WO2020246584A1 - ペプチド核酸を基盤としたアジュバント - Google Patents

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亮大郎 三股
明日美 神田
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デンカ株式会社
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a peptide nucleic acid modified from a cell membrane penetrating peptide having an immunostimulatory ability.
  • the acquired immune system has the ability to form an immune memory that can quickly cope with foreign substances that have been experienced once, after the second exposure.
  • Vaccines utilize this immune memory, and vaccination makes it possible to obtain immunity capable of neutralizing the pathogen before exposure to the pathogen.
  • Approved vaccines include subunit vaccines such as live attenuated vaccines, inactivated vaccines and purified recombinant proteins.
  • Live attenuated vaccines are highly effective vaccines, but they are infectious and therefore safe. It is difficult to secure, and there is a concern of unexpected side reactions.
  • inactivated vaccines and subunit vaccines are superior in terms of safety to live attenuated vaccines, but lack the ability to induce innate immunity because they have lost their infectivity, so the antigen alone is sufficient. Cannot give a good acquired immunity. Therefore, most of the approved inactivated vaccines and subunit vaccines are preparations in which an adjuvant having an immunostimulatory ability is added to an antigen. Therefore, in the development of highly safe vaccines, highly safe inactivated vaccines and subunit vaccine antigens should be used, but in order to obtain sufficient efficacy, the addition of an adjuvant having immunostimulatory ability is added. You will need it.
  • Adjuvants used in approved vaccines include aluminum salts and squalene-based emulsions, but few adjuvants are approved, and aluminum salts are known to promote IgE induction (Non-Patent Document 1). ..
  • the above-mentioned adjuvant is an adjuvant for injection and is difficult to combine with a mucosal vaccine.
  • peptide nucleic acid which is a modified nucleic acid obtained by converting the sugar phosphate skeleton of the nucleic acid into an N- (2-aminoethyl) glycine skeleton, has a high double-stranded forming ability and is not degraded by an in vivo nuclease. Therefore, it is expected to be applied as an antisense molecule and the like.
  • PNA cell penetrating peptide
  • Marichal T Ohata K, Bedoret D, Mesnil C, Sabatel C, Kobiyama K, Lekeux P, Coban C, Akira S, Ishii KJ, Bureau F, Desmet CJ. DNA released from dying host 2011 Jul 17; 17 (8): 996-1002.
  • the present invention relates to providing an adjuvant useful for preparing a highly effective and highly safe vaccine and a vaccine composition containing the adjuvant.
  • CPP cell membrane-permeable peptide
  • TAT Trans-Activator of Transcription Protein
  • HIV Human Immunologicy Virus
  • the present invention relates to the following 1) to 6).
  • An adjuvant consisting of a peptide nucleic acid to which a cell membrane penetrating peptide is bound.
  • An adjuvant composition containing a peptide nucleic acid to which a cell membrane penetrating peptide is bound and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a vaccine composition containing the adjuvant and antigen of 1).
  • IgG antibody titer against A / Singapore / GP1908 / 2015 strain by subcutaneous administration IgG antibody titer against B / Maryland / 15/2015 strain on subcutaneous administration. Neutralizing antibody titer against A / Singapore / GP1908 / 2015 strain on Day 35 by subcutaneous administration.
  • IgG antibody titer against A / Singapore / GP1908 / 2015 strain by nasal administration IgG antibody titer against B / Maryland / 15/2015 strain in nasal administration.
  • the "peptide nucleic acid to which a cell membrane-permeable peptide is bound” means a molecule in which a peptide nucleic acid is bound to the N- or C-terminal of the cell membrane-permeable peptide, and in the present specification, Mitsumata-Immunostimulusory Peptide nucleic acid Also called (MIP).
  • the “cell-penetrating peptide (CPP)” refers to a peptide that, when coexisting with a cell, passes through the cell membrane and translocates into the cell.
  • CPP cell-penetrating peptide
  • Table 1 Peptide derived from TAT of HIV, Penetratin derived from Antennapedia of Drosophila, polyarginine, Transportan derived from neuropeptide galanine, Pep-1 derived from Nuclear Localization Signal (NLS) of SV40, antibacterial peptide. LL37, but not limited to them.
  • Preferred are TAT-derived peptides peptides consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1).
  • a “peptide nucleic acid (PNA)” is a nucleic acid analog having a skeleton in which the sugar-phosphate skeleton of a nucleic acid is replaced with N- (2-aminoethyl) glycine, and a base is bound by a methylene carbonyl bond.
  • the base in the peptide nucleic acid used in the present invention may be any of adenine, guanine, thymine, cytosine and uracil, and the chain length is preferably 20 mer or less, which is preferable from the viewpoint of adjuvant activity. Is 3 to 12 mer, more preferably 3 to 10 mer.
  • the structure of the peptide nucleic acid of 3 to 12 mer is shown in the following formula (1).
  • Base may be the same or different, indicating adenine, guanine, thymine, cytosine or uracil, R indicating -COOH or -CONH 2 , and n indicating an integer of 1-10.
