JP2008535498A - 腫瘍の診断および治療のための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、哺乳動物における腫瘍の診断および治療に有用な物質の組成物、および前記物質のこれら組成物の使用方法に関する。本発明は、（ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠いている、配列番号：２として示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域；または（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補体、を含む、単離核酸を提供する。

Description

関連出願
本願は、２００２年６月１９日に出願された米国特許出願第１０／１７７，４８８号の一部継続出願であり、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ §１２０の下で、米国特許出願第１０／１７７，４８８号に対する優先権を主張する。米国特許出願第１０／１７７，４８８号は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ §１１９の下で、２００１年６月２０日に出願された、米国仮特許出願第６０／２９９，５００号に対する優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、哺乳動物における腫瘍の診断および治療に有用な物質の組成物および前記物質のこれら組成物の使用方法に関する。
発明の背景
米国において悪性腫瘍（癌）は、心臓病に次いで第二位の死亡原因である（非特許文献１）。癌は、増殖して腫瘍塊を形成する正常組織由来の異常細胞数、または新生細胞数の増加、これら新生腫瘍細胞による隣接組織への侵襲、およびやがては血液またはリンパ系を介して転移と呼ばれる過程を経て局所リンパ節および遠隔部位に拡がる悪性細胞の発生を特徴とする。癌性状態では、正常細胞が増殖しない条件下で細胞は増殖する。癌は、種々の程度の侵襲性および攻撃性を特徴とする多種多様の形態で現れる。
癌の診断と治療に関する有効な細胞標的を発見する試みにおいて、研究者達は、１つまたは複数の正常な非癌性細胞と比較して、１つまたは複数のタイプの癌細胞の表面上に特異的に発現される膜貫通ポリペプチド類あるいは膜結合ポリペプチド類を同定しようと努めている。このような膜結合ポリペプチド類は、非癌性細胞の表面上と比較して、癌細胞の表面上に、より多量に発現することが多い。このような腫瘍結合細胞表面の抗原ポリペプチド類の同定により、抗体ベース治療による破壊に関して癌細胞を特異的に標的化する能力が高まっている。これに関して、抗体ベース治療は、ある一定の癌の治療に極めて有効であると証明されていることが注目されている。例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）およびＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（双方ともＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社製、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）は、それぞれ乳癌および非ホジキンリンパ腫を首尾よく治療するために使用されている抗体である。より具体的には、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）の前発癌遺伝子の細胞外ドメインに選択的に結合する組換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナルである。ＨＥＲ２タンパク質過剰発現は、原発性乳癌の２５〜３０％に見られる。ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）は、正常および悪性Ｂリンパ球の表面上に見られるＣＤ２０抗原に対して方向付けられた遺伝子操作のキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。これら交代の双方とも、ＣＨＯ細胞において組換え的に産生される。
癌診断と治療に関する有効な細胞標的を発見するための他の試みにおいて、研究者達は、（１）１つまたは複数の特定のタイプの非癌性正常細胞によるものと比較して、１つまたは複数の特定のタイプの癌細胞により特異的に産生される非膜結合ポリペプチド類、（２）１つまたは複数の正常非癌性細胞よりも有意に高い発現レベルで癌細胞により産生されるポリペプチド類、または（３）癌性状態および非癌性状態（例えば、正常な前立腺組織および前立腺腫瘍組織）の双方において、発現が単一のみの（または極めて限定された数の異なる）組織タイプに特に限定されるポリペプチド類、を同定しようと努めてきた。このようなポリペプチド類は、細胞内に配置されたままであり得るか、または癌細胞により分泌され得る。さらにこのようなポリペプチド類は、癌細胞自身によってではなく、むしろ癌細胞に対して増強効果または促進効果を有するポリペプチド類を産生および／または分泌する細胞によって発現され得る。このような分泌ポリペプチド類は、しばしば、正常細胞よりも癌細胞に有利な増殖要因を提供し、例えば、血管新生因子、細胞接着因子、成長因子などのものを含むタンパク質である。このような非膜結合ポリペプチド類のアンタゴニストの同定により、このような癌の治療に有効な治療剤として役立つことが期待される。さらに、このようなポリペプチド類の発現パターンの同定は、哺乳動物における特定の癌の診断に有用となるであろう。
哺乳動物の癌療法において上記の確認された進展にもかかわらず、哺乳動物における腫瘍の存在を検出できるさらなる診断剤および治療剤の必要性、ならびに新生細胞増殖を有効に阻止する必要性がそれぞれ大である。したがって、（１）、正常細胞または他の異なる癌細胞上と比較して、１つまたは複数のタイプの癌細胞上に、より多量に発現する細胞膜結合ポリペプチド類、（２）１つまたは複数の特定のタイプの非癌性正常細胞によるのと比較して、１つまたは複数の特定のタイプの癌細胞により（または癌細胞の増殖に対して増強効果を有するポリペプチド類を産生する他の細胞により）特異的に産生される非膜結合ポリペプチド類、（３）１つまたは複数の非癌性細胞よりも有意に高い発現レベルで癌細胞により産生される非膜結合ポリペプチド類、または（４）癌性状態および非癌性状態（例えば、正常な前立腺組織および前立腺腫瘍組織）の双方において、発現が単一のみの（または極めて限定された数の異なる）組織タイプに特に限定されるポリペプチド類を同定すること、これらのポリペプチド類、およびそれらをコードする核酸を使用すること、哺乳動物における癌の治療処置および診断用検出に有用な物質の組成物を産生することが本発明の目的である。また、発現が、単一または極めて限定された数の組織に限定される細胞膜結合ポリペプチド類、分泌ポリペプチド類または細胞内ポリペプチド類を同定すること、これらのポリペプチド類、およびそれらをコードする核酸を使用すること、哺乳動物における癌の治療処置および診断用検出に有用な物質の組成物を産生することが本発明の目的である。
Ｂｏｒｉｎｇら、ＣＡ Ｃａｎｃｅｌ Ｊ．Ｃｌｉｎ．４３：７頁（１９９３）
発明の要旨
Ａ． 実施形態
本明細書において、１つまたは複数のタイプの正常な非癌細胞の表面上またはそれらによる場合と比較して、１つまたは複数のタイプの癌細胞の表面上に、またはそれらにより、より高い程度に発現する種々の細胞ポリペプチド類（およびそれらをコードする核酸またはそれらの断片）の同定を、出願者は初めて記載する。あるいは、このようなポリペプチド類は、癌細胞に対して増強または増殖促進効果を有するポリペプチド類を産生および／または分泌する細胞によって発現される。あるいはまた、このようなポリペプチド類は、同一の組織タイプの正常細胞と比較して、腫瘍細胞により過剰発現されないかも知れないが、むしろ単一のみまたは極めて限定された数の組織タイプ（好ましくは、生命に必須でない組織、例えば、前立腺など）の腫瘍細胞および正常細胞により特異的に発現され得る。上記のポリペプチド類の全ては、本明細書において腫瘍結合抗原標的ポリペプチド類（「ＴＡＴ」ポリペプチド類）と称され、哺乳類における癌療法および癌診断に有効な標的として役立つことが期待される。
したがって、本発明の一実施形態において、本発明は、腫瘍結合抗原標的ポリペプチドまたはその断片（「ＴＡＴ」ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を有する単離核酸分子を提供する。
一定の態様において、該単離核酸分子は、（ａ）本明細書に開示されたアミノ酸配列を有する完全長ＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、本明細書に開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列、本明細書に開示されたシグナルペプチドの有無による膜貫通ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書に開示された完全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列の任意の他の具体的に定義された断片、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
他の態様において、該単離核酸分子は、（ａ）本明細書に開示された完全長ＴＡＴポリペプチドｃＤＮＡのコード配列を含むＤＮＡ分子、本明細書に開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドのコード配列、本明細書に開示されたシグナルペプチドの有無による膜貫通ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列、または本明細書に開示された完全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列の任意の他の具体的に定義された断片のコード配列、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
さらなる態様において、本発明は、（ａ）本明細書に開示されたＡＴＣＣにより寄託された任意のヒトタンパク質ｃＤＮＡ類の完全長コード領域によりコードされた同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離核酸分子に関する。
本発明の別の態様は、膜貫通ドメインの欠失もしくは膜貫通ドメインの不活化であるか、またはこのようなコードヌクレオチド配列に相補的であるＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供し、このようなポリペプチド類の膜貫通ドメインを本明細書に開示する。したがって、本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチド類の可溶性細胞外ドメインが考慮されている。
他の態様において、本発明は、（ａ）本明細書に記載された完全長アミノ酸配列を有するＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本明細書に記載されたシグナル配列を欠くＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列、本明細書に記載されたシグナルペプチドの有無による膜貫通ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメイン、または本明細書に開示された完全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列の任意の他の具体的に定義された断片、または（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体、にハイブリダイズする単離核酸分子に関する。これに関して、本発明の実施形態は、本明細書に記載された完全長ＴＡＴポリペプチドコード配列の断片、またはそれらの相補体に関するものであり、それらは、例えば、診断用プローブ、ＰＣＲ用プライマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド用プローブとして有用なハイブリダイゼーション用プローブとして使用できるか、または抗ＴＡＴポリペプチド抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴポリペプチドに結合する他の小型有機分子に関する結合部位を含むポリペプチドを任意にコードできる完全長ＴＡＴポリペプチドの断片をコードするために使用できる。このような核酸断片は、通常、長さが少なくとも約５つのヌクレオチド、あるいは、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００のヌクレオチドであり、この文脈において用語の「約」は、述べられたヌクレオチド配列の長さに、述べられたその長さのプラスまたはマイナス１０％を意味する。さらに、このような核酸断片は、通常、ＴＡＴポリペプチドまたはその相補体の完全長コード配列から誘導される連続ヌクレオチドからなる。ＴＡＴポリペプチドコードヌクレオチド配列断片、またはその相補体の新規な断片は、多くの中で任意の周知の配列アラインメントプログラムのいずれかを用いてＴＡＴポリペプチドコードヌクレオチド配列を他の公知のヌクレオチド配列と整列化させ、どのＴＡＴポリペプチドコードヌクレオチド配列、またはその相補体が新規であるかを判定することにより、ルーチン様式で決定できることを注記する。ＴＡＴポリペプチドコードヌクレオチド配列、またはそれらの相補体のこのような新規断片の全てが、本明細書で考慮されている。これらのヌクレオチド分子断片によってコードされるＴＡＴポリペプチド断片、好ましくは、抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴポリペプチドに結合する他の小型有機分子に対する結合部位を含むこれらのポリペプチド断片もまた考慮されている。
別の実施形態において、本発明は、上記に同定された任意の単離核酸配列によりコードされた単離ＴＡＴポリペプチド類を提供する。
一定の態様において、本発明は、本明細書に開示された完全長アミノ酸配列を有するＴＡＴポリペプチド、本明細書に開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列、本明細書に開示されたシグナルペプチドの有無による膜貫通ＴＡＴポリペプチドタンパク質の細胞外ドメイン、本明細書に開示された任意の核酸配列によりコードされたアミノ酸配列、または本明細書に開示された完全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列の任意の他の具体的に定義された断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＴＡＴポリペプチドに関する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に開示されたＡＴＣＣにより寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡ類のいずれかによりコードされたアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＴＡＴポリペプチドに関する。
よりさらなる態様において、本発明は、（ａ）本明細書に開示された完全長アミノ酸配列を有するＴＡＴポリペプチド、（ｂ）本明細書に開示されたシグナルペプチドを欠くＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列、（ｃ）本明細書に開示されたシグナルペプチドの有無による膜貫通ＴＡＴポリペプチドタンパク質の細胞外ドメイン、（ｄ）本明細書に開示された任意の核酸配列によりコードされたアミノ酸配列、または（ｅ）本明細書に開示された完全長ＴＡＴポリペプチドアミノ酸配列の任意の他の具体的に定義された断片をコードするＤＮＡ分子の相補体にハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む単離ＴＡＴポリペプチドに関する。
具体的な態様において、本発明は、Ｎ末端シグナル配列がなく、および／または開始メチオニンなく、本明細書に先に記載されたようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる単離ＴＡＴポリペプチドを提供する。前記のものを製造するプロセスもまた本明細書に記載され、これらのプロセスは、ＴＡＴポリペプチドの発現に好適な条件下で核酸分子を適切にコードすることを含むベクターを含む宿主細胞を培養すること、および細胞培養物からＴＡＴポリペプチドを回収することを含む。
本発明の別の態様は、膜貫通ドメインの欠失または膜貫通ドメインが不活化される単離ＴＡＴポリペプチドを提供する。同一のものを製造するプロセスもまた本明細書に記載され、これらのプロセスは、ＴＡＴポリペプチドの発現に好適な条件下で核酸分子を適切にコードすることを含むベクターを含む宿主細胞を培養すること、および細胞培養物からＴＡＴポリペプチドを回収することを含む。
他の態様において、本発明は、本明細書に記載された任意のポリペプチド類をコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。宿主細胞の例としては、ＣＨＯ細胞、大腸菌細胞、または酵母細胞を挙げることができる。本明細書に記載されたポリペプチド類を製造するプロセスがさらに提供され、所望のポリペプチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を培養すること、および細胞培養物から所望のポリペプチドを回収することを含む。
他の態様において、本発明は、異種（非ＴＡＴ）ポリペプチドに融合した本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチド類のいずれかを含む単離キメラポリペプチド類を提供する。このようなキメラ分子の例は、例えば、免疫グロブリンのエピトープタグ配列またはＦｃ領域などの異種ポリペプチドに融合した、本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチド類のいずれかを含む。
別の態様において、本発明は、任意の上記または下記ポリペプチド類に好ましくは特異的に結合する抗体を提供する。任意の抗体としては、モノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体または抗ＴＡＴポリペプチド抗体の、そのそれぞれの抗原エピトープへの結合を競合的に阻止する抗体が挙げられる。本発明の抗体は、例えば、メイタンシノイドまたはカリキアミシン、抗体、放射性同位元素、核酸分解酵素など、増殖抑制剤または毒素などの細胞毒性剤に任意に結合できる。本発明の抗体は、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において任意に製造でき、それらが結合する細胞の成長または増殖を阻止するか、または細胞死を誘導することが好ましい。診断目的のために、本発明の抗体は、検出可能に標識でき、固体支持体などに結合できる。
本発明の他の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された抗体のいずれかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のこのようなベクターを含む宿主細胞もまた提供される。宿主細胞の例としては、ＣＨＯ細胞、大腸菌細胞、または酵母細胞を挙げることができる。本明細書に記載された任意の抗体を製造するプロセスがさらに提供され、所望の抗体の発現に好適な条件下で宿主細胞を培養すること、および細胞培養物から所望の抗体を回収することを含む。
別の実施形態において、本発明は、上記または下記ＴＡＴポリペプチド類のいずれかに好ましくは特異的に結合するオリゴペプチド類（「ＴＡＴ結合オリゴペプチド類」）を提供する。本発明のＴＡＴ結合オリゴペプチド類は、例えば、メイタンシノイドまたはカリキアミシン、抗体、放射性同位元素、核酸分解酵素など、増殖抑制剤または毒素などの細胞毒性剤に任意に結合できる。本発明のＴＡＴ結合オリゴペプチド類は、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において任意に製造でき、それらが結合する細胞の成長または増殖を阻止するか、または細胞死を誘導することが好ましい。診断目的のために、本発明のＴＡＴ結合オリゴペプチド類は、検出可能に標識でき、固体支持体などに結合できる。
本発明の他の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されたＴＡＴ結合オリゴペプチド類のいずれかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のこのようなベクターを含む宿主細胞もまた提供される。宿主細胞の例としては、ＣＨＯ細胞、大腸菌細胞、または酵母細胞を挙げることができる。本明細書に記載された任意のＴＡＴ結合オリゴペプチド類を製造するプロセスがさらに提供され、所望のオリゴペプチドの発現に好適な条件下で宿主細胞を培養すること、および細胞培養物から所望のオリゴペプチドを回収することを含む。
別の実施形態において、本発明は、上記または下記ＴＡＴポリペプチド類のいずれかに好ましくは特異的に結合する小型の有機分子（「ＴＡＴ結合有機分子」）を提供する。本発明のＴＡＴ結合有機分子は、例えば、メイタンシノイドまたはカリキアミシン、抗体、放射性同位元素、核酸分解酵素など、増殖抑制剤または毒素などの細胞毒性剤に任意に結合できる。本発明のＴＡＴ結合有機分子は、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において任意に製造でき、それらが結合する細胞の成長または増殖を阻止するか、または細胞死を誘導することが好ましい。診断目的のために、本発明のＴＡＴ結合有機分子は検出可能に標識でき、固体支持体などに結合できる。
また、さらなる実施形態において、本発明は、担体と組合わせて本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチド、本明細書に記載されたキメラＴＡＴポリペプチド、本明細書に記載された抗ＴＡＴ抗体、本明細書に記載されたＴＡＴ結合オリゴペプチド、または本明細書に記載されたＴＡＴ結合有機分子を含む物質の組成物に関する。該担体は、製薬的に許容できる任意の担体である。
また別の実施形態において、本発明は、容器および容器内に含まれた物質の組成物を含む製造品に関するものであり、該物質の組成物は、本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチド、本明細書に記載されたキメラＴＡＴポリペプチド、本明細書に記載された抗ＴＡＴ抗体、本明細書に記載されたＴＡＴ結合オリゴペプチド、または本明細書に記載されたＴＡＴ結合有機分子を含むことができる。さらに該製品は、容器に貼り付けられたラベル、または容器と共に含まれる、腫瘍の治療処置または診断用検出に関する物質の組成物の使用を記述している添付文書を任意に含むことができる。
本発明の別の実施形態は、ＴＡＴポリペプチド、キメラＴＡＴポリペプチド、抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、またはＴＡＴ結合有機分子に応答性の病態の治療に有用な医薬品の調製のために、本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチド、本明細書に記載されたキメラＴＡＴポリペプチド、本明細書に記載された抗ＴＡＴ抗体、本明細書に記載されたＴＡＴ結合オリゴペプチド、または本明細書に記載されたＴＡＴ結合有機分子の使用に関する。
Ｂ． さらなる実施形態
本発明の別の実施形態は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞増殖を阻止する方法に関するものであり、該方法は、該細胞がＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小型有機分子と接触することを含んでなり、抗体、オリゴペプチドまたは有機分子のＴＡＴポリペプチドへの結合は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞増殖を阻止させる。好ましい実施形態において、該細胞は、癌細胞であり、抗体、オリゴペプチドまたは有機分子のＴＡＴポリペプチドへの結合は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を死滅させる。該抗体は、任意にモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単鎖抗体である。本発明の方法に使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド類およびＴＡＴ結合有機分子は、例えば、メイタンシノイドまたはカリキアミシン、抗体、放射性同位元素、核酸分解酵素など、増殖抑制剤または毒素などの細胞毒性剤に任意に結合できる。本発明の方法に使用される抗体およびＴＡＴ結合オリゴペプチド類は、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において任意に産生できる。
本発明のさらに別の実施形態は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を含む癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法に関するものであり、該方法は、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小型有機分子の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含んでなり、それによって、腫瘍の有効な治療的処置がもたらされる。該抗体は、任意にモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単鎖抗体である。本発明の方法に使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド類およびＴＡＴ結合有機分子は、例えば、メイタンシノイドまたはカリキアミシン、抗体、放射性同位元素、核酸分解酵素など、増殖抑制剤または毒素などの細胞毒性剤に任意に結合できる。本発明の方法に使用される抗体およびオリゴペプチド類は、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において任意に産生できる。
本発明のさらに別の実施形態は、ＴＡＴポリペプチドを含有する疑いのあるサンプル中のＴＡＴポリペプチドの存在を判定する方法に関するものであり、該方法は、サンプルをＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小型有機分子に曝露させること、および抗体、オリゴペプチドまたは有機分子のサンプル中のＴＡＴポリペプチドへの結合を判定することを含んでなり、このような結合の存在は、サンプル中にＴＡＴポリペプチドが存在していることを示す。任意に該サンプルは、ＴＡＴポリペプチドを発現する疑いのある細胞（癌細胞であり得る）を含有し得る。この方法に使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子は、任意に固体支持体などに結合された検出可能に標識できる。
本発明のさらなる実施形態は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法に関するものであり、該方法は、（ａ）前記哺乳動物から得られた組織細胞の試験サンプルにおいて、および（ｂ）同じ組織源または同じタイプの既知の正常な非癌性細胞の対照サンプルにおいて、ＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含んでなり、対照サンプルと比較して、試験サンプル中のＴＡＴポリペプチドのより高い発現レベルは、試験サンプルが得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示している。
本発明の別の実施形態は、哺乳動物において腫瘍の存在を診断する方法に関するものであり、該方法は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞を含む試験サンプルと、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小型有機分子とを接触させること、および（ｂ）抗体、オリゴペプチドまたは小型有機分子と試験サンプル中のＴＡＴポリペプチドとの間での複合体の形成を検出することを含んでなり、複合体の形成は、哺乳動物に腫瘍の存在を示している。使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子は、固体支持体などに結合された検出可能に標識でき、および／または組織細胞の試験サンプルは、癌性腫瘍を有する疑いのある個体から得られる。
本発明のさらに別の実施形態は、ＴＡＴポリペプチドの変更された、好ましくは増加された発現または活性と関連する細胞増殖障害を治療するか、または予防する方法に関するものであり、該方法は、このような治療の必要な対象に、ＴＡＴポリペプチドのアンタゴニストの有効量を投与することを含む。細胞増殖障害は癌であることが好ましく、ＴＡＴポリペプチドのアンタゴニストは、抗ＴＡＴポリペプチド抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子またはアンチセンスオリゴペプチドである。増殖障害の有効な治療または予防は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞の直接的死滅または増殖阻止、またはＴＡＴポリペプチドの細胞増殖増強活性にアンタゴナイズさせることによって結果を得ることができる。
本発明のさらに別の実施形態は、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞に、抗体、オリゴペプチドまたは小型有機分子を結合させる方法に関するものであり、該方法は、抗体、オリゴペプチドまたは小型有機分子の前記ＴＡＴポリペプチドへの結合に好適でそれらの間で結合を可能にする条件下、ＴＡＴポリペプチドを発現する細胞と、前記抗体、オリゴペプチドまたは小型有機分子とを接触させることを含む。好ましい実施形態において、抗体は、細胞に対する抗体、オリゴペプチドまたは小型有機分子の結合位置および／または結合量を定量的に、および／または定量的測定に有用である分子または化合物により標識される。
本発明の他の実施形態は、（ｉ）癌または腫瘍の治療的処置または診断的検出、
または（ｉｉ）細胞増殖障害の治療的処置または予防に有用な医薬品の調製において、（ａ）ＴＡＴポリペプチド、（ｂ）ＴＡＴポリペプチドまたはベクターをコードする核酸、もしくはその核酸を含む宿主細胞、（ｃ）抗ＴＡＴポリペプチド抗体、（ｄ）ＴＡＴ結合オリゴペプチド、または（ｅ）ＴＡＴ結合小型有機分子の使用に関する。
本発明の別の実施形態は、前記癌細胞の増殖は、ＴＡＴポリペプチド（ＴＡＴポリペプチドは、癌細胞自体または癌細胞に対して増殖増強効果を有するポリペプチド類を産生する細胞により発現できる）の増殖増強効果に少なくとも部分的に依存する、癌細胞の増殖を阻止する方法に関するものであり、該方法は、ＴＡＴポリペプチドと、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小型有機分子とを接触させること、それによってＴＡＴポリペプチドの増殖増強活性にアンタゴナイズさせること、次に癌細胞の増殖を阻止することを含む。癌細胞の増殖は、完全に阻止することが好ましい。抗体、オリゴペプチドまたは小型有機分子のＴＡＴポリペプチドへの結合は、癌細胞の死滅を誘導することがさらにより好ましい。該抗体は、任意にモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単鎖抗体である。本発明の方法に使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子は、例えば、メイタンシノイドまたはカリキアミシン、抗体、放射性同位元素、核酸分解酵素など、増殖抑制剤または毒素などの細胞毒性剤に任意に結合できる。本発明の方法に使用される抗体およびオリゴペプチド類は、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において任意に産生できる。
本発明のさらに別の実施形態は、前記癌腫瘍の増殖は、ＴＡＴポリペプチドの増殖増強効果に少なくとも部分的に依存する、哺乳動物における腫瘍を治療的に処置する方法に関するものであり、該方法は、ＴＡＴポリペプチドに結合する抗体、オリゴペプチドまたは小型有機分子の治療的有効量を、哺乳動物に投与すること、それによって前記ＴＡＴポリペプチドの増殖増強活性をアンタゴナイズさせること、腫瘍の有効な治療的処置を生じさせることを含む。該抗体は、任意にモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、または単鎖抗体である。本発明の方法に使用される抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子は、例えば、メイタンシノイドまたはカリキアミシン、抗体、放射性同位元素、核酸分解酵素など、増殖抑制剤または毒素などの細胞毒性剤に任意に結合できる。本発明の方法に使用される抗体およびオリゴペプチド類は、ＣＨＯ細胞または細菌細胞において任意に産生できる。
Ｃ． さらに追加の実施形態
よりさらなる実施形態において、本発明は、本出願に関する以下の一連の可能性のある請求項に関する：
１． （ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ分子；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ分子；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード配列；または
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の相補体、
に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離核酸。
２． （ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域；または
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の相補体、
を有する単離核酸。
３． （ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列をコードする核酸；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードする核酸；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードする核酸；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域；または
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の相補体、
にハイブリダイズする単離核酸。
４． 前記ハイブリダイゼーションが、ストリンジェント条件下で生じる請求項３に記載の核酸。
５． 長さが少なくとも約５つのヌクレオチドである請求項３に記載の核酸。
６． 請求項１、２または３の核酸を含む発現ベクター。
７． 前記核酸が、ベクターにより形質転換された宿主細胞により認識される制御配列に作動可能に結合されている請求項６に記載の発現ベクター。
８． 請求項７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
９． ＣＨＯ細胞、大腸菌細胞または酵母細胞である請求項８に記載の宿主細胞。
１０． 前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養すること、および細胞培養から前記ポリペプチドを回収することを含むポリペプチドを産生するプロセス。
１１． （ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離核酸。
１２． （ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その付随するシグナルペプチド配列を有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたアミノ酸配列、
を有する単離ポリペプチド。
１３． 異種ポリペプチドに融合された請求項１１または１２に記載のポリペプチドを含むキメラポリペプチド。
１４． 前記異種ポリペプチドが、免疫グロブリンのエピトープタグ配列またはＦｃ領域である請求項１３に記載のキメラポリペプチド。
１５． （ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する単離抗体。
１６． （ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その付随するシグナルペプチド配列を有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたアミノ酸配列、
を有するポリペプチドに結合する単離抗体。
１７． モノクローナル抗体である請求項１５または１６に記載の抗体。
１８． 抗体断片であるである請求項１５または１６に記載の抗体。
１９． キメラ抗体またはヒト化抗体である請求項１５または１６に記載の抗体。
２０． 増殖抑制剤に結合されている請求項１５または１６に記載の抗体。
２１． 細胞毒性剤に結合されている請求項１５または１６に記載の抗体。
２２． 前記細胞毒性剤が、毒素、抗体、放射性同位元素および核酸分解酵素よりなる群から選択される請求項２１に記載の抗体。
２３． 前記細胞毒性剤が、毒素である請求項２１に記載の抗体。
２４． 前記毒素が、メイタンシノイドおよびカリキアミシンである請求項２３に記載の抗体。
２５． 前記毒素が、メイタンシノイドである請求項２３に記載の抗体。
２６． 細菌中に産生される請求項１５または１６に記載の抗体。
２７． ＣＨＯ細胞中に産生される請求項１５または１６に記載の抗体。
２８． 請求項１５または１６に記載の抗体であって、その抗体が結合する細胞の死を誘導する、抗体。
２９． 検出可能に標識される請求項１５または１６に記載の抗体。
３０． 請求項１５または１６に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を有する単離核酸。
３１． ベクターによって形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列に、作動可能に結合されている請求項３０に記載の核酸を含む発現ベクター。
３２． 請求項３１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
３３． ＣＨＯ細胞、大腸菌細胞または酵母細胞である請求項３２に記載の宿主細胞。
３４． 前記抗体の発現に好適な条件下で請求項３２に記載の宿主細胞を培養すること、および細胞培養から前記抗体を回収することを含む抗体を産生するプロセス。
３５． （ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する単離オリゴペプチド。
３６． （ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その付随するシグナルペプチド配列を有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたアミノ酸配列、
を有するポリペプチドに結合する単離オリゴペプチド。
３７． 増殖抑制剤に結合されている請求項３５または３６に記載のオリゴペプチド。
３８． 細胞毒性剤に結合されている請求項３５または３６に記載のオリゴペプチド。
３９． 前記細胞毒性剤が、毒素、抗体、放射性同位元素および核酸分解酵素よりなる群から選択される請求項３８に記載のオリゴペプチド。
４０． 前記細胞毒性剤が、毒素である請求項３８に記載のオリゴペプチド。
４１． 前記毒素が、メイタンシノイドおよびカリキアミシンよりなる群から選択される請求項４０に記載のオリゴペプチド。
４２． 前記毒素が、メイタンシノイドである請求項４０に記載のオリゴペプチド。
４３． 請求項３５または３６に記載のオリゴペプチドであって、そのオリゴペプチドが結合する細胞の死を誘導する、オリゴヌクレオチド。
４４． 検出可能に標識される請求項３５または３６に記載のオリゴペプチド。
４５． （ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合するＴＡＴ結合有機分子。
４６． （ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その付随するシグナルペプチド配列を有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたアミノ酸配列、
を有するポリペプチドに結合する請求項４５に記載の有機分子。
４７． 増殖抑制剤に結合されている請求項４５または４６に記載の有機分子。
４８． 細胞毒性剤に結合されている請求項４５または４６に記載の有機分子。
４９． 前記細胞毒性剤が、毒素、抗体、放射性同位元素および核酸分解酵素よりなる群から選択される請求項４８に記載の有機分子。
５０． 前記細胞毒性剤が、毒素である請求項４８に記載の有機分子。
５１． 前記毒素が、メイタンシノイドおよびカリキアミシンよりなる群から選択される請求項５０に記載の有機分子。
５２． 前記毒素が、メイタンシノイドである請求項５０に記載の有機分子。
５３． 請求項４５または４６に記載の有機分子であって、その有機分子が結合する細胞の死を誘導する、有機分子。
５４． 検出可能に標識される請求項４５または４６に記載の有機分子。
５５． 担体と組合わせて、
（ａ）請求項１１に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１２に記載のポリペプチド；
（ｃ）請求項１３に記載のキメラポリペプチド；
（ｄ）請求項１５に記載の抗体；
（ｅ）請求項１６に記載の抗体；
（ｆ）請求項３５に記載のオリゴペプチド；
（ｇ）請求項３６に記載のオリゴペプチド；
（ｈ）請求項４５に記載のＴＡＴ結合有機分子；または
（ｉ）請求項４６に記載のＴＡＴ結合有機分子、
を含む物質の組成物。
５６． 前記担体が、製薬的に許容できる担体である請求項５５に記載の物質の組成物。
５７． （ａ）容器；および
（ｂ）前記容器内に含まれた請求項５５に記載の物質の組成物。
５８． 前記容器に貼り付けられたラベル、または癌の治療的処置または診断的検出のために前記物質の組成物使用を言及する前記容器と共に含まれた添付文書をさらに含む請求項５７に記載の製造品。
５９． （ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現する細胞増殖を阻止する方法であって、前記細胞と、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子とを接触させること、それによって前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の前記タンパク質への結合が前記細胞の増殖阻止を引き起こさせることを含む方法。
６０． 前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項５９に記載の方法。
６１． 前記抗体が、抗体断片である請求項５９に記載の方法。
６２． 前記抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体である請求項５９に記載の方法。
６３． 前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が、増殖抑制剤に結合されている請求項５９に記載の方法。
６４． 前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が、細胞毒性剤に結合されている請求項５９に記載の方法。
６５． 前記細胞毒性剤が、毒素、抗体、放射性同位元素および核酸分解酵素よりなる群から選択される請求項６４に記載の方法。
６６． 前記細胞毒性剤が、毒素である請求項６４に記載の方法。
６７． 前記毒素が、メイタンシノイドおよびカリキアミシンよりなる群から選択される請求項６６に記載の方法。
６８． 前記毒素が、メイタンシノイドである請求項６６に記載の方法。
６９． 前記抗体が、細菌中に産生される請求項５９に記載の方法。
７０． 前記抗体が、ＣＨＯ細胞中に産生される請求項５９に記載の方法。
７１． 前記細胞が癌細胞である請求項５９に記載の方法。
７２． 前記癌細胞が、放射線治療または化学療法剤にさらに曝露される請求項７１に記載の方法。
７３． 前記癌細胞が、乳癌細胞、大腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、膵癌細胞、子宮頚癌細胞、黒色腫細胞および白血病細胞よりなる群から選択される請求項７１に記載の方法。
７４． 前記タンパク質が、同じ組織源の正常細胞と比較して、前記癌細胞により、より豊富に発現される請求項７１に記載の方法。
７５． 細胞死を引き起こす請求項５９に記載の方法。
７６． 前記タンパク質が：
（ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その付随するシグナルペプチド配列を有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたアミノ酸配列、
を有する請求項５９に記載の方法。
７７． （ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現する細胞を含む癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置する方法であって、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の治療的有効量を前記哺乳動物に投与すること、それによって前記哺乳動物を有効に処置することを含む方法。
７８． 前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項７７に記載の方法。
７９． 前記抗体が、抗体断片である請求項７７に記載の方法。
８０． 前記抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体である請求項７７に記載の方法。
８１． 前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が、増殖抑制剤に結合されている請求項７７に記載の方法。
８２． 前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が、細胞毒性剤に結合されている請求項７７に記載の方法。
８３． 前記細胞毒性剤が、毒素、抗体、放射性同位元素および核酸分解酵素よりなる群から選択される請求項８２に記載の方法。
８４． 前記細胞毒性剤が、毒素である請求項８２に記載の方法。
８５． 前記毒素が、メイタンシノイドおよびカリキアミシンよりなる群から選択される請求項８４に記載の方法。
８６． 前記毒素が、メイタンシノイドである請求項８４に記載の方法。
８７． 前記抗体が、細菌中に産生される請求項７７に記載の方法。
８８． 前記抗体が、ＣＨＯ細胞中に産生される請求項７７に記載の方法。
８９． 前記腫瘍が、放射線治療または化学療法剤にさらに曝露される請求項７７に記載の方法。
９０． 前記腫瘍が、乳房腫瘍、大腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、中枢神経系腫瘍、肝腫瘍、膀胱腫瘍、膵腫瘍、または子宮頚腫瘍である請求項７７に記載の方法。
９１． 前記タンパク質が、同じ組織源の正常細胞と比較して、前記腫瘍の癌性細胞により、より豊富に発現される請求項７７に記載の方法。
９２． 前記タンパク質が：
（ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その付随するシグナルペプチド配列を有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたアミノ酸配列、
を有する請求項７７に記載の方法。
９３． 前記タンパク質が：
（ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する前記タンパク質を含んでいる疑いのあるサンプル中のタンパク質の存在を判定する方法であって、前記サンプルを、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子に曝露させること、および前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の前記サンプル中の前記タンパク質への結合を測定することを含んでなり、前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の前記タンパク質への結合が、前記サンプル中のタンパク質の存在を示す方法。
９４． 前記サンプルが、前記タンパク質を発現する疑いのある細胞を含む請求項９３に記載の方法。
９５． 前記細胞が癌細胞である請求項９４に記載の方法。
９６． 前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が、検出可能に標識される請求項９３に記載の方法。
９７． 前記タンパク質が：
（ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その付随するシグナルペプチド配列を有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたアミノ酸配列、
を有する請求項９３に記載の方法。
９８． 哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法であって、前記哺乳動物から得られた組織細胞の試験サンプルおよび同じ組織源の既知の正常細胞の対照サンプルにおいて、
（ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する前記タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定することを含んでなり、対照サンプルと比較して、試験サンプルにおける前記タンパク質のより高い発現レベルは、試験サンプルが得られた哺乳動物における腫瘍の存在を示す方法。
９９． 前記タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定するステップが、インサイチュハイブリダイゼーションまたはＲＴ−ＰＣＲ分析においてオリゴヌクレオチドを使用することを含む請求項９８に記載の方法。
１００． 前記タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定するステップが、免疫組織化学またはウェスタンブロット解析において抗体を使用することを含む請求項９８に記載の方法。
１０１． 前記タンパク質が：
（ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その付随するシグナルペプチド配列を有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたアミノ酸配列、
を有する請求項９８に記載の方法。
１０２． 哺乳動物における腫瘍の存在を診断する方法であって、
（ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質に結合する抗体、オリゴヌクレオチドまたは有機分子と、前記哺乳動物から得られた組織細胞の試験サンプルとを接触させること、および前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子と試験サンプル中のタンパク質との間の複合体の形成を検出することを含んでなり、複合体の形成が、哺乳動物における腫瘍の存在を示す方法。
１０３． 前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が、検出可能に標識される請求項１０２に記載の方法。
１０４． 前記組織細胞の試験サンプルが、癌性腫瘍を有する疑いのある個体から得られる請求項１０２に記載の方法。
１０５． 前記タンパク質が：
（ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その付随するシグナルペプチド配列を有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたアミノ酸配列、
を有する請求項１０２に記載の方法。
１０６． （ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の発現または活性の増加と関連する細胞増殖障害を治療または予防する方法であって、前記タンパク質のアンタゴニストの有効量を、このような治療を必要する対象に投与すること、それによって前記細胞増殖障害を有効に治療すること、または予防することを含む方法。
１０７． 前記細胞増殖障害が癌である請求項１０６に記載の方法。
１０８． 前記アンタゴニストが、抗ＴＡＴポリペプチド抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求項１０６に記載の方法。
１０９． （ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を発現する細胞に、抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を結合させる方法であって、前記細胞と、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子とを接触させること、抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の前記タンパク質への結合を生じさせること、それによって前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を前記細胞に結合させることを含む方法。
１１０． 前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項１０９に記載の方法。
１１１． 前記抗体が、抗体断片である請求項１０９に記載の方法。
１１２． 前記抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体である請求項１０９に記載の方法。
１１３． 前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が、増殖抑制剤に結合されている請求項１０９に記載の方法。
１１４． 前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が、細胞毒性剤に結合されている請求項１０９に記載の方法。
１１５． 前記細胞毒性剤が、毒素、抗体、放射性同位元素および核酸分解酵素よりなる群から選択される請求項１１４に記載の方法。
１１６． 前記細胞毒性剤が毒素である請求項１１４に記載の方法。
１１７． 前記毒素が、メイタンシノイドおよびカリキアミシンよりなる群から選択される請求項１１６に記載の方法。
１１８． 前記毒素が、メイタンシノイドである請求項１１６に記載の方法。
１１９． 前記抗体が、細菌中に産生される請求項１０９に記載の方法。
１２０． 前記抗体が、ＣＨＯ細胞中に産生される請求項１０９に記載の方法。
１２１． 前記細胞が癌細胞である請求項１０９に記載の方法。
１２２． 前記癌細胞が、放射線治療または化学療法剤にさらに曝露される請求項１２１に記載の方法。
１２３． 前記癌細胞が、乳癌細胞、大腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、中枢神経系癌細胞、肝癌細胞、膀胱癌細胞、膵癌細胞、子宮頚癌細胞、黒色腫細胞および白血病細胞よりなる群から選択される請求項１２１に記載の方法。
１２４． 前記タンパク質が、同じ組織源の正常細胞と比較して、前記癌細胞により、より豊富に発現される請求項１２３に記載の方法。
１２５． 細胞死を引き起こす請求項１０９に記載の方法。
１２６． 癌の治療的処置用または診断検出用医薬品の調製における請求項１から５または３０のいずれかに記載の核酸の使用。
１２７． 腫瘍の治療用医薬品の調製における請求項１から５または３０のいずれかに記載の核酸の使用。
１２８． 細胞増殖疾患の治療用または予防用医薬品の調製における請求項１から５または３０のいずれかに記載の核酸の使用。
１２９． 癌の治療的処置用または診断検出用医薬品の調製における請求項６、７または３１のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
１３０． 腫瘍の治療用医薬品の調製における請求項６、７から５または３１のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
１３１． 細胞増殖疾患の治療用または予防用医薬品の調製における請求項６、７または３１のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
１３２． 癌の治療的処置用または診断検出用医薬品の調製における請求項８、９、３２または３３のいずれかに記載の宿主細胞の使用。
１３３． 腫瘍の治療用医薬品の調製における請求項８、９、３２または３３のいずれかに記載の宿主細胞の使用。
１３４． 細胞増殖疾患の治療用または予防用医薬品の調製における請求項８、９、３２または３３のいずれかに記載の宿主細胞の使用。
１３５． 癌の治療的処置用または診断検出用医薬品の調製における請求項１１から１４のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
１３６． 腫瘍の治療用医薬品の調製における請求項１１から１４のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
１３７． 細胞増殖疾患の治療用または予防用医薬品の調製における請求項１１から１４のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
１３８． 癌の治療的処置用または診断検出用医薬品の調製における請求項１５から２９のいずれかに記載の抗体の使用。
１３９． 腫瘍の治療用医薬品の調製における請求項１５から２９のいずれかに記載の抗体の使用。
１４０． 細胞増殖疾患の治療用または予防用医薬品の調製における請求項１５から２９のいずれかに記載の抗体の使用。
１４１． 癌の治療的処置用または診断検出用医薬品の調製における請求項３５から４４のいずれかに記載のオリゴペプチドの使用。
１４２． 腫瘍の治療用医薬品の調製における請求項３５から４４のいずれかに記載のオリゴペプチドの使用。
１４３． 細胞増殖疾患の治療用または予防用医薬品の調製における請求項３５から４４のいずれかに記載のオリゴペプチドの使用。
１４４． 癌の治療的処置用または診断検出用医薬品の調製における請求項４５から５４のいずれかに記載のＴＡＴ結合有機分子の使用。
１４５． 腫瘍の治療用医薬品の調製における請求項４５から５４のいずれかに記載のＴＡＴ結合有機分子の使用。
１４６． 細胞増殖疾患の治療用または予防用医薬品の調製における請求項４５から５４のいずれかに記載のＴＡＴ結合有機分子の使用。
１４７． 癌の治療的処置用または診断検出用医薬品の調製における請求項５５または５６のいずれかに記載の物質の組成物の使用。
１４８． 腫瘍の治療用医薬品の調製における請求項５５または５６のいずれかに記載の物質の組成物の使用。
１４９． 細胞増殖疾患の治療用または予防用医薬品の調製における請求項５５または５６のいずれかに記載の物質の組成物の使用。
１５０． 癌の治療的処置用または診断検出用医薬品の調製における請求項５７または５８のいずれかに記載の製造品の使用。
１５１． 腫瘍の治療用医薬品の調製における請求項５７または５８のいずれかに記載の製造品の使用。
１５２． 細胞増殖疾患の治療用または予防用医薬品の調製における請求項５７または５８のいずれかに記載の製造品の使用。
１５３． 前記細胞の増殖が：
（ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の増殖増強作用に少なくとも部分的に依存する、細胞の増殖を阻止する方法であって、前記タンパク質と、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子とを接触させること、それによって前記細胞の増殖を阻止することを含む方法。
１５４． 前記細胞が癌細胞である請求項１５３に記載の方法。
１５５． 前記タンパク質が、前記細胞によって発現される請求項１５３に記載の方法。
１５６． 前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の前記タンパク質への結合が、前記タンパク質の細胞増殖増強活性にアンタゴナイズする請求項１５３に記載の方法。
１５７． 前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の前記タンパク質への結合が、前記細胞の死滅を誘導する請求項１５３に記載の方法。
