PT1585542E - Composições imunogénicas contendo fosfolípido - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÕES IMUNOGÉNICAS CONTENDO FOSFOLÍPIDO

Declaração de pedidos relacionados

Este pedido reivindica o beneficio da prioridade para o pedido de patente provisório U.S. N.° 60/436 919 submetido a 27 de Dezembro de 2002. Este pedido também reivindica o benefício da prioridade para o pedido de patente provisório U.S. N.° 60/513 075 submetido a 21 de

Outubro de 2003.

Campo da invenção A presente invenção refere-se geralmente a composições farmacêuticas. Em particular, a invenção refere-se a composições imunogénicas que compreendem adjuvantes fosfolipidos.

Antecedentes A emergência de vacinas de subunidades criadas por tecnologia de ADN recombinante intensificou a necessidade de composições que contêm adjuvantes seguras e eficazes. As vacinas de subunidades, enquanto oferecem vantagens significativas sobre as vacinas vivas e mortas tradicionais em termos de segurança e custo de produção, geralmente apresentam polipeptideos isolados ou misturas de polipeptideos isolados ao sistema imune, que têm imunogenicidade limitada quando comparada com, por exemplo, vírus inteiros, bactérias e afins. Como resultado, estas vacinas geralmente beneficiam de adjuvantes com capacidades imunoestimulatórias significativas, que as ajudam a alcançar o seu potencial completo no tratamento da doença.

As vacinas vivas tradicionais, por outro lado, não requerem normalmente adjuvantes. Além disso, as vacinas mortas são geralmente mais imunogénicas do que as vacinas de subunidades e normalmente não requerem adjuvantes. Contudo, estas vacinas, como as vacinas de subunidades, 2 podem também beneficiar de adjuvantes que têm capacidades imunoestimulatórias significativas.

Sumário da invenção A presente invenção refere-se a composições imunogénicas que compreendem adjuvantes que têm capacidades imunoestimulatórias significativas e, em particular, composições compreendendo adjuvantes fosfolipidos.

De acordo com um primeiro aspeto da invenção, uma composição imunogénica é providenciada que compreende: (a) um excipiente farmaceuticamente aceitável; (b) uma microparticula de polímero que compreende um polímero biodegradável, por exemplo, um polímero selecionado a partir de um poli(α-hidroxi ácido), um ácido polihidroxibutírico, uma policaprolactona, um poliortoester, um polianidrido, e um policianoacrilato; (c) um antígeno adsorvido para a microparticula; e (d) um composto fosfolípido, por exemplo, um composto fosfolípido sintético da seguinte fórmula:

X

(ÇH^

O

O HO-P=0 HO-P=0

O

O

/

G

3 em que: R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em (a) C (0) ; (b) C (0)-Ci-i4alquil-C (0) , em que o C4-i4 alquilo é opcionalmente substituído com hidroxi, Ci^5 alcoxi, Ci^s alquilenodioxi, Ci_5 alquilamino, ou C1-5 alquilarilo, em que a fração arilo do Ci-5-alquil-arilo is opcionalmente substituído com Cd-5 alcoxi, Ci_5 alquilamino, Ci^s alcoxiamino, Ci_5 alquilamino-Ci-5 alcoxi, -O-C1-5 alquilamino-Ci-5 alcoxi, -O-C1-5 alquilamino-C (0) -C1-5 alquilo C(0)0H, -O-C1-5 alquilamino-C (0)-C1-5 alquil-C (0) C1-5 alquilo; (c) C2 a C15 alquilo de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído com hidroxi ou alcoxi; e (d) -C(0)-C6 -12 arileno-C (0) - em que o arileno é opcionalmente substituído com hidroxi, halogénio, nitro ou amino; a e b são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; d, d' , d", e, e' e e" são independentemente um número inteiro de 1 a 4; X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste num nulo, oxigénio, NH e N(C(0)Ci-4 alquilo), e N (C1—4 alquilo) 2; W1 e W2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em carbonilo, metileno, sulfona e sulfóxido; R2 e R3 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em: (a) C2 a C20 alquilo de cadeia linear ou cadeia ramificada que é opcionalmente substituído com oxo, hidroxi ou alcoxi, (b) C2 a C20 alcenilo ou dialcenilo de cadeia linear ou cadeia ramificada que é opcionalmente substituído com oxo, hidroxi ou alcoxi; (c) C2 a C2o alcoxi de cadeia linear ou cadeia ramificada que é opcionalmente substituído com oxo, hidroxi ou alcoxi; (d) -NH-C2 a C20 alquilo de cadeia linear ou cadeia 4 ramificada, em que o grupo alquilo é opcionalmente substituído com oxo, hidroxi ou alcoxi; e

em que Z é selecionado a partir do grupo que consiste em 0 e NH, e M e N são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C2 a C2o alquilo, alcenilo, alcoxi, aciloxi, alquilamino, e acilamino de cadeia linear ou cadeia ramificada; R3 e R6 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C2 a C2o alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou cadeia ramificada, opcionalmente substituído com fluoro ou oxo; R4 e R7 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C(0)C2 a C2o alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou cadeia ramificada; C2 a C2o alquilo de cadeia linear ou cadeia ramificada; C2 a C2o alcoxi de cadeia linear ou cadeia ramificada; C2 a C2o alcenilo de cadeia linear ou cadeia ramificada; em que os grupos alquilo, alcenilo ou alcoxi são independentemente e opcionalmente substituídos com hidroxi, fluoro ou Ci a C5 alcoxi; G1, G2, G3 e G4 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em oxigénio, metileno, amino, tiol, -NHC (0) -, e -N(C(0)Ci-4 alquilo)-; ou G2 R4 ou G4 R7 podem ser juntos um átomo de hidrogénio ou hidroxil; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A invenção também providencia uma composição imunogénica para utilização num método de administração de uma quantidade terapêutica de um antígeno a um hospedeiro 5 animal vertebrado. A invenção também providencia uma composição imunogénica para utilização num método para tratar um hospedeiro animal que tem uma infeção por um organismo patogénico ou tumor. A invenção também providencia uma composição imunogénica para utilização num método para imunizar um hospedeiro animal contra um tumor ou infeção por um organismo patogénico. A invenção também providencia uma composição imunogénica para utilização num método para estimular uma resposta imune num hospedeiro animal. A invenção também providencia uma composição imunogénica para utilização em terapêutica. A invenção também providencia a utilização de uma composição imunogénica no fabrico de um medicamento para: administração de uma quantidade terapêutica de um antigeno a um hospedeiro animal vertebrado; tratamento de um hospedeiro animal que tem uma infeção por um organismo patogénico ou tumor; imunização de um hospedeiro animal contra um tumor ou infeção por um organismo patogénico; ou estimulação de uma resposta imune no hospedeiro animal.

Em muitas modalidades, as micropartícuias são formadas a partir de um poli(α-hidroxi ácido), tal como um poli(lactideo) ("PLA"), um copolímero de lactideo e glicolídeo, tal como um poli(D,L-lactideo-co-glicolideo) ("PLG"), ou um copolímero de D,L-lactídeo e caprolactona. Polímeros de poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo) incluem aqueles que têm uma razão molar lactídeo/glicolídeo que oscila entre, por exemplo, 20:80 e 80:20, 25:75 e 75:25, 40:60 e 60:40, ou 55:45 e 45:55, e que têm um peso molecular que varia entre, por exemplo, 5,000 a 200,00 Daltons, 10,000 e 100,000 Daltons, 20,000 e 70,000 Daltons, ou 40,000 e 50,000 Daltons.

Antigeno, fosfolípido e vários componentes opcionais 6 suplementares podem independentemente ser, por exemplo: (a) adsorvidos na superfície das micropartículas, (b) presos dentro das micropartículas, (c) em solução, (d) adsorvidos para separar populações de micropartículas, e/ou (e) presos dentro de populações separadas de micropartículas.

Componentes suplementares podem ser incluídos nas várias composições da presente invenção, incluindo produtos farmacêuticos, hormonas, enzimas, mediadores de transcrição ou tradução, intermediários da via metabólica, imunomoduladores, adjuvantes imunológicos adicionais, e combinações dos mesmos.

Os antígenos podem ser, por exemplo, antígenos contendo polipeptídeo ou antígenos contendo polinucleotídeo. Exemplos de antígenos contendo polinucleotídeo incluem, por exemplo, (a) sequências de ácido nucleico que codificam diretamente antígenos contendo polipeptídeo (por exemplo, moléculas de ARNm) e (b) construções de vetor que codificam indiretamente antígenos contendo polipeptídeo, por exemplo, construções de vetor que expressam sequências de ácido nucleico heterólogas, que, por sua vez, codificam antígenos contendo polipeptídeo (por exemplo, construções de vetor de ADN e construções de vetor de ARN).

Os antígenos contendo polipeptídeo podem ser, por exemplo, antígenos de tumor e antígenos de organismos patogénicos, tais como vírus, bactérias, fungos e parasitas. Assim, em algumas modalidades, o antígeno contendo polipeptídeo é derivado de um vírus tal como, por exemplo, vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), vírus herpes simples (HSV), vírus da imunodeficiência humana (VIH), citomegalovírus (CMVj , vírus da influenza (por exemplo, vírus da influenza A), e vírus da raiva. Noutras modalidades, o antígeno contendo polipeptídeo é derivado de 7 uma bactéria tal como, por exemplo, cólera, difteria, tétano, estreptococos (por exemplo, estreptococos A e B), tosse convulsa, Neisseria meningitides (por exemplo, meningite A, B, C, W, Y) . Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, e Haemophilus influenza (por exemplo, Haemophilus Influenza tipo B) . Ainda noutras modalidades, o antigeno contendo polipeptideo é derivado de um parasita tal como, por exemplo, um parasita da malária.

Outras modalidades da invenção estão dirigidas a utilização em métodos de entrega de antigenos a um hospedeiro animal, que compreende administrar ao hospedeiro animal qualquer das composições imunogénicas descritas aqui. 0 hospedeiro animal é preferencialmente um animal vertebrado, mais preferencialmente um mamífero, e ainda mais preferencialmente um humano. A presente invenção está também dirigida a utilizações em métodos para estimular uma resposta imune humoral e/ou uma resposta imune celular, incluindo uma resposta imune Thl, ou uma resposta CTL, ou linfoproliferação, ou produção de citocina, dentro de um hospedeiro animal num hospedeiro animal, compreendendo administrar ao animal qualquer das composições imunogénicas descritas aqui numa quantidade eficaz para induzir a resposta imune humoral e/ou celular.

Noutras modalidades, a invenção é dirigida para utilizações em métodos de imunização, que compreendem administrar a um hospedeiro animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer das composições imunogénicas descritas aqui. A presente invenção está ainda dirigida para utilizações em métodos de imunizar um hospedeiro animal, por exemplo, contra um tumor ou uma infeção virai, bacteriana, ou parasítica, compreendendo administrar ao animal qualquer das composições imunogénicas descritas aqui numa quantidade eficaz para induzir uma resposta protetora. A entrega das composições imunogénicas da invenção pode ser realizada por qualquer método conhecido, incluindo injeção directa (por exemplo, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular).

Portanto, de acordo com algumas modalidades da presente invenção, são providenciadas composições e utilizações em métodos que tratam, incluindo imunizam profilaticamente e/ou terapeuticamente, um hospedeiro animal, por exemplo, contra infeções virais, fúngicas, por micoplasma, bacterianas, ou por protozoários, bem como contra tumores. As utilizações em métodos da presente invenção são úteis para conferir imunidade profilática e/ou terapêutica a um hospedeiro animal, preferencialmente um humano. As utilizações em métodos da presente invenção podem também ser praticadas noutros animais que não sejam humanos, incluindo aplicações na investigação biomédica.

Uma vantagem particular das composições imunogénicas da presente invenção é a capacidade para gerar respostas imunes num sujeito vertebrado. Além da resposta de anticorpo convencional, as composições aqui descritas podem providenciar para, por exemplo, a associação dos antigenos expressos com moléculas da classe I do CMH de tal maneira que uma resposta imune celular in vivo ao antígeno de interesse pode ser montada, que estimula a produção de células T citoliticas ("CTL") para permitir o futuro reconhecimento do antígeno. Além disso, pode ser despoletada uma resposta específica do antígeno por células T auxiliares. Em conformidade, os métodos da presente invenção terão utilidade para despoletar respostas imunes celulares e/ou humorais para uma variedade de antigenos. Como um exemplo específico, antigenos derivados de patógenos virais podem induzir anticorpos, epítopos das células T auxiliares e epítopos das células T citotóxicas. Tais antigenos incluem aqueles codificados por vírus humanos e animais e podem corresponder tanto a proteínas estruturais como não estruturais. 9

Estas e outras modalidades, aspetos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão prontamente aparentes aqueles com habilitação comum na arte com vista à revelação aqui descrita.

Descrição detalhada da invenção A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado em contrário, métodos convencionais de química, química do polímero, bioquímica, biologia molecular, imunologia e farmacologia, dentro da habilitação da arte. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Pharmaceutical Sciences de Remington. 18a Edição (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick e N. Kaplan, editores, Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell, editores, 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edição, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S., editor, CRC Press, 1997) e Polymer Chemistry de Seymour/Carraher (4a edição, Mareei Dekker Inc., 1996).

