KR100372375B1 - 면역반응의강화방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특정한 바이오폴리머를 사용하여 합성 항원을 생분해성 미립자에 봉입시키고, 이들 미립자를 분산매질에 현탁시키고, 이들을 비경구적으로 투여함으로써 전신적 면역반응의 강화를 야기시키는 것이다. 본 발명에서 이러한 면역강화는 하나 이상의 세포독성 T-세포 에피토프가 미립자에 포함되며, 생체적합성 및 생분해성 물질은 수성 매질 및 생리적 유체에 불용성이며 습윤성 및 팽윤성인 바이오 폴리머임을 특징으로하여, 항원이 봉입되어 있는 생체적합성 및 생분해성 물질의 미립자 및 이러한 미립자를 함유하는 약제학적 조성물을 사용함으로써 얻어진다.

Description

면역반응의 강화방법{IMMUNOLOGICAL RESPONSE POTENTIATION PROCESS}
새로운 백신의 개발 및 기존의 백신 제제의 개량은 지난 수년 동안 중요성 및 절박성이 증가되어 왔다 (E. Eppstein et al., New Adjuvants for Vaccines Coutaining Purified Protein Antigens, Advances in Drug Delivary Review 4, 233-253 (1990)). 합성 항원의 생산, 및 적합한 보강제 제제 및 약면역원성 화합물의 면역원성을 증가시키는 투여 형태의 개발이 가장 중요하다. 신규한 항원의 개발의 목표는 한편으로는 아직까지 질병에 대하여 비활성이거나 활성이 불충분한 백신만이 있는 AIDS, 말라리아, 결핵, 콜레라, 간염 A, 암성 질환과 같은 질병이며, 다른 한편에서의 노력은 불활성화 바이러스, 박테리아 또는 톡소이드와 같은 전통적인 백신에 함유된 항원을, 생산하여 세정하기가 더 쉽고 더 잘 특정화될 수 있으며 그들의 구조내에 실제 감염인자의 항원 부위를 갖는 저분자량 펩타이드 및 단백질로 대체시키는 방향이다. 이러한 항원 펩타이드 및 단백질은 생화학적으로 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 고순도로 수득될 수 있다. 이러한 새로운 세대의 합성항원은 그의 화학구조내에 항원-특이적 TH- (헬퍼), Tc- (세포독성) 및 B-림프구를 자극하는 펩타이드 서열 (에피토프 (epitope))을 갖는다. 여기에서 소위 TH-, Tc- 및 B-세포 에피토프는 각각 독립적으로 존재할 수 있거나, 키메라 B-T 에피토프에 공유적으로 연결될 수 있다. 이들 유전자-기술적으로 또는 화학적으로 생산된 항원은 일반적으로 약 500 내지 2000의 저분자량을 갖기 때문에, 이들의 면역원성은 분자량 50,000 내지 150,000의 톡소이드에 비해서 또는 불활성화 바이러스 및 그밖의 다른 미생물과 같은 특정한 항원에 비해서 매우 약하다.
지금까지 알려져 있는 합성 항원의 면역원성 강화를 위한 전략은 제 1 단계에서는 공유결합시킴으로써 이들 항원의 분자량을 증가시키고, 제 2 단계에서는 이들 고분자량 구조를 면역강화 제제에 삽입시키는 것을 기본으로 한다.
분자량의 증가는 합성 항원이 디프테리아 및 파상풍 톡소이드, 소혈청 알부민, 록림펫 헤모시아닌 (rock limpet hemocyanin)과 같은 고분자량 캐리어 단백질에 공유적으로 결합됨으로써 이루어질 수 있는 것으로 알려져 있다. 항원 캐리어 구조물과 관련하여서는 매우 고가이며 비교적 불순한 이종 유기체의 사용, 항원 및 캐리어 단백질의 공유결합을 위해서 반응성이며 비교적 독성인 성분의 필요성, 및 이들 화합물의 정제 및 동일성과 순도시험의 어려움이 단점이 된다. 다른 한편으로는, 또한 B-T 에피토프를 분지구조 (branch structure)의 일종으로 공유적으로 연결시켜 멀티머 (multimer)를 형성시킴으로써 B-T 에피토프의 분자량을 증가시키는 것이 제안되었다 (J.P. Tam, Y.-A. Lu, Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA 86, 9084-9088 (1989)). 이들 구조물은 다중항원 펩타이드 (multiple antigen peptides), 간략하여 MAP라고 부른다.
