JP2002537102A - 吸着された高分子および微粒子を有するミクロエマルジョン - Google Patents

吸着された高分子および微粒子を有するミクロエマルジョン

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Abstract

(57)【要約】 吸着性表面を有する微粒子、このような微粒子の作製方法およびその使用が開示される。この微粒子は、ポリマー（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物など）を含み、そしてカチオン性、アニオン性または非イオン性の界面活性剤を用いて形成される。この微粒子の表面は、生物学的に活性な高分子（例えば、ＤＮＡ、ポリペプチド、抗原およびアジュバント）を効率的に吸着する。代謝可能な油および乳化剤を有する油滴エマルジョンの組成物もまた提供される。免疫刺激量の抗原性物質および免疫刺激量のアジュバント組成物を有する免疫原性組成物もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般に、薬学的組成物に関する。特に、本発明は、吸着表面を有す
る微粒子、そのような微粒子を調製するための方法、および例えば、ワクチンと
してのその使用に関する。さらに、本発明は、油滴エマルジョンを含むアジュバ
ント組成物、および例えばワクチンとしてのその使用に関する。さらに、本発明
は、生分解性微粒子および／またはミクロエマルジョンを含む組成物に関し、こ
こで、生物学的に活性な薬剤（例えば、治療的ポリヌクレオチド、ポリペプチド
、抗原およびアジュバント）がそれに吸着される。
【０００２】 （背景） 粒子化されたキャリアは、治療化合物の徐放性の非経口的送達を達成するため
に用いられている。そのようなキャリアは、長時間にわたり送達系において活性
薬剤を維持するように設計される。粒子化されたキャリアの例としては、ポリメ
チルメタクリレートポリマー由来のもの、ならびにポリ（ラクチド）由来の微粒
子（例えば、ポリ（ラクチド）（米国特許第３，７７３，９１９号を参照のこと
）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、（ＰＬＧとして知られる（例えば、米
国特許第４，７６７，６２８号を参照のこと））およびポリエチレングリコール
（ＰＥＧとして知られる（例えば、米国特許第５，６４８，０９５号を参照のこ
と））が挙げられる。ポリメチルメタクリレートポリマーは、非分解性であるが
、ＰＬＧ粒子は、乳酸およびグリコール酸にたいするエステル結合の、ランダム
な比酵素的加水分解により分解性であり、これらは、正常な代謝経路に沿って分
泌される。
【０００３】 例えば、米国特許第５，６４８，０９５号は、経鼻、経口、肺および経口送達
のための薬物送達系としてのカプセル化された医薬を有するミクロスフェアの使
用を記載する。種々のポリペプチド増殖因子を含む徐放処方物もまた、記載され
ている。例えば、国際特許番号ＷＯ９４／１２１５８号、米国特許第５，１３４
，１２２号および国際特許番号ＷＯ９６／３７２１６号を参照のこと。
【０００４】 Ｆａｔｔａｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａ
ｓｅ ５３：１３７−１４３（１９９８）は、吸着されたオリゴヌクレオチドを
有するポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）から調製されたナノ粒子を
記載する。
【０００５】 粒子状キャリア（例えば、微粒子）もまた、適切な免疫応答を惹起する試みに
おいて、吸着または捕捉された抗原とともに使用されている。そのようなキャリ
アは、その免疫系に対して選択された抗原の複数のコピーを提示し、そして局所
のリンパ節における抗原の捕捉および保持を促進する。その粒子は、マクロファ
ージによって貪食され得、そしてサイトカイン放出を通じて抗原提示を促進し得
る。例えば、共有に係る同時係属中の出願第０９／０１５，６５２号（１９９８
年１月２９日出願）は、細胞媒介性免疫学的応答を刺激するための抗原吸着およ
び抗原カプセル化された微粒子の使用、ならびにその微粒子を作製する方法を記
載する。
【０００６】 共有に係る仮特許出願第６０／０３６，３１６号においては例えば、微粒子を
形成する方法が記載されており、これは、ポリマーを有機溶媒と合わせる工程、
次いでエマルジョン安定剤（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を添加す
る工程、次いでその有機溶媒をエバポレートする工程、それにより、微粒子を形
成する工程を包含する。この微粒子の表面は、ポリマーおよび安定剤を包含する
。次いで、高分子（例えば、ＤＮＡ、ポリペプチドおよび抗原）を、その表面上
に吸着させ得る。
【０００７】 抗原吸着されたＰＬＧ微粒子は、他のより毒性の系よりも顕著な利点を提供す
る。他方、その微粒子表面に対する生物学的に活性な薬剤の吸着は、問題であり
得る。例えば、しばしば、荷電されまたは嵩高い生物学的に活性な薬剤（例えば
、ポリヌクレオチド、大きなポリペプチドなど）をその微粒子表面に吸着するこ
とは、困難または不可能である。従って、そのような薬剤についての柔軟な送達
系について、そして、特に、非常に感受性が高く、そして処方が困難である薬物
について継続された必要性が存在する。
【０００８】 アジュバントは、抗原に対して免疫応答を増強し得る化合物である。アジュバ
ントは、体液性および細胞性の免疫の両方を増強し得る。しかし、特定の病原体
は、細胞性免疫を刺激することが好ましく、特に、Ｔｈ１細胞はそうである。現
在使用されるアジュバントは、Ｔｈ１細胞応答を適切に惹起しないし、そして／
または有害な副作用を有する。
【０００９】 現在、米国でのヒトでの使用について承認されている唯一のアジュバントは、
アルミニウム塩（ミョウバン）である。これらのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジ
フテリア、ポリオ、狂犬病およびインフルエンザを含むいくつかのワクチンにつ
いて有用であるが、他のもの特に細胞媒介性免疫が保護に必要とされる場合には
、有用でないかもしれない。例えば、複数の報告が、ミョウバンが百日咳および
チフスのワクチンの有効性を改善せず、アデノウイルスワクチンを用いてわずか
に効果を提供したことを示している。さらに、例えば、注射部位での肉芽腫の誘
発およびロットごとのミョウバン調整物の変動のような問題が経験されている。
【００１０】 完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）は、強力な免疫刺激剤であり、実験ベ
ースでは、多くの抗原を用いて首尾よく使用されている。ＣＦＡは、３つの成分
から構成される：ミネラルオイル、乳化剤（例えば、Ａｒｌａｃｅｌ Ａ）およ
び殺傷されたミコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓ）。水性抗原溶液を、これらの化合物と混合して、油中水エマ
ルジョンを作製する。しかし、ＣＦＡは、疼痛、膿瘍形成および熱を含む重篤な
副作用を生じ、これらにより、ヒトまたは獣用ワクチンのいずれにおいても使用
されていない。この副作用は、主に、ＣＦＡのミコバクテリア成分に対する宿主
の反応に起因する。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）は、細菌成分を除
いてＣＦＡに類似する。米国において使用について承認されてはいないが、ＩＦ
Ａは、他の国ではいくつかの型のワクチンについて有用となっている。ＩＦＡは
、ヒトにおいてインフルエンザおよびポリオのワクチンとともに、ならびに狂犬
病、イヌジステンパー、および口蹄疫病を含むいくつかの動物ワクチンともに首
尾よく使用されている。しかし、実験によって、ＩＦＡに使用される油および乳
化剤の両方が、マウスにおいて腫瘍を生じ得ることが示されており、これは、代
替のアジュバントがヒト使用についてのよりよい選択であることを示している。
【００１１】 ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）は、ＣＦＡとともに観察されるアジュバント活
性を生成するミコバクテリア細胞壁複合体の最小単位を表す。Ｅｌｌｏｕら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１９７４，５９，１３１
７。広汎なアジュバント能力および副作用を示す、ＭＤＰの多くの合成アナログ
が生成されている。Ｃｈｅｄｉｄら、Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ、１９７８，２
５，６３。ＭＤＰの４つのアナログ（ＭＤＰのスレオニル誘導体（Ｂｙａｒｓら
、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８７、５、２２３；ＭＤＰのｎ−ブチル誘導体（Ｃｈｅ
ｄｉｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１９８２，３５，４１７）；およびム
ラミルトリペプチドの親油性誘導体（Ｇｉｓｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌ
ａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｒｅｌ
ａｔｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ｙ．Ｙａｍａｍｕｒａ
ａｎｄ Ｓ．Ｋｏｔａｎｉ，編、Ｅｘｃｅｒｐｔａ Ｍｅｄｉｃａ、Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ、ｐ．１６７））が、体液性および細胞媒介性の免疫を示し、そして低
レベルの毒性を示すことが示されている。ＭＤＰの別の誘導体であるＮ−アセチ
ルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−［１，
２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−３（ヒドロキシホスホリルオキシ）
］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）は親油性である。ＭＰＴ−ＰＥは、脂質環境に
おいてその分子の疎水性部分の会合を可能にするリン脂質テイルを有するが、ム
ラミルペプチド部分は、水性環境と会合する。従って、ＭＰＴ−ＰＥそのものは
、乳化剤として作用して、水エマルジョンにおける安定な油を生成し得る。
【００１２】 レバミソール（Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）およびイソプリノシンは、宿主免疫を
増強する他の合成アジュバントである。レバミソールは、テトラミソールのレボ
異性体であり、そして体液性および細胞性の免疫を、Ｔ細胞依存性機構によって
増強する。アデノシンおよびグアノシンのプリンの前駆体であるイノシンを含む
複合体であるイソプリノシンは、Ｔ細胞有糸分裂誘発を促進する。イムノグロブ
リン（Ｉｇ）重鎖における配列に相同な４アミノ酸ペプチド（Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ）であるタフトシン（Ｔｕｆｔｓｉｎ）は、主に、マクロファー
ジを刺激する。
【００１３】 生分解性かつ生体適合性のポリマー（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｐ
ＬＧ）として知られる）から調製された微粒子は、多数の抗原について有効なビ
ヒクルであることが実証されている。さらに、ＰＬＧ微粒子は、捕捉された抗原
の放出速度を制御し得、そして従って単回用量ワクチンについての可能性を提供
する。さらに、捕捉された抗原を有する生分解性ポリマーの投与は、広汎な動物
モデルにおいて強力な免疫応答を誘発することが実証されている。Ｏ’Ｈａｇａ
ｎら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、１９９８，３２，
２２５−２４６およびＳｉｎｇｈら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ
．Ｒｅｖ．、１９９８，３４，２８５−３０４、それらの開示はそのすべてが本
明細書において参考として援用される。
【００１４】 スクアレン、三オレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５TM）、および均一な大き
さにされた微小滴を提供するように微小流体化された、ポリソルベート８０（Ｔ
ｗｅｅｎ８０TM）を含むエマルジョン（すなわち、ＭＦ５９）もまた、強力な免
疫応答を誘発することが示された。ＭＦ５９処方物は、ミョウバン塩アジュバン
トを用いて得られたものよりも抗体力価５→１００倍の誘発を示した。ＭＦ５９
は、以下を含む、多数の供給源からの抗原に対する免疫応答を増強することが実
証されている：例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイル
ス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、際とメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイル
ス（ＨＰＶ）、およびマラリア。Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔ
ｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９
５、Ｍ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ、編、Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．２７７−２９６；Ｓｉｎｇｈら、Ｖａｃ
ｃｉｎｅ、１９９８，１６，１８２２−１８２７；Ｏｔｔ ら、Ｖａｃｃｉｎｅ
、１９９５，１３、１５５７−１５６２；Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ，１９９７、Ｆｅｂｒｕａｒｙ、６９−７５；および Ｔ
ｒａｑｕｉｎａら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１９９６，１７４，１１６８
−７５、これらの開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。
ＭＦ５９アジュバントは、サブユニット抗原の免疫原性を改善しつつ、ミョウバ
ンアジュバントの安全性および寛容性のプロファイルを維持する。Ｖａｎ Ｎｅ
ｓｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９２，１９９２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、５７−６２およびＶａｌｅｎｓｉ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４，１５３，４０２９−３９、それらの開示
は、その全体が本明細書において参考として援用される。ＭＦ５９はさらに、同
時係属中の米国特許出願第０８／４３４，５１２号（１９９９年５月４日出願）
（本発明の譲渡者に譲渡される）に記載されている。これは、その全体が本明細
書において参考として援用される。動物研究において、遺伝子毒性、催奇形性で
はないことが見出され、感作を生じもしない。ＭＦ５９の作用機構は、強力なＣ
Ｄ４＋Ｔ細胞の生成、すなわちＴｈ２細胞の応答に依存するようである。しかし
、ＭＦ５９アジュバントは、あったとしてもほとんどＴｈ１応答も細胞傷害性Ｔ
リンパ球（ＣＴＬ）応答も惹起しない。
【００１５】 抗原と混合されたＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、強力なＴｈ１
抗原応答を惹起することが実証されている。Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、
１９９７，３，８４９−８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４，１０８３３−１０８３７；Ｄａｖｉｓら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８，１６０，８７０−８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９
７，２７，２３４０−２３４４；およびＭｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎ
ｅ、１９８８，１６，１２１６−１２２４、これらの開示は、その全体が本明細
書において参考として援用される。メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチド
は、比較的細菌ＤＮＡにおいて共通しているが、脊椎動物ＤＮＡにおいて過小抑
制されそしてメチル化されている。Ｂｉｒｄ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１
９８７，３，３４２−３４７。メチル化されていないＣｐＧモチーフを含む細菌
ＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドもまた、以下を含む免疫応答を惹起するこ
とが知られている：Ｂ細胞増殖、インターロイキン６およびイムノグロブリンの
分泌、ならびにアポトーシス耐性。Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３
７４，５４６−５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、１９９６，９３，２８７９−２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．、１９９６，１５７，１８４０−１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９
９６，１６７，７２−７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．、１９８８，７９，８６６−８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．、Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１９９６，１５７，４９１８−４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ａｎｄ Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｐ
ＣＴ公開ＷＯ９６／０２５５５；ＰＣＴ公開 ＷＯ９８／１６２４７；ＰＣＴ公
開ＷＯ９８／１８８１０；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／４０１００；ＰＣＴ公開ＷＯ９
８／５５４９５；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／３７９１９；およびＰＣＴ公開ＷＯ９８
／５２５８１、これらの開示は、その全体が、本明細書において参考として援用
される。
【００１６】 一リン酸化リピドＡ（ＭＰＬ）は、当業者において、Ｔｈ１リンパ球応答を誘
導することが知られている。Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ
Ｌｉｐｉｄ Ａ ａｓ ａｎ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄ
ｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編，１９９５、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．４９５−５２３。
【００１７】 カチオン性脂質ベースのエマルジョンは、遺伝子キャリアとして使用され得る
こともまた示された。Ｓｅｅ、ｅ．ｇ．、Ｙｉら、Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉ
ｄ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ；ａ Ｎｏｖｅｌ Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ、ａｎｄ Ｎｏｎ
−Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｃ
．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ
．、２４：６５３−６５４（１９９７）；Ｋｉｍら、Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ
Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄ Ｅｍｕｌｓ
ｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ
Ｉｎｔｒａ Ｎａｓａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ
’１．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２５
：３４４−３４５（１９９８）；Ｋｉｍら、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ
Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉ
ｐｉｄ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ
．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２６、＃５４３８（１９９９）。
【００１８】 従って、予防的処置および治療的処置のために使用され得る、Ｔｈ１細胞応答
の増加を生じるアジュバントは、なお所望されている。そのような応答は、例え
ば、ウイルス感染の処置において、ならびにウイルス感染に対して感受性のある
個体の免疫のために有用である。
【００１９】 （発明の要旨） 本発明者らは、本明細書において、広汎な種々の高分子を吸着し得る吸着表面
を有する微粒子を形成する方法を発明した。この微粒子は、ポリマーおよび界面
活性剤の両方から構成される。本発明の微粒子は、そのような高分子を、現在利
用可能な微粒子よりも効率的に吸着する。
【００２０】 その微粒子は、ポリマー（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキ
シ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエーテル、ポリ無水物、ＰＡＣＡ、ポ
リシアノアクリレートなどから誘導され、そして界面活性剤（例えば、カチオン
性、アニオン性、または非イオン性の界面活性剤）とともに形成される。この界
面活性剤は、組合せで使用され得る。さらに、本発明者らは、これらの微粒子が
ウイルス抗原の吸着の改善を達成し、そしてＰＶＡのみを使用するプロセスによ
り形成される微粒子と比較して、優れた免疫応答を提供することを発見した。Ｐ
ＶＡのみを用いて作製された微粒子は、いくつかの高分子を吸着し得るが、他の
界面活性剤を単独、組合せまたはＰＶＡとの組合せで使用する本発明の微粒子は
、広汎な種々の高分子を吸着する。従って、次いで、本発明は、そのような微粒
子、ならびにそれらを生成するためのプロセスおよびその微粒子を用いる方法に
主に関する。
【００２１】 １つの実施形態において、本発明は、吸着剤表面を有する微粒子に関し、ここ
で、その微粒子は、以下からなる群より選択されるポリマーを含む：ポリ（α−
ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステ
ル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレート。
【００２２】 別の実施形態において、本発明は、さらに、その微粒子の表面に吸着された選
択された高分子を含む、そのような微粒子（例えば、医薬、ポリヌクレオチド、
ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディ
エーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤、抗原、アジュバント、またはそれら
の組合せなど）に関する。
【００２３】 別の実施形態において、本発明は、微粒子組成物に関する。この微粒子組成物
は、本発明の微粒子に吸着された、選択された高分子および薬学的に受容可能な
賦形剤を含む。
【００２４】 別の実施形態において、本発明は、吸着剤表面を有する微粒子を生産する方法
に関する。この方法は、以下の工程を包含する： （ａ）ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、
ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレート（ここで、そ
のポリマーは、有機溶媒中で約１％〜約３０％の濃度で存在する）からなる群よ
り選択されるポリマーを含むポリマー溶液と； そのポリマー溶液に対するアニオン性、カチオン性または非イオン性の界面活
性剤（ここで、その界面活性剤は、０．００１〜１０（ｗ／ｗ）の界面活性剤対
ポリマー）の比で存在する）とを合わせて、ポリマー／界面活性剤混合物を形成
する工程； （ｂ）そのポリマー／界面活性剤混合物を分散させる工程； （ｃ）その有機溶媒を除去する工程；および （ｄ）その微粒子を回収する工程。
【００２５】 好ましくは、その有機溶媒を取り除く前にそのポリマー／界面活性剤混合物を
乳化してエマルジョンを形成させる。
【００２６】 別の実施形態において、本発明は、上記方法によって調製された微粒子に関す
る。
【００２７】 別の実施形態において、本発明は、以下の工程を包含する、吸着された高分子
を有する微粒子を生産するための方法に関する： （ａ）ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）を含むポリマー溶液（ここで
、そのポリマーは、有機溶媒中に約３％〜約１０％の濃度で存在する）と； アニオン性、カチオン性または非イオン性の界面活性剤（ここで、その界面活
性剤は、０．００１〜１０（ｗ／ｗ）の界面活性剤対ポリマー）の比で存在する
）とを合わせて、ポリマー／界面活性剤混合物を形成する工程； （ｂ）そのポリマー／界面活性剤混合物を分散させる工程； （ｃ）そのエマルジョンからその有機溶媒を除去する工程； （ｄ）その微粒子を回収する工程；および （ｅ）その微粒子の表面に高分子を吸着させる工程であって、その高分子は、 以下からなる群より選択される工程：医薬、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、
ホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メディエーター、代謝経路における
中間体、免疫調節因子、抗原、アジュバント、およびそれらの組合せ。好ましく
は、その有機溶媒を除去する前にそのポリマー／界面活性剤混合物を乳化して、
エマルジョンを形成させる。別の実施形態において、本発明は、上記の所望の方
法によって調製された吸着された高分子を有する微粒子に関する。
【００２８】 別の実施形態において、吸着剤微粒子組成物を生成する方法に関する。この方
法は、その表面上に高分子を有する吸着剤微粒子と、薬学的に受容可能な賦形剤
とを組み合わせる工程を包含する。
【００２９】 さらに別の実施形態において、本発明は、脊椎動物被験体に、高分子を送達す
る方法に関する。この方法は、上記の組成物を脊椎動物被験体に投与する工程を
包含する。
【００３０】 さらなる実施形態において、本発明は、脊椎動物被験体において細胞性免疫応
答を惹起するための方法に関する。この方法は、本発明の微粒子に吸着された、
治療的に有効な量の選択された高分子を脊椎動物に投与する工程を包含する。
【００３１】 別の実施形態において、本発明は、免疫方法に関する。この方法は、脊椎動物
に、治療的有効量の上記の微粒子組成物を投与する工程を包含する。その組成物
は、必要に応じて、結合していない高分子を含み得、そしてまた、必要に応じて
、リン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩を含むアジュバントを含み得る。
【００３２】 好ましい実施形態において、その微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）から形
成され；より好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）から形成
され；そして最も好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）であ
る。
【００３３】 本発明の別の実施形態において、微粒子調整物は、イオン表面活性剤とのサブ
ミクロンエマルジョンを包含する。ＭＦ５９または他のものは、塩基粒子として
使用され得るが、イオン表面活性剤は、以下を含み得るがそれらに限定されない
：ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジオレ
オイル−ｓｎ−グリセロ−エチルホスホコリン（ＤＥＰＣ）およびジオレオイル
ホスファチジン酸（ＤＰＡ）、これらは各々スクアレン中で可溶性である。
【００３４】 非網羅的な以前に記載された吸着剤微粒子の各々はまた、必要に応じて、それ
らに捕捉された高分子を有し得る。
【００３５】 本発明はまた、イオン性界面活性剤を用いて処方された油滴エマルジョンを含
むミクロエマルジョンに関する。そのような組成物は、容易に、ＤＮＡ、タンパ
ク質および他の抗原性分子のような高分子を吸着する。アジュバント組成物は、
少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含み得る。そのア
ジュバント組成物はまた、正に荷電したエマルジョンを生じる任意の成分を含み
得る。この油滴エマルジョンは、好ましくは、代謝可能な油および乳化剤を含む
。これらの薬剤は、好ましくは、実質的にすべてが１μｍ未満の直径である湯的
を有する、水中油エマルジョンの形態で存在する。好ましくは、この組成物は、
ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーの非存在下で存
在する。この油は、好ましくは、動物油、不法は炭化水素、テルペノイド（例え
ば、スクアレン）または植物油である。この組成物は、好ましくは、０．５〜２
０容量％の油を水性媒体中に含む。この乳化剤は、好ましくは、非イオン性界面
活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノ、ジ、もしくはトリエステ
ルまたはソルビタンモノ、ジもしくはトリエーテル）を含む。好ましくは、その
組成物は、約０．０１重量％〜約０．５重量％の乳化剤を含む。そのオリゴヌク
レオチドは好ましくは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合またはペプチ
ド核酸結合を含む。本発明の好ましい実施形態において、そのオリゴヌクレオチ
ドは、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：配列番号１〜２
８。本発明の他の好ましい実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、２つ
のプリンがそのモチーフの５’直ぐに隣接し、そして２つのピリミジンがそのモ
チーフの３’直ぐに隣接するＣｐＧモチーフを含む。本発明の他の好ましい実施
形態において、そのオリゴヌクレオチドは、以下からなる群より選択されるヌク
レオチド配列を含む：配列番号１９〜２８。配列番号２８において最も好ましい
のは、配列番号２８にである。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、
そのアジュバント組成物は、さらに、別々の免疫刺激剤を含む。この刺激剤は、
好ましくは以下からなる群より選択される：ミョウバン、細菌細胞壁成分、およ
びムラミルペプチド。このアジュバント組成物は、微粒子の形態であり得る。
【００３６】 本発明はまた、免疫原性組成物に関する。この組成物は、免疫刺激量の抗原性
物質、および免疫刺激量の本明細書に記載されるアジュバント組成物を含む。好
ましくは、その抗原性物質は、タンパク質、タンパク質−ポリサッカリド、タン
パク質−リポポリサッカリド、ポリサッカリド、およびリポポリサッカリドから
なる群四厘選択される。本発明のいくつかの実施形態において、その免疫原性組
成物は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとともに、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド
）微粒子に吸着された抗原性物質を含む。この吸着された抗原性物質は、好まし
くは、組換えタンパク質である。本発明の好ましい実施形態において、その抗原
性物質は、ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、単純
ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス（ｆｌｕ）、および狂犬病ウイル
ス）に由来する。好ましくは、その抗原性物質は、ＨＳＶ糖タンパク質ｇＤ、Ｈ
ＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０、およびＨＩＶｐ５５ ｇａｇからなる群より選択
される。本発明の他の好ましい実施形態において、その抗原性物質は、細菌（例
えば、コレラ、ジフテリア、破傷風、百日咳、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏ
ｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎ
ｚａ）に由来する。本発明の他の好ましい実施形態において、この抗原性物質は
、寄生生物（例えば、マラリア寄生生物）に由来する。
【００３７】 本発明はまた、宿主細胞において免疫応答を刺激する方法に関する。この方法
は、その動物に、本明細書において記載される免疫原性組成物を免疫応答を誘発
するに有効な量で投与する工程を包含する。その宿主動物は、好ましくは、哺乳
動物であり、より好ましくはヒトである。
【００３８】 本発明はまた、ウイルス、細菌または寄生生物の感染に対して宿主動物を免疫
する方法に関する。この方法は、その動物に、本明細書に記載される免疫原性組
成物を、保護的応答を誘発するに有効な量で投与する工程を包含する。その宿主
細胞は．好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００３９】 本発明はまた、宿主動物におけるＴｈ１免疫応答を増強する方法に関する。こ
の方法は、その動物に、本明細書に記載される免疫原性組成物を、Ｔｈ１免疫応
答を誘発するに有効な量で投与する工程を包含する。その宿主動物は、好ましく
は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００４０】 本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書における開示に鑑み、当業者
には容易になる。
【００４１】 （発明の詳細な説明） 本発明は、吸着した高分子を有する微粒子が改善された免疫応答を示すこと、
およびＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび代謝可能なな油もしくは生分解性のポリ
間の組合せを含むアジュバントが免疫応答を増強するという驚くべき発見に基づ
く。さらに、吸着された高分子および油エマルジョンの組合せは、強力な免疫応
答を惹起するために有用である。
【００４２】 本発明の実施は、タンパク質に言及しなければ、当該分野内の、化学、高分子
化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬理学の従来の方法を使用する。そ
のような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’
ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏ
ｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ、１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌ
ｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋ
ｗｅｌｌ、編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ、Ｋ．Ｓ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９７）および
Ｓｅｙｍｏｕｒ／Ｃａｒｒａｈｅｒ’ｓ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．、１９９６
）を参照のこと。
【００４３】 本明細書において引用される、すべての刊行物、特許および特許出願は、それ
らが上記であろうと下記であろうと、その全体が本明細書において参考として援
用される。
【００４４】 明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ」
、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかにそうでないことを示さな
い限り、複数の参照形態を包含する。従って、例えば、用語「微粒子」とは、１
つ以上の微粒子などを言及する。
【００４５】 （Ａ：定義） 本発明を記載するにあたり、以下の用語を使用し、そして以下に示されるよう
に定義されることが意図される。
【００４６】 本明細書において使用される場合、用語「微粒子」とは、約１０ｎｍ〜約１５
０μｍの、より好ましくは約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、そして最も好まし
くは約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子をいう。好ましくは、その微粒子は
、針および毛細管を閉塞させることなく、非経口投与または粘膜投与を可能にす
る直径のものである。微粒子サイズは、光子相関比色計、レーザ回折法、および
／または走査電子顕微鏡のような、当該分野において周知の技術によって容易に
決定される。用語「粒子」とはまた、本明細書において定義される微粒子をも言
及するように使用され得る。
【００４７】 本明細書において使用するための微粒子は、滅菌可能で、非毒性であり、そし
て生分解性である材料から形成される。そのような材料としては、限定すること
なく、以下が挙げられる：ポリ（ａ−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポ
リシアノラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ＰＡＣＡ、およびポリシ
アノアクリレート。好ましくは、本発明を用いた使用のための微粒子は、以下に
由来する：ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特に、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）
またはＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドもしくはグリコール酸とのコポリマー（例
えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧ
Ａ」）、またはＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマー。微粒子は、
任意の種々のポリマー性出発物質に由来し得る。これは、種々の分子量を有し、
そしてＰＬＧのようなコポリマーの場合には、種々のラクチド：グリコリド比を
有する。その選択は、大部分選択の問題であって、これは、同時投与される高分
子に一部依存する。これらのパラメータは、以下により詳細に記載される。
【００４８】 本明細書において使用される場合、用語「界面活性剤」とは、表面活性剤（ｓ
ｕｒｆａｃｔａｎｔ）およびエマルジョン安定化剤を包含する。アニオン性界面
活性剤としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：ＳＤＳ、ＳＬＳ、Ｄ
ＳＳ（ジスルホスクシネート）、硫酸化脂肪アルコールなど。カチオン性界面活
性剤としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：セトリミド（ＣＴＡＢ
），塩化ベンザルコニウム、ＤＤＡ（ジメチルジオクトデシルアノもニウムブロ
ミド）、ＤＯＴＡＰなど。非イオン性界面活性剤としては、以下が挙げられるが
それらに限定されない：ソルビタンエステル、ポリソルベート、ポリオキシエチ
ル化グリコールモノエーテル、ポリオキシエチル化アルキルフェノール、ポロキ
サマーなど。
【００４９】 用語「正味の（ｎｅｔ）の正電荷」とは、本明細書において使用される場合、
その微粒子の表面上の電荷がＰＶＡを用いて作られた対応する微粒子の表面上の
電荷よりも正であることを意味する。同様に、陽後「正味の負電荷」とは、本明
細書において使用される場合、その微粒子の表面上の電荷がＰＶＡを用いて作ら
れた対応する微粒子の表面上の電荷よりも負であることを意味する。正味の電荷
は、カチオン性またはアニオン性の界面活性剤を用いて作製されたその微粒子の
ζ電位（動電学的電位ともいわれる）と、ＰＶＡで作製された対応する微粒子と
比較することによって評価され得る。従って、「正味の正電荷」を有する微粒子
表面は、ＰＶＡを用いて作製された微粒子の表面のζ電位よりも大きなζ電位を
有し、そして「正味の負電荷」を有する微粒子表面は、ＰＶＡを用いて作製され
た微粒子の表面のζ電位よりも小さなζ電位を有する。明白なように、本発明の
微粒子についての正味の電荷は、対応するＰＶＡ微粒子のζ電位に比較して算出
される。
【００５０】 用語「ζ電位」とは、本明細書において使用される場合、すべての固体および
液体の界面を横切って存在する電気的電位、すなわち、荷電されたコロイド粒子
を囲むイオンの拡散層を横切る電位をいう。ζ電位は、電気泳動移動度（すなわ
ち、当該分野で周知の技術を用いて測定されるべき表面に接触して配置される荷
電された電極の間をコロイド粒子が移動する速度）から算出され得る。
【００５１】 用語「高分子」とは、本明細書において使用される場合、制限することなく、
医薬、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ホルモン、酵素、転写メディエーター
、翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、免疫調節剤，抗原、アジュバ
ント、またはそれらの組合せを包含する。本発明において使用するための粒子状
の高分子は、以下により詳細に記載される。
【００５２】 用語「医薬（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）」とは、抗生物質、抗ウイルス
剤、増殖因子、ホルモンなどのような生物学的に活性な化合物をいう。これらは
以下により詳細に記載される。
【００５３】 用語「ポリヌクレオチド」とは、生物学的にアッセイな（例えば、免疫原性ま
たは治療的）タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子である。ポリ
ヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの性質に依存して、ポリヌクレ
オチドは、１０ほどのヌクレオチドを含み得、例えば、ここで、ポリヌクレオチ
ドは、抗原をコードする。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、二本鎖および一
本鎖の両方の配列を含み得、そして、以下のことをいうがそれに限定されない：
ウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルス（例え
ば、ＲＮＡおよびＤＮＡのウイルスおよびレトロウイルス）または原核生物ＤＮ
ＡからのゲノムＲＮＡおよびＤＮＡの配列、および特に、合成ＤＮＡ配列。この
用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを包含する配
列を包含し、そしてその核酸分子が、治療的または抗原性のタンパク質をコード
する限り、ネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般
に天然で保存的である）を包含する。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介
して意図的であり得るが、または抗原を生成する宿主の変異を介して偶然であり
得る。
【００５４】 用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを
いい、そして最小限の長さの生成物には限定されない。従って、ペプチド、オリ
ゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、その定義に入る。全長タンパク質お
よびそのフラグメントの両方は、その定義に包含される。この用語はまた、その
タンパク質が免疫学的応答を惹起する能力を維持するか、またはそのタンパク質
が投与される被験体に対する治療的効果を有する限り、ネイティブ配列に対する
改変（例えば、欠失、付加および置換）を包含する（一般に、天然で保存的であ
る）。
【００５５】 「抗原」とは、その抗原が本発明に従って提示されるときの細胞性の抗原特異
的免疫応答または体液性抗体応答を起こすように宿主の免疫系を刺激し得る１つ
以上のエピトープを含む分子を意味する。抗原は、それ自身が、または別の分子
と組み合わせて存在するときに細胞性または体液性応答を惹起し得る。通常、エ
ピトープは、約３〜１５、一般的に約５〜１５のアミノ酸を含む。所定のタンパ
ク質のエピトープは、当該分野において周知の多数のエピトープマッピング技術
を用いて同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ
ｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、直鎖状の
エピトープは、例えば、固体支持体の上で多数のペプチドを同時に合成すること
（そのペプチドはタンパク質分子の部分に対応する）、およびそのペプチドがそ
の支持体になおも付着される間にそのペプチドと抗体とを反応させることによっ
て、決定され得る。そのような技術は当該分野において公知であり、そして例え
ば、以下に記載される：米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１
９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１ ：３９９８−
４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７
０９−７１５、これらすべては、その全体が本明細書において参考として援用さ
れる。同様に、コンフォメーション的エピトープは、アミノ酸の空間的コンフォ
メーションを決定することによって容易に同定される（例えば、Ｘ線結晶学、お
よび二次元核磁気共鳴）。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ、同上を参照のこと。
【００５６】 用語「抗原」とは、本明細書において使用される場合、サブユニット抗原（す
なわち、その抗原が天然で付随する生物全体から分離されそして別個となってい
る抗原）および殺傷され、減弱されまたは不活化された細菌、ウイルス、寄生生
物または微生物をいう。抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントのような
抗体ならびに抗原または抗原性決定基を模倣し得る合成ペプチドミモトープもま
た、本明細書において使用される抗原の定義の中に入る。同様に、インビボ（例
えば、遺伝子治療および核酸免疫適用）治療的または免疫学的タンパク質、また
は抗原性決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、本明
細書における抗原の定義に含まれる。
【００５７】 さらに、本発明の目的のために、抗原は、いくつかの公知のウイルス、細菌、
寄生生物および真菌、ならびに任意の種々の腫瘍抗原のいずれかに由来し得る。
さらに、本発明の目的のために、「抗原」とは、そのタンパク質が免疫学的応答
を惹起する能力を維持する限り、ネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、
付加、および置換（通常天然で保存的である）を包含するタンパク質をいう。こ
れらの改変は、部位特異的変異誘発を介して意図的であり得るが、または抗原を
生成する宿主の変異を介して偶然であり得る。
【００５８】 抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物に存在する分子
に対する体液性および／または細胞性の免疫応答の、被験体における発生をいう
。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子によって媒介され
る免疫応答をいう。他方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他
の白血球によって媒介されるものである。細胞性免疫の重要な１つの局面は、細
胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異性応答を包含する。ＣＴＬは、腫瘍組
織適合性複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質と会合において提示
され、そして細胞の表面に発現されるペプチド抗原について特異性を有する。Ｃ
ＴＬは、微生物の細胞内破壊またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を誘
導しそして促進することを助ける。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞に
よる抗原特異性応答を包含する。ヘルパーＴ細胞は、その表面にＭＨＣ分子と会
合したペプチド抗原を提示する細胞に対して非特異的なエフェクター細胞の機能
を刺激することおよびその活性に焦点を充てることを助けるように作用する。「
細胞免疫応答」とはまた、活性化されたＴ細胞および／またはたの白血球による
、サイトカイン、ケモカインおよび他のそのような分子の産生をいう（これらに
は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものが含まれる）。
【００５９】 細胞性免疫応答を惹起する、組成物（例えば、免疫原性組成物）またはワクチ
ンは、その細胞表面においてＭＨＣ分子との会合において抗原の提示によって脊
椎動物被験体を感作するよう作用し得る。細胞媒介性応答は、その表面において
抗原を提示する細胞に対してまたはその付近に指向される。さらに、抗原特異的
なＴリンパ球は、免疫された宿主の将来の保護を可能にするように生成され得る
。
【００６０】 特定の抗原または組成物が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、多数の
アッセイ（例えば、リンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞障害性
細胞アッセイ）、または感作された被験体において高原について特異的なＴリン
パ球によって決定され得る。そのようなアッセイは、当該分野において周知であ
る。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：
４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２
４：２３６９−２３７６；および以下の例を参照のこと。
【００６１】 従って、本明細書において使用される場合、免疫学的応答とは、ＣＴＬの産生
および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激するものであり得る
。目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答を惹起し得る。従って、免疫学的応答
は、１つ以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／ま
たは目的の組成物もしくはワクチンに存在する抗原に対して特異的に指向される
サプレッサーＴ細胞および／もしくはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感
染性を中和するように作用し得、および／または抗体−補体、または抗体依存性
細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に対する保護を提供する。
そのような応答は、当該分野において周知の標準的な免疫アッセイおよび中和ア
ッセイを用いて決定され得る。
【００６２】 微粒子に対して吸着された、選択された抗原を含む組成物は、それがその微粒
子と会合することなく送達されるときに等量のその抗原によって惹起される免疫
応答よりも多い免疫応答を惹起する能力を有する場合、「増強された免疫原性」
を示す。従って、組成物は、「増強された免疫原性」を示し得る。なぜなら、そ
の抗原は、その微粒子に対する吸着によってより強く免疫原性であるからである
か、またはそれが投与される被験体においてより少ない用量の抗原が免疫応答を
達成するに必要であるからである。そのようなおよび／または図供された免疫原
性は、微粒子／抗原の組成物、および抗原コントロールを動物に投与すること、
および当該分野において周知の放射イムノアッセイおよびＥＬＩＳＡのような標
準的なアッセイを用いてその２つに対する抗体力価を比較することによって決定
され得る。
【００６３】 用語「有効量」または「薬学的有効量」の高分子／微粒子は、本明細書におい
て提供されるように、非毒性であるが所望の応答（例えば、免疫応答）および対
応する治療的効果を提供するのに充分量の高分子／微粒子をいい、または治療タ
ンパク質の送達の場合において、以下に規定するように、その被験体の処置を行
うに充分な量をいう。以下に指摘されるように、必要とされる正確な量は、被験
体の種、年齢および一般的状態、処置される条件の重篤度、および目的の特定の
高分子、投与形態などに依存して、被験体ごとにかわる。個々の症例における適
切な「有効」量は、慣用実験を用いて当業者によって決定され得る。
【００６４】 「脊椎動物被験体」とは、脊椎動物亜門の任意のメンバーを意味する。これに
は、制限することなく、哺乳動物（ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、およびヒ
ト；家庭内動物（イヌ、およびネコ））；および鳥（家庭内、野生および競技用
の鳥（例えば、ニワトリおよび雌ニワトリ（ヒヨコを含む）、シチメンチョウ、
および他の家禽類鳥類）が包含される。この用語は、特定の年齢を意図しない。
従って、成人および新生児の両方が網羅されることが意図される。
【００６５】 「薬学的に受容可能な」または「薬理学的に受容可能な」とは、生物学的また
は他の意味で所望されないものではない物質（すなわち、所望されない生物学的
効果を生ずることもなく、それが含まれる組成物の成分のいずれかとともに有害
な様式で相互作用することもなく、その微粒子処方物とともに固体へ投与され得
る物質）を意味する。
【００６６】 「生理学的ｐＨ」または「生理学的範囲のｐＨ」とは、約７．２〜８．０（両
端含む）の範囲のｐＨ、より代表的には約７．２〜７．６（両端含む）の範囲に
あるｐＨを意味する。
【００６７】 本明細書において使用される場合、「処置」とは以下のいずれかをいう：（ｉ
）伝統的な意味におけるような感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の減少ま
たは除去；および（ｉｉｉ）問題の病原体もしくは障害の実質的もしくは完全な
除去。処置は、予防的（感染前）または治療的（感染後）に行われ得る。
【００６８】 本明細書において使用される場合、用語「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは
それらから形成されたキメラをいう。
【００６９】 本明細書において使用される場合、用語「少なくとも１つのＣｐＧモチーフを
含むオリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む
ポリヌクレオチドをいう。少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレ
オチドは、複数のＣｐＧモチーフを含み得る。これらのオリゴヌクレオチドはま
た、当該分野において、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」として知られる。本明細
書において使用される場合、用語「ＣｐＧモチーフ」とは、シトシンヌクレオチ
ドに続いてグアノシンヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのジヌクレオチド
部分をいう。５−メチルシトシンもまた、シトシンの代わりに用いられ得る。
【００７０】 本明細書において使用される場合、用語「油滴エマルジョン」とは、代謝可能
な油および乳化剤を含むエマルジョンをいう。
【００７１】 本発明のいくつかの実施形態に従って、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、細
菌、または原生生物の感染および腫瘍に対して、予防的および／もしくは治療的
に免疫するか、または治療する組成物および方法が提供される。本発明の方法は
、予防的および／または治療的な免疫を哺乳動物（好ましくは、ヒト）に付与す
るのに有用である。本発明の方法はまた、生体医学研究のためにヒト以外の哺乳
動物において実施され得る。
【００７２】 （Ｂ．一般的方法） （１．吸着された高分子を有する微粒子） 本発明は、本発明のＰＬＡおよびＰＬＧの微粒子が生物学的に活性な高分子を
吸着するという発見に基づく。さらに、これらの微粒子は、より多様な分子（荷
電高分子および／または嵩高い（ｂｕｌｋｙ）高分子を含む）を、ＰＶＡを用い
て調製された微粒子よりも容易に吸着する。従って、本発明の高分子／微粒子を
送達系として使用して、広汎な種々の疾患を処置、予防および／または診断する
ために生物学的に活性な成分を送達し得る。
【００７３】 本発明を用いて、広汎で種々の高分子を送達し得る。これには、以下が挙げら
れるがそれらに限定されない：医薬（例えば、抗生物質および抗ウイルス剤、非
ステロイド抗炎症薬、鎮痛剤、血管拡張剤、心臓血管薬物、向精神薬、神経弛緩
薬、抑鬱剤、抗パーキンソン薬物、βブロッカー、カルシウムチャネルブロッカ
ー、ブラジキニンインヒビター、ＡＣＥインヒビター、血管拡張剤、プロラクチ
ンインヒビター、ステロイド、ホルモンアンタゴニスト、ホルモンアンタゴニス
ト、抗ヒスタミン剤、セロトニンアンタゴニスト、ヘパリン、化学療法剤、抗新
生物剤、および成長因子・増殖因子（以下を含むがそれらに限定されない：ＰＤ
ＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２、ＦＧＦ）、治療剤または
免疫原性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ワクチンにおいて使用する
ための免疫原性タンパク質およびそのエピトープ、ペプチドホルモン（例えば、
インスリン、プロインスリン、成長ホルモン、ＧＨＲＨ、ＬＨＲＨ、ＥＧＦ、ソ
マトスタチン、ＳＮＸ−１１１、ＢＮＰ、インスリノトロピン、ＡＮＰ、ＦＳＨ
、ＬＨ、ＰＳＨ およびｈＣＧ、性腺ステロイドホルモン（アンドロゲン、エス
トロゲン、およびプロゲステロン）、甲状腺刺激ホルモン、インヒビン、コレシ
スキニン、ＡＣＴＨ、ＣＲＦ、ジノルフィン、エンドルフィン、エンドセリン、
フィブロネクチンフラグメント、ガラニン、ガストリン、インスリノトロピン、
グルカゴン、ＧＴＰ結合タンパク質フラグメント、グアニリン、ロイコキニン、
マガイニン、マストラパン、デルマセプチン、システミン、ニューロメジン、ニ
ューロテンシン、パンクレアスタチン、膵臓ポリペプチド、サブスタンスＰ、セ
