WO2022215737A1 - アジュバント活性増強剤及びアジュバント組成物 - Google Patents

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Definitions

  • Adjuvants have been used to enhance the immunogenicity of vaccines, but the only adjuvants that have been proven in humans for a long time are aluminum salts, and the mechanism was not elucidated until recently.
  • various receptors of innate immunity including Toll-like receptor (TLR) have been discovered, and the research and development of adjuvants have progressed rapidly.
  • TLR Toll-like receptor
  • the present inventors have found that when a peptide nucleic acid to which a cell membrane-permeable peptide is bound is combined with a CpG-ODN or squalene-containing emulsion, the immune quality of the CpG-ODN or squalene-containing emulsion does not change. In addition, it was found to increase the strength of immunity.
  • a “peptide nucleic acid (PNA)” is a nucleic acid analogue having a backbone in which the sugar-phosphate backbone of the nucleic acid is replaced by N-(2-aminoethyl)glycine, and the bases are linked by methylene carbonyl bonds.
  • the base in the peptide nucleic acid used in the present invention may be any of adenine, guanine, thymine, cytosine, and uracil, and the chain length is preferably 20 mer or less, which is preferred in terms of adjuvant activity. is 3-12mer, more preferably 3-10mer.
  • the following formula (1) shows the structure of a 3- to 12-mer peptide nucleic acid.
  • Base may be the same or different and represents adenine, guanine, thymine, cytosine or uracil, R represents -COOH or -CONH2 , and n represents an integer of 1-10.
  • the peptide nucleic acid to which the cell membrane-permeable peptide of the present invention is bound is attached to the N- or C-terminus of the cell-permeable peptide by a chemical method, for example, via a cross-linking agent having N-hydroxysuccinimide esters at both ends. and the N-terminus of the peptide nucleic acid.
  • Peptide nucleic acids can be synthesized using, for example, Fmoc-type PNA monomer units, etc., using solid-phase peptide synthesis methods known in the art.
  • adjuvant means a substance that increases the immune response to an antigen when the antigen is injected or transmucosally administered.
  • adjuvant activity of CpG-ODN or squalene-containing emulsion means that the strength of immunity of the adjuvant substance is increased without changing the quality of immunity induced by the CpG-ODN or squalene-containing emulsion (adjuvant substance). means to raise.
  • the adjuvant composition of the present invention can be administered in combination with an antigen, and can be administered simultaneously with the administration of the antigen, before or after the administration of the antigen.
  • the dosage of the adjuvant composition of the present invention can be appropriately determined according to the subject of administration, administration method, administration form, and type of antigen.
  • Pathogenic bacteria include diphtheria, tetanus, pertussis, meningococcus, influenza type b, pneumococcus, cholera, tuberculosis, and periodontal disease.
  • the vaccine composition of the present invention contains an adjuvant substance other than the peptide nucleic acid bound with a cell membrane permeable peptide, the CpG-ODN, and the squalene-containing emulsion as long as it does not impair the immunogenicity and safety of the vaccine. can also
  • the amount of the antigen contained in the vaccine composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount sufficient to induce a specific antibody response, and the ratio with the adjuvant composition to be used in combination is also taken into consideration. Can be set.
  • an influenza virus split antigen when used as an antigen, it may be contained within the range of 1 to 60 ⁇ g HA (converted to HA), which is the dosage for one administration, and 9 to 15 ⁇ g HA (converted to HA) is more preferable.
  • the concentration is a value obtained by measuring the concentration of HA protein by a test method such as a single radiation immunodiffusion test method, which is defined by WHO or national standards.
  • Example 1 Evaluation of adjuvant activity of DIF in influenza vaccine
  • the stock solution was used as a split antigen (SV), and 0.6 ⁇ g of hemagglutinin of each strain, 100 ⁇ g of MIP03, and 6 ⁇ g of CpG-ODN (ODN1826 (InvivoGen), SEQ ID NO: 9) were added per 0.1 mL. was used as the DIF-01 formulation.
  • a non-adjuvant preparation prepared so that hemagglutinin of each strain was 0.6 ⁇ g per 0.1 mL
  • MIP prepared so that hemagglutinin of each strain was 0.6 ⁇ g and MIP03 was 100 ⁇ g per 0.1 mL
  • -03 preparation ODN1826 preparation prepared so that 0.6 ⁇ g of hemagglutinin of each strain and 6 ⁇ g of ODN1826 per 0.1 mL, split antigen (SV), 0.6 ⁇ g of hemagglutinin of each strain per 0.05 mL.