Tal como usado nesta especificação e quaisquer reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma" e "o" incluem referências no plural a menos que o conteúdo dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, o termo "micropartícuia" refere-se a uma ou mais micropartícuias, e afins. A menos que indicado o contrário, todas as percentagens e razões aqui são dadas com base no peso. A. Definições

Ao descrever a presente invenção, os termos seguintes serão empregues, e pretende-se que sejam definidos como indicado a seguir. O termo "micropartícuia" como usado aqui, refere-se a uma partícula de cerca de 10 nm a cerca de 150 pm em 10 diâmetro, mais tipicamente cerca de 200 nm a cerca de 30 pm em diâmetro, e ainda mais tipicamente cerca de 500 nm a cerca de 10-20 pm em diâmetro. As micropart iculas da presente invenção podem agregar-se em grandes massas em algumas circunstâncias. Como um exemplo especifico, as microparticulas da presente invenção tendo adsorvido ADN podem ser, por exemplo, cerca de 0,5-2 pm em diâmetro antes da liofilização, enquanto as mesmas partículas podem estar, por exemplo, em agregados que têm um diâmetro de cerca de 5-15 pm após a liofilização. A micropartícuia geralmente terá um diâmetro que permite a administração parentérica ou mucosal sem ocludir agulhas e capilares. O tamanho da micropartícuia é prontamente determinado por técnicas bem conhecidas na arte, tais como espectroscopia de correlação de fotões, difratometria laser e/ou microscopia eletrónica de varrimento. O termo "partícula" também pode ser utilizado para denotar uma micropartícula como definido aqui.

As microparticulas de polímero para utilização aqui são tipicamente formadas de materiais que são esterilizáveis, substancialmente não tóxicos, e biodegradáveis. Tais materiais incluem polímeros biodegradáveis tais como poli(α-hidroxi ácidos), ácidos polihidroxibutíricos, policaprolactonas, poliortoesteres, polianidridas, e policianoacrilatos (por exemplo, polialquilcianoacrilato ou "PACA"). Mais tipicamente, as microparticulas para utilização com a presente invenção são microparticulas de polímero derivadas de poli(a-hidroxi ácidos), por exemplo, de um poli(lactídeo) ("PLA") ou um copolímero de lactídeo e glicolídeo, tal como um poli (D,L-lactídeo-co-glicolídeo) ("PLG"), ou um copolímero de D,L-lactídeo e caprolactona. As microparticulas de polímero podem ser derivadas de qualquer um de vários materiais poliméricos de partida que têm uma variedade de pesos moleculares e, no caso dos copolímeros tais como PLG, uma 11 variedade de razões de monómeros (por exemplo, lactídeo:glicolídeo) , a seleção das quais constituirá grandemente uma questão de escolha, dependendo em parte da espécie co-administrada. Estes parâmetros são discutidos um pouco mais abaixo. 0 termo "tensoativo" como usado aqui inclui detergentes, agentes dispersantes, agentes suspensores, e estabilizadores de emulsão. Os tensoativos catiónicos para utilização nas composições de micropartícula de polímero da presente invenção incluem, mas não se limitam a, brometo de cetiltrimetilamonio ou "CTAB" (por exemplo, cetrimida), cloreto de benzalconio, DDA (brometo de dimetil dioctodecil amonio), DOTAP (dioleoil-3-trimetilamonio-propano), e afins. Os tensoativos aniónicos incluem, mas não se limitam a, SDS (dodecil sulfato de sódio) , SLS (lauril sulfato de sódio), DSS (dissulfosuccinato), álcoois gordos sulfatados, e afins. Os tensoativos não iónicos incluem, mas não se limitam a, PVA, povidona (também conhecida como polivinilpirrolidona ou PVP), ésteres de sorbitano, polissorbatos, monoésteres de glicol polioxietilado, fenóis de alquilo polioxietilados, poloxâmeros, e afins. 0 termo "produto farmacêutico" refere-se a compostos biologicamente ativos tais como antibióticos, agentes antivirais, fatores de crescimento, hormonas, antígenos e afins. 0 termo "adjuvante" refere-se a qualquer substância que assiste ou modifica a ação de um produto farmacêutico, incluindo, mas não se limitando a, adjuvantes imunológicos, que aumentam ou diversificam a resposta imune a um antígeno. Portanto, os adjuvantes imunológicos são compostos que são capazes de potenciar uma resposta imune a antígenos. Os adjuvantes imunológicos podem potenciar a imunidade humoral e/ou celular.

Um "polinucleotídeo" é um polímero de ácido nucleico. Um polinucleotídeo pode incluir apenas 5, 6, 7 ou 8 12 nucleotídeos. Além disso, um "polinucleotídeo" pode incluir ambas sequências de cadeia dupla e simples e referem-se a, mas não se limitam a, ADNc de ARNm virai, procarionte ou eucarionte, ARN genómico e sequências de ADN de ADN virai (por exemplo, virus ARN e ADN e retrovírus) ou procarionte, e sequências de ADN sintético. 0 termo também inclui sequências que incluem qualquer dos análogos das bases de ADN e ARN. 0 termo inclui ainda modificações, tais como deleções, adições e substituições (geralmente de natureza conservadora), numa sequência nativa, por exemplo, onde a molécula de ácido nucleico codifica uma proteína antigénica. Estas modificações podem ser deliberadas, como através de mutagénese dirigida, ou podem ser acidentais, tais como através de mutações de hospedeiros que produzem antígenos.

Como usada aqui, a frase "ácido nucleico" refere-se a ADN, ARN, ou quimeras formadas das mesmas.

Uma "espécie contendo polinucleotídeo" é uma molécula, em que pelo menos uma porção da qual é um polinucleotídeo. Exemplos incluem construções de vector de ARN, construções de vector de ADN e afins.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" referem-se a um polímero de resíduos de aminoácido e não estão limitados a um comprimento mínimo do produto. Assim, os péptidos, oligopeptídeos, dímeros, multímeros, e afins, estão incluídos na definição. Ambos proteínas de comprimento inteiro e fragmentos das mesmas são abrangidas pela definição. Os termos também incluem modificações, tais como eliminações, adições e substituições (geralmente conservadoras na natureza), numa sequência nativa, por exemplo, de tal maneira que a proteína mantém a capacidade para despoletar uma resposta imunológica ou ter um efeito terapêutico num sujeito ao qual a proteína é administrada.

Uma "espécie contendo polipeptídeo" é uma molécula, em que pelo menos uma porção da qual é um polipeptídeo. 13

Exemplos incluem polipeptídeos, proteínas incluindo glicoproteínas, antígenos sacarídeos conjugados com proteínas transportadoras, e afins.

Por "antígeno" entende-se uma molécula que contém um ou mais epítopos capazes de estimular o sistema imune de um hospedeiro para produzir uma resposta imune celular específica do antígeno quando o antígeno é apresentado, ou uma resposta de anticorpo humoral. Um antígeno pode ser capaz de despoletar uma resposta celular e/ou humoral por si só ou quando presente em combinação com outra molécula.

Um "epítopo" é aquela porção de uma molécula antigénica ou complexo antigénico que determina a sua especificidade imunológica. Um epítopo está dentro do âmbito da presente definição de antígeno. Normalmente, um epítopo é um polipeptídeo ou polissacarídeo num antígeno que ocorre naturalmente. Em antígenos artificiais pode ser uma substância com baixo peso molecular tal como um derivado do ácido arsanílico. Um epítopo reagirá especif icamente in vivo ou in vitro com, por exemplo, anticorpos homólogos ou linfócitos T. Descritores alternativos são determinantes antigénicos, agrupamentos estruturais antigénicos e agrupamento hapténico.

Tipicamente, um epítopo incluirá entre cerca de 5-15 aminoácidos. Epítopos de uma dada proteína podem ser identificados usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítopo, bem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols em Methods in Molecular Biology, Volume 66 (Glenn E. Morris, Editor, 1996) Humana Press, Totowa, Nova Jérsia. Por exemplo, epítopos lineares podem ser determinados por, por exemplo, concorrentemente sintetizar grandes números de péptido sem suportes sólidos, os péptidos correspondendo a porções da molécula da proteína, e reagir os péptidos com anticorpos enquanto os péptidos ainda estão anexados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas na arte e descritas em, por exemplo, Patente 14 U.S. N.° 4 708 871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715. De forma semelhante, os epítopos conformacionais são prontamente identifiedos determinando a conformação espacial dos aminoácidos tais como por, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. O termo "antígeno" como usado aqui denota ambos antigenos de subunidade, isto é, antigenos que estão separados e discretos de um organismo completo com o qual o antígeno está associado na natureza, bem como bactérias, vírus, parasitas ou outros patógenos mortos, atenuados ou desativados ou células tumorais. Anticorpos tais como anticorpos anti-idiotipo, ou fragmentos dos mesmos, e mimótopos de péptido sintéticos, que podem imitar um antígeno ou determinante antigénico, também são capturados na definição de antígeno como usada aqui.

De forma semelhante, um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que expressa uma proteína imunogénica, ou determinante antigénico in vivo, tal como nas aplicações de imunização de ácido nucleico, também está incluído na definição de antígeno aqui.

Além disso, para efeitos da presente invenção, um "antígeno" refere-se a uma proteína, que inclui modificações, tais como eliminações, adições e substituições (geralmente conservadoras na natureza), na sequência nativa, desde que a proteína mantenha a capacidade para despoletar uma resposta imunológica. Estas modificações podem ser deliberadas, como através de mutagénese sítio-dirigida, ou podem ser acidentais, tais como através de mutações de hospedeiros que produzem os antigenos.

Uma "resposta imunológica" a um antígeno ou composição é o desenvolvimento num sujeito de uma resposta imune 15 humoral e/ou celular a moléculas presentes na composição de interesse. Para efeitos da presente invenção, uma "resposta imune humoral" refere-se a uma resposta imune mediada por moléculas de anticorpo, enquanto uma "resposta imune celular" é uma mediada por linfócitos T e/ou outras células sanguíneas brancas. Um aspeto importante da imunidade celular envolve uma resposta específica de antígeno por células T citolíticas ("CTL") . As CTL têm especificidade por antígenos péptidos que são apresentados em associação com proteínas codificadas pelo complexo maior de histocompatibilidade (CMH) e expressas nas superfícies das células. As CTL ajudam a induzir e promover a destruição intracelular de micróbios intracelulares, ou a lise de células infetadas com tais micróbios. Outro aspeto da imunidade celular envolve uma resposta específica de antígeno pelas células T auxiliares. As células T auxiliares atuam para ajudar a estimular a função, e focam a atividade de, células efetoras não específicas contra células que exibem antígenos péptidos em associação com moléculas do CMH na sua superfície. Uma "resposta imune celular" também se refere à produção de citocinas, quemocinas e outras tais moléculas produzidas por células T ativadas e/ou outras células sanguíneas brancas, incluindo aquelas derivadas de células T CD4+ e CD8+.

Uma composição tal como uma composição imunogénica ou vacina que despoleta uma resposta imune celular pode servir para sensibilizar um sujeito vertebrado pela apresentação do antígeno em associação com moléculas do CMH à superfície da célula. A resposta imune mediada pela célula é dirigida a, ou próxima de, células que apresentam antígeno na sua superfície. Além disso, os linfócitos T específicos de antígeno podem ser gerados para permitir a proteção futura de um hospedeiro imunizado. A capacidade de um antígeno ou composição particular para estimular uma resposta imunológica mediada pela célula 16 pode ser determinada por um número de ensaios, tais como por ensaios de linfoproliferação (ativação de linfócitos), ensaios de célula citotóxica CTL, por ensaiar os linfócitos T específicos do antígeno num sujeito sensibilizado, ou por medição da produção de citocina por células T em resposta a re-estimulação com antígeno. Tais ensaios são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376; e os exemplos a seguir. 0 antígeno de interesse pode também despoletar uma resposta imune mediada pelo anticorpo. Portanto, uma resposta imunológica pode incluir um ou mais dos seguintes efeitos: a produção de anticorpos por células B; e/ou a ativação de células T supressoras e/ou células T γδ dirigidas especificamente a um antígeno ou antígenos presentes na composição ou vacina de interesse. Estas respostas podem servir para neutralizar a infetividade, e/ou mediar o complemento do anticorpo, ou a citotoxicidade da célula dependente do anticorpo (ADCC) para providenciar proteção a um hospedeiro imunizado. Tais respostas podem ser determinadas utilizando imunoensaios padrão e ensaios de neutralização, bem conhecidos na arte, por exemplo, radioimunoensaios e ELISA.

As composições imunogénicas da presente invenção exibem "imunogenicidade aumentada" quando possuem uma capacidade superior para despoletar uma resposta imune do que a resposta imune despoletada por uma quantidade equivalente do antígeno numa composição diferente. Assim, uma composição pode exibir "imunogenicidade aumentada", por exemplo, porque a composição gera uma resposta imune mais forte, ou porque é necessária uma dose mais baixa de antígeno para alcançar uma resposta imune no sujeito ao qual é administrada. Tal imunogenicidade aumentada pode ser determinada, por exemplo, administrando as composições da invenção, e controlos do antígeno, a animais e comparando 17 os resultados dos dois ensaios.

Como usado aqui, "tratamento" (incluindo variações do mesmo, por exemplo, "tratar" ou "tratado") refere-se a qualquer de (i) a prevenção de um patógeno ou disfunção em questão (por exemplo cancro ou uma infeção patogénica, como numa vacina tradicional), (ii) a redução ou eliminação de sintomas, e (iii) a eliminação substancial ou completa do patógeno ou disfunção em questão. 0 tratamento pode ser efetuado profilaticamente (antes da chegada do patógeno ou disfunção em questão) ou terapêuticamente (após a chegada dos mesmos).

Os termos "quantidade eficaz" ou "quantidade farmaceuticamente eficaz" de uma composição imunogénica da presente invenção referem-se aqui a uma quantidade suficiente da composição imunogénica para tratar ou diagnosticar uma condição patológica de interesse. A quantidade exata requerida variará de sujeito para sujeito, dependendo, por exemplo, da espécie, idade, e condição geral do sujeito; a severidade da condição a ser tratada; o antigeno particular de interesse; no caso de uma resposta imunológica, a capacidade do sistema imune do sujeito para sintetizar anticorpos, por exemplo, e o grau de proteção desejado; e o modo de administração, entre outros fatores. Uma quantidade "eficaz" apropriada em qualquer caso individual pode ser determinada por alguém com habilitação comum na arte. Assim, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" tipicamente cairá num intervalo relativamente amplo que pode ser determinado através de experiências de rotina.