クレチン、チモシンなど）を含むホルモン、酵素、転写メディエーター、翻訳メ
ディエーター、代謝経路の中間体、免疫調節剤（例えば、種々のサイトカイン（
例えば、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３
、インターロイキン−４、およびγインターフェロン））、抗原、およびアジュ
バント。
【００７４】 好ましい実施形態において、高分子は抗原である。本発明の特定の利点は、吸
着された抗原を有する微粒子が細胞媒介性応答を脊椎動物被験体において生成す
る能力である。本発明の抗原／微粒子が選択された抗原に対する細胞媒介性免疫
応答を惹起する能力は、広汎で種々の病原体による感染に対する強力なツールで
ある。従って、本発明の抗原／微粒子は、ワクチン組成物へと取り込まれ得る。
【００７５】 従って、慣用の抗体応答に加えて、本明細書において記載される系は、例えば
、クラスＩＭＨＣ分子との発現された抗原の会合を提供し、その結果、目的の抗
原に対するインビボ細胞性免疫応答が惹起され得、これが、ＣＴＬの産生を刺激
して、その抗原の将来の認識を可能にする。さらに、この方法は、抗原特異的な
応答をヘルパーＴ細胞によって惹起させ得る。従って、本発明の方法は、任意の
高分子との用途が見出される。その用途について、細胞性および／または体液性
の免疫応答が所望され、好ましくは、抗体を惹起し得るウイルス病原体、Ｔ細胞
ヘルパーエピトープおよびＴ細胞細胞傷害性エピトープに由来する抗原が所望さ
れる。そのような抗原としては、ヒトおよび動物のウイルスが挙げられるがそれ
らに限定されず、そして構造または非構造的なタンパク質のいずれかに対応し得
る。
【００７６】 本発明の微粒子は、細胞内のウイルスに対する免疫のために特に有用である。
このウイルスは、通常貧弱な免疫応答を惹起する。例えば、本発明は、ヘルペス
ウイルス科に由来する広汎な種々のタンパク質に対する免疫応答を刺激するため
の用途を見出す：単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型に由来するタ
ンパク質（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよび
ｇＨ；水痘‐帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ
）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原（ＣＭＶ ｇＢおよび
ｇＨを含む）；ならびに他のヒトヘルペスウイルスに由来する抗原（例えば、Ｈ
ＨＶ６およびＨＨＶ７）。（例えば、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒ
ｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ、編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
１９９０）ｐｐ．１２５−１６９を、サイトメガロウイルスの内容物をコード
するタンパク質の概説について参照のこと；ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１−１５７４を、種々のＨＳＶ−１コード
タンパク質の概説について参照のこと；米国特許第５，１７１，５６８号を、Ｈ
ＳＶ−１およびＨＳＶ−２ ｇＢおよびｇＤのタンパク質ならびにそれらをコー
ドする遺伝子の議論について参照のこと；Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４
）３１０：２０７−２１１を、ＥＢＶゲノムにおける配列をコードするタンパク
質の同定について参照のこと；ならびにＤａｖｉｓｏｎおよび Ｓｃｏｔｔ、Ｊ
．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９−１８１６を、ＶＺＶの概
説について参照のこと）。
【００７７】 ウイルスの肝炎ファミリー（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス
（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、δ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型
肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ））からの抗原もまた
、本明細書において記載される技術において簡便に使用され得る。例えば、ＨＣ
Ｖのウイルスゲノム配列は公知であり、同様に、その配列を取得する方法も公知
である。例えば、国際公開ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およ
び ＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶゲノムは、ウイルスタンパク質
（Ｅ１（Ｅとしても知られる）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳＩとしても知られる）お
よびＮ末端核キャプシドタンパク質（「コア」と称する）を含む（Ｈｏｕｇｈｔ
ｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８を、Ｅ１およ
びＥ２を含むＨＣＶタンパク質の議論について参照のこと）。これらのタンパク
質の各々およびその抗原フラグメントは、この組成物および方法において用途を
見い出す。
【００７８】 同様に、ＨＤＶからのδ抗原についての配列が公知である（例えば、米国特許
第５，３７８，８１４号を参照のこと）。そして、この抗原はまた、この組成物
および方法において簡便に使用され得る。さらに、ＨＢＶに由来する抗原（例え
ば、コア抗原、表面抗原ｓＡｇ、ならびにプレ表面配列、ｐｒｅ−Ｓ１およびｐ
ｒｅ−Ｓ２（以前ｐｒｅ−Ｓと呼ばれた））、ならびに上記の組合せ（例えば、
ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ
−Ｓ２およびｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２）は、本明細書において用途が見出さ
れる。例えば、「ＨＢＶ Ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ ｔｏ ｌｉｃｅｎｓｅ：ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ」ｉｎ Ｍａｃｋ
ｅｔｔ、Ｍ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ、Ｊ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃ
ｉｎｅｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ、ｐｐ．１５９−１７６を、ＨＢＶ
の構造の議論について；ならびに米国特許第４，７２２，８４０号，第同５，０
９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号（これらは、本明細書において、参
考としてそのすべてが援用される）；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９
９５）６９：６８３３ ６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１
９９０）６４：３３１９−３３３０；ａｎｄ Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（
１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００７９】 他のウイルスに由来する抗原もまた、請求された組成物および方法における用
途を見い出す（例えば、限定されることなく、とりわけ以下の科Ｐｉｃｏｒｎａ
ｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルスなど）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ
；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）；Ｆ
ｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ
；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、狂犬病
ウイルスなど）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（
例えば、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；Ｏｒｔｈ
ｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型および
Ｃ型など）；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｔｒ
ｏｖｉｒａｄａｅ（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴ
ＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲ、などとしても知られる））（これら
は以下を含むがそれらに限定されない：単離体ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶL AV 、ＨＩＶLAI、ＨＩＶMN）；ＨＩＶ−１CM235、ＨＩＶ−ｌUS4；ＨＩＶ−２か
らの抗原；シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のメンバーからのタンパク質）
。さらに、抗原もまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびダニ媒介脳炎
ウイルスに由来し得る。例えば Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌ
ｉｋ編 １９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２ｎｄ Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ、編 １９
９１）を、これらおよび他のウイルスの説明について参照のこと）。
【００８０】 より詳細には、上記のいずれかのＨＩＶ単離体からのｇｐ１２０エンベロープ
タンパク質（ＨＩＶの種々の遺伝子サブタイプのメンバーを含む）が知られ、そ
して報告されている（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｔａ
ｂａｓｅ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈ
ｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ、１９９０、Ｌｏｓ
Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ａｎｄ Ｍｏｄｒｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９
８７）６１ ：５７０−５７８を、種々のＨＩＶ単離体のエンベロープタンパク
質の比較について参照のこと）。そしてこれらの単離体のいずれかに由来する抗
原は、本方法において用途が見出される。さらに、本発明は、ｇｐ１６０および
ｇｐ４１のような任意の種々のエンベロープタンパク質、ｐ２４ｇａｇおよびｐ
５５ｇａｇのようなｇａｇ、ならびにｐｏｌ領域に由来するタンパク質を含む。
【００８１】 インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である
。具体的には、インフルエンザＡのそのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮ
Ａは、免疫応答を生成することについて特に有用である。インフルエンザＡの多
数のＨＡサブタイプが同定された（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９
９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら，「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖ
ａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｙｐｅ Ａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕ
ｓｅｓ，」ｐ．１２７−１６８．Ｉｎ：Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｋ
ｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉ
ｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと
）。従って、これらの単離体のいずれかに由来するタンパク質もまた、本明細書
において記載される組成物および方法において使用され得る。
【００８２】 本明細書において記載される組成物および方法はまた、多数の細菌抗原を用い
た用途を見い出す（例えば、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜
炎および他の病原状態を引き起こす生物（限定することなく、以下を包含する：
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｅｓ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅ
ａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、および Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｔｙ
ｐｅ Ｂ（ＨＩＢ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）からのものお
よびそれらの組合せ）。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｂか
らの抗原の例は、以下の共有に係る特許出願に開示されている：ＰＣＴ／ＵＳ９
９／０９３４６；ＰＣＴＩＢ９８／０１６６５；ＰＣＴＩＢ９９／００１０３；
および以下の米国仮特許出願６０／０８３，７５８；６０／０９４，８６９；６
０／０９８，９９４；６０／１０３，７４９；６０／１０３，７９４；６０／１
０３，７９６；および６０／１２１，５２８）。寄生生物抗原の例としては、マ
ラリアおよびライム病を引き起こす生物に由来するものが挙げられる。
【００８３】 本発明を使用して広汎な種々の高分子を送達し得ること、およびそれゆえ大多
数の疾患を処置、予防および／または診断し得ることは容易に明らかである。代
替の実施形態において、本発明の高分子／微粒子組成物は、部位特異的な標的化
送達について使用され得る。例えば、高分子／微粒子組成物の静脈内投与は、肺
、肝臓、脾臓、血液循環または骨髄を標的化するために使用され得る。
【００８４】 吸着剤微粒子の表面（または、本発明のミクロエマルジョン）に対する高分子
の吸着は、以下を含むがそれらに限定されない任意の結合相互作用機構によって
生じる：イオン結合、水素結合、共有結合、ファンデルワールス結合、および親
水性／疎水性相互作用を介した結合。当業者は、吸着されるべき高分子の型につ
いて適切な界面活性剤を容易に選択し得る。
【００８５】 例えば、荷電界面活性剤（例えば、アニオン性界面活性剤またはカチオン性界
面活性剤）の存在で製造される微粒子は、正味の負電荷または正味の正電荷を有
する表面を有する微粒子である。これは、広汎で種々の分子を吸着し得る。例え
ば、アニオン性界面活性剤を用いて製造される微粒子（例えば、ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）、すなわちＳＤＳ−ＰＬＧ微粒子）は、正に荷電した抗原（
例えば、タンパク質）を吸着する。同様に、カチオン性界面活性剤（例えば、ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）（すなわち、ＣＴＡＢ
−ＰＬＧ微粒子））を用いて製造される微粒子は、負に荷電した分子（例えば、
ＤＮＡ）を吸着する。吸着されるべき高分子が正電荷および負電荷の領域を有す
る場合、カチオン性またはアニオン性の界面活性剤が適切であり得る。
【００８６】 本発明とともに使用するための微粒子を製造するための生分解性ポリマーは、
以下から簡便に市販されている：例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈ
ｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ およびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉ
ｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ。例えば、本明細書における微粒子を形成
するための有用なポリマーは、以下に由来するものを包含する：ポリヒドロキシ
ブチル酸；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；ポリ無水物；およびポリ
（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチ
ド）（本明細書において両方とも「ＰＬＡ」として知られる）、ポリ（ヒロドキ
シブチレート）、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのコポリマー（例えば、ポ
リ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（本明細書において「ＰＬＧ」または
「ＰＬＧＡ」と指定される）、またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンの
コポリマー。本明細書における使用について特に好ましいポリマーは、ＰＬＡお
よびＰＬＧのポリマーである。これらのポリマーは、種々の分子量で利用可能で
あり。そして所定の使用のための適切な分子量は、当業者に容易に決定される。
従って、例えば、ＰＬＡについて、適切な分子量は、約２０００から５０００の
オーダーにある。ＰＬＧについて、適切な分子量は、一般に、約１０，０００か
ら約２００，０００の範囲にあり、好ましくは、約１５，０００から約１５０，
０００の範囲にあり、そして最も好ましくは約５０，０００から約１００，００
０の範囲にある。
【００８７】 コポリマー（例えば、ＰＬＧ）が微粒子を形成するために使用される場合、種
々のラクチド：グリコリド比が本明細書において有用であり、そしてその比は大
いに選択の問題であり、これは、同時投与される高分子および所望される分解速
度に部分的に依存する。例えば、５０：５０ ＰＬＧポリマー（５０％のＤ，Ｌ
−ラクチドおよび５０％グリコリドを含む）は、迅速な吸着コポリマーを提供す
るが、７５：２５ ＰＬＧ は、よりゆっくり分解し、そして８５：１５および
９０：１０は、なおいっそうゆっくりと分解する。これは、増加したラクチド成
分に起因する。これは、適切な比のラクチド：グリコリドは、当業者によって、
抗原の性質および問題の障害に基づいて容易に決定される。さらに、抗原または
アジュバントが微粒子に捕捉される本発明の実施形態において、変動するラクチ
ド：グリコリドの比を有する微粒子の混合物は、本明細書において、所定の高分
子について所望の放出反応速度論を達成するため、ならびに一次および二次の免
疫応答の両方を提供するための用途を見出す。本発明の微粒子の分解速度はまた
、ポリマーの分子量およびポリマーの結晶性のような因子によって制御され得る
。変動するラクチド：グリコリド比および分子量を有するＰＬＧコポリマーは、
以下を含む多数の供給源から市販される：Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈ
ｅｉｍ、ＧｅｒｍａｎｙおよびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎ
ｃ．Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ。これらのポリマーはまた、以下に記載される
ような当該分野において周知の技術を用いて乳酸成分の単純な重縮合によって合
成され得る：たばたら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８８）
２２：８３７−８５８。
【００８８】 高分子／微粒子は、当該分野において周知のいくつかの方法のいずれかを用い
て調製される。例えば、二重エマルジョン／溶媒エバポレーション技術（例えば
、以下に記載されるもの：米国特許第３，５２３，９０７号およびＯｇａｗａら
、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３は
、本明細書において使用されて、微粒子が作製され得る。これらの技術は、以下
からなる群より選択される一次エマルジョンの形成を包含する。これは、次いで
、粒子安定化剤／表面活性剤を含む連続水相と混合される。
【００８９】 あるいは、以下に記載されるように、水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒エバポレ
ーション系を使用して、微粒子を形成し得る：Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎ
ｅ（１９９３）１１：９６５−９６９およびＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒ
ｅｓ．（１９９３）１０：３６２。この技術において、この特定のポリマーは、
酢酸エチル、ジメチルクロリド（塩化メチレンおよびジクロロメタンとも呼ばれ
る）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなどの有機溶媒と合わされる。
このポリマーは、約１〜３０％、好ましくは約２〜１５％、より好ましくは約３
〜１０％、そして最も好ましくは約４％の溶液中、有機溶媒中に提供される。こ
のポリマー溶液は、例えば、ホモジナイザを用いて乳化される。次いで、このエ
マルジョンは、必要に応じて、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピ
ロリドン、ならびにカチオン性、アニオン性または非イオン性の界面活性剤のよ
うなエマルジョン安定剤の大容量の水溶液と合わせられる。このエマルジョンは
、１を超えるエマルジョン安定剤および／または界面活性剤（例えば、ＰＶＡお
よび界面活性剤の組合せ）と合わせられ得る。特定の高分子は、安定剤および／
または界面活性剤の組合せを有する微粒子により容易に吸着され得る。エマルジ
ョン安定剤が使用される場合、代表的には、約２〜１５％溶液、より代表的には
約４〜１０％溶液中に提供される。一般に、約１から約０．１：１の範囲内の重
量対重量での界面活性剤対ポリマーの比が使用され、より好ましくは、約０．０
０１：１から約０．０１：１の範囲、そしてさらにより好ましくは約０．００５
：１から約０。０１：１の範囲内のものが使用され得る。次いで、この混合物は
、ホモジナイズされて、安定なｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンが生成する。次いで
、有機溶媒がエバポレートされる。
【００９０】 処方物のパラメータは、０．０５μｍ（５０ｎｍ）のオーダーの小さな微粒子
からそれより大きな微粒子の５０μｍよりさらに大きなものへの調製を可能にす
るように操作され得る。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１
９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（
１９９６）を参照のこと。例えば、減少された攪拌は、より大きな微粒子を生じ
る。なぜなら、内部相の容量が増加するからである。小さな粒子は、高濃度のエ
マルジョン安定剤を有する水性相の容量を減らすことによって生成される。
【００９１】 微粒子はまた、以下のように形成され得る：例えば、Ｔｈｏｍａｓｉｎら、Ｊ
．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９６）４１：１３１；米国特許
第２，８００，４５７号；Ｍａｓｔｅｒｓ、Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒａｙ Ｄｒ
ｙｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるようなス
プレー乾燥およびコアセルベーションを用いる；Ｈａｌｌら、（１９８０）Ｔｈ
ｅ 「Ｗｕｒｓｔｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ」ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｔｈｅｏｒｙ、ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編）、第２巻、ｐｐ
．１３３−１５４ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄ
ａ ａｎｄ Ｄｅａｓｙ、Ｐ．Ｂ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ
Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９８８）Ｓ（２）：９９−１３９に記載される
ようなパンコーティング（ｐａｎ ｃｏａｔｉｎｇ）およびＷｕｒｓｔｅｒコー
ティングのような空気懸濁コーティング技術；ならびに例えば、Ｌｉｍら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ（１９８０）２１０：９０８−９１０に記載されるようなゲル化。
【００９２】 粒子サイズは、例えば、レーザー光散乱によって、例えば、ヘリウム−ネオン
レーザーを取り込んだ分光光度計を用いて測定され得る。一般に、粒子サイズは
、室温で測定され、そして粒子の直径についての平均値を得るために問題のサン
プルの複数の分析を包含する（例えば、５−１０回）。粒子のサイズはまた、走
査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて容易に決定される。
【００９３】 本発明の代替の実施形態は、イオン表面活性剤を有するサブミクロンのエマル
ジョンを含む微粒子調製物である。ＭＦ５９または他のものは基本的な粒子とし
て使用され得るが、イオン性表面活性剤は、以下を包含し得るがそれに限定され
ない：ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、
ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＥＰＣ）およびジ
オレオイル−ホスファチジン酸（ＤＰＡ）。これらは各々、スクアレン中で可溶
性である。プロトタイプのイオン性エマルジョンは、４−５２ｍｇ／ｍｌスクア
レンの範囲の濃度で、スクアレン／１０％Ｓｐａｎ８５中に界面活性剤の各々を
溶解することによって処方され得る。スクアレン／表面活性剤混合物は、０．５
％ Ｔｗｅｅｎ８０／Ｈ2０と、５ｍｌスクアレン／１００ｍｌ Ｈ2０で乳化さ
れ得る。予備エマルジョンは、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザを用いたホモジ
ナイゼーション（５分、５０００ＲＰＭ）によって処方され得、そして最終のエ
マルジョンは、微小流動化によって作製され得る（約１０，０００ｐｓｉ、５回
通過、微小流体化器 １１０Ｓ）。
【００９４】 調製後、微粒子は、そのまま保存され得るか、または将来の使用のために凍結
乾燥され得る。微粒子に対して高分子を吸着させるために、その微粒子調製物は
、目的の高分子と単に混合され、そして得られた処方物を再び使用前に凍結乾燥
され得る。一般に、高分子を、その微粒子に添加して約１から０．２５：１の、
好ましくは１から０．１の、より好ましくは、０．０１から０．０５の、高分子
対微粒子の重量対重量比を有する吸着された高分子を有する微粒子を得る。微粒
子の高分子含量は、標準的な技術を用いて決定され得る。
【００９５】 本発明の微粒子は、その中に捕捉またはカプセル化された高分子、およびそこ
に吸着された高分子を有し得る。従って、例えば、当業者は、本発明に従って、
そこの吸着されたタンパク質を有するカプセル化されたアジュバントを有する微
粒子、またはそこに吸着されたアジュバントを用いてカプセル化されたタンパク
質を有する微粒子を調製し得る。
【００９６】 一旦高分子が吸着した微粒子が生成されると、その微粒子は、薬学的組成物ま
たはワクチンへと処方されて、広汎で種々の障害を、上記に記載されるように処
置、予防および／または診断する。その組成物は、一般に、１つ以上の薬学的賦
型剤またはビヒクル（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレング
リコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）を含有する。さらに、補助的物質（
例えば、湿潤剤または乳化剤）、生物学的緩衝化物質などが、そのようなビヒク
ル中に存在し得る。生物学的緩衝液は、薬学的に受容可能であり、そして所望の
ｐＨ（すなわち、生理学的範囲のｐＨ）を有する処方物を提供する、実質的に任
意の溶液であり得る。緩衝溶液の例は、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、
Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水、ハンクス緩衝化生理食塩水などを包含する。
【００９７】 アジュバントを使用して、薬学的組成物の有効性を向上させ得る。このアジュ
バントを、例えば、同じ組成物または別個の組成物中で、本発明の微粒子ととも
に同時に投与し得る。あるいは、アジュバントは、本発明の微粒子組成物の前ま
