gagコード配列またはEnvコード配列を含む核酸発現ベクター(例えば、プラスミド、ウィルス性ベクターなど)およびPLGを含むHIV DNAワクチン組成物を包含する。好ましくは、この核酸発現ベクターが、PLGに吸収される。特定の実施形態において、PLGの濃度は、核酸発現ベクターの濃度より約5倍と100倍の間で高い。例えば、核酸の濃度は、約10μg/mLと5mg/mLの間であり得、そしてPLGの濃度は約100μg/mLと100mg/mLの間であり得、そして/あるいは1用量あたりの核酸発現ベクターの濃度は約1μg/用量と5mg/用量の間であり得、そして1用量あたりのPLGの濃度は、約10μg/用量と100mg/用量の間であり得る。特定の処方物は、本明細書中に、例えば表1、表2、または表9のカラム2において記載される。
本発明の実施は、他に特に示されない限りは、当業者の範囲内である、化学的、生化学的、分子生物学的、免疫学的、および薬理学的な従来の方法を使用する。このような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、18版(Easton、Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990);Methods In Enzymology(S.ColowickおよびN.Kaplan編、Academic Press,Inc.);およびHandbook of Experimental Immunology,第I〜IV巻(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編、1986、Blackwell、Scientific Publications);Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、1989);Short Protocols in Molecular Biology、第4版(Ausubelら編、1999、John Wiley and Sons);Molecular Biology Techniques:An Intensive Laboratory Course(Reamら編、1998、Academic Press);PCR(Introduction to Biotechniques Series)、第2版(NewtonおよびGraham編、1997、Springer Verlag);PetersおよびDalrymple、Fields Virology(第2版)、Fieldsら(編)、B.N.Raven Press、New York、NYを参照のこと。
μg マイクログラム
AIDS 後天性免疫不全症候群
APC 抗原呈示細胞
CCR5 ケモカインレセプター5
CD4+ CD4レセプター
CD8+ CD8レセプター
CDC 疾病管理センター
CHO cells チャイニーズハムスター卵巣細胞
CMV サイトメガロウィルス
ConA コンカナバリンA
CRF 事例様式
CRF’s 循環組換え様式
CTAB セチルトリメチルアンモニウムブロミド
CTL 細胞障害性Tリンパ球
Cv クロミウム(cromium)
DEAE ジエチルアミノエチル
DNA デオキシリボ核酸
DTH 遅延型過敏症
ELISA 酵素結合免疫吸着測定法
ELISPOT 酵素結合免疫スポット測定法
ENV エンベロープ
FIGE 領域反転ゲル電気泳動
GAG 群特異的抗原
GLP 良好な実験実践
gp 糖タンパク質
HAART 高活性抗レトロウィルス治療
HAP ハイドロジアパティック(hydroziapatic)
HBsAg B型肝炎皮相抗原
HCV C型肝炎ウィルス
HIV/HIV−1 ヒト免疫不全ウィルス/1型
hr 時間
HSV 単純疱疹ウイルス
IFN インターフェロン
IFNγ インターフェロンγ
IM 筋内
IND 研究新薬
IV 静脈内
Kb キロベース
kD キロダルトン
Kg キログラム
mg ミリグラム
mL ミリリットル
MF59 水中油型乳剤アジュバント
NaCl 塩化ナトリウム
NIAID 国立アレルギーおよび感染症研究所
NIH 国立衛生研究所
o−またはO− オリゴマー
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PEG ポリエチレングリコール
PLG カチオンポリラクチド−コ−グリコリド
pSIN シンドビスウィルスベクター
PVA ポリ(ビニルアルコール)
REV ウィルス性タンパク質−ウィルス性発現の制御に関する
SAE 重篤な有害事象
SHIV シミアンヒト免疫不全ウィルス
SP resin 改変ポリエステル−カーボネート樹脂
(全体的な概観)
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、もちろん、特定の処方物もプロセスのパラメーターも変動し得るので、特定の処方物にもプロセスのパラメーターにも限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のためでしかなく、限定されることは意図されないこともまた理解されるべきである。
