JPH08507088A - 免疫応答の増強方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫応答増強方法は、低い免疫原性を有する合成又は遺伝子操作された抗原に関する。この抗原を生物分解性微粒子に埋め込み、これらの抗原-負荷微粒子を生物分解性媒体中に分散し、この媒体は非経口投与した場合に、増強された抗原、Ｔ_H-リンパ球及びＴ_c-リンパ球応答を水性抗原溶液に比べて誘発する。免疫増強の程度はＩＦＡ組成物によって得られる程度にく匹敵する。線状Ｂ-Ｔ_H-細胞エピトープ、線状Ｔ_c-細胞エピトープ、このエピトープの二量体及び多量体並びにその混合物を、低い免疫原性抗原として使用する。微粒子は、生物分解性バイオポリマー、たとえばポリエステル、ポリアンヒドライド、ポリオルトエステルを主成分とする。種々の湿潤性、膨潤性遊離及び生物分解時間を有する微粒子を混合することによってもっとも強くかつ長い免疫増強が達成される。この方法は、ウィルス、細菌、原生動物又は腫瘍細胞によって引き起こされる疾病に対するヒト及び動物の免疫化に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫応答の増強方法 本発明は、合成の、弱い免疫原抗原に対する免疫性の増強方法に関する。合成 の、弱い免疫原抗原とは、ペプチド-又はたん白質構造を有する、以下に述べる 化合物のことであり、この化合物は化学的に又は組換えＤＮＡ-技術で製造され 、水性溶液の形で又はアルミニウム吸着質として非経口投与後極めて低い抗体力 価及び乏しい又はほんの僅かなＴ-細胞増殖と共にほんの微小の免疫応答を生じ る。以下に、抗原のこれらのグループを簡略化のために合成抗原と呼ぶ。したが って定義によれば、ここに記載された合成抗原を水性溶液の形で投与した場合、 上記抗原に対する免疫応答を無視することができる。実験上の比較剤として不完 全フロイントアジユバンド（ＩＦＡ）を使用する。ＩＦＡは油中水型（Ｗ／Ｏ） 剤であり、これは公知方法で体液性及び細胞性免疫応答を刺激する。しかし所望 されない強い副作用のゆえにＩＦＡは検査目的にしか使用されない。ワクチンの 概念は、後述の形態を示し、これは抗原に加えてそれ自体純粋な助剤作用又は免 疫増強する作用又はその上２つの作用の組合せを働かせる物質を含有する。純粋 な助剤はたとえば非経口投与のために抗原を溶解するための水、抗菌性、等張性 及びｐＨ-安定性助剤である。免疫増強物質はしばしばアジユバンドとしても表 わされ、これにたとえば不溶性アルミニウム塩（−リン酸塩、−水酸化物）、特 定のリポポリサッカライド、ムラアミルペプチド、トレハロース-化合物、種々 のサイトカイン、たとえばインターロイキン１、親油性ブロックポリマー（ポロ キサマー）が属する。しかしアジユバンド性状は、実験比較剤の不完全フロイン トアジユバンド及び種々の、まだ開発段階にあるワクチン-投与形態、たとえば リポゾーム、エマルジョン、ナノカプセルも含まれる。この投与形態は生体内で 抗原デポーの形成を生じせしめるだけでなく、免疫剌激性質も有する。 新しいワクチンの開発及び存在するワクチン-製剤の改良は、近年重要であり 、緊急を要している（Ｅ．エプスタイン（Eppstein）等、New Adjuvants for va ccines containing purified protein antigens，Advances in Drug Delivery R eview ４，２３３−２５３，（１９９０））、その際合成抗原の製造及び適す 十分にしか有効でないワクチンが存在する疾病、たとえばＡＩＤＳ、マラリヤ、 結核、肝炎Ａ、癌疾患を目標とし、他方で伝統的なワクチンに含有される抗原、 たとえば不活化ワクチン、細菌又はトキソイドを、簡単に産生しうるかつ精製で る。