또한, B- 및 TH-에피토프의 조합은 항체 형성이 일어나도록 하는데 필수적이며, Tc-에피토프와 TH-에피토프와의 조합은 IFA 중에서 투여한 후에 CTL 반응이라고도 불리우는 세포독성 림프구 반응을 개선시킬 수 있는 것으로도 알려져 있다 (C. Widman et al., J. Immunol. Methods 155, 95-99 (1992)).
이러한 약면역원 항원 및 그들의 고분자량 구조물에 대한 다양한 면역강화 제제는 PS-EP-A1-513,861에 기술되어 있다. 면역촉진제를 함유하는 O/W 에멀젼이 그들의 주된 부분이다. 저장중에 응결의 발생으로 나타날 수 있는 그들의 고유한 열역학적 불안정성은 이들 조악하게-분산되거나 콜로이드-분산된 시스템과 관련한 단점이다. 또한, 이러한 액체-분산된 제제의 성분들은 산화 및 가수분해와 같은 화학적 변화를 겪는다. 기술된 제제는 또한 대부분 독성적으로 완전히 무해하지 않은 뮤라밀 펩타이드와 같은 면역자극제를 필요로 한다. 마지막으로, 이들 제제는 장기간 효과를 전히 나타내지 않는다. 따라서, 수년간에 걸친 백신접종에 의한 보호작용을 얻기 위해서는 규정된 백신접종 계획에 따라서 이들 백신 제제를 3 내지 4 회 주사하는 것이 필요하다 (소위 "추가항원자극 (booster)" 주사).
또한, 항원의 면역강화를 위한 시스템은 마이크로캡슐 또는 미립자라고도 불리우는 소위 생분해성 미립구를 사용하는 국제공개 WO 92/19263-A1으로부터 공지되어 있다. 이 방법은 면역강화가 주로 위장점막에서 관찰되고, 따라서 단지 비교적몇가지 병원체 (소위 장병원성 미생물)에 대해서만 효과를 나타낼 수 있다는 단점이 있다. 미립자가 십이지장에 투여되며 경구적으로 투여되거나 섭취될 수 없다는 사실은 적어도 인간에게서 실제 사용을 방해한다. 또한, PS-EP-A2-333,523에 따르면 조정된 양의 미세하며 (1 내지 10 ㎛) 더 조악하게 과립화된 미립자가 면역강화 효과에 중요한 전제조건인 것으로 보임을 나타내고 있다, 미립자의 입자크기 범위에 대한 이러한 필요조건은 미립자의 생산 및 가공중에 추가의 노력을 기울여야 함을 나타내며, 이것은 단점인 것으로 보인다.
본 발명은 합성 약면역원성 항원의 면역원성을 강화시키는 방법에 관한 것이다. 이하에서 합성 약면역원성 항원은 화학적으로 또는 재조합 DNA 기술에 의해서 생산된 펩타이드 또는 단백질 구조를 가지며, 수용액으로 또는 알루미늄 흡착질의 형태로 비경구 투여함으로써 매우 낮은 항체 역가를 가지고 T-세포 증식은 결여되거나 아주 작은 상태로 미약한 면역학적 반응을 유발하는 화합물인 것으로 이해된다. 이러한 그룹의 항원은 이하에서 간단하게 합성 항원이라고 부른다. 따라서, 정의한 바와 같이, 본 명세서에 기술된 합성 항원에 대한 면역반응은 이러한 합성 항원이 수용액으로 투여된다면 무시할 수 있을 정도이다. 실험적 대조제제로서는 불완전 프로인트 보조액 (Incomplete Freund's adjuvant: IFA)이 사용된다. IFA는 체액성 및 세포성 면역반응을 촉진시키는 것으로 알려져 있는 유중수 (W/O) 제제이다. 그러나, IFA는 강력하며 원치않는 부작용으로 인해서 시험목적으로만 사용될 수 있다.
