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Technisches Sachgebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft
im weiteren Sinn Impfstoffe. Im engeren Sinn betrifft die Erfindung die
Verwendung von Mikropartikeln mit adsorbiertem Antigen zur Stimulierung
von Immunantworten, sowie Verfahren zur Herstellung der Mikropartikel.
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Hintergrund
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Viele Arzneimittel enthalten Adjuvantien,
um ihre Aktivität,
ihre antigene Wirkungsstärke
zu steigern und um die Stabilität
der Rezeptur zu erhöhen.
In dieser Hinsicht enthalten Impfstoffe oft immunologische Adjuvantien,
um die zellvermittelte und die humorale Immunantwort zu verstärken. Zum
Beispiel werden oft Depotadjuvantien verwendet, die verabreichte
Antigene adsorbieren und/oder fällen,
und die dazu dienen, das Antigen an der Injektionsstelle zu halten.
Typische Depotadjuvantien sind unter anderen Aluminiumverbindungen
und Wasserin-Öl-Emulsionen.
Obwohl sie die Antigenwirkung steigern, verursachen Depotadjuvantien
jedoch oft heftige, anhaltende örtliche
Reaktionen, wie etwa Granulome, Abszesse, und Vernarbungen, wenn sie
subcutan oder intramuskulär
injiziert werden.
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Andere Adjuvantien, wie Lipopolysaccharide
und Muramyldipeptide können
nach einer Injektion pyrogene Antworten und/oder Reiter-Symptome
(influenzaartige Symptome, allgemeine Gelenkschmerzen und manchmal
Uveitis der vorderen Gliedmaßen,
Arthritis und Urethritis) hervorrufen.
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Trotz des Vorhandenseins solcher
Adjuvantien bieten konventionelle Impfstoffe oft keinen angemessenen
Schutz gegen den Ziel-Erreger. In diesem Zusammenhang verdichten
sich die Hinweise darauf, daß eine
Impfung gegen intrazelluläre
Krankheitserreger, wie eine An zahl Viren, sowohl gegen den zellulären als auch
gegen den humoralen Zweig des Immunsystems gerichtet sein sollte.
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Insbesondere die cytotoxischen T-Lymphocyten
(CTLs) spielen eine wichtige Rolle bei der zellvermittelten Immunabwehr
gegen intrazelluläre
Krankheitserreger, wie Viren und tumorspezifische Antigene, die
von bösartigen
Zellen produziert werden. Die CTLs bewirken die Cytotoxizität von vireninfizierten
Zellen, indem sie virale Determinanten in Verbindung mit MHC-Molekülen der
Klasse I, die die infizierten Zellen aufweisen, erkennen. Die cytoplasmatische
Proteinexpression ist eine Vorbedingung für die Verarbeitung der MHCs
der Klasse I und die Lieferung antigener Peptide an CTLs. Jedoch
erzeugt eine Immunsierung mit abgetöteten oder abgeschwächten Viren
oft nicht die CTLs, die zur Eindämmung
der intrazellulären
Infektion nötig
wären. Weiterhin
sind konventionelle Impfverfahren gegen Viren, die eine bedeutende
genetische Heterogenität und/oder
schnelle Mutationsraten aufweisen, die die Selektion von Varianten,
die sich dem Immunsystem entziehen, wie HIV oder Influenza, erleichtern,
problematisch. Dementsprechend wurden alternative Impfverfahren
entwickelt.
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Zur Auslösung angemessener Immunantworten
wurden partikutäre
Träger
mit adsorbierten oder eingeschlossenen Antigenen verwendet. WO 94/15635
beschreibt die Verwendung von partikulären Trägern zur Induzierung von CTL-Antworten,
wobei die Antigene kovalent oder nichtkovalent an Partikel wie Eisenoxid,
Silica und Polystyrol gebunden sind. Partikuläre Träger liefern dem Immunsystem
mehrere Kopien eines ausgewählten
Antigens und fördern
den Einschluß und
das Zurückbehalten
von Antigenen in örtlichen
Lymphknoten. Die Partikel können
durch Makrophagen phagocytiert werden und können die Antigenüberbringung
durch Cytokinabgabe erhöhen.
Beispiele für
partikutäre
Träger
sind unter anderen jene, die aus Polymethylmethacrylat-Polymeren
abgeleitet sind, ebenso jene Mikropartikel, die aus den als PLG
bekannten Poly(Lactiden) und Poly(Lactid-co-Glykoliden) abgeleitet
sind. Polymethylmethacrylat-Polymere sind nicht abbaubar, während PLG-Partikel
durch zufällige
nichtenzymatische Hydrolyse von Esterbindungen biologisch in Milchsäuren und
Glykolsäuren
abgebaut werden, die über
die normalen Stoffwechselwege ausgeschieden werden.
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Neuere Studien haben gezeigt, daß PLG-Mikropartikel
mit eingeschlossenen Antigenen dazu in der Lage sind, die zellseitige
Immunität
auszulösen.
Es wurde zum Beispiel gezeigt, daß mikroverkapseltes gp120 des
HIV (Human Immmunodeficiency Virus) in Mäusen HIV- spezifische CD4+- und CD8+-T-Zellen-Antworten induziert
(Moore et al., Vaccine (1995), 13: 1741–1749). Darüberhinaus wurden in Mäusen, die
mit einem in PLG eingeschlossenem Mycobacterium tuberculosis-Antigen
geimpft wurden, sowohl Antikörper-
als auch T-Zellen-Antworten
induziert (Vordermeier et al., Vaccine (1995), 13: 1576-1582).
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Obwohl sie anderen, stärker toxischen
Systemen gegenüber
wesentliche Vorteile aufweisen, haben die in Antigene eingeschlossenen
PLG-Mikropartikel auch einige Nachteile. Zum Beispiel ist die Herstellung von
Mikropartikeln schwierig und bedingt den Einsatz aggressiver Chemikalien,
die das Antigen denaturieren und seine Immunogenität zerstören können. Weiterhin
kann Antigeninstabilität
auch aufgrund der hohen Scherkräfte,
die zur Herstellung von kleinen Mikropartikeln angewandt werden,
und aufgrund von Schnittstelleneffekten innerhalb der verwendeten
Emulsionen auftreten.
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Die Verwendung von an Mikropartikeln
adsorbierten Antigenen vermeidet diese Unzulänglichkeiten. WO97/02810 beschreibt
Zusammensetzungen, in denen ein aktives Agens, etwa ein Virus, an
lamellenartige Partikel adsorbiert wird, die ein biologisch abbaubares
Polymer enthalten, das wenigstens teilweise kristallin ist. Jedoch
waren die Berichte über
die Immunogenität
von Mikropartikeln mit adsorbierten Antigenen gemischt. Tatsächlich haben
die Versuchsautoren postuliert, daß Antigene in Mikropartikeln
eingeschlossen sein müssen,
um eine angemessene Adjuvanswirkung zu erreichen. Vgl. zum Beispiel
Eldridge et al., Infect. Immun. (1991) 59: 2978–2986; Eldridge et al., Seminars
in Hematology (1993) 30: 16–25;
Nakaoka et al., J. Controlled Release (1995) 37: 215–224; Sah
et al., J. Controlled Release (1995) 35: 137–144; und Duncan et al., „Poly(lactide-co-glycolide)
Microencapsulation of Vaccines for Mucosal Immunization" in Mucosal Vaccines (Academic
Press, Inc., 1996).
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Im einzelnen wurde gezeigt, daß in Mikropartikeln
verkapseltes oder daran adsobiertes Ovalbumin die zellseitige Immunantwort
in vivo startet und bei oraler Verabreichung IgA-Antworten der Schleimhäute induziert.
Jedoch induzierte eingeschlossenes Antigen eine stärkere Antwort
als adsorbiertes Antigen (O'Hagan
et al., Vaccine (1993) 11: 149–154).
Coombes et al., Vaccine (1996) 14: 1429–1438 beschreibt auch Versuche sowohl
mit ovalbuminverkapselten als auch mit ovalbuminadsorbierten Mikropartikeln.
Die Antikörperantworten
gegen das adsorbierte Antigen waren signifikant geringer als jene,
die durch die Verabreichung von eingeschlossenem Ovalbumin ausgelöst wurden.
Schließlich
wurde von antigenspezifischen CTL-Antworten bei Mäusen berichtet,
die ein kurzes synthetisches Peptid aus dem Circumsporozoitenprotein
von Plasmodium berghei verwenden, das in biologisch abbaubaren Mikrosphären mikroverkapselt
oder an leere Mikrosphären adsorbiert
war (Men et al., Vaccine (1997) 15: 1405–1312).
