BRPI0609729A2

BRPI0609729A2 - ácido nucléico, vetor de expressão, célula hospedeira, processo para produzir um polipeptìdeo, anticorpo, célula de hibridoma, e método de identificação de um anticorpo

Info

Publication number: BRPI0609729A2
Application number: BRPI0609729-4A
Authority: BR
Inventors: Patrick Dowd; Gretchen Frantz; Paul Polakis; Victoria Smith; Susan Spencer; Thomas Wu; Zemin Zhang
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2006-04-05
Publication date: 2010-04-20
Also published as: AU2006235436A1; CN101208431A; CA2604377A1; RU2007141407A; EP1871886A2; MA29587B1; AU2006235436A2; MX2007012216A; JP2008535498A; IL185900A0; NO20075698L; CR9486A; KR20080003405A; ZA200707967B

Abstract

áCIDO NUCLéICO, VETOR DE EXPRESSãO, CéLULA HOSPEDEIRA, PROCESSO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTìDEO, ANTICORPO, CéLULA DE HIBRIDOMA, E MéTODO DE IDENTIFICAçãO DE UM ANTICORPO. A presente invenção refere-se às composições de substância úteis para a diagnose e tratamento de tumor em mamíferos e aos métodos de usar aquelas composições de substância para os mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA A DIAGNOSE E TRATAMENTO DETUMOR".

Pedidos de Patente Relacionados

Este pedido de patente é uma continuação-em-parte e reivindicaprioridade sob 35 U.S.C. § 120 para Pedido de Patente U. S. NQ 10/177.488,depositado em 19 de junho de 2002, que reivindica prioridade sob 35 U.S.C.§ 119(e) para o Pedido de Patente Provisório Ne 60/299.500, depositado em20 de junho de 2001, as revelações dos quais são aqui incorporadas porreferência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se às composições de substânciaúteis para a diagnose e tratamento de tumor em mamíferos e aos métodosde usar aquelas composições de substância para os mesmos.

Antecedentes da Invenção

Tumores malignos (cânceres) são a segunda causa principal demorte nos Estados Unidos, após doença cardíaca (Boring et al, CA Cancel J.Clin. 43:7 (1993)). Câncer é caracterizado pelo aumento no número decélulas anormais, ou neoplásticas, derivadas de um tecido normal queprolifera-se pára formar uma massa de tumor, a invasão de tecidosadjacentes por estas células tumorais neoplásticas e a geração de célulasmalignas que eventualmente se propagam por meio do sangue ou sistemalinfático para linfonodos regionais e para sítios distantes por meio de umprocesso chamado metástase. Em um estado canceroso, uma célulaprolifera-se sob condições em que as células normais não desenvolveriam.Câncer se manifesta em uma ampla variedade de formas, caracterizada porgraus diferentes de invasidade e agressividade.

Em tentativas para descobrir alvos celulares eficazes paradiagnose e terapia de câncer, os investigadores buscaram identificar atransmembrana ou do contrário polipeptídeos associados à membrana quesão especificamente expressados na superfície de um ou mais tipo(s)particulares de célula de câncer quando comparados a uma ou mais célula(s)não-cancerosa(s) normal(is). Freqüentemente, tais polipeptídeos associadosà membrana são expressados mais abundantemente na superfície dascélulas de câncer quando comparados na superfície das células não-cancerosas. A identificação de tais polipeptídeos de antígeno de superfíciecelular associados ao tumor deu origem à habilidade para especificamentealvejar células de câncer para destruição por meio de terapias com base emanticorpo. Nesta consideração, é observado que terapia com base emanticorpo provou muito eficaz no tratamento de certos cânceres. Porexemplo, HERCEPTIN® e RITUXAN® (ambos de Genentech Inc., South SanFrancisco, Califórnia) são anticorpos que foram usados de forma bemsucedida para tratar câncer de mama e linfoma de não-Hodgkin,respectivamente. Mais especificamente, HERCEPTIN® é um anticorpomonoclonal humanizado derivado de DNA recombinante que seletivamenteliga ao domínio extracelular do proto-oncogene do receptor de fator decrescimento epidérmico humano (HER2). Sobreexpressão de proteína deHER2 é observada em 25-30% de cânceres de mama primários. RITUXAN®é um anticorpo monoclonal murino/humano quimérico geneticamente criadodirecionado contra o antígeno de CD20 encontrado na superfície delinfócitos B normais e malignos. Ambos estes anticorpos sãorecombinantemente produzidos em células de CHO.

Em outras tentativas em descobrir alvos celulares eficazes paradiagnose e terapia de câncer, os investigadores buscaram identificar (1)polipeptídeos associados à não-membrana que são especificamenteproduzidos por um ou mais tipo(s) particular(es) de célula(s) de câncerquando comparados a um ou mais tipo(s) particular(es) de célula(s)normal(is) não-cancerosa(s), (2) polipeptídeos que são produzidos atravésde células de câncer a um nível de expressão que é significativamente maisalto que o de uma ou mais célula(s) não-cancerosa(s) normal(is), ou (3)polipeptídeos cuja expressão é especificamente limitada a apenas um (ounúmero muito limitado de diferentes) tipo(s) de tecido tanto no estadocanceroso como não-canceroso (por exemplo, tecido de próstata normal ede tumor de próstata). Tais polipeptídeos podem permanecerintracelularmente localizados ou segregados pela célula de câncer. Alémdisso, tais polipeptídeos podem não ser expressos pela própria célula decâncer, mas do contrário por células que produzem e/ou segregampolipeptídeos tendo um efeito potencializador ou intensificador decrescimento em células de câncer. Tais polipeptídeos segregados sãofreqüentemente proteínas que proporcionam às células de câncer umavantagem de crescimento sobre as células normais e incluem tais coisascomo, por exemplo, fatores angiogênicos, fatores de adesão celular, fatoresde crescimento, e outros. Identificação dos antagonistas de taispolipeptídeos associados à não-membrana seria esperado servir comoagentes terapêuticos eficazes para o tratamento de tais cânceres. Alémdisso, identificação do padrão de expressão de tais polipeptídeos seria útilpara a diagnose de cânceres particulares em mamíferos.

Apesar dos avanços acima identificados em terapia de câncermamífero, há uma grande necessidade por agentes diagnósticos eterapêuticos adicionais capazes de detectar a presença de tumor em ummamífero e para eficazmente inibir crescimento de célula neoplástica,respectivamente. Conseqüentemente, é um objetivo da presente invençãoidentificar: (1) polipeptídeos associados à membrana celular que são maisabundantemente expressados em um ou mais tipo(s) de célula(s) de câncerquando comparados em células normais ou em outras células de câncerdiferentes, (2) polipeptídeos associados à não-membrana que sãoespecificamente produzidos por um ou mais tipo(s) particular(es) de célula(s)de câncer) (ou por outras células que produzem polipeptídeos tendo umefeito potencializador no crescimento de células de câncer) quandocomparado a um ou mais tipo(s) particular(es) de célula(s) normal(is) não-cancerosa(s), (3) polipeptídeos associados à não-membrana que sãoproduzidos por células de câncer a um nível de expressão que ésignificativamente mais alto que o de uma ou mais célula(s) não-cancerosa(s)normal(is), ou (4) polipeptídeos cuja expressão é especificamente limitada aapenas um (ou número muito limitado de diferentes) tipo(s) de tecido tantoem um estado canceroso como não-canceroso (por exemplo, tecido depróstata normal e de tumor de próstata), e usar aqueles polipeptídeos, eseus ácidos nucléicos de codificação, para produzir composições desubstância útil no tratamento terapêutico e detecção diagnostica de câncerem mamíferos. É também um objetivo da presente invenção identificarpolipeptídeos associados à membrana celular, segregados ou intracelularescuja expressão é limitada a um número só ou muito limitado de tecidos, eusar aqueles polipeptídeos, e seus ácidos nucléicos de codificação, paraproduzir composições de substância úteis no tratamento terapêutico edetecção diagnostica de câncer em mamíferos.

Sumário da Invenção

A. Modalidades

No presente relatório descritivo, os Requerentes descrevem aidentificação de vários polipeptídeos celulares pela primeira vez (e seusácidos nucléicos de codificação ou fragmentos destes) que são expressadosa um grau maior na superfície ou por um ou mais tipos de célula(s) decâncer quando comparados na superfície ou por um ou mais tipos de célulasnão-cance rosas normais. Alternativamente, tais polipeptídeos sãoexpressados por células que produzem e/ou segregam polipeptídeos tendoum efeito potencializador ou intensificador de crescimento em células decâncer. De novo alternativamente, tais polipeptídeos podem não sersobreexpressados por células tumorais quando comparados às célulasnormais do mesmo tipo de tecido, mas do contrário podem serespecificamente expressados por células tumorais e células normais deapenas um número só ou muito limitado de tipos de tecido (preferivelmentetecidos que não são essenciais à vida, por exemplo, próstata, etc). Todosdos polipeptídeos acima são aqui referidos como polipeptídeos de AlvosAntigênicos associados ao Tumor (polipeptídeos de "TAT") e são esperadosservir como alvos eficazes para terapia e diagnose de câncer em mamíferos.

Conseqüentemente, em uma modalidade da presente invenção,a invenção fornece uma molécula de ácido nucléico isolada tendo umaseqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo alvo antigênicoassociado ao tumor ou fragmento deste (um polipeptídeo de "TAT").Em certos aspectos, a molécula de ácido nucléico isoladacompreende uma seqüência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de80% de identidade de seqüência de ácido nucléico, alternativamente pelomenos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidadede seqüência de ácido nucléico, a (a) uma molécula de DNA que codifica umpolipeptídeo de TAT de comprimento total tendo uma seqüência deaminoácido como aqui descrita, uma seqüência de aminoácido depolipeptídeo de TAT carecendo do peptídeo sinal como descrita aqui, umdomínio extracelular de um polipeptídeo de TAT de transmembrana, com ousem o peptídeo sinal, como descrito aqui ou qualquer outro fragmentoespecificamente definido de uma seqüência de aminoácido de polipeptídeode TAT de comprimento total como descrito aqui, ou (b) o complemento damolécula de DNA de (a).

Em outros aspectos, a molécula de ácido nucléico isoladacompreende uma seqüência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de80% de identidade de seqüência de ácido nucléico, alternativamente pelomenos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidadede seqüência: de ácido nucléico, a (a) uma molécula de DNAcompreendendo a seqüência de codificação de um cDNA de polipeptídeo deTAT de comprimento total como descrito aqui, a seqüência de codificação deum polipeptídeo de TAT carecendo do peptídeo sinal como descrito aqui, aseqüência de codificação de um domínio extracelular de um polipeptídeo deTAT de transmembrana, com ou sem o peptídeo sinal, como descrito aqui oua seqüência de codificação de qualquer outro fragmento especificamentedefinido da seqüência de aminoácido de polipeptídeo de TAT decomprimento total como descrito aqui, ou (b) o complemento da molécula deDNA de (a).

Em aspectos adicionais, a invenção refere-se a uma molécula deácido nucléico isolada compreendendo uma seqüência de nucleotídeo quetem pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de ácido nucléico,alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%,'84%, 85%, 86%,87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou100% de identidade de seqüência de ácido nucléico, a (a) uma molécula deDNA que codifica o mesmo polipeptídeo maduro codificado pela região decodificação de comprimento total de qualquer um dos cDNAs de proteínahumana depositados com o ATCC como descritos aqui, ou (b) ocomplemento da molécula de DNA de (a).

Outro aspecto da invenção fornece uma molécula de ácidonucléico isolada compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codificaum polipeptídeo de TAT que ou é deletado no domínio de transmembrana ouinativado no domínio de transmembrana, ou é complementar a tal seqüênciade nucleotídeo de codificação, em que o(s) domínio(s) de transmembrana detal(is) polipeptídeo(s) é/são descrito(s) aqui. Portanto, os domíniosextracelulares solúveis dos polipeptídeos de TAT aqui descritos sãocontemplados.

Em outros aspectos, a presente invenção é direcionada àsmoléculas de ácido nucléico isoladas que hibridam com (a) uma seqüênciade nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de TAT tendo uma seqüênciade aminoácido de comprimento total como descrita aqui, uma seqüência deaminoácido de polipeptídeo de TAT carecendo do peptídeo sinal comodescrita aqui, um domínio extracelular de um polipeptídeo de TAT detransmembrana, com ou sem o peptídeo sinal, como descrito aqui ouqualquer outro fragmento especificamente definido de uma seqüência deaminoácido de polipeptídeo de TAT de comprimento total como descrita aqui,ou (b) o complemento da seqüência de nucleotídeo de (a). Nestaconsideração, uma modalidade da presente invenção é direcionada aosfragmentos de uma seqüência de codificação de polipeptídeo de TAT decomprimento total, ou o complemento desta, como descrita aqui, que podeencontrar uso como, por exemplo, sondas de hibridização úteis como, porexemplo, sondas de diagnóstico, iniciadores de PCR, sondas deoligonucleotídeo anti-sentido, ou para codificar fragmentos de umpolipeptídeo de TAT de comprimento total que pode opcionalmente codificarum polipeptídeo compreendendo um sítio de ligação para um anticorpo depolipeptídeo anti-TAT, um oligopeptídeo de ligação de TAT ou outramolécula orgânica pequena que liga a um polipeptídeo de TAT. Taisfragmentos de ácido nucléico usualmente são pelo menos cerca de 5nucleotídeos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120,125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195,200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340,350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490,500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640,650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790,800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940,950, 960, 970, 980, 990, ou 1000 nucleotídeos em comprimento, em queneste contexto o termo "cerca de" significa o comprimento da seqüência denucleotídeo referido mais ou menos 10% daquele comprimento referido.Além disso, tais fragmentos de ácido nucléico são usualmentecompreendidos de nucleotídeos sucessivos derivados da seqüência decodificação de comprimento total de um polipeptídeo de TAT ou ocomplemento áesta. É observado que novos fragmentos de uma seqüênciade nucleotídeo de codificação de polipeptídeo de TAT, ou o complementodesta, podem ser determinados de uma maneira rotineira alinhando aseqüência de nucleotídeo de codificação de polipeptídeo de TAT com outrasseqüências de nucleotídeo conhecidas usando qualquer um de váriosprogramas de alinhamento de seqüência bem conhecidos e determinandoqual(is) fragmento(s) de seqüência de nucleotídeo de codificação depolipeptídeo de TAT, ou o complemento deste(s), é/são novo(s). Todos detais fragmentos novos das seqüências de nucleotídeo de codificação depolipeptídeo de TAT, ou o complemento destas, são contemplados aqui.

Também contemplados são os fragmentos de polipeptídeo de TATcodificados por estes fragmentos de molécula de nucleotídeo,preferível mente aqueles fragmentos de polipeptídeo de TAT compreendendoum sítio de ligação para um anticorpo de anti-TAT, um oligopeptídeo deligação de TAT ou outra molécula orgânica pequena que liga a umpolipeptídeo de TAT.

Em outra modalidade, a invenção fornece polipeptídeos de TATisolados codificados por quaisquer das seqüências de ácido nucléicoisoladas aqui acima identificadas.

Em um certo aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo deTAT isolado, compreendendo uma seqüência de aminoácido que tem pelomenos cerca de 80% de identidade de seqüência de aminoácido,alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou100% de identidade de seqüência de aminoácido, a um polipeptídeo de TATtendo uma seqüência de aminoácido de comprimento total como descritaaqui, uma seqüência de aminoácido de polipeptídeo de TAT carecendo dopeptídeo sinal como descrita aqui, um domínio extracelular de uma proteínade polipeptídeo de TAT de transmembrana, com ou sem o peptídeo sinal,como descrito aqui, uma seqüência de aminoácido codificada por quaisquerdas seqüências de ácido nucléico descritas aqui ou qualquer outrofragmento especificamente definido de uma seqüência de aminoácido depolipeptídeo de TAT de comprimento total como descrita aqui.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a umpolipeptídeo de TAT isolado compreendendo uma seqüência de aminoácidoque tem pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência deaminoácido, alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, ou 99% de identidade de seqüência de aminoácido, a uma seqüênciade aminoácido codificada por qualquer um do cDNAs de proteína humanadepositados com o ATCC como descritos aqui.

Em ainda um aspecto adicional, a invenção refere-se a umpolipeptídeo de TAT isolado compreendendo uma seqüência de aminoácidoque é codificada por uma seqüência de nucleotídeo que híbrida com ocomplemento de uma molécula de DNA que codifica (a) um polipeptídeo deTAT tendo uma seqüência de aminoacido de comprimento total comodescrita aqui, (b) uma seqüência de aminoacido de polipeptídeo de TATcarecendo do peptídeo sinal como descrita aqui, (c) um domínio extracelularde uma proteína de polipeptídeo de TAT de transmembrana, com ou sem opeptídeo sinal, como descrito aqui, (d) uma seqüência de aminoacidocodificada por quaisquer das seqüências de ácido nucléico descritas aqui ou(e) qualquer outro fragmento especificamente definido de uma seqüência deaminoacido de polipeptídeo de TAT de comprimento total como descrita aqui.

Em um aspecto específico, a invenção fornece um polipeptídeode TAT isolado sem a seqüência sinal N-terminal e/ou sem a metionina departida e é codificada por uma seqüência de nucleotídeo que codifica umatal seqüência de aminoacido anteriormente descrita. Processos paraproduzir o mesmo são também aqui descritos, em que aqueles processoscompreendem cultivar uma célula hospedeira compreendendo um vetor quecompreende a molécula de ácido nucléico de codificação apropriada sobcondições adequadas para expressão do polipeptídeo de TAT e restabelecero polipeptídeo de TAT da cultura de célula.

Outro aspecto da invenção fornece um polipeptídeo de TATisolado que ou é deletado do domínio de transmembrana ou inativado dodomínio de trafísmembrana. Processos para produzir o mesmo são tambémaqui descritos, em que aqueles processos compreendem cultivar uma célulahospedeira compreendendo um vetor que compreende a molécula de ácidonucléico de codificação apropriada sob condições adequadas paraexpressão do polipeptídeo de TAT e restabelecer o polipeptídeo de TAT dacultura de célula.

Em outras modalidades da presente invenção, a invençãofornece vetores compreendendo DNA que codifica qualquer um dospolipeptídeos aqui descritos. Células hospedeiras compreendendo qualquertal vetor são também fornecidas. Por via de exemplo, as células hospedeiraspodem ser células de CHO, células de E. coli, ou células de levedura. Umprocesso para produzir qualquer um dos polipeptídeos aqui descritos étambém fornecido e compreende cultivar as células hospedeiras sobcondições adequadas para expressão do polipeptídeo desejado erestabelecer o polipeptídeo desejado da cultura de célula.

Em outras modalidades, a invenção fornece polipeptídeosquiméricos isolados compreendendo qualquer um dos polipeptídeos de TATaqui descritos fundidos com um polipeptídeo heterologo (não-TAT). Exemplode tais moléculas quiméricas compreende qualquer um dos polipeptídeos deTAT aqui descritos fundidos em um polipeptídeo heterologo como, porexemplo, uma seqüência de rótulo de epítopo ou uma região de Fc de umaimunoglobulina.

Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo que liga,de preferência especificamente, a qualquer um dos polipeptídeos descritosacima ou abaixo. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal,fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado,anticorpo de cadeia simples ou anticorpo que competitivamente inibe aligação de um anticorpo de polipeptídeo anti-TAT a seu respectivo epítopoantigênico. Anticorpos da presente invenção podem opcionalmente serconjugados com um agente inibidor de crescimento ou agente citotóxicocomo uma toxina, incluindo, por exemplo, um maitansinóide oucaliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzimanucleolítica, ou outros.

Os anticorpos da presente invenção podem opcionalmente serproduzidos em células de CHO ou células bacterianas e preferivelmenteinibem o crescimento ou proliferação ou induzem a morte de uma célula àqual eles ligam. Para propósitos diagnósticos, os anticorpos da presenteinvenção podem ser detectavelmente rotulados, ligados a um suporte sólido,ou outros.

Em outras modalidades da presente invenção, a invençãofornece vetores compreendendo DNA que codifica qualquer um dosanticorpos aqui descritos. Célula hospedeira compreendendo qualquer talvetor é também fornecida. Por via de exemplo, as células hospedeiraspodem ser células de CHO, células de E. coli, ou células de levedura. Umprocesso para produzir qualquer dos anticorpos aqui descritos é tambémfornecido e compreende cultivar as células hospedeiras sob condiçõesadequadas para expressão do anticorpo desejado e restabelecer o anticorpodesejado da cultura de célula.

Em outra modalidade, a invenção fornece oligopeptídeos("oligopeptídeos de ligação de TAT") que liga, de preferênciaespecificamente, a qualquer um dos polipeptídeos de TAT descritos acimaou abaixo. Opcionalmente, os oligopeptídeos de ligação de TAT da presenteinvenção podem ser conjugados com um agente inibidor de crescimento ouagente citotóxico como uma toxina, incluindo, por exemplo, ummaitansinóide ou caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, umaenzima nucleolítica, ou outros. Os oligopeptídeos de ligação de TAT dapresente invenção podem opcionalmente ser produzidos em células de CHOou células bacterianas e preferivelmente inibem o crescimento ouproliferação ou induzem a morte de uma célula ao qual eles ligam. Parapropósitos diagnósticos, os oligopeptídeos de ligação de TAT da presenteinvenção podem ser detectavelmente rotulados, ligados a um suporte sólido,ou outros.

Em outras modalidades da presente invenção, a invençãofornece vetores compreendendo DNA que codifica qualquer um dosoligopeptídeosí- de ligação de TAT aqui descritos. Célula hospedeiracompreendendo qualquer tal vetor é também fornecida. Por via de exemplo,as células hospedeiras podem ser células de CHO, células de E. coli, oucélulas de levedura. Um processo para produzir qualquer um dosoligopeptídeos de ligação de TAT aqui descritos é também fornecido ecompreende cultivar as células hospedeiras sob condições adequadas paraexpressão do oligopeptídeo desejado e restabelecer o oligopeptídeodesejado da cultura de célula.

Em outra modalidade, a invenção fornece moléculas orgânicaspequenas ("moléculas orgânicas de ligação de TAT") que liga, depreferência especificamente, a qualquer um dos polipeptídeos de TATdescritos acima ou abaixo. Opcionalmente, as moléculas orgânicas deligação de TAT da presente invenção podem ser conjugadas com um agenteinibidor de crescimento ou agente citotóxico como uma toxina, incluindo, porexemplo, um maitansinóide ou caliqueamicina, um antibiótico, um isótoporadioativo, uma enzima nucleolítica, ou outros. As moléculas orgânicas deligação de TAT da presente invenção preferivelmente inibem o crescimentoou proliferação ou induzem a morte de uma célula à qual eles ligam. Parapropósitos diagnósticos, as moléculas orgânicas de ligação de TAT dapresente invenção podem ser detectavelmente rotuladas, ligadas a umsuporte sólido, ou outros.

Em ainda uma modalidade adicional, a invenção refere-se a umacomposição de substância compreendendo um polipeptídeo de TAT comodescrito aqui, um polipeptídeo de TAT quimérico como descrito aqui, umanticorpo de anti-TAT como descrito aqui, um oligopeptídeo de ligação deTAT como descrito aqui, ou uma molécula orgânica de ligação de TAT comodescrita aqui, em combinação com um veículo. Opcionalmente, o veículo éum veículo farmaceuticamente aceitável.

Em ainda outra modalidade, a invenção refere-se a um artigo defabricação compreendendo um recipiente e uma composição de substânciacontida dentro do recipiente, em que a composição de substância podecompreender um polipeptídeo de TAT como descrito aqui, um polipeptídeode TAT quimérico como descrito aqui, um anticorpo de anti-TAT comodescrito aqui, um oligopeptídeo de ligação de TAT como descrito aqui, ouuma molécula orgânica de ligação de TAT como descrita aqui. O artigo podetambém opcionalmente compreender uma etiqueta anexada ao recipiente,ou uma inserção de pacote inclusa com o recipiente que se refere ao uso dacomposição de substância para o tratamento terapêutico ou detecçãodiagnostica de um tumor.

Outra modalidade da presente invenção é direcionada ao uso deum polipeptídeo de TAT como descrito aqui, um polipeptídeo de TATquimérico como descrito aqui, um anticorpo de polipeptídeo anti-TAT comodescrito aqui, um oligopeptídeo de ligação de TAT como descrito aqui, ouuma molécula orgânica de ligação de TAT como descrita aqui, para apreparação de um fármaco útil no tratamento de uma condição que éresponsiva ao polipeptídeo de TAT, polipeptídeo de TAT quimérico,anticorpo de polipeptídeo anti-TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT, oumolécula orgânica de ligação de TAT.

B. Modalidades Adicionais

Outra modalidade da presente invenção é direcionada a ummétodo para inibir o crescimento de uma célula que expressa umpolipeptídeo de TAT, em que o método compreende contatar a célula comum anticorpo, um oligopeptídeo ou uma molécula orgânica pequena que ligaao polipeptídeo de TAT, e em que a ligação do anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica ao polipeptídeo de TAT causa inibição do crescimento dacélula que expressa o polipeptídeo de TAT. Em modalidades preferidas, acélula é uma célula de câncer e ligação do anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica ao polipeptídeo de TAT causa morte da célula queexpressa o polipeptídeo de TAT. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpomonoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpohumanizado, ou anticorpo de cadeia simples. Anticorpos, oligopeptídeos deligação de TAT e moléculas orgânicas de ligação de TAT empregados nosmétodos da presente invenção podem opcionalmente ser conjugados comum agente inibidor de crescimento ou agente citotóxico como uma toxina,incluindo, por exemplo, um maitansinóide ou caliqueamicina, um antibiótico,um isótopo radioativo, uma enzima nucleolítica, ou outros. Os anticorpos eoligopeptídeos de ligação de TAT empregados nos métodos da presenteinvenção podem opcionalmente ser produzidos em células de CHO oucélulas bacterianas.

Ainda outra modalidade da presente invenção é direcionada aum método de terapeuticamente tratar um mamífero que tem um tumorcanceroso compreendendo células que expressam um polipeptídeo de TAT,em que o método compreende administrar ao mamífero uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo, um oligopeptídeo ou uma moléculaorgânica pequena que liga ao polipeptídeo de TAT, assim resultando notratamento terapêutico eficaz do tumor. Opcionalmente, o anticorpo é umanticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico,anticorpo humanizado, ou anticorpo de cadeia simples. Anticorpos,oligopeptídeos de ligação de TAT e moléculas orgânicas de ligação de TATempregados nos métodos da presente invenção podem opcionalmente serconjugados com um agente inibidor de crescimento ou agente citotóxicocomo uma toxina, incluindo, por exemplo, um maitansinóide oucaliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzimanucleolítica, ou outros. Os anticorpos e oligopeptídeos empregados nosmétodos da presente invenção podem opcionalmente ser produzidos emcélulas de CHO ou células bacterianas.

Ainda outra modalidade da presente invenção é direcionada aum método de determinar a presença de um polipeptídeo de TAT em umaamostra suspeita de conter o polipeptídeo de TAT, em que o métodocompreende expor a amostra a um anticorpo, oligopeptídeo ou moléculaorgânica pequena que liga ao polipeptídeo de TAT e determinar a ligação doanticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica ao polipeptídeo de TAT naamostra, em que a presença de tal ligação é indicativa da presença dopolipeptídeo de TAT na amostra. Opcionalmente, a amostra pode contercélulas (que podem ser células de câncer) suspeitas de expressar opolipeptídeo de TAT. O anticorpo, oligopeptídeo de ligação de TAT oumolécula orgânica de ligação de TAT empregados no método podeopcionalmente ser detectavelmente rotulada, ligada a um suporte sólido, ououtros.

Uma modalidade adicional da presente invenção é direcionada aum método de diagnosticar a presença de um tumor em um mamífero, emque o método compreende detectar o nível de expressão de um gene quecodifica um polipeptídeo de TAT (a) em uma amostra de teste de células detecido obtidas do dito mamífero, e (b) em uma amostra de controle decélulas não-cancerosas normais conhecidas da mesma origem ou tipo detecido, em que um nível mais alto de expressão do polipeptídeo de TAT naamostra de teste, quando comparado à amostra de controle, é indicativo dapresença de tumor no mamífero do qual a amostra de teste foi obtida.

Outra modalidade da presente invenção é direcionada a ummétodo de diagnosticar a presença de um tumor em um mamífero, em que ométodo compreende (a) contatar uma amostra de teste compreendendo ascélulas de tecido obtidas do mamífero com um anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica pequena que ligam a um polipeptídeo de TAT e (b)detectar a formação de um complexo entre o anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica pequena e o polipeptídeo de TAT na amostra de teste,em que a formação de um complexo é indicativa da presença de um tumorno mamífero. Opcionalmente, o anticorpo, oligopeptídeo de ligação de TATou molécula orgânica de ligação de TAT empregados é detectavelmenterotulado, ligado a um suporte sólido, ou outros, e/ou a amostra de teste decélulas de tecido é obtida de um indivíduo suspeito de ter um tumorcanceroso.

Ainda outra modalidade da presente invenção é direcionada aum método para tratar ou impedir um distúrbio proliferativo celular associadoà expressão ou atividade alterada, preferivelmente aumentada, de umpolipeptídeo de TAT, o método compreendendo administrar a um indivíduoem necessidade de tal tratamento uma quantidade eficaz de antagonista deum polipeptídeo de TAT. Preferivelmente, o distúrbio proliferativo celular écâncer e o antagonista do polipeptídeo de TAT é um anticorpo depolipeptídeo afíti-TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT, molécula orgânicade ligação de TAT ou oligonucleotídeo anti-sentido. Tratamento ouprevenção eficaz do distúrbio proliferativo celular pode ser um resultado dematança direta ou inibição do crescimento de células que expressam umpolipeptídeo de TAT ou antagonização do crescimento celular quepotencializa a atividade de um polipeptídeo de TAT.

Ainda outra modalidade da presente invenção é direcionada aum método de ligar um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânicapequena a uma célula que expressa um polipeptídeo de TAT, em que ométodo compreende contatar uma célula que expressa um polipeptídeo deTAT com o dito anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena sobcondições que são adequadas para ligação do anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica pequena ao dito polipeptídeo de TAT e possibilitandoligação entre eles. Em modalidades preferidas, o anticorpo é rotulado comuma molécula ou composto que são úteis para qualitativamente e/ouquantitativamente determinar a localização e/ou quantidade de ligação doanticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena à célula.

Outras modalidades da presente invenção são direcionadas aouso de (a) um polipeptídeo de TAT, (b) um ácido nucléico que codifica umpolipeptídeo de TAT ou um vetor ou célula hospedeira compreendendoaquele ácido nucléico, (c) um anticorpo de polipeptídeo anti-TAT, (d) umaligação de oligopeptídeo TAT, ou (e) uma molécula orgânica pequena deligação de TAT na preparação de um fármaco útil para (i) o tratamentoterapêutico ou detecção diagnostica de um câncer ou tumor, ou (ii) otratamento terapêutico ou prevenção de um distúrbio proliferativo celular.

Outra modalidade da presente invenção é direcionada a ummétodo para inibir o crescimento de uma célula de câncer, em que ocrescimento da dita célula de câncer é pelo menos em parte dependente docrescimento que potencializa o(s) efeito(s) de um polipeptídeo de TAT (emque o polipeptídeo de TAT ou pode ser expressado pela célula de câncer emsi ou uma célula que produz polipeptídeo(s) que tem(êm) um efeitopotencializador de crescimento em células de câncer), em que o métodocompreende contatar o polipeptídeo de TAT com um anticorpo, umoligopeptídeo ou uma molécula orgânica pequena que liga ao polipeptídeode TAT, assim antagonizando a atividade potencializadora de crescimentodo polipeptídeo de TAT e, por sua vez, inibindo o crescimento da célula decâncer. Preferivelmente o crescimento da célula de câncer é completamenteinibido. Até mesmo mais preferivelmente, ligação do anticorpo, oligopeptídeoou molécula orgânica pequena ao polipeptídeo de TAT induz a morte dacélula de câncer. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal,fragmento de anticorpo, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, ouanticorpo de cadeia simples. Anticorpos, oligopeptídeos de ligação de TAT emoléculas orgânicas de ligação de TAT empregados nos métodos dapresente invenção podem opcionalmente ser conjugados com um agenteinibidor de crescimento ou agente citotóxico como uma toxina, incluindo, porexemplo, um maitansinóide ou caliqueamicina, um antibiótico, um isótoporadioativo, uma enzima nucleolítica, ou outros. Os anticorpos eoligopeptídeos de ligação de TAT empregados nos métodos da presenteinvenção podem opcionalmente ser produzidos em células de CHO oucélulas bacterianas.

Ainda outra modalidade da presente invenção é direcionada aum método de terapeuticamente tratar um tumor em um mamífero, em que ocrescimento do dito tumor é pelo menos em parte dependente docrescimento que potencializa o(s) efeito(s) de um polipeptídeo de TAT, emque o método compreende administrar ao mamífero uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo, um oligopeptídeo ou uma moléculaorgânica pequena que liga ao polipeptídeo de TAT, assim antagonizando aatividade pontencializadora de crescimento do dito polipeptídeo de TAT eresultando no tratamento terapêutico eficaz do tumor. Opcionalmente, oanticorpo é um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo, anticorpoquimérico, anticorpo humanizado, ou anticorpo de cadeia simples.Anticorpos, oligopeptídeos de ligação de TAT e moléculas orgânicas deligação de TAT empregados nos métodos da presente invenção podemopcionalmente ser conjugados com um agente inibidor de crescimento ouagente citotoxico como uma toxina, incluindo, por exemplo, ummaitansinóide ou caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, umaenzima nucleolítica, ou outros. Os anticorpos e oligopeptídeos empregadosnos métodos da presente invenção podem opcionalmente ser produzidos emcélulas de CHO ou células bacterianas.

C. Mais Modalidades Adicionais

Em ainda modalidades adicionais, a invenção é direcionada aoconjunto a seguir de reivindicações potenciais para este pedido de patente:

1. Ácido nucléico isolado tendo uma seqüência de nucleotídeoque tem pelo menos 80% de identidade de seqüência de ácido nucléico a:

(a) uma molécula de DNA que codifica a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID Ne: 2;

(b) uma molécula de DNA que codifica a seqüência deaminoácido mostrada como SEQ ID N9: 2, carecendo de seu peptídeo sinalassociado;

(c) uma molécula de DNA que codifica um domínio extracelulardo polipeptídeo mostrado como SEQ ID N-: 2, com seu peptídeo sinalassociado;

(d) uma molécula de DNA que codifica um domínio extracelulardo polipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2, carecendo de seu peptídeosinal associado;

(e) a seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N9: 1;

(f) a seqüência de codificação de comprimento total daseqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N9: 1; ou

(g) o complemento de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f).

2. Ácido nucléico isolado tendo:

(a) uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência deaminoácido mostrada como SEQ ID N9: 2;

(b) uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência deaminoácido mostrada como SEQ ID N9: 2, carecendo de seu peptídeo sinalassociado;

(c) uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínioextracelular do polipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2, com seu peptídeosinal associado;

(d) uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínioextracelular do polipeptídeo mostrado como SEQ ID Ne: 2, carecendo de seupeptídeo sinal associado;

(e) a seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID Ne: 1;

(f) a região de codificação de comprimento total da seqüência denucleotídeo mostrada como SEQ ID N-: 1; ou

(g) o complemento de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f).

3. Ácido nucléico isolado que hibridiza com:

(a) um ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácidomostrada como SEQ ID N9: 2;

(b) um ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácidomostrada como SEQ ID Ne: 2, carecendo de seu peptídeo sinal associado;

(c) um ácido nucléico que codifica um domínio extracelular dopolipeptídeo mostrado como SEQ ID NQ: 2, com seu peptídeo sinalassociado;

(d) um ácido nucléico que codifica um domínio extracelular dopolipeptídeo mostrado como SEQ ID N-: 2, carecendo de seu peptídeo sinalassociado;

(e) a seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID Ne: 1;

(f) a região de codificação de comprimento total da seqüência denucleotídeo mostrada como SEQ ID NQ: 1; ou

(g) o complemento de (a), (b), (c), (d), (e) ou (f).

4. O ácido nucléico da Reivindicação 3, em que a hibridizaçãoocorre sob condições rigorosas.

5. O ácido nucléico da Reivindicação 3 que é pelo menos cercade 5 nucleotídeos em comprimento.

6. Um vetor de expressão compreendendo o ácido nucléico daReivindicação 1, 2 ou 3.

7. O vetor de expressão da Reivindicação 6, em que o dito ácidonucléico está operavelmente ligado às seqüências de controle reconhecidaspor uma célula4hospedeira transformada com o vetor.

8. Uma célula hospedeira compreendendo o vetor de expressãoda Reivindicação 7.

9. A célula hospedeira da Reivindicação 8 que é uma célula deCHO, uma célula de E. coli ou uma célula de levedura.

10. Um processo para produzir um polipeptídeo compreendendocultivar a célula hospedeira da Reivindicação 8 sob condições adequadaspara expressão do dito polipeptídeo e restabelecimento do dito polipeptídeoda cultura de célula.

11. Um polipeptídeo isolado que tem pelo menos 80% deidentidade de seqüência de aminoácido a:

(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID Ne: 2;

(b) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID Ne: 2, carecendo deseu peptídeo sinal associado;

(c) um domínio extracelular do polipeptídeo mostrado como SEQID N9: 2, com seu peptídeo sinal associado;

(d) um domínio extracelular do polipeptídeo mostrado como SEQID N9: 2, carecendo de seu peptídeo sinal associado;

(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeomostrada como SEQ ID N9: 1; ou

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N9:1.

12. Um polipeptídeo isolado tendo:

(a) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID N9: 2;

(b) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID N9: 2,carecendo de sua seqüência de peptídeo sinal associada;

(c) uma seqüência de aminoácido um domínio extracelular dopolipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2, com sua seqüência de peptídeosinal associada;

(d) uma seqüência de aminoácido um domínio extracelular dopolipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2, carecendo de sua seqüência depeptídeo sinal associada;

(e) uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência denucleotídeo mostrada como SEQ ID N9: 1; ou

(f) uma seqüência de aminoácido codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeo mostradacomo SEQ ID N9: 1.

13. Um polipeptídeo quimérico compreendendo o polipeptídeoda Reivindicação 11 ou 12 fundido com um polipeptídeo heterólogo.

14. O polipeptídeo quimérico da Reivindicação 13, em que o ditopolipeptídeo heterólogo é uma seqüência de rótulo de epítopo ou uma regiãode Fc de uma imunoglobulina.

15. Um anticorpo isolado que liga a um polipeptídeo que tempelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácido a:(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID N-: 2;

(b) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID NQ: 2, carecendo deseu peptídeo sinal associado;

(c) um domínio extracelular do polipeptídeo mostrado como SEQID Ne: 2, com seu peptídeo sinal associado;

(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeomostrada como SEQ ID Ne: 1; ou

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID NQ: 1.

16. Um anticorpo isolado que liga a um polipeptídeo tendo:

(a) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID Ng: 2;

(b) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID Ne: 2,carecendo de sua seqüência de peptídeo sinal associada;

(c) uma seqüência de aminoácido um domínio extracelular dopolipeptídeo mostrado como SEQ ID Ne: 2, com sua seqüência de peptídeosinal associada;

(d) Hjma seqüência de aminoácido um domínio extracelular dopolipeptídeo mostrado como SEQ ID NQ: 2, carecendo de sua seqüência depeptídeo sinal associada;

(e) uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência denucleotídeo mostrada como SEQ ID NQ: 1; ou

(f) uma seqüência de aminoácido codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeo mostradacomo SEQ ID NQ: 1.

17. O anticorpo da Reivindicação 15 ou 16 que é um anticorpomonoclonal.

18. O anticorpo da Reivindicação 15 ou 16 que é um fragmentode anticorpo.

19. O anticorpo da Reivindicação 15 ou 16 que é um anticorpoquimérico ou um humanizado.

20. O anticorpo da Reivindicação 15 ou 16 que é conjugado comum agente inibidor de crescimento.

21. O anticorpo da Reivindicação 15 ou 16 que é conjugado comum agente citotóxico.

22. O anticorpo da Reivindicação 21, em que o agente citotóxicoé selecionado do grupo consistindo em toxinas, antibióticos, isótoposradioativos e enzimas nucleolítica.

23. O anticorpo da Reivindicação 21, em que o agente citotóxicoé uma toxina.

24. O anticorpo da Reivindicação 23, em que a toxina éselecionada do grupo consistindo em maitansinóide e caliqueamicina.

25. O anticorpo da Reivindicação 23, em que a toxina é ummaitansinóide.

26. O anticorpo da Reivindicação 15 ou 16 que é produzido embactérias.

27. O anticorpo da Reivindicação 15 ou 16 que é produzido emcélulas de CHO.

28. O anticorpo da Reivindicação 15 ou 16 que induz morte deuma célula ao qual se liga.

29. O anticorpo da Reivindicação 15 ou 16 que édetectavelmente rotulado.

30. Um ácido nucléico isolado tendo uma seqüência denucleotídeo que codifica o anticorpo da Reivindicação 15 ou 16.

31. Um vetor de expressão compreendendo o ácido nucléico daReivindicação 30 operavelmente ligados às seqüências de controlereconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vetor.

32. Uma célula hospedeira compreendendo o vetor deexpressão da Reivindicação 31.

33. A célula hospedeira da Reivindicação 32 que é uma célulade CHO, uma célula de E. coli ou uma célula de levedura.

34. Um processo para produzir um anticorpo compreendendocultivar a célula hospedeira da Reivindicação 32 sob condições adequadaspara expressão do dito anticorpo e restabelecer o dito anticorpo da culturade célula.

35. Um oligopeptídeo isolado que liga a um polipeptídeo que tempelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácido a:

(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID Ng: 2;

(b) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2, carecendo deseu peptídeo sinal associado;

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N9: 1.

36. Um oligopeptídeo isolado que liga a um polipeptídeo tendo:(a) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID N9: 2;

(d) uma seqüência de aminoácido um domínio extracelular dopolipeptídeo mostrado como SEQ ID NQ: 2, carecendo de sua seqüência depeptídeo sinal associada;

(f) uma seqüência de aminoácido codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeo mostradacomo SEQ ID N9: 1.37. O oligopeptídeo da Reivindicação 35 ou 36 é conjugado comum agente inibidor de crescimento.

38. O oligopeptídeo da Reivindicação 35 ou 36 é conjugado comum agente citotóxico.

39. O oligopeptídeo da Reivindicação 38, em que o agentecitotóxico é selecionado do grupo consistindo em toxinas, antibióticos,isótopos radioativos e enzimas nucleolítica.

40. O oligopeptídeo da Reivindicação 38, em que o agentecitotóxico é uma toxina.

41. O oligopeptídeo da Reivindicação 40, em que a toxina éselecionada do grupo consistindo em maitansinóide e caliqueamicina.

42. O oligopeptídeo da Reivindicação 40, em que a toxina é ummaitansinóide.

43. O oligopeptídeo da Reivindicação 35 ou 36 que induze mortede uma célula à qual se liga.

44. O oligopeptídeo da Reivindicação 35 ou 36 que édetectavelmente rotulado.

45. Uma molécula orgânica de ligação de TAT que liga a umpolipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de seqüência deaminoácido a:

(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2;

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N9:1.46. A molécula orgânica da Reivindicação 45 que liga a umpolipeptídeo tendo:

(a) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID N9: 2;

(b) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID N-: 2,carecendo de sua seqüência de peptídeo sinal associada;

(d) uma seqüência de aminoácido um domínio extracelular dopolipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2, carecendo de sua seqüência de

peptídeo sinal associada;

47. A molécula orgânica da Reivindicação 45 ou 46 é conjugadacom um agente inibidor de crescimento.

48. A molécula orgânica da Reivindicação 45 ou 46 é conjugadacom um agente citotóxico.

49. A molécula orgânica da Reivindicação 48, em que o agentecitotóxico é selecionado do grupo consistindo em toxinas, antibióticos,isótopos radioativos e enzimas nucleolítica.

50. A molécula orgânica da Reivindicação 48, em que o agentecitotóxico é uma toxina.

51. A molécula orgânica da Reivindicação 50, em que a toxina éselecionada do grupo consistindo em maitansinóide e caliqueamicina.

52. A molécula orgânica da Reivindicação 50, em que a toxina éum maitansinóide.

53. A molécula orgânica da Reivindicação 45 ou 46 que induzmorte de uma célula à qual se liga.

54. A molécula orgânica da Reivindicação 45 ou 46 que édetectavelmente rotulada.

55. Uma composição de substância compreendendo:

(a) o polipeptídeo da Reivindicação 11 ;

(b) o polipeptídeo da Reivindicação 12;

(c) o polipeptídeo quimérico da Reivindicação 13;

(d) o anticorpo da Reivindicação 15;

(e) o anticorpo da Reivindicação 16;

(f) o oligopeptídeo da Reivindicação 35;

(g) o oligopeptídeo da Reivindicação 36;

(h) a molécula orgânica de ligação de TAT da Reivindicação 45; ou

(i) a molécula orgânica de ligação de TAT da Reivindicação 46;em combinação com um veículo.

56. A composição de substância da Reivindicação 55, em que odito veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável.

(a) um recipiente; e

(b) a composição de substância da Reivindicação 55 contidadentro do dito recipiente.

58. O artigo de fabricação da Reivindicação 57 compreendendotambém um rótulo anexado ao dito recipiente, ou uma inserção de pacoteinclusa com o dito recipiente, referindo ao uso da dita composição desubstância para o tratamento terapêutico ou a detecção diagnostica de umcâncer.

59. Um método de inibir o crescimento de uma célula queexpressa uma proteína que tem pelo menos 80% de identidade deseqüência de aminoácidd a:

(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID Ne: 2;

(c) um domínio extracelular do polipeptídeo mostrado como SEQID NQ: 2, com seu peptídeo sinal associado;

(d) um domínio extracelular do polipeptídeo mostrado como SEQ

57. Um artigo de fabricação compreendendo:ID NQ: 2, carecendo de seu peptídeo sinal associado;

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID NQ:

1, o dito método compreendendo contatar a dita célula com um anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica que ligam à dita proteína, a ligação dodito anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica à dita proteína assimcausando uma inibição de crescimento da dita célula.

60. O método da Reivindicação 59, em que o dito anticorpo é umanticorpo monoclonal.

61. O método da Reivindicação 59, em que o dito anticorpo é umfragmento de anticorpo.

62. O método da Reivindicação 59, em que o dito anticorpo é umanticorpo quimérico ou um humanizado.

63. O método da Reivindicação 59, em que o dito anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica são conjugados com um agente inibidorde crescimento.

64. O método da Reivindicação 59, em que o dito anticorpo,oligopeptídeo sou molécula orgânica são conjugados com um agentecitotóxico.

65. O método da Reivindicação 64, em que o dito agentecitotóxico é selecionado do grupo consistindo em toxinas, antibióticos,isótopos radioativos e enzimas nucleolítica.

66. O método da Reivindicação 64, em que o agente citotóxico éuma toxina.

67. O método da Reivindicação 66, em que a toxina éselecionada do grupo consistindo em maitansinóide e caliqueamicina.

68. O método da Reivindicação 66, em que a toxina é ummaitansinóide.

69. O método da Reivindicação 59, em que o dito anticorpo éproduzido em bactérias.70. O método da Reivindicação 59, em que o dito anticorpo éproduzido em células de CHO.

71. O método da Reivindicação 59, em que a dita célula é umacélula de câncer.

72. O método da Reivindicação 71, em que a dita célula decâncer é também exposta ao tratamento de radiação ou um agentequimioterapêutico.

73. O método da Reivindicação 71, em que a dita célula decâncer é selecionada do grupo consistindo em uma célula de câncer demama, uma célula de câncer colorretal, uma célula de câncer do pulmão,uma célula de câncer ovariano, uma célula de câncer do sistema nervosocentral, uma célula de câncer do fígado, uma célula de câncer da bexiga,uma célula de câncer pancreática, uma célula de câncer cervical, uma célulade melanoma e uma célula de leucemia.

74. O método da Reivindicação 71, em que a dita proteína éexpressada mais abundantemente através da dita célula de câncer quandocomparada a uma célula normal da mesma origem de tecido.

75. O método da Reivindicação 59 que causas a morte da ditacélula.

76. O método da Reivindicação 59, em que a dita proteína tem:

(a) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID Ne: 2;

(b) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID NQ: 2,carecendo de sua seqüência de peptídeo sinal associada;

(c) uma seqüência de aminoácido um domínio extracelular dopolipeptídeo mostrado como SEQ ID Ns: 2, com sua seqüência de peptídeosinal associada;

(f) uma seqüência de aminoácido codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeo mostradacomo SEQ ID Ne: I.

77. Um método de terapeuticamente tratar um mamífero que temum tumor canceroso compreendendo células que expressam uma proteínaque tem pelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácido a:

(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID Ne: 2;

(c) um domínio extracelular do polipeptídeo mostrado como SEQID N-: 2, com seu peptídeo sinal associado;

(d) um domínio extracelular do polipeptídeo mostrado como SEQID NQ: 2, carecendo de seu peptídeo sinal associado;

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID Ns:1, o dito método compreendendo administrar ao dito mamífero umaquantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica que ligam à dita proteína, assim tratando o dito mamíferoeficazmente.

78. O método da Reivindicação 77, em que o dito anticorpo é umanticorpo monoclonal.

79. O método da Reivindicação 77, em que o dito anticorpo é umfragmento de anticorpo.

80. O método da Reivindicação 77, em que o dito anticorpo é umanticorpo quimérico ou um humanizado.

81. O método da Reivindicação 77, em que o dito anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica são conjugados com um agente inibidorde crescimento.

82. O método da Reivindicação 77, em que o dito anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica são conjugados com um agentecitotóxico.83. O método da Reivindicação 82, em que o dito agentecitotóxico é selecionado do grupo consistindo em toxinas, antibióticos,isótopos radioativos e enzimas nucleolíticas.

84. O método da Reivindicação 82, em que o agente citotóxico éuma toxina.

85. O método da Reivindicação 84, em que a toxina éselecionada do grupo consistindo em maitansinóide e caliqueamicina.

86. O método da Reivindicação 84, em que a toxina é ummaitansinóide.

87. O método da Reivindicação 77, em que o dito anticorpo éproduzido em bactérias.

88. O método da Reivindicação 77, em que o dito anticorpo éproduzido em células de GHO.

89. O método da Reivindicação 77, em que o dito tumor étambém exposto ao tratamento de radiação ou um agente quimioterapêutico.

90. O método da Reivindicação 77, em que o dito tumor é umtumor de mama, um tumor colorretal, um tumor pulmonar, um tumorovariano, um tumor do sistema nervoso central, um tumor do fígado, umtumor da bexiga, um tumor pancreático, ou um tumor cervical.