この様な抗原ペプチド及びたん白質を生化学的に又は組換えＤＮＡ-技術に よって高純度で得ることができる。合成抗原のこの新しい世代は、その化学構造 -、Ｔ_c-及びＢ-細胞エピトープは夫々個々に存在することができるか又はキメラ Ｂ-Ｔ-エピトープに共有結合することができる。これらの遺伝子工学的に又は化 学的に製造された抗原は一般に約５００−２，０００の低分子量を有するので、 その免疫原性は分子量５０，０００ないし１５０，０００を有するトキソイドに 反して又は特別の抗原、たとえば不活化ウィルス及び他の微生物に反して極めて 弱い。 合成抗原に対して免疫増強するための従来公知の方法は、最初の段階でこの抗 原の分子量を共有結合によって増加し、第二段階でこの高分子構造物を免疫増強 製剤中に組み入れることにある。 合成抗原を高分子担体たん白質、たとえばジフテリア-及び破傷風-トキソイド 、子牛血清アルブミン、ツタノハガイ-ヘモシアニンと共有結合することによっ て分子量の増加を達成することができることは知られている。抗原-担体たん白 質-構造物の欠点は、異種生物からの極めて高価で、比較的に不純な担体たん白 質の使用、抗原及び担体たん白質の共有結合に反応性で、比較的毒性の試剤の必 要性、精製の困難性、並びにこの化合物の同定-及び純度試験の困難性である。 他方でＢ-Ｔ-エピトープの分子量を、エピトープそれ自体がある種の分枝構造で 共有結合して多量体とすることによって増加することも提案されている（J．P． Tam．Y．-A．Lu，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA８６，９０８４−９０８８（１９８９））。これらの構造物は多重-抗 原ペプチド（ＭＡＰと略される。）として表わされる。 更に、Ｂ-及びＴ_H-エピトープの組合せは、抗体形成の実現に不可欠であるこ と及びＴ_c-エピトープとＴ_H-エピトープとの組合せは、細胞毒性リンパ球 とができることも公知である（Ｃ．ヴィドマン（Widmann）等、J．Immunol．Met hods １５５，９５−９９（１９９２））。 ヨーロッパ特許公開第５１３，８６１号広報によれば、この様な弱い免疫原性 抗原及びその高分子構造物に対して免疫増強する種々の製剤が記載されている。 これに先ず第一に免疫剌激物質を含有するＯ／Ｗ-エマルジョンが属する。この 粗い分散又はコロイド分散系の欠点は、その固有の熱力学的不安定性である。こ れは保存の際、コアレッセンス現象をもたらす。更にこの様な液状-分散製剤の 成分は、化学的変化、たとえば酸化及び加水分解を受ける。更に記載された製剤 は、ほとんどこの毒物学的に全く危険のない免疫剌激剤、たとえばムラアミルペ プチドを必要とする。結局、この製剤は全く長時間作用を示さない。それ故に数 年にわたって接種保護を達成するために、定められた接種プランに従って３ない し４回注射するこのワクチン-製剤が不可欠である（いわゆる“ブースター”-注 射）。 更に国際公開公報ＷＯ９２／１９２６３-Ａ１によれば抗原の免疫増強システ 胃腸粘膜中に観察され、それ故に比較的に僅かな疾病病原菌（いわゆる腸管病原 性微生物）にしか作用を示さないことである。微粒子を更に十二指腸に投与し、 経口的に投薬又は服用することができないという事実は、実際の使用が少なくと もヒトに於て行われないことを示す。その上ヨーロッパ特許公開第３３３，５２ ３号公報によれば、微細（１−１０μｍ）及び粗粒状（２０−５０μｍ）微粒子 の計量された割合が免疫増強作用に対する重要な前提条件であるように思われる 。