１５８． 前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項１５３に記載の方法。
１５９． 前記抗体が、抗体断片である請求項１５３に記載の方法。
１６０． 前記抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体である請求項１５３に記載の方法。
１６１． 前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が、増殖抑制剤に結合される請求項１５３に記載の方法。
１６２． 前記抗体、オリゴペプチドまたは有機分子が、細胞毒性剤に結合される請求項１５３に記載の方法。
１６３． 前記細胞毒性剤が、毒素、抗体、放射性同位元素および核酸分解酵素よりなる群から選択される請求項１６２に記載の方法。
１６４． 前記細胞毒性剤が毒素である請求項１６２に記載の方法。
１６５． 前記毒素が、メイタンシノイドおよびカリキアミシンよりなる群から選択される請求項１６４に記載の方法。
１６６． 前記毒素が、メイタンシノイドである請求項１６４に記載の方法。
１６７． 前記抗体が、細菌中に産生される請求項１５３に記載の方法。
１６８． 前記抗体が、ＣＨＯ細胞中に産生される請求項１５３に記載の方法。
１６９． 前記タンパク質が：
（ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その付随するシグナルペプチド配列を有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたアミノ酸配列、
を有する請求項１５３に記載の方法。
１７０． 前記腫瘍の増殖が：
（ａ）配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチド；
（ｃ）その付随するシグナルペプチドを有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｄ）その付随するシグナルペプチドを欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたポリペプチド、
に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質の増殖増強作用に少なくとも部分的に依存する、哺乳動物のける腫瘍を治療的に処置する方法であって、前記タンパク質と、前記タンパク質に結合する抗体、オリゴペプチドまたは有機分子とを接触させること、それによって前記腫瘍を有効に処置することを含む方方法。
１７１． 前記タンパク質が、前記腫瘍の細胞により発現される請求項１７０に記載の方法。
１７２． 前記抗体、オリゴヌクレオチドまたは有機分子の前記タンパク質への結合が、前記タンパク質の細胞増殖増強活性にアンタゴナイズする請求項１７０に記載の方法。
１７３． 前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項１７０に記載の方法。
１７４． 前記抗体が、抗体断片である請求項１７０に記載の方法。
１７５． 前記抗体が、キメラ抗体またはヒト化抗体である請求項１７０に記載の方法。
１７６． 前記抗体、オリゴヌクレオチドまたは有機分子が、増殖抑制剤に結合される請求項１７０に記載の方法。
１７７． 前記抗体、オリゴヌクレオチドまたは有機分子が、細胞毒性剤に結合される請求項１７０に記載の方法。
１７８． 前記細胞毒性剤が、毒素、抗体、放射性同位元素および核酸分解酵素よりなる群から選択される請求項１７７に記載の方法。
１７９． 前記細胞毒性剤が毒素である請求項１７７に記載の方法。
１８０． 前記毒素が、メイタンシノイドおよびカリキアミシンよりなる群から選択される請求項１７９に記載の方法。
１８１． 前記トキシンがメイタンシノイドである請求項１７９に記載の方法。
１８２． 前記抗体が、細菌中に産生される請求項１７０に記載の方法。
１８３． 前記抗体が、ＣＨＯ細胞中に産生される請求項１７０に記載の方法。
１８４． 前記タンパク質が：
（ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｂ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるアミノ酸配列；
（ｃ）その付随するシグナルペプチド配列を有する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｄ）その付随するシグナルペプチド配列を欠失する配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列；または
（ｆ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域によりコードされたアミノ酸配列、
を有する請求項１７０に記載の方法。
１８６． 表７に示された任意のハイブリドーマ細胞系によって産生された抗体により結合されたエピトープに結合する単離抗体。
１８７． モノクローナル抗体である請求項１８６に記載の抗体。
１８８． 抗体断片である請求項１８６に記載の抗体。
１８９． ヒト化抗体である請求項１８６に記載の抗体。
１９０． 増殖抑制剤に結合される請求項１８６に記載の抗体。
１９１． 細胞毒性剤に結合される請求項１８６に記載の抗体。
１９２． 前記細胞毒性剤が、毒素、抗体、放射性同位元素および核酸分解酵素よりなる群から選択される請求項１９１に記載の抗体。
１９３． 前記細胞毒性剤が毒素である請求項１９１に記載の抗体。
１９４． 前記毒素が、メイタンシノイドおよびカリキアミシンよりなる群から選択される請求項１９３に記載の抗体。
１９５． 前記トキシンがメイタンシノイドである請求項１９３に記載の抗体。
１９６． 細菌中に産生される請求項１８６に記載の抗体。
１９７． ＣＨＯ細胞中に産生される請求項１８６に記載の抗体。
１９８． 請求項１８６に記載の抗体であって、その抗体が結合する細胞の死を誘導する、抗体。
１９９． 検出可能に標識される請求項１８６に記載の抗体。
２００． 表７に示された任意のハイブリドーマ細胞系によって産生された任意の抗体領域を決定する少なくとも１つの相補性を含む請求項１８６に記載の抗体。
２０１． 表７に示された任意のハイブリドーマ細胞系によって産生されたモノクローナル抗体。
２０２． ＴＡＴ１１３ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
２０３． 表７に示された任意のハイブリドーマ細胞系によって産生された抗体により結合されたエピトープに結合する抗体を同定する方法であって、第一の抗体が、表７に示された任意のハイブリドーマ細胞系によって産生された第二の抗体によりのＴＡＴ１１３ポリペプチドへの結合を遮断する能力を判定することを含んでなり、少なくとも４０％および等しい抗体濃度で、前記第二の抗体の前記ＴＡＴ１１３ポリペプチドへの結合を遮断する前記第一の能力により、前記第一の抗体が、前記第二の抗体によって結合されたエピトープに結合できることを示す方法。
本発明のよりさらなる実施形態は、本明細書を読むことによって当業者にとって明白になるであろう。
好ましい実施形態の詳細な説明
定義
本明細書に用いられ、直ぐに数値指定が続く場合、用語の「ＴＡＴポリペプチド」および「ＴＡＴ」は、種々のポリペプチドを称し、完全指定（すなわち、ＴＡＴ／番号）は、本明細書に記載された特定のポリペプチド配列を称す。用語の「番号」が、本明細書に用いられる実際の数値指定として提供される用語の「ＴＡＴ／番号ポリペプチド」および「ＴＡＴ／番号」は、天然配列のポリペプチド類、ポリペプチド変異体ならびに天然配列のポリペプチド類およびポリペプチド変異体（本明細書にさらに定義される）の断片を包含する。本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチド類は、ヒト組織タイプまたは別の起源からなど、種々の起源から単離でき、または組換え法もしくは合成法により調製できる。用語の「ＴＡＴポリペプチド」とは、本明細書に開示された各々個々のＴＡＴ／番号ポリペプチドを称す。「ＴＡＴポリペプチド」を称する本明細書中の全ての開示は、個々にならびに協同でポリペプチド類の各々を称す。例えば、疾患の治療を含む組成物の投与に対して、またはそれに備えて、抗体の形成、ＴＡＴ結合オリゴペプチド類の形成、ＴＡＴ結合有機分子の形成、それらの調製、精製、誘導化についての記載は、各々個々に本発明のポリペプチドに関係する。用語の「ＴＡＴポリペプチド」はまた、本明細書に開示されたＴＡＴ／番号ポリペプチド類の変異体を含む。
「天然配列のＴＡＴポリペプチド」は、天然に由来する対応するＴＡＴポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列のＴＡＴポリペプチドは、天然から単離できるか、または組換え手段または合成手段により製造できる。用語の「天然配列のＴＡＴポリペプチド」は、特定のＴＡＴポリペプチド（例えば、細胞外ドメイン配列）の天然切断体または分泌体、天然変異体（例えば、あるいはスプライシング体）およびポリペプチドの天然の対立遺伝子変異体を特に包含する。本発明の一定の実施形態において、本明細書に開示された天然配列のＴＡＴポリペプチド類は、添付の図面に示された完全長アミノ酸配列を含む成熟または完全長天然配列のポロペプチド類である。出発および終止コドン（示される場合）は、図面の太字体の下線で示される。添付の図面で「Ｎ」または「Ｘ」として示された核酸残基は、任意の核酸残基である。しかしながら、添付の図面に開示されたＴＡＴポリペプチド類は、図面中の１位のアミノ酸として本明細書に指定されたメチオニン残基により開始することが示されているが、図面中の１位のアミノ酸から上流または下流に配置された他のメチオニン残基は、ＴＡＴポリペプチド類に対して出発アミノ酸残基として使用し得ることが考えられる可能性がある。
ＴＡＴポリペプチドの「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」とは、本質的に膜貫通および細胞質内ドメインの無いＴＡＴポリペプチドの形態を称す。通常、ＴＡＴポリペプチドＥＣＤは、このような膜貫通および／または細胞質内ドメインの１％未満を有し、このようなドメインの０．５％未満が好ましい。当然のことながら、本発明のＴＡＴポリペプチド類に関して同定された膜貫通ドメインはいずれも、そのタイプの疎水性ドメインを同定するために当業界にルーチン的に使用されている評価基準に従って同定される。膜貫通ドメインの正確な境界は変化し得るが、本明細書で最初に同定されたドメインのいずれかの末端における約５つのアミノ酸以下の変化である可能性が高い。したがって任意に、ＴＡＴポリペプチドの細胞外ドメインは、実施例または明細書に同定された膜貫通／細胞外ドメインの境界域のいずれかの側に約５つまたはそれ以下のアミノ酸を含有でき、付随するシグナルペプチドを有する、または有さないこのようなポリペプチド類、およびそれらをコードする核酸が、本発明により考慮されている。
本明細書に開示された種々のＴＡＴポリペプチド類の「シグナルペプチド類」のおおよその位置は、本明細書および／または添付の図面に示すことができる。しかしながら、シグナルペプチドのＣ−末端境界域は変わり得るが、本明細書に最初に同定されたシグナルペプチドのＣ−末端境界域のいずれかの側にわずか５つにすぎないアミノ酸によるのが最も相応しく、シグナルペプチドのＣ−末端境界域は、そのタイプのアミノ酸配列要素を同定するために当業界にルーチン的に使用されている評価基準に従って同定できる（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６頁（１９９７）およびｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０頁（１９８６））。さらに、幾つかの場合、分泌ポリペプチドからシグナル配列の開裂は、１つ超の分泌種を生じて完全に均一でないこともまた認識される。該シグナルペプチドが、本明細書に同定されたシグナルペプチドのＣ−末端境界域のいずれかの側にわずか５つにすぎないアミノ酸内に開裂されるこれらの成熟ポリペプチド類、およびそれらをコードするポリヌクレオチド類は、本発明により考慮されている。
「ＴＡＴポリペプチド変異体」とは、本明細書に開示された完全長天然配列のＴＡＴポリペプチド配列、本明細書に開示されたシグナルペプチドを欠失するＴＡＴポリペプチド配列、本明細書に開示されたシグナルペプチドの有無のＴＡＴポリペプチド細胞外ドメイン、または本明細書に開示された完全長ＴＡＴポリペプチドの任意の他の断片（完全長ＴＡＴポリペプチドに関する完全コード配列の部分だけを表す核酸によりコードされたものなど）と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する本明細書に定義されたＴＡＴポリペプチド、好ましくは活性なＴＡＴポリペプチドを意味する。このようなＴＡＴポリペプチド変異体は、例えば、１つまたは複数のアミノ酸残基が、完全長天然アミノ酸配列のＮ−またはＣ−末端に付加されるか、または削除されるＴＡＴポリペプチドを含む。通常、ＴＡＴポリペプチド変異体は、本明細書に開示された完全長天然配列のＴＡＴポリペプチド配列、本明細書に開示されたシグナルペプチドを欠失するＴＡＴポリペプチド配列、本明細書に開示されたシグナルペプチドの有無のＴＡＴポリペプチド細胞外ドメイン、または本明細書に開示された完全長ＴＡＴポリペプチドの任意の他の具体的に定義された断片に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。通常、ＴＡＴ変異体ポリペプチド類は、長さが少なくとも約１０のアミノ酸、あるいは、長さが少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００のアミノ酸、またはそれ以上である。任意に、ＴＡＴ変異体ポリペプチド類は、天然ＴＡＴポリペプチド配列と比較して、１つにすぎない保存アミノ酸置換を有し、あるいは、天然ＴＡＴポリペプチド配列と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０にすぎない保存アミノ酸置換を有する。
本明細書に同定されたＴＡＴポリペプチドに関する「アミノ酸配列の同一性パーセント（％）」は、配列同一性の一部としていずれの保存置換を考慮することなく最大パーセント配列同一性を達成するために、必要ならば、配列および導入ギャップを整列化後、具体的なＴＡＴポリペプチド配列においてアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列の同一性パーセントを測定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手できるコンピュータソフトウェアを用いて、当業技術の範囲内である種々の方法で達成できる。当業者は、比較される完全長配列上に最大アラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムなど、アラインメントを測定するために適切なパラメータを決定できる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列の同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて生成され、ＡＬＩＧＮ−２プログラムに関する完全原始コードは、下記の表１に提供される。ＡＬＩＧＮ−２の配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社により著作されており、下記の表１に示された原始コードは、米国著作権局、ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９に、使用者の文書と共に出願されており、それは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州により公的に入手できるか、または下記の表１に提供された原始コードからコンパイルできる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）操作システム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄに対する使用に関してコンパイルされるはずである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変わらない。
ＡＬＩＧＮ−２プログラムが、アミノ酸配列の比較に使用される状況において、所与のアミノ酸配列Ｂに対して、それと、またはそれに備えて、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列の同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して、それと、またはそれに備えて、ある一定のアミノ酸配列の同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａとして表すことができる）は、以下のとおり算出される：
Ｘ／Ｙ分率の１００倍
式中Ｘは、ＡおよびＢのそのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により同一のマッチとしてスコア化されたアミノ酸残基数であり、Ｙは、Ｂにおける全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ａ対Ｂのアミノ酸配列の同一性％は、Ｂ対Ａのアミノ酸配列の同一性％と等しくないことが認識されるであろう。この方法を用いるアミノ酸配列の同一性％算出の例として、表２および表３は、「ＴＡＴ」と指定されたアミノ酸配列に対して「比較タンパク質」と指定されたアミノ酸配列のアミノ酸配列の同一性％を算出する方法を示しており、「ＴＡＴ」は、対象の仮想ＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」は、対象の「ＴＡＴ」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」および「Ｚ」の各々は、仮想の異なるアミノ酸残基を表す。特に他に述べない限り、本明細書に用いられる全てのアミノ酸配列の同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて直前に記述された段落に記載されたとおりに得られる。
「ＴＡＴ変異体ポリヌクレオチド」または「ＴＡＴ変異体核酸配列」とは、本明細書に開示された完全長天然配列のＴＡＴポリペプチド配列、本明細書に開示されたシグナルペプチドを欠失する完全長天然配列のＴＡＴポリペプチド配列、本明細書に開示されたシグナルペプチドの有無のＴＡＴポリペプチド細胞外ドメイン、または本明細書に開示された完全長ＴＡＴポリペプチドの任意の他の断片（完全長ＴＡＴポリペプチドに関する完全コード配列の一部だけを表す核酸によりコードされたものなど）をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する本明細書に定義されたＴＡＴポリペプチド、好ましくは活性なＴＡＴポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。通常、ＴＡＴ変異体ポリヌクレオチドは、本明細書に開示された完全長天然配列のＴＡＴポリペプチド配列、本明細書に開示されたシグナルペプチドを欠失する完全長天然配列のＴＡＴポリペプチド配列、本明細書に開示されたシグナルペプチドの有無のＴＡＴポリペプチド細胞外ドメイン、または本明細書に開示された完全長ＴＡＴポリペプチドの任意の他の断片をコードする核酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の核酸配列同一性を有するであろう。変異体は、天然ヌクレオチド配列を包含しない。
通常、ＴＡＴ変異体ポリヌクレオチド類は、長さが少なくとも約５つのヌクレオチド、あるいは、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００のヌクレオチドであり、この文脈において用語の「約」とは、述べられたヌクレオチド配列の長さに、述べられたその長さのプラスまたはマイナス１０％を意味する。
本明細書に同定されたＴＡＴコード拡散配列に関する「核酸配列の同一性パーセント（％）」は、最大パーセント配列同一性を達成するために、必要ならば、配列および導入ギャップをアラインした後、対象のＴＡＴ核酸配列においてヌクレオチドと同一である候補配列のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。核酸配列の同一性パーセントを判定する目的のアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手できるコンピュータソフトウェアを用いて、当業技術の範囲内である種々の方法で達成できる。しかしながら、本明細書における目的のために、核酸配列の同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて生成され、ＡＬＩＧＮ−２プログラムに関する完全原始コードは、下記の表１に提供される。ＡＬＩＧＮ−２の配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社により著作されており、下記の表１に示された原始コードは、米国著作権局、ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９に、使用者の文書と共に出願されており、それは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州により公的に入手できるか、または下記の表１に提供された原始コードからコンパイルできる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）操作システム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄに対する使用に関してコンパイルされるはずである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変わらない。
ＡＬＩＧＮ−２プログラムが、核酸配列の比較に使用される状況において、所与の核酸配列Ｄに対する、それとの、またはそれと対照した、所与の核酸配列Ｃの核酸配列の同一性％（あるいは、所与の核酸配列Ｄに対して、それとの、またはそれと対照した、ある一定の核酸配列の同一性％を有するか、または含む所与の核酸配列Ｃとして表すことができる）は、以下のとおり算出される：
Ｗ／Ｚ分率の１００倍
式中Ｗは、ＣおよびＤのそのプログラムのアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により同一のマッチとしてスコア化されたヌクレオチド数であり、Ｚは、Ｄにおける全ヌクレオチド数である。核酸配列Ａの長さが、核酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｃ対Ｄの核酸配列の同一性％は、Ｂ対Ａの核酸配列の同一性％と等しくないことが認識されるであろう。核酸配列の同一性％算出の例として、表４および表５は、「ＴＡＴ−ＤＮＡ」と指定された核酸配列に対して「比較ＤＮＡ」と指定された核酸配列の核酸配列の同一性％を算出する方法を示しており、「ＴＡＴ−ＤＮＡ」は、対象の仮想ＴＡＴコード核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は、対象の「ＴＡＴ−ＤＮＡ」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を表し、「Ｎ」、「Ｌ」および「Ｖ」の各々は、仮想の異なるヌクレオチド類を表す。特に他に述べない限り、本明細書に用いられる全ての核酸配列の同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて直前に記述された段落に記載されたとおりに得られる。
他の実施形態において、ＴＡＴ変異体ポリヌクレオチド類は、ＴＡＴポリペプチドをコードし、好ましくはストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下、本明細書に開示された完全長ＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズできる核酸分子である。ＴＡＴ変異体ポリペプチド類は、ＴＡＴ変異体ポリヌクレオチド類によりコードされるものであり得る。
ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸に関して用いられる場合、用語の「完全長コード領域」とは、本発明の完全長ＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド類の配列（添付の図面において、開始コドンと終止コドンを含め、それらの間にしばしば示される）を称す。ＡＴＣＣに寄託された核酸に関して用いられる場合、用語の「完全長コード領域」とは、ＡＴＣＣにより寄託されたベクターに挿入されるｃＤＮＡのＴＡＴポリペプチドコード部分（添付の図面において、開始コドンと終止コドンを含め、それらの間にしばしば示される）を称す。
本明細書に開示された種々のＴＡＴポリペプチド類を記載するために用いられる場合の「単離」とは、その天然環境の成分から同定、分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。その天然環境の不純物成分は、該ポリペプチドに対して診断または治療使用を典型的に妨害すると思われる物質であり、酵素、ホルモン類、および他のタンパク質溶質または非タンパク質溶質を含み得る。好ましい実施形態において、該ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターの使用により少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に、または（２）クーマシーブルーまたは、好ましくは、銀染色を用いる非還元または還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性に、精製される。天然環境で少なくとも１種の成分のＴＡＴポリペプチドが存在しないことから、単離ポリペプチドは、インサイチュ組換え細胞内にポリペプチドを含む。しかしながら通常、単離ポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
「単離」ＴＡＴポリペプチドコード核酸または他のポリペプチドコード核酸は、通常、ポリペプチドコード核酸の天然源に関連する少なくとも１種の不純物核酸分子から同定され、分離される核酸分子である。単離ポリペプチドコード核酸分子は、天然に見られる形態または設定以外のものである。したがって、単離ポリペプチドコード核酸分子は、天然細胞に存在する特定のポリペプチドコード核酸分子とは区別される。しかしながら、単離ポリペプチドコード核酸分子は、通常、ポリペプチドを発現する細胞に含まれたポリペプチドコード核酸分子を含み、例えば、該核酸分子は、天然細胞のものとは異なる染色体位置にある。
用語の「対照配列」は、特定の宿主生物において操作的に結合されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を称す。原核生物に好適である対照配列としては、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「操作的に結合」される。例えば、シグナルペプチドまたは分泌リーダーに関するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドに係わるＤＮＡに操作的に結合され；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に操作的に結合され；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に操作的に結合される。一般に、「操作的に結合される」とは、結合されるＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダーの場合、連続的でリーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続的である必要はない。結合は、好適な制限部位での連結により達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーを、慣例的な実践法に従って用いる。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、通常の当業者によって容易に判定でき、一般にプローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依って経験的に算出される。一般に、より長いプローブは、適切なアニーリングのために高温を必要とするが、一方、より短いプローブは、低温を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖が、それらの融解温度以下の環境に存在する場合に再アニールするために変性ＤＮＡ能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間に所望の相同性が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにさせる傾向となり、一方、より低い温度では、それを、より低ストリンジェントにする傾向となる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明に関して、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、（１９９５）を参照されたい。
本明細書に定義される「ストリンジェント条件」または「高ストリンジェント条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、５０℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを使用し；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドなどの変性剤、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムによりｐＨ６．５で５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を有する５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを４０℃で使用し；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で使用する溶液中で一晩のハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中４２℃で１０分の洗浄、次いで５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣよりなる１０分の高ストリンジェンシーの洗浄、を使用することによって定義できる。
「中等度ストリンジェント条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年に記載されているように定義でき、上記のものよりも低ストリンジェントの洗浄液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中等度ストリンジェント条件の一例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で一晩のインキュベーション、次いで約３７〜５０℃で１×ＳＳＣ中、フィルター洗浄である。当業技術者は、プローブ長などの因子に適応させるために必要な場合、温度、イオン強度などを調整する方法を認識している。
本明細書に用いられる用語の「エピトープタグ化」とは、「タグポリペプチド」に融合されたＴＡＴポリペプチドまたは抗ＴＡＴ抗体を含むキメラポリペプチドを称す。タグポリペプチドは、抗体を作製できるエピトープを提供するのに十分な残基を有し、さらに融合されるポリペプチドの活性を妨害しないほど十分に短い。タグポリペプチドはまた、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないようにユニークであることが好ましい。好適なタグポリペプチド類は一般に、少なくとも６つのアミノ酸残基を有し、通常は約８と５０との間のアミノ酸残基（好ましくは、約１０と２０との間のアミノ酸残基）を有する。
本明細書の目的のために「活性な」または「活性」とは、未変性または天然ＴＡＴの生物活性および／または免疫学的活性を保持するＴＡＴポリペプチドの形態を称し、「生物」活性とは、未変性または天然ＴＡＴにより備えられた抗原性エピトープに対する抗体産生を誘導する能力以外に未変性または天然ＴＡＴにより引き起こされる生物学的機能（抑制性または刺激性）を称し、「免疫学的」活性とは、未変性または天然ＴＡＴにより備えられた抗原性エピトープに対する抗体産生を誘導する能力を称す。
用語の「アンタゴニスト」は、最も広い意味で用いられ、本明細書に開示された未変性ＴＡＴポリペプチドの生物活性を、部分的または完全に遮断し、抑制し、または中和する任意の分子を含む。同様の様式で、用語の「アゴニスト」は、最も広い意味で用いられ、本明細書に開示された未変性ＴＡＴポリペプチドの生物活性を模倣する任意の分子を含む。好適なアゴニスト分子またはアンタゴニスト分子としては、具体的にアゴニストまたはアンタゴニスト抗体もしくは抗体断片、未変性ＴＡＴポリペプチドの断片またはアミノ酸配列変異体、小型有機分子などが挙げられる。ＴＡＴポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法は、ＴＡＴポリペプチドと、候補アゴニスト分子または候補アンタゴニスト分子とを接触させること、ＴＡＴポリペプチドと通常関連する１つまたは複数の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含んでなり得る。
「治療」または「処置」あるいは「軽減」は、治療的処置および予防的または予防手段の双方を言い、その目的は、標的病態または疾患を予防するか、または遅速させる（減らす）ことである。処置の必要な人としては、既に障害を持つ人ならびに障害を有する傾向がある人または障害を予防すべき人が挙げられる。対象または哺乳動物は、本発明の方法による抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子の治療量を受けた後、患者が、１つまたは複数の以下の観察可能なおよび／または測定可能な減少または不在：癌細胞数の減少または癌細胞の不在；腫瘍サイズの減少；軟組織および骨への癌の拡散など、癌細胞の周辺臓器への侵入抑制（すなわち、ある程度緩徐にし、好ましくは停止させる）；腫瘍転移抑制（すなわち、ある程度緩徐にし、好ましくは停止させる）；腫瘍増殖のある程度の抑制；および／または特定の癌に関連する１つまたは複数の症状のある程度の軽減；罹患率および死亡率の減少、および生活の質の問題の改善、を示す場合、ＴＡＴポリペプチド発現癌に対して首尾よく「治療」されることになる。抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴ結合オリゴペプチドが、増殖を予防し、および／または存在する癌細胞を死滅させ得る程度まで、それは、細胞増殖抑制性および／または細胞毒性であり得る。これらの徴候または症状の軽減もまた、患者により感じることができる。
疾患における成功した処置および改善を評価するための上記パラメータは、医師に精通したルーチン的手法により容易に測定可能である。癌療法に関して、有効性は、例えば、疾患進行時間を評価すること、および／または応答速度（ＲＲ）を判定することにより測定できる。転移は、ステージング試験および骨のスキャンならびにカルシウムレベル試験および骨への拡散を測定するために他の酵素により判定できる。ＣＴスキャンもまた、骨盤およびその領域のリンパ節への拡散を探すために実施できる。胸部Ｘ線および公知の方法による肝酵素レベルの測定は、それぞれ肺および肝臓への転移を探すために使用される。疾患をモニターする他のルーチン的方法としては、経大腸超音波映像法（ＴＲＵＳ）および経直腸的針生体組織検査法（ＴＲＮＢ）が挙げられる。
より局在化された癌である膀胱癌に関して、疾患の進行を測定する方法としては、膀胱鏡検査による尿細胞学的評価、尿中血液の存在のモニタリング、断層撮影または静脈内腎盂X線像による尿路上皮性管の可視化、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）が挙げられる。遠位転移の存在は、腹部のＣＴ、胸部Ｘ線、または骨格の放射性核種画像により評価できる。
「慢性」投与とは、最初の治療効果を、時期を延長させて維持するための、急性様式に対する連続様式の薬剤投与を言う。「間欠」投与は、中断はしないが、連続的ではなく、したがって周期的に実施される処置である。
癌の症状を軽減する治療または診断目的のための「哺乳動物」とは、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどの家畜および飼育動物、および動物園、スポーツ、またはペット動物など、哺乳動物として分類された、いずれの動物をも称す。哺乳動物はヒトであることが好ましい。
１種または複数種のさらなる治療薬「との組合わせ」投与は、同時（並行）投与および任意の順序での連続投与を含む。
本明細書に用いられる「担体」としては、使用される投与量および濃度で、それに曝される細胞または哺乳動物に対して非毒性である製薬的に許容できる担体、賦形剤、または安定化剤が挙げられる。製薬的に許容できる担体は、ｐＨ緩衝水溶液であることが多い。製薬的に許容できる担体の例としては、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０未満残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー類；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの炭糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
「固相」または「固体支持体」とは、本発明の抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子が接着または結合できる非水性マトリックスを意味する。本明細書に包含された固相の例としては、ガラス（例えば、制御ポアガラス）、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド類、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーン類の部分的または全体的に形成されたものが挙げられる。一定の実施形態において、状況に依って固相は、アッセイプレートのウェルを含むことができ；他の実施例において、固相は、精製用カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィ用カラム）である。この用語はまた、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたものなど、離散粒子の不連続固相を含む。
「リポソーム」は、薬物（ＴＡＴポリペプチド、それに対する抗体またはＴＡＴ結合オリゴペプチド）の哺乳動物への送達に有用である種々のタイプの脂質、リン脂質おおび／または界面活性剤から構成される小型の媒体である。リポソームの成分は、通常、生体膜の脂質整列と同様に二層形成で配置される。
「小型」分子または「小型」有機分子は、本明細書において約５００ダルトン以下の分子量有すると定義される。
本明細書に開示されたポリペプチド、抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子またはそれらのアゴニストまたはアンタゴニストの「有効量」は、具体的に記述された目的を実施するのに十分な量である。「有効量」は、記述された目的に関して経験的かつルーチン的な様式で判定できる。
用語の「治療的有効量」とは、対象または哺乳動物における疾患または障害を「治療する」のに有効な抗体、ポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子または他の薬物の量を称す。癌の場合、薬物の治療的有効量は、癌細胞数を減少でき；周辺臓器への癌細胞の侵入を阻止でき（すなわち、ある程度緩徐にし、好ましくは停止させる）；腫瘍転移を阻止でき（すなわち、ある程度緩徐にし、好ましくは停止させる）；腫瘍増殖をある程度阻止でき；および／または癌に関連する１つまたは複数の症状を、ある程度軽減できる。本明細書に定義の「治療」を参照されたい。薬物が、増殖を予防し、および／または存在する癌細胞を死滅させ得る程度に、それは細胞増殖抑制性および／または細胞毒性であり得る。
抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子の「増殖抑制量」は、細胞、特に腫瘍、例えば、インビトロまたはインビボでの癌細胞の増殖を阻止できる量である。新生細胞を阻止する目的のために抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子の「増殖抑制量」は、経験的かつルーチン的な様式で判定できる。
抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子の「細胞毒性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば、インビトロまたはインビボでの癌細胞の破壊を引き起こすことができる量である。新生細胞増殖を阻止する目的のために抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子の「細胞毒性量」は、経験的かつルーチン的な様式で判定できる。
用語の「抗体」は、最も広い意味で用いられ、所望の生物活性または免疫学的な活性を示す限り、例えば、単一の抗ＴＡＴモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体）、ポリエピトープ特異性を有する抗ＴＡＴ抗体組成物、ポリクローナル抗体、単鎖抗ＴＡＴ抗体、および抗ＴＡＴ抗体の断片（下記を参照）を具体的に包含している。用語の「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書に記載の抗体と交換可能に使用される。
「単離抗体」は、その天然環境の成分から同定、分離および／または回収されたものである。その天然環境の不純物成分としては、該抗体に係わる診断または治療使用を妨害し得る物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を挙げることができる。好ましい実施形態において、該抗体は、（１）ローリー法により測定された抗体が９５重量％超に、最も好ましくは、９９重量％超に、（２）スピニングカップシークエネーターの使用により少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に、または（３）クーマシーブルーまたは、好ましくは、銀染色を用いる還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性に、精製される。抗体の天然環境の少なくとも１種の成分が存在しないことから、単離抗体は、インサイチュ組換え細胞内に抗体を含む。しかしながら通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
塩基性４−鎖抗体単位は、２本の同一軽（Ｌ）鎖および２本の同一重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロテトラマー糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドと共に５つの塩基性ヘテロテトラマーからなり、したがって１０の抗原結合部位を含有するが、一方、分泌ＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖と共に２〜５つの塩基性４−鎖単位を含む多価集合を形成するために重合化できる）。ＩｇＧ類の場合、４−鎖単位は、一般に約１５０，０００ダルトンである。Ｌ鎖の各々は、１つのジスルフィド共有結合によりＨ鎖に結合され、一方、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖イソタイプに依って１つまたは複数のジスルフィド結合により互いに結合されている。Ｈ鎖およびＬ鎖の各々はまた、規則正しく間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋を有する。Ｈ鎖の各々は、Ｎ末端の可変性ドメイン（ＶＨ）、次いでアルファおよびガンマ鎖の各々に関して３つの一定ドメイン（ＣＨ）およびμおよびεイソタイプに関して４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変性ドメイン（ＶＬ）、次いでその他の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬは、ＶＨとアラインされ、ＣＬは、重鎖（ＣＨ１）の第一の定常ドメインとアラインされる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変性ドメインと重鎖可変性ドメインとの間に接合面を形成すると考えられている。ＶＨおよびＶＬのペアリングは一緒に、単一の抗原結合部位を形成する。種々のクラスの抗体の構造および性質に関しては、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ、Ａｂｂａ Ｉ．ＴｅｒｒおよびＴｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（編集者）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク、コネチカット州、１９９４年、７１頁および６章を参照されたい。
任意の脊椎動物種からのＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に異なるタイプの１つに帰属させることができる。重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に依って、免疫グロブリンを、種々のクラスまたはイソタイプに帰属させることができる。５つのクラスの免疫グロブリン：それぞれα、δ、ε、γ、およびμと指定された重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭである。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能において比較的小さな相違に基づいてサブクラスにさらに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を発現する。
用語の「可変性」とは、可変性ドメインのある一定のセグメントが、抗体間で配列が広範囲にわたって異なるという事実を言う。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、その可変性は、可変性ドメインの１１０−アミノ酸の範囲にわたって等しく分布されていない。その代わり、Ｖ領域は、各々９〜１２のアミノ酸長である超可変性」と呼ばれる極度に可変性のより短い領域によって分離されている１５〜３０のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲｓ）と呼ばれる相対的に不変性の伸長よりなる。固有の重鎖および軽鎖の可変性ドメインは各々、４つのＦＲｓを含んでなり、たいてい、３つの超可変性領域によって接続されたβ−シート配置を採用しており、それは、β−シート構造に接続し、ある場合においてはβ−シート構造の一部を形成しているループを形成する。各鎖における超可変性は、ＦＲｓにより近接して一緒に保持され、他の鎖の超可変性領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体依存細胞の細胞毒性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など、種々のエフェクター機能を示す。
本明細書に用いられる用語の「超可変性」とは、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を称す。超可変性領域は一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む（例えば、ＶＬにおいて約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）の残基周辺、およびＶＨにおいて約１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ１）および９５〜１０２（Ｈ３）の残基周辺；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州（１９９１））および／または「超可変性ループ」からのこれらの残基（例えば、ＶＬにおいて２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨにおいて２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）の残基；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７頁（１９８７））。
本明細書に用いられる用語の「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を称す。すなわち、この集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して方向づけされており、高度に特異的である。さらに、種々の決定基群（エピトープ群）に対して方向づけられている種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原に対して単一の決定基に対して方向づけられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体による汚染なしに合成できる利点がある。モディファヤー「モノクローナル」は、何らかの特定の方法による抗体の産生が必要なものとして解釈すべきではない。例えば、本発明に有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ方法論によって調製できるか、または細菌細胞、真核動物細胞または植物細胞における組換えＤＮＡ法を用いて作製できる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８頁（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７頁（１９９１）に記載された技法を用いてファージ抗体ライブラリーからも単離できる。
本明細書のモノクローナル抗体としては、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列と同一か、またはそれに相同的である「キメラ」抗体が挙げられ、一方、所望の生物活性を示す限り、鎖の残基は、別の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにこのような抗体の断片において、対応する配列と同一か、またはそれに相同的である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５頁（１９８４）を参照）。本明細書において対象のキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、旧大陸猿、類人猿など）に由来する可変性ドメイン抗原結合配列、およびヒトの定常領域配列を含む「霊長類」抗体が挙げられる。
「無処置」抗体は、抗原結合部位ならびにＣＬ、および少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２ならびにＣＨ３を含むものである。該定常ドメインは、固有の配列定常ドメイン（例えば、ヒト固有の配列定常ドメイン）またはそれらのアミノ酸配列変異体であり得る。無処置抗体は、１つまたは複数のエフェクター機能を有することが好ましい。
「抗体断片」は、無処置抗体の一部、好ましくは、無処置抗体の抗原結合または可変性領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ジア体；線形抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２頁［１９９５］を参照）；単鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多特異的抗体が挙げられる。
抗体のパパイン消化は、容易に結晶化する能力を反映する呼称である、「Ｆａｂ」断片、および残存の「Ｆｃ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変性領域ドメイン（ＶＨ）と一緒の全Ｌ鎖、および１本の重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）よりなる。Ｆａｂ断片の各々は、抗原結合に関して一価である。すなわち、それは、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片に凡そ相当し、依然として抗原を交差結合できる単一の大型Ｆ（ａｂ’）２断片が生成する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域から１つまたは複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらに２，３の残基を有することによってＦａｂ断片とは異なる。本明細書においてＦａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に関する呼称である。元来、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合もまた知られている。
Ｆｃ断片は、ジスルフィドにおり共に保持された双方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により判定され、その領域はまた、ある一定のタイプの細胞上に見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される部分でもある。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。この断片は、密な非共有結合にある１本の重鎖および１本の軽鎖の可変領域ドメインの二量体よりなる。これら２つのドメインの折重ねにより、アミノ酸残基が抗原結合に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変性ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖から各々３つのループ）が出現する。しかしながら、単一の可変性ドメイン（または抗原に特異的な３つだけのＣＤＲを含むＦｖの半分）であっても、抗原を認識し、結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低いアフィニティーで結合する。
「ｓＦｖ]または「ｓｃＦｖ」としても略記される「単鎖Ｆｖ」は、単一ポリペプチド鎖に結合されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドは、抗原結合のためにｓＦｖが所望の構造を形成できるＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことが好ましい。ｓＦｖのレビューに関しては、ＰｌｕｃｋｔｈｕｎのＴｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、２６９−３１５頁（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ１９９５年、下記の文献、を参照されたい。
用語の「ジア体」とは、Ｖドメインの鎖内ではなくて鎖間ペアリングが達成され、二価の断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片が生じるように、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に短いリンカー（約５〜１０の残基）によりｓＦＶを断片（前述の段落を参照）を構築することによって調製された小型の抗体断片を称す。二重特異性ジア体は、２つの抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ジア体は、例えば、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８頁（１９９３）に、より十分に記載されている。
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体から誘導された最小の配列を含有するキメラ抗体である。大部分のヒト化抗体は、レシピエントの超可変性領域からの残基が、所望の抗体特異性、アフィニティー、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類など、非ヒト種（ドナー抗体）の超可変性領域からの残基により置換される免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの場合、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善するために成される。一般に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全ての超可変性ループが、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、全てまたは実質的に全ての複数のＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変性ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの一定領域（Ｆｃ）の少なくとも１つの部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの部分を典型的に含む。さらなる詳細に関して、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５頁（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９頁（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６頁（１９９２）を参照されたい。
「種依存抗体」、例えば、哺乳動物の抗ヒトＩｇＥ抗体は、第二の哺乳動物種由来のその抗原の相同体に対する結合アフィニティーよりも、第一の哺乳動物種由来の抗原に対して強力な結合アフィニティーを有する抗体である。通常、種依存抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合する」が（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８Ｍ以下、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合アフィニティー（Ｋｄ）値）、ヒト抗原に対するその結合アフィニティーよりも、少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い第二の非ヒト哺乳動物種由来の抗原の相同体に対する結合アフィニティーを有する。種依存抗体は、上記に定義された任意の種々のタイプの抗体であり得るが、好ましくは、ヒト化抗体またはヒト抗体である。
