TW202112394A

TW202112394A - 以肽核酸為基礎之佐劑

Info

Publication number: TW202112394A
Application number: TW109119031A
Authority: TW
Inventors: 三股亮大郎; 神田明日美
Original assignee: 日商電化股份有限公司
Priority date: 2019-06-06
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2021-04-01
Also published as: CN113939313A; JPWO2020246584A1; AU2020288030A1; EP3981426A4; US20230330221A1; WO2020246584A1; KR20220017919A; US12016920B2; EP3981426A1

Abstract

本發明提供一種對高有效性且高安全性之疫苗之製備有用之佐劑及包含其之疫苗組合物。本發明之佐劑包含結合有細胞穿透性肽之肽核酸。

Description

以肽核酸為基礎之佐劑

本發明係關於一種具有免疫活化能力之對細胞穿透性肽進行修飾之肽核酸。

後天免疫系統具有針對經歷過一次之異物而形成於第2次以後之曝露中能夠迅速應對之免疫記憶之能力。疫苗係利用該免疫記憶者，藉由接種疫苗，能夠獲得於病原體曝露之前能夠中和該病原體之免疫。

已獲核准之疫苗有減毒活疫苗、不活化疫苗及純化重組蛋白質等次單位疫苗，尤其減毒活疫苗係有效性較高之疫苗，但因具有感染性，故難以確保安全性，有產生未預期之副反應之擔憂。另一方面，不活化疫苗或次單位疫苗與減毒活疫苗相比於安全性方面較優異，但因喪失感染性，故缺乏引起自然免疫之能力，因此僅抗原之情況下無法賦予充分之後天免疫。因此，已核准之不活化疫苗及次單位疫苗多數為向抗原加入具有免疫活化能力之佐劑而成之製劑。因此，於安全性較高之疫苗之開發中，應當使用安全性較高之不活化疫苗或次單位疫苗抗原，但為了獲得充分之有效性，必須添加具有免疫活化能力之佐劑。

又，為了提高病原體之感染防禦效果，成為病原體之入侵門戶之黏膜中之免疫誘導亦較為重要。黏膜中之免疫誘導係藉由投予黏膜疫苗所達成，已核准之黏膜疫苗為減毒活疫苗或源自具有黏膜親和性之毒素之疫苗，不具有黏膜親和性之不活化疫苗及次單位疫苗難以引起對感染防禦而言充分之免疫。因此，此種抗原之黏膜投予中亦需要增強黏膜免疫之佐劑。

已核准之疫苗中使用之佐劑可例舉鋁鹽或基於角鯊烯之乳液，但被核准之佐劑較少，已知鋁鹽會促進IgE(Immunoglobulin E，免疫球蛋白E)誘導(非專利文獻1)。又，上述佐劑為注射劑用佐劑，難以與黏膜疫苗組合。

另一方面，作為將核酸之糖磷酸骨架轉化為N-(2-胺基乙基)甘胺酸骨架之修飾核酸之肽核酸(PNA)具有較高之雙鏈形成能力，不會被活體內核酸酶分解，因此可期待應用為反義分子等。又，於以藥物遞送為代表之領域中，作為將蛋白質、肽或低分子化合物導入至細胞內使其發揮功能之技術，而於該等分子上結合穿膜肽(Cell Penetrating Peptide，CPP)。但是，將PNA或結合有CPP之PNA用作佐劑尚屬未知。 [先前技術文獻] [非專利文獻]

[非專利文獻1]Marichal T, Ohata K, Bedoret D, Mesnil C, Sabatel C, Kobiyama K, Lekeux P, Coban C, Akira S, Ishii KJ, Bureau F, Desmet CJ. DNA released from dying host cells mediates aluminum adjuvant activity. Nat Med. 2011 Jul 17; 17 (8): 996 - 1002.