91. O método da Reivindicação 77, em que a dita proteína éexpressada mais abundantemente pelas células cancerosas do dito tumorquando comparada a uma célula normal da mesma origem de tecido.

92. O método da Reivindicação 77, em que a dita proteína tem:(a) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID NQ: 2;

(d) uma seqüência de aminoácido um domínio extracelular dopolipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2, carecendo de sua seqüência depeptídeo sinal associada;(e) uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência denucleotídeo mostrada como SEQ ID N9: 1; ou

(f) uma seqüência de aminoácido codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeo mostradacomo SEQ ID N-: 1.

93. Um método de determinar a presença de uma proteína emuma amostra suspeita de conter a dita proteína, em que a dita proteína tempelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácido a:

(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2;

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N9:1,o dito método compreendendo expor a dita amostra a um anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica que ligam à dita proteína e determinar aligação do dito anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica à dita proteínana dita amostra, em que a ligação do anticorpo, oligopeptídeo ou moléculaorgânica à dita proteína é indicativo da presença da dita proteína na ditaamostra.

94. O método da Reivindicação 93, em que a dita amostracompreende uma célula suspeita de expressar a dita proteína.

95. O método da Reivindicação 94, em que a dita célula é umacélula de câncer.

96. O método da Reivindicação 93, em que o dito anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica é detectavelmente rotulado.

97. O método da Reivindicação 93, em que a dita proteína tem:(a) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID N9: 2;

(e) uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência denucleotídeo mostrada como SEQ ID Ne: 1; ou

(f) uma seqüência de aminoácido codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeo mostradacomo SEQ ID N9:1.

98. Um método de diagnosticar a presença de um tumor em ummamífero, o dito método compreendendo determinar o nível de expressãode um gene que codifica uma proteína que tem pelo menos 80% deidentidade de seqüência de aminoácido a:

(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2;

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N9:1, em uma amostra de teste de células de tecido obtida do dito mamífero eem uma amostra de controle de células normais conhecidas da mesmaorigem de tecido, em que um nível mais alto de expressão da dita proteínana amostra de teste, quando comparada à amostra de controle, é indicativoda presença de tumor no mamífero do qual a amostra de teste foi obtida.

99. O método da Reivindicação 98, em que a etapa dedeterminar o nível de expressão de um gene que codifica a dita proteínacompreende empregar um oligonucleotídeo em uma hibridização in situ ouanálise de RT-PCR.

100. O método da Reivindicação 98, em que a etapa quedetermina o nível de expressão de um gene que codifica a dita proteínacompreende empregar um anticorpo em uma análise de imunoistoquímicaou de western blot.

101. O método da Reivindicação 98, em que a dita proteína tem:

(a) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID NQ: 2;

(b) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID Ng: 2,carecendo de sua seqüência de peptídeo sinal associada;

(c) uma seqüência de aminoácido um domínio extracelular dopolipeptídeo mostrado como SEQ ID N-: 2, com sua seqüência de peptídeosinal associada;

(e) uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência denucleotídeo mostrada como SEQ ID N-: 1; ou

(f) uma seqüência de aminoácido codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeo mostradacomo SEQ ID Ne: 1

102. Um método de diagnosticar a presença de um tumor em ummamífero, o dito método compreendendo contatar uma amostra de teste decélulas de tecido obtida do dito mamífero com um anticorpo, oligopeptídeoou molécula orgânica que ligam a uma proteína que tem pelo menos 80% deidentidade de seqüência de aminoácido a:

(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2;

(d) um domínio extracelular do polipeptídeo mostrado como SEQID Ne: 2, carecendo de seu peptídeo sinal associado;

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N9:1, e detectar a formação de um complexo entre o dito anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica e a dita proteína na amostra de teste,em que a formação de um complexo é indicativa de presença de matriz deum tumor no dito mamífero.

103. O método da Reivindicação 102, em que o dito anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica é detectavelmente rotulado.

104. O método da Reivindicação 102, em que a dita amostra deteste de células de tecido é obtida de um indivíduo suspeito de ter um tumorcanceroso.

105. O método da Reivindicação 102, em que a dita proteína tem:(a) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID N9: 2;

(e) uma seqüência de aminoácido codificada pela seqüência denucleotídeo mostrada como SEQ ID N9:1; ou

106. Um método para tratar ou impedir um distúrbio proliferativocelular associado à expressão ou atividade aumentada de uma proteína quetem pelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácido a:

(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2;

(b) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID N-: 2, carecendo deseu peptídeo sinal associado;

(c) um domínio extracelular do polipeptídeo mostrado como SEQID Ng: 2, com seu peptídeo sinal associado;

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID Ne:

1, o dito método compreendendo administrar a um indivíduo em necessidadede tal tratamento uma quantidade eficaz de antagonista da dita proteína,assim eficazmente tratando ou impedindo o dito distúrbio proliferativo celular.

107. O método da Reivindicação 106, em que o dito distúrbioproliferativo cejular é câncer.

108. O método da Reivindicação 106, em que o dito antagonistaé um anticorpo de polipeptídeo anti-TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT,molécula orgânica de ligação de TAT ou oligonucleotídeo anti-sentido.

109. Um método de ligar um anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica a uma célula que expressa uma proteína que tem pelomenos 80% de identidade de seqüência de aminoácido a:

(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID N5: 2;

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N2:1, o dito método compreendendo contatar a dita célula com um anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica que ligam à dita proteína e permitir aligação do anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica à dita proteínaocorrer, assim ligando o dito anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica àdita célula.

110. O método da Reivindicação 109, em que o dito anticorpo éum anticorpo monoclonal.

111.0 método da Reivindicação 109, em que o dito anticorpo éum fragmento de anticorpo.

112. O método da Reivindicação 109, em que o dito anticorpo éum anticorpo quimérico ou um humanizado.

113. O método da Reivindicação 109, em que o dito anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica são conjugados com um agente inibidorde crescimento.

114. O método da Reivindicação 109, em que o dito anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica são conjugados com um agentecitotóxico.

115. O método da Reivindicação 114, em que o dito agentecitotóxico é selecionado do grupo consistindo em toxinas, antibióticos,isótopos radioativos e enzimas nucleolítica.

116. O método da Reivindicação 114, em que o agente citotóxicoé uma toxina.

117. O método da Reivindicação 116, em que a toxina éselecionada do grupo consistindo em maitansinóide e caliqueamicina.

118. O método da Reivindicação 116, em que a toxina é ummaitansinóide.

119. O método da Reivindicação 109, em que o dito anticorpo éproduzido em bactérias.

120. O método da Reivindicação 109, em que o dito anticorpo éproduzido em células de CHO.

121. O método da Reivindicação 109, em que a dita célula éuma célula de câncer.

122. O método da Reivindicação 121, em que a dita célula decâncer é também exposta ao tratamento de radiação ou um agentequimioterapêutico.

123. O método da Reivindicação 121, em que a dita célula decâncer é selecionada do grupo consistindo em uma célula de câncer demama, uma célula de câncer colorretal, uma célula de câncer do pulmão,uma célula de câncer ovariana, uma célula de câncer do sistema nervosocentral, uma célula de câncer do fígado, uma célula de câncer da bexiga,uma célula de câncer pancreática, uma célula de câncer cervical, uma célulade melanoma e uma célula de leucemia.

124. O método da Reivindicação 123, em que a dita proteína éexpressada mais abundantemente através da dita célula de câncer quandocomparada a uma célula normal da mesma origem de tecido.

125. O método da Reivindicação 109 que causa a morte da ditacélula.

126. Uso de um ácido nucléico como reivindicado em qualqueruma das Reivindicações 1 a 5 ou 30 na preparação de um fármaco para otratamento terapêutico ou detecção diagnostica de um câncer.

127. Uso de um ácido nucléico como reivindicado em qualqueruma das Reivindicações 1 a 5 ou 30 na preparação de um fármaco paratratar um tumor.

128. Uso de um ácido nucléico como reivindicado em qualqueruma das Reivindicações 1 a 5 ou 30 na preparação de um fármaco paratratamento ou prevenção de um distúrbio proliferativo celular.

129. Uso de um vetor de expressão como reivindicado emqualquer uma das Reivindicações 6, 7 ou 31 na preparação de um fármacopara o tratamento terapêutico ou detecção diagnostica de um câncer.130. Uso de um vetor de expressão como reivindicado emqualquer uma das Reivindicações 6, 7 ou 31 na preparação de fármaco paratratar um tumor.

131. Uso de um vetor de expressão como reivindicado emqualquer uma das Reivindicações 6, 7 ou 31 na preparação de um fármacopara tratamento ou prevenção de um distúrbio proliferativo celular.

132. Uso de uma célula hospedeira como reivindicado emqualquer uma das Reivindicações 8, 9, 32, ou 33 na preparação de umfármaco para o tratamento terapêutico ou detecção diagnostica de umcâncer.

133. Uso de uma célula hospedeira como reivindicado emqualquer uma das Reivindicações 8, 9, 32 ou 33 na preparação de umfármaco para tratar um tumor.

134. Uso de uma célula hospedeira como reivindicado emqualquer uma das Reivindicações 8, 9, 32 ou 33 na preparação de umfármaco para tratamento ou prevenção de um distúrbio proliferativo celular.

135. Uso de um polipeptídeo como reivindicado em qualqueruma das Reivindicações 11 a 14 na preparação de um fármaco para otratamento terapêutico ou detecção diagnostica de um câncer.

136. Uso de um polipeptídeo como reivindicado em qualqueruma das Reivindicações 11 a 14 na preparação de um fármaco para tratarum tumor.

137. Uso de um polipeptídeo como reivindicado em qualqueruma das Reivindicações 11 a 14 na preparação de um fármaco paratratamento ou prevenção de um distúrbio proliferativo celular.

138. Uso de um anticorpo como reivindicado em qualquer umadas Reivindicações 15 a 29 na preparação de um fármaco para o tratamentoterapêutico ou detecção diagnostica de um câncer.

139. Uso de um anticorpo como reivindicado em qualquer umadas Reivindicações 15 a 29 na preparação de um fármaco para tratar umtumor.

140. Uso de um anticorpo como reivindicado em qualquer umadas Reivindicações 15 a 29 na preparação de um fármaco para tratamentoou prevenção de um distúrbio proliferativo celular.

141. Uso de um oligopeptídeo como reivindicado em qualqueruma das Reivindicações 35 a 44 na preparação de um fármaco para otratamento terapêutico ou detecção diagnostica de um câncer.

142. Uso de um oligopeptídeo como reivindicado em qualqueruma das Reivindicações 35 a 44 na preparação de um fármaco para tratarum tumor.

143. Uso de um oligopeptídeo como reivindicado em qualqueruma das Reivindicações 35 a 44 na preparação de um fármaco paratratamento ou prevenção de um distúrbio proliferativo celular.

144. Uso de uma molécula orgânica de ligação de TAT comoreivindicado em qualquer uma das Reivindicações 45 a 54 na preparação deum fármaco para o tratamento terapêutico ou detecção diagnostica de umcâncer.

145. Uso de uma molécula orgânica de ligação de TAT comoreivindicado em qualquer uma das Reivindicações 45 a 54 na preparação deum fármaco para tratar um tumor.

146. Uso de uma molécula orgânica de ligação de TAT comoreivindicado em qualquer uma das Reivindicações 45 a 54 na preparação deum fármaco para tratamento ou prevenção de um distúrbio proliferativocelular.

147. Uso de uma composição de substância como reivindicadoem qualquer uma das Reivindicações 55 ou 56 na preparação de umfármaco para o tratamento terapêutico ou detecção diagnostica de umcâncer.

148. Uso de uma composição de substância como reivindicadoem qualquer uma das Reivindicações 55 ou 56 na preparação de umfármaco para tratar um tumor.

149. Uso de uma composição de substância como reivindicadoem qualquer uma das Reivindicações 55 ou 56 na preparação de umfármaco para tratamento ou prevenção de um distúrbio proliferativo celular.150. Uso de um artigo de fabricação como reivindicado emqualquer uma das Reivindicações 57 ou 58 na preparação de um farmacopara o tratamento terapêutico ou detecção diagnostica de um câncer.

151. Uso de um artigo de fabricação como reivindicado emqualquer uma das Reivindicações 57 ou 58 na preparação de um farmacopara tratar um tumor.

152. Uso de um artigo de fabricação como reivindicado emqualquer uma das Reivindicações 57 ou 58 na preparação de um farmacopara tratamento ou prevenção de um distúrbio proliferativo celular.

153. Um método para inibir o crescimento de uma célula, em queo crescimento da dita célula é pelo menos em parte dependente em umefeito potencializador de crescimento de uma proteína que tem pelo menos80% de identidade de seqüência de aminoácido a:

(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID Ne: 2;

(e) um polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeomostrada como SEQ ID NQ: 1; ou

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação decomprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID NQ:1, o dito método compreendendo contatar a dita proteína com um anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica que ligam à dita proteína, inibindo ocrescimento da dita célula.

154. O método da Reivindicação 153, em que a dita célula éuma célula de câncer.

155. O método da Reivindicação 153, em que a dita proteína éexpressada através da dita célula.

156. O método da Reivindicação 153, em que a ligação do ditoanticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica à dita proteína antagonizauma atividade potencializadora de crescimento celular da dita proteína.

157. O método da Reivindicação 153, em que a ligação do ditoanticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica à dita proteína induz a morteda dita célula.

158. O método da Reivindicação 153, em que o dito anticorpo éum anticorpo monoclonal.

159. O método da Reivindicação 153, em que o dito anticorpo éum fragmento de anticorpo.

160. O método da Reivindicação 153, em que o dito anticorpo éum anticorpo quimérico ou um humanizado.

161. O método da Reivindicação 153, em que o dito anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica são conjugados com um agente inibidorde crescimento.

162. O método da Reivindicação 153, em que o dito anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica são conjugados com um agentecitotóxico.

163. O método da Reivindicação 162, em que o dito agentecitotóxico é selecionado do grupo consistindo em toxinas, antibióticos,isótopos radioativos e enzimas nucleolítica.

164. O método da Reivindicação 162, em que o agente citotóxicoé uma toxina.

165. O método da Reivindicação 164, em que a toxina éselecionada do grupo consistindo em maitansinóide e caliqueamicina.

166. O método da Reivindicação 164, em que a toxina é ummaitansinóide.

167. O método da Reivindicação 153, em que o dito anticorpo éproduzido em bactérias.

168. O método da Reivindicação 153, em que o dito anticorpo éproduzido em células de CHO.

169. O método da Reivindicação 153, em que a dita proteína tem:(a) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID N9: 2;(b) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID N9: 2,carecendo de sua seqüência de peptídeo sinal associada;

(d) uma seqüência de aminoácido um domínio extracelular dopolipeptídeo mostrado como SEQ ID Ng: 2, carecendo de sua seqüência depeptídeo sinal associada;

170. Um método de terapeuticamente tratar um tumor em ummamífero, em que o crescimento do dito tumor é pelo menos em partedependente de um efeito potencializador de crescimento de uma proteínaque tem pelo menos 80% de identidade de seqüência de aminoácido a:

(a) o polipeptídeo mostrado como SEQ ID N9: 2;

(f) um polipeptídeo codificado pela região de codificação de

comprimento total da seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N9:1, o dito método compreendendo contatar a dita proteína com um anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica que ligam à dita proteína, assim tratandoo dito tumor eficazmente.

171. O método da Reivindicação 170, em que a dita proteína éexpressada por células do dito tumor.

172. O método da Reivindicação 170, em que a ligação do ditoanticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica à dita proteína antagonizauma atividade potencializadora de crescimento celular da dita proteína.

173. O método da Reivindicação 170, em que o dito anticorpo éum anticorpo monoclonal.

174. O método da Reivindicação 170, em que o dito anticorpo éum fragmento de anticorpo.

175. O método da Reivindicação 170, em que o dito anticorpo éum anticorpo quimérico ou um humanizado.

176. O método da Reivindicação 170, em que o dito anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica são conjugados com um agente inibidorde crescimento.

177. O método da Reivindicação 170, em que o dito anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica são conjugados com um agentecitotóxico.

178. O método da Reivindicação 177, em que o dito agentecitotóxico é selecionado do grupo consistindo em toxinas, antibióticos,isótopos radioativos e enzimas nucleolítica.

179. O método da Reivindicação 177, em que o agente citotóxicoé uma toxina.

180. O método da Reivindicação 179, em que a toxina éselecionada do grupo consistindo em maitansinóide e caliqueamicina.

181. O método da Reivindicação 179, em que a toxina é ummaitansinóide.

182. O método da Reivindicação 170, em que o dito anticorpo éproduzido em bactérias.

183. O método da Reivindicação 170, em que o dito anticorpo éproduzido em células de CHO.

184. O método da Reivindicação 170, em que a dita proteína tem:

(a) a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID N9: 2;

(f) uma seqüência de aminoácido codificada pela região decodificação de comprimento total da seqüência de nucleotídeo mostradacomo SEQ ID Ns: 1.

186. Um anticorpo isolado que liga ao epítopo ligado por umanticorpo produzido por quaisquer das linhagens celulares de hibridoma mostradas na Tabela 7.

187. O anticorpo da Reivindicação 186 que é um anticorpomonoclonal.

188. O anticorpo da Reivindicação 186 que é um fragmento deanticorpo.

189. O anticorpo da Reivindicação 186 que é um anticorpoquimérico ou um humanizado.

190. O anticorpo da Reivindicação 186 que é conjugado com umagente inibidor de crescimento.

191. O anticorpo da Reivindicação 186 que é conjugado com umagente citotóxico.

192. O anticorpo da Reivindicação 191, em que o agentecitotóxico é selecionado do grupo consistindo em toxinas, antibióticos,isótopos radioativos e enzimas nucleolítica.

193. O anticorpo da Reivindicação 191, em que o agentecitotóxico é uma toxina.

194. O anticorpo da Reivindicação 193, em que a toxina éselecionada do grupo consistindo em maitansinoide e caliqueamicina.195. O anticorpo da Reivindicação 193, em que a toxina é ummaitansinóide.

196. O anticorpo da Reivindicação 186 que é produzida embactérias.

197. O anticorpo da Reivindicação 186 que é produzida emcélulas de CHO.

198. O anticorpo da Reivindicação 186 que induz morte de umacélula à qual se liga.

199. O anticorpo da Reivindicação 186 que é detectavelmenterotulado.

200. O anticorpo da Reivindicação 186 compreendendo pelomenos uma das regiões de determinação de complementaridade dequalquer anticorpo produzido por quaisquer das linhagens celulares dehibridoma mostradas na Tabela 7.

201. Um anticorpo monoclonal produzido por quaisquer dascélulas de hibridoma mostradas na Tabela 7.

202. Uma célula de hibridoma que produz um anticorpomonoclonal que liga a um polipeptídeo de TAT113.

203. Um método de identificar um anticorpo que liga a umepítopo ligado" por um anticorpo produzido por quaisquer das linhagenscelulares de hibridoma mostradas na Tabela 7, o dito métodocompreendendo determinar a habilidade de um primeiro anticorpo parabloquear a ligação de um segundo anticorpo produzido por quaisquer daslinhagens celulares de hibridoma mostradas na Tabela 7 a um polipeptídeode TAT113, em que a habilidade do dito primeiro anticorpo para bloquear aligação do dito segundo anticorpo ao dito polipeptídeo de TAT113 em pelomenos 40% e em concentrações de anticorpo iguais é indicativo do ditoprimeiro anticorpo sendo capaz de ligar a um epítopo ligado através do ditosegundo anticorpo.

Ainda modalidades adicionais da presente invenção serãoevidentes ao artesão versado sob uma leitura do relatório descritivo presente.Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 mostra uma seqüência de nucleotídeo (SEQ ID N9: 1)de um cDNA de TAT113, em que a SEQ ID N9: 1 é um clone designado aquicomo "DNA215609".

Figura 2 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID N9: 2)derivada da seqüência de codificação de comprimento total da SEQ ID N9: 1mostrada na figura 1.

Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas

I. Definições

Os termos "polipeptídeo de TAT" e "TAT" como aqui usados equando imediatamente seguidos por uma designação numérica, refere-se avários polipeptídeos, em que a designação completa (isto é, TAT/número)refere-se às seqüências de polipeptídeo específicas como descritas aqui. Ostermos "polipeptídeo de TAT/número" e "TAT/número" em que o termo"número" é fornecido como uma designação numérica real como aqui usadopara abranger polipeptídeos de seqüência nativa, variantes de polipeptídeo efragmentos de polipeptídeos de seqüência nativa e variantes de polipeptídeo(que são também definidas aqui). Os polipeptídeos de TAT descritos aquipodem ser isolados de uma variedade de fontes, como de tipos de tecidohumano ou de outra fonte, ou preparados através de métodosrecombinantes ou sintéticos. O termo "polipeptídeo de TAT" refere-se a cadapolipeptídeo de TAT/número individual descrito aqui. Todas as revelaçõesneste relatório descritivo que refere ao "polipeptídeo de TAT" se referem acada um dos polipeptídeos individualmente como também juntos. Porexemplo, as descrições da preparação de, purificação de, derivação de,formação de anticorpos para ou contra, formação de oligopeptídeos deligação de TAT para ou contra, formação de moléculas orgânicas de ligaçãode TAT para ou contra, administração de, composições contendo,tratamento de uma doença com, etc, pertencem individualmente a cadapolipeptídeo da invenção. O termo "polipeptídeo de TAT" também incluivariantes dos polipeptídeos de TAT/número descritos aqui.

Um "polipeptídeo de TAT de seqüência nativa" compreende umpolipeptídeo que tem a mesma seqüência de aminoácido que o polipeptídeode TAT correspondente derivado da natureza. Tal seqüência nativa pode serisolada de polipeptídeos de TAT da natureza ou produzida através de meiosrecombinantes ou sintéticos. O termo "polipeptídeo de TAT de seqüêncianativa" especificamente abrange formas truncadas ou segregadas deocorrência natural do polipeptídeo de TAT específico (por exemplo, umaseqüência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural(por exemplo, formas alternativamente juntadas) e variantes alélicas deocorrência natural do polipeptídeo. Em certas modalidades da invenção, ospolipeptídeos de TAT de seqüência nativa descritos aqui são polipeptídeosde seqüência nativa maduros ou de comprimento total compreendendo asseqüências de aminoácidos de comprimento total mostradas nas figuras emanexo. Códons de começo e de parada (se indicados) são mostrados emnegrito e sublinhados nas figuras. Resíduos de ácido nucléico indicadoscomo "N" ou "X" nas figuras em anexo são qualquer resíduo de ácidonucléico. Porém, embora os polipeptídeos de TAT descritos nas figuras emanexo sejam mostrados começar com resíduos de metionina designadosaqui como posição de aminoácido 1 nas figuras, é concebível e possível queoutros resíduos de metionina localizados a montante ou a jusante da posiçãode aminoácido 1 nas figuras podem ser empregados como o resíduo deaminoácido partida para os polipeptídeos de TAT.

O "domínio extracelular" do polipeptídeo de TAT ou "ECD"refere-se a uma forma do polipeptídeo de TAT que é essencialmente livre datransmembrana e domínios citoplásmicos. Usualmente, um polipeptídeo deECD de TAT terá menos que 1% de tal transmembrana e/ou domínioscitoplásmicos e preferivelmente, terá menos que 0,5% de tais domínios.Será entendido que qualquer domínio de transmembrana identificado paraos polipeptídeos de TAT da presente invenção é identificado de acordo comos critérios habitualmente empregados na técnica para identificar aquele tipode domínio hidrofóbico. Os limites exatos de um domínio de transmembranapodem variar mas mais provavelmente por não mais que cerca de 5aminoácidos em qualquer extremidade do domínio como inicialmenteidentificado aqui. Portanto, opcionalmente um domínio extracelular de umpolipeptídeo de TAT pode conter de cerca de 5 ou menos aminoácidos emqualquer lado do domínio de transmembrana/limite de domínio extracelularcomo identificado nos Exemplos ou no relatório descritivo e taispolipeptídeos, com ou sem o peptídeo sinal associado, e ácido nucléico queos codifica, são contemplados pela presente invenção.

A localização aproximada dos "peptídeos de sinal" dos váriospolipeptídeos de TAT descritos aqui pode ser mostrada no presente relatóriodescritivo e/ou nas figuras em anexo. Porém, é observado que o limite C-terminal de um peptídeo sinal pode variar, mas o mais provavelmente emnão mais que cerca de 5 aminoácidos em qualquer lado do peptídeo sinallimite C-terminal como inicialmente identificado aqui, em que o limiteC-terminal do peptídeo sinal pode ser habitualmente identificado de acordocom os critérios empregados na técnica para identificar que tipo de elementode seqüência de aminoácido (por exemplo, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6(1997) e von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14:4683- 4690 (1986)). Alémdisso, é também reconhecido que, em alguns casos, a clivagem de umaseqüência sinal de um polipeptídeo segregado é não-inteiramenteuniformizada, resultando em mais que uma espécie segregada. Estespolipeptídeos maduros, onde o peptídeo sinal é clivado não mais que cercade 5 aminoácidos em qualquer lado do limite C-terminal do peptídeo sinalcomo identificado aqui, e os polinucleotídeos que os codificam, sãocontemplados pela presente invenção.

"Variante de polipeptídeo de TAT" significa um polipeptídeo deTAT, preferivelmente um polipeptídeo de TAT ativo, como definido aquitendo pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de aminoácidocom uma seqüência de polipeptídeo de TAT de seqüência nativa decomprimento total como descrita aqui, uma seqüência de polipeptídeo deTAT carecendo do peptídeo sinal como descrita aqui, um domínioextracelular de um polipeptídeo de TAT, com ou sem o peptídeo sinal, comodescrito aqui ou qualquer outro fragmento de uma seqüência de polipeptídeode TAT de comprimento total como descrita aqui (como aquelas codificadaspor um ácido nucléico que representa apenas uma porção da seqüência decodificação completa para um polipeptídeo de TAT de comprimento total).Por exemplo, tais variantes de polipeptídeo de TAT incluem polipeptídeos deTAT em que um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados, oudeletados, no término N ou C da seqüência de aminoácido nativa decomprimento total. Usualmente, uma variante de polipeptídeo de TAT terápelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de aminoácido,alternativamente pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%de identidade de seqüência de aminoácido, para uma seqüência depolipeptídeo de TAT de seqüência nativa de comprimento total comodescrita aqui, uma seqüência de polipeptídeo de TAT carecendo do peptídeosinal como descrita aqui, um domínio extracelular de um polipeptídeo deTAT, com ou sem o peptídeo sinal, como descrito aqui ou qualquer outrofragmento especificamente definido de uma seqüência de polipeptídeo deTAT de comprimento total como descrita aqui. Usualmente, variantes depolipeptídeos de TAT são pelo menos cerca de 10 aminoácidos emcomprimento, alternativamente pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70,80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200,210, 220, 230,240, 250, 260,á270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380,390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530,540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 aminoácidos em comprimento, ou mais.Opcionalmente, variantes de polipeptídeos de TAT terão não mais que umasubstituição de aminoácido conservadora quando comparados à seqüênciade polipeptídeo de TAT nativa, alternativamente não mais que 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, ou 10 substituições de aminoácido conservadoras quando comparadosà seqüência de polipeptídeo de TAT nativa.

"Por cento (%) de identidade de seqüência de aminoácido" comrespeito às seqüências de polipeptídeo de TAT identificadas aqui é definidocomo a porcentagem de resíduos de aminoácido em uma seqüênciacandidato que são idênticos aos resíduos de aminoácido na seqüência depolipeptídeo de TAT específica, após alinhar as seqüências e introduzirintervalos, se necessário, para alcançar o por cento de identidade deseqüência máximo, e não considerando nenhuma substituição conservadoracomo parte da identidade de seqüência. Alinhamento para propósitos dedeterminar o por cento de identidade de seqüência de aminoácido pode seralcançado de vários modos que estão dentro da habilidade na técnica, porexemplo, usando software de computador publicamente disponível comosoftware de BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aquelesversados na técnica podem determinar os parâmetros apropriados paramedir o alinhamento, incluindo qualquer algoritmo necessário para alcançaralinhamento máximo no comprimento total das seqüências sendocomparadas. Para propósitos aqui, porém, valores de % de identidade deseqüência de aminoácido são gerados usando o programa de computaçãode comparação de seqüência ALIGN-2, em que o código fonte completopara o programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa decomputação de comparação de seqüência ALIGN-2 foi criado por Genentech,Inc. e o código fonte mostrado na Tabela 1 abaixo foi arquivado com adocumentação de usuário no Escritório de Direitos Autorais dos EUA,Washington D.C., 20559, onde é registrado sob o Registro de DireitosAutorais dos EUA N- TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamentedisponível por Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode sercompilado do código fonte fornecido na Tabela 1 abaixo. O programaALIGN-2 deveria ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX,preferivelmente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação deseqüência são fixados pelo programa ALIGN-2 e não variam.

Em situações onde ALIGN-2 é empregado para comparações deseqüência de aminoácido, a % de identidade de seqüência de aminoácidouma seqüência de aminoácido dada A para, com, ou contra uma seqüênciade aminoácido dada B (que pode ser alternativamente fraseada como umaseqüência de aminoácido dada A que tem ou compreende um certo % deidentidade de seqüência de aminoácido para, com, ou contra uma seqüênciade aminoácido dada B) é calculado como segue:100 vezes a fração X/Yonde X é o número de resíduos de aminoácido registrados comoparidades idênticas pelo programa de alinhamento de seqüência ALIGN-2naquele alinhamento de programa de A e B, e onde Y é o número total deresíduos de aminoácido em B.

Será apreciado que onde o comprimento de seqüência deaminoácido A não for igual ao comprimento de seqüência de aminoácido B,a % de identidade de seqüência de aminoácido A para B não igualará à %de identidade de seqüência de aminoácido B para A. Como exemplos de %de cálculos de identidade de seqüência de aminoácido usando este método,as Tabelas 2 e 3 demonstram como calcular a % de identidade de seqüênciade aminoácido da seqüência de aminoácido designada "Proteína deComparação" para a seqüência de aminoácido designada "TAT", em que"TAT" representa a seqüência de aminoácido um polipeptídeo de TAThipotético de interesse, "Proteína de Comparação" representa a seqüênciade aminoácido um polipeptídeo contra o qual o polipeptídeo "TAT" deinteresse está sendo comparado, e "X, "Y" e "Z", cada um, representamresíduos de aminoácido hipotéticos diferentes. A menos que do contrárioespecificamente declarado, todos os valores de % de identidade deseqüência de aminoácido aqui usados são obtidos como descritos noparágrafo imediatamente precedente usando o programa de computaçãoALIGN-2. "Variante de polinucleotídeo de TAT" ou "variante de seqüência deácido nucléico de TAT" significam uma molécula de ácido nucléico quecodifica um polipeptídeo de TAT, preferivelmente um polipeptídeo de TATativo, como definido aqui e que tem pelo menos cerca de 80% de identidadede seqüência de ácido nucléico com uma seqüência de ácido nucleotídeoque codifica uma seqüência de polipeptídeo de TAT de seqüência nativa decomprimento total como descrita aqui, uma seqüência de polipeptídeo deTAT de seqüência nativa de comprimento total carecendo do peptídeo sinalcomo descrita aqui, um domínio extracelular de um polipeptídeo de TAT,com ou sem o peptídeo sinal, como descrito aqui ou qualquer outrofragmento de uma seqüência de polipeptídeo de TAT de comprimento totalcomo descrita aqui (como aquelas codificadas por um ácido nucléico querepresenta apenas uma porção da seqüência de codificação completa paraum polipeptídeo de TAT de comprimento total). Usualmente, um variante depolinucleotídeo de TAT terá pelo menos cerca de 80% de identidade deseqüência de ácido nucléico, alternativamente pelo menos cerca de 81%,82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 8.7%, 88%, 89%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de seqüência de ácido nucléicocom uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma seqüência depolipeptídeo de TAT de seqüência nativa de comprimento total comodescrita aqui, uma seqüência de polipeptídeo de TAT de seqüência nativa decomprimento total carecendo do peptídeo sinal como descrita aqui, umdomínio extracelular de um polipeptídeo de TAT, com ou sem a seqüênciasinal, como descrito aqui ou qualquer outro fragmento de uma seqüência depolipeptídeo de TAT de comprimento total como descrita aqui. Variantes nãoabrangem a seqüência de nucleotídeo nativa.

Usualmente, variantes de polinucleotídeos de TAT são pelomenos cerca de 5 nucleotídeos em comprimento, alternativamente pelomenos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170,175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290,300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400,410, 420, 430, 440,450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590,600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740,750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890,900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, ou 1000 nucleotídeos emcomprimento, em que neste contexto o termo "cerca de" significa ocomprimento de seqüência de nucleotídeo referido mais ou menos 10%daquele comprimento referido.

"Por cento (%) de identidade de seqüência de ácido nucléico"com respeito às seqüências de ácido nucléico de codificação de TATidentificadas aqui é definido como a porcentagem de nucleotídeos em umaseqüência candidata que é idêntica com os nucleotídeos na seqüência deácido nucleico de TAT de interesse, após alinhar as seqüências e introduzirintervalos, se necessário, para alcançar o por cento de identidade deseqüência máximo. Alinhamento para propósitos de determinar o por centode identidade de seqüência de ácido nucleico pode ser alcançado de váriosmodos que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usandosoftware de computador publicamente disponível como software BLAST,BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR).

Para propósitos aqui, porém, % de valores de identidade deseqüência de ácido nucleico é gerado usando o programa de computação decomparação de seqüência ALIGN-2, em que o código fonte completo para oprograma ALIGN-2 é fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa decomputação de comparação de seqüência ALIGN-2 foi criado por Genentech,Inc. e o código fonte mostrado na Tabela 1 abaixo foi arquivado comdocumentação de usuário no Escritório de Direitos Autorais dos EUA,Washington D.C., 20559, onde é registrado sob o Registro de DireitosAutorais dos EUA NQ TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamentedisponível por Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode sercompilado do código fonte fornecido na Tabela 1 abaixo. O programaALIGN-2 deveria ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX,preferivelmentè UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação deseqüência são fixados pelo programa ALIGN-2 e não variam.

Em situações onde ALIGN-2 é empregado para comparações deseqüência de ácido nucleico, o % de identidade de seqüência de ácidonucleico de uma seqüência de ácido nucleico dada C para, com, ou contrauma seqüência de ácido nucleico dada D (que pode ser alternativamentefraseada como uma seqüência de ácido nucleico dada C que tem oucompreende uma certa % de identidade de seqüência de ácido nucleico para,com, ou contra uma seqüência de ácido nucleico dada D) é calculado comosegue:

100 vezes a fração W/Z

onde W é o número de nucleotídeos registrados como paridadesidênticas pelo programa de alinhamento de seqüência ALIGN-2 naquelealinhamento de programa de C e D, e onde Z é o número total denucleotídeos em D. Será apreciado que onde o comprimento de seqüênciade ácido nucleico C não for igual ao comprimento de seqüência de ácidonucleico D, a % de identidade de seqüência de ácido nucleico de C para Dnão igualará à % de identidade de seqüência de ácido nucleico de D para C.Como exemplos de % de cálculos de identidade de seqüência de ácidonucleico, Tabelas 4 e 5 demonstram como calcular a % de identidade deseqüência de ácido nucleico da seqüência de ácido nucleico designada"DNA de comparação" para a seqüência de ácido nucleico designada "TAT-DNA", em que "TAT-DNA" representa uma seqüência de ácido nucleico decodificação de TAT hipotética de interesse, "DNA de comparação"representa a seqüência de nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleicocontra a qual a molécula de ácido nucleico de "TAT-DNA" de interesse estásendo comparada, e "N", "L" e "V", cada um, representam nucleotídeoshipotéticos diferentes. A menos que do contrário especificamente declarado,todos os valores de % de identidade de seqüência de ácido nucleico aquiusados são obtidos como descritos no parágrafo imediatamente precedenteusando o programa de computação ALIGN-2.

Em outras modalidades, variantes de polinucleotídeos de TATsão moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo de TAT eque são capazes de hibridar, preferivelmente sob hibridização rigorosa econdições de lavagem, com as seqüências de nucleotídeo que codificam umpolipeptídeo de TAT de comprimento total como descritas aqui. Variantes depolipeptídeos de TAT podem ser aquelas que são codificadas por umavariante de polinucleotídeo de TAT.

O termo "região de codificação de comprimento total" quandousado em referência a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo deTAT refere-se à seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo deTAT de comprimento total da invenção (que é freqüentemente mostradaentre os códons de começo e de parada, inclusivos destes, nas figuras emanexo). O termo "região de codificação de comprimento total" quando usadoem referência a um ácido nucleico depositado em ATCC refere-se à porçãode codificação de polipeptídeo de TAT do cDNA que é inserido no vetordepositado com o ATCC (que é freqüentemente mostrado entre os códonsde começo e de parada, inclusivos destes, nas figuras em anexo).

"Isolado", quando usado para descrever os vários polipeptídeosde TAT descritos aqui, significa polipeptídeo que foi identificado e separadoe/ou restabelecido de um componente de seu ambiente natural.Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais quetipicamente interferirão com usos diagnósticos ou terapêuticos para opolipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutosproteináceos ou não-proteináceos. Em modalidades preferidas, opolipeptídeo será purificado (1) para um grau suficiente para obter pelomenos 15 resíduos de seqüência de aminoácido N-terminal ou interna pelouso de um seqüenciador de copo giratório, ou (2) para homogeneidade porSDS-PAGE sob condições não-redutoras ou redutoras usando Coomassieblue ou, preferivelmente, coloração de prata. Polipeptídeo isolado incluipolipeptídeo in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelomenos um componente do ambiente natural do polipeptídeo de TAT nãoestará presente. Porém, polipeptídeo normalmente isolado será preparadopor pelo menos uma etapa de purificação.

Urri ácido nucléico de codificação de polipeptídeo de TAT"isolado" ou outro ácido nucléico de codificação de polipeptídeo é umamolécula de ácido nucléico que é identificada e separada de pelo menosuma molécula de ácido nucléico contaminante à qual usualmente estáassociado na fonte natural do ácido nucléico de codificação de polipeptídeo.

Uma molécula de ácido nucléico de codificação de polipeptídeo isolada édiferente na forma ou cenário em que é encontrada na natureza. Moléculasde ácido nucléico de codificação de polipeptídeo isoladas são portantodistinguidas da molécula de ácido nucléico de codificação de polipeptídeoespecíficas como existe em células naturais. Porém, uma molécula de ácidonucléico de codificação de polipeptídeo isolada inclui moléculas de ácidonucléico de codificação de polipeptídeo contidas em células quenormalmente expressam o polipeptídeo onde, por exemplo, a molécula deácido nucléico está em uma localização cromossômica diferente daquelaque as células naturais.

O termo "seqüências de controle" refere-se às seqüências deDNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificaçãooperavelmente ligada em um organismo hospedeiro particular. Asseqüências de controle que são adequadas para procariotos, por exemplo,incluem um promotor, opcionalmente uma seqüência de operador, e um sítiode ligação de ribossoma. As células eucarióticas são conhecidas utilizar ospromotores, sinais de poliadenilação, e intensificadores.

Ácido nucléico está "operavelmente ligado" quando é colocadoem uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. Porexemplo, DNA para uma pré-seqüência ou líder secretório estáoperavelmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se for expresso comouma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ouintensificador está operavelmente ligado a uma seqüência de codificação seafetar a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossoma estáoperavelmente ligado a uma seqüência de codificação se for posicionadopara facilitar a translação. Em geral, "operavelmente ligado" significa que asseqüências de DNA que são ligadas são contíguas, e, no caso de um lídersecretório, contíguas e em fase de leitura. Porém, intensificadores não têmque ser contíguos. Ligação é realizada através de ligação em sítios derestrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os adaptadores ouligantes de oligonucleotídeo sintéticos são usados de acordo com práticaconvencional.

"Severidade" de reações de hibridização é facilmentedeterminável por alguém versado na técnica, e em geral é um cálculoempírico dependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem econcentração de sal. Em geral, sondas mais longas requerem temperaturasmais altas para anelamento apropriado, enquanto sondas mais curtasprecisam de temperaturas inferiores. Hibridização em geral depende dahabilidade do DNA desnaturado para reanelar quando os filamentoscomplementares estiverem presentes em um ambiente abaixo de suatemperatura de fundição. Quanto mais alto o grau de homologia desejadoentre a sonda e seqüência hidrolizável, mais alta a temperatura relativa quepode ser usada. Como resultado, segue que temperaturas relativas maisaltas tenderiam a tornar as condições de reação mais rigorosas, enquantotemperaturas mais baixas menos. Para detalhes adicionais e explanação deseveridade das reações de hibridização, vide Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condições rigorosas" ou "condições de severidade alta", comodefinidas aqui, podem ser identificadas por aqueles que: (1) empregamresistência iônica baixa e temperatura alta para lavagem, por exemplo 0,015M cloreto de sódio/0,0015 M citrato de sódio/0,1% dodecil sulfato de sódio a50°C; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, comoformamida, por exemplo, 50% (v/v) formamida com 0,1% de albumina desoro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/50 mM tampão de fosfatode sódio a pH 6,5 com 750 mM cloreto de sódio, 75 mM citrato de sódio a42°C; ou (3) durante a noite hibridização em uma solução empregando 50%formamida, 5 x SSC (0,75 M NaCI, 0,075 M citrato de sódio), 50 mM fosfatode sódio (pH 6,8), 0,1% pirofosfato de sódio, solução de 5 x Denhardt, DNAde esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), 0,1% SDS, e 10% sulfato dedextrana a 42*C, com uma lavagem de 10 minutos a 42°C em 0,2 x SSC(cloreto de sódio/citrato de sódio) seguido por uma lavagem de severidadealta de 10 minutos consistindo em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55°C.

"Condições moderadamente rigorosas" podem ser identificadascomo descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Nova Iorque, Cold Spring Harbor Press, 1989, e inclui o uso de solução delavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura, resistênciaiônica e % SDS) menos rigorosas que as descritas acima. Um exemplo decondições moderadamente rigorosas é incubação durante a noite a 37°C emuma solução compreendendo: 20% formamida, 5 x SSC (150 mM NaCI, 15mM citrato de trissódio), 50 mM fosfato de sódio (pH 7,6), solução de 5 xDenhardt, 10% sulfato de dextrana, e 20 mg/ml DNA de esperma de salmãocisalhado desnaturado, seguido lavando os filtros em 1 x SSC em cerca de37-50°C. O artesão versado reconhecerá como ajustar a temperatura,resistência iônica, etc. conforme necessário para acomodar os fatores comocomprimento de sonda e outros.

O termo "epítopo rotulado" quando aqui usado refere-se a umpolipeptídeo quimérico compreendendo um polipeptídeo de TAT ouanticorpo de anti-TAT fundido com um "polipeptídeo de rótulo". Opolipeptídeo de rótulo tem bastante resíduos para fornecer um epítopocontra o qual um anticorpo pode ser feito, ainda é curto o bastante de modoque ele não interfere com a atividade do polipeptídeo ao qual é fundido. Opolipeptídeo de rótulo preferivelmente também é bem único de forma que oanticorpo substancialmente não reage cruzado com outros epítopos.Polipeptídeos de rótulo adequados em geral têm pelo menos seis resíduosde aminoácido e usualmente entre cerca de 8 e 50 resíduos de aminoácido(preferivelmente, entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácido).

"Ativo" ou "atividade" para os propósitos aqui se refere à(s)forma(s) de um polipeptídeo de TAT que retém uma atividade biológica e/ouuma imunológica de TAT nativo ou de ocorrência natural, em que atividade"biológica" refere-se a uma função biológica (ou inibidora ou estimulante)causada através de um TAT nativo ou de ocorrência natural diferente de ahabilidade para induzir a produção de um anticorpo contra um epítopoantigênico possuído por um TAT nativo ou de ocorrência natural e umaatividade "imunológica" refere-se à habilidade para induzir a produção de umanticorpo contra um epítopo antigênico possuído por um TAT nativo ou deocorrência natural.

O termo "antagonista" é usado no sentido mais vasto, e incluiqualquer molécula que parcial ou completamente bloqueia, inibe ouneutraliza uma atividade biológica de um polipeptídeo de TAT nativo descritoaqui. De uma maneira similar, o termo "agonista" é usado no sentido maisvasto e inclui qualquer molécula que imita uma atividade biológica de umpolipeptídeo de TAT nativo descrito aqui. Moléculas de agonista ouantagonista adequadas especificamente incluem anticorpos de agonista ouantagonista ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou variantes deseqüência de aminoácido de polipeptídeos de TAT nativos, peptídeos,oligonucleotídeos anti-sentidos, moléculas orgânicas pequenas, etc.Métodos para identificar agonistas ou antagonistas de um polipeptídeo deTAT podem compreender contatar um polipeptídeo de TAT com umamolécula de agonista ou antagonista candidata e medir uma alteraçãodetectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadasao polipeptídeo de TAT.

"Tratando" ou "tratamento" ou "alívio" refere-se ao tratamentoterapêutico e medidas profilácticas ou preventivas, em que o objetivo éimpedir ou reduzir a velocidade (diminuir) a condição ou distúrbio patológicoalvejado. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com odistúrbio como também aqueles propensos a ter o distúrbio ou aqueles emquem será impedido o distúrbio. Um indivíduo ou mamífero é de forma bemsucedida "tratado" para um câncer de expressão de polipeptídeo de TAT se,após receber uma quantidade terapêutica de um anticorpo de anti-TAT,oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânica de ligação de TAT deacordo com os métodos da presente invenção, o paciente mostrar reduçãoobservável e/ou mensurável ou ausência de um ou mais dos seguintes:redução no número de células de câncer ou ausência das células de câncer;redução no tamanho de tumor; inibição (isto é, reduzir até certo ponto epreferivelmente parar) da infiltração de célula de câncer em órgãosperiféricos incluindo a expansão de câncer para tecido macio e osso;inibição (isto é, reduzir até certo ponto e preferivelmente parar) da metástasede tumor; inibição, até certo ponto, de crescimento de tumor; e/ou alívio atécerto ponto, de um ou mais dos sintomas associados ao câncer específico;morbidez e mortalidade reduzidas, e melhoria em questões de qualidade devida. À medida que o anticorpo de anti-TAT ou oligopeptídeo de ligação deTAT pode impedir crescimento e/ou matar células de câncer existentes, elepode ser citoestático e/ou citotóxico. Redução destes sinais ou sintomaspode também ser sentida pelo paciente.

Os parâmetros acima para avaliar o tratamento com sucesso emelhoria na doença são facilmente mensuráveis através de procedimentosrotineiros familiares a um médico. Para terapia de câncer, medida eficáciapode ser, por exemplo, avaliando a progressão de tempo para doença (TTP)e/ou determinando a taxa de resposta (RR). Metástase pode serdeterminada através de testes de escalonamento e por varredura de osso etestes para nível de cálcio e outras enzimas para determinar a expansãopara o osso. Varreduras de CT podem também ser feitas para procurarexpansão para a pélvis e linfonodos na área. Raios X de tórax e mediçãodos níveis de enzima do fígado através de métodos conhecidos são usadospara procurar metástase nos pulmões e fígado, respectivamente. Outrosmétodos rotineiros para monitorar a doença incluem ultra-sonografiatransretal (TRUS) e biópsia de agulha transretal (TRNB).

Para câncer de bexiga, que é um câncer mais localizado,métodos para determinar o progresso da doença incluem avaliaçãocitológica urinaria através de cistoscopia, monitoramento da presença desangue na urina, visualização do trato urotelial por sonografia ou umpielograma intravenoso, tomografia computadorizada (CT) e imageamentode ressonância magnética (MRI). A presença de metástases distantes podeser avaliada por CT do abdômen, raios X do tórax, ou imageamento deradionuclídeo do esqueleto.

Administração "crônica" refere-se à administração do(s) agente(s)em um modo contínuo ao invés de um modo agudo, para manter o efeitoterapêutico inicial (atividade) durante um período estendido de tempo.Administração "intermitente" é tratamento que não é feito consecutivamentesem interrupção, mas do contrário é cíclico em natureza.

"Mamífero" para propósitos do tratamento, alívio dos sintomas oudiagnose de um câncer refere-se a qualquer animal classificado como ummamífero, incluindo os humanos, animais domésticos e de fazenda, e dejardim zoológico, jogos esportivos, ou animais de estimação, como cães,gatos, gado, cavalos, ovelha, porcos, cabras, coelhos, etc. Preferivelmente,o mamífero é humano.

Administração "em combinação com" um ou mais agentesterapêuticos também inclui administração simultânea (simultânea) esucessiva em qualquer ordem.

"Veículos" como aqui usado incluem veículos, excipientes ouestabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que são não-tóxicos à célula oumamífero sendo exposto às dosagens e concentrações empregadas.Freqüentemente o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução aquosatamponada de pH. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluemtampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantesincluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de peso molecular baixo (menos quecerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina de soro, gelatina, ouimunoglobulinas; polímeros hidrófilos como polivinilpirrolidona; aminoácidoscomo glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos,dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas;agentes quelantes como EDTA; alcoóis do açúcar como manitol ou sorbitol;contraíons formadores de sal como sódio; e/ou tensoativos não-iônicoscomo TWEEN®, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS®.

Por "fase sólida" ou "suporte sólido" é significado uma matriznão-aquosa à qual um anticorpo, oligopeptídeo de ligação de TAT oumolécula orgânica de ligação de TAT da presente invenção pode aderir-seou ligar-se. Exemplos de fases sólidas abrangidas aqui incluem aquelasformadas parcial ou completamente de vidro (por exemplo, vidro de porocontrolado), polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas,poliestireno, álcool polivinílico e silicones. Em certas modalidades,dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o poço de umaplaca de ensaio; em outras é uma coluna de purificação (por exemplo, umacoluna de cromatografia de afinidade). Este termo também inclui uma fasesólida descontínua de partículas distintas, como aquelas descritas napatente U. S. N9 4.275.149.

Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta de váriostipos de lipídios, fosfolipídeos e/ou tensoativo que é útil para liberação de umfármaco (como um polipeptídeo de TAT, um anticorpo para este ou umoligopeptídeo de ligação de TAT) para um mamífero. Os componentes dolipossoma são comumente dispostos em uma formação de bicamada, similarao arranjo de lipídio das membranas biológicas.

Uma molécula "pequena" ou molécula orgânica "pequena" édefinida aqui ter um peso molecular abaixo de cerca de 500 Dáltons.