  • An Alm preparation and an Addavax preparation were prepared by adjusting the amount to 6 ⁇ g and mixing an equal amount of Alm (Thermo Scientific) or Addavax (InvivoGen).
  • mice 0.1 mL of the formulation (Table 2) prepared as described above was subcutaneously administered to the back of BALB/c mice (female, 5 weeks old) (8 mice per group), and 21 days after administration, whole blood was collected. Blood obtained by whole blood collection is centrifuged to prepare serum, and IgG (Total IgG) antibody titer that specifically binds to serum A / Kansas / 14 / 2017 strain and B / Maryland / 15 / 2016 strain, IgG1 subclass antibody titers and IgG2a subclass antibody titers were measured, respectively.
  • IgG Total IgG antibody titer that specifically binds to serum A / Kansas / 14 / 2017 strain and B / Maryland / 15 / 2016 strain
  • Tables 3 and 4 summarize the geometric mean antibody titer (GMT) of the group administered with DIF-01, DIF-03 and adjuvant containing these, which showed statistically significant difference, and the ratio of GMT to the non-adjuvant group.
  • Table 3 summarizes the GMT and GMT ratio for the A/Kansas/14/2017 strain.
  • DIF-01 has a higher GMT ratio than ODN1826 and MIP-03, and is thought to exhibit a synergistic effect. , this was also the case when comparing DIF-03 with Addavax and MIP-03.

Abstract

既存のアジュバントの免疫強度を高めるアジュバント活性増強剤及びそれを含有するアジュバント組成物を提供する。 細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸を有効成分とする、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンのアジュバント活性増強剤。

Description

アジュバント活性増強剤及びアジュバント組成物
 本発明は、アジュバント活性増強剤及びこれを含むアジュバント組成物に関する。
 アジュバントはワクチンの免疫原性を高めるために使われてきたが、長い間ヒトで実績のあるアジュバントはアルミニウム塩くらいであり、そのメカニズムも近年になるまで解明されていなかった。しかし、現在では、Toll様受容体(Toll-like receptor:TLR)をはじめとする様々な自然免疫の受容体が発見され、アジュバントの研究開発は急速に進展した。
 そのため、近年では、古くからアジュバントとして知られているエマルジョン型アジュバントに加え、Toll様受容体のリガンド分子である、MPL(Monophosphoryl Lipid A)、CpG-ODN(CpG oligonucleotide)、Flagellin及びPolyI:C等がアジュバントとして開発若しくは上市されている。つまり、自然免疫のメカニズムが解明されるとともに、分子やメカニズムを基盤としたアジュバントの創薬が可能となり、そのため多くの新たなアジュバントが実用化されている。また、複数の異なる作用機序のアジュバントを混ぜた混合型のアジュバントも開発されており、これらの新たなアジュバントの開発により、従来のアルミニウム塩では誘導できなかったTh1型免疫誘導が可能となり、免疫誘導も更に高めることができるようになった。
 アジュバントは免疫誘導のタイプによって、Th1型、Th2型及びその両方を誘導するものに大別され、アルミニウム塩はTh2型、MPL、CpG-ODN及びPolyI:CはTh1型、スクワレン含有エマルジョンやFlagellinはTh1及びTh2型の両方を誘導するタイプとして分類される。このTh1及びTh2型免疫応答は、生体防御上の異なる役割を担っており、Th1型免疫はウイルスや細胞内寄生細菌、Th2型免疫は寄生虫や細菌に対して抵抗性を示す。すなわち、標的とする感染症ごとに、ワクチンで誘導すべき免疫の質は異なり、そのためアジュバントを適切に選択する必要がある。
 アジュバントの選択のポイントは2点あり、1つは前述の通り誘導する免疫の質である。もう1つは免疫の強度、つまり防御レベルまで免疫誘導を高めることが可能であるか否かである。したがって、標的とする感染症やワクチン抗原ごとに適切な免疫の質と強度が得られるようアジュバントを選ばなければならない。
 本願発明者らは、特許文献1において細胞透過性ペプチド(CPP)をペプチド核酸に結合した新規アジュバントについて報告しているが、この細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸と他のアジュバントとを組み合わせた場合に、それらに如何なる質的及び作用的変化を及ぼすかは報告されていない。