[發明所欲解決之問題]

本發明係關於一種對製備高有效性且高安全性之疫苗較為有用之佐劑及包含其之疫苗組合物。 [解決問題之技術手段]

本案發明人等進行了銳意研究，結果發現，於肽核酸修飾如HIV(Human Immunodeficiency Virus，人類免疫缺乏病毒)之TAT(Trans-Activator of Transcription Protein，轉錄激活蛋白)之細胞穿透性肽(CPP)，該結合有CPP之肽核酸於注射及經黏膜投予中均具有佐劑活性。

即，本發明係關於以下之1)至6)。 1)一種佐劑，其包含結合有細胞穿透性肽之肽核酸。 2)一種佐劑組合物，其含有結合有細胞穿透性肽之肽核酸及藥學上容許之載體。 3)一種疫苗組合物，其含有如1)之佐劑及抗原。 4)一種結合有細胞穿透性肽之肽核酸之用途，其用於製造佐劑。 5)一種結合有細胞穿透性肽之肽核酸之用途，其係用於佐劑。 6)一種方法，其使用結合有細胞穿透性肽之肽核酸作為佐劑。 [發明之效果]

根據本發明，能夠提高安全性較高之不活化疫苗之有效性，新製出品質較高之預防藥，能夠對醫藥品產業做出較大貢獻。

以下詳細地說明本發明之適宜實施方式。但是，本發明並不限定於以下之實施方式。於本發明中，「結合有細胞穿透性肽之肽核酸」意指於細胞穿透性肽之N或者C末端結合有肽核酸之分子，於本說明書中，亦稱為Mitsumata免疫刺激肽核酸(Mitsumata-Immunostimulatory Peptide nucleic acid，MIP)。

「細胞穿透性肽(CPP)」係指於與細胞共存之情形時通過細胞膜而轉移至細胞內之肽。例如可例舉：表1所示之源自HIV之TAT之肽、源自果蠅之觸足之Penetratin、聚精胺酸、自神經肽甘丙胺素衍生之Transportan、源自SV40(simian virus 40，猿猴病毒40)之核定位訊號(Nuclear Localization Signal，NLS)之Pep-1、抗菌肽LL37，但並不限定於該等。較佳可例舉源自TAT之肽(包含序列編號1所示之胺基酸序列之肽)。

[表1]

肽	起源	序列(N末端→C末端)
TAT(48～60)	HIV TAT蛋白	GRKKRRQRRRPPQ(序列編號1)
Penetratin	果蠅觸足	RQIKIWFQNRRMKWKK(序列編號2)
聚精胺酸(R8)	合成肽	RRRRRRRR(序列編號3)
聚精胺酸(R9)	合成肽	RRRRRRRRR(序列編號4)
Transportan	神經肽甘丙胺素	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(序列編號5)
Pep-1	SV40 NLS	KETWWETWWTEWSQPKKRKV(序列編號6)
LL-37	抗菌肽	LLGDFERKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTESC(序列編號7)

「肽核酸(PNA)」係指具有將核酸之糖-磷酸骨架置換成N-(2-胺基乙基)甘胺酸之骨架，藉由亞甲基羰基鍵而鍵結鹼基之核酸類似物。作為本發明中使用之肽核酸中之鹼基(Base)，可為腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶之任一者，鏈長較理想為通常之20 mer以下，就佐劑活性之方面而言，較佳為3～12 mer，更佳為3～10 mer。下述式(1)示出3～12 mer之肽核酸之結構。

[化1]

[式中，鹼基可相同或不同，表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶，R表示-COOH或-CONH₂ ，n表示1～10之整數]

於本發明中，作為適宜之肽核酸，例如可例舉具有至少1個鳥嘌呤或胞嘧啶作為鹼基之3 mer或10 mer之肽核酸、具有3個鳥嘌呤作為鹼基之3 mer之肽核酸(G3PNA)、具有3個胞嘧啶作為鹼基之3 mer之肽核酸(C3PNA)、具有10個胞嘧啶作為鹼基之10 mer之肽核酸(C10PNA)等。

本發明之MIP可藉由在細胞穿透性肽之N或者C末端利用化學方法，例如，經由兩末端具有N-羥基丁二醯亞胺酯之交聯劑使細胞穿透性肽與肽核酸之N末端間共價鍵結而製造。再者，肽核酸例如可使用Fmoc型PNA單體單元等，利用該技術領域中公知之固相肽合成法進行合成。