  • suitable peptide nucleic acids include, for example, 3 mer or 10 mer peptide nucleic acids having at least one guanine or cytosine as a base, 3 mer peptide nucleic acids (G3PNA) having 3 guanines as bases, and 3 bases. Examples thereof include a 3 mer peptide nucleic acid (C3PNA) having cytosine, and a 10 mer peptide nucleic acid (C10PNA) having 10 cytosines as a base.
  • the MIP of the present invention is applied to the N-terminal of a cell-penetrating peptide and the N-terminal of a peptide nucleic acid via a chemical method, for example, a cross-linking agent having N-hydroxysuccinimide ester at both ends. It can be manufactured by covalently bonding.
  • the peptide nucleic acid can be synthesized by using, for example, an Fmoc type PNA monomer unit or the like, and using a solid phase peptide synthesis method known in the art.
  • MIP As a suitable MIP used in the present invention, the following peptide consisting of 13 amino acids derived from TAT of HIV (SEQ ID NO: 1) is covalently bonded to G3PNA at its C-terminal and shared with MIP01 (formula (2)) and C10PNA.
  • SEQ ID NO: 1 the following peptide consisting of 13 amino acids derived from TAT of HIV (SEQ ID NO: 1) is covalently bonded to G3PNA at its C-terminal and shared with MIP01 (formula (2)) and C10PNA.
  • the combined MIP03 (formula (3)) can be mentioned.
  • MIP01 represented by the formula (2) an influenza antigen (split antigen)
  • an influenza antigen split antigen
  • the antibody titer in blood against the antigen is obtained. Is higher than in the MIP-free group.
  • the IgA titer of the mucosa also increases.
  • MIP03 represented by the formula (3) has activation of NF ⁇ B and high inducing ability of IL-1 ⁇ , it is highly possible that it promotes activation of the innate immune system, and MIP is innate immunity. It is considered to be an adjuvant having the ability to activate.
  • MIP has an adjuvant activity that enhances the ability to induce antibodies in blood or mucosa in either injection or transmucosal administration, so that MIP becomes an adjuvant and MIP is pharmaceutically acceptable.
  • the composition containing the carrier can be an adjuvant composition.
  • MIP can also be used to produce adjuvants or adjuvant compositions.
  • the "adjuvant” means a substance that increases the immune response to the antigen when the antigen is injected or transmucosally administered.
  • the “mucosa” refers to the inner wall of a vertebrate, particularly an external lumen organ such as a digestive organ, a respiratory organ, a genitourinary organ, and an eye. Therefore, the transmucosal administration includes, but is not limited to, oral administration, nasal administration (nasal administration), oral administration, intravaginal administration, upper respiratory tract administration, alveolar administration, eye drop administration, and the like.
  • the adjuvant or adjuvant composition of the present invention can be administered in combination with the antigen, and the administration may be simultaneous with the administration of the antigen or before or after the administration of the antigen.
  • the dose of the adjuvant or adjuvant composition of the present invention can be appropriately determined according to the administration subject, administration method, administration form, and type of antigen.
  • the adjuvant of the present invention can be combined with an antigen to form a vaccine composition.
  • the vaccine composition of the present invention can be prepared by mixing an antigen and MIP, and a pharmaceutically acceptable carrier can be appropriately added to prepare an appropriate formulation.
  • MIP may be in a chemically bound state with an antigen or other component, or may be present in a free molecular state.
  • the antigen examples include natural products purified from pathogens, or proteins or peptides artificially produced by methods such as gene recombination, and specifically, virions and incomplete viruses which are complete virus particles. Particles, viral structural proteins, viral non-structural proteins, whole cells of pathogens, proteins or glycoproteins derived from pathogens, defense antigens, neutralizing epitopes, etc., which are infectious and have lost infectivity. (Inactivated antigen) and is included.
  • the inactivated antigen is, for example, inactivated by physical (X-ray irradiation, UV irradiation, heat, ultrasonic) or chemical (formalin, beta-propiolactone, binary ethyleneimine, mercury, alcohol, chlorine) or the like. However, it is not limited to those that have been used.
  • the antigen derived from the pathogen is preferably an inactivated antigen derived from the virus or pathogen.
  • Viruses include, for example, measles virus, rut virus, mumps virus, poliovirus, rotavirus, norovirus, adenovirus, enterovirus, herpesvirus, varicella virus, severe acute respiratory infection syndrome (SARS) virus, human immunodeficiency virus (HIV). ), Human T-cell leukemia virus (HTLV-1), human papillomavirus, Japanese encephalitis virus, Westnile virus, yellow fever virus, dengue virus, decavirus, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, type E Hepatitis virus, RS virus, influenza virus and the like can be mentioned, and influenza virus is preferable.
  • pathogenic bacteria examples include Klebs-Löynia, Clostridium tetani, Bordetella pertussis, Meningococcus, Influenza b, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae, Mycobacterium tuberculosis, and periodontal disease bacteria.
  • Dosage forms of the vaccine composition include, for example, liquid preparations, suspensions, lyophilized preparations and the like.
  • the liquid agent include purified water and those dissolved in a buffer solution.
  • the suspending agent include those suspended in purified water, a buffer solution, etc. together with methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, polyvinyl viloridone, gelatin, casein and the like.