好ましい実施形態において、本明細書に記載されるHIVワクチンは、6〜9ヶ月またはさらに長い期間において(例えば、筋内投与)が意図される複数回(例えば、3以上)投与の成分を含む。この成分は同時にまたは異なる時点で与えられ得る。例えば、2つの核酸「初回刺激」免疫が与えられ得、ここで各初回刺激免疫が、Gagタンパク質(例えば、HIV−1 SF2由来のp55 Gag)および/またはEnvタンパク質(例えば、HIV−1 SF162由来の、オリゴマーで、V2が欠失しているgp140エンベロープタンパク質)をコードするDNAの2つの別個の調製物を含み、両方の調製物がPLG微粒子上に処方される。これらの核酸は、1μgと10mgの間のDNAおよび10μgと100mgの間のPLG(例えば、1mgのDNAおよび25mgのPLG微粒子)を含む単位用量バイアルにおいて、代表的に別個に提供される。このDNA含有用量は、代表的に凍結乾燥された形態において保存され、そしてバイアルは一般に使用時に元に戻される。各単位用量バイアルは、典型的には、実際に患者に投与されるより多いDNA(またはタンパク質)を含むことに注意するべきである。最終的な投薬量は、代表的に、Gag DNAおよびEnv DNAそれぞれ0.5mL中1mgからなる。このワクチンのDNA成分は、初回刺激抗体、HIV抗原(例えば、GagおよびEnv)に応答するCD4T細胞およびCD8T細胞が意図される。
特定の実施形態において、複数回投与(例えば、初回刺激−追加刺激型投与)は有利に行われ得る。例えば、1つ以上の目的のHIV抗原を発現する核酸構築物が投与される。次いで、例えば、ポリペプチド抗原および適切なアジュバントを含む組成物において、同一のおよび/または異なるHIV抗原が投与される。あるいは、抗原はDNAより前に投与される。複数回ポリペプチド投与および複数回核酸投与(任意のオーダーで)がまた、行われ得る。
ポリヌクレオチド配列(例えば、核酸発現構築物における使用のための)は、例えば、その遺伝子を発現する細胞からcDNAライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすること、またはその遺伝子を含むことが公知のベクターからその遺伝子を取得することによって、組換え技術を用いて、得られ得る。さらに、所望の遺伝子は、その遺伝子を含む細胞および組織から、標準的な技術、例えば、フェノール抽出およびcDNAまたはゲノムDNAのPCRを用いて、直接単離され得る。DNAを取得および単離するために用いられる技術の説明については、例えば、Sambrookら上記参照。目的とする遺伝子は、クローン化されるよりもむしろ、化学合成によってもまた生産され得る。そのヌクレオチド配列は、所望される特定のアミノ酸配列について適切なコドンを用いて設計され得る。一般的に、そのアミノ酸配列が発現される意図される宿主にとって好ましいコドンが選択される。完全配列は、標準的な方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから完全なコード配列1へと組み立てられる。例えば、Edge,Nature(1981)292:756;Nambairら,Science(1984)223:1299;Jayら,J.Biol.Chem.(1984)259:6311;Stemmer,W.P.C.,(1995)Gene 164:49−53を参照のこと。
HIVがAIDSの病因物質であるという1983年から1984年における発見は、ワクチンの迅速な開発に希望をわかせた。40種類より多くのHIVのワクチンの候補が、すでにフェーズIおよびフェーズIIの臨床試験で試験されており、最初のフェーズII試験は、米国およびタイで現在進行中である。Esparza,J.(2001)Bull World Health Organ.79(12):1133−7。しかし、そのワクチンの開発の主な障害は、HIVおよびAIDSに対する防御の免疫学的相関に関する科学的証拠が欠如していることであった。Clericiら(1996)、Immunol Lett 51(1−2):69−73。HIVに感染したほとんどの個体は、広汎な免疫学的応答を上記ウイルスに対して発生するけれども、これらの応答は、上記感染も除去し得ないし、疾患の進行も防止し得ない。この問題は、HIV株は世界の様々な地域で著しく変わるという事実により、さらに複雑となる。HIVは、特にウイルスエンベロープタンパク質をコードしている遺伝子において、広範囲にわたる遺伝子配列不均一性を示す。種々のサブタイプのウイルスは、それら自体の間で結合し得、付加的循環組換え形態(CRF)を産生する。McCutchanら(1996)、J.Virol.70(6):3331−3338。