作為本發明中使用之適宜之MIP，可例舉以下所示之源自HIV之TAT之包含13個胺基酸之肽(序列編號1)於其C末端與G3PNA共價鍵結而成之MIP01(式(2))、與C10PNA共價鍵結而成之MIP03(式(3))。

[化2]

如下述實施例所示，於向小鼠注射及經黏膜投予將式(2)所示之MIP01與流行性感冒抗原(裂解抗原(split antigen))混合而製備之疫苗組合物之情形時，對該抗原之血中抗體效價高於MIP非添加組。又，於經黏膜投予之情形時，黏膜之IgA效價亦上升。又，式(3)所示之MIP03中確認到NFκB之活化及IL-1β之較高之誘導能力，因此認為促進自然免疫系統之活化之可能性高，MIP為具有自然免疫之活化能力之佐劑。即，MIP於注射或者經黏膜投予抗原之情形時均具有提高血中或者黏膜中之抗體誘導能力之佐劑活性，因此，MIP成為佐劑，且MIP包含藥學上容許之載體之組合物能夠成為佐劑組合物。又，MIP可用於製造佐劑或佐劑組合物。

於本發明中，「佐劑」意指於注射或者經黏膜投予抗原之情形時，增加對抗原之免疫應答之物質。此處，「黏膜」係指脊椎動物中消化器官、呼吸道、泌尿生殖器官、眼等尤其是外通性之內腔器官之內壁。因此，作為經黏膜投予，例如可例舉：經口投予、鼻腔投予(經鼻投予)、口腔投予、陰道內投予、上呼吸道投予、肺泡投予、滴眼投予等，但不限定於該等。

本發明之佐劑或佐劑組合物可與抗原組合投予，投予可與抗原投予同時進行，亦可為抗原投予之前或之後。本發明之佐劑或佐劑組合物之投予量可根據投予對象、投予方法、投予形態、抗原種類而適當決定。

本發明之佐劑可與抗原組合製成疫苗組合物。本發明之疫苗組合物可藉由混合抗原與MIP進行製備，亦可進而適當添加藥學上容許之載體製成適當之製劑。於本發明之疫苗組合物中，MIP可處於與抗原或者其他成分化學性結合之狀態，亦可以游離之分子狀態存在。

作為抗原，適合的是自病原體純化而得之天然產物、或藉由基因重組等方法人為製作之蛋白質或者肽，具體而言可例舉：作為完全病毒粒子之病毒體、不完全病毒粒子、病毒結構蛋白、病毒非結構蛋白、病原菌之全菌體、源自病原菌之蛋白質或者糖蛋白、感染防禦抗原、中和表位等，包括具有感染性者及喪失感染性者(不活化抗原)。作為不活化抗原，例如可例舉藉由物理(X射線照射、UV(ultraviolet，紫外線)照射、熱、超音波)、化學(福馬林、β-丙內酯、二元伸乙基亞胺、汞、醇、氯)等操作而不活化者，但不限定於該等。就安全性之觀點而言，源自病原體之抗原較理想為源自上述病毒或病原菌之不活化抗原。

作為病毒，例如可例舉：麻疹病毒、風疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰白質炎病毒、輪狀病毒、諾羅病毒、腺病毒、腸病毒、疱疹病毒、水痘病毒、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)病毒、人類免疫缺乏病毒(HIV)、人類T細胞白血病病毒(HTLV-1)、人類乳突病毒、日本腦炎病毒、西尼羅河病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、茲卡病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、E型肝炎病毒、RS病毒(respiratory syncytial virus，呼吸道融合性病毒)、流行性感冒病毒等，較佳為流行性感冒病毒。