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WO94/28879 beschreibt eine Zusammensetzung
für orale
Verabreichung, die ein biologisch aktives Material wie ein Antigen,
einen Antikörper
gegen dieses Material und eine Menge Polymerkügelchen umfaßt.
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Jedoch beschreibt keine der vorstehend
genannten Studien die Verwendung antigenadsorbierter Mikropartikel,
und zwar unter Verwendung viraler Atigene, um die zellvermittelte
Immunantwort zu stimulieren. Dementsprechend besteht auch weiterhin
ein Bedarf an effektiven und sicheren Adjuvantien zur Verwendung in
verschiedenen Arzneimitteln und Impfungen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfinder haben überraschenderweise
festgestellt, daß die
Adsorption ausgewählter
viraler Antigene an aus einer Poly(a-Hydroxysäure) abgeleitete Mikropartikel
bessere Immunantworten liefert. Dementsprechend erstreckt sich die
Erfindung primär
auf Verfahren und Zusammensetzungen, die solche Mikropartikel beinhalten,
und auf Herstellungsverfahren für
diese. Die Verwendung von Mikropartikeln mit adsorbierten Antigenen
stellt einen sicheren und wirkungsvollen Weg zur Erhöhung der
Immunogenität
einer großen
Vielzahl von Antigenen dar.
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Die Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.
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In besonders bevorzugten Ausführungsformen
sind die vorstehend erwähnten
Mikropartikel aus Poly(D,L-lactid-co-glykolid) gebildet.
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In Anbetracht dieser Offenbarungen
werden sich diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung dem Durchschnittsfachmann leicht erschließen.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die Ausübung der vorliegenden Erfindung
verwendet, wo dies nicht anders angegeben ist, konventionelle Verfahren
der Chemie, Biochemie, Molekularbiologie, Immunologie und Pharmakologie,
die innerhalb dessen liegen, was auf dem Fachgebiet üblich ist.
Solche Verfahren werden ausführlich
in der Literatur erläutert.
Vgl. zum Beispiel Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage (Easton, Pennsylvania: Mack
Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (Hrsg. S. Colowick
und N. Kaplan, Academic Press, Inc.); und Handbook of Experimental
Immunology, Bde. I–IV
(Hrsg. D. M. Weir und C. C. Blackwell, 1986, Blackwell Scientific
Publications); und Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual(2. Auflage, 1989).
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Im Sprachgebrauch dieser Beschreibung
und der Patentansprüche
im Anhang schließen
die Singularformen „ein", „eine" und „der" jeweils auch die
Pluralbezüge
ein, sofern der Inhalt nicht deutlich das Gegenteil diktiert.
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A. Definitionen
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Bei der Beschreibung der vorliegenden
Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet und sollen dazu
wie nachstehend angegeben definiert sein: Der Begriff „Mikropartikel" bedeutet im Zusammenhang
dieser Arbeit ein Partikel von etwa 100 nm bis etwa 150 μm Durchmesser,
stärker
bevorzugt etwa 200 nm bis etwa 30 μm Durchmesser, und besonders
bevorzugt etwa 500 nm bis etwa 10 μm Durchmesser. Das Mikropartikel wird
vorzugsweise von einem Durchmesser sein, der eine parenterale Verabreichung
ohne Okklusion von Nadeln und Kapillaren erlaubt. Die Größe der Mikropartikel
kann leicht mit Verfahren bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet
allegemein bekannt sind, wie Photonenkorrelations-Spektroskopie,
Laser-Diffraktometrie und/oder abtastende Elektronenmikroskopie.
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Die Mikropartikel zur Verwendung
im Rahmen dieser Erfindung werden aus Materialien bestehen, die sterilisierbar,
ungiftig und biologisch abbaubar sind. Solche Materialien sind,
unter anderen Poly(a-Hydroxysäure),
Polyhydroxybuttersäure,
Polycaprolacton, Polyorthoester, Polyanhydrid; sie sind jedoch nicht
nur auf diese beschränkt.
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Vorzugsweise sind Mikropartikel zur
Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung aus einer Poly(a-Hydroxysäure) abgeleitet,
besonders aus einem Poly(Lactid) („PLA") oder einem Copolymer aus D, L-Lactid
und Glykolid oder Glykolsäure,
wie ein Poly(D, Llactid-co-gykolid) („PLG" oder „PLGA"), oder einem Copolymer aus D, L-Lactid
und Caprolacton. Die Mikropartikel können aus jedem beliebigen von
verschiedenen polymeren Startmaterialien, die verschiedene Mollekulargewichte
und im Fall der Copolymere wie PLG verschiedene Lactid : Glykolid-Verhältnisse
haben, abgeleitet sein; die Auswahl kann großteils nach Belieben erfolgen,
und hängt
teilweise vom gleichzeitig verabreichten Antigen ab. Diese Parameter
werden nachstehend ausführlicher
erörtert.
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Unter „Antigen" wird ein Molekül verstanden, das ein oder
mehrere Epitope enthält,
die das Immunsystem eines Wirtes bei Vorliegen des Antigens zu einer
zellulären
antigenspezifi schen Immunantwort oder einer humoralen Antikörperantwort
stimulieren. Normalerweise enthält
ein Epitop zwischen etwa 3 bis 15, im allgemeinen 5 bis 15 Aminosäuren.
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Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung können Antigene aus jedem beliebigen
von mehreren bekannten Viren abgeleitet sein.
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Weiterhin bezeichnet für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung „Antigen" ein Protein, das
Modifikationen gegenüber
der nativen Sequenz wie Deletionen, Additionen und Substitutionen
(im allgemeinen solche konservativer Art) einschließt, solange
das Protein die Fähigkeit
zu einer Immunantwort beibehält.
Diese Modifikationen können
beabsichtigt sein, wie durch stellengerichtete Mutagenese, oder
sie können
zufällig
sein, wie durch Mutationen von Wirten, die die Antigene erzeugen.
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Eine „Immunantwort" auf ein Antigen
oder eine Zusammensetzung ist die Entwicklung einer humoralen und/oder
zellulären
Immunantwort in einer Person auf Moleküle in dieser Zusammensetzung
von Interesse. Für
Zwecke der vorliegenden Erfindung bezeichnet eine „humoralen
Immunantwort" eine
Immunantwort, die durch Antikörpermoleküle erfolgt,
während
eine „zelluläre Immunantwort" eine solche durch
T-Lymphocyten und/oder andere weiße Blutkörperchen ist. Ein wichtiger
Aspekt der Zellimmunität
betrifft eine antigenspezifische Antwort durch cytolytische T-Zellen
(„CTLs"). CTLs haben eine
Spezifität
für Peptidantigene,
die in Verbindung mit Proteinen, die durch die Haupt-Histokompatibiliätskomplexe
(MHC) codiert werden, überbracht und
auf den Zelloberflächen
exprimiert werden. CTLs helfen dabei, die intrazelluläre Zerstörung intrazellulärer Mikroben
oder die Lyse von mit solchen Mikroben infizierten Zellen zu induzieren
und voranzutreiben. Ein anderer Aspekt der zellulären Immunität betrifft
eine antigenspezifische Antwort durch Helfer-T-Zellen. Helfer-T-Zellen
wirken, indem sie die Funktion nichtspezifischer Effektorzellen
gegen Zellen stimulieren, die mit MHC-Molekülen assoziierte Peptidantigene
auf ihrer Oberfläche
aufweisen, und indem sie deren Aktivität auf diese fokussieren. Eine „zelluläre Immunantwort" bezieht sich auch
auf die Produktion von Cytokinen, Chemokinen und anderen solchen
Molekülen,
die von aktivierten T-Zellen und/oder anderen weißen Blutkörperchen, darunter
auch jenen, die aus CD4+- und CD8+-T-Zellen abgeleitet sind.
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Eine Zusammensetzung oder ein Impfstoff,
der eine zellseitige Immunantwort auslöst, kann dazu dienen, ein Wirbeltier
durch das Überbringen
von Antigen in Verbindung mit MHC-Molekülen an der Zelloberfläche zu sensibilisieren.
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Die zellvermittelte Immunantwort
findet an oder bei Zellen, die auf ihrer Oberfläche ein Antigen aufweisen,
statt. Zusätzlich
können
antigenspezifische T-Lymphocyten erzeugt werden, die fortan den
Schutz eines immunisierte Wirtes ermöglichen.
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Die Fähigkeit eines bestimmten Antigens
oder einer Zusammensetzung, die zellvermittelte Immunantwort zu
stimulieren, kann mit einer Anzahl von Tests bestimmt werden, etwa
durch Lymphoproliferations- (Lymphocytenaktivierungs)-tests, cytotoxische
CTL-Zelltests, oder durch Test auf T-Lymphocyten, die für das Antigen
in einer sensitivisierten Person spezifisch sind. Solche Tests sind
auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Vgl. zum Beispiel Erickson
et al., J. Immunol. (1993) 151: 4189–4199; Doe et al., Eur. J.