「ＴＡＴ結合オリゴペプチド」は、本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチドに、好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。ＴＡＴ結合オリゴペプチド類は、公知のオリゴペプチド合成の方法論を用いて化学的に合成できるか、または調製でき、組換え技法を用いて精製できる。ＴＡＴ結合オリゴペプチド類は、通常、長さが少なくとも約５つのアミノ酸、あるいは、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００、またはそれ以上のアミノ酸であり、このようなオリゴペプチド類は、本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチドに、好ましくは特異的に結合できる。ＴＡＴ結合オリゴペプチド類は、周知の技法を用いて、過度の実験をすることなく同定できる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合できるオリゴペプチド類に関するオリゴペプチドライブラリーをスクリーニングする技法が、当業界に周知であることを注記する（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許第４，７０８，８７１号、米国特許第４，８３３，０９２号、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６８９号、米国特許第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ国際公開第８４／０３５０６号およびＰＣＴ国際公開第８４／０３５６４号；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：３９９８−４００２頁（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：１７８−１８２頁（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１３０−１４９頁（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１０２：２５９−２７４頁（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０：６１１−６１６頁（１９８８）、Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３７８頁（１９８４）；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４頁；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１頁；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３６３頁、およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２：６６８頁を参照）。
「ＴＡＴ結合有機分子」は、本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する本明細書に定義されたオリゴペプチドまたは抗体以外の有機分子である。ＴＡＴ結合有機分子は、公知の方法論（ＰＣＴ国際公開第００／００８２３号およびＰＣＴ国際公開第００／３９５８５号を参照）を用いて同定でき、化学的に合成できる。ＴＡＴ結合有機分子は、通常、サイズが約２０００ダルトン未満、あるいは、サイズが約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトンであり、本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチドに好ましくは特異的に結合できるこのような有機分子は、周知の技法を用いて、過度の実験をすることなく同定できる。この点において、ポリペプチド標的に結合できる分子に関する有機分子ライブラリーをスクリーニングする技法は、当業界に周知であることを注記する（ＰＣＴ国際公開第００／００８２３号およびＰＣＴ国際公開第００／３９５８５号を参照）。
抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子が、抗原を発現する細胞または組織を標的にする診断剤および／または治療剤として有用であり、他のタンパク質と有意に交差反応しないように、対象の抗原、例えば、腫瘍関連ポリペプチド抗原標的に「結合する」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、十分なアフィニティーにより抗原に結合するものである。このような実施形態において、抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子の「非標的」タンパク質への結合の程度は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析または放射性免疫沈降（ＲＩＡ）により測定された特定の標的タンパク質への抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子の結合の約１０％未満である。抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子の標的分子への結合に関して、用語の「特異的結合」または「特異的に結合する」または特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的である」とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有さない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を測定することによって測定できる。例えば、特異的結合は、標的、例えば、過剰の非標識標的と類似する対照分子との競合により判定できる。この場合、標識標的のプローブへの結合が、過剰の非標識標的により競合的に阻止される場合は、特異的結合が示される。本明細書に用いられる用語の「特異的結合」または「特異的に結合する」または特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的である」とは、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上の、標的に対するＫｄを有する分子により示すことができる。一実施形態において、用語の「特異的結合」とは、分子が、他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープのいずれにも実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに結合する結合を称す。
「ＴＡＴポリペプチドを発現する腫瘍細胞の増殖を阻止する」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子、または「増殖抑制」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、適切なＴＡＴポリペプチドを発現するか、または過剰発現する癌細胞の測定可能な増殖阻止をもたらすものである。ＴＡＴポリペプチドは、癌細胞の表面に発現される膜貫通ポリペプチドであり得るか、または癌細胞により産生または分泌されるポリペプチドであり得る。好ましい増殖抑制抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、適切な対照、典型的には、試験される抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子により処置されない腫瘍細胞である対照と比較して、２０％超、好ましくは約２０％から約５０％、さらにより好ましくは、５０％超（例えば、約５０％から約１００％）、ＴＡＴ発現腫瘍細胞の増殖を阻止する。一実施形態において、増殖阻止は、細胞培養中に約０．１μｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌまたは約０．５ｎＭから２００ｎＭの抗体濃度で測定でき、該増殖阻止は、腫瘍細胞の抗体への曝露１〜１０日後に測定される。腫瘍細胞のインビボ増殖阻止は、下記の実験的実施例の節で記載されるような種々の方法で判定できる。約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重での抗ＴＡＴ抗体の投与により、該抗体の最初の投与から約５日から３ヵ月以内、好ましくは約５日から３０日以内で腫瘍サイズまたは腫瘍細胞増殖の減少が生じる場合に、該抗体はインビボで増殖抑制性である。
「アポトーシスを誘導する」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、アネキシンの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞の断片化、および／または膜ベシクル（アポトーシス体と呼ばれる）の形成により測定されるプログラム細胞死を誘導するものである。該細胞は、通常、ＴＡＴポリペプチドを過剰発現するものである。該細胞は、腫瘍細胞、例えば、前立腺、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、肺、腎、大腸、膀胱の細胞であることが好ましい。アポトーシスと関連する細胞事象を評価するために種々の方法が利用できる。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転座は、アネキシン結合により測定でき；ＤＮＡ断片化は、ＤＮＡラダリングにより評価でき；ＤＮＡ断片化と共に核／クロマチン縮合は、低二倍体細胞の増加により評価できる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、アネキシン結合アッセイにおいて未処置細胞と比較して約２倍から５０倍、好ましくは約５倍から５０倍、最も好ましくは約１０倍から５０倍のアネキシン結合誘導を生じるものである。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（固有の配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因し得るこれらの生物活性を称し、抗体のイソタイプにより変化する。抗体のエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；およびＢ細胞活性化が挙げられる。
「抗体依存細胞媒介細胞毒性」または「ＡＤＣＣ」とは、ある一定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）上に結合した分泌Ｉｇが、これら細胞毒性エフェクター細胞を抗原担持標的細胞に特異的に結合させ、引き続き細胞毒により標的細胞を死滅させ得る細胞毒性の形態を称す。抗体は、細胞毒性細胞を「作動状態にさせ」、このような死滅には絶対に必要である。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する主要細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２頁（１９９１）中の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施できる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、Ｃｌｙｎｅｓら（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６頁（１９９８）に開示されるような、例えば、動物モデルにおいてインビボ評価できる。
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を言う。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、対立遺伝子変異体、あるいはこれらの受容体のスプライスされた形態など、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻止性受容体」）が挙げられ、これらは、主としてそれらの細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体のＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻止性受容体のＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて免疫受容体チロシンベースの阻止モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。（Ｍ．Ｄａeｒｏｎ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４頁（１９９７）のレビューを参照）。ＦｃＲ類は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２頁（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１頁（１９９５）にレビューされている。将来に同定されるものを含めて、他のＦｃＲ類も、本明細書の用語の「ＦｃＲ」に包含される。この用語はまた、胎児への母親ＩｇＧ類の移行の原因となる新生児受容体、ＦｃＲｎを含む（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７頁（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９頁（１９９４））。
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。好ましくは、該細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞および好中球がが挙げられ；ＰＢＭＣ細胞およびＮＫ細胞が好ましい。このエフェクター細胞は、天然源、例えば血液から単離できる。
「補体依存細胞毒性」または「ＣＤＣ」とは、補体存在下、標的細胞の細胞溶解を称す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第一の成分（Ｃ１ｑ）の、同族抗原に結合している抗体（適切なサブクラスの）への結合により開始される。補体活性を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３頁（１９９６）に記載されたＣＤＣアッセイを実施できる。
用語の「癌」および「癌性」とは、典型的に無制御細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理的病態を称するか、または言う。癌の例としては、限定はしないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病またはリンパ球悪性が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌（例えば、上皮性扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の悪性線腫および肺の扁平上皮癌などの肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸管癌を含む胃腸癌または胃癌、膵癌、グリア芽腫、子宮頚部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿管癌、肝細胞腫、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌または子宮癌、唾液腺癌、腎癌または腎性癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝性癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、脳癌、ならびに頭頸部癌、および関連転移が挙げられる。
用語の「細胞増殖障害」および「増殖障害」とは、相当程度異常な細胞増殖に関連する障害を称す。一実施形態において、細胞増殖障害は癌である。
本明細書に用いられる「腫瘍」とは、悪性であろうとまたは良性であろうと、全ての新生細胞の成長および増殖、全ての前癌性および癌性の細胞ならびに組織を称す。
「細胞の死を誘導する」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、生存細胞を生育不能にさせるものである。該細胞は、ＴＡＴポリペプチドを発現するものであり、好ましくは、同じ組織タイプの正常な細胞と比較してＴＡＴポリペプチドを過剰発現する細胞である。ＴＡＴポリペプチドは、癌細胞の表面に発現される膜貫通ポリペプチドであるか、または癌細胞により産生されるか、または分泌されるポリペプチドであり得る。好ましくは、該細胞は、癌細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎、大腸、甲状腺、膵臓または膀胱の細胞であることが好ましい。インビトロの細胞死は、抗体依存細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）により誘導された細胞死を識別するために補体および免疫エフェクター細胞の不在下で判定できる。したがって、細胞死に関するアッセイは、免疫エフェクター細胞の不在下、加熱不活化血清（すなわち、補体の不在下）を用いて実施できる。抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子が、細胞死を誘導できるかどうかを判定するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー（Ｍｏｏｒｅら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７：１−１１頁（１９９５）を参照）または７ＡＡＤの取込みにより評価される膜完全性の喪失を、未処置細胞と比較して評価できる。好ましい細胞死誘導抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子は、ＢＴ４７４細胞におけるＰＩ取込みアッセイにおいてＰＩ取込みを誘導するものである。
「ＴＡＴ発現細胞」は、細胞表面上または分泌形態で内因性または形質移入されたＴＡＴポリペプチドを発現する細胞である。「ＴＡＴ発現癌」は、細胞表面上に存在するＴＡＴポリペプチドを有するか、またはＴＡＴポリペプチドを産生し、分泌する細胞を含む癌である。抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子が、それに結合でき、癌に対して治療効果を有するように、「ＴＡＴ発現癌」は、任意にその細胞の表面に十分なレベルのＴＡＴポリペプチドを産生する。別の実施形態において、抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子が、それに結合でき、癌に対して治療効果を有するように、「ＴＡＴ発現癌」は、任意に十分なレベルのＴＡＴポリペプチドを産生し、分泌する。後者に関して、アンタゴニストは、腫瘍細胞による分泌ＴＡＴポリペプチドの産生および分泌を減少させ、阻止し、または予防するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。ＴＡＴポリペプチドを「過剰発現する」癌は、同じ組織タイプの非癌性細胞と比較して、その細胞表面に有意により高レベルを有し、または産生し、分泌するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅によるか、もしくは転写または翻訳の増加により引き起こし得る。ＴＡＴポリペプチドの過剰発現は、細胞表面に存在するか、または細胞により分泌されたＴＡＴタンパク質のレベル増加を評価することにより診断アッセイまたは予後アッセイにおいて（例えば、ＴＡＴポリペプチドをコードする単離核酸からの組換えＤＮＡ技術；ＦＡＣＳ分析などを用いて調製できる単離ＴＡＴポリペプチドに対して調製された抗ＴＡＴ抗体を用いる免疫組織化学アッセイにより）判定できる。あるいは、またはさらに、ＴＡＴポリペプチドコード核酸または細胞中のｍＲＮＡのレベルを、例えば、ＴＡＴコード核酸またはその相補体に対応する核酸ベースのプローブを用いる蛍光インサイチュハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開された国際公開第９８／４５４７９号を参照）、サザンブロット法、ノーザンブロット法、またはリアルタイムの定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法により測定できる。血清などの生体液中のシェッド抗体を、例えば、抗体ベースアッセイを用いて測定することによりＴＡＴポリペプチドの過剰発現もまた試験できる（例えば、１９９０年６月１２日に発行された米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日に公開された国際公開第９１／０５２６４号；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５，４０１，６３８号；およびＳｉａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１３２：７３−８０頁（１９９０）も参照）。上記アッセイ以外に、種々のインビボアッセイが当業実践者に利用できる。例えば、患者の体内の細胞を、検出可能な標識、例えば、放射性同位元素で任意に標識されている抗体に曝露でき、該抗体の患者の細胞への結合は、例えば、放射活性に関して外部スキャニングによるか、または先に抗体に曝露された患者から採取された生検を分析することにより評価できる。
本明細書に用いられる用語の「免疫接着」とは、異種タンパク質の結合特異性（「接着」）と、免疫グロブリンの定常ドメインのエフェクター機能とを組合わせている抗体様分子を意味する。構造的に免疫接着は、抗体の抗原認識と結合部位以外の（すなわち、「異種」である）所望の結合特異性を有するアミノ酸配列と、免疫グロブリンの定常ドメイン配列との融合を含む。免疫接着分子の接着部分は典型的に、少なくとも受容体またはリガンドの結合部位を含む連続アミノ酸配列である。免疫接着において免疫グロブリンの定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４のサブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２など）、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
本明細書に用いられる単語の「標識」とは、「標識された」抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子を生成するために、抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子に直接または間接的に結合させている検出可能な化合物または組成物を称す。標識は、それ自体が検出可能であるか（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変化を触媒できる。
本明細書に用いられる用語の「細胞毒性剤」とは、細胞の機能を阻止するか、または防止し、および／または細胞破壊を引き起こす物質を称す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤、核酸分解酵素などの酵素およびそれらの断片、抗体、細菌、真菌、植物または動物起源の小型分子毒素または酵素活性毒素などの毒素類、それらの断片および／または変異体、および下記に開示された種々の抗腫瘍剤または抗癌剤を含むことが意図されている。他の細胞毒性剤は以下に記載される。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパおおびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート類；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチルオロメラミンなどのエチレンイミン類およびメチルアメラミン類；アセトゲニン類（特にブルアタシンおよびブルアタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコーン；ラパコール；コルチシン類；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類縁体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレシン、および９−アミノカンプトテシンなど）；ブリオスタチン；コーリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシンの合成類縁体など）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポサイド；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類縁体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１など）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロルエタミン、塩酸酸化メクロルエタミン、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロス尿素類；エンジイン抗生物質（例えば、カリキアミシン、特にカリキアミシンガンマ１ＩおよびカリキアミシンオメガＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３−１８６頁（１９９４）を参照））などの抗生物質；ダイネミシンＡなどのダイネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラチノマイシン類、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンなど）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン類、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトトレキサートなどの葉酸類縁体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類縁体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類縁体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナール類；フロリン酸などの葉酸補充液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキサート；デホファミド；デメコールシン；ジアジクオン；エルホルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサマイトシン類などのメイタンシノイド類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ユージーン、オレゴン州）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’、２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特にＴ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；デカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド類、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、プリンストン、ニュージャージー州）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒフリー、パクリタキセルのアルブミン工学的ナノ粒子形成（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、シャウンバーグ、イリノイ州）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Ｒｈoｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｉｃ Ｒｏｒｅｒｅ、アンントニー、仏国）；クロランブシル；ゲンシタビン；（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類縁体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ抑制剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；任意の上記の製薬的に許容できる塩類、酸類または誘導体；ならびにシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ならびにプレドニゾロンの併用療法の略語、ＣＨＯＰ、および５−ＦＵとロイコボビンとで組合わされたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ）との治療措置に関する略語、ＦＯＬＦＯＸなど、上記の２種以上の組合わせ、が挙げられる。
また、この定義に、癌の増殖を促進できるホルモン類の効果を制御、減少、遮断、または阻止するように作用し、しばしば全身処置または全身体処置の形態である抗ホルモン剤が含まれる。それらは、ホルモン自体であり得る。例としては、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンなど）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン類；エストロゲン受容体のダウンレギュレーター類（ＥＲＤ）；卵巣を抑制または閉鎖するために機能する薬剤、例えば、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）ロイプロリドアセテートなどの黄体化（ｌｅｕｔｉｎｉｚｉｎｇ）ホルモン−放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、ゴセレリンアセテート、ブセレリンアセテートおよびトリプテレリン；フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミドなどの他の抗アンドロゲン類；および、例えば、４（５）−イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）メゲストロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エクシームスタン、ホルメスタニー、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールなど、副腎におけるエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを抑制するアロマターゼ抑制剤など、抗エストロゲン類および選択的エストロゲン受容体モジュレーターが挙げられる。さらに、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ−５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）ゾールドロン酸／ゾールドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート、またはＡＣＥＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネートなどのビスホスホネート類；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド類、特に例えば、ＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）など、接着細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を抑制するもの；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ヤクチン類、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなどのワクチン類；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１抑制剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ラパチニブジトシレート（ＧＷ５７２０１６としても知られているＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲデュアルチロシンキナーゼ小型分子抑制剤）；および任意の上記の製薬的に許容できる塩類、酸類または誘導体を含む。
本明細書に用いられる「増殖抑制剤」とは、細胞、特にインビトロまたはインビボでＴＡＴ発現癌細胞の増殖を阻止する化合物または組成物を称す。したがって、該増殖抑制剤は、Ｓ期においてＴＡＴ発現細胞のパーセンテージを有意に減少させるものであり得る。増殖抑制剤の例としては、Ｇ１静止およびＭ期静止を誘導する薬剤など、細胞分裂周期進行（Ｓ期以外の位置で）を遮断する薬剤が挙げられる。古典的なＭ期ブロッカーとしては、ビンカ類（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン類、およびドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ抑制剤が挙げられる。Ｇ１を静止させるこれらの薬剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびアラ−Ｃはまた、Ｓ期静止に溢出する。さらなる情報は、ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ編集のＴｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、１章、Ｍｕｒａｋａｍｉらによる「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ：フィラデルフィア、１９９５年）、特に１３頁、に見ることができる。タキサン類（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、双方ともイチイの木に由来する抗癌薬物である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｇｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｉｃ Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類縁体である。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の組立てを促進し、細胞中の有糸分裂の阻害をもたらす脱重合を防ぐことにより微小管を安定化させる。
「ドキソルビシン」は、アントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全化学名は、（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−α−Ｌ−リキソ−ヘキサピラニシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンである。
用語の「サイトカイン」は、細胞間伝達物質として別の細胞に作用する１つの細胞集団により放出されるタンパク質に関する一般名である。このようなサイトカイン類の例は、リンホカイン類、モノカイン類、および伝統的ポリペプチドホルモン類である。サイトカイン類の中で、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；上皮小体ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体化ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパクホルモン類；肝成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリトロポイエチン（ＥＰＯ）；造骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、および−γなどのインターフェロン類；およびマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒細胞−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒細胞−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２などのインターロイキン（ＩＬ）類；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βなどの腫瘍壊死因子；およびＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）などの他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書に用いられる用語のサイトカインは、天然源または組換え細胞培養および固有の配列サイトカイン類の生物活性等価体からのタンパク質を含む。
使用される用語の「添付文書」とは、このような治療用製品の使用に関する、適応症、使用法、投与量、投与法、禁忌および／または警告についての情報を含む治療用製品の商業包装に慣例的に含まれる取扱説明書を称す。
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 アミノ酸配列同一性％＝
（ＡＬＩＧＮ−２により決定された２つのポリペプチド配列間に等しくマッチングするアミノ酸残基数）を（ＴＡＴポリペプチドのアミノ酸残基の全数）で割る＝
５を１５で割る＝３３．３％
Figure 2008535498
 アミノ酸配列同一性％＝
（ＡＬＩＧＮ−２により決定された２つのポリペプチド配列間に等しくマッチングするアミノ酸残基数）を（ＴＡＴポリペプチドのアミノ酸残基の全数）で割る＝
５を１０で割る＝５０％
Figure 2008535498
 核酸配列同一性％＝
（ＡＬＩＧＮ−２により決定された２つの核酸配列間に等しくマッチングするヌクレオチド数）を（ＴＡＴ−ＤＮＡ核酸配列のヌクレオチドの全数）で割る＝
６を１４で割る＝４２．９％
Figure 2008535498
 核酸配列同一性％＝
（ＡＬＩＧＮ−２により決定された２つの核酸配列間に等しくマッチングするヌクレオチド数）を（ＴＡＴ−ＤＮＡ核酸配列のヌクレオチドの全数）で割る＝
４を１２で割る＝３３．３％
ＩＩ． 本発明の組成物および方法
Ａ． 抗ＴＡＴ抗体
一実施形態において、本発明は、治療剤および／または診断剤として本明細書に使用できる抗ＴＡＴ抗体を提供する。代表的な抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、およびヘテロ結合抗体が挙げられる。
１． ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連抗原およびアジュバントの複数回皮下注入（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注入により動物において増加させることが好ましい。関連抗原（特に合成ペプチド類が使用される場合）を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質に結合させることが有用であり得る。二官能性剤または誘導化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介して）、グルタールアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲおよびＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを用いて、抗原は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン抑制剤に結合できる。
動物は、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質または複合体（それぞれウサギまたはマウスに関する）と３倍容量のフロイント完全アジュバントとを組合わせ、この溶液を複数部位に皮内注入することにより、抗原、免疫原性複合体、または誘導体に対して免疫化させる。１ヵ月後、動物は、フロイント完全アジュバント中、元の量の１／５から１／１０のペプチドまたは複合体を用いて、複数部位で皮下注入により増強させる。７日から１４日後、動物は放血され、血清は、抗体力価に関してアッセイされる。動物は、力価プラトーまで増強させる。複合体はまた、タンパク質融合として組換え細胞培養において作製できる。また、明礬などの凝集化剤は、免疫応答を増強させるために好適に使用される。
２． モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製できるか、または組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）により作製できる。
ハイブリドーマ法において、マウスまたはハムスターなどの他の適切な宿主動物は、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生できるリンパ球を誘発するために上記のとおり免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化できる。免疫化後、リンパ球は単離され、次いでハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を用いて骨髄腫細胞系と融合化される（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年））。
このように調製されたハイブリドーマ細胞は接種され、好ましくは、培地が、非融合、親の骨髄腫細胞（また融合パートナーと称される）の増殖または生存を阻止する１種または複数種の物質を含有する好適な培養培地中で増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンのホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失する場合、ハイブリドーマに選択的な培養培地は典型的に、物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防ぐ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含む。
好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、非融合親の細胞に対して選択する選択培地に感受性のものである。好ましい骨髄腫細胞系は、ｔｈｅ Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国から入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＳＰ−２および誘導体、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州、米国から入手できるＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するものである。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞系もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１頁（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、１９８７年））。
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は、抗原に対して方向づけられるモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によるか、または放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイにより測定されることが好ましい。
モノクローナル抗体の結合アフィニティーは、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０頁（１９８０）に記載されたスキャチャード解析により測定できる。
所望の特異性、アフィニティー、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が一旦同定されたら、そのクローンは、希釈法を限定することによりサブクローン化され、標準法（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６年））により増殖できる。この目的のための好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、例えば、該細胞をマウスにｉ．ｐ．注入することにより動物に腹水腫瘍としてインビボ増殖できる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、アフィニティークロマトグラフィ（例えば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ−セファロースを用いて）またはイオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析など、従来の抗体精製手法により、培養培地、腹水液、または血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手法（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）を用いて配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されたら、ＤＮＡは、発現ベクターに入れることができ、次いで組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得るために、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他に抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトする。抗体をコードするＤＮＡの細菌中の組換え発現に関するレビュー文献としては、Ｓｋｅｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５：２５６−２６２頁（１９９３）およびＰｌuｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１−１８８頁（１９９２）が挙げられる。
さらなる実施形態において、モノクローナル抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４頁（１９９０）に記載された技法を用いて生成された抗体ファージライブラリーから単離できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８頁（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７頁（１９９１）は、ファージライブラリーを用いて、それぞれマウス抗体およびヒト抗体の単離を記載している。引き続く刊行物により、鎖シャフリングによる高アフィニティー（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９−７８３頁（１９９２））、ならびに極めて大型のファージライブラリーを構築する戦法として組合わせ感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６頁（１９９３））を記載している。したがって、これらの技法は、モノクローナル抗体の単離のための、伝統的モノクローナル抗体ハイブリドーマ技法に対して実行可能な代替技法である。
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、同種マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖一定ドメイン（ＣＨおよびＣＬ）配列を用いることにより（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１頁（１９８４））、または免疫グロブリンコード配列と、非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）に関するコード配列の全部または一部と融合することにより、キメラまたは融合抗体ポリペプチドを産生させるために修飾できる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の一定ドメインの代わりに使用できるか、またはそれらは、１つの抗原組合わせ部位の可変性ドメインの代わりに用いて、抗体の抗原への特異性を有する１つの抗原組合わせ部位および異なる抗原への特異性を有する別の抗原組合わせ部位を含むキメラ二価抗体を創製する。
３． ヒトおよびヒト化抗体
本発明の抗ＴＡＴ抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含むことができる。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン類、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合配列など）である。ヒト化抗体としては、ヒト免疫グロブリン類（レシピエント抗体）が挙げられ、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換される。幾つかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体もまた、レシピエント抗体にも、移入ＣＤＲにも、またはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでなり得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変性ドメインの実質的に全てを含んでなり、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの一定領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを典型的に含む［Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５頁（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２９頁（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３−５９６（１９９２）］。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当業界に周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入される１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的に「インポート」可変ドメイン由来の使用で「インポート」残基としばしば称される。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列の代わりに複数のげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列により、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者［Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５頁（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７頁（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６頁（１９８８）］に従って本質的に実施できる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、本質的に無処置ヒト可変性ドメイン未満は、非ヒト種から対応する配列により置換されている。実際、ヒト化抗体は典型的に、幾つかのＣＤＲ残基および可能性として幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類縁部位からの残基により置換されるヒト抗体である。
ヒト化抗体を作製するために使用されるヒト可変性ドメイン、軽鎖および重鎖双方の選択は、該抗体がヒトの治療使用目的である場合、抗原性およびＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）を減少させるために極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、げっ歯類抗体の可変性ドメインの配列は、公知のヒト可変性ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーンされる。げっ歯類に最も近いヒトＶドメイン配列が同定され、その中のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）がヒト化抗体に受入れられる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６頁（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１頁（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する。この同じフレームワークは、数種の異なるヒト化抗体に対して使用できる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５頁（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３頁（１９９３））。
抗体は、抗原に対する高結合アフィニティーおよび他の好適な生物学的特性の保持と共にヒト化されることがさらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて親の配列および種々の概念的ヒト化産物の解析過程により調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用でき、当業者に精通している。選択された候補免疫グロブリン配列の推定三次元立体配置構造を図示し、ディスプレイするコンピュータプログラムを利用できる。これらディスプレイの検査は、候補免疫グロブリン配列の機能において残基の同様の役割解析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の解析を可能にする。この方法で、ＦＲ残基を選択してレシピエントから組合わせることができ、標的抗原に対するアフィニティー増大など、所望の抗体特性が達成されるように配列を移入できる。一般に、超可変性領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合に影響を及ぼすことに関与している。
種々の形態のヒト化抗ＴＡＴ抗体が考慮されている。例えば、免疫化の際に、内因性免疫グロブリン産生が無く、ヒト抗体の完全レパートリーを産生できる形質転換動物（例えば、マウス）を生産することは現在可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおいて抗体の重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合欠失が、内因性抗体産生の完全阻止をもたらすことが記載されている。ヒトの生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイのこのような生殖系列変異マウスへの移入は、抗原誘発の際にヒト抗体の産生を生じる。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１頁（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８頁（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３頁（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，５９１，６６９号（全てＧｅｎＰｈａｒｍ）；米国特許第５，５４５，８０７号；および国際公開第９７／１７８５２号を参照されたい。
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５３頁［１９９０］）は、非免疫化ドナーに由来の免疫グロブリン可変性（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロで、ヒト抗体および抗体断片を産生するために使用できる。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３またはｆｄなどの糸状バクテリオファージの主要または副コートタンパク質遺伝子にインフレームでクローン化され、ファージ粒子の表面上の機能性抗体断片としてディスプレイされる。糸状粒子は、ファージゲノムの単鎖ＤＮＡコピーを含有することから、抗体の機能特性に基づく選択は、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択することになる。したがって、該ファージは、Ｂ細胞の幾つかの特性を模倣する。ファージディスプレイは、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｋｅｖｉｎ，ＳおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ３：５６４−５７１頁（１９９３）にレビューされた種々のフォーマットで実施できる。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかの供給源は、ファージディスプレイのために使用できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８頁（１９９１）は、免疫化マウスの脾臓に由来のＶ遺伝子の小無作為組合わせライブラリーから種々のアレイの抗オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーに由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築でき、種々のアレイの抗原（自己抗原を含む）に対する抗体は、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７頁（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４頁（１９９３）により記載された技法に従って本質的に単離できる。また、米国特許第５，５６５，３３２号および米国特許第５，５７３，９０５号を参照されたい。
上記に検討されたように、ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞によっても生成できる（米国特許第５，５６７，６１０号および米国特許第５，２２９，２７５号を参照）。
４． 抗体断片
ある一定の状況において、抗体全体よりも抗体断片を用いる利点がある。断片のサイズがより小さいと、クリアランスを迅速にし、固形主要へのアクセスを改善させ得る。
抗体断片の製造のために種々の技法が開発されている。伝統的に、これらの断片は、無処置の抗体のタンパク分解酵素により誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ２４：１０７−１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１頁（１９８５）を参照）。しかしながら、これらの断片は、組換え宿主細胞により現在直接製造できる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片は全て発現でき、大腸菌から分泌できるので、これら断片の大量製造を容易にさせる。抗体断片は、上記の抗体ファージライブラリーから単離できる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌から直接回収でき、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２断片を形成できる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３−１６７頁（１９９２））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離できる。回収受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期を増大したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片製造のための他の技法は、当業実務者にとって明白である。他の実施形態において、選択抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。ＦｖおよびｓＦｖは、一定領域が欠けている無処置組合わせ部位を有する唯一の種であり；したがって、それらは、インビボ使用時に非特異的結合の減少に好適である。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにエフェクタータンパク質の融合を生成するために構築できる。編集者Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、上記文献、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇを参照されたい。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されている、「線形抗体」であり得る。このような線形抗体断片は、単特異性または二重特異性であり得る。
５． 二重特異性抗体
