JP2001511148A

JP2001511148A - 免疫応答を刺激するための吸着された抗原を有するマイクロパーティクルの使用

Info

Publication number: JP2001511148A
Application number: JP53306798A
Authority: JP
Inventors: オハーガン，デレク; バンネスト，ギャリー; エス．オット，ギャリー; バラックマン，ジョン; カザズ，ジーナ
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1997-01-30
Filing date: 1998-01-29
Publication date: 2001-08-07
Anticipated expiration: 2018-01-29
Also published as: CA2279204A1; DK0991403T3; US7597908B2; ATE235890T1; US20100021548A1; JP5037747B2; US20030049298A1; AU6255798A; DE69812941D1; EP0991403B1; DE69812941T2; ES2195317T3; NZ337054A; EP0991403A1; JP2009102338A; CA2279204C; PT991403E; AU747577B2; HK1023507A1; WO1998033487A1

Abstract

(57)【要約】吸着された抗原を用いるポリ(ラクチド)またはポリ(ラクチド-コ-グリコリド)マイクロパーティクルの使用が開示される。マイクロパーティクルは、選択された抗原に対するCTL応答の増強に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】免疫応答を刺激するための吸着された抗原を有するマイクロパーティクルの使用技術分野本発明は、一般にワクチン組成物に関する。特に、本発明は免疫学的応答を刺激するための吸着された抗原を用いるマイクロパーティクルの使用、およびマイクロパーティクルを作製する方法に関する。背景多くの薬学的組成物は、活性、抗原力を増加させるための、そして処方物の安定性を向上させるためのアジュバントを含む。この点において、ワクチン組成物はしばしば、細胞媒介性および体液性の免疫応答を増強するための免疫学的アジュバントを含む。例えば、投与された抗原を吸着および／または沈殿させる貯蔵アジュバント、ならびに抗原を注入部位に保持するように働く貯蔵アジュバントがしばしば使用される。代表的な貯蔵アジュバントは、アルミニウム化合物および油中水エマルジョンを含む。しかしながら、貯蔵アジュバントは、抗原性を増加させるが、皮下注射又は筋肉注射された場合、しばしば重篤な持続性の局所反応(例えば、肉芽腫、膿瘍、および傷)を引き起こす。他のアジュバント、例えばリポ多糖類およびムラミルジペプチドは、注入の際の発熱応答および／またはライター症状(インフルエンザ様症状、全身性の関節不快感、ならびに時には前部ブドウ膜炎、関節炎、および尿道炎)を誘発し得る。このようなアジュバントの存在にもかかわらず、従来のワクチンは、しばしば標的病原体に対する適切な防御を提供し損なう。この点において、細胞内病原体 (例えば多数のウイルス)に対するワクチン接種が免疫系の細胞性および体液性部門の両方を標的とする証拠は増大している。より詳細には、細胞毒性Ｔリンパ球(CTL)は、ウイルスおよび悪性細胞により産生される腫瘍特異的抗原のような細胞内病原体に対する細胞媒介免疫防御において、重要な役割を果たす。CTLは、ウイルス感染した細胞により示されるクラスI MHC分子に関連して、ウイルス決定因子を認識することにより感染した細胞の細胞毒性を媒介する。タンパク質の細胞質内発現は、CTLに対する抗原ペプチドのクラスI MHCプロセシングおよび提示のために必須である。しかしながら、死滅または弱毒ウイルスでの免疫は、しばしば細胞内感染を抑制するために必要なCTLを産生し損なう。その上さらに、顕著な遺伝的異質性および／または免疫回避変異体(例えば、HIVまたはインフルエンザ)の選別を容易にする急速な変異速度を示すウイルスに対する従来のワクチン技術には、問題がある。従って、ワクチン接種に代わる技術が開発されてきた。吸着されるかまたは捕獲された抗原を用いる特定のキャリアが、適切な免疫応答を誘発する試みに使用されてきた。そのようなキャリアは、免疫系への選択された抗原の多数の複製物を表し、そして局所リンパ節において抗原の捕獲および保持を促進する。粒子はマクロファージにより食菌され得、そしてサイトカイン放出を介して抗原提示を増強させ得る。粒子キャリアの例は、ポリメチルメタクリレートポリマー由来のもの、ならびにポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド-コ -グリコリド)(PLGとして公知)由来のマイクロパーティクルを含む。ポリメチルメタクリレートポリマーは非分解性であるが、PLG粒子は、乳酸とグリコール酸とのエステル結合の不規則な非酵素的加水分解により生分解性であり、これらは通常の代謝経路に沿って排出される。近年の研究は、捕獲された抗原を用いるPLGマイクロパーティクルが細胞媒介免疫を誘発し得ることを示している。例えば、マイクロカプセル化ヒト免疫不全ウイルス(HIV)gp120は、HIV-特異的CD4+およびCD8+ Ｔ細胞応答を、マウスにおいて誘導することが示されている(Mooreら、Vaccine（1995）13：1741〜1749)。さらに、抗体およびＴ細胞応答の両方が、PLG-捕獲Mycobacterium tuberculosis 抗原でワクチン接種されたマウスにおいて誘導される(Vordermeierら、Vaccine （1995）13：1576〜1582)。他のより毒性のシステムを越える有意な利点を提供しながらも、抗原-捕獲PLG マイクロパーティクルはいくつかの欠点を持っている。例えば、マイクロパーティクルの製造は困難であり、そして、抗原を変質させてその免疫原性を破壊し得る、あらい化学物質の使用を含む。その上さらに、抗原の不安定性が、小さいマイクロパーティクルを調製するために使用される高剪断力により、そして使用されるエマルジョン内の界面効果により、生じ得る。マイクロパーティクルに吸着された抗原の使用は、これらの欠点を避ける。しかしながら、吸着された抗原を用いるマイクロパーティクルの免疫原性における報告は、雑多であった。実際、実験者は、適切なアジュバントの効果を達成するために抗原はマイクロパーティクル内に捕獲されていなければならないと仮定していた。例えば、Eldridgeら、Infect．Immun．（1991）59：2978〜2986；Eld ridgeら、Seminars in Hematology（1993）30：16〜25；Nakaokaら、J．Control led Release（1995）37：215〜224；Sahら、J．Controlled Release（1995）35 ：137〜144；およびDuncanら、Mucosal Vaccines「Poly(lactide-eo-glycolide) Microencapsulation of Vaccines for Mucosal Immunization」(Academic Press ，Inc.、1996)を参照のこと。より詳細には、マイクロパーティクル-カプセル化およびマイクロパーティクル-吸着オボアルブミンは、インビボで細胞性免疫応答を開始し、そして経口投与された場合に粘膜IgA応答を誘導することが示されている。しかしながら、捕獲された抗原は、吸着された抗原よりも良好な応答を誘発した(O'Haganら、Vacc ine（1993）11：149〜154)。Coombesら、Vaccine（1996）14：1429〜1438もまた、オボアルブミン-カプセル化およびオボアルブミン-吸着マイクロパーティクルの両方を用いる実験を記載している。吸着された抗原に対する抗体応答は、捕獲オボアルブミンの投与により誘発されたものよりも顕著に低かった。最後に、抗原特異的CTL応答が、生分解性ミクロスフィア内にマイクロカプセル化されるか、または空のミクロスフィアに吸着された、Plasmodium bergheiのスポロゾイト周囲タンパク質(cicumsporozite protein)由来の短い合成ペプチドを使用してマウスにおいて報告されている(Menら、Vaccine（1997）15：1405〜1312)。