ES2260291T3 - Microparticulas para la administracion de acidos nucleicos heterologos. - Google Patents

Microparticulas para la administracion de acidos nucleicos heterologos.

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ES2260291T3 ES01975584T ES01975584T ES2260291T3 ES 2260291 T3 ES2260291 T3 ES 2260291T3 ES 01975584 T ES01975584 T ES 01975584T ES 01975584 T ES01975584 T ES 01975584T ES 2260291 T3 ES2260291 T3 ES 2260291T3
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John James Donnelly
John M. Polo
Susan Barnett
Manmohan Singh
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Thomas W. Dubensky, Jr.
Gary S. Ott
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Abstract

Un procedimiento para producir una micropartícula que tiene una superficie adsorbente en la cual se adsorbe un constructo de vector capaz de expresar una secuencia de ácido nucleico seleccionada, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (a) emulsionar una mezcla de una solución de polímero y un detergente para formar una emulsión, en la que la solución de polímero comprende un polímero seleccionado entre el grupo constituido por poli (-hidroxi ácido), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido, y un policianoacrilato, en el que el polímero está presente en una concentración de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 30 % en un solvente orgánico, y en el que el detergente está presente en la mezcla en una relación peso a peso de detergente a polímero de entre aproximadamente 0, 00001:1 a aproximadamente 0, 5:1; (b) eliminar el solvente orgánico de la emulsión para formar dicha micropartícula; y (c) adsorber el constructo de vector en la superficie de la micropartícula, en la que dicho constructo de vector se selecciona entre el grupo constituido por un vector ELVIS y un constructo de vector de ARN.

Description

Micropartículas para la administración de ácidos nucleicos heterólogos.
Campo técnico
La presente invención se refiere de manera general a composiciones farmacéuticas. De manera particular, la invención se refiere a micropartículas de polímeros o emulsiones submicrométricas que tienen superficies adsorbentes en las que agentes biológicamente activos, de manera particular ácidos nucleicos, tales como plásmido del ADN, Sistemas de Iniciación de Vectores Eucariotas en Capas (vectores ELVIS) o constructos de vectores de ARN, se adsorben en sobre las anteriores, a los procedimientos para preparar dichas emulsiones de micropartículas y submicrométricas, y a los usos de las mismas, que incluyen la inducción de respuestas inmunes, vacunas y la dosificación de secuencias de nucleótidos heterólogos en células eucariotas y animales.
Antecedentes
Se han usado vehículos particulados con el fin de conseguir la dosificación parenteral controlada de los compuestos terapéuticos. Dichos vehículos se diseñan para mantener el agente activo en el sistema de dosificación durante un período extendido de tiempo. Entre los ejemplos de vehículos particulados se incluyen aquellos derivados a partir de polímeros de polimetil metacrilato, así como micropartículas derivadas de poli (láctidos) (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 3.773.919), poli (láctido-co-glicólidos), conocidos como PLG (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 4.767.628) y polietilén glicol, conocido como PEG (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos Nº 5.648.095). Los polímeros de polimetil metacrilato no son degradables mientras que las partículas de PLG se biodegradan mediante hidrólisis no enzimática aleatoria de los enlaces éster con ácidos láctico y glicólico que se excretan mediante las vías metabólicas normales.
La Patente de los Estados Unidos Nº 5.648.095 describe, por ejemplo, el uso de microesferas con productos farmacéuticos encapsulados como sistemas de dosificación de fármacos para dosificación nasal, oral, pulmonar y oral. Se han descrito también formulaciones de dosificación lenta que contienen diversos polipéptidos factores de crecimiento. Véanse, por ejemplo, la Publicación Internacional Nº WO 94/12158, la Patente de los Estados Unidos Nº 5.134.122 y la Publicación Internacional Nº WO 96/37216.
Fattal y col, Journal of Controlled Release 53:137-143 (1998) describen nanopartículas preparadas a partir de polialquilcianoacrilatos (PACA) que tienen oligonucleótidos adsorbidos.
Se han usado también vehículos particulados, tales como micropartículas con antígenos adsorbidos o atrapados en intentos de desencadenar respuestas inmunes apropiadas. Dichos vehículos presentan copias múltiples de un antígeno seleccionado para el sistema inmune, y promueven el atrapamiento y la retención de los antígenos en los nódulos linfáticos locales. Las partículas se pueden fagocitar mediante macrófagos y pueden mejorar la presentación del antígeno mediante la liberación de citoquina. Por ejemplo, la Solicitud del solicitante, en tramitación, nº 09/015.652, presentada el 29 de Junio de 1998, describe el uso de micropartículas de antígeno adsorbido y antígeno encapsulado para estimular las respuestas inmunológicas mediadas por células, así como los procedimientos de fabricación de las micropartículas.
En la Solicitud de Patente del solicitante, en tramitación, con Nº de Serie 09/015.652 se describe, por ejemplo, un procedimiento de formación de micropartículas que comprende combinar un polímero con un solvente orgánico, añadiendo a continuación un estabilizante de la emulsión, tal como alcohol polivinílico (PVA), evaporando a continuación el solvente orgánico, formando de esta manera las micropartículas. La superficie de las micropartículas comprende el polímero y el estabilizante. A continuación pueden adsorberse sobre dichas superficies macromoléculas tales como vectores ELVIS, otros nucleótidos (ADN o ARN), polipéptidos y antígenos.
Los coadyuvantes son compuestos que son capaces de potenciar una respuesta inmune a los antígenos. Los coadyuvantes pueden potenciar la inmunidad tanto humoral como celular. Sin embargo, para algunos patógenos es preferible estimular la inmunidad celular y, de manera particular, las células Th1. En muchos ejemplos, los coadyuvantes usados en la actualidad no inducen de manera adecuada las respuestas de las células Th1, y/o tienen efectos secundarios perjudiciales.
En la actualidad, los únicos coadyuvantes aprobados para uso humano en los Estados Unidos son las sales de aluminio (alum). Estos coadyuvantes han resultado útiles en algunas vacunas entre las que se incluyen hepatitis B, difteria, polio, rabia, y gripe, pero pueden no ser útiles para otras. Los informes indican, por ejemplo, que el alum fracasa en mejorar la efectividad de las vacunas de la tos ferina y el tifus, y proporciona únicamente un ligero efecto en las vacunas de adenovirus. De manera adicional se han experimentado problemas tales como la inducción de granulomas en el emplazamiento de inyección y la variación de lote a lote de las preparaciones de alum.
Se ha demostrado que las micropartículas preparadas a partir de polímeros biodegradables y biocompatibles, conocidos como poli (láctido-co-glicólidos) (PLG), son vehículos efectivos para numerosos antígenos. De manera adicional, las partículas de PLG pueden controlar la velocidad de dosificación de los antígenos atrapados y, de esta manera, ofrecen un potencial para vacunas de dosis única. Más aún, se ha demostrado que la administración de polímeros biodegradables con antígenos atrapados en un rango de modelos animales induce potentes respuestas inmunes. O'Hagan y col., Advanced Drug Deliv. Rev., 1998, 32, 225-246 y Singh y col., Advanced Drug Deliv. Rev., 1998, 34, 285-304, las descripciones de los cuales se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.
Se ha demostrado que una emulsión que comprende escualeno, trioleato de sorbitán (Span85^{TM}), y polisorbato 80 (Tween 80^{TM}) microfluidizados para proporcionar microgotitas dimensionadas de manera uniforme, es decir, MF59, indure potentes respuestas inmunes. Se ha demostrado que las formulaciones MF59 inducen títulos de anticuerpo de 5 a > 100 veces mayores que los que se obtienen con coadyuvantes de sales de aluminio. Se ha demostrado que MF59 mejora la respuesta inmune a los antígenos procedentes de numerosas fuentes entre las que se incluyen, por ejemplo, el virus del herpes simple (HSV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la gripe, el virus de la hepatitis C (HCV), el citomegalovirus (CMV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus del papiloma (VPH), y la malaria. Ott y col., Vaccine Design: The Subunit And Adjuvant Approach, 1995, M. F. Powell y M. J. Newman, Eds., Plenum Press, Nueva York, p 277-296; Singh y col., Vaccine, 1998, 16, 1822-1827; Ott y col., Vaccine, 1995, 13, 1557-1562; O'Hagan y col., Mol. Medicine Today, 1997, Febrero, 69-75; y Traquina y col., J. Infect. Dis., 1996, 174, 1168-75, las descripciones de los cuales se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. Los coadyuvantes MF59 mejoran la inmunogenicidad de las subunidades de antígeno manteniendo a la vez el perfil de seguridad y tolerabilidad del coadyuvante de alum. Van Nest y col., Vaccines 92, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 57-62 y Valensi y col., J. immunol., 1994, 153, 4029-39, las descripciones de los cuales se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad. MF59 se describe de manera adicional en la Solicitud copendiente de los Estados Unidos con Nº de Serie 08/434.512, presentada el 4 de Mayo de 1995, que se asigna al titular de la presente invención, la descripción de la cual se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. En estudios animales no se ha encontrado que MF59 sea genotóxico, teratogénico, ni que produzca sensibilización. El mecanismo de acción de MF59 parece ser dependiente de la generación de una célula T + CD4 fuerte, es decir, una respuesta de la célula Th2. Los coadyuvantes MF59, sin embargo, desencadenan pocas respuestas Th1, si alguna, o respuestas de los linfocitos T citotóxicos (CTL).
Se ha demostrado que los oligonucleótidos que comprenden motivos CpG mezclados con antígenos inducen fuertes respuestas inmunes Th1. Roman y col, Nat. Med., 1997, 3, 849-854; Weiner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis y col., J. Immunol., 1998, 160, 870-876; Chu y col., J. Exp. Med, 1997, 186, 1623-1631; Lipford y col., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; y Moldoveanu y col, Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, las descripciones de las cuales se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad: Los dinucleótidos CpG sin metilar son relativamente comunes en el ADN bacteriano, pero están poco representados y metilados en el ADN de los vertebrados. Bird, Trends Genet., 1987, 3, 342-347. Se conoce también ADN bacteriano o los oligonucleótidos sintéticos que contienen motivos CpG sin metilar por inducir respuestas inmunes que incluyen, por ejemplo, proliferación de células B, secreción de interleuquina.6 e inmunoglobulina, y resistencia a la apóptosis. Krieg y col., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas y col., J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845; Cowdery y col., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575; Halpern y col., Cell. Immunol., 1996, 167, 72-78; Yamamoto y col., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey y col., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122; Messina y col., J: Immunol., 1991, 147, 1759-1764; Yi y col., J. Immunol, 1996, 157, 4918-4925; Yi y col, J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761; y Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906; Publicación PCT WO 96/02555; Publicación PCT WO 98/16247; Publicación PCT WO 98/18810; Publicación PCT WO 98/40100; Publicación PCT WO 98/55495; Publicación PCT WO 98/37919; y Publicación PCT WO 98/52581, las descripciones de las cuales se incorporan en el presente documento como referencia en su
totalidad.
Se ha demostrado también que se pueden usar emulsiones basadas en lípidos catiónicos como vehículos de genes. Véanse, por ejemplo., Yi y col., Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. bioact. Mater., 24: 653-654 (1997); Kim y col., Proc. Int'l Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 25:344-345 (1998); Kim y col., Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 26 #5438 (1999). Las emulsiones submicrométricas catiónicos, un planteamiento un tanto reciente de la dosificación farmacéutica, demostraron pro primera vez tener capacidad de transporte de moléculas de fármacos pequeñas (Elbaz y col 1993 Int. J. pharm. 96 R1-R6). Se ha demostrado el uso de superficies cargadas para establecer enlaces y proteger los oligonucleótidos de forma estable en suero tanto para oligómeros pequeños (Teixera y col., (199) Pharm Res 16 30-36) como para el ADN del plásmido (Yi y col., (2000) Pharm Res 17 314-320.). Las emulsiones basadas en DOTAP han demostrado mejorar la transfección in vitro e in vivo. (Kim y col., más arriba).
De esta manera, es deseable un coadyuvante que de cómo resultado el incremento de una respuesta de células Th1 que se pueda usar para el tratamiento profiláctico y terapéutico. Dicha respuesta sería eficaz en el tratamiento de, por ejemplo, infecciones víricas así como para la inmunización de individuos susceptibles a las infecciones víricas.
Las Patentes de los Estados Unidos 5.814.482 y 6.015.686 describen Sistemas de Iniciación del Vector Eucariota en Capas (vectores ELVIS), de manera particular los derivados y construidos a partir de genomas de alfavirus (tales como el virus de Sindbis), para uso en la estimulación de una respuesta inmune de un antígeno, en los procedimientos de inhibición de agentes patógenos, y en la dosificación de secuencias de nucleótidos heterólogos en células eucariotas y animales, entre otras.
La Solicitud de Patente Internacional PCT/US99/17308 y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos 09/715.902 del solicitante describe procedimientos para fabricar micropartículas que tienen macromoléculas adsorbidas, tales como un compuesto farmacéutico, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína, una hormona, un enzima, un mediador de la transcripción o la traducción, un intermedio en una vía metabólica, un inmunomodulador, un antígeno, un coadyuvante, o las combinaciones de los mismos, y similares.
La Solicitud de Patente Internacional del solicitante PCT/US00/03331 describe procedimientos para fabricar emulsiones submicrométricas que tienen macromoléculas adsorbidas, tales como una composición farmacéutica, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína, una hormona, un enzima, u mediador de la transcripción o la traducción, un intermedio en una vía metabólica, un inmunomodulador, un antígeno, un coadyuvante o las combinaciones de los mismos, y similares.
Resumen de la invención
Los inventores de la presente invención han descubierto que la efectividad de los diversos usos de los ácidos nucleicos, de manera particular los constructos de vectores capaces de expresar una secuencia de ácido nucleico, y de manera más particular los constructos de vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un antígeno, tal como los constructos de vectores pCMV, de vectores ELVIS o de vector de ARN se pueden mejorar adsorbiendo los constructos del vector en micropartículas de polímero o emulsiones submicrométricas con superficies adsorbentes, que facilitan la introducción de los constructos del vector, y de las secuencias de ácido nucleico heterólogas comprendidas en los constructos del vector, en el interior de las células de un animal.
Tal como se ha descrito en la Solicitud de Patente Internacional PCT/US99/17308 anteriormente descrita, se ha inventado un procedimiento de formación de micropartículas con superficies adsorbentes capaces de adsorber una amplia variedad de macromoléculas. En una forma de realización, las micropartículas están comprendidas por un polímero y un detergente. Las micropartículas de la presente invención adsorben dichas macromoléculas de manera más eficiente que otras micropartículas disponibles en la actualidad.
Diversas formas de realización de la presente invención utilizan micropartículas que se derivan de un polímero, tal como un poli (\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido, un polialquilcianoacrilato, un policianoacrilato, y similares, y están formados con detergentes, tales como detergentes catiónicos, aniónicos o no iónicos, cuyos detergentes pueden usarse en combinación. Los presentes inventores han descubierto que estas micropartículas dan como resultado la adsorción mejorada de los constructos del vector (por ejemplo, constructos de los vectores ELVIS, vector del ARN), así como antígenos víricos, y proporcionan respuestas inmunes superiores.
Tal como se describe en la Solicitud de Patente Internacional descrita anteriormente PCT/US00/03331, se ha inventado una preparación de micropartículas que comprende emulsiones submicrométricas de gotitas de aceite con tensioactivos iónicos. Dichas composiciones adsorben fácilmente macromoléculas tales como ADN, proteínas, y otras moléculas antigénicas. Diversas formas de realización de la presente invención utilizan micropartículas que se derivan de una emulsión de gotitas de aceite que comprende de manera preferible un aceite metabolizable y un agente emulsificante que se presenta de manera preferible en forma de una emulsión de aceite en agua que tiene sustancialmente todas las gotitas de aceite que son menores de 1 micrómetro de diámetro, de manera preferible más pequeñas de 250 nm. De manera preferible, la composición existe en ausencia de cualquier copolímero en bloque de polioxipropileno-polioxietileno. El aceite es de manera preferible un aceite animal, un hidrocarburo no saturado, un terpenoide tal como por ejemplo, escualeno, o un aceite vegetal. La composición comprende de manera preferible un 0,5 a un 20% en volumen del aceite en un medio acuoso. El agente emulsificante comprende de manera preferible un detergente no iónico tal como polioxietileno sorbitán mono-, di-, o triéster o un sorbitán mono-, di-, o triéter. De manera preferible, la composición comprende aproximadamente un 0,01 a aproximadamente un 5% en peso del agente emulsificante.
Por lo tanto, en algunas formas de realización, la porción particulada de la composición de la invención es una micropartícula con una superficie adsorbente, en la que la micropartícula comprende un polímero seleccionado entre el grupo constituido por un (\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido, y un policianoacrilato.
En otras formas de realización, la porción particulada de la composición de la invención es una emulsión submicrométrica que comprende una emulsión de gotitas de aceite formulada con un detergente iónico.
Las micropartículas comprenden de manera adicional constructos de vector capaces de expresar una secuencia de ácido nucleico, tales como un constructo de vector ELVIS seleccionado o vector de ARN adsorbido sobre la superficie de las micropartícula, con el constructo comprendiendo una secuencia nucleótida heteróloga que codifica un polipéptido, una proteína, una hormona, un enzima, un mediador de la transcripción o la traducción, un intermedio en una vía metabólica, un inmunomodulador, un antígeno, un coadyuvante, o las combinaciones de los mismos, y similares.
En otras formas de realización, la invención se dirige a una composición de micropartículas que comprende un ácido nucleico, de manera preferible constructos de vector capaces de expresar una secuencia de ácido nucleico, tal como un constructo de vector pCMV, un vector ELVIS o un vector de ARN seleccionados, adsorbido en una micropartícula de la invención, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otras formas de realización, la invención se dirige a un procedimiento para producir una micropartícula con un ácido nucleico adsorbido, de manera preferible constructos de vector capaces de expresar una secuencia de ácido nucleico, tal como un constructo de vector ELVIS o vector de ARN, el procedimiento comprende:
(a) combinar una solución de polímero que comprende un polímero seleccionado entre el grupo constituido por poli (\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido, y un policianoacrilato, en el que el polímero está presente en una concentración comprendida entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 30% en un solvente orgánico;
y un detergente aniónico, catiónico o no iónico en la solución de polímero, en el que el detergente está presente en una relación comprendida entre 0,001 y 10 (p/p) de detergente a polímero, para formar una mezcla polímero/detergente;
(b) dispersar la mezcla polímero/detergente;
(c) eliminar el solvente orgánico;
(d) recuperar la micropartícula; y
(f) adsorber un constructo de vector ELVIS o vector de ARN en la superficie de la micropartícula, en el que el constructo del vector ELVIS o el vector de ARN comprende una secuencia nucleótida heteróloga que codifica un polipéptido, una proteína, una hormona, un enzima, un mediador de la transcripción o la traducción, un intermedio en una vía metabólica, un inmunomodulador, un antígeno, un coadyuvante, o las combinaciones de los mismos, y similares.
De manera preferible, la mezcla de polímero/detergente se emulsifica para formar una emulsión antes de eliminar el solvente orgánico.
En otras formas de realización, la invención se dirige a una micropartícula producida mediante los procedimientos anteriormente descritos. De manera más preferible, se produce una composición de micropartículas que comprende también un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otras formas adicionales de realización, la invención se dirige a las micropartículas descritas para uso en la dosificación de una secuencia nucleótida heteróloga en un sujeto vertebrado, que comprende administrar a un sujeto vertebrado cualquiera de las composiciones descritas anteriormente.
En formas de realización adicionales la invención se dirige a las micropartículas descritas para uso en el desencadenamiento de una respuesta inmune celular en un sujeto vertebrado que comprende administrar al sujeto vertebrado una cantidad terapéuticamente efectiva de una secuencia nucleótida heteróloga seleccionada adsorbida en una micropartícula de la invención.
En otras formas de realización, la invención se dirige a las micropartículas descritas para uso en inmunización que comprende administrar a un sujeto vertebrado una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de las composiciones de micropartículas anteriores. La composición puede contener de manera opcional macromoléculas no enlazadas, y también puede contener de manera opcional coadyuvantes, incluyendo sales de aluminio tales como fosfato de aluminio, o un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CpG.
En algunas formas de realización preferidas, las micropartículas se forman a partir de poli (\alpha-hidroxi ácido); de manera más preferible un poli (D,L-láctido-co-glicólido); y lo más preferible, un poli (D,L-láctido-co-glicólido).
Cada una de las micropartículas adsorbentes descritas anteriormente de manera no exhaustiva puede tener también de manera opcional macromoléculas atrapadas en su interior, o en solución libre. De esta manera, la invención abarca una variedad de combinaciones en las que las moléculas de ácido nucleico se adsorben sobre las micropartículas y otras moléculas de ácido nucleico se atrapan o adsorben. Más aún, las micropartículas de la invención pueden tener más de una especie de ácido nucleico adsorbido sobre las mismas, así como otras macromoléculas antigénicas adsorbidas sobre las mismas. De manera adicional, las micropartículas pueden tener varias especies de ácido nucleico y/o otras macromoléculas antigénicas atrapadas en el interior.
En otras formas de realización preferidas, las micropartículas se preparan en forma de emulsiones submicrométricas tal como se ha descrito anteriormente.
La presente invención se dirige también a composiciones inmunógenas que comprenden una cantidad inmunoestimulante de un ácido nucleico (por ejemplo, un constructo de vector capaz de expresar una secuencia de ácido nucleico, tal como un constructo de vector ELVIS o vector de ARN, en el que la porción de secuencia nucleótida heteróloga del constructo del vector ELVIS o el vector de ARN puede codificar un antígeno), y una cantidad inmunoestimulante de una composición coadyuvante descrita en el presente documento. En algunas formas de realización de la invención, la composición inmunógena comprende un oligonucleótido CpG en combinación con las micropartículas adsorbidas en el ácido nucleico. La micropartícula adsorbida es por sí misma de manera preferible un constructo de vector ELVIS o vector de ARN que codifica un polipéptido antigénico.
En algunas formas de realización preferidas de la invención, el polipéptido antigénico procede de un virus tal como, por ejemplo, el virus de la hepatitis C (HCV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus del herpes simple (HSV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el citomegalovirus (CMV), el virus de la gripe (flu) y el virus de la rabia. De manera preferible, el polipéptido antigénico se selecciona a partir del grupo constituido por la glicoproteína gD del HSV, la glicoproteína gp 120 del VIH, la glicoproteína gp 140 de VIH, p55 gag del VIH, y los polipéptidos de las regiones pol y tat. En otras formas de realización preferidas de la invención, el polipéptido antigénico procede de una bacteria tal como, por ejemplo, cólera, difteria, tétanos, estreptococo, (por ejemplo, estreptococo B), pertussis, Neisseria meningiditis (por ejemplo, meningitis B); Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, y Haemophilus influenzae. En otras formas de realización adicionalmente preferidas de la invención, el polipéptido antigénico procede de un parásito tal como, por ejemplo, un parásito de la malaria.
Las composiciones coadyuvantes pueden comprender, por ejemplo, sales de aluminio. De manera alternativa, las composiciones coadyuvantes pueden comprender un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CpG. La composición coadyuvante puede comprender también un componente opcional que de como resultado una emulsión cargada positivamente. El oligonucleótido comprende de manera preferible al menos un enlace fosfororotioato o un enlace peptídico de ácido nucleico. En las formas de realización preferidas de la invención, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótido seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID N^{os}: 1-28. En otras formas de realización preferidas de la invención, el oligonucleótido comprende un motivo CpG flanqueado por dos purinas situadas inmediatamente 5' al lado del motivo y dos pirimidinas situadas inmediatamente 3' al lado del motivo. En otras formas de realización preferidas de la invención, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótido seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID N^{os}: 19-28. La más preferida es la SEC ID Nº: 28. En algunas formas de realización preferidas de la invención, la composición coadyuvante comprende de manera adicional un agente inmunoestimulante distinto que se selecciona de manera preferible entre el grupo constituido por alum, un componente de la pared celular bacteriana, y un péptido de muramilo. La propia composición coadyuvante puede estar en forma de una segunda micropartícula. La segunda micropartícula puede absorber y/o atrapar en su interior una variedad de ácidos nucleicos y/o polipéptidos antigénicos, u otras macromoléculas antigénicas. De manera adicional, las composiciones inmunógenas pueden incluir la presencia del ácido nucleico libre en solución.
La presente invención se dirige también a las micropartículas descritas para uso en la estimulación de una respuesta inmune en un animal huésped que comprende administrar al animal una composición inmunógena descrita en el presente documento en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune. El animal huésped es de manera preferible un mamífero, de manera más preferible un macaco Rhesus, y de manera aún más preferible un ser humano.
La presente invención se dirige también a las micropartículas descritas para uso en la inmunización de un animal huésped frente a una infección vírica, bacteriana, o parasítica que comprende administrar al animal una composición inmunógena descrita en el presente documento en una cantidad efectiva para inducir una respuesta protectora. El animal huésped es de manera preferible un mamífero, de manera más preferible un macaco Rhesus, y de manera aún más preferible un ser humano.