Immunol. (1994) 24: 2369-2376;
und die nachstehenden Beispiele.
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Somit kann eine Immunantwort, wie
im Zusammenhang dieser Arbeit gebraucht, eine solche sein, die die
Produktion von CTLs und/oder die Produktion oder Aktivierung von
Helfer-T-Zellen
stimuliert. Das Antigen von Interesse kann auch eine antikörperseitige
Immunantwort auslösen.
Folglich kann eine Immunantwort eine oder mehrere der folgenden
Effekte beinhalten: die Produktion von Antikörpern durch B-Zellen; und/oder
die die Aktivierung von Suppressor-T-Zellen und/oder γδ-T-Zellen,
die spezifisch gegen ein Antigen oder gegen Antigene, die in der
Zusammensetzung oder Impfung von Interesse vorhanden sind, gerichtet
sind. Diese Antworten können
dazu dienen, Infektivität
zu neutralisieren und/oder Antikörper-Komplement-
oder antikörperabhängige Zellcytotoxizität (ADCC)
zu bewirken, um einem immunisierten Wirt Schutz zu verleihen. Solche
Antworten können
mit Standard-Immuntests
und -Neutralisierungstests, die auf dem Fachgebiet allgemein bekannt
sind, festgestellt werden.
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Ein Impfstoff, der ein an Mikropartikel
adsorbiertes ausgewähltes
Antigen enthält,
weist „erhöhte Immunogenität" auf, wenn die von
ihm ausgelöste
Immunantwort stärker
ist als jene, die von der gleichen Menge des nicht in Verbindung
mit den Mikropartikeln verabreichten Antigens ausgelöst wird.
Somit kann ein Impfstoff eine „erhöhte Immunogenität" aufweisen, weil
das Antigen aufgrund seiner Adsorption an die Mikropartikel stärker immunogen
ist, oder weil nur eine geringere Antigendosis erforderlich ist,
um in der Person, der sie verabreicht wird, eine Immunantwort zu
erreichen. Eine solche erhöhte
Immunogenität
kann festgestellt werden, indem die Mikropartikell/Antigen-Zusammensetzung
und Antigen-Kontrollen Versuchstieren verabreicht und die Antikörpertiter
gegen beide verglichen werden; dies kann mit Standardtests wie Radioimmuntest
und ELISAs geschehen, die auf dem Fachgebiet all-gemein bekannt sind.
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Die Begriffe „wirksame Menge" oder „pharmazeutisch
wirksame Menge" eines
Antigens/Mikropartikel, wie im Zusanmenhang dieser Arbeit verwendet,
bezeichnen eine ungiftige, aber ausreichende Menge des Antigens/Mikropartikel,
um die gewünschte
immunologische Antwort und die entsprechende therapeutische Wirkung
zu liefern. Wie nachstehend gezeigt wird, variiert die jeweils erforderliche
genaue Menge von Individuum zu Individuum, je nach Art, Alter und
Gesamtzustand des Individuums, der Schwere des zu behandelnden Zustandes
und dem besonderen Antigen von Interesse, der Verabreichungsweise
und ähnlichen.
Eine geeignete „wirksame" Menge kann in jedem
individuellen Fall von einem Durchschnittsfachmann durch Routineversuche ermittelt
werden.
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Mit „Wirbeltier" ist jeder beliebige
Angehörige
des Unterstammes Chordata gemeint, darunter ohne Einschränkung Säugetiere,
wie Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen, Pferde und Menschen; Haustiere,
wie Hunde und Katzen; sowie Vögel,
darunter Hausgeflügel,
Wildvögel
und jagdbare Vögel,
wie Hähne
und Hühner, einschließlich Küken, Truthähne und
andere Hühnervögel. Der
Begriff bezieht sich nicht auf ein bestimmtes Alter. Er erstreckt
sich somit gleichermaßen
auf adulte wie auf neugeborene Tiere.
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Unter „pharmazeutisch verträglich" oder „pharmakologisch
verträglich" wird ein Stoff verstanden,
der nicht biologisch oder sonstwie unerwünscht ist, d. h. der Stoff
kann zusammen mit der Mikropartikelzubereitung einem Individuum
verabreicht werden, ohne daß er
irgendwelche unerwünschte
biologische Wirkungen verursachen, oder daß er in zerstörerischer
Weise mit einem beliebigen Bestandteil der Zusammensetzung, in der er
enthalten ist, wechselwirken würde.
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Unter „physiologischem pH-Wert" oder „pH-Wert
im physiologischen Bereich" wird
ein pH-Wert im Bereich von etwa 7.2 bis einschließlich 8.0,
noch typischer im Bereich von etwa 7.2 bis einschließlich 7.6
verstanden.
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Wie im Zusammenhang dieser Arbeit
verwendet, bezeichnet „Behandlung" eine beliebige der
folgenden Definitionen: (1.) das Vorbeugen einer Infektion oder
Reinfektion, wie bei der traditionellen Impfung, (2.) das Lindern
oder Ausschalten von Symptomen, und (3.) die wesentliche oder vollständige Eliminierung
des fraglichen Krankheitserregers. Die Behandlung kann prophylaktisch
(vor der Infektion) oder therapeutisch (nach der Infektion) erfolgen.
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B. Allgemeine Verfahren
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Der zentrale Punkt der vorliegenden
Erfindung ist die Entdeckung, daß PLA- und PLG-Mikropartikel mit
adsorbierten viralen Antigenen in einem Wirbeltier eine zellvermittelte
Immunantwort erzeugen können.
Die Fähigkeit
des Antigens/Mikropartikel der vorliegenden Erfindung zur Auslösung einer
zellvermittelten Immunantwort gegen ein ausgewähltes Antigen bildet eine starke
Waffe gegen Infektionen durch eine Vielzahl von Viren. Das Antigen/Mikropartikel
der vorliegenden Erfindung kann in Impfstoffe einbezogen werden.
Darüberhinaus
können
die Adjuvanszubereitungen der Erfindung benützt werden, um die Aktivität von in
vivo erzeugten Antigenen zu erhöhen,
d. h. in Verbindung mit DNA-Immunisierung.
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Obwohl die einzelnen Bestandteile
der Impfstoffe und die in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren
bereits bekannt waren, kam es unerwartet und überraschend, daß soloche
Kombinationen starke zellvermittelte Immunantworten erzeugen, die über dem
Niveau liegen, das bei separater Anwendung der Bestandteile erreicht
wird. So kann das hier beschriebene System zusätzlich zu einer konventionellen
Antikörperantwort
z. B. auch die Assoziierung der exprimierten Antigene mit MHC-Molekülen Klasse
1 bewirken, so daß eine
zellvermittelte Immunantwort auf das Antigen von Interesse in vivo
ausgelöst
werden kann, die die Produktion von CTLs stimuliert, um eine spätere Erkennung
des Antigens zu ermöglichen.
Weiterhin können
die Verfahren eine antigenspezifische Antwort durch Helfer-T-Zellen
auslösen.
Dementsprechend werden die Verfahren der vorliegenden Endung mit
einem beliebigen Antigen Verwendung finden, für das zellvermittelte und/oder
humorale Immunantworten erwünscht
sind, darunter auch Antigene, die aus viralen Krankheitserregern,
die Antikörper
induzieren können,
abgeleitet sind, T-Zell-Helferepitopen und cytotoxischen T-Zell-Epitopen.
Solche Antigene beinhalten unter anderen jene, die von menschlichen
und tierischen Viren codiert werden, und sie können entweder strukturellen
oder nichtstrukturellen Proteinen entsprechen.
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Das Verfahren ist zur Immunisierung
gegen intrazelluläre
Viren, die normalerweise eine schwache Immunantwort auslösen, besonders
nützlich.