国際特許公開第2020/246584号
 本発明は、既存のアジュバントの免疫強度を高めるアジュバント活性増強剤及びそれを含有するアジュバント組成物を提供することに関する。
 本発明者らは、鋭意研究の結果、細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸と、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンを組み合わせた場合に、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンの免疫の質を変化させずに、免疫の強度を高めることを見出した。
 すなわち、本発明は、以下の1)~7)に係るものである。
 1)細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸を有効成分とする、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンのアジュバント活性増強剤。
 2)細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸を、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンと組み合わせて使用する、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンのアジュバント活性増強方法。
 3)細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸とCpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンを含有するアジュバント組成物。
 4)薬学的に許容される担体を含有する3)の組成物。
 5)3)又は4)の組成物及び抗原を含有するワクチン組成物。
 6)CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンのアジュバント活性増強剤を製造するための、細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸の使用。
 7)CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンのアジュバント活性を増強するための、細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸。
 本発明によれば、ワクチンの有効性を高めることが可能となり、品質の高い予防薬の創出として医薬品産業に大きく貢献できる。
Day21におけるA/Kansas/14/2017株(A/H3N2)に対するIgG抗体価。 Day21におけるB/Maryland/15/2016株(B/Victoria)に対するIgG抗体価。 Day21におけるA/Kansas/14/2017株(A/H3N2)に対するIgG1サブクラスの抗体価。 Day21におけるA/Kansas/14/2017株(A/H3N2)に対するIgG2aサブクラスの抗体価。 A/Kansas/14/2017株(A/H3N2)特異的なサブクラス比率(IgG1/IgG2a)。 Day21におけるB/Maryland/15/2016株(B/Victoria)に対するIgG1サブクラスの抗体価。 Day21におけるB/Maryland/15/2016株(B/Victoria)に対するIgG2aサブクラスの抗体価。 B/Maryland/15/2016株(B/Victoria)特異的なサブクラス比率(IgG1/IgG2a)。
 以下に本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
 本発明において、「細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸」とは、細胞膜透過性ペプチドのN若しくはC末端にペプチド核酸が結合した分子を意味し、本明細書においては、Mitsumata-Immunostimulatory Peptide nucleic acid(MIP)とも称す。
 「細胞膜透過性ペプチド(CPP)」とは、細胞と共存した場合に細胞膜を通過して細胞内に移行するペプチドをいう。例えば、表1に示す、HIVのTAT由来のペプチド、ショウジョバエのアンテナペディア由来のPenetratin、ポリアルギニン、神経ペプチドガラニンから派生したTransportan、SV40のNuclear Localization Signal(NLS)由来のPep-1、抗菌ペプチドLL37が挙げられるが、それらに限定されない。
 好ましくは、TAT由来ペプチド(配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるペプチド)が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 「ペプチド核酸(PNA)」とは、核酸の糖-リン酸骨格をN-(2-アミノエチル)グリシンに置き換えた骨格を有し、メチレンカルボニル結合で塩基を結合させた核酸類似体である。本発明において用いられるペプチド核酸中の塩基(Base)としては、アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシルのいずれでも良く、鎖長は一般的な20mer以下が望ましいが、アジュバンド活性の点から、好ましくは3~12merであり、より好ましくは3~10merである。
 下記式(1)に、3~12merのペプチド核酸の構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
〔式中、Baseは同一又は異なっていてもよく、アデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシルを示し、Rは-COOH又は-CONHを示し、nは1~10の整数を示す。〕
