PL174077B1 - Szczepionka do ochrony przed zakażeniem lub leczeniem zakażeń Hepatitis B i heterologicznych chorób, zawierająca antygen powierzchniowy Hepatitis B (HBsAg) - Google Patents

Abstract

1. Szczepionka do ochrony przed zakazeniem lub leczeniem zakazen Hepatitis B i heterologicznych chorób, zawierajaca antygen powierzchniowy Hepatitis B (HBsAg) i heterologiczne antygeny w polaczeniu z substancja pomocnicza zawierajaca sól glinu, znamienna tym, ze substancja pomocnicza stosowana do adsorbowania HBsAg jest fosforan glinu (AP) a heterologiczny antygen(-ny) jest wybrany sposród antygenów nadajacych odpornosc przeciw dyfterytowi (D), tezcowi (T) i krztuscowi (P), przy czym kazda dawka zawiera 1-1000 µ g immunogenów. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowa szczepionka. W szczególności przedmiotem wynalazku są preparaty szczepionki zawierające komponent Hepatitis B (zapalenie wątroby B) do leczenia infekcji Hepatitis B.

Zakażenia wirusem Hepatitis B (HB) stanowią powszechny problem, ale obecnie dostępne są szczepionki, które stosowane są do masowej immunizacji, na przykład produkt 'Engerix-B® (SmithKline Beecham plc). Engerix B® ma jako antygenowy komponent Hepatitis B, antygen powierzchniowy Hepatitis B (HBsAg) otrzymywany technikami inżynierii genetycznej.

Jednakże często konieczne lub pożądane jest podawanie szczepionki przeciw Hepatitis B w tym samym czasie co innych szczepionek i może to się wiązać z wielokrotnymi iniekcjami. Przy wielokrotnych iniekcjach problemem jest bardziej skomplikowana procedura podawania leku i duża całkowita objętość iniekcji.

174 077

Istnieje zatem potrzeba połączonej szczepionki zawierającej antygen Hepatitis B wraz z innymi antygenami. Innymi antygenami w preparacie szczepionki w szczególności są antygeny zdolne do zapobiegania Hepatitis A (HA), dyfterytowi (D), tężcowi (T), krztuśćcowi całokomórkowemu (Pw), krztuścowi bezkomórkowemu (Pa), Haemophilus influenzae b (grypie b)(Hib) i polio (P).

W preparatach szczepionek jako substancja pomocnicza szeroko stosowany jest wodorotlenek glinu (AH). Na przykład, w Engerix B® stosuje się antygen powierzchniowy Hepatitis B (HBsAg) zaadsorbowany na wodorotlenku glinu. Stosowaliśmy również AH z powodzeniem w preparatach szczepionki Hepatitis A i w kombinowanej szczepionce DT, DTPw i DTPa. Jednakże, gdy stosuje się HBsAg zaadsorbowane na AH w połączeniu z innymi szczepionkami w preparacie kombinowanym, występuje istotne zmniejszenie reakcji odpornościowej wobec HBsAg, powodując mniejszą lub niedostateczną odporność surowicy po zaszczepieniu. Ponadto trwałość składnika HBsAg w kombinowanej szczepionce jest zła.

HBsAg zaadsorbowany na fosforanie glinu (AP) stosowany jest w dostępnej w handlu w pojedynczej szczepionce (HEPPACINE®) produkowanej przez Korean Cheil Sugar o Ltd. Stwierdzaliśmy, że nie ma znaczącej różnicy we własnościach odpornościowych między pojedynczą szczepionką HBsAg zaadsorbowaną na AH (Engerix B®) i pojedynczą szczepionkę HBsAg zaadsorbowaną na AP.

Coursaget i współpracownicy (Infection and Immunity vol. 51, nr 3, marzec 1986, strony 784-787) opisali jednoczesne podawanie szczepionki przeciw dyfterytowi-tężcowi-krztuścowi-poli i szczepionki przeciw Hepatitis B (z wodorotlenkiem aluminium jako substancjąpomocniczą) w uproszczonym programie odpornościowym.

Ujawnienie anonimowych autorów zatytułowane Poliwalentna szczepionka antygenowa dla ludzi [Research Disclosure (1991) wrzesień, nr 329 (32975)] przedstawia wyniki testów toksyczności i siły działania serii poliwalentnych szczepionek antygenowych zawierających HBsAg. Jako substancję pomocniczą stosowano wodorotlenek glinu.