Por "sujeito vertebrado" ou "animal vertebrado" entende-se qualquer membro do subfilo Cordata, incluindo, sem limitação, mamíferos tais como gado, ovelhas, porcos, cabras, cavalos, e humanos; animais domésticos tais como cães e gatos; e aves, incluindo domésticas, aves selvagens e cinegéticas tais como galos e galinhas incluindo frangos, perús e outras aves galináceas. 0 termo não denota uma 18 idade particular. Assim, tantos animais adultos como recém-nascidos estão cobertos.

Por "farmaceuticamente aceitável" ou "farmacologicamente aceitável" entende-se um material que não é biologicamente, ou de outra forma, indesejável, isto é, o material pode ser administrado a um indivíduo sem causar quaisquer efeitos biológicos excessivamente indesejáveis no indivíduo ou interagindo de uma maneira excessivamente deletéria com qualquer dos componentes da composição no qual está contido. 0 termo "excipiente" refere-se a qualquer substância essencialmente acessória que pode estar presente na forma de dosagem acabada. Por exemplo, o termo "excipiente" inclui veículos, ligantes, desintegrantes, preenchidores (diluentes), lubrificantes, deslizadores (potenciadores do fluxo), auxiliares de compressão, corantes, adoçantes, conservantes, agentes suspensores/dispersantes, formadores de película/revestidores, aromatizantes e tintas de impressão.

Por "pH fisiológico" ou um "pH no intervalo fisiológico" entende-se um pH no intervalo de aproximadamente 7,2 a 8,0 inclusive, mais tipicamente no intervalo de aproximadamente 7,2 a 7,6 inclusive.

Como usada aqui, a frase "construção de vetor" geralmente refere-se a qualquer montagem de uma construção que é capaz de dirigir a expressão de uma sequência (s) ou gene(s) de ácido nucleico de interesse. Uma construção de vetor tipicamente inclui um promotor/potenciador transcricional ou elemento(s) que define(m) o locus, ou outros elementos que controlam a expressão génica por outros meios tais como splicing alternativo, exportação de ARN nuclear, modificação do mensageiro pós-tradução, ou modificação da proteína pós-transcrição. Além disso, a construção do vetor tipicamente inclui uma sequência que, quando transcrita, está operacionalmente ligada à 19 sequência (s) ou gene(s) de interesse e atua como uma sequência de iniciação da tradução. A construção do vetor também pode opcionalmente incluir um sinal que dirige a poliadenilação, um marcador selecionável, bem como um ou mais locais de restrição e uma sequência de terminação da tradução. Além disso, se a construção do vetor é colocada num retrovirus, a construção do vetor pode incluir um sinal de empacotamento, repetições terminais longas (LTR), e locais de ligação do iniciador de cadeia positivos e negativos apropriados ao retrovirus utilizado (se estes não estão já presentes).

Uma "construção de vetor de ADN" refere-se a uma molécula de ADN que é capaz de dirigir a expressão de uma sequência(s) ou gene(s) de ácido nucleico de interesse.

Um tipo especifico de construção de vetor de ADN é um plasmideo, que é uma molécula de ADN epissomal circular capaz de replicação autónoma dentro de uma célula do hospedeiro. Tipicamente, um plasmideo é um loop de ADN de cadeia dupla circular ao qual segmentos adicionais de ADN podem ser ligados. pCMV é um plasmideo especifico que é bem conhecido na arte. Um vetor pCMV preferido é um que contém o promotor/potenciador do gene immediate early de CMV e um terminador da hormona de crescimento bovina. É descrito com detalhe em Chapman, B. S., et al. 1991. "Effect of intron A from human cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells." Nucleic Acids Res. 19:3979-86. São conhecidas outras construções de vetor de ADN, que são baseadas em virus de ARN. Estas construções de vetor de ADN tipicamente compreendem um promotor que funciona numa célula eucarionte, 5' de uma sequência de cADN para a qual o produto de transcrição é uma construção de vetor de ARN (por exemplo, um replicão de vetor de ARN alfavirus), e uma região de terminação 3' . A construção do vetor de ARN compreende preferencialmente um genoma de ARN de um 20 picornavírus, togavírus, flavivírus, coronavírus, paramixovírus, vírus da febre amarela, ou alfavírus (por exemplo, vírus de Sindbis, vírus da Floresta de Semliki, vírus da encefalite equina Venezuelana, ou vírus do Rio Ross) , que foi modificado pela substituição de um ou mais genes da proteína estrutural com uma sequência de ácido nucleico heteróloga selecionada que codifica um produto de interesse. As construções do vetor de ARN podem ser obtidas por transcrição in vitro a partir de um molde de ADN. Exemplos específicos incluem plasmídeos baseados no vírus de Sindbis (pSIN) tais como pSINCP, descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5 814 482 e 6 015 696, bem como nos pedidos de Patente Internacional WO 97/38087, WO 99/18226 e comumente detida WO 02/26209. A construção de tais vetores, em geral, é descrita nas Patentes U.S. 5 814 482 e 6 015 6 9 6.

Outro exemplo de construções de vetor inclui construções de vetores de ARN (por exemplo, construções de vetor alfavírus) e afins. Como usados aqui, "construção de vetor de ARN", "replicão de vetor de ARN" e "replicão" referem-se a uma molécula de ARN que é capaz de dirigir a sua própria amplificação ou auto-replicação in vivo, tipicamente dentro da célula alvo. A construção de vetor de ARN é utilizada diretamente, sem o requisito para introdução de ADN numa célula e transporte para o núcleo onde a transcrição ocorreria. Ao utilizar o vetor de ARN para entrega direta no citoplasma da célula hospedeira, a replicação autónoma e tradução da sequência de ácido nucleico heteróloga ocorre eficazmente. B. Métodos gerais 1. Fosfolípidos

Os compostos fosfolípidos são utilizados em ligação com a presente invenção. A família de compostos fosfolípidos para utilização na presente invenção é da seguinte fórmula: 21 21 fCH^ (CHa)·" r( i~v XJ- (ÇEfe)' 0 1 HO-1=0 0 1 (ÇH2)d ^ jcHjDí* K» G1 1 (ÇHih,

HO—1=0 O (ÇHa)c / (CMirf ^ G3 Rs R' / em que: R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em (a) C(0); (b) C (0) Ci-i4 alquil-C (0) , em que o C1-14 alquilo é opcionalmente substituído com hidroxi, C1-5 alcoxi, C1-5 alquilenodioxi, C1-5 alquilamino, ou Ci-5-alquil-arilo, em que a fração arilo do Ci-5-alquil-arilo é opcionalmente substituído com C1-5 alcoxi, C1-5 alquilamino, C1-5 alcoxi-amino, C1-5 alquilamino-Ci-5 alcoxi, 0 C1-5 alquilamino-Ci-5 alcoxi, 0 C1-5 alquilamino-C (0) C1-5 alquil C(0)0H, 0 C1-5 alcilamino-C (0) C1-5 alquil-C (0) C1-5 alquilo; (c) C2 a Ci alquilo de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído com hidroxi ou alcoxi; e (d) C(0) C 6—12 arileno-C(O) em que o arileno é opcionalmente substituído com hidroxi, halogéneo, nitro ou amino; a e b são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; d, d' , d", e, e' e e" são independentemente um número 22 inteiro de 1 a 4; X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste num nulo, oxigénio, NH e N (C (0) Ci-4 alquilo), e N (C1-4 alquilo)2; W1 e W2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em carbonilo, metileno, sulfona e sulfóxido; R2 e R5 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em: (a) C2 a C20 alquilo de cadeia linear ou cadeia ramificada que é opcionalmente substituído com oxo, hidroxi ou alcoxi, (b) C2 a C20 alcenilo ou dialcenilo de cadeia linear ou cadeia ramificada que é opcionalmente substituído com oxo, hidroxil ou alcoxi; (c) C2 a C20 alcoxi de cadeia linear ou cadeia ramificada que é opcionalmente substituído com oxo, hidroxi ou alcoxi; (d) NH C2 a C2o alquilo de cadeia linear ou cadeia ramificada, em que o grupo alquilo é opcionalmente substituído com oxo, hidroxi ou alcoxi; e

(e) v m em que Z é selecionado a partir do grupo que consiste em 0 e NH, e M e N são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C2 a C20 alquilo, alcenilo, alcoxi, aciloxi, alquilamino, e acilamino de cadeia linear ou ramificada; R3 e R6 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C2 a C2o alquilo ou alcenilo de cadeia 23 23 linear ou cadeia ramificada, opcionalmente substituído com fluoro ou oxo; R' 4 e R7 sao independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C (0) C2 a C2o alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou cadeia ramificada; C2 a C2o alquilo de cadeia linear ou cadeia ramificada; C2 a C2o alcoxi de cadeia linear ou cadeia ramificada; C2 a C2o alcenilo de cadeia linear ou cadeia ramificada; em que os grupos alquilo, alcenilo ou alcoxi são independentemente e opcionalmente substituídos com hidroxi, fluoro ou Ci a C5 alcoxi; G1, G2, G3 e G4 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em oxigénio, metileno, amino, tiol, NHC (0) , e N(C(0)Ci-4 alquilo); ou G2 R4 ou G4 R7 podem juntos ser um átomo de hidrogénio ou hidroxil; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Em algumas modalidades específicas, R1 é C(0); a, b d, d', d", e e' e e" são independentemente 1 ou 2; X1, X2, Y1 e C20 6 Y2 são NH; W e W são carbonilo; R e R sao Ci0 a alquilo de cadeia linear que é substituído com oxo; R e R são C5-C10 alquilo de cadeia linear; R4 e R7 são C(0)C8-Cn alquilo de cadeia linear; e G1, G2, G3 e G4 são oxigénio.

Um exemplo de um composto específico para utilização em ligação com a presente invenção é o composto seguinte:

0 composto ilustrado está na forma enantiomérica 24 (R,R,R,R), mas outras formas enantioméricas incluindo a forma (R,S,S,R) também são desejáveis. Estes compostos são compostos sintéticos da Eisai Co. Ltd., Tóquio, Japão e são designados ER804057 e ER804053. São membros da anterior familia de fosfolípidos, sob a forma de sal de sódio, onde: R1 é C(0); a e b são 2; d, d', e e e' são 1; d" e e" são 2; X1, X2, Y1 e Y2 são NH; W1 e W2 são carbonilo; R2 e R5 são Ci3 alquilo de cadeia linear que é substituído com oxo na posição 2; R3 e R6 são C7 alquilo de cadeia linear; R4 e R1 sã C(0)Cn alquilo de cadeia linear; G1, G2, G3 e G4 são oxigénio. Este composto não compreende quaisquer grupos sacarídeo; é um composto difosfolípido, já que compreende dois grupos fosfodiéster 0

II -O—P—o- 1

>s °H (aqui, na forma de sal de sódio). Este composto também compreende seis grupos alcanos lineares,

n nos quais n é independentemente ou 6 ou 10. Quatro dos grupos alcano correspondem a grupos alcanoilo,

O -c

ch3 9 onde n é 10. Dois destes grupos alcanoilo correspondem a grupos alcanoiloxi, 3 25 Ο II-ο—c

que correspondem ainda a grupos alcanoiloxialcoxi,

Informação adicional referente aos compostos anteriores e a sua preparação pode ser encontrada, por exemplo, na Patente U.S. N.° 6 290 973 para Eisai Co., Ltd. 2. Antígenos A presente invenção terá utilização para estimular uma resposta imune contra uma ampla variedade de antigenos, incluindo antigenos associados com patógenos e tumores.

Antigenos da família herpesvírus, incluindo proteínas derivadas do vírus do herpes simples (HSV) tipos 1 e 2, tais como glicoproteínas gB, gD e gH do HSV-1 e HSV-2; antígenos derivados do vírus da varicela zóster (VZV), vírus de Epstein-Barr (EBV) e citomegalovírus (CMV) incluindo CMV gB e gH; e antígenos derivados de outros herpesvírus humanos tais como HHV6 e HHV7 podem ser convenientemente utilizados em ligação com a presente invenção. (Ver, por exemplo Chee et al., Cytomegalovirus (J.K. McDougall, editor, Springer-Verlag 1990) páginas 125-169, para uma revisão da proteína que codifica o conteúdo do citomegalovírus; McGeoch et al., J Gen. Virol. (1988) 69:1531-1574, para uma discussão dos vários HSV-1 codificados por proteínas; Patente U.S. N.° 5 171 568 para uma discussão sobre as proteínas gB e gD do HSV-1 e HSV-2 e dos genes que por isso codificam; Baer et al. , Nature 26 (1984) 310:207-211, para a identificação da proteína que codifica sequências num genoma EBV; e Davison e Scott, J. Gen. Virol. (1986) 67:1759-1816, para uma revisão sobre o VZV. )

Antígenos da família do vírus de hepatite, incluindo vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da hepatite delta (HDV), vírus da hepatite E (HEV) e vírus da hepatite G (HGV) , podem também ser convenientmente utilizados nas técnicas descritas aqui. A título de exemplo, a sequência genómica virai do HCV é conhecida, bem como o são métodos para obter a sequência. Ver, por exemplo, Publicação Internacional N.°s WO 89/04669; WO 90/11089; e WO 90/14436. O genoma do HCV codifica várias proteínas virais, incluindo El (também conhecido como E) e E2 (também conhecido como E2/NSI) e uma proteína da nucleocápside N-terminal (designada "núcleo") (ver, Houghton et al., Hepatology (1991) 14:381-388, para uma discussão sobre proteínas doHCV, incluindo El e E2). Cada destas proteínas, bem como os fragmentos antigénicos das mesmas, terão utilização na presente composição e métodos.