Uma "quantidade eficaz" de um polipeptídeo, anticorpo,oligopeptídeo de ligação de TAT, molécula orgânica de ligação de TAT ouum agonista ou antagonista destes como descritos aqui é uma quantidadesuficiente para realizar um propósito especificamente declarado. Uma"quantidade eficaz" pode ser determinada empiricamente e de uma maneirarotineira, em relação ao propósito declarado.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a umaquantidade de um anticorpo, polipeptídeo, oligopeptídeo de ligação de TAT,molécula orgânica de ligação de TAT ou outro fármaco eficaz para "tratar"uma doença ou distúrbio em um indivíduo ou mamífero. No caso de câncer,a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número decélulas de câncer; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, reduzir até certoponto e preferivelmente parar) infiltração de célula de câncer em órgãosperiféricos; inibir (isto é, reduzir até certo ponto e preferivelmente parar)metástase de tumor; inibir, até certo ponto, crescimento de tumor; e/oualiviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados ao câncer. Videa definição aqui de "tratar". À proporção que o fármaco pode impedircrescimento e/ou matar células de câncer existentes, ele pode sercitoestático e/ou citotóxico.

Uma "quantidade inibidora de crescimento" de um anticorpo deanti-TAT, polipeptídeo de TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT ou moléculaorgânica de ligação de TAT é uma quantidade capaz de inibir o crescimentode uma célula, especialmente tumor, por exemplo, célula de câncer, ou invitro ou in vivo. Uma "quantidade inibidora de crescimento" de um anticorpode anti-TAT, polipeptídeo de TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT oumolécula orgânica de ligação de TAT para propósitos de inibir crescimentode célula neoplástica pode ser determinada empiricamente e de umamaneira rotineira.

Uma "quantidade citotóxica" de um. anticorpo de anti-TAT,polipeptídeo de TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânicade ligação de TAT é uma quantidade capaz de causar a destruição de umacélula, especialmente tumor, por exemplo, célula de câncer, ou in vitro ou invivo. Uma "quantidade citotóxica" de um anticorpo de anti-TAT, polipeptídeode TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânica de ligação deTAT para propósitos de inibir crescimento de célula neoplástica pode serdeterminada empiricamente e de uma maneira rotineira.

O termo "anticorpo" é usado no sentido mais vasto eespecificamente abrange, por exemplo, anticorpos monoclonais de anti-TATsimples (incluindo agonista, antagonista, e anticorpos neutralizantes),composições de anticorpo de anti-TAT com especificidade poliepitópica,anticorpos policlonais, anticorpos de anti-TAT de cadeia simples, efragmentos de anticorpos de anti-TAT (vide abaixo) contanto que elesexibam a atividade biológica ou imunológica desejada. O termo"imunoglobulina" (Ig) é usado de forma intercalada com o anticorpo aqui.

Um "anticorpo isolado" é um que foi identificado e separado e/ourestabelecido de um componente de seu ambiente natural. Componentescontaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam comos usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluirenzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Emmodalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais de 95% empeso de anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e o maispreferivelmente mais de 99% em peso, (2) a um grau suficiente para obterpelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácido N-terminal ou internapara uso de um seqüenciador de copo giratório, ou (3) para homogeneidadepor SDS-PAGE sob condições redutoras ou não-redutoras usandoCoomassie blue ou, preferivelmente, coloração prateada. Anticorpo isoladoinclui o anticorpo in situ dentro das células recombinantes uma vez que pelomenos um componente do ambiente natural do anticorpo não estarápresente. Porém, anticorpo normalmente isolado será preparado por pelomenos uma etapa de purificação.

A unidade de anticorpo de 4 cadeias básicas é uma glicoproteínaheterotetramérica composta de duas cadeias leves idênticas (L) e duascadeias pesadas idênticas (H) (um anticorpo de IgM consiste em 5 daunidade de héterotetrâmero básica junto com um polipeptídeo adicionalchamado cadeia J, e portanto contém 10 sítios de ligação de antígeno,enquanto os anticorpos de IgA segregados podem polimerizar-se paraformar montagens polivalentes compreendendo 2-5 das unidades de 4cadeias básicas juntas com cadeia J). No caso das IgGs, a unidade de 4cadeias é em geral cerca de 150.000 dáltons. Cada cadeia L é ligada a umacadeia H através de uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as duascadeias H são ligadas entre si por uma ou mais ligações de dissulfetodependendo do isótipo de cadeia H. Cada cadeia H e L também temligações em ponte de intercadeia espaçadas regularmente. Cada cadeia Htem no término N, um domínio variável (VH) seguido por três domíniosconstantes (CH) para cada uma das cadeias aeye quatro domínios de CHpara isótipos u e e. Cada cadeia L tem no término N, um domínio variável (Vl)seguido por um domínio constante (CL) em sua outra extremidade. O VL estáalinhado com a VH e o Cl está alinhado com o primeiro domínio constante dacadeia pesada (CH1). Os resíduos de aminoácido particulares sãoacreditados formar uma interface entre os domínios variáveis de cadeia levee cadeia pesada. A paridade de um VH e VL juntos forma um sítio de ligaçãode antígeno simples. Para a estrutura e propriedades das classes diferentesde anticorpos, vide, por exemplo, Basic and Clinicai Immunology. 8ã edição,Daniel P. Stites, Abba I. Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange,Norwalk, CT, 1994, página 71 e Capítulo 6.

A cadeia L de qualquer espécie vertebrada pode ser atribuída aum de dois tipos claramente distintos, chamados capa e lambda, com basenas seqüências de aminoácido seus domínios constantes. Dependendo daseqüência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas(CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a classes ou isótiposdiferentes. Há cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM,tendo cadeias pesadas designadas a, 5, £, v e |i, respectivamente. Asclasses yea são também divididas em subclasses em base das diferençasrelativamente secundárias na seqüência de Ch e função, por exemplo,humanos expressam as subclasses a seguir: IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI, elgA2.

O termo "variável" refere-se ao fato que certos segmentos dosdomínios variáveis diferem extensivamente em seqüência entre osanticorpos. O domínio V medeia ligação de antígeno e define aespecificidade de um anticorpo particular para seu antígeno particular.Porém, a variabilidade não é distribuída uniformemente ao longo daextensão de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Do contrário, asregiões V consistem em extensões relativamente invariantes chamadasregiões de estrutura (FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiõesmais curtas de variabilidade extremas chamadas "regiões hipervariáveis"que são cada uma de 9-12 aminoácidos de comprimento. Os domíniosvariáveis das cadeias nativas pesadas e leves cada um compreende quatroFRs, grande parte adotando uma configuração de folha 0, conectado portrês regiões hipervariáveis que formam alças de conexão e em alguns casosformando parte da estrutura de folha p. As regiões hipervariáveis são unidasem cada cadeia em proximidade íntima pelas FRs e, com as regiõeshipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio deligação de antígeno de anticorpos (vide Kabat et al., Sequences of Proteinsof Immunological Interest. 5ê Ed. Ed. Public Health Service, National Instituteof Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estãodiretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, masexibem várias funções efetoras, como participação do anticorpo emcitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

O termo "região hipervariável" quando aqui usado refere-se aosresíduos de aminoácido um anticorpo que são responsáveis pela ligação deantígeno. A região hipervariável em geral compreende resíduos deaminoácido uma "região de determinação de complementaridade" ou "CDR"(por exemplo por volta de cerca de resíduos 24-34 (L1), 50-56 (l_2) e 89-97(L3) no VL, e por volta de cerca de 1-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) noVH; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5â Ed. Ed.Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (por exemplo resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no VL, e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101(H3) no VH; Chotia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

O termo "anticorpo monoclonal" como aqui usado refere-se a umanticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmentehomogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a populaçãosão idênticos com exceção de possíveis mutações de ocorrência natural quepodem estar presentes em quantidades secundárias. Anticorposmonoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um sítioantigênico simples. Além disso, em contraste com as preparações deanticorpos policlonais que incluem anticorpos diferentes direcionadas contradeterminantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal édirecionado contra um determinante simples no antígeno. Além de suaespecificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos em que elespodem ser sintetizados incontaminados através de outros anticorpos. Omodificador "monoclonal" não será interpretado como requerendo produçãodo anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorposmonoclonais úteis na presente invenção podem ser preparados primeiro pelametodologia de hibridoma descrita por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975),ou podem ser feitos usando métodos de DNA recombinante em célulasanimais, bacterianas, eucarióticas ou de planta (vide, por exemplo, PatenteU. S. No.4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também serisolados de bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas emClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol.,222:581-597 (1991), por exemplo.

Os anticorpos monoclonais aqui incluem anticorpos "quiméricos"em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga àsseqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécieparticular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular,enquanto o restante da(s) cadeia(s) é/são idêntica(s) ou homóloga(s) àsseqüências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies oupertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, como tambémfragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológicadesejada (vide Patente U. S. N9 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl.Acad. Sei, USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos de interesseaqui incluem anticorpos "primatizados" compreendendo seqüências deligação de antígeno de domínio variável derivadas de um primata não-humano (por exemplo, Macaco Old World, Macaco etc), e seqüências deregião constante humanas.

Um anticorpo "intacto" é um compreendendo um sítio de ligaçãode antígeno como também um Cl e pelo menos domínios constantes decadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem serdomínios constantes de seqüência nativa (por exemplo domínios constantesde seqüência nativa humana) ou variante de seqüência de aminoácidodestas. Preferivelmente, o anticorpo intacto tem uma ou mais funçõesefetoras.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de umanticorpo intacto, preferivelmente a ligação de antígeno ou região variável doanticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentosde Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (vide patente U. S.N9 5.641.870, exemplo 2; Zapata et al., Proteína Eng. 8(10): 1057-1062[1995]); moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorposmultiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.

Digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos deligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos de "Fab", e umfragmento de resíduo de "Fc", uma designação que reflete a habilidade paracristalizar-se facilmente. O fragmento de Fab consiste em uma cadeia Linteira junto com o domínio de região variável da cadeia H (VH), e o primeirodomínio constante de uma cadeia pesada (CH1). Cada fragmento de Fab émonovalente com respeito à ligação de antígeno, isto é, tem um sítio deligação de antígeno simples. Tratamento de pepsina de um anticorpo rendeo fragmento de F(ab')2 grande simples que rudemente corresponde a doisfragmentos de Fab de dissulfeto ligados tendo atividade de ligação deantígeno divalente e ainda é capaz de reticular o antígeno. Os fragmentos deFab diferem dos fragmentos de Fab tendo poucos resíduos adicionais notérmino de carbóxi do domínio de CH1 incluindo uma ou mais cisteínas daregião de dobradiça de anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab emque o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupotiol livre. Os fragmentos de F(ab')2 de anticorpo foram produzidosoriginalmente como pares dos fragmentos de Fab tendo as cisteínas dedobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos deanticorpo são também conhecidos.

O fragmento de Fc compreende as porções carbóxi-terminais deambas cadeias H se mantidas unidas por dissulfetos. As funções efetoras deanticorpos são determinadas através das seqüências na região de Fc cujaregião é também a parte reconhecida pelos receptores de Fc (FcR)encontrados em certos tipos de células.

"Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo contendo um sítio dereconhecimento e de ligação de antígeno completo. Este fragmento consisteem um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e umaleve em associação apertada, não-covalente. Do dobramento destes doisdomínios emanam seis alças hipervariáveis (3 alças cada uma da cadeia H eL) que contribuem com os resíduos de aminoácido para ligação de antígenoe conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Porém, atémesmo um domínio variável simples (ou porção de um Fv compreendendoapenas três CDRs específicas para um antígeno) tem a habilidade parareconhecer e ligar antígeno, embora a uma afinidade inferior que o sítio deligação inteiro.

"Cadeia Fv simples" também abreviada como "sFv" ou "scFv"são fragmentos de anticorpo compreendendo os domínios de anticorpo deVh e VL conectados em uma cadeia de polipeptídeo simples. Preferivelmente,o polipeptídeo de sFv também compreende um ligante de polipeptídeo entreos domínios de VH e VL que permitem sFv formar a estrutura desejada paraligação antígeno. Para uma revisão de sFv, vide Pluckthun em ThePharmacology of Monoclonal Anticorpos, vol. 113, Rosenburg e Moore eds.,Springer - Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995,infra.

O termo "diacorpos" refere-se aos fragmentos de anticorpospequenos preparados construindo fragmentos de sFv (vide parágrafoprecedente) com ligantes curtos (cerca de 5 -10 resíduos) entre os domíniosde VH e de VL de modo que a paridade de intercadeia mas não intracadeiados domínios de V é alcançado, resultando em um fragmento bivalente, istoé, fragmento tendo dois sítios de ligação de antígeno. Diacorposbiespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos de sFv "crossover" emque os domínios de VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em cadeiasde polipeptídeo diferentes. Diacorpos são descritos mais completamente, porexemplo, na EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 90:6444-6448 (1993).

Anticorpos de formas "humanizadas" não-humanos (por exemplo,roedor) são anticorpos quiméricos contendo seqüência mínima derivados doanticorpo não-humano. Para a maior parte, os anticorpos humanizados sãoimunoglobulinas humanas (anticorpo de recipiente) em que os resíduos deuma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de umaregião hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo de doador)como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano tendo aespecificidade de anticorpo, afinidade e capacidade desejadas. Em algumascircunstâncias, os resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulinahumana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Alémdisso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não sãoencontrados no anticorpo de recipiente ou no anticorpo de doador. Estasmodificações são feitas para também refinar o desempenho de anticorpo.Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos depelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis em que todas ousubstancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas deuma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas dasFRs são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpohumanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porçãode uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de umaimunoglobulina humana. Para mais detalhes, vide Jones et al., Nature321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Um "anticorpo dependente de espécie", por exemplo, umanticorpo de IgE anti-humana mamífera, é um anticorpo que tem umaafinidade de ligação mais forte por um antígeno de uma primeira espéciemamífera que para um homólogo daquele antígeno de uma segunda espéciemamífera. Normalmente, o anticorpo dependente de espécie"especificamente liga" a um antígeno humano (isto é, tem um valor deafinidade de ligação (Kd) de não mais que cerca de 1 x 10"7 M,preferivelmente não mais que cerca de 1 x 10"8 e o mais preferivelmente nãomais que cerca de 1 x 10"9 M) mas tem uma afinidade de ligação por umhomólogo do antígeno de uma segunda espécie mamífera não-humana queé pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 500 vezes, oupelo menos cerca de 1000 vezes, mais fraco que sua afinidade de ligaçãopelo antígeno humano. O anticorpo dependente de espécie pode ser dequaisquer dos vários tipos de anticorpos como definidos acima, maspreferivelmente é um anticorpo humanizado ou humano.

Um "oligopeptídeo de ligação de TAT" é um oligopeptídeo queliga, de preferência especificamente, a um polipeptídeo de TAT comodescrito aqui. Oligopeptídeos de ligação de TAT podem ser sintetizadosquimicamente usando metodologia de síntese de oligopeptídeo conhecidaou podem ser preparados e purificados usando tecnologia recombinante.Oligopeptídeos de ligação de TAT são usualmente pelo menos cerca de 5aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos cerca de 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 aminoácidos em comprimentoou mais, em que tais oligopeptídeos são capazes de ligar, de preferênciaespecificamente, a um polipeptídeo de TAT como descrito aqui.Oligopeptídeos de ligação de TAT pode ser identificados semexperimentação imprópria usando técnicas bem conhecidas. Nestaconsideração, é observado que técnicas para triar bibliotecas deoligopeptídeo por oligopeptídeos que são capazes de especificamente ligar aum alvo de polipeptídeo são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo,Patente U. S. NeS 5.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409,5.403.484, 5.571.689, 5.663.143; Publicação do PCT N93 WO 84/03506 eWO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81:3998-4002(1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82:178-182 (1985);Geysen et al., em Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysenet al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. ImmunoL,140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sd. USA,87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. etal. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581;Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:8363, e Smith, G. P.(1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).

Uma "molécula orgânica de ligação de TAT" é uma moléculaorgânica diferente de um oligopeptídeo ou anticorpo como definidos aqui queliga, de preferência especificamente, a um polipeptídeo de TAT comodescrito aqui. Moléculas orgânicas de ligação de TAT podem seridentificadas e quimicamente sintetizadas usando metodologia conhecida(vide, por exemplo, Publicação do PCT NeS WO00/00823 e WO00/39585).Moléculas orgânicas de ligação de TAT usualmente são menos que cerca de2000 dáltons em tamanho, alternativamente menos que cerca de 1500, 750,500, 250 ou 200 dáltons em tamanho, em que tais moléculas orgânicas sãocapazes de ligar, de preferência especificamente, a um polipeptídeo de TATcomo descrito aqui e pode ser identificada sem experimentação imprópriausando técnicas bem conhecidas. Nesta consideração, é observado quetécnicas para triar bibliotecas de moléculas orgânicas por moléculas que sãocapazes de ligar a um alvo de polipeptídeo são bem conhecidas na técnica(vide, por exemplo, Publicação do PCT NeS WO00/00823 e WO00/39585).Um anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica "queliga" um antígeno de interesse, por exemplo um alvo de antígeno depolipeptídeo associado ao tumor, é um que liga o antígeno com afinidadesuficiente de modo que o anticorpo, oligopeptídeo ou outra moléculaorgânica são úteis como um agente diagnóstico e/ou terapêutico noalvejamento de uma célula ou tecido que expressa o antígeno, e não reagecruzado de modo significativo com outras proteínas. Em tais modalidades, aextensão de ligação do anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânicapara uma proteína "não-alvo" será menos que cerca de 10% da ligação doanticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica para sua proteína alvoparticular como determinado por análise de classificação de célula ativadapor fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). Com respeito àligação de um anticorpo, o oligopeptídeo ou outra molécula orgânica a umamolécula alvo, o termo "ligação específica" ou "especificamente liga" ou é"específico para" um polipeptídeo particular ou um epítopo em umpolipeptídeo alvo significa ligação particular que é mensurável diferente deuma interação não-específica. Ligação específica pode ser medida, porexemplo, determinando a ligação de uma molécula comparada à ligação deuma molécula de controle que em geral é uma molécula de estrutura similarque não tem atividade de ligação. Por exemplo, ligação específica pode serdeterminada através de competição com uma molécula de controle que ésimilar ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não-rotulado. Neste caso,ligação específica é indicada se a ligação do alvo rotulado para uma sondafor competitivamente inibida por excesso alvo não-rotulado. O termo "ligaçãoespecífica" ou "especificamente liga" ou é "específico para" um polipeptídeoparticular ou um epítopo em um alvo de polipeptídeo particular como aquiusado pode ser apresentado, por exemplo, por uma molécula que tem umKd para o alvo de pelo menos cerca de 10"4 M, alternativamente pelo menoscerca de 10"5 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"6 M,alternativamente pelo menos cerca de 10"7 M, alternativamente pelo menoscerca de 10"8 M, alternativamente pelo menos cerca de 10"9 M,alternativamente pelo menos cerca de 10"10 M, alternativamente pelo menoscerca de 10"11, alternativamente pelo menos cerca de 10"12 M, ou maior. Emuma modalidade, o termo "ligação específica" refere-se à ligação onde umamolécula liga a um polipeptídeo ou epítopo particular em um polipeptídeoparticular sem substancialmente ligar a qualquer outro polipeptídeo ouepítopo de polipeptídeo.

Um anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica que"inibe o crescimento de células tumorais que expressam um polipeptídeo deTAT" ou um anticorpo "inibidor de crescimento", oligopeptídeo ou outramolécula orgânica é um que resulta em inibição de crescimento mensurávelde células de câncer expressando ou sobreexpressando o polipeptídeo deTAT apropriado. O polipeptídeo de TAT pode ser um polipeptídeo detransmembrana expresso na superfície de uma célula de câncer ou pode serum polipeptídeo que é produzido e segregado por uma célula de câncer.Anticorpos, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas de anti-TAT de inibidoresde crescimento preferidos inibem crescimento de células tumorais deexpressão de TAT em mais que 20%, preferivelmente de cerca de 20% acerca de 50%, e até mesmo mais preferivelmente, em mais que 50% (porexemplo, de cerca de 50% a cerca de 100%) quando comparados aocontrole apropriado, o controle tipicamente sendo células tumorais nãotratadas com o anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica sendotestadas. Em uma modalidade, inibição de crescimento pode ser medida emuma concentração de anticorpo de cerca de 0,1 a 30 ug/ml ou cerca de 0,5nM a 200 nM em cultura de célula onde a inibição de crescimento édeterminada 1-10 dias após exposição das células tumorais ao anticorpo.Inibição de crescimento de células tumorais in vivo pode ser determinada devários modos como é descrita na seção de Exemplos Experimentais abaixo.O anticorpo é inibidor de crescimento in vivo se a administração do anticorpode anti-TAT a cerca de 1 ug/kg a cerca de 100 mg/kg do peso do corporesultar em redução no tamanho do tumor ou proliferação de célulastumorais dentro de cerca de 5 dias a 3 meses da primeira administração doanticorpo, preferivelmente dentro de cerca de 5 a 30 dias.

Um anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica que"induz apoptose" é um(a) que induz morte de célula programadadeterminada mediante ligação de anexina V, fragmentação de DNA,encolhimento de célula, dilatação do retículo endoplásmico, fragmentação decélula, e/ou formação de vesículas de membrana (chamadas corposapoptóticos). A célula usualmente é uma que sobreexpressa um polipeptídeode TAT. Preferivelmente a célula é uma célula tumoral, por exemplo, umacélula de próstata, mama, ovariana, estômago, endometrial, pulmão, rim,cólon, bexiga. Vários métodos estão disponíveis para avaliar os eventoscelulares associados à apoptose. Por exemplo, translocação de fosfatidilserina (PS) pode ser medida por ligação de anexina; fragmentação de DNApode ser avaliada através de encadeamento de DNA; e condensaçãonuclear/cromatina juntamente com fragmentação de DNA pode ser avaliadapor qualquer aumento em células hipodiploides. Preferivelmente, o anticorpo,oligopeptídeo ou outra molécula orgânica que induz apoptose é uma queresulta em cerca de 2 a 50 vezes, preferivelmente cerca de 5 a 50 vezes, e omais preferivelmente cerca de 10 a 50 vezes, indução de ligação de anexinacom relação à célula sem tratar em um ensaio de ligação de anexina.

"Funções efetoras" de anticorpo se referem àquelas atividadesbiológicas atribuíveis à região de Fc (uma região de Fc de seqüência nativaou região de Fc variante de seqüência de aminoácido) de um anticorpo, evariam com o isótipo de anticorpo. Exemplos de funções efetoras deanticorpo incluem: citotoxicidade dependente de ligação e complemento deC1q; ligação de receptor de Fc; citotoxicidade mediada por céluladependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; sub-regulação de receptoresde superfície das células (por exemplo, receptor de célula B); e ativação decélula B.

"Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou"ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade em que Ig segregada ligadaem receptores de Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (porexemplo, células Assassinas Naturais (NK), neutrófilos, e macrófagos)permite estas células efetoras citotóxicas especificamente ligar a uma célulaalvo carregando antígeno e subseqüentemente matar a célula alvo comcitotoxinas. Os anticorpos "fortalecem" as células citotóxicas e sãoabsolutamente requeridos para tal matança. As células primárias paramediar ADCC, células de NK, expressam FcyRIII apenas, enquantomonócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII- Expressão de FcR em célulashematopoéticas é resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC deuma molécula de interesse, um ensaio in vitro de ADCC, como aqueledescrito na patente US No.5.500.362 ou 5.821.337 pode ser executado.Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares desangue periférico (PBMC) e células Assassinas Naturais (NK). Comoalternativa, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula deinteresse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animalcomo aquele descrito em Clynes et al. (USA) 95:652-656 (1998).

"Receptor de Fc" ou "FcR" descreve um receptor que liga àregião de Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano deseqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que liga um anticorpode IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRIIe FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas alternativamente juntadasdestes receptores. Receptores de FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptorativador") e FcyRIIB (um "receptor inibidor"), que têm seqüências deaminoácido similares que diferem primariamente nos domínios citoplásmicosdestas. Receptor ativador FcyRIIA contém um motivo de ativação com baseem tirosina de imunorreceptor (ITAM) em seu domínio citoplásmico.Receptor inibidor FcyRIIB contém um motivo de inibição com base emtirosina de imunorreceptor (ITIM) em seu domínio citoplásmico, (vide revisãoM. em Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs sãorevisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991);Capei et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin.Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a ser identificadosno futuro, são abrangidos pelo termo "FcR" aqui. O termo também inclui oreceptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGsmaternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J.Immunol. 24:249 (1994)).

"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam umou mais FcRs e executam funções efetoras. Preferivelmente, as célulasexpressam pelo menos FcyRIII e executam função efetora de ADCC.Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem célulasmononucleares de sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais(NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células deNK sendo preferidos. As células efetoras podem ser isoladas de uma fontenativa, por exemplo, de sangue.

"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo na presença de complemento. Ativação da viade complemento clássica é iniciada pela ligação do primeiro componente dosistema de complemento (C1q) aos anticorpos (da subclasse apropriada)que está ligado a seu antígeno cognato. Para avaliar a ativação decomplemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser executado.

Os termos "câncer" e "canceroso" se referem ou descrevem acondição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada porcrescimento de célula desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas nãosão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia oumalignidades linfóides. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluemcâncer de célula escamosa (por exemplo, câncer de célula escamosaepitelial), câncer do pulmão incluindo câncer do pulmão de célula pequena,câncer do pulmão de célula não-pequena, adenocarcinoma do pulmão ecarcinoma escamosa do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular,câncer gástrico ou estomacal incluindo câncer gastrointestinal, câncerpancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado,câncer de bexiga, câncer do trato urinário, hepatoma, câncer de mama,câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma endometrial ouuterino, carcinoma de glândula salivai, câncer de rim ou renal, câncer depróstata, câncer vulvar, câncer da tiróide, carcinoma hepático, carcinomaanal, carcinoma peniano, melanoma, mieloma múltiplo e linfoma de célula B,cérebro, como também câncer de cabeça e de pescoço, e metástaseassociada.

Os termos "distúrbio proliferativo celular" e "distúrbioproliferativo" referem-se a distúrbios que estão associados a algum grau deproliferação de célula anormal. Em uma modalidade, o distúrbio proliferativocelular é câncer.

"Tumor", como aqui usado, refere-se a todo crescimento decélula neoplástica e de proliferação, quer malignas ou benignas, e todascélulas e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.

Um anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica que"induz morte celular" é um que leva uma célula viável ficar não-viável. Acélula é uma que expressa um polipeptídeo de TAT, preferivelmente umacélula que sobreexpressa um polipeptídeo de TAT quando comparada auma célula normal do mesmo tipo de tecido. O polipeptídeo de TAT pode serum polipeptídeo de transmembrana expresso na superfície de uma célula decâncer ou pode ser um polipeptídeo que é produzido e segregado por umacélula de câncer. Preferivelmente, a célula é uma célula de câncer, porexemplo, uma célula de mama, ovariana, estômago, glândula endometrial,salivai, pulmão, rim, cólon, tiróide, pancreática ou da bexiga. Morte celular invitro pode ser determinada na ausência de complemento e células efetorasimunes para distinguir morte de célula induzida por citotoxicidade mediadapor célula dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente decomplemento (CDC). Desse modo, o ensaio para morte de célula pode serexecutado usando soro inativado a calor (isto é, na ausência decomplemento) e na ausência de células efetoras imunes para determinar seo anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica é capaz de induzirmorte celular, perda de integridade da membrana como avaliado porabsorção de iodeto de propídio (PI), azul tripano (vide Moore et alCytotechnology 17-1-11 (1995)) ou 7AAD pode ser avaliada com relação àscélulas sem tratar. Anticorpos, oligopeptídeos ou outras moléculas orgânicasde indução de morte celular preferidos são aqueles que induzem absorçãode PI no ensaio de absorção de PI em células de BT474.Uma "célula de expressão de TAT" é uma célula que expressaum polipeptídeo de TAT endógeno ou transfeccionado na superfície celularou em uma forma segregada. Um "câncer de expressão de TAT" é umcâncer compreendendo células que têm um polipeptídeo de TAT presentena superfície da célula ou que produz e segrega um polipeptídeo de TAT.Um "câncer de expressão de TAT" opcionalmente produz níveis suficientesde polipeptídeo de TAT na superfície das células deste, de modo que umanticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou outro antagonista de moléculaorgânica pode ligar a este e pode ter um efeito terapêutico com respeito aocâncer. Em outra modalidade, um "câncer de expressão de TAT"opcionalmente produz e segrega níveis suficientes de polipeptídeo de TAT,de modo que um anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou outro antagonistade molécula orgânica pode ligar a este e pode ter um efeito terapêutico comrespeito ao câncer. Com respeito ao último, o antagonista pode ser umoligonucleotídeo anti-sentido que reduz, inibe ou impede produção esecreção do polipeptídeo de TAT segregado pelas células tumorais. Umcâncer que "sobreexpressa" um polipeptídeo de TAT é um que tem níveissignificativamente mais altos de polipeptídeo de TAT na superfície dascélulas deste, ou produz e segrega, comparado a uma célula não-cancerosado mesmo tipo de tecido. Tal sobreexpressão pode ser causada poramplificação de gene ou por transcrição ou translação aumentada.Sobreexpressão de polipeptídeo de TAT pode ser determinada em umensaio diagnóstico ou prognóstico avaliando níveis aumentados da proteínade TAT presente na superfície de uma célula, ou segregados pela célula (porexemplo, por meio de um ensaio de imunoistoquímica usando anticorpos deanti-TAT preparados contra um polipeptídeo de TAT isolado que pode serpreparado usando tecnologia de DNA recombinante de um ácido nucléicoisolado que codifica o polipeptídeo de TAT; análise de FACS, etc). Comoalternativa, ou adicionalmente, pode-se medir os níveis de ácido nucléico decodificação de polipeptídeo de TAT ou mRNA na célula, por exemplo, pormeio de hibridização fluorescente in situ usando uma sonda com base emácido nucléico que corresponde a um ácido nucléico de codificação de TATou o complemento deste; (FISH; vide W098/45479 publicado em outubro de1998), técnicas de Southern blot, Northern blot, ou reação em cadeia depolimerase (PCR), como PCR quantitativa de tempo real (RT-PCR). Pode-setambém estudar a sobreexpressão de polipeptídeo de TAT medindoantígeno desprendido em um fluido biológico como soro, por exemplo,usando ensaios com base em anticorpo (vide também, por exemplo, PatenteU. S. N9 4.933.294 12 emitida êm junho de 1990; WO91/05264 publicado em18 de abril de 1991; patente U. S. 5.401.638 emitida em 28 de março de1995; e Sias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Além dosensaios acima, vários ensaios in vivo estão disponíveis ao médico versado.Por exemplo, pode-se expor células dentro do corpo do paciente a umanticorpo que é opcionalmente rotulado com uma marcação detectável, porexemplo, isótopo radioativo, e ligação do anticorpo às células no pacientepode ser avaliada, por exemplo, por varredura externa para radioatividadeou analisando uma biópsia tirada de um paciente previamente exposto aoanticorpo.

Como aqui usado, o termo "imunoadesina" designa moléculassemelhante a anticorpo que combinam a especificidade de ligação de umaproteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efetoras dos domíniosconstantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinascompreendem uma fusão de uma seqüência de aminoácido com aespecificidade de ligação desejada que é diferente daquela do sítio dereconhecimento e ligação de antígeno de um anticorpo (isto é, é"heteróloga"), e uma seqüência de domínio constante de imunoglobulina. Aparte de adesina de uma molécula de imunoadesina tipicamente é umaseqüência de aminoácido contígua compreendendo pelo menos o sítio deligação de um receptor ou um ligando. A seqüência de domínio constante deimunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida de qualquerimunoglobulina, como subtipos lgG-1, lgG-2, lgG-3 ou lgG-4, IgA (incluindolgA-1 e lgA-2), IgE, IgD ou IgM.

A palavra "marcação" quando aqui usada refere-se a umcomposto ou composição detectável que é direta ou indiretamenteconjugada com o anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica paragerar um anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica "rotulada". Amarcação pode ser por si só detectável (por exemplo marcações deradioisótopo ou marcações fluorescentes) ou, no caso de uma marcaçãoenzimática, pode catalisar a alteração química de um composto oucomposição de substrato que é detectável.

O termo "agente citotóxico" como aqui usado refere-se a umasubstância que inibe ou impede a função das células e/ou causa adestruição das células. O termo é intencionado a incluir isótopos radioativos(por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótoposradioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos, enzimas e fragmentosdestes como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas como toxinas demoléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origembacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantesdestas, e os vários agentes de antitumor ou anticâncer descritos abaixo.Outros agentes citotóxicos são descritos abaixo. Um agente tumoricidacausa destruição das células tumorais.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil notratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluemagentes de alquilação como tiotepa e ciclosfosfamida de CYTOXAN®;sulfonatos de alquila como bussulfan, improssulfan e pipossulfan; aziridinascomo benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas emetilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina,trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina;acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol;colquicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o topotecan deanálogo sintético (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®),acetilcamptotecina, escopolectina e 9-aminocamptotecina); brioestatina;calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos de adozelesin,carzelesin e bizelesin); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida;criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina;duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1);eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardasde nitrogênio como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina,ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de oxido de mecloretamina, melfalan,novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila;nitrouréias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina,nimustina e ranimnustina; antibióticos como os antibióticos de enediina (porexemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamai ecaliqueamicina omegal (vide, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina;como também cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos de antibióticode enediina de cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina,autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina,carminomicina, carzinofilina, cromomicinis, dactinomicina, daunorrubicina,detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina de ADRIAMYCIN®(incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e deoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina,marcelomicina, mitomicinas como mitomicina C, ácido micofenólico,nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina,quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina,ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos como metotrexato e5- fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico como denopterina, meto-trexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como fludarabina,6- mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina comoancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina,doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógeno como calusterona, próprio-nato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadre-nais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforçador de ácido fólicocomo ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácidoaminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato;defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; umaepotilona; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidainina;maitansinóides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona;mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina;losoxantrona; 2-etilidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK®(JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran;espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina;tricotecenos (especialmente toxina de T-2, verracurin A, roridin A eanguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina;manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosídeo("Ara-C"); tiotepa; taxóides, por exemplo, Paclitaxel de TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.), ABRAXANETM formulação depaclitaxel de nanopartícula criada de albumina livre de cremofor (AmericanPharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), e doxetaxel de TAXOTERE®(Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); cloranbucila; gemcitabina(GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platinacomo cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELB AN®); platina; etoposida(VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina;leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato;daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides como ácido retinóico;capecitabina (XELODA®); sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ouderivados de qualquer um dos acima; como também combinações de doisou mais dos acima como CHOP, uma abreviação para uma terapiacombinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, e prednisolona, eFOLFOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina(ELOXATINTM) combinada com 5-FU e leucovovina.

Também inclusos nesta definição estão os agentes anti-hormonais que agem para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos dehormônios que podem promover o crescimento de câncer, e são freqüente-mente na forma de tratamento sistêmico, ou de corpo inteiro. Eles podem serhormônios em si. Exemplos incluem antiestrogênios e moduladores dereceptor de estrogênio seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo,tamoxifeno (incluindo tamoxifeno de NOLVADEX®), raloxifeno de EVISTA®,droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LYI 17018, onapris-tona, e toremifeno de FARESTON®; antiprogesteronas; sub-reguladores dereceptor de estrogênio (ERDs); agentes que funcionam para suprimir oufechar os ovários, por exemplo, agonistas de hormônio de liberação dehormônio leutinizante (LHRH) como acetato de leuprolida de LUPRON® eELIGARD®, acetato de goserrelina, acetato de buserrelina e tripterrelina;outros antiandrógenos como flutamida, nilutamida e bicalutamida; einibidores de aromatase como os que inibem a enzima aromatase que regulaa produção de estrogênio nas glândulas supra-renais, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestanode AROMASEN®, formestanie, fadrozol, vorozol de RTVISOR®, letrozol deFEMARA®, e anastrozol de ARIMIDEX®. Além disso, tal definição de agentesquimioterapêuticos inclui bisfosfonatos como clodronato (por exemplo,BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato de DIDROCAL®, NE-58095, ZOMETA®ácido zoledrônico/zoledronato, alendronato de FOSAMAX®, pamidronato deAREDIA®, tiludronato de SKELDD®, ou risedronato de ACTONEL®; comotambém troxacitabina (um análogo de citosina de nucleosídeo 1,3-dioxolano);oligonucleotídeos anti-sentidos, particularmente aqueles que inibemexpressão de genes em vias de sinalização implicadas na proliferação decélula aberrante, como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, e receptor defator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas como vacina deTHERATOPE® e vacinas de terapia de gene, por exemplo, vacina deALLOVECTIN®, vacina de LEUVECTIN®, e vacina de VAXID®; inibidor detopoisomerase I de LURTOTECAN®; rmRH de ABARELIX®; ditosilato delapatinib (um inibidor de molécula pequena de tirosina cinase dual de ErbB-2e EGFR também conhecido como GW572016); e sais farmaceuticamenteaceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um do acima.

Um "agente inibidor de crescimento" quando aqui usado refere-se a um composto ou composição que inibe crescimento de uma célula,especialmente uma célula de câncer de expressão de TAT, ou in vitro ou invivo. Desse modo, o agente inibidor de crescimento pode ser um quesignificativamente reduz a porcentagem de células de expressão de TAT emfase S. Exemplos de agentes inibidores de crescimento incluem agentes quebloqueiam a progressão do ciclo celular (em um lugar diferente da fase S),como agentes que induzem apreensão de Gl e apreensão de fase M.Bloqueadores de fase M clássicos incluem as vincas (vincristina evinblastina), taxanos, e inibidores de topoisomerase II como doxorrubicina,epirrubicina, daunorrubicina, etoposida e bleomicina. Aqueles agentes queapreendem Gl também estendem para apreensão de fase S, por exemplo,agentes de alquilação de DNA como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina,mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracila e ara-C.

Informação adicional pode ser encontrada em The MolecularBasis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado "Cell cycleregulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WBSaunders: Filadélfia, 1995), especialmente pág. 13. Os taxanos (paclitaxel edocetaxel) são fármacos de anticâncer ambos derivados da árvore de teixo.Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu,é um análogo semi-sintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb).Paclitaxel e docetaxel promovem o conjunto de microtúbulos de dímeros detubulina e estabilizam os microtúbulos impedindo despolimerizaçãoresultando na inibição de mitose nas células.

"Doxorrubicina" é um antibiótico de antraciclina. O nome químicototal de doxorrubicina é (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxi-a-L-lixo-hexapi-ranosil)óxi]-7,8,9,10-tetraidro-6,8,ll-triidróxi-8-(hidroxiacetil)-1-metóxi-5,12-naftacenodiona.

O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadaspor uma população de célula que age em outra célula como mediadoresintercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas ehormônios de polipeptídeo tradicionais. Inclusos entre as citocinas hormôniode crescimento estão como hormônio de crescimento humano, hormônio decrescimento humano de N-metionila, e hormônio de crescimento bovino;hormônio da paratiróide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; prorelaxina;hormônios de glicoproteína como hormônio estimulante de folículos (FSH),hormônio estimulante da tiróide (TSH) e hormônio luteinizante (LH); fator decrescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina;lactogênio placentário; fator de necrose tumoral a e B; substância inibidorade mulerian; peptídeo associado à gonadotropina de camundongo; inibina;activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina(TPO); fatores de desenvolvimento nervoso como NGF-a; fator decrescimento de plaquetas; fatores de crescimento transformantes (TGFs)como TGF-a e TGF-B; fator crescimento semelhante à insulina I e II;eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferonas como interferona a,B e y; fatores estimulantes de colônias (CSFs) como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulócitos-macrófagos (GM-CSF); e CSF de granulócitos(G-CSF); interleucinas (ILs) como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,IL-8, IL-9, IL-1 í, IL-12; um fator de necrose tumoral como TNF-a ou TNF-B; eoutros fatores de polipeptídeo incluindo ligando de LIF e de kit (KL). Comoaqui usado, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de culturade células recombinantes e equivalentes biologicamente ativos das citocinasde seqüência nativas.

O termo "inserção de pacote" é usado para referir às instruçõeshabitualmente inclusas em pacotes comerciais de produtos terapêuticoscontendo informação acerca das indicações de uso, dosagem, administração,contra-indicações e/ou advertências relativas ao uso de tais produtosterapêuticos.Tabela 1

<table>table see original document page 87</column></row><table>Tabela 1 (continuação)/*

ftÍDclude<stdio.h>frinclude <ctypch>

#define MAXJMP 16 f* max jurnps in a diag */

íí define MAXGAP 24 /* don't continue to penalize gaps largcr than this */■

ftdefine JMPS 1024 /* rnax jmps in an path V

fldefine MX 4 /* save If ihcrc's at least MX-1 bases.slnce last jmp */

tfdeEme DMAT 3 /* vaJue of maiching bases */

^define DMIS 0 /* penaity for mismatched bases */

frdeflne DINSO 8 /* penaity for a gap •/ .

#definc DINS1 l /* penaity per base */

#dcGne PINSO. 8 /* penaity for a gap */

Me fine PINSI 4 . /* penaity per residue */

struct jmp {

short n[M AXJMP); /* sue of jmp (neg for dely) V

uosigoed short x[MAXJMP]; /* base no. of jmp in seq x */

}; /*Umitsscqto2Al6-l */

struct diag (

lot score; /* score at last jmp */

offset; f* offset of prev block */

short ljmp; 1* current jmp index ♦/

}; struct jmp jp; /* Ust of jmps */

struct]: >atfi {

ini spc; /* number of leading spaces */

sbort n[JMPS);/* size of jmp (gap) •/ }; int xfJMPS];/* locof jmp (last elem before gap) */ char •ofile; /* output file name */ *■

char *naroex[2]; /* seq names: getseqsO */

char *prog; t* prog name for err msgs */

char *scqx[2J; /* seqs: getseqsO */

int dmax; /• besl diag: nwO */

int dmaxO; /• final diag */

Int dna; /* set if dna: mainO •/

iat endgaps; /* &et if penal izJng end gaps

Int gapx. gapy; /* total gaps in seqs */

int lenO, lenl; /* seq lens */

int ngapx, ngapy; /* total size of gaps */

int smax; /• raax score: nw() */

int "xbm; /* bitraap for maiching */

long offset; /• currem offset in jmp file *

erruef diag *âx; /* holds diagonais */

struct path PPÍ2J; f* holds path for seqs */

diar •calloc'0. *maJJocO, *indexQ, "*&cpyÜ; char *»getseq0, *g_callocO;Tabela 1 (continuação)

/* Needleman-Wunscn alignment program

* usBge: progs filei Íile2

* whcrc filei and Clc2 are two dna or two protein sequences.

* The sequences can be in upper- or lowcr-case en mey cemain ambigutty

* Any Unes beginning with Y. Vor'<' are ignored -

* Max file length ü 65535 (ümitcd by unsigned shon x in lhe jmp jtroci)

* A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA

* Outpul is íd lhe file "ajjgn.outM

*

* The program may creaie a unp file in /tmp to hold iafo ebout traceback.

* Original version developed under BSD 4.3 on a vax E650V

#include "nw.h"#ínclude "dayit"

eíatic dbva][26) = {

ll]4,2,l3.0,0.4,]l,0,0.!2-Or3.15AO,0^,6t8,8.7,9,0,10,0

);

elatíc _pbval[26J = {

1, 2|(l«CD,-,A,))i(a«(,N,-,A0), 4,8. 16,32,64,128(256,0xFFFFÍTF, í«I0,1«12, 1«I3, J«I4.1«15, J«16,1«17, ]«18,1«19,1«20, 1«21, I«22,1«23, J«24, i«25Kl«CE'A')yi(U<Xr-tA'))

majn(ac, av)

Jnt ac;cbar *av[J;

{

prog = avlOJ;if(acl=3){

íprintf{std€rr,wusage: %s filei file2\c*, prog);

fpriotfístderr^where filei and £ile2 are two dna or two protein sequences.VT);rprintfístderr.TTic sequences can be in upper- or Jower-case\n");fprintf(aderi," Any lines beginning with';' or '<■ are ignorwiW);fprintfístderr^Output is In the file \"align.oiJf Ho");exit(l);

)

name*{0] = av[l];

namex(l)«=av[2];

seqxfOj - getseq(namex(0]. AilenO);

seqxjl] = getseq(namcx(l], &lenl);

xbm * (dna)? ^dbvaJ: jbval;

cndgaps = 0; /* 1 to penalize cndgaps */

ofüe * "augn.out"; /* ouiput file */

nwO; /* fill in the matrix, gel lhe possible jmps */

readjmpsO; /* gel lhe actuaJ jmps */

priotO*. /* prínt stats, alignment */

cleanup(0);

/* unlint any tmp files V)Tabela 1 (continuação)

/* do lhe alignment, rcturn best score: mainO

* dna: values in Fitch and Smith. PNAS, 80. 1382-1386,1983

* pro: PAM 25Ü values

* When scores are cqual, we prefer mismaiches lo any gap. prefer

* a new gap (o extendíng an ongoing gap, and prefer a gap in seqx

* lo s gap in seq y.

•/

nwO

{

char *px, *py.

int •ndely, *dely;

inl ndelx, dclx;

inl *imp;

inl mis;

ínt insO, insl;

reglster id;

reglster ij;

regisíer ♦colO. ♦coll;

register «,yy;

nw

/* seqs and ptrs */

J* Iceep track of dely V

f* Jccep track of delx V

/* for stvappíog rowO, rowl */

f* score for each lype */

/* insertion pena] ti es */

/* diagonal index */

/* jtnp index */

/* score for curr, lasl row */

/* index into seqs */

dx = (struct diag *)g_caüoc("io g« diags", IenO+4en1+1, sizeof(struct diag));

ndely *= (Int *)g_caüoc("io gct ndely", lenl+1, s«eof(iat));

dely= (io( •)g_caUoc("io gel dcly*\ lenl+1, sizeof(int));

co!0<= (inl *)g_caJJoc("to get co!0", lenl+1, sizeof(int));

coll ~ (Int *)£_caUoc("to gel coll", lenl + 1, sÍ£eof(mt));

insO = (dna)? DINSO: P1NSO;

insl «= (dna)7 DINS1: PINSl;

smax = -100Q0;

if (endgaps) f

for (col0[0] - delylO] s= -insO, yy = 1; yy <= lenl; yy++) {colOtyyj ~ dclylyyj = colOtyy-l] - insl;ndelytyy] = yy.

}

colO[OJ»0; /»Wai«rmanBullMatf»Biol84*/ -

}

eise

for (yy = 1; yy <= lenl; yy++)dely[yy] = -insO;/* fiU ín match matríx ■V

for (px = seqx[0], xx = 1; xx lenO; px++, xx++) {/* Initíaliae first entry in col*/

If (endgaps) (

if(xx = 1)

coIHO] = dclx = -<ins0+insl);

eise

colltO] = delx ^col0[0] - insl;ndelx = xx;

}

e)se{

colH03 = 0;delx = -insO;nddx = 0;

]Tabela 1 (continuação)

for (py = seqx( 1), yy = 1; yy <= lenl; py++, yy++) {

mi?. ^ colOJv;'•1 ];if(dna)

mis += (xbm[,px-'A')&xbm[*py-,A'])? DMAT: DM1S;

dse

mis += _day[*px-'A3(*py-'Al;

/* update peDaJty for dei in x seq;

* favor new dcl over ongong dei

* ignore MAXGAP if weighúng endgaps♦/

if (endgaps ||ndely(yy]< MAXGAP) {

if (colO[yy] - insO >= dely[yy]) {

delytyy) = col0[yy] - (insO+insl);ndelyfyy] = I;

}else{

de!y[yy]-=insl;ndely[yy)+4;

}

)else{

If (colOlyy] - (InsO+insl) >= de!y[yy]) {

deljtyy] = col0[yyj - (InsO+insl);ndelylyy) = 1;

}clsc

nde)y(yy}++;

}

/• update penalty for dei ín y seq;

* favor new dei over ongoog dei*/

If (endgaps J ndelx < MAXGAP) {

if (coll tyy-1] - insO >= delx) {

delx = coll[yy-l] - (insO+insl);ndelx s 1;

J cUe (

delx -= insl;ndelx++:

}

)etee{

if (colltyy-1) - (insO+insl) >= delx) {

delx = coll[yy-l] - (insO+insl);ndelx = 1:

) eis*

ndelx++;

)

/* pick lhe maxlmum scorc; we're favoring

* mis over any dei and delx over dely

...nw

id = xx - yy + lenl -1;if (mis >= delx && mis >= dcly[yy])colllyyl = mis;Tabela 1 (continuação)

elself(delx>=dely(yy]){co!l|yy] = delx;

ij ■= dx[id].ijn-ip;

if (dx[id).jp.n[0) && (Wna | (ndelx>= MAXJMP&.& xx > dx[id].jp.n[lj}+MX) B mis > dxlld].score+DlNSO)) (dx[id]ijmp++;if(++ij>= MAXJMP) {wrilcjmps(id);ij - dx[id].ijmp = 0;dxlld].o«set=offset;

offsel += sizeor(slnid jmp) * sizeof(offcef);

)

dx[id].jp.n(ij] = ndelx:dx[id].jp.x[ijj = xx;dxpdj.score = delx;

J

cise {

coll[yy] = dely(yy];ij = dx(id].ijmp;if (dx[id] jp.n[0] && (!dna | (ndely[yy] >= MAXJMP

&& xx > dx[id].jp.x[ij]+MX) i mis > dx[id].6core*DINS0)) {dx[id].ijmp++;if (+-HJ >= MAXJMP) {wriiejmps(ld);ij = dx[id].ijmp = 0;dxfjd].offsel •= offse«;

offact += sizeof(s troei j mp) + sizeof(offscl);

J

}

dxfidj jp.n(ij] = -ndelylyy];dx[id].jpji[ij]=xx;dx[id].score = delytyy];

}

lf (xx = lenO && yy < lenl) (/»last ctriV

if (endgaps)

coll[yy] -= insO+insl*flenl-yy);

If (coll[yyj>smax){

stnaxc co)l(yy];dmax - id;

}

í

if (endgaps && XI < lenO)

coll{yy-l]-= ios0+insl#0en0-xx);if{colllyy-l]>5max){

smax = coll(yy-l];

dmax = id;

}

tmp = colO; col0«= coü; coll ■= tmp; )(>oid) free((char *)ndely);(vold) frce((char *)dely);(void) free((char *)col0);(void)free((char»)con); }Tabela 1 (continuação)

<table>table see original document page 93</column></row><table>Tabela 1 (continuação)

/*

* trace back ibe best palh, count matdiesV

stfltíc

getmatflx, ly, fírstgap, lastgap)

int lx, ly; /* "core" (minua endgaps) */

inl firslgap, tastgap; /* leading uailing overlap */

í

inf nm, iO, il, sizO, sizl;

cbar outx[32];double pci;register nO, nl;

register cbar *p0, *pJ;/* get lotai maiches, score*i

K)-il - sizO » íiil = 0;pO * seqxfO] + pp(l)^pc:p] =seqx(l] + pp[OJjpc;n0 = pp|l].spc4 1;nl b= pp[0].spc-f 1;um *= 0;

white<*pO&&*pl){If(siz0){

pl++;ol++;

)

els€if(síij){pÓ++;n0++;sizl-:

}

else {

If (xbmt»pO-'Al&xbm(*pl-,Al)

nm++;if(nO+-f = ppI01jtriO])

sizO-pp(0].n(JO+-f};if(nl++ = pp[njt[il))

íizl = ppD].n[i1++];

pO++;

/* pct homology.