La presente invención se dirige también a las micropartículas descritas para uso en el incremento de una respuesta inmune Th1, o una respuesta CTL, o la lipoproliferación, o la producción de citoquina en un animal huésped que comprende administrar al animal una composición inmunógena descrita en el presente documento en una cantidad efectiva para inducir la respuesta inmune Th1, o la respuesta CTL, o la lipoproliferación, o la producción de citoquina. El animal huésped es de manera preferible un mamífero, de manera más preferible un macaco Rhesus, y más preferible aún un ser humano.
La presente invención se dirige también al uso de las micropartículas descritas en la fabricación de un medicamento para aumentar una respuesta inmune en un animal huésped en el que se administra en primer lugar al animal una macromolécula adsorbida en una micropartícula que comprende una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica un primer antígeno (por ejemplo, el ADN de un plásmido, tal como pCMV o un constructo de un vector ELVIS, o un vector de ARN) en una cantidad efectiva para desencadenar una respuesta inmunológica. Posteriormente, se administra al animal un segundo antígeno.
El primer antígeno y el segundo antígeno en estas formas de realización pueden ser el mismo o ser diferentes, y de manera preferible son el mismo. Entre los antígenos preferidos se incluyen antígenos bacterianos y víricos, tales como antígenos de VIH (por ejemplo, gp120, gp140, gp160, p24gag y p55gag), antígenos del virus C de la hepatitis, antígenos del virus A de la gripe, antígenos bacterianos de la meningitis B, y antígenos bacterianos del estreptococo B. El segundo antígeno se adsorbe de manera preferible en las micropartículas descritas en el presente documento, o se coadministra con un coadyuvante, tal como MF59. Se puede coadministrar también la macromolécula con un coadyuvante si se desea. En algunas formas de realización preferidas, la macromolécula se administra dos o más veces antes del segundo antígeno, que se puede administrar también dos o más veces.
De acuerdo con una forma de realización específica: (1) se administra la macromolécula (a) en el momento de la administración inicial, (b) en un período de tiempo que oscila entre 1-8 semanas a partir de la administración inicial, y (c) en un período de tiempo que oscila entre 4-32 semanas a partir de la administración inicial, y (2) el segundo antígeno se administra (a) en un período de tiempo que oscila entre 8-50 semanas a partir de la administración inicial y (b) en un período de tiempo que oscila entre 8-100 semanas a partir de la administración inicial.
Se puede llevar a cabo la dosificación de las composiciones de micropartículas de la invención por cualquier procedimiento conocido, incluyendo inyección directa (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular), y se puede mejorar también dicha dosificación mediante el uso de la electroporación (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos nº 09/499.023, la descripción del cual se incorpora por la presente por referencia en su totalidad). La electroporación es la aplicación de pulsos eléctricos de corta duración a las células para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares, facilitando de esta manera la captación del ADN por las células. Recientemente se ha encontrado que la aplicación de un campo eléctrico a los tejidos in vivo aumenta de manera significativa la captación de ADN y la expresión génica (Mathiesen, I., 1999 Gene Therapy 6:508). Entre los tejidos diana para electroporación in vivo están la piel, el hígado, los tumores, y el músculo. Para la aplicación de la vacuna de ADN, Widera y col. han demostrado que la electroporación in vivo mejora sustancialmente la potencia de la vacuna de ADN en ratones, cobayas, y conejos (Widera, G, y col, 2000, J. Immunol.
164:4635).
Los vectores ELVIS de las formas de realización anteriormente descritas son generalmente moléculas de ADN que comprenden un promotor que funciona en una célula eucariota, una secuencia de ADNc para la que el producto de la transcripción es un constructo del vector del ARN (por ejemplo, el replicón del vector de ARN del alfavirus), y una región de terminación en 3'. Los constructos del vector de ARN comprenden de manera preferible un genoma de ARN procedente de un picornavirus, togavirus, flavivirus, coronavirus, paramixovirus, el virus de la fiebre amarilla, o un alfavirus (por ejemplo, virus de Sindbis, virus Semliki Forest, el virus de la encefalitis equina de Venezuela, o el virus Ross River), y de manera más preferible un genoma de alfavirus, que se haya modificado mediante la sustitución de uno o más genes de proteínas estructurales con una secuencia heteróloga de ácido nucleico seleccionada que codifica un producto de gen de interés. Los constructos del vector de ARN de la presente invención se obtienen de manera general mediante transcripción in vitro de una cadena de ADN molde.
Estos y otros aspectos y formas de realización de la presente invención se evidenciarán de manera sencilla para aquellas personas normalmente expertas en la técnica, a la vista de la descripción en el presente documento.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 proporciona una secuencia de ADN (SEC ID Nº: 63) que codifica un polipéptido modificado p55gag de VIH.
La Fig. 2 proporciona una secuencia de ADN (SEC ID Nº: 64) que codifica un polipéptido modificado p55gag de VIH-1.
La Fig. 3 proporciona una secuencia de ADN (SEC ID Nº: 65) que codifica un polipéptido modificado de la envoltura de VIH-1.
La Fig. 4 proporciona una secuencia de ADN (SEC ID Nº: 66) que codifica un polipéptido modificado de la envoltura de VIH-1.
La Fig.5 proporciona una secuencia de ADN (SEC ID Nº: 67) que codifica un polipéptido modificado p55gag de VIH-1.
La Fig. 6 proporciona una secuencia de ADN (SEC ID Nº: 68) que codifica un polipéptido modificado p55gag de VIH-1.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente que las micropartículas con moléculas de ácido nucleico adsorbidas, de manera preferible constructos de vector capaces de expresar una secuencia de ácido nucleico, y de manera más preferible constructos de vector que comprenden una secuencia de ácido nucleico heteróloga que codifica un antígeno, tal como los constructos de los vectores pCMV, los vectores ELVIS o el vector del ARN, desencadenan respuestas inmunes mejoradas. De manera adicional, la combinación de micropartículas con moléculas de ácido nucleico absorbidas (por ejemplo, con constructos de vectores pCMV, vectores ELVIS o el vector del ARN adsorbidos) y coadyuvantes son útiles para desencadenar respuestas inmunes mejoradas.
La invención se basa también en el descubrimiento sorprendente que los constructos de vector comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican antígenos, tal como los constructos de los vectores pCMV, vectores ELVIS o el vector del ARN, en asociación con la administración subsiguiente del antígeno, desencadenan respuestas inmunes mejoradas.
La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de química, química de polímeros, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de las capacidades de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía, véanse, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición (Easton, Pensilvania; Mack Publishing Company, 1990); Methods in Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K. S., ed, CRC Press, 1997) y Seymour/Carraher's Polymer Chemistry (4º edición, Marcel Dekker Inc., 1996).
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en el presente documento, sea más arriba o más abajo, se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.
Tal como se usan en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "la" incluyen referencias plurales a no ser que el contenido dicte claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, el término "micropartícula" se refiere a una o más micropartículas, y similares.
A. Definiciones
En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretende que se definan tal como se indica a continuación
A no ser que se afirme otra cosa, todos los porcentajes y relaciones en el siguiente documento se proporcionan en base peso.
El término "micropartícula" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una partícula de diámetro comprendido entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 150 \mum, de manera más preferible entre aproximadamente 200 nm y aproximadamente 30 \mum de diámetro, y lo más preferible entre aproximadamente 500 nm y aproximadamente 10 \mum de diámetro. De manera preferible, la micropartícula será de un diámetro que permita la administración por vía parenteral o mucosa sin ocluir agujas y capilares. El tamaño de la micropartícula se determina fácilmente mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como la espectroscopía de correlación de fotones, la difractometría láser y/o la microscopía de barrido de electrones. El término "partícula" se puede usar también para denotar una micropartícula tal como se define en el presente documento. La micropartícula puede referirse de manera alternativa a una composición de emulsión submicrométrica tal como se ha descrito en el presente
documento.
Las micropartículas de polímero para uso en el presente documento se forman a partir de materiales que se puedan esterilizar, y sean no tóxicos y biodegradables. Dichos materiales incluyen, sin limitación, poli (\alpha-hidroxi ácido), ácido polihidroxibutírico, policaprolactona, poliortoéster, polianhídrido, PACA y policianoacrilato. De manera preferible, las micropartículas para uso en la presente invención son micropartículas de polímero derivadas de un poli (\alpha-hidroxi ácido), de manera particular, a partir de un poli (láctido) ("PLA") o un copolímero de D,L-láctido y glicólido o ácido glicólico, tal como un poli (D,L-láctido-co-glicólido) ("PLG" o "PLGA"), o un copolímero de D,L-láctido y caprolactona. Las micropartículas de polímero se pueden derivar de cualquiera de los diversos materiales de partida poliméricos que tienen una variedad de pesos moleculares y, en el caso de los copolímeros tales como PLG, una variedad de relaciones láctido:glicólido, la elección del cual será claramente una materia de elección. Estos parámetros se describen de manera más completa a continuación De manera alternativa, las micropartículas de la invención están comprendidas en una emulsión submicrométrica.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "emulsión de gotitas de aceite" se refiere a una emulsión que comprende un aceite metabolizable y un agente emulsificante. El término "emulsión submicrométrica" tal como se usa en el presente documento se refiere a una emulsión de gotitas de aceite de la invención que comprende gotitas que oscilan en tamaño entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 1000 nm.
Tal como se usa en el presente documento, el término "micropartícula" puede referirse a una micropartícula de polímero tal como se ha descrito en el presente documento, o a una composición de emulsión submicrométrica tal como se describe en el presente documento.
El término "detergente" tal como se usa en el presente documento incluye tensioactivos, agentes dispersantes, agentes suspensores, y estabilizantes de la emulsión. Los detergentes aniónicos incluyen, pero no se limitan a, SDS (dodecil sulfato de sodio), SLS (lauril sufato de sodio), DSS (disulfosuccinato), alcoholes grasos sulfatados, y similares. Los detergentes catiónicos incluyen, pero no se limitan a, cetrimida (bromuro de cetil trimetil amonio, o "CTAB"), cloruro de benzalconio, DDA (bromuro de dimetil dioctodecil amonio), DOTAP (dioleoil-3-trimetilamonio-propano), y similares. Los detergentes no iónicos incluyen, pero no se limitan a, PVA, povidona (conocida también como polivinilpirrolidona o PVP), ésteres de sorbitán, polisorbatos, monoéteres de glicol polioxietilados, alquil fenoles polioxietilados, poloxámeros, y similares.
El término "potencial zeta" tal como se usa en el presente documento, se refiere al potencial eléctrico que existe a través de la interfase de todos los sólidos y líquidos, es decir, el potencial a través de la capa difusa de iones que rodean una partícula coloidal cargada. Se puede calcular el potencial zeta a partir de las movilidades electroforéticas, es decir, las velocidades a las que las partículas coloidales se mueven entre electrodos cargados puestos en contacto con la sustancia que se va a medir, usando técnicas bien conocidas en la técnica.
El término "macromolécula" tal como se usa en el presente documento se refiere, sin limitación, a un producto farmacéutico, un polinucleótido, un polipéptido, una hormona, un enzima, un mediador de la transcipción o la traducción, un intermedio en una vía metabólica, un inmunomodulador, un antígeno, un coadyuvante, o las combinaciones de los mismos. Las macromoléculas particulares para uso con la presente invención se describen con más detalle a continuación.
El término "compuesto farmacéutico" se refiere a los compuestos biológicamente activos tales como antibióticos, agentes antivíricos, factores de crecimiento, hormonas, y similares, descritas con más detalle a continuación.
El término "coadyuvante" se refiere a cualquier sustancia que asiste o modifica la acción de un compuesto farmacéutico, que incluye pero no se limita a coadyuvantes inmunológicos, que aumentan o diversifican la respuesta inmune a un antígeno.
Un "polinucleótido" es un polímero de ácido nucleico, que codifica normalmente una proteína o polipéptido biológicamente activo (por ejemplo, inmunógeno o terapéutico). Dependiendo de la naturaleza del polipéptido codificado por el polinucleótido , un polinucleótido puede incluir tan solo 10 nucleótidos, por ejemplo, donde el oligonucleótido codifica un antígeno. Además, un "polinucleótido" puede incluir secuencias de cadena tanto simple como doble, y referirse a, pero no limitarse a, ADNc procedente que procede de ARNm de virus, procariotas o eucariotas, secuencias de ARN y ADN genómico procedente de virus (por ejemplo ARN y ADN procedentes de virus y retrovirus) o ADN procariota, y de manera especial secuencias de ADN sintético. El término incluye también secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN. El término incluye de manera adicional modificaciones, tales como delecciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservativas en la naturaleza), en una secuencia nativa, de tal manera que la molécula de ácido nucleico codifica una proteína terapéutica o antigénica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, tales como mutagénesis dirigidas al emplazamiento, o pueden ser accidentales, tales como mutagénesis de los huéspedes que producen los antígenos.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos, y no se limitan a una mínima longitud del producto: De esta manera, se incluyen dentro de la definición los péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros y similares. Tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas quedan comprendidos en la definición. Los términos incluyen también modificaciones, tales como delecciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservativas en la naturaleza) de una secuencia nativa, de manera preferible de forma que la proteína mantenga la capacidad de desencadenar una respuesta inmunológica o tenga un efecto terapéutico sobre un sujeto al cual se administra la proteína.
Por "antígeno" se entiende una molécula que contiene uno o más epitopos capaces de estimular un sistema inmune de un huésped para fabricar una respuesta inmune específica del antígeno celular cuando el antígeno se presenta de acuerdo con la presente invención, o una respuesta de anticuerpo humoral. Un antígeno puede ser capaz de estimular una respuesta celular o humoral por sí mismo o cuando se presenta en combinación con otra molécula. Normalmente, un epitopo incluirá entre aproximadamente 3-15, de manera preferible aproximadamente 5-15, y de manera más preferible aproximadamente 7-15 aminoácidos. Se pueden identificar los epitopos de una proteína dada usando cualquiera de las técnicas de mapeado de epitopos, bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol 66 (Glenn E. Morris, ED., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, se pueden determinar los epitopos lineales mediante, por ejemplo, sintetización concurrente de gran número de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos a la vez que los péptidos siguen estando ligados a los soportes. Dichas técnicas son conocidas en la técnica, y se describen en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 4.708.871; Geysen y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 3998-4002; Geysen y col. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715, incorporadas todas en el presente documento por referencia en su totalidad. De manera similar, los epitopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de aminoácidos mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, más arriba.
El término "antígeno" tal como se usa en el presente documento denota ambas subunidades de antígeno, es decir, antígenos que están separados y específicos procedentes de un organismo completo con el que el antígeno se asocia en la naturaleza, así como bacterias virus, parásitos u otros microbios atenuados inactivados o muertos. Se incluyen también en la definición de antígeno en el presente documento anticuerpos tales como anticuerpos anti-idiotipo, o fragmentos de los mismos, y mimotopos de péptidos sintéticos, que pueden imitar un antígeno o determinante antigénico in vivo, tal como en terapia génica y aplicaciones de inmunización de ácido nucleico. De manera similar, se incluye también en la definición de antígeno en el presente documento un oligonucleótido o polinucleótido que exprese una proteína terapéutica o inmunogénica, o un determinante antigénico in vivo, tal como en aplicaciones de terapia génica y de inmunización mediante ácido nucleico.
De manera adicional, a efectos de la presente invención, los antígenos se pueden derivar de cualquiera de los diferentes virus, bacterias, parásitos y hongos conocidos, así como de cualquiera de los diversos antígenos tumorales. Además, a efectos de la presente invención, un "antígeno" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como delecciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservativas en la naturaleza), en la secuencia nativa, de forma que la proteína mantiene la capacidad de desencadenar una respuesta inmunológica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, tales como la mutagénesis dirigida al emplazamiento, o pueden ser accidentales, tales como las mutaciones de los huéspedes que producen los antígenos.
Una "respuesta inmunológica" o "respuesta inmune" respecto de un antígeno o composición es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmune humoral y/o celular a las moléculas presentes en la composición de interés. A efectos de la presente invención, una "respuesta inmune celular" se refiere a una respuesta inmune mediada por linfocitos T y/o otros leucocitos de la sangre. Un aspecto importante de la inmunidad celular implica una respuesta específica del antígeno por las células T citolíticas ("CTL"). Las CTL tienen especificidad por los antígenos de péptido que se presentan en asociación con las proteínas codificadas por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y que se expresan sobre la superficie de las células. Las CTL ayudan a inducir y promover la destrucción intracelular de los microbios intracelulares, o la lisis de las células infectadas con dichos microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta específica del antígeno por las células T ayudante. Las células T ayudante actúan ayudando a estimular la función, y el focaliza la actividad de las células efectoras no específicas frente a las células que despliegan antígenos de péptido en asociación con las moléculas MHC en su superficie. Una "respuesta inmune celular" se refiere también a la producción de citoquinas, quimioquinas y otras moléculas similares producidas por células T activadas y/o otros leucocitos de la sangre, que incluyen aquellas derivadas de las células T CD4+ y CD8+.
Una composición, tal como una composición inmunógena, o vacuna que desencadena una respuesta inmune celular, puede servir para sensibilizar un sujeto vertebrado mediante la presentación del antígeno en asociación con las moléculas MHC en la superficie celular. La respuesta inmune mediada por células se dirige a, o cerca de, las células que presentan el antígeno en su superficie. De manera adicional, pueden generarse los linfocitos T específicos del antígeno para permitir la protección futura de un huésped inmunizado.
Se puede determinar mediante numerosos ensayos la capacidad de un antígeno o composición particular para estimular una respuesta inmunológica mediada por células, tales como mediante ensayos de linfoproliferación (activación del linfocito), ensayos de células citotóxicas CTL, ensayando para los linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado, o por medida de la producción de citoquina por las células T en respuesta a la reestimulación con el antígeno. Dichos ensayos son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Erickson y col., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199; Doe y col., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376; y los ejemplos a continuación.
De esta manera, una respuesta inmunológica tal como se usa en el presente documento puede ser una respuesta que estimula la producción de CTL, y/o la producción o activación de las células T ayudantes. El antígeno de interés puede desencadenar también una respuesta inmune mediada por anticuerpos. De esta forma, una respuesta inmunológica puede incluir uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos por las células B; y/o la activación de las células T supresoras y/o las células T \gamma\delta dirigidas de manera específica a un antígeno o antígenos presentes en la composición o vacuna de interés. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la infectividad, y/o mediar el complemento del anticuerpo, o la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) para proporcionar protección en un huésped inmunizado. Dichas respuestas se pueden determinar usando inmunoensayos estándar y ensayos de neutralización, bien conocidos en la técnica.
Una composición que contiene un antígeno seleccionado adsorbido en una micropartícula, despliega una "inmunogenicidad mejorada" cuando esta posee una mayor capacidad para desencadenar una respuesta inmune que la respuesta inmune desencadenada por una cantidad equivalente del antígeno cuando se dosifica sin asociación con la micropartícula. De esta manera, una composición puede desplegar "inmunogenicidad mejorada" debido a que el antígeno es más fuertemente inmunogénico en virtud de la adsorción de las micropartículas, o debido a que es necesaria una dosis más baja de antígeno para conseguir una respuesta inmune en el sujeto al cual se administra. Se puede determinar dicha inmunogenicidad mejorada administrando la composición micropartículas/antígeno, y los controles de antígeno en animales y comparando los títulos de anticuerpo frente a los dos usando ensayos estándar tales como radioinmunoensayo y ELISA, bien conocidos en la técnica.
Los términos "cantidad efectiva" o "cantidad farmacéuticamente efectiva" de una composición dada, tal como se proporcionan en el presente documento, se refieren a una cantidad de composición, suficiente pero no tóxica, para proporcionar una respuesta deseada, tal como una respuesta inmunológica, y el correspondiente efecto terapéutico, o en el caso de la dosificación de una proteína terapéutica, una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento del sujeto, tal como se define a continuación. Tal como se detallará más adelante, la cantidad exacta requerida variará entre sujeto y sujeto, dependiendo de la especie, edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la dolencia que está siendo tratada, y la macromolécula particular de interés, el modo de administración y similares. Se puede determinar una cantidad "efectiva" apropiada en cualquier caso individual por una persona normalmente experta en la técnica usando experimentación rutinaria.
Por "sujeto vertebrado" se entiende cualquier miembro del subfilum cordata, que incluye, sin limitación, mamíferos tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, caballos, y seres humanos; animales domésticos tales como perros y gatos; y pájaros, que incluyen los domésticos, aves de corral y salvajes tales como gallos e incluyendo por tanto pollos, pavos y otra gallináceas. El término no denota una edad particular. De esta manera, se pretende que cubra a animales adultos y recién nacidos.
Por "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se entiende un material que no sea indeseable biológicamente o de otra manera, es decir, el material se puede administrar a un individuo junto con la formulación de micropartículas sin producir ningún efecto biológico indeseable en el individuo o sin que interactúe de forma perjudicial con cualquiera de los componentes de la composición en la que se contiene.
El término "excipiente" se refiere a sustancias que se proporcionan de manera común en formas de dosificación acabadas, e incluye vehículos, ligantes, desintegrantes, rellenos (diluyentes), lubricantes, deslizantes (mejoradores del flujo), coadyuvantes de la compresión, colores, endulzantes, conservantes, agentes suspensores/dispersantes, formadores de películas/recubrimientos, aromas y tintas de impresión.
Por "pH fisiológico" o un "pH en el intervalo fisiológico" se entiende un pH en el intervalo comprendido entre aproximadamente 7,2 y 8,0 inclusive, de manera más típica en el intervalo comprendido entre aproximadamente 7,2 y 7,6 inclusive.
Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" (incluyendo variaciones del mismo, por ejemplo, "tratar" o "tratado") se refiere a cualquiera de (i) la prevención de la infección o reinfección, tal como en la vacuna tradicional (ii) la reducción o eliminación de los síntomas, y (iii) la eliminación sustancial o completa del patógeno o transtorno en cuestión. El tratamiento se puede efectuar de manera profiláctica (antes de la infección) o de manera terapéutica (tras la infección).
Tal como se usa en el presente documento, la frase "ácido nucleico" se refiere a ADN, ARN o quimeras formadas a partir de los anteriores.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "oligonucleótido que comprende al menos un motivo CpG" se refiere a un polinucleótido que comprende al menos un dinucleótido CpG. Los oligonucleótidos que comprenden al menos un motivo CpG pueden comprender múltiples motivos CpG. Estos oligonucleótidos son también conocidos en la técnica como "oligonucleótidos CpG". Tal como se usa en el presente documento, la frase "motivo CpG" se refiere a una porción de dinucleótido de un oligonucleótido que comprende un nucleótido citosina seguido por un nucleótido guanosina. Se puede usar también 5-metilcitosina en lugar de citosina.
Tal como se usa en el presente documento, "replicón del vector de ARN del alfavirus", "replicón del vector de ARN", "constructo del vector de ARN", y "replicón" se refieren a una molécula de ARN que es capaz de dirigir su propia amplificación o autorreplicación in vivo, en el interior de una célula diana. Un replicón del vector de ARN derivado de un alfavirus deberá contener los siguientes elementos ordenados: secuencias víricas 5' requeridas en cis para la replicación (también denominadas como 5' CSE), secuencias que, cuando se expresan, codifican proteínas no estructurales de alfavirus biológicamente activas (por ejemplo, nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), secuencias víricas 3' requeridas en cis para la replicación (también denominadas 3' CSE), y una extensión de poliadenilato. Un replicón del vector de ARN derivado de alfavirus puede contener también un promotor de la "región de unión" subgenómica vírica, secuencias procedentes de uno o más genes de proteínas estructurales o porciones de las mismas, molécula(s) de ácido nucleico extraño(s) que sean de un tamaño suficiente para permitir la producción de virus viables, así como la(s) secuencia(s) heterologa(s) que se va(n) a expresar.
Tal como se usa en el presente documento, "Sistema de Iniciación del Vector en Capas Eucariota", "ELVIS" o "vector ELVIS" se refiere a un conjunto que es capaz de dirigir la expresión de una(s) secuencia(s) o gen(es) de interés. El sistema de iniciación del vector en capas eucariota deberá contener un promotor 5' que sea capaz de inicializar in vivo (es decir, en el interior de una célula) la síntesis del ARN a partir de ADNc, y una secuencia de vector vírica que sea capaz de dirigir su propia replicación en una célula eucariota y expresar también una secuencia heteróloga. En formas de realización preferidas, la secuencia del vector del ácido nucleico es una secuencia derivada de alfavirus y se comprende de una secuencia 5' que es capaz de inicializar la transcripción de un ARN de un alfavirus (también denominado como 5' CSE), así como las secuencias que, cuando se expresan, codifican las proteínas no estructurales del alfavirus biológicamente activo (por ejemplo, nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), y una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus (también denominada como 3' CSE). De manera adicional, la secuencia del vector puede incluir un promotor de la "región de unión" subgenómica vírica, las secuencias procedentes de uno o más genes de proteínas estructurales o porciones de las mismas, molécula(s) de ácido nucleico extraño que sean de un tamaño suficiente para permitir alcanzar una amplificación óptima, una secuencia heteróloga que se vaya a expresar, uno o más emplazamientos de restricción para la inserción de las secuencias heterólogas, así como una secuencia de poliadenilación. El sistema de iniciación del vector en capas eucariota puede contener también secuencias de reconocimiento ayustadas, una secuencia de reconocimiento de la ribozima catalítica, una señal de exportación nuclear, y una secuencia de terminación de la transcripción.