De forma análoga, a sequência para o δ-antígeno do HDV é conhecida (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 5 378 814) e este antígeno também pode ser convenientemente utilizado na presente composição e métodos. Além disso, antígenos derivados do HBV, tais como o antígeno núcleo, o antígeno de superfície, sAg, bem como as sequências pré-superfície, pre-Sl e pre-S2 (antes designadas pre-S), bem como combinações dos anteriores, tais como sAg/pre-Sl, sAg/pre-S2, sAg/pre-S1/pré-S2, e pre-Sl/pre-S2, terão utilização aqui. Ver, por exemplo, "HBV Vaccines - from the laboratory to license: a case study" em Mackett, M. e Williamson, J.D., Human Vaccines and Vaccination, páginas 159-176, para uma discussão sobre a estrutura do HBV; e Patentes U.S. N.°s 4 722 840, 5 098 704, 5 324 513, incorporadas aqui por 27 referência por inteiro; Beames et al., J Virol. (1995) 69:6833-6838, Birnbaum et al., J. Virol. (1990) 64:3319-3330; e Zhou et al., J. Virol. (1991) 65:5457-5464.

Antigenos derivados de outros vírus também terão utilização nas composições e métodos da presente invenção, tais como sem limitação, proteínas de membros das famílias Picornaviridae (por exemplo, poliovírus, etc.); Caliciviridae; Togaviridae (por exemplo, vírus da rubéola, vírus do dengue, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Bimaviridae; Rhabodoviridae (por exemplo, vírus da raiva, etc.); Filoviridae; Paramyxoviridae (por exemplo, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório, etc.); Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus da influenza tipos A, B e C, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviradae (por exemplo, HTLV-I; HTLV-II; HIV-1 (também conhecidos como HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc.)), incluindo, mas não limitados a, antigenos dos isolados HIVnib, HIVSF2f HIV/LAVf HIVlai, HIVmn) ; HIV-1Cm235í HIV-1us4; HIV-2; vírus da imunodeficiência símia (SIV) entre outros. Além disso, antigenos também podem ser derivados do vírus do papiloma humano (HPV) e do vírus da encefalite transmitido por carraças. Ver, por exemplo Virology, 3a Edição (W.K. Joklik editor, 1988); Fundamental Virology, 2a Edição (B.N. Fields e D.M. Knipe, editores, 1991), para uma descrição destes e de outros vírus.

Mais particularmente, as proteínas de envelope gpl20 ou gpl40 de qualquer dos isolados do HIV anteriores, incluindo membros dos vários subtipos genéticos do HIV, são conhecidas e reportadas (ver, por exemplo, Myers et al., Los Alamos Database, Laboratório Nacional de Los Alamos, Los Alamos, Novo México (1992); Myers et al., Human Retrovirus and Aids, 1990, Los Alamos, Novo México: Laboratório Nacional de Los Alamos; e Modrow et al. , J. Virol. (1987) 61:570-578, para uma comparação das sequências de envelope de uma variedade de isolados do HIV) 28 e antígenos derivados de qualquer destes isolados terá utilização nos presentes métodos. Além disso, a invenção é igualmente aplicável a outras proteínas imunogénicas derivadas de qualquer dos vários isolados do HIV, incluindo qualquer das várias proteínas de envelope tais como gpl60 e gp41, antígenos gag tais como p24gag e p55gag, bem como proteínas derivadas das regiões pol e tat. 0 vírus da influenza é outro exemplo de um vírus para o qual a presente invenção será particularmente útil. Especificamente, as glicoproteínas de envelope HA e NA da influenza A são de particular interesse para gerar uma resposta imune. Foram identificados numerosos subtipos HA da influenza A (Kawaoka et al., Virology (1990) 179:759-7 67; Webster et al., "Antigenic variation among type A influenza virus," páginas 127-168. Em: P. Palese e D.W. Kingsbury (editores), Genetics of influenza virus. Springer-Verlag, Nova Iorque). Assim, proteínas derivadas de quaisquer destes isolados também podem ser utilizadas nas composições e métodos descritos aqui.

As composições e métodos descritos aqui também terão utilização com numerosos antígenos bacterianos, tais como aqueles derivados de organismos que causam difteria, cólera, tuberculose, tétano, tosse convulsa, meningite, e outros estados patogénicos, incluindo, sem limitação, Bordetella pertussis, Neisseria meningitides (A, B, C, Y), Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, e Haemophilus influenza. Hemophilus influenza tipo B (HIB), Helicobacter pylori, e combinações dos mesmos. Exemplos de antígenos de Neisseria meningitides B são revelados nos seguintes pedidos de patente detidos comumente: PCT/US99/09346; PCT IB98/01665; e PCT IB99/00103. Exemplos de antígenos parasíticos incluem aqueles derivados de organismos que causam malária e doença de Lyme.

Antígenos adicionais para utilização com a invenção, que não são necessariamente exclusivos daqueles listados 29 noutros sítios deste pedido, incluem os seguintes: (a) um antígeno da proteína de N. meningitidis serogrupo B, tais como aqueles nas Referências 1 a 7 a seguir; (b) uma preparação de uma vesícula exterior à membrana (OMV) a partir de N. meningitidis serogrupo B, tais como aquelas reveladas nas Referências 8, 9, 10, 11, etc. a seguir; (c) um antígeno sacarídeo de N. meningitidis serogrupo A, C, W135 e/ou Y, tais como o oligossacarídeo revelado na Referência 12 a seguir do serogrupo C (ver também Referência 13) ; (d) um antígeno sacarídeo de Streptococcus pneumoniae [por exemplo Referências 14, 15, 16] . (e) um antígeno de N. gonorrhoeae [por exemplo, Referências 1, 2, 3]; (e) um antígeno de Chlamydia pneumoniae [por exemplo,

Referências 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23]; (f) um antígeno de

Chlamydia trachomatis [por exemplo Referência 24]; (g) um antígeno do vírus da hepatite A, tal como vírus desativado [por exemplo, Referências 25, 26]; (h) um antígeno do vírus da hepatite B, tal como antígenos de superfície e/ou núcleo [por exemplo, Referências 26, 27]; (i) um antígeno do vírus da hepatite C [por exemplo Referência 28]; (j) um antígeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina da tosse convulsa (PT) e hemoglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente também em combinação com pertactina e/ou aglutinogénios 2 e 3 [por exemplo,

Referências 29 e 30]; (k) um antígeno da difteria, tal como toxóide diftérico [por exemplo, capítulo 3 da Referência 31], por exemplo, o mutante CRM 197 [por exemplo,

Referência 32]; (1) um antígeno do tétano, tal como toxóide tetânico [por exemplo, capítulo 4 da Referência 31]; (m) um antígeno da proteína de Helicobacter pylori tal como CagA [por exemplo, Referência 33], VacA [por exemplo Referência 33], NAP [por exemplo Referência 34], HopX [por exemplo Referência 35], HopY [por exemplo Referência 35] e/ou urease; (n) um antígeno sacarídeo de Haemophilus influenzae B [por exemplo Referência 13]; (o) um antígeno de 30

Porphyramonas ginglvalis [por exemplo Referência 36]; (p) antígeno(s) da poliomielite [por exemplo Referências 37, 38] tais como IPV ou OPV; (q) antigeno(s) da raiva [por exemplo Referência 39] tais como vírus desativado liofilizado [por exemplo Referência 40, Rabavert™); (r) antígenos do sarampo, caxumba e/ou rubéola [por exemplo, capítulos 9, 10 e 11 da Referência 31]; (s) antígeno(s) da influenza [por exemplo capítulo 19 da Referência 31], tais como hemoglutinina e/ou proteínas de superfície da neuraminidase; (t) um antígeno de Moraxella catarrhalis [por exemplo, tempo 41]; (u) um antígeno de Streptococcus agalactiae (estreptococos do grupo B) [por exemplo Referências 42, 43]; (v) um antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococos do grupo A) [por exemplo

Referências 43, 44, 45]; (w) um antígeno de Staphylococcus aureus [por exemplo Referência 46]; e (x) composições compreendendo um ou mais destes antígenos. Onde um antígeno sacarídeo ou carbohidrato é utilizado, é preferencialmente conjugado com uma proteína transportadora de maneira a aumentar a imunogenicidade [por exemplo Referências 47 a 56] . Proteínas transportadoras preferidas são toxinas bacterianas ou toxóides, tais como toxóides diftéricos ou tetânicos. O toxóide diftérico CRM 197 é particularmente preferido. Outras proteínas transportadoras adequadas incluem proteína da membrana exterior de N. meningitidis [por exemplo Referência 57], péptidos sintéticos [por exemplo Referências 58, 59], proteínas de choque térmico [por exemplo Referência 60], proteínas da tosse convulsa [por exemplo Referências 61, 62], proteína D de H. influenzae [por exemplo Referência 63], toxina A ou B de C. difficile [por exemplo Referência 64], etc. Onde uma mistura comprende sacarídeos capsulares de ambos serogrupos A e C, é preferido que a razão (p/p) de sacarídeo MenA: sacarídeo MenC seja superior a 1 (por exemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ou superior). Sacarídeos de serogrupos 31 diferentes de N. meningitidis podem ser conjugados para as mesmas proteínas transportadoras ou diferentes. Qualquer reação de conjugação adequada pode ser utilizada, com qualquer ligante adequado onde necessário. Os antígenos de proteína tóxica podem ser desintoxicados onde necessário (por exemplo desintoxicação da toxina da tosse convulsa por meios químicos [Referência 30]. Ver: Pedido de patente internacional 99/24578 [Referência 1]; Pedido de patente internacional W099/36544 [Referência 2]; Pedido de patente internacional WO99/57280 [Referência 3]; Pedido de patente internacional WO00/22430 [Referência 4]; Tettelin et al., (2000) Science 287:1809-1815 [Referência 5]; Pedido de patente internacional W096/29412 [Referência 6]; Pizza el al. (2000) Science 287:1816-1820 [Referência 7]; Pedido de patente internacional PCT/IB01/00166 [Referência 8]; Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775):1093-1096 [Referência 9]; Fukasawa et al. (1990) Vaccine 17:2951-2958 [Referência 10]; Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323-333 [Referência 11]; Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698 [Referência 12]; Costantino et al. (1999) Vaccine 17:1251-1263 [Referência 13]; Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332 [Referência 14]; Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v [Referência 15]; Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207 [Referência 16]; Pedido de patente internacional apresentada no dia 3 de Julho de 2001 reivindicando prioridade de GB0016363.4 [Referência 17]; Kalman et al. (1999) Nature Genetics 21 :385-389 [Referência 18]; Read et al. (2000) Nucleic Acids Res 28:1397-406 [Referência 19]; Shirai et al. (2000) J. Infect. Dis. 181(Suplemento 3):S524-S527 [Referência 20]; Pedido de patente internacional WO99/27105 [Referência 21]; Pedido de patente internacional WO00/27994 [Referência 22]; Pedido de patente internacional WO00/37494 [Referência 23]; Pedido de patente internacional W099/28475 [Referência 24]; Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188 [Referência 32 32 volume 10:48-114 25]; Iwarson (1995) APMIS 103:321-326 [Referência 26]; Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 e 79-80 [Referência 27]; Hsu et al. (1999) Clin Liver Dis 3:901-915 [Referência 28]; Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334: 349-355 [Referência 29]; Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238 [Referência 30]; Vaccines (1988) editores Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0 [Referência 31]; Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70 [Referência 32]; Pedido de patente internacional WO93/18150 [Referência 33]; Pedido de patente internacional WO99/53310 [Referência 34]; Pedido de patente internacional W098/04702 [Referência 35]; Ross et al. (2001) Vaccine 19:4135-4142 [Referência 36]; Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308 [Referência 37]; Zimmerman e Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126 [Referência 38]; Dreesen (1997) Vaccine 15 Suppl:S2-6 [Referência 39]; MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998 Jan 16;47 (1):12, 19 [Referência 40]; McMichael (2000) Vaccine 19 Suplemento 1:S101-107 [Referência 41]; Schuchat (1999) Lancet 353(9146):51-6 [Referência 42]; pedidos de patente GB 0026333.5, 0028727.6 e 0105640.7 [Referência 43]; Dale (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-43, viii [Referência 44]; Ferretti et al. (2001) PNAS USA 98:4658-4663 [Referência 45]; Kuroda et al. (2001) Lancet 357 ( 9264):1225-1240; ver também páginas 1218-1219 [Referência 46]; Ramsay et al. (2001) Lancet 357(9251):195-196 [Referência 47]; Lindberg (1999) Vaccine 17 Suplemento 2:S28-36 [Referência 48]; Buttery e Moxon (2000) J R Coll Physicians London 34:163-168 [Referência 49]; Ahmad e Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-133, vii [Referência 50]; Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567 [Referência 51]; Patente Europeia 0 477 508 [Referência 52]; Patente U.S. N.° 5 306 492 [Referência 53]; Pedido de patente internacional W098/42721 [Referência 54]; Conjugate Vaccines (editores Cruse et al.) ISBN 3805549326, particularmente 33 [Referência 55]; Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISBN: 0123423368 e 012342335X [Referência 56]; pedido de patente Europeia 0372501 [Referência 57]; pedido de patente Europeia 0378881 [Referência 58]; pedido de patente Europeia 0427347 [Referência 59]; Pedido de patente internacional W093/17712 [Referência 60]; Pedido de patente internacional W098/58668 [Referência 61]; pedido de patente Europeia 0471177 [Referência 62]; Pedido de patente internacional WO00/56360 [Referência 63]; pedido de patente internacional WOOO/61761 [Referência 64].

Onde um antigeno diftérico é incluído na composição é também preferido que inclua antigeno tetânico e antígenos da tosse convulsa. De forma análoga, onde um antigeno tetânico é incluído é também preferido que inclua antígenos diftéricos e da tosse convulsa. De forma análoga, onde um antigeno da tosse convulsa é incluído é também preferido que inclua antígenos diftéricos e tetânicos.

Antígenos adicionais incluem antígenos dirigidos a peste, febre maculosa, varíola, tifo tifoide, vírus da leucemia felina, e febre amarela. 4. Composições de micropartículas imunogénicas

Polímeros biodegradáveis úteis para formar as composições de micropartículas imunogénicas descritas aqui incluem homopolímeros, copolímeros e misturas de polímero derivadas dos seguintes: ácido polihidroxibutírico (também conhecido como polihidroxibutirato) ; ácido polihidroxivalérico (também conhecido como polihidroxivalerato); ácido poliglicólico (PGA) (também conhecido como poliglicolídeo); ácido poliláctico (PLA) (também conhecido como polilactídeo); polidioxanona; policaprolactona; poliortoester; e polianidrido. Mais típicos são poli(α-hidroxi ácidos), tais como poli(L-lactídeo), poli(D,L-lactídeo) (ambos conhecidos como "PLA" aqui), poli(bidoxibutiratos), copolímeros de lactídeo e glicolídeo, tais como poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeos) 34 (designados como "PLG" aqui) ou copolímeros de D,L-lactídeo e caprolactona.