Zum Beispiel wird die vorliegende Erfindung Anwendung finden, um eine
Immunantwort gegen eine Vielzahl von Proteinen der Familie der Herpesviren
auszulösen,
darunter Proteinen, die aus Herpes Simplex-Viren (HSV) der Typen
1 und 2 abgeleitet sind, wie die HSV-1- und HSV-2-Glykoproteine
gB, gD und gH; Antigene, die aus Varicella Zoster-Viren (VZV), Epstein-Barr-Viren
(EBV) und Cytomegalieviren (CMV) abgeleitet sind, darunter CMV gB
und gH; und Antigene, die aus anderen menschlichen Herpesviren,
wie HHV6 und HHV7 abgeleitet sind. (Vgl. z. B. Chee et al., Cytomegaloviren
(Hrsg. J. K. McDougall, Springer-Verlag 1990) S. 125–169, zu
einer Besprechung des Proteincodierungsgehaltes des Cytomegalievirus;
McGeoch et al., J. Gen. Virol. (1988) 69: 1531–1574, zu einer Diskussion
der verschiedenen HSV-1-codierten Proteine; U.S. Patent Nr. 5,171,568
zu einer Diskussion der gB- und gD-Proteine von HSV-1 und HSV-2
und die diese codierenden Gene; Baer et al., Nature (1984) 310:
207–211,
zur Bestimmung von Proteincodierungssequenzen in einem EBV-Genom;
und Davison und Scott, J. Gen. Virol. (1986) 67: 1759–1816, zu
einer Besprechung von VZV.) Antigene aus der Familie der Hepatitisviren,
darunter das Hepatitis-A-Virus (HAV), Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus
(HCV), das Hepatitis-Delta-Virus (HDV), das Hepatitis-E-Virus (HEV)
und das Hepatitis-G-Virus (HGV), können ebenfalls bequem in den
hier beschriebenen Verfahren verwendet werden. Beispielsweise ist
die virale Genomsequenz von HCV bekannt, ebenso die Verfahren zur
Feststellung der Sequenz. Vgl. z. B. die internationalen Veröffentlichungen
Nr. WO 89/04669; WO 90/11089; und WO 90/14436. Das HCV-Genom codiert mehrere
virale Proteine, darunter E1 (auch als E bekannt) und E2 (auch als
E E2/NSI bekannt) und ein N-terminales Nucleocapsidprotein („core" genannt) (vgl. Houghton
et al., Hepatology (1991) 14: 381–388, zu einer Diskussion von
HCV-Proteinen, darunter E1 und E2). Jedes dieser Proteine, wie auch
antigene Fragmente davon, werden in den vorliegenden Verfahren Anwendung
finden.
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Ähnlicherweise
ist auch die Sequenz des δ-Antigens
von HDV bekannt (vgl. z. B. U. S. Patent Nr. 5,378,814), und auch
dieses Antigen kann in den vorliegenden Verfahren bequem verwendet
werden. Weiterhin werden in den vorliegenden Verfahren von HBV abgeleitete
Antigene Anwendung finden, wie das Core-Antigen, das Oberflächenantigen
sAg, ebenso wie die Prä-Oberflächensequenzen
pre-Sl und pre-S2 (früher pre-S
genannt), ebenso wie Kombinationen davon, wie sAg/pre-Sl, sAg/pre-S2,
sAg/pre-S1/pre-S2, und pre-S1/pre-S2. Vgl. z. B. „HBV Vaccines – from the
laboratory to license: a case study" in Mackett, M. und Williamson, J. D.,
Human Vaccines and Vaccination, S. 159–176, zu einer Diskussion der
HBV-Struktur; und
die U.S. Patente Nr. 4,722,840, 5,098,704, 5,324,513; Beames et
al., J. Virol. (1995) 69: 6833–6838,
Birnbaum et al., J. Virol., (1990) 64: 3319–3330; und Zhou et al., J.
Virol. (1991) 65: 5457–5464.
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Aus anderen Viren abgeleitete Antigene
werden in den beanspruchten Verfahren ebenfalls Anwendung finden,
wie, ohne Einschränkung,
Proteine von Mitgliedern der Familien Picornaviridae (z. B. Polioviren usw.);
Caliciviridae; Togaviridae (z. B. Rubella-Virus, Dengue-Virus, usw.); Flaviviridae;
Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabodoviridae (z. B.
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Tollwutvirus usw.); Filoviridae;
Paramyxoviridae (z. B. Mumpsvirus, Masernvirus, Respiratorisches Syncytialvirus
usw.); Orthomyxoviridae (z. B. Influenzaviren Typen A, B und C usw.);
Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviradae (z. B. HTLV-I; HTLV-II;
HIV-1 (auch als HTLV-III, LAV, ARV, hTLR usw. bekannt), einschließlich von
Antigenen aus den Isolaten HIVIIIb, HIVSF2, HIVLAV, HIVLAI, HIVMN, jedoch
nicht nur aus diesen); HIV-1CM235 ; HIV-1US4;
HIV-2; Simian-Immunschwächevirus
(SIV) und andere.
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Weiterhin können Antigene auch aus menschlichen
Papillomviren (HPV) und den von Zecken übertragenen Encephalitisviren
abgeleitet sein. Vgl. z. B. Virology, 3. Auflage (Hrsg. W. K. Joklik
1988); Fundamental Virology, 2. Auflage (Hrsg. B. N. Fields und
D. M. Knipe, 1991), zu einer Beschreibung dieser und anderer Viren.
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Insbesondere ist das gp20-Hüllprotein
eines beliebigen der vorstehend genannten HIV-Isolate, einschließlich jenes von Angehörigen der
verschiedenen genetischen Subtypen von HIV bekannt und beschrieben
(vgl. z. B. Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National
Laboratory, Los Alamos, New Mexico (1992); Myers et al., Human Retroviruses
and Aids, 1990, Los Alamos, New Mexico: Los Alamos National Laboratory;
und Modrow et al., J. Virol. (1987) 61: 570–578, zu einem Vergleich der
Hüllsequenzen
verschiedener HIV-Isolate),
und in den vorliegenden Verfahren werden Antigene, die aus einem
beliebigen dieser Isolate abgeleitet sind, Anwendung finden. Darüberhinaus
ist die Erfindung gleichermaßen
auf andere immunogene Proteine, die aus einem beliebigen HIV-Isolat
abgeleitet wurden, anwendbar, auch auf ein beliebiges Hüllprotein wie
gp160 und gp41, auf gag-Antigene wie p24gag und p55gag, ebenso wie
auf aus der pol-Region abgeleitete Proteine.
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Wie vorstehend erläutert, ist
das Influenzavirus ein weiteres Beispiel eines Virus, für das die
vorliegende Erfindung besonders nützlich ist. Speziell die Hüllglykoproteine
HA und NA von Influenza A sind zur Auslösung einer Immunantwort von
besonderem Interesse. Es wurden zahlreiche HA-Subtypen von Influenza
A identifiziert (Kawaoka et al., Virology (1990) 179: 759–767; Webster
et al., „Antigenic
Variation among type A influenza viruses", S. 127-168. In: P. Palese und D. W. Kingsbury
(Hrsg.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, New York). Somit können auch
Proteine, die von einem beliebigen dieser Isolate abgeleitet sind, in
den hier beschriebenen Immunisierungsverfahren verwendet werden.
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Es liegt auf der Hand, daß die vorliegende
Erfindung zur Auslösung
einer Immunantwort gegen viele verschiedene Antigene und somit zur
Behandlung von oder Vorbeugung gegen eine große Zahl von Kranhkeiten benützt werden
kann.
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Das ausgewählte Antigen wird zur anschließenden Abgabe
an Mikropartikel adsorbiert. Biologisch abbaubare Polymere zur Herstellung
von Mikropartikeln zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung sind
im Handel zum Beispiel von Boehringer Ingelheim, Deutschland und
Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, AL erhältlich. Zur Bildung der Mikropartikel
nutzbare Polymere sind zum Beispiel unter anderen die aus Polyhydroxybuttersäure abgeleiteten;
Polycaprolacton; Polyorthoester; Polyanhydrid; ebenso wie eine Poly(a-Hydroxysäure), wie
Poly(L-lactid), Poly(D, L-lactid) (hier beide als „PLA" bezeichnet), Poly(Hydroxybutyrat),
Copolymere von D, L-Lactid und -Glykolid, wie Poly (D, L-lactid-co-Glykolid) (hier als „PLG" oder „PLGA" bezeichnet) oder
ein Copolymer von D, L-Lactid und Caprolacton. Zur Verwendung hierin
besonders bevorzugte Polymere sind PLA- und PLG-Polymere. Diese
Polymere sind in vielen Molekulargewichten erhältlich, und das für ein gegebenens
Antigen geeignete Molekulargewicht läßt sich von einem Fachmann
leicht bestimmen. So zum Beispiel liegt das geeignete Molekulargewicht
für PLA
in der Größenordnung
von etwa 2000 bis 5000. Für
PLG rangieren die geeigneten Molekulargewichte im allgemeinen von
etwa 10.000 bis 200.000, vorzugsweise von etwa 15.000 bis etwa 150.000,
und besonders bevorzugt von etwa 50.000 bis etwa 100.000.
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Wird ein Copolymer, wie PLG, zur
Bildung der Mikropartikel verwendet, können dabei verschiedene Lactid
: Glykolid-Verhältnisse
Anwendung finden, wobei das Verhältnis
großenteils
eine Sache der Auswahl ist und teilweise vom gleichzeitig verabreichten
Antigen und der gewünschten
Degradationsrate abhängt.