"Constructo del vector del alfavirus" se refiere a un conjunto que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia o gen de interés. Dichos constructos de vector están comprendidos de manera general por una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripción de un ARN de alfavirus (también denominado como 5' CSE), así como las secuencias que, cuando se expresan, codifican proteínas no estructurales de alfavirus biológicamente activo (por ejemplo, nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), una secuencia de reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus (también denominada como 3' CSE), y una extensión de poliadenilato. De manera adicional, el constructo del vector puede incluir un promotor de la "región de unión" subgenómica vírica, las secuencias de uno o más genes procedentes de proteínas estructurales o porciones de las mismas, una(s) molécula(s) de ácido nucleico extraño que sea(n) de tamaño suficiente para permitir la producción de virus viables, un promotor 5' que sea capaz de inicializar la síntesis de ARN vírico a partir de ADNc in vitro o in vivo, una secuencia heteróloga que se va a expresar, y uno o más emplazamientos de restricción para la inserción de las secuencias heterólogas.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "constructo del vector" se refiere de manera general a cualquier conjunto que sea capaz de dirigir la expresión de una(s) secuencia(s) de ácido nucleico o gen(es) de interés. El constructo del vector incluye de manera típica el promotor transcripcional/mejorador o locus que define el(los) elemento(s), u otros elementos que controlan la expresión del gen mediante otros medios que los ayustamientos alternados, exportación del ARN nuclear, modificación post-traduccional del mensajero, o modificación post-transcripcional de la proteína. De manera adicional, el constructo del vector incluye típicamente una secuencia que, cuando se transcribe, se enlaza de manera operable con la(s) secuencia(s) o gen(es) de interés y actúa como una secuencia de iniciación de la traducción. El constructo del vector puede incluir de manera opcional una señal que dirija la poliadenilación, un marcador seleccionable, así como uno o más emplazamientos de restricción y una secuencia de terminación de la traducción. De manera adicional, si el constructo del vector se coloca en un retrovirus, el constructo del vector puede incluir una señal de empaquetado, repeticiones de terminales largos (LTR) y emplazamientos de enlace del cebador de la cadena positiva y negativa apropiados para el retrovirus usado (si estos no están ya presentes), los ejemplos de constructos de vector incluyen vectores ELVIS, que comprende el ADNc complemento de los constructos del vector de ARN, los propios constructos del vector de ARN, los constructos del vector del alfavirus, los constructos del vector de CMV y similares.
Un tipo específico de constructo de vector es un "plásmido", que se refiere a un ADN circular de doble cadena, de forma circular, en el que se pueden enlazar segmentos adicionales de ADN. Los plásmidos específicos descritos a continuación incluyen pCMV y pSINCP.
De acuerdo con algunas formas de realización de la presente invención, se proporcionan composiciones y procedimientos de tratamiento, que incluyen inmunizar de manera profiláctica y/o terapéutica, un animal huésped frente a las infecciones víricas, fúngicas, por micoplasma, bacterianas, o de protozoos, así como frente a los tumores. Los procedimientos de la presente invención son útiles para conferir inmunidad profiláctica y/o terapéutica a un mamífero, de manera preferible un ser humano. Se pueden practicar también los procedimientos de la presente invención en mamíferos, diferentes a los seres humanos, incluyendo mamíferos en los marcos de la investigación biomédica.
B. Procedimientos generales 1. Micropartículas de polímero con macromoléculas adsorbidas
Las micropartículas de polímero, entre las que se incluyen micropartículas de PLA y PLG, adsorben de manera eficiente las macromoléculas biológicamente activas. De manera adicional, estas micropartículas adsorben una gran variedad de moléculas, entre las que se incluyen macromoléculas cargadas y/o voluminosas. De esta manera, las macromoléculas/micropartículas usadas en conexión con la presente invención se pueden usar como un sistema de dosificación para dosificar los componentes biológicamente activos con el fin de tratar, evitar y/o diagnosticar una amplia variedad de enfermedades.
Se puede dosificar una amplia variedad de macromoléculas en asociación con las micropartículas entre las que se incluyen, pero no se limitan a, compuestos farmacéuticos tales como antibióticos y agentes antivíricos, fármacos antiinflamatorios no esteroideos, analgésicos, vasodilatadores, fármacos cardiovasculares, sicotrópicos, neurolépticos, antidepresivos, fármacos antiparkinsonianos beta bloqueantes, bloqueantes del canal del calcio, inhibidores de la bradiquinina, inhibidores ACE, vasodilatadores, inhibidores de la prolactina, esteroides, antagonistas de hormonas, antihistamínicos, antagonistas de la serotonina, heparina, agentes quimioterapéuticos, antineoplásticos y factores del crecimiento, que incluyen pero no se limitan a PDGF, EGF, KGF, IGF-1 e IGF-2,FGF, polinucleótidos que codifican proteínas terapéuticas o inmunógenas y epitopos de las mismas para uso en vacunas, hormonas que incluyen péptido hormonas tales como insulina, proinsulina, hormona del crecimiento, GR, LHRH, EGF, somastatina, SNX-111, BNP, insulinotropina, ANP, FSH, LH, PSH y hCG, hormonas esteroides de las gónadas (andrógenos, estrógenos y progesterona), hormona estimuladora del tiroides, inhibina, colecistoquinina, ACTH, CRF, dinorfinas, endorfinas, endotelina, fragmentos de fibronectina, galanina, gastrina, insulinotropina, glucagón, fragmentos de proteína que enlazan con GTP, guanilina, las leucoquininas, magainina, mastoparans, dermaseptina, sistemina, neuromedinas, neurotensina, pancreastatina, polipéptido pancreático, sustancia P, secretina, timosina, y similares, enzimas, mediadores de la transcripción o la traducción, intermedios en las vías metabólicas, inmunomoduladores, tales como cualquiera de las diversas citoquinas que incluyen interleuquina-1, interleuquina-2, interleuquina-3, interleuquina-4, y gamma interferón, antígenos, y coadyuvantes.
En algunas formas de realización de la invención preferidas, la macromolécula es ácido nucleico, de manera más preferible un constructo de vector tal como un constructo de un vector ELVIS, o de un vector de ARN. Una ventaja particular de la presente invención es la capacidad de las micropartículas con el vector ELVIS adsorbido para generar respuestas inmunes mediadas por células en un sujeto vertebrado. La capacidad del antígeno/micropartículas de la presente invención para desencadenar una respuesta inmune mediada por células frente a un antígeno seleccionado proporciona una herramienta poderosa frente a la infección por una amplia variedad de patógenos. De acuerdo con esto, el antígeno/micropartículas de la presente invención se puede incorporar en las composiciones de vacuna.
De esta manera, de manera adicional a una respuesta de anticuerpo convencional, los sistemas descritos en el presente documento pueden proporcionar, por ejemplo, la asociación de los antígenos expresados con moléculas MHC de clase I de tal manera que se puede organizar una respuesta celular inmune in vivo al antígeno de interés que estimule la producción de CTL para permitir el reconocimiento futuro del antígeno. Además, los procedimientos pueden desencadenar una respuesta específica del antígeno mediante las células T ayudantes. De acuerdo con esto, los procedimientos de la presente invención encontrarán uso con cualquier macromolécula para la cual se deseen las respuestas celular y/o humoral, de manera preferible los antígenos derivados de patógenos víricos que pueden inducir anticuerpos, epitopos de las células T ayudantes y epitopos de las células T citotóxicas. Dichos antígenos incluyen, pero no se limitan a, aquellos codificados por virus humanos y animales, y pueden corresponder con cualquier proteína estructural o no estructural.
Las micropartículas de la presente invención son particularmente útiles para la inmunización frente a virus intracelulares que desencadan normalmente malas respuestas inmunes. Por ejemplo, la presente invención encontrará uso para estimular una respuesta inmune frente a una amplia variedad de proteínas de la familia de los herpesvirus, entre las que se incluyen proteínas derivadas del virus del herpes simple (HSV) tipos 1 y 2, tales como la glicoproteínas gB, gD y gH de HSV-1 y HSV-2; antígenos derivados del virus zoster de la varicela (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV) y citomegalovirus (CMV) que incluye CMV gB y gH; y antígenos derivados de otros herpesvirus humanos tales como HHV6 y HHV7. (Véanse, por ejemplo, Chee y col., Cytomegaloviruses (J. K. McDougall, ed., Springer-Verlag 1990) pp. 125-169, para una revisión de la proteína que codifica el contenido del citomegalovirus; McGeoch y col., J. Gen. Virol. (1998) 69: 1531-1574, para una descripción de los diversos HSV-1 que codifican proteínas; la Patente de los Estados Unidos Nº 5.171.568 para una descripción de las proteínas gB y gD de HSV-1 y HSV-2 y los genes que codifican los anteriores; Baer y col., Nature (1984) 310:207-211, para la identificación de las secuencias que codifican la proteína en un genoma de EBV; y Davison y Scott, J. gen. Virol (1986) 67:1759-1816, para una revisión de VZV).
Se pueden usar también de manera conveniente los antígenos de la familia del virus de la hepatitis, entre los que se incluyen el virus de la hepatitis A (HAV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV), el virus de la hepatitis delta (HDV), el virus de la hepatitis E (HEV) y el virus de la hepatitis G (HGV) en las técnicas descritas en el presente documento. Por medio de ejemplo, se conoce la secuencia genómica vírica de HCV, así como los procedimientos para obtener la secuencia. Véanse, por ejemplo las Publicaciones Internacionales N^{os} WO 89/04669; WO 90/11089; y WO 90/14436. El genoma de HCV codifica algunas proteínas víricas que incluyen E1 (también conocida como E) y E2 (también conocida como E2/NSI) y una proteína N-terminal de la nucleocápsida (denominada "núcleo") (véase, Houghton y col., Hepatology (1991) 14:381-388, para una descripción de las proteínas de HCV, entre las que se incluyen E1 y E2). Cada una de estas proteínas, así como los fragmentos antigénicos de las mismas, encontrará uso en la presente composición y sus procedimientos.
De manera similar, se conoce la secuencia del antigeno \delta de HDV (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 5.378.814)) y se puede usar también este antígeno de manera conveniente en la presente composición y sus procedimientos. De manera adicional, encontrarán uso en el presente documento los antígenos derivados de HBV, tales como el antígeno núcleo, el antígeno superficial, Sag, así como las secuencias presuperficiales, pre-S1 y pre-S2 (denominadas formalmente pre-S), así como las combinaciones de los anteriores, tales como Sag/pre-S1, Sag/pre-S2, Sag/preS-1/pre-S2, y pre-S1/pre-S2. Véanse, por ejemplo "HBV Bacines - from the laboratory to license: a case study" en Mackett, M. y Williamson, J. D., Human Vaccines and Vaccination, pp. 159-176, para una descripción de la estructura de HBV; y las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.722.840, 5.098.704, 5.324.513 incorporadas en el presente documento por referencia en su totalidad; Beames y col., J. Virol. (1995) 69:6833-6838, Bimbaum y col., J. Virol. (1990) 64:3319-3330; y Zhou y col., J. Virol. (1991) 65:5457-5464.
Los antígenos derivados de otros virus encontrarán uso en las composiciones y procedimientos reivindicados, tales como sin limitación, las proteínas procedentes de miembros de las familias Picornaviridae (por ejemplo, poliovirus, etc); Caliciviridae; Togaviridae (por ejemplo, virus de la rubéola, virus del dengue, etc); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabodoviridae (por ejemplo, virus de la rabia, etc); Filoviridae; Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio, etc); Orthomixoviridae (por ejemplo, virus de la gripe tipos A, B y C, etc); Bunyaviridae, Arenaviridae; Retroviridae (por ejemplo, HTLV-I; HTLV-II; VIH-1 (también conocidos como HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc.)), que incluyen pero no se limitan a antígenos de los aislados de HIV_{IIIB}, HIV_{SF2}, HIV_{LAV,} HIV_{LAI}, HIV_{MN}); VIH-1_{CM235}, VIH-1_{US4}; VIH-2; virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS) entre otros. De manera adicional, se pueden derivar también antígenos del virus del papiloma humano (VPH) y el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas. Véanse, por ejemplo Virology, 3ª Edición (W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2ª Edición (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds 1991) para una descripción de este y otros virus.
De manera más particular, se conocen y se ha informado acerca de las proteínas de la envuelta gp120 ó gp140 de cualquiera de los anteriores aislados de VIH, entre las que se incluyen miembros de diversos subtipos genéticos de VIH (véanse por ejemplo, Myers y col., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, Nuevo Méjico (1992); Myers y col., Human Retroviruses and Aids, 1990, Los Alamos, Nuevo Méjico: Los Alamos National Laboratory; y Modrow y col., J. Virol. (1987) 61:570-578, para una comparación de las secuencias de la envuelta de una variedad de aislados de VIH) y antígenos derivados de cualquiera de estos aislados encontrarán uso en los procedimientos presentes. Además, la invención es igualmente aplicable a otras proteínas inmunógenas derivadas de cualquiera de los diversos aislados de VIH, incluyendo cualquiera de las diversas proteínas de envuelta tales como gp160 y gp41, antígenos gag tales como p24gag y p55gag, así como las proteínas derivadas de las regiones pol y tat. Cualquiera de estas proteínas y antígenos puede también modificarse por el uso en la presente invención. Por ejemplo, las Figuras 1, 2, 5, y 6 proporcionan secuencias de ADN que codifican antígenos gag modificados (SEC ID N^{os}: 63, 64, 67 y 68) y las Figuras 3, y 4 proporcionan secuencias de ADN que codifican antígenos de la envuelta modificados (SEC ID N^{os}: 65 y 66).
El virus de la gripe es otro ejemplo de virus para el que la presente invención será particularmente útil. De manera específica, las glicoproteínas HA y NA de la envuelta de la gripe A son de particular interés para generar una respuesta inmune. Se han identificado numerosos subtipos HA de la gripe A (Kawaoka y col., Virology (1990) 179:759-767; Webster y col., "Antigenic variation among type A influenzae viruses", p 127-168. En: P. Palese y D. W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenzae viruses. Springer-Verlag, Nueva York). De esta manera, se pueden usar también las proteínas derivadas de cualquiera de estos aislados en las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento.
Las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento encontrarán uso con numerosos antígenos bacterianos, tales como aquellos derivados de organismos que producen difteria, cólera, tuberculosis, tétanos, pertussis, meningitis, y otros estados patogénicos que incluyen, sin limitación, Bordetella pertussis, Neisseria meningitides (A, B, C, Y), Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, y Haemophilus influenzae. Haemophilus influenzae de tipo B (HIB), Helicobacter pylori, y las combinaciones de los mismos. Los ejemplos de antígenos de Neisseria meningitides B se describen en las siguientes solicitudes de patente de propiedad compartida: PCT/US99/09346; PCT IB98/01665; y PCT IB99/00103. Entre los ejemplos de antígenos de parásitos se incluyen los derivados de organismos que producen malaria y enfermedad de Lyme.
Los antígenos adicionales para uso con la invención, algunos de los cuales se relacionan en otros puntos de esta solicitud, incluyen los siguientes (se presentan las referencias inmediatamente a continuación):
- Un antígeno de proteína de N. meningitidis serogrupo B, tal como los de las Refs. 1 a 7 a continuación.
- la preparación de una vesícula de membrana externa (OMV) procedente de N. meningitidis serogrupo B, tal como las que se describen en las Refs. 8, 9, 10, 11 etc, a continuación.
- un antígeno de sacárido de N. meningitidis serogrupo A, C, W135 y/o Y, tal como el oligosacárido descrito en la Ref. 12 a continuación procedente del serogrupo C (véase también Ref. 13).
- un antígeno de sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo Refs. 14, 15, 16].
- un antígeno de N. gonorrhoeae [por ejemplo, Refs 1, 2, 3].
- un antígeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo, refs. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23].
- un antígeno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo, 24]
- un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como el virus inactivado [por ejemplo, Refs. 25, 26].
- un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como los antígenos superficiales y/o núcleo [por ejemplo, Refs. 26, 27].
- un antígeno del virus de la hepatitis C [por ejemplo, Ref 28].
- un antígeno de Bordetella pertussis, tal como la holotoxina pertussis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. Pertussis, de manera opcional también en combinación con perctatina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, refs. 29 & 30].
- un antígeno de la difteria, tal como el del toxoide de la difteria [por ejemplo, capítulo 3 de la Ref. 31] por ejemplo, el mutante CRM_{197} [por ejemplo Ref. 32].
- un antígeno del tétanos, tal como el del toxoide del tétanos [por ejemplo, capítulo 4 de la Ref. 31].
-un antígeno de proteína de Helicobacter pylori tal como CagA [por ejemplo, Ref. 33], VacA [por ejemplo, Ref. 33], NAP [por ejemplo, Ref. 34], HopX [por ejemplo, Ref. 35], HopY [por ejemplo, Ref 35] y 7 o ureasa.
- un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, Ref 13].
- un antígeno de Porphyramonas gingivalis [por ejemplo, Ref 36]
- antígeno(s) de la polio [por ejemplo, Refs 37, 38] tales como IPV u OPV.
- antígeno(s) de la rabia [por ejemplo, Ref. 39] tal como el virus inactivado liofilizado [por ejemplo, Ref. 40, Ravabert^{TM}].
- antígenos del sarampión, paperas y/o rubéola [por ejemplo, capítulos 9, 10 y 11 de la Ref. 31].
- antígeno(s) de la gripe [por ejemplo, capítulo 19 de la Ref. 31], tal como la hemaglutinina y/o proteínas superficiales de la neuroamidasa.
- un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, Ref 41]
- un antígeno de Streptococcus agalactiae (streptococos Grupo B) [por ejemplo, Refs. 42, 43]
- un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococos Grupo A) [por ejemplo, Refs 43, 44, 45].
- un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, Ref 46].
- Composiciones que comprendan uno o más de estos antígenos.
Cuando se usa un antígeno de sacárido o carbohidrato, es preferible conjugarlo con una proteína vehículo con el fin de mejorar la inmunogenicidad [por ejemplo, refs. 47 a 56]. Las proteínas vehículo preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tales como los toxoides de la difteria y el tétanos. Es particularmente preferido el toxoide de la difteria CRM_{197}. Otras proteínas vehículo adecuadas incluyen la proteína de la membrana externa de N. meningitidis [por ejemplo, Ref. 57], péptidos sintéticos [por ejemplo Refs. 58, 59] proteínas de shock térmico [por ejemplo Ref. 60], proteínas pertussis [por ejemplo Refs. 61, 62], proteína D de H. Influenzae [por ejemplo. Ref. 63], la toxina A o B de C. difficile [por ejemplo Ref. 64], etc. Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares de los serogrupos A y C, se prefiere que la relación (p/p) del sacárido MenA:sacárido MenC sea mayor que 1 (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor). Se pueden conjugar sacáridos de diferentes serogrupos de N. meningitidis con proteínas vehículo iguales o diferentes.
Se puede usar cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier ligante adecuado cuando sea necesario.
Se pueden detoxificar los antígenos de proteínas tóxicas cuando sea necesario (por ejemplo, detoxificación de la toxina pertussis mediante reactivos químicos y/o dispositivos [Ref. 30].
Cuando se incluye en la composición el antígeno de la difteria, se prefiere incluir también los antígenos del tétanos y de pertussis. De manera similar, cuando se incluye un antígeno del tétanos se prefiere incluir también los antígenos de la difteria y pertussis. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de pertussis se prefiere incluir también los antígenos de la difteria y el tétanos.
Es fácilmente aparente que la invención sujeto se puede usar para dosificar una amplia variedad de macromoléculas y por tanto para tratar, evitar y/o diagnosticar un gran número de enfermedades. En algunas formas de realización, las composiciones de macromoléculas/micropartículas de la presente invención se pueden usar para dosificación dirigida a emplazamientos específicos. Por ejemplo, se puede usar la administración intravenosa de las composiciones de macromoléculas/micropartículas para direccionar al pulmón, hígado, bazo, circulación sanguínea, o médula ósea.
La adsorción de macromoléculas en la superficie de las micropartículas adsorbentes (o en las emulsiones submicrométricas de la presente invención) se produce mediante cualquier mecanismo de interacción de enlace, que incluyen, pero no se limita a, enlace iónico, enlace de hidrógeno, enlace covalente, enlace covalente, enlace de Van der Waals, atrapamiento físico, y enlace mediante interacciones hidrófilas/hidrófobas. Aquellas personan normalmente expertas en la técnica pueden seleccionar fácilmente detergentes apropiados para el tipo de macromolécula que se va a
adsorber.
Por ejemplo, las micropartículas fabricadas en presencia de detergentes cargados, tales como detergentes aniónicos o catiónicos, pueden dar como resultado micropartículas con que una superficie tenga una carga negativa neta o positiva neta, y pueden adsorber una amplia variedad de moléculas. Por ejemplo, las micropartículas fabricadas con detergentes aniónicos, tales como dodecil sulfato de sodio (SDS), es decir, micropartículas SDS-PLG, adsorben antígenos cargados positivamente, tales como proteínas. De manera similar, las micropartículas fabricadas con detergentes catiónicos, tales como bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB), es decir, micropartículas CTAB-PLG, adsorben macromoléculas cargadas negativamente, tales como ADN. Cuando las macromoléculas que se van a adsorber tienen regiones de carga positiva y negativa, pueden ser apropiados detergentes catiónicos, aniónicos, no iónicos o zwitteriónicos.
Los polímeros biodegradables para fabricar micropartículas para uso en la presente invención se encuentran comercialmente disponibles de manera sencilla de, por ejemplo, Boehringer Ingelheim, Germany and Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, AL. Por ejemplo, los polímeros útiles para formar las micropartículas del presente documento incluyen homopolímeros, copolímeros y polímeros mezclados derivados de los siguientes: ácido polihidroxibutírico (también conocido como polihidroxibutirato); ácido polihidroxi valérico (también conocido como polihidroxivalerato); ácido poliglicólico (PGA) (también conocido como poliglicólido): ácido poliláctico (PLA) (también conocido como poliláctido); polidioxanona; policaprolactona; poliortoéster; y polianhídrido. Más preferidos son poli (\alpha-hidroxi ácidos), tales como poli (L-láctido), poli (D,L-láctido) (conocidos ambos como "PLA" n el presente documento), poli (hidroxibutirato), copolímeros de D,L-láctido y glicólido, tales como poli (D,L-láctido-co-glicólido) (designados como "PLG" o "PLGA" en el presente documento) o un copolímero de D,L-láctido y caprolactona. Los polímeros particularmente preferidos para uso en el presente documento son polímeros PLA y PLG. Estos polímeros se comercializan en una variedad de pesos moleculares, y una persona experta en la técnica es capaz de determinar fácilmente el peso molecular apropiado para un uso dado. De esta manera, por ejemplo, para el PLA, un peso molecular adecuado estará comprendido en el intervalo de aproximadamente 2000 a 5000. Para el PLG, los pesos moleculares adecuados oscilarán generalmente entre aproximadamente 10.000 y aproximadamente 200.000, de manera preferible de aproximadamente 15.000 a aproximadamente 150.000.
Si se usa un copolímero tal como PLG para formar las micropartículas, encontrarán uso en el presente documento una variedad de relaciones de láctido:glicólido, y la relación es claramente una materia de elección, dependiendo en parte de la molécula coadministrada y de la velocidad d degradación deseada. Por ejemplo, un polímero PLG 50:50, que contiene un 50% de D,L-láctido y un 50% de glicólido proporcionará un copolímero de resorción rápida mientras que PLG 75:25 se degrada más lentamente, y 85:15 y 90:10, incluso más lentamente, debido al aumento en el componente de láctido. Es fácilmente evidente que una relación adecuada de láctido:glicólido se determina fácilmente por una persona experta en la técnica basándose, por ejemplo, en la naturaleza del antígeno y el transtorno en cuestión. Más aún, en las formas de realización de la presente invención en las que el antígeno o los coadyuvantes están atrapados en el interior de las micropartículas, las mezclas de micropartículas con relaciones variables de láctido:glicólido encontrarán uso en el presente documento con el fin de alcanzar la cinética de dosificación deseada para una macromolécula dada y para proporcionar tanto una respuesta inmune primaria como secundaria. Puede controlarse también la velocidad de degradación de las micropartículas de la presente invención mediante dichos factores tales como el peso molecular del polímero y la cristalinidad del polímero. Los copolímeros PLG con relaciones variables de láctido:glicólido y pesos moleculares están comercialmente disponibles de manera fácil a partir de numerosas fuentes que incluyen desde Boehringer Ingelheim, Germany and Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, AL. Se pueden sintetizar también estos polímeros mediante policondensación simple del componente de ácido láctico usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como las descritas en Tabata y col., J. Biomed. Mater. Res. (1988) 22:837-858.