* if penoliung endgaps, base is Che shorter seq

* else, knock off overbangs and lake shorter core*/

If (endgaps)

lx * flenO < leal)? lenO: lenl;

else

lx = (lx < ly)? lx : ly,pct = I00.*(double)nm/(double)lx;Jjprintfífx. "\n");

fprinífífx, *<%d maich%s jn an overlap of %d: percent sinüJariiy\n'nm, (nm = 1)? -; *esM, lx. pct);Tabela 1 (continuação)

fprintf(fx, "<gaps in firsí sequence: ífed", gapx);if (gapx) (

(vuidj &pr;ntf(cuu, * {%ó

ngapx, (dna)7 "baseVresidue", (ngapx — 1)7 "':V);fprintf(fx,"%s'\ outx);fprintfCfx, gaps in sccond sequence: %d", gapy);

If (gapy) (

(void) sprintfloutx, " (9bd fcs%s)\

ngapy, (dna)? "baseVreridue", (ngapy = 1)7fprintflft/fes", outx);

...getmat

}

if (dna)

fprintfí&t,

"\n<score: %d (match c %à, mismaich = 9bd, gap penaíty = %d 4 Sfed per base)\n"smax, DMAT, DM1S, D1NS0, DINS1);

fprintf(fx,

"\rKscore: 9bd (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penaJiy = %d + %á per rcsidue)\n"smax,PINS0, PINS1);íf<cndgaps)

fprintfífe.

"<endgaps penalizei Ieft endgap: %d %sfcs, righr endgap: %d %s%s\nM,Grstgap, (dna)? "base" : "residuc*. (firstgap = 1)7 : V,lastgap, (dna)7 "base* : "residue", (lastgap « 1)? " : "s");

else

fprintf(lx, "<endgaps not pcnalizeá\nn);

}

nm;

Imax;

UI23;

nc[2);

ni|2J:

5Í212J;

*ps[2];

*pof2];

SlfitJC

fita ticslaticslaticstatic«taticslatic charstatic charslatic charstatíc char/*

* print alignment of described in slruct patb pp[]•/

slatic

pr.alignOí

/• matches in core — for checking •//* lengths of sirípped file names *//* jmp index for a path *//* number at siart of curreni Une *//* curreni eietn number -- for gapping */

f* ptr to curreni element *//* ptr to next outpül char slot */

ouU2][P_LINEJ; /* ourput line •/startP_UNEl; /* set by starsO V

pr_aHgn

intint

register

nn;

more;

i;

/* char couni •/

for (i = 0, Imax = 0; i < 2; i+4) {

nn = sírjpname(namex(i]);if (no > Iroax)

Imax - qd;

Dc[i)=l;nifi)= 1;sii[i]«ij(i3«=0;psf i) = scqx[j];po[i] = om[i);Tabela 1 (continuação)

for {nn = om = 0, more s t: more:) { ...pr_alignior íi = more = 0; i < 2; i++) (I*

* do wc have more of this sequence?*/

continue;

moTc++;

ff (pp[IJ^pc) ( r leadlng space •/pp[i].spc-;

}

else lf (sizfi]) { /* in a gap ♦/£i2[i]-;

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* at this location*/

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dumpblockO dumpblock{

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for <i"= 0; i < 2; i-H-)

•po{i]-= "tf;<table>table see original document page 97</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 98</column></row><table>Tabela 1 (continuação)

<table>table see original document page 99</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 100</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 101</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 102</column></row><table>Tabela 4

TAT-DNA NNNNNNNNNNNNNN (Comprimento ■= 14nucleotídeos)

DNA de comparação NNNNNNLLLLLLLLLL (Comprimento = 16nucleotídeos)

% de identidade de seqüência de ácido nucléico =(o número de nucleotídeos identicamente pareados entre asduas seqüências de ácido nucléico como determinado por ALIGN-2) divididopor (o número total de nucleotídeos da seqüência de ácido nucléico de TAT-DNA) =

6 dividido por 14 = 42,9%

Tabela 5

TAT-DNA NNNNNNNNNNNN (Comprimento = 12 nucleotídeos)

DNA de comparação NNNNLLLVV (Comprimento = 9nucleotídeos)

4 dividido por 12 = 33,3%

II. Composições e Métodos da Invenção

A. Anticorpos de anti-TAT

Em uma modalidade, a presente invenção fornece anticorpos deanti-TAT que podem encontrar uso aqui como agentes terapêuticos e/oudiagnósticos. Anticorpos exemplares incluem anticorpos policlonais,monoclonais, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados.

1. Anticorpos Policlonais

Anticorpos policlonais são preferivelmente crescidos em animaisatravés de múltiplas injeções subcutaneas (sc) ou intraperitoneais (ip) doantígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígenorelevante (especialmente quando peptídeos sintéticos forem usados) comuma proteína que é imunogênica nas espécies a ser imunizadas.

Por exemplo, o antígeno pode ser conjugado com hemocianinade lapa (KLH), albumina de soro, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsinade feijão-soja, usando um agente bifuncional ou de derivatização, porexemplo, éster de sulfosuccinimida de maleimidobenzoíla (conjugaçãoatravés de resíduos de cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduosde lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2, ou R1N=C=NR onde R eR1 são grupos alquila diferentes.

Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugadosimunogênicos, ou derivados combinando, por exemplo, 100 ug ou 5 ug daproteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente)com 3 volumes do adjuvante completo de Freund e injetando a soluçãointradermicamente em sítios múltiplos. Um mês depois, os animais sãoreforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugadono adjuvante completo de Freund através de injeção subcutânea em sítiosmúltiplos. Sete a 14 dias depois, os animais são sangrados e o soro éensaiado para titulação de anticorpo. Os animais são reforçados até osplanaltos de titulação. Conjugados também podem ser feitos em cultura decélula recombinante como fusões de proteína. Também, agentes deagregação como alume são adequadamente usados para intensificar aresposta imune.

2. Anticorpos Monoclonais

Os anticorpos monoclonais podem ser feitos usando o métodode hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), oupode ser feito através de métodos de DNA recombinante (patente U. S. NQ4.816.567).

No método de hibridoma, um camundongo ou outro animalhospedeiro apropriado, como um hamster, é imunizado como descrito parasuscitar linfocitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos queespecificamente ligarão à proteína usada para imunização acima.Alternativamente, linfocitos podem ser imunizados in vitro. Após imunização,os linfocitos são isolados e depois fundidos com uma linhagem celular demieloma usando um agente de fundição adequado, como polietileno glicol,para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies:Principies and Practice, págs. 59- 103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma desse modo preparadas são semeadase crescidas em um meio de cultura adequado cujo meio preferivelmentecontém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ousobrevivência das células de mieloma parentais não-fundidas (tambémreferidas como par de fusão). Por exemplo, se as células de mielomaparentais carecerem da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase(HGPRT ou HPRT), o meio de cultura seletivo para os hibridomastipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina e timidina (meio de HAT) cujassubstâncias impedem o crescimento de células deficientes de HGPRT.

Células de mieloma de par de fusão preferidas são aquelas quefundem-se eficazmente, suportam produção de nível alto estável deanticorpo pelas células de produção de anticorpo selecionadas, e sãosensíveis a um meio seletivo que seleciona contra as células parentais não-fundidas.

Linhagens celulares de mieloma preferidas são linhagens demieloma murino, como aquele derivado de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis do Salk Institute Cell Distribuition Center, SanDiego, Califórnia, EUA, e SP-2 e derivados por exemplo, células de X63-Ag8-653 disponíveis da American Type Culture Collection, Manassas,Virgínia, EUA. Linhagens celulares de mieloma humano e de heteromielomade camundongo-humano também foram descritas para a produção deanticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); eBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)).

Meio de cultura nos quais as células de hibridoma estãocrescendo é ensaiado para produção de anticorpos monoclonaisdirecionados contra o antígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligaçãode anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma édeterminada através de imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação invitro, como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado aenzima (ELISA).

A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, porexemplo, ser determinada pela análise de Scatchard descrita em Munson etal., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Uma vez as células de hibridoma que produzem anticorpos daespecificidade, afinidade, e/ou atividade desejadas são identificadas, osclones podem ser subclonados limitando os procedimentos de diluição epodem ser crescidos através de métodos padrão (Goding, MonoclonalAntibodies: Principies and Practice, págs.59-103 (Academic Press, 1986)).Meios de cultura adequados para este propósito incluem, por exemplo, meiode D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem sercrescidas in vivo como tumores de ascites em um animal por exemplo, porinjeção i.p das células em camundongos.

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones éadequadamente separado do meio de cultura, fluido de ascites, ou soroatravés de procedimentos de purificação de anticorpo convencionais como,por exemplo, cromatografia de afinidade (por exemplo, usando proteína A ouproteína G-Sepharose) ou cromatografia de permuta iônica, cromatografiade hidroxilapatite, eletroforese em gel, diálise, etc.

DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isoladoe seqüenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usandosondas de oligonucleotídeo que são especificamente capazes de ligação agenes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos murinos). Ascélulas de hibridoma servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vezisolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão que são depoistransfeccionados em células hospedeiras como células de E. coli, células deCOS símias, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), ou células demieloma que do contrário não produzem a proteína de anticorpo, para obtera síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes.Artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de DNA quecodifica o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion em Immunol.,5:256-262 (1993) e Plückthun, Immunol. Rev. 130:151-188 (1992).

Em uma modalidade adicional, anticorpos monoclonais oufragmentos de anticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fago deanticorpo geradas usando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature,348:552-554(1990).

Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol.Biol., 222:581-597 (1991) descreve o isolamento de anticorpos murinos ehumanos, respectivamente, usando bibliotecas de fago. Publicaçõessubseqüentes descrevem a produção de anticorpos humanos de afinidadealta (faixa nM) mediante embaralhamento de cadeia (Marks et al.,Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), como também infecção combinatória erecombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fagomuito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)).Desse modo, estas técnicas são alternativas viáveis para técnicas dehibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para isolamento deanticorpos monoclonais.

O DNA que codifica o anticorpo pode ser modificado paraproduzir polipeptídeos quiméricos ou de anticorpo de fusão, por exemplo,substituindo as seqüências humanas de domínio constante de cadeiapesada e cadeia leve (CH e CL) pelas seqüências murinas homólogas(patente U. S. Ns 4.816.567; e Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA,81:6851 (1984)), ou fundindo a seqüência de codificação de imunoglobulinacom toda ou parte da seqüência de codificação para um polipeptídeo denão-imunoglobulina (polipeptídeo heterólogo). As seqüências depolipeptídeo de não-imunoglobulina podem substituir pelo domíniosconstantes de um anticorpo, ou eles são substituídos pelo domíniosvariáveis de um sítio e combinação de antígeno de um anticorpo para criarum anticorpo bivalente quimérico compreendendo um sítio de combinaçãode antígeno tendo especificidade para um antígeno e outro sítio decombinação de antígeno tendo especificidade para um antígeno diferente.

3. Anticorpos Humanos e Humanizados

Os anticorpos de anti-TAT da invenção podem tambémcompreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Formashumanizadas de anticorpos não-humanos (por exemplo, murinos) sãoimunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentosdestas (como Fv, Fab, Fab, F(ab')2 ou outras subseqüências de ligação deantígeno de anticorpos) contendo as seqüência mínima derivada deimunoglobulina não-humana. Anticorpos humanizados incluemimunoglobulinas humanas (anticorpo de recipiente) em que os resíduos deuma região de determinação complementar (CDR) do recipiente sãosubstituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não-humana(anticorpo de doador) como camundongo, rato ou coelho tendo aespecificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em algumascircunstâncias, os resíduos da imunoglobulina de estrutura de Fv humanasão substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Anticorposhumanizados podem também compreender resíduos que nem sãoencontrados no anticorpo de recipiente nem nas seqüências de CDR ou deestrutura importadas. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderásubstancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domíniosvariáveis em que todas ou substancialmente todas as regiões de CDRcorrespondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana e todas ousubstancialmente todas as regiões de FR são aqueles de uma seqüênciaconsenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamentetambém compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante deimunoglobulina (Fc), tipicamente à de uma imunoglobulina humana [Jones etal., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329(1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Métodos para humanizar anticorpos não-humanos são bemconhecidos na técnica. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou maisresíduos de aminoácido introduzidos nele de uma fonte que é não-humana.Estes resíduos de aminoácido não-humanos são freqüentemente referidoscomo resíduos de "importação" que são tipicamente tirados de um domíniovariável de "importação". Humanização pode ser essencialmente executadaseguindo o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al.,Science, 239:1534-1536 (1988)], substituindo as CDRs ou seqüências deCDR de roedores pelas seqüências correspondentes de um anticorpohumano. Conseqüentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorposquiméricos (patente U. S. Ne 4.816.567), em que substancialmente menosque um domínio de variável humano intacto foi substituído pela seqüênciacorrespondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorposhumanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduosde CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos porresíduos de sítios análogos em anticorpos roedores.

A escolha de domínios variáveis humanos, leve e pesado, aserem usados para fazer os anticorpos humanizados é muito importantepara reduzir antigenicidade e resposta de HAMA (anticorpo deanticamundongo humano) quando o anticorpo for intencionado para usoterapêutico humano. De acordo com o assim-chamado método de "melhorajuste", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é tríadacontra a biblioteca inteira de seqüências de domínios variáveis humanasconhecidas. A seqüência de domínio V humana que está mais próxima à doroedor é identificada e a região de estrutura humana (FR) dentro dela éaceita para o anticorpo humanizado (Sims et al, J. Immunol. 151:2296 (1993);Chotia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método usa uma região deestrutura particular derivada da seqüência de consenso de todos osanticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leve ou pesadas.A mesma estrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizadosdiferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Prestaetal., J. Immunol. 151:2623(1993)).

É também importante que os anticorpos sejam humanizadoscom retenção de afinidade de ligação alta para o antígeno e outraspropriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este meta, de acordo comum método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por umprocesso de análise das seqüências parentais e vários produtoshumanizados conceituais usando modelos tridimensionais das seqüênciasparentais e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais estãocomumente disponíveis e estão familiarizados àqueles versados na técnica.Programas de computação estão disponíveis que ilustra e exibe estruturasconformacionais tridimensionais prováveis das seqüências deimunoglobulina candidatas selecionadas. Inspeção destas telas permiteanálise do provável papel dos resíduos no funcionamento da seqüência deimunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam ahabilidade da imunoglobulina candidato para ligar seu antígeno. Desse modo,resíduos de FR podem ser selecionados e combinados das seqüências derecipiente e de importação de forma que a característica de anticorpodesejada, como afinidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo(s), éalcançada. Em geral, os resíduos de região hipervariável são direta esubstancialmente envolvidos influenciando a ligação de antígeno.

Várias formas de um anticorpo de anti-TAT humanizado sãocontempladas. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um fragmentode anticorpo, como um Fab que é opcionalmente conjugado com um ou maisagente citotóxicos para gerar um imunoconjugado. Alternativamente, oanticorpo humanizado pode ser um anticorpo intacto, como um anticorpo delgG1 intacto.

Como uma alternativa para humanização, anticorpos humanospodem ser gerados. Por exemplo, é agora possível produzir animaistransgenicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, em imunização,de produzir um repertório total de anticorpos humanos na ausência deprodução de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que adeleção homozigota do gene da região de junção de cadeia pesada deanticorpo (JH) em camundongos mutantes quiméricos e de linhagemgerminal resulta em inibição completa da produção de anticorpo endógeno.Transferência do arranjo de gene de imunoglubilina de linhagem germinalem tais camundongos mutantes de linhagem germinal resultará na produçãode anticorpos humanos sob desafio de antígeno. Vide, por exemplo,Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90:2551 (1993); Jakobovits etal., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7:33(1993); patente U. S. NeS 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas deGenPharm); 5.545.807; e WO 97/17852.

Alternativamente, tecnologia de apresentação de fago(McCafferty et al., Nature 348:552-553 [1990]) pode ser usada para produziranticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro, de repertórios degene de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não-imunizados. De acordo com esta técnica, genes de domínio V de anticorposão clonados dentro da estrutura ou um gene de proteína de revestimentoprincipal ou secundário de um bacteriófago filamentoso, como M13 ou fd, eapresentado como fragmentos de anticorpo funcionais na superfície dapartícula de fago. Porque a partícula filamentosa contém uma cópia de DNAunifilamentar do genoma de fago, seleções com base nas propriedadesfuncionais do anticorpo também resultam em seleção do gene que codifica oanticorpo apresentando aquelas propriedades. Desse modo, o fago imitaalgumas das propriedades da célula B. Apresentação de fago pode serexecutada em uma variedade de formatos, revisada em, por exemplo,Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology3:564-571 (1993). Várias fontes de segmentos de gene V podem ser usadaspara apresentação de fago. Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991)isolou um arranjo diverso de anticorpos de antioxazolona de uma bibliotecacombinatória aleatória pequena de genes V derivados dos baços decamundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores não-imunizados humanos pode ser construído e anticorpos para um arranjodiverso de antígenos (incluindo auto-antígenos) podem ser isoladosessencialmente seguindo as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol.222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Vide,também, patente U. S. NeS 5.565.332 e 5.573.905.

Como debatido acima, anticorpos humanos podem também sergerados por células B ativadas in vitro (vide patente U. S. 5.567.610 e5.229.275).

4. Fragmentos de Anticorpo

Em certas circunstâncias há vantagens de usar fragmentos deanticorpo, ao invés de anticorpos inteiros.

O tamanho menor dos fragmentos permite liberação rápida, epode conduzir a acesso melhorado aos tumores sólidos.

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção defragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes -fragmentos eramderivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, porexemplo, Morimoto et al., Journal of Biochmeical and Biophysical Methods:107-117 (1992); e Brennan et al.. Science, 229:81 (1985)). Porém, estesfragmentos podem agora ser produzidos diretamente através de célulashospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo de Fab, Fv e ScFvpodem todos ser expressos e segregados de E. coli, desse modo permitindoa produção fácil de quantidades grandes destes fragmentos. Os fragmentosde anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpodebatidas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab'SH podem serdiretamente restabelecidos de E. colie quimicamente acoplados para formarfragmentos de F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Deacordo com outro método, fragmentos de F(ab')2 podem ser isoladosdiretamente da cultura de célula hospedeira recombinante. Fragmento deFab e F(ab')2 com meia-vida in vivo aumentada compreendendo unsresíduos de epítopo de ligação de receptor de recuperação são descritos napatente U. S. Ne 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentosde anticorpo serão evidentes ao médico versado. Em outras modalidades, oanticorpo de escolha é um fragmento de Fv de cadeia simples (scFv). VideWO 93/16185; patente U. S. Ns 5.571.894; e patente U. S. Ne 5.587.458. Fve sFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos que sãodestituídos de regiões constantes; desse modo, eles são adequados paraligação não-específica reduzida durante uso in vivo. Proteínas de fusão desFv podem ser construídas para render a fusão de uma proteína efetora ouno término amino ou carbóxi de um sFv. Vide Antibody Engineering, ed.Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo pode também ser um"anticorpo linear", por exemplo, como descrito na patente U. S. 5.641.870por exemplo. Tais fragmentos de anticorpo lineares podem sermonoespecíficos e biespecíficos.

5. Anticorpos Biespecíficos

Anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidadesde ligação a pelo menos dois epítopos diferentes. Anticorpos biespecíficosexemplares podem ligar a dois epítopos diferentes de uma proteína TATcomo descrito aqui. Outros tais anticorpos podem combinar um sítio deligação TAT com um sítio de ligação para outra proteína. Alternativamente,um braço de anti-TAT pode ser combinado com um braço que liga a umamolécula de desencadeamento em um leucócito como uma molécula dereceptor de célula T (por exemplo CD3), ou receptores de Fc para IgG(FcyR), como FcyRI (CD64), FcyRH (CD32) e FcyRMI (CD 16), para focalizare localizar mecanismos de defesas celulares para a célula de expressão deTAT. Anticorpos biespecíficos podem também ser usados para localizaragentes citotóxicos para células que expressam TAT. Estes anticorpospossuem um braço de ligação de TAT e um braço que ligam o agentecitotóxico (por exemplo, saporina, antiinterferona a, alcalóide de vinca,cadeia de ricina A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorposbiespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento totalou fragmentos de anticorpo (por exemplo, os anticorpos biespecíficos de F(ab')2).

WO 96/16673 descreve um anticorpo de anti-ErbB2/anti-FcYRIMbiespecíficos e patente U. S. Ng 5.837.234 revela um anticorpo de anti-ErbB2/anti-FcYRI biespecífico. Um anticorpo de anti-ErbB2/Fca biespecíficoé mostrado em WO98/02463. Patente U. S. Ne 5.821.337 ensina umanticorpo de anti-ErbB2/anti-CD3 biespecífico.

Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos natécnica. Produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimentototal é com base na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeialeve de imunoglobulina onde as duas cadeias têm especificidades diferentes(Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)). Por causa do sortimentoaleatório das cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas(quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpodiferentes das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta.Purificação da molécula correta que é usualmente feita através de etapas decromatografia de afinidade é bastante incômoda, e os rendimentos deproduto são baixos. Procedimentos similares são descritos em WO 93/08829,e em Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).

De acordo com um método diferente, domínios variáveis deanticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios decombinação de anticorpo-antígeno) são fundidos com as seqüências dedomínio constante de imunoglobulina. Preferivelmente, a fusão é com umdomínio constante de cadeia pesada de Ig, compreendendo pelo menosparte da dobradiça, Ch2, e regiões de Ch3. É preferido ter a primeira regiãoconstante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligaçãode cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. DNAs quecodificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, acadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressãoseparados, e são co-transfeccionados em uma célula hospedeira adequada.Isto prove maior flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos trêsfragmentos de polipeptídeo em modalidades quando as razões desiguaisdas três cadeias de polipeptídeo usadas na construção fornecem orendimento ótimo do anticorpo biespecífico desejado. Porém, é possívelinserir as seqüências de codificação para duas ou todas as três cadeias depolipeptídeo em um vetor de expressão simples quando a expressão de pelomenos duas cadeias de polipeptídeo em razões iguais resultar emrendimentos altos ou quando as razões não tiverem nenhum efeitosignificativo no rendimento da combinação de cadeia desejada.

Em uma modalidade preferida deste método, os anticorposbiespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulinahíbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço, e um parde cadeia pesada - cadeia leve de imunoglobulina híbrida (fornecendo umasegunda especificidade de ligação) no outro braço. Foi descoberto que estaestrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejadode combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, como a presençade uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas porção da moléculabiespecífica prove um modo fácil de separação. Este método é descrito emWO 94/04690. Para mais detalhes de gerar anticorpos biespecíficos vide,por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986).

De acordo com outro método descrito na patente U. S. NQ5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode sercriada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que restabelecemda cultura de célula recombinante. A interface preferida compreende pelomenos uma parte do domínio de CH3. Neste método, uma ou mais cadeiaslaterais de aminoácido menores da interface da primeira molécula deanticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo,tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ousimilar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas na interface dasegunda molécula de anticorpo substituindo cadeias laterais de aminoácidograndes com menores (por exemplo, alanina ou-treonina). Isto prove ummecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outrosprodutos finais indesejados como homodímeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou"heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugadopode ser acoplado à avidina, o outro à biotina. Tais anticorpos forampropostos, por exemplo, para alvejar células do sistema imune para célulasindesejadas (patente U. S. Ne 4.676.980), e para tratamento de infecção deHIV (WO 91/00360, WO 92/200373, e EP 03089). Anticorposheteroconjugados podem ser feitos usando qualquer método de reticulaçaoconveniente. Agentes reticulantes adequados são bem conhecidos natécnica, e são descritos na patente U. S. N9 4.676.980, juntos com váriastécnicas de reticulaçao.

Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos de fragmentos deanticorpo foram também descritos na literatura. Por exemplo, anticorposbiespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Brennan et al.,Science 229:81 (1985) descreve um procedimento em que anticorposintactos são proteoliticamente clivados para gerar os fragmentos de F(ab')2.Estes fragmentos estão reduzidos na presença do agente complexador deditiol, arsenita de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e impedir formação dedissulfeto intermolecular. Os fragmentos do Fab gerados são depoisconvertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados deFab'-TNB é depois reconvertido no Fab'-tiol através de redução commercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outroderivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorposbiespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para aimobilização seletiva de enzimas.

Progresso recente facilitou o restabelecimento direto defragmentos de Fab'-SH de E. coli que pode ser quimicamente acoplado paraformar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225(1992) descreve a produção de uma molécula de F(ab')2 de anticorpobiespecífico completamente humanizado. Cada fragmento de Fab foisegregado separadamente de E. coli e submetido ao acoplamento químicodirecionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpobiespecífico desse modo formado pôde ligar às células que sobreexpressamo receptor de ErbB2 e células T humanas normais, como tambémdesencadear a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvosde tumor de mama humano. Várias técnicas para fazer e isolar fragmentosde anticorpo biespecífico diretamente da cultura de célula recombinanteforam também descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foramproduzidos usando zíperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas de Fos eJun foram ligados às porções do Fab de dois anticorpos diferentes atravésde fusão de gene. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na regiãode dobradiça para formar monomeros e depois reoxidados para formar osheterodímeros de anticorpo. Este método pode também ser utilizado para aprodução de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpo" descritapor Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) proveuum mecanismo alternativo para fazer fragmentos de anticorpo biespecífico.Os fragmentos compreendem um VH conectado a um VL por um ligante que.é muito curto para permitir paridade entre os dois domínios na mesmacadeia. Conseqüentemente, os domínios de VH e de VL de um fragmentosão forçados para parear com os domínios de VL e de VH complementaresde outro fragmento, assim formando dois sítios de ligação de antígeno.Outra estratégia para fazer fragmentos de anticorpo biespecífico pelo uso dedímeros de Fv de cadeia simples (sFv) foram também relatados. VideGruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Porexemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et al., J.Immunol. 147:60(1991).

6. Anticorpos Heteroconjugados

Anticorpos heteroconjugados estão também dentro do escopo dapresente invenção. Anticorpos heteroconjugados são compostos de doisanticorpos covalentemente unidos. Tais anticorpos foram propostos, porexemplo, para alvejar células do sistema imune para células indesejadas[patente U. S. Ne 4.676.980], e para tratamento de infecção de HIV [WO91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. É contemplado que os anticorpospodem ser preparados in vitro usando métodos conhecidos em química deproteína sintética, incluindo aquelas envolvendo agentes reticulantes. Porexemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação depermuta de dissulfeto ou formando uma ligação de tioéter. Exemplos dereagentes adequados para este propósito incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e aqueles descritos, por exemplo, na patente U. S. N94.676.980.

7. Anticorpos Multivalentes

Um anticorpo multivalente pode ser interiorizado (e/oucatabolizado) mais rápido que um anticorpo bivalente por uma célula queexpressa um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos dapresente invenção podem ser anticorpos multivalentes (que é diferente daclasse de IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígeno (por exemplo,anticorpos tetravalentes) que podem ser produzidos facilmente porexpressão recombinante de ácido nucleico que codifica as cadeias depolipeptídeo do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender umdomínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação de antígeno. Odomínio de dimerização preferido compreende (ou consiste em) uma regiãode Fc ou uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo compreenderáuma região de Fc e três ou mais sítios de ligação de antígeno amino-terminalpara a região de Fc. O anticorpo multivalente preferido aqui compreende (ouconsiste em) três a cerca de oito, mas preferivelmente quatro, sítios deligação de antígeno. O anticorpo multivalente compreende pelo menos umacadeia de polipeptídeo (e preferivelmente duas cadeias de polipeptídeo), emque a(s) cadeia(s) de polipeptídeo compreende(m) dois ou mais domíniosvariáveis. Por exemplo, a(s) cadeia(s) de polipeptídeo pode(m) compreenderVDI-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 éum segundo domínio variável, Fc é uma cadeia de polipeptídeo de umaregião de Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo, e n é 0ou 1. Por exemplo, a(s) cadeia(s) de polipeptídeo pode(m) compreender:VH-CH1-ligante flexível-VH-CH1-cadeia de região de Fc; ou VH-CH1-VH-CH1-cadeia de região de Fc. O anticorpo multivalente aqui preferivelmentetambém compreende pelo menos dois (e preferivelmente quatro)polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Por exemplo, o anticorpomultivalente aqui pode compreender de cerca de dois a cerca de oitopolipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos dedomínio variável de cadeia leve contemplados aqui compreendem umdomínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, também compreendemum domínio CL.

8. Criação de Função Efetora

Pode ser desejável para modificar o anticorpo da invenção comrespeito à função efetora, por exemplo, para intensificar citotoxicidademediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou citotoxicidadedependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser alcançadointroduzindo uma ou mais substituições de aminoácido em uma região de Fcdo anticorpo. Alternativa ou adicionalmente, o(s) resíduo(s) de cisteínapode(m) ser introduzido(s) na região de Fc, assim permitindo formação deligação de dissulfeto de intercadeia nesta região. O anticorpo homodiméricodesse modo gerado pode ter capacidade de internalização melhorada e/oumorte celular mediada por complemento e citotoxicidade celular dependentede anticorpo (ADCC) aumentadas. Vide Caron et al, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorposhomodiméricos com atividade de antitumor intensificada podem também serpreparados usando reticulador heterobifuncional como descrito em Wolff etal. Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpopode ser criado tendo regiões de Fc duais e pode assim ter capacidades delise de complemento e de ADCC intensificadas. Vide Stevenson et al., Anti-Cancer Drugs Design 3:219-230 (1989). Para aumentar a meia-vida doanticorpo em soro, pode-se incorporar um epítopo de ligação de receptor derecuperação no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) comodescrito na patente U. S. 5.739.277, por exemplo. Como aqui usado, o termo"epítopo de ligação de receptor de recuperação" refere-se a um epítopo daregião de Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, oulgG4) que é responsável para aumentar a meia-vida em soro in vivo damolécula de IgG.

9. Imunoconiuqados

A invenção também refere-se aos imunoconjugadoscompreendendo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico como umagente quimioterapêutico, um agente inibidor de crescimento, uma toxina(por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana,fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos desta), ou um isótopo radioativo(isto é, um radioconjugado). Agentes quimioterapêuticos úteis na geração detais imunoconjugados foram descritos acima.

Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podemser usadas incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não-ligantes detoxina de difteria, cadeia de exotoxina A (Pseudomonas aeruginosa), cadeiade ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina,proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacaamericana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantiae, curcina,crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina,fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeosestá disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplosincluem 212Bi, 1311, 131 In, 90Y, e 186Re. Conjugados do anticorpo e agentecitotóxico são feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento deproteína bifuncionais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)(SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (como HCIde dimetil adipimidato), ésteres ativos (como suberato de dissuccinimidila),aldeídos (como glutaraldeído), compostos de bis-azido (como bis (p-azidobenzoíla) hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniombenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (como tolieno 2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativos (como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode serpreparada como descrita em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Ácidotriaminopentaacético de 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno rotulado cmocarbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para conjugação deradionucleotídeo para o anticorpo. Vide W094/11026.

Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de moléculamenores, como acaliqueamicina, maitansinóides, um tricoteno e CC1065, eos derivados destas toxinas tendo atividade de toxina, são tambémcontemplados aqui.

Maitansina e Maitansinóides

Em uma modalidade preferida, um anticorpo de anti-TAT(comprimento total ou fragmentos) da invenção é conjugado com uma oumais moléculas de maitansinóide.

Maitansinóides são inibidores mitotóticos que agem inibindo apolimerização de tubulina. Maitansina foi primeiro isolada do arbusto africanooriental Maytenus serrata (patente U. S. N9 3.896.111). Subseqüentemente,foi descoberto que certos micróbios também produzem maitansinóides,como maitansinol e C-3 ésteres de maitansinol (Patente U. S. N9 4.151.042).Maitansinol sintético e derivados e análogos destes são descritos, porexemplo, na patente U. S. N9S 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608;4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428;4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650;4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533, as revelações dasquais são incorporadas por este meio expressamente por referência.

Conjugados de Anticorpo Maitansinóide

Em uma tentativa para melhorar seu índice terapêutico,maitansina e maitansinóides foram conjugados com anticorpos queespecificamente ligam a antígenos de célula tumoral. Imunoconjugadoscontendo maitansinóides e seu uso terapêutico são descritos, por exemplo,na patente U. S. NQS 5.208.020, 5.416.064 e Patente européia EP 0 425235B1, as revelações das quais são incorporadas por este meio expressamentepor referência. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 8618-8623 (1996)descreveu imunoconjugados compreendendo um maitansinóide designadoDM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 direcionado contra câncercolorretal humano. O conjugado foi descoberto ser altamente citotóxico paracélulas de câncer de cólon cultivadas, e mostrou atividade de antitumor emum ensaio de crescimento de tumor in vivo. Chari et al., Câncer REsearch52:127-131 (1992) descreve imunoconjugados em que um maitansinóide foiconjugado por meio de um ligante de dissulfeto para o anticorpo murino A7que liga a um antígeno em linhagens celulares de câncer de cólon humano,ou para outro anticorpo monoclonal murino TA.1 que liga o oncogene deHER—2/neu. A citotoxicidade do conjugado de TA.1-maitansonóide foitestada in vitro na linhagem celular de câncer de mama humana SK-BR-3que expressa 3 x 105 antígenos de superfície de HER-2 por célula. Oconjugado de fármaco alcançou um grau de citotoxicidade similar aofármaco de maitansinóide livre que poderia ser aumentado aumentando onúmero de moléculas de maitansinóide por molécula de anticorpo.O conjugado de A7-maitansinóide mostrou baixa citotoxicidade sistêmica emcamundongos.

Conjugados de Anticorpo-Maitansinóide de Polipeptídeo de anti-TAT(Imunoconjugados)

Conjugados de anticorpo-maitansinóide de anti-TAT sãopreparados quimicamente ligando um anticorpo de anti-TAT a uma moléculade maitansinóide sem significativamente diminuir a atividade biológica doanticorpo ou da molécula de maitansinóide. Uma média de 3-4 moléculas demaitansinóide conjugado por molécula de anticorpo mostrou eficácia emintensificar a citotoxicidade de células alvo sem negativamente afetar afunção ou solubilidade do anticorpo, embora até mesmo uma molécula detoxina/anticorpo seria esperado intensificar a citotoxicidade no uso deanticorpo sem proteção. Maitansinóides são bem conhecidos na técnica epodem ser sintetizados através de técnicas conhecidas ou isolados de fontesnaturais. Maitansinóides adequados são descritos, por exemplo, na patenteU. S. N9 5.208.020 e nas outras patentes e publicações de não-patentereferidas mais aqui. Maitansinóides preferidos são maitansinol e análogos demaitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições damolécula de maitansinol, como vários ésteres de maitansinol.

Há muitos grupos de ligação conhecidos na técnica para fazerconjugados de anticorpo-maitansinóide, incluindo, por exemplo, aquelesdescritos na patente U. S. N- 5.208.020 ou Patente EP 0425 235 BI, e Chariet al., Câncer Research 52:127-131 (1992). Os grupos de ligação incluemgrupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos ácidos lábeis, grupos fotolábil,grupos peptidase lábeis, ou grupos esterase lábeis, como descritos naspatentes acima identificadas, grupos dissulfeto e tioéter sendo preferidos.

Os conjugados do anticorpo e maitansinóide podem ser feitosusando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionaiscomo N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) cicloexano-1-carboxilato, iminotiolano (ISTO), derivadosbifuncionais de imidoésteres (como HCL de adipimidato de dimetila), ésteresativos (como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (como glutaraldeído),compostos de bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina),derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina),diisocianatos (como 2,6-diisocianato de tolueno), e compostos de flúorbisativos (como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Agentes de acoplamentoparticularmente preferidos incluem N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato(SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para prover uma ligação de dissulfeto.

O ligante pode ser ligado à molécula de maitansinóide em váriasposições, dependendo do tipo da ligação. Por exemplo, uma ligação de ésterpode ser formada através de reação com um grupo hidroxila usandotécnicas de acoplamento convencionais. A reação pode ocorrer na posiçãoC-3 que tem um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada comhidroximetila, na posição C-15 modificado com um grupo hidroxila, e naposição C-20 que tem um grupo hidroxila. Em uma modalidade preferida, aligação é formada na posição C-3 do maitansinol ou um análogo demaitansinol.

Caliqueamicina

Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpode anti-TAT conjugado com uma ou mais moléculas de caliqueamicina.A família de antibióticos caliqueamicina é capaz de produzir a quebra deDNA bifilamentar em concentrações subpicomolar. Para a preparação deconjugados da família de caliqueamicina, vide patentes U. S. 5.712.374,5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001,5.877.296 (todas de Americn Cyanamid Company). Análogos estruturais decaliqueamicina que pode ser usados incluem, mas não são limitados a, Yi1.a2\ a3', N-acetil-Yi1, PSAG e 0i' (Hinman et al., Câncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Câncer Research 58:2925-2928 (1998) e a patenteU. S. acima mencinada para American Cyanamid). Outro fármaco deantitumor que o anticorpo pode ser conjugado é QFA que é um antifolato.Caliqueamicina e QFA têm sítios intracelulares de ação e não cruzam amembrana plasmática facilmente. Portanto, absorção celular destes agentesatravés de internalização mediada por anticorpo grandemente intensificaseus efeitos citotóxicos.

Outros Agentes Citotóxicos

Outros agentes de antitumor que podem ser conjugado com osanticorpos de anti-TAT da invenção incluem BCNU, estreptozoicina,vincristina e 5-fluorouracila, a família de agentes conhecidos coletivamentecomo complexo de LL-E33288 descrito na patente U. S. 5.053.394,5.770.710, como também esperamicinas (patente U. S. 5.877.296).

Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podemser usadas incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não-ligantes detoxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa),cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina,proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacaamericana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina,crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina,fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide, por exemplo, WO 93/21232publicado em 28 de outubro de 1993.

A presente invenção também contempla um imunoconjugadoformado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (porexemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease como umadesoxirribonuclease; DNase).

Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo podecompreender um átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótoposradioativos está disponível para a produção de anticorpos de anti-TATradioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, i125, Y90, Re186, Re188, Sm153,Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado for usadopara diagnose, ele pode compreender um átomo radioativo para estudoscintigráficos, por exemplo tc99m ou I123, ou uma marcação de giro paraimageamento de ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecidocomo imageamento de ressonância magnética, mri), como iodo-123novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17,gadolínio, manganês ou ferro.

O rádio ou outros rótulos podem ser incorporados no conjugadode modos conhecido. Por exemplo, o peptídeo pode ser biossintetizado ousintetizado através de síntese química de aminoacido usando precursoresde aminoacido adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 no lugar dehidrogênio. Rótulos como tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111 por meio de umresíduo de cisteína no peptídeo. ítrio-90 pode ser ligado por meio de umresíduo de lisina. O método de IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem.Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser usado para incorporar iodo-123."Monoclonal Antibodies in Immunoscitigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)descreve outros métodos em detalhes.

Conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser feitosusando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionaiscomo N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) cicloexano-1-carboxilato, iminotiolano (ISTO), derivadosbifuncionais de imidoésteres (como HCI de adipimidato de dimetila), ésteresativos (como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (como glutaraldeído),compostos de bis-azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), deriva-dos de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocia-natos (como 2,6-diisocianato de tolieno), e compostos de flúor bis-ativos(como l,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina dericina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science 238:1098(1987). Ácido de 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminapentaacéticorotulado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar paraconjugação de radionucleotídeo para o anticorpo. Vide W094/11026. Oligante pode ser um "ligante clivável" facilitando a liberação do fármacocitotóxico na célula. Por exemplo, um ligante lábil de ácido, ligante sensível apeptidase, ligante fotolábil, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto(Chari et al., Câncer Research 52:127-131 (1992); patente U. S. Ne5.208.020) podem ser usados.

Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo oanticorpo de anti-TAT e agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, portécnicas recombinantes ou síntese de peptídeo. O comprimento de DNApode compreender as respectivas regiões que codificam as duas porções doconjugado ou adjacentes um ao outro ou separados por uma região quecodifica um peptídeo de ligante que não destrói as propriedades desejadasdo conjugado.

Em ainda outra modalidade, o anticorpo pode ser conjugado comum "receptor" (como estreptavidina) para utilização em pré-alvejamento dotumor em que o conjugado de anticorpo-receptor é administrado ao paciente,seguido por remoção de conjugado não-ligado da circulação usando umagente de limpeza e depois administração de um "ligando" (por exemplo,avidina) que é conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, umradionucleotídeo).

10. Imunolipossomas

Os anticorpos de anti-TAT descritos aqui podem também serformulados como imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma vesículapequena composta de vários tipos de lipídios, fosfolipídeos e/ou tensoativoque é útil para liberação de um fármaco a um mamífero. Os componentes dolipossoma são comumente dispostos em uma formação de bicamada, similarao arranjo de lipídio das membranas biológicas. Lipossomas contendo oanticorpo são preparados por métodos conhecidos na técnica, comodescritos em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688 (1985);Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 77:4030 (1980); Pat. U. S. N834.485.045 e 4.544.545; e W097/38731 publicado em 23 de outubro de 1997.Lipossomas com tempo de circulação intensificado são descritos na patenteU. S. N9 5.013.556.

Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelométodo de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídiocompreendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolaminaderivatizada de PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrusados através defiltros de tamanho de poro definido para render lipossomas com o diâmetrodesejado. Os fragmentos de Fab do anticorpo da presente invenção podemser conjugado com os lipossomas como descrito em Martin et al., J. Biol.Chem. 257:286-288 (1982) por meio de uma reação de intercâmbio dedissulfeto. Um agente quimioterapêutico é opcionalmente contido dentro dolipossoma. Vide Gabizon et al., J. Câncer National Inst. 81(19):1484 (1989).

B. Oligopeptídeos de Ligação de TAT

Oligopeptídeos de ligação de TAT da presente invenção sãooligopeptídeos que ligam, de preferência especificamente, a um polipeptídeode TAT como descrito aqui. Oligopeptídeos de ligação de TAT podem serquimicamente sintetizados usando metodologia de síntese de oligopeptídeoconhecida ou podem ser preparados e purificados usando tecnologiarecombinante. Oligopeptídeos de ligação de TAT usualmente são pelomenos cerca de 5 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelomenos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82,83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100aminoácidos em comprimento ou mais, em que tais oligopeptídeos sãocapazes de ligar, de preferência especificamente, a um polipeptídeo de TATcomo descrito aqui. Oligopeptídeos de ligação de TAT pode ser identificadossem experimentação imprópria usando técnicas bem conhecidas. Nestaconsideração, é observado que técnicas para triar bibliotecas deoligopeptídeo para oligopeptídeos que são capazes de especificamente ligara um alvo de polipeptídeo são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo,Patente U. S. NQS 5.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409,5.403.484, 5.571.689, 5.663.143; Publicação do PCT NeS WO 84/03506 eWO84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 81:3998-4002(1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 82:178-182 (1985);Geysen et al., em Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysenet al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol.,140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA,87:6378; Lowman, H. B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T.et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol.,222:581; Kang, A. S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:8363, eSmith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).

Nesta consideração, apresentação de bacteriófago (fago) é umatécnica bem conhecida que permite triar-se bibliotecas de oligopeptídeograndes para identificar membro(s) daquelas bibliotecas que são capazes deespecificamente ligar a um alvo de polipeptídeo. Apresentação de fago éuma técnica pela qual polipeptídeos variantes são apresentados comoproteínas de fusão para a proteína de revestimento na superfície daspartículas de bacteriófago (Scott, J. K. e Smith, G. P. (1990) Science 249:386). A utilidade da apresentação de fago fica no fato que as bibliotecasgrandes de variantes de proteína seletivamente randomizados (oufortuitamente cDNAs clonados) pode ser rápida e eficazmente classificadaspara aquelas seqüências que ligam a uma molécula alvo com afinidade alta.Apresentação de bibliotecas de peptídeo (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 87:6378) ou de proteína (Lowman, H. B. et al. (1991)Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J.D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A. S. et al. (1991) Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 88:8363) em fago foram usadas para triar milhões depolipeptídeos ou oligopeptídeos para as com propriedades de ligaçãoespecíficas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).Classificação de bibliotecas de fago de mutantes aleatórios requer umaestratégia para construir e propagar um número grande de variantes, umprocedimento para purificação de afinidade usando o receptor alvo, e ummeio de avaliar os resultados dos enriquecimentos de ligação. Patente U. S.Nes 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689 e 5.663.143.

Embora a maioria dos métodos de apresentação de fago usoufago filamentoso, sistemas de apresentação de fago lambdóide (WO9734683; U.S. 5.627.024), sistemas de apresentação de fago de T4 (Ren etal., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Câncer Research, 58(15): 3209-3214(1998); Jiang et al., Infecction & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren etal., Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sei., 5: 1833 (1996);Efimovetal., Virus Genes, 10: 173 (1995)) e sistema de apresentação defago de 17 (Smith e Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); U.S. 5.766.905) são também conhecidos.

Muitas outras melhorias e variações do conceito básico deapresentação de fato foram agora desenvolvidas. Estas melhoriasintensificam a habilidade dos sistemas de apresentação para triar bibliotecasde peptídeo para ligar às moléculas alvos selecionadas e apresentarproteínas funcionais com o potencial de triar estas proteínas parapropriedades desejadas. Dispositivos de reação combinatória foramdesenvolvidos para reações de apresentação de fago (WO 98/14277) ebibliotecas de apresentação de fago foram usadas para analisar e controlarinterações bimoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) e propriedades depeptídeos helicoidais restrigidos (WO 98/20036). WO 97/35196 descreve ummétodo de isolar um ligando de afinidade em que uma biblioteca deapresentação de fago é contatada com uma solução em que o ligando ligaráa uma molécula alvo e uma segunda solução em que o ligando de afinidadenão ligará à molécula alvo, para seletivamente isolar os ligandos de ligação.WO 97/46251 descreve um método de ciclo de seleção de uma biblioteca deapresentação de fago aleatória,com um anticorpo de afinidade purificado edepois isolando o fago de ligação, seguido por um processo de micro-ciclosde seleção usando cavidades de microplaca para isolar o fago de ligação deafinidade alta. O uso de proteína A de Staphyloccocus aureus como umrótulo de afinidade foi também relatado (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9; 187).WO 97/47314 descreve o uso de bibliotecas de subtração de substrato paradistinguir especificidades da enzima usando uma biblioteca combinatória quepode ser uma biblioteca de apresentação de fago.

Um método para selecionar enzimas adequadas para o uso emdetergentes usando apresentação de fago é descrito em WO 97/09446.Métodos adicionais de selecionar proteínas de ligação específicas sãodescritos na patente U. S. NeS 5.498.538, 5.432.018, e WO 98/15833.

Métodos de gerar bibliotecas de peptídeo e triar estas bibliotecassão também descritos na patente U. S. NeS 5.723.286, 5.432.018, 5.580.717,5.427.908, 5.498.530, 5.770.434, 5.734.018, 5.698.426, 5.763.192, e 5.723.323.

C. Moléculas Orgânicas de Ligação de TAT

Moléculas orgânicas de ligação de TAT são moléculas orgânicasdiferentes de oligopeptídeos ou anticorpos como definidos aqui que ligam,de preferência especificamente, a um polipeptídeo de TAT como descritoaqui. Moléculas orgânicas de ligação de TAT podem ser identificadas equimicamente sintetizadas usando metodologia conhecida (vide, porexemplo, Publicação do PCT N9S WO00/00823 e WOOO/39585). Moléculasorgânicas de ligação de TAT usualmente são menos que cerca de 2000dáltons em tamanho, alternativamente menos que cerca de 1500, 750, 500,250 ou 200 dáltons em tamanho, em que tais moléculas orgânicas que sãocapazes de ligar, de preferência especificamente, a um polipeptídeo de TATcomo descrito aqui podem ser identificadas sem experimentação imprópriausando técnicas bem conhecidas. Nesta consideração, é observado quetécnicas para triar bibliotecas de moléculas orgânicas para moléculas quesão capazes de ligar a um alvo de polipeptídeo são bem conhecidas natécnica (vide, por exemplo, Publicação do PCT N05 WO00/00823 eWOOO/39585). Moléculas orgânicas de ligação de TAT podem ser, porexemplo, aldeídos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas,carbazidas, aminas primárias, aminas secundárias, aminas terciárias,hidrazinas N-substituídas, hidrazidas, alcoóis, éteres, tióis, tioéteres,dissulfetos, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, uréias, carbamatos,carbonatos, cetais, tiocetais, acetais, tioacetais, haletos de arila, sulfonatosde arila, haletos de alquila, sulfonatos de alquila, compostos aromáticos,compostos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alquinos, dióis, amino alcoóis,oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas,epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloreto de sulfonila, compostos de diazo,cloreto de ácido, ou outros.

d. Triando para Anticorpos de anti-TAT, Oliqopeptídeos de Ligação de TAT eMoléculas Orgânicas de Ligação de TAT com as Propriedades Desejadas

Técnicas para gerar anticorpos, oligopeptídeos e moléculasorgânicas que ligam aos polipeptídeos de TAT foram descritas acima. Pode-se também selecionar anticorpos, oligopeptídeos ou outras moléculasorgânicas com certas características biológicas, como desejado.

Os efeitos inibidores de crescimento de um anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica da invenção podem seravaliados por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando célulasque expressam para um polipeptídeo de TAT endogenamente ou seguindotransfecçao com o gene TAT. Por exemplo, linhagens de células tumoraisapropriadas e células transíeccionadas de TAT podem tratadas com umanticorpo monoclonal de anti-TAT, oligopeptídeo ou outra molécula orgânicada invenção em várias concentrações durante alguns dias (por exemplo, 2-7)dias e tingidas com violeta cristal ou MTT ou analisadas por algum outroensaio colorimétrico. Outro método de medir proliferação seria comparar aabsorção de 3H-timidina pelas células tratadas na presença ou ausência deum anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT ou moléculaorgânica de ligação de TAT da invenção. Após tratamento, as células sãocolhidas e a quantidade de radioatividade incorporada no DNA quantificadaem um contador de cintilação. Controles positivos apropriados incluemtratamento de uma linhagem celular selecionada com um anticorpo inibidorde crescimento conhecido inibir crescimento daquela linhagem celular.Inibição do crescimento das células tumorais in vivo pode ser determinadade vários modos conhecidos na técnica. Preferivelmente, a célula tumoral éuma que sobreexpressa um polipeptídeo de TAT. Preferivelmente, oanticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT ou moléculaorgânica de ligação de TAT inibirá proliferação de célula de uma célulatumoral de expressão de TAT in vitro ou in vivo em cerca de 25-100%comparado à célula tumoral sem tratar, mais preferivelmente, em cerca de30-100%, e até mesmo mais preferivelmente em cerca de 50-100% ou 70-100%, em uma modalidade, em uma concentração de anticorpo de cerca de0,5 a 30 ug/ml. Inibição de crescimento pode ser medida a umaconcentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 ug/ml ou cerca de 0,5 nM a200 nM em cultura de célula onde a inibição de crescimento é determinada1-10 dias após exposição das células tumorais ao anticorpo. O anticorpo éinibidor de crescimento in vivo se a administração do anticorpo de anti-TAT acerca de 1 ug/kg a cerca de 100 mg/kg peso do corpo resultar em reduçãono tamanho do tumor ou redução da proliferação de células tumorais dentrode cerca de 5 dias a 3 meses da primeira administração do anticorpo,preferivelmente dentro de cerca de 5 a 30 dias.