 本発明において用いられる、好適なペプチド核酸としては、例えば塩基として少なくとも1個のグアニン又はシトシンを有する3mer又は10merのペプチド核酸、塩基として3個のグアニンを有する3merのペプチド核酸(G3PNA)、塩基として3個のシトシンを有する3merのペプチド核酸(C3PNA)、塩基として10個のシトシンを有する10merのペプチド核酸(C10PNA)等が挙げられる。
 本発明の細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸は、細胞膜透過性ペプチドのN若しくはC末端に、化学的手法、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを両末端に有する架橋剤を介して細胞透過性ペプチドとペプチド核酸のN末端間を共有結合させることにより製造することができる。
 なお、ペプチド核酸は、例えばFmoc型PNAモノマーユニット等を用い、当技術分野で公知の固相ペプチド合成法を利用して合成することができる。
 本発明において用いられる好適な細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸として、以下に示すHIVのTAT由来の13アミノ酸からなるペプチド(配列番号1)がそのC末端で、G3PNAと共有結合したMIP01(式(2))、C10PNAと共有結合したMIP03(式(3))が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 本発明において、上記細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸と組み合わせて用いられるCpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンは、いずれもアジュバントとして使用できることが知られている分子又は組成物である。
 CpG-ODN(CpG oligonucleotide)は、CpGモチーフ(特定の6塩基(5′-プリン-プリン-CG-ピリミジン-ピリミジン-3′)で構成されるオリゴDNA)を含む合成核酸であり、TLR9を介してI型IFN,炎症性サイトカイン,B細胞の増殖,樹状細胞の成熟化,NK細胞の活性化などを誘導する強力なTh1型アジュバントとして知られている。CpG-ODNは構造上の特徴によってA~Cの3クラスに分類され、本発明のCpG-ODNはその配列構造は限定されないが、B細胞の増殖,樹状細胞の成熟化を誘導する点から、BクラスのCpG-ODNが好ましい。
 BクラスのCpG-ODNの構造は、直線状であり、ホスホロチオエート骨格を有するのが特徴であり、例えば、ODN1668(5’-tccatgacgttcctgatgct-3’(配列番号8))、ODN1826(5’-tccatgacgttcctgacgtt-3’ (配列番号9))、ODN2006(5’-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3’ (配列番号10))、CpG1018(5’-tgactgtgaacgttcgagatga-3’ (配列番号11)等が市販されている。
 スクワレン含有エマルジョンは、スクワレンを投与当りに3~15mg、好ましくは5~10mg含有する水中油型乳濁液であり、スクワレンの他に界面活性剤及びトコフェロール等の抗酸化剤を含有することもできる。市販品としては、例えばAddavax(商標)(InvivoGen社;以下、「Addavax」と称する)等が挙げられる。
 本発明の細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸とCpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンとの組み合わせにおいて、その使用比率は細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸1質量部に対し、CpG-ODNでは0.06~60質量部の範囲であるのが好ましく、0.6~30質量部であるのがより好ましい。また、スクワレン含有エマルジョンでは30~150質量部の範囲であるのが好ましく、50~100質量部であるのがより好ましい。
 後述実施例に示すとおり、式(3)で示されるMIP03をCpG-ODN(ODN1826)又はスクワレン含有エマルジョン(Addavax)と組み合わせて、それぞれインフルエンザ抗原(スプリット抗原)を添加して調製したワクチン組成物をマウスへ注射した場合、当該抗原に対する血中の抗体価は、相乗的に高くなる。また、IgGサブクラスの評価では、Th1型免疫とTh2型免疫誘導のバランスは、CpG-ODN及びスクワレン含有エマルジョンの性質がそれぞれ維持される。すなわち、細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸は、CpG-ODNやスクワレン含有エマルジョンと組み合わせることにより、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンが誘導する免疫の質を変えることなく、当該アジュバントの免疫の強度を高める機能を有する。
 したがって、細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸は、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンのアジュバント活性増強剤となり、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンと組み合わせて使用することにより、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンのアジュバント活性を増強することができる。そして、細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸と、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョン含有する組成物は高い免疫強度を発揮するアジュバント組成物となり得る。
 本発明において、「アジュバント」とは、抗原を注射若しくは経粘膜投与する場合において、抗原に対する免疫応答を増加させる物質を意味する。