Cuando se usan, los polímeros preferidos de poli (D,L-láctido-co-glicólido) son aquellos que tienen una relación molar láctido/glicólido que oscila entre 30:70 y 70:30, de manera más preferible 40:60 a 60:40, y que tienen un peso molecular que oscila entre 10.000 y 100.000 daltons, de manera más preferible entre 30.000 daltons y 70.000 daltons.
Las micropartículas de polímero se preparan usando cualquiera de los diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en algunas formas de realización se pueden usar también las técnicas de emulsión doble/evaporación del solvente, tales como las que se describen en la Patente de los Estados Unidos Nº 3.523.907 y en Ogawa y col., Chem. Pharm. Bull. (1988) 36:1095-1103 para fabricar las micropartículas. Estas técnicas implican la formación de una emulsión primaria constituida por gotitas de solución de polímero, que se mezclan de manera subsiguiente con una fase acuosa continua que contiene un estabilizante de partícula/tensioactivo.
De manera alternativa, se puede usar un sistema de evaporación del solvente de agua en aceite en agua (a/o/a) para formar las micropartículas, tal como se ha descrito por O'Hagan y col., Vaccine (1993) 11:965-969, en el Documento PCT/US99/17308 (Documento WO 00/06123) de O'Hagan y col., y Jeffery y col., Pharm. Res. (1993) 10:362. En esta técnica, el polímero concreto se combina de manera típica con un solvente orgánico tal como acetato de etilo, cloruro de dimetilo (también denominado cloruro de metileno y diclorometano), acetonitrilo, acetona, cloroformo, y similares. Se proporcionará el polímero en solución de aproximadamente un 1-30%, de manera preferible en aproximadamente un 2-15%, de manera más preferible en aproximadamente un 3-10% y lo más preferible en aproximadamente un 4-6%, en un solvente orgánico. A continuación se combina la solución de polímero con una solución acuosa y se emulsifica para formar una emulsión o/w. La solución acuosa puede ser, por ejemplo, agua desionizada, solución salina normal, o una solución tamponada tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) o una solución tampón de citrato de sodio/ácido etiléndiaminotetracético (citrato de sodio/EDTA). De manera preferible, la relación en volumen de la solución de polímero a líquido acuoso oscila entre aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1, de manera más preferible aproximadamente 10:1.Se conduce la emulsificación usando cualquier equipo apropiado para esta tarea, y es típicamente u dispositivo de cizalladura elevada tal como, por ejemplo, un homogenizador.
A continuación se combina de manera preferible un volumen de emulsión de o/w con un volumen más grande de solución acuosa, que contiene de manera preferible un detergente catiónico, aniónico, o no iónico. La relación en volumen de solución acuosa de emulsión de o/a oscila de manera típica entre aproximadamente 2:1 a 10:1, de manera más típica aproximadamente 4:1. Los ejemplos de detergentes aniónicos, catiónicos y no iónicos apropiados para la práctica de la invención se relacionan con anterioridad, e incluyen SDS, CTAB y PBA, de manera respectiva. Algunas macromoléculas pueden adsorberse más fácilmente en micropartículas que tienen una combinación de estabilizantes y/o detergentes, por ejemplo, una combinación de PVA y DOTAP. Más aún, en algunos casos puede ser deseable añadir detergente a la anterior solución orgánica. Cuando se usa un detergente no iónico tal como PVA como estabilizante de la emulsión, se proporciona normalmente en una solución de aproximadamente un 2-15%, de manera más típica en una solución de aproximadamente un 4-10%. Cuando se usa un detergente catiónico o aniónico, se proporciona normalmente en una solución de aproximadamente un 0,05-5%, de manera más típica en una solución de aproximadamente un 0,25-1%. Generalmente se usará una relación ponderal de detergente a polímero en el intervalo de entre 0,00001:1 y aproximadamente 0,5:1, de manera más preferible entre aproximadamente 0,0001:1 y aproximadamente 0,5:1, de manera más preferible entre aproximadamente 0,001:1 y aproximadamente 0,5:1, e incluso de manera más preferible entre aproximadamente 0,005:1 y aproximadamente 0,5:1.
A continuación la mezcla se homogeneiza para producir una emulsión doble w/o/w. A continuación se evaporan los solventes orgánicos. Se pueden manipular los parámetros de formulación para permitir la preparación de micropartículas pequeñas en el orden de 0,05 \mum (50 nm) a micropartículas más grandes de 50 \mum o incluso mayores. Véase, por ejemplo, Jeffery y col., Pharm. Res (1993) 10:362-368; McGee y col., J. Microencap. (1996). La agitación reducida, por ejemplo, da como resultado micropartículas más grandes, así como un aumento en el volumen de la fase interna. Se producen partículas pequeñas mediante volúmenes en fase acuosa bajos con concentraciones altas de estabilizantes de la emulsión.
Se puede encontrar información adicional en la Solicitud de los Estados Unidos con Nº de Serie ______, N^{os} de Expediente del Apoderado PP16502.002, titulados "Micropartículas con Macromoléculas adsorbidas" presentada el 28 de septiembre de 2001.
Se pueden manipular los parámetros de formulación para permitir la preparación de micropartículas pequeñas del orden de 0,05 \mum (50 nm) a micropartículas más grandes de 50 \mum o incluso mayores. Véase por ejemplo, Jeffery y col., Pharm. Res (1993) 10:362-368; McGee y col., J. Microencap. (1996). La agitación reducida, por ejemplo, da como resultado partículas más grandes, así como un aumento en el volumen de la fase interna. Se producen partículas pequeñas mediante volúmenes en fase acuosa bajos con concentraciones altas de estabilizantes de la emulsión.
Se pueden formar también micropartículas usando el secado por rociado y la coacervación, tal como se ha descrito en, por ejemplo, Thomasin y col., J. Controlled Release (1996) 41:131; en la Patente de los Estados Unidos Nº 2.800.457; en Masters, K. (1976) Spray Drying 2ª Ed, Wiley, Nueva York; técnicas de recubrimiento por suspensión en aire, tales como el recubrimiento de cubas de alimentación y recubrimiento Wurster, tal como se ha descrito por Hall y col, (1980) El "Procedimiento Wurster" en Controlled Release Technologies: Methods, Theory, and Applications (A. F. Kydonieus, ed.), Vol 2, pp. 133-154 CRC Press, Boca Ratón, Florida y en Deasy, P. B., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sist. (1988) S(2):99-139; y gelación iónica, tal como se ha descrito por, por ejemplo, Lim y col., Science (1980) 210:908-910.
Se puede determinar el tamaño de partícula mediante, por ejemplo, dispersión de luz láser, usando por ejemplo, un espectómetro que incorpora un láser de helio-neón. Generalmente el tamaño de partícula se determina a temperatura ambiente e implica un análisis múltiple de la muestra en cuestión (por ejemplo, 5-10 veces) para dar como resultado un valor promedio para el diámetro de partícula. Se determina también fácilmente el tamaño de partícula usando microscopía por barrido de electrones (SEM).
Las formas de realización alternativas de la presente invención utilizan preparaciones de micropartículas que comprenden una emulsión submicrométrica, que incluye de manera preferible un tensioactivo iónico. Se pueden usar por ejemplo MF59 u otros como base de la emulsión submicrométrica que contiene aceite, mientras que los tensioactivos iónicos pueden incluir, pero no limitarse a, dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DEPC) y ácido dioleoil fosfatídico (DPA), cada uno de los cuales es soluble en escualeno. Se pueden formular emulsiones iónicas prototípicas disolviendo cada uno de los detergentes en escualeno/10% de Span 85 a concentraciones que oscilan entre 4-52 mg/ml de escualeno. Se pueden emulsificar las mezclas de escualeno/tensioactivo con Tween80/H_{2}O al 0,5% en 5 ml de escualeno/100 ml de H_{2}O. Se puede formar una preemulsión mediante homogeneización con un homogeneizador Silverson (5 minutos, 5000 rpm) y se pueden fabricar las emulsiones finales mediante microfluidización (\sim 10.000 psi (6,89 x 10^{7} N/m^{2}), 5 pases, Microfluidizador 110 S). La descripción adicional que concierne a las emulsiones submicrométricas se puede encontrar más abajo.
Tras la preparación, se pueden almacenar las micropartículas tal como están o por criocongelación para uso futuro. Típicamente, con el fin de adsorber macromoléculas en las micropartículas, la preparación de micropartículas se mezcla sencillamente con la macromolécula de interés, y la formulación resultante puede liofilizarse de nuevo antes del uso. Generalmente, se añaden las macromoléculas a las micropartículas para dar como resultado micropartículas con macromoléculas adsorbidas que tienen una relación ponderal comprendida entre aproximadamente 0,0001:1 a 0,25:1 macromoléculas a micropartículas, de manera preferible, 0,001:1 a 0,1, de manera más preferible 0,01 a 0,05. Se puede determinar el contenido de macromoléculas de las micropartículas usando técnicas convencionales.
Tal como se ha señalado anteriormente, las macromoléculas para uso en conexión con la presente invención incluyen proteínas, de manera preferible moléculas de antígeno, y ácidos nucleicos, de manera preferible constructos de vector capaces de expresar una secuencia de ácido nucleico, tal como constructos de vectores basados en CMV, vectores ELVIS o el vector de ARN.
Las micropartículas de polímero de la presente invención pueden tener macromoléculas atrapadas o encapsuladas en su interior, así como tener macromoléculas adsorbidas sobre la superficie de las anteriores. De esta manera, por ejemplo, una persona experta en la técnica puede preparar micropartículas de acuerdo con la invención que tengan coadyuvantes encapsulados con el vector ELVIS absorbido sobre la superficie de las anteriores, o micropartículas que tengan el antígeno encapsulado con el constructo del vector de ARN adsorbido sobre la superficie de las anteriores. La invención contempla una variedad de combinaciones de macromoléculas de ácido nucleico adsorbidas sobre y atrapadas en el interior de las micropartículas, junto con otros ácidos nucleicos así como otras moléculas antigénicas. En algunas formas de realización preferidas, las micropartículas de la invención tienen constructos de vectores ELVIS o el vector de ARN adsorbidos sobre la superficie de las anteriores.
De manera adicional, cualquiera de las formas de realización de las micropartículas de la invención puede dosificarse en conjunción con la electroporación.
Una vez se producen las micropartículas con macromoléculas adsorbidas y/o las micropartículas de la emulsión submicrométrica, se pueden formular, junto con cualquier coadyuvante deseado, en composiciones farmacéuticas entre las que se incluyen vacunas, para tratar, prevenir y/o diagnosticar una amplia variedad de transtornos, tal como se ha descrito anteriormente. Las composiciones incluirán de manera general uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, se pueden usar vehículos tales como agua, solución salina, glicerol, polietilén glicol, ácido hialurónico, etanol, etc. Pueden estar presentes en dichos vehículos otros excipientes tales como agentes humectante o emulsificantes, sustancias biológicas tamponantes, y similares, Un tampón biológico puede ser virtualmente cualquier solución que sea farmacológicamente aceptable y que proporcione la formulación con el pH deseado, es decir, un pH en el intervalo fisiológico. Entre los ejemplos de soluciones tampón se incluyen solución salina, solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con Tris, solución salina tamponada de Hank, y similares. Se pueden introducir otros excipientes conocidos en la técnica en la forma de dosificación final que incluyen ligantes, desintegrantes, rellenos (diluyentes), lubricantes, deslizantes (mejoradores del flujo), coadyuvantes de la compresión, colores, endulzantes, conservantes, agentes suspensores/dispersantes, formadores de película/recubrimientos, aromas y tintas de impresión.
Las composiciones de la invención comprenderán una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más macromoléculas de interés. Esto es, se incluirá una cantidad de macromolécula/micropartícula en las composiciones, que conseguirán que el sujeto produzca una respuesta suficiente, con el fin de evitar, reducir, eliminar o diagnosticar los síntomas. La cantidad exacta necesaria variará dependiendo del sujeto que está siendo tratado; la edad y el estado general del sujeto que está siendo tratado, la gravedad de la dolencia que está siendo tratada; en el caso de una respuesta inmunológica, la capacidad del sistema inmune del sujeto para sintetizar anticuerpos; el grado de protección deseada y el antígeno particular seleccionado y su modo de administración, entre otros factores. Puede determinarse fácilmente una cantidad efectiva apropiada por una persona experta en la técnica. De esta manera, una cantidad terapéuticamente efectiva estará comprendida en un intervalo relativamente amplio, que se puede determinar mediante ensayos rutinarios. Por ejemplo, a efectos de la presente invención, cuando la macromolécula es un polinucleótido, una dosis efectiva oscilará típicamente entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 10 mg, de manera más preferible entre aproximadamente 10 ng y aproximadamente 1 mg, y lo más preferible aproximadamente 100 \mug a aproximadamente 1 mg de la macromolécula dosificada por dosis; cuando la macromolécula es un antígeno, una dosis efectiva oscilará de manera típica entre aproximadamente 1 \mug y aproximadamente 100 mg, de manera más preferible entre aproximadamente 10 \mug y aproximadamente 1 mg, y lo más preferible aproximadamente 50 \mug y aproximadamente 1 mg de la macromolécula dosificada por dosis.
Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar por vía parenteral, por ejemplo mediante inyección. Las composiciones se pueden inyectar por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular. Otros modos de administración incluyen la administración nasal, mucosal, rectal, vaginal, oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdermal o transcutánea. El tratamiento de dosificación puede ser una dosis única programada o una dosis múltiple programada. Una dosis múltiple programada es aquella en la que un curso primario de administración puede estar formado con 1-10 dosis separadas, seguido por otras dosis suministradas en intervalos de tiempo posteriores, escogidas para mantener y/o reforzar la respuesta terapéutica, por ejemplo en 1-4 meses para una segunda dosis, y si se necesita, una(s) dosis posterior(es) después de varios meses.
En algunas formas de realización de la invención, una serie de una o más inyecciones de un constructo de vector (que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica un antígeno) es seguida por una serie de una o más inyecciones de antígeno (también denominados en el presente documento como "aceleradores"). Como ejemplo específico, el constructo del vector se puede administrar en tres inyecciones: (a) en el momento de la administración inicial, (b) en un período de tiempo que oscila entre 1-8 semanas desde la administración inicial, y (c) en un período de tiempo que oscila entre 4-32 semanas desde la administración inicial, mientras que el antígeno se puede administrar en dos inyecciones: (a) en un período de tiempo que oscila entre 8.50 semanas desde la administración inicial y (b) en un período de tiempo que oscila entre 8-100 semanas desde la administración inicial.
El régimen de dosificación se determinará, al menos en parte, por la necesidad del sujeto, y será dependiente del juicio del médico a cargo del paciente.
Además, si se desea la prevención de la enfermedad, las micropartículas con los constructos de vector adsorbidos se administran de manera general antes de la infección primaria con el patógeno de interés. Si se desea el tratamiento de la enfermedad (diferente que la prevención), por ejemplo, la reducción de síntomas o recurrencias, las micropartículas con constructos de vector adsorbidos se administran de manera general subsiguientemente a la infección primaria.
2. Emulsiones de gotitas de aceite
En otras formas de realización de la presente invención, se prepara una emulsión de gotitas de aceite (de manera particular, una emulsión submicrométrica) que comprende un aceite metabolizable y un agente emulsificante. Se pueden combinar moléculas tales como un oligonucleótido que comprendan al menos un motivo CpG con la emulsión de gotitas de aceite para formar un coadyuvante.
La emulsión de gotitas de aceite comprende de manera preferible un aceite metabolizable y un agente emulsificante, en el que el aceite y el agente emulsificante están presentes en forma de una emulsión de aceite en agua, que tiene sustancialmente todas las gotitas de aceite con un diámetro inferior a un micrómetro. Las emulsiones submicrométricas, con gotitas en este intervalo de tamaño preferido, muestran una superioridad sorprendente sobre otras emulsiones que contienen aceite y agentes emulsificantes en las que las gotitas de aceite son significativamente más grande que las que proporciona la presente invención. En las formas de realización preferidas, la emulsión está cargada positivamente como resultado del uso de un detergente catiónico como agente emulsificante o, de manera alternativa, contiene un detergente catiónico de manera adicional al agente emulsificante. Esto permite la adsorción de moléculas antigénicas de nucleótido, tales como oligonucleótidos CpG o constructos de vector. De manera alternativa, el uso de un detergente aniónico permite la adsorción de moléculas tales como proteínas.
Aunque se conocen de manera general los componentes individuales de las composiciones de emulsiones submicrométricas de la presente invención, dichas composiciones no se han combinado de la misma manera. De acuerdo con esto, son bien conocidos en la técnica los componentes individuales, aunque se describen a continuación tanto de manera general como con algún detalle para las formas de realización preferidas, y los términos usados en el presente documento, tales como aceite metabolizable, agente emulsificante, agente inmunoestimulante, péptido de muramilo, y péptido de muramilo lipófilo, son suficientemente bien conocidos para que describan estos compuestos, sin descripción adicional, a una persona experta en la técnica.
Un componente de estas composiciones es un aceite no tóxico, metabolizable, de manera preferible uno de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono que incluya, pero no se limite a, alcanos, alquenos, alquinos y sus ácidos y alcoholes correspondientes, los éteres y ésteres de los mismos, y las mezclas de los mismos. El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o aceite preparado de manera sintética que se pueda metabolizar en el cuerpo del animal huésped al cual se administrará el coadyuvante, y que no sea tóxico para el sujeto. El animal huésped es de manera típica un mamífero, y de manera preferible un ser humano. El aceite mineral y los aceites tóxicos destilados de petróleo similares están expresamente excluidos de esta invención.
El componente oleoso de esta invención puede ser también cualquier alcano, alqueno o alquino de cadena larga, o un ácido o alcohol derivado de los mismos como ácido libre, su sal o un éster tal como un mono-, o di- o triéster, tal como los triglicéridos y ésteres de 1,2-propanodiol o poli-hidroxi alcoholes similares. Los alcoholes se pueden acilar empleando ácido amino- o polifuncional, por ejemplo ácido acético, ácido propanoico, ácido cítrico o similares. Se pueden usar también éteres derivados de alcoholes de cadena larga que son aceite y satisfacen los diferentes criterios que se muestran en el presente documento.
La fracción alcano, alqueno o alquino individual y sus derivados ácido o alcohol tendrán generalmente de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono. La fracción puede tener una estructura de cadena lineal o ramificada. Puede estar completamente saturada o tener uno o más dobles o triples enlaces. Cuando se emplean aceites basados en mono o poli éster- o éter-, la limitación de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 carbonos se aplica al ácido graso individual o a las fracciones de alcohol graso, no a la cantidad total de carbono.
Se puede usar en el presente documento cualquier aceite metabolizable, de manera particular procedente de una fuente animal, de pescado o vegetal. Es esencial que el aceite sea metabolizado por el huésped al cual se administra, de otra manera, el componente de aceite podría producir abscesos, granulomas o incluso carcinomas, o (cuando se usa en la práctica veterinaria) puede hacer la carne de las aves y animales vacunados inaceptable para el consumo humano debido al efecto perjudicial que el aceite sin metabolizar pueda tener sobre el consumidor.
Para una descripción detallada de dichas emulsiones submicrométricas, véanse la Publicación Internacional Nº WO 90/14837 y la Solicitud de Patente Internacional de propiedad compartida PCT/US00/03331.
El componente oleoso de estos coadyuvantes y composiciones inmunógenas estará presente en una cantidad comprendida entre aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 20% en volumen, pero de manera preferible no más de aproximadamente un 15%, de manera especial en una cantidad de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 12%, Se prefiere más usar entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 4% de aceite.
La porción acuosa de estas composiciones de emulsión submicrométrica es de manera preferible solución salina tamponada o, de manera más preferible, con agua sin adulterar. Debido a que estas composiciones se proyectan para administración parenteral, es preferible fabricar soluciones finales tamponadas para uso como composiciones inmunógenas, de tal manera que la tonicidad, es decir, la osmolalidad, sea esencialmente la misma que la de los fluidos fisiológicos normales con el fin de evitar el hinchado posterior a la administración o la absorción rápida de la composición debido a las concentraciones diferenciales de iones entre la composición y los fluidos fisiológicos. Es preferible también tamponar la solución salina con el fin de mantener compatible el pH con las condiciones fisiológicas normales. También, en algunos ejemplos, puede ser necesario mantener el pH en un nivel concreto con el fin de asegurar la estabilidad de algunos componentes de la composición tales como los glicopéptidos.
Se puede usar en el presente documento cualquier tampón fisiológicamente aceptable, pero se prefieren los tampones fosfato. Se pueden usar otros tampones aceptables tales como acetato, tris, bicarbonato, carbonato, o similares como sustitutos para los tampones fosfato. El pH del componente acuoso será de manera preferible de entre aproximadamente 8,0-8,0.
Cuando se prepara inicialmente la emulsión submicrométrica, sin embargo, se prefiere agua sin adulterar como componente acuoso de la emulsión. Aumentar la concentración de sal hace más difícil conseguir el tamaño de gotita pequeña deseado. Cuando las composiciones inmunógenas finales se preparan a partir del coadyuvante, se puede añadir el material antigénico en un tampón con una osmolalidad apropiada para proporcionar la composición inmunógena deseada.
La cantidad de componente acuoso empleado en estas composiciones será la cantidad necesaria para llevar el valor de la composición a la unidad. Esto es, una cantidad de componente acuoso suficiente para fabricar el 100% que se va a mezclar, con los otros componentes relacionados anteriormente, con el fin de llevar las composiciones al volumen.
En la ciencia farmacéutica se usa un número sustancial de agentes emulsificantes y suspensores. Entre estos se incluyen materiales producidos de forma natural tales como gomas de árboles, proteínas vegetales, polímeros basados en azúcar tales como alginatos y celulosa, y similares. Algunos oxipolímeros o polímeros que tienen un hidróxido u otro sustituyente hidrófilo en el esqueleto de carbono tienen actividad tensioactiva, por ejemplo, povidona, alcohol polivinílico, y glicol éter basado en compuestos mono- y poli-funcionales. Los compuestos derivados de ácidos grasos de cadena larga forman un tercer grupo sustancial de agentes emulsificantes y suspensores que podrían usarse en esta invención. Cualquiera de los tensioactivos anteriores es útil siempre que no sea tóxico.
Los ejemplos específicos de agentes emulsificantes adecuados (también denominados como tensioactivos o detergentes) que se pueden usar de acuerdo con la presente invención se describen en la Solicitud de Patente Internacional de propiedad compartida PCT/US00/0331. Los tensioactivos se dividen de manera general en cuatro tipos básicos: aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos, y no iónicos. Los ejemplos de detergentes aniónicos incluyen, pero no se limitan a, ácido algínico, ácido caprílico, ácido cólico, ácido 1-decanosulfónico, ácido desoxicólico, ácido 1-dodecanosulfónico, N-lauroilsarcosina, y ácido taurocólico, y similares. Los detergentes catiónicos incluyen, pero no se limitan a, cetrimida (bromuro de hexadeciltrimetilamonio, o CTAB), cloruro de benzalconio, bromuro de dimetil dioctodecil amonio (DDA), DOTAP, bromuro de dodeciltrimetilamonio, cloruro de bencildimetilhexadecil amonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de metilbencetonio, y 4-picolín dodecil sulfato, y similares. Los ejemplos de detergentes zwitteriónicos incluyen, pero no se limitan a, 3-[(3.-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propanosulfonato (comúnmente abreviado CHAPS), 3-[(colamidopropil)-dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato (generalmente abreviado CHAPSO) N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato, y liso-\alpha-fosfatidilcolina, y similares. Los ejemplos de detergentes no iónicos incluyen, pero no se limitan a, decanoil-N-metilglucamida, dietilén glicol monopentil éter, n-dodecil \beta-D-glucopiranósido, condensados de óxido de etileno de alcoholes grasos (por ejemplo, comercializados bajo el nombre comercial Lubrol) polioxietilén éteres de ácidos grasos (de manera particular ácidos grasos C_{12}-C_{20}), éteres de ácido graso de polioxietilén sorbitán (por ejemplo, comercializados bajo el nombre comercial Tween) y éteres de ácido graso de sorbitán (por ejemplo, comercializados bajo el nombre comercial de Span) y similares.
Un grupo particularmente útil de tensioactivos son los tensioactivos no iónicos basados en sorbitán, tales como los SPAN® o ARLACEL® comercialmente disponibles, usualmente con una designación de letra o número que los distingue entre los diversos sorbitanes mono-, di-, y triéster sustituidos. Un grupo relacionado de tensioactivos comprende monoésteres de polioxietilén sorbitán y triésteres de polioxietilén sorbitán, comercialmente disponibles bajo la marca TWEEN®. Los tensioactivos TWEEN® se pueden combinar con tensioactivos de monoéster o triéster de sorbitán relacionados para promover la estabilidad de la emulsión.