용어 백신은 이하에서 항원 이외에도 그들 자체가 전혀 불활성인 성분의 기능 또는 면역강화기능을 수행하거나, 또는 이들 두가지 기능을 조합하여 수행하는 물질을 함유하는 제제인 것으로 이해된다. 전혀 불활성인 성분은 예를들어, 비경구 투여를 위해 항원을 용해시키는 물, 항미생물성, 등장성 및 pH-안정화 불활성 성분이다. 때때로, 면역강화 물질은 예를들어 불용성 알루미늄 염 (-포스페이트, -하이드록사이드), 특정한 리포폴리사카라이드, 뮤라밀 펩타이드, 트레할로즈 화합물, 인터류킨 1과 같은 몇가지 사이토킨, 친유성 블럭 코폴리머 (폴록사머)를 포함하는 보강제 (adjuvant)라고 부른다. 그러나, 실험적 대조제제인 불완전 프로인트 보조액, 및 리포좀, 에멀젼, 나노캅셀과 같은 백신의 몇가지 투여 형태도 보강제 특성을 갖는다. 이들 투여 형태는 생체내에서 항원 침착물의 형성을 야기시킬 뿐 아니라, 면역-촉진 특성도 갖는다.
도 1은 본 발명에 따른 면역강화를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 MAP를 함유하는 속방성 마이크로캡슐 및 IFA 제제를 단일 투여한 후의 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 3은 MAP를 함유하는 서방성 마이크로캡슐 및 IFA 제제를 단일 투여한 후의 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 4는 MAP를 함유하는 속방성 및 서방성 마이크로캡슐의 혼합물 및 IFA 제제를 단일 투여한 후의 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 5는 MAP를 함유하는 속방성 마이크로캡슐 및 IFA 제제를 삼중 투여한 후의 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 6은 다양한 MAP-함유 마이크로캡슐 및 IFA 제제를 단일 투여한 후의 증식성 T-림프구 반응을 나타낸 것이다.
도 7은 합성 Tc-항원 및 상응하는 MAP를 각각 함유하는 속방성 마이크로캡슐의 혼합물을 단일 투여한 후의 Tc-반응을 나타낸 것이다.
1. 생분해성 미립자내에 합성 항원의 봉입 (embedding)
이 특허의 전문에서의 정의에 따르면 이 방법의 출발점은 그들의 공지의 화학 구조내에 면역 시스템에 의해서 인지될 수 있는 병원성 미생물의 적어도 하나의 규정된 에피토프를 함유하는 합성 항원이다. 이 경우에, 에피토프는 B-세포 에피토프, TH-에피토프, Tc-에피토프, 또는 이들 에피토프의 임의의 혼합물일 수 있다. 소위 다중항원 펩타이드 (MAP)는 단독으로 또는 Tc-에피토프와의 배합물로 바람직하게는 이 방법의 출발점을 구성한다. 에피토프의 공급원에는 박테리아, 바이러스, 원생동물 및 종양세포가 포함된다. 본 발명에 따르면, 합성 항원을 생분해성 미립자에 봉입시킨다. 본 발명에서는 생분해성 미립자를 생산하기 위해서 특정한 물리화학적 특성을 갖는 바이오폴리머를 선택하는 것이 필수적이다. 중요한 특성은 바이오폴리머, 및 수성매질 및 생리적 액체중에서 이들로부터 생산된 구형 미립자의 습윤성 (wettability), 불용성, 팽창성 (expandability) 및 생분해성이다. 중요하게는, 바이오폴리머의 팽창성의 정도 및 그들의 생분해 시간이 마이크로캡슐로부터 항원의 방출동력학을 결정한다. 본 발명에서는 놀랍게도, 이들 방출동력학은 또한 시간에 걸친 면역반응의 진행에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 습윤성, 팽창성 및 생분해 시간을 변화시키기 위한 이러한 바이오폴리머의 예는 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글기콜산), 폴리(하이드록시부티르산), 폴리(하이드록시부티르산-코-발레르산), 폴리(카프로락톤)이다. 바이오폴리머에 대한 합성 항원의 봉입은 분무-건조, 용매 증발 또는 코아세르베이션 (coaservation)과 같은 다양한 공지의 방법을 이용하여 수행된다. 이렇게 하여 1 내지 200 ㎛크기의 항원-부하된 구형 미립자가 생성된다.