  • absorption promoters, surfactants, preservatives, stabilizers, moisture proofing agents, solubilizing agents and the like can be added to these preparations, if necessary.
  • the vaccine composition of the present invention may contain an adjuvant other than MIP as long as it does not impair the immunogenicity and safety of the vaccine.
  • the amount of the antigen contained in the vaccine composition of the present invention is not particularly limited as long as it is sufficient to induce a specific antibody response, and is appropriately set in consideration of the ratio with the MIP to be used in combination. be able to.
  • a split antigen of influenza virus when used as an antigen, it may be contained within the range of 1 to 60 ⁇ g HA (HA equivalent), which is a single dose, and 9 to 15 ⁇ g HA (HA equivalent) is more preferable.
  • the concentration is a value obtained by measuring the concentration of HA protein by a test method defined by WHO or national standards such as a unified radioimmunoassay test method.
  • the route of administration of the vaccine composition of the present invention is not particularly limited, and administration by injection (sublingual administration, intramuscular administration, intradermal administration, intravenous administration), oral administration, parenteral administration (for example, nasal administration, eye drop administration, etc.) It may be administered via vaginal administration, sublingual administration, or transdermal administration), and is administered, for example, by dropping, spraying, or spraying into the nasal cavity.
  • the administration target of the adjuvant composition or vaccine composition of the present invention includes humans and mammals other than humans, but humans are preferable.
  • mammals other than humans include mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, pigs, cows, goats, sheep, dogs, cats, rhesus monkeys, cynomolgus monkeys, orangutans, chimpanzees and the like.
  • CPP01 TAT-derived peptide (SEQ ID NO: 1)
  • MIP01 represented by the above formula (2)
  • MIP03 represented by the formula (3) as MIP was outsourced to Peptide Institute of Japan.
  • Example 1 Evaluation of adjuvant activity by subcutaneous administration of MIP01 A / H1N1 subtype (A / Singapore / GP1908 / 2015 strain) and B / Peptide strain (B / Maryland / 15/2016 strain) of influenza HA vaccine "Seiken"
  • the undiluted solution was a split antigen (SV), and each split antigen was mixed so that the amount of hemaglutinine of each strain was 1 ⁇ g per 0.3 mL, and 1 ⁇ g of a cell membrane-permeable peptide consisting of 13 amino acids derived from HIV TAT or MIP01 was added thereto.
  • SV split antigen
  • 0.3 mL of the administration solution (Table 2) prepared as described above was administered subcutaneously to the back of BALB / c mice (female, 5 weeks old) twice at 3-week intervals (5 animals in each group), and each administration was performed. Two weeks after that, all blood was collected. Serum is prepared by centrifuging the blood obtained from all blood samples, and the IgG (Total IgG) titer that specifically binds to the A / Singapore / GP1908 / 2015 strain and the B / Maryland / 15/2016 strain of the serum is determined. It was measured. In addition, the neutralizing antibody titer against the A / Singapore / GP1908 / 2015 strain was also measured in the serum after the second administration.
  • the IgG titers of each administration group are as shown in FIGS. 1A and 1B.
  • the antigen-specific IgG titer in blood for each strain was higher than that in the adjuvant-non-adjuvant group in both the 1-time and 2-dose administrations.
  • the antigen-specific IgG titer in blood was higher in both the 1st and 2nd doses in the MIP01-administered group than in the CPP01-administered group. ..
  • FIG. 2 shows the neutralizing antibody titer against the A / Singapore / GP1908 / 2015 strain after two administrations.
  • the neutralizing antibody titer was also the highest in the MIP01-administered group, followed by the non-adjuvant-added group and the lowest value. Was shown in the CPP01 administration group. Therefore, it was confirmed that administration of MIP01 improved not only the antigen-specific IgG titer in blood but also the neutralizing antibody titer important for virus elimination, and the structure in which the peptide nucleic acid was bound to the cell membrane penetrating peptide was MIP01. It was considered to be important for exerting the adjuvant activity of the virus.
  • Example 2 Evaluation of adjuvant activity in nasal administration of MIP01 Similar to Example 1, A / H1N1 subtype (A / Singapore / GP1908 / 2015 strain) and B / Victoria strain (B / Maryland /) of influenza HA vaccine "Seiken" Each stock solution of 15/2016 strain) was used as a split antigen, and each split antigen was mixed so that the amount of hemaglutinine of each strain was 1 ⁇ g per 10 ⁇ L, and CPP01 or MIP01 was added to 10 ⁇ g. In addition, as a control, an antigen-only administration solution to which no adjuvant was added was also prepared.
  • the administration solution (Table 3) prepared as described above was administered to the nasal cavity of BALB / c mice (female, 5 weeks old) twice at 3-week intervals (5 animals in each group). Two weeks after each administration, all blood was collected and serum was prepared by centrifugation. In addition, after blood was collected 2 weeks after the second administration, the inside of the nasal cavity was washed with 400 ⁇ L of D-PBS containing a protease inhibitor per individual, and this washing solution was collected as a nasal washing solution.