Se puede variar el tamaño de las gotitas de aceite cambiando la relación de detergente a aceite (aumentando la relación disminuye el tamaño de la gotita, presión de operación (aumentando la presión de operación se reduce el tamaño de la gotita), la temperatura (aumentando la temperatura disminuye el tamaño de la gotita). El tamaño real de la gotita variará con el detergente concreto, el aceite, y el agente inmunoestimulante (si hay alguno), y con las condiciones de operación concretas elegidas. Se puede verificar el tamaño de la gotita mediante el uso de instrumentos de dimensionamiento, tales como el Sub-Micron Particle Analyzer (Modelo N4MD) comercial fabricado por la Coulter Corporation, y se pueden variar los parámetros usando las directrices que se muestran anteriormente hasta que sustancialmente todas las gotitas sean menores de 1 micrómetro de diámetro. Por sustancialmente todas se entiende al menos aproximadamente un 80% (en número), de manera preferible al menos aproximadamente un 90%, de manera más preferible al menos aproximadamente un 95%, y lo más preferible al menos aproximadamente un 98%. La distribución del tamaño de partícula es típicamente Gaussiana, de tal manera que el diámetro sea más pequeño que los límites establecidos.
Una emulsión preferida de gotitas de aceite es la MF59. Se puede fabricar la MF59 de acuerdo con los procedimientos descritos en, por ejemplo, Ott y col., Vaccine Design: The Subunit And Adjuvant Approach, 1995, M. F. Powell y M. J. Newman, Eds., Plenum Press, Nueva York, p. 277-296; Singh y col., Vaccine, 1998, 16, 1822-1827; Ott y col., Vaccine, 1995, 13, 1557-1562; y Valensi y col., J. Immunol., 1994, 153, 4029-39, las descripciones de los cuales se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad.
Otras emulsiones de gotitas de aceite incluyen, por ejemplo, SAF, que contiene un 10% de escualeno, un 0,5% de Tween 80, un 5% de polímero plurónico bloqueado L121, y thr-MDP microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometido a vortización para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande, y el sistema del coadyuvante Ribi® (RAS, (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene un 2% de escualeno, un 0,2% de Tween 80, y uno o más componentes de la pared celular bacteriana entre el grupo constituido por monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TMD), y el esqueleto de la pared celular (CWS), de manera preferible MPL + CWS (DetoxJ) (para una descripción adicional de las emulsiones de aceite en agua submicrométricas adecuadas para uso en el presente documento, véase la Solicitud de Patente del solicitante Nº 09/015.736, presentada el 29 de Enero de 1998).
Después de preparar las micropartículas de la invención, dependiendo del tipo de polímero o del tipo de emulsión submicrométrica, las macromoléculas tales como polipéptidos y los constructos del vector pueden absorberse sobre las anteriores tal como se ha descrito más arriba. Las micropartículas de la emulsión submicrométrica de la presente invención pueden tener también macromoléculas atrapadas o encapsuladas en el interior de ellas, así como tener macromoléculas adsorbidas sobre la anterior. De esta manera, por ejemplo, una persona experta en la técnica puede preparar micropartículas de acuerdo con la invención que tengan coadyuvantes encapsulados con el vector ELVIS adsorbido sobre la superficie de las anteriores, o micropartículas que tengan el antígeno encapsulado con el constructo del vector de ARN absorbido sobre la superficie de las anteriores. La invención contempla una variedad de combinaciones de macromoléculas de ácido nucleico adsorbidas en y atrapadas en el interior de las micropartículas, junto con otros ácidos nucleicos así como otras moléculas antigénicas. De manera preferible, las micropartículas de la invención tienen constructos de vectores ELVIS o el vector de ARN adsorbidos sobre el anterior. De manera adicional, se puede dosificar cualquiera de las formas de realización de las micropartículas de la invención en conjunción con la electroporación.
3. Vectores ELVIS
Los vectores ELVIS son Sistemas de Iniciación del Vector en Capas Eucariotas, que se describen de manera general en las Patentes de los Estados Unidos 5.814,482 y 6,015.686, citadas anteriormente, así como en las Solicitudes de Patente Internacional WO 97/38087 y WO 99/18226. En una forma de realización, un vector ELVIS se deriva del genoma de un alfavirus, de manera más preferible del virus Sindbis (SIN), virus Semliki Forest (SFV), virus de la encefalitis equina de Venezuela (VEE), o virus Ross River (RRV). El alfavirus es un virus de ARN de aproximadamente 11-12 kb de longitud, que contiene un enromado en 5' y una cola de poliadenilato en 3'. El virus infeccioso maduro se compone de un ARN genómico envuelto por la nucleocápsida y las proteínas de la envuelta. La infección por alfavirus de las células huésped se produce mediante un episodio específico del receptor, y culmina con la liberación del ARN genómico en el citoplasma. Durante la replicación vírica se sintetizan las glicoproteínas E1 y E2 de la envuelta, que codifican el virus y se embeben en la membrana de la célula huésped, a través de la cual brota la progenie de viriones y se libera hacia el exterior de la célula huésped.
La replicación del genoma vírico comienza con la cadena de ARN genómico sirviendo como molde para la síntesis de una cadena complementaria de ARN negativo. La cadena de ARN sirve a continuación como molde del ARN genómico de longitud completa, y para un ARN subgenómico de cadena positiva iniciado internamente. Las proteínas no estructurales se traducen desde la cadena subgenómica. Todos los genes víricos se expresan primero como poliproteínas, después se procesan tras la traducción en forma de proteínas individuales mediante rotura proteolítica.
Se puede construir un replicón del vector del alfavirus sustituyendo algunas porciones del genoma vírico (por ejemplo, los genes de las proteínas estructurales) con una secuencia del ácido nucleico heterólogo seleccionado. De esta manera, en algunas formas de realización, un vector del replicón del alfavirus puede comprender una secuencia 5' capaz de iniciar la transcripción de un alfavirus, una secuencia de nucleótido que codifica las proteínas no estructurales del alfavirus, un promotor de la región de unión alfavírica, un emplazamiento de reconocimiento de la ARN polimerasa del alfavirus y una extensión de poliadenilato 3'. De manera adicional, el replicón del vector del alfavirus puede contenerse en forma de una copia de ADNc en el interior de un constructo del vector del alfavirus. Dichos constructos de vector comprenden de manera típica un promotor 5' capaz de iniciar la síntesis del ARN a partir del ADNc situado corriente arriba y asociado de manera operativa con el ADNc del vector, de tal manera que la transcripción produce el ARN del vector replicón. El vector constructo puede contener también una secuencia 3' que controla la terminación de la transcripción. Una secuencia heteróloga de ácido nucleico puede estar presente corriente arriba o corriente abajo de la región de unión vírica.
El vector ELVIS dirige el mecanismo de replicación del virus de ARN para conseguir la dosificación de una secuencia heteróloga de nucleótidos de interés usando una teoría de doble capa (basada por ejemplo en el vector constructo del alfavirus descrito anteriormente. De manera general, un vector ELVIS proporciona un sistema de expresión en capas capaz de amplificar la cantidad de ARN que codifica el producto de gen de interés debido a que la primera capa inicia la transcripción de una segunda capa. De esta manera, un vector ELVIS típico comprende un promotor 5' capaz de iniciar la síntesis del ARN a partir de ADNc, un complemento del ADNc de un constructo capaz de la replicación autónoma en una célula, y cuyo constructo es también capaz de expresar una secuencia heteróloga de ácido nucleico, y una secuencia 3’ que controla la terminación de la transcripción. El constructo capaz de la replicación y expresión autónoma de la secuencia de ácido nucleico seleccionado puede ser un constructo del vector del alfavirus. De esta manera, la primera capa del vector ELVIS de ADN transcribe el constructo del vector del alfavirus de ARN, mediante la que se consigue la expresión de la secuencia heteróloga del ácido nucleico.
Se puede construir un vector ELVIS basado en un alfavirus preparando en primer lugar un ADNc complementario en un genoma de alfavirus. A continuación se elimina el ADNc que corresponde al ARN genómico de las secuencias que codifican una o más proteínas estructurales víricas que se pueden sustituir a continuación con el ADN heterólogo que codifica el producto de gen de interés, evitando por tanto el empaquetado del virus maduro y permitiendo la amplificación de la secuencia heteróloga. El ADNc modificado que contiene la secuencia heteróloga se inserta a continuación en el interior de la primera capa del vector ELVIS. Tras la entrada en las células y el núcleo, se transcribirá el vector ELVIS y las moléculas de ARNm resultantes, que son vectores de ARN capaces de la auto replicación, comenzará a replicarse y a traducir polipéptidos, incluyendo el gen heterólogo de interés.
Mientras que se prefieren constructos del vector de alfavirus derivados del virus Sindbis, se pueden usar fácilmente otras especies de alfavirus de acuerdo con las enseñanzas proporcionadas en el presente documento. De manera alternativa, se pueden utilizar vectores derivados de cualquier virus de ARN, de manera particular aquellos de virus de cadenas positivas.
En las Patentes de los Estados Unidos 5.814.482 y 6.015.686 se describe, en general, la construcción de un vector ELVIS. De manera breve, se obtiene el ARN a partir de un virus de ARN, a continuación se sintetiza el ADNc mediante amplificación PCR usando cebadores apropiados para genes o porciones particulares del virus de ARN, cuyos cebadores pueden contener también de manera adicional tantos emplazamientos de restricción como sea necesario. A continuación se clonan los fragmentos de ADNc en un plásmido y se transforman en un huésped apropiado tal como E. coli. Se hacen crecer colonias positivas para la purificación del plásmido, y a continuación los plásmidos se ensamblan en el vector ELVIS deseado con una porción que tiene el ADN heterólogo tal como un gen indicador (por ejemplo, GPF) o un gen deseado que codifica para un antígeno. El Ejemplo 3 describe a continuación un vector ELVIS preferido particular (pSINCP) usado de acuerdo con la presente invención.
4. Vectores constructo de ARN y pCMV
En otras formas de realización de la presente invención, se usa directamente un vector constructo de ARN o un vector replicón de ARN, sin la necesidad de introducir el ADN en el interior de una célula y transportarlo hasta el núcleo donde tendría lugar la transcripción. Usando el vector de ARN para la dosificación directa en el citoplasma de la célula huésped, se produce de manera eficiente la replicación y la traducción autónoma de la secuencia heteróloga de ácido nucleico. En esta forma de realización, el vector constructo de ARN o el vector replicón de ARN se obtienen mediante transcripción in vitro de un vector constructo basado en ADN. De manera preferible, el vector constructo de ARN o el vector replicón de ARN se deriva del genoma de un alfavirus, de manera más preferible de un virus Sindbis (SIN), virus Semliki Forest (SFV), virus de la encefalitis equina de Venezuela, o virus Ross River (RRV). En otras formas de realización, el vector constructo de ARN se deriva de un virus distinto de un alfavirus. De manera preferible, dichos virus distintos usados para la derivación de los vectores constructo de ARN son virus de ADN de cadena positiva, y de manera más preferible son picornavirus, flavivirus, rubivirus, o coronavirus. Se proporcionan con más detalle en otra parte las composiciones y procedimientos para la transcripción in vitro de vectores de ARN basados en alfavirus (véanse la Patente de los Estados Unidos 5.842.723, y Polo y col., 1999, PNAS 96:4598-603). El vector de ARN se adsorbe a continuación en una micropartícula de la invención para dosificación tal como se detalla en el presente documento. Aunque se prefiere un vector de ARN de alfavirus típico procedente de SIN, SFV, VEE o RRV, se pueden sustituir fácilmente vectores similares derivados de otras especies de alfavirus.
En otras formas de realización de la presente invención, se usan vectores constructo de pCMV, tales vectores constructo son bien conocidos en la técnica. Un vector de pCMV particularmente preferido contiene el mejorador/promotor inmediatamente temprano de CMV y un terminador de la hormona de crecimiento bovino. Este se describe en detalle en Chapman, B. S. y col. 1991 "Effect of intron A from human cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells". Nucleic Acids Res. 19:3979-86.
5. Coadyuvantes
Se pueden usar de manera opcional coadyuvantes para mejorar la eficacia de las composiciones farmacéuticas, siendo particularmente preferidos los coadyuvantes estimulantes Th1. Se pueden administrar los coadyuvantes de manera concurrente con las micropartículas de la presente invención, por ejemplo, en la misma composición o en composiciones separadas. De manera alternativa, se puede administrar un coadyuvante antes o de manera posterior a las composiciones de micropartículas de la presente invención. En otra forma de realización, el coadyuvante, tal como un coadyuvante inmunológico, se puede encapsular en la micropartícula. Los coadyuvantes, como cualquier otra macromolécula, se pueden encapsular en el interior de las micropartículas usando cualquiera de los diversos procedimientos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 3.523.907; Ogawa y col, Chem. Pharm. Bull (1988) 36:1095-1103; O'Hagan y col., Vaccine (1993) 11:965-969 y Jefferey y col., Pharm Res. (1993) 10:362. De manera alternativa, se pueden absorber los coadyuvantes sobre la micropartícula tal como se ha descrito anteriormente para cualquier macromolécula. De manera alternativa los coadyuvantes pueden comprender la emulsión de gotitas de aceite de la presente invención.
Entre los coadyuvantes inmunológicos se incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) otras formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo (véase a continuación) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como por ejemplo (a) MF59 (Publicación Internacional Nº WO 90/14837; Capítulo 10 en Vaccine design; the subunit an adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), que contiene un 5% de escualeno, un 0,4% de Tween 80, y un 0,5% de Span 85 (que contiene de manera opcional diversas cantidades de MTP-PE (véase a continuación), aunque no se necesitan) formulado en forma de partículas submicrométricas mediante un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene un 10% de escaleno, un 0,4% de Tween 80, un 5% de polímero L121 bloqueado con plurónico, y thr-MDP (véase a continuación) microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometido a vortización para generar una emulsión con tamaño de partícula más grande, y (c) el sistema coadyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene un 2% de escualeno, un 0,2% de Tween 80, y uno o más componente de la pared celular bacteriana entre el grupo constituido por monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y el esqueleto de la pared celular (CWS), de manera preferible MPL + CWS (Detox^{TM}) (para una descripción adicional de las emulsiones de aceite en agua submicrométricas adecuadas para uso en el presente documento, véase la Solicitud de Patente de propiedad compartida Nº 09/015.736, publicada el 29 de Junio de 1998); (3) se pueden usar coadyuvantes de la saponina, tales como Quil A, o QS21 (por ejemplo, Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir de ellos tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes), cuyo ICOM pude estar desprovisto de un detergente adicional, por ejemplo, Documento WO 00/07621; (4) Coadyuvante de Freunds Completo (CFA) y Coadyuvante de Freunds Incompleto (IFA); (5) citoquinas tales como interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (Documento WO 99/44636), etc.), interferones (por ejemplo gamma interferón), factor estimulante de la colonia de macrófgagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc; (6) monofosforil lípido A (MPL) o MPL 3-O-deacilado (3dMPL), por ejemplo Documento GB-2220221, EP-A-0689454, de manera opcional en ausencia sustancial de alum cuando se usa con sacáridos pneumocócicos, por ejemplo Documento WO 00/56358; (7) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y o emulsiones de aceite en agua, por ejemplo, Documentos EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231; (8) oligonucleótidos que comprenden motivos CpG (Roman y col., Nat. Med., 1997, 3, 849-854; Weiner y col., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis y col., J. Immunol, 1988, 160, 870-876; Chu y col., J. Exp. Med, 1997, 186, 1623-1631; Lipford y col., Eur. J. Immunol. 1997, 27, 2349-2344; Moldoveanu y col, Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg y col., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman y col., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883: Ballas y col., J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845; Cowdery y col., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575; Halpern y col., Cell Immunol., 1996, 167, 72-78; Yamamoto y col., Jpn J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey y col., J. Immunol, 1996, 157, 2116-2122; Messina y col., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764; Yi y col, J. Immunol., 1996, 157, 4918-4925; Yi y col., J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761; y Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906; Solicitudes de Patente Internacional WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/40100, WO 98/55495, WO 98/37919 y WO 98/52581) es decir, que contienen al menos un dinucleótido CG, usándose de manera opcional 5-metilcitosina en lugar de citosina; (9) un éter polioxietilenado o un éster polioxietilenado, por ejemplo, Documento WO 99/52549; (10) un tensioactivo éster de polioxietilén sorbitán en combinación con un octoxinol (Documento WO 01/21207) o un tensioactivo de éster o éter de polioxietilén alquilo en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol (Documento WO 01/21152); (11) una saponina y un oligonucleótido inmunoestimulatorio (por ejemplo un oligonucleótido CpG) (Documento WO 00/62800); (12) un inmunoestimulante y una partícula de sal metálica, por ejemplo, Documento WO 00/23105; (13) una saponina y una emulsión de aceite en agua, por ejemplo, Documento WO 99/11241; (14) una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (de manera opcional + un esterol), por ejemplo, Documento WO 98/57659; (15) mutantes detoxificados de una toxina ribosilante de un ADP bacteriano tal como la toxina del cólera (CT), una toxina pertussis (PT), o una toxina lábil al calor de E. coli (LT), de manera particular LT-K63 (cuando se sustituye la lisina por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 63) LTR72 (cuando se sustituye la arginina por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 72), CT-S109 (cuando se sustituye la serina por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 109), y PT-K9/G129 (cuando se sustituye la lisina por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 9 y se sustituye la glicina en la posición 129) (véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales N^{os} WO 93/13202 y WO 92/19265); y (16) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la efectividad de la composición. Se prefieren alum (de manera especial fosfato y/o hidróxido de aluminio) y MF59.
Entre los péptidos de muramilo se incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isogluatme (no MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isogluatminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
Para ejemplos adicionales de coadyuvantes, véanse Vaccine Design, The Subunit and the Adjuvant Approach, Powell, M. F. y Newman, M. J. eds. Plenum Press, 1995).
De esta manera, un componente opcional adicional de las composiciones de la presente invención es, de manera preferible, un coadyuvante tal como las sales de aluminio o un oligonucleótido que comprenda al menos un motivo CpG. Tal como se usa en el presente documento, la frase "motivo CpG" se refiere a una porción de dinucleótido de un oligonucleótido que comprende un nucleótido de citosina seguido por un nucleótido de guanosina. Se pueden preparar dichos oligonucleótidos usando la síntesis de oligonucleótidos convencionales bien conocida por las personas expertas en la técnica. De manera preferible, los oligonucleótidos de la invención comprenden un esqueleto modificado, tal como un fosforotioato o ácido nucleico de péptido, con el fin de conferir resistencia en el oligonucleótido frente a la nucleasa. Son bien conocidos por las personas expertas en la técnica los esqueletos modificados. Los ácidos nucleicos de péptido preferidos se describen en detalle en las Patentes de los Estados Unidos números 5.821.060, 5.789.573, 5.736.392 y 5.721.102, en la Patente Japonesa Nº 10231290, la Patente Europea Nº 839.828 y en las Publicaciones PCT Números WO 98/42735, WO 98/42876, WO 98/36098, WO 98/27105, WO 98/20162, WO 98/16550, WO 98/15648, WO 98/04571, WO 97/41150, WO 97/39024, y WO 97/38013, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad.
El oligonucleótido comprende de manera preferible entre aproximadamente 6 y aproximadamente 100 nucleótidos, de manera más preferible entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 nucleótidos, lo más preferible entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 nucleótidos. De manera adicional, os oligonucleótidos de la invención pueden comprender substituciones de las fracciones azúcar y fracciones basadas en nitrógeno. Los oligonucleótidos preferidos se describen en, por ejemplo, Krieg y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12631-12636, Klinman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883, Weiner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 10833-10837, Chu y col., J. Exp. Med., 1997, 186, 1623-1631, Brazalot-Millan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15553-15558, Ballas y col., J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845, Cowdery y col., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575, Halpern y col., Cell. Immunol., 1996, 167, 72-78, Yamamoto y col., Jpn J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873, Stacey y col., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122, Messina y col., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764, Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761, Roman y col., Nat. Med., 1997, 3, 849-854, Davis y col., J. Immunol., 1998, 160, 870-876, Lipford y col., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344, Moldoveanu y col., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906, Publicación PCT WO 96/02555, Publicación PCT WO 98/16247, Publicación PCT WO 98/18810, Publicación PCT WO 98/40100, Publicación PCT WO 98/55495, Publicación PCT WO 98/37919, y Publicación PCT WO 98/52581, las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad. Se entiende que los oligonucleótidos de la invención comprenden al menos un motivo CpG pero pueden contener una pluralidad de motivos CpG.
Los oligonucleótidos preferidos comprenden secuencias de nucleótidos tales como, por ejemplo, tccatgacgttcctgacgtt (SEC DE ID Nº: 1), ataatecgacgttcaagcaag (SEC DE ID Nº: 2), ggggtcaacgttgagggggg (SEC DE ID Nº: 3), tctcccagcgtgcgccat (SEC DE ID Nº: 4), gagaacgctcgaccttcgat (SEC DE ID Nº 5), tccatgtcgttcctgatgct (SEC DE ID Nº: 6), tccatgacgttcctgatgct (SEC DE ID Nº: 7), gctagacgttagcgt (SEC DE ID Nº: 8), atcgactctcgagcgttctc (SEC DE ID Nº: 9), gaaccttccatgctgttccg (SEC DE ID Nº:10), cgtagatgttagcgt (SEC DE ID Nº: 11), tcaacgtt (SEC DE ID Nº: 12), gcaacgtt (SEC DE ID Nº: 13), tcgacgtc (SEC DE ID Nº: 14), tcagcgct (SEC DE ID Nº: 15), tcaacgct (SEC DE ID Nº: 16), tcatcgat (SEC DE ID Nº: 17), tcttcgaa (SEC DE ID Nº: 18), tgactgtgaacgttcgagatga (SEC DE ID Nº: 19), tgactgtgaacgttagcgatga (SEC DE ID Nº: 20), tgactgtgaacgttagagcgga (SEC DE ID Nº: 21), gtttgcgcaacgttgttgccat (SEC DE ID Nº. 22), atggcaacaacgttgcgcaaac (SEC DE ID Nº: 23), cattggaaaacgttcttcgggg (SEC DE ID Nº: 24), ccccgaagaacgttttccaatg (SEC DE ID Nº: 25), attgacgtcaat (SEC DE ID Nº: 26), ctttccattgacgtcaatgggt (SEC DE ID Nº: 27), y tccatacgttcctgacgtt (SEC DE ID Nº: 28). En las formas de realización preferidas de la invención, el oligonucleótido comprende un motivo CpG flanqueado por dos purinas en el lado 5' del motivo y dos pirimidinas en el lado 3' del motivo. Se entiende, sin embargo, que se puede usar en la presente invención cualquier oligonucleótido que comprenda un motivo CpG siempre que el oligonucleótido induzca un incremento en la estimulación de linfocitos Th1 cuando se combina con las composiciones de micropartículas descritas en el presente documento.
6. Antígenos
La presente invención se dirige también a las composiciones inmunógenas que comprenden las micropartículas descritas anteriormente con las macromoléculas adsorbidas, de manera preferible los vectores constructo que codifican los antígenos y/o el antígeno per se. De manera general, un antígeno estimula la proliferación de linfocitos T, de manera preferible los linfocitos Th1, con receptores para el antígeno, y puede reaccionar con los linfocitos para iniciar la serie de respuestas denominada como inmunidad mediada por células, de esta manera, un antígeno puede inducir una respuesta CTL, y/o una respuesta humoral, y puede inducir la producción de citoquina.
Un epitopo está dentro del alcance de esta definición de antígeno. Un epitopo es la porción de una molécula antigénica o un complejo antigénico que determina su especificidad inmunológica. Comúnmente, un epitopo es un péptido o polisacárido en antígenos que se producen de manera natural. En antígenos artificiales puede ser una sustancia de bajo peso molecular tal como un derivado de ácido arsanílico. Un epitopo reaccionará de manera específica in vivo o in vitro con anticuerpos homólogos o linfocitos T. Los descriptores alternativos son determinantes antigénicos, agrupamientos estructurales antigénicos y agrupamientos hapténicos.
En las formas de realización preferidas de la invención, la sustancia antigénica se deriva de un virus tal como, por ejemplo, el virus de la inmunodeficiencia humana VIH, el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV), el virus del herpes simple (HSV), el citomegalovirus (CMV), el virus de la gripe (flu), y el virus de la rabia. De manera preferible, la sustancia antigénica se selecciona entre el grupo constituido por la glicoproteína gD de HSV, la glicoproteína gp120 de VIH, p55 gag de VIH, y los polipéptidos de las regiones pol y tat. En otras formas de realización preferidas de la invención, la sustancia antigénica se deriva de una bacteria tal como, por ejemplo, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, cólera, difteria, tétanos, Neisseria meningitidis, y pertussis. En otras formas de realización preferidas de la invención, la sustancia antigénica es de un parásito tal como, por ejemplo, un parásito de la malaria. En otra forma de realización preferida de la presente invención, el antígeno se adsorbe en la superficie de una micropartícula de la presente invención.
Se pueden producir los antígenos mediante procedimientos conocidos en la técnica, o se pueden conseguir procedentes de fuentes comerciales. Los antígenos que caen dentro del alcance de esta invención incluyen partículas de virus completamente inactivadas, proteínas de virus aislados y subunidades de proteínas, células completas y bacterias, proteínas de la pared celular y de la membrana celular, y similares. Se describen a continuación algunos antígenos preferidos.