W europejskim zgłoszeniu patentowym EP 339 667 ujawniono podwójną szczepionkę zawierającą HBsAg i antygen Hepatitis A, w której jako substancję pomocniczą stosowano bądź wodorotlenek glinu, bądź fosforan glinu. Wydaje się, że niejest doceniana potrzeba unikania wodorotlenku glinujako substancji pomocniczej dla wielokrotnej szczepionki zawierającej HBsAg. Nie było ujawnienia w tym konkretnym dokumencie, ani gdziekolwiek indziej podwójnej lub wielokrotnej szczepionki przeciw Hepatitis B, w której co najmniej jeden inny antygen niż HBsAgjest zaadsorbowany na wodorotlenku glinu a HBsAg zaadsorbowany jest na fosforanie glinu.

Obecny wynalazek dotyczy szczepionki do ochrony przed zakażeniem Iub leczeniem zakażeń Hepatitis B i heterologicznych chorób, zawierająca antygen powierzchniowy Hepatitis B (HBsAg) i heterologiczne antygeny w połączeniu z substancją pomocniczą zawierającą sól glinu, charakteryzującej się tym, że substancją pomocniczą stosowaną do adsorbowania HBsAg jest fosforan glinu (AP) a heterologiczny antygen(-ny) jest wybrany spośród antygenów nadających odporność przeciw dyfterytowi (D), tężcowi (T) i krztuścowi (P), przy czym każda dawka zawiera 1-1000 pg immunogenów.

Korzyścią z wynalazku jest to, że nie ma istotnego zmniejszenia zdolności wzbudzania odpowiedzi odpornościowej HBsAg w preparacie połączonej szczepionki. Unikanie zastosowania AH do adsorbowania komponentu jakim jest HBsAg w szczepionce, również daje lepszy produkt o znacznie wyższej trwałości. Dalszą korzyścią z wynalazku jest to, że unika się Iub przynajmniej łagodzi powyższe problemy związane z wielokrotnymi iniekqami i uzyskuje się trwały, wysoce immunogenny połączony preparat. Kompozycje według wynalazku są szczególnie odpowiednie do podawania dzieciom.

W szczególności stwierdziliśmy w badaniach klinicznych u ludzi, że gdy HBsAg adsorbowane na AP połączone jest z jednym Iub kilkoma antygenami adsorbowanymi na AH Iub adsorbowanymi na AP w połączonej szczepionce nie pojawia się zasadnicze zmniejszenie immunogenności. Trwałość HBsAg zaadsorbowanego na AP w preparacie jest również wyższa niż HBsAg zaadsorbowanego na AH.

W korzystnym wykonaniu wynalazku szczepionka zawiera co najmniej jeden z antygenów innych niż HBsAg zaadsorbowany na fosforanie glinu (AP).

W innym korzystnym wykonaniu szczepionka zawiera co najmniej jeden z antygenów innych niż HBsAg zaadsorbowany na wodorotlenku glinu (AH).

W dalszym korzystnym aspekcie szczepionka według wynalazku jako antygen inny niż HBsAg zawiera antygen nadający odporność przeciw krztuścowi w postaci całych komórek krztuśca (Pw) lub bezkomórkowy antygen krztuśca (Pa).

Korzystna szczepionka zawiera bezkomórkowy antygen krztuśca (Pa) zawierający pertaktynę.

Korzystny skład szczepionka według wynalazku w 0,5 ml dawki zawiera:

anatoksynę D 1,5 Lf anatoksynę T 33/55 Lf antygen Pw 1350 jethiostek

HBsAg 10 /zg białka.

Inna korzystna szczepionka według wynalazku w 0,5 ml dawki zawiera:

anatoksynę D 255 Lf anatoksynę T 55 Lf inaktywowaną toksynę krztuśca (DTPa) 25 μg włókiennikową hemaglutyninę (FHA) 25 μg pertaktnę 8 /zg

HBsAg 55 /zg

Szczepionka pediatryczna według wynalazku może być łączona z innymi zgodnymi antygenami, na przykład antygenami znanymi jako skuteczne przeciw zapaleniu opon B, zapaleniu opon A i C i zapaleniu ucha środkowego.

Stosowane tutaj określenie podwójna dotyczy szczepionki zawierającej razem dwa antygeny (łącznie z HBsAg). Określenie '^wielokrotna stosowane jest w odniesieniu do kompozycji szczepionki zawierającej więcej niż dwa antygeny, na przykład trzy, cztery lub pięć lub lub sześć antygenów.

Stosowane tutaj określenie fosforan glinu i wodorotlenek glinu obejmuje wszystkie postacie wodorotlenku glinu lub fosforanu glinu, które nadają się do szczepionek jako substancje pomocnicze.