Os polímeros anteriores estão disponíveis numa variedade de pesos moleculares, e o peso molecular apropriado para uma dada utilização é prontamente determinado por alguém habilitado na arte. Assim, por exemplo, um peso molecular adequado para PLA pode estar na ordem de cerca de 2000 a 5000 . Um peso molecular adequado para PLG pode oscilar entre cerca de 10, 000 a cerca de 200,000, tipicamente cerca de 15,000 a cerca de 150,000.

Onde os copolímeros são utilizados, copolímeros com uma variedade de razões de monómero podem estar disponíveis. Por exemplo, onde PLG é utilizado para formar as micropartículas, uma variedade de razões molares lactídeo:glicolídeo terão utilização aqui, e a razão é largamente uma questão de escolha, dependendo em parte de qualquer espécie adsorvida e/ou presa co-administrada e da taxa de degradação desejada. Por exemplo, um polímero 50:50 PLG, contendo 50% de D,L-lactídeo e 50% de glicolídeo, providenciará um copolímero de rápida re-absorção enquanto o 75:25 PLG degrada-se mais lentamente, e 85:15 e 90:10, ainda mais lentamente, devido ao componente lactídeo aumentado. Misturas de micropartículas com razões variáveis de lactídeo:glicolídeo ratios também podem encontrar utilização aqui de maneira a alcançar a cinética de libertação desejada. A taxa de degradação das micropartículas da presente invenção também pode ser controlada por tais fatores como o peso molecular do polímero e a cristalinidade do polímero.

Os copolímeros PLG com razões variáveis de lactídeo:glicolídeo e pesos moleculares estão prontamente disponíveis comercialmente a prtir de um número de fontes incluindo da Boehringer Ingelheim, Alemanha e Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, AL. Alguns copolímeros PLG exemplares incluem: (a) RG 502, um PLG tendo uma razão 35 molar lactídeo/glicolídeo de 50:50 e um peso molecular de 12,000 Da; (b) RG 503, um PLG tendo uma razão molar lactídeo/glicolídeo de 50:50 e um peso molecular de 34,000 Da; (c) RG 504, um PLG tendo uma razão molar lactídeo/glicolídeo de 50:50 e um peso molecular de 48,000 Da, (d) RG 752, um PLG tendo uma razão molar lactídeo/glicolídeo de 75:25 e um peso molecular de 22,000 Da; r (e) RG 755, um PLG tendo uma razão molar lactídeo/glicolídeo de 75:25 e um peso molecular de 68,000 Da. Os polímeros PLG também podem ser sintetizados por policondensação simples do componente ácido láctico utilizando técnicas bem conhecidas na arte, tais como descritas em Tabata et al., J. Biomed. Mater. Res. (1988) 22 : 837-858.

Onde utilizados, os polímeros poli (D,L-lactídeo-co-glicolídeo) são tipicamente aqueles que têm uma razão molar lactídeo/glicolídeo que oscila de 20:80 a 80:20, mais tipicamente 40:60 a 60:40, e têm um peso molecular que varia entre 10,000 e 100,000 Daltons, mais tipicamente entre 20,000 Daltons e 70,000 Daltons.

As micropartículas são preparadas utilizando qualquer dos vários métodos bem conhecidos na arte. Por exemplo, em algumas modalidades, técnicas de evaporação emulsão/solvente duplas, tais como aquelas descritas na Patente U.S. N.° 3 523 907 e Ogawa et al., Chem. Pharm. Buli. (1988) 36:1095-1103, podem ser utilizadas aqui para fabricar as micropartículas. Estas técnicas envolvem a formação de uma emulsão primária que consiste em goticulas da solução do polímero, que é subsequentemente misturada com uma fase aquosa contínua que contém uma partícula estabilizadora/tensoativa.

Noutras modalidades, as micropartículas também podem ser formadas utilizando atomização e coacervação como descrito em, por exemplo, Thomasin et al., J. Controlled Release (1996) 41:131; Patente U.S. N.° 2 800 457; Masters, 36 Κ. (1976) Spray Drying 2a Edição, Wiley, Nova Iorque; técnicas de revestimento por suspensão no ar, tais como revestimento em recipiente rotativo e revestimento Wurster, como descrito por Hall et al., (1980) The "Wurster Process" em Controlled Release Technologies: Methods, Theory, and Applications (A.F. Kydonieus, editor), Volume 2, páginas 133-154 CRC Press, Boca Raton, Florida e Deasy, P.B., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. (1988) S(2):99-139; e gelificação iónica como descrito por, por exemplo, Lim et al., Science (1980) 210: 908-910.

Em modalidades preferidas, pode ser utilizado um sistema de evaporação do solvente água-em-óleo-em-água (a/o/a) para formar as microparticulas, ao longo das linhas descritas por 0'Hagan et al., Vaccine (1993) 11:965-969, PCT/US99/17308 (WO 00/06123) a 0'Hagan et al. e Jeffery et al., Pharm. Res. (1993) 10:362.

Em geral, um polímero de interesse tal como PLG é dissolvido num solvente orgânico, tal como acetato de etilo, cloreto de dimetilo (também designado cloreto de metileno e diclorometano), acetonitrilo, acetona, clorofórmio, e afins. O polímero será tipicamente providenciado numa solução com cerca de 1-30%, mais tipicamente cerca de 2-15%, ainda mais tipicamente cerca de 3-10% e mais tipicamente, cerca de 4-8%, num solvente orgânico. A solução do polímero é depois combinada com um primeiro volume de solução aquosa e emulsionada para formar uma emulsão o/a. A solução aquosa pode ser, por exemplo, água desionizada, solução normal salina, uma solução tamponada, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou uma solução tampão de citrato de sódio/ácido etilenodiaminotetraacético (citrato de sódio/ETDA). Estas últimas soluções podem (a) providenciar uma tonicidade, isto é, osmolaridade, que é essencialmente a mesma que os fluídos fisiológicos normais e (b) manter um pH compatível com condições fisiológicas normais. Em 37 alternativa, as características de tonicidade e/ou pH das composições da presente invenção podem ser ajustadas após a formação da micropartícula e antes da administração. Preferencialmente, a razão em volume da solução do polimero para a solução aquosa oscila de cerca de 5:1 a cerca de 20:1, mais preferencialmente cerca de 10:1. A emulsificação é conduzida utilizando qualquer equipamento apropriado para esta tarefa, e é tipicamente um dispositivo de alto cisalhamento tal como, por exemplo, um homogenizador.

Em algumas modalidades, um ou mais componentes adicionais são presos dentro das microparticulas. Por exemplo, antigeno, fosfolípido e/ou os componentes suplementares opcionais descritos a seguir podem ser introduzidos adicionando os mesmos (a) à solução do polimero, se na forma solúvel em óleo ou dispersivel em óleo ou (b) ou à solução aquosa, se na forma solúvel em água ou dispersivel em água.

Um volume da emulsão o/a é depois combinado com um segundo volume maior de uma solução aquosa, que tipicamente contém um tensoativo. A razão em volume da solução aquosa para a emulsão o/a tipicamente oscila entre cerca de 2:1 e 10:1, mais tipicamente cerca de 4:1. Exemplos de tensoativos apropriados para a prática da invenção estão listados a seguir. Aqueles com habilitação comum na arte podem rapidamente selecionar tensoativos apropriados para o tipo de espécie a ser adsorvida. Por exemplo, as microparticulas fabricadas na presença de tensoativos carregados, tais como tensoativos aniónicos ou catiónicos, podem produzir microparticulas com uma superfície que tem uma carga negativa liquida ou positiva liquida, que pode adsorver uma ampla variedade de moléculas. Por exemplo, as microparticulas fabricadas com tensoativos aniónicos, tais como dodecil sulfato de sódio (SDS), por exemplo, microparticulas SDS-PLG, adsorvem espécies positivamente carregadas, por exemplo, espécies contendo polipeptideo 38 tais como proteínas. De forma análoga, as micropartícuias fabricadas com tensoativos catiónicos, tais como CTAB, por exemplo, micropartícuias PLG/CTAB, adsorvem espécies negativamente carregadas, por exemplo, espécies contendo polinucleotídeo tais como ADN. Onde a espécie a ser adsorvida tem regiões de carga positiva e negativa, tensoativos quer catiónicos ou aniónicos ou não iónicos podem ser apropriados. Certas espécies podem adsorver mais prontamente as micropartículas que têm uma combinação de tensoativos. Além disso, em algumas ocasiões, pode ser desejável adicionar tensoativo à solução orgânica anterior.

Onde um tensoativo catiónico tal como CTAB é utilizado, é tipicamente providenciado numa solução de cerca de 0,00025-1%, mais tipicamente numa solução de cerca de 0,0025-0.1%. Onde um tensoativo aniónico tal como DSS é utilizado, é tipicamente providenciado numa solução de cerca de 0,00001-0,025%, mais tipicamente numa solução de cerca de 0,0001-0,0025%. Onde um tensoativo não iónico tal como PVA é utilizado, é tipicamente providenciado numa solução de cerca de 2-15%, mais tipicamente numa solução de cerca de 4-10%. Para um tensoativo catiónico, uma razão tensoativo-para-polímero peso-para-peso no intervalo de cerca de 0,00001:1 1 a cerca de 0,5:1 é tipicamente utilizada; mais tipicamente de cerca de 0,001:1 a cerca de 0,1:1, e ainda mais tipicamente de cerca de 0,0025:1 a cerca de 0,05:1; para um tensoativo aniónico tal como DSS, uma razão tensoativo-para-polímero peso-para-peso no intervalo de cerca de 0,00001:1 1 a cerca de 0,025:1 é tipicamente utilizada, mais tipicamente de cerca de 0,0001:1 a cerca de 0,0025:1; para um tensoativo não iónico tal como PVA uma razão tensoativo-para-polímero peso-para-peso no intervalo de cerca de 0,001:1 a cerca de 0,1:1 é tipicamente utilizada, mais tipicamente de cerca de 0,0025:1 a cerca de 0,05:1 é utilizada.

Esta mistura é depois homogenizada para produzir uma 39 emulsão dupla a/o/a estável. Cada um dos passos de homogenização anteriores é tipicamente conduzido à temperatura ambiente (isto é, 25°C) ou inferior, mais tipicamente inferior, por exemplo, enquanto arrefece dentro de um banho de gelo.

Os solventes orgânicos são depois evaporados. Após a preparação, as microparticulas podem ser utilizadas como tal ou liofilizadas para utilização futura.

Os parâmetros de formulação podem ser manipulados para permitir a preparação de pequenas microparticulas na ordem de 0,05 pm (50 nm) até microparticulas maiores com 50 pm ou mesmo maiores. Ver, por exemplo, Jeffery et al., Pharm. Res. (1993) 10: 362-368; McGee et al., J. Microencap. (1996). Por exemplo, a agitação reduzida tipicamente resulta em microparticulas maiores, bem como o aumento no volume de fase interna e um aumento na concentração do polímero. Partículas pequenas são tipicamente produzidas por um aumento da agitação bem como por volumes baixos da fase aquosa, elevadas concentrações de estabilizadores de emulsão e uma diminuição na concentração do polímero. O tamanho da partícula pode ser determinado por, por exemplo, difusão da luz a laser, utilizando por exemplo, um espectrómetro incorporando um laser hélio-néon. Em geral, o tamanho da partícula é determinado à temperatura ambiente e envolve análises múltiplas da amostra em questão (por exemplo, 5-10 vezes) para produzir um valor médio para o diâmetro da partícula. O tamanho da partícula também é prontamente determinado utilizando microscopia eletrónica de varrimento (SEM).

Na preparação, uma variedade de componentes podem ser misturados com as micropartículas, incluindo antígeno, fosfolípido, e componentes suplementares opcionais tais como aqueles descritos a seguir, e a formulação resultante pode ser liofilizada antes da utilização se desejado. Tipicamente, estes componentes são adicionados às 40 micropartícuias como uma solução aquosa ou de dispersão. Em algumas ocasiões, estas espécies serão adsorvidas para a superfície das microparticulas (ver, por exemplo, os Exemplos a seguir nos quais antigenos polipeptideos são adsorvidos para a superfície da micropartícuia). O conteúdo das espécies adsorvidas pode ser determinado utilizando técnicas padrão.

Assim, as microparticulas do polímero da presente invenção podem ter uma variedade de componentes presos ou encapsulados dentro deles, bem como ter uma variedade de componentes adsorvidos sobre eles. Por exemplo, alguém com habilitação comum na arte pode preparar de acordo com a invenção microparticulas que adsorveram componentes, além do antígeno adsorvido. Alguém com habilitação comum na arte também pode preparar de acordo com a invenção microparticulas que têm componentes encapsulados, tais como antígeno, fosfolípido e/ou qualquer dos componentes suplementares descritos a seguir. 5. Componentes suplementares

As composições imunogénicas da presente invenção podem incluir uma ampla variedade de componentes suplementares opcionais. Tais componentes suplementares incluem: (a) produtos farmacêuticos tais como antibióticos e agentes antivirais, fármacos anti-inflamatórios não esteroidais, analgésicos, vasodilatadores, fármacos cardiovasculares, psicotrópicos, neurolépticos, anti-depressivos, fármacos anti-Parkinson, bloqueadores beta, bloqueadores do canal de cálcio, inibidores da bradiquinina, inibidores de ACE, vasodilatadores, inibidores da prolactina, esteroides, antagonistas de hormonas, antihistamínicos, antagonistas da serotonina, heparina, agentes quimioterapêuticos, antineoplásticos e fatores de crescimento, incluindo, mas não limitado a, PDGF, EGF, KGF, IGF-1 e IGF-2, FGF, (b) hormonas incluindo hormonas péptidas tais como insulina, proinsulina, hormona de crescimento, GHRH, LHRH, EGF, 41 somatostatina, SNX-111, BNP, insulinotropina, ANP, FSH, LH, PSH e hCG, hormonas esteroides gonadais (androgénios, estrogénios e progesterona), hormona estimulante da tiroide, inibina, colecistoguinina, ACTH, CRF, dinorfinas, endorfinas, endotelina, fragmentos de fibronectina, galanina, gastrina, insulinotropina, glucagon, fragmentos de proteína de ligação ao GTP, guanilina, as leucoguininas, magainina, mastoparanos, dermasseptina, sistemina, neuromedinas, neurotensina, pancreastatina, polipeptídeo pancreático, substância P, secretina, timosina, e afins, (c) enzimas, (d) mediadores de transcrição ou tradução, (e) intermediários em vias metabólicas, (f) imunomoduladores, tais como quaisquer das várias citocinas incluindo interleucina-1, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-4 e interferão gama e (g) adjuvantes imunológicos suplementares tais como aqueles descritos a seguir.