二重特異性は、少なくとも２種の異なるエピトープに結合特異性を有する抗体である。代表的な二重特異性抗体は、本明細書に記載されたＴＡＴタンパク質の２種の異なるエピトープに結合できる。他のこのような抗体は、ＴＡＴ結合部位と別のタンパク質への結合部位とを組合わせることができる。あるいは、抗ＴＡＴアームは、細胞防御機序をＴＡＴ発現細胞に焦点を合わせて集中させる目的で、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ３）などの白血球上のトリガリング分子、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などのＩｇＧ（ＦｃγＲ）に関するＦｃ受容体に結合するアームと組み合わせることができる。二重特異性抗体はまた、ＴＡＴを発現する細胞に細胞毒性剤を集中させるために使用できる。これらの抗体は、ＴＡＴ結合アームおよび細胞毒性剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位元素ハプテン）に結合するアームを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。
国際公開第９６／１６６７３号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦＣγＲＩＩＩ抗体を記載しており、米国特許第５，８３７，２３４号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦＣγＲＩ抗体を開示している。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦＣγＲＩＩＩ抗体は、国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示している。
二重特異性抗体を作製する方法は、当業界に公知である。完全長二重特異性抗体の伝統的製造は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいており、この２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７−５３９頁（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無作為組合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の可能性のある混合物を生成し、それらのうち１種だけが、正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィステップにより実施される正しい分子の精製は、幾分厄介であり、生成物の収率は低い。同様の手法は、国際公開第９３／０８８２９号およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ、１０：３６５５−３６５９頁（１９９１）に開示されている。
種々のアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変性ドメイン（抗体−抗原組合わせ部位）は、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合される。融合は、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含むＩｇ重鎖定常ドメインとによることが好ましい。少なくとも１つの融合に存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖一定領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合、および所望ならば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡ類を、個別の発現ベクターに挿入し、好適な宿主細胞に同時にトランスフェクトする。これは、この構築に使用される３本のポリペプチド鎖の不等な比率が、所望の二重特異性抗体の最適収率を提供する実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互割合を調整して、より大きな適応性を提供する。しかしながら、等しい比率での少なくとも２本のポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合、またはこの比率が、所望の鎖の組合わせ収率に有意に影響を及ぼさない場合、２本または３本全てのポリペプチド鎖に関するコード配列を単一発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、１つのアームにおいて第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他のアームにおいてハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）から構成される。この不斉構造は、二重特異性分子の半分だけに免疫グロブリンの軽鎖が存在することにより、分離方法を容易にするので、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合わせから所望の二重特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。二重特異性抗体の生成についてのさらなる詳細に関して、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１２１：２１０頁（１９８６）を参照されたい。
米国特許第５，７３１，１６８号に記載された別のアプローチによれば、抗体分子の対間の接合面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にするために操作できる。好ましい接合面は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第一の抗体分子の接合面から１つまたは複数の小型アミノ酸側鎖は、大型側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）により置換される。大型側鎖と同一または類似のサイズの代償的「空隙」は、大型アミノ酸側鎖を、より小型のもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより第二の抗体分子の接合面上に創製される。これは、ホモ二量体などの他の望ましくないエンド産物よりもヘテロ二量体の収率を増加させる機序を提供する。
二重特異性抗体としては、交差結合または「ヘテロ複合体」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロ複合体における抗体の１つは、アビジンと結合でき、他の抗体はビオチンと結合できる。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的とし（米国特許第４，６７６，９８０号）、ＨＩＶ感染の治療（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号、および欧州特許出願公開第０３０８９号）のために提案されている。ヘテロ複合体抗体は、任意の好適な交差結合法を用いて作製できる。好適な交差結合剤は当業界に周知であり、多くの交差結合技法と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
抗体断片からの二重特異性抗体を生成する技法もまた、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製できる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：８１頁（１９８５）は、無処置抗体をタンパク質分解的に開裂してＦ（ａｂ’）２断片を生成する手法を記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで生成されたＦａｂ’断片は、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。次に、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンを用いる還元により再度Ｆａｂ’−チオールに変換され、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的免疫化用試剤として使用できる。
最近の進歩により、二重特異性抗体を形成するために化学的に結合できる、大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨ断片の直接回収を容易にしている。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５頁（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。各Ｆａｂ’断片は、大腸菌から個別に分泌され、インビトロで直接的化学結合に供されて二重特異性抗体を形成した。このように形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合でき、ならびにヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を開始させる。組換え細胞培養から直接二重特異性抗体断片を作製し、単離するための種々の方法もまた記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて製造されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｕｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３頁（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチド類は、遺伝子融合により２種の異なる抗体のＦａｂ’部分に結合された。抗体のホモ二量体は、ヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、次いで再度酸化されて抗体のヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体のホモ二量体の製造に利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒらによる、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８頁（１９９３）に記載されている「ジア体」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替機序を提供した。この断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間に対合させるには短過ぎるリンカーにより、ＶＬに結合されたＶＨを含む。したがって、１つの断片のＶＨおよびＶＬドメインは、別の断片の相補性ＶＬおよびＶＨドメインと対合させることにより、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用による二重特異性抗体断片を作製するための別の方法もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８頁（１９９４）を参照されたい。二価超の抗体が考慮されている。例えば、三重特異性抗体を調製できる。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：６０頁（１９９１）。
６． ヘテロ複合体抗体
ヘテロ複合体抗体もまた、本発明の範囲内に入る。ヘテロ複合体抗体は、２つの共有結合抗体から構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的とし（米国特許第４，６７６，９８０号）、ＨＩＶ感染の治療（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号、および欧州特許出願公開第０３０８９号）のために提案されている。該抗体は、架橋剤を含むものなど、合成タンパク質化学の公知の方法を用いてインビトロで調製し得ることが考慮されている。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いるか、またはチオエーテル結合を形成することにより構築できる。この目的のための好適な試剤の例としては、イミノチオレートならびにメチル−４−メルカプトブチルイミデートおよび、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されたものが挙げられる。
７． 多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により二価抗体よりも速くインターナライズ（および／またはカタボライズ）できる。本発明の抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に産生できる３つ超の抗原結合部位（例えば、四価抗体）を有する多価抗体（ＩｇＭクラス以外である）の可能性がある。多価抗体は、二量化ドメインおよび３つ超の抗原結合部位を含んでなり得る。好ましい二量化ドメインは、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（または、よりなる）。このシナリオにおいて、抗体は、Ｆｃ領域およびＦｃ領域に対してアミノ末端に３つ超の抗原結合部位を含む。本明細書の好ましい多価抗体は、３つから約８つであるが、好ましくは、４つの抗原結合部位を含む（または、よりなる）。多価抗体は、少なくとも１本のポリペプチド鎖（および好ましくは、２本のポリペプチド鎖）を含んでなり、該ポリペプチド鎖は、２つ超の可変性ドメインを含む。例えば、該ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含むことができ、式中、ＶＤ１は、第一の可変性ドメインであり、ＶＤ２は、第二の可変性ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１本のポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは、０または１である。例えば、ポリペプチド鎖は：ＶＨ−ＣＨ１−可動性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含むことができる。本明細書の多価抗体は、少なくとも２本（および好ましくは４本）の軽鎖可変性ドメインポリペプチドをさらに含むことが好ましい。例えば、本明細書の多価抗体は、約２本から約８本の軽鎖可変性ドメインポリペプチドを含む。本明細書に考慮された軽鎖可変性ドメインポリペプチドは、軽鎖可変性ドメインを含んでなり、任意に、ＣＬドメインをさらに含む。
８． エフェクター機能工学
例えば、抗原依存細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または抗体の補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）を増強するように、エフェクター機能に対して本発明の抗体を修飾することが望ましいと言える。これは、抗体のＦｃ領域に１つまたは複数のアミノ酸置換基を導入することによって達成される。あるいはまたはさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し得ることによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。このように生成されたホモ二量化抗体は、内部移行能力を改善し、および／または補体媒介細胞死滅および抗体依存細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増加することができた。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２頁（１９９２）を参照されたい。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量化抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：２５６０−２５６５頁（１９９３）に記載されたヘテロ二官能性交差リンカーを用いて調製できる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ３：２１９−２３０頁（１９８９）を参照されたい。抗体の血清中半減期を増加させるために、回収受容体結合エピトープを、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載された抗体（特に抗体断片）に取り込むことができる。本明細書に用いられる用語の「回収受容体結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子のインビボ血清中半減期を増加させる原因となるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを称す。
９． 免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、増殖抑制剤、毒素類（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源、もしくはそれらの断片の酵素活性毒素類）、または放射性同位元素（すなわち、放射性複合体）などの細胞毒性剤に結合された抗体を含む免疫複合体に関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤は、上部に記載されている。使用できる酵素活性毒素類およびそれらの断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス−フォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ−アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ−チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）抑制剤、クルシン、クロチン、サパオナリア−オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）抑制剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類が挙げられる。種々の放射性核種は、放射性複合化抗体の製造のために利用できる。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。抗体と細胞毒性剤との複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル類（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート類（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの種々の二官能性タンパク質−カップリング剤を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：１０９８頁（１９８７）に記載されているように調製できる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種の抗体への複合化用の代表的なキレート化剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。
抗体と、カリキアミシン、メイタンシノイド類、トリコテン、ならびにＣＣ１０６５、および毒素活性を有するこれら毒素の誘導体など、１つまたは複数の小型分子毒素との複合体もまた、本明細書に考慮されている。
メイタンシンおよびメイタンシノイド類
好ましい一実施形態において、本発明の抗ＴＡＴ抗体（完全長または断片）は、１つまたは複数のメイタンシノイド分子に結合される。
メイタンシノイド類は、チューブリン重合化を阻止することにより作用する有糸分裂抑制剤である。メイタンシンは、東アフリカ潅木のメイテヌス−セラータ （Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａ）から最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、ある一定の微生物もまた、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステル類（米国特許第４，１５１，０４２号）などのメイタンシノイド類を産生することが発見された。合成メイタンシノールおよびそれの誘導体ならびに類縁体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；米国特許第４，２４８，８７０号；米国特許第４，２５６，７４６号；米国特許第４，２６０，６０８号；米国特許第４，２６５，８１４号；米国特許第４，２９４，７５７号；米国特許第４，３０７，０１６号；米国特許第４，３０８，２６８号；米国特許第４，３０８，２６９号；米国特許第４，３０９，４２８号；米国特許第４，３１３，９４６号；米国特許第４，３１５，９２９号；米国特許第４，３１７，８２１号；米国特許第４，３２２，３４８号；米国特許第４，３３１，５９８号；米国特許第４，３６１，６５０号；米国特許第４，３６４，８６６号；米国特許第４，４２４，２１９号；米国特許第４，４５０，２５４号；米国特許第４，３６２，６６３号；米国特許第４，３７１，５３３号に開示されており、それらの開示は、参照として本明細書に明白に組み込まれている。
メイタンシノイド−抗体複合体
治療指数を改善する試みにおいて、メイタンシンおよびメイタンシノイド類は、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体に結合されている。メイタンシノイド類を含有する免疫複合体およびそれらの治療使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第５，４１６，０６４号、および欧州特許第０ ４２５ ２３５号に開示されており、それらの開示は、参照として本明細書に明白に組み込まれている。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３頁（１９９６）は、ヒトの結腸直腸癌に対して向けられたモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合されたＤＭ１と称されるメイタンシノイドを含む免疫複合体を記載した。該複合体は、培養大腸癌細胞に対して高度細胞毒性であることが見出され、インビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１頁（１９９２）は、メイタンシノイドが、ヒト大腸癌細胞系上の抗原に対して結合するマウス抗体Ａ７に、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ発癌遺伝子に結合する別のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に、ジスルフィドリンカーを介して結合した免疫複合体を記載している。ＴＡ．１−メイタンシノイド複合体の細胞毒性は、１細胞当り３×１０５ＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３に対しインビトロで試験した。該薬物複合体は、抗体１分子当りメイタンシノイド分子数を増加させることにより増加し得る遊離のメイタンシノイド薬物と同様程度の細胞毒性を達成した。ＴＡ．１−メイタンシノイド複合体は、マウスにおいて全身細胞毒性が低いことを示した。
抗ＴＡＴポリペプチド抗体−メイタンシノイド複合体（免疫複合体）
抗ＴＡＴ抗体−メイタンシノイド複合体は、抗体またはメイタンシノイド分子の生物活性を有意に減ずることなく、抗ＴＡＴ抗体をメイタンシノイド分子に化学結合させることにより調製される。１抗体分子当り結合される平均３〜４つのメイタンシノイド分子は、抗体の機能または溶解性に負の影響を及ぼすことなく、標的細胞の細胞毒性を増強させる効力を示したが、毒素／抗体の１分子でも、裸の抗体の使用よりも細胞毒性を増強することが予想される。メイタンシノイド類は当業界に周知であり、既知の技法により合成できるか、または天然供給源から単離できる。好適なメイタンシノイド類は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、上記に参照される他の特許および非特許刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイド類は、メイタンシノールおよび芳香族環または種々のメイタンシノールエステル類など、メイタンシノール分子の他の位置で修飾されたメイタンシノール類縁体である。
例えば、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許第０ ４２５ ２３５号、およびＣｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１頁（１９９２）に開示されたものなど、抗体−メイタンシノイド複合体を作製するために、当業界に公知の多くの結合基がある。該結合基としては、上記に確認された特許に開示されたジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基、またはエステラーゼ不安定基が挙げられ、ジスルフィド基およびチオエーテル基が好ましい。
抗体とメイタンシノイドとの複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル類（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート類（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製できる。特に好ましいカップリング剤としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７頁［１９７８］）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられ、ジスルフィド結合を提供する。
該リンカーは、結合のタイプに依って種々の位置でメイタンシノイド分子に結合できる。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技法を用いてヒドロキシル基との反応により形成できる。この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシ基で修飾されたＣ−１５位、およびヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じ得る。好ましい実施形態において、該結合は、メイタンシノールまたはメイタンシノール類縁体のＣ−３位で形成される。
カリキアミシン
別の対象の免疫複合体は、１つまたは複数のカリキアミシン分子に結合された抗ＴＡＴ抗体を含む。抗生物質のカリキアミシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で２本鎖ＤＮＡの切断を生じることができる。カリキアミシンファミリーの複合体調製に関して、米国特許第５，７１２，３７４号、米国特許第５，７１４，５８６号、米国特許第５，７３９，１１６号、米国特許第５，７６７，２８５号、米国特許第５，７７０，７０１号、米国特許第５，７７０，７１０号、米国特許第５，７７３，００１号、米国特許第５，８７７，２９６号（全てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ社）を参照されたい。使用できるカリキアミシンの構造的類縁体としては、限定はしないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ−アセチルγ１ Ｉ、ＰＳＡＧおよびθI 1（Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：３３３６−３３４２頁（１９９３）、Ｌｏｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５８：２９２５−２９２８頁（１９９８）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ社の前述の米国特許）が挙げられる。抗体が結合できる別の抗腫瘍薬物は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリキアミシンおよびＱＦＡ双方は、細胞内作用部位を有し、細胞膜を容易に交差しない。したがって、抗体媒介内部移行を介するこれら薬剤の細胞取込みにより、それらの細胞毒性効果を大いに増強する。
他の細胞毒性剤
本発明の抗ＴＡＴ抗体に結合できる他の抗腫瘍剤としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、米国特許第５，７７０，７１０号に記載された、ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として集合的に知られた薬剤のファミリー、ならびにエスペラミシン類（米国特許第５，８７７，２９６号）が挙げられる。
使用できる酵素活性毒素およびそれらの断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス−フォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ−アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ−チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）抑制剤、クルシン、クロチン、サパオナリア−オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）抑制剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン類が挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照されたい。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼなどのリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間で形成された免疫複合体を考慮している。
腫瘍の選択的破壊に関して、抗体は、高度放射性原子を含むことができる。種々の放射性同位元素は、放射性複合化抗ＴＡＴ抗体の製造に利用できる。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位元素が挙げられる。該複合体が、診断に用いられる場合、それは、シンチグラフィー試験用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または再度ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像（核磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られている）用のスピン標識を含む。
放射性標識または他の標識は、公知の方法で複合体に取り込むことができる。例えば、ペプチドは生合成できるか、または、例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を用いて化学的アミノ酸合成により合成できる。ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、およびＩｎ１１１のような標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合できる。イットリウム−９０は、リシン残基を介して結合できる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７頁）は、ヨウ素−１２３に使用できる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｏｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９年）は、詳細に他の方法を記載している。
抗体と細胞毒性剤の複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル類（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート類（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：１０９８頁（１９８７）に記載されているように調製できる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種の抗体への複合化用の代表的なキレート化剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。該リンカーは、細胞内の細胞毒性剤の放出を促進する「開裂可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ５２：１２７−１３１頁（１９９２；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用できる。
あるいは、抗ＴＡＴ抗体および細胞毒性剤を含む融合タンパク質は、例えば、組換え技法またはペプチド合成により作製できる。ＤＮＡの長さは、互いに隣接するか、または複合体の所望の性質を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分離された複合体の２つの部分をコードするそれぞれの領域を含むことができる。
さらに別の実施形態において、抗体は、標的化前の腫瘍における利用のために「受容体」（ストレプトアビジンのような）に結合でき、抗体−受容体の複合体を患者に投与し、次いでクリアリング剤を用いて循環流動から未結合複合体を除去し、次いで細胞毒性剤（例えば放射性核種）に結合する「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
１０． 免疫リポソーム
本明細書に開示された抗ＴＡＴ抗体は、免疫リポソームとしても製剤化できる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物送達に有用である種々のタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小胞である。リポソームの成分は、通常、生体膜の脂質配列と同様の二層形成で配列される。抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：３６８８頁（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４０３０頁（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および米国特許第４，５４４，５４５号；および１９９７年１０月２３日に公開された国際公開第９７／３８７３１号に記載されているように当業界に公知の方法により調製される。循環流動時間が増強されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法を用いることにより生成できる。リポソームは、規定されたポアサイズのフィルターを通して押出されて所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応によりＭａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８頁（１９８２）に記載されたようにリポソームに結合できる。化学療法剤は、リポソーム内に任意に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４頁（１９８９）を参照されたい。
Ｂ． ＴＡＴ結合オリゴペプチド類
本発明のＴＡＴ結合オリゴペプチドは、本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチドに、好ましくは特異的に結合するオリゴペプチドである。ＴＡＴ結合オリゴペプチド類は、公知のオリゴペプチド合成の方法論を用いて化学的に合成できるか、または調製でき、組換え技法を用いて精製できる。ＴＡＴ結合オリゴペプチド類は、通常、長さが少なくとも約５つのアミノ酸、あるいは、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００、またはそれ以上のアミノ酸であり、このようなオリゴヌクレオチド類は、本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチドに、好ましくは特異的に結合できる。ＴＡＴ結合オリゴペプチド類は、周知の技法を用いて、過度の実験をすることなく同定できる。この点において、ポリペプチド標的に特異的に結合できるオリゴペプチド類に関するオリゴペプチドライブラリーをスクリーニングする技法は、当業界に周知であることを注記する（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許第４，７０８，８７１号、米国特許第４，８３３，０９２号、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６８９号、米国特許第５，６６３，１４３号；ＰＣＴ国際公開第８４／０３５０６号およびＰＣＴ国際公開第ＰＣＴ８４／０３５６４号；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８１：３９９８−４００２頁（１９８４）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：１７８−１８２頁（１９８５）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、１３０−１４９頁（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１０２：２５９−２７４頁（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０：６１１−６１６頁（１９８８）、Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３７８頁（１９８４）；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４頁；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１頁；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３６３頁、およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２：６６８頁を参照）。
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、ポリペプチド標的に特異的に結合できるこれらのライブラリーのメンバーを同定するために大きなオリゴペプチドライブラリーをスクリーンすることを可能にする１つの周知の技法である。ファージディスプレイは、可変性ポリペプチド類が、融合タンパク質としてバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質にディスプレイされる技法である（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６頁）。ファージディスプレイの有用性は、選択的無作為化されたタンパク質変異体（または無作為的にクローン化されたｃＤＮＡ類）の大きなライブラリーが、高アフィニティーを有する標的分子に結合するこれらの配列に対して迅速かつ効率的に分類できる事実に見出される。ファージに対するペプチド（Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３７８頁（１９８４））またはタンパク質（Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４頁；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１頁；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８３６３頁）ライブラリーのディスプレイは、特異的結合特性を有するものに関して多数のポリペプチド類またはオリゴヌクレオチド類をスクリーニングするために使用されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２：６６８頁）。無作為変異体のファージライブラリーの分類は、多数の変異体を構築し、増殖させる方法、標的受容体を用いてアフィニティー精製のための手法、および結合の高濃度結果を評価する手段を必要とする。米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６８９号、および米国特許第５，６６３，１４３号。
大抵のファージディスプレイ方法は、糸状ファージを使用しているが、ラムダ状ファージディスプレイシステム（国際公開第９５／３４６８３号；米国特許第５，６２７，０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（Ｒｅｎら、Ｇｅｎｅ、２１５：４３９頁（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５８（１５）：３２０９−３２１４頁（１９９８）；Ｊｉａｎｇら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６５（１１）：４７７０−４７７７（１９９７）；Ｒｅｎら、Ｇｅｎｅ、１９５（２）：３０２−３１１頁（１９９７）；Ｒｅｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．５：１８３３頁（１９９６）；Ｅｆｉｍｏｖら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ、１０：１７３頁（１９９５））およびＴ７ファージディスプレイシステム（ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２１７：２２８−２５７頁（１９９３）；米国特許第５，７６６，９０５号）もまた知られている。
基本的なファージディスプレイ構想の多くの他の改善および変更が、現在開発されている。これらの改善により、選択された標的分子に結合するためのペプチドライブラリーをスクリーンし、所望の性質に関してこれらのタンパク質をスクリーニングする可能性を有する機能性タンパク質をディスプレーするために、ディスプレイシステムの能力が増強される。ファージディスプレイ反応のために組合わせ反応デバイスが開発され（国際公開第９８／１４２７７号）、ファージディスプレイライブラリーは、二分子相互作用（国際公開第９８／２０１６９号；国際公開第９８／２０１５９号）および固定されたらせん状ペプチドの性質（国際公開第９８／２００３６号）を分析し、制御するために使用されている。国際公開第９７／３５１９６号は、ファージディスプレイライブラリーが一溶液と接触させるアフィニティーリガンドを単離する方法を記載しており、該リガンドは、標的分子および第二の溶液に結合し、結合リガンドを選択的に単離するために、該アフィニティーリガンドは標的分子に結合しない。国際公開第９７／４６２５１号は、無作為ファージディスプレイライブラリーとアフィニティー精製抗体とをバイオパニングする方法、次に結合ファージを単離し、次いで高アフィニティー結合ファージを単離するためにマイクロプレートウェルを用いてマイクロパニングするプロセスを記載している。アフィニティータグとして黄色ブドウ球菌タンパク質Ａの使用もまた報告されている（Ｌｉら（１９９８）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、９：１８７頁）。国際公開第９７／４７３１４号は、ファージディスプレイライブラリーであり得る組合わせライブラリーを用いて酵素特異性を区別するために基質減算ライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイを用いる界面活性剤の使用に好適な酵素を選択する方法は、国際公開第９７／０９４４６号に記載されている。特異的結合タンパク質を選択するさらなる方法は、米国特許第５，４９８，５３８号、米国特許第５，４３２，０１８号および国際公開第９８／１５８３３号に記載されている。
ペプチドライブラリーを生成し、これらのライブラリーをスクリーニングする方法もまた、米国特許第５，７２３，２８６号、米国特許第５，４３２，０１８号、米国特許第５，５８０，７１７号、米国特許第５，４２７，９０８号、米国特許第５，４９８，５３０号、米国特許第５，７７０，４３４号、米国特許第５，７３４，０１８号、米国特許第５，６９８，４２６号、米国特許第５，７６３，１９２号、および米国特許第５，７２３，３２３号に開示されている。
Ｃ． ＴＡＴ結合有機分子
ＴＡＴ結合有機分子は、本明細書に記載されているＴＡＴポリペプチドに、好ましくは特異的に結合する本明細書に定義されたオリゴペプチドまたは抗体以外の有機分子である。ＴＡＴ結合有機分子を同定でき、公知の方法論（例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第００／００８２３号および国際公開第００／３９５８５号）を用いて化学的に合成できる。ＴＡＴ結合有機分子は、通常、サイズが約２０００ダルトン未満、あるいは、サイズが約１５００未満、７５０、５００、２５０または２００ダルトンであり、本明細書に記載されているＴＡＴポリペプチドに、好ましくは特異的に結合できるこのような有機分子は、周知の技法を用いて過度の実験をすることなく同定できる。この点において、ポリペプチド標的に結合できる分子に関する有機分子ライブラリーをスクリーニングする技法は、当業界に周知である（例えば、ＰＣＴ公開の国際公開第００／００８２３号および国際公開第００／３９５８５号を参照）ことを注記する。ＴＡＴ結合有機分子は、例えば、アルデヒド類、ケトン類、オキシム類、ヒドラゾン類、セミカルバゾン類、カルバジド類、第一級アミン類、第二級アミン類、第三級アミン類、Ｎ−置換ヒドラジン類、ヒドラジド類、アルコール類、エーテル類、チオール類、チオエーテル類、二硫化物、カルボン酸類、エステル類、アミド類、尿素類、カルバメート類、カーボネート類、ケタール類、チオケタール類、アセタール類、チオアセタール類、ハロゲン化アリール類、スルホン化アリール類、ハロゲン化アルキル類、スルホン化アルキル類、芳香族化合物、ヘテロ環式化合物、アニリン類、アルケン類、アルキン類、ジオール類、アミノアルコール類、オキサゾリジン類、オキサゾリン類、チアゾリジン類、チアゾリン類、エナミン類、スルホンアミド類、エポキシド類、アジリジン類、イソシアネート類、塩化スルホニル類、ジアゾ化合物、酸クロリド類などであり得る。
Ｄ． 所望の性質を有する抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド類およびＴＡＴ結合有機分子のスクリーニング
ＴＡＴポリペプチド類に結合する抗体、オリゴペプチド類および有機分子を生成する技法は、上部に記載されている。さらに、所望のある一定の生物学的特徴を有する抗体、オリゴペプチド類および有機分子を選択できる。
本発明の抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドおよび有機分子の増殖抑制効果は、例えば、内因的またはＴＡＴ遺伝子のトランスフェクションに続いてＴＡＴポリペプチドを発現する細胞を用いる、当業界に公知の方法により評価できる。例えば、適切な腫瘍細胞系およびＴＡＴ−トランスフェクション細胞は、数日間（例えば、２日〜７日）種々の濃度で本発明の抗ＴＡＴモノクローナル抗体、オリゴペプチドおよび他の有機分子で処置でき、クリスタルバイオレットもしくはＭＴＴにより染色でき、または幾つかの他の比色アッセイにより分析できる。増殖を測定する別の方法は、本発明の抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドおよびＴＡＴ結合有機分子の存在下または不在下で処置された細胞による３Ｈ−チミジン取込みを比較することによると考えられる。処置後、細胞を採取し、ＤＮＡに取り込まれた放射活性量をシンチレーションカウンターで定量化される。適切な陽性対照としては、その細胞系の増殖を阻止することが知られている、増殖抑制抗体による選択された細胞系の処置が挙げられる。インビボ腫瘍細胞の増殖抑制は、当業界に公知の種々の方法で測定できる。好ましくは、腫瘍細胞は、ＴＡＴポリペプチドを過剰発現するものである。一実施形態において、０．５μｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌまでの抗体濃度で、抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドおよびＴＡＴ結合有機分子は、未処置腫瘍細胞と比較して、好ましくは、約２５〜１００％、より好ましくは、約３０〜１００％、さらにより好ましくは、約６０〜１００％または７０〜１００％でインビトロまたはインビボのＴＡＴ発現腫瘍細胞増殖を阻止する。増殖抑制は、細胞培養時に約０．５μｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌまたは約０．５ｎＭから２００ｎＭの抗体濃度で測定でき、増殖抑制は、抗体に対する腫瘍細胞の曝露１〜１０日後に測定される。約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重での抗ＴＡＴ抗体の投与が、抗体の最初の投与から約５日から３ヵ月以内、好ましくは、約５日から３０日以内で腫瘍サイズの減少または腫瘍細胞増殖の減少をもたらす場合、該抗体はインビボで増殖抑制する。
細胞死を誘導する抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドおよびＴＡＴ結合有機分子を選択するために、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７ＡＡＤの取込みにより示された膜完全性の喪失が、対照と比較して評価できる。ＰＩ取込みアッセイは、補体および免疫エフェクター細胞の不在下で実施できる。ＴＡＴポリペプチド発現腫瘍細胞は、培地単独または適切な抗ＴＡＴ抗体（例えば、約１０μｇ／ｍｌ）、ＴＡＴ結合オリゴペプチドおよびＴＡＴ結合有機分子を含有する培地を用いてインキュベートする。この細胞を３日間インキュベートする。各々の処置後、細胞を洗浄し、細胞凝集塊の除去のため３５ｍｍのスレーナ−キャップ１２×７５チューブ（１本のチューブ当り１ｍｌ、１処置群当り３本のチューブ）に一定分割する。次にチューブは、ＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を受ける。サンプルは、ＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）フローサイトメーターおよびＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（登録商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析できる。ＰＩ取込みにより測定された細胞死の統計的に有意なレベルを誘導するこれらの抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子は、細胞死誘導抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドまたはＴＡＴ結合有機分子として選択できる。
対象の抗体により結合されたＴＡＴポリペプチドに対するエピトープに結合する抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子をスクリーンするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、編集者Ｋａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているようなルーチン的交差遮断アッセイを実施できる。このアッセイは、試験抗体、オリゴペプチドまたは他の有機分子が、公知の抗ＴＡＴ抗体と同一の部位またはエピトープに結合するかどうかを判定するために使用できる。あるいは、またはさらに、エピトープマッピングは、当業界に公知の方法により実施できる。例えば、抗体配列は、接触残基を同定するためにアラニンスキャニングによるなどで変異誘発できる。変異抗体は、適切な折りたたみを確保するためにポリクローナル抗体と結合させるために最初に試験する。異なる方法において、ＴＡＴポリペプチドの種々の領域に対応するペプチド類は、複数の試験抗体または試験抗体および特性化または公知のエピトープを有する抗体との競合アッセイに使用できる。
Ｅ． 抗体依存酵素媒介プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）
本発明の抗体はまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、国際公開第８１／０１１４５号）を活性抗癌薬物に変換させるプロドラッグ活性酵素に対して、抗体を結合させることによるＡＤＥＰＴにおいて使用できる。例えば、国際公開第８８／０７３７８号および米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫複合体の酵素成分としては、そのより活性な細胞毒性形態に変換させるような方法で、プロドラッグに作用できる任意の酵素を含む。
本発明の方法に有用である酵素としては、限定はしないが、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファーゼ；抗癌薬物、非毒性５−フルオロシトシンを５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用であるセラチアプロテアーゼ、テルモリシン、ズブチリシン、カルボキシペプチダーゼ類およびカテプシン類（カテプシンＢおよびＬなど）などのプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ類；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なβ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなどの炭水化物開裂酵素；β−ラクタム類により誘導化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；およびアミン窒素がフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基により誘導化された薬物を遊離薬物に変換するために有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼ類、が挙げられる。あるいは、また「アブザイム類」として知られている酵素活性を有する抗体は、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換するために使用できる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ３２８：４５７−４５８頁（１９８７）を参照）。抗体−アブザイム複合体は、アブザイムの腫瘍細胞集団への送達のため、本明細書に記載されているように調製できる。
本発明の酵素は、上記に検討されたヘテロ二官能性交差試剤に使用など、当業界に周知の技法により抗ＴＡＴ抗体に共有結合できる。あるいは、本発明の酵素の少なくとも１つの官能的に活性な部分に結合された本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当業界に周知の組換えＤＮＡ技法を構築できる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４−６０８頁（１９８４）を参照）。
Ｆ． 完全長ＴＡＴポリペプチド類
本発明はまた、本出願においてＴＡＴポリペプチド類と称されるポリペプチド類をコードする新たに同定され、単離されたヌクレオチド配列を提供する。特に、種々のＴＡＴポリペプチド類をコードするｃＤＮＡ類（部分長および完全長）は、下記の実施例においてさらに詳細に開示されているように同定され、単離されている。
下記の実施例に開示されているように、種々のｃＤＮＡクローンは、ＡＴＣＣにより寄託されている。これらのクローンの実際のヌクレオチド配列は、当業界においてルーチン的な方法を用いて、熟練技術者による寄託されたクローンの配列決定によって容易に決定できる。予測されたアミノ酸配列は、ルーチン的な技術を用いてヌクレオチド配列から決定できる。幾つかの場合において、本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチド類およびコード核酸に関して、出願者は、この時点で利用できる配列情報により同定できる最良のリーディングフレームであると思われるものを同定した。
Ｇ． 抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド変異体
本明細書に記載された抗ＴＡＴ抗体および完全長の固有配列のＴＡＴポリペプチド類に加えて、抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド変異体を調製できることが考慮されている。抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド変異体は、コードＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することにより、および／または所望の抗体またはポリペプチドの合成により調製できる。アミノ酸の変化が、グリコシル化部位数または位置を変えるか、または膜固定特性を変えるような、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの翻訳後プロセスを変えることができることを、当業者は認識するであろう。
本明細書に記載された抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド類における変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている、例えば、任意の技法および保存的および非保存的変異に関するガイドラインを用いて作製できる。変異は、固有の配列抗体またはポリペプチドと比較して、アミノ酸配列における変化を生じる抗体またはポリペプチドをコードする１つまたは複数のコドンの置換、削除または挿入であり得る。任意に変異は、抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの１つまたは複数のドメインにおいて、少なくとも１つのアミノ酸の任意の他のアミノ酸による置換によるものである。アミノ酸残基が、所望の活性に有害な影響を与えることなく挿入、置換または削除できる決定におけるガイダンスは、抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドと、相同的な既知のタンパク質分子とを比較すること、および高い相同性の領域に作製されたアミノ酸配列の変化数を最少化することに見ることができる。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、セリンによるロイシンの置換、すなわち保存的アミノ酸置換など、同様の構造的および／または化学的性質を有する別のアミノ酸により置換する結果であり得る。挿入または削除は、任意に約１つから５つのアミノ酸の範囲であり得る。許容される変異は、配列中のアミノ酸を系統的に挿入、削除または置換させることにより、および生じた変異体を、完全長または成熟した固有配列により示された活性に関して試験することにより判定できる。
抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド断片は、本明細書に提供されている。このような断片は、Ｎ末端またはＣ末端で切断できるか、または、例えば、完全長固有の抗体またはタンパク質と比較した場合、内部残基を欠如することができる。ある一定の断片は、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの所望の生物活性に必須ではないアミノ酸残基を欠如している。
抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド断片は、多くの従来法のいずれによっても調製できる。所望のペプチド断片は、化学的に合成できる。代替アプローチとしては、例えば、特定のアミノ酸残基により規定された部位でタンパク質を開裂することが知られている酵素によるタンパク質の処理による酵素的消化、または好適な制限酵素を用いるＤＮＡの消化、ならびに所望の断片の単離により抗体またはポリペプチド断片を生成することを含む。さらに別の好適な技法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望の抗体またはポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し、増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’および３’プライマーとして使用される。抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチド断片は、本明細書に開示された固有の抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドによる少なくとも１つの生物活性および／または免疫学的活性を共有していることが好ましい。