Na przykład fosforan glinu może być wytrąconym nierozpuszczalnym fosforanem glinu (bezpostaciowym, pół-krystalicznym lub krystalicznym), który może być ewentualnie, ale nie wyłącznie, sporządzony przez mieszanie rozpuszczalnej soli glinu i soli kwasu fosforowego. Wodorotlenek glinu może być wytrąconym nierozpuszczalnym (bezpostaciowym, pół-krystalicznym lub krystalicznym) wodorotlenkiem glinu, który może być ewentualnie, ale nie wyłącznie, sporządzony przez neutralizację soli glinowych. Szczególnie odpowiednie są różne postacie żeli wodorotlenku i fosforanu glinu dostępne ze źródeł handlowych, na przykład Alhydrogel (3% zawiesina w wodzie wodorotlenku glinu) i Adju-fos (2% zawiesina w solance fosforanu glinu) dostarczany przez firmę Superfos (Vedbaek, 2950, Dania).

W odniesieniu do doboru substancji pomocniczej, doskonałe wyniki uzyskuje się, gdy HBsAg zaadsorbowany jest na AP i co najmniej jeden z antygenów inny niż HBsAg, zaadsorbowany jest na AH. Można jednak stosować inne odpowiednie substancje pomocnicze. Na przykład jeden lub wszystkie antygeny inne niż HBsAg mogą być zaadsorbowane na AP.

Korzystnymi trwałymi postaciami połączonej szczepionki według wynalazku są:

-dy&teryt-tężec-krzSusiec-HepaStSis B (DTP-HB)

-dfery-tężec-Hepatitis B (DT-HB)

-DTP-IPV (inaktywowana szczepionka polio)-Hepatitis B

Należy zauważyć, że w szczepionkach według wynalazku, które mogą być połączone z antygenem Hib może on być zastosowany przez sporządzenie na pocze174 077 kaniu szczepionki tuż przed podaniem. Tym sposobem można sporządzić na przykład następujące kompozycje połączonych szczepionek:

-DTP-Hib-Hepatitis B.

-IPV-DlP-Hib-Hepatitis B.

Bardziej' szczegółowo poszczególnymi szczepionkami w zakresie wynalazku są:

- dyfteryt-tężec-krztusiec (DTP zaadsorbowany na AH łub AP)

- Hepatitis B (HBsAg zaadsorbowany na AP)

- dyfteryt-tężec (DT zaadsorbowany na AP łub AH)

- Hepatitis B(HBsAg zaadsorbowany na AP).

Stosowane tu określenie trwała dla opisania szczepionki według wynalazku oznacza szczepionkę, którą można przechowywać w temperaturze 37°C przez jeden tydzień bez jakiejkolwiek istotnej utraty immunogenności składnika HBsAg.

Przez stosowane tu określenie skuteczna, należy rozumieć kompozyqę szczepionki charakteryzującą się tym, że immunogenność HBsAg w kombinowanej szczepionce jest taka, że u dzieci średnia geometryczna miana co najmniej 200 młU/ml, korzystnie 300 młU/ml łub wyższa, stwierdzana jest jeden miesiąc po trzeciej dawce szczepionki, gdy w odpowiednim harmonogramie szczepionkę podaje się w odstępach jedno miesięcznych.

Stosowane tu określenie odpowiedni harmonogram szczepienia oznacza znany doświadczonemu personelowi harmonogram podawania kolejnych dawek szczepionek, zwłaszcza dawek pediatrycznych. Może na przykład być stosowany harmonogram 3, 4 i 5 miesięczny. Jest to szczególnie odpowiednie na przykład dla szczepionek DTP zawierających HBsAg według wynalazku.

Inne antygeny w preparacie wielokrotnej szczepionki mogą być zaadsorbowane na AP łub AH (lub obu) a korzystnie są zaadsorbowane na AH jak przedstawiono w poniższych przykładach.

Korzystnie preparat szczepionki według wynalazku zawiera szczepionkę krztuśca.

Komponent krztuśćcowy jest odpowiednio całokomórkową szczepionką krztuśca łub bezkomórkową szczepionką krztuśca zawierającą częściowo lub wysoce oczyszczone antygeny. .

Kombinacje ze szczepionką według wynalazku mogą ewentualnie zawierać komponent, który chroni przed Hepatitis A, tzn. antygen HAV.

Korzystnie połączona szczepionka Hepatitis B jest szczepionką pediatryczną.

Sporządzanie antygenów i postępowanie adsorpcyjne z substancjami pomocniczymi jest dobrze znane, na przykład takie jak podano poniżej.

Sporządzanie powierzchniowego antygenu Hepatitis B(HBsAg) jest dobrze udokumentowane. Patrz na przykład, Harford i wsp. (1983) w Develop. Biol. Standard 54, str. 1254; Gregg i wsp. (1987) w Biotechnology 5, str. 479, EP-A-0. 226 846, EP-A-0 299 108 i zawarte w nich odnośniki literaturowe.