Para selecionar um anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo deligação de TAT ou molécula orgânica de ligação de TAT que induz morte decélula, perda de integridade da membrana como indicado, por exemplo, poriodeto de propídio (PI), azul tripano ou absorção de 7AAD pode ser avaliadacom relação ao controle. Um ensaio de absorção de PI pode ser executadona ausência de complemento e células efetoras imunes. Células tumorais deexpressão de polipeptídeo de TAT são incubadas sozinhas com meio oumeio contendo o anticorpo de anti-TAT apropriado (por exemplo, a cerca de10 ug/ml), oligopeptídeo de ligação de TAT ou molécula orgânica de ligaçãode TAT. As células são incubadas durante um período de tempo de 3 dias.Seguindo cada tratamento, as células são lavadas e aliquotadas em 35 mmde tubos de 12 x 75 revestidos com coador (1 ml por tubo, 3 tubos por grupode tratamento) para remoção das aglomerações de célula. Os tubos depoisrecebem PI (10 ug/ml). As amostras podem ser analisadas usando umcitômetro de fluxo FACSCAN® e software de FACSCONVERT® CelIQuest(Becton Dickinson). Aqueles anticorpos de anti-TAT, oligopeptídeos deligação de TAT ou moléculas orgânicas de ligação de TAT induzem níveisestatisticamente significativos de morte celular determinada por absorção dePI podem ser selecionados como anticorpos de anti-TAT, oligopeptídeos deligação de TAT ou moléculas orgânicas de ligação de TAT indutores demorte celular.

Para triar para anticorpos, oligopeptídeos ou outras moléculasorgânicas que ligam a um epítopo em um polipeptídeo de TAT ligado por umanticorpo de interesse, um ensaio de bloqueio cruzado rotineiro como aqueledescritos em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser executado. Esteensaio pode ser usado para determinar se um anticorpo de teste,oligopeptídeo ou outra molécula orgânica liga o mesmo sítio ou epítopocomo um anticorpo de anti-TAT conhecido. Como alternativa, ouadicionalmente, mapeamento de epítopo pode ser executado por métodosconhecidos na técnica. Por exemplo, a seqüência de anticorpo pode sermutageneizada como varredura de alanina, para identificar resíduos decontato. O anticorpo mutante é inicialmente testado para ligar com anticorpopoliclonal para assegurar dobramento apropriado. Em um método diferente,peptídeos que correspondem às regiões diferentes de um polipeptídeo deTAT podem ser usados em ensaios de competição com os anticorpos deteste ou com um anticorpo de teste e um anticorpo com um epítopocaracterizado ou conhecido.

E. Terapia de Pró-fármaco Mediada por Enzima Dependente de Anticorpo(ADEPT)

Os anticorpos da presente invenção podem também ser usadosem ADEPT conjugando o anticorpo com uma enzima de ativação de pró-fármaco que converte um pró-fármaco (por exemplo, um agentequimioterapêutico de peptidila, vide WO81/01145) para um fármaco de anti-câncer ativo. Vide, por exemplo, WO 88/07378 e patente U. S. Ns 4.975.278.

O componente da enzima do imunoconjugado útil para ADEPTinclui qualquer enzima capaz de agir em um pró-fármaco em um tal modo aabrigá-la em sua forma mais ativa, citotóxica.

Enzimas que são úteis no método desta invenção incluem, masnão são limitadas a, fosfatase alcalina útil por conter fosfato para converterpró-fármacos em fármacos livres; arilsulfatase útil por conter sulfato paraconverter pró-fármacos em fármacos livres; citosina desaminase útil paraconverter 5-fluorocitosina não-tóxica no fármaco de anti-câncer, 5-fluorouracila; proteases, como serratia protease, termolisina, subtilisina,carboxipeptidases e catepsinas (como catepsinas B e L), que são úteis porconter peptídeo para converter pró-fármacos em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, útil por converter pró-fármacos contendosubstituintes de D-amino ácido; enzimas de clivagem de carboidrato como 6-galactosidase e neuraminidase úteis por converter pró-fármacos glicosiladosem fármacos livres; B-lactamase útil por converter fármacos derivatizadoscom B-lactamas em fármacos livres; e penicilina amidases, como penicilinaamidase de penicilina V ou G amidase, útil por converter fármacosderivatizados em seu nitrogênio de amina com grupos fenoxiacetila oufenilacetila, respectivamente, em fármacos livres. Alternativamente,anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como"abzimas", podem ser usados para converter os pró-fármacos da invençãoem fármacos ativos livres (vide, por exemplo, Massey, Nature 328 :457-458(1987)). Conjugados de anticorpo-abzima podem ser preparados comodescritos aqui para liberação da abzima para uma população de célulatumoral.

As enzimas desta invenção podem ser covalentemente ligadasaos anticorpos de anti-TAT por técnicas bem conhecidas na técnica como ouso dos reagentes reticuladores heterobifuncionais debatidos acima.Alternativamente, proteínas de fusão compreendendo pelo menos a regiãode ligação de antígeno de um anticorpo da invenção ligado a pelo menosuma porção funcionalmente ativa de uma enzima da invenção podem serconstruídas usando técnicas DNA recombinante bem conhecidas na técnica(vide, por exemplo, Neuberger et al, Nature 312:604-608 (1984).

F. Polipeptídeos de TAT de Comprimento Total

A presente invenção também fornece seqüências de nucleotídeorecentemente identificadas e isoladas que codificam polipeptídeos referidosno presente pedido de patente como polipeptídeos de TAT. Em particular,cDNAs (comprimento parcial e total) codificando vários polipeptídeos de TATforam identificados e isolados, como descrito em mais detalhes nosExemplos abaixo.

Como descrito nos Exemplos abaixo, vários clones de DNAforam depositados com a ATCC. As seqüências de nucleotídeo atuaisdaqueles clones podem ser facilmente determinadas pelo artesão versadopor seqüenciação do clone depositado usando métodos rotineiros na técnica.A seqüência de aminoácido prognosticada pode ser determinada daseqüência de nucleotídeo usando habilidade rotineira. Para os polipeptídeosde TAT e ácidos nucléico de codificação descritos aqui, em alguns casos, osRequerentes identificaram o que é acreditado ser a estrutura de leituramelhor identificável com a informação de seqüência disponível na ocasião.

G. Variantes de Anticorpo de anti-TAT e de Polipetídeo de TAT

Além dos anticorpos de anti-TAT e polipeptídeos de TAT deseqüência nativa de comprimento total descritos aqui, é contemplado que asvariantes de anticorpo de anti-TAT e de polipeptídeo de TAT podem serpreparadas. Variantes de anticorpo de anti-TAT e de polipeptídeo de TATpodem ser preparadas introduzindo alterações de nucleotídeo apropriadasno DNA de codificação, e/ou por síntese do anticorpo ou polipeptídeodesejado. Aqueles versados na técnica apreciarão que alterações deaminoácido podem alterar os processos pós-translacionais do anticorpo deanti-TAT ou polipeptídeo de TAT, como alterar o número ou posição dossítios de glicosilação ou alterar as características de ancoragem demembrana. Variações nos anticorpos de anti-TAT e polipeptídeos de TATdescritos aqui, podem ser feitas, por exemplo, usando quaisquer dastécnicas e diretrizes para as mutações conservadoras e não-conservadorasexpostas, por exemplo, na patente U. S. N9 5.364.934. Variações podem seruma substituição, deleção ou inserção de um ou mais códons que codificamo anticorpo ou polipeptídeo que resultam em uma alteração na seqüência deaminoácido quando comparado com o anticorpo ou polipeptídeo deseqüência nativa. Opcionalmente a variação é através de substituição depelo menos um aminoácido com qualquer outro aminoácido em um ou maisdos domínios do anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT. Orientaçãoem determinar que resíduo de aminoácido pode ser inserido, substituído oudeletado sem adversamente afetar a atividade desejada pode serencontrada comparando a seqüência do anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT com a de moléculas de proteína conhecidas homólogase minimizando o número de alterações de seqüência de aminoácido feitasnas regiões de homologia alta. Substituições de aminoácido podem serresultantes de substituir um aminoácido com outro aminoácido tendopropriedades estruturais e/ou químicas similares, como a substituição deuma leucina com uma serina, isto é, substituições de aminoácidoconservadoras. Inserções ou deleções podem opcionalmente ser na faixa decerca de 1 a 5 aminoacidos. A variação permitida pode ser determinadasistematicamente fazendo inserções, deleções ou substituições deaminoacidos na seqüência e testando as variantes resultantes para atividadeapresentada pela seqüência nativa de comprimento total ou madura.

Fragmentos de anticorpo de anti-TAT e de polipeptídeo de TATsão fornecidos aqui. Tais fragmentos podem ser truncados no término N outérmino C, ou podem carecer de resíduos internos, por exemplo, quandocomparados com um anticorpo ou proteína nativa de comprimento total.Certos fragmentos carecem de resíduos de aminoácido quê não sãoessenciais para uma atividade biológica desejada do anticorpo de anti-TATou polipeptídeo de TAT.

Fragmentos de anticorpo de anti-TAT e de polipeptídeo de TATpodem ser preparados por quaisquer de várias técnicas convencionais.Fragmentos de peptídeo desejados podem ser quimicamente sintetizados.Um método alternativo envolve gerar fragmentos de anticorpo ou depolipeptídeo através de digestão enzimática, por exemplo, tratando aproteína com uma enzima conhecida clivar proteínas em sítios definidosatravés de resíduos de aminoácido particulares, ou digerindo o DNA comenzimas de restrição adequadas e isolar o fragmento desejado. Ainda outratécnica adequada envolve isolar e amplificar um fragmento de DNA quecodifica um anticorpo desejado ou fragmento de polipeptídeo, através dereação em cadeia de polimerase (PCR). Oligonucleotídeos que definem ostérminos desejados do fragmento de DNA são empregados nos iniciadoresde 5' e 3' na PCR. Preferivelmente, fragmentos de anticorpo de anti-TAT ede polipeptídeo de TAT compartilham pelo menos uma atividade biológicae/ou imunológica com o anticorpo de anti-TAT nativo ou polipeptídeo de TATdescritos aqui.

Em modalidades particulares, substituições conservadoras deinteresse são mostradas na Tabela 6 sob o título de substituições preferidas.Se tais substituições resultarem em uma alteração na atividade biológica,então alterações mais substanciais, denominadas substituições exemplaresna Tabela 6, ou como também descritas abaixo em referência às classes deaminoácido, são introduzidas e os produtos triados.Tabela 6

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Modificações substanciais em função ou identidade imunológicado anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT são realizadasselecionando substituições que diferem significativamente em seu efeito emmanter (a) a estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área dasubstituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (b) acarga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o volume dacadeia lateral. Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos combase nas propriedades da cadeia lateral comum:

(1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;(2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr; Asn; Gln

(3) acídicos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Substituições não-conservadoras requererão trocar um membrode uma destas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos tambémpodem ser introduzidos nos sítios de substituição conservadores ou, maispreferivelmente, nos sítios remanescentes (não-conservados).

As variações podem ser feitas usando métodos conhecidos natécnica como mutagênese mediada por oligonucleotídeo (loco-direcionada),varredura de alanina e mutagênese de PCR. Mutagênese loco-direcionada[Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)], mutagênese de cassete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)],mutagênese de seleção de restrição [Wells et al., Philos. Trans. R. Soe.London SerA.317:415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas podem serexecutadas no DNA clonado para produzir o DNA de variante de anticorpode anti-TAT ou de polipeptídeo de TAT.

Análise de varredura de aminoácido pode também serempregada para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de umaseqüência contígua. Entre os aminoácidos de varredura preferidos estãoaminoácidos relativamente pequenos, neutros. Tais aminoácidos incluemalanina, glicina, serina e cisteína. Alanina é tipicamente um aminoácido devarredura preferido entre este grupo porque elimina a cadeia lateral além dobeta-carbono e é menos provável de alterar a conformação principal decadeia da variante [Cunningham e Wells, Science. 244:1081-1085 (1989)].Alanina é também tipicamente preferida porque é o aminoácido mais comum.Também, é freqüentemente encontrada em ambas posições enterradas eexpostas [Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N. Y.); Chothia, J.Mol. Biol., 150:1 (1976)].

Se a substituição de alanina não render quantidades adequadasde variante, um aminoácido isotérico poderá ser usado.Qualquer resíduo de cisteína não envolvido em manter aconformação apropriada do anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TATtambém pode ser substituído, em geral com serina, para melhorar aestabilidade oxidativa da molécula e impedir reticulação aberrante.Inversamente, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) aoanticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT para melhorar suaestabilidade (particularmente onde o anticorpo for um fragmento de anticorpocomo um fragmento de Fv).

Um tipo particularmente preferido de variante substitucionalenvolve substituir um ou mais resíduos da região hipervariável de umanticorpo pai (por exemplo, um anticorpo humanizado ou ser humano). Emgeral, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimentotambém terão propriedades biológicas melhoradas com relação ao anticorpopai do qual elas são geradas. Um modo conveniente para gerar taisvariantes substitucionais envolve maturação de afinidade usandoapresentação de fago. Brevemente, vários sítios de região hipervariável (porexemplo, 6-7 sítios) são mutados para gerar todas possíveis substituições deamino em cada sítio. As variantes de anticorpo desse modo geradas sãoapresentadas em uma maneira monovalente de partículas de fagofilamentosas como fusões para o produto de gene III de M13 empacotadodentro de cada partícula. As variantes apresentadas de fago são depoistríadas por sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) comoaqui descrito. Para identificar sítios de região hipervariável candidatos paramodificação, mutagênese de varredura de alanina pode ser executada paraidentificar resíduos de região hipervariável que contribuem significativamentepara ligar ao antígeno. Como alternativa, ou adicionalmente, pode serbenéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo de antígeno-anticorpopara identificar pontos de contato entre o anticorpo e polipeptídeo de TAThumano. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são os candidatospara substituição de acordo com as técnicas elaboradas aqui. Uma vez taisvariantes são geradas, o painel de variantes é submetido à triagem comodescrito aqui e anticorpos podem ser selecionados com propriedadessuperiores em um ou mais ensaios relevantes para mais desenvolvimento.

Moléculas de ácido nucléico que codificam variantes deseqüência de aminoácido do anticorpo de anti-TAT são preparadas por umavariedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, masnão são limitados, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes deseqüência de aminoácido de ocorrência natural) ou preparação através demutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou loco-direcionada),mutagênese de PCR, e mutagênese de cassete de uma variante preparadamais prematura ou uma versão de não-variante do anticorpo de anti-TAT.

H. Modificações de Anticorpos de anti-TAT e Polipeptídeos de TAT

Modificações covalentes de anticorpos de anti-TAT epolipeptídeos de TAT. estão incluídas dentro do escopo desta invenção. Umtipo de modificação covalentê inclui reagir resíduos de aminoácido alvejadosde um anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT com um agentederivatizante orgânico que é capaz de reagir com cadeias lateraisselecionadas ou os resíduos N ou C terminais do anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT. Derivatização com agentes bifuncionais é útil, porexemplo, para reticular anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT parauma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água para uso no métodopara purificar anticorpos de anti-TAT, e vice-versa. Agentes reticulantescomumente usados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ésteres comácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres dedissuccinimidila como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidasbifuncionais como bis-N-maleimido-1,8-octano e agentes como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Outras modificações incluem desamidação de resíduos deglutaminila e de asparaginila para resíduos de glutamila e de aspartilacorrespondentes, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina,fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de serila ou de treonila,metilação dos grupos a-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e dehistidina [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H.Freeman & Co., São Francisco, páginas. 79-86 (1983)], acetilação da aminaN-terminal, e amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal.

Outro tipo de modificação covalente do anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT incluso dentro do escopo desta invenção compreendealterar o padrão de glicosilação nativo do anticorpo ou polipeptídeo.

"Alterar o padrão de glicosilação nativo" é intencionado aqui parapropósitos significarem excluir uma ou mais porções de carboidratoencontradas no anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT de seqüêncianativa (ou remover o sítio de glicosilação subjacente ou excluir a glicosilaçãopor meios químicos e/ou enzimáticos), e/ou adicionar um ou mais sítios deglicosilação que não estão presentes no anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT de seqüência nativa. Além disso, a frase incluialterações qualitativas na glicosilação das proteínas nativas, envolvendouma alteração na natureza e proporções das várias porções de carboidratopresentes.

Glicosilação de anticorpos e outros polipeptídeos é tipicamenteN-ligada ou O-ligada. N-ligado refere-se à ligação da porção de carboidrato àcadeia lateral de um resíduo de asparagina. A asparagina-X-serina dasseqüências de tripeptídeo e asparagina-X-treonina onde X é qualqueraminoácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento paraligação enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina.Desse modo, a presença de qualquer uma destas seqüências de tripeptídeoem um polipeptídeo criou um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina,galactose, ou xilose a um hidroxiamino ácido, comumente serina ou treonina,embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser usadas.Adição de sítios de glicosilação ao anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo deTAT é convenientemente realizada alterando a seqüência de aminoácido demodo que ela contenha uma ou mais das seqüências de tripeptídeo acimadescritas (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode tambémser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serinaou de treonina para a seqüência do anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo deTAT original (para sítios de glicosilação O-ligados). A seqüência deaminoácido de anticorpo de anti-TAT ou de polipeptídeo de TAT podeopcionalmente ser alterada através de alterações no nível de DNA,particularmente mutando o DNA que codifica o anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT nas bases pré-selecionadas de modo que os códonssão gerados que transladarão nos aminoácidos desejados.

Outros meios de aumentar o número de porções de carboidratono anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT é por acoplamento químicoou enzimático dos glicosídeos ao polipeptídeo. Tais métodos são descritosna técnica, por exemplo, em WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de1987, e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306 (1981).

Remoção das porções de carboidrato presentes no anticorpo deanti-TAT ou polipeptídeo de TAT pode ser realizada química ouenzimaticamente ou por substituição mutacional dos códons que codificampara resíduos de aminoácido que servem como alvos para glicosilação.Técnicas de desglicosilação química são conhecidas na técnica e descritas,por exemplo, por Hakimuddin, et al., Are. Biochem. Biophys. 259:52 (1987) eatravés de Borda et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). Clivagemenzimática das porções de carboidrato em polipeptídeos pode ser alcançadapelo uso de uma variedade de endo- e exo-glicosidases como descrito porThotakura et al., Meth. Enzvmol. 138:350 (1987).

Outro tipo de modificação covalente de anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT compreende ligar o anticorpo ou polipeptídeo a um deuma variedade de polímeros não-proteináceos, por exemplo, polietilenoglicol (PEG), polipropileno glicol ou polioxialquilenos, da maneira exposta napatente U. S. NgS 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou4.179.337. O anticorpo ou polipeptídeo também pode ser atraído emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de co-acervação ou através de polimerização interfacial (por exemplo,microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas depoli(metilmetacrilato), respectivamente), em sistemas de liberação defármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina,microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões.Tais técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ãedição, Oslo, A. Ed., (1980).

O anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT da presenteinvenção pode também ser modificado de certo modo para formar moléculasquiméricas compreendendo um anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo deTAT fundido com o outro, polipeptídeo heterólogo ou seqüência deaminoácido.

Em uma modalidade, tal molécula quimérica compreende umafusão do anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT com um polipeptídeorótulo que fornece um epítopo ao qual um anticorpo anti-rótulo podeseletivamente ligar. O rótulo de epítopo é em geral colocado no términoamino ou carboxila do anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT. Apresença de tais formas rotuladas com epítopo do anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT pode ser detectada usando um anticorpo contra opolipeptídeo rótulo. Também, fornecimento do rótulo de epítopo permite oanticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT ser purificado facilmenteatravés de purificação de afinidade usando um anticorpo anti-rótulo ou outrotipo de matriz de afinidade que liga ao rótulo de epítopo. Váriospolipeptídeos rótulos e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos natécnica. Exemplos incluem rótulos de poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); a polipeptídeo rótulo de influenza HA e seu anticorpo12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; o rótulo de c-myc eos anticorpos de 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 para este [Evan et al.,Molecular and Celullar Biology, 5:3610-3616 (1985)]; e o rótulo, daglicoproteína de vírus do herpes simples D (gD) e seu anticorpo [Paborsky etal., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Outros polipeptídeos de rótuloincluem o peptídeo Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; opeptídeo de epítopo KT3 [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; umpeptídeo de epítopo de a-tubulina [Skinner et al, J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; e o rótulo de peptídeo de proteína 10 do gene T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6393-6397 (1990)].Em uma modalidade alternativa, a molécula quimérica podecompreender uma fusão do anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TATcom uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina.Para uma forma bivalente da molécula quimérica (também referida como um"imunoadesina"), um tal fusão poderia ser à região de Fc de uma moléculade IgG. As fusões de Ig preferivelmente incluem a substituição de uma formasolúvel (domínio de transmembrana deletado ou inativado) de um anticorpode anti-TAT ou polipeptídeo de TAT no lugar de pelo menos uma regiãovariável dentro de uma molécula de Ig. Em uma modalidade particularmentepreferida, a fusão de imunoglobulina inclui a dobradiça, Ch2 e Ch3, ou adobradiça, CH1, CH2 e regiões de CH3 de uma molécula de lgG1. Para aprodução de fusões de imunoglobulina vide também patente US Ne5.428.130 emitida em 27 de junho de 1995.

I. Preparação de Anticorpos de anti-TAT e Polipeptídeos de TAT

A descrição abaixo refere-se primariamente à produção deanticorpos de anti-TAT e polipeptídeos de TAT cultivando célulastransformadas ou transfeccionadas com um vetor contendo ácido nucléicode codificação de anticorpo de anti-TAT e polipeptídeo de TAT. É, claro,contemplado que métodos alternativos que são bem conhecidos na técnicapodem ser empregados para preparar anticorpos de anti-TAT epolipeptídeos de TAT. Por exemplo, a seqüência de aminoácido apropriada,ou porções desta, pode ser produzida através de síntese de peptídeo diretausando técnicas de fase sólida [vide, por exemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., São Francisco, CA (1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soe, 85:2149-2154 (1963)]. Síntese de proteína invitro pode ser executada usando técnicas manuais ou por automatização.Por exemplo, síntese automatizada pode ser realizada usando umSintetizador de Peptídeo de Applied Biosystems (Foster City, CA) usando asinstruções do fabricante. Várias porções do anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT podem ser quimicamente sintetizadas separadamente epodem ser combinadas usando métodos químicos ou enzimáticos paraproduzir o anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT desejado.1. Isolamento de DNA Codificando Anticorpo de anti-TAT ou Polipeptídeo deTAT

DNA que codifica anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TATpode ser obtido de uma biblioteca de cDNA preparada de tecido acreditadapossuir o mRNA de anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT eexpressá-lo a um nível detectável. Conseqüentemente, DNA de anticorpo deanti-TAT ou polipeptídeo de TAT humano pode ser convenientemente obtidode uma biblioteca de cDNA preparada de tecido humano. O gene decodificação do anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT pode tambémser obtido de uma biblioteca genômica ou através de procedimentossintéticos conhecidos (por exemplo, síntese de ácido nucléico automatizada).

Bibliotecas podem ser tríadas com sondas (comooligonucleotídeos de pelo menos cerca de 20-80 bases) projetadas paraidentificar o gene de interesse ou a proteína codificada por ele. Triagem docDNA ou biblioteca genômica com a sonda selecionada pode ser conduzidausando procedimentos padrões, como descritos em Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nova Iorque: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989). Um meio alternativo para isolar o gene que codificaanticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT é usar metodologia de PCR[Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A LaboratoryManual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Técnicas para triar uma biblioteca de cDNA são bem conhecidasna técnica. As seqüências de oligonucleotídeo selecionadas como sondasdeveriam ser de comprimento suficiente e suficientemente desambíguas quefalsos positivos são minimizados. O oligonucleotídeo é preferivelmenterotulado de modo que ele pode ser detectado na hibridização para DNA nabiblioteca sendo triada. Métodos de marcação são bem conhecidos natécnica, e incluem o uso de radiomarcações como ATP 32P-rotulado,biotinilação ou marcação de enzima. Condições de hibridização, incluindoseveridade moderada e severidade alta, são fornecidas em Sambrook et al., supra.

As seqüências identificadas em tal biblioteca podem ser-comparadas aos métodos de triagem e podem ser alinhadas com outrasseqüências conhecidas depositadas e disponíveis nas bases de dadospúblicas como GenBank ou outras bases de dados de seqüência privadas.Identidade de seqüência (no nível de aminoácido ou de nucleotídeo) dentrodas regiões definidas da molécula ou ao longo da seqüência decomprimento total pode ser determinada usando métodos conhecidos natécnica e como descritos aqui Ácido nucléico tendo seqüência decodificação de proteína pode ser obtido triando cDNA selecionado oubibliotecas genômicas usando a seqüência de aminoácido deduzida descritaaqui pela primeira vez, e, se necessário, usando procedimentos de extensãode iniciador convencionais como descritos em Sambrook et al., supra, paradetectar precursores e processar intermediários de mRNA que podem nãoter sido do contrário transcritos no cDNA.

2. Seleção e Transformação de Células Hospedeiras

Células hospedeiras são transfeccionadas ou transformadascom vetores de expressão ou de clonagem descritos aqui para produção deanticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT e cultivadas em meiosnutrientes convencionais modificados quando apropriado para induzirpromotores, selecionar transformante ou amplificar os genes que codificamas seqüências desejadas. As condições de cultura, como meios,temperatura, pH e outros, podem ser selecionadas pelo artesão versadosem experimentação imprópria. Em geral, princípios, protocolos, e técnicaspráticas para maximizar a produtividade das culturas de célula podem serencontrados em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et al., supra.

Métodos de transfecção de célula eucariótica e transformação decélula procariótica são conhecidos ao artesão normalmente versado, porexemplo, CaCI2, CaP04, mediado por lipossoma e eletroporação.Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é executadausando técnicas padrão apropriadas para tais células. O tratamento decálcio empregando cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et al.,supra, ou eletroporação são em geral usados para procariotos. Infecção comAgrobacterium tumefaciens é usada para transformação de certas células deplanta, como descrito por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) e WO 89/05859publicado em 29 de junho de 1989. Para células mamíferas sem taisparedes celulares, o método deprecipitação de fosfato de cálcio de Grahame van der Eb, Virology, 52:456 - 457 (1978) pode ser empregado. Aspectosgerais de transfecções de sistema de célula mamíferas hospedeiras foramdescritos na Patente U. S. Ne 4.399.216. Transformações em levedura sãotipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J.Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 76:3829(1979). Porém, outros métodos para introduzir D NA nas células, comoatravés de microinjeção nuclear, eletroporação, fusão de protoplastobacteriano com células intactas, ou policações, por exemplo, polibreno,poliornitina, podem também ser usados. Para várias técnicas paratransformar células mamíferas, vide Keown et al. Methods in Enzymology,185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Células hospedeiras adequadas para clonar ou expressar o DNAnos vetores aqui incluem células de procarioto, levedura ou de eucariotomais altas. Procariotos adequados incluem mas não são limitados aeubactérias, como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, porexemplo, Enterobacteriaceae como E. coli. Várias cepas de E. coli estãopublicamente disponíveis, como cepa de K12 de E. coli MM294 (ATCC31.446); X1776 de E. coli (ATCC 31.537); cepa de E. coli W3110 (ATCC27.325) e K5 772 (ATCC 53.635). Outras células hospedeiras procarióticasadequadas incluem Enterobacteriaceae como Escherichia, por exemplo, E.coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonela, por exemplo,Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans eShigella, como também Bacilli como B. subtilis e B. licheniformis (porexemplo, 41P de B. licheniformis descrito em DD 266.710 publicada em 12de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa, e Streptomyces. Estesexemplos são ilustrativos ao invés de limitativos. Cepa de W3110 é umhospedeiro particularmente preferido ou hospedeiro pai porque é uma cepahospedeira comum para fermentações de produto de DNA recombinante.Preferivelmente, a célula hospedeira segrega quantidades mínimas deenzimas proteolíticas. Por exemplo, cepa W3110 pode ser modificada pararealizar uma mutação genética nos genes que codificam proteínasendógenas para o hospedeiro, com exemplos de tais hospedeiros incluindocepa de W3110 de E. coli 1A2, que tem o genótipo completo tonA; cepa deW3110 de E. coli 9E4, que tem o genótipo completo tonA ptr3; cepa deW3110 de E. coli 27C7 (ATCC 55.244), que tem o genótipo completotonAptr3phoA E15 (argF-lac)169degP ompT kan'; cepa de W3110 de E. coli37D6, que tem o genótipo completo tonAptr3phoA E15 (argF-lac)169degPompT rbs7 HvG kan'; cepa de W3110 de E. coli 40B4, que é a cepa 37D6com a mutação de deleção de degP resistente à não-canamicina, e umacepa de E coli que tem protease periplásmica mutante descrita na patenteU. S. N- 4.946.783 emitida em 7 de agosto de 1990. Alternativamente,métodos de clonagem in vitro, por exemplo, PCR ou outras reações depolimerase de ácido nucléico, são adequados.

Anticorpo de comprimento total, fragmentos de anticorpo, eproteínas de fusão de anticorpo podem ser produzidos em bactérias, emparticular quando glicosilação e Fc de função efetora não são necessárias,como quando o anticorpo terapêutico é conjugado com um agente citotóxico(por exemplo, uma toxina) e o imunoconjugado mostra eficácia por si só emdestruição de células tumorais. Anticorpos de comprimento total têm maiormeia-vida em circulação. Produção em E. coli é mais rápido e mais eficienteem custo. Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos embactérias, vide, por exemplo, U.S. 5.648.237 (Carter et. al.), U. S. 5.789.199(Joly et al.), e U. S. 5.840.523 (Simmons et al.) que descreve região deiniciação de translação (TIR) e seqüências sinais para otimizar expressão esecreção, estas patentes incorporadas aqui por referência. Após expressão,o anticorpo é isolado da de célula de E. coli pasta em uma fração solúvel epode ser purificado através, por exemplo, de uma coluna de proteína A ou Gdependendo do isótipo. Purificação final pode ser realizada similar aoprocesso para purificar anticorpo expresso por exemplo, em células de CHO.

Além de procariotos, micróbios eucarióticos como fungosfilamentosos ou levedura são hospedeiros adequados de clonagem ouexpressão para vetores de codificação de anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT. Saccharomyces cerevisiae é um microorganismohospedeiro eucariótico inferior comumente usado. Outros incluemSchizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981];EP 139.383 publicada em 2 de maio de 1985); hospedeiros deKluyveromyces (patente U. S. NQ 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology,9:968-975 (1991)) como, por exemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683,CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis(ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178),K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg etal., Bio/Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans e K. marxianus;yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al., J.Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Cândida; Trichoderma reesia (EP244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA.76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces como Schwanniomyces oceidentalis(EP 394.538 publicada em 31 de outubro de 1990); e fungos filamentososcomo, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357publicado em 10 de janeiro de 1991), e hospedeiros de Aspergillus como A.nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.. 112:284-289[1983]; Tilbum et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 81: 1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J..4:475-479 [1985]). Leveduras metilotropicas são adequadas aqui e incluem, masnão são limitadas a, levedura capaz de crescimento em metanol selecionadodos gêneros consistindo em Hansenula, Cândida, Kloeckera, Pichia,Saccharomyces, Torulopsis, e Rhodotorula. Uma lista de espéciesespecíficas que são exemplares desta classe de leveduras pode serencontrada em C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).

Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpode anti-TAT glicosilado ou polipeptídeo de TAT são derivadas de organismosmulticelulares. Exemplos de células invertebradas incluem células de insetocomo Drosophila S2 e Spodoptera Sf9,-como também células de planta,como culturas de célula de algodão, milho, batata, feijão-soja, petúnia,tomate, e tabaco. Numerosas cepas baculovirais e variantes e célulashospedeiras de inseto correspondentes permissivas de hospedeiros comoSpodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus(mosquito), Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas), e Bombyx moriforam identificados. Uma variedade de cepas virais para transfecção estápublicamente disponível, por exemplo, a variante L-1 de Autographacalifornica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem serusados como o vírus aqui de acordo com a presente invenção,particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

Porém, interesse foi maior em células vertebradas, e propagaçãode células vertebradas em cultura (cultura de tecido) se tornou umprocedimento rotineiro. Exemplos de linhagens de células hospedeirasmamíferas úteis são linhagem de CV1 de rim de macaco transformada porSV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (293ou 293 células subclonadas para crescimento em cultura de suspensão,Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê(BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/DHFR (CHO,Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de sertolide camundongo (TM4, Mather. Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células derim de macaco (CV1, ATCC CCL 70); células de rim de macaco do tipoAfrican Green (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervicalhumano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL34); células de fígado de búfalo rato (BRL 3A, ATCC CRL 1442); célulaspulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano(Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCCCCL 51); células de TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sei. 383:44-68(1982)); células de MRC 5; células de FS4; e uma linhagem de hepatomahumana (Hep G2).

As células hospedeiras são transformadas com a expressãoacima descrita ou clonando vetores para produzir anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT e cultivados em meios nutrientes convencionaismodificados conforme apropriado para induzir os promotores, selecionartransformantes, ou amplificar os genes que codificam as seqüênciasdesejadas.

3. Seleção e Uso de um Vetor Replicável

O ácido nucléico (por exemplo, cDNA ou DNA genômico)codificando anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT pode ser inseridoem um vetor replicável para clonagem (amplificação do DNA) ou paraexpressão. Vários vetores estão publicamente disponíveis. O vetor pode, porexemplo, ser na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral, ou fago.A seqüência de ácido nucléico apropriada pode ser inserida no vetor poruma variedade de procedimentos. Em geral, o DNA é inserido em um/unssítio(s) de endonuclease de restrição apropriado(s) usando técnicasconhecidas na técnica. Componentes de vetor em geral incluem, mas nãosão limitados a, um ou mais de uma seqüência sinal, uma origem dereplicação, um ou mais genes rótulos, um elemento intensificador, umpromotor, e uma seqüência de terminação de transcrição. Construção devetores adequados contendo um ou mais destes componentes empregamtécnicas de ligação padrões que são conhecidas ao artesão versado.

O TAT pode ser produzido recombinantemente não sódiretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com umpolipeptídeo heterólogo que pode ser uma seqüência sinal ou outropolipeptídeo que tem um sítio de clivagem específico ao término N daproteína ou polipeptídeo maduros. Em geral, a seqüência sinal pode ser umcomponente do vetor, ou pode ser uma parte do DNA de codificação deanticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT que é inserido no vetor. Aseqüência sinal pode ser uma seqüência sinal procariótica selecionada, porexemplo, do grupo de líderes de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou deenterotoxina II estável ao calor. Para secreção de levedura o sinal daseqüência pode ser, por exemplo, o líder de levedura invertase, o líder defator alfa (incluindo os líderes de a-fator de Saccharomyces eKluyveromyces, o último descrito na patente U. S. N9 5.010.182), ou líder defosfatase ácida, o líder de glicoamilase de C. albicans (EP 362.179 publicadoem 4 de abril de 1990), ou o sinal descrito em WO 90/13646 publicado em15 de novembro de 1990. Sob expressão de célula mamífera, seqüênciassinais mamíferas podem ser usadas para direcionar secreção da proteína,como seqüências sinais de polipeptídeos segregados das mesmas espéciesou relacionadas, como também líderes secretórios virais.

Ambos vetores de expressão e clonagem contêm umaseqüência de ácido nucléico que permite o vetor replicar em uma ou maiscélulas hospedeiras selecionadas. Tais seqüências são bem conhecidas auma variedade de bactéria, levedura, e vírus. A origem de replicação doplasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem de plasmídeo 2u é adequada para levedura, e váriasorigens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis paravetores de clonagem em células mamíferas.

Vetores de expressão e clonagem tipicamente conterão um genede seleção, também denominado um rótulo selecionável. Genes de seleçãotípicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ououtras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, outetraciclina, (b) deficiências auxotróficas de complemento, ou (c) nãoprovêem nutrientes críticos disponíveis de meios complexos, por exemplo, ogene que codifica racemase de D-alanina para Bacilli.

Um exemplo de rótulos selecionáveis adequados para célulasmamíferas é aquele que permite a identificação de células competentes alevar o ácido nucléico de codificação de anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT, como DHFR ou timidina cinase. Uma célula hospedeiraapropriada quando DHFR do tipo selvagem é empregado é a linhagemcelular de CHO deficiente em atividade de DHFR, preparada e propagadacomo descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 77:4216 (1980).Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trpl presenteno plasmídeo de levedura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979);Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)].O gene trpl prove um rótulo de seleção para uma cepa mutante de leveduracarecendo da habilidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC Ne44076 ou PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

Vetores de expressão e clonagem usualmente contêm umpromotor operavelmente ligado à seqüência de ácido nucléico de codificaçãode anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT para direcionar síntese demRNA. Promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiraspotenciais são bem conhecidos. Promotores adequados para o uso comhospedeiros procarióticos incluem os sistemas de promotor de p-lactamasee lactose [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature,281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema de promotor de triptofano(trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], e promotoreshíbridos como o promotor de tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA.80:21-25 (1983)]. Promotores para uso em sistemas bacterianos tambémconterão uma seqüência de Shine-Dalgarno (S. D.) operavelmente ligada aoDNA que codifica o anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT.

Exemplos de seqüências promotoras adequadas para uso comhospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato cinase[Hitzeman et al., J. Biol. Chem.. 255:2073 (1980)] ou outras enzimasglicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg.. 7:149 (1968); Holanda,Biochemistry, 17:4900 (1978)], como. enolase, gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase, hexocinase, piruvato desçarboxilase, fosfofruetocinase,glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase,triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glucocinase.

Outros promotores de levedura que são promotores induzíveisque têm a vantagem adicional de transcrição controlada por condições decrescimento, são as regiões de promotor para álcool desidrogenase 2,isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas aometabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose egalactose. Vetores e promotores adequados para uso em expressão delevedura são também descritos em EP 73.657.

Transcrição de anticorpo de Anti-TAT ou polipeptídeo de TAT devetores em células hospedeiras mamíferas é controlada, por exemplo, porpromotores obtidos dos genomas de vírus como vírus de polioma, vírus debolba (UK 2.211.504 publicada em 5 de julho de 1989), adenovírus (comoAdenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário,citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e Símio Vírus 40 (SV40),de promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ouum promotor de imunoglobulina, e de promotores de choque térmico, desdeque tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de célulahospedeira.

Transcrição de um DNA que codifica o anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT através de eucariotos mais altos pode ser aumentadainserindo uma seqüência de intensificador no vetor. Intensificadores sãoelementos de DNA de ação eis, usualmente cerca de 10 a 300 bp atuandoem um promotor para aumentar sua transcrição. Muitas seqüências deintensificador são agora conhecidas de genes mamíferos (globina, elastase,albumina, a-fetoproteína e insulina). Porém, tipicamente usar-se-á umintensificador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem ointensificador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (bp 100-270),o intensificador de promotor prematuro de citomegalovírus, o intensificadorde polioma no lado tardio da origem de replicação, e intensificadores deadenovírus. O intensificador pode ser unido no vetor em uma posição 5' ou3' para a seqüência de codificação de anticorpo de anti-TAT ou depolipeptídeo de TAT, mas é preferivelmente localizado em um sítio 5' dopromotor.

Vetores de expressão usados em células hospedeiraseucarióticas (levedura, fungos, inseto, planta, animal, humano, ou célulasnucleadas de outros organismos multicelulares) também conterãoseqüências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilizaro mRNA. Tais seqüências estão comumente disponíveis das regiões não-transladadas de 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs eucarióticos ou virais oucDNAs. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos comofragmentos poliadenilados na porção não-transladada do mRNA que codificao anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT.Ainda outros métodos, vetores, e células hospedeirasadequados para adaptação à síntese de anticorpo de anti-TAT oupolipeptídeo de TAT em cultura de célula vertebrada recombinante sãodescritos em Gething et al., Nature, 293:620-625, (1981); Mantei et al.,Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060; e EP 117.058.

4. Cultivando as Células Hospedeiras

As células hospedeiras usadas para produzir o anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo de TAT desta invenção podem ser cultivadas em umavariedade de meios. Meios comercialmente disponíveis como o F10 de Ham(Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e aMeio de Eagles Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequadospara cultivar as células hospedeiras. Além disso, quaisquer dos meiosdescritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal.Biochem. 102:255 (1980), Pat. U. S NQS 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762;4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou patente U. S. Re.30.985 podem ser usados como meios de cultura para as célulashospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado quandonecessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (comoinsulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloretode sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (como HEPES), nucleotídeos(como adenosina e timidina), antibióticos (como fármaco deGENTAMYCIN™), elementos de traço (definidos como compostosinorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na faixamicromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outrosuplemento necessário pode também ser incluído em concentraçõesapropriadas que seriam conhecidas àqueles versados na técnica. Ascondições de cultura, como temperatura, pH, e outras, são aquelaspreviamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, eserá evidente ao artesão normalmente versado.

5. Detectando Amplificacão/Expressão de Gene

Amplificação e/ou expressão de gene pode(m) ser medida(s)diretamente em uma amostra, por exemplo, Southern bloting convencional,Northern bloting para quantificar a transcrição de mRNA [Thomas, Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980)], mancha por ponto (análise de DNA),ou hibridização in situ, usando uma sonda apropriadamente rotulada, combase nas seqüências fornecidas aqui. Alternativamente, anticorpos podemser empregados que podem reconhecer dúplices específicos, incluindodúplices de DNA, dúplices de RNA, e dúplices híbridos de DNA-RNA oudúplices de DNA-proteína. Os anticorpos por sua vez podem ser rotulados eo ensaio pode ser realizado onde o dúplex está ligado a uma superfície, deforma que na formação do dúplex na superfície, a presença de anticorpoligado ao dúplex pode ser detectada.

Expressão de gene, alternativamente, pode ser medida pormétodos imunológicos, como manchamento imunoistoquímico de células ouseções de tecido e ensaio de cultura de célula ou fluidos do corpo, paraquantificar diretamente a expressão de produto de gene. Anticorpos úteispara manchamento imunoistoquímico e/ou ensaio de fluidos de amostrapodem ser monoclonais ou policlonais, e podem ser preparados em qualquermamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contrauma polipeptídeo de TAT de seqüência nativa ou contra um peptídeosintético com base nas seqüências de DNA fornecidas aqui ou contraseqüência exógena fundida para DNA de TAT e codificando um epítopo deanticorpo específico.

6. Purificação de Anticorpo de anti-TAT e Polipeptídeo de TAT

Formas de anticorpo de anti-TAT e polipeptídeo de TAT podemser restabelecidas do meio de cultura ou de lisados de célula hospedeira. Seligadas à membrana, elas podem ser liberadas da membrana usando umasolução de detergente adequada (por exemplo Triton-X 100) ou através declivagem enzimática. Células empregadas na expressão de anticorpo deanti-TAT e polipeptídeo de TAT podem ser rompidas através de vários meiosfísicos ou químicos, como ciclismo congelamento-descongelamento,sonicação, rompimento mecânico, ou agentes de lise de célula. .

Pode ser desejado purificar anticorpo de anti-TAT e polipeptídeode TAT das proteínas de células recombinantes ou polipeptídeos. Osprocedimentos a seguir são exemplares de procedimentos de purificaçãoadequados: por fracionamento em uma coluna de permuta iônica;precipitação de etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou emuma resina de permuta de cátion como DEAE; cromatofocalização; SDS-PAGE; precipitação de sulfato de amônio; filtração em gel usando, porexemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A-Sepharose para removercontaminantes como IgG; e colunas de quelação de metal para ligar formasrotuladas com epítopo do anticorpo de anti-TAT e polipeptídeo de TAT.Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e taismétodos são conhecidos na técnica e descritos por exemplo em Deutscher,Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principiesand Practice, Springer - Verlag, Nova Iorque (1982). A(s) etapa(s) depurificação selecionada(s) dependerá(ão), por exemplo, da natureza doprocesso de produção usada e do anticorpo de anti-TAT ou polipeptídeo deTAT particular produzido.

Quando usar técnicas recombinantes, o anticorpo pode serproduzido intracelularmente, no espaço periplásmico, ou pode serdiretamente segregado no meio. Se o anticorpo for produzidointracelularmente, como uma primeira etapa, o restos particulados, célulashospedeiras ou fragmentos lisados são removidos, por exemplo, porcentrifugação ou ultrafiltração. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167(1992) descreve um procedimento para isolar anticorpos que sãosegregados para o espaço periplásmico de E. coli. Brevemente, pasta decélula é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA,. efenilmetilsulfonilfluoreto (PMSP) por cerca de 30 min. Restos de célulaspodem ser removidos através de centrifugação. Onde o anticorpo forsegregado no meio, sobrenadantes de tais sistemas de expressão são emgeral primeiro concentrados usando um filtro de concentração de proteínacomercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração deAmicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease como PMSF pode serincluído em quaisquer das etapas anteriores para inibir proteólise eantibióticos podem ser incluídos para impedir o crescimento decontaminantes adventícios.

A composição de anticorpo preparada das células pode serpurificada usando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita,eletroforese em gel, diálise, e cromatografia de afinidade, com cromatografiade afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A conveniência deproteína A como um ligando de afinidade depende das espécies e isótipo dequalquer domínio de Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo.Proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são com base emcadeias pesadas humanas v1> Y2 ou y4 (Lindmark et al., j. Immunol. Meth.62:1-13 (1983)). Proteína G é recomendada para todos os isótipos decamundongo e para v3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)).A matriz à qual o ligando de afinidade está ligado é mais freqüentementeagarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamenteestáveis como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzenopermitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento maiscurtos que podem ser alcançados com agarose. Onde o anticorpocompreender um domínio de Ch3, a resina de Bakerbond ABX™ (J. T. Baker,Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação deproteína como fracionamento em uma coluna de permuta iônica,precipitação de etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia em sílica,cromatografia em heparina cromatografia de SEPHAROSE™ em uma resinade permuta de ânion ou cátion (como uma coluna de ácido poliaspártico),cromatofocalização, SDS-PAGE, e precipitação de sulfato de amônio estãotambém disponíveis dependendo do anticorpo a ser restabelecido.

Seguindo qualquer uma das etapas de purificação preliminares,a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes podemser submetidos a cromatografia de pH baixo de interação hidrofóbica usandoum tampão de elução a um pH entre cerca de 2,5-4,5, preferivelmenteexecutada em concentrações baixas de sal (por exemplo, de cerca 0-0,25 Mde sal).

J. Formulações Farmacêuticas

Formulações terapêuticas dos anticorpos de anti-TAT,oligopeptídeos de ligação de TAT, moléculas orgânicas de ligação de TATe/ou polipeptídeos de TAT usados de acordo com a presente invenção sãopreparadas para armazenamento misturando o anticorpo, polipeptídeo,oligopeptídeo ou molécula orgânica tendo o grau desejado de pureza comveículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveisopcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ã edição, Osol, A., Ed.(1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos,excipientes, ou estabilizantes aceitáveis são não-tóxicos aos recipientes emdosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões como acetato,Tris, fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácidoascórbico e metionina; preservativos (como cloreto de amônio deoctadecildimetilbenzila; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio,cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; parabenos dealquila como parabeno de metila ou de propila; catecol; resorcinol;cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo(menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina de soro,gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona;aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, oulisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindoglicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; tonificadorescomo trealose e cloreto de sódio; açúcares como sacarose* manitol, trealoseou sorbitol; tensoativo como polissorbato; contra-íons de formação de salcomo sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína e Zn);e/ou tensoativos não-iônicos como TWEEN®, PLURONICS® ou polietilenoglicol (PEG). O anticorpo preferivelmente compreende o anticorpo a umaconcentração de entre 5-200 mg/ml, preferivelmente entre 10-100 mg/ml.

As formulações aqui podem também conter mais de umcomposto ativo quando necessário para a indicação particular sendo tratada,preferivelmente aquelas com atividades complementares que nãoadversamente afetam um ao outro. Por exemplo, além de um anticorpo deanti-TAT, oligopeptídeo de ligação de TAT, ou molécula orgânica de ligaçãode TAT, pode ser desejável incluir na uma formulação um anticorpo adicional,por exemplo, um segundo anticorpo de anti-TAT que liga um epítopodiferente no polipeptídeo de TAT, ou um anticorpo para algum outro alvocomo um fator de crescimento que afeta o crescimento do câncer particular.Como alternativa, ou adicionalmente, a composição pode tambémcompreender um agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citocina,agente inibidor de crescimento, agente anti-hormonal, e/ou cardioprotetor.Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação emquantidades que são eficazes para o propósito intencionado.

Os ingredientes ativos podem também ser atraídos emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de co-acervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo,hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármacocoloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina,microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões.Tais técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Science, 16§edição, Osol, A. Ed. (1980).

Preparações de liberação contínua podem ser preparadas.Exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluemmatrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo oanticorpo cujas matrizes são na forma de artigos configurados, por exemplo,filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação contínuaincluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), oupoli(vinilálcool)), polilactídeos (Pat. U. S. N9 3.773.919), copolímeros deácido L-glutâmico e y etil-L-glutamato, etileno não-degradante - acetato devinila, copolímeros de ácido láctico degradante - ácido glicólico comoLUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero deácido láctico - ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a ser usadas para administração in vivo devemser estéreis. Isto é facilmente realizado através de filtração através demembranas de filtração estéreis.K. Diaqnose e Tratamento com Anticorpos de anti-TAT, Oliqopeptídeos deLigação de TAT e Moléculas Orgânicas de Ligação de TAT

Para determinar expressão de TAT no câncer, vários ensaiosdiagnósticos estão disponíveis. Em uma modalidade, sobreexpressão depolipeptídeo de TAT pode ser analisada através de imunoistoquímica (IHC).Seções de tecido embebidas em parafina de uma biópsia de tumor podemser submetidas ao ensaio de IHC e outorgada aos critérios de intensidade demanchamento de proteína de TAT como segue:

Contagem 0 - nenhum manchamento é observado oumanchamento de membrana é observado em menos que 10% das célulastumorais.

Contagem 1+ - um manchamento de membranafracamente/muito pouco perceptível é detectado em mais que 10% dascélulas tumorais. As células são apenas tingidas em parte de sua membrana.