  • the results of IgG titers of each strain are as shown in FIGS. 3A and 3B, and the antigen-specific IgG titer in blood for each strain, whether nasally administered or once or twice.
  • the titer was higher than that in the non-adjuvant group.
  • the IgG titer for the B / Maryland / 15/2016 strain was confirmed to have a significant increase in antibody titer compared to the non-adjuvant group (Mann-Whitney U test, p ⁇ 0.05).
  • the IgA titer for each strain was the highest in the MIP01-administered group at any time of administration, followed by the lowest in the adjuvant-added group. It was a CPP01 administration group (Fig. 4A, Fig. 4B). Therefore, MIP obtained by modifying a cell-penetrating peptide into a peptide nucleic acid has adjuvant activity not only by injection but also by transmucosal administration, and transmucosal administration promotes IgA induction in mucosa in addition to IgG in blood. It is considered that.
  • Example 3 Innate immunity activating ability of MIP03 The innate immunity activating ability of MIP03 was evaluated in vitro.
  • MIP03 was added to 1 ⁇ 10 6 cells / mL Raw 264.7 Reporter Cell Line (Novus biologicals, NBP2-26261) to a final concentration of 10, 20, 40 and 80 ⁇ M, 5% CO 2 , 2 at 37 ° C. After culturing for 1 day, the culture solution was collected. The collected culture broth was centrifuged at 12,000 ⁇ g for 1 minute, and the supernatant of the culture solution was measured for alkaline phosphatase and cytokines.
  • SEAP Reporter Gene Assay luminescence (Cayman Chemical, 600260) was used for the measurement of alkaline phosphatase, and Bio-Plex Pro mouse cytokine GI23-Plex (Bio-Rad, M60009RDPDB03) was used for the measurement of cytokines.
  • a medium was added as a negative control (NC)
  • Imiquimod (0.02 ⁇ M), which is an agonist of Toll-like receptor 7, was added as a positive control in cytokine measurement, and the evaluation was made in comparison with these.
  • the measurement results of alkaline phosphatase are as shown in FIG. 5, and it was confirmed that the luminescence signal of alkaline phosphatase was improved depending on the concentration of MIP03 added. Therefore, it was found that MIP03 promotes the activation of NF ⁇ B, suggesting that it activates innate immunity.
  • the results of cytokine measurement are shown in FIGS. 6 to 9, and it was confirmed that IL-1 ⁇ and IL-1 ⁇ induction increased in a concentration-dependent manner of MIP03 (FIGS. 6 and 7), and IL-1 ⁇ in particular was compared with Imiquimod. However, very high induction was confirmed (Fig. 7).
  • the measurement result of IL-13 is shown in FIG. 8 and the measurement result of IFN- ⁇ is shown in FIG. 9. .
  • MIP03 promotes the activation of the innate immune system via C-type Rectin Receptor and Nod-Like Receptor.
  • MIP is an adjuvant having the ability to activate innate immunity.

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Abstract

有効性が高く且つ安全性の高いワクチンの調製に有用なアジュバント及びそれを含むワクチン組成物を提供する。　細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸からなるアジュバント。

Description

ペプチド核酸を基盤としたアジュバント
　本発明は、免疫賦活化能を有する細胞膜透過性ペプチドを修飾したペプチド核酸に関する。
　獲得免疫系は一度経験した異物に対して、２回目以降の曝露では迅速に対処できる免疫記憶を形成する能力を有する。この免疫記憶を利用したのがワクチンであり、ワクチンの接種により、病原体の曝露以前に当該病原体を中和可能な免疫を得ることが可能となる。
　承認されたワクチンには、弱毒生ワクチン、不活化ワクチン及び精製組換えタンパク質等のサブユニットワクチンがあり、特に弱毒生ワクチンは、有効性の高いワクチンであるが、感染性を有するため安全性を担保することが難しく、予期しない副反応の懸念がある。一方、不活化ワクチンやサブユニットワクチンは、弱毒生ワクチンに比べて安全性面では優れたワクチンであるが、感染性を消失しているため自然免疫を惹起する能力に欠け、そのため抗原単独では十分な獲得免疫を付与できない。このため、既承認の不活化ワクチン及びサブユニットワクチンの多くは、抗原に免疫賦活化能を有するアジュバントを加えた製剤である。したがって、安全性の高いワクチンの開発では、安全性の高い不活化ワクチンやサブユニットワクチン抗原を使用するべきであるが、十分な有効性を獲得するために免疫賦活化能を有するアジュバントの添加が必要となる。
　また、病原体の感染防御効果を高めるには、病原体の侵入の門戸となる粘膜における免疫誘導も重要である。粘膜における免疫誘導は粘膜ワクチンの投与により達成されるが、既承認の粘膜ワクチンは弱毒生ワクチンや粘膜親和性を有する毒素由来のワクチンであり、粘膜親和性を有さない不活化ワクチン及びサブユニットワクチンでは感染防御に十分な免疫を惹起することが難しい。そのため、このような抗原の粘膜投与においても粘膜免疫を増強するアジュバントが必要となる。
　既承認のワクチンで使用されるアジュバントには、アルミニウム塩やスクワレンベースのエマルションが挙げられるが、承認されるアジュバントは少なく、アルミニウム塩ではＩｇＥ誘導を促すことが知られている（非特許文献１）。また、上記のアジュバントは注射剤用のアジュバントであり、粘膜ワクチンに組み合わせることは難しい。
　一方、核酸の糖リン酸骨格をＮ－（２－アミノエチル）グリシン骨格に変換した修飾核酸であるペプチド核酸（ＰＮＡ）は、高い二重鎖形成能を有し、生体内ヌクレアーゼで分解されないことから、アンチセンス分子等として応用が期待されている。
　また、ドラッグデリバリーをはじめとする分野では、タンパク質、ペプチド又は低分子化合物を細胞内へ導入し機能させる技術として、これらの分子に膜透過性ペプチド（Ｃｅｌｌ　Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ　Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＣＰＰ）を結合することが行われている。
　しかし、ＰＮＡやＣＰＰを結合したＰＮＡをアジュバントとして利用することは知られていない。
Marichal T, Ohata K, Bedoret D, Mesnil C, Sabatel C, Kobiyama K, Lekeux P,Coban C, Akira S, Ishii KJ, Bureau F, Desmet CJ. DNA released from dying host cells mediates aluminum adjuvant activity. Nat Med. 2011 Jul 17;17(8):996-1002.