上記に言及されている通り、上記組成物は、好ましくは「初回刺激−追加刺激」アプローチを使用して投与される。例えば、2回の初回刺激注射物(例えば、各々が、HIV−1のSF2由来のp55 GagをコードするDNA調製物およびHIV−1のSF162由来の、V2ループを欠損したオリゴマーgp140エンベロープタンパク質をコードするDNAの調製物という2種の別個の調製物を含み、その両方が、PLG微粒子(Env PLG/DNAまたはGag PLG/DNA)上に処方されている)が投与される。追加刺激組成物は、タンパク質を含み、例えば抗原は、MF59アジュバントと組み合わせた、組換えオリゴマーの、V2ループの欠失したgp140エンベロープタンパク質(HIV o−gp140)から構成されている。そのタンパク質は、代表的には、注射の直前に上記アジュバントと混合される。
o−gp140抗原は、バイアル1本当たり0.35mL中に140μgを含む、3mLのI型ガラスバイアルに入った液体として供給される。MF59アジュバントは、バイアル1本当たり0.7mLを含む3mLのI型ガラスバイアルに入れて供給される。一般的に、実際に被験体に投与されるDNAおよびタンパク質の用量は、そのバイアルに含まれる用量未満である。例えば、そのバイアルが1.4mgを含む場合、約1.0mgのDNAが、代表的に被験体に投与される。同様に、各々の単位容量バイアルが、140μgのタンパク質を含む場合、約100μgのタンパク質が、代表的に被験体に投与される。
(実施例1:ワクチン製造プロセスおよび放出)
(A.PLG/DNA HIVワクチン)
核酸を用いたPLG/DNA初回刺激免疫化に関して、プラスミドDNA(EnvまたはGag)を、本質的には以下の通りに生分解性ポリマー微粒子(PLG)上に吸着させた。そのDNAワクチンを製造するために、大腸菌(DH5株)を、上記HIV Env遺伝子およびGag遺伝子をコードするプラスミドを用いて形質転換した。改変型アルカリ溶解方法を使用して、プラスミドDNAを、染色体DNA、タンパク質および他の細胞断片から単離した。プラスミドDNAを、PEG8000を用いた沈殿により濃縮した。その後、上記プラスミドは、二回のクロマトグラフィー工程により精製し、限外濾過により処方物緩衝液中に移した。
上記組換えオリゴマー性HIV gp−140(o−gp140)を、本質的にはSrivastavaら(2003)、J Virol.77(20):11244−11259に記載のように調製した。宿主細胞の発酵に続き、細胞培養液の上清を得、濾過し、濃縮し、そして精製した。
MF59アジュバント(MF59C.1)は、スクアレン内部油相およびクエン酸塩緩衝液外部水相を持つ、水中油滴型エマルジョンである。例えば、米国特許第6,299,884号および6,086,901号;Ottら,「MF59−−Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines」Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(Powell,M.F.and Newman,M.J.eds.)Plenum Press,New York,pp.277−296(1995)。二つの非イオン性界面活性剤、トリオレイン酸ソルビタンおよびポリソルベート80は、上記エマルジョンを安定化させるのに役立つ。上記MF59アジュバンドの安定性は、動物およびヒトにおいて、多くの抗体と組み合わせて示されている。例えば、Higginsら,「MF59 Adjuvant Enhances the Immunogenecity of Influenza Vaccine in Both Young and Old Mice」Vaccine 14(6):478−484(1996)を参照のこと。
上記PLG/DNA初回刺激ワクチン、o−gp140追加刺激抗原、およびMF59アジュバンドの要素を、以下の表において規定する。
*免疫応答を維持する必要がある場合
(実施例3:取り扱いおよび保存)
投与用に上記DNA/PLGワクチンを調製するため、一本のバイアルの各々のDNA/PLG(EnvまたはGag)を、0.7mLの注射用水を注射器に引き出すことおよびそれをその二本のバイアルに添加することにより、再構成する。そのバイアルを、二分間まで激しく攪拌する。上記懸濁物が均一であり、乳白色であり、十分に分散した場合、その混合物は完成している。その再構成された溶液を、最大のDNA/PLG用量(1000μg)を送達するために、更なる調製なしに投与する。500μg用量および250μg用量を調製するために、新しい注射器を使って0.7mLまたは2.1mLのさらなる0.9%のNaCl溶液(生理食塩水)それぞれを、準備され、再構成されたすべてのバイアルに加え、かき混ぜて混合する。新しい注射器を用いて、0.5mLの上記Env PLG/DNA混合物を、その後0.5mLの上記Gag DNA/PLG混合物を同一の注射器に引き出す。その後、合わせた容積1mL中の、全DNA用量を、三角筋に筋肉内注射(IM)し得る。
前記凍結乾燥したDNA/PLGワクチンを、2℃〜8℃にて保存する。HIV o−gp140を、−60℃未満で凍結して保存し、そして上記MF59アジュバントを、冷蔵庫中に2℃〜8℃にて保存する。MF59は、凍結するべきではない。