2. 분산매질 내의 현탁액
제 2 단계에서는 본 발명에 따르는 항원-부하된 미립자를 미립자의 비경구 투여에 적합한 분산매질 내에 배치시킨다. 이와 관련하여서는 분산매질이 생체적합성이며 생분해성이고, 또한 면역반응을 강화시키는데 유익한 특성을 갖는 것이 본 발명에 필수적이다. 이러한 유익한 분산매질은 예를들어, 레시틴의 수성 또는 오일상 용액 또는 0.1 내지 20%, 바람직하게는 2 내지 10%의 농도범위로 레시틴을 갖는 수성-오일상 에멀젼이다. 추가의 적합한 분산매질은 물, 오일, 텐사이드 (tenside) 및 코-텐사이드 성분을 함유하는 소위 마이크로에멀젼이다. 이를 위해서는 천연 또는 합성 모노-, 디- 및 트리글리세라이드, 레시틴, 폴록사머 및 폴리소르베이트와 같은 생체적합성 및 생분해성 물질이 사용된다. 언급된 분산매질은 생분해성 미립자의 놀랍게도 우수한 습윤 및 현탁특성을 특징적으로 나타낸다. 이들 습윤 및 현탁특성은 예를들어, 카복시메틸 셀룰로즈 또는 폴리소르베이트와 같이 통상적으로 사용되는 분산매질의 성질보다 훨씬 더 우수하다. 분산매질 내에서 미립자의 분산은 진탕함으로써 간단하게 수행될 수 있으며, 이를 이용하여 주사용 제제가 생성된다.
3. 투여
현탁매질 내에 현탁된 항원-부하된 미립자는 비경구적으로 투여되며, 여기에서 이러한 투여는 1회 또는 규정된 간격으로 수회 수행될 수 있다. 투여의 후자의 형태는 용어 "추가항원자극 (booster)"으로 공지되어 있다. 일차 및 이차 추가항원 자극 용량은 예를들어, 초기 주사 후에 1 내지 4 주 및 3 내지 6 주에 투여될 수 있다. 수개월 동안 지속하는 강화된 면역반응은 본 발명에 따르는 제제의 단일 또는 다중 투여로 인해서 유발된다.
4. 강화된 면역반응의 성취
면역반응의 강화는 일반적으로 본 발명에 따라 합성 항원이 부하된 미립자를 단일, 예외적인 경우에는 또한 삼중 비경구 투여한 후에 BALB/c마우스에서 측정된다. 파상풍 독소의 만능 TH-에피토프 (서열 947 내지 967) 및 플라스모디움 베르게이 (Plasmodium berghei)의 서컴스포로조이트 단백질 (circumsporozoite protein)의 반복부위의 B-세포 에피토프로부터 생산된 MAP, 및 플라스모디움 베르게이(Plasmodium berghei)의 서컴스포로조이트 단백질의 Tc-에피토프 (서열 252내지 260)가 합성 모델-항원으로서 사용된다 (S. Demotz et al., J. of Immunology 142, 394-402 (1989), P. Romero et al., Nature 341, 323 (1989); J.L Weber et al., Exp. Parasitology 63, 295 (1987)). 면역강화의 강도 및 길이는 특이적 항체 역가, T-림프구 증식 및 특이적 세포독성 T-림프구 활성을 이용하여 측정된다. 이들 3가지 파라메터는 공지의 면역학적 방법에 따라 결정된다.
도 1은 본 발명에 따르는 방법을 이용하여 성취된 면역강화의 해당 파라메터를 개략적으로 나타낸 것이다. 본 발명에서, 면역강화는 투여된 합성 항원의 결과인 면역학적 반응이 시간이 경과함에 따라 진행하는 중에 강도가 항원 수용액에 대해서는 강화되고, 항체 역가, T-세포 증식 및 Tc-자극의 레벨에 대하여는 IFA 제제에 비해서 동등하거나 증가된 양으로 강화되는 것을 의미한다.
따라서, 다양한 습윤성, 팽창성 및 생분해 시간의 바이오폴리머를 혼합시킴으로써 체액성 합체반응 및 세포성 T-림프구 반응을 불완전 프로인트 보조액을 이용하여 도달된 강화와 동등하거나 그에 비해 훨씬 더 큰 정도까지 강화시킬 수 있는 가능성이 있다. 또한, 이 방법에 따르는 면역반응은 시간-조절될 수 있고, IFA 및 수용액에 비해서 수주일에 걸쳐서 연장될 수 있다.