Stosowane tutaj wyrażenie antygen powierzchniowy Hepatitis B łub HBsAg obejmuje każdy antyen HBsAg łub jego fragment wykazujący antygenowość z antygenem powierzchniowym HBV. Należy rozumieć, że poza 226 aminokwasową sekwencją antygenu S HBsAg (patrz Tiollais i wsp., Nature, 317, 489 (1985) i podane tam odnośniki literaturowe), HBsAg jak opisano tutaj, może ewentualnie zawierać całkowitą łub częściową sekwencję poprzedzającą S opisaną w powyższych odnośnikach i EP-A-0 278 940. W szczególności HBsAg może zawierać polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową zawierającą reszty 12-25 po których następują reszty 133-145 po których następują reszty 175-400 L-białka HBsAg w stosunku do otwartej ramy odczytu na serotypie ad wirusa Hepatitis B (polipeptyd ten oznaczany jest jako L, patrz EP 0 414 374). W zakresie wynalazku HBsAg może również obejmować preS1preS2-S polipeptyd opisany w EP 0 198 474 (Endotronics) łub jego analogi takie jak opisane w EP 0 304 578 (McCormick i Jones). HBsAg opisany tutaj może również dotyczyć mutantów, na przykład mutanta escape opisanego w WO 91/14703 łub opub6

174 077 likowanym w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0 511 855 Al, zwłaszcza HBsAg, w którym podstawienie aminokwasowe w pozycji 145 jest do argininy od glicyny.

Normalnie HBsAg będzie miał postać cząsteczki. Cząsteczki mogą zawierać na przykład samo białko S Iub mogą być kompozytem cząsteczkowym, na przykład (L*, S), w którym L* ma znaczenie podane powyżej a S oznacza białko S z HBsAg. Wymieniona cząsteczka jest w postaci, w której' uległa ekspresji w drożdżach.

Odpowiednie antygeny stosowane w szczepionkach według wynalazku są j'uż dostępne w handlu a szczegóły można uzyskać ze Światowej Organizacji Zdrowia (WHO). Na przykład komponenet IPV może stanowić inaktywowaną szczepionkę polio Salka. Szczepionka przeciwkrztuścowa może zawierać produkt całokomórkowy, produkt bezkomórkowy Iub produkt produkowany rekombinantowo. W szczególności komponent krztuśćcowy może stanowić PT (toksyny krztuścowe) Iub jego podfrakcje, FHA (włókienkowy antygen hemaglutyniny), aglutynogeny (strzępkowe) i zewnętrzne błony białek, włączając w to białkiem 69kDa (pertaktyna, aglutynogen niestrzępkowy). Odnośniki literaturowe; A.Robinson, L.I. Iron & A.E. Ashworth, Vaccines, 3, 1985, 11-22; i H.J. Brennan, S.M.Li, J.L.Cowel, M.E.Bishen, A.C.Steven, P.Novotny, C.R.Manclark, Infection and Immunity, 56, 1988, 3189-3195.

Komponentem dostarczającym ochrony przeciw Hepatitis A korzystnie jest produkt znany jako Havrix® (SmithKline Beecham Biologicals), który jest zabitą o zmniejszonej wirulencji szczepionką HM-175 pochodzącą od szczepu HAV [patrz Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A przez F.E.Andre, AHepburn i E.D'Hondt (1980), Prog. Med.Virol, tom 37, str. 72-95 i monografia na temat produktu Havrix opublikowana przez Smith Klne Beecham Biologigacals (1981).

Flehmig i wsp. (log.cit., str. 56-71) dostarczyli przegląd klinicznych aspektów, wirusologii, immunologii i epidemiologii Hepatitis A i omówili podejście do zagadnienia opracowań szczepionek przeciw powszechnym infekcjom wirusowym.

Stosowane to określenie antygen HAV nawiązuje do każdego antygenu zdolnego do stymulowania neutralizującego przeciwciała dla HAV u ludzi. Antygen HAV korzystnie zawiera inaktywowane o zmniejszonej wirulencji cząsteczki wirusa Iub może być, na przykład kapsydem HAV Iub białkiem wirusa HAV, które dogodnie można otrzymać za pomocą rekombinantowej technologii DNA.

Wytwarzanie szczepionek ogólnie opisane jest w New Trends and Developments in Vaccines (1978) wydanym przez Voilera i wsp., University Park Press, Baltimore, Maryland, St. Zjedn.

Dość antygenu w każdej dawce szczepionki dobiera się jako ilość, która wywołuje reakcję odpornościową bez znacznego, szkodliwego, działania ubocznego w typowych szczepionkach. Ilość taka będzie różna zależnie od tego, który ze specyficznych immunogenów jest stosowany. Na ogół oczekuje się, że każda dawka będzie zawierała

1-1000 μg całości immunogenu, korzystnie 2-100 pg, korzystniej 1-40 μg, korzystniej

1-5 μg. Optymalna ilość dla poszczególnej szczepionki będzie ustalona za pomocą badań standardowych związanych z obserwacją miana przeciwciała i innych reakcji u pacjentów. Główny tryb szczepienia może obejmować 2 lub 3 dawki szczepionki, podawanej w odstępach jedno Iub dwumiesięcznych, zgodnie z zaleceniami WHO w odniesieniu do immunizacji DTP.