非臨床安全評価計画を、上記HIV DNAワクチン処方物の3筋肉内(IM)用量、次いで上記HIVタンパク質ワクチン処方物の3IM用量の臨床投与を援助するために設計した。上記DNAワクチン処方物の1臨床用量(1.0mL)は、1mgのEnv−DNA、1mgのGag−DNAおよび50mgのPLGを含み、一方、上記HIVタンパク質ワクチンの1臨床用量(0.5mL)は、0.1mg/0.25mLのEnvタンパク質および0.25mLのMF59を含む。
ニュージーランドシロウサギに対する単回IM注射によって上記HIV DNA−PLGワクチン処方物(Env−DNA PLGおよびGag−DNA PLG)の宿主ゲノムDNAへの組込みを評価するため、以下の研究を行った。その研究は、3群から成り立っており、その1群あたり雌雄二匹ずつのウサギを含んでいた。0日目に、処理したウサギの各々の後脚に上記Env−DNA PLGまたは上記Gag−DNA PLGのどちらか一方の単回IM注射(0.5mL/脚)をした(表6参照)。コントロールのウサギには、いかなる注射もしなかった。全ての動物を、29日目に剖検した。
(表6 実験的研究設計)
b動物一匹あたり総容積1mLを与えるために、群2および群3の動物に、脚一本あたり容積0.5mLの量を与えた。
c剖検を、投与30日後(29日目)に行った。
qフィールド逆転ゲル電気泳動(ゲノムDNAのみ)により精製したゲノムDNA中の上記標的配列の定量
LLD=上記アッセイの低い方の検出限界(5コピー数/μg DNA)よりも低い。
BALB/cマウスに対する筋肉内(IM)注射による単回投与後の、上記HIV DNA PLGワクチン処方物(Env−DNA PLGおよびGag−DNA PLG)の組織局在および持続性を評価するため、以下の研究を行った。その研究は、1群あたり雄雌15匹ずつの動物からなる群を5つ含んでいた。1日目に、処理したマウスの右大腿二頭筋領域に、高用量のEnv−DNA PLGもしくはGag−DNA PLG、または低用量のEnv−DNA PLGもしくはGag−DNA PLGのいずれかを単回筋肉内(IM)注射した。コントロールのマウスには、いかなる注射もしなかった。一群あたり雄雌5匹ずつの動物を、投与1週間後(8日目)、投与2ヶ月後(61日目)または投与3ヶ月後(91日目)に剖検した。(表9)。
上記HIVワクチン処方物の、反復投与後のニュージーランドシロウサギにおける局所的毒性および全身的毒性を評価するため、ならびに知見の可逆性を決定するため、以下の研究を行った。一群あたり雌雄8匹ずつの動物の群を二つ用いた。処理したウサギに、隔週与える上記HIV DNAワクチン処方物(Env−DNA PLGおよびGag−DNA PLG)を4回投与した。その後、上記処理したウサギに、同様に隔週与える上記HIVタンパク質ワクチン処方物を4回投与した。最後のHIV DNAワクチン用量および最初のHIVタンパク質ワクチン用量を、同じ日(43日目)に投与した。用量は、筋肉内(IM)注射により大腿四頭筋に投与し、両足に注射した43日目を除いて、脚を交互に選んだ。コントロール動物に、生理食塩水溶液の筋肉内(IM)注射を4回し、その後、MF59の筋肉内(IM)注射を4回した。一群あたり雄雌4匹ずつを、投与の3日後(88日目、主要剖検)または投与の2週間後(99日目、回復剖検)に剖検した。表11は、実験的研究設計を示す。
c0.25mLのMF59+0.25mLの生理食塩水からなる。
c0.5mLのEnv−DNA PLG(2mg/mLのDNA,50mg/mLのPLG)+0.5mLのGag−DNA PLG(2mg/mLのDNA,50mg/mLのPLG)からなる。
d0.25mLのEnvタンパク質(0.4mg/mL)+0.25mLのMF59からなる。
e一群あたり雄雌4匹ずつの動物。
単回筋肉内(IM)注射により投与した場合の、種々の濃度のDNA/PLGの潜在的局部刺激効果を、雄のニュージーランドシロウサギにおいて評価するため、以下の研究を2群の雄のウサギ9匹をそれぞれ用いて行った。1日目に、各々のウサギに、上記試験物およびコントロール物質の0.5mLの筋肉内(IM)注射を与えた。1群あたり3羽のウサギを投与の1日後(2日目)、投与の1週間後(8日目)、または投与の2週間後(15日目)に剖検した。実験設計を、表15に示す。
DF=開発処方物
RF=研究処方物