Contagem 2+ - um manchamento de membrana completo fracoa moderado é observado em mais que 10% das células tumorais.

Contagem 3+ - um manchamento de membrana completo forte amoderado é observado em mais que 10% das células tumorais.

Aqueles tumores com contagens 0 ou 1+ para expressão depolipeptídeo de TAT podem ser caracterizadas como não sobreexpressandoTAT, enquanto que aqueles tumores com contagens de 2+ ou 3+ podem sercaracterizados como sobreexpressando TAT.

Como alternativa, ou adicionalmente, ensaios de FISH como oINFORM® (vendido por Ventana, Arizona) ou PATHVISION® (Vysis, Illinois)podem ser realizados em tecido de tumor fixo em formalina, embebidos emparafina para determinar a extensão (se houver) da sobreexpressão de TATno tumor. Sobreexpressão ou amplificação TAT podem ser avaliadas usandoum ensaio diagnóstico in vivo, por exemplo, administrando uma molécula(como um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica) que liga amolécula a ser detectada e rotulado com uma marcação detectável (porexemplo, um isótopo radioativo ou uma marcação fluorescente) e varrendo opaciente externamente para localização da marcação.Como descrito acima, os anticorpos de anti-TAT, oligopeptídeose moléculas orgânicas da invenção têm várias aplicações não-terapêuticas.Os anticorpos de anti-TAT, oligopeptídeos e moléculas orgânicas dapresente invenção podem ser úteis para diagnose e escalonamento decânceres de expressão de polipeptídeo de TAT (por exemplo, emradioimageamento). Os anticorpos, oligopeptídeos e moléculas orgânicassão também úteis para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo deTAT de células, para detecção e quantificação de polipeptídeo de TAT invitro, por exemplo, em um ELISA ou um western blot, para matar e eliminar aexpressão de células de TAT de uma população de células misturadas comouma etapa na purificação de outras células.

Correntemente, dependendo do estágio do câncer, tratamentode câncer envolve uma ou uma combinação das terapias a seguir: cirurgiapara remover o tecido canceroso, terapia de radiação, e quimioterapia.Anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou terapia de molécula orgânica podeser especialmente desejável em pacientes anciãos que não toleram bem atoxicidade e efeitos colaterais da quimioterapia e em doença metastáticaonde terapia de radiação tem utilidade limitada. Os anticorpos de anti-TAT,oligopeptídeos e moléculas orgânicas de alvejamento de tumor da invençãosão úteis para aliviar cânceres de expressão de TAT em diagnose inicial dadoença ou durante a recaída. Para aplicações terapêuticas, o anticorpo deanti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica pode ser usado sozinho, ouem terapia de combinação com, por exemplo, hormônios, antiangiogenes, oucompostos radiorrotulados, ou com cirurgia, crioterapia, e/ou radioterapia.Tratamento com anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânicapodem ser administrado junto com outras formas de terapia convencional, ouconsecutivamente, pré ou pós terapia convencional. Fármacosquimioterapêuticos como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (palictaxel),estramustina e mitoxantrona são usados para tratar câncer, em particular,em pacientes de bom risco. No método presente da invenção para tratar oualiviar câncer, o paciente de câncer pode ser administrado com anticorpo deanti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica em conjunção com otratamento com um ou mais dos agentes quimioterapêuticos precedentes.Em particular, terapia de combinação com palictaxel e derivados modificados(vide, por exemplo, EP0600517) é contemplada. O anticorpo de anti-TAT,oligopeptídeo ou molécula orgânica será administrada com uma doseterapeuticamente eficaz do agente quimioterapêutico. Em outra modalidade,o anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica é administradajunto com quimioterapia para intensificar a atividade e eficácia do agentequimioterapêutico, por exemplo, paclitaxel. A Physicians' Desk Reference(PDR) descreve dosagens destes agentes que foram usados no tratamentode vários cânceres. O regime de doseamento e dosagens destes fármacosquimioterapêuticos acima mencionados que são terapeuticamente eficazesdependerão do câncer particular sendo tratado, da extensão da doença eoutros fatores familiares ao médico versado na técnica e podem serdeterminados pelo médico.

Em uma modalidade particular, um conjugado compreendendoum anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica conjugadacom um agente citotóxico é administrado ao paciente. Preferivelmente, oimunoconjugado ligado à proteína de TAT é interiorizado pela célula,resultando em eficácia terapêutica aumentada do imunoconjugado matandoa célula de câncer à qual se liga. Em uma modalidade preferida, o agentecitotóxico alveja ou interfere com o ácido nucléico na célula de câncer.Exemplos de tais agentes citotóxicos são descritos acima e incluemmaitansinóides, caliqueamicinas, ribonucleases e DNA endonucleases.

Os anticorpos de anti-TAT, oligopeptídeos, moléculas orgânicasou conjugados de toxina destes são administrados a um paciente humano,em acordo com os métodos conhecidos, como administração intravenosa,por exemplo, como um bolo ou através de infusão contínua durante um certotempo, por rotas intramusculares, intraperitoneais, intracerobroespinhais,subcutaneas, intra-articulares, intrasinoviais, intratecais, orais, tópicos ou deinalação. Administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica é preferida.

Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com aadministração do anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica.A administração combinada inclui co-administração, usando formulaçõesseparadas ou uma formulação farmacêutica simples, e administraçãosucessiva em qualquer ordem, em que preferivelmente há um período detempo enquanto ambos (ou todos) agentes ativos exercem suas atividadesbiológicas simultaneamente. Preferivelmente tal terapia combinada resultaem um efeito terapêutico sinergístico.

Pode também ser desejável combinar a administração doanticorpo ou anticorpos de anti-TAT, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas,com administração de um anticorpo direcionado contra outro antígeno detumor associado ao câncer particular.

Em outra modalidade, os métodos de tratamento terapêuticos dapresente invenção envolvem a administração combinada de um anticorpo deanti-TAT (ou anticorpos), oligopeptídeos ou moléculas orgânicas e um oumais agentes quimioterapêuticos ou agentes inibidores de crescimento,incluindo co-administração de coquetéis de agentes quimioterapêuticosdiferentes. Agentes quimioterapêuticos incluem fosfato de estramustina,prednimustina, cisplatina, 5-fluorouracila, melfalano, ciclofosfamida,hidroxiuréia e hidroxiureiataxanos (como paclitaxel e doxetaxel) e/ouantibióticos de antraciclina. Preparação e programa de doseamento para taisagentes quimioterapêuticos podem ser usados de acordo com as instruçõesdos fabricantes ou como determinado empiricamente pelo médico versado.Preparação e programa de doseamento para tal quimioterapia são tambémdescritos em Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkinas,Baltimore, MD (1992).

O anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica podem sercombinados com um composto anti-hormonal; por exemplo, um composto deantiestrogenio como tamoxifeno; um anti-progesterona como onapristona(vide, EP 616 812); ou um antiandrógeno como flutamida, em dosagensconhecidas para tais moléculas. Onde o câncer a ser tratado for câncerindependente de andrógeno, o paciente pode previamente ter sidosubmetido à terapia de antiandrógeno e, após o câncer se tornarindependente de andrógeno, o anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo oumolécula orgânica (e opcionalmente outros agentes como descritos aqui)pode ser administrada ao paciente.

Às vezes, pode ser benéfico também co-administrar umcardioprotetor (para impedir ou reduzir disfunção do miocárdio associado àterapia) ou uma ou mais citocinas ao paciente. Além dos regimesterapêuticos acima, o paciente pode ser submetido à remoção cirúrgica decélulas de câncer e/ou terapia de radiação, antes, simultaneamente, ou pósterapia de anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica. Dosagensadequadas para quaisquer dos agentes co-administrados acima são aquelaspresentemente usadas e podem ser diminuídas devido à ação combinada(sinergia) do agente e anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou moléculaorgânica.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem e modode administração serão selecionados pelo médico de acordo com os critériosconhecidos. A dosagem apropriada de anticorpo, oligopeptídeo ou moléculaorgânica dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definida acima, aseveridade e curso da doença, se o anticorpo, oligopeptídeo ou moléculaorgânica for administrada para propósitos preventivos ou terapêuticos,terapia anterior, a história clínica do paciente e resposta ao anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica, e a discrição do médico assistente. Oanticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é administradaadequadamente uma vez ao paciente ou em uma série de tratamentos.Preferivelmente, o anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica éadministrada através de infusão intravenosa ou por injeções subcutâneasdependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 ug/kg a cerca de 50mg/kg peso do corpo (por exemplo, cerca de 0,1-15 mg/kg/dose) de anticorpopode ser uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se,por exemplo, através de uma ou mais administrações separadas, ou atravésde infusão contínua. Um regime de doseamento pode compreenderadministrar uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por umadose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo de anti-TAT.Porém, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Uma dosagem diáriatípica poderia variar de cerca de 1 ug/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendodos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas durantevários dias ou muito mais tempo, dependendo da condição, o tratamento écontínuo até uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorrer. Oprogresso desta terapia pode ser facilmente monitorado por métodosconvencionais e ensaios e com base em critérios conhecidos ao médico ououtras pessoas versadas na técnica.

Aparte da administração da proteína de anticorpo ao paciente, apresente pedido de patente contempla administração do anticorpo atravésde terapia de gene. Tal administração de ácido nucléico que codifica oanticorpo é abrangida pela expressão "administrar uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo". Vide, por exemplo, WO96/07321publicado em 14 de março de 1996 relativo ao uso de terapia de gene paragerar anticorpos intracelulares.

Há dois métodos principais de adquirir o ácido nucléico(opcionalmente contido em um vetor) nas células do paciente; in vivo e exvivo. Para liberação in vivo o ácido nucléico é diretamente injetado nopaciente, usualmente no sítio onde o anticorpo é requerido. Para tratamentoex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucléico é introduzidonestas células isoladas ou as células modificadas são administradasdiretamente ao paciente ou, por exemplo, encapsuladas dentro demembranas porosas que são implantadas no paciente (vide, por exemplo,Patente U. S. NQS 4.892.538 e 5.283.187). Há uma variedade de técnicasdisponíveis para introduzir ácidos nucléicos em células viáveis. As técnicasvariam, dependendo se o ácido nucléico é transferido para células cultivadasin vitro, ou in vivo nas células do hospedeiro intencionado. Técnicasadequadas para a transferência de ácido nucléico em células mamíferas invitro incluem o uso de lipossomas, eletroporação, microinjeção, fusão decélula, DEAE-dextrana, método de precipitação de fosfato de cálcio, etc. Umvetor comumente usado para liberação do gene ex vivo é um vetor retroviral.

As técnicas de transferência de ácido nucléico in vivocorrentemente preferidas incluem transfecção com vetores virais (comoadenovírus, vírus de herpes simples I, ou adenovírus associado) e sistemascom base em lipídio (lipídios úteis para transferência mediada por lipídio dogene é DOTMA, DOPE e DC-Choi, por exemplo). Para revisão dosprotocolos de marcação de gene e terapia de gene correntementeconhecidos vide Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Vide tambémWO 93/25673 e as referências nele citadas.

Os anticorpos de anti-TAT da invenção podem ser nas formasdiferentes abrangidas pela definição de "anticorpo" aqui. Desse modo, osanticorpos incluem anticorpo de comprimento total ou intacto, fragmentos deanticorpo, anticorpo de seqüência nativa ou variantes de aminoácido,anticorpos humanizados, quiméricos ou de fusão, imunoconjugados, efragmentos funcionais destes. Em anticorpos de fusão uma seqüência deanticorpo é fundida em uma seqüência de polipeptídeo heteróloga. Osanticorpos podem ser modificados na região de Fc para fornecer funçõesefetoras desejadas. Como debatido em mais detalhes nas seções aqui, comas regiões de Fc apropriadas, o anticorpo desprotegido ligado na superfíciedas células pode induzir citotoxicidade, por exemplo, por meio decitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) ou recrutando ocomplemento em citotoxicidade dependente de complemento, ou algumoutro mecanismo. Alternativamente, onde for desejável eliminar ou reduzir afunção efetora, para minimizar os efeitos colaterais ou complicaçõesterapêuticas, certas outras regiões de Fc podem ser usadas.

Em uma modalidade, o anticorpo compete para ligar ou ligarsubstancialmente ao mesmo epítopo que os anticorpos da invenção.Anticorpos que têm as características biológicas dos anticorpos de anti-TATpresentes da invenção são também contemplados, especificamenteincluindo o alvejamento de tumor in vivo e qualquer inibição de proliferaçãode célula ou características citotóxicas.

Métodos de produzir os anticorpos acima são descritos emdetalhes aqui.

Os presentes anticorpos de anti-TAT, oligopeptídeos emoléculas orgânicas são úteis para tratar um câncer de expressão de TATou aliviar um ou mais sintomas do câncer em um mamífero. Um tal câncerinclui câncer de próstata, câncer do trato urinário, câncer do pulmão, câncerde mama, câncer de cólon e câncer ovariano, mais especificamente,adenocarcinoma de próstata, carcinomas de células renais,adenocarcinomas colorretais, adenocarcinomas pulmonares, carcinomas decélulas escamosas pulmonares, e mesotelioma pleural. Os cânceresabrangem cânceres metastáticos de qualquer um dos precedentes. Oanticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é capaz de ligar a pelo menosuma porção das células de câncer que expressam o polipeptídeo de TAT nomamífero. Em uma modalidade preferida, o anticorpo, oligopeptídeo oumolécula orgânica é eficaz em destruir ou matar a expressão de TAT célulastumorais ou inibir o crescimento de tais células tumorais, in vitro ou in vivo,ao ligar ao polipeptídeo de TAT na célula. Um tal anticorpo inclui umanticorpo de anti-TAT desprotegido (não conjugado com qualquer agente).Anticorpos desprotegidos tendo propriedades de inibição citotóxica ou decrescimento de célula podem ser também arreado com um agente citotóxicopara os tornar mais potentes até mesmo sob destruição de célula tumoral.Propriedades citotóxicas podem ser conferidas a um anticorpo de anti-TATpor, por exemplo, conjugando o anticorpo com um agente citotóxico, paraformar um imunoconjugado como descrito aqui. O agente citotóxico ou umagente inibidor de crescimento é preferivelmente uma molécula pequena.Toxinas como caliqueamicina ou um maitansinóide e análogos ou derivadosdestes, são preferíveis. A invenção fornece uma composiçãocompreendendo um anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou moléculaorgânica da invenção, e veículo. Composições podem ser administradas aopaciente em necessidade de tal tratamento para o propósito de tratar câncer,em que a composição pode compreender um ou mais anticorpos de anti-TAT presentes como um imunoconjugado ou como o anticorpo descoberto.Em uma modalidade adicional, as composições podem compreender estesanticorpos, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas em combinação comoutros agentes terapêuticos como agentes citotóxicos ou inibidores decrescimento, incluindo agentes quimioterapêuticos. A invenção tambémfornece formulações compreendendo um anticorpo de anti-TAT,oligopeptídeo ou molécula orgânica da invenção, e veículo. Em umamodalidade, a formulação é uma formulação terapêutica compreendendo umveículo farmaceuticamente aceitável.

Outro aspecto da invenção são ácidos nucléico isolados quecodificam os anticorpos de anti-TAT. Ácidos nucléicos que codificam ambasas cadeias H e L e especialmente os resíduos de região hipervariável,cadeias que codificam o anticorpo de seqüência nativo como tambémvariantes, modificações e versões humanizadas do anticorpo, sãoabrangidos.

A invenção também prove métodos úteis para tratar um câncerde expressão de polipeptídeo de TAT ou aliviar um ou mais sintomas docâncer em um mamífero, compreendendo administrar uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo oumolécula orgânica ao mamífero. As composições terapêuticas de anticorpo,oligopeptídeo ou molécula orgânica podem ser administradas em curto prazo(agudo) ou crônico, ou intermitente como direcionado pelo médico. Tambémfornecidos são métodos de inibir o crescimento, e matar uma célula deexpressão de polipeptídeo de TAT.

A invenção também fornece kits e artigos de fabricaçãocompreendendo pelo menos um anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo oumolécula orgânica. Kits contendo anticorpos de anti-TAT, oligopeptídeos oumoléculas orgânicas encontram uso, por exemplo, para ensaios de morte decélula TAT, para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo de TATdas células. Por exemplo, para isolamento e purificação de TAT, o kit podeconter um anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânicaacoplada às contas (por exemplo, contas de sefarose). Kits contendo osanticorpos, oligopeptídeos ou moléculas orgânicas podem ser fornecidospara detecção e quantificação de TAT in vitro, por exemplo , em um ELISAou um western blot. Tal anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica útilpara detecção podem ser fornecidos com uma marcação como umfluorescente ou radiorrótulo.

L Artigos de Fabricação e Kits

Outra modalidade da invenção é um artigo de fabricaçãocontendo materiais úteis para o tratamento de câncer de expressão de anti-TAT. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ouinserção de pacote dentro ou associado ao recipiente. Recipientesadequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc:

Os recipientes podem ser formados de uma variedade demateriais como vidro ou plástico. O recipiente retém uma composição que éeficaz para tratar a condição de câncer e pode ter uma porta de acessoestéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco de solução intravenosaou um frasco tendo uma rolha penetrável por uma agulha de injeçãohipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpode anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica da invenção. O rótulo ouinserção de pacote indica que a composição é usada para tratar câncer. Orótulo ou inserção de pacote também compreenderá instruções paraadministrar o anticorpo, oligopeptídeo ou composição de molécula orgânicaao paciente de câncer. Adicionalmente, o artigo de fabricação pode tambémcompreender um segundo recipiente compreendendo um tampãofarmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI),solução salina tamponada de fosfato, solução de Ringer e solução dedextrose. Pode também incluir outros materiais desejáveis de um ponto devista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros,agulhas, e seringas.

Kits são também fornecidos que serão úteis para váriospropósitos, por exemplo, para ensaios de morte celular de expressão de TAT,para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo de TAT das células.Para isolamento e purificação de polipeptídeo de TAT, o kit pode conter umanticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica acoplada àscontas (por exemplo, contas de sefarose). Kits contendo os anticorpos,oligopeptídeos ou moléculas orgânicas podem ser fornecidos para detecçãoe quantificação de polipeptídeo de TAT in vitro, por exemplo, em um ELISAou um western blot. Como com o artigo de fabricação, o kit compreende umrecipiente e um rótulo ou inserção de pacote dentro ou associado aorecipiente. O recipiente retém uma composição compreendendo pelo menosum anticorpo de anti-TAT, oligopeptídeo ou molécula orgânica da invenção.Recipientes adicionais contendo, por exemplo, diluentes e tampões,anticorpos de controle, podem ser incluídos.

O rótulo ou inserção de pacote pode fornecer uma descrição dacomposição como também instruções para o uso intencionado in vitro oudiagnóstico.

M. Usos para Ácidos Nucléicos de Codificação de Polipeptídeos de TAT ePolipeptídeo de TAT

Seqüências de nucleotídeos (ou seu complemento) codificandopolipeptídeos de TAT têm várias aplicações na técnica de biologia molecular,incluindo uso como sondas de hibridização, em cromossomo e mapeamentodos genes e na geração de sondas de RNA e de DNA anti-sentido. Ácidonucléico de codificação de TAT também será útil para a preparação depolipeptídeos de TAT pelas técnicas recombinantes descritas aqui, em queaqueles polipeptídeos de TAT podem encontrar uso, por exemplo, napreparação de anticorpos de anti-TAT como descrito aqui.

A seqüência nativa de comprimento total gene TAT, ou porçõesdesta, pode ser usada como sondas de hibridização para uma biblioteca decDNA para isolar o cDNA de TAT de comprimento total ou ainda isolaroutros cDNAs (por exemplo,- aqueles codificando variantes de TAT deocorrência natural ou TAT de outras espécies) que tem uma identidade deseqüência desejada para a seqüência TAT nativa descrita aqui.Opcionalmente, o comprimento das sondas será cerca de 20 a cerca de 50bases. As sondas de hibridização podem ser derivadas de pelo menosregiões parcialmente novas da seqüência de nucleotídeo nativa decomprimento total em que aquelas regiões podem ser determinadas semexperimentação imprópria ou de seqüências genômicas incluindo ospromotores, elementos intensificadores e íntrons de seqüência nativa deTAT. Por via de exemplo, um método de triagem compreenderá isolar aregião de codificação do gene de TAT usando a seqüência de DNAconhecida para sintetizar uma sonda selecionada de cerca de 40 bases.Sondas de hibridização podem ser rotuladas por uma variedade demarcações, incluindo radionucleotídeos como 2P ou 3S, ou marcaçõesenzimáticas como fosfatase alcalina acoplada à sonda por meio de sistemasde acoplamento de avidina/biotina. Sondas rotuladas tendo uma seqüênciacomplementar à do gene de TAT da presente invenção podem ser usadaspara triar bibliotecas de cDNA humano, DNA genômico ou mRNA paradeterminar que os membros de tais bibliotecas hibridizam com a sonda. Sãodescritas técnicas de hibridização em mais detalhes nos Exemplos abaixo.Quaisquer seqüências de EST descritas no presente pedido de patentepodem ser similarmente empregadas como sondas, usando os métodosdescritos aqui.

Outros fragmentos úteis dos ácidos nucléicos de codificação deTAT incluem oligonucleotídeos anti-sentido ou sentido compreendendo umaseqüência de ácido nucléico unifilamentar (RNA ou DNA) capaz de ligar àsseqüências de mRNA de TAT (sentido) ou de DNA de TAT (anti-sentido)alvos. Oligonucleotídeos anti-sentidos ou sentido, de acordo com a presenteinvenção, compreendem um fragmento da região de codificação de DNA deTAT. Um tal fragmento em geral compreende pelo menos cerca de 14nucleotídeos, preferivelmente de cerca de 14 a 30 nucleotídeos. A habilidadepara derivar um oligonucleotídeo anti-sentido ou um sentido, com base emuma seqüência de cDNA que codifica uma proteína dada é descrita, porexemplo, em Stein e Cohen (Câncer Res. 48:2659, 1988) e van der Krol et al.(BioTechniques 6:958, 1988).

Ligação de oligonucleotídeos anti-sentido ou sentido àsseqüências alvos de ácido nucléico resulta na formação de dúplices quebloqueiam a transcrição ou translação da seqüência alvo por um de váriosmeios, incluindo degradação intensificada dos dúplices, terminaçãoprematura de transcrição ou translação, ou através de outros meios. Taismétodos são abrangidos pela presente invenção. Os oligonucleotídeos anti-sentidos desse modo podem ser usados para bloquear expressão deproteínas de TAT, em que aquelas proteínas de TAT podem desempenharum papel na indução de câncer em mamíferos. Oligonucleotídeos anti-sentido ou sentido também compreendem oligonucleotídeos tendo cadeiasprincipais modificadas de açúcar-fosfodiéster (ou outras ligações de açúcar,como aquelas descritas em WO 91/06629) e em que tais ligações de açúcarsão resistentes às nucleases endógenas. Tais oligonucleotídeos comligações de açúcar resistentes são estáveis in vivo (isto é, capazes deresistir à degradação enzimática) mas retém especificidade de seqüênciapara ser capaz de ligar às seqüências de nucleotídeo alvos.

Sítios intragênicos preferidos para ligação anti-sentido incluem aregião que incorpora o códon de iniciação/partida de translação (5'-AUG/5'-ATG) ou códon de terminação/parada (5'-UAA, 5'-UAG e 5-UGA/5'-TAA, 5'-TAG e 5'-TGA) da estrutura de leitura aberta (ORF) do gene. Estas regiõesreferem-se a uma porção do mRNA ou gene que abrange de cerca de 25 acerca de 50 nucleotídeos contíguos em qualquer direção (isto é, 5' ou 3') deuma iniciação de translação ou códon de terminação. Outras regiõespreferidas para ligação anti-sentido incluem: íntrons; éxons; junções deíntron-éxon; a estrutura de leitura aberta (ORF) ou "região de codificação",que é a região entre o códon de iniciação de translação e o códon determinação de translação; a capa de 5' de um mRNA compreendendo umresíduo de guanosina N7-metilado unido ao resíduo mais 5' do mRNA pormeio de uma ligação de 5'-5' de trifosfato e inclui estrutura de capa de 5' emsi como também os primeiros 50 nucleotídeos adjacentes à capa; a regiãonão-transladada de 5' (5'UTR), a porção de um mRNA na direção 5'docódon de iniciação de translação, e desse modo incluindo nucleotídeos entreo sítio de tampa de 5' e o códon de iniciação de translação de um mRNA ounucleotídeos correspondentes no gene; e a região não-transladada de 3'(3'UTR), a porção de um mRNA na direção 3' do códon de terminação detranslação, e desse modo incluindo nucleotídeos entre o códon determinação de translação e terminação 3' de um mRNA ou nucleotídeoscorrespondentes no gene.

Exemplos específicos de compostos anti-sentidos preferidosúteis para inibir expressão de proteínas TAT incluem oligonucleotídeoscontendo cadeias principais modificadas ou ligações de internucleosídeonão-naturais. Oligonucleotídeos que têm cadeias principais modificadasincluem aqueles que retêm um átomo de fósforo na cadeia principal eaqueles que não têm um átomo de fósforo na cadeia principal. Para opropósito deste relatório descritivo, e como às vezes referido na técnica,oligonucleotídeos modificados não tendo um átomo de fósforo em suacadeia principal de internucleosídeo podem também ser considerados seroligonucleosídeos. Cadeias principais de oligonucleotídeos modificadospreferidas incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos de quiral,fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotri-ésteres, fosfonatos demetila e outros de alquila incluindo fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de5'-alquileno e fosfonatos de quiral, fosfinatos, fosforamidatos incluindofosforamidato de 3'-amino e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos,tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos e borano-fosfato tendo ligações normais de 3 -5', análogos ligados a 2'-5' destes, eaqueles tendo polaridade invertida em que uma ou mais ligações deinternucleotídeo são uma ligação 3' a 3', 5' a 5' ou 2' a 2'. Oligonucleotídeospreferidos que têm polaridade invertida compreendem uma ligação simplesde 3' a 3' na ligação de internucleotídeo 3'-mais isto é um resíduo denucleosídeo invertido simples que pode ser abásico (a nucleobase estáfaltando ou tem um grupo hidroxila no lugar deste). Vários sais, saismisturados e formas de ácidos livres são também inclusos. Patentes dosEstados Unidos representativas que ensinam a preparação de ligaçõescontendo fósforo incluem, mas não são limitadas a, Pat. U. S. N^: 3.687.808;4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423;5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939;5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821;5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.194.599;5.565.555; 5.527.899; 5.721.218; 5.672.697 e 5.625.050, cada um destes éaqui incorporado por referência.

Cadeias principais de oligonucleotídeo modificado preferidas quenão incluem um átomo de fósforo nelas têm cadeias principais que sãoformadas por ligações de internucleosídeo de alquila ou cicloalquila decadeia curta, ligações de internucleosídeo de heteroátomo misturado e dealquila ou de cicloalquila, ou uma ou mais ligações de internucleosídeoheteroatômico ou heterocíclico de cadeia curta. Estes incluem aqueles tendoligações de morfolino (formadas em parte da porção de açúcar de umnucleosídeo); cadeias principais de siloxano; cadeias principais de sulfeto,sulfóxido e sulfona; cadeias principais de formacetila e de tioformacetila;cadeias principais de formacetila de metileno e de tioformacetila; cadeiasprincipais de riboacetila; cadeias principais contendo alqueno; cadeiasprincipais de sulfamato; cadeias principais de metilenoimino e demetilenohidrazino; cadeias principais de sulfonato e de sulfonamida; cadeiasprincipais de amida; e outras tendo partes de componente misturadas de N,O, S e CH.sub.2. Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinama preparação de tal oligonucleosídeos incluem, mas não são limitadas a Pat.Pat. U. S. N95: 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141;5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677;5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240;5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070;5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; 5.792.608; 5.646.269 e 5.677.439, cadaum deste é aqui incorporado por referência.

Em outros oligonucleotídeos anti-sentidos preferidos, o açúcar ea ligação de internucleosídeo, isto é, a cadeia principal, das unidades denucleotídeo é substituída com grupos novos. As unidades de base sãomantidas para hibridização com um composto alvo de ácido nucléicoapropriado. Um tal composto oligomérico, um oligonucleotídeo mimético quefoi mostrado ter propriedades de hibridização excelentes, é referido comoum ácido nucléico de peptídeo (PNA). Em compostos de PNA, a cadeiaprincipal de açúcar de um oligonucleotídeo é substituída com uma cadeiaprincipal contendo amida, em particular uma cadeia principal deaminoetilglicina. As nucleobases são retidas e estão direta ou indiretamenteligadas aos átomos de nitrogênio de aza da porção de amida da cadeiaprincipal. Patentes de Estados Unidos representativas que ensinam apreparação de compostos de PNA incluem, mas não são limitadas a, Pat. U.S. N95: 5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262, cada uma destas é aquiincorporada por referência. Ensinamento adicional de compostos de PNApode ser encontrado em Nielsen et al., Science, 1991, 254,1497-1500.

Oligonucleotídeos anti-sentidos preferidos incorporam cadeiasprincipais de fosforotioato e/ou cadeias principais de hesteroátomo, e emparticular -CH2-NH-0-CH2-, -CH2-N(CH3)-0-CH2- [conhecido como umacadeia principal de metileno (metilimino) ou de MMI], -CH2-0-N(CH3)-CH2) -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- e -0-N(CH3)-CH2-CH2- [em que a cadeia principalde fosfodiéster nativa é representada como -0-P-0-CH2-] descrita na Pat. U.S. N9 5.489,677 acima referida, e as cadeias principais de amida da Pat. U.S. No.5.602.240 acima referida. Também preferidos são oligonucleotídeosanti-sentidos que têm estruturas de cadeia principal de morfolino da Pat. U.S. NQ 5.034.506 acima referida.

Oligonucleotídeos modificados podem também conter uma oumais porções de açúcar substituída. Oligonucleotídeos preferidoscompreendem um dos seguintes na posição 2': OH; F; O-alquila, S-alquila,ou N-alquila; O-alquenila, S-alquinila, ou N-alquenila; O-alquinila, S-alquinilaou N-alquinila; ou O-alquil-O-alquila, em que a alquila, alquenila e alquinilapodem ser Ci a Cio alquila ou C2 a Ci0 alquenila e alquinila substituída ouinsubstituída. Particularmente preferidos são 0[(CH2)nO]CH3, 0(CH2)nOCH3,0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, 0(CH2)nONH2 e 0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, onde ne m são de 1 a cerca de 10. Outros oligonucleotídeos anti-sentidospreferidos compreendem um dos seguintes na posição 2': Ci a Cio alquilainferior, alquila inferior substituída, alquenila, alquinila, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3,S02-CH3, ON02, N02, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila,aminoalquilamina, polialquilamina, silila substituída, um grupo de clivagemde RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar aspropriedades farmacocinéticas de um oligonucleotídeo, ou um grupo paramelhorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleotídeo, eoutros substituintes tendo propriedades similares.

Uma modificação preferida inclui 2'-metoxietóxi (2'-0-CH2CH2OCH3l também conhecido como 2'-0-(2-metoxietil) ou 2'-MOE)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) isto é, um grupoalcoxialcoxi. Uma modificação preferida também inclui 2'-dimetilaminooxietóxi, isto é, um grupo 0(CH2)20N(CH3)2) também conhecidocomo 2'-DMAOE, como descrito nos exemplos mais abaixo, e 2'-dimetilaminoetoxietóxi (também conhecido na técnica como 2'-0-dimetilaminoetoxietila ou 2'-DMAEOE), isto é, 2'-0-CH2-0-CH2-N(CH2).

Uma modificação preferida adicional inclui ácidos nucléicostravados (LNAs) em que o grupo 2'-hidroxila é ligado aos átomos de carbonodo anel de açúcar de 3' ou 4' assim formando uma porção de açúcarbicíclica. A ligação é preferivelmente um grupo metileno (-CH2-)n queatravessa o átomo de oxigênio de 2' e o átomo de carbono de 4' em que n é1 ou 2. LNAs e preparação destes são descritos em WO 98/39352 e WO99/14226.

Outras modificações preferidas incluem 2'-rhetóxi (2'-0-CH3), 2'-aminopropóxi (2,-OCH2CH2CH2NH2), 2'-alil (2'-CH2-CH=CH2), 2'-0-alil (2'-0-CH2-CH=CH2) e 2'-flúor (2'-F). A modificação de 2' pode ser na posiçãoarabina (para cima) ou posição ribo (para baixo). Uma modificação de 2'-arabino preferida é 2'-F. Modificações similares podem também ser feitas emoutras posições no oligonucleotídeo, particularmente na posição 3' do açúcarno nucleotídeo terminal de 3' ou nos oligonucleotídeos ligados 2'-5' e aposição 5' do nucleotídeo terminal de posição de 5'.

Oligonucleotídeos podem também ter miméticos de açúcar comoporções de ciclobutila no lugar do açúcar de pentofuranosila. Patentes dosEstados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais estruturasde açúcar modificadas incluem, mas não são limitadas a, Pat. U. S. NeS

4.981.9575.466.7865.597.9095.670.633

5.118.8005.514.7855.610.300

5.319.0805.519.1345.627.053

5.359.0445.567.8115.639.873

5.393.8785.576.4275.646.265

5.446.1375.591.7225.658.873

5.792.747; e 5.700.920, cada uma destas é aqui incorporada porreferência em sua totalidade.

Oligonucleotídeos podem também incluir modificações ousubstituições de nucleobase (freqüentemente referida na técnicasimplesmente como "base"). Como aqui usado, nucleobases "inalteradas" ou"naturais" incluem a adenina de bases de purina (a) e guanina (G), e a timinade bases de pirimidina (T), citosina (C) e uracila (U). Nucleobasesmodificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais como5-metilcitosina (5-me-C), citosina de 5-hidroximetila, xantina, hipoxantina,2-aminoadenina, 6-metila e outros derivados de alquila de adenina e guanina,2-propila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila,2-tiotimina e 2-tjocitosina, 5-halouracila e citosina, 5-propinila (-C=C-CH3 ou-CH2-CeCh) uracila e citosina e outros derivados de alquinila de bases depirimidina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila),4-tiouracila, 8-halo, 8-amina, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninase guaninas 8-substituídas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometila eoutras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguaninae 7-deazaadenina e 3-deazaguanina e 3-deazaadenina. Nucleobasesmodificadas também incluem pirimidinas tricíclicas como citidina defenoxazina (1H-pirimido [5,4-b] [1,4]benzoxazin-2(3 H)-ona), citidina defenotiazina (1H-pirimido[5,4-b][l,4]benzotiazin-2(3H)-ona), braçadeiras de Gcomo uma citidina de fenoxazina substituída (por exemplo 9-(2-aminoetóxi)-H-pirimido[5,4-b] [I ,4]benzoxazin-2(3H)-ona), citidina de carbazol (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), citidina de piridoindol (H-pirido[3',2':4,5]pirrol[2,3-d]pirimidin-2-ona).

Nucleobases modificadas podem também incluir aquelas em quea de purina ou de pirimidina é substituída com outros heterociclos, porexemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina e 2-piridona.Nucleobases também incluem aquelas descritas na Pat. U. S. N2 3.687.808,aquelas descritas em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons,1990, e aquelas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, EdiçãoInternacional, 1991, 30, 613. Certas destas nucleobases são particularmenteúteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos dainvenção. Estas incluem pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas epurinas N-2, N-6 e 0-6 substituídas, incluindo substituições de 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina, 5-metilcitosinaforam mostradas aumentar estabilidade de dúplex de ácido nucléico em 0,6-1,2 graus C. (Sanghvi et al, Antisentido Research and Applications, CRCPress, Boca Raton, 1993, págs. 276-278) e substituições de base sãopreferidas, até mesmo mais particularmente quando combinadas commodificações de açúcar de 2'-0-metoxietila. Patentes dos Estados Unidosrepresentativas que ensinam a preparação de nucleobases modificadasincluem, mas não são limitadas a: Pat. U. S. N9 3.687.808, como tambémPat. U. S. N5S: 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066;5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711;5.552.540; 5.587.469; 5.594.121; 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985;5.830.653; 5.763.588; 6.005.096; 5.681.941 e 5.750.692, cada uma destas éaqui incorporada por referência.

Outra modificação de oligonucleotídeos anti-sentidosquimicamente ligando ao oligonucleotídeo uma ou mais porções ouconjugados que intensificam a atividade, distribuição celular ou absorçãocelular do oligonucleotídeo. Os compostos da invenção podem incluir gruposde conjugados covalentemente ligados a grupos funcionais como gruposhidroxila primária ou secundária. Grupos de conjugados da invenção incluemintercaladores, moléculas repórter, poliaminas, poliamidas, polietileno glicóis,poliéteres, grupos que intensificam as propriedades farmacodinâmicas dosoligômeros, e grupos que intensificam as propriedades farmacocinéticas dosoligômeros. Grupos de conjugados típicos incluem colesteróis, lipídios,lipídios de cátion, fosfolipídeos, fosfolipídeos catiônicos, biotina, fenazina,folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceína, rodaminas,cumarinas, e corantes. Grupos que intensificam as propriedadesfarmacodinâmicas, no contexto desta invenção, incluem grupos quemelhoram absorção de oligômero, intensificam a resistência do oligômero àdegradação, e/ou fortalecem hibridização seqüência-específica com RNA.Grupos que intensificam as propriedades farmacocinéticas, no contextodesta invenção, incluem grupos que melhoram a absorção, distribuição,metabolismo ou excreção do oligômero. Porções conjugadas incluem masnão são limitadas às porções de lipídio como uma porção de colesterol(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1989, 86, 6553-6556), ácidoeólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), umtioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N. Y. Acad. Sei.,1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3,2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20,533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ouundecila (Saison-Behmoaras etal., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanovet al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75,49-54), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou trietil-amônio-1-di-O-hexadecil-rac-glicero-S-H-fosfonato (Manoharan et al.,Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990,18, 3777-3783), uma cadeia de poliamina ou uma dê polietileno glicol(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), ou ácidoacético de adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett, 1995, 36, 3651-3654), uma porção de palmitila (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995,1264, 229-237), ou uma porção de octadecilamina ou de hexilamino-carbonil-oxicolesterol.

Oligonucleotídeos da invenção podem também ser conjugadoscom substâncias de fármaco ativo, por exemplo, aspirina, warfarina,fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triiodobenzóico, ácidoflufenâmico, ácido folínico, uma benzotiadiazida, clorotiazida, uma diazepina,indometicina, um barbiturato, um cefalosporina, um fármaco de sulfa, umantidiabético, um antibacteriano ou um antibiótico. Conjugados deoligonucleotídeo-fármaco e sua preparação são descritos no pedido depatente U. S. Ng 09/334.130 (depositado em 15 de jun. 15 de 1999) epatentes dos Estados Unidos NeS: 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105;5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717; 5.580.731

5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077

5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735

4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335

4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830

5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536

5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241; 5.391.723; 5.416.203

5.451.463; 5.510.475; 5.5121667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810

5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923

5.599.928 e 5.688.941, cada uma destas é aqui incorporada por referência.

Não é necessário para todas as posições em um composto dadoserem modificadas uniformemente, e de fato mais que uma dasmodificações acima mencionadas pode ser incorporada em um compostosimples ou até mesmo em um nucleosídeo simples dentro de umoligonucleotídeo. A presente invenção também inclui compostos anti-sentidos que são compostos quiméricos. Compostos anti-sentidos"quiméricos" ou "quimeras", no contexto desta invenção, são compostosanti-sentidos, particularmente oligonucleotídeos contendo duas ou maisregiões quimicamente distintas, cada uma feita de pelo menos uma unidadede monômero, isto é, um nucleotídeo no caso de um composto deoligonucleotídeo. Estes oligonucleotídeos tipicamente contêm pelo menosuma região em que o oligonucleotídeo é modificado para conferir resistênciade oligonucleotídeo aumentada à degradação de nuclease, absorção celularaumentada, e/ou afinidade de ligação aumentada pelo ácido nucléico alvo.Uma região adicional do oligonucleotídeo pode servir como um substratopara enzimas capazes de clivar RNA.DNA ou híbridos de RNA.-RNA. Por viade exemplo, RNase H é uma endonuclease celular que diva o filamento deRNA de um dúplex de RNA:DNA. Portanto, ativação de RNase H resulta emclivagem do alvo de RNA, assim grandemente intensificando a eficiência deinibição de oligonucleotídeo de expressão de gene. Por conseguinte,resultados comparáveis podem freqüentemente ser obtidos comoligonucleotídeos mais curtos quando oligonucleotídeos quiméricos foremusados, comparados aos deoxioligonucleotídeos de fosforotioato quehibridam com a mesma região alvo. Compostos anti-sentidos quiméricos dainvenção podem ser formados como estruturas de compósito de dois oumais oligonucleotídeos, oligonucleotídeos modificados, oligonucleosídeose/ou miméticos de oligonucleotídeo como descritos acima. Oligonucleotídeosanti-sentidos quiméricos preferidos incorporam pelo menos um açúcar 2'modificado (preferivelmente 2'-0-(CH2)2-0-CH3) no terminal 3' para conferirresistência à nuclease e uma região com pelo menos açúcares 4 de 2'-Hcontíguos para conferir atividade de RNase H. Tais compostos tambémforam referidos na técnica como híbridos ou formadores de intervalo.Formadores de intervalo preferidos têm uma região de açúcares de 2'modificados (preferivelmente 2'-0-(CH2)2-0-CH3) no terminal 3' e noterminal 5' separado por pelo menos uma região tendo pelo menos 4açúcares contíguos de 2'-H e preferivelmente incorporam ligações de cadeiaprincipal de fosforotioato. Patentes dos Estados Unidos representativas queensinam a preparação de tais estruturas híbridas incluem, mas não sãolimitadas a, Pat. U. S. NQS 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775;5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355;5.652.356; e 5.700.922, cada uma destas é aqui incorporada por referênciaem sua totalidade.

Os compostos anti-sentidos usados de acordo com estainvenção podem ser conveniente e habitualmente feitos através da técnicabem conhecida de síntese de fase sólida. Equipamento para tal síntese évendido para vários vendedores incluindo, por exemplo, Applied Biosystems(Foster City, Calif.). Quaisquer outros meios para tal síntese conhecida natécnica podem adicionalmente ou como alternativa ser empregados. É bemconhecido usar técnicas similares para preparar oligonucleotídeos como osfosforotioatos e derivados alquilados. Os compostos da invenção podemtambém ser misturados, encapsulados, conjugados ou do contrárioassociados a outras moléculas, estruturas de molécula ou misturas decompostos, como por exemplo, lipossomas, moléculas alvejadas porreceptor, formulações orais, retais, tópicas ou outras, para ajudar naabsorção, distribuição e/ou absorção. Patentes dos Estados Unidosrepresentativas que ensinam a preparação de tais formulações auxiliares decaptura, distribuição e/ou absorção incluem, mas não são limitadas a, Pat. U.S. NoS. 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158;5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013:556;5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619;5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528;5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; e 5.595.756, cada uma destasé aqui incorporada por referência.

Outros exemplos de oligonucleotídeos sentido ou anti-sentidosincluem aqueles oligonucleotídeos que são covalentemente ligados àsporções orgânicas, como aqueles descritos em WO 90/10048, e outrasporções que aumentam afinidade do oligonucleotídeo por uma seqüência deácido nucléico alvo, como poli-(L-lisina). Também ainda, agentes deintercalação, como elipticina, e agentes de alquilação ou complexos de metalpodem ser ligados aos oligonucleotídeos sentido ou anti-sentidos paramodificar as especificidades de ligação do oligonucleotídeo anti-sentido ousentido para a seqüência de nucleotídeo alvo.

Oligonucleotídeos anti-sentido e sentido podem ser introduzidosem uma célula contendo a seqüência de ácido nucléico alvo por qualquermétodo de transferência de gene, incluindo, por exemplo, transfecção deDNA mediada por CaP04, eletroporação, ou usando vetores de transferênciade gene como vírus de Epstein-Barr. Em um procedimento preferido, umoligonucleotídeo anti-sentido ou sentido é inserido em um vetor retroviraladequado. Uma célula contendo a seqüência de ácido nucléico alvo écontatada com o vetor retroviral recombinante, in vivo ou ex vivo. Vetoresretrovirais adequados incluem, mas não são limitados àqueles derivados doretrovírus murino M-MuLV, N2 (um retrovírus derivado de M-MuLV), ou osvetores de cópia dupla designados DCT5A, DCT5B e DCT5C (vide WO90/13641). Oligonucleotídeos sentido ou anti-sentido também podem serintroduzidos em uma célula contendo a seqüência de nucleotídeo alvo porformação de um conjugado com uma molécula de ligação de ligando, comodescrito em WO 91/04753. Moléculas de ligação de ligando adequadasincluem, mas não são limitadas a, receptores de superfície das células,fatores de crescimento, outras citocinas, ou outros ligandos que ligam aosreceptores de superfície das células. Preferivelmente, conjugação damolécula de ligação de ligando não interfere substancialmente com ahabilidade da molécula de ligação de ligando de ligar a sua molécula oureceptor correspondente, ou entrada de bloco do oligonucleotídeo sentido ouanti-sentido ou sua versão conjugada na célula.

Alternativamente, um oligonucleotídeo sentido ou um anti-sentido pode ser introduzido em uma célula contendo a seqüência de ácidonucléico alvo mediante formação de um complexo de oligonucleotídeo-lipídio,como descrito em WO 90/10448. O complexo de oligonucleotídeo-lipídiosentido ou anti-sentido é preferivelmente dissociado dentro da célula poruma lipase endógena.

Moléculas RNA ou de DNA anti-sentido ou sentido são em geralpelo menos cerca de 5 nucleotídeos em comprimento, alternativamente pelomenos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90,95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165,170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280,290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430,440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580,590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730,740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880,890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, ou 1000 nucleotídeosem comprimento, em que neste contexto o termo "cerca de" significa ocomprimento de seqüência de nucleotídeo referido mais ou menos 10%daquele comprimento referido.

As sondas podem também ser empregadas em técnicas de PCRpara gerar um fundo geral de seqüências para identificação de seqüênciasde codificação TAT estritamente relacionadas. Seqüências de nucleotídeoque codificam um TAT podem também ser usadas para sondas dehibridização de constructo para mapear o gene que codifica TAT e para aanálise genética de indivíduos com distúrbios genéticos. As seqüências denucleotídeo fornecidas aqui podem ser mapeadas em um cromossomo eregiões específicas de um cromossomo usando técnicas conhecidas, comohibridização in situ, análise de ligação contra rótulos cromossômicosconhecidos, e triagem de hibridização com bibliotecas.

Quando as seqüências de codificação para TAT codificarem umaproteína que liga a outra proteína (exemplo onde o TAT for um receptor), oTAT pode ser usado em ensaios para identificar as outras proteínas oumoléculas envolvidas na interação de ligação. Por tais métodos, inibidoresda interação de ligação de receptor/ligando podem ser identificados.Proteínas envolvidas em tais interações de ligação podem também serusadas para triar para inibidores de peptídeo ou de molécula pequena ouagonistas da interação de ligação. Também, o receptor de TAT pode serusado para isolar ligando(s) correlativo(s). Ensaios de triagem podem serprojetados para encontrar compostos de chumbo que mimetizam a atividadebiológica de um TAT nativo ou um receptor para TAT. Tais ensaios detriagem incluirão ensaios tratáveis para triagem de processamento alto debibliotecas químicas, os tornando particularmente adequados para identificaros candidatosi de fármaco de molécula pequena. Moléculas pequenascontempladas incluem compostos orgânicos ou inorgânicos sintéticos. Osensaios podem ser executados em uma variedade de formatos, incluindoensaios de ligação de proteína-proteína, ensaios de triagem bioquímica,imunoensaios e ensaios com base em célula que são bem caracterizados natécnica.

Ácidos nucléicos que codificam TAT ou suas formas modificadaspodem também ser usados para gerar animais transgênicos ou animais"nocauteados" que, por sua vez, são úteis no desenvolvimento e triagem dereagentes te rape uticam ente úteis. Um animal transgênico (por exemplo, umcamundongo ou rato) são umas células tendo animais contendo umtransgene, cujo transgene foi introduzido no animal ou um antepassado doanimal em um pré-natal, por exemplo, um estágio embrionário. Umtransgene é um DNA que é integrado no genoma de uma célula da qual umanimal transgênico se desenvolve. Em uma modalidade, TAT de codificaçãode cDNA podem ser usados para clonar TAT de codificação de DNAgenômico de acordo com as técnicas estabelecidas e as seqüênciasgenômicas usadas para gerar animais transgênicos contendo células queexpressam TAT de codificação de DNA. Métodos para gerar animaistransgênicos, particularmente animais como camundongos ou ratos, ficaramconvencionais na técnica e descritos, por exemplo, na patente U. S. NeS4.736.866 e 4.870.009. Tipicamente, células particulares seriam alvejadaspara incorporação de transgene de TAT com intensificadores tecido-específicos. Animais, que incluem uma cópia de um transgene que codificaTAT introduzido na linhagem germinal do animal em um estágio embrionário,podem ser usados para examinar o efeito de expressão aumentada de DNAcodificando TAT. Tais animais podem ser usados como animais de testepara reagentes julgados conferir proteção, por exemplo, das condiçõespatológicas associadas a sua sobreexpressão. De acordo com esta facetada invenção, um animal é tratado com o reagente e uma incidência reduzidada condição patológica, comparados aos animais sem tratar carregando otransgene, indicaria uma intervenção terapêutica potencial para a condiçãopatológica.

Alternativamente, homólogos não-humanos de TAT podem serusados para construir um animal de TAT "nocauteado" tendo um TAT decodificação de gene defeituoso ou alterado como resultado da recombinaçãohomóloga entre o TAT de codificação de gene endógeno e o TAT decodificação de DNA genômico alterado introduzido em uma célula-troncoembrionária do animal. Por exemplo, TAT de codificação de cDNA pode serusado para clonar TAT de codificação de DNA genômico de acordo com astécnicas estabelecidas. Uma porção do TAT de codificação de DNAgenômico pode ser deletada ou pode ser substituída com outro gene, comoum gene que codifica um rótulo selecionável que pode ser usado paramonitorar integração. Tipicamente, vários quilobases de DNA deflanqueamento inalterado (ambas terminações 5' e 3') são incluído no vetor[vide por exemplo, Thomas e Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para umadescrição de vetores de recombinação homólogos]. O vetor é introduzido emuma linhagem de célula-tronco embrionária (por exemplo, através deeletroporação) e as células são selecionadas em que o DNA introduzido foihomologamente recombinado com o DNA endógeno [vide por exemplo, Li etal., Cell, 69:915 (1992)]. As células selecionadas são depois injetadas emum blastocisto de um animal (por exemplo, um camundongo ou rato) paraformar quimeras de agregação [vide por exemplo, Bradley, emTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J.Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), págs. 113-152]. Um embrião quiméricopode depois ser implantado em um animal adotivo fêmea pseudoprenhaadequado e o embrião trazidos de acordo com criar um animal "nocauteado".Progênie abrigando o DNA homologamente recombinado em suas célulasgerminais pode ser identificada através de técnicas padrões e usadas paracriar animais em que todas as células do animal contêm o DNAhomologamente recombinado. Animais nocauteados podem sercaracterizados por exemplo, por sua habilidade para defender contra certascondições patológicas e por seu desenvolvimento de condições patológicasdevido à ausência do polipeptídeo de TAT.