No caso das composições imunogénicas de micropartícuias, tais componentes suplementares podem ser, por exemplo, adsorvidas para a superfície das micropartícuias, presas dentro das micropartículas, dissolvidas ou dispersas em solução enquanto não ligadas às micropartículas, adsorvidas a ou presas dentro de outro grupo de micropartículas, e assim em diante.

No caso das composições imunogénicas de emulsão, tais componentes suplementares podem ser, por exemplo, dissolvidos ou dispersos dentro da fase aquosa da emulsão e assim em diante.

Adjuvantes imunológicos suplementares podem ser utilizados para aumentar a eficácia das composições imunogénicas. Por exemplo, tais adjuvantes imunológicos podem ser administrados concorrentemente com as composições imunogénicas da presente invenção, por exemplo, na mesma composição ou em composições separadas. Em alternativa, tais adjuvantes podem ser administrados antes ou 42 subsequentes às composições imunogénicas da presente invenção.

Adjuvantes imunológicos suplementares incluem, mas não se limitam a: (1) sais de alumínio (alum) , tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) adjuvantes da saponina, tais como Quil A, ou QS21 (por exemplo, Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) ) podem ser utilizados ou partículas geradas daí tais como ISCOM (complexos imunoestimulantes), que ICOM podem ser desprovidos de detergente adicional por exemplo, WO00/07621; (3) Adjuvante Completo de Freunds (CFA) e

Adjuvante Incompleto de Freunds (IFA); (4) citocinas, tais como interleucinas (por exemplo IL-1, IL-2, IL4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-12 (W099/44636) etc.), interferões (por exemplo interferão gama), fator estimulante de colónia de macrófago (M-CSF), fator de necrose de tumor (TNF), etc.; (5) oligonucleotídeos comprendendo motivos CpG (Roman et al., Nat. Med., 1997, 3, 849-854; Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis et al., J. Immunol. 1988, 160, 870- 876; Chu et al., J. Exp. Med., 1997, 186, 1623-1631; Lipford et al., Eur. J. Immunol. 1997, 27, 2340-2344;

Moldoveanu et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883: Bailas et al., J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al., J. Immunol., 1996, 156, 4570- 4575; Halpern et al., Cell. Immunol., 1996, 167, 72-78;

Yamamoto et al., Jpn. J. Câncer Res., 1988, 79, 866-873;

Stacey et al., J. Immunol, 1996, 157, 2116-2122; Messina et al., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764; Yi et al., J.

Immunol., 1996, 157, 4918-4925; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 5394 -5402; Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761; e Yi et al. , J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906;

Pedidos de patente Internacionais WO96/02555, W098/16247, WO98/18810, W098/40100 W098/55495, W098/37919 e W098/52581), isto é oligonucleotídeos contendo pelo menos 43 um dinucleotídeo CG (um nucleotídeo citosina seguido de um nucleotídeo guanosina), com 5 metilcitosinas sendo utilizadas opcionalmente em lugar de citosina; (6) um polioxietileno éter ou um polioxietileno éster por exemplo W099/52549; (7) um tensoativo éster de sorbitano polioxietileno em combinação com um octoxinol (W001/21207) ou um polioxietileno alguilo éter ou tensoativo de éster em combinação com pelo menos um tensoativo não iónico adicional tal como um octoxinol (WOOl/21152); (8) uma saponina e um oligonucleotideo imunoestimulante (por exemplo, um oligonucleotideo CpG) (WO00/62800); (9) um imunoestimulante e uma partícula de sal metal por exemplo WO00/23105; (10) uma saponina e uma emulsão óleo-em-água, por exemplo, W099/11241; (11) uma saponina (por exemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + um esterol), por exemplo, W098/57659; (12) mutantes desintoxicados de uma toxina bacteriana ADP-ribosilante tal como uma toxina da cólera (CT), uma toxina da tosse convulsa (PT) , ou uma toxina da E. coli termolábil (LT), particularmente LT-K63 (onde a lisina é substituída pelo aminoácido de tipo selvagem na posição 63) , LT-R72 (onde a arginina é substituída pelo aminoácido de tipo selvagem na posição 72), CT-S109 (onde a serina é substituída pelo aminoácido de tipo selvagem na posição 109), e PT-K9/G129 (onde a lisina é substituída pelo aminoácido de tipo selvagem na posição 9 e glicina substituída na posição 129) (ver, por exemplo, Publicação Internacional N.° WO93/13202 e W092/19265); (13) adjuvantes compreendendo ARN de cadeia dupla ("dsRNA") naturais ou sintéticos, gue é geralmente feito de pares de base de ácido-ribocitidílico ácido riboguanílico intermitente ([rG-rC]) e ácido riboadenílico ácido polribouridílico ([rA-rU]); para mais informações ver, por exemplo, o documento PCT/US02/30423 detido comumente; e (14) outras substâncias que atuam como agentes imunoestimulantes para aumentar a eficácia da composição. 44 Péptidos muramilo incluem, mas não se limitam a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), Nacteil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamo (nor-MDP), N- acetilmuramil-L-alanil-D-isogluatminil-L-alanina-2-(1'-2' -dipalmitoil-sn-glicero-3-huidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Para exemplos adicionais de adjuvantes, ver Vaccine Design, The Subunit and the Adjuvant Approach, Powell, M.F. e Newman, M.J, editores, Plenum Press, 1995). 6. Administração

Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas por via parentérica, por exemplo, por injeção (que pode ser sem agulha). As composições podem ser injetadas por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, intradérmica, ou intramuscular, por exemplo. Outros modos de administração incluem administração nasal, mucosal, intra-ocular, retal, vaginal, oral e pulmonar, supositórios, e aplicações transdérmicas e transcutâneas.

Em algumas modalidades, as composições da presente invenção podem ser utilizadas para entrega dirigida a um local especifico. Por exemplo, a administração intravenosa das composições pode ser utilizada para atingir o pulmão, fígado, baço, circulação sanguínea, ou medula óssea.

Como pode ser interpretado do anterior, as composições da presente invenção incluirão geralmente um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Por exemplo, veículos tais como água, solução salina, glicerol, polietilenoglicol, ácido hialurónico, etanol, etc. podem ser utilizados. Outros excipientes, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, substâncias tamponantes biológicas, e afins, podem estar presentes. Um tampão biológico pode ser virtualmente qualquer solução que é farmacologicamente aceitável e que providencia a formulação com o pH desejado, isto é, um pH no intervalo fisiológico. 45

Exemplos incluem solução salina, solução salina tamponada com fosfato, solução salina tamponada com Tris, solução salina tamponada com Hank, e afins. Dependendo da forma de dosagem final, outros excipientes conhecidos na arte podem também ser introduzidos, incluindo ligantes, desintegrantes, preenchidores (diluentes), lubrificantes, deslizantes (potenciadores de fluxo), auxiliares de compressão, corantes, adoçantes, conservantes, agentes suspensores/dispersantes, formadores de pelicula/revestimentos, aromatizantes e tintas de impressão. 0 tratamento pode ser conduzido de acordo com um regime de dose única ou um regime de dose múltipla. Um regime de dose múltipla é um no qual pode ser dado um primeiro plano de administração, por exemplo, com 1-10 doses separadas, seguidas de outras doses dadas em intervalos de tempo subsequentes, escolhidos para manter e/ou reforçar a resposta terapêutica, por exemplo a 1-4 meses para uma segunda dose, e se necessário, uma dose(s) subsequente após vários meses. O regime de dosagem também será, pelo menos em parte, determinado pela necessidade do sujeito e ser dependente do julgamento do clinico.

Além disso, se a prevenção da doença é desejada, as composições são geralmente administradas antes da chegada da ocorrência primária da infeção ou distúrbio de interesse. Se outras formas de tratamento são desejadas, por exemplo, a redução ou eliminação de sintomas ou recurrências, as composições são geralmente administradas subsequentes à chegada da ocorrência primária da infeção ou distúrbio de interesse. C. Experimental A seguir estão exemplos de modalidades especificas para levar a cabo a presente invenção. Os exemplos são oferecidos para fins ilustrativos apenas, e não se pretende que limitem o âmbito da presente invenção de nenhuma 46 maneira .

Foram feitos esforços para assegurar precisão relativamente aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas deve ser permitido, obviamente, algum erro e desvio experimental.

Exemplo 1

Preparação e caracterização de micropartícuias Blank PLG

Microparticulas foram preparadas utilizando uma solução a 6% p/v de polímero RG504 (um polímero PLG que tem uma razão molar lactídeo/ glicolídeo de 50:50 e um peso molecular de 42-45 kDaltons, disponível de Boehringer Ingelheim) em cloreto de metileno. 10 ml desta solução foram homogenizados com 2,5 ml PBS utilizando uma sonda de 10-mm de um homogenizador (Ultra-Turrax T25 IKA-

Labortechnik, Alemanha) durante três minutos a 15,000 rpm, formando assim uma emulsão água-em-óleo. Esta emulsão foi depois adicionada a 50 ml de água destilada contendo 6 ug/ml de dioctil sulfosuccinato de sódio (DSS)(disponível de Sigma, USA) e homogenizado a velocidades muito elevadas utilizando um homogenizador com uma sonda de 20-mm (ES-15

Omni International, GA, USA) durante 25 minutos num banho de gelo. Isto resultou numa emulsão água-em-óleo-em-água, que foi mexida a 1000 rpm durante 12 h à temperatura ambiente, possibilitando a evaporação do cloreto de metileno. As microparticulas resultantes foram liofilizadas. As microparticulas resultantes continham 0,05% DSS p/p. A distribuição do tamanho das microparticulas resultantes foi determinada utilizando um analisador de tamanho de partículas (Master Sizer, Malvern Instruments, UK), e foi observado estar entre 0,8 e 1,2 pm. Exemplo 2

Preparação e caracterização de microparticulas PLG com Eisai 57 ou Eisai 53 presas

Microparticulas foram preparadas homogenizando 10 ml de solução 6% p/v de polímero PLG RG504 em cloreto de 47 metileno ao qual foi adicionado tanto (a) 3 mg de Eisai57 (ER-804057, Eisai Co., Ltd., Tóquio, Japão) fosfolípido numa suspensão de clorofórmio ou (b) 3 mg Eisai 53 (ER- 804053, Eisai Co., Ltd., Tóquio, Japão) fosfolipido numa suspensão de etanol, com 2,5 ml de PBS utilizando uma sonda de 10-mm (Ultra-Turrax T25 IKA-Labortechnik, Alemanha) durante três minutos a 15,000 rpm formando assim emulsões água-em-óleo. Cada uma destas emulsões foi depois adicionada a 50 ml de água destilada que contém 6 ug/ml DSS e homogenizada a velocidades muito elevadas utilizando um homogenizador com uma sonda de 20-mm (ES-15 Omni

International, GA, USA) durante 25 minutos num banho de gelo. Isto resultou em emulsões água-em-óleo-em-água, que foram mexidas a 1000 rpm durante 12 h à temperatura ambiente, enquanto se permitiu que o cloreto de metileno evaporasse. As microparticulas resultantes foram liofilizadas. As microparticulas resultantes continham 0,05% DSS p/p. A distribuição do tamanho das microparticulas resultantes foi determinada utilizando um analisador de tamanho de partículas (Master Sizer, Malvern Instruments, UK) e observou-se estar entre 0,8 e 1,2 pm. Exemplo 3

Preparação de composições injetáveis 10 mg (isto é, 10 ml de uma suspensão de 10 mg/ml) de partículas DSS do Exemplo 1 foram incubados durante a noite à temperatura ambiente com 1 mg de antígeno B da meningite ("MenB") (ver, por exemplo, PCT/IB02/03904; WO 01/52885; Volume 287 Science, 1816 (2000)) em 1 ml de tampão de histidina (10 mmol, pH 5,0). A suspensão foi liofilizada apos a adição de excipiente (manitol:sacarose, 45:15 mg/ml).

Estas composições foram (a) após reconstituição em água para injeção, injetadas por via intramuscular em ratinhos ("PLG/MenB") , (b) combinadas com 0,1 ml de uma

solução que contém 1,0 mg/ml de oligonucleotídeo CpG 48 (disponível de Oligos Inc., USA) em tampão T.E. ("PLG/MenB + sol CPG") e injetadas, (c) combinadas com 0,1 ml de uma solução que contém 1,0 mg/ml ER-804053 em etanol ("PLG/MenB + sol Eisai53") e injetadas, (d) combinadas com 0,1 ml de uma solução que contém 1,0 mg/ml ER-804057 em etanol ("PLG/MenB + sol Eisai57") e injetadas, (e) combinadas com 10 mg de partículas DSS liofilizadas com ER-804053 presa do Exemplo 2 ("PLG/MenB + PLG/Eisai53") e injetadas, ou (f) combinadas com 10 mg de partículas DSS liofilizadas com ER-804057 presas do Exemplo 2 ("PLG/MenB + PLG/Eisai57") e injetadas.