微粒子の粒子の大きさの範囲に対するこの要求は、微粒子の製造及び後処理に 多くの費用がかかりり、このことは欠点と考えられる。 本発明の課題は、合成抗原を特異的バイオポリマーを用いて生物分解性微粒子 中に埋め込み、この微粒子を分散媒体中に懸濁し、非経口的に投与し、この際全 身性免疫応答の増強を生じることにある。 本発明によれば、この課題を請求の範囲１−１２に記載した方法で解決する。 例１−６中にこれに関する実施例を示す。以下に本発明による方法を、図１−７ によって更に詳述する。夫々は次の通りである： 図１ 本発明による免疫増強の図解による描写。 図２ ＭＡＰを含有し、急速に遊離するマイクロカプセル及びＩＦＡ-製剤の１ 回投与後の抗体力価。 図３ ＭＡＰを含有し、徐々に遊離するマイクロカプセル及びＩＦＡ-製剤の１ 回投与後の抗体力価。 図４ 急速に及び徐々に遊離するマイクロカプセルの、ＭＡＰ含有混合物並びに ＩＦＡ-製剤の１回投与後の抗体力価。 図５ ＭＡＰを含有し、急速に遊離するマイクロカプセル及びＩＦＡ-製剤の３ 回投与後の抗体力価。 図６ 種々のＭＡＰ含有マイクロカプセルとＩＦＡ-製剤の１回投与後の増殖性 Ｔ-リンパ球-応答。 図７ 夫々合成Ｔ_c-抗原及び対応するＭＡＰを含有する、急速に遊離するマイク ロカプセルの混合物の１回投与後のＴ_c-応答。 １．合成抗原を生物分解性微粒子中に埋め込む 処理の出発点は、この明細書の初めに定義された合成抗原であり、これはその 公知の化学的構造中に病原性微生物の一定のかつ免疫系で見分けられるエピトー プ少なくとも１個を含有する。その際エピトープは、同様にＢ-細胞-エピトープ 、Ｔ_H-細胞-エピトープ、Ｔ_c-エピトープ又はこれらのエピトープの任意の混合 物である。好ましくはいわゆる多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）、単独又はＴ_c-エピ トープとの組合せが処理の出発点を形成する。エピトープの起源は、細菌、ウィ ルス、原生動物及び腫瘍細胞である。本発明によれば、合成抗原を生物分解性微 粒子に埋め込む。生物分解性微粒子の製造に特異的物理-化学的性質を有するバ イオポリマーを選ぶのが重要である。決定的性質は、水性媒体及び生理液中での バイオポリマー及びこれから製造された球状マイクロカプセルの湿潤性 、不溶性、膨潤性及び生物分解性である。バイオポリマーの膨潤性の程度及びそ の生物分解時間は、マイクロカプセルからの抗原の遊離動力学を決定的に定める 。驚くべきことに、本発明者は、この遊離動力学が免疫応答の時間的経過にも影 響を与えることを見い出した。種々の湿潤性、膨潤性及び生物分解性を有するこ の様なバイオポリマーの例は、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）、 ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ酪酸-コ-バレリン酸）、ポリ（カプ ロラクトン）である。バイオポリマー中に合成抗原を埋め込むことは、種々の公 知の方法、たとえば噴霧乾燥、溶剤-蒸発又はコアセルベーションによって行わ れる。その場合、抗原負荷された球状マイクロカプセルが１ないし２００μｍの 粒子の大きさで生じる。 ２．分散媒体中で懸濁化 本発明による抗原負荷された微粒子を第二段階で微粒子の非経口投与に適する 分散媒体中に加える。この際、分散媒体が生物適合性及び生物分解性であり、更 に免疫応答の増強に有利な性質を有することが重要である。この様な有利な分散 媒体は、たとえば濃度範囲０．１−２０％、好ましくは２−１０％でレシチンの 水性又は油性溶液又はレシチンとの水中油型（waessrig-oelige）エマルジョン である。