しかしながら、上記の研究のいずれも、ウイルス抗原を使用する、細胞媒介免疫応答を刺激するための抗原吸着マイクロパーティクルの使用を記載していない。従って、種々の薬学的組成物およびワクチンにおいて使用するための効果的かつ安全なアジュバントの必要が依然として存在する。発明の要旨本発明者らは、驚くべきことに、選択したウイルス抗原をポリ(α-ヒドロキシ酸)由来のマイクロパーティクルに吸着させることが、優れた免疫応答を提供することを本明細書中において見いだした。従って、次いで、本発明は第一に、このようなマイクロパーティクルを含む方法および組成物、ならびにそれらを製造するためのプロセスに関する。吸着された抗原を用いるマイクロパーティクルの使用は、広範で多様な抗原の免疫原性を増強するための安全かつ効果的なアプローチを提供する。従って、１つの実施態様において、本発明はポリ(α-ヒドロキシ酸)マイクロパーティクルに吸着された、選択されたウイルス抗原および薬学的に受容可能な賦形剤を含む組成物に関する。さらなる実施態様において、本発明は、脊椎動物被験体に治療的有効量である上記のマイクロパーティクル組成物を投与する工程を包含する、免疫の方法に関する。よりさらなる実施態様において、本発明は脊椎動物被験体において細胞性免疫応答を誘発するための方法に関し、この方法は、脊椎動物被験体にポリ(α-ヒドロキシ酸)マイクロパーティクルに吸着された、治療的有効量の選択されたウイルス抗原を投与する工程を包含する。なおさらなる実施態様において、本発明は以下を包含する組成物の製造法に関する：（a）ウイルス抗原を提供する工程；（b）ウイルス抗原をポリ(α-ヒドロキシ酸)マイクロパーティクルに吸着させる工程；および（c）吸着された抗原を有するマイクロパーティクルを薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせる工程。特に好適な実施態様において、上記のマイクロパーティクルはポリ(D,L-ラクチド-コ-グリリド)から形成される。本発明のこれらのおよび他の実施態様は、本明細書での開示の観点から当業者に容易に想到する。発明の詳細な説明本発明の実践は、他に指示されない場合、当該分野技術範囲内の、従来の化学的、生化学的、分子生物学的、免疫学的、および薬理学的方法を用いる。このような技術は文献中に十分に説明されている。例えば、以下を参照のこと：Reming ton's Pharmaceutical Sciences、第18版(Easton、Pennsylvania:Mack Publishi ng Company、1990)；Methods In Enzymology(S．ColowickおよびN．Kaplan、編、Academic Press，Inc.)；およびHandbook of Experimental Immunology、第I 〜IV巻(D．M．WeirおよびC．C．Blackwell、編、1986、Blackwell Scientific P ublications)；およびSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual( 第２版、1989)。本明細書中および添付の請求の範囲で使用されるように、単数形「a」「an」および「the」は、内容が明らかにその他の指示をしない場合、複数の参照を含む。Ａ．定義本発明の記載において、以下の用語が用いられ、そしてこれらは以下に示されるように定義されることを意図される。本明細書中で使用されるように用語「マイクロパーティクル」は、直径約100n m〜約150μｍの粒子、より好ましくは直径約200nm〜約30μｍの粒子、そして最も好ましくは直径約500nm〜約10μｍの粒子を示す。好ましくは、マイクロパーティクルは注射針およびキャピラリーを閉塞することなく非経口投与し得る直径のものである。マイクロパーティクルのサイズは、当該分野で周知の技術(例えば、光子相関分光法、レーザー回折測定、および／または走査型電子顕微鏡法) により容易に決定される。本明細書中で使用するためのマイクロパーティクルは、滅菌可能、非毒性、かつ生分解性である物質から形成される。そのような材料は、ポリ(α-ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物を含むが、これらに限定されない。好ましくは、本発明とともに使用するためのマイクロパーティクルは、ポリ(α-ヒドロキシ酸)由来、特に、ポリ(ラクチド)(「PLA」)、またはD,L-ラクチドとグリコリドもしくはグリコール酸とのコポリマー(例えば、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)(「PLG」もしくは「PLG A」))、またはD,L-ラクチドとカプロラクトンとのコポリマー由来である。マイクロパーティクルは、種々の分子量を有し、そしてPLGのようなコポリマーの場合において、種々のラクチド：グリコリド比を有する、任意の様々なポリマー出発物質由来であり得、これらの選択は、一部は同時投与される抗原に依存するが、大部分は選び方の問題である。これらのパラメータは以下でより十分に記載される。「抗原」により、宿主の免疫系を刺激して、抗原が存在するかまたは体液性抗体応答が存在する場合に、細胞性抗原特異的免疫応答を起こす、１つ以上のエピトープを含む分子が意味される。通常、エピトープは約３〜15の間の、一般には約５〜15のアミノ酸を含む。本発明の目的のために、抗原は、任意の複数の公知のウイルス由来であり得る。その上さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、タンパク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、ネイティブ配列に対する改変、例えば欠損、付加、および置換(一般に本質的に保存的)を含むタンパク質を示す。これらの改変は、位置指定突然変異誘発を介しての様に、故意であり得るか、または抗原を産生する宿主の突然変異を介しての様な偶然であり得る。抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物に存在する分子に対する、体液性および／または細胞性免疫応答の被験体における発達である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は、抗体分子により媒介される免疫応答を示すが、一方「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介されるものである。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞傷害性Ｔ細胞(「CTL」)による抗原特異的応答を含む。CTLは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)によりコードされるタンパク質と関連して存在しそして細胞表面で発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。CTLは、細胞内微生物の細胞内駆除、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導および促進を助ける。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、MHC分子と関連してそれらの表面上でペプチド抗原を示す細胞に対する非特異的エフェクター細胞の、機能の刺激を助けるように、そして活性の的を絞るのを助けるように振る舞う。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球(C D4+およびCD8+Ｔ細胞由来のものを含む)により産生される、他のそのような分子の産生を示す。細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面においてMHC分子と共に抗原が存在することにより、脊椎動物被験体を感作させ得る。細胞媒介免疫応答は、その表面に抗原が存在している細胞に指向される（directed）か、または近い。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫宿主の将来的保護を可能にするために産生され得る。特定の抗原または組成物の、細胞媒介免疫学的応答を刺激する能力は、多数のアッセイ（例えばリンパ球増殖(リンパ球活性化)アッセイ、CTL細胞毒性アッセイにより、または感作された被験体における抗原に対して特異的なＴリンパ球をアッセイすること）により、測定され得る。そのようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ericksonら、J．Immunol．（1993）151：4189〜4199；Doe ら、Eur．J．Immunol．（1994）24：2369〜2376；および以下の実施例を参照のこと。従って、本明細書中で使用される免疫学的応答は、CTLの産生および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介免疫応答を引き出し得る。これ故に、免疫学的応答は、１つ以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるいは目的の組成物またはワクチン中に存在する抗原(単数または複数)を特異的に指向するサプレッサーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染力を中和するのに、ならびに／または抗体補体、もしくは免疫宿主に対する保護を提供するための抗体依存性細胞傷害(ADCC)を媒介するのに役に立ち得る。そのような応答は、当該分野で周知の標準免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して測定され得る。マイクロパーティクルに吸着された選択された抗原を含むワクチン組成物は、マイクロパーティクルと会合することなく誘導体化された場合の同当量の抗原により誘発される免疫応答よりも免疫応答を誘発する強い能力を有する場合、「増強された免疫原性」を示す。従って、ワクチン組成物は「増強された免疫原性」を示し得る。なぜなら、抗原がマイクロパーティクルへの吸着のおかげでより強力な免疫原性であるからか、または抗原が投与される被験体において免疫応答を達成するために、より少ない用量の抗原が必要だからである。このような増強された免疫原性は、マイクロパーティクル／抗原組成物および抗原コントロールを動物に投与し、そして放射免疫アッセイおよびELISAのような当該分野で周知の標準的アッセイを使用して２つに対する抗体力価を比較することにより測定され得る。本明細書中で提供されるように、抗原／マイクロパーティクルの、用語「有効量」または「薬学的有効量」は、非毒性の、しかし所望の免疫学的応答および対応する治療効果を提供するために十分な量の抗原／マイクロパーティクルを示す。以下で指摘されるように、必要とされる正確な量は、種、年齢、および被験体の一般的な状態、処置される状態の重篤度、ならびに目的の特定の抗原、投与の形態などに依存して、被験体ごとに変化する。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、日常的実験操作を使用して当業者により決定され得る。「脊椎動物被験体」は、任意の数のクロダタ(cordata)亜門を意味し、以下を含むがこれらに限定されない：ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、およびヒトのような哺乳動物；イヌおよびネコのような飼育動物；ならびに、飼育、野生、および狩猟鳥類を含む鳥類(ひな鳥、七面鳥、および他のキジ類のトリを含む、雄鳥および雌鳥など)。この用語は特定の年齢を示さない。従って、成体および新生の動物の両方が包含されることを意図する。「薬学的に受容可能な」または「薬理学的に受容可能な」は、生物学的にまたはその他において望ましくないことはない材料を意味する。すなわちこの材料は、任意の望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく、または心身に有害な様式でそれが含まれる組成物の任意の成分と相互作用することなくマイクロパーティクルの処方物とともに個体に投与され得る。「生理学的pH」または「生理学的範囲におけるpH」は、両端を含めほぼ7.2〜8 .0の範囲内のpHであり、より代表的には両端を含めほぼ7.2〜7.6の範囲内のpHである。本明細書中で使用されるように、「処置」は、以下のいずれかを示す：(i)伝統的なワクチンにおけるような、感染または再感染の予防；(ii)症状の緩和または消去；および(iii)問題の病原体の実質的または完全な除去。処置は、予防的( 感染前)または治療的(感染後)に成し遂げられ得る。Ｂ．一般的方法本発明の中心は、吸着ウイルス抗原を用いるPLAマイクロパーティクルおよびP LGマイクロパーティクルが脊椎動物被験体において細胞媒介免疫応答を生成し得るという発見である。本発明の抗原／マイクロパーティクルの、選択された抗原に対する細胞媒介免疫応答を誘発する能力は、広範なウイルスによる感染に対する強力な武器を提供する。本発明の抗原／マイクロパーティクルは、ワクチン組成物に組み込まれ得る。その上さらに、本発明のアジュバント処方物が、インビボで、すなわちDNA免疫と共に産生される抗原の活性を向上させるために使用され得る、本明細書中で記載されるワクチン組成物の個々の成分および方法は公知であったが、そのような組合せが、成分が別々に使用された場合に達成されるレベルを超える強力な細胞媒介免疫応答を生成するということは予期せぬことでありまた驚くべきことであった。従って、従来の抗体応答に加えて、本明細書中で記載されるシステムは、例えば、抗原の将来的認識を可能にするためのCTLの産生を刺激する、目的の抗原に対するインビボでの細胞性免疫応答が取り付けられ得るような、発現した抗原とクラスI MHC分子との会合を提供し得る。その上さらに、この方法は、ヘルパーＴ細胞により抗原特異的応答を誘発し得る。従って、本発明の方法は、それに対する細胞性および／または体液性免疫応答が望ましい任意の抗原を用いる使用を見いだし、抗体、Ｔ細胞ヘルパーエピトープ、およびＴ細胞細胞毒性エピトープを誘導し得るウイルス病原体由来の抗原を含む。このような抗原は、ヒトウイルスおよび動物ウイルスによりコードされるものを含むがこれらに限定されず、そして構造または非構造タンパク質のいずれかに対応し得る。この技術は、通常は弱い免疫応答を誘発する細胞内ウイルスに対する免疫のために特に有用である。例えば、本発明は、ヘルペスウイルスファミリー由来の広範なタンパク質に対する免疫応答を刺激するための使用を見いだし、以下を含む：単純ヘルペスウイルス(HSV)タイプ１および２由来のタンパク質、例えばHSV-1 およびHSV-2グルコタンパク質gB、gD、およびgH；水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、エプシュタイン-バールウイルス(EBV)、およびサイトメガロウイルス(CMV)由来の抗原であって、CMV、gB、およびgHを含む；ならびにHHV6およびHHV7のような他のヒトヘルペスウイルス由来の抗原。（例えば以下を参照のこと：Cheeら、Cy tomegaloviruses(J．K．McDougall編、Springer-Verlag 1990)125〜169頁、サイトメガロウイルスのタンパク質コード内容物（protein coding content）の総説として；McGeochら、J．Gen．Virol．（1988）69：1531〜1574、種々のHSV-1コードタンパク質の議論として；米国特許第5,171,568号、HSV-1およびHSV-2のgB およびgDタンパク質、ならびにそれらをコードする遺伝子についての議論として；Baerら、Nature（1984）310：207〜211、EBVゲノムにおけるタンパク質コード配列の同定について；ならびにDavisonおよびScott、J．Gen．Virol．（1986）6 7 ：1759〜1816、VZVの総説として。）肝炎ウイルスファミリー(A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、δ型肝炎ウイルス(HDV)、E型肝炎ウイルス(HEV)、およびG 型肝炎ウイルス(HGV)を含む)由来の抗原はまた、本明細書中で記載される技術において都合良く使用され得る。例として、HCVのウイルスゲノム配列は、配列を得るための方法であるとして公知である。例えば、国際公開広報第WO 89/04669 号；WO 90/11089号；およびWO 90/14436号を参照のこと。HCVゲノムは、いくつかのウイルスタンパク質をコードし、E1(Eとしてもまた知られる)およびE2(E2/N SIとしてもまた知られる)ならびにN-末端ヌクレオカプシドタンパク質(「コア」と呼ばれる)を含む（E1およびE2を含むHCVタンパク質の議論として、 Houghtonら、Hepatology（1991）14：381〜388を参照のこと）。