特定の実施形態において、対象の保存的置換は、好ましい置換基の略字により表６に示されている。このような置換基が、生物活性の変化をもたらす場合、表６の代表的な置換基と称されるか、またはアミノ酸クラスに関してさらに下記のより実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされる。
Figure 2008535498
 抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの官能基の実質的修飾または免疫学的同一性は、（ａ）例えば、シートまたはらせん状立体配座として置換領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さ、の維持に対するそれらの効果が有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然の残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下のグループに分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ；Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換基は、別のクラスに関するこれらクラスの１つのメンバーを交換することを必要とする。このように置換された残基はまた、保存的置換部位または、より好ましくは、残存（非保存）部位に導入できる。
変異体は、オリゴヌクレオチド媒介（部位方向）変異誘発、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ変異誘発など、当業界に公知の方法を用いて作製できる。部位方向変異誘発［Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３：４３３１頁（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０：６４８７頁（１９８７）］、カセット変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、３４：３１５頁（１９８５）］、制限選択変異誘発［Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ、３１７：４１５頁（１９８６）］または他の公知の技法は、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド変異体ＤＮＡを生成するためにクローン化されたＤＮＡ上で実施できる。
スキャニングアミノ酸分析はまた、連続配列に沿って１つまたは複数のアミノ酸を同定するために使用できる。スキャニングアミノ酸の中で、比較的小型の中性アミノ酸が好ましい。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンは、ベータ−炭素を以上の側鎖を開裂し、変異体の主鎖の立体配座を変えにくいことから、この基のなかで典型的に好ましいスキャニングアミノ酸である［ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５頁（１９８９）］。アラニンは、最も共通するアミノ酸であることからも典型的に好ましい。さらに、アラニンは、埋め込み位置および曝露位置の双方に見られることが多い［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、ニューヨーク州）；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：１頁（１９７６）］。アラニン置換が、適切な量の変異体を生成しない場合、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を使用できる。
抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、一般にセリンにより置換されて分子の酸化的安定性を改善し、異常な交差結合を防止できる。逆に、システイン結合を、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに付加するとその安定性を改善できる（特に該抗体が、Ｆｖ断片などの抗体断片である場合）。
特に好ましいタイプの置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変性領域の残基を置換することを含む。一般に、さらに開発のために選択されて生じた変異体は、変異体が生成される親抗体に比べて生物学的性質を改善するであろう。このような置換変異体の生成に好適な方法は、ファージディスプレイを用いてアフィニティー成熟を含む。手短に言えば、幾つかの超可変性領域の部位（例えば、６〜７つの部位）は、各部位で全て可能なアミノ置換を生成するために変異される。このように生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に対する融合として糸状ファージ粒子から一価様式でディスプレイされる。次にファージディスプレイされた変異体は、本明細書に開示された生物活性（例えば、結合アフィニティー）についてスクリーンされる。修飾に関して候補超可変性領域の部位を確認するために、アラニンスキャニング変異誘発は、抗原結合に有意に寄与する超可変性領域の残基を同定するために実施できる。あるいは、またはさらに、抗体とヒトＴＡＴポリペプチドとの間の接触点を確認するために抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することは有利となり得る。このような接触残基と隣接残基とは、本明細書において合成された技法に従って置換のための候補物である。このような変異体が生成されると、変異体パネルは、本明細書に記載されたスクリーニングに供され、１つまたは複数の関連アッセイにおいて優れた性質を有する抗体は、さらなる開発のために選択できる。
抗ＴＡＴ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当業界に公知の種々の方法により調製される。これらの方法としては、限定はしないが、天然源（天然アミノ酸配列変異体の場合）からの単離、またはオリゴヌクレオチド媒介（または部位方向）変異誘発による調製、ＰＣＲ変異誘発、および抗ＴＡＴ抗体の早期に調製された変異体または非変異体版のカセット変異誘発が挙げられる。
Ｈ． 抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの修飾
抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれる。一タイプの共有結合修飾は、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基と、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの選択された側鎖またはＮ−またはＣ−末端残基と反応できる有機誘導化剤とを反応させることを含む。二官能性剤との誘導化は、例えば、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを、抗ＴＡＴ抗体およびその逆を生成するのに使用のために、水不溶性支持体マトリックスまたは表面に交差結合させるのに有用である。通常使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル類、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステル類を含むホモ二官能性イミドエステル類、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミド類およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの試剤が挙げられる。
他の修飾としては、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．サンフランシスコ、７９−８６頁（１９８３）］、Ｎ−末端アミンアセチル化、およびＣ−末端カルボキシル基のアミド化、が挙げられる。
本発明の範囲内に含まれる抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの別のタイプの共役結合修飾は、抗体またはポリペプチドの固有のグリコシル化パターンを変えることを含む。「固有のグリコシル化パターンを変えること」とは、本明細書の目的のために、固有の配列の抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに見られる１つまたは複数の炭水化物を削除すること（基礎をなすグリコシル化部位を除去することによるか、または化学的および／または酵素的手段によりグリコシル化を削除することによる）、および／または固有の配列の抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位を付加することを意味することが意図されている。さらに、この語句は、存在する種々の炭水化物部分の性質および割合の変化を含む、固有のタンパク質のグリコシル化における質的な変化を含む。
抗体および他のポリペプチド類のグリコシル化は、典型的にはＮ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物部分の結合を称す。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸であるトリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在によって、グリコシル化部位として可能なものが生じる。Ｏ−結合グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンに対する糖類のＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの中の１つの糖との結合を称するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシルリシンもまた使用できる。
抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、１つまたは複数の上記のトリペプチド配列（Ｎ−結合グリコシル化部位に関して）を含有するようにアミノ酸配列を変えることによって都合よく達成される。この変化はまた、元の抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの配列（Ｏ−結合グリコシル化部位）への１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基による付加、または置換によって成すことができる。抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列は、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように予め選択された塩基で抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって、ＤＮＡレベルでの変化を介して任意に変えることができる。
抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド上の炭水化物部分数を増加させる別の手段は、該ポリペプチドへのグリコシド類の化学的または酵素的結合による。このような方法は、当業界において、例えば、１９８７年９月１１日に公開された国際公開第８７／０５３３０号、およびＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９−３０６頁（１９８１）に記載されている。
抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに存在する炭水化物部分の除去は、化学的もしくは酵素的またはグリコシル化の標的として役立つアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によって達成できる。化学的脱グリコシル化技法は、当業界に公知であり、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎらによる、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９：５２頁（１９８７）およびＥｄｇｅらによる、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８：１３１頁（１９８１）に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａらによる、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８：３５０頁（１９８７）に記載されている種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成できる。
抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの別のタイプの共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号；米国特許第４，４９６，６８９号；米国特許第４，３０１，１４４号；米国特許第４，６７０，４１７号；米国特許第４，７９１，１９２号または米国特許第４，１７９，３３７号に記載されている様式で、種々の非タンパク質様ポリマー類、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン類のうちの１つに抗体またはポリペプチドを結合させることを含む。抗体またはポリペプチドはまた、例えば、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロ乳濁液、ナノ粒子およびナノカプセル）中、またはマクロ乳濁液中、コアセルベーション技法または界面重合（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）により調製されたマイクロカプセル内に混入させることができる。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ編集者（１９８０）に開示されている。
本発明の抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドは、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法でも修飾できる。
一実施形態において、このようなキメラ分子は、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは一般に、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に置かれる。抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのこのようなエピトープタグ化形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出できる。また、エピトープタグの提供により、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを、エピトープタグに結合する抗タグ抗体または別のタイプのアフィニティーマトリックスを用いるアフィニティー精製により容易に精製できる。種々のタグポリペプチド類およびそれぞれの抗体は、当業界に周知である。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８：２１５９−２１６５頁（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５：３６１０−３６１６頁（１９８５）］；および単純ヘルペスウィルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（６）：５４７−５５３頁（１９９０）］が挙げられる。他のタグポリペプチド類としては、フラグ−ペプチド［Ｈｏｐｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１２０４−１２１０頁（１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：１９２−１９４頁（１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１５１６３−１５１６６頁（１９９１）］；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３９３−６３９７頁（１９９０）］が挙げられる。
代替の実施形態において、キメラ分子は、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドと、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合を含むことができる。キメラ分子（「免疫アドヘシン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」とも称される）の二価形態に関して、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域にあり得る。Ｉｇ融合は、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変性領域の代わりに抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの溶解性（削除または不活化された膜貫通ドメイン）形態の置換を含むことが好ましい。特に好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、またはＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合の生成に関しては、また１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照されたい。
Ｉ． 抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド類の調製
下記の説明は、抗ＴＡＴ抗体コード核酸またはＴＡＴポリペプチドコード核酸を含有するベクターにより形質転換されたか、またはそれをトランスフェクトした細胞を培養することによる、主として抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド類の製造に関する。もちろん、当業界に周知である代替法は、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを調製するために使用できることが考慮されている。例えば、適切なアミノ酸配列、またはそれの部分は、固相法［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．、サンフランシスコ、カリフォルニア州（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９−２１５４頁（１９６３）を参照］を用いる直接ペプチド合成により製造できる。インビトロタンパク質合成は、手動技法を用いるか、または自動化により実施できる。自動化合成は、例えば、製造元の取扱説明書を用い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて実施できる。抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド種々の部分は、個々に化学的に合成でき、化学的または酵素的方法を組合わせて所望の抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドを製造できる。
１． 抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡは、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドのｍＲＮＡを有し、検出可能なレベルで発現すると考えられている組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。したがって、ヒト抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドＤＮＡは、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから都合よく得ることができる。抗ＴＡＴ抗体コード遺伝子またはＴＡＴポリペプチドコード遺伝子は、ゲノムライブラリーまたは既知の合成法（例えば、自動化核酸合成）からも得ることができる。
ライブラリーは、対象の遺伝子、またはそれによりコードされたタンパク質を同定するために設計されたプローブ（少なくとも約２０〜８０の塩基のオリゴヌクレオチドなど）でスクリーンできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ（ニューヨーク：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）に記載されたように標準的な手法を用いて実施できる。抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子を単離するための代替手段は、ＰＣＲ方法論を使用することである［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５年）］。
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする技法は、当業界に周知である。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、長さが十分であり、偽陽性が最少になるように十分に明瞭である必要がある。オリゴヌクレオチドは、スクリーンされるライブラリーにおけるＤＮＡにハイブリダイゼーションの際に検出できるように標識されることが好ましい。標識方法は、当業界に周知であり、３２Ｐ標識ＡＴＰ、ビオチニル化または酵素標識の使用を含む。中等度ストリンジェンシーおよび高度ストリンジェンシーなど、ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献に提供されている。
このようなライブラリースクリーニング法で同定された配列は比較でき、寄託された他の公知の配列と整列させ、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の私的な配列のデータベースなどの公的なデータベースが利用できる。分子の規定領域内または完全長配列を交差した配列同一性は、当業界に公知で本明細書に記載された方法を用いて決定できる。
タンパク質コード配列を有する核酸は、最初に本明細書に開示された推測アミノ酸配列を用い、ｃＤＮＡに逆転写されたことがないと考えられるｍＲＮＡの前駆体および処理中間体を検出するために、必要ならば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献に記載された従来のプライマー伸長法を用いて、選択されたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーにより得ることができる。
２． 宿主細胞の選択および形質変換
宿主細胞は、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド産生のために本明細書に記載された発現またはクローン化ベクターをトランスフェクトされるか、または形質変換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるために適切に修飾された従来の栄養培地中で培養する。培地、温度、ｐＨなどの培養条件は、過度に実験することなく熟練技術者により選択できる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするために原理、プロトコル、および実用的技法は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編集者（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９９１年）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、上記文献に見ることができる。
真核細胞のトランスフェクション法および原核細胞の形質転換法は、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介および電気穿孔など、通常の熟練技術者に知られている。用いられる宿主細胞に依って、形質転換は、このような細胞に適切な標準的技法を用いて実施される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献に記載された塩化カルシウム使用するカルシウム処理、または電気穿孔は、原核細胞に一般に使用される。アグロバクテリウムチュメファシエンスによる感染は、Ｓｈａｗらによる、Ｇｅｎｅ、２３：３１５頁（１９８３）および１９８９年６月２９日に公表された国際公開第８９／０５８５９号に記載されているように、ある一定の植物細胞の形質転換に使用される。このような細胞壁のない哺乳動物細胞に関して、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６−４５７頁（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法が使用できる。哺乳動物の宿主細胞系のトランスフェクションの一般態様は、米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母への形質転換は、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１３０：９４６頁（１９７７）およびＨｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、７６：３８２９頁（１９７９）の方法に従って典型的に実施される。しかしながら、核ミクロ注入、電気穿孔、無処置細胞との細菌原形質との融合、またはポリカチオン類、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンによるなど、細胞にＤＮＡを導入する他の方法もまた使用できる。哺乳動物細胞を形質転換する種々の技法に関して、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：５２７−５３７頁（１９９０）およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照されたい。
本明細書のベクターにＤＮＡをクローン化するか、または発現するのに好適な宿主細胞としては、原核細胞、酵母細胞、または高等真核細胞が挙げられる。好適な原核細胞としては、限定はしないが、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、大腸菌などの腸内細菌科が挙げられる。種々の大腸菌株は、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）およびＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）など公的に入手できる。他の好適な原核宿主細胞としては、エシェリキア属などの腸内細菌科、例えば、大腸菌、エンテロバクター属、エルウィナ属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、サルモネラ菌、セラチア属、例えば、霊菌、およびシゲラ属、ならびに枯草菌およびリケニホルミス菌（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に開示されたリケニホルミス菌４１Ｐ）、緑膿菌などのシュードモナス属、およびストレプトミセス属が挙げられる。これらの例は、限定するのではなく説明のためである。Ｗ３１１０株は、組換えＤＮＡ産物発酵に関して共通の宿主株であることから、特に好ましい宿主または親の宿主のものである。宿主細胞は、最少量のタンパク分解酵素を分泌することが好ましい。例えば、Ｗ３１１０株は、完全遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５，２４４）；完全遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ ｉｌｖＧ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を有する３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；および１９９０年８月７日に発行された米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異体ペリプラズムプロテアーゼを有する大腸菌株など、このような宿主の例により宿主に内因性のタンパク質をコードする遺伝子において遺伝子変異を達成させるために修飾できる。あるいは、インビトロクローン化法、例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応は好適である。
治療用抗体が、細胞毒性剤（例えば、毒素）に結合し、それ自体による免疫複合体が、腫瘍細胞破壊の効力を示す場合など、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要でない場合、完全長抗体、抗体断片、および抗体融合タンパク質は細菌中に産生できる。完全長抗体は、循環流動中、より大きな半減期を有する。大腸菌中の産生は、より速く、よりコスト効率的である。細菌中の抗体断片およびポリペプチド類の発現に関して、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号（Ｃａｒｔｅｒら）、米国特許第５，７８９，１９９号（Ｊｏｌｙら）、および発現および分泌を最適化するための翻訳開始部位（ＴＩＲ）およびシグナル配列を記載している米国特許第５，８４０，５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓら）を参照されたい。これらの特許は、参照として本明細書に組み込まれている。発現後、抗体は、溶液フラクションにおいて大腸菌細胞ペーストから単離され、例えば、イソタイプに依ってタンパク質ＡまたはＧカラムを通して精製できる。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現される抗体を精製するためのプロセスと同様に実施できる。
原核微生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗ＴＡＴ抗体コードベクターまたはＴＡＴポリペプチドコードベクターに関する好適なクローニング宿主または発現宿主である。酵母は、通常使用される下等真核宿主微生物である。他のものとしては、分裂酵母ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）’ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９０：１４０頁［１９８１］；１９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９，３８３号）；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５４（２）：７３７−７４２頁［１９８３］）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：１３５（１９９０））、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：９６８−９７５頁（１９９１））；ｙａｒｒｏｗｉａ（欧州特許第４０２，２２６号）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許第１８３，０７０号；Ｓｔｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８：２６５−２７８頁［１９８８］）；カンジダ属；トリコデルマ属リーシア（ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４，２３４号）；アカパンカビ（Ｃａｓｅら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：５２５９−５２６３頁［１９７９］）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許出願公開第３９４，５３８号）；および、例えば、アカパンカビ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属（１９９１年１月１０日公開の国際公開第９１／００３５７号）などの糸状菌、、偽巣性コウジ菌（Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１１２：２８４−２８９頁［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ、２６：２０５−２２１頁［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：１４７０−１４７４頁［１９８４］）およびクロカビ（ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．４：４７５−４７９頁［１９８５］）などのアスペルギルス属宿主が挙げられる。メチロトロピック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母は、本明細書において好適であり、限定はしないが、ハンゼヌラ属、カンジダ属、クロエッケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ））、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属、トルロプシス属およびロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）よりなる属から選択されたメタノールに対して増殖できる酵母が挙げられる。このクラスの酵母について代表的な特定種のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ、２６９（１９８２）に見ることができる。
グリコシル化抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９などの昆虫細胞、ならびに綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ツクバネアサガオ、トマト、およびタバコの細胞培養などの植物細胞が挙げられる。多数のバキュロウィルス株ならびに変異体およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、ネッタイシマカ（蚊）、セスジヤブカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ミバエ）、およびカイコなどの宿主からの対応する許容昆虫細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オウトグラファカリフォルニアＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコＮＰＶのＢｍ−５株は公的に入手でき、このようなウィルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのため、本発明による本明細書のウィルスとして使用できる。
しかしながら、脊椎動物細胞が最大の対象となっており、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、現在ではルーチン的手法となっている。有用な哺乳動物の宿主細胞系の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）により形質転換されたサルの腎臓ＣＶ１系；ヒトの胎生腎臓系（懸濁培養における増殖に対してサブクローン化された２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９頁（１９７７））；ベビーハムスターの腎細胞(ＢＨＫ ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６頁（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１頁（１９８０））；さる腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカグリーンモンキーの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚部癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８頁（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞は、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチド産生のために上記の発現またはまたはクローン化ベクターにより形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅させるのに適切に修飾された従来の栄養培地中で培養する。
３． 複製可能なベクターの選択および使用
抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、クローン化（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入できる。種々のベクターは、公的に入手できる。例えば、該ベクターは、プラスミド、コスミド、ウィルス粒子、またはファージの形態であり得る。適切な核酸配列を、種々の手法によりベクターに挿入できる。一般に、ＤＮＡは、当業界に公知の技法を用いて適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては一般に、限定はしないが、１つまたは複数のシグナル配列、複製源、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列が挙げられる。１つまたは複数のこれら成分を含有する好適なベクターの構築は、熟練技術者に知られている標準的な連結法を使用する。
ＴＡＴは、組換え的に直接的のみならず、ポリペプチドと、シグナル配列または成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端で特異的な開裂部位を有する他のポリペプチドであり得る異種ポリペプチドとの融合としても生成できる。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入される抗ＴＡＴ抗体コードＤＮＡまたはＴＡＴポリペプチドコードＤＮＡの一部であり得る。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーよりなる群から選択される原核細胞のシグナル配列であり得る。酵母分泌に関して、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（サッカロミセスおよびクルイベロミセスのα−因子リーダーなど、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、または酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンスグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日公開の欧州特許出願公開第３６２，１７９号）、または１９９０年１１月１５日公開の国際公開第９０／１３６４６号に記載されたシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現において、哺乳動物のシグナル配列は、同種または関連種の分泌ポリペプチド類、ならびにウィルス分泌リーダーからのシグナル配列など、タンパク質の直接分泌に使用できる。
発現ベクターおよびクローン化ベクターの双方は、１つまたは複数の選択された宿主細胞中でベクターが複製できる核酸配列を含有する。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウィルスに対して周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起源は、大部分のグラム陰性菌に好適であり、２μプラスミドの起源は、酵母に好適であり、種々のウィルス起源（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞のクローン化ベクターに好適である。
発現およびクローン化ベクターは、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を典型的に含有する。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗体または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンに耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性欠乏を補完し、または（ｃ）複雑な培地から利用できない重要な栄養源、例えば、桿菌に関してＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給する、タンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に好適な選択性マーカーの例は、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼなどの抗ＴＡＴ抗体コード核酸またはＴＡＴポリペプチドコード核酸を取り上げる能力があって細胞の同定を可能にするものである。野生型ＤＨＦＲが使用される場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠いたＣＨＯ細胞系であり、Ｕｒｌａｕｂらによる、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６頁（１９８０）に記載されたとおりに調製され、増殖される。酵母に使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９頁（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ、７：１４１頁（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ，１０：１５７頁（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中増殖する能力を欠く酵母の変異体株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１に対して選択マーカーを提供する［Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：１２頁（１９７７）］。
発現およびクローン化ベクターは、通常、ｍＲＮＡ合成を方向づけるために抗ＴＡＴ抗体コード核酸またはＴＡＴポリペプチドコード核酸配列に操作的に結合されたプロモーターを含有する。種々の可能性のある宿主細胞により認識されたプロモーターは周知である。原核生物宿主との使用に好適なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２７５：６１５頁（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：５４４（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７頁（１９８０）；欧州特許第３６，７７６号］、ｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーター［ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２１−２５頁（１９８３）］が挙げられる。細菌系に使用のためのプロモーターはまた、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡに操作的に結合されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。
酵母宿主との使用に好適なプロモーティング配列の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３頁（１９８０）］またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．、７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７：４９００（１９７８））が挙げられる。
増殖条件により制御されるさらなる利点の転写を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ−２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびマルトースならびにガラクトースの利用の原因となる酵素に関するプロモーター領域である。酵母発現の使用に好適なベクターおよびプロモーターは、欧州特許第７３，６５７号にさらに記載されている。
哺乳動物宿主細胞における、ベクターからの抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの転写は、以下のプロモーターが宿主細胞系に適合性であるという条件で、例えば、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス（１９８９年７月５日公開の英国特許第２，２１１，５０４号）、アデノウィルス（アデノウィルス２など）、ウシパピローマウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスおよびサルウィルス４０（ＳＶ４０）などのウィルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、および熱ショックプロモーターから得られるプロモーターにより制御される。
高等真核生物による抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、該ベクター内へ、エンハンサー配列を挿入することによって増大できる。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増大させる、ＤＮＡのシス作用性要素であり、通常、約１０ｂｐから３００ｂｐである。哺乳動物遺伝子（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質、およびインスリン）の多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかし、典型的には、真核生物細胞ウィルスのエンハンサーが用いられる。例としては、複製源の遅発側上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製源の遅発側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーが挙げられる。該エンハンサーは、抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードする配列に対して５’または３’の位置で、ベクター内にスプライスできるが、好ましくは、該プロモーターから５’の位置にある。
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列もまた含有する。このような配列は、真核生物またはウィルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および、時には３’非翻訳領域から一般に入手可能である。これらの領域は、複製源の遅発側上の抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。
組換え脊椎動物細胞の培養において、複製源の遅発側上の抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの合成への適合に好適なさらに他の方法、ベクター、および宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０−６２５頁（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２８１：４０−４６頁（１９７９）；欧州特許第１１７，０６０号；および欧州特許第１１７，０５８号に記載されている。
４．宿主細胞の培養
本発明の抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの生産に用いられる宿主細胞は、種々の培地において培養できる。Ｈａｍ’ｓＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（（Ｍｅｍ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコー修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。また、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；または第５，１２２，４６９号、国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；または米国再発行特許第３０，９８５号に記載されている培地のいずれかを、宿主細胞の培養培地として使用できる。これらの培地のいずれかに、適宜、ホルモン類および／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＯＩＮ（商標）薬）、微量元素（マイクロモル範囲で最終濃度において通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは等価エネルギー源を添加できる。任意の他の必要なサプリメントもまた、当業者に知られていると考えられる適切な濃度で含めることができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で先に用いられたものであり、通常の当業者には明らかであろう。
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅および／または発現は、本明細書に提供された配列に基づき、適切な標識プローブを用いて、例えば、ｍＲＮＡの転写を定量化するためには、慣例的なサザンブロッティング、ノーザンブロッティング〔Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：５２０１−５２０５（１９８０）〕、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインサイチュハイブリダイゼーションによって、サンプル中で直接測定できる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖などの特定の二重鎖を認識できる抗体が使用できる。次いで、該抗体を標識化でき、アッセイを実施できるが、このアッセイでは、表面上に二重鎖が形成された際に、その二重鎖に結合した抗体の存在が検出できるように、表面に二重鎖が結合している。
あるいは、細胞または組織切片の免疫組織化学的染色などの免疫学的方法および遺伝子産物の発現を直接定量化するための細胞培養物または体液のアッセイにより、遺伝子発現を測定できる。免疫組織化学的染色および／またはサンプル液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物において調製できる。該抗体は、天然配列ＴＡＴポリペプチドに対して、または本明細書に提供されたＤＮＡ配列に基づいた合成ペプチドに対して、またはＴＡＴ ＤＮＡに融合させ、特定の抗体エピトープをコードする外因性配列に対して、便利に調製できる。
６．抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの精製
抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドの形態は、培養培地から、または宿主細胞ライセートから回収できる。それが膜に結合している場合は、好適な洗浄溶液（例えば、トリトンＸ− １００）を用いて、または酵素的開裂によって膜から遊離させることができる。抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドの発現に使用された細胞は、凍結−解凍サイクリング、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤などの種々の物理的または化学的手段で破壊できる。
抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドを、組換え細胞のタンパク質またはポリペプチドから精製することが所望され得る。以下の操作は、好適な精製操作の例である：イオン交換カラム上での分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上またはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５を用いたゲルろ過；ＩｇＧなどの混入物を除去するためのタンパク質Ａセファロースカラム；および抗ＴＡＴ抗体およびＴＡＴポリペプチドのエピトープタグ化形態を結合する金属キレート化カラム。タンパク質精製の種々の方法が使用でき、このような方法は当業界に知られており、例えば、Ｄｅｕｔｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９８２）に記載されている。選択される精製ステップ（１つまたは複数）は、例えば、用いられる産生法の性質および産生される具体的な抗ＴＡＴ抗体またはＴＡＴポリペプチドに依存する。
組換え法を用いる場合、該抗体は、細胞内の細胞周辺腔に産生され得るか、または培地内へ直接分泌され得る。該抗体が細胞内に産生される場合、第１のステップとして、宿主細胞または溶解断片、いずれかの粒子デブリは、例えば、遠心分離または限外ろ過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７頁（１９９２）は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離するための操作を記載している。簡単に述べると、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下、約３０分にわたって細胞ペーストを解凍する。細胞デブリは遠心分離により除去できる。該抗体が培地に分泌される場合、そのような発現系からの上澄み液は、一般に先ず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを用いて濃縮する。タンパク質分解を抑制するために、先のステップのいずれかにおいて、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含めることができ、有害な混入物の増殖を防止するために、抗生物質を含めることができる。
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製法である。アフィニティーリガンドとしてのタンパク質Ａの好適性は、該抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づいている抗体の精製に使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３頁（１９８３））。タンパク質Ｇは、マウスの全てのアイソタイプおよびヒトγ３に対して推薦されている（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５頁（１９８６））。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用できる。制御ポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスにより、アガロースで達成されるよりも高い流速および短い処理時間が可能になる。該抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、精製には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、フィリップスバーグ、ニュージャージー州）が有用である。イオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリン上のクロマトグラフィーアニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；および硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収される抗体に依存して利用できる。
任意の予備的精製ステップの後、対象の抗体および混入物を含む混合物を、約２．５〜４．５の間のｐＨにおける溶出緩衝液を用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することができ、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０Ｍ〜０．２５Ｍの塩）で実施する。
Ｊ．製薬製剤
本発明に従って用いられる抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、ＴＡＴ結合有機分子および／またはＴＡＴポリペプチドは、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で、所望の精製度を有する該抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドまたは有機分子を、任意の製薬的に許容できる担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））と混合することにより、貯蔵用に調製される。許容できる担体、賦形剤または安定化剤は、投与量および使用される濃度において、レシピエントに対して非毒性であり、挙げられるものとしては、酢酸塩、トリス、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェニル、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの単糖、二糖および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；トレハロースおよび塩化ナトリウムなどの張性化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ポリソルベートなどの界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤がある。該抗体は、５ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度の抗体を含むことが好ましい。
本明細書における製剤はまた、治療されている特定の適応症に必要な場合、１つ超の活性化合物、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的活性を有するものを含有できる。例えば、抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチド、またはＴＡＴ結合有機分子に加えて、１つの製剤中に、さらなる抗体、例えば、ＴＡＴポリペプチド上の異なるエピトープに結合する二次抗ＴＡＴ抗体、または特定の癌の増殖に影響を与える成長因子などのいくつかの他の標的に対する抗体を含むことが望ましいことがあり得る。代替として、または追加して、該組成物は、化学療法剤、細胞毒性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、および／または心臓保護剤をさらに含んでなり得る。このような分子は、意図された目的にとって有効な量で組み合わされて好適に存在する。