他の適する分散媒体はいわゆるマイクロエマルジョンであり、これは水 -、油-、界面活性剤-及び共界面活性剤-成分から成る。これに対して、生物適合 性及び合成モノ-ジ-及びトリグリセリド、レシチン、ポロキサマー及びポリソル ベートを使用する。上記分散媒体は、生物分解性微粒子に対する驚くべきことに 良好な湿潤-及び懸濁化性質の点で優れている。この湿潤性質及び懸濁性質は、 通常使用される分散媒体、たとえばカルボキシメチルセルロース又はポリソルベ ートのその性質よりも著しく良好である。分散媒体中の微粒子の分散化は、簡単 な振とうによって行うことができ、この際、注射用製剤が生じる。 ３．投与 抗原負荷されかつ分散媒体中に懸濁化された微粒子を非経口投与し、この際こ の投与は一定の時間間隔で１回又は多数回行うことができる。後者の投与法は“ ブースター”という概念で公知である。第一及び第二ブースター投薬量は、たと えば最初の注射後１−４週間及び３−６ケ月間投与することができる。本発明 による製剤の１回又は多数回投与の後、増強された、数ケ月持続する免疫応答を 生じる。 ４．増強された免疫応答の発生 しかし、免疫応答の増強を、一般に１回、特にしかも３回の非経口投与後、本 発明による合成抗原で負荷された微粒子をＢＡＬＢ／ｃマウスで測定する。合成 プ（配列９４７−９６７）及びプラズモジウムベルグヘイのサーカムスポロゾイ ジウムベルグヘイサーカムスポロゾイド-プロテインのＴ_c-エピトープ（配列２ ５２−２６０）を使用する（Ｓ．デモツ（Demotz）等、J．of Immunology，１４ ２，３９４−４０２（１９８９））；Ｐ．ロメロ（Remero）等、Nature ３４１ ，３２３（１９８９）；Ｊ．Ｌ．ヴェーバー（Weber）等、Exp．parasitology ６３，２９５（１９８７））。免疫増強の強度及び時間を、特異的抗体力価、Ｌ -リンパ球-増殖及び特異的細胞毒性Ｔ-リンパ球-活性によって測定する。この３ つのパラメーターを、公知の免疫学的方法に従って測定する。 図１に、本発明による方法で得られる免疫増強の重要なパラメーターを図解し て示す。免疫増強は、本発明に於て次の意味である。すなわち免疫応答の強度は 投与される合成抗原の時間的経過で抗体力価、Ｔ-細胞-増殖及びＴ_c-刺激のレベ ルで水性抗原溶液に対する増強であり、そして同程度に又はより大きな程度でＩ ＦＡ-製剤に対する増強である。 これから種々の湿潤性、膨潤性及び生物分解性を有するバイオポリマーの混合 物による可能性は、体液の抗体-応答及び細胞性Ｔ-リンパ球応答をある程度増強 することであることが明らかである。その程度は不完全フロイントアジユバンド で得られる増強と同等であるか又はより高い。更にこの方法による免疫応答を時 間的に調節することができ、ＩＦＡ及び水性溶液に比して約数週間延ばされる。 本発明の方法は、使用される生物分解性微粒子の適切な性質に基づき、合成抗 原、特にいわゆるＭＡＰに対して適切な、その時間的経過で調節可能な体液およ び細胞性免疫応答を増強することができる。その上この方法は、Ｂ-及びＴ_H- リンパ球の適切なかつ増強された剌激と共に細胞毒性Ｔ-リンパ球も刺激するこ とができるという卓越した利点を有する。それによって特にウィルス、原生動物 及び腫瘍細胞に対する免疫化も有益に実施することができる。この細胞毒性Ｔ- リンパ球刺激をこの際、驚くべきことに初めて示すことができた。ヨーロッパ特 許公開第３３３，５２３号広報及びＰＣＴ ＷＯ９２／１９２６３中に記載され た免疫増強と対照的に、これをまず第一に全身性で、すなわち粘膜でなく、強度 及び時間の点で又は時間的経過の点で調節することができる。