死亡は一つもなく、また体重に対するいかなる処理関連の影響もなかった。注射部位の明確な挫傷を、1日目から4日目の間に、群1のウサギ9匹中4匹および群2のウサギ9匹中5匹においてそれぞれ散発的に観察した。損傷は、注射部位番号2を除くすべての注射部位において注目された。注射部位におけるわずかの損傷のこの所見は、筋肉内(IM)注射に一致している。注射部位における皮膚のDraize評点付けの結果を、表16に提示する。13日目から15日目にかけて、群1の2羽のウサギ(IM部位3および4)に、そして13日目から14日目にかけて群2の1羽のウサギ(IM部位4)に、非常にわずかな浮腫があるのが注目された。剖検肉眼的所見を、注射部位に限定した。剖検肉眼所見は、赤く堅い領域、黄褐色領域、筋肉を覆う筋膜での出血、皮下出血領域からなった。これらの所見は、2日目の方がより有勢であった。注射部位の組織病理学的検査は、生理食塩水処理部位において針外傷に対する特徴的応答(筋線維変性および出血)を示した。試験物質処理部位の評価は、2日目に、全ての処方物に関して同様の、最小限の処理関連の炎症〜軽度の処理関連の炎症を示した。8日目に、肉芽腫性変化は、顕著な所見であり、処方物の間に違いはなかった。これらの肉芽腫性変化は、PLG微粒子に対する公知の応答および/または再生プロセスと一致している。15日目までに、上記組織病理的変化は、部分的[1%DNA+100mgPLG(開発(development)処方物および研究(research)処方物),2%DNA+50mgPLG,4%DNA+25mgPLG]にまたは完全[100mg PLG/PVA]に消散した。また、表16を参照のこと。
Gag−DNA PLG処方物の筋肉内(IM)注射部位での免疫原性および持続性を評価するため、1群あたり10匹の雌BALB/cマウスを、表17で概説するように処理した。0日目および28日目に動物に投与し、筋肉内(IM)注射部位を最終投与後4週目および8週目に取得した。本研究で試験した上記処方物は、上記毒性研究で用いた処方物と類似していた。
b投与の4週間後
c投与の8週間後
注射部位の上記PCR分析の結果を、表18に提示する。結果は、上記DNA−PLG処方物は、持続性という点で上記裸のDNAのコントロールに匹敵するということを示した。上記Gag−DNAは、最終投与後の4週間および8週間で、注射部位でまだ検出可能であるが、その残存する量は、不十分(上記注射されたDNAの約10−7%)であるということを示した。
これらの研究の条件下で、上記HIVワクチン処方物の単回投与および/または複数回投与は、動物モデル(ニュージーランドシロウサギおよびBALB/cマウス)において十分に寛容され、そしてさらに、上記処方物は、強力な免疫応答を惹起した。上記複数回用量ウサギ研究では、上記HIVワクチン処方物は、臨床的知見、体重、体温、食物消費、ならびに臨床病理学(血液学、凝固および臨床化学)に対して、処理関連の副作用を全く生じなかった。注射部位の皮膚評点付けは、非常にわずか〜わずかの紅斑または浮腫が時折生じる事例を示した。そしてその事例は、可逆的であるようだった。上記注射部位でのこれらの所見は、単回用量局所寛容ウサギ研究において観察される所見と一致している。後者において、組織病理学的評価は、上記注射部位において、処理に関連する最小限〜軽度の炎症を示し、上記回復期間の終期までに部分的にまたは完全に消散した。さらなる研究では、上記注射部位のPCR分析は、上記Env−DNA PLGは上記宿主ゲノムDNAに組み込まないということ、および上記Gag−DNA PLGは4週間後にも8週間後にも上記注射部位で持続しないということを示した。
以下の研究を実行し、免疫原性に対するPLG媒介性送達の効果を決定した。
本明細書に記載されるHIVワクチンを、赤毛ザルマカクにおいて次のように評価した。プラスミドpCMVKm2.GagMod.SF2およびプラスミドpCMVKm2.o−gp140.SF162を、本質的には米国特許第6,602,705号に記載のように調製した。gag挿入部分およびenv挿入部分をpCMVKm2構築物から切除し、pSINCP(pSIN1.5の改変版であって、本質的にはHariharanら(1998)、J Virol 72(2):950−8に記載されている)に連結することにより、シンドビス構築物を調製した。
アカゲザル免疫化研究を行って、組換えタンパク質を用いた初回刺激−追加刺激レジメンにおける、2つのDNAワクチンベクターおよびカチオン性PLG微粒子DNA送達系を評価した。5匹のアカゲザルマカクの群を、筋肉内注射により免疫化した。PLG微粒子に吸着しているか吸着していない、HIV SF2 Gag(0.5mg)およびHIV SF162 gp140 Env(1.0mg)をコードするDNAワクチンで、0週目、4週目、14週目に注射した。上記動物を、29週目に、アニオン性PLG微粒子上に吸着した酵母由来のp55 Gagタンパク質(Gag/PLG)で追加刺激した。最後に、上記動物を、38週目および75週目に、水中油MF59アジュバントと共に投与した、CHO細胞由来のV2領域欠失オリゴマーgp140Envタンパク質(Env/MF59)を用いて追加刺激した。