該活性成分はまた、例えば、コアセルベーション法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、コロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）における、またはマクロエマルジョンにおける、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに捕捉できる。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
持続放出製剤を調製できる。持続放出製剤の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、該マトリックスは形状化製品、例えば、薄膜、またはマイクロカプセルの形態であり得る。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロライド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）アセテートからなる注射用ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマーが挙げられる。
インビボ投与に用いられる製剤は滅菌されていなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通すろ過によって容易に達成される。
Ｋ．抗ＴＡＴ抗体、ＴＡＴ結合オリゴペプチドおよびＴＡＴ結合有機分子による診断および治療
癌におけるＴＡＴ発現の判定には、種々の診断アッセイが利用できる。一実施形態において、ＴＡＴポリペプチドの過剰発現を、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析できる。腫瘍生検からのパラフィン埋め込み組織切片をＩＨＣアッセイに供し、以下のＴＡＴタンパク質染色強度基準と合せることができる：
スコア０ −染色が見られないか、または、１０％未満の腫瘍細胞に膜染色が見られる。
スコア１＋ −１０％超の腫瘍細胞に、かすかに／わずかに認められる膜染色が検出される。細胞は膜の一部のみが染色されている。
スコア２＋ −１０％超の腫瘍細胞に、弱から中等度の完全な膜染色が見られる。
スコア３＋ −−１０％超の腫瘍細胞に、中等度から強の完全な膜染色が見られる。
ＴＡＴポリペプチド発現に関して、スコア０またはスコア１＋を有する腫瘍は、ＴＡＴを過剰発現していないとして特性化できるが、スコア２＋からスコア３＋を有する腫瘍は、ＴＡＴを過剰発現しているとして特性化できる。
代替として、または追加して、腫瘍におけるＴＡＴ過剰発現の程度（存在する場合は）を判定するために、ＩＮＦＯＲＭ（登録商標）（Ｖｅｎｔａｎａ、アリゾナ州により販売）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（登録商標）（Ｖｙｓｉｓ、イリノイ州）などのＦＩＳＨアッセイを、ホルマリン固定、パラフィン埋め込み腫瘍組織について実施できる。
ＴＡＴ過剰発現または増幅は、インビボ診断アッセイを用いて、例えば、検出される分子に結合し、検出可能な標識（例えば、放射性同位元素または蛍光標識）でタグ化される分子（抗体、オリゴペプチドまたは有機分子など）を投与し、該標識の局在化に関して親を外部走査することによって評価できる。
上記のとおり、本発明の抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、種々の非治療的適用を有する。本発明の抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、ＴＡＴポリペプチドを発現する癌の診断およびステージング（例えば、放射線画像化）に有用であり得る。該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子はまた、細胞からＴＡＴポリペプチドを精製または免疫沈降するために、他の細胞の精製における一工程として、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットで、インビトロでＴＡＴポリペプチドを検出および定量化して、混合細胞の集団からＴＡＴ発現細胞を死滅させ、除去するために有用である。
現在、癌の病期に依存して、癌治療は以下の療法の１つまたは組み合わせを含む：癌組織を除去するための外科手術、放射線療法、および化学療法。抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子療法は、化学療法の毒性および副作用を十分忍容できない高齢の患者において、および放射線療法の有用性が限定されている転移性疾患において特に望ましいと考えられる。本発明の腫瘍標的抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドおよび有機分子は、該疾患の初期診断時または再発時のＴＡＴ発現性癌の緩和に有用である。治療的適用では、抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、単独で、または、例えば、ホルモン、抗抗原、または放射性標識化号物との、または外科手術、寒冷療法、および／または放射線療法との併用療法において使用できる。抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子処置は、他の形態の慣例的療法と関連させ、慣例的療法に連続して、その前に、またはその後に、投与することができる。ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル）、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パリクタキセル）、エストラムスチンおよびミトキサントロンなどの化学療法剤が、癌の治療に、特に危険性の十分な患者に使用される。癌の治療または緩和のための当該方法において、一種または複数種の先行化学療法剤による治療と関連させて、抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を癌患者に投与することができる。特に、パリクタキセルおよび修飾誘導対（例えば、欧州特許第０６００５１７号参照）との併用療法が考慮されている。抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、治療的に有効用量の化学療法剤と共に投与される。他の実施形態において、抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、化学療法剤、例えば、パクリタキセルの活性および有効性を増強するために化学療法と関連させて投与される。医薬品集（ＰＤＲ）は、種々の癌の治療に用いられてきたこれらの薬剤の投与量を開示している。治療的に有効なこれらの前記化学療法剤の用法および用量は、治療される具体的な癌、該疾患の程度および当業界の医師によく知られた他の因子に依存し、医師により決定することができる。
特定の一実施形態において、細胞毒性剤と結合させた抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を含む複合体が患者に投与される。ＴＡＴタンパク質に結合させた免疫複合体が該細胞によって内部移行し、それが結合する癌細胞死滅における免疫複合体の治療的有効性の増加をもたらすことが好ましい。好ましい一実施形態において、該細胞毒性剤は、癌細胞内の核酸を標的にするか、または妨害する。このような細胞毒性剤の例は、上に記載されており、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎｓ）、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼが挙げられる。
抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチド、有機分子またはそれらの毒素複合体は、静脈内投与により、例えば、ボーラスとして、またはある期間にわたる連続的注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路などの公知の方法によって、ヒト患者に投与される。該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の静脈内または皮下投与が好ましい。
他の治療法を該抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の投与と組み合わせることができる。併用投与としては、別個の製剤、または単独の製薬製剤を用いる同時投与、および双方の（または全ての）活性剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮するが時間の存在する、いずれかの順序における連続的投与が挙げられる。このような併用療法は、相乗的な治療効果をもたらすことが好ましい。
また、抗ＴＡＴ抗体（一種または複数種）、オリゴペプチドまたは有機分子の投与を、特定の癌に関連した他の腫瘍抗原に特異的な抗体の投与と組み合わせることが望ましい。
他の実施形態において、本発明の治療的処置方法は、抗ＴＡＴ抗体（一種または複数種）、オリゴペプチドまたは有機分子と、種々の化学療法剤のカクテルの同時投与など、一種または複数種の化学療法剤または増殖阻害剤との併用投与を含む。化学療法剤としては、エストラムスチンホスフェート、プレドニムスチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシウレアおよびヒドロキシウレアタキサン（パクリタキセルおよびドキセタキセルなど）および／またはアントラサイクリン抗生物質が挙げられる。このような化学療法剤の調製および投与スケジュールは、製造元の支持により、または当業実施者により経験的に決定されたとおり使用できる。このような化学療法のための調製および投与スケジュールはまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｅｄ．、Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、バルチモア、メリーランド州（１９９２）にも記載されている。
該抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、抗ホルモン化合物、例えば、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物；オナプリストン（欧州特許第６１６８１２号を参照）などの抗プロゲステロン；またはフルタミドなどの抗アンドロゲンを、このような分子に関して公知の投与量で組み合わせることができる。治療される癌がアンドロゲン非依存性癌の場合、患者を先に抗アンドロゲン療法に供し、癌がアンドロゲン非依存性になった後に、該患者に抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子（および任意に、本明細書に記載された他の薬剤）を投与できる。
時には、心臓保護剤（該療法に関連した心筋機能不全を防止するか、または減少させるため）または一種または複数種のサイトカインを患者に同時投与することが有益であり得る。上記の治療法に加えて、患者を、抗体、オリゴペプチドまたは有機分子療法の前に、同時に、または後に、癌細胞の外科手術による除去および／または放射線療法に供することができる。上記の同時投与薬剤の好適な投与量は、現在用いられているものであるか、または該薬剤と抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子との併用作用（相乗作用）のために低下させることができる。
疾患の予防または治療に関して、投与量および投与様式は、公知の基準に従って医師により選択される。抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の適切な投与量は、上記で規定した治療される疾患のタイプ、該疾患の重症度および経過、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の投与が、予防目的か治療目的か、先行療法、患者の臨床歴および該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子に対する応答、および担当医師の裁量に依存する。該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、一度に、または一連の治療にわたって患者に好適に投与される。該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、静脈内注射または皮下注射によって投与されることが好ましい。疾患のタイプまたは重症度に依存して、例えば、１回または複数回の別個の投与によるにせよ、連続的注射によるにせよ、約１μｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ／投与〜１５ｍｇ／ｋｇ／投与）の抗体が、患者への投与の最初の候補投与量であり得る。投与方法は、こうＴＡＴ抗体の約４ｍｇ／ｋｇの最初の負荷用量、引き続いて、約２ｍｇ／ｋｇの１週間に１回の維持用量の投与を含んでなり得る。しかし、他の投与方法も有用であり得る。典型的な１日投与量は、上記の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日またはそれ以上にわたる反復投与では、病態に依り、疾患症状の所望の抑制が生じるまで、該処置が持続される。この療法の進行は、慣例的な方法およびアッセイにより、医師または当業界の他の者に知られている基準に基づいて、容易にモニターすることができる。
患者への抗体タンパク質の投与以外に、当該適用では、遺伝子療法による該抗体の投与が考慮されている。該抗体をコードする核酸のこのような投与は、「治療的有効量の抗体の投与」という表現に包含されている。例えば、細胞内抗体を作出するための遺伝子療法の使用に関する、１９９６年３月１４日公開の国際公開第９６／０７３２１号を参照されたい。
核酸（任意にベクター内に含有されている）を患者の細胞内に入れるには、２つの主要な方法：インビボおよびエクスビボがある。インビボ送達では、核酸は、患者に、通常は、抗体が必要とされている部位に、直接注入される。エクスビボ治療では、患者の細胞を取り出し、これらの単離細胞内に核酸を導入し、修飾された細胞を直接、または、例えば、患者に移植される多孔膜内に封入して（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号を参照）、患者に投与する。生存可能な細胞に核酸を導入する種々の技法が利用できる。該核酸が、インビトロで培養細胞内に転移されるか、それとも目的の宿主の細胞内にインビボで転移されるかに依って、該技法は変わってくる。インビトロでの哺乳動物細胞内への核酸の転移に好適な技法としては、リポソーム、電気穿孔、ミクロ注入、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用が挙げられる。遺伝子のエクスビボ送達のために一般に用いられるベクターは、レトロウィルスベクターである。
現在、好ましいインビボ核酸転移法としては、ウィルスベクター（アデノウィルス、単純疱疹Ｉウィルス、またはアデノ関連ウィルスなど）および脂質ベース系（遺伝子の脂質媒介転移に有用な資質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌ）によるトランスフェクションが挙げられる。現在知られている遺伝子作製および遺伝子療法のプロトコルのレビューに関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３頁（１９９２）を参照されたい。また、国際公開第９３／２５６７３号およびそれに引用された参考文献を参照されたい。
本発明の抗ＴＡＴ抗体は、本明細書における「抗体」の定義により包含される種々の形態であり得る。したがって、該抗体としては、完全長または完全抗体、抗体断片、天然配列抗体またはアミノ酸変異体、ヒト化、キメラまたは融合抗体、免疫複合体、およびそれらの機能的断片が含まれる。融合抗体において、抗体配列は異種ポリペプチド配列に融合している。所望のエフェクター機能を提供するために、抗体をＦｃ領域において修飾することができる。本発明のいくつかの節でより詳細に検討されるように、適切なＦｃ領域により、細胞表面上に結合した裸の抗体は、例えば、抗体依存細胞障害性（ＡＤＣＣ）を介し、または補体依存性細胞障害性における補体の動員により、またはいくつかの他の機構により、細胞障害性を誘起し得る。あるいは、副作用または治療的合併症を最少化するために、エフェクター機能を除去または低下させることが望ましい場合、一定の他のＦｃ領域が使用できる。
一実施形態において、該抗体は、本発明の抗体と同一のエピトープに対する結合に関して競合するか、またはそれに実質的に結合する。本発明の当該抗ＴＡＴ抗体の生物学的特徴、特に、インビボ腫瘍標的性および何らかの細胞増殖阻害性または細胞障害性などの特徴を有する抗体もまた考慮されている。
上記の抗体を作製する方法は、本明細書に詳述されている。
当該抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドおよび有機分子は、ＴＡＴ発現性癌の治療または哺乳動物における癌の１つまたは複数の症状の緩和に有用である。このような癌としては、前立腺癌、尿路の癌、肺癌、乳癌、大腸癌および卵巣癌、より具体的には、前立腺腺癌、腎細胞癌、結腸直腸腺癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、および胸膜中皮腫がが挙げられる。該癌は、先述のいずれかの転移癌を包含する。該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、哺乳動物において、ＴＡＴポリペプチドを発現する癌細胞の少なくとも一部に結合することができる。好ましい一実施形態において、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、該細胞上のＴＡＴポリペプチドに結合した際に、インビトロまたはインビボで、ＴＡＴ発現腫瘍細胞を破壊または死滅させる上で、またはこのような腫瘍細胞の増殖を阻害する上で有効である。このような抗体としては、裸の抗ＴＡＴ抗体（いずれの試剤にも結合していない）が挙げられる。細胞毒性または細胞増殖阻害性を有する裸の抗体を細胞毒性剤と結びつけて、腫瘍細胞の破壊において、それらをより強力にすることができる。例えば、抗ＴＡＴ抗体に細胞毒性剤を結合し、本明細書に記載された免疫複合体を形成することによって、該抗体に細胞毒性を付与することができる。該細胞毒性剤または増殖阻害剤は小型分子であることが好ましい。カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）またはメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）およびそれらの類縁体または誘導体が好ましい。
本発明は、本発明の抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を含む組成物および担体を提供する。癌治療を目的として、そのような治療を必要としている患者に、免疫複合体として、または裸の抗体として存在する一種または複数種の抗ＴＡＴ抗体を含む組成物を投与することができる。さらなる一実施形態において、該組成物は、化学療法剤を含め、細胞毒性剤または増殖阻害剤などの他の治療薬と組み合わせたこれらの抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を含んでなり得る。本発明はまた、本発明の抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子、および担体を含む製剤を提供する。一実施形態において、該製剤は、製薬的に許容できる担体を含む治療的製剤である。
本発明の他の態様は、抗ＴＡＴ抗体をコードする単離核酸である。Ｈ鎖とＬ鎖の双方および特に高頻度可変領域残基をコードする核酸、天然配列抗体をコードする鎖、ならびに該抗体の変異体、修飾型およびヒト化型が包含される。
本発明はまた、治療的有効量の抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＴＡＴポリペプチド発現性の癌の治療または前記癌の１つまたは複数の症状を緩和するために有用な方法を提供する。該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の治療的組成物は、医師に指示されたとおり、短期（急性）または長期、または間欠的に投与できる。ＴＡＴポリペプチド発現細胞の増殖を阻害する方法および該細胞を死滅させる方法もまた提供される。
本発明はまた、少なくとも１種の抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を含むキットおよび製品を提供する。抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を含有するキットは、例えば、ＴＡＴ細胞死アッセイに、細胞からのＴＡＴポリペプチドの精製または免疫沈降に使用される。例えば、ＴＡＴの単離および精製のために、該キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合させた抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を含有することができる。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいて、インビトロでのＴＡＴの検出および定量化のために、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を含有するキットを提供することができる。検出に有用なこのような抗体、オリゴペプチドまたは有機分子は、蛍光標識または放射性標識などの標識をつけて提供できる。
Ｌ．製品およびキット
本発明の他の実施形態は、抗ＴＡＴ発現性の癌の治療に有用な材料を含有する製品である。該製品は、容器および該容器上の、または該容器に付随させた標識または添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジが挙げられる。該容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成できる。該容器は、癌の病態の治療に有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、該容器は、皮下注射の針によって貫通可能な栓を有する静脈内溶液またはバイアルであり得る）。該組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子である。該標識または添付文書は、該組成物が癌の治療に使用されることを示す。該標識または添付文書は、癌患者への該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子の組成物の投与に関する使用説明書をさらに含む。また、該製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの製薬的に許容できる緩衝液を含む第２の容器をさらに含む。それはさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、および注射器などの、商業および使用者の立場から望ましい他の物質を含み得る。
種々の目的、例えば、ＴＡＴ発現細胞死滅アッセイのため、細胞からのＴＡＴポリペプチドの精製または免疫沈降のために有用なキットもまた提供される。ＴＡＴポリペプチドの単離および精製のために、該キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合させた抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を含有することができる。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいて、インビトロでのＴＡＴポリペプチドの検出および定量化のために、該抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を含有するキットを提供することができる。該製品に関し、該キットは、容器および該容器上の、または該容器に付随させた標識または添付文書を含む。該容器は、本発明の少なくとも１種の抗ＴＡＴ抗体、オリゴペプチドまたは有機分子を含む組成物を保持する。例えば、希釈剤および緩衝液、対照抗体を含有する追加の容器を含み得る。該標識または添付文書は、該組成物の説明ならびに目的のインビトロまたは診断用の使用に関する使用説明を提供できる。
Ｍ．ＴＡＴポリペプチドおよびＴＡＴポリペプチドをコードする核酸の使用
ＴＡＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（またはそれらの相補体）は、染色体および遺伝子マッピング、および抗センスＲＮＡおよびＤＮＡプローブの作出におけるハイブリダイゼーションプローブとしての使用など、分子生物学業界において、種々の適用を有する。ＴＡＴをコードする核酸はまた、ＴＡＴポリペプチドが、例えば、本明細書に記載されたＴＡＴ抗体の調製において使用できる、本明細書に記載された組換え法によるＴＡＴポリペプチドの調製にも有用である。
完全長の天然配列ＴＡＴ遺伝子、またはその一部は、完全長ＴＡＴｃＤＮＡを単離するための、またはさらに、本明細書に開示された天然配列に所望の配列同一性を有する、他のｃＤＮＡ（例えば、ＴＡＴまたは他の種のＴＡＴの天然変異体をコードするもの）を単離するためのｃＤＮＡライブラリー用ハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。任意に、該プローブの長さは、約２０塩基から約５０塩基である。該ハイブリダイゼーションプローブは、完全長天然ヌクレオチド配列の少なくとも部分的に新規な領域由来であり得、これらの領域は、過度の実験なしに、または天然配列ＴＡＴのプロモーター、エンハンサー要素およびイントロンなどのゲノム配列から決定できる。例えば、スクリーニング法は、公知のＤＮＡ配列を用いてＴＡＴ遺伝子のコード領域を単離し、約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射性ヌクレオチド、またはアビジン／ビオチン結合系によりプローブに結合させたアルカリホスファターゼなどの酵素標識などの種々の標識により標識できる。ヒトのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーンし、このようなライブラリーのどのメンバーに該プローブがハイブリダイズするかを判定するために、本発明のＴＡＴ遺伝子の配列に相補的な配列を有する標識プローブが使用できる。ハイブリダイゼーション法は、下記の実施例においてさらに詳細に記載されている。本出願に開示された任意のＥＳＴ配列が、本明細書に開示された方法を用い、プローブとして同様に使用できる。
ＴＡＴをコードする核酸の他の有用な断片としては、標的のＴＡＴｍＲＮＡ（センス）またはＴＡＴ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することのできる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明によるアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＡＴ ＤＮＡのコード領域の断片を含む。このような断片は一般に、少なくとも１４ヌクレオチド、好ましくは、約１４から３０のヌクレオチドを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいたアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６５９頁、１９８８年）およびｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ．ら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：９５８頁、１９８８年）に記載されている。
標的核酸配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合によって、二重鎖の分解増強、転写または翻訳の早期終止などのいくつかの手段のうちの１つにより、または他の手段により標的配列の転写または翻訳を阻止する二重鎖の形成がもたらされる。このような方法は本発明に包含されている。したがって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、哺乳動物における癌の誘導にある役割を演じていると考えられるＴＡＴタンパク質の発現を阻止するために使用できる。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、内因性ヌクレアーゼに抵抗性の、修飾糖−ホスホジエステル主鎖（または、国際公開第９１／０６６２９号に記載されたものなどの他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含む。抵抗性の糖結合を有するこのようなオリゴヌクレオチドは、インビボで安定（すなわち、酵素的分解に抵抗することができる）であるが、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性を保持している。
アンチセンス結合のための好ましい遺伝子内部位としては、該遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始／出発コドン（５’−ＡＵＧ／５’−ＡＴＧ）または終止／停止コドン（５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５−ＵＧＡ／５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡ）を組み込んでいる領域が挙げられる。これらの領域は、翻訳開始コドンまたは翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわち、５’または３’）における約２５から約５０の連続ヌクレオチドを含むｍＲＮＡまたは遺伝子の一部にある。アンチセンス結合のための他の好ましい領域としては：イントロン；エキソン；イントロン−エキソン結合体；オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域である「コ−ド領域」；５’−５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの最５’残基に結合したＮ７−メチル化グアノシン残基を含むｍＲＮＡの５’キャップならびに該キャップに隣接した最初の５０のヌクレオチド；５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、翻訳開始コドンから５’方向にあり、したがって、ｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドまたは該遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むｍＲＮＡの一部；および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、翻訳終止コドンから３’方向にあり、したがって、ｍＲＮＡの翻訳終止コドンと３’端との間のヌクレオチドまたは該遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むｍＲＮＡの一部が挙げられる。
ＴＡＴタンパク質の発現抑制に有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例としては、修飾主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドには、該主鎖にリン原子を保持するものおよび該主鎖にリン原子を保持しないものが含まれる。本明細書の目的に関して、および時には当業界で引用される場合、ヌクレオシド間主鎖内にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリ−エステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートなどのメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキル ホスホルアミデートなどのホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類縁体、および１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’対３’結合、５’対５’結合または２’対２’結合である反転極性を有するものが挙げられる。反転極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最３’ヌクレオチド間結合における単一の３’対３’結合、すなわち、アベーシック（核酸塩基がその位置でヒドロキシル基を失っているまたは有する）であり得る単一の反転ヌクレオシド残基を含む。種々の塩、混合塩および遊離の酸形態もまた含まれる。リン含有結合の調製を教示している代表的な米国特許としては、限定はしないが、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５．，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，１９４，５９９号；第５，５６５，５５５号；第５，５２７，８９９号；第５，７２１，２１８号；第５，６７２，６９７号および第５，６２５，０５０号が挙げられ、これらの各々は参照として本明細書に組み込まれている。
リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環式のヌクレオシド間結合によって形成される主鎖を有する。これらには、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；およびＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ．ｓｕｂ．２混合要素部分を有する他のものが含まれる。このようなオリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的な米国特許としては、限定はしないが、米国特許：第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，７９２，６０８号、第５，６４６，２６９号および第５，６７７，４３９号が挙げられ、これらの各々は、参照として本明細書に組み込まれている。
他の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖結合とヌクレオシド間結合の双方とも、すなわち、ヌクレオチド単位の主鎖が、新規の基により置換される。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションに関して維持される。このようなオリゴマー化合物の１つ、優れたハイブリダイゼーション性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、アミド含有主鎖、特に、アミノエチルグリシン主鎖により置換される。核酸塩基は保持されて、該主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許としては、限定はしないが：米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号が挙げられ、これらの各々は参照として本明細書に組み込まれている。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年、２５４、１４９７−１５００頁に見ることができる。
好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート主鎖および／またはヘテロ原子主鎖および特に、上記に引用した米国特許第５，４８９，６７７号に記載された−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−〔メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている〕、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−〔天然ホスホジエステル主鎖は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される〕、および上記に引用した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド主鎖を組み込む。上記に引用した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた好ましい。
修飾オリゴヌクレオチドはまた、１つまたは複数の置換糖部分も含有できる。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、またはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、またはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルまたはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含んでなり、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。Ｏ〔（ＣＨ２）ｎＯ〕ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ〔（ＣＨ２）ｎＣＨ３）〕２、が特に好ましく、ここで、ｎおよびｍは、１から約１０である。他の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’位に、以下のうちの１つを含む：Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２、ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物速度論特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、および同様な特性を有する他の置換基。好ましい修飾としては、２’−Ｏ−（２’−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５年、７８、４８６−５０４頁）すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。さらなる好ましい修飾としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書下記の実施例に記載されている２’−ＤＭＡＯＥとしても知られているＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当業界で、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥ）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）が挙げられる。
好ましいさらなる修飾としては、２’ヒドロキシル基が糖環の３’または４’の炭素原子に結合し、それによって二環式糖部分を形成しているロックド核酸（ＬＮＡｓ）が挙げられる。該結合は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋している、ｎが１または２であるメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であることが好ましい。ＬＮＡｓおよびそれらの調製は、国際公開第９８／３９３５２号および国際公開第９９／１４２２６号に記載されている。
他の好ましい修飾としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ− ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ ＮＨ２）、２’−アリル（２’− ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。２’−修飾は、アラビノ（アップ）位またはリボ（ダウン）位におけるものであり得る。好ましい２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。該オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の、または２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおける３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位にも同様な修飾を行うことができる。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の替わりにシクロブチル部分などの糖部分を有することもできる。このような修飾糖構造の調製を教示している代表的な米国特許としては、限定はしないが、米国特許：第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号、および第５，７００，９２０号が挙げられ、これらの各々は、参照として本明細書に組み込まれている。
また、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当業界では、単に「塩基」と称されることが多い）の修飾および置換を含み得る。本明細書に用いられる「非修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３またはＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ）ウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらなる修飾核酸塩基としては、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド〔５，４−ｂ〕〔１，４〕ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド〔５，４−ｂ〕〔１，４〕ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド〔５，４−ｂ〕〔１，４〕ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）などのＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド〔４，５−ｂ〕インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド〔３’，２’：４，５〕ピロロ〔２，３−ｄ〕ピリミジン−２−オン）が挙げられる。修飾核酸塩基にはまた、プリン塩基またはピリミジン塩基が他のヘテロ環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンにより置換されているものも含まれる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８−８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０年に開示されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１年、３０、６１３頁により開示されているものが挙げられる。これらの核酸塩基のうちの一定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性の増加に特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびに、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンなどのＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換により、核酸二重鎖の安定性が、０．６〜１．２程度増加することが示されておりＣ．（Ｓａｎｇｈｖｉら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３年、２７６−２７８頁）、好ましい塩基置換であり、特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合はさらに好ましい。修飾核酸塩基の調製を教示している代表的な米国特許としては、限定はしないが、米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに、米国特許第４，８４５，２０５号、米国特許第５，１３０，３０２号、米国特許第５，１３４，０６６号、米国特許第５，１７５，２７３号、米国特許第５，３６７，０６６号、米国特許第５，４３２，２７２号、米国特許第５，４５７，１８７号、米国特許第５，４５９，２５５号、米国特許第５，４８４，９０８号、米国特許第５，５０２，１７７号、米国特許第５，５２５，７１１号、米国特許第５，５５２，５４０号、米国特許第５，５８７，４６９号、米国特許第５，５９４，１２１号、米国特許第５，５９６，０９１号、米国特許第５，６１４，６１７号、米国特許第５，６４５，９８５号、米国特許第５，８３０，６５３号、米国特許第５，７６３，５８８号、米国特許第６，００５，０９６号、米国特許第５，６８１，９４１号、および米国特許第５，７５０，６９２号が挙げられ、これらの各々は、参照として本明細書に組み込まれている。
オリゴヌクレオチドの１つまたは複数の部分に化学的に結合しているアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の修飾またはオリゴヌクレオチドの活性、細胞分散または細胞取込みを増強する複合体。本発明の化合物は、第一級または第二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した複合基を含み得る。本発明の複合基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物動態特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物速度論的特性を増強する基が含まれる。典型的な複合基としては、コレステロール、脂質、カチオン脂質、リン脂質、カチオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が挙げられる。本発明の脈絡における薬物動態特性を増強する基としては、オリゴマーの取込みを改善し、オリゴマーの耐分解性を増強し、および／またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを増強する基が挙げられる。本発明の脈絡における薬物速度論的特性を増強する基としては、オリゴマーの取込み、分散、代謝または排泄を改善する基が挙げられる。複合体部分としては、限定はしないが、コレステロ＾ル部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９年、８６、６５５３−６５５６頁）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９４年、４、１０５３−１０６０頁）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２年、６６０、３０６−３０９頁；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３年、３、２７６５−２７７０頁）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９２年、２０、５３３−５３８頁）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９１年、１０、１１１１−１１１８頁；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０年、２５９、３２７−３３０頁；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３年、７５、４９−５４頁）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ラク−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ラク−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ、１９９５年、３６、３６５１−３６５４頁；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９０年、１８、３７７７−３７８３頁）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５年、１４、９６９−９７３頁）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ、１９９５年、３６、３６５１−３６５４頁）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５年、１２６４、２２９−２３７頁）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分がが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、活性薬剤物質、例えば、アスピリン、ワーファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナミン酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツール酸塩、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗菌剤または抗生物質に結合させることができる。オリゴヌクレオチド−薬剤複合体およびそれらの調製は、米国特許出願第０９／３３４，１３０号（１９９９年６月１５日出願）ならびに，米国特許第４，８２８，９７９号、米国特許第４，９４８，８８２号、米国特許第５，２１８，１０５号、米国特許第５，５２５，４６５号、米国特許第５，５４１，３１３号、米国特許第５，５４５，７３０号、米国特許第５，５５２，５３８号、米国特許第５，５７８，７１７号、米国特許第５，５８０，７３１号、米国特許第５，５８０，７３１号、米国特許第５，５９１，５８４号、米国特許第５，１０９，１２４号、米国特許第５，１１８，８０２号、米国特許第５，１３８，０４５号、米国特許第５，４１４，０７７号、米国特許第５，４８６，６０３号、米国特許第５，５１２，４３９号、米国特許第５，５７８，７１８号、米国特許５，６０８，０４６号、米国特許第４，５８７，０４４号、米国特許第４，６０５，７３５号、米国特許第４，６６７，０２５号、米国特許第４，７６２，７７９号、米国特許第４，７８９，７３７号、米国特許第４，８２４，９４１号、米国特許第４，８３５，２６３号、米国特許第４，８７６，３３５号、米国特許第４，９０４，５８２号、米国特許第４，９５８，０１３号、米国特許第５，０８２，８３０号、米国特許第５，１１２，９６３号、米国特許第５，２１４，１３６号、米国特許第５，０８２，８３０号、米国特許第５，１１２，９６３号、米国特許第５，２１４，１３６号、米国特許第５，２４５，０２２号、米国特許第５，２５４，４６９号、米国特許第５，２５８，５０６号、米国特許第５，２６２，５３６号、米国特許第５，２７２，２５０号、米国特許第５，２９２，８７３号、米国特許第５，３１７，０９８号、米国特許第５，３７１，２４１号、米国特許第５，３９１，７２３号、米国特許第５，４１６，２０３号、米国特許第５，４５１，４６３号、米国特許第５，５１０，４７５号、米国特許第５，５１２，６６７号、米国特許第５，５１４，７８５号、米国特許第５，５６５，５５２号、米国特許第５，５６７，８１０号、米国特許第５，５７４，１４２号、米国特許第５，５８５，４８１号、米国特許第５，５８７，３７１号、米国特許第５，５９５，７２６号、米国特許第５，５９７，６９６号、米国特許第５，５９９，９２３号、米国特許第５，５９９，９２８号および米国特許第５，６８８，９４１号に記載されており、これらの各々は、参照として本明細書に組み込まれている。
所与の化合物における全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、前記修飾の１つ超を、単一の化合物、またはさらに、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込むことができる。本発明にはまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物が含まれる。本発明の脈絡における「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、各々が少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチドから作製された２つ以上の化学的に異なる領域を含有するアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加を付与するために、該オリゴヌクレオチドが修飾されている少なくとも１つの領域を典型的に含有する。該オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂することのできる酵素に対する基質として役立つ。例えば、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨｎ活性化によって、標的ＲＮＡの開裂がもたらされ、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率が大きく高まる。その結果、キメラオリゴヌクレオチドを用いた場合、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドに比較して、より短いオリゴヌクレオチドで、しばしば同等の結果を得ることができる。本発明のキメラアンチセンス化合物は、２種以上の上記オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣物の複合構造として形成できる。好ましいキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を付与するために、３’末端に、少なくとも１つの２’修飾糖（好ましくは、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３）、およびＲＮアーゼＨ活性を付与するために、少なくとも４つの連続的な２’−Ｈ糖を有する領域を組み込んでいる。このような化合物は、当業界においてハイブリッドまたはギャップマーとも称される。好ましいギャップマーは、３’末端および少なくとも４つの連続的な２’−Ｈ糖を有する少なくとも１つの領域によって分離されている５’末端に、２’修飾糖（好ましくは、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３）の領域を有し、好ましくは、ホスホロチオエート主鎖結合を組み込んでいる。このようなハイブリッド構造の調製を教示している代表的な米国特許としては、限定はしないが、米国特許第５，０１３，８３０号；米国特許第５，１４９，７９７号；米国特許第５，２２０，００７号；米国特許第５，２５６，７７５号；米国特許第５，３６６，８７８号；米国特許第５，４０３，７１１号；米国特許第５，４９１，１３３号；米国特許第５，５６５，３５０号；米国特許第５，６２３，０６５号；米国特許第５，６５２，３５５号；米国特許第５，６５２，３５６号；および米国特許第５，７００，９２２号が挙げられ、これらの各々は、参照として、その全体が本明細書に組み込まれている。
本発明により用いられるアンチセンス化合物は、固相合成の周知の技法により、簡便に、および慣例的に作製できる。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティー、カリフォルニア州）などの供給業者によって販売されている。このような合成のための当業界に知られている任意の他の手段も追加して、または代替として使用できる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために同様な技法を用いることはよく知られている。本発明の化合物はまた、取り込み、分散および／または吸収を補助するために、例えば、リポソーム、受容体標的分子、経口製剤、経直腸製剤、局所製剤または他の製剤として、他の分子、分子構造体または化合物の混合物と混合、封入化、複合化、または結合させることができる。このような取り込み、分散および／または吸収補助製剤調製を教示している代表的な米国特許としては、限定はしないが、米国特許第５，１０８，９２１号；米国特許第５，３５４，８４４号；米国特許第５，４１６，０１６号；米国特許第５，４５９，１２７号；米国特許第５，５２１，２９１号；米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，５４７，９３２号；米国特許第５，５８３，０２０号；米国特許第５，５９１，７２１号；米国特許第４，４２６，３３０号；米国特許第４，５３４，８９９号；米国特許第５，０１３，５５６号；米国特許第５，１０８，９２１号；米国特許第５，２１３，８０４号；米国特許第５，２２７，１７０号；米国特許第５，２６４，２２１号；米国特許第５，３５６，６３３号；米国特許第５，３９５，６１９号；米国特許第５，４１６，０１６号；米国特許第５，４１７，９７８号；米国特許第５，４６２，８５４号；米国特許第５，４６９，８５４号；米国特許第５，５１２，２９５号；米国特許第５，５２７，５２８号；米国特許第５，５３４，２５９号；米国特許第５，５４３，１５２号；米国特許第５，５５６，９４８号；米国特許第５，５８０，５７５号；および米国特許第５，５９５，７５６号が挙げられ、これらの各々は、参照として本明細書に組み込まれている。
センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例としては、国際公開第９０／１００４８号に記載されたものなどの、有機部分、およびポリ−（Ｌ−リシン）などの標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分、に共有結合しているオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を変更するために、エリプチシンなどのインターカレート剤、およびアルキル化剤または金属複合体を、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させることができる。
例えば、ＣａＰＯ４媒介ＤＮＡトランスフェクション、電気穿孔などの任意の遺伝子転移法により、またはエプスタインバルウィルスなどの遺伝子転移ベクターの使用により、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列を含有する細胞内に導入することができる。好ましい一操作において、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、好適なレトロウィルスベクター内に挿入される。標的核酸配列を含有する細胞を、インビボで、またはエクスビボで、組換えレトロウィルスベクターに接触させる。好適なレトロウィルスベクターとしては、限定はしないが、マウスレトロウィルスＭ−ＭｕＬＶ，Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウィルス）由来のもの、またはＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃと称される二重コピーベクター（国際公開第９０／１３６４１号を参照）が挙げられる。
また、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第９１／０４７５３号に記載されているようなリガンド結合分子との複合体の形成により、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞に導入することができる。好適なリガンド結合分子としては、限定はしないが、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドがが挙げられる。リガンド結合分子の結合が、リガンド結合分子の対応する分子または受容体に結合する能力を実質的に妨害しないか、または細胞内へのセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合型の進入を実質的に妨害しないことが好ましい。
あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、国際公開第９０／１０４４８号に記載されているようなオリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞に導入することができる。該センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、内因性リパーゼによって細胞内で解離することが好ましい。
アンチセンスまたはセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は一般に、少なくとも約５つのヌクレオチド、あるいは、長さが少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００のヌクレオチドであり、この文脈において用語の「約」は、述べられたヌクレオチド配列の長さに、述べられたその長さのプラスまたはマイナス１０％を意味する。
また、該プローブは、密接に関連したＴＡＴコード配列の同定のための配列プールを作出するために、ＰＣＲ法において使用できる。
また、ＴＡＴをコードするヌクレオチド配列は、ＴＡＴをコードする遺伝子のマッピング用ハイブリダイゼーションプローブを構築するために、および遺伝子疾患に罹っている個体の遺伝子分析に使用できる。本明細書に提供されたヌクレオチド配列は、インサイチュハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、およびライブラリーによるハイブリダイゼーションスクリーニングなどの公知の技法を用いて、染色体および染色体の特定領域にマップできる。 ＴＡＴコード配列が、他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＴＡＴが受容体の場合）、該結合相互作用に関与する他のタンパク質または分子を同定するためのアッセイに、ＴＡＴを使用できる。このような方法により、受容体／リガンド結合相互作用の阻害剤を同定できる。また、このような結合相互作用に関与するタンパク質を、該結合相互作用のペプチドまたは小型分子阻害剤またはアゴニストをスクリーンするために使用できる。また、受容体ＴＡＴを、関連リガンド（１つまたは複数）を単離するために使用できる。天然ＴＡＴまたはＴＡＴの受容体の生物学的化性を模倣する主要化合物を見出すために、スクリーニングアッセイをデザインできる。このようなスクリーニングアッセイは、化学物質ライブラリーのハイスループットスクリーニングに供することのできるアッセイを含み、小型分子の薬物候補の同定に特に好適となる。考慮される小型分子には、合成の有機または無機化合物が含まれる。該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、免疫アッセイおよび細胞ベースのアッセイなど、種々の様式で実施でき、これらは当業界において十分に特性化されている。
また、ＴＡＴまたはその修飾形態をコードする核酸は、遺伝子導入動物または「ノックアウト」動物の創製に使用でき、次いで、これらは、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングに有用である。遺伝子導入動物（例えば、マウスまたはラット）は、出生前、例えば、胚形成期に該動物または該動物の祖先に導入された導入遺伝子を含有する細胞を有する動物である。導入遺伝子は、遺伝子導入動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡである。一実施形態において、ＴＡＴをコードするｃＤＮＡは、確立された技法によって、ＴＡＴをコードするゲノムＤＮＡのクローン化に使用でき、該ゲノム配列は、ＴＡＴをコードするＤＮＡを発現させる細胞を含有する遺伝子導入動物の創製に使用される。
遺伝子導入動物、特にマウスまたはラットなどの動物を創製する方法は、当業界で慣例的となっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号に記載されている。典型的には、組織特異的エンハンサーにより、ＴＡＴ導入遺伝子組み込みのために特定の細胞が標的化されることになる。
ＴＡＴをコードするＤＮＡの発現増強の効果を調べるために、 胚形成期に動物の胚系に導入された、ＴＡＴをコードする導入遺伝子のコピーを含む遺伝子導入動物を使用することができる。このような動物を、例えば、その過剰発現に関連した病態からの防御を付与すると考えられる試薬に対するテスター動物として用いることができる。本発明のこの事実により、動物を該試薬で処置し、導入遺伝子を担持する非処置動物と比較して、該病態の発生が減少すれば、該病態に対する治療的処置の可能性が示されることになる。
あるいは、ＴＡＴをコードする内因性遺伝子と動物の胚性幹細胞に導入されたＴＡＴをコードする変更ゲノムＤＮＡとの間での相同的組換えの結果、ＴＡＴをコードする欠失遺伝子または変更遺伝子を有するＴＡＴ「ノックアウト」動物を構築するために、ＴＡＴの非ヒト相同体を用いることができる。例えば、確立された技法に従って、ＴＡＴをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために、ＴＡＴをコードするｃＤＮＡを用いることができる。ＴＡＴをコードするゲノムＤＮＡの一部を、欠失させるか、または、組込みをモニターするために使用できる選択性マーカーをコードする遺伝子などの他の遺伝子と置き換えることができる。典型的には、非変更のフランキングＤＮＡの数キロ塩基（５’端および３’端双方での）をベクター内に含ませる（相同的組換えベクターの説明に関しては、例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈ、Ｃｅｌｌ、５１：５０３（１９８７）を参照）。該ベクターを胚性幹細胞系に導入し（例えば、電気穿孔により）、導入遺伝子が内因性ＤＮＡと相同的に組み換わった細胞を選択する〔例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ、６９：９１５（１９９２）を参照）〕。次いで、選択された細胞を動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞内に注入し、凝集キメラを形成する〔例えば、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ ＣｅｌｌｓにおけるＢｒａｄｌｅｙ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、オックスフォード、１９８７年）、１１３−１５２頁を参照〕。次いで、キメラ胚を好適な偽妊娠メスフォスター動物に移植し、該胚を「ノックアウト」動物を創製する時期に至らしめることができる。生殖細胞に相同的組換えＤＮＡを有する後代を標準的技法により同定し、動物の全ての細胞が相同的組換えＤＮＡを含有する動物を作出するために用いることができる。ノックアウト動物は、例えば、一定の病態に対するそれらの防御能力に関し、およびＴＡＴポリペプチドの不在による病態の発現に関して特性化できる。
ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸もまた、遺伝子療法に使用できる。遺伝子療法の適用において、例えば、欠失遺伝子の置換に関して、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成するために、遺伝子を細胞内に導入する。「遺伝子療法」には、１回の処置により持続的な効果が達成される慣例的な遺伝子療法、および治療的に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの単回投与または反復投与を含む遺伝子治療薬の投与の双方が含まれる。インビボで一定の遺伝子の発現を阻止するための治療薬として、アンチセンスＲＮＡｓおよびＤＮＡｓを使用できる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドが、細胞膜による取込み制限に起因するそれらの低い細胞内濃度にかかわらず、それらが阻害剤として作用する細胞内に移入できることがすでに示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：４１４３−４１４６頁〔１９８６〕）。該オリゴヌクレオチドは、例えば、それらの負に荷電したホスホジエステル基を非荷電基により置換することによって、それらの取込み増強のために修飾することができる。
生存可能細胞内へ核酸を導入するために利用できる種々の技法がある。該核酸がインビトロで培養細胞に転移されるのか、それともインビボで目的の宿主の細胞に転移されるのかに依って、該技法は変わってくる。インビトロで哺乳動物細胞内へ核酸を転移するのに好適な技法としては、リポソーム、電気穿孔、ミクロ注入、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用が挙げられる。現在好ましいインビボ遺伝子転移法としては、ウィルス（典型的にはレトロウィルス）ベクターによるトランスフェクションおよびウィルスコートタンパク質-リポソーム媒介トランスフェクション（Ｄｚａｕら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１、２０５−２１０頁〔１９９３〕）が挙げられる。いくつかの場合、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンドなどの標的細胞を標的にする物質と共に核酸源を提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、例えば、特定の細胞型に向性のカプシドタンパク質またはその断片、サイクリングにおいてインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を目的とし、細胞内半減期を増加させるタンパク質を、標的化するために、および／または取込みを促進するために、エンドサイトーシスに関連した細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が使用できる。受容体媒介エンドサイトーシスの技法は、例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２、４４２９−４４３２頁（１９８７）；およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７、３４１０−３４１４頁（１９９０）により記載されている。遺伝子マーキングおよび遺伝子療法プロトコルのレビューに関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６、８０８−８１３頁（１９９２）を参照されたい。
本明細書に記載された、ＴＡＴポリペプチドをコードする核酸分子またはその断片は、染色体の同定に有用である。これに関して、実際の配列データに基づいた染色体マーキング試薬は、現在利用できるものが比較的少ないため、新規の染色体マーカーを同定する必要性が存続している。本発明のＴＡＴ核酸分子各々を染色体マーカーとして使用することができる。
また、本発明のＴＡＴポリペプチドおよび核酸分子は、組織分類のために診断的に使用することもでき、この場合、本発明のＴＡＴポリペプチドは、他の組織に比較して、ある組織において、好ましくは、同じ組織タイプの正常組織に比較して疾患組織において、異なる発現をすることができる。ＴＡＴ核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析およびウェスタン分析のためのプローブの作出に使用される。
本発明は、ＴＡＴポリペプチドを模倣するもの（アゴニスト）またはＴＡＴポリペプチドの作用を防止するもの（アンタゴニスト）を同定するために、化合物をスクリーニングする方法を包含する。本明細書で特定した遺伝子によってコードされたＴＡＴポリペプチドに結合する、もしくは複合体化する、または例えば、細胞からのＴＡＴポリペプチドの発現抑制など、コードされたポリペプチドと他の細胞タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するために、アンタゴニスト薬剤候補のスクリーニングアッセイがデザインされる。このようなスクリーニングアッセイには、化学物質ライブラリーのハイスループットスクリーニングに供することのできるアッセイが含まれ、小型分子の薬剤候補の同定に特に好適となる。
該アッセイは、当業界で十分特性化されている、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、細胞ベースアッセイなどの種々の様式で実施できる。
アンタゴニストに関するアッセイは全て、薬剤候補を本明細書で特定された核酸にコードされたＴＡＴポリペプチドに、これらの２つの成分の相互作用が可能になる条件下で十分な時間、接触させることを要する点が共通である。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は、反応混合物中で単離または検出できる。特定の一実施形態において、本明細書で特定化された遺伝子によりコードされたＴＡＴポリペプチドまたは薬剤候補は、共有または非共有結合により、固相上、例えば、マイクロタイタープレート上に固定される。非共有結合は一般に、固体表面をＴＡＴポリペプチドの溶液でコーティングし、乾燥することにより達成される。あるいは、固定化抗体、例えば、固定化されるＴＡＴポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いてそれを固体表面に係留できる。該アッセイは、固定成分、例えば、係留した成分を含有するコーティング表面に、検出可能な標識によって標識できる非固定成分を加えることによって実施される。反応が完了したら、非反応成分を、例えば、洗浄により除去し、固体表面に係留された複合体を検出する。もともと非固定成分が検出可能な標識を担持している場合は、表面に固定された標識の検出により、複合体化が生じたことが示される。もともと非固定成分が標識を担持していない場合、複合体化は、例えば、固定された複合体に特異的に結合する標識抗体を用いることによって検出できる。
候補化合物が、本明細書で特定された遺伝子によりコードされた特定のＴＡＴポリペプチドと相互作用はするが、それに結合しない場合、該候補化合物とそのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によってアッセイできる。このようなアッセイには、例えば、架橋、共免疫沈降、および勾配またはクロマトグラフィカラムによる共精製などの伝統的な方法が含まれる。また、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｆｉｅｌｄｓおよび共同研究者（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３４０：２４５−２４６頁（１９８９）；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：９５７８−９５８２頁（１９９１））によって記載されている酵母ベースの遺伝子系を用いて、ＣｈｅｖｒａｙおよびＮａｔｈａｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５７８９−５７９３頁（１９９１）に開示されているように、モニターできる。酵母ＧＡＬ４などの多くの転写活性化因子は、２つの物理的に異なるモジュラードメインからなり、１つは、ＤＮＡ結合ドメインとして働き、他方は、転写活性化ドメインとして働く。先行の刊行物に記載された酵母発現系（一般に、「二ハイブリッド系」と称される）は、この性質を利用し、２種のハイブリッドタンパク質を用い、その１つでは、標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合しており、他方では、候補活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下、ＧＡＬ１−ｌａｃＺレポーター遺伝子の発現は、タンパク質−タンパク質相互作用によるＧＡＬ４活性の復元に依存する。相互作用しているポリペプチドを含有するコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生成基質により検出される。ツーハイブリッド法を用いて２つの特異的タンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を確認するための完全キット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商標））は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。また、この系は、特定のタンパク質相互作用に関与しているタンパク質ドメインをマップするために、ならびに、これらの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の位置を決めるために拡張することができる。
本明細書で特定されたＴＡＴポリペプチドをコードする遺伝子の相互作用を妨害する化合物および他の細胞内または細胞外成分は、以下のとおり試験することができる：通常、該遺伝子の産物および細胞内または細胞外成分を含有する反応混合物を、２つの産物の相互作用および結合を可能にする条件下と時間で調製する。結合を阻害する候補化合物の能力を試験するために、該反応液を、試験化合物の不在下および存在下で操作する。さらに、陽性対照として役立つプラセボを第３の反応混合物に添加できる。試験化合物と該混合物に存在する細胞内または細胞外成分との間の結合（複合体形成）を、本明細書の上記のとおりモニターする。対照反応液（１つまたは複数）中に複合体が形成され、試験化合物を含有する反応混合物中に形成されないことは、該試験化合物が、該試験化合物とその反応相手との相互作用を妨害することを示す。
アンタゴニストに関するアッセイでは、ＴＡＴポリペプチドを、特定の活性に関してスクリーンされる化合物と共に細胞に添加でき、ＴＡＴポリペプチドの存在下、対象となっている活性を阻害する該化合物の能力は、該化合物がＴＡＴポリペプチドに対するアンタゴニストであることを示す。あるいは、競合的阻害アッセイのために、適切な条件下、ＴＡＴポリペプチドおよび可能性のあるアンタゴニストを、膜結合ＴＡＴポリペプチド受容体または組換え受容体と組み合わせることによって検出できる。ＴＡＴポリペプチドは、受容体に結合したＴＡＴポリペプチド分子の数を、可能性のあるアンタゴニストの有効性を判定するために使用できるように、放射能などにより標識できる。該受容体をコードする遺伝子は、当業者に知られた多数の方法、例えば、リガンドパンニングおよびＦＡＣＳ選別により同定できる。Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．、１（２）：第５章（１９９１）。ポリアデニル化ＲＮＡがＴＡＴポリペプチドに応答性の細胞から調製される発現クローニングを用いることが好ましく、このＲＮＡから創製されたｃＤＮＡライブラリーはプールに分割され、ＴＡＴポリペプチドに応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞のトランスフェクトに用いられる。ガラススライド上で増殖させたトランスフェクト細胞を、標識ＴＡＴポリペプチドに曝露させる。ＴＡＴポリペプチドはヨード化または部位特異的タンパク質キナーゼに対する認識部位の包含などの種々の手段によって標識化できる。固定化および培養の後、該スライドをオートラジオグラフ分析に供する。陽性のプールを同定し、サブプールを調製し、相互作用的サブプーリングおよび再スクリーニング法を用いて再トランスフェクトし、その結果、推定上の受容体をコードする単一クローンが得られる。
受容体同定の代替法として、標識ＴＡＴポリペプチドを、受容体分子を発現する細胞膜または抽出調製物に光親和結合させることができる。架橋物質をＰＡＧＥによって分析し、Ｘ線フィルムに曝露する。該受容体を含有する標識複合体を切除し、ペプチド断片に分解し、タンパク質マイクロシークエンシングに供する。マイクロシークエンシングから得られたアミノ酸配列を用いて、推定上の受容体をコードする遺伝子同定のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーンする縮合オリゴヌクレオチドプローブのセットをデザインする。
アンタゴニストに関する他のアッセイにおいて、該受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＴＡＴポリペプチドと共に培養する。次いで、この相互作用を増強または阻害する該化後の能力を測定できる。
可能性のあるアンタゴニストのより具体的な例としては、免疫グロブリンとＴＡＴポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限定はしないが、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体などの抗体および抗体断片、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、およびこのような抗体または断片のキメラ型またはヒト型、ならびにヒト抗体および抗体断片が挙げられる。あるいは、アンタゴニストとして可能性のあるものは、密接に関連したタンパク質、例えば、該受容体を認識はするが作用はしないことから、ＴＡＴポリペプチドの作用を競合的に阻害するＴＡＴポリペプチドの変異体であり得る。
ＴＡＴポリペプチドアンタゴニストとして可能性のある他のものは、例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子が標的ｍＲＮＡにハイブリダイズしてタンパク質翻訳を阻止することにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用するアンチセンス法を用いて調製された、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ構築体である。アンチセンス法は、三重らせんの形成、またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝子発現を制御するために使用でき、これらの方法は双方とも、ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドに結合に基づいている。例えば、本明細書における成熟ＴＡＴポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、約１０から４０塩基の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドのデザインに用いられる。転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるようにＤＮＡオリゴヌクレオチドがデザインされ（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、６：３０７３頁（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６頁（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３６０（１９９１）を参照）、それにより、ＴＡＴポリペプチドの転写および産生が阻止される。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＴＡＴポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止する（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−Ｏｋａｎｏ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：ボカレートン、フロリダ州、１９８８年）。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボ発現してＴＡＴポリペプチドの産生を阻害できるように細胞に送達できる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば、標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０位と＋１０位との間から誘導されたオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
アンタゴニストとして可能性のあるものとしては、活性部位、受容体結合部位、または成長因子もしくはＴＡＴポリペプチドの他の関連結合部位に結合し、そのことによって、ＴＡＴポリペプチドの通常の生物学的活性を阻止する小型分子が挙げられる。小型分子の例としては、限定はしないが、小型ペプチドまたはペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、および合成非ペプチジル有機または無機化合物が挙げられる。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することのできる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡに対する配列特異的ハイブリダイゼーション、引き続いて、ヌクレオチド鎖切断開裂により作用する。ＲＮＡ標的として可能性のあるものの内部での特異的リボザイム開裂部位は、公知の技法によって同定できる。さらなる詳細に関しては、例えば、Ｒｏｓｓｉ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４：４６９−４７１頁（１９９４）、およびＰＣＴ国際公開第９７／３３５５１号（１９９７年９月１８日公開）を参照されたい。
転写の阻止に用いられる三重らせん形成における核酸分子は、一本鎖で、デオキシヌクレオチドからなる必要がある。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、二重鎖の一本上にプリンまたはピリミジンの相当な長さの伸長を一般に必要とするフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）塩基対則により、三重らせんの形成を促進するようにデザインされる。さらなる詳細に関しては、例えば、ＰＣＴ国際公開第９７／３３５５１号、上記を参照されたい。
これらの小型分子は、本明細書の上記で検討されたいずれか１つまたは複数のスクリーニングアッセイにより、および／または当業者によく知られている他の任意のスクリーニング法により同定することができる。
ＴＡＴポリペプチドの組換え生産のために、ＴＡＴポリペプチドをコードする単離核酸を、当業界の知られている技法を用い、本明細書に記載されているとおり、本明細書で使用できる。次いで、生産されたＴＡＴポリペプチドを、当業界によく知られている技法を用い、本明細書に記載されているとおり、抗ＴＡＴ抗体を作出するために使用することができる。
本明細書で特定された、ＴＡＴポリペプチドに特異的に結合する抗体、ならびに、本明細書で先に開示したスクリーニングアッセイによって特定した他の分子を、製薬組成物の形態で、癌などの種々の障害の治療に投与することができる。 ＴＡＴポリペプチドが細胞内のものであり、抗体全体が阻害剤として用いられる場合、内部移行抗体が好ましい。しかしながら、該抗体、または抗体断片を細胞内に送達するために、リポフェクションまたはリポソームもまた使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインできる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、および／または組換えＤＮＡ法によって生産できる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：７８８９−７８９３頁（１９９３）を参照されたい。
また、本明細書における製剤は、処置されている具体的な適応症のために、適宜、１種超の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものを含有することもできる。あるいは、またはそれに加えて、該組成物は、その機能を増強する、例えば、細胞障害剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長阻害剤などの薬剤を含んでなり得る。このような分子は、意図された目的にとって有効な量で組み合わされて好適に存在する。
以下の実施例は、例示のみを目的として提供されており、決して本発明の範囲を限定する意図はない。
本明細書に引用された全ての特許参考文献は、参照として、それらの全体が本明細書に組み込まれている。
本実施例に述べられた市販の試薬は、別に指示されない限り、製造元の指示に従って使用した。以下の実施例、および本明細書を通して特定された、ＡＴＣＣ登録番号による細胞の出所は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州である。
実施例１：ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）を用いた組織発現プロファイリング
他のヒト腫瘍（１つまたは複数）および／または正常なヒト組織に比較して、対象となっている特定のヒト腫瘍組織（１つまたは複数）において、有意に、および検出可能にその発現がアップレギュレートされるポリペプチド（およびそれらをコードする核酸）を同定する目的で、遺伝子発現情報を含む登録商標データベース（ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ社、ガイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）を、解析した。具体的には、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースと共に使用するための、Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃ社、ガイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を介して入手できるソフトウェアを用いて、またはＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースと共に使用するためにＧｅｎｅ Ｔｅｃｈ社で書込みが行われ、開発された登録商標ソフトウェアと共に、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）データベースの解析が行われた。解析における陽性適合の評価は、例えば、組織特異性、腫瘍特異性および正常な基本的および／または正常な増殖性組織における発現レベルなどのいくつかの基準に基づいて行われる。以下の分子（一種または複数種）は、他のヒト腫瘍（１つまたは複数）および／または正常なヒト組織に比較して、特定のヒト腫瘍（１つまたは複数）において、高い組織発現、および有意で再現性を有する検出可能な発現のアップレギュレーション、および任意に、正常な基本的および／または正常な増殖性ヒト組織における比較的低い発現を示す組織発現プロフィルを示す。
上記の発現解析を用いて、本明細書において配列番号：２で示されているＴＡＴ１１３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、それぞれ、対応する正常なヒト結腸組織および直腸組織に比較して、ヒトの癌性結腸および直腸腫瘍の一定のタイプにおいて、有意に、再現性を有して、検出可能に過剰発現されると判定された。
Ａ．結腸
第１の実験において、２３７の独立した正常なヒト結腸組織サンプルの群において、ＴＡＴ１１３の発現を解析した。解析された正常なヒト結腸組織サンプルの全てにおいて、ＴＡＴ１１３ｍＲＮＡ発現のレベルには著しく一貫性があり、きわめて狭い分布内に入り、サンプル群全体の平均ＴＡＴ１１３発現レベルに比較して、ＴＡＴ１１３発現で２倍超の増加を明白に示す正常なヒト結腸組織サンプルはないことが、これらの解析の結果により示された。
定量的比較を目的として、種々の独立した異なるタイプの癌性ヒト結腸組織サンプルもまた、ＴＡＴ１１３発現に関して解析した。これらの解析から得られた結果により、癌性サンプルにおけるＴＡＴ１１３の発現レベルはきわめて可変的であり、解析した正常な結腸組織サンプルの群に関するＴＡＴ１１３発現の平均レベルに比較して、有意な数の癌性サンプルが、ＴＡＴ１１３発現において、少なくとも２倍（から約１６倍まで）の増加を示すことが実証された。より具体的には、正常な結腸に比較して、以下の結腸癌タイプに関して、検出可能な、再現性を有するＴＡＴ１１３過剰発現が見られた（各々の癌のタイプに関して括弧内に示された数は、解析された正常な結腸組織サンプルの群に関するＴＡＴ１１３発現の平均レベルに比較した場合に、ＴＡＴ１１３発現において少なくとも２倍の増加を示した独立したサンプルの数／解析された独立した腫瘍サンプルの総数を表している）：非特定位置の結腸腺癌（４／９）、盲腸および右上行結腸の腺癌（２５／３５）、横行結腸の腺癌（５／６）および左下行結腸およびＳ字結腸の腺癌（２１／３４）。追加の実験を行い、これらの結果を確認した。
Ｂ．直腸
他の実験において、ＴＡＴ１１３の発現を、４６の独立した正常ヒト直腸組織サンプルの群において解析した。解析された正常なヒト直腸組織サンプルの全てにおいて、ＴＡＴ１１３ｍＲＮＡ発現のレベルには著しく一貫性があり、きわめて狭い分布内に入り、サンプル群全体の平均ＴＡＴ１１３発現レベルに比較して、ＴＡＴ１１３発現で２倍超の増加を明白に示す正常なヒト直腸組織サンプルはないことが、これらの解析の結果により示された。
定量的比較を目的として、２５の独立したヒト直腸腺癌組織サンプルもまた、ＴＡＴ１１３発現に関して解析した。これらの解析から得られた結果により、癌性サンプルにおけるＴＡＴ１１３の発現レベルはきわめて可変的であり、解析した正常な直腸組織サンプルの群に関するＴＡＴ１１３発現の平均レベルに比較して、試験した２５のサンプルのうち１５が、ＴＡＴ１１３発現において、少なくとも２倍（から約１３倍まで）の増加を示すことが実証された。
上記のことを考慮すると、本明細書に配列番号：２で示されたＴＡＴ１１３ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードする核酸は、種々の哺乳動物組織サンプルにおける、本明細書に配列番号：２で示されたＴＡＴ１１３ポリペプチドおよびそれをコードするｍＲＮＡの発現レベルを、定量的および定性的に判定するために利用できる優れた標的であり、それらの間を定量的および定性的に比較することが可能になる。したがって、本明細書に配列番号：２で示されたＴＡＴ１１３ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードする核酸は、ユニークな発現プロファイルを上記の哺乳動物における一定のタイプの癌性腫瘍の診断に利用できる分子である。さらに、この解析によって、ＴＡＴポリペプチドが、対応する正常なヒト組織に比較して、一定のヒト腫瘍において、有意に、再現性を有し、検出可能に過剰発現することが実証されたため、ＴＡＴ１１３ポリペプチドは、哺乳動物におけるこのような腫瘍の治療的処置に利用できるすぐれた標的として役立つ。
実施例２：癌性腫瘍におけるＴＡＴポリペプチドのアップレギュレーションを検出するためのマイクロアレイ分析
数千の遺伝子配列を含有していることの多い核酸マイクロアレイは、正常な対応組織に比較して疾患組織において差異的に発現した遺伝子の同定に有用である。核酸マイクロアレイを用いて、試験および対照の組織サンプルからの試験および対照のｍＲＮＡサンプルを逆転写して、標識化し、ｃＤＮＡプローブを作出する。次いで、該ｃＤＮＡプローブを、固体支持体に固定した核酸のアレイにハイブリダイズさせる。該アレイは、該アレイの各メンバーの配列および位置が分かるように構成される。例えば、一定の疾患状態において発現することが知られている選択された遺伝子を、固体支持体上に配置する。標識プローブと特定のアッレイメンバーとのハイブリダイゼーションにより、該プローブを誘導したもとになるサンプルがその遺伝子を発現することが示される。試験（疾患組織）サンプルからのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが、対照（正常組織サンプル）からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルよりも大きい場合は、その疾患組織において過剰発現した遺伝子（１つまたは複数）が同定される。この結果の意味するところは、疾患組織における過剰発現タンパク質は、疾患状態の存在に関する診断的マーカーとしてのみならず、その疾患状態の治療に関する治療的標的としても有用であるということである。
核酸のハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ法の方法論は、当業界に十分知られている。本実施例において、ハイブリダイゼーションおよびプローブのための核酸の具体的な調製、スライド、ならびにハイブリダイゼーション条件は全て、２００１年３月３０日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０４８２号に詳述されており、これは参照として本明細書に組み込まれている。
本実施例において、特定の癌性腫瘍（１つまたは複数）で過剰発現しているポリペプチドを同定する目的で、種々のヒト組織由来の癌性腫瘍を、種々の組織タイプからの癌性腫瘍および／または非癌性ヒト組織に比較してアップレギュレートした遺伝子発現に関して試験した。一定の実験において、同一の組織タイプ（同一の患者からのものが多い）の癌性ヒト腫瘍組織および非癌性ヒト腫瘍組織を得て、ＴＡＴポリペプチド発現に関して分析した。さらに、種々の異なるヒト腫瘍のうちのいずれかの癌性ヒト腫瘍組織を得て、肝臓、腎臓および肺などの上皮性出所の非癌性ヒト組織をプールすることによって調製した「ユニバーサル」上皮対照サンプルと比較した。プール上皮組織から単離されたｍＲＮＡは、種々の異なる上皮組織からの発現遺伝子産物の混合物となっており、そのため、上皮性出所の腫瘍における遺伝子発現レベルを定量的に比較するための優れた陰性対照を提供する。プール対照サンプルを用いたマイクロアレイハイブリダイゼーション実験により、２色分析における線形プロットが作出される。次いで、２色分析で作出された線の勾配を用いて、各実験内の比率（試験検出：対照検出）を正規化した。次いで、種々の実験からの正規化した比率を比較して、遺伝子発現のクラスタ化の同定に用いた。したがって、プール「ユニバーサル対照」サンプルによって、単純な２サンプル比較における有効な相対的遺伝子発現の判定が可能であるのみならず、いくつかの実験にわたる多サンプル比較も可能である。
本実験において、本明細書に記載されたＴＡＴポリペプチドをコードする核酸配列から誘導された核酸プローブをマイクロアレイの創製に用い、それに対するハイブリダイゼーションに、種々の腫瘍組織からのＲＮＡを用いた。正規化された比率：実験比率に基づいた値を、「カットオフ比」と称した。このカットオフ比以上の値のみを有意と判定した。各実験に関連したノイズまたはばらつきの量から比率の有意性を予測したが、腫瘍サンプル中における、対応する正常組織および／またはプール正常上皮ユニバーサル対照と比較して相対的に過剰発現した候補遺伝子を同定するために、典型的には、１．８倍〜２倍高いカットオフ比を用いた。この方法で、腫瘍サンプルにおいて相対的に過剰発現していると確認された遺伝子に関する比率は、２倍から４０倍、またはさらに大きく変動する。それに比較した、同一のＲＮＡを各々の色に標識し、それ自体にハイブリダイズさせた対照実験においては、バックグラウンド以上のシグナルを有する実際上全ての遺伝子に関して、観察された比率は、１．８倍をかなり下回る。このことから、１．８倍の比率以上の実験ノイズは、きわめて低いこと、および観察された１．８倍以上の倍数変化は有意であることが示され、分析されたサンプル間の発現における、実質的で検出可能で再現性を有する差異を表しており、比較されることが予測される。
本出願において配列番号：２で示されたＴＡＴ１１３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、正常なヒト結腸組織およびプール上皮対照サンプルの双方に比較した場合、試験された７５の独立したヒト結腸腫瘍サンプルの５０％超で有意に過剰発現する（すなわち、少なくとも２倍）ことが、これらの実験の結果により実証された。また、観察された過剰発現は、正常な対応ヒト結腸サンプルならびにプールヒト上皮結腸サンプルの双方に比較した場合、複数のヒト結腸腫瘍サンプルにわたって有意で、検出可能で、再現性を有することが、これらのデータにより実証されている。上記のとおり、本発明のＴＡＴ１１３ポリペプチド、およびコードする核酸は、ヒト結腸腫瘍の存在に関する診断的マーカーとして有用であるのみならず、ヒトにおけるこれらの腫瘍の治療に関する治療的標的の可能性のあるものとして役立つことを、これらのデータは実証している。
実施例３：ＴＡＴｍＲＮＡ発現の定量的分析
本アッセイにおいて、癌性腫瘍（１つまたは複数）における、他の癌性腫瘍または正常な非癌性組織に比較して有意に過剰発現する遺伝子を見出すために、５’ヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）およびリアルタイム定量的ＰＣＲ（例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｚｍ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、フォスターシティー、カリフォルニア州）を用いた。５’ヌクレアーゼアッセイ反応は、リアルタイムで遺伝子発現をモニターするためにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を利用する蛍光ＰＣＲベースの技法である。ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンを作出するために、２種のオリゴヌクレオチドプライマー（それらの配列は対象となっている遺伝子またはＥＳＴ配列に基づく）を用いる。２種のＰＣＲプライマー間に位置するヌクレオチド配列を検出するために第３のオリゴヌクレオチド、またはプローブがデザインされる。該プローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素により非伸長性であり、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素によって標識化される。２種の色素がプローブ上にある時に近接して位置している場合、レポーター色素からの任意のレーザー誘導発光が、消光色素によって消光される。ＰＣＲ増幅反応時、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレート依存様式でプローブを開裂する。得られたプローブ断片は溶液中に解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第２の蛍光体の消光作用を免れている。合成された新たな分子各々に対し、１分子のレポーター色素が遊離し、非消光レポーター色素の検出により、該データの定量的および定量的解釈の基礎が提供される。本アッセイは、当業界によく知られており、２種の異なるヒト組織サンプル間の遺伝子発現の差異を定量的に確認するために、ルーチンに使用されている。例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３−４１７頁（１９９２）；Ｌｉｖａｋら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．、４：３５７−３６２頁（１９９５）；Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：９８６−９９４頁（１９９６）；Ｐｅｎｎｉｃａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（２５）：１４７１７−１４７２２頁（１９９８）；Ｐｉｔｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３９６（６７１２）：６９９−７０３（１９９８）およびＢｉｅｃｈｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７８：６６１−６６６頁（１９９８）を参照されたい。
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００ＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎなどのリアルタイムの定量的ＰＣＲデバイス上で５’ヌクレアーゼの操作を行う。該システムは、サーモサイクラー、レーザー、チャージカプルドデバイス（ＣＣＤ）カメラおよびコンピュータからなる。該システムは、サーモサイクラー上の９６ウェル型式におけるサンプルを増幅する。増幅中に、レーザー誘導蛍光シグナルを９６ウェル全てに関して、光ファイバーケーブルによりリアルタイムで採取し、ＣＣＤで検出する。該システムには、機器の操作およびデータ解析のためのソフトウェアが含まれている。
選別のための出発物質は、種々の異なる癌性組織から単離したｍＲＮＡである。該ｍＲＮＡは、例えば蛍光分析により、正確に定量的化される。陰性対照として、試験されている癌性組織と同じ組織タイプの種々の正常組織からＲＮＡを単離した。多くの場合、腫瘍サンプル（１つまたは複数）は、同じ組織タイプの「対応した」正常サンプル（１つまたは複数）と直接比較され、これは、腫瘍サンプルと正常サンプル（１つまたは複数）が同一個体から得られていることを意味している。
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初、Ｃｔ、または閾値サイクルとして表される。これは、レポーターシグナルがバックグラウンドレベルの蛍光以上に蓄積するサイクルとして定義される。ΔＣｔ値は、癌のｍＲＮＡ結果を正常なヒトｍＲＮＡ結果と比較する場合に、核酸サンプルにおける特定標的配列の出発コピーの相対数の定量的測定値として用いられる。１Ｃｔ単位は、１ＰＣＲサイクルまたは正常に比較しておよそ２倍の相対的増加に相当し、２単位は、４倍の相対的増加、３単位は、８倍の相対的増加に相当するなど、２種以上の異なる組織間のｍＲＮＡ発現における相対的増加倍数を、定量的に、および定量的に測定することができる。この点で、このアッセイは、正常対照に比較してのヒト腫瘍サンプルにおけるｍＲＮＡ発現の少なくとも２倍の増加を、再現性を持って検出する上で技術的に十分感受性であることが、当業界で十分認められている。
この技法を用いて、異なるヒト組織ドナーからの正常なヒト結腸サンプルならびに腫瘍サンプル（１つまたは複数）を誘導した同一のヒト組織ドナーから誘導された種々の「対応した」正常なヒト結腸腫瘍サンプルの双方に比較した場合、９つの独立したヒト結腸腫瘍サンプルのうち９つ全てにおいて、本出願に配列番号：２で示されたＴＡＴ１１３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、有意に、および再現性を有して過剰発現する（すなわち、少なくとも２倍）と判定された。したがって、上記のとおり、本発明のＴＡＴ１１３ポリペプチド、およびコードする核酸は、ヒト結腸腫瘍の存在に関する診断的マーカーとして有用であるのみならず、ヒトにおけるこれらの腫瘍の治療に関する治療的標的の可能性のあるものとして役立つことを、これらのデータは実証している。
実施例４：インサイチュハイブリダイゼーション
インサイチュハイブリダイゼーションは、細胞または組織の調製物内の核酸配列の検出および位置確認のための強力な多目的技法である。それは、例えば、遺伝子の発現部位の確認、転写の組織分散の分析、ウィルス感染の確認および位置確認、特定のｍＲＮＡ合成における変化の追跡および染色体マッピングの補助に有用であり得る。
インサイチュハイブリダイゼーションは、ＰＣＲ作出３３Ｐ標識リボプローブを用い、ＬｕおよびＧｉｌｌｅｔｔ、Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ １：１６９−１７６頁（１９９４）によるプロトコルの最適化版に従って実施した。簡単に述べると、ホルマリン固定し、パラフィン埋め込みしたヒト組織を切片化し、脱パラフィン化し、プロテイナーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）中、３７℃で１５分間、除タンパクし、ＬｕおよびＧｉｌｌｅｔｔ、上記に記載されたとおり、インサイチュハイブリダイゼーションのためにさらに処理した。ＰＣＲ産物から、〔３３ −Ｐ〕ＵＴＰ標識アンチセンスリボプローブを作出し、５５℃で一晩ハイブリダイズした。該スライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２原子核乳剤中に浸漬し、４週間曝露した。
３３Ｐ−リボプローブの合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の３３Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢＦ １００２、ＳＡ＜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を高速真空乾燥した。乾燥３３Ｐ−ＵＴＰを含有する各試験管に、以下の成分を加えた：
２．０μｌ ５×転写緩衝液
１．０μｌ ＤＴＴ（１００ｍＭ）
２．０μｌ ＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ：１０μ：各１０ｍＭのＧＴＰ
ＣＴＰ＆ＡＴＰ＋１０μｌ Ｈ２Ｏ）
１．０μｌ ＵＴＰ（５０μＭ）
１．０μｌ Ｒｎａｓｉｎ
１．０μｌ ＤＮＡテンプレート（１μｇ）
１．０μｌ Ｈ２Ｏ
１．０μｌ ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＣＲ産物用、通常、Ｔ３＝ＡＳ、Ｔ７＝Ｓ）
該試験管を３７℃で１時間インキュベートした。１．０μｌのＲＱ１ ＤＮアーゼを加え、引き続き、３７℃で１５分間インキュベートした。９０μｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス ｐＨ７．６／１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を加え、混合物をピペットでＤＥ８１紙上に取った。残留溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外ろ過ユニットに装填し、プログラム１０を用いて回転させた（６分間）。該ろ過ユニットを第２の試験管上で反転させてプログラム２を用いて回転させた（３分間）。最後の回収回転後、１００μｌのＴＥを加えた。１μｌの最終産物をＤＥ８１紙上に取り、６ｍｌのＢｉｏｆｌｕｏｒ ＩＩ中でカウントした。
該プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で操作した。１〜３μｌのプローブまたは５μｌのＲＮＡ Ｍｒｋ ＩＩＩを、３μｌの充填緩衝液に加えた。９５℃のヒートブロック上で３分間加熱後、該プローブを直ちに氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシュし、サンプルを装填し、１８０〜２５０ボルトで４５分間操作した。該ゲルをサランラップでラップし、−７０℃の冷凍庫で１時間から一晩、増感スクリーンを有するＸＡＲフィルムに曝露した。
３３Ｐハイブリダイゼーション
Ａ．凍結切片の予備処理
該スライドを冷凍庫から取り出し、アルミニウムトレイ上に乗せ、室温で５分間解凍させた。該トレイを５５℃のインキュベーター内に５分間置いて、結露を減らした。該スライドを換気フード内の氷上で４％のパラホルムアルデヒド中、１０分間固定し、室温で５分間、０．５×ＳＳＣ中で洗浄した（２５ｍｌ ２０×ＳＳＣ＋９７５ｍｌＳＱ Ｈ２Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中、室温で５分間、徐タンパクし（２５０ｍｌの予備加温したＲＮアーゼ緩衝液中、１２．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ 貯蔵液）、該切片を、室温で０．５×ＳＳＣ中、１０分間洗浄した。該切片を７０％、９５％、１００％のエタノール中、各２分間、脱水した。
Ｂ． パラフィン埋め込み切片の予備処理
該スライドを脱パラフィンし、ＳＱ Ｈ２Ｏ中に入れ、室温で２×ＳＳＣ中、各５分間ずつ、２回すすいだ。該切片を、２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮアーゼを含まないＲＮアーゼ緩衝液中、５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ；３７℃、１５分間）−ヒト胚、または８×プロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲｎアーゼ緩衝液中１００μｌ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織中、徐タンパクした。引き続き、０．５×ＳＳＣ中でのすすぎおよび脱水を、上記のとおり実施した。
Ｃ． プレハイブリダイゼーション
Ｂｏｘバッファ（４×ＳＳＣ、５０％ホルムアルデヒド）で飽和させたフィルター紙で裏張りしたプラスチックボックス内に、該スライドを配置した。
Ｄ． ハイブリダイゼーション
１．０×１０６ｃｐｍのプローブおよびスライド１枚当たり１．０μｌのｔＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌ原液）を、９５℃で３分間加熱した。該スライドを氷上で冷却し、スライド１枚当たり４８μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を加えた。攪拌後、スライド上の５０μｌのプレハイブリダイゼーションに５０μｌの３３Ｐ混合物を加えた。該スライドを５５℃で一晩インキュベートした。
Ｅ． 洗浄
洗浄は、室温で、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡにより、２×１０分間（４００ｍｌの２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）行い、引き続き、３７℃で３０分間、ＲＮアーゼＡ処理（２５０ｍｌのＲＮアーゼ緩衝液中、５００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ＝２０μｇ／ｍｌ）を行った。該スライドを、室温で、２×ＳＳＣ、ＥＤＴＡにより、２×１０分間洗浄した。ストリンジェンシー洗浄条件は以下のとおりであった：５５℃で２時間、０．１×ＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌ ２０×ＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）。
Ｆ． オリゴヌクレオチド
本明細書に開示された種々のＤＮＡ配列について、インサイチュ分析を実施した。これらの分析のために用いられたオリゴヌクレオチドは、添付の図に示された核酸（またはそれらの相補体）に相補的になるように得られた。
Ｇ． 結果
本明細書に配列番号：２で示されたＴＡＴ１１３ポリペプチドをコードする核酸について、インサイチュハイブリダイゼーション分析を実施した。分析した１０／２２の独立した原発性ヒト結腸癌サンプルおよび６／９の独立した転移性結腸癌サンプルにおいて、ＴＡＴ１１３遺伝子の強力な発現が、これらの分析結果によって示された。反対に、分析した全ての正常な結腸組織サンプルにおいては、ＴＡＴ１１３の検出可能な発現は見られなかった（または、見られた発現は著しく低いものだった）。
実施例５：ＧＥＰＩＳによる差異的ＴＡＴポリペプチド発現の検証および解析
上記の実施例の１つまたは複数に記載された腫瘍抗原として同定できたと考えられるＴＡＴポリペプチドを、以下のとおり解析し、検証した。表された配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、パロアルト、カリフォルニア州）を探索し、対象となるＥＳＴ配列をＧＥＰＩＳにより同定した。インシリコ遺伝子発現プロファイリング（ＧＥＰＩＳ）は、新規の癌治療標的に関して対象となっている遺伝子を特性化する、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社で開発されたバイオインフォーマティックス手段である。ＧＥＰＩＳは、遺伝子発現プロフィル判定のために大量のＥＳＴ配列およびライブラリー情報を利用する。ＧＥＰＩＳは、ＥＳＴデータベースにおける発生数とのその比例的関連に基づいた遺伝子の発現プロフィルを判定することができ、それは、ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）ＥＳＴの合理的なデータベースおよびＧｅｎｅｎｔｅｃｈの所有権を有する情報を、ストリンジェントで統計的に有意味の方法に組み込むことによって働く。本実施例で、ＧＥＰＩＳは、新規な腫瘍抗原を同定し交差検証するために用いられるが、ＧＥＰＩＳは、きわめて特異的な分析または広範なスクリーニング作業のいずれかを実施するために構成することができる。最初のスクリーンで、ＧＥＰＩＳは、特定の組織または対象となっている組織（対象となっている腫瘍組織であることが多い）における発現に関連するＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベースからのＥＳＴ配列を同定するために用いられる。次いで、この最初のスクリーンで同定されたＥＳＴ配列（または最初のスクリーンから得られた複数の関連し、重なっているＥＳＴ配列をアラインさせることから得られたコンセンサス配列）を、コードされたタンパク質における少なくとも１つの膜貫通ドメインの存在を確認することを目的としたスクリーンに供した。最後に、対象となっている種々の配列に関する完全な組織発現プロフィルを作出するためにＧＥＰＩＳを使用した。このタイプのスクリーニングバイオインフォーマティックスを用い、種々のＴＡＴポリペプチド（およびそれらをコードする核酸分子）が、特定のタイプの癌または一定の癌で、他の癌および／または正常な癌性組織に比較して有意に過剰発現していると確認された。ＧＥＰＩＳの適合の評価は、例えば、組織特異性、腫瘍特異性および正常な基本的および／または正常な増殖性組織における発現レベルなどのいくつかの基準に基づく。
上記のＧＥＰＩＳ発現解析を用いて、本明細書において配列番号：２で示されたＴＡＴ１１３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ヒト結腸腫瘍サンプルにおいて、対応する正常な結腸組織に比較して、有意に、再現性を有して、検出可能に過剰発現すると判定された。したがって、本明細書において配列番号：２で示されたＴＡＴ１１３ポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードする核酸は、種々の哺乳動物組織サンプルにおける、本明細書において配列番号：２で示されたＴＡＴ１１３ポリペプチド、およびそれをコードするｍＲＮＡの発現レベルを定量的および定量的に判定するために利用できる優れた標的であり、そのことによって、それらの間の定量的および定量的比較を行うことを可能にする。したがって、本明細書において配列番号：２で示されたＴＡＴ１１３ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードする核酸は、哺乳動物における腫瘍の診断に利用できる優れた標的である。さらに、ＴＡＴ１１３ポリペプチドが、一定のヒト腫瘍において、それらの対応する正常なヒト組織に比較して、有意に、再現性を有して、検出可能に過剰発現することが、この解析によって実証されているため、ＴＡＴ１１３ポリペプチドは、哺乳動物におけるこのような腫瘍の治療的処置のために利用できる優れた標的として役立つ。
実施例６．ＴＡＴ１１３に結合する抗体の調製
モノクローナル抗体を作製する技法は当業界に知られており、例えば、上記、Ｇｏｄｉｎｇに記載されている。使用できる免疫原としては、精製ＴＡＴポリペプチド、ＴＡＴポリペプチドを含有する融合タンパク質、および細胞表面上に組換えＴＡＴポリペプチドを発現する細胞が挙げられる。免疫原の選択は、過剰な実験なしに、当業者により行うことができる。
Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスを、フロインド完全アジュバント中に乳化させたＴＡＴ免疫原により免疫化し、１〜１００マイクログラムの量で、比較してまたは腹腔内に注射する。代替として、該免疫原を、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｃｈ、ハミルトン、モンタナ州）中に乳化させ、動物の後足裏に注射する。次いで、免疫化したマウスを、１０日から１２日後に、選択されたアジュバント中に乳化させた追加免疫原によってブーストする。該マウスはまた、その後数週間、さらなる免疫化注射によってブーストすることができる。抗ＴＡＴ抗体を検出する目的で、ＥＬＩＳＡアッセイにおける試験用に、該マウスから血清サンプルを逆眼窩放血により定期的に得ることができる。
好適な抗体力価の検出後、抗体に「陽性」な動物に、ＴＡＴの最終静脈内注射をすることができる。３日から４日後、該マウスを殺処置し、脾臓細胞を採取する。次いで、該脾臓細胞をＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ １５９７から入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１などの選択されたマウス骨髄腫細胞系に融合させる（３５％ポリエチレングリコールを用いて）。融合により、ハイブリドーマが細胞が作出され、次いでこれらを、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの」増殖を阻害するためにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）培地を含有する９６ウェルの組織培養プレートに平板培養できる。