更に免疫増強に関 して狭く、正確に定義された粒子の大きさの分布は不必要である。これは技術上 の利点をもたらす。 ここに記載する方法は、細菌、ウィルス、原生動物及び腫瘍細胞によって引き 起こされる疾病に対するヒト及ひ動物の免疫化に使用される。市販のワクチンを 用いて不満足で、すなわち不十分で及び所望されない副作用の甘受下にしか達成 することができない、ウィルス、原生動物及び腫瘍細胞に対する免疫化には、特 にこの方法が主に使用される。本発明による方法による細胞毒性Ｔ-細胞の刺激 並びにより長い時間間隔にわたって持続する免疫応答が、この使用に対する基礎 となっている。 例１にＰ３０Ｂ２で表示される分枝された多重抗原ペプチドに対する抗体応答 の増強を記載する。このペプチドは破傷風トキシンの一般的Ｔ_H-細胞エピトープ （配列９４７−９６７）及びＢ-細胞からプラスモジウムベルグヘイのサーカム スポロゾイドプロテインのくり返し領域を形成する：Ｐ３０Ｂ２ ０．０２ｇを 水２．００ｇ中に溶解し、次いでこの溶液を超音波発生機によってジクロロメタ ン４０．０ｇ中にポリ（ｄ，１-乳酸-コ-グリコール酸）５０：５０ ２．０ｇ を有する溶液中で分散する。噴霧乾燥によってこの分散液から球状微粒子（ＲＧ ５０２）を製造する。次いで抗原を負荷された微粒子を、たまごレシチンの５％ 滅菌溶液（オボチン１７０、ルーカスメイヤー、Ｄ-ハンブルグ）中で振とうし て懸濁する。この懸濁液を８匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスのグループに夫々０．５ｍ ｌ皮下注射する。マウス１匹あたり注射される抗原の量は３０μｇである。比較 として８匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスの第二グループを不完全フロイントアジユバン ド（ＩＦＡ）の抗原同量で免疫化する。抗体力価をＥＬＩＳＡで測定する。 図２はＩＦＡと比較してＲＧ５０２による免疫増強の例１に関する時間的経過 を示す。ＲＧ５０２及びＩＦＡで得られた抗体力価は免疫後最初の１５週間相互 に同等である。その後、ＩＦＡにより誘発された力価は減少し、一方微粒子で誘 発された力価は少なくとも２８週間一定に保たれる。親水性の著しく膨潤し、急 速に遊離しかつ急速に生物分解しうるバイオポリマー、たとえばＰＬＧＡ５０： ５０を用いて、抗体力価１−２・１０³が投与２週間後に得られ、少なくとも２ ８週間にわたって一定に保たれる。これに反してＩＦＡ-製剤の１回投与後に測 定される力価はすでに１５週間後に減少し、２８週間後で、２・１０²でしかな い。 例２にＰ３０Ｂ２（例１による）で表示される分枝された多重抗原ペブチドに 対する抗体応答の増強を記載する。このペプチドは破傷風トキシンの一般的Ｔ_H- 細胞エピトープ（配列９４７−９６７）及びＢ-細胞からプラスモジウムベルグ ヘイのサーカムスポロゾイドプロテインのくり返し領域を形成する：Ｐ３０Ｂ２ ０．０２ｇを水２．００ｇ中に溶解し、次いでこの溶液を超音波発生機によっ てジクロロメタン４０．０ｇ中にポリ（ｄ，１-乳酸）（Resomer ２６，ベーリ ンガーインゲルハイム）２．０ｇを有する溶液中で分散する。シリコーン油の添 加によって誘発されるコアセルベーションによって、この分散液から球状微粒子 （Ｒ２０６）を製造する。次いで抗原を負荷された微粒子を、たまごレシチンの ５％滅菌溶液（オボチン１７０、ルーカスメイヤー、Ｄ-ハンブルグ）中で振と うして懸濁する。この懸濁液を８匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスのグループに夫々０． ５ｍｌ皮下注射する。マウス１匹あたり注射される抗原の量は３０μｇである。 