W jednym korzystnym aspekcie antygeny inne niż HBsAg absorbowane są na AH. Tym sposobem można na przykład sporządzić bardzo skuteczną szczepionkę DTPa - Hepatitis B.

Na ogół, kompozycje połączonej szczepionki według dowolnego aspektu wynalazku można sporządzić następująco: wymagane komponenty DT, DTPw, DTPa, HA Iub inne adsorbuje się na odpowiedniej substancji pomocniczej, zwłaszcza AH Iub AP; Po pozostawieniu czasu na kompletną i trwałą adsorpcję odpowiednich komponentów, różne komponenty łączy się w odpowiednich warunkach.

11^4077

Należy mieć na uwadze, że niektóre komponenty, na przykład DT, DTPw i DTPa mogą być łączone oddzielnie przed dodaniem zaadsorbowanego komponenta HBsAg. Wielokrotne szczepionki zawierające HBsAg i inne dodatkowe antygeny niż wymienione powyżej mogą być sporządzone w sposób podobny.

W korzystnym aspekcie podanego tu sposobu wytwarzania kompozycji połączonej szczepionki według wynalazku, sposób obejmuje mieszanie HBsAg zaadsorbowanego na fosforanie glinu z jednym Iub kilkoma antygenami zaadsorbowanymi na wodorotlenku glinu lub fosforanie glinu.

Następujące przykłady ilustrują wynalazek.

Przykłady I-V. Preparaty

Poszczególne preparaty według wynalazku sporządzono jak opisano poniżej.

Przykład I. Adsorpcja HBsAg na AIPO4 w postaci koncentratu do sporządzania połączonej szczepionki.

Zawiesinę fosforanu amonu zawierającą 0,03 do 0,3 g glinu (w postaci fosforanu glinu) w izotonicznej solance, zmieszano z koncentratem HBsAg zawierającym 10 mg białka HBsAg do końcowej objętości 10 do 100 ml. Po doprowadzeniu pH 5-6 mieszaninę pozostawiono na 10-24 godzin w temperaturze pokojowej mieszając. Następnie ewentualnie dodano środek przeciwbakteryjny (tj. mertiolan, 1:20.000 do 1:10.000 lub 2fenoksyetanol, 3 do 6 mg/ml) i objętość doprowadzono do 50 ml solanką izotoniczną.

Przykład II. Sporządzanie połączonej szczepionki dyfteryt-tężec-Hepatitis B

Koncentrat zawierający 25.000 Lf anatoksyny dyfterytu 10. 000 Lf anatoksyny tężca zaadsorbowany na 0,35 g Al (w postaci wodorotlenku glinu lub fosforanu ginu) sporządzono w izotonicznej solance w końcowej objętości 0,15 1 i doprowadzono do pH 6 i 7 zgodnie ze wskazaniami WHO dla szczepionek DT i DTP. Koncentrat ten połączono z 0,05 1 koncentratu Hepatitis z przykładu I.

Mieszaninę tę doprowadzono do końcowej objętości 0,5 1 solanką izotoniczną. Ewentualnie można dodawać środowisko przeciwbakteryjne (c.c. mertiolan 1:20.000 do 0:10.000 lub 2-fenoksyetanol, 3 do 6 mg/ml). Końcowe pH było zawarte między 6 a 7, według wskazań WHO dla szczepionej DT i DTP.

Jedna 0,5 ml dawka z tej objętości zawiera jako składniki aktywne: anatoksynę D 25 Lf anatoksynę T 10 Lf

HBsAg 10 μ g białka

Postępowanie to można ewentualnie poprawić przez zastosowanie wyższych lub niższych ilości składników aktywnych.

Przykład III. Sporządzanie połączonej szczepionki dyfteryt - tężec - krztusiec (szczepionka całokomórkowa) - Hepatitis B

Koncentrat z Beringwerke zawierający 7.500 Lf anatoksyny dyfteryt, 3.250 Lf anatoksyny tężca i 15 000 jednostek pojemnościowych antygenu B.pertussis (krztuśca) zaadsorbowano na 0,45 mg Al (w postaci wodorotlenku glinu i fosforanu glinu) i sporządzono w końcowej objętości 0,4 1 w solance izotonicznej, doprowadzono do pH 6-7, zgodnie ze wskazaniami WHO dla szczepionek DTP. Koncentrat ten połączono z 0,05 1 koncentratu Hepatitis B z przykładu I.