　本発明は、有効性が高く且つ安全性の高いワクチンの調製に有用なアジュバント及びそれを含むワクチン組成物を提供することに関する。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）のＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のような細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）をペプチド核酸に修飾し、このＣＰＰが結合したペプチド核酸が注射及び経粘膜投与のいずれにおいてもアジュバント活性を有することを見出した。
　すなわち、本発明は、以下の１）～６）に係るものである。
　１）細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸からなるアジュバント。
　２）細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸及び薬学的に許容される担体を含有するアジュバント組成物。
　３）１）のアジュバント及び抗原を含有するワクチン組成物。
　４）アジュバントを製造するための、細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸の使用。
　５）細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸のアジュバントとしての使用。
　６）細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸をアジュバントとして使用する方法。
　本発明によれば、安全性の高い不活化ワクチンの有効性を高めることが可能となり、品質の高い予防薬の創出として医薬品産業に大きく貢献できる。
皮下投与におけるＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対するＩｇＧ抗体価。 皮下投与におけるＢ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１５株に対するＩｇＧ抗体価。 皮下投与でのＤａｙ３５における、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対する中和抗体価。 経鼻投与におけるＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対するＩｇＧ抗体価。 経鼻投与におけるＢ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１５株に対するＩｇＧ抗体価。 経鼻投与での鼻腔洗浄液における、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対するＩｇＡ抗体価。 経鼻投与での鼻腔洗浄液における、Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１５株に対するＩｇＡ抗体価。 ＭＩＰ０３のＮＦκＢの活性化作用。 ＭＩＰ０３のサイトカイン（ＩＬ－１α）誘導作用。 ＭＩＰ０３のサイトカイン（ＩＬ－１β）誘導作用。 ＭＩＰ０３のサイトカイン（ＩＬ－１３）誘導作用。 ＭＩＰ０３のサイトカイン（ＩＦＮ－γ）誘導作用。
　以下に本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本発明において、「細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸」とは、細胞膜透過性ペプチドのＮ若しくはＣ末端にペプチド核酸が結合した分子を意味し、本明細書においては、Ｍｉｔｓｕｍａｔａ－Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＩＰ）とも称す。
　「細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）」とは、細胞と共存した場合に細胞膜を通過して細胞内に移行するペプチドをいう。例えば、表１に示す、ＨＩＶのＴＡＴ由来のペプチド、ショウジョバエのアンテナペディア由来のＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ、ポリアルギニン、神経ペプチドガラニンから派生したＴｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、ＳＶ４０のＮｕｃｌｅａｒ　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｓｉｇｎａｌ（ＮＬＳ）由来のＰｅｐ－１、抗菌ペプチドＬＬ３７が挙げられるが、それらに限定されない。
　好ましくは、ＴＡＴ由来ペプチド（配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」とは、核酸の糖－リン酸骨格をＮ－（２－アミノエチル）グリシンに置き換えた骨格を有し、メチレンカルボニル結合で塩基を結合させた核酸類似体である。本発明において用いられるペプチド核酸中の塩基（Ｂａｓｅ）としては、アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシルのいずれでも良く、鎖長は一般的な２０ｍｅｒ以下が望ましいが、アジュバンド活性の点から、好ましくは３～１２ｍｅｒであり、より好ましくは３～１０ｍｅｒである。
　下記式（１）に、３～１２ｍｅｒのペプチド核酸の構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
〔式中、Ｂａｓｅは同一又は異なっていてもよく、アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシルを示し、Ｒは－ＣＯＯＨ又は－ＣＯＮＨ2を示し、ｎは１～１０の整数を示す。〕
　本発明において、好適なペプチド核酸としては、例えば塩基として少なくとも１個のグアニン又はシトシンを有する３ｍｅｒ又は１０ｍｅｒのペプチド核酸、塩基として３個のグアニンを有する３ｍｅｒのペプチド核酸（Ｇ３ＰＮＡ）、塩基として３個のシトシンを有する３ｍｅｒのペプチド核酸（Ｃ３ＰＮＡ）、塩基として１０個のシトシンを有する１０ｍｅｒのペプチド核酸（Ｃ１０ＰＮＡ）等が挙げられる。