사용된 생분해성 미립자의 조정된 특성으로 인해서, 본 발명에 기술된 방법은 시간의 경과에 따라 그의 진행을 조절할 수 있는 합성 항원, 특히 소위 MAP에 대한 체액성 및 세포성 면역반응의 유도된 강화를 이룰 수 있다. 또한, 이 방법은 특히 바이러스, 원생동물 및 종양세포에 대한 면역을 성공적으로 제공할 수 있기때문에 B- 및 TH-림프구의 유도되고 강화된 자극 뿐 아니라 세포독성 T-림프구를 자극할 수 있다는 놀라운 잇점을 갖는다. 여기에서는 놀랍게도 T-림프구의 세포독성 자극을 최초로 입증할 수 있었다. PS EP-A2-333,523 및 PCT WO 92/19263에 기술된 면역강화와는 대조적으로 본 발명의 강화는 주로 전신적이며, 즉 점막성이 아니고, 시간의 경과에 따라 강도, 및 지속시간 또는 진행을 조절할 수 있다. 또한, 면역강화를 위해서 좁고 정확하게 규정된 입자크기분포가 필요하지는 않으며, 이것은 기술적 잇점을 수반한다.
본 발명의 방법은 박테리아, 바이러스, 원생동물 및 종양세포에 의해서 야기된 질병에 대하여 인간 및 동물을 면역시키기 위해서 사용된다. 특히 통상적인 백신을 사용함으로써 불만족스러운 방식으로, 즉 원치않는 부작용을 감수하며 불충분하게 도달될 수 밖에 없는 바이러스, 원생동물 및 종양세포에 대한 면역이 이 방법의 주된 적용분야를 나타낸다. 본 발명에 따르는 방법을 이용한 세포독성 T-세포의 자극 및 장기간에 걸쳐 지속하는 면역반응이 이러한 적용분야를 위한 기초를 구성한다.
본 발명의 목적은 특정한 바이오폴리머를 사용하여 합성 항원을 생분해성 미립자에 봉입시키고, 이들 미립자를 분산매질에 현탁시키고, 이들을 비경구적으로 투여함으로써 전신적 면역반응의 강화를 야기시키는 것이다.
본 발명에 따르면 이러한 목적은 특허청구범위에 기술된 내용에 따라 성취된다. 이에 대한 예시적인 구체예는 실시예 1 내지 6에 기술되어 있다. 본 발명의 방법은 이하의 도면 도 1 내지 7을 이용하여 더욱 상세히 설명된다.
실시예 1
본 실시예는 파상풍 독소의 만능 TH-세포 에피토프 (서열 947 내지 967) 및 플라스모디움 베르게이 (Plasmodium berghei)의 B-세포 에피토프로부터 작제된 P30B2로서 동정되는 분지된 다중항원 펩타이드에 대한 항체반응의 강화를 기술하고있다: P30B2 0.02 g을 물 2.00 g에 용해시키고, 이어서 이 용액을 디클로로메탄 40.0 g 중의 폴리(d,1-락트산 코-글리콜산) 50:50 (Resomer 502, Boehringer Ingelheim) 2.0 g의 용액 중에서 초음파 발생기를 사용하여 분산시켰다. 이 분산액으로부터 분무건조를 이용하여 구형 미립자 (RG502)를 생산하였다. 이어서, 항원이 부하된 미립자를 난레시틴 (Ovothin 170, Lukas Meyer, D-Hamburg)의 5% 멸균용액에 진탕하여 현탁시켰다. 이 현탁액을 각각 0.5 mℓ의 양으로 8 마리의 BALB/c 마우스의 그룹에 피하주사하였다. 각각의 마우스에 주사한 항원의 양은 30 ㎍였다. 8 마리의 BALB/c 마우스의 두번째 그룹은 대조군으로서 불완전 프로인트 보조액 (IFA)중의 동일한 양의 항원으로 면역시켰다. 항체 역가는 ELISA를 이용하여 결정하였다.
도 2는 실시예 1에 따라 시간의 경과에 따른 RG502에 의한 면역강화의 진행을 IFA와 비교하여 나타낸 것이다. RG502 및 IFA로부터 수득한 항체 역가는 면역시킨 후의 처음 15주 동안 서로 동등하다. IFA에 의해서 유도된 역가가 저하한 후에도 마이크로캡슐에 의해서 유도된 역가는 적어도 28주에 걸쳐서 일정하게 유지된다. PGLA 50:50과 같은 친수성의 강력한 팽창성, 속방출성 및 신속한 생분해성 바이오폴리머를 투여한지 2주 후에 이미 1 내지 2x103의 항체 역가가 수득되었으며, 적어도 28주의 기간에 걸쳐서 일정하게 유지된다. 이와는 반대로, IFA 제제를 1회 투여한 후에 측정한 역가는 15주 후에 이미 저하하였으며, 28주 후에는 겨우 2x102이었다.