比較として８匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスの第二グループを不完全フロイントアジユ バント（ＩＦＡ）の抗原同量で免疫化する。抗体力価をＥＬＩＳＡで測定する。 図３は、ＩＦＡに比較してＲ２０６による免疫増強の、例２に関する時間的経過 を示す。疎水性の弱く膨潤し、徐々に遊離しかつ徐々に生物分解しうるＲ２０６ で得られた抗体力価は最初の１２週間連続的に増加し、次いでＩＦＡで免疫２週 間後すでに得られた水準に達する。ＩＦＡ-力価は約１５週間後再び連続的に減 少するが、Ｒ２０６-力価は少なくとも２８週間にわたって一定を保つ。 例３にＰ３０Ｂ２（例１による）で表示される分枝された多重抗原ペブチドに 対する抗体応答の増強を記載する。このペプチドは破傷風トキシンの一般的Ｔ_H- 細胞エピトープ（配列９４７−９６７）及びＢ-細胞からプラスモジウムベルグ ヘイのサーカムスポロゾイドプロテインのくり返し領域を形成する：Ｐ３０Ｂ２ を例１と同様にポリ（ｄ，１-乳酸-コ-グリコール酸）７５：２５（ResomerＲＧ ７５２，ベーリンガーインゲルハイム）中に入れ、球状微粒子（ＲＧ７５２）に 加工処理する。同一量のＰ３０Ｂ２を含有する微粒子ＲＧ７５２、ＲＧ５０２（ 例１から）及びＲ２０６（例２から）を、たまごレシチンの５％滅菌溶液（オボ チン１７０、ルーカスメイヤー、Ｄ-ハンブルグ）中で振とうして懸濁する。こ の懸濁液を８匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスのグループに夫々０．５ｍｌ皮下注射する 。マウス１匹あたり注射される抗原の量は３０μｇである。比較として８匹のＢ ＡＬＢ／Ｃマウスの第二グループを不完全フロイントアジユバント（ＩＦＡ）の 抗原同一量で免疫化する。抗体力価をＥＬＩＳＡで測定する。 図４は、ＩＦＡに比較してＲＧ５０２、ＲＧ７５２及びＲ２０６による免疫増 強の、例３に関する時間的経過を示す。急速にかつ徐々に遊離するバイオポリマ ーから生じる、これらのマイクロカプセル混合物で得られる抗体力価は、急速に 増加し、ＩＦＡで誘発された抗体力価よりもファクター２．５だけ高い水準を免 疫２週間後にすでに得られる。ＩＦＡ-力価は約１５週間後に再び連続的に減少 するが、マイクロカプセル混合物で得られる力価は少なくとも２８週間にわたっ て比較的一定を保つ。 例４にＰ３０Ｂ２（例１による）で表示される分枝された多重抗原ペプチドに 対する抗体応答の増強を記載する。このペプチドは破傷風トキシンの一般的Ｔ_H- 細胞エピトープ（配列９４７−９６７）及びＢ-細胞からプラスモジウムベルグ ヘイのサーカムスポロゾイドプロテインのくり返し領域を形成する：Ｐ３０Ｂ２ を例１と同様にポリ（ｄ，１-乳酸-コ-グリコール酸）５０：５０（ResomerＲＧ ５０２、ベーリンガーインゲルハイム）中に入れ、球状微粒子（ＲＧ５０２）に 加工処理する。抗原が負荷された微粒子をたまごレシチンの５％滅菌溶液（オボ チン１７０、ルーカスメイヤー、Ｄ-ハンブルグ）中で振とうして懸濁する。こ の懸濁液を８匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスのグループに夫々０．５ｍｌ皮下注射する 。マウス１匹あたり注射される抗原の量は３×１０μｇである。注射を１６ 日後（１．ブースター）及び１１３日後（２．ブースター）にくり返す。比較と して８匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスの第二グループを不完全フロイントアジユバント （ＩＦＡ）の抗原同一量で免疫化する。