　本発明のＭＩＰは、細胞膜透過性ペプチドのＮ若しくはＣ末端に、化学的手法、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを両末端に有する架橋剤を介して細胞透過性ペプチドとペプチド核酸のＮ末端間を共有結合させることにより製造することができる。
　なお、ペプチド核酸は、例えばＦｍｏｃ型ＰＮＡモノマーユニット等を用い、当技術分野で公知の固相ペプチド合成法を利用して合成することができる。
　本発明において用いられる好適なＭＩＰとして、以下に示すＨＩＶのＴＡＴ由来の１３アミノ酸からなるペプチド（配列番号１）がそのＣ末端で、Ｇ３ＰＮＡと共有結合したＭＩＰ０１（式（２））、Ｃ１０ＰＮＡと共有結合したＭＩＰ０３（式（３））が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　後述実施例に示すとおり、式（２）で示されるＭＩＰ０１とインフルエンザ抗原（スプリット抗原）を混合して調製したワクチン組成物をマウスへ注射及び経粘膜投与した場合、当該抗原に対する血中の抗体価はＭＩＰ非添加群に対して高くなる。また、経粘膜投与した場合は、粘膜のＩｇＡ力価も上昇する。また、式（３）で示されるＭＩＰ０３には、ＮＦκＢの活性化及びＩＬ－１βの高い誘導能が認められることから、自然免疫系の活性化を促している可能性が高く、ＭＩＰは自然免疫の活性化能を有するアジュバントであると考えられる。
　すなわち、ＭＩＰは抗原を注射若しくは経粘膜投与する場合のいずれにおいても血中若しくは粘膜にける抗体誘導能を高めるアジュバント活性を有しており、よって、ＭＩＰはアジュバントとなり、またＭＩＰは薬学上許容される担体を含む組成物はアジュバント組成物になり得る。また、ＭＩＰはアジュバント又はアジュバント組成物を製造するために使用できる。
　本発明において、「アジュバント」とは、抗原を注射若しくは経粘膜投与する場合において、抗原に対する免疫応答を増加させる物質を意味する。
　ここで、「粘膜」とは脊椎動物において、消化器、呼吸器、泌尿生殖器、眼等、特に外通性の内腔器官の内壁をいう。したがって、経粘膜投与としては、例えば、経口投与、鼻腔投与（経鼻投与）、口腔投与、膣内投与、上気道投与、肺胞投与、点眼投与等が挙げられるがそれらに限定されない。
　本発明のアジュバント又はアジュバント組成物は、抗原と組み合わせて投与することができ、投与は抗原の投与と同時であっても、抗原の投与の前又は後であっても良い。
　本発明のアジュバント又はアジュバント組成物の投与量は、投与対象、投与方法、投与形態、抗原の種類に応じて適宜決定することができる。
　本発明のアジュバントは抗原と組み合わせて、ワクチン組成物とすることができる。本発明のワクチン組成物は、抗原とＭＩＰを混合することにより調製でき、さらに薬学的に許容される担体を適宜添加して適当な製剤にすることができる。本発明のワクチン組成物において、ＭＩＰは抗原若しくはその他成分と化学的結合状態にあっても良く、遊離の分子状態で存在しても良い。
　抗原としては、病原体から精製された天然の生産物、又は遺伝子組換え等の手法により人為的に作製されたタンパク質若しくはペプチドが該当し、具体的には完全なウイルス粒子であるビリオン、不完全ウイルス粒子、ウイルス構造タンパク質、ウイルス非構造タンパク質、病原菌の全菌体、病原菌由来のタンパク質若しくは糖タンパク質、感染防御抗原、中和エピトープ等が挙げられ、感染性を有するものと感染性を消失させたもの（不活化抗原）とが含まれる。不活化抗原としては、例えば、物理的（Ｘ線照射、ＵＶ照射、熱、超音波）、化学的（ホルマリン、ベータプロピオラクトン、バイナリーエチレンイミン、水銀、アルコール、塩素）等の操作により不活化されたものが挙げられるが、それらに限定されない。病原体由来の抗原は、安全性の観点から、上記ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原であることが望ましい。
　ウイルスとしては、例えば麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス、水痘ウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－１）、ヒトパピローマウイルス、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ＲＳウイルス、インフルエンザウイルス等が挙げられ、好ましくはインフルエンザウイルスである。
　病原菌としては、ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎球菌、コレラ菌、結核菌、歯周病菌等が挙げられる。
　ワクチン組成物の剤形としては、例えば、液剤、懸濁剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。液剤としては、精製水、緩衝液に溶解したもの等が挙げられる。懸濁剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルビロリドン、ゼラチン、カゼイン等と共に精製水、緩衝液等に懸濁させたもの等が挙げられる。
　これらの製剤には、通常使用されている吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤、防湿剤、溶解補助剤等を必要に応じて添加することができる。
　なお、本発明のワクチン組成物には、当該ワクチンの免疫原性及び安全性を害さない限りにおいて、ＭＩＰ以外のアジュバントを含有することもできる。
　本発明のワクチン組成物に含まれる抗原の量は、特異的抗体応答を誘導するのに十分な量であれば特に限定されるものではなく、併用するＭＩＰとの比率も勘案して適宜設定することができる。例えば、抗原としてインフルエンザウイルスのスプリット抗原を用いた場合、１回の投与用量である１～６０μｇ　ＨＡ（ＨＡ換算）の範囲内で含有すればよく、９～１５μｇＨＡ（ＨＡ換算）がより好ましい。前記濃度は、ＨＡタンパク質の濃度を一元放射免疫拡散試験法等の、ＷＨＯや国の基準で定められた試験法で測定することによって得られる値である。