Envタンパク質およびGagタンパク質に対する抗体応答を、酵素結合免疫反応吸着測定法(ELISA)により測定した。両方のELISAに関し、Nunc Maxisorpプレートを、PBS(pH7.0)中5μg/mlのEnvタンパク質50μlまたはPBS(pH7.0)中5μg/mlのGagタンパク質50μlで、一晩4℃で被覆した。上記被覆ウェルを、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中の5%ヤギ血清(Gibco BRL,Grand Island,NY)150μlで、37℃にて1時間ブロッキングした。血清のサンプルをまず、ブロッキング緩衝液中に1:25または1:100で希釈し、次いで3倍ずつの段階希釈を行った。結合抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗サルIgG(Southern Biotechnology Associates,Inc,ブロッキング緩衝液で1:5000に希釈した)を用いて検出し、37℃で1時間インキュベートした。発色のため、3,3’,5,5’テトラメチルベンズジジン(TMB)を、製造者の指示に従って15分間インキュベートし、そしてその反応を、2NのHClを加えることにより停止させた。その後、上記アッセイプレートを、ELISAプレートリーダーで、450nmの吸収波長にて読み取った。血清標準を、各々のマイクロタイタープレート上に含んだ。上記標準の参照値を、上記サンプルELISA力価の正規化のために用いた。上記力価は、上記血清希釈の逆数を表し、光学密度0.5を与える。ウイルス中和抗体を、標準的技術を用いて、同族のHIV−1 SF162ウイルスに対して評価した。
アカゲザルの末梢血単核細胞(PBMC)を、フィコール−ハイパーク勾配にヘパリン化した全血から分離した。アカゲザルBリンパ芽球様細胞株を誘導するために、PMBCを、0.5μg/mLのシクロスポリンA(Sigma)の存在下で、上記594S細胞株からヘルペスウイルスのパピオ含有培養上清に曝露した。アカゲザルPBMCを、24ウェルプレート中の、10%の熱非働体化ウシ胎仔血清(AR10)を補充したAIM−V:RPMI1640(50:50)培養培地(Gibco)1.5ml中で、1ウェル当たり2×106〜3×106個の細胞にて8日間、培養した。抗原特異的細胞を、gagペプチドまたはenvペプチド(10.7μg/mlの総ペプチド)のいずれかのプールの添加により刺激した。組換えヒトIL−7(15ng/ml,R&D Systems,Minneapolis,MN)を、培養の開始時に添加した。ヒトrIL−2(Proleukin,20 IU/ml,Chiron)を、1日目、3日目および6日目に添加した。
自己のB−LCLを、gag(rVV gag−polSF2)またはenv(rVV gp160 envSF162)を発現する組換えワクシニアウイルス(rVV)を用いて感染させ、その後、一晩Na2[51Cr]O4(NEN,Boston,MA;2.5×105のB−LCLあたり10μCi)で標識し、そして洗浄した。組換えVV(組換えワクチニアウイルス)に感染した51Cr標識B−LCL(1丸底ウェル当たり2500個)を、培養PBMCの3回の段階希釈を含む複製ウェルに添加した。非標識B−LCL(1ウェル当たり1×105個)を、非特異的細胞溶解を防止するために添加した。4時間後、50μlの培養の上清を取得し、Lumaplate(Packard,Meriden,CT)に添加し、Wallac Microbeta TriLux液体シンチレーションカウンター(Perkin Elmer Life Sciences,Boston,MA)を用いて計測した。溶解した標的から放出された51Crを、以下の式:
(特異的51Cr放出パーセント)=100%×(平均実験放出−自然発生放出)/(最大放出−自然発生放出)
で正規化した。ここで、
自然発生放出=PBMCの不在下で標的細胞から放出された毎分平均カウント(cpm)であり、そして
最大放出=0.1% Triton X−100の存在下で標的細胞から放出された平均cpm
である。PBMCの二回の段階希釈(consecutive dilution)の際、正味の特異的溶解(抗原特異的溶解−非特異的溶解)が10%以上の場合、応答を陽性として評点付けた。
p55 Gagタンパク質(3μg/ml)またはEnvペプチド(16μg/ml)のプールの不在下または存在下で、2×105個のPBMCを、平底マイクロタイターウェル中で、0.2mlの容積のAR10中でインキュベートした。 6つのレプリカ培養を確率した。4日間のインキュベーションの後、[3H]−チミジン([3H]TdR,Amersham,Piscataway,NJ)を加えた(1μCi/ウェル)。一晩のインキュベーションに続き、培養物をガラス微小繊維フィルタ上に得た。Microbeta TriLux液体シンチレーションカウンター(Perkin Elmer)を用いて、細胞の[3H]TdR取り込みを測定した。