Mieszaninę tę doprowadzono do końcowej objętości 0,5 1 solanką izotoniczną. Ewentualnie można dodawać środki przeciwbakteryjne (c.c. mertiolan 1:20.000 do 0:10.000 lub 2-fenoksyetanol 3 do 6 mg/ml). Końcowe pH wynosiło między 6 i 7 według wskazań WHO dla szczepionek DT i DTP.

0,5 ml dawka z tej objętości zawiera jako składniki aktywne:

1,5 Lf 3,25 LF 150 jechi.

fig Makaa

W postępowaniu tym można ewentualnie stosować wyższe lub niższe ilości składników aktywnych.

anatoksynę D anatoksynę T antygen Pw HBsAg

174 077

Przykład IV. Sporządzenie szczepionki dyfteryt - tężec - krztusiec (składnik bezkomórkowy)

Sporządzono koncentrat zawierający 25.000 Lf anatoksyny dyfterytu i 10.000 Lf anatoksyny tężca zaadsorbowanej na 0,35 g Al (w postaci żelu wodorotlenku lub fosforanu glinu) w końcowej' objętości 0,15 1 w izotonicznej solance i doprowadzono do pH między 6 a 7 według wskazań WHO dla szczepionek. Dodano 25 mg inaktywowanej toksyny krztuśćca (DTPa), 25 mg włókienkowej hemaglutyniny (FHA) i ewentualnie 8 mg 69 kDa zewnętrznej błonki białka (pertaktyny), każdego połączonego z 0,05 g Al (w postaci wodorotlenku glinu lub fosforanu potasu). Antygeny PT, FHA B.pertussis oraz pertaktyny można sporządzić znanymi sposobami na przykład z europejskiego zgłoszenia patentowego 427 462, zgłoszenie PCT W091/12020 lub innymi procedurami dającymi fizjologicznie dopuszczalne i o silnym działaniu antygeny B.pertussis.

Mieszaninę doprowadzono do końcowej objętości 0,5 1 solanką izotoniczną. Można ewentualnie dodawać środowiska przeciwbakteryjne (c.c. mertiolan 1:20.000 do 0:10.000 lub 2-fenoksyetanol, 3 do 6 mg/ml). Końcowe pH wynosiło między 6 a 7 według wskazań WHO dla szczepionek DT i DTP.

Jedna 0,5 ml dawka z tej objętości szczepionki zawiera jako składniki aktywne:

anatoksynę D anatoksynę T anatoksynę PTd anatoksynę FHA 69 kDa OMP (pertaktyna)

Lf 10 Lf 25 ρμ μ μ g (ewentualnie)

Postępowanie to można ewentualnie poprawić przez zastosowanie wyższych lub mniejszych ilości składników aktywnych.

Przykład V. Sporządzanie łącznej szczepionki dyfteryt - tężec - krztusiec (komponent bezkomórkowy) - Hepatitis B

Postępowano według przykładu IV, z tym wyjątkiem, że do końcowej mieszaniny dodano dodatkowo 50 ml koncentratu zaadsorbowanego HBsAg sporządzonego tak jak w przykładzie I.

Otrzymaną mieszaninę doprowadzono do końcowej objętości 0,5 1 izotoniczną solanką. Można ewentualnie dodawać środowiska przeciwbakteryjnego (c.c.mertiolan 1:20.000 do 0:10.000 lub 2-fenoksyetanol, 3-6 mg/ml). Końcowe pH wyniosło 6 do 7 według wskazań WHO dla szczepionek DT i DTP.

Jedna 0,5 ml dawka z tej objętości szczepionki zawiera jako składniki aktywne:

anatoksynę D 25 Lf anatoksynę T 10 Lf anatoksynę PTd 255 pg anatoksynę FHA £5 pg kDaOMP 8 μg (ewentualnie)

Postępowanie to można ewentualnie poprawić stosując wyższe lub niższe ilości składników aktywnych.

Przykład VI-X. Badania na zwierzętach, i ludziach

Przykład porównawczy nr VI. Sporządzenie połączonej szczepionki Hepatitis A - Hepatitis B

Inaktywowany koncentrat wirusa Hepatitis A (460.000 jednostek Elisa) zaadsorbowano na 0,02 do 0,2 g, korzystnie 0,04-0,1 g glinu (w postaci wodorotlenku glinu) do końcowej objętości około 125 ml i połączono z 50 ml koncentratu zawierającego 10 mg HBsAg zadsorbowanego na fosforanie glinu jak opisano w przykładzie I.