 本発明において、「CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンのアジュバント活性増強」とは、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョン(アジュバント物質)が誘導する免疫の質を変えることなく、当該アジュバント物質の免疫の強度を高めることを意味する。
 本発明のアジュバント組成物は、抗原と組み合わせて投与することができ、投与は抗原の投与と同時であっても、抗原の投与の前又は後であっても良い。
 本発明のアジュバント組成物の投与量は、投与対象、投与方法、投与形態、抗原の種類に応じて適宜決定することができる。
 本発明のアジュバント組成物は抗原と組み合わせて、ワクチン組成物とすることができ、さらに薬学的に許容される担体を適宜添加して適当な製剤にすることができる。本発明のワクチン組成物において、細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸(MIP)は抗原若しくはその他成分と化学的結合状態にあっても良く、遊離の分子状態で存在しても良い。
 抗原としては、病原体から精製された天然の生産物、又は遺伝子組換え等の手法により人為的に作製されたタンパク質若しくはペプチドが該当し、具体的には完全なウイルス粒子であるビリオン、不完全ウイルス粒子、ウイルス構造タンパク質、ウイルス非構造タンパク質、病原菌の全菌体、病原菌由来のタンパク質若しくは糖タンパク質、感染防御抗原、中和エピトープ等が挙げられ、感染性を有するものと感染性を消失させたもの(不活化抗原)とが含まれる。不活化抗原としては、例えば、物理的(X線照射、UV照射、熱、超音波)、化学的(ホルマリン、ベータプロピオラクトン、バイナリーエチレンイミン、水銀、アルコール、塩素)等の操作により不活化されたものが挙げられるが、それらに限定されない。病原体由来の抗原は、安全性の観点から、上記ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原であることが望ましい。
 ウイルスとしては、例えば麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス、水痘ウイルス、重症急性呼吸器感染症候群(SARS)ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)、ヒトパピローマウイルス、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルス、デングウイルス、ジカウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、RSウイルス、インフルエンザウイルス等が挙げられ、好ましくはインフルエンザウイルスである。
 病原菌としては、ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザb型菌、肺炎球菌、コレラ菌、結核菌、歯周病菌等が挙げられる。
 ワクチン組成物の剤形としては、例えば、液剤、懸濁剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。液剤としては、精製水、緩衝液に溶解したもの等が挙げられる。懸濁剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルビロリドン、ゼラチン、カゼイン等と共に精製水、緩衝液等に懸濁させたもの等が挙げられる。
 これらの製剤には、通常使用されている吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤、防湿剤、溶解補助剤等を必要に応じて添加することができる。
 なお、本発明のワクチン組成物には、当該ワクチンの免疫原性及び安全性を害さない限りにおいて、細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸、CpG-ODN及びスクワレン含有エマルジョン以外のアジュバント物質を含有することもできる。
 本発明のワクチン組成物に含まれる抗原の量は、特異的抗体応答を誘導するのに十分な量であれば特に限定されるものではなく、併用するアジュバント組成物との比率も勘案して適宜設定することができる。例えば、抗原としてインフルエンザウイルスのスプリット抗原を用いた場合、1回の投与用量である1~60μg HA(HA換算)の範囲内で含有すればよく、9~15μg HA(HA換算)がより好ましい。前記濃度は、HAタンパク質の濃度を一元放射免疫拡散試験法等の、WHOや国の基準で定められた試験法で測定することによって得られる値である。
 本発明のワクチン組成物の投与経路は特に限定されず、注射による投与(皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、静脈内投与)、経口投与、非経口投与(例えば、鼻腔投与、点眼投与、経膣投与、舌下投与、経皮投与)のいずれでもよく、例えば、鼻腔内に滴下、噴霧又はスプレーすることにより投与される。
 本発明のアジュバント組成物又はワクチン組成物の投与対象は、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられるが、ヒトが好ましい。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、アカゲザル、カニクイザル、オランウータン、チンパンジー等が挙げられる。
 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
<細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸(MIP)>
 MIPとして前記式(3)で示したMIP03を株式会社ペプチド研究所に合成を委託した。
実施例1 DIFのインフルエンザワクチンにおけるアジュバント活性評価