抗原gagペプチドプール30μg/mlまたはenvペプチドプール30μg/ml)の不在下または存在下で、アカゲザルPBMCを37℃にて1晩培養した。抗CD28(1μg/ml,Pharmingen,San Diego,CA)を同時刺激の供給源として添加し、ブレフェルジンA(1:1000、Pharmingen)を、サイトカインの分泌を防止するために加えた。1晩のインキュベーションの後、PBMCを、細胞表面のCD4(抗CD4アロフィコシアニン結合体、クローンSK3、Becton Dickinson,San Jose,CA)およびCD8(抗CD8α PerCP結合体、クローンSK1、Beckton Dickinson)について染色し、Cytofix/Cytoperm(Pharmingen)を用いて透過性処理し、そしてその後、細胞内IFN−γ(モノクローナル抗体4S.B3、フィコエリトリン結合体、Pharmingen)、および細胞内TNF−α(MAb11、FITC結合体、Pharmingen)について染色した。染色した細胞を、FACSCaliburTMフローサイトメトリー(Becton Dickson)を用いて分析した。
PLGを伴わないDNAベクターの免疫原性を評価した。抗Gag抗体について、最初の免疫原性レジメンとして生理食塩水中にて加えた場合、(pCMVもpSINCPも)いずれのベクターも有効ではなかった。しかし、Gag/PLGタンパク質抗原を用いて、裸のgag DNAで初回刺激した動物の追加刺激は、著しい抗体応答を迅速に惹起した。同様に、Env/MF59タンパク質は、抗Env抗体の量を迅速にブーストした。いかなる時にも、pCMVまたはpSINCPにより誘導される抗体の力価に有意差はなかった。
動物をまた、DNA/PLG組成物を用いて上記のように免疫化し、PLG微粒子に吸着したDNAワクチンの免疫原性を評価した。上記HIV DNAワクチンのカチオン性PLG微粒子上への吸着は、(特に抗体応答に関する)免疫応答を増強するのに有効であった。PLG送達は、pCMVまたはpSINCPのいずれかを受けるマカクにおける抗体力価を、有意に増加した。DNA初回刺激フェーズの間ずっと、PLG群の抗gag力価は、測定した全ての時点において、裸のDNAに比べて有意に高く(p=0.0003〜0.04)、力価のピーク値は約1000倍高かった(図1)。タンパク質追加刺激の後、これらの差は維持され、pCMV/PLGおよびpSINCP/PLGは、裸のDNAと比較して、約10倍〜25倍高かった(p=0.02〜0.04)。抗Env抗体の応答はまた、上記PLG群において有意に高かったが、DNA初回刺激後(第2のDNAの投与の2週から6週後)のピークの応答においてのみであった(P=0.003〜0.015)。タンパク質追加刺激の後およびタンパク質追加刺激の間、上記抗env力価は、全ての群において類似していた。上記PLG/DNAワクチン群については、抗体応答のピークを、2回目のDNA免疫化の後に取得したが、一方、裸のDNAによる応答のピークには、3回の免疫化が必要だった。
上記動物を、29週目にアニオン性PLG微粒子に吸着した組換えGagタンパク質を用い、その後38週目および75週目にMF59アジュバント中の組換えEnvを用いて、追加刺激した(それぞれ最終DNA免疫化の15週間後、24週間後、51週間後)。抗体の力価が全ての群において増加した(図1、図2)。gagタンパク質を用いて追加刺激した後、PLG/CTAB−DNAで初回刺激された動物における上記抗gag抗体の力価は、裸のDNAで初回刺激された動物より約10倍高かった。上記抗gag力価は、DNA初回刺激により達成されるピークの力価に等しい(DNA/PLG)か、またはDNA初回刺激により達成されるピークの力価を超えていた(DNA/生理食塩水)。Envに関しては、DNA初回刺激の後、全ての群の力価が、ピークの力価を超えて著しく増加された(p=0.0002〜0.02)(図2)。第2のEnvタンパク質追加刺激は、抗体の力価を、第1のEnvタンパク質追加刺激の後に見られるレベルにまで回復した。DNAワクチン初回刺激の後、ウイルス中和抗体応答は、どの動物においても検出されなかった。しかし、1回および2回のタンパク質追加刺激免疫化の後、増加する力価が観察され、全幾何平均力価(それぞれ8または64)(p=0.00071)であった。(図3)。これらの時点の両方において、上記力価は、種々のワクチン群の間で統計的に異なっていた。
上記HIVワクチン試験(および他の成果)からのデータに基づけば、偽薬コントロールにおける深刻で有害な経験の割合は、約3.5%であった。他の組換え糖タンパク質抗原をMF59と一緒に使用した広範な安全性データは、そのようなワクチン抗原は、MF59と一緒に投与された場合、非常に安全で一般的に十分に寛容されるということを示す。さらに、これらのワクチンは、特定の抗原に対して、強力な抗体応答を惹起した。DNA/PLGで初回刺激されたマカクを、組換えタンパク質で追加刺激する有効性(Envタンパク質追加刺激の後、T細胞からのTh−1型サイトカインの強力な産生を含む)は、また証明された。
Claims (27)
- HIV DNAワクチン組成物であって、
少なくとも1つのHIV Gagコード配列またはEnvコード配列を含む核酸発現ベクター;および
PLG
を含む、HIV DNAワクチン組成物。 - 前記PLGの濃度が、前記核酸発現ベクターの濃度より約5と100倍の間で高い、請求項1に記載のワクチン組成物。
- 請求項2に記載のワクチン組成物であって、ここで、前記核酸の濃度が約10μg/mLと5mg/mLの間であり、そして前記PLGの濃度が約100μg/mLと100mg/mLの間である、ワクチン組成物。