실시예 2
본 실시예는 파상풍 독소의 만능 TH-세포 에피토프 (서열 947 내지 967) 및 플라스모디움 베르게이 (Plasmodium berghei)의 서컴스포로조이트 단백질(circumsporozoite protein)의 반복부위의 B-세포 에피토프로부터 작제된 P30B2 (도 1에 따름)의 분지된 다중항원 펩타이드에 대한 항체반응의 강화를 기술하고 있다. P30B2 0.02 g을 물 2.00 g에 용해시키고, 이어서 이 용액을 디클로로메탄 40.0 g 중의 폴리(d,1-락트산) (Resomer 206, Boehringer Ingelheim) 2.0 g의 용액 중에서 초음파 발생기를 사용하여 분산시켰다. 이 분산액으로부터 코아세르베이션(coaservatiion)을 이용하여 구형 미립자 (R206)를 생산하였다. 이어서, 항원이 부하된 미립자를 난레시틴 (Ovothin 170, Lukas Meyer, D-Hamburg)의 5% 멸균용액에 진탕하여 현탁시켰다. 이 현탁액을 각각 0.5 mℓ의 양으로 8 마리의 BALB/c 마우스의 그룹에 피하주사하였다. 각각의 마우스에 주사한 항원의 양은 30 ㎍였다. 8 마리의 BALB/c 마우스의 두번째 그룹은 대조군으로서 불완전 프로인트 보조액 (IFA)중의 동일한 양의 항원으로 면역시켰다. 항체 역가는 ELISA를 이용하여 결정하였다.
도 3은 실시예 2에 따라서 시간의 경과에 따른 R206에 의한 면역강화의 진행을 IFA와 비교하여 나타낸 것이다. 소수성의 약팽창성, 서방출성 및 느린 생분해성 R206으로부터 수득되는 항체 역가는 처음 12주 동안 연속적으로 상승한 다음에 면역시킨지 2주 후에 이미 IFA에 의해서 도달한 레벨에 도달한다. IFA 역가는 약 15주 후에 다시 꾸준하게 저하하지만, R206 역가는 적어도 28주의 기간에 걸쳐서 일정하게 유지된다.
실시예 3
본 실시예는 파상풍 독소의 만능 TH-세포 에피토프 (서열 947 내지 967) 및 플라스모디움 베르게이 (Plasmodium berghei)의 서컴스포로조이트 단백질의 반복부위의 B-세포 에피토프로부터 작제된 P30B2 (도 1에 따름)의 분지된 다중항원 펩타이드에 대한 항체반응의 강화를 기술하고 있다: 실시예 1과 유사하게 P30B2를 폴리(d,1-락트산 코-글리콜산) 75:25 (Resomer RG752, Boehringer Ingelheim)에 삽입시키고, 구형 미립자 (RG752)로 가공하였다. RG752, RG502 (실시예 1로부터) 및 R206 (실시예 2로부터)을 함유하는 미립자의 동일한 양을 난레시틴(Ovothin 170, Lukas Meyer, D-Hamburg)의 5% 멸균용액에 진탕하여 현탁시켰다. 이 현탁액을 각각 0.5 mℓ의 양으로 8 마리의 BALB/c 마우스의 그룹에 피하주사하였다. 각각의 마우스에 주사한 항원의 양은 30 ㎍였다. 8 마리의 BALB/c 마우스의 두번째 그룹은 대조군으로서 불완전 프로인트 보조액 (IFA) 중의 동일한 양의 항원으로 면역시켰다. 항체 역가는 ELISA를 이용하여 결정하였다.
도 4는 실시예 3에 따라서 시간의 경과에 따른 RG506, RG752 및 R206의 혼합물에 의한 면역강화의 진행을 IFA와 비교하여 나타낸 것이다. 속방출성 및 서방출성 바이오폴리머의 이러한 마이크로캡슐 혼합물로부터 수득되는 항체 역가는 신속하게 상승하여, IFA에 의해서 도달한 항체 역가 보다 인수 2.5 까지 더 높은 레벨에 도달한다. IFA 역가는 약 15주 후에 다시 꾸준하게 저하하지만, 마이크로캡슐 혼합물에 의해서 도달한 역가는 적어도 28주의 기간에 걸쳐서 비교적 일정하게 유지된다.