Beispielsweise liefert ein 50 : 50 PLG-Polymer, das 50% D, L-Lactid
und 50% Glykolid enthält,
ein schnell resorbierendes Copolymer, während 75 : 25 PLG langsamer
degradiert, und 85 : 15 und 90 : 10 wegen des erhöhten Lactidanteils
noch langsamer. Es liegt auf der Hand, daß ein geeignetes Lactid : Glykolid-Verhältnis sich
je nach der Art des Antigens und der fraglichen Krankheit vom Fachmann
leicht bestimmen läßt. Darüberhinaus werden
auch Gemischen von Mikropartikeln mit variierenden Lactid Glykolid-Verhältnissen
in Rezepturen Anwendung finden, um die gewünschte Abgabekinetik für ein gegebenes
Antigen zu erreichen und sowohl eine primäre als auch eine sekundäre Immunantwort
zu veranlassen. Die Degradationsrate der Mikropartikel der vorliegenden
Erfindung kann auch über
Faktoren wie Molekulargewicht und Kristallinität des Polymers gesteuert werden.
PLG-Copolymere mit variierenden Lactid : Glykolid-Verhältnissen
und Molekulargewichten sind im Handel von einer Anzahl Hersteller
erhältlich,
darunter Boehringer Ingelheim, Deutschland und Birmingham Polymers,
Inc., Birmingham, AL. Diese Polymere lassen sich auch durch einfache
Polykondensation der Milchsäurekomponente
mit den in Ta bata et al., J. Biomed. Mater. Res. (1988) 22: 837–858 beschriebenen,
auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren synthetisieren.
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Die Antigen-enthaltenden Mikropartikel
werden mit einer beliebigen von mehreren auf dem Fachgebiet allgemein
bekannten Verfahren hergestellt. Beispielsweise können doppelte
Emulsions-/Lösungsmittelverdampfungsverfahren,
wie sie in U.S. Patent Nr. 3.523.907 und Ogawa et al., Chem. Pharm.
Bull. (1988) 36: 1095–1103
beschrieben sind, hierin zur Herstellung der Mikropartikel verwendet
werden. Diese Verfahren beinhalten die Bildung einer primären, aus
Tröpfchen
von Polymerlösung
bestehenden Emulsion, die anschließend mit einer kontinuierlichen
wässrigen
Phase, die einen Partikelstabilisator/Tensid enthält, vermischt
wird.
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Insbesondere kann ein Wasser-in-Öl-in-Wasser
(w/o/w) Lösungsmittelverdampfungssystem
zur Bildung der Mikropartikel verwendet werden, wie es von O'Hagan et al., Vaccine
(1993) 11: 965–969
und Jeffery et al., Pharm. Res. (1993) 10: 362 beschrieben wurde.
Bei diesem Verfahren wird das jeweilige Polymer mit einem organischen
Lösungsmittel
kombiniert, wie etwa Ethylacetat, Dimethylchlorid (auch Methylenchlorid
und Dichlormethan genannt), Acetonitril, Aceton, Chloroform, und ähnliche.
Das Polymer wird in einer 2–15%igen, vorzugsweise
4–10%-igen,
und besonders bevorzugt einer 6%-igen Lösung in organischem Lösungsmittel
bereitgestellt. Die Polymerlösung
wird zum Beispiel mit einem Homogenisator emulgiert. Dann wird die
Emulsion mit einem größeren Volumen
einer wässrigen
Lösung
eines Emulsionsstabilisators wie Polyvinylalkohol (PVA) oder Polyvinylpyrrolidon
emulgiert. Der Emulsionsstabilisator wird typischerweise in einer
2-15%-igen, noch typischer in einer 4–10%-igen Lösung bereitgestellt. Dann wird
das Gemisch homogenisiert und ergibt eine stabile w/o/w-Doppelemulsion.
Schließlich
werden die organischen Lösungsmittel
verdampft.
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Die Parameter der Zubereitung können verändert werden,
um kleine (< 5 μm) und große (> 30 μm) Mikropartikel
herzustellen. Vgl. z. B. Jeffery et al., Pharm. Res. (1993) 10:
362-368; McGee et
al., J. Microencap. (1996). Beispielsweise ergibt schwächeres Schütteln größere Mikropartikel;
ebenso eine Zunahme des Volumens der internen Phase. Kleine Partikel
erzeugt man durch ein niedriges Volumen der wässrigen Phase mit hohen PVA-Konzentrationen.
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Mikropartikel lassen sich auch durch
Sprühtrocknung
und Koazervierung bilden, wie zum Beispiel in Thomasin et al., J.
Controlled Release (1996) 41: 131; U. S. Patent Nr. 2,800,457; Masters,
K. (1976) Spray Drying, 2. Aufl., Wiley, New York beschrieben; durch
Luftstrom beschichtungsverfahren, wie pan-Beschichtung und Wurster-Beschichtung,
wie von Hall et al., (1980) The „Wurster Process" in Controlled Release
Technologies: Methods, Theory, and Applications (Hrsg. A. F. Kydonieus),
Bd. 2, S. 133–154,
CRC Press, Boca Raton, Florida und von Deasy, P. B., Crit. Rev.
Ther. Drug Carrier Syst. (1988) S(2): 99–139 beschrieben; und durch ionische
Gelbildung wie zum Beispiel von Lim et al., Science (1980) 210:
908–910
beschrieben.
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Die Partikelgröße kann beispielsweise durch
Laserlichtstreuung unter Verwendung eines Spektrometers mit einem
Helium-Neon-Lasers bestimmt werden. Im allgemeinen erfolgt die Bestimmung
der Partikelgröße bei Zimmertemperatur,
und sie beinhaltet mehrere Analysen der Probe, um einen Mittelwert
des Partikeldurchmessers zu erhalten. Die Partikelgröße läßt sich
auch leicht durch abtastende Elektronenmikroskopie (SEM) bestimmen.
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Nach der Herstellung können die
Mikropartikel im Ist-Zustand gelagert oder für weiter Verwendung gefriergetrocknet
werden. Um Antigen an die Mikropartikel zu adsorbieren, wird die
Mikropartikelzubereitung einfach mit dem Antigen von Interesse vermischt,
und der so erhaltene Stoff kann vor seiner Anwendung abermals lyophilisiert
werden. Der Proteingehalt der Mikropartikel kann mittels Standardverfahren
bestimmt werden.
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Ein besonders zu bevorzugendes Verfahren
zum Adsorbieren von Antigen an hergestellte Mikropartikel ist das
folgende: Mikropartikel werden rehydriert und mittels dialysierbarer
Detergentien zu einer im wesentlichen monomeren Mikropartikelsuspension
dispergiert. Nutzbare Detergentien sind beliebige Vertreter der
verschiedenen N-Methylglucamide (als MEGAs bekannt), wie Heptanoyl-N-Methylglucanmid
(MEGA-7), Octanoyl-N-Methylglucamid (MEGA-8), Nonanoyl-N-Methylglucamid
(MEGA-9), und Decanoyl-N-Methylglucamid (MEGA-10); Cholsäure; Natriumcholat;
Deoxycholsäure;
Natriumdeoxycholat; Taurocholsäure;
Natriumtaurocholat; Taurodeoxycholsäure; Natriumtaurodeoxycholat;
3-[(3-Cholamidopropyl)Dimethylammonio]-1-Propansulfonat (CHAPS);
3-[(3-Cholamidopropyl)Dimethylammonio]-2-Hydroxy-L-Propan-Sulfonat (CHAPSO);
N-Dodecyl-N,N-Dimethyl-3-Ammonio-l-Propan-Sulfonat
(ZWITTERGENT 3–12); N,N-bis-(3-D-Gluconamidopropyl)-Deoxycholamid (DEOXY-BIGCHAP);
N-Octylglucosid; Sucrosemonolaurat; Glykocholsäure/Natriumglykocholat; Laurosarcosin
(Natriumsalz); Glykodeoxycholsäure/Natriumglykodeoxycholat;
sie sind jedoch nicht nur auf diese beschränkt. Die genannten Detergentien
sind im Handel z. B. von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO erhältlich.
Im allgemeinen wird man ein Mischungsverhältnis von 0,0156 : 1 Detergens
zu Mikropartikel (w : w) verwenden, stärker bevorzugt 0,625 : 1, noch
stärker
bevorzugt 0,25 : 1 und besonders bevorzugt etwa 1 1 bis 2 : 1, Detergens
zu Mikropartikel (w : w).