これらのタンパク質、ならびにそれらの抗原性フラグメントの各々は本発明の方法において使用を見いだす。同様に、HDV由来のδ-抗原に対する配列が公知であり(例えば、米国特許第5,3 78,814号を参照のこと)、そしてこの抗原はまた、本発明の方法において都合良く使用され得る。さらに、HBV由来の抗原、例えばコア抗原、表面抗原、sAg、ならびにプレサーフェイス(presurface)配列、pre-S1およびpre-S2(以前はpre-Sと呼ばれる)、ならびに上記の組合せ、例えばsAg／pre-S1、sAg／pre-S2、sAg／pr e-S1／pre-S2、およびpre-S1／pre-S2が、本明細書中で使用を見いだす。例えば以下を参照のこと：Mackett、M．およびWilliamson、J．D．、Human Vaccines a nd Vaccination、159〜176頁の「HBVワクチン-研究所から認可へ：事例研究」（ HBVの構造の議論について）；および米国特許第4,722,840号、第5,098,704号、第5,324,513号；Beamesら、J．Virol．（1995）69：6833〜6838、Birnbaumら、J ．Virol．（1990）64：3319〜3330；ならびにZhouら、J．Virol．（1991）65：5 457〜5464。他のウイルス由来の抗原もまた、請求される方法において使用を見いだし、例えば、以下のメンバー由来のタンパク質：ピコルナウイルス科(例えば、ポリオウイルスなど)；カルシウイルス科；トガウイルス科(例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど)；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科(Rhabodoviridae)(例えば、狂犬病ウイルスなど)；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科(例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど)；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスタイプＡ、Ｂ、およびＣなど)；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科(例えば、HTLV-1；HTLV-II；HI V-1(HTLV-III、LAV、ARV、hTLR、などとしても知られる))、単離したHIV_lllb、H IV_SF2、HIV_LAV、HIV_LAI、HIV_MN由来の抗原を含むがこれらに限定されない)；HIV -1_CM235、HIV-1_US4；HIV-2；他のもののうちのサル免疫不全ウイルス(SIV)が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、抗原はまた、ヒトパピローマウイルス(HPV)およびダニ媒介脳炎ウイルス由来であり得る。例えば、以下を参照のこと；Virology、第３版(W．K．Joklik編、1988)；Fundamental Virology、第２版(B．N．FieldsおよびD．M．Knipe、編、1991)(これらのおよびその他のウイルスについての記載として)。より詳細には、HIVの種々の遺伝子亜類型のメンバーを含む、上記の単離HIVのいずれか由来のgp120エンベロープタンパク質が、公知でありそして報告されており(例えば、以下を参照のこと；Myersら、Los Alamos Database、Los Alamos National Laboratory、Los Alamos、New Mexico(1992)；Myersら、Human Retrov iruses and Aids、1990、Los Alamos、New Mexico：Los Alamos National Labor atory；およびModrowら、J．Virol．（1987）61：570〜578、種々の単離HIVのエンベロープ配列の比較について)、そしてこれらの単離体のいずれかに由来する抗原が、本発明の方法において使用を見いだす。その上さらに、本発明は、任意の種々のエンベロープタンパク質(例えば、gp160およびgp41、p24gagおよびp55g agのようなgag抗原、ならびにpol領域由来のタンパク質)を含む、種々の単離HIV のいずれか由来の他の免疫原性タンパク質に、等しく応用可能である。上記に説明されるように、インフルエンザウイルスは本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。特に、インフルエンザＡのエンベロープグルコタンパク質HAおよびNAは免疫応答を生成するので、特別な関心を集めている。インフルエンザＡの多数のHA亜類型が同定されてきた(Kawaokaら、Virology（1990）179 ：759〜767；Websterら、「タイプＡインフルエンザウイルスにおける抗原変異」127〜168頁：P．PaleseおよびD．W．kingsbury(編)、Genetics of influenza viruses．Springer-Verlag、New York)。従って、これらの単離体のいずれか由来のタンパク質がまた、本明細書中で記載される免疫技術に使用され得る。本発明が、広範な抗原に対する免疫応答を持たせるために、そしてそれ故に多数の疾患を処置または予防するために使用され得ることは容易に明らかとなる。選択された抗原は、引き続く送達のためにマイクロパーティクルに吸着される。本発明とともに使用するためのマイクロパーティクルを製造するための生分解性ポリマーは、例えば、Boehringer Ingelheim、Germany and Birmingham P olymers、Inc.、Birmingham、ALから市販で容易に入手可能である。例えば、本明細書中のマイクロパーティクルを形成するために有用なポリマーは、以下から由来するものを含む；ポリヒドロキシ酪酸；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；ポリ無水物；ならびにポリ(α-ヒドロキシ酸)(例えば、ポリ(L-ラクチド)、ポリ(D,L-ラクチド)(両方とも本明細書中で「PLA」として知られる)、ポリ (ヒドロキシブチレート))、D,L-ラクチドおよびグリコリドのコポリマー(例えば、ポリ(D,L-ラクチド-co-グリコリド)(本明細書中で「PLG」または「PLGA」として示される)、またはD,L-ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマー。本明細書中で使用するために特に好ましいポリマーは、PLAおよびPLGポリマーである。これらのポリマーは種々の分子量において入手可能であり、そして所定の抗原に対して適切な分子量が、当業者により容易に決定される。従って、例えば、PLA については適切な分子量は約2000〜5000のオーダーである。PLGについては、適切な分子量は一般に、約10,000〜約200,000の範囲であり、好ましくは約15,000 〜約150,000であり、そしてもっとも好ましくは約50,000〜約100,000である。 PLGのようなコポリマーがマイクロパーティクルを形成するために使用される場合、種々のラクチド：グリコリド比が本明細書中で使用を見いだし、そしてこの比は同時投与される抗原および所望される分解速度に一部依存するが、大きくは選び方の問題である。例えば、50：50のPLGポリマー(50％のD,L-ラクチドおよび50％のグリコリドを含む)は、速い再吸収コポリマーを提供するが、一方75：2 5のPLGは、増加したラクチド成分のために、よりゆっくりと分解し、そして85： 15および90：10はよりいっそうゆっくりと分解する。ラクチド：グリコリドの適切な比が、問題の抗原および疾患の性質に基づいて、当業者により容易に決定されることは、容易に明らかである。その上さらに、種々のラクチド：グリコリドの比を用いるマイクロパーティクルの混合物が、所定の抗原に対する所望の放出速度を達成するために、そして一次および二次免疫応答の両方を提供するために、処方物において使用が見出される。本発明のマイクロパーティクルの分解速度はまた、ポリマー分子量およびポリマー結晶性のような因子により制御され得る。