La RgD2 del virus del herpes simple es una proteína recombinante producida en células de ovario de hámster chino modificadas mediante ingeniería genética. Esta proteína tiene truncada la región de ancla normal, dando como resultado una proteína glicosilada secretada en el medio de cultivo del tejido. Se puede purificar la gD2 en medio CHO hasta más de un 90% de pureza. El env-2-3 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es una forma recombinante de la proteína de envuelta de VIH procedente de a partir de Sacchromyces cerevisiae modificada mediante ingeniería genética. Esta proteína representa la región de proteína completa de gp120 de VIH, pero está no glicosilada y desnaturalizada tal como se purifica a partir de la levadura. Gp120 de VIH es una forma secretada completamente glicosilada de gp120 producida en las células CHO de una manera similar a la de la gD2 anterior. Se describen en las Publicaciones PCT WO 85/04587 y WO 88/02634 los antígenos HSV adicionales adecuados para uso en composiciones inmunógenas, las descripciones de los cuales se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad. Se prefieren de manera particular las mezclas de antígenos gB y gD, que tienen antígenos superficiales truncados que carecen de regiones ancla.
Se describen en las Solicitudes de los Estados Unidos con Nº de serie 490.858, presentada el 9 de Marzo de 1990, y la Solicitud Europea publicada con número 181150 (14 de mayo de 196), así como en las Solicitudes de los Estados Unidos con números de serie 60/168.471; 09/475.515; 09/475.504; y 09/610.313 los antígenos de VIH adicionales adecuados para uso en las composiciones inmunógenas, las descripciones de los cuales se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad.
Se describen en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.689.225, la Solicitud de los Estados Unidos con número de serie 367.363, presentada el 16 de Junio de 1989 y la Publicación PCT WO 89/07143 los antígenos de citomegalovirus adecuados para uso en composiciones inmunógenas, las descripciones de los cuales se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad.
Se describen en el Documento PCT/US88/04125, la Solicitud Europea publicada con número 318216 (31 de Mayo de 1989), la Solicitud Japonesa publicada con número 1-500565 presentada el 18 de Noviembre de 1988, la Solicitud canadiense 583.561, y el Documento EPO 388.232, los antígenos de la hepatitis C adecuados para uso en composiciones inmunógenas, las descripciones de los cuales se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad. En la Solicitud de Patente Europea 90/302866.0, presentada el 16 de Marzo de 1990, y la Solicitud de los Estados Unidos con número de serie 456.637, presentada el 21 de Diciembre de 1989, y el Documento PCT/US90/01348, se describe un conjunto diferente de antígenos de HCV, las descripciones de los cuales se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad.
Se pueden usar las composiciones inmunógenas de la invención para inmunizar aves y mamíferos frente a enfermedades e infecciones, que incluyen sin limitación cólera, difteria, tétanos, pertussis, gripe, sarampión, meningitis, paperas, plagas, poliomelitis, rabia, fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, rubéola, viruela, fiebres tifoideas, tifus, virus de la leucemia felina, y fiebre amarilla.
Algunas composiciones inmunógenas de la invención emplearán una cantidad efectiva de un antígeno. Por ejemplo. Se puede incluir una cantidad de antígeno que, en combinación con un coadyuvante, haga que el sujeto produzca una respuesta inmunológica suficiente y específica, de manera que comunique protección al sujeto en el momento de una exposición posterior a un virus, bacteria, hongo, micoplasma, o parásito.
En otras formas de realización, se usará una composición que comprende un antígeno para estimular la respuesta inmunológica de un vector constructo administrado anteriormente, que comprende de manera preferible una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica el antígeno. De manera más preferible, el antígeno se asocia con (por ejemplo, adsorbido sobre) las micropartículas descritas en el presente documento y/o, el antígeno se coadministra con un coadyuvante.
No se puede asignar ninguna dosificación unitaria única que proporcione directrices específicas para cada uno de los antígenos que se pueden emplear en esta invención. La cantidad efectiva de antígeno será una función de su actividad y pureza inherentes, y se determina de manera empírica mediante experimentación rutinaria por aquellas personas normalmente expertas en la técnica. Se contempla que se pueden usar las composiciones coadyuvantes de esta invención con células completas o composiciones inmunógenas víricas, así como con los antígenos purificados o subunidades de proteínas o composiciones inmunógenas de péptidos preparadas mediante técnicas de ADN recombinante, o síntesis.
Cuando se proporciona el antígeno en conexión con una emulsión, debido a que las composiciones coadyuvantes de la invención son estables, se pueden mezclar el antígeno y la emulsión de manera típica mediante agitación simple. Otras técnicas, tales como hacer pasar una mezcla del coadyuvante y solución o suspensión del antígeno rápidamente a través de una pequeña abertura (tal como una aguja hipodérmica), proporcionan fácilmente una composición inmunógena útil.
Las composiciones inmunógenas de acuerdo con la presente invención comprenden entre aproximadamente 1 nanogramo y aproximadamente 1000 microgramos de ácido nucleico, de manera preferible ADN tal como, por ejemplo, oligonucleótidos CpG. En algunas formas de realización preferidas, las composiciones inmunógenas contienen entre aproximadamente 10 nanogramos y aproximadamente 800 microgramos de ácido nucleico. En algunas formas de realización preferidas, las composiciones inmunógenas contienen entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 500 microgramos de ácido nucleico. En algunas formas de realización preferidas, las composiciones inmunógenas contienen entre aproximadamente 1 microgramo y aproximadamente 10 miligramos de ácido nucleico. En algunas formas de realización preferidas, las composiciones inmunógenas contienen entre aproximadamente 250 microgramos y aproximadamente 1 miligramo de ácido nucleico. En algunas formas de realización preferidas, las composiciones inmunógenas contienen entre aproximadamente 500 microgramos y aproximadamente 1 miligramo de ácido nucleico. Una persona experta en la técnica puede formular fácilmente una composición inmunógena que comprenda cualquier cantidad deseada de ácido nucleico. Las composiciones inmunógenas de acuerdo con la presente invención se proporcionan estériles y libres de pirógenos. Se pueden administrar de manera conveniente las composiciones inmunógenas en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, tal como se ha descrito en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980), la descripción de la cual se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad.
La presente invención se dirige también a los procedimientos para estimular una respuesta inmune en un animal huésped, que comprenden administrar al animal una o más composiciones inmunógenas descritas anteriormente en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune. El animal huésped es de manera preferible un mamífero, de manera más preferible un ser humano. Las rutas preferidas de administración incluyen, pero no se limitan a, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, intrarterial, intraocular y oral así como transdermal o mediante inhalación o supositorio. Las rutas de administración más preferidas incluyen la intramuscular, intraperitoneal, intradérmica e inyección subcutánea. De acuerdo con algunas formas de realización de la presente invención, las composiciones inmunógenas se administran al animal huésped usando dispositivos de inyección sin aguja, que son bien conocidos y está ampliamente disponibles Una persona normalmente experta en la técnica puede, siguiendo las enseñanzas del presente documento, usar dispositivos de inyección sin agujas para dosificar las composiciones inmunógenas en las células de un individuo. De manera adicional, se pueden dosificar las formas de realización de la invención conjuntamente con la electroporación.
La presente invención se dirige también a los procedimientos para inmunizar un animal huésped frente a un virus, bacteria, o infección parásita que comprende administrar al animal una o más composiciones inmunógenas descritas anteriormente en una cantidad efectiva para inducir una respuesta protectora. El animal huésped es de manera preferible un mamífero, de manera más preferible un ser humano. Se han descrito anteriormente las rutas preferidas de administración. Aunque el tratamiento profiláctico o terapéutico del animal huésped se puede dirigir a cualquier patógeno, los patógenos preferidos incluyen, pero no se limitan a, los patógenos víricos, bacterianos y parásitos descritos anteriormente.
La presente invención se dirige también a los procedimientos para inducir una respuesta inmune en un animal huésped que comprenden administrar al animal una o más composiciones inmunógenas descritas anteriormente en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune. El animal huésped es de manera preferible un mamífero, de manera más preferible un ser humano. Se han descrito anteriormente las rutas preferidas de administración. Una persona experta en la técnica está familiarizada con las respuestas inmunes y las medidas de las mismas.
La presente invención contempla el uso de micropartículas de polímero o micropartículas de emulsiones submicrométricas con macromoléculas adsorbidas para desencadenar una respuesta inmune sola, o en combinación con otras macromoléculas. Esto es, la invención abarca micropartículas con ácido nucleico adsorbido, emulsiones submicrométricas con ácido nucleico adsorbido o moléculas inmunoestimulantes, y la combinación de micropartículas, con ácido nucleico adsorbido junto con emulsiones submicrométricas con ácido nucleico adsorbido o moléculas inmunoestimulantes. Se puede usar también la electroporación para mejorar la liberación de ácido nucleico.
Tal como se demuestra mediante los siguientes Ejemplos, las micropartículas de polímero de la presente invención con macromoléculas adsorbidas desencadenan fuertes respuestas inmunes. De manera adicional, las micropartículas de las emulsiones submicrométricas de la presente invención con macromoléculas adsorbidas es por tanto una herramienta poderosa para desencadenar respuestas inmunes.
C. Parte experimental
Los ejemplos siguientes son formas de realización para llevar a cabo la presente invención. Se ofrecen los Ejemplos únicamente con objetivos ilustrativos, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención de ninguna manera.
Se han hecho esfuerzos para asegurar la fiabilidad con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc), pero deberá permitirse, por supuesto, algún error experimental y desviación.
Ejemplo 1 Preparación de micropartículas de polímero con ácido nucleico adsorbido
Se prepararon micropartículas PLG-GTAB usando un procedimiento de evaporación de solvente modificado. De manera breve, se prepararon las micropartículas emulsificando 10 ml de una solución de polímero al 5% p/v en cloruro de metileno con 1 ml de tampón T.E. a velocidad alta usando un homogeneizador IKA. A continuación se añadió la emulsión primaria a 50 ml de agua destilada que contenía bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) (0,5% p/v). Esto dio como resultado la formación de una emulsión agua/aceite/agua que se agitó a 6.000 rpm durante 12 horas a temperatura ambiente, dejando evaporar el cloruro de metileno. Se lavaron dos veces las micropartículas resultantes en agua destilada mediante centrifugación a 10.00 g y se criocongelaron.
Para un lote típico de 100 mg de ADN absorbido en micropartículas, se pesaron 100 mg de micropartículas catiónicas de PLG-CTAB en un vial de vidrio y se resuspendieron con un volumen 5 ml de solución de ADN de 200 \mug/ml (es decir, el plásmido de pCMV o de pSINCP que contiene gp140 o p55gag) en el tampón T.E. Se sometió a vortización la suspensión durante un minuto para dispersar de manera uniforme las micropartículas en la solución de ADN. Se colocó el vial en un agitador (velocidad lenta) a 4ºC para adsorción durante la noche. El día siguiente se centrifugaron las micropartículas a 8000 rpm en una centrífuga Beckman durante 10 minutos, y se recogió el sobrenadante para la cuantificación del ADN. Se lavó el residuo una vez con tampón 1 X TE resuspendiendo el residuo 1 X en tampón TE, dispersando con una espátula y centrifugando a 8.000 rpm durante 10 minutos. Se resuspendió el residuo final en una cantidad mínima de agua desionizada (aproximadamente 2 ml) dispersando el residuo con una espátula, y se criocongeló en un liofilizador bench top (Labconco) durante 24 horas.
Se evaluó el sobrenadante para el contenido de ADN leyendo la absorbancia a 260 nm. Se calculó la cantidad de ADN absorbido en las micropartículas sustrayendo la cantidad en el sobrenadante de la entrada de ADN total (1 mg por 100 mg de micropartículas. Se estimó la carga total disolviendo 5 mg de la formulación final en una solución de NaOH 0,5 M/SDS al 1% y leyendo la solución transparente tras la hidrólisis a 260 nm.
Ejemplo 2 Preparación de micropartículas de emulsión submicrométrica con ácido nucleico adsorbido
Se preparó una emulsión submicrométrica formada de MF59 y DOTAP proporcionando DOTAP (en cloroformo) en un vaso de precipitados y dejando evaporar este hasta 200 \mul. Se añadieron Tween (0,5% p/p), Escualeno (5,0% p/p) y Span (0,5% p/p) y se homogeneizaron durante 1 min usando un homogeneizador Omni con una sonda de 10 mm a 10K revs/min con el fin de proporcionar una materia prima homogénea para la emulsificación final. Se pasó esta 5 veces a través de un homogeneizador Microfluidizer M110S (Microfluidics Co., Newton, MA) a \sim 800 psi (5,52 x 10^{6} N/m^{2}). Se midió el potencial zeta de la emulsión, que es una medida de la carga superficial neta, en un DELSA 440 SX Zetasizer de Coulter y se encontró que era aproximadamente + 55 mV.
Se adsorbió el ADN (1 mg de ADN de gp140 de VIH-1 o 0,5 mg de ADN de p55 gag, presente en pCMV o PSINCP) mediante incubación con la emulsión submicrométrica durante la noche a 4ºC.
Ejemplo 3 Preparación de vectores constructo ELVIS y otros vectores para la adsorción en micropartículas
Se llevó a cabo la construcción de vectores ELVIS y replicón basados en alfavirus usando un virus Sindbis como ejemplo representativo. Como se apreciará, se puede aplicar fácilmente lo siguiente a la derivación de vectores de cualquier alfavirus por una persona experta en la técnica. Se infectaron aproximadamente 10^{7} células BHK-21 con la cepa SINDCquirón del virus Sindbis (depósito VR-2643 de la ATCC, 13 de abril de 1999) en un MOI de 1 PFU/célula. Tras 24 horas después de la infección, tras el desarrollo de CPE, se aisló el ARN total de las células usando el Reactivo TRIzol (GIBCO/BRL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras la purificación, se disolvió el ARN vírico en agua libre de nucleasa, se tomó una alícuota, y se almacenó a -80ºC para uso posterior en la clonación del
ADNc.
Se llevó a cabo la síntesis de ADNc mediante amplificación PCR, usando los conjuntos de cebadores que se muestran a continuación (Se indica para cada cebador la numeración del nucleótido Sindbis).
1
2
Se usaron pares de cebadores 1-5 para clonar los genes de las proteínas estructurales del virus, mientras que los pares 6-14 fueron para los genes de las proteínas no estructurales del virus. Los oligonucleótidos de los pares 1-5 contenían secuencias adicionales que representan los emplazamientos del enzima de restricción de EcoRI y HindIII, que no están presentes en el ARN subgenómico del virus Sindbis. Los oligonucleótidos 6-14 contenían los emplazamientos de SacI y XhoI, que no están presentes en el genoma completo de las cepas de virus Sindbis secuenciadas anteriormente ((están descritos estos emplazamientos).
Se llevó a cabo cada reacción de transcripción inversa (RT) en un volumen de 50 \mul usando el enzima SuperscriptII (GIBCO/BRL), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La mezcla de reacción contenía la cantidad equivalente de ARN de 10^{6} células y 50 pmoles de cada cebador que se muestra a continuación.
Mezcla 1: cebadores 1, 3 y 5
Mezcla 2: cebadores 2 y 4
Mezcla 3: cebadores 6, 9 y 12
Mezcla 4: cebadores 8, 11 y 14
Se congelaron las reacciones RT y se usaron posteriormente en la amplificación PCR. Se llevaron a cabo las reacciones PCR usando una Vent ADN polimerasa (NEB) tal como recomendaba el fabricante. Cada 50 \mul de reacción PCR contenían 3 \mul de mezclas RT descritas anteriormente y 50 pmoles de cebadores. Se llevaron a cabo un total de 14 reacciones (Tabla 1).
TABLA 1
Nº de fragmento Cebadores N de reacción RT Longitud del fragmento (bp.)
1 1 y 1.1 1 1128
2 2 y 2.1 2 800
3 3 y 3.1 1 789
4 4 y 4.1 2 644
5 5 y 5.1 1 670
6 6 y 6.1 3 962
7 7 y 7.1 3 666
8 8 y 8.1 4 1107
9 9 y 9.1 3 638
10 10 y 10.1 3 912
11 11 y 11.1 4 743
12 12 y 12.1 3 870
13 13 y 13.1 3 1034
14 14 y 14.1 4 1088
Las reacciones PCR de los fragmentos 1-5 se llevaron a cabo usando las siguientes condiciones: 12 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos y 74ºC durante 90 segundos. Para los fragmentos 6-14 se cambió el número de ciclos desde 12 a 15. Se analizó una alícuota pequeña de cada mezcla de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa para confirmar la presencia de los fragmentos del tamaño esperado. Se extrajo la mezcla de reacción restante con fenol-cloroformo y se precipitaron los fragmentos de ADN usando etanol.
Para la clonación, se digirieron los fragmentos 1-5 con HindIII y EcoRI, y a continuación se ligaron con el plásmido pRS2 (pUC19 con los emplazamientos de restricción adicionales en un polienlazante) tratado con los mismos enzimas. Se digirieron los fragmentos 6-14 con SacI y XhoI y se ligaron con el mismo plásmido pRS2 tratado con SacI y XhoI. Todos los plásmidos recombinantes se transformaron en la cepa XL-1 Blue de E. coli (Stratagene, La Jolla,
CA).
De manera adicional, se generaron los clones representando la región del promotor subgenómico y las regiones sin traducir 3' -finales usando los siguientes pares de cebadores:
YSIN1F: 5'-GATTCGCTTACTTCCACAGC (SEC DE ID Nº: 57)
YSIN1R: 5'-ACTGACGGCTGTGGTCAGTT (SEC DE ID Nº: 58)
YSIN2F: 5'-GATGTACTTCCGAGGAACTG (SEC DE ID Nº. 59)
YSIN2R: 5'-CCACAAGCTTGAAATGTTAAAAACAAAATTTTGT (SEC DE ID Nº. 60)
Se hicieron crecer colonias positivas para cada transformación para la purificación del plásmido usando un kit QIAGEN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación se ensamblaron los fragmentos, designados p1-p14 de manera correspondiente en configuraciones de vector apropiadas.
Se llevó a cabo la construcción de un Sistema de Iniciación del Vector en Capas Eucariota y un vector constructo de alfavirus para la transcripción in vitro del ARN del vector replicón usando los clones p1-p14 del ADNc del virus Sindbis, más los fragmentos de la región subgenómica y 3' final tal como sigue. Se ligó un fragmento ApaI-MscI, que contenía el promotor de la SP6 ARN polimerasa y el comienzo del ARN genómico del virus Sindbis, con el fragmento MscI-XhoI del fragmento 14 clonado en el plásmido pRS2 digerido con ApaI-XhoI. Se denominó el plásmido resultante p15. A continuación se ligaron el fragmento SacI-EcoRI de p8, el fragmento EcoRI-NsiI de p7 y el fragmento NsiI-XhoI de p6 en el pRS2 digerido con SacI-XhoI. Se denominó el plásmido resultante p16. A continuación se ligaron el fragmento SacI-MunI de p12, el fragmento MunI-NheI de p11 y el fragmento NheI-XhoI de p10 en el plásmido pRS2 digerido con SacI-XhoI. Se denominó el plásmido resultante p 17. A continuación se ligaron el fragmento ApaI-ApaLI de p15 y el fragmento ApaLi-XhoI de p13 en el pRS2 tratado con ApaI-XhoI, dando como resultado el plásmido denominado p18. A continuación se ligaron el fragmento ApaI-XhoI de p18 y el fragmento NsiI-XhoI de p17 junto con el pRS2 tratado con ApaI-XhoI. Se denominó el plásmido resultante p19. Finalmente se ligaron el fragmento ApaI-AvrII de p19, el fragmento AvrII-SalGI de p19 y el fragmento SalGI-BamH de p16 junto con un vector replicón Sindbis anteriormente construido que expresaba el indicador GFP (véase Dubenski y col., J. Virol. 70:508-519, 1996; Polo y col., 1999, ibid, y la Patente de los Estados Unidos 5.843.723), que se había digerido con ApaI-BamHI para eliminar los genes de las proteínas no estructurales existentes. Se denomino al constructo del vector Sindbis resultante, que contiene secuencias derivadas de la cepa de virus SINDquirón que codifica también un indicador GFP, como SINCR-GP (también conocido como DCSP6SINgfp). Se llevó a cabo la preparación del ARN del replicón de este constructo indicador, así como de los constructos del vector Sindbis que expresan otras diversas secuencias heterólogas (por ejemplo, antígenos, descritos en la especificación y a continuación) mediante linealización del ADN usando PmeI, seguido por la transcripción in vitro usando la polimerasa del bacteriófago SP6 tal como se ha descrito anteriormente (Polo y col, ibid; Dubensky y col., ibid)
De manera similar, se usaron las mismas secuencias Sindbis para conjuntar en un Sistema de Iniciación del vector en Capas Eucariota basado en alfavirus (véanse los Documentos de los Estados Unidos 5.814.482 y 6.015.686), en las que tiene lugar directamente la transcripción del vector de ARN autoamplificado en el interior de las células eucariotas transfectadas con ADN del plásmido ELVIS mediante un promotor eucariota (por ejemplo, promotor II de la ARN polimerasa). Se construyó un ADN del plásmido ELVIS, que expresa también el indicador GFP, reemplazando las secuencias derivadas del virus Sindbis en un vector ELVIS existente con las correspondientes secuencias de SINCR-GFP como anteriormente. Comenzando con el vector ELVIS de pSIN1.5 descrito anteriormente (Hariharan y col., J. Virol. 72:950-958, 1998), se modificó en primer lugar el esqueleto del plásmido sustituyendo el esqueleto del plásmido con el de pCMVLink (zur Megede y col., J. Virol. 74:2628-2635, 2000) usando dos emplazamientos SacI encontrados en cada plásmido, para generar el constructo intermedio conocido como ELVIS1.5CB. A continuación se eliminó uno de los dos emplazamientos sacI de ELVIS1.5CB (localizado de manera adyacente en el extremo SIN 3') mediante digestión parcial con SacI usando finales enromados de la T4 ADN polimerasa, y a continuación ligando en el emplazamiento modificado, un PmeI enlazante en 5'.GTTTAAAC-3'. El plásmido correcto sin el emplazamiento SacI diana se designó ELVIS1.5CbdlSac. A continuación se preparó este plásmido intermedio para la inserción de nuevos genes de proteínas estructurales SIN mediante digestión con SacI y XhoI. Se obtuvieron los genes no estructurales correspondiente mediante amplificación PCR a partir de SINCR-GFP usando los cebadores del
oligonucleótido
5'CCTATGAGCTCGTTTAGTGAACCGTATTGACGGCGTAGTACACAC (SEC DE ID Nº: 61) y 5'CCTATCTCGAGGGGTGGTGTTGTAGTATTAGTC (SEC DE ID Nº: 62), seguido por la digestión con SacI y XhoI, y la ligadura, para producir el constructo intermedio SINCP-Not.
Finalmente se eliminó uno de los dos emplazamientos NotI presentes en este constructo mediante digestión parcial y rellenado con Klenow, para dejar únicamente un emplazamiento NotI en el polienlazante. Este vector ELVIS construido de nuevo se designó SINCP (o pSINCP).
La inserción de secuencias heterólogas (por ejemplo, antígeno que codifica genes) en los vectores de alfavirus SINCR o SINCP se lleva a cabo principalmente mediante digestión con XhoI/NotI o XhoI/XbaI, seguido por la ligadura con un fragmente de ADN deseado que también tiene los términos XhoI/NotI o XhoI/XbaI. De manera alternativa estos emplazamientos pueden enromarse al final o se pueden usar otros emplazamientos polienlazantes (o se pueden reemplazar otras secuencias heterólogas) para permitir la clonación de un mayor número de insertos. Por ejemplo, se insertaron los genes que codifican p55 gag de VIH-1 (cepa SF2) y gp140 env (cepa SF162) en estos vectores. De manera específica, se insertó el códon que optimiza la secuencia p55gagamod de VIH optimizado (véase la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de propiedad compartida 09/475.515; zur Megede y col, ibid) mediante digestión de los vectores con XhoI/XbaI y ligando en el fragmento p55gagmod obtenido mediante digestión con SalI/XbaI. Se designaron los vectores resultantes SINCR-p55gag y SINCP-p55gag. De manera similar, se insertó el códon que optimiza las secuencias gp140 de VIH (descrito en el Ejemplo 10 y en Barnett y col, 2001. J. Virol 75:5526-40), en los plásmidos SINCR y SINCP para generar los constructos SINCR-gp140 y SINCP-gp140. Se llevó a cabo la formulación del ADN del plásmido ELVIS (pSINCP) y se transcribieron in vitro los replicones del vector de ARN a partir de los plásmidos SINCR tal como se ha descrito en otra parte en los Ejemplos.