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Das Mikropartike/Detergens-Gemisch
wird dann physikalisch, z. B. mit einem Keramikmörser und -Stößel gemahlen,
bis ein weicher Brei entsteht. Dann wird ein geeigneter wässriger
Puffer, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder Tris-gepufferte
Kochsalzlösung
hinzugefügt
und das so erhaltene Gemisch ultraschallzertrümmert oder homogenisiert, bis
die Mikropartikel vollkommen suspendiert sind. Dann wird das Antigen
von Interesse zur Mikropartikelsuspension hinzugefügt und das
System dialysiert, um das Detergens zu entfernen. Das System aus
polymeren Mikropartikeln und Detergens wird vorzugsweise so gewählt, daß das Antigen
von Interesse an die Mikropartikeloberfläche adsorbiert und dabei noch
die Antigenaktivität beibehält. Aus
den so erhaltenen Mikropartikeln mit oberflächenadsorbiertem Antigen kann
das nicht gebundene Antigen ausgewaschen werden, und sie können als
Suspension in einer geeigneten Pufferlösung aufbewahrt oder wie nachstehend
beschrieben mit den geeigneten Excipientien lyophilisiert werden.
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Sobald die Antigen/Mikropartikel
hergestellt sind, werden sie wie vorstehend beschrieben zu Impfstoffen
zur Behandlung und/oder Vorbeugung vieler Virenkrankheiten zubereitet.
Die Zusammensetzungen beinhalten gewöhnlich ein oder mehrere „pharmazeutisch
akzeptable Excipientien oder Vehikel" wie Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin,
Polyethylenglykol, Hyaluronsäure,
Ethanol usw. Weiterhin können
in solchen Vehikeln Hilfsstoffe, wie benetzende und emulgierende
Mittel, biologische Puffersubstanzen und ähnliches vorhanden sein. Ein
biologischer Puffer kann praktisch jede beliebige Lösung sein,
die pharmakologisch akzeptabel ist, und die der Zubereitung den
gewünschten
pH-Wert, d. h. einen solchen im physiologischen Bereich verleiht. Beispiele
für Pufferlösungen sind
Kochsalzlösung,
phosphatgepufferte Kochsalzlösung
(PBS) oder Tris-gepufferte Kochsalzlösung, Hank'sche gepufferte Kochsalzlösung und ähnliche.
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Zur Steigerung der Wirkung der Arzneimittel
können
Adjuvantien eingesetzt werden. Die Adjuvantien können gleichzeitig mit den Mikropartikeln
der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, d. h. in der gleichen Zusammensetzung
oder aber in separaten Zusammensetzungen. Alternativ kann ein Adjuvans
vor oder nach den Mikropartikelzusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung verabreicht werden. Solche Adjuvantien sind unter anderen:
(1) Aluminiumsalze (Alaun), wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat,
Aluminiumsulfat, usw.; (2) Öl-in-Wasser-Emulsionsrezepturen
(mit oder ohne spezifische immunstimulierende Agentien, wie Muramylpeptide
(siehe nachstehend) oder Bestandteile der bakteriellen Zellwand,
wie beispielsweise (a) MF59 (Internationale Veröffentlichung Nr. WO90/14837),
das 5% Squalene, 0,5% Tween 80, und 0,5% Span 85 enthält (sowie
wahlweise, jedoch nicht unbedingt verschiedene Mengen MTP-PE (siehe
nachstehend)), und das mittels eines Mikrofluidizers wie Model 110Y
von Microfluidics, Newton, MA in Submikronteilchen zubereitet ist;
(b) SAF, das 10% Squalene, 0,4% Tween 80, 5% Pluron-blockiertes
Polymer L121, und thr-MDP (siehe nachstehend) enthält, und
das entweder zu einer Submikronemulsion mikrofluidisiert oder zur
Erzeugung einer Emulsion mit größeren Partikeln
gevortext wurde, und (c) RibiTM Adjuvanssystem
(RAS, Ribi Immunochem, Hamilton, MT), das 2% Squalene, 0,2% Tween
80, und eine oder mehrere bakterielle Zellwandbestandteile aus folgender
Gruppe enthält:
Monophosphorylipid A (MPL), Trehalosedimycolat (TDM), und Zellwandskelett
(CWS), vorzugsweise MPL + CWS (DetoxTM).
(Zu einer weiteren Diskussion geeigneter Submikron-Öl-in-Wasser-Emulsionen
zur Verwendung in dieser Erfindung vgl. die in gemeinsamem Eigentum
befindliche, am gleichen Datum wie die vorliegende Anmeldung zu
den Akten genommene Patentanmeldung Nr. 2300–1397 (Vorgangs-Nr. des Anwalts);
(3) es können
Saponinadjuvantien, wie StimulonTM (Cambridge
Bioscience, Worcester, MA) oder daraus erzeugte Partikel wie ISCOMs
(immunostimulating complexes) verwendet werden; (4) vollständiges Freund'sches Adjuvans (CFA)
und unvollständiges
Freund'sches Adjuvans
(IFA); (5) Cytokine, wie Interleukine (IL-1, IL-2, usw.), Makrophagenkolonien-stimulierender
Faktor (M-CSF), Tumornekrosefaktor (TNF), usw.; und (6) andere Substanzen,
die als immunstimulierende Agentien wirken und die Effektivität der Zusammensetzung
erhöhen.
Alaun und MF59 sind vorzuziehen.
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Muramylpeptide beinhalten, sind aber
nicht darauf beschränkt,
N-Acetyl-Muramyl-L-Threonyl-D-Isoglutamin
(thr-MDP), N-Acteyl-Normuramyl-L-Alanyl-D-Isoglutam (nor- MDP), N-Acetylmuramyl-L-Alanyl-D-Isogluatminyl-L-Alanin-2-(1'-2'-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3Hydroxyphosphoryloxy)-Ethylamin
(MTP-PE), usw. Die Zusammensetzungen enthalten eine „therapeutisch
wirksame Menge" des
Antigens von Interesse. Das heißt,
in die Zusammensetzung wird eine Menge Antigen/Mikropartikel gegeben,
die eine Immunantwort der Person bewirkt, die ausreicht, um Symptomen
vorzubeugen, diese zu reduzieren oder zu eliminieren. Die genaue
Menge variiert je nach der zu behandelnden Person, dem Alter und
dem Allgemeinzustand der zu behandelnden Person, der Fähigkeit
des Immunsystems der Person, Antikörper zu synthetisieren, der
gewünschten
Schutzwirkung, der Schwere des zu behandelnden Zustands, dem bestimmten
ausgewählten
Antigen und der Art seiner Verabreichung, sowie anderen Faktoren.
Eine geeignete wirksame Menge kann von einem Fachmann leicht bestimmt
werden. Somit bewegt sich die „therapeutisch
wirksame Menge" in
einem relativ breiten Bereich, der durch Routineversuche bestimmt
werden kann. Beispielsweise reicht eine wirksame Dosis für den Zweck
der vorliegenden Erfindung typischerweise von etwa 1 μg bis etwa
100 mg, stärker bevorzugt
von etwa 10 μg
bis etwa 1 mg, und besonders bevorzugt von etwa 50 μg bis etwa
500 μg Antigen pro
Dosis.
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Die fertig zubereiteten Stoffe der
Erfindung können
parenteral, z. B. durch Injektion verabreicht werden. Die Stoffe
können
entweder subcutan, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär injiziert
werden. Andere Verabreichungsweisen sind oral und pulmonär, durch
Suppositorien und transdermal durch Auftragen. Der Dosierungsplan
kann ein Einzeldosisplan oder ein Mehrfachdosisplan sein. Ein Mehrfachdosisplan
ist einer, bei dem eine erste Impfungsreihe 1–10 separate Dosen umfassen
kann, und dem weitere Dosen in Zeitintervallen folgen, die so gewählt sind,
daß sie
die Immunantwort erhalten und/oder verstärken; zum Beispiel die zweite
Dosis nach 1–4
Monaten und nötigenfalls
eine oder mehrere weitere nach einigen Monaten. Das Dosierungsschema
hängt auch
wenigstens teilweise vom Bedarf der Person und vom Urteil des Arztes
ab. Ist die Vorbeugung einer Krankheit beabsichtigt, so werden die
Impfungen im allgemeinen vor einer Primärinfektion mit dem Krankheitserreger
von Interesse verabreicht. Ist eine Behandlung beabsichtigt, z.
B. die Verringerung von Symptomen oder Rückfällen, werden die Impfungen
nach der Primärinfektion
verabreicht.
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C. Versuchsteil
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Nachstehend finden sich Beispiele
spezifischer Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung
und sollen den Schutzbereich der Erfindung in keiner Weise einschränken.
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Es wurde Mühe darauf verwendet, Genauigkeit
bei den Zahlenangaben (zum Beispiel Mengen, Temperaturen usw.) sicherzustellen,
doch manche Versuchsfehler und -abweichungen sollten natürlich in
Betracht gezogen werden.