Além disso, 100 mg de partículas DSS liofilizadas com fosfolípido preso do Exemplo 2 foram incubadas durante a noite à temperatura ambiente com 1,0 mg de antígeno B da meningite em 1 ml de tampão de histidina (pH 5,0). Cada uma destas composições (referidas aqui como "PLG/Eisai53/MenB" ou "PLG/Eisai57/MenB") foi diretamente injetada por via intramuscular em ratinhos.

Em cada um dos casos anteriores, os ratinhos são reforçados aos 21 dias e 35 dias.

Exemplo comparativo 4

Preparação e caracterização da emulsão MF59 500 μΐ de clorofórmio foram colocados num béquer de 50 ml, e 100 μΐ de Span® 85 (disponível de Sigma, USA) e 1 ml esqualeno (disponível de Sigma, USA) foram adicionados e misturados. 100 μΐ de Tween® 80 (de Sigma, USA) foram adicionados a 18,8 ml de água D.L e misturados mexendo durante 15 minutos. A solução Tween® foi adicionada a uma mistura de óleo e homogenizada com uma sonda de 10 mm (Ultra-Turrax T25 IKA-Labortechnik, Alemanha) , durante 1 minuto. A mistura emulsionada foi passada através de um microfluidizador (modelo MI105 de Microfluidics) a 90 psi 5 vezes. Deixou-se o clorofórmio residual evaporar durante 30 minutos. As emulsões são analisadas pelo tamanho por dispersão dinâmica de luz produzindo uma distribuição de 49 tamanhos <200 nm.

Exemplo comparativo 5

Preparação e caracterização de emulsões MF59 Eisai57 e Eisai53

Emulsões óleo-em-água foram preparadas com Eisai 57 ou Eisai53 incorporadas na fase de óleo. Resumidamente, 800 μΐ de Eisai57 a 5 mg/ml em clorofórmio e 800 μΐ de Eisai53 a 5 mg/ml em clorofórmio foram colocados em bégueres de 50 ml separados. Deixou-se evaporar o clorofórmio até um volume de cerca de 500 μΐ em cada. 100 μΐ de Span® 83 e 1 ml de esqualeno foram adicionados a cada e misturados. 100 μΐ de Tween® 80 foram adicionados a 18,8 ml de água D.I. e misturados mexendo durante 15 minutos. A solução Tween® foi adicionada a cada mistura de óleo e homogenizada com uma sonda de 10 mm (Ultra-Turrax T25 IKA-Labortechnik, Alemanha) durante 1 minuto. Cada mistura emulsionada foi passada através de um microfluidizador a 90 psi 5 vezes. As emulsões foram analisadas pelo tamanho por dispersão dinâmica de luz produzindo uma distribuição de tamanhos <200 nm.

Exemplo comparativo 6

Preparação de composições injetáveis A 0,5 ml de cada das emulsões formadas nos Exemplos comparativos 4 e 5 foi adicionado 0,5 ml de uma solução contendo 0,2 mg/ml de antigeno em PBS e as composições resultantes foram misturadas durante 5 minutos. Os antigenos utilizados foram como se segue: (a) antigeno B da meningite, com as composições injetáveis resultantes referidas aqui como "MF59 + sol MenB", "MF59/Eisai53 + sol MenB" e "MF59/Eisai57 + sol MenB"; (b) proteina de envelope gpl20 do HIV (ver, por exemplo, WO 00/06123; WO 02/26209), com as composições injetáveis resultantes referidas aqui como "MF59 + sol gpl20", "MF59/Eisai53 + sol gpl20" e

"MF59/Eisai57 + sol gpl20"; (o) polipeptideo E1E2 do HCV (ver, por exemplo, PCT/US02/20676), com as composições 50 injetáveis resultantes referidas aqui como "MF59 + sol E1E2" '"MF59/Eisai53 + sol E1E2" e "MF59/Eisai57 + sol E1E2". A 0,5 ml da emulsão formada no Exemplo comparativo 4 foi adicionado (a) 0,5 ml de uma solução contendo 0,1 mg/ml de oligonucleotideo CpG em PBS e (b) 0,5 ml de uma solução contendo 0,2 mg/ml de antigeno em PBS. As composições resultantes foram misturadas durante 5 minutos. Os antigenos utilizados foram como se segue: (a) proteína B da meningite ("MF59 + sol MenB + sol CpG"); (b) proteína de envelope gpl20 do HIV ("MF59 + sol gpl20 + sol CpG"); (c) polipeptídeo E1E2 do HCV ("MF59 + sol E1E2 + sol CpG").

Cada destas composições foi diretamente injetada por via intramuscular em ratinhos. Em cada caso, os ratinhos são reforçados aos 21 dias e 35 dias.

Exemplo 7

Avaliação in vivo de ensaios de anticorpo

Os anticorpos específicos de antigeno isotipos IgG e IgG (IgGl e IgG2a) foram determinados por ELISA utilizando deteção colorimétrica baseada em 3,3,5,5'- tetrametilbenzidina. As placas de ELISA (Nunc Maxisorb U96) foram revestidas com 50 μΐ de antigeno purificado a 5 pg/ml durante a noite a 4 °C. Os poços revestidos foram bloqueados durante 1 hora a 37 °C com 150 μΐ de 5 % de soro de cabra (Gibco BRL, Grand Island, Nova Iorque) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). As placas foram lavadas três vezes com um tampão de lavagem (PBS, 0,3% Tween-20), tapadas, e secas. As amostras de soro e um padrão de soro foram inicialmente diluídas no tampão bloqueador e depois transferidas em placas bloqueadas revestidas nas quais as amostras foram diluídas em série três vezes com o mesmo tampão. As placas foram lavadas após 1 hora de incubação a 37°C. Peroxidase de raiz-forte anti-rato de cabra IgG gama conjugada específica de cadeia (Laboratórios Caltag, Inc.) foi utilizada para determinar a IgG total e IgGl e IgG2a 51 anti-rato foram utilizadas para determinar os isotipos. Após a incubação de 1 hora a 37°C, as placas foram lavadas para remover anticorpos não ligados substrato TMB foi utilizado para desenvolver as placas, e a reação da cor foi bloqueada após 15 minutos pela adição de 2N HCL. Os títulos dos anticorpos foram expressos como o recíproco da diluição da amostra, no qual a densidade ótica da amostra diluída igualou 0,5 a 450 nm. Os resultados seguem-se nos Quadros 2 e 3A-3C.

Quadro 2. Títulos GMT duas semanas após a 3a imunização.

Formulação IgG Total PLG/MenB 8245 PLG/MenB + sol CPG 14402 PLG/MenB + sol Eisai53 43382 PLG/MenB + sol Eisai57 72901 PLG/MenB + PLG/Eisai53 35964 Formulação IgG Total PLG/MenB + PLG/Eisai57 34526 PLG/Eisai53/MenB 36310 PLG/Eisai57/MenB 44656

Quadro 3A. Títulos GMT três semanas após a 3a imunização.

Formulação Comparativa IgG Total IgG2a Razão: (IgG2a)/ (MF59+sol MenB) MF59 + sol MenB 46325 2530 1 MF59 + sol MenB + sol CpG 33985 5815 2,30 MF59/Eisai53 + sol MenB 98501 24508 9, 69 MF59/Eisai57 + sol MenB 78366 19691 7,78 52

Quadro 3B. Títulos GMT três semanas após a 3a imunização.

Formulação Comparativa IgG Total IgG2a Razão: (IgG2a)/ (MF59+sol gpl20) MF59 + sol gpl20 764 25 1 MF59 + sol gpl20 + sol CpG 5285 1753 70, 12 MF59/Eisai53 + sol gpl20 5062 1941 77, 64 MF59/Eisai57 + sol gpl20 13307 15618 624,7

Quadro 3C. Títulos GMT três semanas após a 3a imunização.

Formulação Comparativa IgG Total IgG2a Razão: (IgG2a)/ (MF59+sol E1E2) MF59 + sol E1E2 1090 2 1 NÍF59 + sol E1E2 + sol CpG 201 69 34 MF59/Eisai53 + sol E1E2 774 256 128 Formulação Comparativa IgG Total IgG2a Razão: (IgG2a)/ (MF59+sol E1E2) MF59/Eisai57 + sol E1E2 1205 562 281

Apesar de modalidades preferidas da sujeita invenção terem sido descritas com algum detalhe, entende-se que podem ser feitas variações óbvias sem sair do âmbito da invenção. 53

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 43691902 P [0001] US 51307503 E > [0001] US 4708871 A [0042] US 5814482 A [0060] US 6015696 A [0060] wo 9738087 A [0060] wo 9918226 A [0060] wo 0226209 A [0060] [0129] US 6290973 B [0077] US 5171568 A [0079] wo 8904669 A [0080] wo 9011089 A [0080] wo 9014436 A [0080] US 5378814 A [0081] US 4722840 A [0081] US 5098704 A [0081] US 5324513 A [0081] US 9909346 W [0085] US IB9801665 W [0085] US IB9900103 W [0085] wo 9924578 A [0086] wo 9936544 A [0086] wo 9957280 A [0086] wo 0022430 A [0086] wo 9629412 A [0086] GB 0016363 A [0086] 54

wo 9927105 A wo 0027994 A wo 0037494 A wo 9928475 A wo 9318150 A wo 9953310 A wo 9804702 A GB 0026333 A GB 0028727 A GB 0105640 A EP 0477508 A US 5306492 A WO 9842721 A EP 0372501 A EP 0378881 A EP 0427347 A WO 9317712 A WO 9858668 A EP 0471177 A WO 0056360 A WO 0061761 A US 3523907 A US 2800457 A US 9917308 W WO 0006123 A WO 0007621 A WO 9944636 A wo 9602555 A wo 9816247 A wo 9818810 A wo 9840100 A wo 9855495 A wo 9837919 A wo 9852581 A wo 9952549 A

[0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0086] [0094] [0095] [0096] [0096] [0129] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] [0111] 55 • wo 0121207 A [0111] • wo 0121152 A [0111] • wo 0062800 A [0111] • wo 0023105 A [0111] • wo 9911241 A [0111] • wo 9857659 A [0111] • wo 9313202 A [0111] • wo 9219265 A [0111] • us 0230423 W [0111] • wo 0152885 A [0123] • us 0220676 W [0129] Literatura não relacionada descrição com patentes, citada na

Remington' s Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing

Company, 1990 [0026] • Methods In Enzymology. Academic Press, Inc, [0026] • Handbook of Experimental Immunology. Blackwell Scientific Publications, 1986, vol. I-IV [0026] • SAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1989 [0026] • Handbook of Surface and Colloidal Chemistry. CRC Press, 1997 [0026] • Seymour/Carraher's Polymer Chemistry. Mareei

Dekker Inc, 1996 [0026] • Epitope Mapping Protocols. Methods in Molecular Bi-ology. Humana Press, 1996, vol. 66 [0042] • GEYSEN et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1984, vol. 81, 3998-4002 [0042] • GEYSEN et al. Molec. Immunol., 1986, vol. 23, 709-715 [0042] • ERICKSON et al. J. Immunol., 1993, vol. 151, 4189-4199 [0048] • DOE et al. Eur. J. Immunol1994, vol. 24, 2369-2376 [0048] 56 CHAPMAN, B. S. et al. Effect of intron A from human cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells. Nucleic Acids Res., 1991, vol. 19, 3979-86 [0059] CHEE et al. Cytomegaloviruses. Springer-Verlag, 1990, 125-169 [0079] MCGEOCH et al. J Gen. Virol., 1988, vol. 69, 1531-1574 [0079] BAER et al. Nature, 1984, vol. 310, 207-211 [0079] DAVISON ; SCOTT. J. Gen. Virol., 1986, vol. 67, 1759-1816 [0079] MACKETT, M. ; WILLIAMSON, J.D. HBV Vaccines - from the laboratory to license: a case study. Human Vaccines and Vaccination, 159-17 6 [0081] BEAMES et al. J Virol., 1995, vol. 69, 6833-6838 [0081] BIRNBAUM et al. J. Virol., 1990, vol. 64, 3319-3330 [0081] ZHOU et al. J. Virol., 1991, vol. 65, 5457-5464 [0081] Virology. 1988 [0082]