Ejemplo 4 Inmunización de los macacos Rhesus con antígeno con plásmidos pCMV o pSINCP usando micropartículas o emulsiones submicrométricas
Se formaron micropartículas de polímero PLG y emulsiones submicrométricas de MF59 tal como se ha descrito anteriormente en los Ejemplos previos 1 y 2. Los grupos de micropartículas y emulsiones submicrométricas se fabricaron con el fin de analizar los efectos diferentes de inmunización de los macacos rhesus con un vector constructo del plásmido pCMV-gp140 o pCMV-p55gag (véase la Solicitud de la patente de los Estados Unidos del solicitante 09/475.515), en micropartículas o en emulsiones submicrométricas, así como comparando el efecto de usar un plásmido ELVIS, pSINCP-gp140 o pSINCP-p55gag, construidos tal como se ha descrito anteriormente. Se inmunizaron seis grupos de animales con diferentes formulaciones tal como sigue:
El grupo 1 usó pCMV-gp140 y pCMV-p55 gag sin micropartículas o emulsiones submicrométricas.
El grupo 2 usó pCMV-gp140 y pCMV p55 gag adsorbidos en micropartículas PLG/CTAB.
El grupo 3 usó pCMV-gp140 y pCMV-p55 gag adsorbidos en una emulsión submicrométrica de MF59-DOTAP.
El grupo 4 usó pSINCP-gp140 y pSINCP-p55 gag sin micropartículas o emulsiones submicrométricas.
El grupo 5 uso pSINCP-gp140 y pSINCP-p55 gag adsorbidos en micropartículas PLG/CTAB.
El grupo 6, ni usó antígeno, ni partículas, ni emulsiones submicrométricas.
Para cada grupo de animales, se inmunizaron los macacos rhesus 5 (únicamente 4 para el grupo 6) con cantidades suficientes de material de tal manera que la dosificación del vector con ADN de gp140 fue cada una de 1,0 mg, y el vector que contenía el ADN de p55 gag fue cada una de 0,5 mg, excepto para el control que no tenía ninguna. Se inmunizaron los animales una segunda vez cuatro semanas después de la primera inmunización, y una tercera vez 14 semanas después de la primera inmunización. Se analizó el suero a las 2 semanas (2wp1), 6(2wp2), 11-12 semanas (7wp2) y 16 (2wp3). La vía de inmunización fue IM TA. Tras las inmunizaciones, se midieron los títulos de IgG del plasma anti-p55gag y anti-gp140, los resultados de los cuales aparecen a continuación en las Tablas 2 y 3 como media geométrica de los títulos.
TABLA 2
Título de IgG en suero para anti-p55 gag (Media geométrica)
Grupo Forma de ADN 2wp1 2wp2 7wp2 2wp3
1 pCMV en solución salina 7 19 19 118
2 pCMV adsorbido en partículas de PLG/CTAB 490 10770 4360 1637
3 pCMV adsorbido en emulsión de MF59/DOTAP 142 5702 1480 3536
4 pSINCP en solución salina 8 7 8 45
5 pSINCP adsorbido en partículas PLG/CTAB 728 19256 3426 856
6 ninguna 12 9 8 7 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3
Título de IgG en suero para anti-gp140 (Media geométrica)
Grupo Forma de ADN 2wp1 2wp2 7wp2 2wp3
1 pCMV en solución salina 5 517 81 2460
2 pCMV adsorbido en partículas de PLG/CTAB 5 2762 5290 1913
3 pCMV adsorbido en emulsión de MF59/DOTAP 5 564 112 4823
4 pSINCP en solución salina 8 48 20 70
5 pSINCP adsorbido en partículas PLG/CTAB 15 11289 4266 1002
6 ninguna 12 14 11 11
Se analizó el mismo grupo de animales tal como se hizo para los animales anteriores para la inducción de una respuesta CTL. El efector para las relaciones diana (E:T) osciló entre aproximadamente 4:1 y 100:1. Los resultados del ensayo CTL aparecen a continuación en las tablas 4 y 5. UN "respondedor" es un macaco rhesus que mostró un 10% o más de lisis específica de la diana en dos o más relaciones E:T consecutivas.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4
Número de respondedores (p55gag)
Grupo Forma de ADN 2wp1 2wp2 7wp2 2wp3
1 pCMV en solución salina 0 4 1 4
2 pCMV adsorbido en partículas de PLG/CTAB 3 3 2 3
3 pCMV adsorbido en emulsión de MF59/DOTAP 0 1 1 0
4 pSINCP en solución salina 0 1 0 0
5 pSINCP adsorbido en partículas PLG/CTAB 0 3 1 1
6 ninguna 0 0 0 0
TABLA 5
Número de respondedores (gp140)
Grupo Forma de ADN 2wp1 2wp2 7wp2 2wp3
1 pCMV en solución salina 0 0 0 0
2 pCMV adsorbido en partículas de PLG/CTAB 0 0 0 0
3 pCMV adsorbido en emulsión de MF59/DOTAP 0 0 0 0
4 pSINCP en solución salina 0 0 0 1
5 pSINCP adsorbido en partículas PLG/CTAB 0 1 1 1
6 ninguna 0 0 0 0
Se analizaron también los mismos animales para la linfoproliferación. Este ensayo mide la proliferación específica de células T in vitro en respuesta a la reestimulación con antígeno. Se purificaron las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) del macaco rhesus a partir de sangre completa heparinizada mediante centrifugación en gradientes Ficoll-Hypaque. Se cultivaron las PBMC en un número de 2 x 10^{5} por pocillo en placas de microvaloración de fondo plano en presencia o ausencia de 3 microgramos/ml de proteína p55 gag recombinante purificada. Se iniciaron seis cultivos replicados por condición. Tras cuatro días de cultivo se añadió timidina tritiada ([^{3}H]TdR) (1 microcurio por pocillo), se continuaron los cultivos durante la noche y se cosecharon al día siguiente. Se depositaron las células sobre láminas de filtro de microfibra de vidrio. Se expusieron las láminas de filtro al líquido de centelleo y se recontaron en un contador por centelleo líquido. Se midió la incorporación de [^{3}]TdR para cada condición y se calcularon los conteos promedio por min (cpm) para los 6 replicados. Los resultados aparecen a continuación en la Tabla 6. Se calculó la media Geométrica del Índice de Estimulación (GMSI) como cuentas por minuto (cpm) de las células estimuladas con p55gag divididas por las cpm de las células sin estimular, de esta manera, el resultado más positivo es el más grande de GMSI.
TABLA 6
GMSI
Grupo Forma de ADN 2wp1 2wp2 7wp2 2wp3
1 pCMV en solución salina 2,6 5,1 3,0 3,2
2 pCMV adsorbido en partículas de PLG/CTAB 6,6 15,4 5,9 4,6
3 pCMV adsorbido en emulsión de MF59/DOTAP 9,1 29,5 13,6 10,5
4 pSINCP en solución salina 7,5 6,6 4,1 4,3
5 pSINCP adsorbido en partículas PLG/CTAB 10,4 13,8 5,4 4,4
6 ninguna 1,4 1,5 1,3 1,2
Se analizaron también los mismos animales para la inducción de la producción de citoquina intracelular. Este ensayo mide la producción específica de citoquinas por las células T in vitro en respuesta a una breve reestimulación con antígeno. Se purificaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del macaco Rhesus a partir de sangre completa heparinizada mediante centrifugación en gradientes de Ficoll-Hypaque. Se estimularon alícuotas de 1 x 10^{6} PBMC con una fuente de péptidos solapados sintéticos que expanden la secuencia de la proteína gag (o env) en presencia de un anticuerpo monoclonal anti-CD28 coestimulatorio. Se añadió Brefeldin A para permitir la acumulación de citoquinas sintetizadas de nuevo en el interior de las células. Tras la incubación durante la noche, se tiñeron las PBMC con anticuerpos monoclonales marcados fluorescentemente, comercialmente disponible para la presencia de interferón-\gamma intracelular (IFN-\gamma) y el factor-\alpha de necrosis tumoral (TNF-\alpha) y para la superficie celular de los marcadores CD4 y CD8. Se analizaron las muestras de células teñidas en un citómetro de flujo y se adquirieron los datos de aproximadamente 50.000-100.000 PBMC. Se determinó la frecuencia de las células citoquina-positiva para cada muestra usando software comercialmente disponible. En las tablas 7 y 8, se muestran los resultados, de manera respectiva, para gp140 y p55gag. Las Tablas muestran el número de animales que responden, donde un respondedor se define como un animal que puntúa más de 100 células CD4 por 100.000 que expresan TNF-\alpha e IFN-\gamma tal como se midió mediante tinción intracelular.
TABLA 7
Respondedores a la citoquina de gp140
Grupo Forma de ADN 2wp2 7wp2 2wp3
1 pCMV en solución salina 1 0 0
2 pCMV adsorbido en partículas de PLG/CTAB 1 2 0
3 pCMV adsorbido en emulsión de MF59/DOTAP 0 0 0
4 pSINCP en solución salina 0 0 0
5 pSINCP adsorbido en partículas PLG/CTAB 0 1 0
6 ninguna 0 0 0 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 8
Respondedores a la citoquina de p55gag
Grupo Forma de ADN 2wp2 7wp2 2wp3
1 pCMV en solución salina 0 0 0
2 pCMV adsorbido en partículas de PLG/CTAB 2 1 0
3 pCMV adsorbido en emulsión de MF59/DOTAP 0 0 0
4 pSINCP en solución salina 0 0 0
5 pSINCP adsorbido en partículas PLG/CTAB 1 1 0
6 ninguna 0 0 0
Ejemplo 5 Vectores constructo de ARN
Se pueden adsorber los vectores constructo de ARN (por ejemplo, los replicones) en micropartículas para la liberación de las secuencias heterólogas de ácido nucleico en las células de los animales. El vector constructo de ARN comprende de manera general un ARN vírico que ha tenido una región del ARN genómico (por ejemplo, un gen de la proteína estructural) sustituido con la secuencia heteróloga seleccionada, derivada de la secuencia que codifica el ADN para el producto de gen de interés. Los ejemplos representativos de los constructos del vector de ARN incluyen, pero no se limitan a, vectores de ARN de alfavirus (véanse por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5843723, la Publicación WO 99/18226, y Polo y col., 1999, PNAS 96:4598-4603), los vectores de ARN de picornavirus (véase por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 6156538, y Vignuzzi y col., 2001, J Gen Virol. 82:1737-47), los vectores de ARN de flavivirus (véase por ejemplo, Varnavski y col., 199, Virology 255:366-75, y los vectores de ARN de rubivirus (véase por ejemplo, Pugachev y col., 2000, J Virol. 74:10811-5). Se pueden obtener de manera general los vectores constructo de ARN para uso en la presente invención a partir de constructos de ADNc de plásmido como una fuente de material de partida, mediante procedimientos estándar de transcripción in vitro (véase referencias anteriores). De manera similar al ADN del plásmido, estos vectores constructo de ARN se pueden adsorber en micropartículas de la invención tal como se describe en otra parte en los ejemplo. Por ejemplo, los vectores constructo de ARN se adsorben sobre las micropartículas incubando 100 mg de micropartículas catiónicas en 1 mg/ml de solución de ADN a 4ºC durante 6 h. A continuación las micropartículas se separan mediante centrifugación, se lava el residuo con tampón TE y se criocongelan las micropartículas. La reconstitución y liberación de los vectores constructo de ARN formulados con PLG es similar a la descrita para el ADN, usando por ejemplo al menos 1 \mug, 10 \mug, 100 \mug, o 1000 \mug de vector constructo de ARN formulado para liberación.
Ejemplo 6 Coadyuvantes en ratones
Se llevó a cabo un experimento con ratones para analizar el efecto de un coadyuvante de fosfato de aluminio (alum) en ratones. Se prepararon micropartículas de polímero tal como se ha descrito anteriormente con o sin pCMV-p55gag absorbido sobre la anterior. Se inyectaron 10 microgramos de ADN, sea desnudo o adsorbido en las micropartículas de PLG, en grupos de 6 ratones CB6 F1 en 0 y 6 semanas, sin o con alum. En la Tabla 9 a continuación, se muestran los resultados como media geométrica de los títulos de anticuerpos.
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TABLA 9
Título de IgG en suero para anti-p55 gag (Media geométrica/error estándar)
Grupo Forma de ADN 3 semanas 6 semanas 9 semanas 12 semanas
1 pCMV en solución salina 28 149 6238 5274
2 pCMV adsorbido en micropartículas de PLG 5022 21992 346856 171301
3 pCMV en solución salina más alum 1536 3039 195070 92438
Ejemplo 7 Electroporación con micropartículas y vectores constructo ELVIS y vector de ARN
Se puede usar la electroporación en combinación con micropartículas de polímero o micropartículas de emulsiones submicrométricas hechas con cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente, tales como el ADN del plásmido, los constructos de los vectores ELVIS, y el vector de ARN.
Ejemplo 8 Inducción de la respuesta inmune en Rhesus con inmunizaciones de inducción y potenciación
Se llevó a cabo un experimento para determinar el efecto de la inducción con ADN y la potenciación con proteína adsorbida en micropartículas PLG. De manera particular, se prepararon micropartículas PLG-SDS tal como se ha descrito anteriormente y en la Solicitud de Patente Internacional de propiedad compartida PCT/US99/17308 y la proteína recombinante p55gag se adsorbió en la anterior. Se inmunizó un grupo de animales con 1 mg de pCMV-p55gag. Se inmunizaron los animales de nuevo a las 4 semanas, y a continuación de nuevo a las 8 semanas. Se potenciaron los animales con proteína p55gag adsorbida en micropartículas PLG a las 41 semanas. En la Tabla 10 a continuación se muestran los resultados, que muestran los títulos de anticuerpo para los respondedores, la inducción de la linfoproliferación de células T ayudantes (índice de estimulación media de los respondedores), y la inducción de CTL (número de respondedores, basado en más de un 10% de lisis en dos o más relaciones E:T consecutivas). Se midieron los resultados a las 14 semanas tras la 3ª inducción para las columnas de inducción, y dos semanas después de la potenciación para las columnas de potenciación. Los números en los paréntesis indican el número de respondedores de un total de 4 animales
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TABLA 10
Vacuna Título de anticuerpo Linfoproliferación (SI) CTL
inducción potenciación inducción potenciación inducción potenciación Inducción Potenciación
PCMV- PLG/p55gag 44 (1) 1777 (4) 2,5 (2) 21,8 (4) 4 4
p55gag
Ejemplo 9 Inducción de anticuerpos neutralizantes
Se ensayó el suero de los macacos rhesus en el Ejemplo 5 anterior para la inhibición de dos cepas diferentes de VIH-1 (SF2 y SF162) usando un stock de virus hecho crecer en PBMC y un ensayo basado en una línea de células T CCR5+/CXCR4+/CD4+. Se usó el suero en una dilución de 1:20. Se midió la actividad inhibitoria y se expresó como un porcentaje de inhibición. Se sustrajo la actividad inhibitoria del suero de los animales antes de las inmunizaciones a partir de los resultados de cada animal. En la Tabla 11 a continuación, se muestran los resultados para cada uno de los cinco animales en cada grupo.
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TABLA 11
Porcentaje de inhibición
Grupo Forma de ADN VIH-1_{SF2} VIH-1_{SF162}
2wp2 2wp3 2wp2 2wp3
1 pCMV en solución salina 0 0 0 0
0 0 0 17
0 8 0 0
0 0 0 12
0 0 0 52
2 pCMV adsorbido en partículas PLG/CTAB 58 40 3 0
0 41 6 0
0 0 0 0
72 79 0 0
48 61 11 10
3 pCMV adsorbido en emulsión MF59/DOTAP 0 100 0 0
0 0 0 0
76 100 3 4
81 100 0 0
15 93 0 0
4 pSINCP en solución salina 0 0 0 0
0 0 0 0
0 0 12 1
0 0 0 0
0 0 16 0
5 pSINCP adsorbido en partículas PLG/CTAB 73 50 19 0
43 0 29 0
91 0 4 0
69 0 32 6
91 23 no 0
disponible 
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Ejemplo 10 Preparación de plásmidos
Se hicieron crecer plásmidos que codificaban p55gag y gp140 de VIH-1 impulsados por el promotor del citomegalovirus humano (CMV) en la cepa DH5\alpha de Escherichia coli, purificada usando un kit Qiagen Endofree Plasmid Giga (Quiagen, Inc.) y se resuspendieron en cloruro de sodio al 0,9% (Abbott Laboratories, North Chicago, III). El vector pCMV usado contiene el mejorador/promotor inmediato temprano de CMV y un terminador de la hormona bovina del crecimiento y se describe en detalle en otra parte (Chapman, B. S., y col. 1991. "Effect of intron A from human cytomegalovirus (Towne) inmediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells". Nucleic Acids Res. 19:3979-86). La vacuna de AND del plásmido gag de VIH (pCMV gag) contiene un gen p55gag construido de manera sintética, con codones que reflejan el uso en mamíferos, derivados de la cepa SF2 de VIH-1 tal como se ha descrito anteriormente (zur Megede, J., y col. 2000. "Increased expression and immunogenicity of sequence-modified human immunodeficiency virus type 1 gag gene". J Virol. 74:2628-35). La vacuna de ADN del plásmido env de VIH (pCMVgp140) constituida por una secuencia señal del activador del plasminógeno del tejido humano (tPA) y el gp140 de la cepa SF162 de VIH-1, el codón optimizado para una expresión de alto nivel en células de mamíferos (Barnett, S. W., et. 2001. "The ability of an oligomeric human immunodeficiency virus type 1 (VIH-1) envelope antigen to elicit neutralizing antibodies against primary VIH-1 isolates is improved following partial deletion of the second hypervariable region" J Virol. 75:5526-40). Se ha descrito en el Ejemplo 3 anterior el vector del plásmido SINCP con p55gag o gp140 env de VIH-1.
Ejemplo 11 Preparación de proteínas
Se han publicado en Cheng-Mayer, C., M. Quiroga, J. W. Tung, D. Dina, y J. A. Levy. 1990. "Viral determinants of human immunodeficiency virus type 1 T-cell or macrophage tropism, cytopathogenicity, and CD4 antigen modulation". J Virol. 64:4390-8 las secuencias de proteína y ADNc de la gp160env.SF162. Se pueden encontrar estas secuencias en el Genbank con número de acceso M65024. Se expresó la proteína g140.SF162(dV2) recombinante de VIH-1 en las células de ovario de hámster chino y se purificaron tal como se ha descrito anteriormente (Barnett, S. W., ET. 2001. J Virol 75:5526-40). Se expresó la proteína SF2 p55 gag recombinante de VIH-1 en levaduras, y se purificó mediante cromatografía de intercambio catiónico (Chiron Corporation, Emeryville, CA). Se clonó la secuencia de ADNc de p55gag procedente de la cepa SF2 de VIH-1 (Genbank, número de acceso K02007) en un vector de expresión de ubiquitina, dando como resultado la adición de glicina y arginina en el término N de la secuencia de tipo salvaje. Se extrajo la proteína p55gag recombinante del residuo de las células de levaduras usando fosfato 50 mM, urea 6M, pH 7,9, seguido por cromatografía de intercambio iónico en S-fractogel (catiónico). Se obtuvo la elución de p55gag con un gradiente lineal de NaCl (pico a 0,4 m de NaCl). La pureza estimada fue de un 90% mediante SDS-PAGE.
Ejemplo 12 ADN adsorbido en micropartículas de PLG poli (láctido-co-glicólido)
Se obtuvo polímero PLG (RG505) procedente de Boehringer Ingelheim. Se prepararon micropartículas catiónicas usando un procedimiento de evaporación de solvente modificado. De manera breve, se prepararon las micropartículas emulsificando 10 ml de una solución de polímero al 5% (p/vol) en cloruro de metileno con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a velocidad alta usando un homogeneizador IKA. A continuación se añadió la emulsión primaria en 50 ml de agua destilada que contenía bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) (0,5% p/vol), dando como resultado la formación de una emulsión de agua en aceite en agua, que se agitó a 6.000 rpm durante 12 h a temperatura ambiente, dejando evaporar el cloruro de metileno. Las micropartículas resultantes se lavaron dos veces en agua destilada mediante centrifugación a 10.000 g y se criocongelaron. El ADN del plásmido del Ejemplo 11 se adsorbió sobre las micropartículas incubando 100 mg de micropartículas catiónicas y 5 ml de una solución de 200 microgramos/ml de ADN a 4ºC durante 6h. A continuación se separaron las micropartículas mediante centrifugación, se lavó el residuo con tampón TE (Tris-EDTA), y las micropartículas. Se criocongelaron.
Ejemplo 13 Micropartículas de PLG absorbidas en proteínas
Se prepararon micropartículas blanco mediante una técnica de evaporación del solvente. De manera breve, se prepararon las micropartículas homogeneizando 10 ml de solución de polímero al 6% p/v en cloruro de metileno, con 40 ml de agua destilada que contenía SDS (1% p/v)) a velocidad alta usando una sonda de 10 mm. Esto dio como resultado una emulsión de aceite en agua, que se agitó a 1000 rpm durante 12 horas a temperatura ambiente, y se dejó evaporar el cloruro de metileno. Las micropartículas resultantes se filtraron a través de un tamiz de 38 \mum, se lavaron 3 veces en agua destilada, y se criocongelaron. Se determinó la distribución de tamaño de las micropartículas usando un analizador del tamaño de partículas (Master sizer. Malvern Instruments, Reino Unido).
Se incubaron 50 mg de partículas SDS blanco liofilizadas con 0,5 mg de la proteína p55 gag del Ejemplo 12 en 10 ml de tampón de borato 25 mM con urea 6 M. Se dejaron las partículas en una plataforma de laboratorio de vaivén (Aliquot mixer, Miles labs) a temperatura ambiente durante 5 horas. Se separaron las micropartículas del medio de incubación mediante centrifugación, y se lavó el residuo de SDS una vez con tampón borato con urea 6 M y a continuación tres veces con agua destilada, y se liofilizó.
Se determinó el nivel de carga de la proteína absorbida en las micropartículas disolviendo 10 mg de las micropartículas en 2 ml de solución de SDS al 5%-hidróxido de sodio 0,2 M a temperatura ambiente. Se midió la concentración de proteína mediante el ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, Illinois). Se midió el potencial zeta tanto para las micropartículas blanco como para las adsorbidas usando un analizador Malvern Zeta (Malvern Instruments, Reino Unido).
Ejemplo 14 Preparación de proteína con coadyuvante MF59
Se combinó proteína recombinante g140.SF162(dV2) de VIH-1 del Ejemplo 12 con coadyuvante MF59 tal como se ha descrito anteriormente (Barnett, S. W., et. 2001. J Virol. 75:5526-40)
Ejemplo 15 Inmunización
Se alojaron machos y hembras de macacos rhesus en el Southern Research Institute (Frederick, MD).
Se llevó a cabo la inmunización con el ADN del plásmido en las semanas 0, 4, y 14. Se proporcionaron a los rhesus inyecciones intramusculares de 0,5 mg de la pCMVgag del Ejemplo 11 (en solución salina o formulada con micropartículas de PLG/CTAB tal como se ha descrito en el Ejemplo 13 o formuladas con MF59/DOTAP tal como se ha descrito en el Ejemplo 2) y 1,0 mg de pCMVenv del Ejemplo 11 (en solución salina o formulada con micropartículas de PLG/CTAB tal como se ha descrito en el Ejemplo 13) en 4 emplazamientos separados por animal (0,25 mg de pCMVgag en la parte superior del brazo derecho y en la parte superior de la pierna derecha;0,5 mg de pCMV en la parte superior del brazo izquierdo y en la parte superior de la pierna izquierda. De manera alternativa se proporcionó a los rhesus inyecciones intramusculares de 0,5 mg de pSINCPgag del ejemplo 11 (en solución salina o formuladas con micropartículas de PLG/CTAB tal como se ha descrito en el Ejemplo 13) y 1,0 mg de pSINCPenv del Ejemplo 11 (en solución salina o formulada con micropartículas de PLG/CTAB tal como se ha descrito en el Ejemplo 13) y 4 emplazamientos separados por animal.
Se potenciaron los rhesus mediante inyección intramuscular de 0,2 mg de proteína p55gag recombinante/micropar-
tículas de PLG del Ejemplo 14 en la semana 29 con 0,1 mg de proteína recombinante gp140env(dV2/coadyuvante MF59 del ejemplo 15 en la semana 38.