種々のラクチド：グリコリドの比および分子量を持つPLGコポリマーは、Boehringer Ingelheim、Germany and Birmingham Polymers 、Inc.、Birmingham、ALを含む多数の供給源により市販で容易に入手し得る。これらのポリマーはまた、Tabataら、J．Biomed．Mater．Res．（1988）22：837〜 858において記載されているような、当該分野で周知の技術を使用して、乳酸成分の単純重縮合により合成され得る。抗原含有マイクロパーティクルは、当該分野で周知のいくつかの方法のいずれかを使用して調製される。例えば、米国特許第3,523,907号およびOgawaら、Chem ．Pharm．Bull．（1988）36：1095〜1103において記載されるような、二重乳濁液／溶媒エバポレート技術がマイクロパーティクルを作成するために本明細書中で使用され得る。これらの技術は、ポリマー溶液の液滴からなる第一の乳濁液の形成、続いてそれを粒子安定剤／界面活性剤を含む連続した水相と混合する工程を含む。より詳細には、O'Haganら(Vaccine（1993）11：965〜969)およびJefferyら(Ph arm．Res．（1993）10：362)に記載されるように、水中油中水(w／o／w)溶媒エバポレート系がマイクロパーティクルを形成するために使用され得る。この技術において、特定のポリマーが有機溶媒(例えば、酢酸エチル、ジメチルクロリド( 塩化メチレンおよびジクロロメタンとも呼ばれる)、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなど)と合わせられる。ポリマーは、約２〜15％、より好ましくは約４〜10％、そして最も好ましくは６％の有機溶媒溶液で提供される。ポリマー溶液は、例えばホモジナイザーを使用して乳濁化される。次いで、乳濁液は大量の乳濁液安定剤(例えば、ポリビニルアルコール(PVA)またはポリビニルピロリドン)の水溶液と合わせられる。乳濁液安定剤は、代表的には約２〜15％溶液で、より代表的には約４〜10％溶液で提供される。次いで、混合物はホモジナイズされて安定なw／o／w二重乳濁液を生成する。次いで、有機溶媒をエバポレートする。処方物のパラメーターは、小さい(＜５μm)および大きい(＞30μm)マイクロパーティクルを調製し得るために操作され得る。例えば、Jefferyら、Pharm．Res ．（1993）10：362〜368;McGeeら、J．Microencap．(1996)を参照のこと。例えば、撹拌の減少は、内部相容量における増加を行うにつれて、より大きいマイクロパーティクルを生成する。小さい粒子は、高濃度のPVAを持つ低量の水相により生成される。マイクロパーティクルはまた、以下において記載されるような、噴霧-乾燥およびコアセルベーションを使用して形成され得る；例えば、Thomasinら、J．Con trolled Release（1996）41：131；米国特許第2,800,457号；Masters、K．（197 6）Spray Drying第２版、Wiley、New York；Hallら、(1980)「Wurster Process 」(Controlled Release Technonlogies:Methods，Theory，and Applications(A ．F．Kydonieus編)、第２巻、133〜154頁、CRC Press、Boca Raton、FloridaおよびDeasy、P．B．、Crit．Rev．Ther．Drug Carrier Syst．（1988）S(2)：99 〜139)により記載されるように、パンコーティング(pan coating)およびウースターコーティング(Wurster coating)のような、気中懸濁コーティング技術；および、例えば、Limら、Science（1980）210：908〜910により記載されるようなイオン性ゲル化。粒子サイズは、例えばヘリウム-ネオンレーザーを組み込んだ分光器を使用して、例えばレーザー光散乱により測定され得る。一般に、粒子サイズは室温で測定され、そして粒子の直径に対する平均値を得るために問題のサンプルの多数の分析(例えば、５〜10回)を含む。粒子サイズはまた、走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して容易に測定される。調製に続いて、マイクロパーティクルは将来の使用のためにそのままでまたは凍結乾燥されて保存され得る。抗原をマイクロパーティクルに吸着させるために、マイクロパーティクルの調製物は目的の抗原と単に混合され、そして生成する処方物は使用前に再び凍結乾燥され得る。マイクロパーティクルのタンパク質含有量は標準的技術を使用して測定され得る。抗原を調製したマイクロパーティクルに吸着させるための特に好ましい方法は、以下の通りである。マイクロパーティクルは再水和され、そして透析可能な界面活性剤を使用して、マイクロパーティクルの本質的に単量体である懸濁液に分散される。有用な界面活性剤は以下を含むが、それらに限定されない；種々のN- メチルグルカミド(MEGAとして知られる)のいずれか(例えば、ヘプタノイル-N-メチルグルカミド(MEGA-7)、オクタノイル-N-メチルグルカミド(MEGA-8) 、ノナノイル-N-メチルグルカミド(MEGA-9)、およびデカノイル-N-メチルグルカミド(MEGA-10))；コール酸；コール酸ナトリウム；デオキシコール酸；デオキシコール酸ナトリウム；タウロコール酸；タウロコール酸ナトリウム；タウロデオキシコール酸；タウロデオキシコール酸ナトリウム；3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパン-スルホネート(CHAPS)；3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパン-スルホネート(CHAP SO)；N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパン-スルホネート(ZWITTE RGENT 3-12)；N,N-ビス-(3-D-グルコンアミドプロピル)-デオキシコールアミド( DEOXY-BIGCFIAP)；N-オクチルグルコシド；モノラウリン酸スクロース；グリココール酸／グリココール酸ナトリウム；ラウロサルコシン(ナトリウム塩)；グリコデオキシコール酸／グリコデオキシコール酸ナトリウム。上記の界面活性剤は、例えば、Sima chemical Co.(St．Louis MO)から市販されている。一般に、約0 .0156：１の比の界面活性剤対マイクロパーティクル(w：w)が、より好ましくは約0.625：１、さらにより好ましくは約0.25：１、そして最も好ましくは約１：１〜２：１の比の界面活性剤対マイクロパーティクル(w：w)が使用される。次いで、マイクロパーティクル／界面活性剤混合物は、例えば、セラミックの乳鉢および乳棒を使用して、なめらかなスラリーが形成されるまで、物理的に粉砕される。次いで、適切な水性緩衝液(例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)またはトリス緩衝化生理食塩水)を加え、そして得られる混合物を、マイクロパーティクルが完全に懸濁するまで超音波処理またはホモジナイズする。次いで、目的の抗原をマイクロパーティクル懸濁液に加え、そして系を透析して界面活性剤を除去する。ポリマーマイクロパーティクルおよび界面活性剤系は、好ましくは、目的の抗原が抗原の活性を依然維持したままでマイクロパーティクル表面に吸着するように選択される。生成する表面に吸着した抗原を含むマイクロパーティクルは結合していない抗原を含まないように洗浄され得、そして適切な緩衝液処方物中で懸濁液として保存されるか、または以下にさらに記載されるように、適切な賦形剤とともに凍結乾燥される。一旦、抗原／マイクロパーティクルが生成されると、上記に記載されるような広範な種々のウイルス疾患を処置および／または予防するために、それらはワクチン組成物中に処方される。一般に、組成物は１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」(例えば水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど)を含む。さらに、補助物質(例えば、湿潤剤または乳化剤、生物学的緩衝物質など)がそのようなビヒクル中に存在し得る。