たは後に投与され得る。別の実施形態において、免疫学的アジュバントのような
アジュバントは、微粒子中でカプセル化され得る。アジュバントは、任意の高分
子と同様に、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかを用いて微粒子中にカ
プセル化され得る。例えば、米国特許第３，５２３，９０７号；Ｏｇａｗａら、
Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３；Ｏ
’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９ ａｎｄ
Ｊｅｆｆｅｒｅｙら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２を参照の
こと。あるいは、アジュバントは、任意の高分子について上気されるようにその
微粒子上に吸着され得る。あるいは、アジュバントは、本発明の油滴エマルジョ
ンを含み得る。
【００９８】 免疫学的アジュバントとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：
（１）アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸ア
ルミニウム、硫酸アルミニウムなど；（２）水中油エマルジョン処方物（ムラミ
ルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分のような他の特異的免疫
刺激剤のあるなし）（例えば、（ａ）Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙ 微小流体化器（ｍ
ｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、
ＭＡ）のような微小流体化器を用いてサブミクロン粒子へと処方された、５％ス
クアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５（必要に応じ
て、種々の亮のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含むが必要ではない）を含
有する、ＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７号）、（ｂ）微小流体化
されてサブミクロンエマルジョンとされたか、またはボルテックスされてより大
きな粒子サイズのエマルジョンが生成された、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗ
ｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤ
Ｐ（以下を参照のこと）を含有する、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、
０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノリン脂質（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ
ｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁
骨格（ＣＷＳ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘTM）からなる群より
選択される１つ以上の細菌細胞壁成分を含有する、Ｒｉｂｉアジュバント系（Ｒ
ＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）（本明
細書における使用のための適切なサブミクロン水中油エマルジョンのさらなる議
論については、以下の共有に係る特許出願番号を参照のこと： ０９／０１５，
７３６（１９９８年１月２９日出願））；（３）サポニンアジュバント（例えば
、Ｑｕｉｌ ＡまたはＱＳ２１（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM（Ｃａｍｂｒｉｄ
ｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ））が使用され得るか
、またはそれからＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）のような粒子が生成され得る）
；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュ
バント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１
、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死
因子（ＴＮＦ）など）；（６）無毒化した細菌ＡＤＰリボシル化毒素（例えば、
コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素
（ＬＴ）の変異体（特に、ＬＴ−Ｋ６３（ここで、リジンが６３位の野生型アミ
ノ酸に取って代わる）、ＬＴ−Ｒ７２（ここで、アルギニンが７２位の野生型ア
ミノ酸に取って代わる）、ＣＴ−Ｓ１０９（セリンが１０９位の野生型アミノ酸
に取って代わる）およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（リジンが９位の野生型アミノ酸
に取って代わり、グリシンが１２９位のものに取って代わる））、（例えば、国
際公開番号Ｗ０９３／１３２０２ および Ｗ０９２／１９２６５を参照のこと
）；（７）ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび他の免疫刺激配列（ＩＳＳ）；なら
びに（８）その組成物の有効性を向上させる免疫刺激剤として働く他の物質。ミ
ョウバンおよびＭＦ５９が好ましい。
【００９９】 ムラミルペプチドとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない： Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤ
Ｐ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏ
ｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−
Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒド
ロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン （ＭＴＰ−ＰＥ）など。
【０１００】 アジュバントのさらなる例について、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｔｈｅ
Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐ
ｏｗｅｌｌ、Ｍ．Ｆ．ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ、Ｍ．Ｊ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅ
ｓｓ、１９９５）を参照のこと。
【０１０１】 この組成物は、「治療有効量」の目的の高分子を含む。すなわち、ある量の高
分子／微粒子が組成物に含まれ、これは、症状を予防、低減、除去または診断す
るために、十分な応答を生成することを被検体を引き起こす。必要な正確な量は
、とりわけ、処置される被検体；処置される被検体の年齢および一般状態；処置
される状態の重篤度；免疫学的応答の場合における、被検体の免疫系が抗体を合
成する能力；所望される保護の程度、ならびに選択される特定の抗原およびその
投与形態に依存して変動する。適切な有効量は、当業者に容易に決定され得る。
従って、「治療有効量」は、慣用的な試行を通じて決定され得る比較的広範囲に
入る。例えば、高分子がポリヌクレオチドである場合の本発明の目的について、
有効用量は、代表的に、約１ｎｇから約１ｍｇの、より好ましくは約１０ｎｇか
ら約１μｇの、そしてより好ましくは、約５０ｎｇから約５００ｎｇの、１用量
あたりに送達される高分子の範囲であり；高分子が抗原である場合、有効用量は
、代表的に、１μｇから約１００ｍｇの、より好ましくは約１０μｇから約１ｍ
ｇの、そして最も好ましくは約５０μｇから約５００μｇの範囲の、１用量あた
りに送達される高分子の範囲である。
【０１０２】 一旦処方されると、本発明の組成物は、非経口的に投与され得る（例えば、注
射）。この組成物は、経皮的、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかで注射
され得る。投与の他の形態は、経鼻、経口、および肺への投与、坐剤ならびに経
皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）ならびに塗
布を包含する。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュー
ルであり得る。複数回用量スケジュールは、主要な投与処置は、１から１０の別
個の用量を用いてであり得、続いて他の用量が、引き続き治療応答をを維持およ
び／または強制するために選択された時間間隔で与えられ得る（例えば、数カ月
後に第二用量として１から４カ月で引き続きの用量）。この投薬レジメンはまた
、少なくとも部分的に、被検体の必要によって決定され、そして実行者の判断に
依存する。
【０１０３】 さらに、疾患の予防が所望される場合、ワクチンにおける高分子は、一般に、
目的の病原体を用いた主要な感染の前に投与される。処置が所望される場合（例
えば、再発の症状の減少）、高分子は、一般的に主要な幹線の後に投与される。
【０１０４】 （２．油滴エマルジョン） 本発明の別の実施形態において、油滴エマルジョンは、代謝可能な油および乳
化剤を含ませて調製される。少なくとも１つのＣｐＧを含むオリゴヌクレオチド
のような分子は、油滴エマルジョンと合わせらて、アジュバントを形成し得る。
油滴エマルジョンは好ましくは、代謝可能な油および乳化剤を含む。ここで、油
および乳化剤は、油滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在する。この油滴
は実質的にすべてが、直径１ミクロン未満である。そのような小滴は、油および
乳化剤を含むアジュバント組成物よりも驚くほどの優越性を示す。ここで、油滴
は、本発明によって提供されるものよりも有意に大きい。好ましい実施形態にお
いて、そのエマルジョンは、カチオン正解面活性剤が乳化剤として使用される結
果として正に荷電されているか、または代替的に、乳化剤とは別個のカチオン性
界面活性剤を含む。これは、ヌクレオチド抗原性分子（例えば、ＣｐＧオリゴヌ
クレオチドまたはウイルスＤＮＡ）の吸着を可能にする。あるいは、アニオン性
界面活性剤の使用は、タンパク質のような分子の吸着を可能にする。
【０１０５】 本発明のアジュバント組成物の個々の成分は公知であるが、そのような組成物
は、同様の様式では組み合わされてこなかった。従って、個々の成分は、一般的
におよび好ましい実施形態についていくらか詳細にの両方で以下に記載されてい
るが、当該分野において周知であり、そして本明細書において使用される用語（
例えば、代謝可能な油、乳化剤、免疫刺激剤、免疫刺激剤、ムラミルペプチド、
および脂溶性ムラミルペプチド）は、さらなる説明なしに、当業者にとって、こ
れらの化合物を記載することが十分に周知である。
【０１０６】 これらの組成物の１成分は、代謝可能な、非毒性油、好ましくは約６から約３
０炭素原子の１つ（以下を含むがそれらに限定されない：アルカン、アルケン、
アルキン、および対応する酸およびアルコール、それらのエーテルおよびエステ
ル、ならびにそれらの混合物）である。その油は、植物油、魚油、動物油、また
は合成調製された油であって、アジュバントが投与される宿主動物の体内で代謝
され得そしてその被検体にとって非毒性であるもののいずれかであり得る。宿主
細胞は、代表的に、哺乳動物であり、そして好ましくはヒトである。ミネラルオ
イルおよび類似の毒性石油蒸留油は、本発明から明示的に除外される。
【０１０７】 本発明の油成分はまた、任意の長鎖アルカン、アルケンまたはアルキンまたは
その酸もしくはアルコール誘導体（これは、遊離酸、その塩またはモノエステル
、ジエステルもしくはトリエステルのようなエステル（例えば、とりグリセリド
および１，２−プロパンジオールまたは類似のポリヒドロキシアルコール））で
あり得る。アルコールは、アミノ官能または多官能酸（例えば、酢酸、プロパン
酸、クエン酸など）を用いてアシル化され得る。長鎖アルコールに由来するエー
テルであって本明細書において使用される油でありそしてその他の基準を満たす
ものもまた使用され得る。
【０１０８】 個々のアルカン、アルケン、またはアルキンの部分およびその酸またはアルコ
ール誘導体は、一般に、約６から約３０炭素原子を有する。この部分は、直鎖ま
たは分岐鎖の構造を有し得る。これは、完全に飽和され得、または１つ以上の二
重結合もしくは三重結合を有し得る。モノエステルまたはポリエステルあるいは
エーテルベースの油が使用される場合、約６から約３０炭素原子の限定は、個々
の脂肪酸または脂肪アルコール部分に適用され、全体の炭素数には適用されない
。
【０１０９】 任意の代謝可能な油、特に動物、魚または植物の供給源に由来するものが本明
細書において使用され得る。その油は、投与される宿主によって代謝されること
が必須であり、そうでなければ、その油成分は、腫瘍、肉芽腫または癌腫でさえ
生じ得るか、または（動物医療で使用される場合）ワクチン摂取された鳥類およ
び動物の肉が、代謝されない油が消費者に対して与え得る有害効果に起因してヒ
トでの消費に受容可能でなくなり得る。
【０１１０】 植物油の例示的供給源としては、堅果、種子および穀物種子（ｇｒａｉｎ）が
挙げられる。ピーナツ油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブが最も共通
して利用可能である、堅果油を例示する。種子油としては、ベニバナ油、綿実油
、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが挙げられる。穀物種子油の群には、コーン油が
最も容易に利用可能であるが、他の穀物の種子（例えば、コムギ、オーツムギ、
ライムギ、イネ（コメ）、テフ、ライコムギなどもまた使用され得る。
【０１１１】 植物油を取得するための技術は十分に開発されており、そして周知である。こ
れらおよび他の類似の油の組成は、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘに見出され
得、そして植物、栄養および植物技術における原料物質である。
【０１１２】 グリセロールと１，２−プロパンジオールとの６から１０の炭素脂肪酸エステ
ルは、種子油には天然に存在しないが、堅果および種子の油からの適切な出発物
質の加水分解、分離およびエステル化によって調製され得る。これらの生成物は
、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）という名称で、ＰＶＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ、Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
、４１６ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｂｏｏｎｇｏｎ、ＮＪなどから市
販されている。
【０１１３】 動物供給源に由来する油もまた、本発明のアジュバントおよび免疫原性組成物
において使用され得る。動物油および脂肪は、それらがトリグリセリドとして存
在し、そして油または植物からの油よりも高い程度の飽和度を有するという事実
に起因して、生理的な温度では通常固体である。しかし、その脂肪酸は、部分的
または完全なトリグリセリドのサポニン化（遊離脂肪酸を提供する）によって動
物から入手可能である。哺乳動物乳汁からの脂質および油は代謝可能であり、そ
してそれゆえ、本発明の実施において使用され得る。分離、精製、サポニン化の
ための手段、および動物供給源から純粋な油を入手するたに必要な他の手順は当
該分野で周知である。
【０１１４】 ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油
、サメ肝油、および鯨油（例えば、鯨脳）は、本明細書において使用され得る魚
油のいくつかを例示する。多数の分岐鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的
に合成され、そして一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン（
２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，
２２−テトラコサヘキサエン）（これは、本明細書において特に好ましい）と呼
ばれる分岐不飽和テルペノイドを含有する。スクアレンに対する飽和アナログで
あるスクアランもまた、特に好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを
含む魚油は、商業供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野における
公知の方法によって入手され得る。
【０１１５】 これらのアジュバントおよび免疫原性組成物の油成分は、約０．５容量％から
約２０容量％の量で存在するが、好ましくは、１５％以下であり、特に約１％か
ら約１２％である。約１％から約４％の油を使用することが最も好ましい。
【０１１６】 これらのアジュバント組成物の水性部分は、好ましくは緩衝化生理食塩水であ
るか、または好ましくは、純水である。これらの組成物は、非経口的投与につい
て意図されることから、免疫原性組成物として最終の緩衝化された溶液を構成し
て、その等張性（すなわち、重量オスモル濃度）を、通常の生理学的流体と本質
的に同じようにさせて、その組成物と生理学的流体との間の異なるイオン濃度に
ついて、その組成物の投与後の膨張または迅速な吸収を予防することが好ましい
。通常の生理学的条件と適合するｐＨを維持するためにその生理食塩水を緩衝化
することもまたこのましい。また、特定の場合において、糖ペプチドのような特
定の組成物成分の安定性を確保するために特定のレベルでｐＨを維持することが
必要であり得る。
【０１１７】 任意の生理学的に受容可能な緩衝剤は、本明細書において使用され得るが、リ
ン酸緩衝剤が好ましい。他の受容可能な緩衝剤（例えば、酢酸、ｔｒｉｓ、重炭
酸、炭酸など）も、リン酸緩衝剤の代替として使用され得る。水性成分のｐＨは
、好ましくは、約６．０から８．０の間である。
【０１１８】 しかし、ミクロエマルジョンがまず調製される場合、純水が、エマルジョンの
水性成分として好ましい。塩濃度を増加させることで、所望の小滴サイズを達成
することはより困難となる。最終の免疫原性組成物がアジュバントから調製され
る場合、免疫原性の材料が適切な重量オスモル濃度で緩衝液中に添加されて、所
望の免疫原性組成物を提供し得る。
【０１１９】 これらの組成物において使用される水性成分の品質は、その組成物の価値を均
一へともたらすのに必要な量である。すなわち、１００％とするに十分な水性成
分のある量が上記の列挙される他の成分とともに混合され、その組成物がある容
量へともたらされる。
【０１２０】 乳化剤および懸濁剤のかなりの数が、一般に、医薬品科学で使用されている。
これらとしては、天然に由来する物質（例えば、樹木からのゴム、植物タンパク
質、糖ベースのポリマー（例えば、アルギネートおよびセルロース）など）が挙
げられる。特定のオキシポリマーまたは炭素骨格に水酸化置換基もしくは他の親
水性置換基を有するポリマーは、表面活性活性を有する（例えば、ポビドン、ポ
リビニルアルコール、およびグリコールエーテルベースの一官能および多官能の
化合物）。長鎖の脂肪酸誘導化合物は、本発明において使用され得る、乳化剤お
よび懸濁剤の第三の実質的なグループを形成する。上記の表面活性剤のいずれも
、非毒性である限り有用である。
【０１２１】 本発明に従って使用され得る適切な乳化剤（表面活性剤または界面活性剤とも
呼ばれる）の適切な例は、以下を包含する： １．水溶性石鹸（例えば、高級脂肪酸（Ｃ10からＣ22）のナトリウム、カリウ
ム、アンモニウムおよびアルカノールアニモニウム（ａｌｋａｎｏｌａｎｉｍｏ
ｎｉｕｍ）塩、および特にナトリウムおよびカリウムの獣脂およびココナッツ石
鹸。
【０１２２】 ２．アニオン性合成非石鹸界面活性剤。これは、有機硫酸反応産物の水溶性の
塩に代表され得る。この産物は、その分子構造において、約８から約２２の炭素
原子ならびに硫酸および硫酸エステルラジカルからなる群より選択されるラジカ
ルを含むアルキルラジカルを有する。これらの例は、獣脂およびココナッツ石鹸
に由来するナトリウムもしくはカリウムアルキル硫酸塩；アルキルグリセリルエ
ーテルスルホン酸ナトリウム；ココナツ油脂肪酸モノグリセリドスルホン酸ナト
リウムおよびココナツ油脂肪酸モノグリセリド硫酸ナトリウム；１モルの高級脂
肪酸アルコールおよび約１から約６モルのエチレンオキシドの反応産物の硫酸エ
ステルのナトリウムもしくはカリウム塩；アルキルフェノールエチレンオキシド
エーテルスルホン酸ナトリウムまたはカリウム（１分子当たり１から約１０単位
のエチレンオキシドを有する、およびここでそのアルキルラジカルは、約８から
約１２の炭素原子を含む；イソエチオン酸でエステル化され、そして水酸化ナト
リウムを用いて中和された脂肪酸の反応産物；メチルタウリド（ｔａｕｒｉｄｅ
）の脂肪酸アミドのナトリウムまたはカリウム塩；ならびにＳＯ3スルホン化Ｃ1 0 からＣ24のαオレフィンのナトリウム塩およびカリウム塩。
【０１２３】 ３．有機疎水性化合物とアルキレンオキシド基との縮合によって作製された非
イオン性合成界面活性剤。代表的な疎水性基としては、プロピレンオキシドとプ
ロピレングリコールとの縮合産物、アルキルフェノール、プロピレンオキシドと
エチレンジアミドとの縮合産物、約８から約２２炭素原子を有する脂肪族アルコ
ール、ならびに脂肪酸のアミドが挙げられる。
【０１２４】 ４．非イオン性界面活性剤（例えば、アミンオキシド、ホスフィンオキシド、
およびスルホキシド（これらは半極性の特徴を有する））。長鎖三級アミンオキ
シドの特定の例としては、以下が挙げられる：ジメチルドデシルアミンオキシド
およびビス−（２−ヒドロキシエチル）ドデシルアミン。ホスフィンオキシドの
特定の例は、米国特許第３，３０４，２６３号（１９６７年２月１４日に発行）
に見出され、そして以下を包含する：ジメチルドデシルホスフィンオキシドおよ
びジメチル（２−ヒドロキシドデシル）ホスフィンオキシド。
【０１２５】 ５．長鎖スルホキシド（式Ｒ1−ＳＯ−Ｒ2に対応するものを含む。ここで、Ｒ 1 およびＲ2は、置換されたアルキルラジカルまたは置換されていないアルキルラ
ジカルであって、前者は約１０から約２８炭素原子を含有し、他方、Ｒ2は、１
から約３炭素原子を含む）。これらのスルホキシドの特定の例としては、ドデシ
ルメチルスルホキシドおよび３−ヒドロキシトリデシルメチルスルホキシドが挙
げられる。
【０１２６】 ６．両性合成界面活性剤（例えば、３−ドデシルアミノｄ−プロピオン酸ナト
リウム、および３−ドデシルアミノプロパンスルホン酸ナトリウム）。
【０１２７】 ７．双性イオン性合成界面活性剤（例えば、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘ
キサデシルアンモニオ）プロパン−１−スルホネートおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジメ
チル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホネ
ート。
【０１２８】 さらに、以下の型の乳化剤のすべては、本発明の組成物中において使用され得
る：（ａ）脂肪酸石鹸（すなわち、アルカリ塩）、ロジン（ｒｏｓｉｎ）酸、お
よびトールオイル；（ｂ）アルキルアレンスルホネート；（ｃ）アルキルスルフ
ェート（分岐鎖および直鎖の疎水性基を有する表面活性剤、ならびに一次および
二次のスルフェート基）；（ｄ）疎水性基と親水性基との間の中間体結合を含む
スルフェートおよびスルホネート（例えば、脂肪アシル化メチルタウリドおよび
硫酸化脂肪モノグリセリド；（ｅ）ポリエチレングリコールの長鎖酸エステル、
特にトールオイルエステル；（ｆ）アルキルフェノールのポリエチレングリコー
ルエーテル；（ｇ）長鎖アルコールおよびメルカプタンのポリエチレングリコー
ルエーテル；ならびに（ｈ）脂肪アシルジエタノールアミド。表面活性剤は、１
つを超える様式で分類され得ることから、このパラグラフに開示される多数のク
ラスの表面活性は、以前に記載される表面活性剤クラスと重複する。
【０１２９】 生物学的状況のために特に設計され、そしてそこにおいて一般に使用される、
多数の油乳化剤が存在する。例えば、多数の生物学的界面活性剤（表面活性剤）
は、それ自体がＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙによってその１
９８７ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ
ｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓの３１０−３１６頁に列挙されている。そのような表
面活性剤は、４つの塩基性型へと分割される：アニオン性、カチオン性、双性イ
オン性、および非イオン性。アニオン性界面活性剤の例は、以下を包含するがそ
れらに限定されない：アルギン酸、カプリル酸、コール酸、１−デカンスルホン
酸、デオキシコール酸、１−ドデカンスルホン酸、Ｎ−ラウロイルサルコシン、
およびタウロコール酸など。カチオン性界面活性剤は以下を包含するがそれらに
限定されない：セトリミド（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド−Ｃ
ＴＡＢ）、塩化ベンザルコニウム、ジメチル ジオクトデシルアンモニウム（Ｄ
ＤＡ）ブロミド、ＤＯＴＡＰ、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、塩化
ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メ
チルベンゼトニウム、および４−ピコリンドデシルスルフェートなど。双性イオ
ン性界面活性剤の例としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：３−
［（３− コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−ｌ−プロパンスルホネ
ート（一般に、ＣＨＡＰＳと省略される）、３−［（コラミドプロピル）−ジメ
チルアンモニオ］ヒドロキシ−ｌ−プロパンスルホネート （一般に、ＣＨＡＰ
ＳＯと省略される）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ−ｌ−プロパ
ンスルホネート、およびリゾ−α−ホスファチジルコリンなど。非イオン性界面
活性剤の例としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：デカノイル −
Ｎ−メチルグルカミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ｎ−ドデ
シルβ−Ｄ−グルコピラノシド、脂肪アルコールのエチレンオキシド縮合物 （
例えば、Ｌｕｂｒｏｌの商標名で販売される）、脂肪酸のポリオキシエチレンエ
ーテル（特に、Ｃ12からＣ20の脂肪酸）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸
エーテル（例えば、Ｔｗｅｅｎの商標名で販売される）、およびソルビタン脂肪
酸エーテル（例えば、Ｓｐａｎの商標名で販売される）など。正に荷電したエマ
ルジョンを生じるアジュバント組成物の任意の成分は、例えば、上記のカチオン
性界面活性剤のいずれかであり得る。あるいは、上記のカチオン性界面活性剤は
、そのエマルジョンを正に荷電させるために上記の油滴エマルジョンのいずれか
とともに使用され得る。
【０１３０】 界面活性剤の特に有用なグループは、ソルビタンベースの非イオン性表面活性
剤である。これらの表面活性剤は、ソルビトールの脱水によって調製されて、１
，４−ソルビタンを生じ、これは次いで、脂肪酸の１つ以上の等価物と反応され
る。脂肪酸置換された部分は、さらに、エチレンオキシドと反応されて表面活性
剤の第二グループを形成し得る。
【０１３１】 脂肪酸置換されたソルビタン表面活性剤は、１，４−ソルビタンと、ラウリル
酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、または類似の長鎖脂肪酸のよう
な脂肪酸と反応させることによって作製されて、１，４−ソルビタンモノエステ
ルである１，６−ソルビタンセスキエステルまたは１，４−ソルビタントリエス
テルを生じる。これらの表面活性剤についての一般的な名称は、例えば、以下を
包含する：ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタ
ンモノエステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレエー
ト、およびソルビタントリオレエート。これらの表面活性剤は、ＳＰＡＮ（登録
商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の名称で市販されている。通常、これ
には、種々のモノトリエステル、ジエステル、およびトリエステルで置換された
ソルビタンとの間を識別する文字または数字の指定が伴う。
【０１３２】 ＳＰＡＮＳ（登録商標）およびＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の表面活性剤は、
親水性であり、そして一般に油に可溶性もしくは分散性である。それらはまた、
ほとんどの有機溶媒中で可溶性である。水中で、それらは、一般に、不溶性であ
るが分散性である。一般に、これらの表面活性剤は、１．８から８．６の間の親
水性−親油性の平衡（ＨＬＢ）数を有する。そのような表面活性剤は、当該分野
において公知の手段によって作製され得、または例えば、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃ
ａｓ Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥからＡＴＬＡＳ（登録商標）とい