Ejemplo 16 Respuestas de anticuerpos
Se recogió sangre heparinizada de animales anestesiados, en diversos momentos tras la inmunización, y se recuperó el plasma mediante centrifugación. Se midieron los anticuerpos anti VIH Gag y Env mediante el ensayo inmunosorbente enlazado al enzima (ELISA) tal como sigue. Se recubrieron los pocillos de las placas de microvaloración con proteína recombinante p55gag de VIH-1.SF2 o proteína recombinante gp140env de VIH-1.SF162 en 5 microgramos/ml de PBS, 50 microlitros por pocillo, y se incubaron a 4ºC durante la noche. Se lavaron las placas seis veces con tampón de lavado (PBS, Tween 20 al 0,3%) y se bloquearon a 37ºC durante 1 h con 200 microlitros por pocillo de tampón de bloqueo (PBS, Tween 20 al 0,3%, suero de cabra al 5%). Se diluyeron las muestras a 1:25 y a continuación se diluyeron en serie tres veces en tampón de bloqueo. Se aspiró la solución de bloqueo y a continuación se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 h con 70 microlitros por pocillo de cada dilución de plasma. Tras lavarse seis veces, se incubaron las placas durante 1 h a 37ºC con anti-IgG conjugada con peroxidasa de rábano picante (dilución 1:8.000). Tras seis lavados, se revelaron las placas con sustrato TMB durante 15 minutos. Se paró la reacción con HCl 2 N y se midieron las densidades ópticas (OD) a una longitud de onda de 450 nm. Se calculó el título como el recíproco de la dilución a la cual se alcanzó una OD_{450 \ nm} de 0,5.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 12 Títulos de anticuerpo en plasma Anti-gag de Rhesus
3
TABLA 13 Títulos de anticuerpo en plasma Anti-env de Rheus
4 
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Ejemplo 17 Respuestas de los linfocitos T citolíticos (CTL)
Se prepararon un conjunto de 51 péptidos sintéticos con una longitud de 20 aminoácidos (aa), que se solapan en 10 aa, y que empalman con p55 gag, y una fuente de 66 péptidos sintéticos con una longitud de 20 aa, que se solapan mediante 10 aa y que empalman con gp140. Se separaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de macaco Rhesus de sangre heparinizada mediante centrifugación en gradientes Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech, Piscataway, N. J.). Se cultivaron las PBMC durante 8 días en placas de 24 pocillos a 3 x 10^{6} por pocillo en 1,5 ml de un medio de cultivo AIMV/RPMI 1640 (Gibco-BrL, Grand Island, N. Y.) suplementado con suero bovino fetal al 10%. Se estimularon los CTL gag específicos mediante la adición de la fuente de péptido gag y se estimularon los CTL env específicos mediante la adición de la fuente de péptido env. Se suplementaron los cultivos con interleuquina-7 humana recombinante (IL-7; 15 ng/ml; R&D Systems, Minneapolis, Minn). Se añadió IL-2 recombinante humana (20 IU/ml; Proleukin; Chiron) en los días 1, 3, y 6. Se derivaron líneas de células linfoblastoides B estables de rhesus exponiendo las PBMC al sobrenadante de un cultivo que contenía herpesvirus de papio de la línea de células S594 (Falk, L. Y col. 1976. Properties of a baboon lymphotropic herpesvirus related to Epstein-Barr virus. Int J Cancer. 18:798-807. Rabin, H., y col. 1976. Virological studies of baboon (Papio hamadryas) lymphoma: isolation and characterization of foamyviruses. J. Med Primatol. 5:13-22) en presencia de 0,5 microgramos/ml de ciclosporina A (Sigma, San Luis, MO). Se infectaron autólogos B-LCL con virus de vacuna recombinante (rVV) que codifica gag-pol de VIH-1.SF2 (rVV gag-pol) o gp160env de VIH-1.ST162 (rVV gp160env) (relación PFU:célula de 10) y se marcaron de manera concurrente con Na[^{51}Cr]_{2}O_{4} (NEN, Boston, MA) a 25 microcurios por 1 x 10^{6} B-LCL. Tras cultivar durante la noche a 37ºC, se lavaron las B-LCL marcadas con ^{51}Cr e infectadas con rVV, y a continuación se añadieron (2.500 por pocillo de fondo redondeado) a los pocillos duplicados que contenían diluciones en serie de las PBMC cultivadas tres veces. A continuación se añadieron 10^{5} B-LCL sin infectar y sin marcar por pocillo para inhibir la citolisis no específica. Tras 4 h de incubación a 37ºC, se cosecharon 50 microlitros de sobrenadantes del cultivo y se añadieron a LumaPlates (Packard, Meriden, CT) y se contó la radioactividad (cuentas por minuto (cpm)) con un contador por centelleo líquido Microdata 1450 (Wallac, Gaithersburg, MD). Se normalizó el ^{51}Cr liberado de la diana usando la fórmula: % específico de liberación de ^{51}Cr = 100% x (media experimental:cpm -SR)/(MR-SR), donde SR = media de cpm de las dianas solas y MR = media de cpm de las dianas expuestas a Triton X-100. Se determinó que un animal tenía una respuesta positiva específica a p55gag si a dos diluciones consecutivas de las fuentes de péptido gag estimulados con PBMC, la lisis de los B-LCL infectados con rVVgag excedieron la lisis de los B-LCL infectados con rVVgp160env en al menos un 10%, y si en a dos diluciones consecutivas de PBMC cultivado, la lisis de los B-LCL infectados con rVVgag debido al péptido gag estimulado con PBMC excede la lisis de los B-LCL infectados con rVVgag debido al B-LCL estimulado con el péptido env en al menos un 10%. Se determinó que un animal tenía una respuesta positiva específica a gp160 si a dos diluciones consecutivas de las fuentes de péptido env estimulados con PBMC, la lisis de los B-LCL infectados con rVVgp160env excedieron la lisis de los B-LCL infectados con rVVgag en al menos un 10%, y si a dos diluciones consecutivas de PBMC cultivado, la lisis de los B-LCL infectados con rVVgp160env debido al péptido env estimulado con PBMC excede la lisis de los B-LCL infectados con rVVgp160env debido al B-LCL estimulado con el péptido gag en al
menos un 10%.
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TABLA 14 CTL gag específicos
Inducción de CTL p55gag específicos mediante vacunas 
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Número de animales positivos por grupo (n = 5)
Semana 2 2 6 11 16 20 24
Vacuna Tiempo:pre 2w1st 2wp2nd 7wp2nd 2wp3rd 6wp3rd 10wp3rd
pSINCP 0 0 1 0 0 0
pSINCP/PLG 0 0 3 1 1 0
pCMV 0 0 4 1 4 3 1
pCMV/PLG 0 3 3 2 3 1 1
pCMV/MF59 0 0 1 1 0 0
Ninguna 0 0 0 0 0 0 
\newpage
TABLA 15 CTL env específicos
Inducción de CTL gp140env específicos mediante vacunas 
\vskip1.000000\baselineskip
Número de animales positivos por grupo (n = 5)
Semana 2 2 6 11 16 20 24
Vacuna Tiempo:pre 2w1st 2wp2nd 7wp2nd 2wp3rd 6wp3rd 10wp3rd
pSINCP 0 0 0 0 1 0
pSINCP/PLG 0 0 1 0 1 0
pCMV 0 0 0 0 0 1 1
pCMV/PLG 0 0 0 0 0 0 0
pCMV/MF59 0 0 1 1 0 0
Ninguna 0 0 0 0 0 0 
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Ejemplo 18 Ensayo de linfoproliferación (LPA)
Se cultivaron 2 x 10^{5} PBMC de rhesus por pocillo en presencia o ausencia de proteína p55gag recombinante o el conjunto de péptidos env sintéticos. Se establecieron seis pocillos replicados para cada condición de cultivo. Tras 4 días de incubación se pulsaron los cultivos durante la noche con 1 microcurio/pocillo de [^{3}H]TdR. Se determinó la incorporación de [^{3}H]TdR en las células mediante conteo por centelleo líquido (BetaPlate, Wallac, Gaithersburg, MD), se calculó el Índice de Estimulación como SI = media de cpm (estimulación de gag o env)/(media de cpm (sin estimular).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 16 Índices de estimulación en la linfoproliferación de Resus anti-gac
5
TABLA 17 Índices de estimulación en la linfoproliferación de Reus anti-env
7
Ejemplo 19 Inmunofluorescencia de citoquina intracelular y citometría de flujo
Se cultivaron PBMC (1 x 10^{6} por pocillo) de Rhesus durante la noche en presencia de brefeldin A (Pharmingen, San Diego, CA) y anticuerpo monoclonal anti-CD28 (mAB) (Pharmingen) y en presencia o ausencia de fuentes de péptidos gag o env. Se prepararon pocillos duplicados para cada condición de estimulación. El día siguiente se tiñeron las células con proteína de colorofila peridinin (PerCP) conjugada con anti-CD8 mAb y aloficocianina (APC) conjugada con anti-CD4 mAb (Becton Dickinson, San Jose, CA), se fijo y permeabilizó (Cytofix/Cytoperm, pharmingen), y se tiñó con isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con un factor-\alpha de necrosis antitumoral (TNF-\alpha) mAb y ficoeritrina (PE) conjugada con anti interferón-\gamma (IFN-\gamma) mAb (Pharmingen). Se analizaron las muestras de células teñidas usando un citómetro de flujo FACSCalibur^{TM} y un software CellQuest^{TM} (Becton Dickinson). Se calculó la fracción de células teñidas positivamente para IFN-\gamma y TNF-\alpha para los sublotes de células T CD4+8- y CD8+4-. Se calculó el número de células gag- o env- específicas por sustracción del promedio de la fracción IFN-g/TNF-a encontrado en los pocillos control sin estimular a partir del promedio de la fracción IFN-\gamma/TNF-a encontrado en los pocillos estimulados con gag- o env-.
Para un sublote de células t dado (CD4+8- o CD8+4-) y el antígeno (gag o env) se designó una respuesta como positiva si la fracción de células específicas al antígeno fue al menos de un 0,1%.
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TABLA 18 Células T gag específico IFN\gamma^{+}/TNF\alpha^{+} CD4+
Inducción de células T p55gag específico IFN\gamma^{+}/TNF\alpha^{+} CD4-mediante vacunas 
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Número de animales positivos por grupo (n = 5)^{*}
Pre Tras 1ª Tras 2ª Tras 3ª Tras proteína
pSINCP 0 0 0 0 1
pSINCP/LG 0 0 2 0 0
pCMV 0 0 0 0 0
pCMV/PLG 0 0 2 0 1
pCMV/MF59 0 0 0 0 0
Ninguna 0 0 0 0 0
* Positivo: Frecuencia \geq 0,1% 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 19 Células T env específico IFN\gamma^{+}/TNF\alpha^{+} CD4+
Inducción de células T gp140env específico IFN\gamma^{+}/TNF\alpha^{+} CD4+ mediante vacunas 
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Número de animales positivos por grupo (n = 5)^{*}
Pre Tras 1ª Tras 2ª Tras 3ª Tras proteína
pSINCP 0 0 0 0 3
pSINCP/LG 0 0 1 0 3
pCMV 0 0 1 0 2
pCMV/PLG 0 0 2 0 3
pCMV/MF59 0 0 0 0 0
Ninguna 0 0 0 0 0
* Positivo: Frecuencia \geq 0,1%
TABLA 20 Células T gag específico IFN\gamma^{+}/TNF\alpha^{+} CD8+
Inducción de células T p55gag específico IFN\gamma^{+}/TNF\alpha^{+} CD8+ mediante vacunas 
\vskip1.000000\baselineskip
Número de animales positivos por grupo (n = 5)^{*}
Pre Tras 1ª Tras 2ª Tras 3ª Tras proteína
pSINCP 0 0 0 0 0
pSINCP/LG 0 0 0 0 0
pCMV 0 0 0 1 2
pCMV/PLG 0 0 1 0 3
pCMV/MF59 0 0 0 0 0
Ninguna 0 0 0 0 0
* Positivo: Frecuencia \geq 0,1%
TABLA 21 Células T env específico IFN\gamma^{+}/TNF\alpha^{+} CD8+
Inducción de células T gp140env específico IFN\gamma^{+}/TNF\alpha^{+} CD8+ mediante vacunas 
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Número de animales positivos por grupo (n = 5)^{*}
Pre Tras 1ª Tras 2ª Tras 3ª Tras proteína
pSINCP 0 0 0 1 0
pSINCP/LG 0 0 0 0 0
pCMV 0 0 0 0 2
pCMV/PLG 0 0 0 0 3
pCMV/MF59 0 0 0 0 0
Ninguna 0 0 0 0 0
* Positivo: Frecuencia \geq 0,1%
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Ref. 63 - Solicitud de Patente Internacional WO 00/56360.
Ref. 64 - Solicitud de Patente Internacional WO 00/61761.

Claims (53)

1. Un procedimiento para producir una micropartícula que tiene una superficie adsorbente en la cual se adsorbe un constructo de vector capaz de expresar una secuencia de ácido nucleico seleccionada, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a)
emulsionar una mezcla de una solución de polímero y un detergente para formar una emulsión, en la que la solución de polímero comprende un polímero seleccionado entre el grupo constituido por poli (\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido, y un policianoacrilato, en el que el polímero está presente en una concentración de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 30% en un solvente orgánico, y en el que el detergente está presente en la mezcla en una relación peso a peso de detergente a polímero de entre aproximadamente 0,00001:1 a aproximadamente 0,5:1;
(b)
eliminar el solvente orgánico de la emulsión para formar dicha micropartícula; y
(c)
adsorber el constructo de vector en la superficie de la micropartícula, en la que dicho constructo de vector se selecciona entre el grupo constituido por un vector ELVIS y un constructo de vector de ARN.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el constructo de vector comprende una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica un miembro seleccionado entre el grupo constituido por un compuesto farmacéutico, un polipéptido, una hormona, un enzima, un mediador de la transcripción o la traducción, un intermedio en una vía metabólica, un inmunomodulador, un antígeno, y un coadyuvante.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un antígeno seleccionado entre el grupo constituido por gp120 de VIH, gp140 de VIH, p24gag de VIH, p55gag de VIH, y el antígeno hemaglutinina A de la Gripe.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un polipéptido gag de VIH, y comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por los nucleótidos 844-903 de la SEC. ID Nº: 63, los nucleótidos 841-900 de la SEC. ID Nº: 64, los nucleótidos 1213-1353 de la SEC. ID Nº: 67, y los nucleótidos 82-1512 de la SEC. ID Nº: 68.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un polipéptido de la envuelta de VIH y comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por los nucleótidos 1513-2547 de la SEC. ID Nº:65 y los nucleótidos 1210-1353 de la SEC. ID Nº: 66.
6. Una micropartícula fabricada de acuerdo con el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. Una micropartícula con una superficie adsorbente en la cual se ha adsorbido una macromolécula biológicamente activa que comprende: una micropartícula seleccionada entre el grupo constituido por (a) una micropartícula de polímero que comprende: (i) un polímero seleccionado entre el grupo constituido por un poli (\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido, y un policianoacrilato; y un detergente; y (b) una emulsión submicrométrica que comprende: (i) un aceite metabolizable; y (ii) uno o más agentes emulsificantes; y
la macromolécula biológicamente activa, en la que la macromolécula biológicamente activa es una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un constructo de vector seleccionado entre el grupo constituido por un constructo de vector ELVIS y un vector de ARN.
8. La micropartícula de la reivindicación 7, en la que la micropartícula seleccionada es la emulsión submicrométrica, y (a) el aceite es un terpenoide y (b) uno o más agentes emulsificantes, uno o más detergentes no iónicos y uno o más detergentes catiónicos.
9. La micropartícula de la reivindicación 8, en la que el aceite es escualeno y los uno o más agentes emulsificantes comprenden: un éster de ácido graso de polioxietilén sorbitán, un éster de ácido graso de sorbitán, y DOTAP:
10. La micropartícula de la reivindicación 7 en la que dicha micropartícula de polímero se selecciona como dicha micropartícula.
11. La micropartícula de la reivindicación 10, en la que dicha micropartícula de polímero comprende un poli (\alpha-hidroxi ácido) seleccionado entre el grupo constituido por poli (L-láctido), poli (D,L-láctido) y poli (D,L-láctido-co-glicólido).
12. La micropartícula de la reivindicación 10 u 11, que comprende de manera adicional una segunda macromolécula biológicamente activa atrapada en el interior de la micropartícula, en la que la segunda macromolécula biológicamente activa es un miembro seleccionado entre el grupo constituido por un polinucleótido, un polinucleósido, un compuesto farmacéutico, un polipéptido, una hormona, un enzima, un mediador de la transcripción o la traducción, un intermedio en una vía metabólica, un inmunomodulador, un antígeno y un coadyuvante.
13. La micropartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 en la que dicho constructo de vector es un vector ELVIS.
14. La micropartícula de la reivindicación 13, en la que dicho vector ELVIS comprende un complemento de ADNc de un constructo de vector de ARN derivado de un miembro seleccionado entre el grupo constituido por alfavirus, picornavirus, togavirus, flavivirus, coronavirus, paramixovirus, y el virus de la fiebre amarilla, y en la que dicho constructo de vector de ARN comprende de manera adicional una secuencia heteróloga de nucleótido seleccio-
nada.
15. La micropartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que dicho constructo de vector es un constructo de vector de ARN derivado de un miembro seleccionado entre el grupo constituido por alfavirus, picornavirus, togavirus, flavivirus, coronavirus, paramixovirus, y el virus de la fiebre amarilla, y en la que dicho constructo de vector de ARN comprende una secuencia heteróloga de nucleótido seleccionada.
16. La micropartícula de la reivindicación 14 ó 15, en la que dicho constructo de vector se deriva de un alfavirus seleccionado entre el grupo constituido por virus Sindbis, virus Semliki Forest, virus de la encefalitis equina de Venezuela, o virus Ross River.
17. La micropartícula de la reivindicación 13 ó 14, en la que dicho constructo de vector comprende una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica un miembro seleccionado entre el grupo constituido por un compuesto farmacéutico, un polipéptido, una hormona, un enzima, un mediador de la transcripción o la traducción, un intermedio en una vía metabólica, un inmunomodulador, un antígeno, y un coadyuvante.
18. La micropartícula de la reivindicación 17, en la que dicha secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un antígeno seleccionado entre el grupo constituido por gp120 de VIH, gp140 de VIH, p24gag de VIH, p55gag de VIH, y el antígeno de la hemaglutinina A de la gripe.
19. La micropartícula de la reivindicación 18, en la que dicha secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un polipéptido gag de VIH y comprende al menos una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por los nucleótidos 844-903 de la SEC. ID Nº: 63, los nucleótidos 841-900 de la SEC. ID Nº: 64, los nucleótidos 1213-1353 de la SEC. ID Nº: 67, y los nucleótidos 82-1512 de la SEC. ID Nº: 68.
20. La micropartícula de la reivindicación 18, en la que dicha secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un polipéptido de la envuelta de VIH y comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por los nucleótidos 1513-2547 de la SEC. ID Nº: 65 y los nucleótidos 1210-1353 de la SEC. ID Nº: 66.
21. La micropartícula de la reivindicación 13, en la que dicho constructo de vector es un vector seleccionado entre el grupo constituido por los vectores ELVIS pSINCP-gp140 y pSINCP-p55gag.
22. La micropartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 21 que comprende de manera adicional al menos una segunda macromolécula biológicamente activa adsorbida sobre la superficie de la misma, en la que la segunda macromolécula biológicamente activa es al menos un miembro seleccionado entre el grupo constituido por un polipéptido, un polinucleótido, un polinucleósido, un antígeno, un compuesto farmacéutico, una hormona, un enzima, un mediador de la transcripción o la traducción, un intermedio en una vía metabólica, un inmunomodulador, y un coadyuvante.
23. La micropartícula de la reivindicación 22, en la que la segunda macromolécula biológicamente activa es un antígeno seleccionado entre el grupo constituido por gp120 de VIH, gp140 de VIH, p24gag de VIH, p55gag de VIH, y el antígeno de la hemaglutinina A de la Gripe, un polinucleótido que codifica gp140 de VIH, o es un coadyu-
vante.
24. La micropartícula de la reivindicación 23, en la que la segunda macromolécula biológicamente activa es un coadyuvante que es una sal de aluminio.
25. Una composición de micropartículas que comprende una micropartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 24 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
26. La composición de micropartículas de la reivindicación 25, que comprende de manera adicional un coadyuvante.
27. La composición de micropartículas de la reivindicación 26, en la que el coadyuvante es (a) un miembro seleccionado entre el grupo constituido por un oligonucleótido CpG o (b) una sal de aluminio que es un fosfato de aluminio.
28. La composición de micropartículas de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27 para uso en la inducción o el aumento de una respuesta inmune en un animal huésped.
29. La composición de micropartículas de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27 para uso en la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una macromolécula en un animal huésped en la que el animal huésped es un vertebrado.
30. La composición de micropartículas de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27 para uso en el tratamiento de una enfermedad o como una vacuna.
31. La composición de micropartícula de las reivindicaciones 28 a 29 en la que dicho animal es un ser humano.
32. El uso de un constructo de vector adsorbido en la fabricación de un medicamento para aumentar una respuesta inmune en un animal huésped, en el que;
(a) el constructo de vector comprende una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica un primer antígeno en una cantidad efectiva para desencadenar una respuesta inmune;
(b) el constructo de vector se adsorbe sobre micropartículas que comprenden (i) un polímero seleccionado entre el grupo constituido por poli (\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido y un policianoacrilato y (ii) un detergente;
(c) la administración del constructo de vector adsorbido es seguida por: la potenciación de la respuesta inmune administrando un segundo antígeno al animal huésped; y
(d) el primer y el segundo antígeno pueden ser el mismo o diferente.
33. El uso de un constructo de vector adsorbido y un segundo antígeno en la fabricación de un medicamento para aumentar una respuesta inmune en un animal huésped, en el que;
(a) el constructo de vector comprende una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica un primer antígeno en una cantidad efectiva para desencadenar una respuesta inmune;
(b) el constructo de vector se adsorbe sobre las micropartículas que comprenden (i) un polímero seleccionado entre el grupo constituido por un poli (\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido y un policianoacrilato y (ii) un detergente;
(c) el segundo antígeno se administra tras el constructo de vector adsorbido y potencia la respuesta inmune en el animal; y
(d) el primer antígeno y el segundo antígeno pueden ser el mismo o diferente.
34. El uso de la reivindicación 32 ó 33 en el que el constructo de vector adsorbido se selecciona entre un ADN de plásmido y un constructo de vector de ARN.
35. El uso de la reivindicación 34, en el que el ADN de plásmido es un vector ELVIS.
36. El uso de la reivindicación 35, en el que el vector ELVIS comprende un complemento ADNc de un constructo de vector de ARN derivado de un miembro seleccionado entre el grupo constituido por alfavirus, picornavirus, togavirus, flavivirus, coronavirus, paramixovirus y el virus de la fiebre amarilla.
37. El uso de la reivindicación 36, en el que el alfavirus se selecciona entre el grupo constituido por virus Sindbis, virus Semliki Forest, virus de la encefalitis equina de Venezuela, o virus Ross River.
38. El uso de la reivindicación 34, en el que el ADN del plásmido comprende un promotor/mejorador CMV.
39. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 38, en el que el primer y segundo antígenos se seleccionan entre el grupo constituido por antígenos de VIH, antígenos del virus de la hepatitis C, y antígenos del virus A de la gripe.
40. El uso de la reivindicación 39, en la que el primer y segundo antígenos se seleccionan entre el grupo constituido por los antígenos de gp 120, gp140, gp 160, p24gag y p55gag de VIH.
\newpage
41. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 40, en el que el segundo antígeno se adsorbe en micropartículas que comprenden (i) un polímero seleccionado entre el grupo constituido por un poli (\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxi butírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido, y un policianoacrilato y (ii) un detergente.
42. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 41, en el que el constructo de vector adsorbido y/o segundo antígeno se coadministran con un coadyuvante.
43. El uso de la reivindicación 42, en el que el coadyuvante es MF59.
44. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 43, en el que el polímero comprende un poli (\alpha-hidroxi ácido) seleccionado entre el grupo constituido por poli (L-láctido), poli (D,L-láctido) y poli (D,L-láctido-co-glicólido) y en el que el detergente comprende un detergente catiónico seleccionado entre CTAB, cloruro de benzalconio, DDA y DOTAP.
45. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 44, en el que el constructo de vector se administra dos o más veces antes que se administre el segundo antígeno.
46. El uso de la reivindicación 45, en el que el segundo antígeno se administra también dos o más veces.
47. El uso de la reivindicación 46, en el que el constructo del vector se administra (a) en el momento de la administración inicial, (b) en un período de tiempo que oscila entre 1-8 semanas desde la administración inicial, y (c) en un período de tiempo que oscila entre 4-32 semanas desde la administración inicial, y en el que el segundo antígeno se administra (a) en un período de tiempo que oscila entre 8-50 semanas desde la administración inicial y (b) en un período de tiempo que oscila entre 8-100 semanas desde la administración inicial.
48. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 47, en el que el animal es un mamífero seleccionado entre el macaco rhesus y un ser humano.
49. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 48, en el que el constructo de vector y el segundo antígeno se administran por vía subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intravenosa o intramuscular.
50. El uso de la reivindicación 32, en el que dicha respuesta inmune comprende una respuesta inmune Th1 o CTL.
51. El uso de la reivindicación 32, en el que dicha respuesta inmune se genera frente a una infección vírica, bacteriana o de parásitos.
52. El uso de la composición de micropartículas de la reivindicación 25 en la fabricación de un medicamento para (a) inmunizar un huésped animal frente a una infección vírica, bacteriana, o de parásitos, (b) induciendo una respuesta inmune Th1 o CTL en un animal huésped o (c) reduciendo el nivel de infección en un animal huésped que tiene una infección vírica, bacteriana o de parásitos.
53. El uso de la reivindicación 52 en el que dicho animal huésped es un ser humano.
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