抗体力価をＥＬＩＳＡで測定する。 図５は、ＩＦＡと比較してＲＧ５０２のブースター注射後の免疫化の、例４に 関する時間的経過を示す。ＲＧ５０２及びＩＦＡで得られる抗体力価は、同一程 度で増加する。したがって本発明による方法は、ブースターによって得られる免 疫増強にも適する。 例５に、例１−４によるＰ３０Ｂ２で表示される分枝された多重抗原ペプチド に対するＴ_H-リンパ球増殖Ｐ３０Ｂ２を例１，２及び３と同様にくＲＧ５０２、 ＲＧ７５２及びＲ２０６中に入れ、種々の強い膨潤性を有する球状微粒子に加工 処理する。同一量のＰ３０Ｂ２を含有する微粒子を、たまごレシチンの５％滅菌 溶液（オボチン１７０、ルーカスメイヤー、Ｄ-ハンブルグ）中で振とうして懸 濁する。この懸濁液を８匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスのグループに夫々０．５ｍｌ皮 下注射する。マウス１匹あたり注射される抗原の量は３０μｇである。比較して ８匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスの第二グループを不完全フロイントアジユバント（Ｉ ＦＡ）の抗原同一量で免疫化する。抗体力価をＥＬＩＳＡで測定する。 図６は、種々のマイクロカプセル製剤及びＩＦＡ-製剤の投与１４日後の、例 ５中に記載されたＴ-リンパ球増殖を示す。すべてのマイクロカプセル製剤、す なわち急速な抗原遊離を有するＲＧ５０２、ほとんどに緩慢化された抗原遊離を 有するＲＧ７５２及び著しく緩慢化された抗原遊離を有するＲ２０６、並びにす べて３つのマイクロカプセルタイプの混合物がＴ-リンパ球-増殖を少なくとも同 等の、一部ＩＦＡ-製剤よりも強い程度で増強することが明らかである。 例６に、プラズモジウムベルグヘイのサーカムスポロイドプロテインのＴ_c-細 胞エピトープ（ＣＴＬ３５９Ａ、配列２５２−２６０）上で細胞毒性Ｔ-リンパ 球-反応を生じることを記載する：ＣＴＬ３５９Ａ０．００８ｇを水１．０ｇ中 に溶解し、次いでこの溶液を超音波発生機によって、ジクロロメタン６０．０ｇ 中にポリ（ｄ，１-乳酸-コ-グリコール酸）４．０ｇ（Resomer ５０２、ベーリ ンガーインゲルハイム）を含有する溶液中に分散する。噴霧乾燥によってこの分 散液から球状微粒子を製造する。これらの、ＣＴＬ３５９Ａで負荷された微 粒子を、例１によるＰ３０Ｂ２で負荷された微粒子とＣＴＬ３５９Ａ：Ｐ３０Ｂ ２割合１：１０で混合し、ＣＴＬに対する免疫応答を増加する。次いでマイクロ カプセルの混合物をたまごレシチンの５％滅菌溶液（オボチン１７０、ルーカス メイヤー、Ｄ-ハンブルグ）中で振とうして懸濁する。この懸濁液を２匹のＢＡ ＬＢ／Ｃマウスのグループに夫々０．５ｍｌ皮下注射する。マウス１匹あたり注 射される抗原の量は４μｇＣＴＬ３５９Ａ及び４０μｇＰ３０Ｂ２である。Ｔ_c- 細胞応答を、１０日及び２０日後細胞-溶解-テストで測定する。 図７は、免疫化又は製剤の投与の１０日及び２０日後測定された例６に関する Ｔ_c-リンパ球応答を示す。パーセント細胞-溶解-活性は、作用／標的細胞割合Ｅ ／Ｔの存在下に表わされる。マイクロカプセル化されたＴ_c-エピトープ及びＴ_H- エピトープ（ＲＧ５０２中のＰ３０Ｂ２＋３５９Ａ）の同時間投与は、投与２０ 日後に観察することができる著しいＴ_c-リンパ球-刺激を驚くべきことに誘発す る。Ｔ_c-応答の時間的経過が特に重要と考えられる。この応答はＴ_H-又は抗体応 答に反して著しくより長い時間を必要とする。 本発明に於て、合成抗原に対する免疫応答を増強する、生物分解性球状微粒子 が提案されていることが重要である。