실시예 4
본 실시예는 파상풍 독소의 만능 TH-세포 에피토프 (서열 947 내지 967) 및 플라스모디움 베르게이 (Plasmodium berghei)의 서컴스포로조이트 단백질의 반복부위의 B-세포 에피토프로부터 작제된 P30B2 (도 1에 따름)의 분지된 다중항원 펩타이드에 대한 항체반응의 강화를 기술하고 있다: 실시예 1과 유사하게 P30B2를 폴리(d,1-락트산 코-글리콜산) 50:50 (Resomer RG502, Boehringer Ingelheim)에 삽입시키고, 구형 미립자 (RG502)로 가공하였다. 항원이 부하된 미립자를 난레시틴(Ovothin 170, Lukas Meyer, D-Hamburg)의 5% 멸균용액에 진탕하여 현탁시켰다. 이 현탁액을 각각 0.5 mℓ의 양으로 8 마리의 BALB/c 마우스의 그룹에 피하주사하였다. 각각의 마우스에 주사한 항원의 양은 3x10 ㎍였다. 주사는 16일 후 (첫번째 추가 항원자극) 및 113일 후 (두번째 추가항원자극)에 반복하였다. 8 마리의 BALB/c 마우스의 두번째 그룹은 대조군으로서 동일한 백신접종 계획에 따라 불완전 프로인트 보조액 (IFA) 중의 동일한 양의 항원으로 면역시켰다. 항체 역가는 ELISA를 이용하여 결정하였다.
도 5는 실시예 4에 따라서 RG502에 의한 추가항원자극 주사한 후에 시간의 경과에 따른 면역강화의 진행을 IFA와 비교하여 나타낸 것이다. RG502 및 IFA로부터 수득한 항체 역가는 동등하게 상승한다. 따라서, 본 발명의 방법은 추가항원자극에 의해서 도달된 면역강화에도 적합하다.
실시예 5
본 실시예는 실시예 1 내지 4에 따르는 P30B2의 다중항원 펩타이드에 대한 TH-림프구 증식의 강화를 기술하고 있다. P30B2를 실시예 1, 2 및 3과 유사하게 RG502, RG752 및 R206에 삽입하고, 다양한 정도의 팽창성을 갖는 구형 미립자로 가공하였다. P30B2를 함유하는 미립자의 동일한 양을 난레시틴 (Ovothin 170, Lukas Meyer, D-Hamburg)의 5% 멸균용액에 진탕하여 현탁시켰다. 이 현탁액을 각각 0.5mℓ의 양으로 8 마리의 BALB/c 마우스의 그룹에 피하주사하였다. 각각의 마우스에 주사한 항원의 양은 30 ㎍였다. 8 마리의 BALB/c 마우스의 두번째 그룹은 대조군으로서 불완전 프로인트 보조액 (IFA) 중의 동일한 양의 항원으로 면역시켰다. 림프절에서의 T-세포 증식은 공지의 방식으로 결정하였다.
도 6은 다양한 마이크로캡슐 제제 및 IFA 제제를 투여한 지 14일 후에 실시예 5에서 기술된 T-림프구 증식을 나타낸다. 이것으로부터 모든 마이크로캡슐 제제, 즉 항원 속방출을 갖는 RG502, 중간 정도로 느린 항원 방출을 갖는 RG752 및 매우 느린 항원 방출을 갖는 R206, 및 이들 세가지 마이크로캡슐 타입 모두의 혼합물은 모두 IFA 제제 보다 적어도 동등하며 부분적으로는 더 큰 정도로 T-림프구 증식을 강화시키는 것을 알 수 있다.
실시예 6
본 실시예는 플라스모디움 베르게이 (Plasmodium berghei)의 서컴스포로조이트 단백질의 Tc세포 에피토프 (CTL 359A, 서열 252 내지 260)의 세포독성 T-림프구 반응의 유발을 기술하고 있다: CTL 359A 0.008 g을 물 1.0 g에 용해시키고, 이어서 이 용액을 초음파 발생기를 사용하여 디클로로메탄 60.0 g 중의 폴리(d,1-락트산코-글리콜산)(Resomer 502, Boehringer Ingelheim) 4.0 g의 용액에 분산시켰다. 구형 미립자는 분무건조에 의해서 생산하였다. CTL 359A가 부하된 미립자를 실시예 1에 따라 P30B2로 부하된 미립자와 1:10의 CTL 359A : P30B2의 비로 혼합시켜 CTL에 대한 면역반응을 증가시켰다. 이어서 마이크로캡슐의 혼합물을 난레시틴 (Ovothin 170, Lukas Meyer, D-Hamburg)의 5% 멸균용액에 진탕하여 현탁시켰다. 이 현탁액을 각각 0.5 mℓ의 양으로 2 마리의 BALB/c 마우스의 그룹에 피하주사하였다. 각각의 마우스에 주사한 항원의 양은 CTL 359A 4 ㎍ 및 P30B2 40 ㎍이었다. Tc-세포반응은 세포용해시험을 이용하여 10 및 20일 후에 결정하였다.