- 請求項1に記載のワクチン組成物であって、ここで、1用量あたりの前記核酸の濃度が約1μg/用量と5mg/用量の間であり、かつ1用量あたりの前記PLGの濃度が、約10μg/用量と100mg/用量の間である、ワクチン組成物。
- 表1または表2において記載される、請求項1〜4のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
- 表9のカラム2において記載される、請求項1〜4のいずれか1項に記載のワクチン組成物。
- HIVワクチン組成物であって、
オリゴマーgp140(o−gp140);および
薬学的に受容可能な賦形剤
を含む、HIVワクチン組成物。 - 前記o−gp140の濃度が、約0.1mg/mLと10mg/mLの間である、請求項7に記載のHIVワクチン。
- 1用量あたりの前記o−gp140の濃度が、約100μg/用量である、請求項7に記載のHIVワクチン。
- 表3または表11において記載される、請求項7に記載のHIVワクチン。
- さらにアジュバントを含む、請求項7に記載のHIVワクチン。
- 前記アジュバントが、MF59またはCpGである、請求項11に記載のHIVワクチン。
- 前記アジュバントがMF59であり、そして該MF59が表4に記載される、請求項12に記載のHIVワクチン。
- HIVワクチンであって、
請求項1〜6のいずれか1項に記載のHIV Env DNAワクチン;
請求項1〜6のいずれか1項に記載のHIV Gag DNAワクチン;および
請求項7〜13のいずれか1項に記載のHIVワクチン
を含む、HIVワクチン。 - 被験体において免疫応答を起こさせる方法であって、
(a)該被験体に、請求項1〜14のいずれか1項に記載の少なくとも1つのHIVワクチン組成物を投与する工程、
(b)工程(a)の投与の後に、請求項1〜14のいずれか1項に記載の少なくとも1つのHIVワクチン組成物を投与する工程、
を包含する、方法。 - 請求項15に記載の方法であって、ここで、
工程(a)が、請求項1〜6のいずれか1項に記載の少なくとも1つのワクチン組成物を投与する工程を包含し、かつ
工程(b)が、請求項7〜13のいずれか1項に記載の少なくとも1つのワクチン組成物を投与する工程を包含する、方法。 - 請求項16に記載の方法であって、ここで、
工程(a)が、請求項1〜6のいずれか1項に記載の少なくとも1つのワクチン組成物の複数回投与を包含し、かつ
工程(b)が、請求項7〜13のいずれか1項に記載の少なくとも1つのワクチン組成物の複数回投与を包含する、方法。 - 請求項17に記載の方法であって、ここで、
工程(a)が、1ヶ月間隔で2回または3回の投与を包含し;
工程(b)が、1、2または3ヶ月間隔で2回または3回の投与を包含し;かつ
工程(a)の投与と工程(b)の投与との間の時間が、1〜5ヶ月である、方法。 - 請求項15〜18のいずれかに1項に記載の方法であって、ここで工程(a)が、少なくとも1つのHIV Gagワクチンおよび少なくとも1つのHIV Envワクチンを投与する工程を包含する、方法。
- 請求項15または18に記載の方法であって、ここで、工程(b)が請求項1〜6のいずれか1項に記載の少なくとも1つのDNAワクチン、および請求項7〜13のいずれか1項に記載の少なくとも1つのHIVワクチンを同時投与する工程を包含する、方法。
- 請求項20に記載の方法であって、ここで、工程(a)が少なくとも1つのHIV Gagワクチンおよび少なくとも1つのHIV Envワクチンを投与する工程を包含する、方法。
- 請求項15〜21のいずれか1項に記載の方法であって、ここで、少なくとも1回の投与が、筋内または皮内である、方法。
- オリゴマーHIV Env gp140タンパク質を作製する方法であって、以下の工程:
gp140をコードする核酸を宿主細胞に導入する工程;
gp140が細胞において発現される条件下で宿主細胞を培養する工程;および
オリゴマーgp140(o−gp140)タンパク質を宿主細胞から単離する工程、
を包含する、方法。 - 前記o−gp140が、前記細胞から分泌され、そして該細胞上清から単離される、請求項23に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のHIV DNAワクチンを作製する方法であって、
核酸が無菌のPLG微粒子に結合して、DNA/PLG HIVワクチンを形成するように、1つ以上のHIVポリペプチドをコードする配列を含む核酸発現ベクターと、該PLG微粒子とを結合させる工程を包含する、方法。 - さらに前記DNA/PLG HIVワクチンを、凍結乾燥する工程を包含する、請求項25に記載の方法。
- 請求項7〜13のいずれか1項に記載のHIVワクチンを作製する方法であって、o−gp140とアジュバントとを結合させる工程を包含する、方法。
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