Fundamental Virology. 1991 [0082] MYERS et al. Human Retroviruses and Aids. Los Alamos National Laboratory, 1990 [0083] MODROW et al. J. Virol., 1987, vol. 61, 570-578 [0083] KAWAOKA et al. Virology, 1990, vol. 179, 759-767 [0084] Antigenic variation among type A influenza viruses. WEBSTER et al. Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, 127-168 [0084] TETTELIN et al. Science, 2000, vol. 287, 1809-1815 [0086] PIZZA. Science, 2000, vol. 287, 1816-1820 [0086] BJUNE et [0086] al. Lancet, 1991, vol. 338 (8775), 1093-1096 FUKASAWA et al. Vaccine, 1990, vol. 17, 2951-2958 [0086] ROSENQVIST et al. Dev. Biol. Stand., 1998, vol. 92, 57 323-333 [0086] COSTANTINO et al. Vaccine, 1992, vol. 10, 691-698 [0086] COSTANTINO et al. Vaccine, 1999, vol. 17, 1251-1263 [0086] WATSON. Padiatr Infect Dis J, 2000, vol. 19, 331-332 [0086] RUBIN. Pediatr Clin North Am, 2000, vol. 47, 269-285 [0086] JEDRZEJAS. Mi crobiol Mol Biol Rev, 2001, vol. 65, 187- 207 [0086] KALMAN et al. Nature Genetics, , 1999, vol. 21, 385-389 [0086] READ et al. Nucleic Acids Res, 2000, vol. 28, 1397-406 [0086] SHIRAI et al. J. Infect. Dis., 2000, vol. 181 (3), S524-S527 [0086] BELL. Pediatr Infect Dis J, 2000, vol. 19, 1187-1188 [0086] IWARSON. APMIS, 1995, vol. 103, 321-326 [0086] GERLICH et al. Vaccine, 1990, vol. 8, 63-6879-80 [0086] HSU et al. Clin Liver Dis, 1999, vol. 3, 901-915 [0086] GUSTAFSSON et al. N. Engl. J. Med., 1996, vol . 334, 349-355 [0086] RAPPUOLI et al. TIBTECH, 1991, vol. 9, 232-238 [0086] Vaccines. 1988 [0086] DEL GUIDICE et al. Molecular Aspects of Medicine, 1998, vol. 19, 1-70 [0086] 3l. 19, 4135-4142 [0086] North Am, 2000, vol. 47, Physician, 1999, vol. 59, 15 (S 2 — 6 [0086] 16 January 1998, vol. 47 ROSS et al. Vaccine, 2001, vo SUTTER et al. Pediatr Clin 287-308 [0086] ZIMMERMAN ; SPANN. Am Fam 113-118125-126 [0086] DREESEN. Vaccine, 1997, vol. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 58 (1), 12, 19 [0086] • MCMICHAEL. Vaccine, 2000, vol. 19 (1), 101-107 [0086] • SCHUCHAT. Lancet, 1999, vol. 353 (9146), 51-6 [0086] • DALE. Infect Dis Clin North Am, 1999, vol. 13, 227-43 [0086] • FERRETTI et al. PNAS USA, 2001, vol. 98, 4658-4663 [0086] • KURODA et al. Lancet, 2001, vol. 357 (9264), 1225-1240 [0086] • RAMSAY et al. Lancet, 2001, vol. 357 (9251), 195-196 [0086] • LINDBERG. Vaccine, 1999, vol. 17 (2), 28-36 [0086] • BUTTERY ; MOXON. J R Coll Physicians London, 2000, vol. 34, 163-168 [0086] • AHMAD ; CHAPNICK. Infect Dis Clin North Am, 1999, vol. 13, 113-133 [0086] • GOLDBLATT. J. Med. Microbiol., 1998, vol. 47, 563-567 [0086] • Conjugate Vaccines. vol. 10, 48-114 [0086]

• HERMANSON. Bioconjugate Techniques, 1996, ISBN 0123423368 [0086] TABATA et al. J. Biomed. 837-858 [0092] Mater. Res., 1988, vol. 22, OGAWA et al. Chem. Pharm. 1103 [0094] . Buli., 1988, vol. 36, 1095- THOMASIN et al. J. Controlled Release, 131 [0095] 1996, vol. 41, MASTERS, K. Spray Drying. Wiley, 1976 [0095] Wurster Process. HALL et al. Controlled Release

Technologies: Methods, Theory, and Applications. CRC Press, 1980, vol. 2, 133-154 [0095] • DEASY, P.B. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1988, vol. S (2), 99-139 [0095] • LIM et al. Science, 1980, vol. 210, 908-910 [0095] • 0'HAGAN et al. Vaccine, 1993, vol. 11, 965-969 [0096] 59 JEFFERY et al. Pharm. Res., 1993, vol. 10, 362 [0096] JEFFERY et al. Pharm. Res., 1993, vol. 10, 362-368 [0103] 1988, 1997, J. Immunol., Vaccine, 1988, 1995, vol. 374, PNAS USA, J. Immunol., Immunol., 1996, Cell. Immunol., 1996, Jpn. J. Câncer Res., J. Immunol, 1996, J. Immunol., 1991, vol. MCGEE et al. J. Microencap., ROMAN et al. Nat. Med., 1997, WEINER et al. PNÃS 10833-10837 [0111] DAVIS et al. J. Immunol., [0111] CHU et al. J. Exp. Med., [0111] LIPFORD et al. Eur. 2344 [0111] MOLDOVEANU et al. 1224 [0111] KRIEG et al. Nature, KLINMAN et al. 2879-2883 [0111] BALLAS et al. 1840-1845 [0111] COWDERY et al. J.

[0111] HALPERN et al.

[0111] YAMAMOTO et al. 866-873 [0111] STACEY et al. 2116-2122 [0111] MESSINA et al. 1764 [0111] 1996 [0103] vol. 3, 849-854 [0111] USA, 1997, vol. 94, vol. 160, 870-876 vol. 186, 1623-1631 1997, vol. 27, 2340- vol. 16, 1216- 546-549 [0111] 1996, vol. 93, 1996, vol. 157, vol. 156, 4570-4575 vol. 167, 72-78 1988, vol. 79, vol. 157, 147, 1759- YI et al. J. Immunol., 1996, vol. 157, 4918-4925 [0111] YI et al. J. Immunol., 1996, vol. 157, 5394-5402 [0111] YI et al. J. Immunol., 1998, vol. 160, 4755-4761 [0111] YI et al. J. Immunol., 1998, vol. 160, 5898-5906 [0111]

Vaccine Design, The Subunit and the Adjuvant Approach.

Plenum Press, 1995 [0113]

Science, 2000, vol. 287, 1816 [0123]

Claims (32)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição imunogénica compreendendo: (a) água; (b) uma micropartícula de polímero compreendendo um polímero selecionado de um poli(α-hidroxi ácido), um ácido polihidroxibutírico, uma policaprolactona, um poliortoester, um polianidrido, e um policianoacrilato; (c) um antígeno adsorvido na micropartícula; e (d) um composto fosfolípido sintético tendo a seguinte fórmula:

em que: R1 é selecionado a partir do grupo que consiste em (a) C(0) ; (b) C (0)—Ci—14 alquil-C (0) , e que o Ci_i4 alquilo é alquil-C (0) -C1-5 opcionalmente substituído com hidroxi, Ci_5 alcoxi, Ci_5 alquilenodioxi, Ci-5 alquilamino, ou Ci-5-alquil-arilo, em que o grupo arilo do Ci_5-alquil-arilo é opcionalmente substituído com C1-5 alcoxi, Ci_s alquilamino, C1-5 alcoxiamino, C1-5 alquilamino-Ci-5 alcoxi, -O-C1-5 alquilamino-Ci^5 alcoxi, -O-C1-5 alquilamino-C (0) -C1-5 alquilo C(0)0H, —O-C1-5 alquilamino-C (0)-C1-5 alquilo; 2 (c) C2 a C i5 alquilo de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído com hidroxi ou alcoxi; e (d) -C(0)-C6 -12 arileno-C (0) - em que o arileno é opcionalmente substituído com hidroxi, halogéneo, nitro ou amino; a e b são independentemente 0, 1, 2, 3 ou 4; d, d', d", e, e' e e" são independentemente um número inteiro de 1 a 4; X1, X2, Y1 e Y2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste num nulo, oxigénio, NH e N(C(0)Ci_4 alquilo), e N (Ci_4 alquilo) 2; W1 e W2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em carbonilo, metileno, sulfona e sulfóxido; R2 e R5 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em: (a) C2 a C2o alquilo de cadeia linear ou de cadeia ramificada que é opcionalmente substituído com oxo, hidroxi ou alcoxi, (b) C2 a C20 alcenilo ou dialcenilo de cadeia linear ou de cadeia ramificada que é opcionalmente substituído com oxo, hidroxi ou alcoxi; (c) C2 a C20 alcoxi de cadeia linear ou de cadeia ramificada que é opcionalmente substituído com oxo, hidroxi ou alcoxi; (d) -NH-C2 a C20 alquilo de cadeia linear ou de cadeia ramificada, em que o grupo alquilo é opcionalmente substituído com oxo, hidroxi ou alcoxi; e

em que Z é selecionado a partir do grupo que consiste em 0 e NH, e M e N são independentemente selecionados a partir 3 do grupo que consiste em C2 a C2o alquilo, alcenilo, alcoxi, aciloxi, alquilamino, e acilamino de cadeia linear ou de cadeia ramificada; R1 e R2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C2 a C2o alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou de cadeia ramificada, opcionalmente substituído com fluoro ou oxo; R3 e R4 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C(0)C2 a C2o alquilo ou alcenilo de cadeia linear ou de cadeia ramificada; C2 a C20 alquilo de cadeia linear ou de cadeia ramificada; C2 a C20 alcoxi de cadeia linear ou de cadeia ramificada; C2 a C2o alcenilo de cadeia linear ou de cadeia ramificada; em que os grupos alquilo, alcenilo ou alcoxi são independentemente e opcionalmente substituídos com hidroxi, fluoro ou Ci a C5 alcoxi; G1, G2, G1 e G3 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em oxigénio, metileno, amino, tiol, -NHC (0) -, e -N(C(0)Ci-4 alquilo)-; ou G2 R3 ou G5 R4 podem juntos ser um átomo de hidrogénio ou hidroxilo; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

2. A composição imunogénica da reivindicação 1, em que R1 é C (0); a, b, d, d', d", e, e' e e" são independentemente 1 ou 2; X1, X2, Y1 e Y2 são NH; W1 e W2 são carbonilo; R1 e R5 são Cio a C20 alquilo de cadeia linear que é substituído com oxo; R1 e R2 são C5-Ci0 alquilo de cadeira linear; R3 e R4 são C(0)C8-Ci4 alquilo ou alcenilo de cadeia linear; e G1, G , G e G sao oxigénio. 1 A composição imunogénica da reivindicação 1, em que R1 2 alquilo de cadeia linear que é substituído com oxo na 3 é C(0); a e b são 2; d, d' , e e e' são 1; d" e e" são 2; 4 posição 2; R1 e R2 são C7 alquilo de cadeia linear; R3 e R4 5 X1, X2, Y1 e Y2 são NH; W1 e W3 são carbonilo; R2 e R5 são Ci3 4 são C(0)Cn alquilo de cadeia linear; G1, G2, G3 e G4 são oxigénio.

4. A composição imunogénica de qualquer das reivindicações 1-3, em que o fosfolípido está preso dentro das microparticulas. qualquer das é adsorvido nas

5. A composição imunogénica de reivindicações 1-3, em que o fosfolípido microparticulas.

6. A composição imunogénica de qualquer das reivindicações 1-3, em que o fosfolípido é disperso em solução aquosa.

7. A composição imunogénica de qualquer das reivindicações 1-6, em que dois ou mais antígenos são adsorvidos nas microparticulas.

8. A composição imunogénica de qualquer das reivindicações 1-6, em que o antígeno adicional está preso dentro das microparticulas.

9. A composição imunogénica de qualquer das reivindicações 1-8, em que a composição imunogénica compreende ainda um tensoativo.

10. A composição imunogénica de qualquer das reivindicações 1-9, em que as microparticulas têm um diâmetro entre 500 nanómetros e 20 micróns.

11. A composição imunogénica de qualquer das reivindicações 1-10, em que o poli(α-hidroxi ácido) é selecionado de poli(L-lactídeo), poli(D,L-lactídeo) e poli(lactídeo-co-glicolídeo). 5

12. A composição imunogénica de qualquer das reivindicações 1-10, em qe o poli(α-hidroxi ácido) é poli(D,L—lactídeo—co—glicolídeo).

13. A composição imunogénica da reivindicação 12, em que o poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo) tem uma razão molar lactideo:glicolídeo que oscila entre 40:60 a 60:40.

14. A composição imunogénica de qualquer das reivindicações 1-13, em que o antígeno é um antígeno contendo polipeptídeo.

15. A composição imunogénica de qualquer das reivindicações 1-13, em que o antígeno é um antígeno contendo polinucleotídeo. qualquer das derivado de uma

16. A composição reivindicações 1-15, célula de tumor. imunogénica de em que o antígeno é

17. A composição imunogénica de qualquer das reivindicações 1-15, em que o antígeno é derivado de um organismo patogénico.

18. A composição imunogénica da reivindicação 17, em que o organismo patogénico é selecionado de um vírus, uma bactéria, um fungo e um parasita.

19. A composição imunogénica da reivindicação 17, em que o organismo patogénico é selecionado de VIH, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, meningite B, Haemophilus influenza tipo B, tosse convulsa, difteria, tétano, e vírus da influenza A.

20. A composição imunogénica da reivindicação 17, em que o 6 organismo patogénico é selecionado do vírus da imunodeficiência humana, Neisseria meningitidis, e vírus da hepatite.

21. A composição imunogénica de gualquer das reivindicações 1-20, compreendendo ainda um adjuvante imunológico suplementar.

22. A composição imunogénica de qualquer das reivindicações 1-21, em que a composição imunogénica é uma composição injetável.

23. A composição imunogénica de qualquer uma das reivindicações 1-22 para utilização num método de administração de uma quantidade terapêutica de um antígeno a um hospedeiro animal vertebrado.

24. A composição imunogénica de qualquer uma das reivindicações 1-22 para utilização num método para tratar um hospedeiro animal que tem uma infeção por organismo patogénico ou tumor.

25. A composição imunogénica de qualquer uma das reivindicações 1-22 para utilização num método de imunizar um hospedeiro animal contra um tumor ou infeção por um organismo patogénico.

26. A composição imunogénica de qualquer uma das reivindicações 1-22 para utilização num método para estimular uma resposta imune num hospedeiro animal.

27. A composição imunogénica da reivindicação 26, em que a resposta imune compreende uma resposta imune humoral.

28. A composição imunogénica da reivindicação 26, em que a 7 resposta imune compreende uma resposta imune celular.

29. A composição imunogénica de qualquer uma das reivindicações 24-26, em que o hospedeiro animal é um animal vertebrado.

30. A composição imunogénica de qualquer uma das reivindicações 23-26, em que o hospedeiro animal é um mamífero.

31. A composição imunogénica de qualquer uma das reivindicações 23-26, em que o hospedeiro animal é um humano.

32. A composição imunogénica de qualquer uma das reivindicações 1-21 para utilização em terapêutica.

33. Utilização de uma composição imunogénica de qualquer uma das reivindicações 1-22 no fabrico de um medicamento para: i) administração de uma quantidade terapêutica de um antígeno a um hospedeiro animal vertebrado; ii) tratamento de um hospedeiro animal que tem uma infeção por um organismo patogénico ou um tumor; iii) imunização de um hospedeiro animal contra um tumor ou infeção por um organismo patogénico; ou iv) estimulação de uma resposta imune num hospedeiro animal.