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Beispiel 1: Herstellung
HA-eingeschlossener Mikrosphären
mittels einer Lösungsverdampfungstechnik
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In ein 15 ml-Glasteströhrchen wurden
0,5 ml 5 mg/ml Influenza A/Beijing93-Hämagglutinin- antigen (HA) und 5 in 6% w : w PLG
(Poly D, L-lactid-co-Glykolid) in Dichlormethan, Molverhältnis Lactid
: Glykolid 50 : 50, mittleres Molekulargewicht 70–100 kDa
(Medisorb Technologies International), gefüllt. Die Lösung wurde 2 Minuten lang bei
hoher Umdrehungszahl mit einem Handhomogenisierer homogenisiert.
Das Homogenat wurde in einem 100 ml-Glasbecher zu 20 ml 8% Polyvinylalkohol
(PVA) (12–23
kDa) hinzugefügt.
Das Gemisch wurde zwei Minuten lang bei 10.000 U/min mit einem Tisch-Skalen-Homogenisierer,
der mit einem Generator von 20mm Durchmesser ausgestattet war, homogenisiert.
Die Lösung
wurde mit einem Magnetrührstab
bei Zimmertemperatur mäßig schnell
umgerührt,
bis die Lösungsmittel
verdampft waren. Die Mikrosphären
wurden in Wasser resuspendiert und mehrere Male mit Wasser gewaschen,
wobei die Mikrosphären
zwischen den Waschvorgängen
mittels Zentrifugierung gefällt
wurden. Die Mikrosphären
wurden in Gegenwart eines Trockenmittels (Dririt-CaSO4)
im Vakuum getrocknet. Die mittlere Volumengröße wurde mittels Laser-Diffraktionsmessung
bestimmt; sie betrug 0,9 μm.
Der Proteingehalt der Mikrosphären
wurde mittels Aminosäurenzusammensetzungs-Analyse
bestimmt; er betrug 0,5% w . w.
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Beispiel 2: Herstellung
HA-adsorbierter Mikrosphären
mittels einer Lösungsverdampfungstechnik
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In einen 100 ml-Glasbecher wurden
10 ml Wasser und 100 ml 4% w : w PLG in Dichlormethan; Molverhältnis Lactid
: Glykolid 50 : 50, mittleres Molekulargewicht 80 kDa gefüllt (Boehringer
Ingelheim). Die Lösung
wurde drei Minuten bei 10.000 U/min mit einem Tisch-Skalen-Homogenisierer,
der mit einem Generator von 35 mm Durchmesser ausgestattet war,
homogenisiert. Unter weiterem dreiminütigem Homogenisieren wurden
400 ml 10% PVA (12–23
kDa) hinzugefügt.
Die Lösung
wurde bei Zimmertemperatur über
Nacht mäßig schnell
umgerührt,
bis das Dichlormethan verdampft war. Die Mikrosphären wurden
mehrere Male mit Wasser gewaschen, wobei die Mikrosphären zwischen
den Waschvorgängen
mittels Zentrifugierung gefällt
wurden; anschließend
wurden sie gefriergetrocknet. 123 mg gefriergetrockneter Mikrosphären wurden
in einer Glasphiole zu 2,4 ml 1 mg/ml Influenza A/Beijing93-HA-Antigen
hinzugefügt
und nach Inkubierung über
Nacht bei 4°C gefriergetrockeet.
Die mittlere Volumengröße wurde
mittels Laser-Diffraktionsmessung bestimmt; sie betrug 0,34 μm. Der Proteingehalt
nach der Gefriertrocknung betrug etwa 2% w : w.
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Beispiel 3: Immunogenität HA-eingeschlossener
und -adsorbierter Mikrosphären
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Die wie vorstehend beschrieben hergestellten
HA-eingeschlossenen und -adsorbierten Mikrosphären wurden Mäusen verabreicht,
und nach 28 Tagen erhielten die Tiere eine Auffri schungsimpfung,
wie in Tabelle 1 gezeigt. Es wurde eine Gesamtdosis von 4 μg HAadsorbierte
Mikropartikel verabreicht. Es wurde eine Gesamtdosis von HA-eingeschlossene
Mikropartikel verabreicht. Am Tag 42 wurde Serum gesammelt und auf Gesamt-HIA-
und Gesamt-Ig-Gehalt untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle
1 gezeigt. Wie gesehen werden kann, waren die HA-adsorbierten Mikropartikel
stärker
immunogen als die HA-eingeschlossene Rezeptur.
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Beispiel 4: Herstellung
HA-adsorbierter Mikrosphären
mittels eines Sprühtrocknungsverfahrens
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2% (w : w) Poly(D,L-lactid-co-glykolid)
(Medisorb Technologies International, Molverhältnis Lactid : Glykolid 50
: 50, Molekulargewicht oder -äquivalent
70–100
kDa) in Dichlormethan wurden mit einem Büchi-Minisprühtrockner (Modell B-191) bei
einer Einlaßtemperatur
von 67–68°C, einer
Auslaßtemperatur
von 55°C, einem
Sprühdruck
von 80 PSI und einer Durchflußrate
von 800 l/h sprühgetrocknet.
Die Größe der so
erhaltenen Mikropartikel wurde durch lichtmikroskopische Untersuchung
und Vergleich mit Größenstandards
bestimmt; sie betrug 1–5 μm im Durchmesser.
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450 mg der sprühgetrockneten Mikropartikel
und 9 ml 10% MEGA-10-Detergens (im w : w-Verhältnis MEGA-10 zu Mikropartikel
von 2 : 1) wurden in einen Keramikmörser gegeben. Das Gemisch wurde
mit einem Keramikstößel zerkleinert,
bis ein weicher Brei entstand. Es wurden 22,5 ml phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(PBS) hinzugefügt
und das Gemisch drei Minuten lang bei 25.000 U/min mit einem Tisch-Skalen-Homogenisierer,
mit einem 10mm-Generator homogenisiert, bis die Mikropartikel völlig resuspendiert
waren.
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A/Beijing HA-Massen-Antigen mit 1
mg/ml Proteingehalt, wie mit einem Bicinchoninsäure- (BCA)- Proteintest (Pierce,
Rockford, IL) bestimmt, und mit einer HA-Aktivität von etwa 0,2 mg/ml, wie mit
Radial-Einzelimmundiffusion (SRID) bestimmt, wurde folgendermaßen an die
Mikropartikel adsoriert: 6 ml A/Beijing HA-Massen-Antigen wurden
mit 9,6 ml PBS verdünnt
und dann zu 8,4 ml des Mikropartikelbreies hinzugefügt (Endzusammensetzung:
0,25 mg/ml Protein, 120 mg Mikropartikel, 1% w : v MEGA-10, 5% w
: w- Protein : Partikel-Verhältnis).
Das Gemisch wurde mit einer Zellulose-Dialysemembran mit einem Grenzdurchlassbereich
von einem Molekulargewicht vom 50.000 gründlich gegen PBS dialysiert,
bis das MEGA-10 entfernt war, was durch einen colorimetrischen Test
nachgewiesen wurde. Das Dialysat wurde aus dem Dialyseschlauch entfernt
und zentrifugiert, wodurch man Mikropartikel erhielt. Der Überstand
wurde entfernt und verworfen und die Mikropartikel gewaschen, wobei
die PBS zweimal gewechselt und zwischen den Waschvorgängen zentrifugiert
wurde. Pro Waschvorgang wurden 30 ml PBS verwendet. Die Proteinbeladung
wurde mit Standardverfahren unter Verwendung von BCA bestimmt; sie
betrug ungefähr
1,4% Proteingehalt pro Gewichtseinheit des Mikropartikel.
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Beispiel 5: Immunogenität durch
Sprühtrocknung
hergestellter HA-adsorbierter Mikrosphären
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Um die Immunogenität der in
Beispiel 4 hergestellten Mikropartikel zu testen, wurden Gruppen
von Balb/C-Mäusen
(n = 10) nach dem in Tabelle 2 gezeigten Schema intramuskulär immunisiert.
Erstimpfung und Auffrischung erfolgten im Abstand von einem Monat.
Die Dosierung geschah mit A/Beijing-Antigen auf der Grundlage der
HA-Aktivität
(SRID), entweder als lösliches
Antigen nur in PBS, oder an Mikropartikel oberflächenadsorbiert. Zwei Wochen
und vier Wochen nach der Auffrischungsimpfung wurden Serumproben
genommen und mittels kalorimetrischem ELISA auf ihren spezifischen
A/Beijing-Gesamt-Ig-Titer untersucht. Die Serumproben wurden weiterhin
auf ihre Hämagglutinations-Inhibitionsaktivität (HI) untersucht.
Die Ergebnisse der ELISA- und HI-Tests sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Wie
angegeben, ergab die intramuskuläre
Immunisierung mit HA-adsorbierten Mikropartikeln einen gleich hohen
oder meßbar
höheren
Ig-Titer als die Immunisierung mit HA allein.