使用されるバイオポリマーの物理的-化学 的性質の確定によって、この免疫増強をその程度及び時間的経過で調節すること ができる。この方法は、更に抗体-及びＴ_H-リンパ球-増強に細胞毒性Ｔ-リンパ 球も刺激することもできる。免疫増強の程度は、ＩＦＡ-製剤によって得られる 増強と少なくとも同等であり、その時間的経過は明らかに延長される。同時に、 ウィルス、細菌、原生動物又は腫瘍細胞によって引き起こされる疾病に対するヒ ト及び動物の免疫化に使用することができる処理方法である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 メン・イング スイス国、ツェーハー‐1012 ローザン ヌ、アヴェニュー・ヴィクトール‐ルフィ ー、52 (72)発明者 トーマシン・クラウディオ スイス国、ツェーハー‐ラッペルスヴィ ル、ノイエ・ヨーナストラーセ、105 (72)発明者 メルクレ・ハンス・ペーター スイス国、ツェーハー‐8049 チューリッ ヒ、オッテンベルクストラーセ、22

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．合成抗原に対するヒト及び動物の免疫応答を増強するにあたり、合成抗原を 先ず生物分解性球状微粒子に埋め込み、その後合成抗原が負荷された微粒子を分 散媒体中に懸濁し、この組成物を非経口的に投与し、その際増強された免疫応答 を発生させることを特徴とする、上記増強方法。 ２．合成抗原として少なくとも１個のＢ-細胞-エピトープ及び少なくとも１個の Ｔ_H-細胞-エピトープを有する簡単な鎖から成る化合物を使用することを特徴と する、上記方法。 ３．合成抗原としてくり返し共有結合されたＢ-細胞-エピトープ及びＴ_H-細胞- エピトープから成る化合物を使用することを特徴とする、上記方法。 ４．合成抗原として細胞毒性Ｔ-細胞-エピトープ（Ｔ_c）から成る化合物を使用 することを特徴とする、上記方法。 ５．合成抗原として、少なくとも１個のＴ_H-及び少なくとも１個のＴ_c-エピトー プの混合物を使用することを特徴とする、上記方法。 ６．合成抗原は、原生動物又はウィルス又は細菌又は腫瘍細胞から生じるＢ-及 びＴ-細胞-エピトープを含有することを特徴とする、請求の範囲１ないし５のい ずれかに記載の方法。 ７．合成抗原は、原生動物又はウィルス又は細菌又は腫瘍細胞から、又はこれら の任意の組合せから生じるＢ-及びＴ-細胞-エピトープを含有することを特徴と する、請求の範囲１ないし５のいずれかに記載の方法。 ８．球状微粒子は生物分解性バイオポリマーを主成分とし、この際バイオポリマ ーはポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）、ポ リカプロラクトン、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ヒドロキシ酪酸-コ-バレリ アン酸）、ポリオルトエステル又はポリアンヒドライドより成る群から選ばれる ことを特徴とする、請求の範囲１ないし７のいずれかに記載の方法。 ９．バイオポリマーは、少なくとも２個の異なるグループから生じることを特徴 とする、請求の範囲８記載の方法。 １０．分散媒体として水性又は油状レシチン-液又は水中油型（waessrig-oelige ）レシチン-エマルジョンを使用することを特徴とする、請求の範囲１〜９の いずれかに記載の方法。 １１．分散媒体としてマイクロエマルジョンを使用することを特徴とする、請求 の範囲１〜９のいずれかに記載の方法。 １２．ウィルス、細菌、原生動物又は腫瘍細胞によって引き起こされる疾病に対 してヒト及び動物を免疫化するのに、請求の範囲１〜１１のいずれかに記載の方 法を使用する方法。