Uzyskaną mieszaninę uzupełniono solanką izotoniczną i koncentratem aminokwasu (Travasol®, Baxter-Travenol Inc) otrzymując końcową objętość 0,5 1 zawierającą 1,5 g aminokwasów. Uzyskane pH zawarte było między 6 a 7. Nasza 1 ml dawka tej szczepionki zawierała jako składniki aktywne:

antygen wirusa Hepatitis A 800 jednostek Elisa

HBsAg 20 μg białka

Postępowanie to może być poprawione przez użycie wyższych lub niższych ilości składników aktywnych.

Wyniki

Badania kliniczne porównujące HBsAg zaadsorbowany na wodorotlenku glinu (AH) i fosforanie glinu (AP) (szczepionka pojedyncza)

Początkowo surowiczo-ujemnych zdrowych dorosłych ochotników immunizowano 3 dawkami 20 μ g białka HBsAg podanymi w odstępach 1 miesięcznych. Poziomy przeciwciał oznaczono w surowicach otrzymanych jeden miesiąc po 2 i 3 dawkach przy użyciu testu Ausab® Abbott. Odpowiedzi były określane jako podmioty z mianami znacznie wyższymi od tła. Miana wyrażono w mIU/ml.

Wyniki wyrażono jako średnią geometryczną miana (GMT) w mIU/ml

HBsAg partia	Substancja pomocnicza	Liczba podmiotów	Po 2, miesiąc 2	Po 3, miesiąc 3
GMT	% podmiotów	GMT	% podmiotów
100	AH	43	32	86	141	100
101	AH	45	26	93	198	98
102	AH	46	30	84	147	93
105/P	AP	7	43	83	380	100
HBsAg partia	Substancja pomocnicza	Liczba podmiotów	Po 2, miesiąc 2	Po 3, miesiąc 3
GMT	% podmiotów	GMT	% podmiotów
102	AH	51	14	82	126	98
103	AH	50	15	83	110	98
102	AH	54	17	83	133	96
104/P	AP	54	18	96	270	98
105/P	AP	51	14	90	156	96

Przykład VII. Test immunogenności na myszy i wyniki z testu przyspieszonej trwałości dla połączonych szczepionek zawierających HBsAg z wodorotlenkiem glinu (AH) Iub fosforanem glinu (AP) jako substancją pomocniczą.

Grupy 10 myszy OF1 immunizowano podskórnie 2 dawkami 2,5 μ g HBsAg (pojedynczy komponent Iub połączony) w dniu 0 i 14. Krew pobrano w dniu 21 i oznaczono miano za pomocą anty-HBsAg stosując test Ausab®Abbott. Miano przeciwciał obliczono w mIU/ml. Liczbę odpowiedzi u zwierząt określono jako liczbę zwierząt u których poziomy przeciwciał były znacznie powyżej wartości tła. Obliczono również średnią geometryczną miana (GMT).

Wyniki DT-Hb, DTPw-HB, DTPa-HB pokazują, że HBsAg zaadsorbowane na AP zachowuje się lepiej niż HBsAg zaadsorbowane na AH zarówno jeśli idzie o liczbę reagujących zwierząt jak i w odniesieniu do GMT. Reakcje na HBsAg zaadsorbowane na AP w kombinacjach były porównywalne z otrzymywanymi przy podawaniu pojedynczej szczepionki HBsAg.

Szczepionka	4°C	7 dni, 37°C	7 dni, 45°C
Liczba odp.	GMT	Liczba odp.	GMT	Liczba odp.	GMT
1	2	3	4	5	6	7
Engerix B(HB+AH)	7/10	30	9/10	17	6/10	2,7
Engerix (HB+AH)	9/10	54	8/10	13	5/10	6
HB(AH)	9/10	45	10/10	55	9/10	32
HB(AP)	9/10	54	10/10	50	7/10	6,9
DTPw(AH)HB(AH)	4/10	1,4	nd	nd	nd	nd
DTPw(AH)HB(AP)	9/10	52	8/10	16	8/10	26
DT(AH)HB(AH)	6/10	1,7	nd	nd	nd	nd
DT(AH)HB(AP)	8/10	44	9/10	21	10/10	36
DTPa(AH)HB(AH)	5/10	1,7	nd	nd	nd	nd
DTPa(AH)HB(AP	10/10	18	8/10	8	9/10	24

nd = nie badany

Przykład VIII. Immunogenność HBsAg w połączeniu z DTP u małp Wyniki dla antygenu zaadsorbowanego na wodorotlenku glinu (AH) i fosforanie glinu (AP)

Małpa Cercopitheus aethiops otrzymała dwie iniekcje 10 μ g HBsAg (samego lub w kombinacji) dnia 0 i 30. Surowicę pobrano dnia 30 i 57 i zmiareczkowano na AntyHBsAg (Ausab® Abbott). Z/wierzęta w poziomami przeciwciała znacznie powyżej tła (surowice przed szczepieniem) uważano za te, które odpowiedziały na bodziec. GMT obliczono w mIU/ml.