도 1은 면역화 또는 제제를 투여한 지 10 및 20일 후에 측정한 것으로 실시예 6과 관련된 Tc-림프구 반응을 나타낸다. 세포용해활성의 백분위수 (percentile)는 효과/표적세포 비 E/T의 함수로서 나타낸다. 의외의 방식으로, 마이크로캡슐화된 Tc에피토프 및 TH에피토프 (RG502 내의 P30B2 + 359A)의 동시투여는 투여한 지 20 일 후에 관찰될 수 있는 현저한 Tc-림프구 자극을 유도한다. TH및 항체반응에 대비해서 상당히 더 긴 시간을 필요로 하는 Tc반응의 시간 경과에 따른 진행이 특히 흥미로운 것으로 보인다.
합성 항원에 대한 면역반응을 강화시키는 생분해성 구형 미립자가 제안되는 것이 본 발명에 필수적이다. 사용된 바이오폴리머의 물리화학적 특성을 측정함으로써 일한 면역강화의 정도 및 시간 경과에 따른 진행을 조절할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 항체 및 TH-림프구 강화 이외에도 또한 세포독성 L-림프구를 자극할 수 있도록 한다. 면역강화의 정도는 IFA 제제를 이용하여 얻어지는 강화와 적어도 동등하며, 시간 결과에 따른 그의 진행은 명백하게 연장된다. 따라서, 바이러스, 박테리아, 원생동물 또는 종양세포에 의해서 야기되는 질병에 대해서 인간 및 동물을 면역시키는데 사용될 수 있는 본 발명의 방법을 이용할 수 있다.

Claims (6)

  1. 하나 이상의 세포독성 T-세포 에피토프가 미립자에 포함되며, 생체적 합성 및 생분해성 물질은 수성 매질 및 생리적 유체에 불용성이며 습윤성 및 팽윤성인 바이오폴리머임을 특징으로하여, 항원이 봉입되어 있는 생체적합성 및 생분해성 물질의 미립자.
  2. 제1항에 있어서, 포함되어 있는 하나 이상의 세포독성 T-세포 에피토프 이외에도 다중항원 펩타이드 (MAP)가 또한 포함되어 있음을 특징으로하는 미립자.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 수성 매질 및 생리적 유체에 불용성이며 습윤성 및 팽윤성인 바이오폴리머가 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리(하이드록시부티르산), 폴리(하이드록시부티르산-코-발레르산) 및 폴리(카프로락톤)으로부터 선택됨을 특징으로하는 미립자.
  4. a)하나 이상의 세포독성 T-세포 에피토프가 미립자에 포함되며,
    b) 미립자는 수성 매질 및 생리적 유체에 불용성이며 습윤성 및 팽윤성인 하나 이상의 바이오폴리머로 구성되고,
    c) 생체적합성 및 생분해성 분산매질이 레시틴의 수성 또는 오일상 용액, 또는 0.1 내지 20%의 농도범위로 레시틴을 함유하는 수성-오일상 에멀젼, 또는 물,오일, 계면활성제 및 공계면활성제 성분을 함유하는 마이크로에멀젼임을 특징으로하여, 생체적합성 및 생분해성 분산매질 내의 현탁액 중에 항원이 봉입되어 있는 생체 적합성 및 생분해성 물질의 미립자를 함유하는 비경구 적용을 위한 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 미립자가 미립자에 포함된 하나 이상의 세포독성 T-세포 에피토프 이외에도 다중항원 펩타이드 (MAP)를 또한 포함함을 특징으로하는 약제학적 조성물.
  6. 제 4 항 또는 5 항에 있어서, 수성 매질 및 생리적 유체에 불용성이며 습윤성 및 팽윤성인 바이오폴리머가 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리(하이드록시부티르산), 폴리(하이드록시부티르산-코-발레르산) 및 폴리(카프로락톤)으로부터 선택됨을 특징으로하는 약제학적 조성물.
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