生物学的緩衝液は、薬理学的に受容可能であり、そして所望のpH、すなわち生理学的な範囲の中のpHを持つ処方物を提供する事実上任意の溶液であり得る。緩衝溶液の例は、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水、ハンク緩衝化生理食塩水などを含む。アジュバントは薬学的組成物の有効性を向上させるために使用され得る。アジュバントは本発明のマイクロパーティクルと同時に(例えば、同じ組成物中で、または分離した組成物中で)投与され得る。あるいは、アジュバントは本発明のマイクロパーティクル組成物の前または続けて投与され得る。そのようなアジュバントは、以下を含むがそれらに限定されない：(1)アルミニウム塩(明礬)、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；(2)水中油乳濁液処方物(ムラミルペプチド(以下を参照のこと)もしくはバクテリア細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激剤とともに、または伴わず)、例えば(a)MF 59(国際公開公報第WO 90/14837)、Model 11OY微量流動化装置(microfluidizer)( Microfluidics、Newton、MA)のような微量流動化装置を使用してサブミクロンの粒子中に処方された、５％のスクアレン、0.5％のTween 80、および0.5％のSpan 85(必要に応じて種々の量のMTP-PE(以下を参照のこと)を、必要とされなくても、含む)を含む、(b)SAF、サブミクロンの乳濁液中に微量流動化されているか、またはボルテックスされてより大きな粒子サイズの乳濁液を形成している、10％のスクアレン、0.4％のTween 80、５％のプルロニックブロック化(pluronic-blo cked)ポリマーL121、およびthr-MDP(以下を参照のこと)を含む、および(c)Ribi^T ^M アジュバントシステム(RAS)(Ribi Immunochem、Hamilton、MT)、２％のスクアレン、0.2％のTween 80、ならびにモノホスホルリピッド（monophosphorylipid ）Ａ(MPL)、トレハロースジミコレート(dimycolate)(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)からなる群由来の１つ以上のバクテリア細胞壁成分、好ましくはMPL+CWS(Detox^TM)を含む(本明細書中で使用するための適切なサブミクロンの水中油乳濁液のさらなる議論については、共有に係る特許出願代理人整理番号第2300-1397、本明細書と同日に提出)を参照のこと；(3)サポニンアジュバント、Stimulon^TM(Cambridge Bioscience、Worcester、MA)など、またはISCOM( 免疫刺激複合体)のようなそれから生成した粒子が使用され得る；(4)完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)；(5)サイトカイン、例えばインターロイキン(IL-1、IL-2など)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)、など；および(6)免疫刺激剤として振る舞い組成物の有効性を向上させる他の物質。明礬およびMF59が好ましい。ムラミルペプチドは、以下を含むがそれらに限定されない；N-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノルムラミル-L- アラニル-D-イソグルタミン(isogluatme)(nor-MDP)、Ｎ−アセチルムラミル-L- アラニル-D-イソグルタミニル(isogluatminyl)-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ(huydroxyphosphoryloxy)- エチルアミン(MTP-PE)、など。組成物は、「治療的に有効な量」の目的の抗原を含む。すなわち、被験体に症状を予防、緩和、または除去するために十分な免疫学的応答を生成させる量の抗原／マイクロパーティクルが、組成物中に含まれる。正確な必要量は、とりわけ、処置される被験体；処置される被験体の年齢および一般的な状態；被験体の免疫系の抗体を合成する能力；所望の防御の程度；処置される状態の重篤度；選択された特定の抗原およびその投与様式に依存して変化する。適切な有効量は、当業者により容易に決定され得る。従って、「治療的に有効な量」は、日常の試験を通して決定され得る相対的に広い範囲になる。例えば、本発明の目的のために、効果的な用量は、代表的には、１用量あたりに送達される約１μg〜約100mg、より好ましくは約10μg〜約1mg、そして最も好ましくは約50μg〜約500μgの抗原の範囲である。一旦処方されると、本発明の組成物は非経口的に、例えば注入により投与され得る。組成物は皮下、腹膜内、静脈内、または筋肉内のいずれかで注入され得る。投与の他の様式は、経口および肺投与、坐剤、ならびに経皮適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。多回用量スケジュールは、予防接種の初期コースが１〜10の別個の用量、続いて免疫応答を保持および／または補強するために選択された引き続く時間の間隔(例えば、第二の用量に対して１〜４ヶ月)をおいて与えられる他の用量、そしてもし必要であるならば、数ヶ月後の引き続く用量を用いるものであり得るものである。投薬レジメンはまた、少なくとも一部は、被験体の必要性により決定され、そして開業医の判断に依存する。その上さらに、疾患の予防が望ましい場合、一般にワクチンは目的の病原体の初期感染の前に投与される。処置が望ましい場合( ‘例えば症状の緩和または回復)、ワクチンは一般に初期感染に続いて投与される。Ｃ．実験以下は本発明を実行するための特定の実施態様の実施例である。実施例は、例示の目的のみのために提供され、そしていかなる方法においても本発明の範囲を制限することを意図しない。使用される数字(例えば、量、温度など)に関して精度を高めるために努力がなされたが、しかしいくらかの実験誤差および偏差が、もちろん、許容されるべきである。実施例１溶媒エバポレーション技術を用いたHA捕獲ミクロスフィアの調製 15mlガラス試験管にジクロロメタン中の0.5ml 5mg/mlインフルエンザA/北京93 赤血球凝集素抗原（HA）および5ml 6％w:w PLG（ポリD,L-ラクチド-コ-グリコリド）(50:50のモル比のラクチドとグリコリド、平均MW=70〜100kDa、（Medisorb Technologies International）)を入れた。この溶液をハンドヘルドホモジナイザーを用いて、高rpmで２分間ホモジナイズした。このホモジネートに100mlガラスビーカー中で20ml 8％ポリビニルアルコール（PVA）（12〜23kDa）を添加した。これを、直径20mmのジェネレーターを備えたベンチスケールのホモジナイザーを用いて、10,000rpmで２分間ホモジナイズした。この溶液を、溶媒がエバポレートされるまでマグネチックスターラーバーを用いて、中速で室温で撹拌した。ミクロスフィアを水中で再懸濁させ、ミクロスフィアペレットを洗浄と洗浄との間に遠心分離を用いて、数回水で洗浄した。ミクロスフィアは、減圧下で乾燥剤（Dririte CaSO₄）の存在中で乾燥させた。容積サイズの平均値は、レーザー回折測定により0.9μmであると決定された。ミクロスフィアのタンパク質含量はアミノ酸組成分析により0.5％w:wであると決定された。実施例２溶媒エバポレーション技術を用いたHA吸着ミクロスフィアの調製 100mlガラスビーカーにジクロロメタン中の10mlの水および100ml 4％w:wPLG(5 0:50のモル比のラクチドとグリコリド、平均MW=80kDa、（Boehringer Ingelheim ）)を入れた。この溶液を、直径35mmのジェネレーターを備えたベンチスケールのホモジナイザーを用いて、10,000rpmで3分間ホモジナイズした。400ml 10％PV A(12〜23kDa)を、さらに3分間ホモジナイズする間に連続して添加する。この溶液を、ジクロロメタンがエバポレートされるまでマグネチックスターラーバーを用いて中速で一晩室温で撹拌した。ミクロスフィアペレットを洗浄と洗浄との間に遠心分離を用いて、数回洗浄し、そして凍結乾燥した。