ハイブリドーマ細胞を、ＴＡＴに対する反応性に関してＥＬＩＳＡ中でスクリーンする。ＴＡＴに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の判定は、当業技術の範囲内にある。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、抗ＴＡＴモノクローナル抗体を含有する腹水を産生させることができる。あるいは、該ハイブリドーマ細胞を組織培養フラスコまたはローラーボトル内で増殖させることができる。腹水中に産生されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、引き続いて、ゲル排除クロマトグラフィを用いて達成できる。あるいは、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｃに対する抗体の結合に基づいたアフィニティークロマトグラフィーが使用できる。
上記の技法を用いて、各々が配列番号：２で示されたＴＡＴ１１３ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する、１２の別個の異なるハイブリドーマ細胞系が作出された。これらの１２のハイブリドーマ細胞系は、本明細書で、１２Ｅ５．１．１（モノクローナル抗体１２Ｅ５を産生）、６Ｇ１０．１．１（モノクローナル抗体６Ｇ１０を産生）、１７Ｃ１２．７．８（モノクローナル抗体１７Ｃ１２を産生）、１Ｂ５．１．３（モノクローナル抗体１Ｂ５を産生）、６Ｈ１０．３．１１（モノクローナル抗体６Ｈ１０を産生）、１７Ｈ５．２５．１（モノクローナル抗体１７Ｈ５を産生）、１５Ｂ６．４．１（モノクローナル抗体１５Ｂ６を産生）、１１Ａ１２．３．２（モノクローナル抗体１１Ａ１２を産生）、１３Ａ７．１．８（モノクローナル抗体１３Ａ７を産生）、４Ｄ１．１．２．１（モノクローナル抗体４Ｄ１を産生）、１４Ａ３．１．１（モノクローナル抗体１４Ａ３を産生）および１０Ｆ１１．１１．１１．１１（モノクローナル抗体１０Ｆ１１を産生）と称される。これらの１２のハイブリドーマ系によって産生されたモノクローナル抗体は、ＴＡＴ１１３ポリペプチドを発現する細胞のウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ分析、ＦＡＣＳ選別分析および／または免疫組織化学的分析などの周知の、ルーティンに使用される技法を用いて、配列番号：２で示されるＴＡＴ１１３ポリペプチドに結合することが示された。機能的抗ＴＡＴ１１３モノクローナル抗体を産生する１２のハイブリドーマ系のうち、２つ（ハイブリドーマクローン１２Ｅ５．１．１および６Ｇ１０．１．１）が、下記に詳述されているとおり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州とのブダペスト条約により寄託された。
実施例７：競合的結合分析およびエピトープマッピング
記載されたモノクローナル抗体によって結合したＴＡＴ１１３エピトープを、標準的な競合的結合分析（Ｆｅｎｄｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：１５５０−１５５８頁（１９９０））によって判定した。蛍光を定量化するために、ＰＡＮＤＥＸ（商標）Ｓｃｒｅｅｎ Ｍａｃｈｉｎｅを用いて、ＴＡＴ１１３を発現するように操作した完全ＰＣ３細胞に対する直接蛍光により交叉ブロッキング試験を抗体に実施した。確立された操作を用いて、各モノクローナル抗体をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合させた（Ｗｏｆｓｙら、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８７頁、ＭｉｓｈｅｌおよびＳｃｈｉｉｇｉ（編）、サンフランシスコ：Ｗ．Ｊ．Ｆｒｅｅｍａｎ社（１９８０））。ＴＡＴ１１３発現ＰＣ３細胞の集密単層をトリプシン化し、１回洗浄し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％ＮａＮ３を含有する冷ＰＢＳ中、１．７５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁させた。ＰＡＮＤＥＸ（商標）プレート膜の目詰まりを減少させるために、最終濃度１％のラテックス粒子（ＩＤＣ、ポートランド、オレゴン州）を加えた。懸濁液中の細胞、２０μｌ、および２０μｌの精製モノクローナル抗体（１００μｇ／ｍｌから０．１μｇ／ｍｌ）を、ＰＡＮＤＥＸ（商標）プレートウェルに加え、氷上で３０分間インキュベートした。２０μｌ中、ＦＩＴＣ標識モノクローナル抗体の予め測定された希釈液を各ウェルに加え、３０分間インキュベートし、洗浄し、ＰＡＮＤＥＸ（商標）Ｓｃｒｅｅｎ Ｍａｃｈｉｎｅにより、蛍光を定量化した。各々が他の結合を、無関連のモノクローナル抗体対照に比較して、同じ抗体濃度で、４０％以上阻止するならば、モノクローナル抗体はエピトープを共有していると考えられた。本実験において、モノクローナル抗体１２Ｅ５、１７Ｃ１２、１Ｂ５、６Ｈ１０、１７Ｈ５、１５Ｂ６、１１Ａ１２、１３Ａ７、４Ｄ１、１４Ａ３および１０Ｆ１１は、それぞれ、ＴＡＴ１１３エピトープＢ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｂ、Ａ、Ａ、ＡおよびＣに帰属された。このアッセイを用いて、通常の当業者は、上記のものと同一のエピトープに結合する他のモノクローナル抗体を同定することができる。
実施例８：ＴＡＴ１１３に結合する毒素結合抗体の調製
細胞毒性または細胞増殖抑制性の薬剤、すなわち、癌の治療において、腫瘍細胞を殺す、または阻害する薬剤の局所送達のために、抗体−薬剤複合体（ＡＤＣ）、すなわち、免疫複合体の使用（Ｐａｙｎｅ（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７−２１２頁；ＳｙｒｉｇｏｓおよびＥｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：６０５−６１４頁；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−ＤｕｖａｚおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２頁；米国特許第４，９７５，２７８号）は、腫瘍への薬剤部分の標的送達、および腫瘍中の細胞内蓄積を可能にするが、これらの非結合薬剤の全身投与は、排除しようとしている腫瘍細胞と同様に、正常な細胞に対して許容できないレベルの毒性をもたらし得る（Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ（１９８６年３月１５日）６０３−０５頁；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １９８４年：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁におけるＴｈｏｒｐｅ、（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」）。最小の毒性での最大の効力は前記のものによって求められる。ＡＤＣをデザインし、精製する努力は、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の選択性ならびに薬剤結合性および薬剤放出性に焦点を当ててきた。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の双方がこれらの戦略に有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２１：１８３−８７頁）。これらの方法に用いられる薬剤としては、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびビンデシン（Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６）上記）が挙げられる。抗体−毒素複合体に用いられる毒素としては、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの小型分子毒素（Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｊ．ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１頁；Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１０２５−１０２８頁；Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１頁）、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（欧州特許第１３９１２１３号；Ｌｉｕら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３頁）、およびカリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）（Ｌｏｄｅら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：２９２８頁；Ｈｉｎｍａｎら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２頁）が挙げられる。
精製抗体への毒素の結合による抗体−薬剤複合体を作製するための技法は、当業界に十分知られており、ルーチンに用いられている。例えば、毒素ＤＭ１に対する精製モノクローナル抗体の結合は以下のとおり達成できる。ジチオピリジル基を導入するために、精製抗体を、Ｎ−スクシニミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエートにより誘導体化する。ＮａＣｌ（５０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含有する５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）の４４．７ｍｌ中の抗体（３７６．０ｍｇ、８ｍｇ／ｍＬ）を、ＳＰＰ（２．３ｍｌのエタノール中、５．３モル当量）で処理する。周囲温度でアルゴン下、９０分間のインキュベーション後、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのＥＤＴＡによって平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを通して、該反応混合物をゲルろ過する。次いで、フラクションを含有する抗体をプールしアッセイする。抗体−ＳＰＰ−Ｐｙ（放出可能な２−チオピリジン基を有する３３７．０ｍｇ）を、上記の３５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、により、２．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈する。次に、３．０ｍＭのジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、最終反応混合物中、３％ｖ／ｖ）中、ＤＭ１（１．７当量、１６．１モル）を抗体溶液に加える。アルゴン下、周囲温度で２０時間、反応を進行させる。３５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５により平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ゲルろ過カラム（５．０ｃｍ×９０．０ｃｍ、１．７７Ｌ）上に該反応物を装填する。流速は５．０ｍｌ／分で、６５の（各２０．０ｍｌ）フラクションを回収した。フラクションをプールし、アッセイし、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、抗体分子１個当たりに結合したＤＭ１薬剤分子の数（ｐ’）を判定する。
例示を目的として、毒素ＤＭ１に対する精製モノクローナル抗体の結合はまた、以下のとおり達成することもできる。ＳＭＣＣリンカーを導入するために、精製抗体を、（スクシニミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）により誘導体化する。５０ｍＭのリン酸カリウム／５０ｍＭの塩化ナトリウム／２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中、２０ｍｇ／ｍｌでの抗体を、７．５モル当量のＳＭＣＣ（ＤＭＳＯ中、２０ｍＭ、６．７ｍｇ／ｍｌ）により処理する。アルゴン下、周囲温度で２時間攪拌後、該反応混合物を、５０ｍＭのリン酸カリウム／５０ｍＭの塩化ナトリウム／２ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ６．５により平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを通してろ過する。フラクションを含有する抗体をプールし、アッセイする。次いで、抗体−ＳＭＣＣを、５０ｍＭのリン酸カリウム／５０ｍＭの塩化ナトリウム／２ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ６．５により、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈し、ジメチルアセトアミド中、ＤＦＭ１（５ＳＭＣＣ／抗体想定の１．７当量、７．３７ｍｇ／ｍｌ）の１０ｍＭ溶液と反応させる。該反応物をアルゴン下、周囲温度で１６．５時間攪拌する。次いで、ｐＨ６．５の１×ＰＢＳにより、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲルろ過カラム（１．５×４．９ｃｍ）を通して、該結合反応混合物をろ過する。次に、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度により、ＤＭ１／抗体比（ｐ）を測定する。
細胞毒性剤は、典型的に、抗体のしばしば多数であるリシン残基を介して抗体に結合している。対象の抗体に存在するか、または操作して入れたチオール基を介した結合もまた達成されている。例えば、リガンドに対する共有結合部位を形成するために遺伝子操作法によって、システイン残基がタンパク質内に導入されている（Ｂｅｔｔｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１３：９６４４−９６５０頁；Ｂｅｒｎｈａｒｄら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１２６−１３２頁；Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら（１９９４）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １：２４７−２５５頁；Ｔｕら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：４８６２−４８６７頁；Ｋａｎｎｏら（２０００）Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７６：２０７−２１４頁；Ｃｈｍｕｒａら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８（１５）：８４８０−８４８４頁；米国特許第６，２４８，５６４号）。遊離のシステイン残基が対象の抗体に存在すると、毒素はその部位に結合することができる。例えば、薬剤リンカー試薬、ＤＭＳＯ中に溶解させた、マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、すなわち、ＭＣ−ＭＭＡＥ、マレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、すなわち、ＭＣ−ＭＭＡＦ、ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥまたはＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを、アセトニトリルおよび水の中に既知濃度で希釈し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の冷システイン誘導体化抗体に加える。約１時間後、過剰のマレイミドを加えて反応をクエンチし、未反応の抗体チオール基をキャップする。該反応混合物を、遠心分離限外ろ過により濃縮し、毒素結合抗体を、ＰＢＳ中Ｇ２５樹脂を通した溶出により精製、脱塩し、滅菌条件下、０．２ｍフィルターを通してろ過し、保存のため凍結する。
さらに、選択抗体上の遊離システインを、ビスマレイミド試薬、ＢＭ（ＰＥＯ）４（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）によって修飾して、抗体の表面上の未反応マレイミド基を残すことができる。これは、５０％エタノール／水混合液中に１０ｍＭの濃度までＢＭ（ＰＥＯ）４を溶解させ、リン酸緩衝生理食塩水中におよそ１．６ｍｇ／ｍｌ（１０ミクロモル）の濃度で抗体を含有する溶液に１０倍モル過剰を加え、１時間反応させることによって達成できる。１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液を有する３０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６中、ゲルろ過によって、過剰なＢＭ（ＰＥＯ）４を除去する。およそ１０倍モル過剰のＤＭ１をジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中に溶解し、抗体−ＢＭＰＥＯ中間体に加える。薬剤部分試薬を溶解させるために、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）もまた使用できる。該反応混合物を一晩反応させてから、ＰＢＳ中にゲルろ過または透析をして、未反応の薬剤を除去する。ＰＢＳ中Ｓ２００カラム上でのゲルろ過を用いて、高分子量の凝集物を除去し、精製された抗体−ＢＭＰＥＯ−ＤＭ１複合体を得る。
本明細書および他に記載された周知のルーチンに使用される技法を用いて、抗ＴＡＴ１１３モノクローナル抗体１２Ｅ５（上記実施例６に記載されたとおりに調製され、下記に記載されるＡＴＣＣにより寄託されている）を、ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥに結合させた。
実施例９：インビトロ細胞死アッセイ
対象のＴＡＴポリペプチドを発現する哺乳動物細胞は、標準的な発現ベクターおよびクローニング法によって得ることができる。あるいは、対象のＴＡＴポリペプチドを発現する多くの腫瘍細胞系が、例えばＡＴＣＣを介して公共的に入手でき、標準的なＥＬＩＳＡ分析またはＦＡＣＳ分析を用いてルーチンに同定できる。次いで、インビトロでＴＡＴポリペプチド発現細胞を死滅させる抗体の能力を判定するために、抗ＴＡＴポリペプチドモノクローナル抗体（およびその毒素結合誘導体）をアッセイに使用できる。
特に本発明に関して、細胞表面上にＴＡＴ１１３ポリペプチドを安定して発現するＰＣ３由来の細胞系（本明細書でＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰと称される）を標準的技法を用いて操作して、ＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞によるＴＡＴ１１３ポリペプチドの発現を、標準的なＦＡＣＳ細胞選別、ＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学的分析を用いて確認した。ＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞を死滅させるＭＭＡＥ化合物モノクローナル抗体１２Ｅ５−ＭＭＡＥの能力を、以下のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＴＢ２８８；Ｍｅｎｄｏｚａら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：５４８５−５４８８頁）を使用するインビトロ細胞死アッセイを用いて判定した：
１．増殖培地中、約１０４細胞（ＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞またはＴＡＴ１１３を発現しない非トランスフェクトＰＣ３細胞）を含有する細胞培養物の５０μｌのアリコートを９６ウェルの不透明壁プレートの各ウェルに置く。さらに、細胞なしの増殖培地５０μｌを含有する対照ウェルを準備する。
２．抗体１２Ｅ５−ＭＭＡＥまたはＴＡＴ１１３に結合しないＭＭＡＥ結合抗インターロイキン−８モノクローナル抗体を５０μｌの容量、および０．０００１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度で各ウェルに加え、該プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３〜５日間インキュベートする。
３．該プレートを、およそ３０分間室温に平衡化する。
４．各ウェルに存在する細胞培養培地の容量に等しい容量の、Ｐｒｏｍｅｇａ社からのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔを加え、プレートをオービタルシェイカー上で２分間振とうさせ、細胞溶解物を誘導する。
５．該プレートを室温で１０分間インキュベートし、発光シグナルをを安定化させる。
６．ＲＬＵ＝相対発光単位として報告されるＴｒｏｐｉｘ Ｗｉｎｇｌｏｗ Ｐｒｏｇｒａｍａｎｄにより、ルミノメータ上で発光を記録する。
上記のアッセイから得られた結果は、１２Ｅ５−ＭＭＡＥ抗体は、抗体依存様式で、ＴＡＴ１１３ポリペプチド発現細胞の死を誘導できることを実証している。より具体的には、１２Ｅ５−ＭＭＡＥ抗体も、ＩＬ−８−ＭＭＡＥ抗体も１μｇ／ｍｌ以下の抗体濃度では、非トランスフェクトＰＣ３細胞の有意な死を誘導しない。１μｇ／ｍｌ以上の抗体濃度では、非トランスフェクトＰＣ３細胞の死滅量は、抗体濃度と共に直線的に増加し、それは抗体に独立した様式である。したがって、１μｇ／ｍｌ以上の抗体濃度における非トランスフェクトＰＣ３細胞の死は、反応混合物中に存在するＭＭＡＥ毒素の増加濃度の非特定的な結果であり、使用される抗体の結合特異性の関数ではないと考えられる。しかし、ＴＡＴ１１３ポリペプチドを安定して発現するＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞に関して、ＩＬ−８−ＭＭＡＥは、非トランスフェクトＰＣ３細胞を死滅させるその抗体の能力と同じパターンを有する細胞死を誘導するが、１２Ｅ５−ＭＭＡＥは、０．００１μｇ／ｍｌという低い抗体濃度で有意な細胞死を誘導する。実際、１μｇ／ｍｌの抗体濃度（この濃度で、非ＴＡＴ１１３特異的ＩＬ−８−ＭＭＡＥ抗体は有意な細胞死を示さない）で、事実上全てのＰＣ３−ｇＤ−ＭＤＰ細胞が、１２Ｅ５−ＭＭＡＥによって死滅する。このように、これらのデータは、モノクローナル抗体１２Ｅ５は、細胞の表面に発現しているＴＡＴ１１３ポリペプチドに結合し、結合しているそれらの細胞の死を誘導できることを実証している。
第２の実験において、インビトロで結腸癌由来ＣＯＬＯ２０５細胞（出願者がＦＡＣＳ細胞選別分析により、ＴＡＴ１１３ポリペプチドを発現することを示した細胞）を死滅させるモノクローナル抗体１２Ｅ５−ＭＭＡＥの能力を判定するために、上記のアッセイを使用した。ＰＣ３由来細胞系に関して上記に提示された結果に一致して、ＩＬ−８−ＭＭＡＥは約１μｇ／ｍｌ以上の抗体濃度になるまで、有意なＣＯＬＯ２０５細胞死を示し始めることなく、この細胞死のレベルは、抗体濃度と共に直線的に増加し、および抗体に独立した様式である。しかし、モノクローナル抗体１２Ｅ５−ＭＭＡＥは、約０．１μｇ／ｍｌという低い抗体濃度で有意なＣＯＬＯ２０５細胞死を誘導し始める。実際、１μｇ／ｍｌの抗体濃度（この濃度で、非ＴＡＴ１１３特異的ＩＬ−８−ＭＭＡＥ抗体は有意な細胞死を示さない）で、きわめて著しいレベルの１２Ｅ５−ＭＭＡＥ誘導ＣＯＬＯ２０５細胞死が見られる。このように、これらのデータもまた、モノクローナル抗体１２Ｅ５は、細胞の表面に発現しているＴＡＴ１１３ポリペプチドに結合し、結合しているそれらの細胞の死を誘導できることを実証している。
実施例１０：インビボ腫瘍細胞死アッセイ
インビボで腫瘍細胞の死を誘導する能力に関して、毒素結合または非結合の抗ＴＡＴポリペプチドモノクローナル抗体の有効性を試験するために、以下のプロトコルを使用できる。
無胸腺ヌードマウスの一群に、５×１０６のＴＡＴポリペプチド発現腫瘍促進細胞を、脇腹に皮下接種する。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３間の平均腫瘍容量に達したら、該マウスを５群に等しく分け、以下のとおり処置した：
第１群−１週に１回、４週間、ＰＢＳ対照媒体を投与；
第２群−１週に１回、４週間、１ｍｇ／ｋｇで非特異的対照抗体を投与；
第３群−１週に１回、４週間、３ｍｇ／ｋｇで非特異的対照抗体を投与；
第４群−１週に１回、４週間、１ｍｇ／ｋｇで特異的抗ＴＡＴポリペプチド抗体を投与；
第５群−１週に１回、４週間、３ｍｇ／ｋｇで特異的抗ＴＡＴポリペプチド抗体を投与。
次いで、定期的間隔で書く処置群のマウスにおける平均腫瘍容量を判定し、抗体の有効性を判定できる。
実施例１１：ハイブリダイゼーションプローブとしてのＴＡＴの使用
以下の方法では、ハイブリダイゼーションプローブとして、すなわち、哺乳動物における腫瘍の存在の診断のための、ＴＡＴをコードするヌクレオチド配列の使用を記載する。
本明細書に開示されている完全長または成熟ＴＡＴのコード配列を含むＤＮＡはまた、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリーまたはヒト組織ゲノムライブラリーにおける相同性ＤＮＡ（ＴＡＴの天然変異体をコードするものなど）をスクリーンするプローブとしても使用できる。
いずれかのライブラリーのＤＮＡを含有するフィルターのハイブリダイゼーションおよび洗浄は、以下の高ストリンジェンシー条件下で実施される。該フィルターに対する放射性標識ＴＡＴ誘導プローブのハイブリダイゼーションを、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２×デンハート液、および１０％の硫酸デキストラン中、４２℃で２０時間実施する。該フィルターの洗浄は、０．１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳの水性溶液中、４２℃で実施する。
次いで、完全長天然配列ＴＡＴをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡを、当業界に知られている標準的な技法を用いて同定することができる。
実施例１２：大腸菌におけるＴＡＴの発現
本実施例では、大腸菌における組換え発現によるＴＡＴの非グリコシル化形態の調製を例示する。
先ず、ＴＡＴをコードするＤＮＡ配列を、選択されたＰＣＲプライマーを用いて増幅する。該プライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含有する必要がある。種々の発現ベクターを使用することができる。好適なベクターの一例は、アンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を含有するｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ、２：９５（１９７７）を参照）である。該ベクターは制限酵素によって消化され、脱リン酸化される。次いで、ＰＣＲ増幅配列をベクター内に結合させる。該ベクターは、抗生物質耐性遺伝子をコードする配列、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、およびエンテロキナーゼ開裂部位を含む）、ＴＡＴコード領域、ラムダ転写ターミネーター、およびａｒｇＵ遺伝子を含むことが好ましい。
次いで、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記に記載された方法を用い、該結合混合物を使用して選択された大腸菌株を形質転換する。ＬＢプレート上で増殖する能力により形質転換体を同定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析およびＤＮＡ配列決定により確認することができる。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培養培地中で一晩増殖できる。この一晩の培養物を、引き続き大規模培養の接種に使用できる。次いで該細胞を所望の視覚密度まで増殖させるが、その間に発現プロモーターが働く。
該細胞をさらに数時間培養した後、該細胞を遠心分離により採取する。遠心分離により得られた細胞ペレットは、当業界に知られている種々の薬剤を用いて可溶化でき、次いで可溶化したＴＡＴタンパク質は、該タンパク質の緊密な結合を可能にする条件下、金属キレート化カラムを用いて精製することができる。
以下の操作を用いて、ＴＡＴを、ポリ−Ｈｉｓタグ化形態で、大腸菌において発現させることができる。先ず、選択されたＰＣＲプライマーを用いて、ＴＡＴをコードするＤＮＡを増幅する。該プライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位、ならびに、効率的で信頼性を有する翻訳開始、金属キレート化カラム上での迅速な精製、およびエンテロキナーゼによるタンパク質分解性除去を提供する他の有用な配列を含有する。次いで、ＰＣＲ増幅、ポリＨｉｓタグ化配列を、５２（Ｗ３１１０ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ）ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ）株に基づいた宿主大腸菌を形質転換するために用いられる発現ベクター内に結合する。先ず、形質転換体を、５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振とうしながら、３〜５のＯ．Ｄ．６００になるまで増殖させる。次いで、培養物をＣＲＡＰ培地（５００ｍＬの水中、３．５７ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦ、ならびに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコースおよび７ｍＭのＭｇＳＯ４を混合することにより調製）中に５０〜１００倍に希釈し、３０℃で振とうしながらおよそ２０〜３０時間増殖させる。サンプルを取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により発現を検証し、バルク培養物を遠心分離して、細胞をペレット化する。精製およびリフォールディングまで、細胞ペレットを凍結させる。
０．５Ｌから１Ｌの発酵物（６〜１０ｇのペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８緩衝液中、１０容量（ｗ／ｖ）に再懸濁させる。固体亜硫酸ナトリウムおよびテトラチオン酸ナトリウムを加えて、最終濃度をそれぞれ、０．１Ｍおよび０．０２Ｍにし、該溶液を４℃で一晩攪拌する。このステップにより、全てのシステイン残基が亜硫酸化によりブロックされて、タンパク質の変性がもたらされる。該溶液を、Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心分離機において、４０，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離する。上澄み液を３〜５容量の金属キレートカラム緩衝液（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）により希釈し、０．２２ミクロンのフィルターを通してろ過し、清澄化する。清澄化した抽出物を、金属キレートカラム緩衝液で平衡化した５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに充填する。該カラムを、５０ｍＭのイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ウトロール（Ｕｔｒｏｌ）グレード）、ｐＨ７．４を含有する追加緩衝液により洗浄する。該タンパク質は、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液により溶出する。所望のタンパク質を含有するフラクションをプールし、４℃で保存する。タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて算出された吸光係数を用い、２８０ｎｍにおける吸光度により予測する。
２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシンおよび１ｍＭのＥＤＴＡから構成された、新鮮調製リフォールディング緩衝液内に、該サンプルを徐々に希釈することによって、該タンパク質をリフォールドする。最終タンパク質濃度が、５０マイクログラム／ｍｌから１００マイクログラム／ｍｌの間になるように、リフォールディング容量を選択する。リフォールディング溶液を、４℃で１２〜３６時間、静かに攪拌する。０．４％（ｐＨおよそ３）の最終濃度にＴＦＡを添加することによって、リフォールディング反応をクウェンチする。該タンパク質をさらに精製する前に、０．２２ミクロンのフィルターを通して該溶液をろ過し、アセトニトリルを、２〜１０％の最終濃度まで添加する。０．１％ＴＦＡの移動性緩衝液を用い、１０％から８０％のアセトニトリル勾配での溶出により、リフォールドされたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラム上でクロマトグラフィにかける。Ａ２８０吸光度を有するフラクションのアリコートを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分析し、均一なリフォールドタンパク質を含有するフラクションをプールする。一般に、大抵のタンパク質の適切にリフォールドされた種は、最もコンパクトであり、それらの疎水性内部が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているため、最も低い濃度のアセトニトリルで溶出する。凝集した種は、通常、より高いアセトニトリル濃度で溶出する。逆相ステップは、所望の形態から誤ってリフォールドされた形態のタンパク質を分離することに加えて、サンプルから内毒素も除去する。
所望のフォールドＴＡＴポリペプチドを含有するフラクションをプールし、該溶液に向けた窒素の緩流を用いてアセトニトリルを除去する。タンパク質を、０．１４Ｍの塩化ナトリウムおよび４％のマンニトールと共に２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８中に、透析により、または処置緩衝液中で平衡化したＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂を用いたゲルろ過により処置し、滅菌ろ過する。
実施例１３：哺乳動物におけるＴＡＴの発現
本実施例では、哺乳動物細胞における組換え発現によるＴＡＴのグリコシル化形態の可能性のあるものの調製を例示する。
ベクター、ｐＲＫ５（１９８９年３月１５日公開の欧州特許第３０７，２４７号を参照）を、発現ベクターとして用いる。任意に、ＴＡＴ ＤＮＡを、選択された制限酵素によりｐＲＫ５内に結合し、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、に記載された結合方法などを用いて、ＴＡＴ ＤＮＡの挿入を可能にする。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ＴＡＴと称される。
一実施形態において、選択された宿主細胞は２９３細胞であり得る。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）を、ウシ胎仔血清および任意に、栄養成分および／または抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートに集密になるまで増殖させる。約１０μｇのｐＲＫ５−ＴＡＴＤＮＡを、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするや１μｇのＤＮＡと混合し〔Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら、Ｃｅｌｌ、３１：５４３頁（１９８２）〕、５００μｌの１ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２２７ＭのＣａＣｌ２に溶解させる。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を滴下して加え、２５℃で１０分間、沈殿を形成させる。沈殿物を懸濁させ、２９３細胞に加え、３７℃で約４時間、沈降させる。該培養培地を吸引除去し、ＰＢＳ中、２ｍｌの２０％グリセロールを３０秒間加える。次いで、該２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮培地を加えて、該細胞を約５日間インキュベートする。
トランスフェクションのおよそ２４時間後、該培養培地を除去し、培養培地（単独）または２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−システインおよび２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを含有する培養培地により置換する。１２時間のインキュベーション後、馴化培地を採取し、スピンフィルター上で濃縮し、１５％ＳＤＳゲル上に充填する。処理したゲルを乾燥し、選択された時間、フィルムに曝露し、ＴＡＴポリペプチドの存在を明らかにすることができる。トランスフェクトした細胞を含有する培養物をさらにインキュベーション（無血清培地中）して、該培地を、選択されたバイオアッセイにおいて試験することができる。
代替技法において、ＴＡＴを、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１２：７５７５頁（１９８１）に記載された硫酸デキスオラン法を用いて２９３細胞内に一時的に導入できる。２９３細胞を、スピナーフラスコ内で最高密度まで増殖させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＴＡＴ ＤＮＡを加える。該細胞を先ず、遠心分離によりスピナーフラスコから濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を、細胞ペレット上で４時間インキュベートする。該細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌのウシインスリンおよび０．１μｇ／ｍｌのウシトランスフェリンを含有するスピナーフラスコ内へ再導入する。約４日後、該馴化培地を遠心分離し、ろ過して、細胞およびデブリを除去する。次いで、発現ＴＡＴを含有するサンプルを濃縮し、透析および／またはカラムクロマトグラフィーなどの任意の選択された方法により精製することができる。
他の実施形態において、ＴＡＴをＣＨＯ細胞内に発現させることができる。ｐＲＫ５−ＴＡＴを、ＣａＰＯ４またはＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞内にトランスフェクトできる。上記のとおり、該細胞培養物をインキュベートし、該培地を、培養培地（単独）または３５Ｓ−メチオニンなどの放射性標識を含有する培地により置換することができる。ＴＡＴポリペプチドの存在を判定後、培養培地を、無血清培地により置換できる。好ましくは、外培養物は約６日間インキュベートし、次いで、該馴化培地を採取する。次いで、発現ＴＡＴを含有する培地を濃縮し、任意の選択された方法により精製することができる。
エピトープ−タグ化ＴＡＴもまた、宿主のＣＨＯ細胞内に発現させることができる。ＴＡＴは、ｐＲＫ５ベクターからサブクローン化できる。サブクローン挿入体はＰＣＲを受けて、フレーム内に、ポリ−ｈｉｓタグなどの選択されたエピトープタグと、バキュロウィルス発現ベクター内へ融合できる。次いで、安定なクローン選択のために、ＤＨＦＲなどの選択マーカーを含有するＳＶ４０駆動ベクター内へ、ポリ−ｈｉｓタグ化ＴＡＴ挿入体をサブクローン化できる。最後に、ＣＨＯ細胞にＳＶ４０駆動ベクターをトランスフェクトできる（上記のとおり）。発現を検証するために、上記のとおり標識化を実施できる。次に、発現ポリ−Ｈｉｓタグ化ＴＡＴを含有する培養培地を、濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィーなどの任意の選択された方法により精製できる。
ＴＡＴはまた、一時的発現操作によりＣＨＯおよび／またはＣＯＳ細胞において、または他の安定な発現操作によりＣＨＯ細胞において発現させることもできる。
ＣＨＯ細胞における安定な発現は、以下の操作を用いて実施される。該タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶性形態をコードする配列（例えば、細胞外ドメイン）が、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ２度目を含有するＩｇＧ１定常領域配列に融合し、および／またはポリ−Ｈｉｓタグ化形態であるＩｇＧ構築体（免疫アドヘシン）として発現する。
ＰＣＲ増幅後、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｔ３．１６、Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９９７）に記載されている標準的技法を用いて、それぞれのＤＮＡを、ＣＨＯ発現ベクター内にサブクローン化する。ＣＨＯ発現ベクターは、対象のＤＮＡの適合性制限部位５’および３’を有するように構築され、ｃＤＮＡの簡便なシャットリングを可能にする。ＣＨＯ細胞におけるベクター使用発現は、Ｌｕｃａｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：９（１７７４−１７７９頁（１９９６）に記載されているとおりであり、対象のｃＤＮＡの発現を駆動するためのＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーおよびジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）が用いられる。ＤＨＦＲ発現により、トランスフェクション後のプラスミドの安定維持のための選択が可能になる。
市販のトランスフェクション試薬、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ＤＯＳＰＥＲ（登録商標）またはＦＵＧＥＮＥ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、１２マイクログラムの所望プラスミドＤＮＡを、およそ１０００万のＣＨＯ細胞に導入する。該サンプル簿は、Ｌｕｃａｓ，上記、に記載されているとおり増殖させる。下記のさらなる増殖および生産のために、およそ３×１０７細胞をアンプルに凍結する。
プラスミドＤＮＡを含有するアンプルを、水浴に入れて攪拌することにより解凍する。該内容物を１０ｍＬｓの培地を含有する遠心分離管にピペットで入れ、１０００ｒｐｍで５分間、遠心分離する。上澄み液を吸引し、該細胞を、１０ｍＬの選択培地（５％の０．２μｍダイアフィルトレートしたウシ胎仔血清を有する０．２μｍろ過したＰＳ２０）に再懸濁する。次いで該細胞を、９０ｍＬの選択培地を含有する１００ｍＬのスピナー内に分割する。１〜２日後、該細胞を、１５０ｍＬの選択増殖培地を充填した２５０ｍＬスピナー内に移し、３７℃でインキュベートする。さらに２〜３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬおよび２０００ｍＬのスピナーに、３×１０５細胞／ｍＬを接種する。該細胞培地を、遠心分離および生産培地における再懸濁により、新鮮培地と交換する。任意の好適なＣＨＯ培地が使用できるが、１９９２年６月１６日発行の米国特許第５，１２２，４６９号に記載された生産培地が実際に使用できる。３Ｌの生産スピナーに、１．２×１０６細胞／ｍＬで接種する。０日目に、細胞数ｐＨｉｅ判定される。１日目に、スピナーをサンプリングし、ろ過空気によるスパージングを開始する。２日目に、スピナーをサンプリングし、温度を３３℃に移し、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌグルコースおよび０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば、３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を使用する。生産を通して、ｐＨは、７．２付近に維持するように、適宜調整する。１０日後、または生存度が７０％以下に低下するまで、該細胞培養物を、遠心分離および０．２２μｍフィルターを通して採取する。ろ液は、４℃で保存するか、または精製のため、直ちにカラム上に装填した。
ポリ−Ｈｉｓタグ化構築体に関して、該タンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製する。精製前、馴化培地に、イミダゾールを５ｍＭの濃度まで加える。該馴化培地を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４で平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラム上にポンプ装入し、緩衝液は０．３ＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのイミダゾールを含有し、４℃で４〜５ｍｌ／分の流速である。充填後、該カラムを、追加の平衡緩衝液で洗浄し、該タンパク質を、０．２５Ｍのイミダゾールを含有する平衡緩衝液で溶出させる。高精製タンパク質を、引き続き、２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにより、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌおよび４％のマンニトール、ｐＨ６．８を含有する貯蔵緩衝液内に脱塩し、−８０℃で保存する。
免疫アドヘシン（Ｆｃ含有）構築体を、以下のとおり馴化培地から精製する。該馴化培地を、２０ｍＭのリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ６．８中で平衡化した５ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上にポンプ装入する。充填後、該カラムを平衡緩衝液により徹底的に洗浄してから、１００ｍＭのクエン酸、ｐＨ３．５により溶出させる。溶出したタンパク質を直ちに、２７５μＬの１Ｍ トリス緩衝液、ｐＨ９を含有する試験管内へ、１ｍｌのフラクションを採取することにより中和する。高精製タンパク質を引き続き、ポリ−Ｈｉｓタグ化タンパク質に関して上記したとおり、貯蔵緩衝液中に脱塩する。均一性をＳＤＳポリアクリルアミドゲルおよびエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって評価する。
実施例１４：酵母におけるＴＡＴの発現
以下の方法で、酵母における組換えＴＡＴの発現を記載する。
先ず、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＴＡＴの細胞内産生または分泌のために、酵母発現ベクターを構築する。ＴＡＴの細胞内発現を指示するために、ＴＡＴをコードするＤＮＡおよびプロモーターを、選択されたプラスミド内の好適な制限酵素部位内に挿入する。ＴＡＴ発現のための、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、天然ＴＡＴシグナルペプチドまたは他の哺乳動物シグナルペプチド、または、例えば、酵母アルファ因子またはインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列およびリンカー配列（適宜）をコードするＤＮＡと共に、分泌のために、ＴＡＴをコードするＤＮＡを分泌プラスミド内にクローン化できる。
次いで、酵母株ＡＢ１１０などの酵母細胞を、上記の発現プラスミドにより形質転換し選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母上澄み液を、１０％トリクロロ酢酸による沈降およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離、引き続き、クーマシーブルー染色によるゲルの染色によって分析できる。
組換えＴＡＴは、引き続き、遠心分離による発酵培地からの酵母細胞の除去、次いで、選択されたカートリッジフィルターを用いた培地の濃縮により、単離し精製することができる。ＴＡＴを含有する濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製できる。
実施例１５：バキュロウィルス感染昆虫細胞におけるＴＡＴの発現
以下の方法では、バキュロウィルス感染昆虫細胞におけるＴＡＴの組換え発現を記載する。
ＴＡＴをコードする配列を、バキュロウィルス発現ベクター内に含有されるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグは、ポリ−ｈｉｓタグおよび免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域のような）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの市販のプラスミドから誘導されたプラスミドなど、種々のプラスミドが使用できる。簡単の述べると、ＴＡＴをコードする配列、または、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列、もしくは、タンパク質が細胞外である場合は、成熟タンパク質をコードする配列などのＴＡＴをコードする配列の所望の部分を、５’および３’領域に相補的なプライマーと共に、ＰＣＲにより増幅させる。５’プライマーは、フランキング（選択された）制限酵素部位を組み込むことができる。次いで、該産物を、それらの選択された制限酵素により消化し、発現ベクター内にサブクローン化する。
組換えバキュロウィルスは、上記のプラスミドおよびＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤ（商標）ウィルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞内に共トランスフェクトすることによって作出される。２８℃で４〜５日間インキュベーションした後、放出されたウィルスを採取し、さらなる増幅に用いる。ウィルス感染およびタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｅｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、オクスフォード：オクスフォード大学出版（１９９４）により記載されたとおりに実施する。
次に、発現したポリ−ｈｉｓタグ化ＴＡＴを、以下のとおり、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。Ｒｕｐｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：１７５−１７９頁（１９９３）により記載されたとおり、組換えウィルス感染Ｓｆ９細胞から調製する。簡単に述べると、Ｓｆ９細胞を洗浄し、音波処理緩衝液（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％のグリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２０秒間、２回音波処理する。音波処理物を遠心分離により清澄化し、上澄み液を充填緩衝液（５０ｍＭのリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ７．８）中、５０倍に希釈し、０．４５μｍのフィルターを通してろ過する。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販されている）を、５ｍＬのベッド容量で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの充填緩衝液で平衡化する。ろ過した細胞抽出物を、１分当たり０．５ｍＬでカラムに充填する。該カラムを充填緩衝液により、ベースラインＡ２８０まで洗浄し、その時点でフラクションの採取を開始する。次に、該カラムを第二次洗浄緩衝液（５０ｍＭのリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄し、非特異的結合タンパク質を溶出させる。やはり、ベースラインＡ２８０に達したら、該カラムを、第二次緩衝液中、０ｍＭから５００ｍＭのイミダゾール勾配によって展開させる。１ｍＬのフラクションを採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色またはアルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）に対するＮｉ２＋−ＮＴＡ−複合体によるウェスタンブロットによって分析する。溶出したＨｉｓ１０−タグ化ＴＡＴを含有するフラクションをプールし、充填緩衝液に対して透析する。
代替として、ＩｇＧタグ化（またはＦｃタグ化）ＴＡＴの精製は、例えば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇカラムクローニングなどの公知のクロマトグラフィ法を用いて実施できる。
実施例１６：特異的抗体を用いたＴＡＴポリペプチドの精製
天然または組換えＴＡＴポリペプチドは、タンパク質精製業界における種々の標準的な技法によって精製できる。例えば、プロＴＡＴポリペプチド、成熟ＴＡＴポリペプチド、またはプレＴＡＴポリペプチドは、対象のＴＡＴポリペプチドに特異的な抗体を用いて免疫アフィニティークロマトグラフィーによて精製される。一般に、免疫アフィニティーカラムは、活性化クロマトグラフィー樹脂に対する抗ＴＡＴポリペプチド抗体の共有結合により構築される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムによる沈殿、または固定化タンパク質Ａ上での精製（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）により、免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、または固定化タンパク質Ａ上でのクロマトグラフィーにより、マウス腹水から調製される。部分的精製免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（Ｐｈｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）などのクロマトグラフィー樹脂に共有結合する。該抗体を該樹脂に結合させ、該樹脂をブロックし、該誘導樹脂を製造元の指示に従って洗浄する。
このような免疫アフィニティーカラムは、可溶性形態でのＴＡＴポリペプチドを含有する細胞からフラクションを調製することによりＴＡＴポリペプチドの精製に利用される。この調製物は、洗浄剤の添加、または当業界に知られた他の方法により、分画遠心分離を介して得られた細胞全体または細胞成分フラクションの可溶化によって誘導される。あるいは、シグナル配列を含有する可溶性ＴＡＴポリペプチドを、該細胞を増殖させる培地に有用な量で分泌させることができる。
可溶性のＴＡＴポリペプチド含有調製物は、免疫アフィニティーカラム上を通過させ、該カラムを、ＴＡＴポリペプチドの優先的な吸収を可能にする条件下（例えば、洗浄剤の存在下、高イオン強度の緩衝液）で洗浄する。次いで該カラムを、抗体／ＴＡＴポリペプチド結合を破壊する条件下（例えば、およそｐＨ２〜３などの低ｐＨ化し、または、尿素またはチオシアネートイオンなどのカオトロピック高濃度）で溶出させ、ＴＡＴポリペプチドを採取する。
材料の寄託
以下の材料を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ、マナサス、ＶＡ２０１１０−２２０９、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した：
Figure 2008535498
 これらの寄託は、特許手続きおよびその下での規則を目的とした微生物寄託の国際的承認についてのブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）の規定の下になされた。これによって、寄託月日から３０年間、寄託物の生存可能な培養維持が保証される。寄託物は、ブダペスト条約の期間、ＡＴＣＣにより入手可能となり、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ社とＡＴＣＣとの間の同意に供され、関連米国特許の発行の際、または任意の米国もしくは外国の特許出願の公開の際、いずれが先になっても、寄託培養物の後代の永久的および無制限の入手可能性を保証し、米国特許商標庁長官により、３５ＵＳＣ§１２２およびそれに準ずる長官規則（８８６ＯＧ６３８への具体的リファレンスを有する３７ＣＦＲ§１．１４を含む）に従ってそれに資格が与えられると決定された者に該後代の入手可能性を保証する。
本出願の譲受人は、寄託された材料の培養物が、好適な条件下で培養した場合に、死滅するか、失われるか、または破壊されたならば、通告した上で、その材料が直ちに他の同一なものと取り替えられることに同意した。寄託材料の入手可能性は、その特許法に従っていずれかの政府機関の下で認可された権利に違反して本発明を実施する許可として考えるべきではない。
先に記された明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にする上で十分であると考えられる。寄託された実施形態は、本発明の一定の態様の単なる例示として意図されているため、本発明は、寄託された構築体によって範囲が限定されるものではなく、機能的に等価な任意の構築体が本発明の範囲内にある。本明細書における材料の寄託は、本明細書に含まれる記述が本発明の態様の最良の様式を含めて、本発明のいずれかの態様の実施を可能にする上で不十分であるとの承認を構成するものではなく、特許請求の範囲を、それが表示する特定の図に限定するものとして考えるべきでもない。実際、本明細書に示され説明されたものに加えて、本発明の種々の改変が先の説明から当業者に明らかであろうし、添付の特許請求の範囲内に入る。
図１は、ＴＡＴ１１３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示しており、配列番号：１は、本明細書において「ＤＮＡ２１５６０９」と指定されたクローンである。 図２は、図１に示された配列番号：１の完全長コード配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。

Claims (6)

  1. （ａ）配列番号：２として示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
    （ｂ）その付随するシグナルペプチドを欠いている、配列番号：２として示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
    （ｃ）配列番号：２として示されるポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；
    （ｄ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列；
    （ｅ）配列番号：１として示されるヌクレオチド配列の完全長コード領域；または
    （ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補体、
    を含む、単離核酸。
  2. 請求項１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  3. 前記核酸が、前記ベクターによって形質転換された宿主細胞により認識される制御配列に作動可能に結合されている、請求項２に記載の発現ベクター。
  4. 請求項２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  5. ＣＨＯ細胞、大腸菌細胞または酵母細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
  6. ポリペプチドを産生する方法であって、該ポリペプチドの発現に好適な条件下で請求項４に記載の宿主細胞を培養すること、および該細胞培養物から該ポリペプチドを回収することを含む、方法。
JP2008505655A 2005-04-08 2006-04-05 腫瘍の診断および治療のための組成物および方法 Withdrawn JP2008535498A (ja)

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