　本発明のワクチン組成物の投与経路は特に限定されず、注射による投与（皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、静脈内投与）、経口投与、非経口投与（例えば、鼻腔投与、点眼投与、経膣投与、舌下投与、経皮投与）のいずれでもよく、例えば、鼻腔内に滴下、噴霧又はスプレーすることにより投与される。
　本発明のアジュバント組成物又はワクチン組成物の投与対象は、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられるが、ヒトが好ましい。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、アカゲザル、カニクイザル、オランウータン、チンパンジー等が挙げられる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
＜ＣＰＰ及びＭＩＰ＞
　ＣＰＰとしてＣＰＰ０１（ＴＡＴ由来ペプチド（配列番号１）、ＭＩＰとして前記式（２）で示したＭＩＰ０１及び式（３）で示したＭＩＰ０３を株式会社ペプチド研究所に合成を委託した。
実施例１　　ＭＩＰ０１の皮下投与におけるアジュバント活性評価
　インフルエンザＨＡワクチン「生研」のＡ／Ｈ１Ｎ１亜型（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株）及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統（Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６株）の各原液をスプリット抗原（ＳＶ）とし、０．３ｍＬ当りに各株のヘムアグルチニンが１μｇとなるよう各スプリット抗原を混合し、そこへＨＩＶのＴＡＴ由来の１３アミノ酸からなる細胞膜透過性ペプチド若しくはＭＩＰ０１が１μｇとなるよう添加した。また、対照としてアジュバントを添加しない抗原のみの投与液も併せて調製した。
　上記の通りに調製した投与液（表２）を３週間隔で２回、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、５週齢）の後背部皮下へ０．３ｍＬ投与し（各群５匹）、各投与から２週間後に全採血した。全採血で得られた血液を遠心分離して血清を調製し、血清のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株及びＢ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６株に特異的に結合するＩｇＧ（Ｔｏｔａｌ　ＩｇＧ）力価を測定した。また、２回投与後の血清で、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対する中和抗体価も測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　各投与群のＩｇＧ力価は図１Ａ及び図１Ｂに示す通りである。スプリット抗原にＭＩＰ０１を投与当たり１μｇ添加することで１回及び２回投与のいずれにおいても、各株に対する血中の抗原特異的なＩｇＧ力価はアジュバント非投与群に比べて高くなった。また、ＣＰＰ０１投与群と比較しても、ＭＩＰ０１投与群では１回及び２回投与の両時点において、いずれの株に対しても血中の抗原特異的なＩｇＧ力価は高いことが確認された。図２では、２回投与後のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株に対する中和抗体価を示すが、中和抗体価もＭＩＰ０１投与群が最も高い結果となり、次にアジュバント非添加群、最も低い値を示したのがＣＰＰ０１投与群となった。したがって、ＭＩＰ０１投与により、血中の抗原特異的ＩｇＧ力価だけでなく、ウイルスの排除に重要な中和抗体価も向上することが確認され、細胞膜透過ペプチドにペプチド核酸を結合させた構造がＭＩＰ０１のアジュバント活性発揮に重要であると考えられた。
実施例２　　ＭＩＰ０１の経鼻投与におけるアジュバント活性評価
　実施例１と同様にインフルエンザＨＡワクチン「生研」のＡ／Ｈ１Ｎ１亜型（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株）及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統（Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６株）の各原液をスプリット抗原とし、１０μＬ当りに各株のヘムアグルチニンが１μｇとなるよう各スプリット抗原を混合し、そこへＣＰＰ０１若しくはＭＩＰ０１が１０μｇとなるよう添加した。また、対照としてアジュバントを添加しない抗原のみの投与液も併せて調製した。
　上記の通りに調製した投与液（表３）を３週間隔で２回、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、５週齢）の鼻腔に１０μＬ（片鼻５μＬ）投与した（各群５匹）。各投与から２週間後に全採血し、遠心分離により血清を調製した。また、２回投与２週間後の採血を行った後、個体当り４００μＬのプロテアーゼインヒビター含有Ｄ－ＰＢＳで鼻腔内を洗浄し、この洗浄液を鼻腔洗浄液として回収した。血清は、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株及びＢ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６株に特異的に結合するＩｇＧ（Ｔｏｔａｌ　ＩｇＧ）力価の測定、鼻腔洗浄液はＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５株及びＢ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６株に特異的に結合するＩｇＡ力価の測定に供した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　各株のＩｇＧ力価の結果は図３Ａ及び図３Ｂに示す通りであるが、経鼻投与においても、１回及び２回投与のいずれにおいても、各株に対する血中の抗原特異的なＩｇＧ力価はアジュバント非投与群に比べて高くなった。特に、Ｂ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１５／２０１６株に対するＩｇＧ力価は、アジュバント非添加群に対して有意な抗体価の上昇が確認された（マン・ホイットニーのＵ検定、ｐ＜０．０５）。また、鼻腔洗浄液の抗原特異的ＩｇＡ力価についても、いずれの投与時点においても各株に対するＩｇＡ力価はＭＩＰ０１投与群で最も高値となり、次にアジュバント非添加群、最も低値であったのがＣＰＰ０１投与群であった（図４Ａ、図４Ｂ）。したがって、細胞膜透過ペプチドをペプチド核酸に修飾したＭＩＰは、注射による投与だけでなく、経粘膜投与においてもアジュバント活性を有し、経粘膜投与では血中のＩｇＧに加えて、粘膜におけるＩｇＡ誘導も促進すると考えられる。