 インフルエンザHAワクチン「生研」のA/H1N1亜型(A/Kansas/14/2017株)及びB/Victoria系統(B/Maryland/15/2016株)の各原液をスプリット抗原(SV)とし、0.1mL当りに各株のヘムアグルチニンが0.6μg、MIP03が100μg及びCpG-ODN(ODN1826(InvivoGen社)、配列番号9)が6μgとなるよう添加し、これをDIF-01製剤とした。また、スプリット抗原(SV)を用いて、0.05mL当りに各株のヘムアグルチニンが0.6μgと、MIP03が100μgとなるよう添加し、この調製液に等量の水酸化アルミニウム(Alm(Thermo Scientific社))若しくはスクワレン含有エマルジョン(Addavax(InvivoGen社))を混合し、それぞれDIF-02製剤及びDIF-03製剤とした。
 また、対照として、0.1mL当りに各株のヘムアグルチニンが0.6μgとなるよう調製した非アジュバント製剤、0.1mL当りに各株のヘムアグルチニンが0.6μg及びMIP03が100μgとなるよう調製したMIP-03製剤、0.1mL当りに各株のヘムアグルチニンが0.6μg及びODN1826が6μgとなるよう調製したODN1826製剤、スプリット抗原(SV)を用いて、0.05mL当りに各株のヘムアグルチニンが0.6μgとなるよう調整し、これに等量のAlm(Thermo Scientific)若しくはAddavax(InvivoGen)を混合した、Alm製剤及びAddavax製剤をそれぞれ調製した。
 上記の通りに調製した製剤(表2)をBALB/cマウス(雌、5週齢)の後背部皮下へ0.1mL投与し(各群8匹)、投与から21日後に全採血した。全採血で得られた血液を遠心分離して血清を調製し、血清のA/Kansas/14/2017株及びB/Maryland/15/2016株に特異的に結合するIgG(Total IgG)抗体価、IgG1サブクラス抗体価及びIgG2aサブクラス抗体価をそれぞれ測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 各投与群のIgG抗体価は図1及び図2に示す通りである。A/Kansas/14/2017株に対する抗体価は、DIF-01製剤投与群はODN1826製剤投与群に対して、DIF-03製剤投与群はAddavax製剤投与群に対して、いずれも有意に高い抗体誘導を示した。また、B/Maryland/15/2016株に対する抗体価は、DIF-03製剤投与群でAddavax製剤投与群に対して有意に高い抗体誘導を示し、DIF-01製剤投与群では有意差はないもののODN1826製剤投与群よりも高い抗体価であった。統計学的有意差を示したDIF-01、DIF-03及びこれらが含むアジュバントの単独投与群の幾何平均抗体価(GMT)とGMTの非アジュバント群に対する比率を表3及び4にまとめた。表3にはA/Kansas/14/2017株に対するGMT及びGMT比率をまとめたが、DIF-01はODN1826やMIP-03と比べてもGMTの比率が大きく、相乗的な効果を示すと考えられ、これはDIF-03とAddavax及びMIP-03との比較でも同様であった。また、B/Maryland/15/2016株についても、表4に示す通りA/Kansas/14/2017株と同様にDIF-01及びDIF-03のGMTは相乗的アジュバント効果の結果であると考えられた。したがって、DIF-01及びDIF-03については、アジュバントの混合によってシナジスティックな免疫賦活効果を示した。一方で、DIF-02製剤投与群とAlm製剤投与群の抗体誘導は同程度であり、MIP-03はAlmとの混合ではアジュバント活性の向上が期待できないことがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 次に、IgG1及びIgG2aサブクラスの抗体価とサブクラスの比率を評価した。A/Kansas/14/2017株の結果を図3A~図3C、B/Maryland/15/2016株の結果を図4A~図4Cに示すが、DIF-01製剤及びDIF-03投与群の各サブクラスの抗体価は、いずれもODN1826製剤投与群及びAddavax製剤投与群に比べて同等若しくは高い抗体価を示すが、IgG1/IgG2aのサブクラスの比率はDIF-01製剤投与群ではODN1826製剤投与群と同様にIgG2a優位であり、DIF-03製剤投与群ではAddavax製剤投与群と同様にIgG1優位である。したがって、MIP-03は混合する既知のアジュバントが誘導する免疫の質を変化させずに、免疫の強度を高める作用があると考えられる。

Claims (7)

  1.  細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸を有効成分とする、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンのアジュバント活性増強剤。
  2.  細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸を、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンと組み合わせて使用する、CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンのアジュバント活性増強方法。
  3.  細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸とCpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンを含有するアジュバント組成物。
  4.  薬学的に許容される担体を含有する請求項3記載の組成物。
  5.  請求項3又は4記載の組成物及び抗原を含有するワクチン組成物。
  6.  CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンのアジュバント活性増強剤を製造するための、細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸の使用。
  7.  CpG-ODN又はスクワレン含有エマルジョンのアジュバント活性を増強するための、細胞膜透過性ペプチドが結合したペプチド核酸。
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