Ácido nucléico que codifica os polipeptídeos de TAT podetambém ser usado em terapia de gene. Em aplicações de terapia de gene,genes em células são introduzidos para alcançar síntese in vivo de umproduto genético terapeuticamente eficaz, por exemplo para substituição deum gene defeituoso. "Terapia de gene" inclui tanto terapia de geneconvencional, onde um efeito duradouro é alcançado por um tratamentosimples, e a administração de agentes terapêuticos de gene* que envolveadministração de uma vez ou repetida de um DNA ou mRNAterapeuticamente eficaz. RNA e DNAs anti-sentidos podem ser usados comoagentes terapêuticos para bloquear a expressão de certos genes in vivo. Foijá mostrado que oligonucleotídeos anti-sentidos curtos podem serimportados para células onde eles agem como inibidores, apesar de suasbaixas concentrações intracelulares causadas por sua absorção restringidapela membrana de célula. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA83:4143-4146 [1986]). Os oligonucleotídeos podem ser modificados paraintensificar sua absorção, por exemplo substituindo seus grupos defosfodiéster negativamente carregados através de grupos descarregados.

Há uma variedade de técnicas disponíveis para introduzir ácidosnucléicos em células viáveis. As técnicas variam, dependendo se o ácidonucléico é transferido para células cultivadas in vitro, ou in vivo nas célulasdo hospedeiro intencionado. Técnicas adequadas para a transferência deácido nucléico em células mamíferas in vitro incluem o uso de lipossomas,eletroporação, microinjeção, fusão de célula, DEAE-dextrana, o método deprecipitação de fosfato de cálcio, etc. As técnicas de transferência de gene invivo correntemente preferidas incluem transfecção com vetores virais(tipicamente retrovirais) e transfecção mediada por proteína-lipossoma derevestimento viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993]).

Em algumas situações é desejável fornecer a fonte de ácido nucléico comum agente que alveja as células alvos, como um anticorpo específico parauma proteína de membrana de superfície celular ou a célula alvo, um ligandopara um receptor na célula alvo, etc. Onde lipossomas forem empregados,proteínas que ligam a uma proteína de membrana de superfície celularassociada à endocitose podem ser usadas para alvejar e/ou facilitarabsorção, por exemplo proteína de capsídeo ou fragmentos destes trópicospara um tipo de célula particular, anticorpos para proteínas que sofreminternalização em ciclismo, proteínas que alvejam localização intracelular eintensificam meia-vida intracelular. A técnica de endocitose mediada porreceptor é descrita, por exemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); e Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 3410-3414(1990). Para revisão de marcação de gene e protocolos de terapia de genevide o Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).

As moléculas de ácido nucléico que codificam os polipeptídeosde TAT ou fragmentos destes descritos aqui são úteis para identificação decromossomo. Nesta consideração, existe uma necessidade contínua paraidentificar rótulos de cromossomo novos, uma vez que relativamente poucosreagentes de marcação de cromossomo, com base em dados de seqüênciasatuais está presentemente disponível. Cada molécula de ácido nucléico deTAT da presente invenção pode ser usada como um rótulo de cromossomo.

Os polipeptídeos de TAT e moléculas de ácido nucléico dapresente invenção podem também ser diagnosticamente usados paratipagem de tecido, em que os polipeptídeos de TAT da presente invençãopodem ser diferencialmente expressos em um tecido quando comparado aoutro, preferivelmente em um tecido doente quando comparado a um tecidonormal do mesmo tipo de tecido. Moléculas de ácido nucléico de TATencontrarão uso para gerar sondas para PCR, análise northern, análisesouthern e análise Ocidental.

Esta invenção abrange métodos de triar compostos paraidentificar aqueles que mimetizam o polipeptídeo de TAT (agonistas) ouimpedem o efeito do polipeptídeo de TAT (antagonistas). Ensaios de triagemsão projetados para candidatos de fármaco de antagonista para identificarcompostos que ligam ou complexam-se com os polipeptídeos de TATcodificados pelos genes identificados aqui, ou do contrário interferem com ainteração dos polipeptídeos codificados com outras proteínas celulares,incluindo por exemplo, inibindo a expressão de polipeptídeo de TAT decélulas. Tais eíisaios de triagem incluirão ensaios tratáveis para triagem deprocessamento alto de bibliotecas químicas, os tornando particularmenteadequados para identificar os candidatos de fármaco de molécula pequena.

Os ensaios podem ser executados em uma variedade deformatos, incluindo ensaios de ligação de proteína-proteína, ensaios detriagem bioquímica, imunoensaios, e ensaios baseados em célula que sãobem caracterizados na técnica.

Todos os ensaios para antagonistas são comuns em que elespedem contato do candidato de fármaco com um polipeptídeo de TATcodificado por um ácido nucléico identificado aqui sob condições e duranteum tempo suficiente para possibilitar estes dois componentes interagirem.

Em ensaios de ligando, a interação é ligação e o complexoformado pode ser isolado ou detectado na mistura de reação. Em umamodalidade particular, o polipeptídeo de TAT codificado pelo geneidentificado aqui ou o candidato de fármaco é imobilizado em uma fasesólida, por exemplo, em uma placa de microlitro, através de ligaçõescovalentes ou não-covalentes. Ligação não-covalente em geral é realizadarevestindo a superfície sólida com uma solução do polipeptídeo de TAT esecando. Alternativamente, um anticorpo imobilizado, por exemplo , umanticorpo monoclonal, específico para o polipeptídeo de TAT a serimobilizado pode ser usado para ancorá-lo a uma superfície sólida. O ensaioé executado adicionando o componente não-imobilizado que pode serrotulado por uma marcação detectável ao componente imobilizado, porexemplo, a superfície revestida contendo o componente ancorado. Quando areação estiver concluída, os componentes não-reagidos são removidos, porexemplo, mediante lavagem, e os complexos ancorados na superfície sólidasão detectados. Quando o componente originalmente não-imobilizadocarregar uma marcação detectável, a detecção de marcação imobilizada nasuperfície indica que complexação ocorreu. Onde o componenteoriginalmente não-imobilizado não carrega uma marcação, complexaçãopode ser detectada, por exemplo, usando um anticorpo rotulado queespecificamente liga o complexo imobilizado.

Se o composto candidato interagir mas não ligar a umpolipeptídeo de TAT particular codificado por um gene identificado aqui, suainteração com aquele polipeptídeo pode ser ensaiada por métodos bemconhecidos para detectar interações de proteína-proteína. Tais ensaiosincluem métodos tradicionais, como, por exemplo, reticulação, co-imunoprecipitação e co-purificação através de gradientes ou colunascromatográficas. Além disso, interações de proteína-proteína podem sermonitoradas usando um sistema genético baseado em levedura descrito porFields e colaboradores (Fields e Song, Nature (Londres), 340:245-246(1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 88:9578-9582 (1991)) comodescrito por Chevray e Nathans, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 5789-5793(1991). Muitos ativadores transcripeionais, como GAL4 de levedura,consistem em dois domínios modulares fisicamente distintos, um agindocomo o domínio de ligação de DNA, o outro funcionando como o domínio deativação de transcrição. O sistema de expressão de levedura descrito naspublicações anteriores (em geral referido como o "sistema dois híbridos") tiravantagem desta propriedade, e emprega duas proteínas híbridas, uma emque a proteína alvo é fundida com o domínio de ligação de DNA de GAL4, eoutra em que proteínas ativas de candidato são fundidas no domínio deativação. A expressão de um gene repórter de GAL1 -lacZ sob controle deum promotor ativado por GAL4 depende da reconstituição da atividade deGAL4 por meio de interação de proteína-proteína. Colônias contendopolipeptídeos de interação são detectadas com um substrato cromogênicopara p-galactosidase. Um kit completo (MATCHMAKER™) para identificarinterações de proteína-proteína entre duas proteínas específicas usando atécnica de dois híbridos está comercialmente disponível de Clontech. Estesistema pode também ser estendido para mapear domínios de proteínaenvolvidos em interações de proteína específicas como também para definirresíduos de aminoácido que são cruciais para estas interações.

Compostos que interferem com a interação de um gene quecodifica um polipeptídeo de TAT identificado aqui e outros componentes intraou extracelulares podem ser testados como segue: usualmente uma misturade reação é preparada contendo o produto do gene e o componente intra-ou extracelular sob condições e durante um tempo para permitir a interaçãoe ligação dos dois produtos. Para testar a habilidade de um compostocandidato para inibir ligação, a reação é operada na ausência e na presençado composto de teste. Além disso, um placebo pode ser adicionado a umaterceira mistura de reação, para servir como controle positivo. A ligação(formação de complexo) entre o composto de teste e o componente intra- ouextracelular presente na mistura é monitorada como aqui acima descrito. Aformação de um complexo na(s) reação(ões) de controle mas não na misturade reação contendo o composto de teste indica que o composto de testeinterfere com a interação do composto de teste e seu par de reação.

Para ensaio para antagonistas, o polipeptídeo de TAT pode seradicionado a uma célula junto com o composto a ser triado para umaatividade particular e a habilidade do composto para inibir a atividade deinteresse na presença do polipeptídeo de TAT indica que o composto é umantagonista para o polipeptídeo de TAT. Alternativamente, antagonistaspodem ser detectados combinando o polipeptídeo de TAT e um antagonistapotencial com polipeptídeo de receptores ligados à membrana de TAT oureceptores recombinantes sob condições apropriadas para um ensaio deinibição competitivo. O polipeptídeo de TAT pode ser rotulado, como porradioatividade, de modo que o número moléculas de polipeptídeos de TATligados ao receptor pode ser usado para determinar a eficácia doantagonista potencial. O gene que codifica o receptor pode ser identificadopor numerosos métodos conhecidos àqueles de habilidade na técnica, porexemplo, ciclo de seleção de ligando e classificação de FACS. Coligan et al.,Current Protocols in Immun., 1(2): Capítulo 5 (1991). Preferivelmente,clonagem de expressão é empregada em que RNA poliadenilado épreparado de uma célula responsiva para o polipeptídeo de TAT e umabiblioteca de cDNA criada deste RNA é dividida em fundo geral e usada paratransfeccionar células de COS ou outras células que não são responsivas aopolipeptídeo de TAT. Células transfeccionadas que são crescidas emlâminas de vidro são expostas ao polipeptídeo de TAT rotulado. Opolipeptídeo de TAT pode ser rotulado por uma variedade de meios incluindoiodação ou inclusão de um sítio de reconhecimento para uma proteínacinase sítio-específica. Seguindo fixação e incubação, as lâminas sãosubmetidas à análise auto-radiográfica. Fundos gerais positivos sãoidentificados e sub-fundos gerais são preparados e re-transfeccionadosusando um processo de sub-agrupamento e re-triagem interativo,eventualmente rendendo um clone simples que codifica o receptor putativo.

Como um método alternativo para identificação de receptor,polipeptídeo de TAT rotulado pode ser ligado por fotoafinidade commembrana de célula ou preparações de extrato que expressam a moléculade receptor. Material reticulado é resolvido através de PAGE e exposto afilme de raio X. O complexo rotulado contendo o receptor pode ser excisado,resolvido em fragmentos de peptídeo, e submetido à microsseqüenciação deproteína. A seqüência de aminoácido obtida de microsseqüenciação seriausada para projetar um conjunto de sondas de oligonucleotídeodegeneradas para triar uma biblioteca de cDNA para identificar o gene quecodifica o receptor putativo.

Em outro ensaio para os antagonistas, células mamíferas ouuma preparação de membrana que expressa o receptor seriam incubadascom polipeptídeo de TAT rotulado na presença do composto candidato.A habilidade do composto para intensificar ou bloquear esta interação pôdedepois ser medida.

Exemplos mais específicos de antagonistas potenciais incluemum oligonucleotídeo que liga às fusões de imunoglobulina com polipeptídeode TAT, e, em particular, anticorpos incluindo, sem limitação, anticorpos poli-e monoclonais e fragmentos de anticorpo, anticorpos de cadeia simples,anticorpos antiidiotípicos, e versões quiméricas ou humanizadas de taisanticorpos ou fragmentos, como também anticorpos humanos e fragmentosde anticorpo. Alternativamente, um antagonista potencial pode ser umaproteína estritamente relacionada, por exemplo, uma forma mutada dopolipeptídeo de TAT que reconhece o receptor mas não dá nenhum efeito,assim competitivamente inibindo a ação do polipeptídeo de TAT.

Outro antagonista potencial de polipeptídeo de TAT é umconstructo de RNA ou de DNA anti-sentido preparado usando tecnologiaanti-sentido onde, por exemplo, uma molécula de RNA ou de DNA anti-sentido age para bloquear a translação de mRNA diretamente para hibridarcom o mRNA alvejado e impedir translação de proteína. Tecnologia anti-sentido pode ser usada para controlar a expressão de gene através daformação de hélice tripla ou DNA ou RNA anti-sentido, ambos destesmétodos são com base na ligação de um polinucleotídeo ao DNA ou RNA.Por exemplo, a porção de codificação de 5' da seqüência de polinucleotídeoque codifica os polipeptídeos de TAT maduros aqui, é usada para projetarum oligonucleotídeo de RNA anti-sentido de cerca de 10 a 40 pares de baseem comprimento. Um oligonucleotídeo de DNA é projetado para sercomplementar a uma região do gene envolvida na transcrição (hélice tripla -vide Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979), Cooney et al., Science, 241- 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), assim impedindotranscrição e a produção do polipeptídeo de TAT. O oligonucleotídeo deRNA anti-sentido híbrida com o mRNA in vivo e bloqueia translação damolécula de mRNA no polipeptídeo de TAT (anti-sentido - Okano,Neurochem, 56 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisentido Inhibitorsof Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Osoligonucleotídeos descritos acima podem também ser liberados às célulasde modo que o RNA ou o DNA anti-sentido possam ser expressados in vivopara inibir produção do polipeptídeo de TAT. Quando o DNA anti-sentido forusado, oligodeoxirribonucleotídeos derivados do sítio de iniciação detranslação, por exemplo, entre cerca das posições de -10 e +10 daseqüência de nucleotídeo de gene alvo, são preferidos.

Antagonistas potenciais incluem moléculas pequenas que ligamao sítio ativo, o sítio de ligação de receptor, ou fator de crescimento ou outrosítio de ligação relevante do polipeptídeo de TAT, assim bloqueando aatividade biológica normal do polipeptídeo de TAT. Exemplos de moléculaspequenas incluem, mas não são limitadas a, peptídeos pequenos oumoléculas semelhantes a peptídeo, preferivelmente peptídeos solúveis, ecompostos orgânicos ou inorgânicos não-peptidila sintéticos.

Ribozimas são moléculas de RNA enzimático capazes decatalisar a clivagem específica de RNA. Ribozimas agem por hibridizaçãoseqüência-específica para o RNA alvo complementar, seguido por clivagemendonucleolítica. Sítios de clivagem de ribozima específicos dentro de umalvo de RNA potencial podem ser identificados através de técnicasconhecidas. Para mais detalhes vide, por exemplo, Rossi, Current Biology.4:469-471 (1994), e publicação do PCT Ne WO 97/33551 (publicada em 18 desetembro de 1997).

Moléculas de ácido nucléico em formação de hélice tripla usadaspara inibir transcrição deveriam ser unifilamentares e compostas dedeoxinucleotídeos. A composição de base destes oligonucleotídeos éprojetada de modo que ela promova formação de hélice tripla por meio deregras paridade com base em Hoogsteen que em geral requerem extensõesconsideráveis de purinas ou pirimidinas em um filamento de um dúplex. Paramais detalhes vide, por exemplo, publicação do PCT NQ WO 97/33551, supra.

Estas moléculas pequenas podem ser identificadas por qualquerum ou mais dos ensaios de triagem debatidos aqui acima e/ou por quaisqueroutras técnicas de triagem bem conhecidas àqueles versados na técnica.

Ácido nucléico de codificação de polipeptídeo de TAT isoladopode ser usado para recombinantemente produzir polipeptídeo de TATusando técnicas bem conhecidas na técnica e como descritas aqui. Por suavez, os polipeptídeos de TAT produzidos podem ser empregados para geraranticorpos de anti-TAT usando técnicas bem conhecidas na técnica e comodescritas aqui.

Anticorpos que especificamente ligam um polipeptídeo de TATidentificados aqui, como também outras moléculas identificadas pelosensaios de triagem descritos anteriormente, podem ser administrados aotratamento de vários distúrbios, incluindo câncer, na forma de composiçõesfarmacêuticas.

Se o polipeptídeo de TAT for anticorpos intracelulares e inteirossão usados como inibidores, anticorpos de interiorização são preferidos.

Porém, lipofecção ou lipossomas podem também ser usados para liberar oanticorpo, ou um fragmento de anticorpo, para as células. Onde fragmentosde anticorpo forem usados, o fragmento inibidor menor que especificamenteliga ao domínio de ligação da proteína alvo é preferido. Por exemplo, combase nas seqüências de região variável dê um anticorpo, moléculas depeptídeo que retém a habilidade para ligar a seqüência de proteína alvopodem ser projetadas. Tais peptídeos podem ser quimicamente sintetizadose/ou produzidos através de tecnologia de DNA recombinante. Vide, porexemplo, Marasco et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 7889-7893 (1993).

A formulação aqui pode também conter mais de um compostoativo quando necessário para a indicação particular sendo tratada,preferivelmente aqueles com atividades complementares que nãoadversamente afetam um ao outro.Alternativamente, ou além disso, a composição podecompreender um agente que intensifica sua função, como, por exemplo, umagente citotóxico, citocina, agente quimioterapêutico, ou agente inibidor decrescimento. Tais moléculas estão adequadamente presentes emcombinação em quantidades que são eficazes para o propósito intencionado.

Os exemplos a seguir são oferecidos para propósitos ilustrativosapenas, e não são intencionados a limitar o escopo da presente invenção deforma alguma.

Todas as referências de patente e da literatura citadas norelatório descritivo presente são por este meio incorporadas por referênciaem sua totalidade.

Exemplos

Reagentes comercialmente disponíveis referidos nos exemplosforam usados de acordo com as instruções do fabricante a menos que docontrário indicado. A fonte daquelas células identificadas nos exemplos aseguir, e ao longo do relatório descritivo, através de números de acessoATCC é a American Type Culture Collection, Manassas, VA.

Exemplo 1: Perfilação de Expressão de Tecido Usando GeneExpress®

Uma base de dados privada contendo informação de expressãode gene (GeneExpress®, Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD) foi analisadaem uma tentativa para identificar polipeptídeos (e seus ácidos nucléicos decodificação) da qual expressão é significativa e detectavelmente sobre-regulada em tecido(s) particular(es) de tumor humano de interesse quandocomparado a outro(s) tumor(es) humano(s) e/ou tecidos humanos normais.

Especificamente, análise da base de dados de GeneExpress® foi conduzidausando qualquer software disponível através de Gene Logic Inc.,Gaithersburg, MD, para uso com a base de dados de GeneExpress® ou comsoftware privado escrito e desenvolvido por Genentech, Inc. para uso com abase de dados de GeneExpress®. A avaliação de golpes positivos na análiseé com base em vários critérios incluindo, por exemplo, especificidade detecido, especificidade de tumor e nível de expressão em tecidos deproliferação essenciais normais e/ou normais. A(s) molécula(s) a seguirapresentarão um perfil de expressão de tecido que mostra expressão detecido alta e sobre-regulação de expressão significativa e reprodutíveldetectável em um tumor ou tumores humano(s) específico(s) quandocomparados a(s) outro(s) tumor(es) humano(s) e/ou tecidos humanosnormais e opcionalmente expressão relativamente baixa em tecidos deproliferação essenciais normais e/ou normais humanos.

Usando a análise de expressão descrita acima, foi determinadoque mRNA que codifica o polipeptídeo de TAT113 mostrado aqui como SEQID NQ:2 é significativa, reprodutiva e detectavelmente sobreexpressado emcertos tipos de tumores cancerosos humanos de cólon e reto quandocomparados ao tecidos de cólon e reto humanos normais correspondente,respectivamente.

A. Cólon

Em um primeiro experimento, expressão de TAT113 foianalisada em um grupo de 237 amostras independentes de tecido de cólonhumano normal. Os resultados destas análises demonstraram que o nível deexpressão de TAT113 de mRNA em todas as amostras de tecido de cólonhumano normal analisadas foi notavelmente consistente e caíram dentro deuma distribuição muito apertada, sem nenhuma amostra de tecido de cólonhumano comprovando maior que um aumento de duas vezes em expressãode TAT113 quando comparado ao nível médio de expressão de TAT113para o grupo de amostras ao todo.

Para propósitos de comparação quantitativa, uma variedade detipos independentes e diferentes de amostras de tecido de cólon humanocanceroso foram também analisadas para expressão de TAT113. Osresultados obtidos destas análises demonstraram que o nível de expressãode TAT113 nas amostras cancerosas foi bastante variável, com um númerosignificativo das amostras cancerosas mostrando um aumento de pelomenos duas vezes (a tão alto quanto cerca de 16 vezes) na expressão deTAT113 quando comparado ao nível médio de expressão de TAT113 para ogrupo de amostras analisadas de tecido de cólon normal. Maisespecificamente, sobreexpressão de TAT113 detectável e reprodutível foiobservada para os tipos de câncer de cólon a seguir quando comparados aocólon normal (em que os números mostrados entre parênteses para cadatipo de câncer representam o número de amostras independentes queapresentaram pelo menos um aumento de 2 vezes em expressão deTAT113 quando comparada ao nível médio de expressão de TAT113 para ogrupo de amostras de tecido de cólon normal analisadas/o número total deamostras de tumor independentes analisadas): adenocarcinoma de cólon delocalização não especificada (4/9), adenocarcinoma do ceco e cólonascendente direito (2735), adenocarcinoma do cólon transversal (76) eadenocarcinoma do cólon descendente direito e sigmóide (21/34).experimentos adicionais foram conduzidos que confirmaram estes resultados.

B. Reto

Em outro experimento, expressão de TAT113 foi analisada emum grupo de 46 amostras independentes de tecido de reto humano normal.

Os resultados destas análises demonstraram que o nível expressão deTAT113 de mRNA em todas as amostras de tecido de reto humano normalanalisadas foi notavelmente consistente e caiu dentro de uma distribuiçãomuito apertada, sem nenhuma amostra de tecido de reto humano normalcomprovando maior que um aumento de 2 vezes em expressão de TAT113quando comparado ao nível médio de expressão de TAT113 para o grupo deamostras como um todo.

Para propósitos de comparação quantitativa, 25 amostrasindependentes de tecido de adenocarcinoma retal humano foram tambémanalisadas para expressão de TATÍ13. Os resultados obtidos destasanálises demonstraram que o nível de expressão de TAT113 nas amostrascancerosas foi bastante variável, com 15 das 25 amostras testadasapresentando pelo menos um aumento de 2 vezes (a tão alto quanto cercade 13 vezes) na expressão de TAT113 quando comparada ao nível médioexpressão de TAT113 para o grupo de amostras de tecido de reto normalanalisadas.

Dado o acima, o polipeptídeo de TAT113 mostrado aqui comoSEQ ID NQ: 2, e o ácido nucléico que codifica aquele polipeptídeo, são alvosexcelentes que podem ser explorados quantitativa e qualitativamentedeterminando o nível de expressão do polipeptídeo de TAT113 mostradoaqui como SEQ ID NQ: 2, e o mRNA que o codifica, em várias amostras detecido mamíferas, assim permitindo-se fazer comparações quantitativas equalitativas entre eles.

Portanto, o polipeptídeo de TAT113 mostrado aqui como SEQ IDNQ: 2, e o ácido nucleico que codifica aquele polipeptídeo, são moléculascujo perfil de expressão único pode ser explorado para a diagnose de certostipos de tumores cancerosos em mamíferos como descritos acima. Alémdisso, como esta análise demonstra que o polipeptídeo de TAT113 ésignificativa, reprodutiva e detectavelmente sobreexpressado em certostumores humanos quando comparados a seus tecidos humanos normaiscorrespondentes, o polipeptídeo de TAT113 serve como um alvo excelenteque pode ser explorado para o tratamento terapêutico de tais tumores emmamíferos.

Exemplo 2: Análise de Microarranjo para Detectar Sobre-Regulacão dePolipeptídeos de Tat em Tumores Cancerosos

Microarranjo de ácido nucleico, freqüentemente contendomilhares de seqüências de gene, é útil para identificar genesdiferencialmente expressos em tecidos doentes quando comparados a suascontrapartes normais. Usando microarranjo de ácido nucleico, amostras demRNA de teste e de controle das amostras de tecido de teste e de controlesão transcritas de forma reversa e rotuladas para gerar sondas de cDNA. Assondas de cDNA são depois hibridadas com um arranjo de ácidos nucléicosimobilizado em um suporte sólido. O arranjo é configurado de modo que aseqüência e posição de cada membro do arranjo sejam conhecidas. Porexemplo, uma seleção de genes conhecidos ser expressos em certosestados de doença pode ser arranjada em um suporte sólido. Hibridizaçãode uma sonda rotulada com um membro de arranjo particular indica que aamostra daquela a sonda foi expressa derivada daquele gene. Se o sinal dehibridização de uma sonda de uma amostra de teste (tecido de doença) formaior que o sinal de hibridização de uma sonda de uma amostra de controle(tecido normal), o gene ou genes sobreexpressados no tecido de doençasão identificados. A implicação deste resultado é que uma proteínasobreexpressada em um tecido doente não só é útil como um rótulodiagnóstico para a presença da condição de doença, mas também como umalvo terapêutico para tratamento da condição de doença.

A metodologia de hibridização de ácidos nucléicos e tecnologiade microarranjo é bem conhecida na técnica. No exemplo presente, apreparação específica de ácidos nucléicos para hibridização e sondas,lâminas, e condições de hibridização é toda detalhada no Pedido de Patentedo PCT Ne PCT/USOI/10482, depositado em 30 de março de 2001 e que éaqui incorporado por referência.

No presente exemplo, os tumores cancerosos derivados devários tecidos humanos foram estudados para expressão de gene sobre-regulado com relação aos tumores cancerosos de tipos de tecido diferentese/ou tecidos humanos não-cancerosos em uma tentativa para identificaraqueles polipeptídeos que são sobreexpressados em um/uns tumor(es)canceroso(s) particular(es). Em certos experimentos, tecido de tumorhumano canceroso e tecido de tumor humano não-canceroso do mesmo tipode tecido (freqüentemente do mesmo paciente) foram obtidos e analisadospara expressão de polipeptídeo de TAT. Adicionalmente, tecido de tumorhumano canceroso de qualquer uma variedade de tumores humanosdiferentes foi obtido e comparado a uma amostra "universal" de controleepitelial que foi preparada agrupando tecidos humanos não-cancerosos deorigem epitelial, incluindo fígado, rim e pulmão. mRNA isolado dos tecidosepiteliais agrupados representa uma mistura de produtos de gene expressosde vários tecidos epiteliais diferentes, assim fornecendo um controlenegativo excelente junto ao qual para quantitativamente comparar níveis deexpressão de gene em tumores de origem epitelial. Experimentos dehibridização de microarranjo usando as amostras de controle agrupadasgeradas de um diagrama linear em uma análise de duas cores. O declive dalinha gerada em uma análise de duas cores foi depois usado para normalizaras razões de (detecção de teste:controle) dentro de cada experimento. Asrazões normalizadas de vários experimentos foram depois comparadas eusadas para identificar agrupamento de expressão de gene. Desse modo, aamostra de "controle universal" agrupada não só permitiu determinações deexpressão de gene relativamente eficazes em uma comparação de duasamostras simples, também permitiu comparações de multi-amostras aolongo de vários experimentos.

Nos experimentos presentes, sondas de ácido nucléicoderivadas das seqüências de ácido nucléico de codificação de polipeptídeode TAT aqui descritas foram usadas na criação do microarranjo e RNA devários tecidos de tumor foi usado para a hibridização com este. Um valorcom base na razão normalizada : razão experimental foi designado comouma "razão de corte". Apenas valores que ficaram acima desta razão decorte foram determinados ser significativos. Significação de razões foiestimada da quantidade de ruído ou difração associada a cada experimento,mas tipicamente, uma razão de corte de 1,8 vez - 2 vezes ou maior foi usadapara identificar genes candidatos relativamente sobreexpressados emamostras de tumor comparadas ao tecido normal correspondente e/ou ocontrole universal epitelial normal agrupado. Razões para genesidentificados desse modo como sendo relativamente sobreexpressados emamostras de tumor variaram de duas vezes a 40 vezes, ou até mais. Porcomparação, em um experimento de controle em que o mesmo RNA foirotulado em cada cor e hibridado consigo mesmo, para virtualmente todosgenes com sinais acima da base, a razão observada é significativamentemenor que 1,8 vez. Isto indica que o ruído experimental acima de uma razãode 1,8 vez é extremamente baixo, e que uma alteração de vezes observadade 1,8 vez ou maior é significativa e esperada representar uma realidade,diferença detectável e reprodutivelmente em expressão entre as amostrasanalisadas e comparadas.

Os resultados destes experimentos demonstraram que mRNAque codifica o polipeptídeo de TAT113 mostrado no presente pedido depatente como SEQ ID NQ: 2 é sobreexpressado significativamente (isto é,pelo menos duas vezes) em mais que 50% das 75 amostras de tumor decólon humano independentes testadas quando comparadas ao tecido decólon humano normal e à amostra de controle epitelial agrupada. Estesdados também demonstram que a sobreexpressão observada é significativa,detectável e reprodutível ao longo das amostras múltiplas de tumor de cólonhumano quando comparadas tanto às amostras de cólon humano decontraparte normal como também à amostra de controle epitelial humanaagrupada. Como descrito acima, estes dados demonstram que opolipeptídeo de TAT113 da presente invenção, e o ácido nucléico decodificação, não só são úteis como rótulos diagnósticos para a presença detumores de cólon humano, mas também servem como alvos terapêuticospotenciais para o tratamento daqueles tumores em humanos.

Exemplo 3: Análise Quantitativa De Expressão Ee Mrna Ee Tat

Neste ensaio, um ensaio de nuclease de 5' (por exemplo,TaqMan®) e PCR quantitativa de tempo real (por exemplo, ABI Prizm 7700Sequence Detection System® (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division,Foster City, CA)) foram usados para encontrar genes que sãosignificativamente sobreexpressados em um tumor ou tumores cancerososquando comparados a outros tumores cancerosos ou tecido não-cancerosonormal. A reação de ensaio de nuclease de 5' é uma técnica baseada emPCR fluorescente que faz uso da atividade de exonuclease de 5' da enzimaTaq DNA polimerase para monitorar expressão de gene em tempo real. Doisiniciadores de oligonucleotídeo (cujas seqüências são com base no gene ouseqüência de EST de interesse) são usados para gerar um amplicon típicode uma reação de PCR. Um terceiro oligonucleotídeo, ou sonda, é projetadopara detectar seqüência de nucleotídeo localizada entre os dois iniciadoresde PCR. A sonda é não-extensível através da enzima de Taq DNApolimerase, e é rotulada com um corante fluorescente repórter e um corantefluorescente extinguível. Qualquer emissão do corante repórter induzido alaser é extinguida pelo corante/extinguível quando os dois corantes foremlocalizados juntos uma vez estão na sonda. Durante a reação deamplificação de PCR, a enzima Taq DNA polimerase diva a sonda de umamaneira modelo-dependente. Os fragmentos de sonda resultantesdesassociam-se na solução, e o sinal do corante repórter liberado é livre doefeito extintor do segundo fluoróforo. Uma molécula de corante repórter éliberada para cada molécula nova sintetizada, e detecção do coranterepórter inextinguível prove a base para interpretação quantitativa equantitativa dos dados. Este ensaio é bem conhecido e habitualmente usadona técnica para quantitativamente identificar as diferenças de expressão degene entre duas amostras de tecido humano diferentes, vide, por exemplo,Higuchi et al.. Biotechnology 10:413-417 (19921; Livak et al., PCR MethodsAppl., 4:357-362 (1995); Heid et al., Genome Res. 6:986-994 (1996);Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(25): 14717-14722 (1998); Pitti etal., Nature 396(6712):699-703 (1998) e Bieche et al., Int. J. Câncer 78:661-666(1998).

O procedimento de nuclease de 5' é operado em um dispositivode PCR quantitativa de tempo real como ABI Prism 7700TM SequenceDetection. O sistema consiste em um termociclizador, laser, dispositivo decarga acoplada (CCD) câmera e computador. O sistema amplifica asamostras em um formato de 96 cavidades em um termociclizador. Duranteamplificação, o sinal fluorescente induzido a laser é colhido em tempo realatravés de cabos de fibróptica para todas as 96 cavidades, e detectado noCCD. O sistema inclui software para operar o instrumento e analisar osdados.

O material de partida para a triagem foi mRNA isolado de umavariedade de tecidos cancerosos diferentes. O mRNA é precisamentequantificado, por exemplo, fluorometricamente. Como um controle negativo,RNA foi isolado de vários tecidos normais do mesmo tipo de tecido como ostecidos cancerosos sendo testados. Freqüentemente, a(s) amostra(s) detumor é/são comparada(s) diretamente à(s) amostra(s) normal(is)"emparelhada(s)" do mesmo tipo de tecido, significando que o tumor e a(s)amostra(s) normal(is) é/são obtida(s) do mesmo indivíduo.

Dados de ensaio de nuclease de 5' são expressadosinicialmente como Ct, ou o ciclo de limiar. Este é definido como o ciclo noqual o sinal repórter acumula acima do nível de base de fluorescência. Osvalores ACt são usados como medição quantitativa do número relativo decópias de partida de uma seqüência alvo particular em uma amostra deácido nucléico ao comparar os resultados de mRNA de câncer aosresultados de mRNA de humanos normais. Como uma unidade de Ctcorresponde a 1 ciclo de PCR ou aproximadamente um aumento relativo de2 vezes com relação ao normal, duas unidades correspondem a umaumento relativo de 4 vezes, 3 unidades correspondem a um aumentorelativo de 8 vezes e assim por diante, pode-se quantitativa equantitativamente medir o aumento relativo em vezes em expressão demRNA entre dois ou mais tecidos diferentes. Nesta consideração, é bemacordado na técnica que este ensaio é suficientemente de forma técnicasensível para reprodutivamente detectar um aumento de pelo menos 2vezes em expressão de mRNA em uma amostra de tumor humano comrelação a um controle normal.

Usando esta técnica, foi determinado que mRNA que codifica opolipeptídeo de TAT113 mostrado no presente pedido de patente como SEQID N9: 2 é significativa e reprodutivamente sobreexpresso (isto é, pelo menos2 vezes) em todos os 9 das 9 amostras independentes de tumor de cólonhumano quando comparadas a ambas as amostras de cólon humano normalde doadores de tecido humano diferentes como também várias amostras detumor de cólon humano normal "emparelhadas" derivadas do mesmo doadorde tecido humano como do qual a amostra(s) de tumor foi/foram derivada(s).Como descrito acima, portanto, estes dados demonstram que o polipeptídeode TAT113 da presente invenção, e o ácido nucléico de codificação, não sósão úteis como rótulos diagnósticos para a presença de tumores de cólonhumano, mas também servem como alvos terapêuticos potenciais para otratamento daqueles tumores em humanos.

Exemplo 4: Hibridizacão in situ

Hibridização in situ é uma técnica poderosa e versátil para adetecção e localização de seqüências de ácido nucléico dentro de célula oupreparações de tecido. Pode ser útil, por exemplo, identificar sítios deexpressão de gene, analisar a distribuição de tecido de transcrição,identificar e localizar a infecção viral, seguir alterações na síntese de mRNAespecífica e auxiliar no mapeamento cromossômico. Hibridização in situ foiexecutada seguindo uma versão otimizada do protocolo por Lu e Gillett, Cell,Vision 1:169-176 (1994), usando ribosondas rotuladas com 33P geradas porPCR. Brevemente, tecidos humanos embebidos em parafina fixados emformalina foram seccionados, desparafinizados, desproteinados emproteinase K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37°C, e também processadospara hibridização in situ como descrito por Lu e Gillett, supra. Umaribossonda anti-sentido rotulada com [33P]-UTP foi gerada de um produto dePCR e hibridada a 55°C durante a noite. As lâminas foram imersas ememulsão de trilha nuclear de Kodak NTB2 e expostas durante 4 semanas.

Síntese De P-Ribossonda

6,0 ul (125 mCi) de 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA <2000Ci/mmol) foram secados em vac de velocidade. A cada tubo contendo 33P-UTP secado, foram adicionados os ingredientes a seguir:

2,0 ul 5x tampão de transcrição

1,0 ul DTT (100 mM)

2,0 ul mistura de NTP (2,5 mM: 10 u; cada um de 10 mM GTP, CTP & ATP + 10 ul H20)

1,0 ul UTP(50uM)

1,0ulRnasin

1,0 ul modelo de DNA (1 ug)

1,0ulH2O

1,0 ul RNA polimerase (para produtos de PCR T3 = AS, T7 = S, usualmente)

Os tubos foram incubados a 37°C durante uma hora. 1,0 ul deRQ1 DNase foi adicionado, seguido por incubação a 37°C durante 15minutos. 90 ul TE (10 mM Tris pH 7,6/1 mM EDTA pH 8,0) foramadicionados, e a mistura foi pipetada sobre papel de DE81. A soluçãorestante foi carregada em uma unidade de ultrafiltração de Microcon-50, egirada usando programa 10 (6 minutos). A unidade de filtração foi invertidaem um segundo tubo e girada usando programa 2 (3 minutos). Após o girode restabelecimento final, 100 ul TE foram adicionados. 1 ul do produto finalfoi pipetado em papel de DE81 e contado em 6 ml de Biofluor II.

A sonda foi operada em um gel de TBE/uréia. 1-3 ul da sonda ou5 ul de RNA Mrk IU foram adicionados a 3 pi de tampão de carregamento.Após aquecer em um bloco de calor a 95°C durante três minutos, a sonda foicolocada imediatamente em gelo. As cavidades de gel foram fluxados, aamostra carregada, e operada a 180-250 volts durante 45 minutos. O gel foiembrulhado em envoltório de Saran e exposto ao filme de XAR com umatela intensificadora em congelador a -70°C uma hora durante a noite.Hibridizacão de 33P

A. Pré-tratamento de Seções Congeladas

As lâminas foram removidas do congelador, colocadas embandejas de alumínio e descongeladas para temperatura ambiente durante 5minutos. As bandejas foram colocadas em incubadora a 55°C durante cincominutos para reduzir a condensação. As lâminas foram fixadas durante 10minutos em 4% paraformaldeído em gelo na coifa, e lavadas em 0,5 x SSCdurante 5 minutos, em temperatura ambiente (25 ml 20 x SSC + 975 ml SQH20). Após desproteinação em 0,5 ug/ml proteinase K durante 10 minutos a37°C (12,5 ul de 10 mg/ml matéria-prima em 250 ml tampão RNAse livre deRNase pré-aquecido), as seções foram lavadas em 0,5 x SSC durante 10minutos em temperatura ambiente. As seções foram desidratadas em 70%,95%, 100% etanol, 2 minutos cada.

B. Pré-tratamento de Seções Embebidas em Parafina

As lâminas foram desparafinizadas, colocadas em SQ H20, eenxaguadas duas vezes em 2 x SSC em temperatura ambiente, por 5minutos cada vez. As seções foram desproteinadas em 20 ug/ml proteinaseK (500 pi de 10 mg/ml em 250 ml de tampão de RNase livre de RNase; 37°C,15 minutos) - embrião humano, ou 8 x proteinase K (100 ul em 250 ml detampão de Rnase, 37°C, 30 minutos) - tecidos de formalina. Enxágüessubseqüentes em 0,5 x SSC e desidratação foram executados como descritoacima.C. Pré-hibridizacão

As lâminas foram dispostas em uma caixa de plástico forrada compapel de filtro saturado com tampão de Caixa (4 x SSC, 50% formamida)-.

D. Hibridização

1,0 x 106 cpm sonda e 1,0 ul tRNA (50 mg/ml matéria-prima) porlâmina foram aquecidos a 95°C durante 3 minutos. As lâminas foramesfriadas em gelo, e 48 ul de tampão de hibridização foram adicionados porlâmina. Após submissão a vórtice, 50 ul de mistura de 33P foram adicionadosa 50 ul de pré-hibridização em lâmina. As lâminas foram incubadas durante anoitea55°C.

E. Lavagens

Lavagem foi feita 2 x 10 minutos com 2 x SSC, EDTA emtemperatura ambiente (400 ml de 20 x SSC + 16 ml 0,25M EDTA, seguidopor tratamento de RNaseA a 37°C durante 30 minutos (500 ul de 10 mg/mlem 250 ml de tampão de Rnase = 20 ug/ml). As lâminas foram lavadas 2x10 minutos com 2 x SSC, EDTA em temperatura ambiente. As condições delavagem de severidade foram como segue: 2 horas a 55°G, 0,1 x SSC,EDTA (20 ml 20 x SSC + 16 ml EDTA, VF4L).

F. Oligonucleotídeos

Análise in situ foi executada em uma variedade de seqüênciasde DNA descritas aqui. Os oligonucleotídeos empregados para estasanálises foram obtidos para ser complementares aos ácidos nucléicos (ou oscomplementos destes) como mostrado nas figuras em anexo.

G. Resultados

Análises de hibridização in situ foram executadas no ácidonucléico que codifica o polipeptídeo de TAT113 mostrado aqui como SEQ IDN-: 2. Os resultados destas análises mostraram expressão forte do gene deTAT113 em 10/22 amostras de câncer de cólon humano primárioindependentes e 6/9 amostras de câncer de cólon metastáticoindependentes analisadas. Ao contrário, nenhuma expressão detectável (ouexpressão significativamente inferior) de TAT113 foi observada em todas asamostras de tecido de cólon normal analisadas.Exemplo 5: Verificação e Análise de Expressão de Polipeptídeo de Tat deDiferencial por Gepis

Polipeptídeos de TAT que podem ter sido identificados como umantígeno de tumor como descrito em um ou mais dos Exemplos acima foramanalisados e verificados como segue. Uma base de dados de DNA de rótulode seqüência expressa (EST) (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Paio Alto,CA) foi pesquisada e as seqüências de EST interessantes foramidentificadas por GEPIS. Perfilação da expressão de gene in silico (GEPIS) éuma ferramenta da bioinformática desenvolvida por Genentech, Inc. quecaracteriza genes de interesse para novos alvos terapêuticos de câncer.GEPIS tira proveito de quantidades grandes de seqüência de EST einformação de biblioteca para determinar perfis de expressão de genporexemploEPIS é capaz de determinar o perfil de expressão de um gene combase em sua correlação proporcional com o número de suas ocorrências embases de dados de EST, e trabalha integrando o banco de dados relacionaide LIFESEQ® e informação privada de Genentech em um modo rigoroso eestatisticamente significante. Neste exemplo, GEPIS é usado para identificare validar cruzado antígenos de tumor novos, embora GEPIS possa serconfigurado para executar quaisquer análises muito específicas ou tarefasde triagem vastas. Para a triagem inicial, GEPIS é usado para identificarseqüências de EST da base de dados de LIFESEQ® que correlata com aexpressão em um tecido ou tecidos particulares de interesse(freqüentemente um tecido de tumor de interesse).

As seqüências de EST identificadas nesta triagem inicial (ouseqüências de consenso obtidas de alinhamento múltiplo relacionado eseqüências de EST de sobreposição obtidas da triagem inicial) foram depoissubmetidas a uma triagem intencionada para identificar a presença de pelomenos um domínio de transmembrana na proteína codificada. Por fim,GEPIS foi empregado para gerar um perfil de expressão de tecido completopara as várias seqüências de interesse. Usando este tipo de bioinformáticade triagem, vários polipeptídeos de TAT (e suas moléculas de codificação deácido nucléico) foram identificados como sendo significativamentesobreexpressados em um tipo particular de câncer ou certos cânceresquando comparados a outros cânceres e/ou tecidos não-cancerosos normais.A avaliação de repetições de GEPIS é com base em vários critérios incluindo,por exemplo, especificidade de tecido, especificidade de tumor e nível deexpressão em essencial tecidos de proliferação normais e/ou normais.

Usando a análise de expressão de GEPIS descrita acima, foideterminado que mRNA que codifica o polipeptídeo de TAT113 mostradoaqui como SEQ ID N-: 2 é significativa, reprodutiva e detectavelmentesobreexpresso em amostras de tumor de cólon humano quando comparadoao tecido de cólon normal correspondente. Como tal, o polipeptídeo deTAT113 mostrado aqui como SEQ ID Ne: 2, e o ácido nucléico que codificaaquele polipeptídeo, são alvos excelentes que podem ser explorados paraquantitativa e qualitativamente determinar o nível de expressão dopolipeptídeo de TAT113 mostrado aqui como SEQ ID N-: 2, e o mRNA que ocodifica, em várias amostras de tecido mamífero, assim permitindo-se fazercomparações quantitativas e qualitativas entre eles. Portanto, o polipeptídeode TAT113 mostrado aqui como SEQ ID N9: 2, e o ácido nucléico quecodifica aquele polipeptídeo, são alvos excelentes que podem serexplorados para a diagnose de tumor em mamíferos. Além disso, como estaanálise demonstra que o polipeptídeo de TAT113 é significativa, reprodutivae detectavelmente sobreexpresso em certos tumores humanos quandocomparado a seus tecidos humanos normais correspondentes, opolipeptídeo de TAT113 serve como um alvo excelente que pode serexplorado para o tratamento terapêutico de tal tumores em mamíferos.

Exemplo 6: Preparação de Anticorpos que Ligam Tat113

Técnicas para produzir anticorpos monoclonais são conhecidasna técnica e são descritas, por exemplo, em Goding, supra. Imunógenos quepodem ser empregados incluem polipeptídeos de TAT purificados, proteínasde fusão contendo polipeptídeos de TAT, e células que expressampolipeptídeos de TAT recombinantes na superfície das células. Seleção doimunógeno pode ser feita pelo artesão versado sem experimentaçãoimprópria.Camundongos, como Balb/c, são imunizados com o imunógenode TAT emulsificado em adjuvante de Freund completo e injetadosubcutânea ou intraperitonealmente em uma quantidade de 1-100microgramas. Alternativamente, o imunógeno é emulsionado em adjuvantede MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e injetado naspatas traseiras do animal. Os camundongos imunizados são depoisreforçados 10 a 12 dias depois com imunógeno adicional emulsificado noadjuvante selecionado. Depois disso, durante várias semanas, oscamundongos podem também ser reforçados com injeções imunizaçãoadicionais. Amostras de soro podem ser obtidas periodicamente doscamundongos através de hemorragia retro-orbital para testar em ensaios deELISA para detectar anticorpos de anti-TAT,

Após uma titulação de anticorpo adequada ter sido detectada, osanimais "positivos" para anticorpos podem ser injetados com uma injeçãointravenosa final de TAT. Três a quatro dias depois, os camundongos sãosacrificados e as células do baço são colhidas. As células do baço sãodepois fundidas (usando 35% de polietileno glicol) para uma linhagemcelular de mieloma murino selecionada como P3X63AgU.1, disponível deATCC, Ne CRL 1597. As fusões geram células de hibridoma que podemdepois ser banhadas em placas de cultura de tecido de 96 cavidadescontendo meio de HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibirproliferação de células não-fundidas, híbridos de mieloma, e híbridos decélula de baço.

As células de hibridoma são tríadas em um ELISA parareatividade contra TAT. Determinação de células "positivas" de hibridomaque segregam os anticorpos monoclonais desejados contra TAT estãodentro da habilidade na técnica.

As células de hibridoma positivas podem ser injetadasintraperitonealmente em camundongos de Balb/c singenéicos para produzirascites contendo os anticorpos monoclonais de anti-TAT. Alternativamente,as células de hibridoma podem ser crescidas em frascos de cultura de tecidoou garrafas-rollos. Purificação dos anticorpos monoclonais produzidos nosascites pode ser realizada usando precipitação de sulfato de amônio,seguida por cromatografia de exclusão em gel. Alternativamente,cromatografia de afinidade com base na ligação do anticorpo à proteína A ouproteína G pode ser empregada.

Usando a técnica acima descrita, 12 linhagens celulares dehibridoma separadas e distintas foram geradas, cada uma destas produzanticorpos monoclonais que ligam ao polipeptídeo de TAT113 mostradocomo SEQ ID N9: 2. Estas 12 linhagens celulares de hibridoma são aquireferidas como 12E5.1.1 (produzindo anticorpo monoclonal 12E5), 6G10,1.1(produzindo anticorpo monoclonal 6G10), 17C12.7.8 (produzindo anticorpomonoclonal 17C12), 1B5.1.3 (produzindo anticorpo monoclonal 1B5),6H10.3.11 (produzindo anticorpo monoclonal 6H10), 17H5.25.1 (produzindoanticorpo monoclonal 17H5), 15B6.4.1 (produzindo anticorpo monoclonal15B6), 11A12.3.2 (produzindo anticorpo monoclonal 11A12), 13A7.1.8(produzindo anticorpo monoclonal 13A7), 4DI. 1.2.1 (produzindo anticorpomonoclonal 4DI), 14A3.1.1 (produzindo anticorpo monoclonal 14A3) e10FI 1.11.11.11 (produzindo anticorpo monoclonal 10F11). Os anticorposmonoclonais produzidos por estas 12 linhagens de hibridoma forammostrados ligar ao polipeptídeo de TAT113 mostrado como SEQ ID N9: 2usando técnicas bem conhecidas e habitualmente empregadas comowestern blot, análise de ELISA, análise de classificação de FACS de célulasexpressando o polipeptídeo de TAT113 e/ou análise de imunoistoquímica.Das 12 linhagens de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais anti-TAT113 funcionais, dois (clones de hibridoma 12E5.1.1 e 6G10.1.1) foramdepositados sob a condição do Tratado de Budapeste com a AmericanTissue Type Collection, Manassas, VA como descrito em mais detalhesabaixo.