作為病原菌，可例舉：白喉菌、破傷風菌、百日咳菌、腦膜炎菌、b型流行性感冒菌、肺炎球菌、霍亂菌、結核菌、牙周病菌等。

作為疫苗組合物之劑型，例如可例舉：液劑、懸浮劑、冷凍乾燥製劑等。作為液劑，可例舉溶解於純化水、緩衝液而成者等。作為懸浮劑，可例舉與甲基纖維素、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、明膠、酪蛋白等一起懸浮於純化水、緩衝液等而成者等。可視需要向該等製劑添加通常使用之吸收促進劑、界面活性劑、保存劑、穩定劑、防濕劑、溶解助劑等。

再者，本發明之疫苗組合物只要不損害該疫苗之免疫原性及安全性，亦可含有MIP以外之佐劑。

本發明之疫苗組合物所含之抗原之量只要為足以誘導特異性抗體應答之量，則無特別限定，亦可考慮與所併用之MIP之比率而適當進行設定。例如，於使用流行性感冒病毒之裂解抗原作為抗原之情形時，於1次之投予用量即1～60 μg HA(hemagglutinin，血球凝集素)(HA換算)之範圍內含有即可，更佳為9～15 μg HA(HA換算)。上述濃度為藉由利用單輻射免疫擴散試驗法等按照WHO(World Health Organization，世界衛生組織)或國家之基準所確定之試驗法測定HA蛋白質之濃度所得之值。

本發明之疫苗組合物之投予路徑並無特別限定，可為利用注射之投予(皮下投予、肌內投予、皮內投予、靜脈內投予)、經口投予、非經口投予(例如，鼻腔投予、滴眼投予、經陰道投予、舌下投予、經皮投予)之任一者，例如藉由對鼻腔內進行滴加、噴霧或噴射進行投予。

本發明之佐劑組合物或疫苗組合物之投予對象可例舉人及除人以外之哺乳動物，較佳為人。作為除人以外之哺乳動物，例如可例舉：小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、豬、牛、山羊、綿羊、狗、貓、恆河猴、食蟹猴、猩猩、黑猩猩等。 [實施例]

以下，藉由實施例具體地說明本發明，但本發明並不受該等任何限定。＜CPP及MIP＞委託肽研究所(PEPTIDE INSTITUTE)股份有限公司合成作為CPP之CPP01(源自TAT之肽(序列編號1))、作為MIP之上述式(2)所示之MIP01及式(3)所示之MIP03。

實施例1 MIP01之皮下投予時之佐劑活性評估將流行性感冒HA疫苗「生研」之A/H1N1亞型(A/Singapore/GP1908/2015株)及B/維多利亞系(Victoria lineage)(B/Maryland/15/2016株)之各原液作為裂解抗原(SV)，以每0.3 mL中各株之血球凝集素成為1 μg之方式混合各裂解抗原，以成為1 μg之方式向其中添加源自HIV之TAT之包含13個胺基酸之細胞穿透性肽或者MIP01。又，作為對照，亦一併製備不添加佐劑之僅有抗原之投予液。

將以上述方式製備之投予液(表2)以3週為間隔向BALB/c小鼠(雌，5週齡)之後背部皮下投予2次，每次0.3 mL(各組5隻)，自各投予起2週後進行全採血。將藉由全採血獲得之血液進行離心分離，製備血清，測定血清之與A/Singapore/GP1908/2015株及B/Maryland/15/2016株特異性結合之IgG(總IgG)效價。又，於2次投予後之血清中，亦測定對A/Singapore/GP1908/2015株之中和抗體效價。

[表2]

#	抗原	佐劑
亞型/系	用量 (μgHA/株/shot)	名稱	序列(N末端→C末端)	用量 (μg/shot)
1	A/H1N1	1	CPP01	GRKKRRQRRRPPQ	1
2	A/H1N1	1	MIP01	GRKKRRQRRRPPQ-G3PNA	1
3	A/H1N1	1	-	-	-
4	B/維多利亞	1	CPP01	GRKKRRQRRRPPQ	1
5	B/維多利亞	1	MIP01	GRKKRRQRRRPPQ-G3PNA	1
6	B/維多利亞	1	-	-	-