実施例３　　ＭＩＰ０３の自然免疫活性化能
　ＭＩＰ０３の自然免疫活性化能をｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価した。
　１×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬのＲａｗ２６４．７　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ（Ｎｏｖｕｓ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，　ＮＢＰ２－２６２６１）へ終濃度として１０、２０、４０及び８０μＭとなるようＭＩＰ０３を添加し、５％　ＣＯ2、３７℃で２日間培養した後、培養液を回収した。回収した培養液は、１２，０００×ｇで１分間遠心分離して、その上清のアルカリフォスファターゼ及びサイトカインを測定した。アルカリフォスファターゼの測定には、ＳＥＡＰ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ，６００２６０）、サイトカインの測定にはＢｉｏ－Ｐｌｅｘ　Ｐｒｏ　マウスサイトカインＧＩ２３－Ｐｌｅｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｍ６０００９ＲＤＰＤＢ０３）を使用した。また、陰性対照（ＮＣ）として培地、サイトカイン測定では陽性対照としてＴｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ 7のアゴニストであるＩｍｉｑｕｉｍｏｄ（０．０２μＭ）を添加して、これらと比較評価した。
　アルカリフォスファターゼの測定結果は図５に示す通りであるが、ＭＩＰ０３の添加濃度依存的なアルカリフォスファターゼの発光シグナルの向上が確認された。したがって、ＭＩＰ０３はＮＦκＢの活性化を促すことがわかり、自然免疫を活性化させることが示唆された。また、図６～９にサイトカイン測定の結果を示すが、ＭＩＰ０３の濃度依存的にＩＬ－１α及びＩＬ－１β誘導が高まることが確認され（図６及び７）、特にＩＬ－１βはＩｍｉｑｕｉｍｏｄと比べても非常に高い誘導が確認された（図７）。また、Ｔｈ２及びＴｈ１関連サイトカインとして、ＩＬ－１３の測定結果を図８、ＩＦＮ－γの測定結果を図９に示すが、いずれのサイトカインも陽性対照であるＩｍｉｑｕｉｍｏｄと同程度の誘導が確認された。
　上記の通り、ＮＦκＢの活性化及びＩＬ－１βの高い誘導能を有するため、ＭＩＰ０３はＣ－ｔｙｐｅ　Ｌｅｃｔｉｎ　ＲｅｃｅｐｔｏｒやＮｏｄ－Ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒを介した自然免疫系の活性化を促している可能性が高く、その結果、抗体応答に関連するＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインの誘導能を示すと考えられる。したがって、ＭＩＰは、自然免疫の活性化能を有するアジュバントである。

Claims (12)

  1. 　細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸からなるアジュバント。
  2. 　細胞膜透過性ペプチドが、配列番号１～７で示されるアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれる請求項１に記載のアジュバント。
  3. 　細胞膜透過性ペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドである請求項１に記載のアジュバント。
  4. 　ペプチド核酸が下記式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     〔式中、Ｂａｓｅは同一又は異なっていてもよく、アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシルを示し、Ｒは－ＣＯＯＨ又は－ＣＯＮＨ2を示し、ｎは１～１０の整数を示す。〕
    で表される請求項１～３のいずれか１項に記載のアジュバント。
  5. 　式（１）において、ｎが１～８の整数である請求項４に記載のアジュバント。
  6. 　式（１）において、Ｒが－ＣＯＮＨ2である請求項４又は５に記載のアジュバント。
  7. 　式（１）において、Ｂａｓｅがいずれもグアニン又はシトシンである請求項４～６のいずれか１項に記載のアジュバント。
  8. 　細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸及び薬学的に許容される担体を含有するアジュバント組成物。
  9. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のアジュバント及び抗原を含有するワクチン組成物。
  10. 　アジュバントを製造するための、細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸の使用。
  11. 　細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸のアジュバントとしての使用。
  12. 　細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸をアジュバントとして使用する方法。
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