う登録商標で市販されている。
【０１３３】 表面活性剤の関連グループは、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステルお
よびポリオキシエチレンソルビタントリエステルを包含する。これらの材料は、
エチレンオキシドを、１，４−ソルビタンモノエステルまたはトリエステルへと
添加することによって調製される。ポリオキシエチレンの添加は、親油性ソルビ
タンモノエステルまたはトリエステルの表面活性剤を、親水性の表面活性剤に変
換する。これは、水中で可溶性油分散性であり、そして有機液体において種々の
程度で可溶性である。
【０１３４】 これらの材料は、ＴＷＥＥＮという名称で市販されており、水中油エマルジョ
ンを調製するため、および油の可溶化をするため、ならびに無水軟膏水溶性また
は洗浄可能にさせるために有用である。ＴＷＥＥＮ表面活性剤は、関連するソル
ビタンモノエステルまたはトリエステル表面活性剤と合わせられて、エマルジョ
ンの安定性を促進させ得る。ＴＷＥＥＮ表面活性剤は、一般に、９．６と１６．
７との間のＨＬＢ値を有する。
【０１３５】 単独で、あるいはＳＰＡＮ（登録商標）、ＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）、およ
びＴＷＥＥＮ（登録商標）の表面活性剤と組み合わせて使用され得る、非イオン
性表面活性剤の第三のグループは、長鎖脂肪酸とエチレンオキシドとの反応によ
って作製されるポリオキシエチレン脂肪酸である。最も一般的に利用可能なこの
型の表面活性剤は、ＭＹＲＪ（登録商標）という商標の固体であり、そしてステ
アリン酸のポリオキシエチレン誘導体である。ＭＹＲＪ（登録商標）表面活性剤
は、親水性であり、そしてＴＷＥＥＮ（登録商標）表面活性剤のように水中で可
溶性もしくは分散性である。ＭＹＲＪ（登録商標）は、エマルジョンを形成する
際に使用するために、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）
／ＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）混合物と混和され得
る。ＭＹＲＪ（登録商標）表面活性剤は、当該分野において公知の方法によって
作製され得るか、またはＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃ から市販されて
いる。
【０１３６】 ポリオキシエチレンベースの非イオン性表面活性剤の第四のグループは、ラウ
リル、アセチル、ステアリル、およびオレイルのアルコールに由来するポリオキ
シエチレン脂肪酸エーテルである。これらの材料は、上記のように、エチレンオ
キシドを脂肪アルコールへと添加することによって調製される。これらの表面活
性剤についての商標名は、ＢＲＩＪ（登録商標）である。ＢＲＩＪ（登録商標）
表面活性剤は、その表面活性剤中のポリオキシエチレン部分のサイズに応じて親
水性であるかまたは親油性であり得る。これらの化合物の調製物は当該分野から
入手可能であるが、それらはまた、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃのよう
な商業的供給源から容易に入手可能である。
【０１３７】 本発明の実施において潜在的に使用され得る、他の非イオン性界面活性剤は、
例えば、以下である：ポリオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ポリオ
キシエチレンエーテル、ポリオキシプロピレン脂肪エステル、ポリオキシエチレ
ンを含む蜜蝋誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン
脂肪グリセリド、グリセロール脂肪酸エステルまたは他のポリオキシエチレン酸
アルコールまたは１２−２２炭素原子の長鎖脂肪酸のエーテル誘導体。
【０１３８】 本発明のアジュバントおよび免疫原性組成物は複数相系であることが意図され
ることから、約７から約１６の範囲のＨＬＢ値を有するエマルジョン形成非イオ
ン性表面活性剤を選択することが好ましい。この値は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）
表面活性剤のような単純な非イオン性表面活性剤の使用を通じて入手され得るか
、またはソルビタンモノエステル、ジエステルまたはトリエステルベースの表面
活性剤を有するような表面活性剤の混和物の使用によって達成され得る；ソルビ
タンエステルポリオキシエチレン脂肪酸；ポリオキシエチレンラノリン誘導体化
表面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル；高ＨＬＢポリオキシエチレン脂
肪エーテル表面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル表面活性剤；あるいは
ポリエチレン脂肪エーテル表面活性剤またはポリオキシエチレンソルビタン脂肪
酸。
【０１３９】 本発明の実施においてエマルジョン安定化させる非イオン性表面活性剤として
単純な非イオン性表面活性剤を使用することがより好ましく、最も特定するとＴ
ＷＥＥＮ（登録商標）表面活性剤である。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０と称する
表面活性剤は、他の様式では、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレエー
トについてポリソルベートとしても知られているが、上記の表面活性剤の中で最
も好ましい。
【０１４０】 十分な小滴サイズの減少は、０．０２重量％（ｗ／ｗ）から２．５重量％（ｗ
／ｗ）で存在する表面活性剤を有することによって通常行われ得る。０．０５％
から１％の量が好ましく、０．０１％から０．５％が特に好ましい。
【０１４１】 本発明の小滴が達成される様式は、本発明の実施にとっては重要ではない。サ
ブミクロンの油滴が入手され得る１つの様式は、商業的乳化剤の使用による（例
えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡから入手されるモデル
番号１１０Ｙ）。他の商業的乳化剤の例としては、Ｇａｕｌｉｎ Ｍｏｄｅｌ
３０ＣＤ（Ｇａｕｌｉｎ、Ｉｎｃ．、Ｅｖｅｒｅｔｔ、ＭＡ）およびＲａｉｎｎ
ｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂ Ｔｙｐｅ ８．３０Ｈ（Ｍｉｒｏ Ａｔｏｍｉｚｅｒ
Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄａｉｒｙ、Ｉｎｃ．、Ｈｕｄｓｏｎ、ＷＩ）が挙げられる
。高剪断力の原理によって操作されるこれらの乳化剤は、高圧のもとで、小さな
開口部を通じて液体を押しつけることによって開発される。モデル１１０Ｙ が
５，０００−３０，０００ ｐｓｉで操作される場合、１００−７５０ ｎｍの
直径を有する油滴が提供される。
【０１４２】 油滴のサイズは、界面活性剤と油の比を変化させること（その比を増加させる
と小滴サイズが減少する）、圧力を操作する（操作圧力を増加すると小滴サイズ
は減少する）、温度（温度を上昇させると小滴サイズが減少する）、および両親
媒性免疫刺激剤の添加（そのような薬剤を添加すると、小滴サイズが減少する）
によって変動され得る。実際の小滴サイズは、特定の界面活性剤、油、および免
疫刺激剤（あれば）ならびに選択された特定の操作条件によって変動する。小滴
サイズは、サイズ変更する装置の使用（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ によって製造される市販のＳｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌ
ｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ Ｎ４ＭＤ））によって確認され得、そして
そのパラメーターは、上記のガイドラインを用いて変動され得、その後、実質的
に全ての小滴は１ミクロン未満の直径、好ましくは０．８ミクロン未満の直径、
そして最も好ましくは０．５ミクロン未満の直径となる。実質的にすべてとは、
少なくとも約８０％（数ベース）、好ましくは少なくとも９０％、より好ましく
は約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８％を意味する。粒子サイズ
分布は、代表的にはガウス分布であり、その結果、平均直径は、言及された限界
よりも小さくなる。
【０１４３】 本発明は、好ましくは、先行技術文献において以前に教示される他の成分の非
存在下で油エマルジョンを調製して、十分な免疫原性についてサブミクロンエマ
ルジョン（すなわち、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックポリ
マー（例えば、米国特許第４，７７２，４６６号および同第４，７７０，８７４
号、ならびに欧州特許出願０ ３１５ １５３ Ａ２におけるアジュバントとと
もに使用することについて記載されるもの）とともに使用されることによって実
施され得る。
【０１４４】 本発明のミクロエマルジョン組成物は、水中で代謝可能な油およびＰＯＰ−Ｐ
ＯＥコポリマー以外の乳化剤を含み得る。乳化剤は、何らかの特定の免疫刺激活
性を有する必用はない。なぜなら、油組成物自身が、油滴がサブミクロン範囲に
あるときにはアジュバントとして機能し得るからである。しかし、増加された免
疫刺激活性は、公知の免疫刺激剤のいずれかをその組成物中に含ませることによ
って提供され得る。免疫刺激剤は、乳化剤および油とは別個であり得るか、また
は免疫刺激剤および乳化剤は１つのそして同じ分子であり得る。前者の状況の例
としては、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのような殺
傷されたミコバクテリアおよびその細胞内成分と混合された代謝可能な油が挙げ
られる。さらなる免疫刺激物質としては、そのような細菌の細胞壁の成分である
ムラミルペプチドを含み、そしてその誘導体を含む。乳化剤／免疫刺激剤を混合
物の例は、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９
８８、１４１，１７２０−１７２７（この開示は本明細書においてその全体が参
考として援用される）に記載される親油性ムラミルペプチドである。これらの材
料は、塩基性のＮ−アセチルムラミルペプチド（親水性部分）（これは、免疫刺
激基として作用する）を含むが、これはまた、得られる化合物に対して表面活性
特徴を提供する親油性部分を包含する。そのような化合物、および他の型の両親
媒性の免疫刺激物質は、免疫刺激剤および乳化剤の両方として作用し、そして本
発明の実施において好ましい。さらに、本発明を実施することはまた、両親媒性
免疫刺激性物質を、両親媒性ではない免疫刺激物質と組み合わせて使用すること
によって可能である。例は、本質的に置換されていない（すなわち、本質的に親
水性の）ムラミルジペプチドと組み合わせた親油性ムラミルペプチドの使用であ
る。
【０１４５】 好ましい油滴エマルジョンは、ＭＦ５９である。ＭＦ５９は、例えば、以下に
記載される手順に従って作製され得る：Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇ
ｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ、
１９９５、Ｍ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ、Ｅｄｓ．、
Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．２７７−２９６；Ｓｉｎｇ
ｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９８，１６，１８２２−１８２７；Ｏｔｔら、Ｖａ
ｃｃｉｎｅ、１９９５，１３，１５５７−１５６２；ならびにＶａｌｅｎｓｉら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４，１５３，４０２９−３９、これらの開示は
、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０１４６】 他の油滴エマルジョンとしては以下が挙げられる：例えば、ＳＡＦ（１０％ス
クアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１
２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロンエマルジョンへと微小流体化
されるか、またはボルテックスされてより大きな粒子サイズエマルジョンが生成
される）、ならびにＲｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）（２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅ
ｅｎ ８０、および以下からなる群より選択される１つ以上の細菌細胞壁成分を
含む：一リン酸化リピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）
、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好まし
くはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＪ）（本明細書での使用のために適切な水中油
エマルジョのさらなる議論については、共有に係る、特許出願番号０９／０１５
，７３６（１９９８年１月２９日出願）を参照のこと）。
【０１４７】 本発明のミクロエマルジョンを調製した後、高分子がそれに吸着されて、ミク
ロエマルジョンのアジュバント効果を増加させ得る。本発明の組成物のさらなる
成分は、オリゴヌクレオチドである。これは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ
を含む。本明細書において使用される場合、用語「ＣｐＧモチーフ」とは、オリ
ゴヌクレオチドのジヌクレオチド部分をいい、これは、シトシンヌクレオチド、
続いてグアノシンヌクレオチドを含む。そのようなオリゴヌクレオチドは、当業
者に周知の従来のオリゴヌクレオチド合成を用いて調製され得る。好ましくは、
本発明のオリゴヌクレオチドは、改変された骨格（例えば、ホスホロチオエート
またはペプチド核酸）を含み、その結果、オリゴヌクレオチドへヌクレアーゼ耐
性を付与する。改変された骨格は、当業者に周知である。好ましいペプチド核酸
は、以下に詳細に記載されている：以下の米国特許第５，８２１，０６０号、第
５，７８９，５７３号、第５，７３６，３９２号、および第５，７２１，１０２
号、日本国特許公開１０−２３１２９０、欧州特許番号８３９，８２８、および
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／４２７３５、ＷＯ９８／４２８７６、ＷＯ９８／３６
０９８、ＷＯ９８／２７１０５、ＷＯ９８／２０１６２、ＷＯ９８／１６５５０
、ＷＯ９８／１５６４８、ＷＯ９８／０４５７１、ＷＯ９７／４１１５０、ＷＯ
９７／３９０２４、およびＷＯ９７／３８０１３、これらの開示は、その全体が
参考として本明細書において援用される。
【０１４８】 このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約６と約１００との間のヌクレオチ
ド、より好ましくは約８と約５０の間のヌクレオチド、最も好ましくは約１０と
約４０の間のヌクレオチド。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、糖部分お
よび窒素塩基部分の置換物を含み得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば
、以下に開示される：Ｋｒｉｅｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、１９９８，９５，１２６３１−１２６３６、Ｋｌｉｎｍａｎら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６，９３，２８７９−２８８
３、Ｗｅｉｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９
７，９４，１０８３３−１０８３７、Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９
７，１８６，１６２３−１６３１，Ｂｒａｚｏｌｏｔ−Ｍｉｌｌａｎら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５５３−１５
５５８、Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６，１５７，１８４０
−１８４５、Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５６，４
５７０−４５７５、Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６
，１６７，７２−７８、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．、１９８８，７９，８６６−８７３、Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．、Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４７，１７５９−
１７６４、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１
９９６，１５７、５３９４−５４０２、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９
８，１６０，４７５５−４７６１、Ｒｏｍａｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７
，３，８４９−８５４、Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８，１６
０，８７０−８７６、Ｌｉｐｆｏｒｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９
９７，２７，２３４０−２３４４、Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ、
１９８８，１６，１２１６−１２２４、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９
８、１６０，５８９８−５９０６、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／０２５５５，ＰＣＴ公
開ＷＯ９８／１６２４７、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／１８８１０、ＰＣＴ公開ＷＯ９
８／４０１００、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／５５４９５，ＰＣＴ公開ＷＯ９８／３７
９１９、およびＰＣＴ公開ＷＯ９８／５２５８１、これらの開示は、その全体が
本明細書において参考として援用される。本発明のオリゴヌクレオチドは、少な
くとも１つのＣｐＧモチーフを含むが、複数のＣｐＧモチーフを含み得ることが
理解されるべきである。
【０１４９】 好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のようなヌクレオチド配列を含
む：
【０１５０】
【化１】 。本発明の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドはＣｐＧモチーフを含み
、このＣｐＧモチーフは、モチーフの５’側で２個のプリンおよびモチーフの３
’側で２個のピリミジンに隣接される。しかし、本明細書中に記載の油滴エマル
ジョンと組み合わせられる場合に、オリゴヌクレオチドがＴｈ１リンパ球刺激を
増大させる限り、ＣｐＧモチーフを含む任意のオリゴヌクレオチドが本発明にお
いて使用され得ることが理解されるべきである。
【０１５１】 別の好ましい実施形態では、高分子は、ミクロエマルジョンに吸着した免疫原
性ＤＮＡまたは免疫原性タンパク質である。このような吸着は、強力なアジュバ
ント効果を有するミクロエマルジョンを作製する。
【０１５２】 本発明はまた、吸着された抗原性および／または免疫原性の分子を有する上記
ミクロエマルジョンを含む免疫原性組成物に関する。アジュバント組成物は、一
般的に、アジュバントと免疫原性組成物において使用される抗原性物質とを合わ
せる前に、上記成分から調製される。抗原または抗原性物質の用語は、以下を含
む任意の物質をいう：動物の血流に対して外来性である場合に、このような動物
の組織に接近するとすぐに特異的抗体の形成を刺激し、そしてインビボまたはイ
ンビトロにおいて同一抗体と特異的に反応する、タンパク質もしくはタンパク質
−ポリサッカリド、タンパク質−リポポリサッカリド、ポリサッカリド、リポポ
リサッカリド、ウイルスサブユニット、ウイルス全体または細菌全体。さらに、
これは、抗原に対するレセプターを有するＴ−リンパ球（好ましくは、Ｔｈ１リ
ンパ球）の増殖を刺激し、そしてこのリンパ球と反応して、細胞性免疫と称され
る一連の応答を開始させ得る。
【０１５３】 ハプテンは、この抗原の定義の範囲内である。ハプテンは、その免疫学的特異
性を決定する、抗原性分子または抗原性複合体の部分である。通常、ハプテンは
、天然に存在する抗原の中のペプチドまたはポリサッカリドである。人工の抗原
において、これはアルサニル酸誘導体のような低分子量物質であり得る。ハプテ
ンは、インビボまたはインビトロにおいて、同一抗体またはＴリンパ球と特異的
に反応する。代替的な記述子は、抗原性決定基、抗原性構造基およびハプテン基
である。
【０１５４】 本発明の好ましい実施形態では、抗原性物質は、例えば、以下のようなウイル
ス由来である：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス（ｆｌｕ）および狂犬病ウイル
ス。好ましくは、抗原性物質は、ＨＳＶ糖タンパク質ｇＤ、ＨＩＶ糖タンパク質
ｇｐ１２０、およびＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇからなる群から選択される。本発明
の他の好ましい実施形態では、抗原性物質は、例えば、以下のような細菌由来で
ある：Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａ、コレラ、ジフテリア、破傷風、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎ
ｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、および百日咳。本発明の他の好ましい実施形態では、抗原
性物質は例えば、マラリア寄生生物のような寄生生物由来である。本発明の別の
好ましい実施形態では、抗原は本発明の微粒子の表面に吸着される。
【０１５５】 抗原は、当該分野において公知の方法によって産生され得るか、または商業的
供給源から購入され得る。本発明の範囲内である抗原としては、以下が挙げられ
る：不活化したウイルス粒子全体、単離されたウイルスタンパク質およびタンパ
ク質サブユニット、細胞全体および細菌、細胞膜および細胞壁タンパク質など。
いくつかの好ましい抗原を以下に記載する。
【０１５６】 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｒｇＤ２は、遺伝子操作されたチャイニーズ
ハムスター卵巣細胞において産生される組換えタンパク質である。このタンパク
質は短縮化された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）正常なアンカー領域を有し、これは組
織培養培地中に分泌されるグリコシル化タンパク質を生じる。このｇＤ２は、Ｃ
ＨＯ培地において９０％より高い純度まで精製され得る。ヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）ｅｎｖ−２−３は、遺伝子操作されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて産生されるＨＩＶエンベロープタンパク質の組換
え形態である。このタンパク質は、ＨＩＶ ｇｐ１２０のタンパク質領域全体を
表すが、酵母から精製される場合にはグリコシル化されず、そして変性する。Ｈ
ＩＶ ｇｐ１２０は、上記のｇＤ２に類似の様式でＣＨＯ細胞において産生され
る、完全にグリコシル化された分泌形態のｇｐ１２０である。免疫原性組成物に
おける使用に適切なさらなるＨＳＶ抗原は、ＰＣＴ公開ＷＯ８５／０４５８７お
よびＷＯ８８／０２６３４（これらの開示は、それらの全体において本明細書中
で参考として援用される）に記載される。アンカー領域を欠失する短縮化された
表面抗原であるｇＢ抗原およびｇＤ抗原の混合物が特に好ましい。
【０１５７】 免疫原性組成物における使用に適切なインフルエンザ抗原は、市販されている
。以下の実施例において使用され得る抗原としては、ＦＬＵＯＧＥＮ（登録商標
）（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓより製造）、Ｄｕｐｈａｒ（Ｄｕｐｈａｒ Ｂ．Ｖ
．より製造）、およびインフルエンザワクチンバッチＡ４１（ｉｎｆｌｕｅｎｚ
ａ ｖａｃｃｉｎｅ ｂａｔｃｈ Ａ４１）（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｖａｃｃｉ
ｎｏｇｅｎｏ Ｐｏｚｚｉより製造）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】 免疫原性組成物における使用に適切なマラリア抗原は、米国特許出願番号３３
６，２８８（１９８９年４月１１日出願）、および米国特許第４，８２６，９５
７号（これらの開示は、それらの全体において本明細書中で参考として援用され
る）に記載される。
【０１５９】 免疫原性組成物における使用に適切なさらなるＨＩＶ抗原は、米国特許出願番
号４９０，８５８号（１９９０年３月９日出願）および公開された欧州特許出願
番号１８１１５０（１９８６年５月１４日）（これらの開示は、それらの全体に
おいて本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１６０】 免疫原性組成物における使用に適切なサイトメガロウイルス抗原は、米国特許
第４，６８９，２２５号、米国特許出願番号３６７，３６３（１９８９年６月１
６日出願）、およびＰＣＴ公開ＷＯ８９／０７１４３（これらの開示は、それら
の全体において本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１６１】 免疫原性組成物における使用に適切なＣ型肝炎ウイルスは、以下において記載
される：ＰＣＴ／ＵＳ８８／０４１２５、公開された欧州特許出願番号３１８２
１６（１９８９年５月３１日）、公開された日本国特許出願番号１−５００５６
５（１９８８年１１月１８日出願）、カナダ国特許出願番号５８３，５６１、お
よびＥＰＯ３８８，２３２（これらの開示は、それらの全体において本明細書中
で参考として援用される）。異なるセットのＨＣＶ抗原が、欧州特許出願番号９
０／３０２８６６．０（１９９０年３月１６日出願）および米国特許出願番号４
５６，６３７（１９８９年１２月２１日出願）、およびＰＣＴ／ＵＳ９０／０１
３４８（これらの開示は、それらの全体において本明細書中で参考として援用さ
れる）に記載される。
【０１６２】 本発明の免疫原性組成物は、コレラ、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフル
エンザ、麻疹、髄膜炎、流行性耳下腺炎、ペスト、ポリオ、狂犬病、ロッキー山
紅斑熱、風疹、痘瘡、腸チフス（ｔｙｐｈｏｉｄ）、チフス（ｔｙｐｈｕｓ）、
ネコ白血病ウイルス、および黄熱病を含むが、これらに限定されない疾患および
感染に対して、鳥類および哺乳動物を免疫するために使用され得る。
【０１６３】 本発明の免疫原性組成物の組成は、有効量の抗原を使用する。すなわち、アジ
ュバントと組み合わせて、免疫したウイルス、細菌、真菌類、マイコプラスマ、
または寄生生物への引き続く曝露から被験体に防御を与えるように、被験体に特
異的かつ十分な免疫学的応答（好ましくは、Ｔｈ１リンパ球応答）を生じさせる
量の抗原が含まれる。
【０１６４】 本発明において使用され得る各々すべての抗原について特定の指針を提供する
、単回用量の指示は割り当てられ得ない。抗原の有効量は、その固有の活性およ
び純度の関数であり、そして慣用的な実験を通して当業者によって経験的に決定
される。本発明のアジュバント組成物は、細胞全体（すなわち、ウイルス性免疫
原性組成物）と組み合わせて使用され得、同様に、精製された抗原（すなわち、
組換えＤＮＡ技術または合成によって調製されるタンパク質サブユニット免疫原
性組成物もしくはペプチド免疫原性組成物）と組み合わせて使用され得ることが
意図される。本発明のアジュバント組成物は安定であるので、抗原およびエマル
ジョンは、単純に振盪することによって混合され得る。他の技術（例えば、この
アジュバントと抗原の溶液または懸濁液との混合物を小さな開口部（例えば、皮
下注射針）に急速に通過させること）によって、有用な免疫原性組成物は容易に
提供される。
【０１６５】 本発明に従う免疫原性組成物は、約１ナノグラム〜約１０００マイクログラム
の核酸（好ましくは、ＤＮＡ（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドのような））
を含む。いくつかの好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、約１０ナノグラ
ム〜約８００マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態では、
免疫原性組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムの核酸を含む。いくつか
の好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、約１〜約３５０マイクログラムの
核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、約２５〜約