各投予組之IgG效價如圖1A及圖1B所示。每次投予對裂解抗原添加1 μg之MIP01，藉此於1次及2次投予中，對各株之血中抗原特異性之IgG效價均高於佐劑非投予組。又，與CPP01投予組相比，亦確認到於MIP01投予組中，於1次及2次投予之兩個時間點，對於任一株，血中抗原特異性之IgG效價均較高。於圖2中，示出2次投予後對A/Singapore/GP1908/2015株之中和抗體效價，但中和抗體效價之結果亦為MIP01投予組最高，次之為佐劑非添加組，CPP01投予組顯示最低值。因此確認到，藉由投予MIP01，不僅血中抗原之特異性IgG效價，對病毒之排除較為重要之中和抗體效價亦提高，認為細胞穿透性肽與肽核酸結合之結構對於發揮MIP01之佐劑活性較為重要。

實施例2 MIP01之經鼻投予時之佐劑活性評估與實施例1同樣地將流行性感冒HA疫苗「生研」之A/H1N1亞型(A/Singapore/GP1908/2015株)及B/維多利亞系(B/Maryland/15/2016株)之各原液作為裂解抗原，以每10 μL中各株之血球凝集素成為1 μg之方式混合各裂解抗原，以成為10 μg之方式向其中添加CPP01或者MIP01。又，作為對照，亦一併製備不添加佐劑之僅有抗原之投予液。

將以上述方式製備之投予液(表3)以3週為間隔向BALB/c小鼠(雌，5週齡)之鼻腔投予2次，每次10 μL(一隻鼻5 μL)(各組5隻)。自各投予起2週後進行全採血，藉由離心分離製備血清。又，於進行2次投予2週後之採血後，每個個體利用400 μL之含蛋白酶抑制劑之D-PBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，杜貝可磷酸鹽緩衝鹽水)洗淨鼻腔內，回收該洗淨液作為鼻腔洗淨液。將血清供於與A/Singapore/GP1908/2015株及B/Maryland/15/2016株特異性結合之IgG(總IgG)效價之測定，將鼻腔洗淨液供於與A/Singapore/GP1908/2015株及B/Maryland/15/2016株特異性結合之IgA效價之測定。

[表3]

#	抗原	佐劑
亞型/系	用量 (μgHA/株/shot)	名稱	序列(N末端→C末端)	用量 (μg/shot)
7	A/H1N1	1	CPP01	GRKKRRQRRRPPQ	10
8	A/H1N1	1	MIP01	GRKKRRQRRRPPQ-G3PNA	10
9	A/H1N1	1	-	-	-
10	B/維多利亞	1	CPP01	GRKKRRQRRRPPQ	10
11	B/維多利亞	1	MIP01	GRKKRRQRRRPPQ-G3PNA	10
12	B/維多利亞	1	-	-	-

各株之IgG效價之結果如圖3A及圖3B所示，於經鼻投予時，亦為1次及2次投予之任一者中對各株之血中抗原特異性之IgG效價均高於佐劑非投予組。尤其是對B/Maryland/15/2016株之IgG效價，相對於佐劑非添加組而言確認到顯著之抗體效價之上升(曼-惠特尼之U檢定，p＜0.05)。又，關於鼻腔洗淨液之抗原特異性IgA效價，於任一投予時間點對各株之IgA效價均於MIP01投予組中成為最高值，次之為佐劑非添加組，CPP01投予組為最低值(圖4A、圖4B)。因此，認為於肽核酸修飾細胞穿透性肽而成之MIP不僅於利用注射之投予中，於經黏膜投予中亦具有佐劑活性，於經黏膜投予中，除促進血中之IgG以外，亦促進黏膜中之IgA誘導。