123mgの凍結乾燥ミクロスフィアに、2.4ml 1mg/mlインフルエンザA/北京93 HA抗原を、ガラスバイアル中で添加し、4℃で一晩インキュベーションした後、凍結乾燥した。容積サイズの平均値は、レーザー回折測定により0.34μmであると決定した。タンパク質含量は凍結乾燥後、約２％w:wであった。実施例３ HA 捕獲および吸着ミクロスフィアの免疫原性上記のように生成した、HA捕獲および吸着ミクロスフィアをマウスに投与し、そしてこのマウスを表１のように、28日後にブーストした。総投与量４μgのHA 吸着マイクロパーティクルを投与した。総投与量のHA捕獲マイクロパーティクルを投与した。血清を42日目に採取し、そして総HIAおよび総Igについて評価した。その結果を表１に示す。示され得るように、HA吸着マイクロパーティクルは HA捕獲処方物より免疫原性であった。実施例４スプレー乾燥技術を用いるHA吸着ミクロスフィアの調製ジクロロメタン中の2％（w:w）ポリ（d,l-ラクチド-コ-グリコリド）（Mediso rb Technologies、50:50のモル比のラクチドとグリコリド、70〜100KdalのMWまたは当量）を、67〜68℃の入口温度、55℃の出口温度、80PSIのスプレー圧、）を用いてスプレー乾燥した。生じたマイクロパーティクルはサイズ標準に対して光顕微鏡試験によって直径が1〜5μmであることが決定された。 450mgのスプレー乾燥したマイクロパーティクルおよび9ml 10％MEGA-10界面活性剤（2:1の比のMEGA-10とマイクロパーティクル）をセラミック乳鉢に入れた。この混合物を、滑らかなスラリー状になるまで、セラミック乳棒を用いて粉砕した。22.5mlのリン酸緩衝化生理活性食塩水（PBS）を添加し、そしてこの混合物を、マイクロパーティクルが十分再懸濁するまで、直径10mmのジェネレーターを備えたベンチスケールのホモジナイザーを用いて、25,000rpmで3分間ホモジナイズした。ビシンコニン酸（bicinchoninic acid）（BCA）タンパク質アッセイ（Pierce 、Rockford、IL）によりアッセイされ、1mg/mlタンパク質を含み、そして単一放射免疫拡散法（SRID）によりアッセイされ、約0.2mg/mlHA活性である、A/北京HA バルク抗原は、以下のようにマイクロパーティクルに吸収された。6mlA/北京HAバルク抗体を、9.6mlPBSで希釈し、次いで8.4mlのマイクロパーティクルスラリーを添加した（最終組成物：0.25mg/mlのタンパク質、120mgのマイクロパーティクル、１％w:vのMEGA-10、５％w:wタンパク質：パーティクルの割合）。この混合物を、MEGA-10を除去するまで、PBSに対して50,000分子量カットオフセルロース透析膜を用いて広範囲にわたって透析し、続いて染色アッセイにより測定した。透析物を透析バッグから取り出し、そしてペレットマイクロパーティクルを遠心分離した。上清を取り出し、廃棄し、そしてマイクロパーティクルを洗浄と洗浄の間に遠心分離しながら、２回PBSを換えて洗浄した。30mlPBSを1回の洗浄で使用した。タンパク質ロードを、マイクロパーティクルで約1.4％タンパク質含量のBCAを使用した、標準の方法で測定した。実施例５スプレー乾燥により生成されたHA吸着マイクロパーティクルの免疫原性実施例４で生成されたマイクロパーティクルの免疫原性の試験のために、Balb /Cマウス（n=10）のグループを表２に示したスケジュールに従って筋肉内で免疫した。プライムとブーストを、別々に１月行った。投与をPBS単独に溶解するかマイクロパーティクルに表面で吸着するかのどちらかで、HA活性に基づいてA/北京抗体（SRID）で行った。血清サンプルはブースト免疫後２週目および４週目で取り出し、そして染色ベースELISAによりA/北京の具体的なIg力価のためにアッセイした。血清サンプルを、さらに赤血球凝集阻害活性（HI）について評価した。ELISAの結果およびHIアッセイを表２に要約する。示されたように、HA吸着マイクロパーティクルでの筋肉内免疫は、HA単独での免疫よりも当量または測定可能なほどより高いIgおよびHI力価を生じた。標準ミクロ被包技術を用いてPLGマイクロパーティクル中に被包したA/北京HA は、弱いHI応答を誘導することを示し、筋肉内投与後、被包プロセスの間に起こるHAの変性を示す。従って、マイクロパーティクルの表面上の抗原の存在は、抗原のマイクロカプセル化における利点を示し、驚くべきことにアジュバント効果を示す。実施例６ PLG 捕獲HSVgD2ミクロスフィアの調製 HSVgD2捕獲PLGマイクロパーティクルを、一般的に、上記のように溶媒エバポレーション技術により調製した。簡潔には、１％w/w抗原負荷レベルを有するマイクロパーティクルを、2mlの抗原溶液に添加し、そして塩化メチレン中の10ml の５％w/v PLGポリマー溶液とシルバーソンホモジナイザーを用いて、高速で乳化することにより調製した。次いで、一次エマルジョンを、PVA（10％w/v）を含む蒸留水（50ml）に添加した。この結果、w/o/wエマルジョンを形成し、これを再び４分間高速でホモジナイズした。生じたエマルジョンを、室温で12時間1000 rpmで撹拌し、そして塩化メチレンをエバポレートした。マイクロパーティクルを濾過し、蒸留水で２回洗浄し、そして凍結乾燥した。実施例７ PLG 吸着HSVgD2ミクロスフィアの調製ブランクマイクロパーティクルを溶媒エバポレーション技術により調製した。簡潔には、０％w/wタンパク質ロードレベル（ブランクまたはプラセボ）を有するマイクロパーティクルを、２mlの通常の生理食塩水溶液を添加し、そして塩化メチレン中の10mlの10％w/v PLGポリマー溶液で、シルバーソンホモジナイザーを用いて高速で乳化することにより調製した。次いで、一次エマルジョンを、ポリビニルアルコール（10％w/v）を含む50mlの蒸留水に添加した。この結果、w /o/wエマルジョンを形成し、これを再び４分間高速で撹拌した。得られたエマルジョンを室温で１２時間1000rpmで撹拌し、そして塩化メチレンをエバポレートした。このマイクロパーティクルを濾過し、蒸留水で２回洗浄し、そして凍結乾燥した。ブランクPLGマイクロパーティクルを、HSVgD2タンパク質溶液に添加し、室温で２時間試験管振盪機で懸濁物を振盪させることでよく混合した。次いで、この懸濁物を-80℃で凍結した。この凍結懸濁物を、会合HSVgD2処方物として使用するために凍結乾燥した。実施例８ HSVgD2 捕獲および吸着ミクロスフィアの免疫原性上記のように生成した、HSVgD2捕獲および吸着ミクロスフィアを、マウスの筋肉内投与し、そしてマウスを28日後ブーストした。総投与量10μgのマイクロパーティクルを投与した。血清を４週目および８週目に採取し、そしてIgGおよび中和力価を評価した。この結果を表３に示す。見られ得るように、マイクロパーティクルに吸着したHSVgD2は、HSVgD2捕獲マイクロパーティクルより高い中和力価を与えた。実施例９ Gag 吸着および捕獲ミクロスフィアの調製 Gag吸着0.4μmマイクロパーティクル処方物を作製するために使用する溶液は以下の通りである：（１）塩化ジメチル中の４％RG 503 PLG（Boehringer Ingelheim）。（２）水中の10％PVA（ICN）。（３）PBS。特に、内部エマルジョンを、12.5mlのポリマー溶液に1.25mlのPBSを添加し、そして小さいプローブを備えたハンドヘルドIKAホモジナイザーを用いて、23kで 2.5分間ホモジナイズすることによって作製した。二次エマルジョンを50mlのPVA 溶液に内部エマルジョンを添加し、そして20mmプローブを備えたベンチトップホモジナイザーを用いて、10Krpmで３分間ホモジナイズすることによって作製した。このエマルジョンを、溶媒のエバポレーションのために一晩撹拌して放置した。次いで、形成したミクロスフィアを38μメッシュ（Malvern Master sizerでの大きさの）で濾過し、次いで３回遠心分離することによって水で洗浄し、そして凍結乾燥した。 P24gagは以下のようにミクロスフィアに吸着される。Ａ．５％吸着したミクロスフィア 200mgの乾燥凍結したプラセボミクロスフィアを、PBS中の80ml 0.25mg/ml P 24gagタンパク質と、一晩室温で揺すりながらインキュベートした。翌日、ミクロスフィアを遠心分離し、そして上清をgag濃度についてBCAでアッセイし、吸着した量を決定した。このミクロスフィアをPBSで１回洗浄し、そして凍結乾燥した。この凍結乾燥したミクロスフィアを、別のPBS中の40ml 0.25mg/ml P24gagと、室温で一晩揺すりながらインキュベートした。