２５０マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態では、免疫原
性組成物は、約１００マイクログラムの核酸を含む。当業者は、任意の所望され
る量の核酸を含む免疫原性組成物を容易に処方し得る。本発明に従う免疫原性組
成物は、無菌性で、かつ発熱物質を含まずに提供される。免疫原性組成物は、単
位投薬量形態で都合良く投与され得、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｓｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ
．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８０）（この開示は、その全体において本明細書
中で参考として援用される）に記載されるような、薬学分野において周知の任意
の方法によって調製され得る。
【０１６６】 本発明はまた、宿主動物において免疫応答を刺激する方法に関する。この方法
は、免疫応答を誘導するに有効な量の上記免疫原性組成物を動物に投与する工程
を包含する。宿主動物は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトである。
好ましい投与経路としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：筋内
、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内および経口、ならびに経皮的また
は吸入もしくは坐剤による。最も好ましい投与経路としては、筋内注射、腹腔内
注射、皮内注射、および皮下注射が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態に
従って、免疫原性組成物は、無針注入デバイス（ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｉｎｊ
ｅｃｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）（これは周知であり、そして広範に入手利用可能
である）を使用して、宿主動物に投与される。当業者は、本明細書の教示に従っ
て、無針注入デバイスを使用し、個体の細胞に免疫原性組成物を送達し得る。
【０１６７】 本発明はまた、ウイルス感染、細菌感染、または寄生生物感染に対して宿主動
物を免疫する方法に関し、この方法は、防御応答を誘導するに有効な量の上記免
疫原性組成物を動物に投与する工程を包含する。宿主動物は、好ましくは、哺乳
動物、より好ましくはヒトである。好ましい投与経路は、上記されている。宿主
動物の予防的または治療的処置は、任意の病原体に指向し得るが、好ましい病原
体としては、上記のウイルス病原体、細菌病原体、および寄生生物病原体が挙げ
られる（しかし、これらに限定されない）。
【０１６８】 本発明はまた、宿主動物においてＴｈ１免疫応答を増大させる方法に関する。
この方法は、Ｔｈ１免疫応答を誘導するに有効な量の上記免疫原性組成物を動物
に投与する工程を包含する。宿主動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは
ヒトである。好ましい投与経路は、上記されている。当業者は、Ｔｈ１リンパ球
、ならびにその応答および測定に容易に精通する。
【０１６９】 本発明は、単独または互いとの組み合わせにおいて免疫応答を誘発するために
使用される吸着抗原を有する微粒子またはミクロエマルジョンの使用を意図する
。すなわち、本発明は、吸着された抗原を有する微粒子、吸着された抗原または
免疫刺激分子を有するミクロエマルジョン、および吸着された抗原を有する微粒
子と吸着された抗原もしくは免疫刺激分子を有するミクロエマルジョンとの組み
合わせを包含する。
【０１７０】 以下の実施例によって示されるように、吸着された高分子を有する本発明の微
粒子は、強力な免疫応答を誘発する。さらに、本発明の油滴エマルジョンはまた
、強力な免疫応答を誘発する。従って、吸着された高分子を有する本発明の微粒
子と本発明の油滴エマルジョンアジュバントとの組み合わせは、免疫応答を誘発
するための強力なツールである。本発明はさらに、本発明を明らかにするために
意図された以下の実施例によって例示される。前述の例は、本発明を例示するこ
とを意味し、そして如何なる様式でも本発明を制限すると解釈されるべきではな
い。当業者は、本発明の精神および範囲内である変更を認識する。本明細書中で
引用されるすべての参考文献は、それらの全体において本明細書中で参考として
援用される。
【０１７１】 （Ｃ．実験） 以下は、本発明の実施についての特定の実施形態の例である。この例は、例示
目的のために提供され、そして如何なる様式でも本発明の範囲を制限するように
意図されない。
【０１７２】 用いられた数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にするように努
力がなされたが、当然のことながら、幾分かの実験誤差および偏差は許容される
べきである。
【０１７３】 （実施例１） （エマルジョン安定剤としてＰＶＡを使用するブランク微粒子の調製） ブランク微粒子（例えば、吸着された高分子または捕捉された（ｅｎｔｒａｐ
ｐｅｄ）高分子を有さない）を、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を使用して、
以下のように作製した。溶液は、以下を使用した： （１）ジクロロメタン中の６％ＲＧ ５０４ ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ） （２）水中の１０％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（ＩＣＮ）。
【０１７４】 特に、１０ｍｌのポリマー溶液と１．０ｍｌの蒸留水とを合わせること、そし
てＯｍｎｉ ｂｅｎｃｈｔｏｐホモジナイザーを使用し、１０Ｋ ｒｐｍにて１
０ｍｍプローブと共に３分間ホモジナイズして、水／油（ｗ／ｏ）エマルジョン
を形成することによって、この微粒子は作製された。このｗ／ｏエマルジョンを
４０ｍｌの１０％ＰＶＡ溶液に添加し、そして３分間ホモジナイズして、水／油
／水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンを形成した。このｗ／ｏ／ｗエマルジョンを溶
媒のエバポレーションのために一晩攪拌しながら放置し、微粒子を形成する。形
成された微粒子を、４回の遠心分離によって水で洗浄し、そして凍結乾燥した。
次いで、今後の使用のために、この微粒子をＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ整粒
器でサイズ分類した。
【０１７５】 （実施例２） （ＣＴＡＢを使用するブランク微粒子の調製） ブランク微粒子を、ＣＴＡＢを使用して、以下のように作製した。溶液は、以
下を使用した： （１）ジメチルクロリド中の４％ＲＧ ５０４ ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ） （２）水中の０．５％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０１７６】 特に、１２．５ｍｌのポリマー溶液と１．２５ｍｌの蒸留水とを合わせること
、そしてＯｍｎｉ ｂｅｎｃｈｔｏｐホモジナイザーを使用し、１０Ｋ ｒｐｍ
にて１０ｍｍプローブと共に３分間ホモジナイズして、ｗ／ｏエマルジョンを形
成することによって、この微粒子は作製された。このｗ／ｏエマルジョンを５０
ｍｌの０．５％ＣＴＡＢ溶液に添加し、そして３分間ホモジナイズして、ｗ／ｏ
／ｗエマルジョンを形成した。このｗ／ｏ／ｗエマルジョンを溶媒のエバポレー
ションのために一晩攪拌しながら放置し、微粒子を形成する。次いで、形成され
た微粒子を、３８μメッシュを通して濾過し、４回の遠心分離によって水で洗浄
し、そして凍結乾燥した。次いで、今後の使用のために、この微粒子をＭａｌｖ
ｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ整粒器でサイズ分類した。
【０１７７】 （実施例３） （ＳＤＳを使用するブランク微粒子の調製） ブランク微粒子を、ＳＤＳを使用して、以下のように作製した。溶液は、以下
を使用した： （１）ジメチルクロリド中の６％ＲＧ ５０４ ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ） （２）水中の１％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０１７８】 特に、１２．５ｍｌのポリマー溶液と５０ｍｌのＳＤＳ溶液とを合わせること
、そしてＯｍｎｉ ｂｅｎｃｈｔｏｐホモジナイザーを使用し、１０Ｋ ｒｐｍ
にて１０ｍｍプローブと共に３分間ホモジナイズすることによって、この微粒子
は作製された。このエマルジョンを溶媒のエバポレーションのために一晩攪拌し
ながら放置した。今後の使用のために、形成された微粒子を、３８μメッシュを
通して濾過し、４回の遠心分離によって水で洗浄し、そして凍結乾燥した。次い
で、今後の使用のために、この微粒子をＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ整粒器で
サイズ分類した。
【０１７９】 （実施例４） （ブランク微粒子へのタンパク質の吸着） タンパク質を以下のように微粒子に吸着させた。
【０１８０】 （Ａ．ｐ５５ｇａｇの１％および３％の理論上負荷（ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ
ｌｏａｄ）） １％および３％の理論上負荷を達成するために、実施例３においてのように生
成された５０ｍｇの凍結乾燥したブランクＳＤＳ／ＰＬＧ微粒子を、Ｎａｌｇｅ
ｎｅ遠心管内に配置し、そして１０ｍｌの２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９）をｐ
５５ｇａｇタンパク質（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｅｒｋｅｌ
ｅｙ、ＣＡ）を含有する６Ｍ尿素と共に添加した：（ａ）１％の理論上負荷のた
めに、１０ｍｌの５０μｇ／ｍｌのｐ５５ｇａｇ溶液を使用した；そして（ｂ）
３％の理論上負荷のために、１０ｍｌの１５０μｇ／ｍｌのｐ５５ｇａｇ溶液を
使用した。この混合物を、振盪させながら、室温にて一晩インキュベートした。
翌日、微粒子を遠心分離し、そして塩基加水分解（ｂａｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓ
ｉｓ）、次ぐビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ）アッセイ（ＢＣＡ
；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によりタンパク質負荷を分析して、
吸着した量を決定した。今後の使用のために、微粒子を１０ｍｌのホウ酸塩／６
Ｍ尿素緩衝液で２回洗浄し、そして３０ｍｌの水で２回洗浄し、そして凍結乾燥
した。
【０１８１】 （Ｂ．ＨＣＶコア抗原（ＨＣＶ ｃｏｒｅ ａｎｔｉｇｅｎ）の１％の理論上
負荷） １％の理論上負荷を達成するために、５０ｍｇの凍結乾燥したブランクＳＤＳ
／ＰＬＧ微粒子を、Ｎａｌｇｅｎｅ遠心管内に配置し、そして１０ｍｌの３０ｍ
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を単一ＨＣＶコアタンパク質（１０ｍｌの５０
μｇ／ｍｌ ＨＣＶコアタンパク質溶液；Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）を含有する６Ｍ尿素と共に添加した。この混合物
を、振盪させながら、室温にて一晩インキュベートした。翌日、微粒子を遠心分
離し、そして、塩基加水分解、次ぐビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ；Ｐｉｅｒ
ｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によりＨＣＶ濃度についてタンパク質負荷を分
析して、吸着した量を決定した。今後の使用のために、微粒子を３０ｍｌのクエ
ン酸塩／６Ｍ尿素緩衝液で２回洗浄し、そして３０ｍｌの水で２回洗浄し、そし
て凍結乾燥した。
【０１８２】 （実施例５） （微粒子の吸着効率） 実施例４からの吸着タンパク質を有する凍結乾燥微粒子を、塩基加水分解を使
用して、吸着されたタンパク質の合計について、以下のように分析した。１０ｍ
ｇの凍結乾燥した吸着された粒子を、５％のＳＤＳを有する２ｍｌの０．２Ｎ
ＮａＯＨ中で４時間加水分解し、中和し、１：１０に希釈し、そしてＭｉｃｒｏ
ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用し
て、タンパク質含量について分析した。表１に示されるように、改変された表面
を有する微粒子をＣＴＡＢおよびＳＤＳのような界面活性剤を用いて調製し、両
方とも単独のＰＶＡを使用して作製される微粒子よりも効率的にタンパク質を吸
着した。
【０１８３】
【表１】 （実施例６） （Ａ．ｇａｇ−吸着微粒子の免疫原性） 実施例４に記載されるように、ＰＶＡまたはＳＤＳを使用して生成されるｇａ
ｇ−吸着微粒子、ならびに付随した微粒子を有さないｐ５５ｇａｇ単独（ネガテ
ィブコントロールとして）およびワクシニアｇａｇ−ｐｏｌコントロール（ポジ
ティブコントロールとして）を、マウスに筋内投与した。この動物を７日目およ
び１４日目に追加免疫した。投与された総用量を、表２および３に示す。最後の
免疫の２週間後に脾臓を収集し、そしてＤｏｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）９３：８５７８−８５８３に記載のように、ＣＴＬ活
性をアッセイした。
【０１８４】 リンパ球培養物を、以下のように調製した。免疫したマウス由来の脾臓細胞（
ｓｃ）を、２４ウェルディッシュにおいて１ウェルあたり５×１０6細胞で培養
した。これらの細胞のうち、１×１０6個を、１０μＭの濃度で３７℃にて１時
間、合成エピトープ性ペプチド形態ＨＩＶ−１SF2タンパク質で感作し、洗浄し
、そして熱非働化胎仔ウシ血清、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール、抗
生物質、および５％インターロイキン２（Ｒａｔ Ｔ−Ｓｔｉｍ、Ｃｏｌｌａｂ
ｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、
ＭＡ）を補充した２ｍｌの培養培地［５０％ ＲＰＭＩ １６４０および５０％
α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）］において残存する４×１０6個の未処理ｓｃと共に
同時培養した。３日目および５日目に、１ｍｌの新鮮な培養培地で細胞に給餌（
ｆｅｅｄ）し、そして６日目に細胞傷害性をアッセイした。
【０１８５】 細胞傷害性細胞アッセイを、以下のように実施した。51Ｃｒ放出アッセイにお
いて使用されたＳｖＢＡＬＢ（Ｈ−２d）（ＳｖＢ）およびＭＣ５７（Ｈ−２b）
標的細胞は、クラスＩＩ ＭＨＣ分子ではなく、クラスＩ ＭＨＣ分子を発現す
る。約１×１０6個の標的細胞を、５０μＣｉ（１Ｃｉ＝３７Ｇｂｐ）の51Ｃｒ
および合成ＨＩＶ−１ペプチド（１ｍＭ）を含有する２００μｌの培地中で６０
分間インキュベートし、そして３回洗浄した。エフェクター（Ｅ）細胞と５×１
０3個の標的（Ｔ）細胞とを、９６ウェルの丸底組織培養プレート中の２００μ
ｌの培養培地において種々のＥ／Ｔ比率で４時間培養した。二連のウェルからの
平均ｃｐｍを使用して、特異的な51Ｃｒ放出の％を算出した。
【０１８６】 表２および３に示されるように、ＳＤＳ−ＰＬＧ／ｐ５５微粒子は、ワクシニ
アコントロールに匹敵し得る活性を有しており、そしてＰＶＡ−ＰＬＧ／ｐ５５
微粒子およびｐ５５ｇａｇタンパク質処方物よりも活性であった。詳細には、表
２において示されるように、ｐ５５ｇａｇタンパク質は、１０μｇ、２５μｇお
よび５０μｇの濃度で不活性であった。さらに、表３において示されるように、
ＳＤＳ−ＰＬＧ／ｐ５５処方物は、ＰＶＡ−ＰＬＧ／ｐ５５およびｐ５５ｇａｇ
タンパク質処方物よりも活性であり、このことは、このタンパク質が、ＰＶＡ−
ＰＬＧ／ｐ５５およびｐ５５ｇａｇタンパク質処方物と比較してＳＤＳ−ＰＬＧ
／ｐ５５処方物において、より効率的に微粒子に吸着されたことを示す。
【０１８７】
【表２】 （実施例７） （改変した表面を有するｐＣＭＶ ｇｐ１２０ ＤＮＡ吸着微粒子の調製） 吸着したｇｐ１２０をコードするプラスミドＤＮＡを有する微粒子を以下のよ
うに調製した。２０ｍｇのブランクの微粒子を、実施例１および２に記載するよ
うに調製し、これを４℃にて３時間１．０ｍｌ容積中で、ｐＣＭＶ ｇｐ１２０
ＤＮＡの増加濃度でインキュベートした。インキュベーション後、この微粒子
を遠心分離し、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で２回洗浄し、そして一晩凍結乾燥し
た。この微粒子を実施例５に記載するように加水分解し、そしてＡ260ｎｍで吸
着したＤＮＡの量について分析した。
【０１８８】 表４は、ＰＬＧ−ＰＶＡおよびＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子の負荷効率を図示する
。この表に示すようにＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子は、対応するＰＬＧ−ＰＶＡ粒子
よりも効果的に吸着する。
【０１８９】
【表４】 （実施例８） （ＨＣＶ−Ｅ２吸着） 微粒子を、先の実施例に記載するように、ＰＶＡおよびいくつかの異なる界面
活性剤を使用して調製した。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来のＥ２タンパク質
を以下のように微粒子の表面上に吸着させた：０．２ｍｇ／ｍｌのＥ２を、ＰＢ
Ｓ中で２０ｍｇの微粒子に添加し、全容量０．５ｍｌ中の０．５％ｗ／ｗ Ｅ２
／ＰＬＧでの溶液を形成した。この溶液を３７℃にて１．５時間インキュベート
し、次いで遠心分離した。上清を収集し、次いでｍｉｃｒｏＢＣＡによりタンパ
ク質含有量のついて測定した。この結果を表５に示す。この結果は、本発明の微
粒子による高分子の優れた吸着を確認した。
【０１９０】
【表５】 （実施例９） （ｇｐ１２０タンパク質の吸着） 微粒子を、先の実施例に記載するようにＰＶＡを使用して、調製した。微粒子
をまた、以下のように、ＮａＯｌｅａｔｅ、陰イオン性界面活性剤を使用して調
製した：ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、内部水相として１．６７ｍｌの３０ｍＭの
ＮａＣｉｔｒａｔｅ（ｐＨ６）、溶媒として１６．７ｍｌのジクロロメタン中の
６％ポリマーＲＧ ５０５ ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉ
ｍ）（油相）、および外部水相として６６．８ｍｌの０．４％ＮａＯｌｅａｔｅ
を用いて調製した。これらの微粒子を、「ＮａＯｌｅａｔｅ−ＰＬＧ（ｗ／ｏ／
ｗ）」として以下の表６に表す。さらに、微粒子を、水中に油の製剤形態で、Ｎ
ａＯｌｅａｔｅを使用して調製し、そしてこれらの微粒子を「ＮａＯｌｅａｔｅ
−ＰＬＧ（ｏ／ｗ）」として以下の表６に表す。ｇｐ１２０タンパク質を、以下
のように、調製した微粒子の表面に吸着させた：０．３８８ｍｇ／ｍｌのタンパ
ク質をＰＢＳ中の約２０ｍｇの微粒子に添加し、総容量０．８ｍｌ中の約１．４
％ｗ／ｗのｇｐ１２０／ＰＬＧでの溶液を形成した。この溶液を、３７℃にて１
．５時間インキュベートし、次いで遠心分離した。上清を収集し、次いでｍｉｃ
ｒｏＢＣＡによりタンパク質含有量について測定した。結果を表６に示す。この
結果は、本発明の微粒子による高分子の優れた吸着を確認した。
【０１９１】
【表６】 （実施例１０） （リステリオリジン（ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｓｉｎ）タンパク質の吸着） 微粒子を、先の実施例に記載するようにＰＶＡおよびＣＴＡＢを使用して調製
した。Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来のリステオリジンタ
ンパク質（ＬＬＯ）を、以下のように微粒子の表面上に吸着させた：１．０ｍｇ
／ｍｌのＬＬＯをＰＢＳ中の１００ｍｇの微粒子に添加し、総容量５ｍｌ中の１
％ｗ／ｗ ＬＬＯ／ＰＬＧでの溶液を形成した。この溶液を３７℃にて１．５時
間インキュベートし、次いで遠心分離した。上清を収集し、次いでｍｉｃｒｏＢ
ＣＡによりタンパク質含有量について測定した。結果を表７に示す。この結果は
、本発明の微粒子による高分子の優れた吸着を確認した。
【０１９２】
【表７】 （実施例１１） （アジュバントとしてのアルミニウム塩の効果） ｐ５５ｇａｇＤＮＡ吸着ＰＬＧ微粒子をＣＴＡＢを使用して上記のように調製
した。この微粒子を２種類の濃度でマウスに筋肉内注射し、そしてコントロール
として、ＤＮＡのみを同じ２種類の濃度で注射した。さらに、ある試験で、５０
μｇのリン酸アルミニウムを注射したＣＴＡＢ組成物に添加した。各処方物を１
０匹のマウスに注射した。このマウスを２８日後にブーストした。二度目の免疫
化の２週間後、血清を収集し、そして標準誤差（ＳＥ）と一緒に、各血清の相乗
平均力価（ＧＭＴ）を測定した。この結果を表８で要約し、一次的な値および対
数値の両方で表す。各数は、１０匹のマウスから得た結果の平均である。
【０１９３】
【表８】 これらの結果を統計学的に比較するために、各々についてＰ−値を求めた：Ｄ
ＮＡ−ＣＴＡＶ 対 ＤＮＡ−ＣＴＡＢ＋ＡＬＵＭ（Ｐ−値＝０．００１７）；
ＤＮＡ−ＣＴＡＢ＋ＡＬＵＭ 対 ＤＮＡのみ（Ｐ−値＜０．０００１）；およ
びＤＮＡ−ＣＴＡＢ（１０μｇ） 対 ＤＮＡのみ（１０μｇ）（Ｐ−値＜０．
０００１）。これらのＰ−値は、表８中の値の統計学的有意性を確認した。
【０１９４】 （実施例１２） （ζ電位の測定） ζ電位の測定をＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ ３３１１６
製のＤＥＬＳＡ ４４０ ＳＸ ゼータサイザー（ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）で行っ
た。このシステムを、Ｃｏｕｌｔｅｒ製の移動度標準物質（ＥＭＰ ＳＬ７、ポ
リスチレンラテックスビーズの水性懸濁液）を使用して較正した。滅菌水でサン
プルセルをリンスした後、サンプルをサンプルセルに添加した。次いで、ビーム
をその最も低い値に合わせることにより計数器をゼロに設定した。参照について
電流を０．７ｍＡ、そしてサンプルについて２０Ｖに設定した。４つ全てのビー
ムからの検出器レベルを確認し、次いでソフトウエアから「ｒｕｎ」を選択する
ことによりサンプルを実行し、そして周波数測定を読み出した。このビームは２
０Ｈｚ離れているべきである。次いで、各サンプルについて平均ζ電位を読み出
す。
【０１９５】 本発明のいくつかの微粒子処方物についての測定を読み出し、そして結果を表
９に示す。結果が示すように、高分子の微粒子表面への吸着が微粒子のζ電位を
変化させる。
【０１９６】
【表９】 （実施例１３） （カプセル化した高分子および吸着した高分子を有する微粒子） （Ａ）．ＰＬＧ微粒子を、ＲＧ５０５ＰＬＧおよびＰＶＡを使用して調製し、
そしてこれは、アジュバントＬＴＫ６３をカプセル化する。１００ｍｇの微粒子
を４００μｇ／ｍｌのｐ２４ｇａｇタンパク質を含む５ｍｌのＰＢＳとインキュ
ベートした。次いで、この混合物を一晩室温で揺り動かしながらインキュベート
し、遠心分離することにより２０ｍｌのＰＢＳで２回、そして水で１回洗浄し、
次いで、凍結乾燥した。塩基性加水分解および中和後、吸着したタンパク質％お
よびカプセル化したアジュバント％を測定し；結果を表１０に表す。
【０１９７】 （Ｂ）．ＰＬＧ微粒子を、以下のように、ＳＤＳおよびＲＧ５０５ＰＬＧを使
用して調製し、そしてこれは、アジュバントＣｐＧオリゴヌクレオチドをカプセ
ル化する：５ｍｌのＤＣＭ中の６％ＲＧ５０５ポリマーを、０．５ｍｌの５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ中の５ｍｇ／ｍｌのＣｐＧと乳化し、ｗ／ｏエマルジョ
ンを形成した。このｗ／ｏエマルジョンを２０ｍｌの１％ＳＤＳに添加し、次い
で乳化し、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成した。微粒子を、一晩、溶媒エバポレ
ーションにより形成し、次いで洗浄し、遠心分離し、そして乳化した。１０ｍｇ
のＣｐＧ−カプセル化微粒子を１ｍｌのＤＣＭに溶解した。０．５ｍｌの水を抽
出オリゴヌクレオチドに添加し、次いで混合物を遠心分離し、そして水層を移動
相としてＰＢＳでサイズ排除カラム上に注入した。１０ｍｇのプラセボ微粒子を
１００μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドと混合し、そしてＤＣＭで上記のように
抽出し、そして標準物質としてカラム上に流した。粒子中に存在する閉じ込めら
れたＣｐＧオリゴヌクレオチドの量を、標準物質に対して算出した。
【０１９８】 ｐ５５ｇａｇを以下のようにＣｐＧ−カプセル化微粒子上に吸着した：５０ｍ
ｇの乳化したＣｐＧ−カプセル化微粒子を、１４０μｇのｐ５５ｇａｇタンパク
質を含む６Ｍウレア（ｐＨ９）と５ｍｌの２５ｍＭ ホウ酸塩と共に一晩インキ
ュベートした。この混合物を室温で一晩揺り動かしながらインキュベートし、２
０ｍｌのホウ酸緩衝液／６Ｍウレアで２回、そして２０ｍｌの水で２回洗浄し、
次いで、凍結乾燥した。
【０１９９】 １０ｍｇのＣｐＧ−カプセル化／ｐ５５ｇａｇ吸着した微粒子を、塩基加水分
解し、そして取り込んだ高分子％および吸着した高分子％を測定した。他に記載
しない限り、目標の負荷は、１．０％であった。結果を表１０に表す。
【０２００】
【表１０】 （実施例１４） （２種類の吸着高分子を有する微粒子） （Ａ）．本発明に従って、２種類以上の高分子を、両方の高分子を吸着してい
る微粒子を含む組成物中に投与し得るか、または各々単一の高分子を吸着してい
る、２種類以上の異なる微粒子を含む組成物中に投与し得る。例えば、以下のよ
うに、微粒子を調製し、これは、Ｅ２ポリペプチドおよびアジュバントＣｐＧオ
リゴヌクレオチドの両方を吸着している：ブランクのＰＬＧ−ＣＴＡＢを先に記
載したように調製した。２０ｍｇの乳化した微粒子を生理食塩水中の１ｍｌの２
００μｇ／ｍｌのＥ２と４時間インキュベートした。この混合物を室温で４時間
揺り動かし、１０，０００Ｇで遠心分離することにより２０ｍｌの正常な生理食
塩水で２回洗浄し、そしてペレットを、室温で４時間、２００μｇ／ｍｌのＣｐ
Ｇを含む１ｍｌのＴＥ緩衝液中のＣｐＧ溶液に再懸濁した。最後の上清を、遠心
分離することによりＴＥ緩衝液で２回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。１０ｍｇ
の吸着したＣｐＧおよびＥ２を有する微粒子を塩基加水分解し、そしてタンパク
質濃度をＢＡＣにより決定し、そして上清中の残りの量のＣｐＧをＨＰＬＣによ
り分析し、微粒子上に吸着したＣｐＧの量を測定した。結果を表１１に表し、こ
れは、両方の微粒子についてポジティブな吸着を示す。
【０２０１】 （Ｂ）．微粒子を本発明に従って調製した。一部をＥ２ポリペプチドを吸着す
るために使用し、一方、他部分をアジュバントＣｐＧオリゴヌクレオチドを吸着
するために使用した。ブランクのＰＬＧ−ＣＴＡＢを先に記載するように調製し
た。２０ｍｇの凍結乾燥した微粒子を生理食塩水中の１ｍｌの２００μｇ／ｍｌ
のＥ２と４時間インキュベートした。この混合物を室温で４時間揺り動かし、１
０，０００Ｇで遠心分離することにより、２０ｍｌの正常な生理食塩水で２回洗
浄し、次いで、凍結乾燥した。別々に、２０ｍｇの凍結乾燥した微粒子をＴＥ緩
衝液中の１ｍｌの２００μｇ／ｍｌのＣｐＧと４時間インキュベーションした。
この混合物を室温で４時間揺り動かし、２０ｍｌのＴＥ緩衝液と１０，０００Ｇ
で遠心分離することにより２回洗浄し、次いで、凍結乾燥した。吸着した高分子
のパーセントの測定の結果を表１１に現す。
【０２０２】
【表１１】 （実施例１５） （界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）とＰＶＡの組み合わせを使用して形成さ
れた微粒子） 以下の手順を使用して、２種類の界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）を含む
微粒子を形成した：ＰＶＡおよび界面活性剤：１０ｍｌのＤＣＭ中の５％ＰＬＧ
ポリマーおよび０．２％の界面活性剤ＤＯＴＡＰを１．０ｍｌの蒸留水と３分間
１２，０００ｒｐｍで乳化し、第１のｗ／ｏエマルジョンを形成した。このｗ／
ｏエマルジョンを４０ｍｌの０．８％ＰＶＡに添加し、そして３分間乳化し、第
２のｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成した。この第２のｗ／ｏ／ｗエマルジョンを
一晩攪拌し、溶媒をエバポレートし、そして微粒子を形成した。この微粒子を蒸
留水中で２回洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、この微粒子を本発明に従っ
て、高分子の吸着に用意した。
【０２０３】 同じ手順を使用して、ＰＶＡおよび界面活性剤ＤＤＡの組み合わせを含む微粒
子を形成した。
【０２０４】 （実施例１６） （吸着したｐ５５ＤＮＡを有する微粒子の免疫原性） 微粒子を界面活性剤ＣＴＡＢまたはＤＤＡを使用して、先の実施例のように形
成した。ｐ５５ＤＮＡを微粒子へ吸着させ、そして免疫原性を先の実施例に記載
する手順を使用して評価した。結果を以下の表１２に要約する。
【０２０５】
【表１２】 （実施例１７） （吸着したルシフェラーゼＤＮＡを有する微粒子を使用したインビボルシフェ
ラーゼ発現） 微粒子をＰＬＧおよび界面活性剤ＣＴＡＢを使用して、上記の手順を使用して
形成した。ルシフェラーゼＤＮＡを先に記載の方法を使用して、これらの微粒子
上に吸着させた。５μｇ用量のルシフェラーゼＤＮＡを使用するインビトロルシ
フェラーゼ発現を、ルシフェラーゼＤＮＡのみ（１２４８ｐｇ）および上に吸着
したルシフェラーゼＤＮＡを有する微粒子（２２５０ｐｇ）を使用して測定した
。インビボでのルシフェラーゼ発現を、以下のように投与後１日および１４日目
に筋肉において測定した：２つの群のマウス（ｎ＝５）を５０μｇのルシフェラ