實施例3 MIP03之自然免疫活化能力於活體外對MIP03之自然免疫活化能力進行評估。

以最終濃度成為10、20、40及80 μM之方式對1×10⁶ cells/mL之Raw264.7報導細胞株(Reporter Cell Line)(Novus biologicals，NBP2-26261)添加MIP03，於5%CO₂ 、37℃下培養2天後，回收培養液。將所回收之培養液以12,000×g離心分離1分鐘，測定其上清液之鹼性磷酸酶及細胞激素。鹼性磷酸酶之測定使用SEAP(Secreted Alkaline Phosphatase，分泌型鹼性磷酸酶)報導基因分析套組(發光)(Reporter Gene Assay kit Luminescence)(Cayman Chemical，600260)，細胞激素之測定使用Bio-Plex Pro小鼠細胞激素GI23-Plex(Bio-Rad，M60009RDPDB03)。又，作為陰性對照(NC)而添加培養基，於細胞激素測定中作為陽性對照而添加作為類鐸受體7(Toll-like receptor 7)之促效劑之咪喹莫特(0.02 μM)，與該等進行比較評估。

鹼性磷酸酶之測定結果如圖5所示，確認到依存於MIP03之添加濃度之鹼性磷酸酶之發光訊號提高。因此可知MIP03促進NFκB之活化，表明將自然免疫予以活化。又，圖6～9示出細胞激素測定之結果，確認到依存於MIP03之濃度，IL-1α及IL-1β誘導提高(圖6及7)，尤其是IL-1β與咪喹莫特相比確認到非常高之誘導(圖7)。又，作為Th2(T helper 2，第二型輔助性T細胞)及Th1相關細胞激素，將IL-13之測定結果示於圖8，將IFN-γ之測定結果示於圖9，任一細胞激素均確認到與作為陽性對照之咪喹莫特相同程度之誘導。如上所述，由於具有NFκB之活化及IL-1β之高誘導能力，故而認為MIP03促進經由C型凝集素受體或Nod樣受體之自然免疫系統之活化之可能性較高，其結果為表現出與抗體應答相關之Th1/Th2細胞激素之誘導能力。因此，MIP為具有自然免疫之活化能力之佐劑。

圖1A係皮下投予中對A/Singapore/GP1908/2015株之IgG抗體效價。圖1B係皮下投予中對B/Maryland/15/2015株之IgG抗體效價。圖2係於皮下投予之第35天時對A/Singapore/GP1908/2015株之中和抗體效價。圖3A係經鼻投予中對A/Singapore/GP1908/2015株之IgG抗體效價。圖3B係經鼻投予中對B/Maryland/15/2015株之IgG抗體效價。圖4A係經鼻投予之鼻腔洗淨液中對A/Singapore/GP1908/2015株之IgA抗體效價。圖4B係經鼻投予之鼻腔洗淨液中對B/Maryland/15/2015株之IgA抗體效價。圖5係MIP03之NFκB之活化作用。圖6係MIP03之細胞激素(IL-1α(interleukin-1α，介白素-1α))誘導作用。圖7係MIP03之細胞激素(IL-1β)誘導作用。圖8係MIP03之細胞激素(IL-13)誘導作用。圖9係MIP03之細胞激素(IFN-γ(Interferon-γ，干擾素-γ))誘導作用。

Claims

一種佐劑，其包含結合有細胞穿透性肽之肽核酸。
如請求項1之佐劑，其中細胞穿透性肽選自包含序列編號1～7所示之胺基酸序列之肽。
如請求項1之佐劑，其中細胞穿透性肽為包含序列編號1所示之胺基酸序列之肽。
如請求項1至3中任一項之佐劑，其中肽核酸以下述式(1)表示： [化1]
[式中，鹼基可相同或不同，表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶，R表示-COOH或-CONH₂ ，n表示1～10之整數]。
如請求項4之佐劑，其中於式(1)中，n為1～8之整數。
如請求項4或5之佐劑，其中於式(1)中，R為-CONH₂ 。
如請求項4至6中任一項之佐劑，其中於式(1)中，鹼基均為鳥嘌呤或胞嘧啶。
一種佐劑組合物，其含有結合有細胞穿透性肽之肽核酸及藥學上容許之載體。
一種疫苗組合物，其含有如請求項1至7中任一項之佐劑及抗原。
一種結合有細胞穿透性肽之肽核酸之用途，其用於製造佐劑。
一種結合有細胞穿透性肽之肽核酸之用途，其係用於佐劑。
一種方法，其將結合有細胞穿透性肽之肽核酸用作佐劑。