Exemplo 7: Análises de Ligação Competitiva e Mapeamento de Epítopo

Os epítopos de TAT113 ligados pelos anticorpos monoclonaisdescritos foram determinados por análise de ligação competitiva padrão(Fendly et al., Câncer Research 50: 1550-1558 (1990)). Estudos de bloqueiocruzado foram feitos em anticorpos através de fluorescência direta emcélulas de PC3 intactas criados para expressar TAT113 usando aPANDEX™ Screen Machine para quantificar a fluorescência. Cada anticorpomonoclonal foi conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC), usandoprocedimentos estabelecidos (Wofsy et al., Selected Mehods in CellularImmuunology, pág. 287, Mishel e Schiigi (eds.) São Francisco: W.J.Freeman Co. (1980)). Monocamadas confluentes de células de PC3 deexpressão de TAT113 foram tripsinadas, lavadas uma vez e ressuspensas a1,75 x 106 célula/ml em PBS frio contendo 0,5% de albumina de soro bovino(BSA) e 0,1% de NaN3. Uma concentração final de 1% de partículas de látex(IDC, Portland, OU) foi adicionada para reduzir o entupimento dasmembranas de placa PANDEX™. Células em suspensão, 20 ul, e 20 ul deanticorpos monoclonais purificados (100 ug/ml a 0,1 ug/ml) foramadicionados às cavidades da placa PANDEX™ e incubados em gelo durante30 minutos. Uma diluição predeterminada de anticorpos monoclonaisrotulados com FITC em 20 ul foi adicionada a cada cavidade, incubadadurante 30 minutos, lavada e a fluorescência foi quantificada pelaPANDEX™ Screen Machine. Os anticorpos monoclonais foramconsiderados compartilhar um epítopo se cada um bloqueasse ligação dooutro em 40% ou mais em comparação com um controle de anticorpomonoclonal irrelevante e na mesma concentração de anticorpo. Nesteexperimento, anticorpos monoclonais 12E5, 17C12, 1B5, 6H10, 17H5, 15B6,11A12, 13A7, 4D1, 14A3 e 10F11 foram designados epítopos TAT113 B, A,D, E, F, A, B, A, A, A e C, respectivamente. Usando este ensaio, alguémversado na técnica pode identificar outros anticorpos monoclonais que ligamao mesmo epítopo que aqueles descritos acima.

Exemplo 8: Preparação dos Anticorpos Conjugados com Toxina que LigamTat113

O uso de conjugados de anticorpo-fármaco (ADC), isto éimunoconjugados, para a liberação local de agentes citotóxicos oucitoestáticos, isto é, fármacos para matar ou inibir células tumorais notratamento de câncer (Payne (2003) Câncer Cell 3:207-212; Syrigos eEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz eSpringer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; US 4.975.278) permiteliberação alvejada da porção do fármaco aos tumores, e acumulaçãointracelular nele, onde administração sistêmica destes agentes de fármaconão-conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para ascélulas normais como também as células tumorais buscadas ser eliminadas(Baldwin et al., (1986) Lancei (Arruine. 15, 1986) págs. 603-05; Thorpe,(1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review",em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinicai Application, Pincheraet al. (eds.), págs.475-506). Eficácia máxima com toxicidade mínima ébuscada assim. Esforços para projetar e refinar ADC focalizaram naseletividade de anticorpos monoclonais (mAbs) como também propriedadesde ligação de fármaco e de liberação de fármaco. Anticorpos policlonais eanticorpos monoclonais foram relatados como úteis nestas estratégias(Rowland et al., (1986) Câncer Immunol. Immunother., 21:183-87).

Fármacos usados nestes métodos incluem daunomicina, doxorrubicina,metotrexato e vindesina (Rowland et al., (1986) supra). Toxinas usadas emconjugados de anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas como toxina dedifteria, toxinas de planta como ricina, toxinas de molécula pequena comogeldanamicina (Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Câncer Inst. 92(19):1573-1581; Mandleriet al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028;Mandler et al. (2002) Bioconiugate Chem. 13:786-791), maitansinóides (EP1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sri. USA 93:8618-8623), ecaliqueamicina (Lode et al. (1998) Câncer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993)Câncer Res. 53:3336-3342).

Técnicas para produzir conjugados de anticorpo-fármaco ligandotoxinas aos anticorpos purificados são bem conhecidas e habitualmenteempregadas na técnica. Por exemplo, conjugação de um anticorpomonoclonal purificado com a toxina DM1 pode ser realizada como segue.Anticorpo purificado é derivatizado com N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato para introduzir grupos ditiopiridila. Anticorpo (376,0 mg,8 mg/ml) em 44,7 ml de 50 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 6,5)contendo NaCI (50 mM) e EDTA (1 mM) é tratado com SPP (5,3equivalentes molares em 2,3 ml de etanol). Após incubação durante 90minutos sob argônio em temperatura ambiente a mistura de reação foifiltrada em gel através de uma coluna de Sephadex G25 equilibrada com 35mM citrato de sódio, 154 mM NaCI e 2 mM EDTA. Frações contendoanticorpo são depois agrupadas e ensaiadas. Anticorpo-SPP-Py (337,0 mgcom grupos 2-tiopiridina liberáveis) é diluído com os 35 mM tampão decitrato de sódio acima, pH 6,5, para uma concentração final de 2,5 mg/ml.DM1 (1,7 equivalente, 16,1 rnols) em 3,0 mM de dimetilacetamida (DMA, 3%v/v na mistura de reação final) é depois adicionado à solução de anticorpo. Areação é deixada prosseguir em temperatura ambiente sob argônio durante20 horas. A reação é carregada em uma coluna de filtração em gelSephacryl S300 (5,0 cm x 90,0 cm, 1,77 L) equilibrada com 35 mM citrato desódio, 154 mM NaCI, pH 6,5. A taxa de fluxo é 5,0 uVmin e 65 frações (20,0ml cada) são colhidas. As frações são agrupadas e ensaiados, em que onúmero de moléculas de fármaco de DM1 ligado por molécula de anticorpo(p') é determinado medindo a absorbância a 252 nm e 280 nm.

Para propósitos ilustrativos, conjugação de um anticorpomonoclonal purificado com a toxina DM1 pode também ser realizada comosegue. Anticorpo purificado é derivatizado com cicloexano-1-carboxilato de(succinimidil 4-(N-maleimidometila) (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) paraintroduzir o ligante de SMCC. O anticorpo é tratado a 20 mg/ml em 50 mMfosfato de potássio/50 mM cloreto de sódio/2 mM EDTA, pH 6,5 com 7,5equivalentes molares de SMCC (20 mM em DMSO, 6,7 mg/ml). Após agitardurante duas horas sob argônio em temperatura ambiente, a mistura dereação é filtrada através de uma coluna de Sephadex G25 equilibrada com50 mM fosfato de potássio/50 mM cloreto de sódio/2 mM EDTA, pH 6,5.Frações contendo anticorpo são agrupadas e ensaiadas. Anticorpo-SMCC édepois diluído com 50 mM fosfato de potássio/50 mM cloreto de sódio/2 mMEDTA, pH 6,5, para uma concentração final de 10 mg/ml, e reagido com umasolução a 10 mM de DM1 (1,7 equivalente assumindo 5 SMCC/anticorpo,7,37 mg/ml) em dimetilacetamida. A reação é agitada em temperaturaambiente sob argônio 16,5 horas. A mistura de reação de conjugação édepois filtrada através de uma coluna de filtração em gel Sephadex G25 (1,5x 4,9 cm) com 1 x PBS em pH 6,5. A razão de DM1/anticorpo (p) é depoismedida pela absorbância a 252 nm e a 280 nm.

Fármacos citotóxicos têm sido tipicamente conjugados com osanticorpos através dos resíduos de lisina freqüentemente numerosos doanticorpo. Conjugação através de grupos tiol presentes, ou criados, com oanticorpo de interesse foi também realizada. Por exemplo, resíduos decisteína foram introduzidos em proteínas através de técnicas de engenhariagenética para formar sítios de ligação covalentes para ligandos (Better et al.(1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al. (1994) BioconjugateChem. 5:126-132; Greenwood et al. (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei USA 96:4862-4867; Kanno et al.(2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al. (2001) Proc. Nat. Acad.Sei. USA 98(15):8480-8484; patente U. S. NQ 6.248.564). Uma vez umresíduo de cisteína livre existe no anticorpo de interesse, toxinas podem serligadas àquele sítio. Como um exemplo, os reagentes de ligante de fármaco,auristatina de maleimidocaproil-monometila E (MMAE), isto é MC-MMAE,auristatina de maleimidocaproil-monometila F (MMAF), isto é MC-MMAF,MC-val-cit-PAB-MMAE ou MC-val-cit-PAB-MMAF, dissolvidos em DMSO,são diluído êm acetonitrila e água em concentração conhecida, eadicionados ao anticorpo derivatizado de cisteína esfriado em solução salinatamponada (PBS). Após cerca de uma hora, um excesso de maleimida éadicionado para extinguir a reação e revestir qualquer grupo tiol de anticorponão-reagido. A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífugae o anticorpo conjugado de toxina é purificado e dessalgado através deelução através de resina de G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 msob condições estéreis, e congelado para armazenamento.

Além disso, uma cisteína livre em um anticorpo de escolha podeser modificada pelo reagente de bis-maleimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical),deixando um grupo maleimido não-reagido na superfície do anticorpo. Istopode ser realizado dissolvendo BM(PEO)4 em uma mistura de 50% deetanol/água para uma concentração de 10 mM e adicionando um excessomolar décuplo a uma solução contendo o anticorpo em solução salina defosfato tamponada a uma concentração de cerca de 1,6 mg/ml (10micromolares) e permitindo-a reagir durante 1 hora. BM(PEO)4 em excessoé removido através de filtração em gel em 30 mM citrato, pH 6 com 150 mMtampão de NaCI. Um excesso molar aproximado de 10 vezes de DM1 édissolvido em dimetil acetamida (DMA) e adicionado ao intermediário deanticorpo-BMPEO. Dimetil formamida (DMF) pode também ser empregadopara dissolver o reagente da porção de fármaco. A mistura de reação édeixada reagir durante a noite antes da filtração em gel ou diálise em PBSpara remover o fármaco não-reagido. Filtração em gel nas colunas de S200em PBS é usada para remover os agregados de peso molecular alto efornecer conjugado de anticorpo-BMPEO-DM1 purificado.

Usando técnicas bem conhecidas e habitualmente empregadasdescritas aqui e em outro lugar, anticorpo monoclonal de anti-TAT113 12E5(preparado como descrito acima no Exemplo 6 e depositado com a ATCCcomo descrito abaixo) foi conjugado com MC-val-cit-PAB-MMAE. Oanticorpo conjugado com toxina foi purificado e é aqui referido como "12E5-MMAE".

Exemplo 9: Ensaios de Morte Celular In Vitro

Células mamíferas que expressam o polipeptídeo de TAT deinteresse podem ser obtidas usando técnicas vetor de expressão eclonagem padrões. Alternativamente, muitas linhagens de célula tumoral queexpressam polipeptídeos de TAT de interesse estão publicamentedisponíveis, por exemplo, através da ATCC e podem ser habitualmenteidentificadas usando análise de ELISA ou FACS padrão. Polipeptídeo deanticorpos monoclonais de anti-TAT (e derivados de conjugado de toxinadestes) podem depois ser empregados em ensaios para determinar ahabilidade do anticorpo para matar células de expressão de polipeptídeo deTAT in vitro.

Com consideração específica para a presente invenção, umalinhagem celular PC3-derivada que estavelmente expressa polipeptídeo deTAT113 em sua superfície das células (aqui chamada PC3-gD-MDP) foicriada usando técnicas padrões e expressão do polipeptídeo de TAT113pelas células de PC3-gD-MDP foi confirmada usando classificação de célulade FACS padrão, análises de ELISA e Imunoistoquímica. A habilidade doanticorpo monoclonal conjugado com MMAE-MMAE 12E5 causar a morte decélulas de PC3-gD-MDP foi determinada usando um ensaio de morte celularin vitro empregando o protocolo a seguir (Promega Corp. Technical BulletinTB288; Mendoza et al (2002) Câncer Res. 62:5485-5488):

1. Uma alíquota de 50 ul de cultura de célula contendo cerca de104 células (células de PC3-gD-MDP ou células de PC3 não-tranfeccionadasnão expressando TAT113) em meio de crescimento é depositada em cadacavidade de uma placa com paredes opacas de 96 cavidades. Cavidades decontrole adicionais são fixados contendo 50 ul de meio de crescimento semcélulas.

2. Anticorpos de 12E5-MMAE, ou um anticorpo monoclonal deanti-interleucina 8 conjugado com MMAE que não liga a TAT113, éadicionado a cada poço em um volume de 50 ul e em várias concentraçõesvariando de 0,0001 a 100 ug/ml e as placas são incubadas a 37°C e 5% deC02 durante 3-5 dias.

3. As placas são equilibradas em temperatura ambiente durantecerca de 30 minutos.

4. Um volume do Reagente de Viabilidade de CélulaLuminescente CelITiter-GIo de Promega Corp. igual ao volume de cultura decélula presente médio em cada poço é adicionado e as placas são agitadasdurante 2 minutos em um agitador orbital para induzir lise das células.

5. As placas são incubadas em temperatura ambiente durante 10minutos para estabilizar o sinal de luminescência.

6. Luminescência é registrada em um luminômetro com oPrograma Tropix Winglow e reportada como RLU = unidades deluminescência relativa.

Os resultados obtidos do ensaio acima descrito demonstram queo anticorpo de 12E5-MMAE é capaz de induzir a morte de células queexpressam para o polipeptídeo de TAT113 em uma maneira dependente doanticorpo. Mais especificamente, nem 12E5-MMAE nem IL-8-MMAEinduzem morte significativa de células de PC3 não-transfectadas emconcentrações de anticorpo de 1 ug/ml e abaixo. Em concentrações deanticorpo acima de 1 ug/ml, a quantidade de morte de células de PC3 não-transfectadas aumenta linearmente com a concentração de anticorpo e fazassim de uma maneira independente de anticorpo. Portanto, parece que amorte de células de PC3 não-transfectadas em concentrações de anticorpoacima de 1 ug/ml é um resultado não-específico dos níveis crescentes datoxina de MMAE presente na mistura de reação e não é uma função daespecificidade de ligação do anticorpo empregado. Com respeito às célulasde PC3-gD-MDP que estavelmente expressam polipeptídeo de TAT113,porém, embora IL-8-MMAE induza morte de célula com um padrão que éidêntico ao da habilidade de anticorpo para matar células de PC3 não-transfectadas, 12E5-MMAE induz morte celular significativa emconcentrações de anticorpo tão baixas quanto 0,001 ug/ml. De fato, em umaconcentração de anticorpo de 1 ug/ml (onde o anticorpo de IL-8-MMAE nãoespecífico de TAT113 não exibe nenhuma célula significativa), virtualmentetodas as células de PC3-gD-MDP são mortas por 12E5-MMAÊ. Como tal,estes dados demonstram que anticorpo monoclonal 12E5 liga aopolipeptídeo de TAT113 como é expressado na superfície das células e écapaz de induzir a morte daquelas células às quais se liga.

Em um segundo experimento, o ensaio acima descrito foiempregado para determinar a habilidade do anticorpo monoclonal 12E5-MMAE para matar células de COLO205 derivadas de câncer de çólon in vitro(células que os Requerentes mostraram por análise de classificação decélula de FACS expressam polipeptídeo TT113). Consistente com osresultados apresentados acima para as linhagens celulares derivadas dePC3, IL-8-MMAE não começa a apresentar morte de célula de COLO205significativa até acima de uma concentração de anticorpo de cerca de 1ug/ml, em que o nível de morte de célula aumenta linearmente comconcentração de anticorpo e de uma maneira independente de anticorpo.Porém, anticorpo monoclonal 12E5-MMAE começa a induzir morte de célulade COLO205 significativa em concentrações de anticorpo tão baixas quantocerca de 0,1 ug/ml. De fato, a uma concentração de anticorpo de 1 ug/ml(onde o anticorpo de IL-8-MMAE específico de não-TAT113 não exibenenhuma morte de célula significativa), um nível muito significativo de mortede célula de COLO205 induzido por 12E5-MMAE é observado. Como tal,estes dados demonstram novamente que anticorpo monoclonal 12E5 liga aopolipeptídeo de TAT113 como é expressado na superfície das células e écapaz de induzir a morte daquelas células às quais se liga.

Exemplo 10: Ensaio de Morte de Células Tumorais In Vivo

Para testar a eficácia dos anticorpos monoclonais depolipeptídeo de anti-TAT conjugado ou não-conjugado com toxina para ahabilidade de induzir a morte de células tumorais in vivo, o protocolo a seguirpode ser empregado.

Inocular um grupo de camundongos desprotegidos atímicos com5 x 106 das células promotoras de tumor de expressão de polipeptídeo deTAT células subcutaneamente no flanço. Quando os tumores alcançaremum volume de tumor médio de entre 100-200 mm3, os camundongos sãoigualmente agrupados em 5 grupos e tratados como segue:

Grupo 1 - Veículo de controle de PBS administrado uma vez porsemana durante 4 semanas;

Grupo 2 - anticorpo de controle não-específico administrado a 1mg/kg, uma vez por semana durante 4 semanas;

Grupo 3 - anticorpo de controle não-específico administrado a 3mg/kg, uma vez por semana durante 4 semanas;

Grupo 4 - anticorpo de polipeptídeo anti-TAT específicoadministrado a 1 mg/kg, uma vez por semana durante 4 semanas;

Grupo 5 - anticorpo de polipeptídeo anti-TAT específicoadministrado a 3 mg/kg, uma vez por semana durante 4 semanas.

Volume de tumor médio pode depois ser determinado noscamundongos de cada grupo de tratamento em intervalos periódicos e aeficácia dos anticorpos determinada.Exemplo 11: Uso de TAT como uma Sonda de Hibridizacão

O método a seguir descreve o uso de uma seqüência denucleotídeo que codifica TAT como uma sonda de hibridizacão, isto é,diagnose da presença de um tumor em um mamífero.

DNA compreendendo a seqüência de codificação TAT decomprimento total ou maduro como descrito aqui pode também serempregado como uma sonda para triar para DNAs homólogos (comoaqueles codificando variantes de ocorrência natural de TAT) em bibliotecasde cDNA de tecido humano ou bibliotecas genômicas de tecido humano.

Hibridizacão e lavagem de filtros contendo quaisquer DNAs debiblioteca são executadas sob as condições de severidade alta a seguir.Hibridizacão de sonda derivada de TAT radiorrotulada para os filtros éexecutada em uma solução de 50% formamida, 5x SSC, 0,1% SDS, 0,1%pirofosfato de sódio, 50 mM fosfato de sódio, pH 6,8, 2x solução deDenhardt, e 10% sulfato de dextrana a 42°C durante 20 horas. Lavagem dosfiltros é executada em uma solução aquosa de 0,1 x SSC e 0,1% SDS a 42°C.

DNAs tendo uma identidade de seqüência desejada com aseqüência nativa de comprimento total de codificação de DNA podem depoisser identificados usando técnicas padrões conhecidas na técnica.

Exemplo 12: Expressão de TAT em E. coli

Este exemplo ilustra preparação de uma forma não-glicosiladade TAT através de expressão recombinante em E. coli.

A seqüência de DNA codificando TAT é amplificada inicialmenteusando iniciadores de PCR selecionados. Os iniciadores deveriam contersítios de enzima de restrição que correspondem aos sítios de enzima derestrição no vetor de expressão selecionado. Uma variedade de vetores deexpressão pode ser empregada. Um exemplo de um vetor adequado épBR322 (derivado de E. coli; vide Bolívar et al., Gene, 2:95 (1977)) contendogenes para resistência à ampicilina e tetraciclina. O vetor é digerido comenzima de restrição e desfosforilado. As seqüências amplificadas de PCRsão depois ligadas no vetor. O vetor preferivelmente incluirá seqüências quecodificam para um gene de resistência antibiótica, um promotor de trp, umlíder de polyhis (incluindo os primeiros seis códons de STII, seqüência depolyhis, e sítio de clivagem de enterocinase), a região de codificação de TAT,terminador transcripcional lambda, e um gene de argU.

A mistura de ligação é depois usada para transformar uma cepade E. coli selecionada usando os métodos descritos em Sambrook et al.,supra. Transformantes são identificados por sua habilidade para crescer emplacas de LB e colônias resistentes antibióticas são depois selecionadas.DNA de plasmídeo pode ser isolado e confirmado por análise de restrição eseqüenciação de DNA.

Clones selecionados podem ser crescidos durante a noite emmeio de cultura líquido como caldo de LB suplementado com antibióticos. Acultura durante a noite pode subseqüentemente ser usada para inocular umacultura de escala maior. As células são depois crescidas em uma densidadeóptica desejada durante a qual o promotor de expressão é ativado.

Após cultivar as células por várias horas mais, as células podemser colhidas através de centrifugação. O pélete de célula obtida pelacentrifugação pode ser solubilizado usando vários agentes conhecidos natécnica, e a proteína de TAT solubilizada pode depois ser purificada usandouma coluna de quelação de metal sob condições que permitem a ligaçãofirme da proteína.

TAT pode ser expressado em E. coli em uma forma rotulada compoly-His, usando o procedimento a seguir. O DNA codificando TAT éinicialmente amplificado usando iniciadores de PCR selecionados. Osiniciadores conterão sítios de enzima de restrição que correspondem aossítios de enzima de restrição no vetor de expressão selecionado, e outrasseqüências úteis que provêem iniciação de translação eficiente e segura,purificação rápida em uma coluna de quelação de metal, e remoçãoproteolítica com enterocinase. As seqüências rotuladas com poly-Hisamplificadas com PCR são depois ligadas em um vetor de expressão que éusado para transformar um hospedeiro de E. coli com base na cepa 52(W3110 fuhA(tonA) lon gale rpoHits(htpRts)clpP(laclq). Transformantes sãoprimeiro crescidos em LB contendo 50 mg/ml carbenicilina a 30°C comagitação até uma O.D.600 de 3-5 ser alcançado. Culturas são depoisdiluídas 50-100 vezes em meios de CRAP (preparados misturando 3,57 g(NH4)2S04, 0,71 g de citrato de sódio.2H20, 1,07 g KCI, 5,36 g extrato delevedura de Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF em 500 ml de água, comotambém 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55% (p/v) glicose e 7 mM MgS04) ecrescidos durante cerca de 20-30 horas a 30°C com agitação. As amostrassão removidas para verificar expressão por análise de SDS-PAGE, e acultura de volume é centrifugada para empelotar as células. Péletes decélula são congeladas até purificação e redobradas.

Pasta de E. colióe fermentações de 0,5 a 1 L (6-10 g de pelotas)é ressuspensa em 10 volumes (p/v) em 7 M guanidina, 20 mM Tris, pH 8tampão. Sulfito de sódio sólido e tetrationato de sódio são adicionados parafazer concentrações finais de 0,1 Me 0,02 M, respectivamente, e a soluçãoé agitada durante a noite a 4°C. Esta etapa resulta em uma proteínadesnaturada com todos os resíduos de cisteína bloqueados por sulfitolização.A solução é centrifugada a 40.000 rpm em uma Ultra-centrífuga de Beckmanpor 30 min. O sobrenadante é diluído com 3-5 volumes de tampão de colunade quelato de metal (6 M guanidina, 20 mM Tris, pH 7,4) e filtrado através defiltro de 0,22 mícron para clarificar. O extrato clarificado é carregado parauma coluna de quelato de metal de 5 ml de Qiagen equilibrada no tampão decoluna de quelato de metal. A coluna é lavada com tampão adicionalcontendo 50 mM imidazol (Calbiochem, tipo Utrol), pH 7,4. A proteína éeluída com tampão contendo 250 mM imidazol. As frações contendo aproteína desejada são agrupadas e armazenadas a 4°C. Concentração deproteína é estimada por sua absorbância a 280 nm usando o coeficienteextinguível calculado com base em sua seqüência de aminoácido.

As proteínas são redobradas diluindo a amostra lentamente emtampão de redobragem recentemente preparada consistindo em: 20 mM Tris,pH 8,6, 0,3 M NaCI, 2,5 M uréia, 5 mM cisteína, 20 mM glicina e 1 mM EDTA.

Volumes de redobragem são escolhidos de forma que a concentração deproteína final fique entre 50 a 100 microgramas/ml. A solução deredobragem é agitada suavemente a 4°C durante 12-36 horas. A reação deredobragem é extinguida pela adição de TFA a uma concentração final de0,4% (pH de cerca de 3). Antes da purificação adicional da proteína, asolução é filtrada através de um filtro de 0,22 mícron e acetonitrila éadicionada a 2-10% de concentração final. A proteína redobrada écromatografada em uma coluna de fase inversa Poros R1/H usando umtampão móvel de 0,1% de TFA com elução com um gradiente de acetonitrilade 10 a 80%. As alíquotas de frações são analisadas com absorbância deA280 em géis de poliacrilamida de SDS e frações contendo proteínaredobrada homogênea são agrupadas. Em geral, as espécies corretamenteredobradas são eluídas da maioria das proteínas em concentrações maisbaixas de acetonitrila uma vez que aquelas espécies são mais compactascom seus interiores hidrofóbicos protegidos da interação com a resina defase invertida. Usualmente espécies agregadas são eluídas emconcentrações de acetonitrila mais altas. Além de solucionar formasdesdobradas de proteínas da forma desejada, a etapa de fase invertidatambém remove endotoxinas das amostras.

As frações contendo o polipeptídeo de TAT dobrado desejadosão agrupadas e a acetonitrila removida usando um fluxo suave denitrogênio direcionado para a solução. As proteínas são formuladas em 20mM Hepes, pH 6,8 com 0,14 M cloreto de sódio e 4% manitol através dediálise ou através de filtração em gel usando resinas de G25 Superfine(Pharmacia) equilibradas no tampão de formulação e filtradas estéril.Exemplo 13: Expressão de Tat em Células Mamíferas

Este exemplo ilustra preparação de uma forma potencialmenteglicosilada de TAT através de expressão recombinante em célulasmamíferas.

O vetor, pRK5 (vide EP 307.247, publicado em 15 de março de1989), é empregado como o vetor de expressão. Opcionalmente, o DNA deTAT é ligado em pRK5 com enzimas de restrição selecionadas para permitirinserção do DNA de TAT usando métodos de ligação como descritos emSambrook et al., supra. O vetor resultante é chamado pRK5-TAT.

Em uma modalidade, as células hospedeiras selecionadaspodem ser células 293. Células 293 humanas (ATCC CCL 1573) sãocrescidas em confluência em placas de cultura de tecido em meio comoDMEM suplementado com soro de bezerro fetal e opcionalmente,componentes nutrientes e/ou antibióticos. Cerca de 10 ug DNA de pRK5-TAT são misturados com cerca de 1 ug de DNA que codifica o gene de RNAde VA [Thimmappaya et al., Cell, 31 :543 (1982)] e dissolvidos em 500 pi de1 mM Tris-HCI, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCI2. A esta mistura sãoadicionados, a gotas, 500 ul de 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCI, 1,5mM NaP04, e um precipitado é permitido formar durante 10 minutos a 25°C.

O precipitado é suspenso e adicionado às células 293 e deixado resolverdurante cerca de quatro horas a 37°C. O meio de cultura é aspirado e 2 mlde 20% glicerol em PBS são adicionados durante 30 segundos. As células293 são depois lavadas com meio livre de soro, meio fresco é adicionado eas células são incubadas durante cerca de 5 dias.

Aproximadamente 24 horas após as transfecções, o meio decultura é removido e substituído com meio de cultura (sozinho) ou meio decultura contendo 200 uCi/ml de 35S-cisteína e 200 uCi/ml 35S-metionina.Após uma incubação de 12 horas, o meio condicionado é colhido,concentrado em um filtro de giro, e carregado sobre um gel de SDS a 15%.

O gel processado pode ser secado e exposto ao filme durante um períodoselecionado de tempo para revelar a presença de polipeptídeo de TAT. Asculturas contendo células transfeccionadas podem sofrer incubaçãoadicional (em meio livre de soro) e o meio é testado em bioensaiosselecionados.

Em uma técnica alternativa, TAT pode ser introduzido nascélulas 293 transientemente usando o método de sulfato de dextranadescrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sei, 12:7575 (1981).Células 293 são crescidas em densidade máxima em um frasco giratório e700 ug de DMA de pRK5-TAT são adicionados. As células são primeiroconcentradas do frasco giratório através de centrifugação e lavadas comPBS. O precipitado de DNA-dextrana é incubado no pélete de célula durantequatro horas. As células são tratadas com 20% de glicerol durante 90segundos, lavadas com meio de cultura de tecido, e reintroduzidas no frascogiratório contendo meio de cultura de tecido, 5 ug/ml de insulina bovina e 0,1ug/ml de transferrina bovina. Após cerca de quatro dias, os meioscondicionados e filtrados são centrifugados para remover as células e osrestos. A amostra contendo TAT expresso pode depois ser concentrada epurificada por qualquer método selecionado, como diálise e/ou cromatografiade coluna.

Em outra modalidade, TAT pode ser expressado em células deCHO. O pRK5-TAT pode ser transfeccionado em células de CHO usandoreagentes conhecidos como CaP04 ou DEAE-dextrana, Como descritoacima, as culturas de célula podem ser incubadas, e o meio substituído commeio de cultura (sozinho) ou meio contendo um radiorrótulo como 35S-metionina. Após determinar a presença de polipeptídeo de TAT, o meio decultura pode ser substituído com meio livre de soro. Preferivelmente, asculturas são incubadas durante cerca de 6 dias, e depois o meiocondicionado é colhido. O meio contendo o TAT expresso pode depois serconcentrado e purificado por qualquer método selecionado.

TAT rotulado com epítopo pode também ser expressado emcélulas de CHO hospedeiras. O TAT pode ser subclonado do vetor de pRK5.A inserção deísubclone pode sofrer PCR para fundir na estrutura com umrótulo de epítopo selecionado como um rótulo de poly-His em um vetor deexpressão de Baculovírus. A inserção de TAT rotulada poly-His pode depoisser subclonadas em um vetor dirigido por SV40 contendo um rótulo deseleção como DHFR para seleção de clones estáveis. Por fim, as células deCHO podem ser transfeccionadas (como descritas acima) com o vetordirigido por SV40. Marcação pode ser executada, como descrito acima, paraverificar a expressão. O meio de cultura contendo o TAT rotulado com poly-His expresso pode depois ser concentrado e purificado por qualquer métodoselecionado, como através de cromatografia de afinidade de quelato de Ni2+.

TAT pode também ser expressado em células de CHO e/ou deCOS por um procedimento de expressão transiente ou em células de CHOpor outro procedimento de expressão estável.Expressão estável em células de CHO é executada usando oprocedimento a seguir. As proteínas são expressadas como um constructode IgG (imunoadesina) em que as seqüências de codificação para as formassolúveis (por exemplo domínios extracelulares) das respectivas proteínassão fundidas com uma seqüência de região constante de lgG1 contendo adobradiça, domínios de CH2 e de CH2 e/ou é uma forma rotulada com poly-His.

Seguindo amplificação de PCR, os respectivos DNAs sãosubclonados em um vetor de expressão de CHO usando técnicas padrõescomo descritas em Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology,Unidade 3.16, John Wiley and Sons (1997). Vetores de expressão de CHOsão construídos para ter sítios de restrição compatíveis de 5' e 3' do DNA deinteresse para permitir o transporte conveniente de cDNA. O vetor usado naexpressão em células de CHO é como descrito em Lucas et al., Nucl. AcidsRes. 24:9 (1774-1779 (1996), e usa o promotor/intensificador prematuro deSV40 para dirigir a expressão do cDNA de interesse e de diidrofolatoreductase (DHFR). Expressão de DHFR permite a seleção para manutençãoestável do plasmídeo seguindo transfecção.

Doze microgramas do DNA de plasmídeo desejado sãointroduzidos em cerca de 10 milhões de células de CHO usando reagentesde transfecção comercialmente disponíveis SUPERFECTt® (Quiagen),DOSPER® ou FUGENE® (Boehringer Mannheim). As células são crescidascomo descritas em Lucas et al., supra. Cerca de 3 x 10+ células sãocongeladas em uma ampola para crescimento adicional e produção comodescritos abaixo.

As ampolas contendo o DNA de plasmídeo são descongeladasatravés de colocação em banho de água e misturadas através de vórtice. Osconteúdos são pipetados em um tubo de centrífuga contendo 10 mL demeios e centrifugados a 1000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante éaspirado e as células são ressuspensas em 10 ml de meios seletivos (PS20filtrado a 0,2 um com 5% de soro bovino fetal diafiltrado a 0,2 um). Ascélulas são depois aliquotadas em girador de 100 ml contendo 90 ml demeios seletivos. Após 1-2 dias, as células são transferidas para um giradorde 250 ml enchido de 150 ml de meio de crescimento seletivo e incubado a37°C. Após outros 2-3 dias, giradores de 250 ml, 500 ml e 2000 ml sãosemeados com 3 x 105 células/mL. Os meios de célula são trocados commeios frescos por centrifugação e ressuspensão em meio de produção.Embora quaisquer meios de CHO adequados possam ser empregados, ummeio de produção descrito na patente U. S. NQ 5.122.469, emitida em 16 dejunho de 1992, pode ser usado de fato. Um agitador de produção de 3L ésemeado com 1,2 x 106 células/mL. No dia 0, o número de célula de pH édeterminado. No dia 1, o agitador é amostrado e pulverização com ar filtradoé começada. No dia 2, o agitador é amostrado, a temperatura deslocadapara 33°C, e 30 ml de 500 g/L de glicose e 0,6 ml de 10% de antiespuma(por exemplo, 35% emulsão de polidimetilsiloxano, Dow Corning 365Emulsão do Tipo Médico) tirados. Ao longo da produção, o pH é ajustadoconforme necessário para mantê-lo por volta de 7,2. Após 10 dias, ou atéque a viabilidade caia para abaixo 70%, a cultura de célula é colhida atravésde centrifugação e filtração através de um filtro de 0,22 um. O filtrado ou foiarmazenado a 4°C ou imediatamente carregado sobre as colunas parapurificação.

Paia os constructos rotulados com poly-His, as proteínas sãopurificadas usando uma coluna de Ni-NTA (Qiagen). Antes da purificação,imidazol é adicionado aos meios condicionados a uma concentração de 5mm. Os meios condicionados são bombeados sobre uma coluna de 6 ml deNi-NTA equilibrada em 20 mM Hepes, pH 7,4, tampão contendo 0,3 M NaCIe 5 mM imidazol a uma taxa de fluxo de 4-5 ml/min a 4°C. Após carregar, acoluna é lavada com tampão de equilibração adicional e a proteína eluídacom tampão de equilibração contendo 0,25 M imidazol. A proteína altamentepurificada é subseqüentemente dessalgada em um tampão de armazena-mento contendo 10 mM Hepes, 0,14 M NaCI e 4% manitol, pH 6,8, com umacoluna de 25 ml de G25 Superfine (Pharmacia) e armazenada a -80°C.

Constructos de imunoadesina (contendo FC) são purificadas dosmeios condicionados como segue. O meio condicionado é bombeado sobreuma coluna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia) que tinha sido equilibrada em20 mM de tampão de fosfato de Na, pH 6.8. Após carregar, a coluna élavada extensivamente com tampão de equilibração antes da elução com100 mM de ácido cítrico, pH 3.5. A proteína eluída é neutralizadaimediatamente colhendo 1 ml de frações em tubos contendo 275 ul de 1 Mde tampão de Tris, pH 9. A proteína altamente purificada ésubseqüentemente dessalgada em tampão de armazenamento comodescrito acima para as proteínas rotuladas com poly-His. A homogeneidadeé avaliada através de géis e poliacrilamida de SDS e por seqüenciação deaminoácido N-terminal através de degradação de Edman.

Exemplo 14: Expressão de Tat em Levedura

O método a seguir descreve expressão recombinante de TATem levedura.

Primeiro, vetores de expressão de levedura são construídos paraprodução intracelular ou secreção de TAT do promotor de ADH2/GAPDH.DNA codificando TAT e o promotor é inserido nos sítios de enzima derestrição adequados no plasmídeo selecionado para direcionar expressãointracelular de TAT. Para secreção, DNA codificando TAT pode ser clonadono plasmídeo selecionado, junto com DNA que codifica o promotor deADH2/GAPDH, um peptídeo sinal nativo de TAT ou outro peptídeo sinalmamífero, ou, por exemplo, um aifa-fator de levedura ou seqüênciasinal/líder secretória invertase, e seqüências ligadoras (se necessário) paraexpressão de TAT.

Células de levedura, como cepa de levedura AB110, podem sertransformadas com os plasmídeos de expressão descritos acima ecultivadas em meios de fermentação selecionados. Os sobrenadantes delevedura transformados podem ser analisados através de precipitação com10% de ácido tricloroacético e separação por SDS-PAGE, seguido pormanchamento dos géis com coloração Coomassie blue.

TAT recombinante pode subseqüentemente ser isolado epurificado removendo as células de levedura do meio de fermentaçãoatravés de centrifugação e depois concentrando o meio usando filtros deBrevemente, células de Sf9 são lavadas, ressuspensas em tampão desonicação (25 ml de Hepes, pH 7,9; 12,5 mM de MgCI2; 0,1 mM de EDTA;10% de glicerol; 0,1% de NP-40; 0,4 M de KCI), e sonicadas duas vezesdurante 20 segundos em gelo. Os sonicados são clareados através decentrifugação, e o sobrenadante é diluído 50 vezes em tampão de carga (50mM de fosfato, 300 mM de NaCI, 10% de glicerol, pH 7,8) e filtrado atravésde um filtro de 0,45 um. Uma coluna de agarose de NTA de Ni2+(comercialmente disponível de Qiagen) é preparada com um volume de leitode 5 ml, lavada com 25 ml de água e equilibrada com 25 ml de tampão decarga. O extrato de célula filtrada é carregado sobre a coluna a 0,5 ml porminuto. A coluna é lavada para linha base A28o com tampão de carga, emcujo ponto a coletânea de fração é iniciada. Em seguida, a coluna é lavadacom um tampão de lavagem secundário (50 mM de fosfato; 300 mM de NaCI,10% de glicerol, pH 6,0) eluindo proteína não-especificamente ligada. Apósalcançar linha base de A2so novamente, a coluna é desenvolvida com umgradiente de 0 a 500 mM de Imidazol no tampão de lavagem secundário.Frações de um ml são colhidas e analisadas por SDS-PAGE èmanchamento de prata ou western blot com Ni2+-NTA conjugado comfosfatase alcalina (Qiagen). As frações contendo o TAT rotulado com Hisioeluído são agrupadas e submetidas à diálise contra tampão de carga.

Alternativamente, purificação do TAT rotulado com IgG (ourotulado com Fc) pode ser executada usando técnicas de cromatografiaconhecidas, incluindo por exemplo, cromatografia de coluna de Proteína Aou proteína G.

Exemplo 16: Purificação de Polipeptídeos de Tat Usando AnticorposEspecíficos

Polipeptídeos de TAT nativos ou recombinantes podem serpurificados por uma variedade de técnicas padrões na técnica de purificaçãode proteína. Por exemplo, o pró-polipeptídeo de TAT, polipeptídeo de TATmaduro, ou polipeptídeo de pré-TAT é purificado através de cromatografiade imunoafinidade usando anticorpos específicos para o polipeptídeo deTAT de interesse. Em geral, uma coluna de imunoafinidade é construída porcovalentemente acoplando o anticorpo de polipeptídeo de anti-TAT a umaresina cromatográfica ativada.

Imunoglobulinas policlonais ou são preparadas de soros imunesatravés de precipitação com sulfato de amônio ou por purificação emProteína A imobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N., J.).Igualmente, anticorpos monoclonais são preparados de fluido de ascites decamundongo por precipitação de sulfato de amônio ou cromatografia emProteína A imobilizada. Imunoglobulina parcialmente purificada écovalentemente ligada a uma resina cromatográfica como SEPHAROSE™ativado por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). O anticorpo é acoplado àresina, a resina é bloqueada, e a resina de derivado é lavada de acordo comas instruções do fabricante.

Uma tal coluna de imunoafinidade é utilizada na purificação depolipeptídeo de TAT preparando uma fração de células contendopolipeptídeo de TAT em uma forma solúvel. Esta preparação é derivada porsolubilização da célula inteira ou de uma fração subcelular obtida por meiode diferencial de centrifugação pela adição de detergente ou por outrosmétodos bem conhecidos na técnica. Alternativamente, o polipeptídeo deTAT solúvel contendo uma seqüência sinal pode ser segregado emquantidade útil tio meio em que as células são crescidas.

Uma preparação contendo polipeptídeo de TAT solúvel épassada na coluna de imunoafinidade, e a coluna é lavada sob condiçõesque permitem a absorbância preferencial de polipeptídeo de TAT (porexemplo, tampões de resistência iônica alta na presença de detergente).Depois, a coluna é eluída sob condições que rompem a ligação doanticorpo/polipeptídeo de TAT (por exemplo, um tampão de pH baixo comoaproximadamente pH 2-3, ou uma concentração alta de um chaótropo comoíon de uréia ou de tiocianato), e polipeptídeo de TAT é colhido.

Depósito de Material

Os materiais a seguir foram depositados com a American TypeCulture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA(ATCC):Tabela 7

Material Dep._de Data de depósito

ATCC Ng

Linhagem celular de hibridoma 12E5.1.1 PRT-6625 3 de março de 2005Linhagem celular de hibridoma 6G10.1.1 PRT-6623 3 de março de 2005

Estes depósitos foram feitos sob as providências do Tratado deBudapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito deMicroorganismos para o propósito de Procedimento de Patente e sob asRegulações (Tratado de Budapeste). Isto assegura manutenção de umacultura viável do depósito durante 30 anos da data de depósito. Os depósitosterão feitos disponíveis pela ATCC sob a condição do Tratado de Budapeste,e sujeitos a um acordo entre Genentech, Inc. e ATCC que asseguradisponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cultura do depósito aopúblico sob emissão da patente U. S. pertinente ou deixando em aberto aopúblico de qualquer pedido de patente U. S. ou estrangeiro, o que quer quevenha primeiro, e assegura disponibilidade da progênie a um determinadopelo Comissário de Patentes de Marcas dos EUA ser intitulado a este deacordo com 35 USC § 122 e as regras do Comissário (incluindo 37 CFR §1.14 com referência particular a 886 OG 638).

O cessionário do presente pedido de patente concordou que seuma cultura dos materiais em depósito morresse ou fosse perdida oudestruída quando cultivada sob condições adequadas, os materiais serãoprontamente substituídos sob notificação com outro do mesmo.

Disponibilidade do material depositado não é para ser interpretada comouma licença para praticar a invenção em contravenção dos direitosconcedidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com suas leisde patentes.

O relatório descritivo escrito antecedente é considerado sersuficiente para permitir alguém versado na técnica a praticar a invenção.A presente invenção não é para ser limitada em escopo pelo constructodepositado, uma vez que a modalidade depositada é intencionada comouma ilustração simples de certos aspectos da invenção e quaisquerconstructos que são funcionalmente equivalentes estão dentro do escopodesta invenção. O depósito do material aqui não constitui uma admissão quea descrição escrita aqui contida seja inadequada para permitir a prática dequalquer aspecto da invenção, incluindo o melhor modo desta, nem é paraser interpretada como limitando o escopo das reivindicações às ilustraçõesespecíficas que ela representa. De fato, várias modificações da invençãoalém daquelas mostradas e descritas aqui tornarão evidentes àquelesversados na técnica da descrição anterior e que incorrem no escopo dasreivindicações em anexo.

Listagem de Seqüência

<110> GENENTECH, INC.

DOWD,PATRICK

FRANTZ,GRETCHEN

POLAKIS,PAUL

SMITH,VICTORIA

SPENCER,SUSAN D.

WU,THOMAS D.

ZHANG,ZEMIN

<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA A DIAGNOSE E TRATAMENTO DE TUMOR

<130> P5001R1PÍ- PCT

<140> PCT/US2006/013501

<141> 2006-04-05

<150> US 11/102,501

<151> 2005-04-08

<160> 2

<210> 1

<211> 1633

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ggcgtgggag ctgcctaggc cgggccctgc cagggagcaa gtctgcatcg 50cagaggccag ggcagagtgg ctcctcacag cctgaagctc atccttctgc 100acgggccagc caggccagca cagaggcacc agggcagcag tgcacacagg 150tccccgggga ccccaccatg tggagcggat ggtggctgtg gccccttgtg 200gccgtctgca ctgcagactt ctttcgggac gaggcagaga ggatcatgag 250ggactcccct gtcattgatg ggcacaatga cctcccctgg cagctgctgg 300atatgttcaa caaccggctg caggacgaga gggccaacct gaccaccttg 350gccggcacac acaccaacat ccccaagctg agggccggct ttgtgggagg 400ccagttctgg tccgtgtaca cgccctgcga cacccagaac aaagacgccg 450tgcggaggac gctggagcag atggacgtgg tccaccgcat gtgccggatg 500tacccggaga ccttcctgta tgtcaccagc agtgcaggca ttcggcaggc 550cttccgggaa gggaaggtgg ccagcctgat cggcgtggag ggcggccact 600ccattgacag cagtttgggc gtcctgcggg cactctatca gctgggcatg 650cggtacctga ccctcaccca cagctgcaac acgccctggg ctgacaactg 700gctggtggac acgggagaca gcgagcccca gagccaaggc ttgtcaccct 750ttgggcagcg tgtggtgaag gagctgaacc gtctgggggt cctcatcgac 800ttggctcacg tgtctgtggc caccatgaag gccaccctgc agctgtccag 850agccccggtc atcttcagcc actcctcggc ctacagcgtg tgcgcaagcc 900ggcgcaacgt gcctgacgac gtcctgaggc tggtgaaaca gacagacagc 950ctggtgatgg tgaacttcta caacaattac atttcctgca ccaacaaggc 1000caacctgtcc caagtggccg accatctgga tcacatcaag gaggtggcag 1050gagccagagc cgtgggtttt ggtggggact ttgatggtgt tccaagggtc 1100cctgaggggc tggaggacgt ctccaagtat ccagacctga tcgctgagct 1150gctcaggagg aactggacgg aggcggaggt caagggcgca ctggctgaca 1200acctgctgag ggtcttccag gctgtggaac aggccagcaa cctcacacag 1250gctcccgagg aggagcccat cccgctggac cagctgggtg gctcctgcag 1300gacccattac ggctactcct ctggggcttc cagcctccat cgccactggg 1350ggctcctgct ggcctccctc gctcccctgg tcctctgtct gtctctcctg 1400tgaaacctgg gagaccagag tcccctttag ggttcccgga gctccgggaa 1450gacccgccca tcccaggact ccagatgcca ggagccctgc tgcccacatg 1500caaggaccag catctcctga gaggacgcct gggcttacct ggggggcagg 1550atgcctgggg acagttcagg acacacacac agtaggcccg caataaaagc 1600aacacccctt caaaaaaaaa aaaaaaaaaà aaa 1633<210> 2<211> 411<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 2

Met Trp Ser Gly Trp Trp Leu Trp Pro Leu Vai Ala Vai Cys Thr1 5 10 15

Ala Asp Phe Phe Arg Asp Glu Ala Glu Arg He Met Arg Asp Ser20 25 30

Pro Vai lie Asp Gly His Asn Asp Leu Pro Trp Gln Leu Leu Asp35 40. 45

Met Phe Asn Asn Arg Leu Gln Asp Glu Arg Ala Asn Leu Thr Thr50 55 60

Leu Ala Gly Thr His Thr Asn lie Pro Lys Leu Arg Ala Gly Phe.65 70 75

Vai Gly Gly Gln Phe Trp Ser Vai Tyr Thr Pro Cys Asp Thr Gln80 85 90

Asn Lys Asp Ala Vai Arg Arg Thr Leu Glu Gln Met Asp Vai Vai95 100 105

His Arg Met Cys Arg Met Tyr Pro Glu Thr Phe Leu Tyr Vai Thri- 110 115 120

Ser Ser Ala Gly lie Arg Gln Ala Phe Arg Glu Gly Lys Vai Ala125 130 135

Ser Leu lie Gly Vai Glu Gly Gly His Ser lie Asp Ser Ser Leu140 145 150

Gly Vai Leu Arg Ala Leu Tyr Gln Leu Gly Met Arg Tyr Leu Thr155 160 165

Leu Thr His Ser Cys Asn Thr Pro Trp Ala Asp Asn Trp Leu Vai170 175 180

Asp Thr Gly Asp Ser Glu Pro Gln Ser Gln Gly Leu Ser Pro Phe185 190 195

Gly Gln Arg Vai Vai Lys Glu Leu Asn Arg Leu Gly Vai Leu lie200 205 210Asp Leu Ala His Vai215

Leu Ser Arg Ala Pro230

Vai Cys Ala Ser Arg245

Vai Lys Gln Thr Asp260

Tyr lie Ser Cys Thr275

His Leu Asp His lie290

Phe Gly Gly Asp Phe305

Glu Asp Vai Ser Lys320

Arg Asn Trp Thr Glu335

Leu Leu Arg Vai Phe350

Gln Ala Pro Glu Glu365

Ser Cys Arg Thr His380

His Arg His Trp Gly395

Leu Cys Leu Ser Leu410

Ser Vai Ala Thr Met220

Vai lie Phe Ser His

235

Arg Asn Vai Pro Asp250

Ser Leu Vai Met Vai265

Asn Lys Ala Asn Leu280

Lys Glu Vai Ala Gly295

Asp Gly Vai Pro Arg310

Tyr Pro Asp Leu lie325

Ala Glu Vai Lys Gly340

Gln Ala Vai Glu Gln355

Glu Pro lie Pro Leu370

Tyr Gly Tyr Ser Ser385

Leu Leu Leu Ala Ser400

Leu

Lys Ala Thr Leu Gln225

Ser Ser Ala Tyr Ser240

Asp Vai Leu Arg Leu255

Asn Phe Tyr Asn Asn270

Ser Gln Vai Ala Asp285

Ala Arg Ala Vai Gly300

Vai Pro Glu Gly Leu315

Ala Glu Leu Leu Arg330

Ala Leu Ala Asp Asn345

Ala Ser Asn Leu Thr360

Asp Gln Leu Gly Gly375

Gly Ala Ser Ser Leu390

Leu Ala Pro Leu Vai405

Claims

1. Ácido nucléico isolado compreendendo:(a) uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência deaminoácido mostrada como SEQ ID NQ: 2;(b) uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência deaminoácido como mostrada na SEQ ID N9: 2, carecendo de seu peptídeosinal associado;(c) uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio ex-tracelular do polipeptídeo mostrada como SEQ ID N9: 2;(d) a seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID N9: 1;(e) a região de codificação de comprimento total da seqüênciade nucleotídeo mostrada como SEQ ID N9:1; ou(f) o complemento de (a), (b), (c), (d) ou (e).

2. Vetor de expressão compreendendo o ácido nucléico comodefinido na reivindicação 1.

3. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 2, em queo dito ácido nucléico é operavelmente ligado às seqüências de controle re-conhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vetor.

4. Célula hospedeira compreendendo o vetor de expressão co-mo definido naáreivindicação 2.

5. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 4, que éuma célula CHO, uma célula de E. coli ou uma célula de levedura.

6. Processo para produzir um polipeptídeo compreendendo culti-var a célula hospedeira como definida na reivindicação 4, sob condições a-dequadas para expressão do dito polipeptídeo e restabelecer o dito polipep-tídeo da cultura de células.