ーゼプラスミドまたは５０μｇのＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ルシフェラーゼＤＮＡ微粒
子のどちらかで各々注射した。マウスの両方の群を２本の肢で前脛骨（ＴＡ）筋
に筋肉内注射した。２つの群における各マウスからの両方のＴＡ筋肉を、１日ま
たは１４日のどちらかで採取し、そして−８０℃冷凍庫中で保存した。この筋肉
を、ドライアイス上で乳鉢と乳棒ですった。粉状にした筋肉を、０．５ｍｌの１
×Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒでエッペンドルフチューブに収
集した。このサンプルを室温にて１５分間ボルテックスした。３回の凍結／吸引
後、サンプルを１０分間１４，０００ｒｐｍでスピンした。各マウスのＴＡ筋の
上清を各時点でプールし、そして２０ｕｌのサンプルをルシフェラーゼ発現につ
いて強化閃光下で、ＭＬ３０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）を使用してアッセイした
。
【０２０６】 ルシフェラーゼ決定を化学発光アッセイを使用して行った。緩衝液を調製し、
これは、１×Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に１ｍｇ／ｍ
ｌのＢＳＡを含む。１０ｍｇ／ｍｌでルシフェラーゼ酵素ストック（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ）を標準物質として使用して、５００ｐｇ／２０ｕｌの濃度に希釈した。こ
の標準物質を１：２に連続的に希釈し、Ｍｉｃｒｉｌｉｔｅ２プレート（Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ）に落とし、標準曲線を作成した。２０μｌのブランクおよびサンプ
ルをまた、プレート上に置き、１：２に連続的に希釈した。このプレートをＭＬ
３０００中に置き、そこで１００ｕｌのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒ
ｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルごとに注入した。強化閃光下で相対的
光ユニットを各サンプルについて測定した。
【０２０７】 結果を、表１３において以下に作表する。
【０２０８】
【表１３】 （実施例１８） （吸着した抗原 対 包括した抗原を用いる微粒子の免疫原性） 微粒子を、先の実施例において議論した手順を用いて調製した。次いで、Ｅ２
タンパク質を、上記のようにその上に吸着させた。Ｅ２を用いて、その上に吸着
させるのではなく、その中に包括させた微粒子もまた、上記のように調製した。
この微粒子を、各型の微粒子を用いる１０匹のマウスの免疫後にＩｇＧ抗体を誘
導するそれらの能力について評価した。各マウスからの血清の相乗平均力価（Ｇ
ＭＴ）を測定し、次いで、１０匹の動物のグループについて平均した。標準誤差
（ＳＥ）もまた計算した。フィッシャーのＰＬＳＤ（有意性レベル５％）をｐ＝
０．０００６で測定した。その結果を以下の表１４に示す。この結果は、本発明
の吸着した微粒子を使用する体液性免疫応答の卓越した誘導を明確に実証する。
【０２０９】
【表１４】 （実施例１９） （ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質を吸着した微粒子の免疫原性） ＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子を、先の実施例において議論した手順を用いて調製し
た。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）からのＥ１Ｅ２タンパク質をその上に吸着させ
た。その粒子を、ミョウバンアジュバントのあるなしで、１０μｇまたは１００
μｇのタンパク質のいずれかを提供するように計算された微粒子の投薬量でマウ
スを免疫するために使用した。相乗平均力価を計算し、そしてその結果を以下の
表１５に示す。
【０２１０】
【表１５】 この結果が示すように、タンパク質を吸着した微粒子は、１０μｇ用量で卓越
した免疫応答を産生する。このことは、この微粒子が、遊離のＤＮＡがこのよう
な応答を生成することができない、低い用量で免疫応答を誘発する際に有用であ
る利点を有することを実証する。
【０２１１】 （実施例２０） （ｐ２４ｇａｇタンパク質を吸着した微粒子の免疫原性） ＰＬＧ−ＰＶＡ微粒子を、先の実施例に議論した手順を用いて調製した。次い
で、タンパク質ｐ２４ｇａｇを、上記のようにその上に吸着させた。その微粒子
を、１０匹のマウスの免疫後にＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、およびＩｇＧ２ａ抗
体を誘導するそれらの能力について評価した。２回目の免疫後２週間（２ｗｐ２
）マウスおよび３回目の免疫後２週間（２ｗｐ３）のマウスから収集した血清の
相乗平均力価（ＧＭＴ）を測定し、次いで、１０匹の動物のグループについて平
均した。標準誤差（ＳＥ）もまた計算した。その結果を以下の表１６に示す。こ
の結果は、本発明の吸着した微粒子を使用する体液性免疫応答の卓越した誘導を
明確に実証する。
【０２１２】
【表１６】 （実施例２１） （ｐ５５ｇａｇタンパク質および種々のアジュバントのＩＭ免疫） ＰＬＧ／ＣＴＡＢ、ＰＬＧ／ＳＤＳ、およびＰＬＧ／ＰＶＡ微粒子を、先の実
施例において上記に記載したように形成した。微粒子上に吸着した抗原ｐ５５ｇ
ａｇタンパク質を用いてマウスを免疫すること 対 遊離の可溶性ｐ５５ｇａｇ
を提供することの異なる効果を分析するために、そして、他の微粒子上にもまた
吸着したか、あるいは可溶性形態で供給されるかの、アジュバントＣｐＧ（Ｃｐ
Ｇモチーフを有する２０塩基長の一本鎖オリゴヌクレオチド）を有することの効
果を決定するために、微粒子の８つのグループを作製した。異なるグループは以
下のように調製した： グループ１は、ＣｐＧを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した可溶性ｐ５
５ｇａｇタンパク質（２Ｍ 尿素を有するｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液中で２ｍｇ
／ｍｌで酵母において産生された組換えＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇタンパク質）を
使用した。
【０２１３】 グループ２は、ＣｐＧを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した、ｐ５５ｇ
ａｇが吸着したＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を使用した。
【０２１４】 グループ３は、遊離のＣｐＧと混合した、ｐ５５ｇａｇが吸着したＰＬＧ／Ｓ
ＤＳ粒子を使用した。
【０２１５】 グループ４は、ｐ５５ｇａｇが吸着し、アジュバントを有さないＰＬＧ／ＳＤ
Ｓ粒子を使用した。
【０２１６】 グループ５は、ＣｐＧが吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した、ｐ５５ｇ
ａｇが包括されたＰＬＧ／ＰＶＡ粒子を使用した。
【０２１７】 グループ６は、コントロールであり、抗原を使用せず、そして可溶性ＣｐＧを
使用した。
【０２１８】 グループ７は、別のコントロールであり、可溶性ｐ５５ｇａｇタンパク質を使
用し、そしてアジュバントを使用しなかった。
【０２１９】 グループ８は、別のコントロールであり、ｇａｇ遺伝子を発現するワクシニア
ウイルス（ｖｖ ｇａｇ）のみを使用し、アジュバントを使用しなかった。
【０２２０】 各グループについて、１０匹のマウスを、十分な量の微粒子または遊離の分子
で免疫し、その結果、グループ８（これは、１０×１０7ｐｆｕの用量で使用し
た）を除いて、ｐ５５ｇａｇ抗原およびＣｐＧアジュバントの投薬量は各２５μ
ｇである（グループに存在する場合）。免疫の経路は、グループ８（この経路は
ＩＰである）を除いて、ＩＭであった。免疫後、血清抗ｐ５５ ＩｇＧ力価を測
定し、その結果は以下の表１７Ａに見られる（３ｗｐ２、２回目の免疫３週間後
）。表１７Ｂは、アイソタイプであるＩｇＧ１成分およびＩｇＧ２ａ成分の分析
を提供し、これは、ＩｇＧ２Ａ／ＩｇＧ１の比を含む。ＣＴＬによる標的の溶解
はまた、各グループを用いて測定された。それらの結果は、以下の表１８Ａおよ
び１８Ｂに見られる（２つの別々の実験）。
【０２２１】
【表１７Ａ】
【０２２２】
【表１７Ｂ】
【０２２３】
【表１８Ａ】 aＳｖＢ細胞株を、関連性のないペプチドでパルスしたb ＳｖＢ細胞株を、ｐ７ｇペプチドでパルスした
【０２２４】
【表１８Ｂ】 aＳｖＢ細胞株を、関連性のないペプチドでパルスしたb ＳｖＢ細胞株を、ｐ７ｇペプチドでパルスした （実施例２２） （ｐ５５ｇａｇタンパク質またはｐ５５ ＤＮＡおよび種々のアジュバントの
ＩＭ免疫） ＰＬＧ微粒子を、以前に上記で記載されるように形成した。微粒子のグループ
を、微粒子に吸着したｐ５５ ｇａｇタンパク質でマウスを免疫すること 対
遊離の可溶性ｐ５５ｇａｇを提供することの異なる効果を分析するため、および
、他の微粒子上にまた吸着したか、または遊離の可溶性形態で提供したかのアジ
ュバントＣｐＧ（ＣｐＧ１またはＣｐＧ２、異なるオリゴヌクレオチドのグルー
プを表す）を有する効果を決定するために作成した。１０匹の動物のグループを
、以下のようにして異なる処方で免疫した： グループ１は、ｐ５５ｇａｇタンパク質（２Ｍ 尿素を有するｔｒｉｓ／Ｎａ
Ｃｌ緩衝液中で２ｍｇ／ｍｌで酵母において産生された組換えＨＩＶ ｐ５５
ｇａｇタンパク質）と混合した、ＣｐＧを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用
した。
【０２２５】 グループ２は、ｐ５５ｇａｇタンパク質が吸着したＰＬＧ／ＳＤＳ粒子と混合
した、ＣｐＧ１を吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２２６】 グループ３は、遊離のＣｐＧと混合した、ｐ５５ｇａｇタンパク質が吸着した
ＰＬＧ／ＳＤＳ粒子を使用した。
【０２２７】 グループ４は、ｐ５５ｇａｇタンパク質が吸着し、アジュバントを有さないＰ
ＬＧ／ＳＤＳ粒子を使用した。
【０２２８】 グループ５は、ＣｐＧ１が吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子およびＰＶＡ／ｐ５
５ｇａｇタンパク質が包括されたＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２２９】 グループ６は、ｐ５５ｇａｇタンパク質が吸着したＰＬＧ／ＳＤＳ粒子と混合
した、ＣｐＧ２を吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子である。
【０２３０】 グループ７は、コントロールであり、ｐ５５ｇａｇタンパク質が吸着したＰＬ
Ｇ／ＳＤＳ粒子およびブランクＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子を使用する。
【０２３１】 グループ８は、別のコントロールであり、遊離のＣｐＧ２のみを使用する。
【０２３２】 グループ９は、別のコントロールであり、遊離のＣｐＧ１のみを使用する。
【０２３３】 グループ１０は、別のコントロールであり、遊離の可溶性ｐ５５ｇａｇタンパ
ク質１のみを使用する。
【０２３４】 各グループについて、１０匹のマウスを、十分な量の微粒子または遊離の分子
で免疫し、その結果、ｐ５５ｇａｇ抗原およびＣｐＧアジュバントの投薬量は各
２５μｇであった（そのグループに存在する場合）。免疫の経路はＩＭ ＴＡで
あった。免疫後、血清抗ｐ５５ ＩｇＧ力価を測定し、その結果は以下の表１９
Ａに見られる。その血清を２ｗｐ２（２回目の免疫２週間後）および２ｗｐ３（
３回目の免疫２週間後）で測定した。
【０２３５】
【表１９Ａ】 同様の実験を、種々のＰＬＧ微粒子を使用して、界面活性剤としてＣＴＡＢを
使用して、抗原としてｐ５５ｇａｇＤＮＡを使用して、アジュバントしてＣｐＧ
またはＬＴＫ６３を使用して、および以下のグループを使用して行った： グループ１は、１μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＰＶＡ／ＣＴ
ＡＢ粒子を使用した。
【０２３６】 グループ２は、１０μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＰＶＡ／Ｃ
ＴＡＢ粒子を使用した。
【０２３７】 グループ３は、１μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子
を使用した。
【０２３８】 グループ４は、１０μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒
子を使用した。
【０２３９】 グループ５は、粒子またはアジュバントなしで、１μｇの可溶性ｐ５５ｇａｇ
ＤＮＡを使用した。
【０２４０】 グループ６は、粒子またはアジュバントなしで、１０μｇの可溶性ｐ５５ｇａ
ｇＤＮＡを使用した。
【０２４１】 グループ７は、遊離のＣｐＧと混合した、１μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着
したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２４２】 グループ８は、吸着したＣｐＧ１を有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子と混合した、
１μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２４３】 グループ９は、遊離のＬＴＫ６３と混合した、１μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを
吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２４４】 グループ１０は、吸着したＬＴＫ６３を有するＰＬＧ／ＳＤＳ粒子と混合した
、１μｇのｐ５５ｇａｇＤＮＡを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２４５】 各グループについて、１０匹のマウスを、十分な量の微粒子または遊離の分子
で免疫し、その結果、示されるように、ｐ５５ｇａｇ抗原およびＣｐＧアジュバ
ントの投薬量は各２５μｇであった（そのグループに存在する場合）。免疫の経
路はＩＭ ＴＡであった。免疫後、血清抗ｐ５５ ＩｇＧ力価を測定し、その結
果は以下の表１９Ｂに見られる。その血清を２ｗｐ２（２回目の免疫２週間後）
で測定した。
【０２４６】
【表１９Ｂ】 同様の実験を、種々のＰＬＧ微粒子またはＭＦ５９ミクロエマルジョンを使用
して、界面活性剤としてホスファチジン酸（ＰＡ）、ＤＳＳ、ＤＯＴＡＰ、また
はＣＴＡＢを使用して、抗原としてｇｐ１２０タンパク質を使用して、および以
下のグループを使用して行った： グループ１は、遊離のｇｐ１２０タンパク質を有するＭＦ５９エマルジョンを
使用した。
【０２４７】 グループ２は、吸着したｇｐ１２０タンパク質を有するＭＦ５９／ＰＡエマル
ジョンを使用した。
【０２４８】 グループ３は、包括されたｇｐ１２０タンパク質を有するＰＬＧ／ＤＳＳを使
用した。
【０２４９】 グループ４は、吸着したｇｐ１２０タンパク質を有し、そしてアジュバントを
有さないＰＬＧ／ＤＳＳ粒子を使用した。
【０２５０】 グループ５は、吸着したｇｐ１２０タンパク質が吸着したＰＬＧ／ＤＳＳ粒子
およびＣｐＧが吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２５１】 グループ６は、ＣｐＧを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２５２】 グループ７は、ＣｐＧ１を吸着したＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ ８０粒子と混合し
た、吸着したｇｐ１２０タンパク質を有するＰＬＧ／ＤＳＳ粒子を使用した。
【０２５３】 グループ８は、ＣｐＧ１を吸着したＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ ８０エマルジョン
を使用した。
【０２５４】 グループ９は、ｇｐ１２０タンパク質を吸着するＭＦ５９／ＰＡ粒子と混合し
た、ＣｐＧを吸着したＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用した。
【０２５５】 グループ１０は、遊離のＣｐＧ１および可溶性ｇｐ１２０タンパク質を使用し
た。
【０２５６】 各グループについて、１０匹のマウスを、十分な量の微粒子または遊離の分子
で免疫し、その結果、ｇｐ１２０抗原およびＣｐＧアジュバントの投薬量は各２
５μｇであった（そのグループに存在する場合）。免疫の経路はＩＭ ＴＡであ
った。免疫後、血清抗ｇｐ１２０ ＩｇＧ力価を測定し、その結果は以下の表１
９Ｃに見られる。その血清を２ｗｐ２（２回目の免疫２週間後）および２ｗｐ３
（３回目の免疫２週間後）で測定した。
【０２５７】
【表１９Ｃ】 上記のデータは、ｇｐ１２０タンパク質抗原の場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチ
ドが他のＰＬＧ粒子またはＭＦ５９／ＤＯＴＡＰエマルジョンに吸着されていて
も、いなくても、ＰＬＧ粒子に吸着された抗原で免疫されたグループにおいて最
も高い免疫応答が誘発されたことを実証する。対照的に、抗原がＭＦ５９／ＤＯ
ＴＡＰエマルジョンに吸着され、そしてＣｐＧオリゴヌクレオチドがＰＬＧ粒子
に吸着された場合、免疫応答は基本的に些細であった。本明細書中の教示によっ
て、当業者は、任意の特定の抗原についての最適な吸着された微粒子のおよび／
またはミクロエマルジョンの組み合わせを容易に決定し得る。
【０２５８】 （実施例２３ ｐ５５ＤＮＡの吸着および捕捉） 吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子を上記の実施例に記
載されるように形成し、そしてブランク粒子、遊離ＣＴＡＢ、および遊離ｐ５５
ＤＮＡに対するＩＭ免疫後４週間および２度目のＩＭ免疫後２週間の抗体の誘導
について試験した。結果を以下の表２０Ａに表し、そして結果は、溶液中で遊離
するよりも微粒子に吸着されたｐ５５ＤＮＡを有することの明瞭な利点を示す。
【０２５９】 （表２０Ａ）
【０２６０】
【表２０Ａ】 ＣＴＬの誘導を同じ処方物で調べ、そして標的：エフェクターの比（４：１、
１５：１、および６０：１）を使用しての１度目の免疫後３週後に測定した。結
果を以下の表２０Ｂに表し、結果は微粒子に吸着されたｐ５５ＤＮＡの利点を示
す。
【０２６１】
【表２０Ｂ】 吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微量粒子、および捕捉され
たｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＰＶＡ微粒子を、上記の実施例に記載されるよ
うに形成した。マウスのＩＭ免疫および抗体の誘導（血清の収集および分析）を
、１度目の免疫後４週間（４ｗｐｌ）で、および２度目の免疫後２、４、６、１
３、ならびに１５週間（それぞれ２ｗｐ２、４ｗｐ２、６ｗｐ２、１３ｗｐ２、
ならびに１５ｗｐ２）で、上記の実施例に記載されるように行った。以下の表２
０Ｃに示される結果は、捕捉されたｐ５５および遊離のｐ５５の両方にわたって
吸着された微粒子の明瞭な利点を実証する。
【０２６２】 （表２０Ｃ）
【０２６３】
【表２０Ｃ】 吸着されたｐ５５ＤＮＡ（１％ＤＮＡ）を有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ／ＰＶＡ粒
子を、上記の実施例に記載されるように調整し、そしていくつかの特徴について
測定した。結果を以下の表２０Ｄに表す。
【０２６４】 （表２０Ｄ）
【０２６５】
【表２０Ｄ】 ＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子およびＰＬＧ／ＰＶＡ／ＣＴＡＢ粒子を、上記のように
調製し、そしてｐ５５ＤＮＡをそれらの粒子上に吸着した。マウスをｐ５５ＤＮ
Ａの用量が、１μｇまたは１０μｇのいずれかである粒子で免疫した。２度目の
免疫後２週間の抗体誘導実験の結果を上記の表１９Ｂに表し、そして以下の表２
０Ｅに要約した。
【０２６６】 （表２０Ｅ）
【０２６７】
【表２０Ｅ】 界面活性剤としてＤＯＴＡＰまたはＣＴＡＢを使用し、かつ抗原としてｐ５５
ＤＮＡを使用する種々のＰＬＧ微粒子、またはＭＦ５９ミクロエマルジョンを調
製し、そして以下のようにマウスを免疫するために使用した： グループ１は、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用
した。
【０２６８】 グループ２は、捕捉されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用
した。
【０２６９】 グループ３は、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＤＯＴＡＰ粒子を使
用した。
【０２７０】 グループ４は、遊離ＣＴＡＢおよび遊離ｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ粒子を使
用した。
【０２７１】 グループ５は、遊離ｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ８０エマルジ
ョンを使用した。
【０２７２】 グループ６は、遊離ｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９エマルジョンを使用した。
【０２７３】 グループ７は、遊離ｐ５５ＤＮＡを単独で使用した。
【０２７４】 グループ８は、ブランクＰＬＧ粒子および遊離したｐ５５ＤＮＡを使用した。
【０２７５】 グループ９は、ブランクＰＬＧ粒子、遊離ＣＴＡＢ、および遊離したｐ５５Ｄ
ＮＡを使用した。
【０２７６】 各グループについて、１０匹のマウスを十分量のｐ５５ＤＮＡの用量が１μｇ
である微粒子または遊離分子で免疫した。免疫の経路は、ＩＭ ＴＡであった。
免疫後、血清抗ｐ５５ＤＮＡの力価を測定し、測定結果を以下の表２０Ｆに表し
た。血清を３ｗｐ１（１度目の免疫後、３週間）および３ｗｐ２（２度目の免疫
後、３週間）で測定した。
【０２７７】 （表２０Ｆ）
【０２７８】
【表２０Ｆ】 抗原として１μｇの用量（他に示されない場合を除いて）で、ＤＯＴＡＰ４０
またはＤＯＴＡＰ８０、およびｐ５５ＤＮＡを使用するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子
およびＰＬＧ微粒子、およびＭＦ５９ミクロエマルジョンを、上記に記載される
ように調製し、そして以下のようにマウスを免疫するために使用した： グループ１は、バーストされていない吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ
／ＣＴＡＢ粒子を使用した（すなわち、これらの粒子は、免疫の前にインビトロ
でバーストされる）。
【０２７９】 グループ２は、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子を使用
した。
【０２８０】 グループ３は、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ粒子（比フ
リーズドライ）を使用した。
【０２８１】 グループ４は、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ４０エ
マルジョンを使用した。
【０２８２】 グループ５は、１０μｇの用量で、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９
／ＤＯＴＡＰ４０エマルジョンを使用した。
【０２８３】 グループ６は、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ８０エ
マルジョンを使用した。
【０２８４】 グループ７は、１０μｇの用量で、吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９
／ＤＯＴＡＰ８０エマルジョンを使用した。
【０２８５】 グループ８は、遊離ｐ５５ＤＮＡを使用した。
【０２８６】 グループ９は、１０μｇの用量で、遊離ｐ５５ＤＮＡを使用した。
【０２８７】 グループ１０は、１０μｇの用量で、遊離ｐ５５ＤＮＡを有するＭＦ５９エマ
ルジョンを使用した。
【０２８８】 各グループについて、１０匹のマウスを十分量のｐ５５ＤＮＡの用量が、示さ
れるように１または１０μｇの用量である微粒子または遊離分子で免疫した。免
疫の経路は、ＩＭ ＴＡであった。免疫後、血清抗ｐ５５ＤＮＡ力価を測定し、
測定結果を以下の表２０Ｇに表す。この血清を、４ｗｐ１（１度目の免疫後、４
週間）および２ｗｐ２（２度目の免疫後、２週間）で測定した。
【０２８９】 （表２０Ｇ）
【０２９０】
【表２０Ｇ】 （実施例２４ モルモットにおける免疫応答の微粒子誘導） 吸着されたｇｐ１２０ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子を、上記の実施
例において記載されるように形成した。他のサンプルを以下の表２０に示し、そ
してそれらとしては、ｇｐ１２０ＤＮＡによってコードされる微粒子（リン酸ア
ルミニウムを有するか、有さない）、コントロールの遊離可溶性ｇｐ１２０（リ
ン酸アルミニウムを有するか、有さない）、およびＭＦ５９タンパク質が挙げら
れる。モルモットのＩＭ免疫および抗体の誘導（血清の収集および分析）を上記
の実施例に記載されるように行った。結果を以下の表２１に示す。
【０２９１】 （表２１）
【０２９２】
【表２１】 （実施例２５ 微粒子に吸着されたｐ５５ＤＮＡを有する鼻腔内（ＩＮ）免疫
） 吸着されたｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＣＴＡＢ微粒子、および吸着された
ｐ５５ＤＮＡを有するＰＬＧ／ＤＤＡ微粒子を、上記の実施例に記載されるよう
に形成した。２５または１００μｇでのマウスのＩＮ免疫、抗体誘導（血清の収
集および分析）、およびＣＴＬ誘導を上記の実施例において記載されるように、
１度目の免疫後、２週間および４週間（２ｗｐ１、４ｗｐ１）で、２度目の免疫
後、２週間および４週間（２ｗｐ２、４ｗｐ２）で、および３度目の免疫後、２
週間および４週間（２ｗｐ３、４ｗｐ３）で行った。コントロールとしては、可
溶性ｐ５５ＤＮＡ単独、または１０μｇのコレラ毒素を有する免疫が挙げられる
。抗体誘導についての結果を、表２２に示し、そしてＣＴＬによる溶解（４度目
の免疫後、４週間で）の結果を、以下の表２３に示した。
【０２９３】 （表２２）
【０２９４】
【表２２】 （表２３）
【０２９５】
【表２３】 （実施例２６ アジュバント組成物の調整） ＭＴＰ−ＰＥは、ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ（Ｂａｓａｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎ
ｄ）により提供された。スクアレンおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０をＳｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）より得た。ＣＦＡ
およびＩＦＡをＧｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）より得た。水酸
化アルミニウム（Ｒｅｈｓｏｒｐｔａｒ）をＲｅｈｅｉｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｈｅｉｇｈｔｓ ＮＪ）より得た。
【０２９６】 油滴の調製を多くの方法によって行った。第１の方法において、４％スクアレ
ン、０．００８％ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、２５０μｇ／ｍｌＭＴＰ−ＰＥ
および抗原（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中）を含む混合物を６回、２３ゲ
ージ針を通過させた。油滴からなるこのエマルジョンは、１０ミクロンの範囲の
サイズであり、そしてＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯと称される。第２の方法は、上記の混
合物をＫｉｒｋｌａｎｄ乳化剤を５回、通過させる工程を包含する。油滴からな
るこのエマルジョンは、主に１〜２ミクロンであり、そしてＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ
−ＫＥと称される。このＫｉｒｋｌａｎｄ乳化剤（Ｋｉｒｋｌａｎｄ Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ、Ｗａｌｎｕｔ Ｃｒｅｅｋ、ＣＡ）は、小型の市販のナイフの刃をつ
けたホモジナイザー（例えば、Ｇａｕｌｉｎ Ｍｏｄｅｌ ３０ＣＤおよびＲａ
ｉｎｎｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂ Ｔｙｐｅ ８．３０Ｈ）であり、作業チャンバー
において約１０００ｐｓｉを産生する。第３の方法において、０．３〜１８％ス
クアレンおよび０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌ ＭＴＰ−ＰＥ（ＴＷＥＥＮ（登録商
標）８０を含むか、含まない）を含む混合物を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ
（型番１１０Ｙ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を５，０
００〜３０，０００ｐｓｉで通過させた。代表的には、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉ
ｚｅｒ中で５０ｍｌのエマルジョンを、５分、または１００ｍｌを１０分混合し
た。生じるエマルジョンは、スクアレン、ＭＴＰ−ＰＥならびに界面活性剤の濃
度、およびにｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒの操作圧力ならびに温度に依存する
１００〜７５ｎｍの油滴からなった。この組成物は、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦ