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Es wurde gezeigt, daß mit einem
Standard-Mikroverkapselungsverfahren in PLG-Mikropartikel verkapselte
A/Beijing-HA nach intramuskulärer
Verabreichung schwache HI-Antworten
lieferten, was darauf hinweist, daß die Denaturierung von HA
während
des Verkapselungsvorgangs stattfand. Deshalb bietet das Darreichen
des Antigens auf der Oberfläche
von Mikropartikeln Vorteile gegenüber einer Mikroverkapselung
des Antigens und zeigt überraschenderweise
eine Adjuvanswirkung.
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Beispiel 6: Herstellung
PLG-eingeschlossener HSVgD2-Mikrosphären
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Mit einer Lösungsmittelverdampfungstechnik
wurden im allgemeinen wie vorstehend beschrieben, HSVgD2-eingeschlossene
PLG-Mikropartikel hergestellt. Kurz gesagt, wurden die Mikropartikel
mit einer 1% w : w-Antigenladung hergestellt, indem 2 ml Antigenlösung zu
10 ml 5% w : v PLG-Polymerlösung
in Methylchlorid hinzugefügt
und mit einem Silverson-Homogenisierer
bei hoher Geschwindigkeit emulgiert wurden. Die Primäremulsion
wurde dann zu 50 ml destilliertem Wasser mit PVA (10% w : v) hinzugefügt. Das
führte
zur Bildung einer w/o/w-Emulsion, die nochmals 4 Minuten lang bei
hoher Geschwindigkeit homogenisiert wurde. Die so erhaltene Emulsion
wurde bei Zimmertemperatur 12 Stunden lang mit 1000 U/min umgerührt, und
das Methylchlorid wurde verdampfen gelassen. Die Mikropartikel wurden
filtriert, zweimal in destilliertem Wasser gewaschen und lyophilisiert
Beispiel 7: Herstellung PLG-adsorbierter HSVgD2-Mikrosphären Mit
einer Lösungsmittelverdampfungstechnik
wurden leere Mikropartikel hergestellt. Kurz gesagt, wurden die
Mikropartikel mit einer 0% w : w-Proteinladung (leere Mikropartikel
oder Placebo) hergestellt, indem 2 ml gewöhnliche Kochsalzlösung zu
10 ml 10% w : v PLG-Polymerlösung in
Methylchlorid hinzugefügt
und mit einem Silverson-Homogenisierer bei hoher Geschwindigkeit
emulgiert wurde. Die Primäremulsion
wurde dann zu 50 ml destilliertem Wasser mit Polyvinylalkohol (10%
w : v) hinzugefügt.
Das führte
zur Bildung einer w/o/w-Emulsion, die nochmals 4 Minuten lang bei
hoher Geschwindigkeit umgerührt
wurde. Die so erhaltene Emulsion wurde bei Zimmertemperatur 12 Stunden
lang mit 1000 U/min umgerührt,
und das Methylchlorid wurde verdampfen gelassen. Die Mikropartikel
wurden filtriert, zweimal in destilliertem Wasser gewaschen und
lyophilisiert. Die leeren PLG-Mikropartikel wurden zu einer HSVgD2-Proteinlösung hinzugefügt und durch
Schütteln
der Suspension auf einem Reagenzglasschüttler bei Zimmertemperatur
zwei Stunden lang gründlich
gemischt.
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Die Suspension wurde dann bei –80°C eingefroren.
Die eingefrorene Suspension wurde zur Verwendung als assoziierte
HSVgD2-Zubereitung lyophilisiert.
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Beispiel 8: Immunogenität HSVgD2-eingeschlossener
und -adsorbierter Mikrosphären
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Die wie vorstehend beschrieben hergestellten
HSVgD2-eingeschlossenen und -adsorbierten Mikrosphären wurden
an Mäuse
verabreicht, und nach 28 Tagen wurde eine Auffrischung vorgenommen.
Es wurde eine Gesamtmikropartikeldosis von 10 μg verabreicht. Nach 4 und nach
8 Wochen wurden Serumproben genommen und die Ig- und Neutralisationstiter
geprüft.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Wie daraus ersichtlich
ist, ergab an Mikropartikel adsorbiertes HSVgD2 höhere Neutralisationstiter
als die in HSVgD2 eingeschlossenen Mikropartikel Tabelle
3
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Beispiel 9 : Herstellung
Gag-adsorbierter und -eingeschlossener Mikrosphären
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Folgende Lösungen wurden zur Herstellung
Gag-adsorbierter 0,4 μm-Mikropartikelzubereitungen
verwendet:
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- (1) 4% RG 503 PLG (Boehringer Ingelheim) in Dimethylchlorid
- (2) 10% PVA (ICN) in Wasser
- (3) PBS
-
Im einzelnen wurde die interne Emulsion
durch Hinzufügung
von 1,25 ml PBS zu 12,5 ml Polymerlösung und 2,5-minütige Homogenisierung
bei 23 K mit einem IKA-Handhomogenisierer mit einer kleinen Sonde vorgenommen.
Die zweite Emulsion wurde durch Hinzufügung der internen Emulsion
zu 50 ml der PVA-Lösung
und 3-minütige
Homogenisierung mit einem Tischhomogenisierer mit einer 20 mm-Sonde
bei 10 K vorgenommen. Die Emulsion wurde über Nacht weiter gerührt, um
das Lösungsmittel
verdampfen zu lassen. Die gebildeten Mikrosphären wurden durch ein 38 μ-Netz gefiltert,
dessen Größe im Malvern
Master-Größenbestimmer
eingestellt worden war, dann durch Zentrifugierung drei Mal mit
Wasser gewaschen und lyophilisiert.
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P24 gag wurde folgendermaßen an die
Mikrosphären
adsorbiert:
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a) 5% adsorbierte Mikrosphären
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200 mg lyophilisierte Placebo-Mikrosphären wurden
mit 80 ml 0,25 mg/ml P24gag-Protein in PBS unter Schaukeln über Nacht
bei Zimmertemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Mikrosphären zentrifugiert
und der Überstand
mit BCA auf seine gag-Konzentration getestet, um die adsorbierte
Menge zu bestimmen. Die Mikrosphären
wurden einmal mit PBS gewaschen und lyophilisiert. Die lyophilisierten
Mikrosphären wurden
mit weiteren 40 ml 0,25 mg/ml P24 gag in PBS unter Schaukeln bei
Zimmertemperatur über
Nacht inkubiert. Am nächsten
Tag wurden die Mikrosphären
zentrifugiert und der Überstand
mittels BCA auf Protein überprüft. Die
Mikrosphären
wurden einmal mit PBS gewaschen und lyophilisiert. Die lyophilisierten
Mikrosphären
wurden mittels Basenhydrolyse auf adsorbiertes Gesamtprotein analysiert.
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b) 1% adsorbierte Mikrosphären
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100 mg 0,4 μm-Placebo-Mikrosphären wurden
mit 10 ml 0,2 mg/ml P24gag in PBS unter Schaukeln über Nacht
bei Zimmertemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Mikrosphären zentrifugiert
und der Überstand
mit BCA auf Protein getestet. Die Mikrosphären wurden einmal mit PBS gewaschen,
lyophilisiert und mittels Basenhydrolyse auf adsorbiertes Protein
analysiert.
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Beispiel 10: Immunogenität Gag-adsorbierter
Mikrosphären
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Die wie in Beispiel 9 beschrieben
hergestellten Gag-adsorbierten Mikrosphären sowie gag-verkapselte Mikrosphären und
Leermikrosphären
als Kontrolle wurden wie vorstehend beschrieben Mäusen verabreicht und
die CTL-Aktivität
zwei Wochen nach der Endimmunisierung geprüft. Wie in den Tabellen 4 und
5 gezeigt, induzierten Mikropartikel mit an der Oberfläche überbrachtem
gag (1%) die CTL-Aktivität,
während
die gleiche Menge in biologisch abbaubare Partikel verkapseltes
gag dies nicht bewirkte. 5% oberflächenadsorbiertes gag war auch
besser für
die Induzierung von CTL-Aktivität
als eingeschlossenes Protein.
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Damit ist die Anwendung antigenadsorbierter
Mikropartikel zur Stimulierung der zellvermittelten Immunantworten,
wie auch Verfahren zur Herstellung der Mikropartikel offenbart.
Obwohl bevorzugte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ziemlich detailliert beschrieben wurden,
versteht es sich, daß offensichtliche
Variationen davon ausgeführt
werden können,
ohne von der Idee und vom Schutzbereich der Erfindung, wie in den
anhängenden
Patentansprüchen
definiert, abzuweichen.