翌日、ミクロスフィアを遠心分離し、そして上清をBCAでタンパク質についてアッセイした。このミクロスフィアをPBSで１回洗浄し、そして凍結乾燥した。この凍結乾燥したミクロスフィアを、塩基加水分解により吸着した総タンパク質について分析した。Ｂ．１％吸着したミクロスフィア 100mg 0.4μmプラセボミクロスフィアを、PBS中の10ml 0.2mg/ml P24gagと、室温で一晩揺することでインキュベートした。翌日、ミクロスフィアを遠心分離し、そして上清をBCAでタンパク質についてアッセイした。このミクロスフィアをPBSで１回洗浄し、凍結乾燥し、次いで、塩基加水分解により吸着したタンパク質についてアッセイした。実施例10 Gag 吸着ミクロスフィアの免疫原性実施例９の記述のように生成された、gag吸着ミクロスフィア、ならびにgagカプセル化ミクロスフィアおよびコントロールとしてのブランクミクロスフィアをマウスに上記のように投与し、そしてCTL活性を最終免疫後の２週目にアッセイした。表４および５に示したように、表面にgag（１％）が存在するマイクロパーティクルはCTL活性を誘導するが、一方、生分解性粒子中のgagカプセル化マイクロパーティクルの同量では誘導しなかった。５％表面吸着gagはまた、CTL活性の誘導のために組み入れたタンパク質より良好であった。従って、抗原吸着マイクロパーティクルの使用が細胞媒介免疫学的応答を刺激すること、ならびにマイクロパーティクルの作製方法を開示する。本発明の好ましい実施態様はある程度詳細に記述したが、明らかな改変は、添付した請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく成され得ることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者バンネスト，ギャリーアメリカ合衆国カリフォルニア 94608, エミリービル，アール―440，ホートンストリート 4560，カイロンコーポレイション内 (72)発明者オット，ギャリーエス. アメリカ合衆国カリフォルニア 94608, エミリービル，アール―440，ホートンストリート 4560，カイロンコーポレイション内 (72)発明者バラックマン，ジョンアメリカ合衆国カリフォルニア 94608, エミリービル，アール―440，ホートンストリート 4560，カイロンコーポレイション内 (72)発明者カザズ，ジーナアメリカ合衆国カリフォルニア 94608, エミリービル，アール―440，ホートンストリート 4560，カイロンコーポレイション内

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリ(α-ヒドロキシ酸)マイクロパーティクルに吸着された、選択されたウイルス抗原および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、組成物。２．前記マイクロパーティクルが、ポリ(L-ラクチド)、ポリ(D,L-ラクチド)、およびポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)からなる群より選択されるポリ(α-ヒドロキシ酸)から形成される、請求項１に記載の組成物。３．前記マイクロパーティクルがポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)から形成される、請求項２に記載の組成物。４．前記選択された抗原がgp120である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。５．前記選択された抗原がp24gagである、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。６．前記選択された抗原がインフルエンザＡ赤血球凝集素抗原である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。７．脊椎動物被験体に、治療的有効量のポリ(α-ヒドロキシ酸)マイクロパーティクルに吸着された選択されたウイルス抗原を投与する工程を包含する、免疫の方法。８．前記マイクロパーティクルが、ポリ(L-ラクチド)、ポリ(D,L-ラクチド)、およびポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)からなる群より選択されるポリ(α-ヒドロキシ酸)から形成される、請求項７に記載の方法。９．前記マイクロパーティクルがポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)から形成される、請求項８に記載の方法。１０．前記選択された抗原がgp120である、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。１１．前記選択された抗原がp24gagである、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。１２．前記選択された抗原がインフルエンザＡ赤血球凝集素抗原である、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。１３．サブミクロンの水中油エマルジョンを前記被験体に投与する工程をさらに包含する、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。１４．脊椎動物被験体に、ポリ(α-ヒドロキシ酸)マイクロパーティクルに吸着された治療的有効量の選択されたウイルス抗原を投与する工程を包含する、脊椎動物被験体において細胞性免疫応答を誘発するための方法。１５．前記マイクロパーティクルが、ポリ(L-ラクチド)、ポリ(D,L-ラクチド)、およびポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)からなる群より選択されるポリ(α-ヒドロキシ酸)から形成される、請求項１４に記載の方法。１６．前記マイクロパーティクルがポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)から形成される、請求項１５に記載の方法。１７．前記選択された抗原がgp120である、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。１８．前記選択された抗原がp24gagである、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。１９．前記選択された抗原がインフルエンザＡ赤血球凝集素抗原である、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。２０．脊椎動物被験体の免疫に有用な医薬の製造における、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物の使用。２１．細胞性免疫応答が脊椎動物被験体において誘発される、請求項２０に記載の使用。２２．（a）ウイルス抗原を提供する工程；（b）該ウイルス抗原をポリ(α-ヒドロキシ酸)マイクロパーティクルに吸着させる工程；および（c）吸着抗原を有する該マイクロパーティクルを薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせる工程、を包含する、組成物の製造法。２３．前記マイクロパーティクルが、ポリ(L-ラクチド)、ポリ(D,L-ラクチド)、およびポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)からなる群より選択されるポリ(α-ヒドロキシ酸)から形成される、請求項２２に記載の方法。２４．前記マイクロパーティクルがポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)から形成される、請求項２３に記載の方法。２５．前記選択された抗原がgp120である、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。２６．前記選択された抗原がp24gagである、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。２７．前記選択された抗原がインフルエンザＡ赤血球凝集素抗原である、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。