と称される。
【０２９７】 （実施例２７ ＣＴＡＢを使用する微粒子の調製） ブランク微粒子をＣＴＡＢを使用して以下のように産生した。使用した溶液： （１）ジメチルクロライド中の４％ＲＧ５０４ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）。 （２）水中の０．５％ＣＴＡＢ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０２９８】 特に、１２．５ｍｌのポリマー溶液と１．２５ｍｌの蒸留水とを混合し、ｗ／
ｏエマルジョンを形成するために１０Ｋｒｐｍで１０ｍｍプローブを備えたＯｍ
ｎｉベンチトップ（ｂｅｎｃｈｔｏｐ）ホモジナイザーを使用して３分ホモジネ
ートし、微粒子を作製した。ｗ／ｏエマルジョンを５０ｍｌの０．５％ＣＴＡＢ
溶液に添加し、そしてｗ／ｏ／ｗエマルジョンを形成するために３分間、ホモジ
ネートした。ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを溶媒の蒸発のために一晩攪拌し続け、微
粒子を形成した。次いで、形成された微粒子を３８μメッシュを通して濾過し、
４回遠心分離することにより水で洗浄し、そして凍結乾燥した。次いで、微粒子
を将来の使用のためにＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒサイズで分類した。
【０２９９】 （実施例２８ 免疫応答表現型に対するＭＰＬおよびＣｐＧオリゴヌクレオチ
ドの効果） １０匹のマウスのグループを以下のように免疫した：グループ１）ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドの存在下および非存在下で組換えＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇタンパ
ク質を有するＭＦ５９；グループ２）ＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇタンパク質を有す
るモノホスホリル脂質（ｌｉｐｄ）Ａ（ＭＰＬ）を取り込むＭＦ５９；グループ
３）ＣｐＧオリゴヌクレオチドの存在下および非存在下で表面に吸着されたＨＩ
Ｖ ｐ５５ ｇａｇタンパク質を有するＳＤＳ／ＰＬＧ微粒子；グループ４）Ｍ
ＰＬを有する微粒子に吸着されたＳＤＳ／ＰＬＧ ｐ５５；グループ５）ＭＰＬ
を有する組換えタンパク質；およびグループ６）組換えタンパク質単独。ＭＦ５
９の用量は、２５μｌ／動物であり、そしてＨＩＶ ｐ５５タンパク質は２５μ
ｇ／動物であり、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５０μｇ／動物であり、ＭＰＬ
は１０μｇ／動物で与えられた。微粒子は、２５μｇのタンパク質を含む用量で
与えられた。
【０３００】 ＭＰＬをＲｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓ．Ｉｎｃ．（Ｈａｍｉｌｔ
ｏｎ、Ｍｏｎｔａｎａ）より得た。ＭＰＬ／ＭＦ５９を、ＣＨＣｌ3中にＭＰＬ
を溶解し、スクアレン／Ｓｐａｎ８５に溶液を移し、そして標準ＭＦ５９エマル
ジョンをＴｗｅｅｎ８０／Ｈ2Ｏと処方することによって調製した。
【０３０１】 組換え酵母ｐ５５ ｇａｇタンパク質を、当業者に公知の標準的発酵技術（酵
母がダイノミル（ｄｙｎｏｍｉｌｌ）によって分裂する）によって産生した。ｐ
５５タンパク質を、尿素／ＮａＣｌ緩衝液中の細胞溶解物より得たペレット物質
より抽出した。尿素溶液タンパク質を、６Ｍの尿素の存在下でアニオン交換クロ
マトグラフィーによって９０％以上の均一性まで精製した。
【０３０２】 毎週の間隔で３度の筋肉内注射を受けたマウス、および血清サンプルを、３度
目の注射後２週間で収集し、そしてＣＡ Ａｅｑｕｏｒｎ（Ｓｅａｌｉｔｅ Ｉ
ｎｃ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）に基づく化学発光ＥＬＩＳＡアッセイを使用
して総ＩｇＧ（Ｇ＋Ｍ＋Ａ）、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａについてアッセイした
。代表的なアッセイの結果を図１および２に示す。吸着された微粒子の場合、Ｃ
ｐＧオリゴヌクレオチドを受けた動物は、吸着された粒子単独のＩｇＧ２ａ応答
より１９倍高いＩｇＧ２ａ応答、ＭＰＬを有する吸着された粒子よりも７倍高い
応答、そしてタンパク質単独よりも１７倍高い応答を示した。ＭＦ５９を有する
タンパク質の場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを受けた動物は、ＣｐＧオリゴヌ
クレオチドの非存在下で誘導されたＩｇＧ２ａ応答よりも７倍高いＩｇＧ２ａ応
答を示し、ＭＦ５９およびＭＰＬの組み合わせよりも２．６倍より高く、ＭＰＬ
を有するタンパク質よりも１５倍より高く、そしてタンパク質単独よりも２３倍
より高かった。これらの結果は、ＭＦ５９またはＰＬＧ微粒子のいずれかと組み
合わされたＣｐＧオリゴヌクレオチドが、ＭＦ５９またはＰＬＧ微粒子のいずれ
かを有するＭＰＬによって誘導されたリンパ球応答よりも有意により高いＴｈ１
リンパ球応答を刺激することを示す。
【０３０３】 オリゴヌクレオチドはＯｌｉｇｏ Ｅｔｃ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌ
ｌｅ、ＯＲ）によって調製された。ＣｐＧ１は、配列番号２８を含む。ＣｐＧ２
は、非ＣｐＧ配列ｔｃｃａｇｇａｃｔｔｃｔｃｔｃａｇｇｔｔ（配列番号２９）
を含む。
【０３０４】 （実施例２９ ｐ５５ ｇａｇタンパク質のＩＭ免疫および種々のアジュバン
ト） ９匹のマウスのグループを以下のように筋肉内免疫した（記載される場合を除
く）：グループ１）ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの存在下での組換えＨＩＶ ｐ
５５ ｇａｇタンパク質を有するＭＦ５９、およびＤＯＴＡＰ８０；グループ２
）ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの存在下での組換えＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇタン
パク質を有するＭＦ５９、およびＤＯＴＡＰ１６０；グループ３）組換えＨＩＶ
ｐ５５ ｇａｇタンパク質を有するＭＦ５９およびＤＯＴＡＰ；グループ４）
組換えＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇタンパク質を有するＭＦ５９；グループ５）Ｃｐ
Ｇ１オリゴヌクレオチドの存在下での組換えＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇタンパク質
を有するＭＦ５９；グループ６）組換えＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇタンパク質およ
びＤＯＴＡＰ１６０；グループ７）組換えＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇタンパク質お
よびＣｐＧ１オリゴヌクレオチド；グループ８）ＣｐＧ１オリゴヌクレオチドの
存在下での組換えＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇタンパク質、およびＤＯＴＡＰ１６０
；およびグループ９）ｖｖ−ｇａｇ−ｐｏｌ（２×１０7ｐｆｕ）ＩＰ。ＭＦ５
９ｎｏ用量は２５μｌ／動物であり、ＨＩＶ ｐ５５タンパク質は２５μｇ／動
物であり、そしてＣｐＧオリゴヌクレオチドは５０μｇ／動物であった。免疫後
、血清抗ｐ５５ ＩｇＧ力価を測定し、測定結果を図３に示した。示されるよう
に、正に荷電したエマルジョン（ＤＯＴＡＰを有する）の存在下での抗体力価は
、正に荷電したエマルジョン（ＤＯＴＡＰを有さない）の存在下の２倍の高さで
ある。ＣＴＬによる標的（ＳｖＢ細胞株）の溶解をまた、各グループで測定し、
測定結果を図４に表した。示されるように、正に荷電したエマルジョンを生じる
ためのＤＯＴＡＰの添加は、ＣＴＬ応答を増加する。
【０３０５】 （実施例３０ イオン性エマルジョンアジュバント） イオン性界面活性剤を含む１ミクロン未満のエマルジョンを、非イオン性安定
化ＭＦ５９処方物を使用して処方した。いくつかのイオン性界面活性剤をスクア
レン中の溶解度について試験した。３つのイオン性界面活性剤ジオレオイル−３
−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジオレオイル−ｓｎ−グ
リセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＥＰＣ）およびジオレオイル−ホスファチ
ジン酸（ＤＰＡ）が、スクアレンに可溶性であることを見出した。各界面活性剤
を、４〜５２ｍｇ／ｍｌスクアレンの範囲の濃度で、スクアレン／１０％Ｓｐａ
ｎ８５に溶解することによって、プロトタイプイオン性エマルジョンを処方した
。スクアレン／界面活性剤混合物を５ｍｌのスクアレン／１００ｍｌ Ｈ2Ｏの
０．５％Ｔｗｅｅｎ８０／Ｈ2Ｏを用いて乳化した。プレエマルジョンをＳｉｌ
ｖｅｒｓｏｎホモジナイザーを用いてホモジネート（５分、５０００ＲＰＭ）す
ることによって生成し、そして最終エマルジョンを微小流動化（約１０，０００
ｐｓｉ、５回の通過、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ１１０Ｓ）によって作製し
た。各型のエマルジョンを液滴のサイズおよびζ電位について試験した。これら
の結果を以下の表２４に示す。
【０３０６】
【表２４】 ＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ／１６０およびＭＦ５９／ＤＯＴＡＰ／８０をＤＮＡお
よびＣｐＧ ＯＤＮの両方の結合について試験した。２つのＭＦ５９／ＤＯＴＡ
Ｐ処方物、１６０ｍｇ／１００ｍｌＤＯＴＡＰおよび８０ｍｇ／１００ｍｌＤＯ
ＴＡＰ使用してｐ５５ＤＮＡを吸着した。これらのエマルジョンを各々５０μｇ
／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌおよび２００μｇ／ｍｌのＤＮＡと共に４℃で一晩イ
ンキュベートした。ＤＯＴＡＰを含まないＭＦ５９／水のコントロールもまた５
０、１００および２００μｇのＤＮＡと共にインキュベートした。これらのエマ
ルジョンをエアーフュージ（ａｉｒ ｆｕｇｅ）を使用して遠心分離し、そして
各サンプルについての浮遊物（ｓｕｂｎａｔａｎｔ）を酸加水分解し、そしてＤ
ＮＡアッセイを行った。（なぜなら、Ａ２６０測定を妨げる十分な濁度が存在す
るから）。ＤＯＴＡＰコントロールサンプルを有さないＭＦ５９を使用して標準
曲線を確立した。この標準曲線よりＭＦ５９／ＤＯＴＡＰサンプルの浮遊物中に
残ったＤＮＡの量を算出し、これらの結果を以下の表２５に示す。
【０３０７】
【表２５】 ＭＦ５９をスクアレン中のＤＰＴＡＰを使用して作製した。これを０．５ｍｇ
／ｍｌＣｐＧと共に一晩インキュベートし、翌日そのエマルジョンを、エッペン
ドルフ（ｅｐｐｉｎｄｏｒｆ）遠心分離中で５０分間、遠心分離し、そして浮遊
物をＧＰＣカラムにかけた。０．５／ｍｌＣｐＧを通常のＭＦ５９に添加し、そ
してスピンダウンし、次いでカラム上で分析した。ＭＦ５９／Ｄｏｔａｐ浮遊物
におけるＣｐＧの量は、ＣｐＧでスパイクしたＭＦ５９の量の５０％であった。
このことは、ＣｐＧの投入量のほとんど５０％が、実際に油相にあることを示す
。
【０３０８】 吸着等温線（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｓｏｔｈｅｒｍ）が、次になされ、こ
こでＣｐＧが、１００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌおよび２ｍ
ｇ／ｍｌで、ＭＦ５９／Ｄｏｔａｐに添加された。これを４℃で約４日間放置し
、ついで、エアーフュージでサンプルを遠心分離し、続いて０．５ｍｇ／ｍｌＣ
ｐＧで、ＭＦ５９をスパイクした。
【０３０９】 浮遊物（非常に透明である）を、ＧＰＣカラムにかけ、次いで０．５μｇ、１
μｇ、５μｇ、１０μｇおよび２０μｇでスパイクされたＭＦ５９を用いて標準
曲線を作製した。吸着の百分率を測定し、そして測定結果を以下の表２６に示し
た。
【０３１０】
【表２６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、好ましい免疫原性組成物によって生成される免疫グロブリンアイソタ
イプの代表的な結果を示す棒グラフである。この組成物は、本発明に従うＰＬＧ
微粒子を含む。
【図２】 図２は、好ましい免疫原性組成物によって生成される免疫グロブリンアイソタ
イプの代表的な結果を示す棒グラフである。この組成物は、本発明に従うＭＦ５
９アジュバントを含む。
【図３】 図３は、好ましいエマルジョンアジュバントを用いて免疫する際の血清抗ｐ５
５ＩｇＧ力価の代表的な結果を示す図である。
【図４】 図４は、好ましいエマルジョンアジュバントを用いて免疫する際のＣＴＬによ
る標的の溶解の代表的な結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/05 Ａ６１Ｋ 39/08 39/08 39/10 39/10 39/102 39/102 39/106 39/106 39/145 39/145 39/21 39/21 39/245 39/245 39/29 39/29 47/06 47/06 47/18 47/18 47/34 47/34 47/44 47/44 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/12 31/12 33/06 33/06 37/02 37/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／１６１，９９７ (32)優先日 平成11年10月28日(1999．10．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 オット， ギャリー エス． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608 −2916， エミリービル， ホートン ス トリート 4569， カイロン コーポレイ ション (72)発明者 ドネリー， ジョン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608 −2916， エミリービル， ホートン ス トリート 4569， カイロン コーポレイ ション (72)発明者 カザズ， ジナ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608 −2916， エミリービル， ホートン ス トリート 4569， カイロン コーポレイ ション (72)発明者 ウゴゾーリ， ミルドレッド アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608 −2916， エミリービル， ホートン ス トリート 4569， カイロン コーポレイ ション (72)発明者 シンフ， マンモハン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608 −2916， エミリービル， ホートン ス トリート 4569， カイロン コーポレイ ション (72)発明者 バラックマン， ジョン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608 −2916， エミリービル， ホートン ス トリート 4569， カイロン コーポレイ ション Ｆターム(参考） 4C076 AA17 BB11 CC06 CC07 CC31 CC34 CC35 DD02F DD09F DD19F DD31F DD34A EE23F EE51A EE53A EE54A FF43 4C084 AA03 BA44 MA01 MA05 MA22 MA66 NA03 NA10 ZB022 ZB052 ZB072 ZB322 ZB332 ZB352 ZB382 4C085 AA02 AA03 AA38 BA02 BA10 BA12 BA17 BA18 BA20 BA55 BA78 BA87 BA89 CC07 CC08 CC32 EE01 EE06 FF02 FF14 GG01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA03 MA05 MA07 MA22 MA66 NA03 NA10 ZB07 ZB32 ZB33 ZB35 ZB38 4G065 AB19X AB32X AB33X AB40X BA01 BA03 BA04 BA06 BA07 BB06 CA03 DA02 EA01

Claims (54)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 吸着性表面を有するミクロエマルジョンであって、該ミクロ
    エマルジョンは、以下： （ａ）代謝可能な油；および （ｂ）乳化剤； を含む微小滴エマルジョンを含み、 ここで、該乳化剤は、界面活性剤を含む、ミクロエマルジョン。
  2. 【請求項２】 前記油および前記乳化剤が、油滴を有する水中油型エマルジ
    ョンの形態で存在し、該油滴の実質的に全てが、直径１ミクロン未満であり、そ
    して該組成物が、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマ
    ーの非存在下で存在する、請求項１に記載のミクロエマルジョン。
  3. 【請求項３】 前記油が、動物油、不飽和炭化水素、テルペノイドおよび植
    物油からなる群のメンバーである、請求項２に記載のミクロエマルジョン。
  4. 【請求項４】 前記油が、スクアレンであるテルペノイドである、請求項３
    に記載のミクロエマルジョン。
  5. 【請求項５】 前記組成物が、０．５〜２０容量％の前記油を水性媒体中に
    含む、請求項２に記載のミクロエマルジョン。
  6. 【請求項６】 前記組成物が、０．０１〜０．５重量％の前記乳化剤を含む
    、請求項１に記載のミクロエマルジョン。
  7. 【請求項７】 前記乳化剤が、非イオン性界面活性剤を含む、請求項１に記
    載のミクロエマルジョン。
  8. 【請求項８】 前記乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル
    、ポリオキシエチレンソルビタンジエステルもしくはポリオキシエチレンソルビ
    タントリエステルまたはソルビタンモノエーテル、ソルビタンジエーテルもしく
    はソルビタントリエーテルを含む、請求項７に記載のミクロエマルジョン。
  9. 【請求項９】 前記乳化剤が、カチオン性界面活性剤を含む、請求項１に記
    載のミクロエマルジョン。
  10. 【請求項１０】 前記カチオン性界面活性剤が、ヘキサデシルトリメチルア
    ンモニウムブロミド、ベンザルコニウムクロリド、ジメチルジオクトデシルアン
    モニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベ
    ンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリ
    ド、メチルベンゼトニウムクロリドおよび４−ピコリンドデシル硫酸からなる群
    より選択される、請求項９に記載のミクロエマルジョン。
  11. 【請求項１１】 前記組成物が、０．０１〜０．５重量％の前記乳化剤を含
    む、請求項９に記載のミクロエマルジョン。
  12. 【請求項１２】 前記乳化剤が、アニオン性界面活性剤を含む、請求項１に
    記載のミクロエマルジョン。
  13. 【請求項１３】 その表面に吸着された生物学的に活性な高分子をさらに含
    み、該生物学的に活性な高分子が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリヌク
    レオシド、抗原、薬剤、ホルモン、酵素、転写メディエーターまたは翻訳メディ
    エーター、代謝経路における中間体、イムノモジュレーターおよびアジュバント
    からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、請求項１に記載の
    ミクロエマルジョン。
  14. 【請求項１４】 前記高分子が、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ミョウバン、
    細菌細胞壁成分およびムラミルペプチドからなる群より選択されるアジュバント
    である、請求項１３に記載のミクロエマルジョン。
  15. 【請求項１５】 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのホスホロチ
    オエート結合を含む、請求項１４に記載のミクロエマルジョン。
  16. 【請求項１６】 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのペプチド核
    酸結合を含む、請求項１５に記載のミクロエマルジョン。
  17. 【請求項１７】 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜２８からなる群
    より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載のミクロエマルジョ
    ン。
  18. 【請求項１８】 前記オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧモチーフのすぐ５’側
    に２つのプリンが、そして該モチーフのすぐ３’側に２つのピリミジンが隣接し
    た該ＣｐＧモチーフを含む、請求項１４に記載のミクロエマルジョン。
  19. 【請求項１９】 前記抗原がウイルス由来である、請求項１３に記載のミク
    ロエマルジョン。
  20. 【請求項２０】 前記ウイルス抗原が、ウイルスサブユニットを含む、請求
    項１９に記載のミクロエマルジョン。
  21. 【請求項２１】 前記ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎
    ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス
    （ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス（ｆｌ
    ｕ）および狂犬病ウイルスからなる群より選択される、請求項１９に記載のミク
    ロエマルジョン。
  22. 【請求項２２】 前記抗原が、ＨＳＶ糖タンパク質ｇＤ、ＨＩＶ糖タンパク
    質ｇｐ１２０およびＨＩＶ ｐ５５ ｇａｇからなる群より選択される、請求項
    １９に記載のミクロエマルジョン。
  23. 【請求項２３】 前記抗原が、細菌由来である、請求項１３に記載のミクロ
    エマルジョン。
  24. 【請求項２４】 前記細菌が、コレラ、ジフテリア、破傷風、百日咳、Ｈｅ
    ｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌ
    ｕｅｎｚａからなる群より選択される、請求項２３に記載のミクロエマルジョン
    。
  25. 【請求項２５】 前記抗原性物質が寄生生物由来である、請求項１３に記載
    のミクロエマルジョン。
  26. 【請求項２６】 前記寄生生物が、マラリア寄生生物を含む、請求項２５に
    記載のミクロエマルジョン。
  27. 【請求項２７】 宿主動物において免疫応答を誘導する方法であって、該動
    物に請求項１３〜２６のいずれかに記載のミクロエマルジョンを投与する工程を
    包含する、方法。
  28. 【請求項２８】 前記宿主動物が哺乳動物である、請求項２７に記載の方法
    。
  29. 【請求項２９】 前記哺乳動物がヒトである、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 宿主動物をウイルス感染、細菌感染または寄生生物感染に
    対して免疫する方法であって、該動物に、防御応答を誘導するに有効な量の請求
    項１３〜２６のいずれかに記載のミクロエマルジョンを投与する工程を包含する
    、方法。
  31. 【請求項３１】 前記宿主動物が哺乳動物である、請求項３０に記載の方法
    。
  32. 【請求項３２】 前記哺乳動物がヒトである、請求項３１に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 Ｔｈ１免疫応答を宿主動物において誘導する方法であって
    、該動物に、請求項１３〜２６のいずれかに記載のミクロエマルジョンを投与す
    る工程を包含する、方法。
  34. 【請求項３４】 請求項１３に記載のミクロエマルジョンおよび吸着性表面
    を有する微粒子を含む組成物であって、該微粒子が、以下： ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリ
    オルトエステル、ポリ無水物およびポリシアノアクリレートからなる群より選択
    されるポリマー；ならびに 第２の界面活性剤、 を含む、組成物。
  35. 【請求項３５】 前記微粒子が、その表面に吸着された生物学的に活性な第
    １の高分子をさらに含み、該生物学的に活性な第１の高分子が、ポリペプチド、
    ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、薬剤、ホルモン、酵素、転写メデ
    ィエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、イムノモジュ
    レーターおよびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つのメンバ
    ーである、請求項３４に記載の組成物。
  36. 【請求項３６】 前記微粒子が、該微粒子内にカプセル化された生物学的に
    活性な第２の高分子をさらに含み、該生物学的に活性な第２の高分子が、ポリペ
    プチド、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、抗原、薬剤、ホルモン、酵素、
    転写メディエーターまたは翻訳メディエーター、代謝経路における中間体、イム
    ノモジュレーターおよびアジュバントからなる群より選択される少なくとも１つ
    のメンバーである、請求項３４に記載の組成物。
  37. 【請求項３７】 前記微粒子が、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラ
    クチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）からなる群より選択
    されるポリ（α−ヒドロキシ酸）を含む、請求項３４〜３６のいずれかに記載の
    組成物。
  38. 【請求項３８】 前記微粒子が、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド
    ）を含む、請求項３４〜３６のいずれかに記載の組成物。
  39. 【請求項３９】 前記第２の界面活性剤が、カチオン性界面活性剤である、
    請求項３４〜３６のいずれかに記載の組成物。
  40. 【請求項４０】 前記第２の界面活性剤が、アニオン性界面活性剤である、
    請求項３４〜３６のいずれかに記載の組成物。
  41. 【請求項４１】 前記第２の界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、
    請求項３４〜３６のいずれかに記載の組成物。
  42. 【請求項４２】 前記生物学的に活性な第１の高分子が、ｇｐ１２０、ｐ２
    ４ｇａｇ、ｐ５５ｇａｇおよびインフルエンザＡ血球凝集素抗原からなる群より
    選択される抗原である、請求項３５〜３６のいずれかに記載の組成物。
  43. 【請求項４３】 前記生物学的に活性な第１の高分子が、ｇｐ１２０をコー
    ドするポリヌクレオチドである、請求項３５〜３６のいずれかに記載の組成物。
  44. 【請求項４４】 前記生物学的に活性な第２の高分子が、アジュバントであ
    る、請求項３６に記載の組成物。
  45. 【請求項４５】 前記微粒子に吸着された前記アジュバントが、アルミニウ
    ム塩である、請求項３４〜３６のいずれかに記載の組成物。
  46. 【請求項４６】 薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項３４〜４
    ５のいずれかに記載の組成物。
  47. 【請求項４７】 吸着されていないアジュバントをさらに含む、請求項３４
    〜４６のいずれかに記載の組成物。
  48. 【請求項４８】 前記吸着されていないアジュバントが、ＣｐＧオリゴヌク
    レオチド、ＬＴＫ６３、ＬＴＲ７２、ＭＰＬ、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ Ａおよびア
    ルミニウム塩からなる群より選択されるメンバーである、請求項４７に記載の組
    成物。
  49. 【請求項４９】 前記吸着されていないアジュバントが、リン酸アルミニウ
    ムであるアルミニウム塩である、請求項４８に記載の組成物。
  50. 【請求項５０】 治療有効量の高分子を脊椎動物被験体に送達する方法であ
    って、該脊椎動物被験体に、請求項３５、３６、４２、４３、４４、４７または
    ４８のいずれかに記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
  51. 【請求項５１】 請求項３５、３６、４２、４３、４４、４７または４８の
    いずれかに記載の組成物の、疾患の診断のための使用。
  52. 【請求項５２】 請求項３５、３６、４２、４３、４４、４７または４８の
    いずれかに記載の組成物の、疾患の処置のための使用。
  53. 【請求項５３】 請求項３５、３６、４２、４３、４４、４７または４８の
    いずれかに記載の組成物の、ワクチンのための使用。
  54. 【請求項５４】 請求項３５、３６、４２、４３、４４、４７または４８の
    いずれかに記載の組成物の、免疫応答の惹起のための使用。
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