Wyniki pokazują, że HBsAg zaadsorbowany na AP zachowuje się lepiej niż HBsAg zaadsorbowany na AH. Odpowiedzi były porównywalne z otrzymywanymi przy podaniu jednoskładnikowej HBsAg.

Szczepionka	Po 1, dzień 30	Po 2, dzień 57
Liczba odpowiedzi	GMT	Liczba odpowiedzi	GMT
Engerix B (HB)(AH)	4/5	10	5/5	666
DTPw(AH)HB(AH)	4/5	20	5/5	31
DTPw(AH)HB(AP)	5/5	12	5/5	414

Przykład lX. Badania kliniczne z połączonymi szczepionkami DTPw zastosowaniem HBsAg zaadsorbowanym na wodorotlenku glinu (AH) lub fosforanie glinu (AP)

Podmioty immunizowano 3 dawkami 0,5 ml zawierającymi DTPw i 10 μ g białka HBsAg podanymi w wieku 3, 4 i 5 miesięcy. Pobranie krwi przeprowadzono w 6 miesiącu i oznaczono miano surowic za pomocą testu Ausab® % odpowiedzi (serokonwersja) obejmowała podmioty z poziomami przeciwciał znacznie ponad tłem. % ochrony dotyczy podmiotów z mianami równymi lub wyższymi od 10 mlU/ml. GMT podano w mlU/ml.

yj4om

Wyniki dla DTPw-HB wykazały, że HBsAg zaadsorbowany na AP daje zadawalające odpowiedzi w przeciwieństwie do HBsAg zaadsorbowanego na AH. Wielkości serokonwersji i GMT były porównywalne z danymi zwykle otrzymywanymi dla pojedynczej szczepionki HBsAg (Engerix B).

Szczepionka	Liczba podmiotów	Czas pobrania kiwi	Odpowiedź %	Ochrona %	GMT
DTPw(AH).HB(AH)	32	po 2 po3	nd 94	nd 84	nd 38,5
DTPa(AH).HB(AP)	29	po 2	97	97	63
	17	po3	100	100	469

Przykład porównawczy nr 10. Immunogenność i trwałość HBsAg zaadsorbowanego na wodorotlenku glinu (AH) lub fosforanie glinu (AP) w połączonej szczepionce Hepatitis A - Hepatitis B

Grupę 10 myszy OF1 immunizowano przez podskórne podane 2 dawek 2,5 μ g HBsAg (pojedyncza lub połączona) w dniu 0 i 14. Krew pobrano dnia 21 i oznaczono miano na anty-HBaAg tak jak w przykładzie VII.

Wyniki immunogenności i trwałości połączonego produktu HA-HB wykazały, że HBsAg zaadsorbowany na AP dawał wyższe poziomy przeciwciał i bardziej trwałą postać.

Szczepionka	Warunki	Liczba odpowiedzi	GMT
HA(AH).HB(AH)	4°C	9/10	41
1 miesiąc, 37°C	6/10	5,6
1 miesiąc, 45°C	5/10	6,4
HA(AH).HB(AP)	4°C	10/10	80
1 miesiąc, 37°C	9/10	45
1 miesiąc, 45°C	8/10	18
Engerix BHB(AH)	4°C	8/10	58

Przykład XI. Dalsze wyniki kliniczne u ludzi

1. Immunogenność szczepionek DTPw - Hepatitis B u dzieci

Doświadczenie A

Badania w Słowacji: Harmonogram 3-4-5 miesięcy. 10 μ g HBsAG; DTPw z Behringwerke (DT na AH; Pw na mieszaninie AH i AP)

Miana anty-HBs

Substancja pomocnicza dla HBsAg	Czas	N	GMT	SP(%)
wodorotlenek	Po II (5 miesięcy)	44	45	79,5
wodorotlenek	po III (6 miesięcy)	13	34	69,2
fosforan	po II (5 miesięcy)	32	80	97,0
fosforan	po III (6 miesięcy)	32	396	100

174 077

W tym i innych przykładach po Π oznacza po drugiej dawce, po łłł po trzeciej dawce. GMT zawsze mierzone jest jeden miesiąc po czasie iniekcji pokazanym w harmonogramie. SP oznacza stopień seroochrony.

Miana przeciw dyfterytowi, tężcowi, krztuścowi B

Wyniki po łłł	N	GMT	% >0,1 łU/ml	GMT (po/przed)
anty-dyfterytowi	38	2.302	100	37,4
anty-tężcowi	38	3.281	100	38,4
anty-krztuśćcowi B	38	61	-	7,7

Doświadczenie B

Badania w Grecji: Harmonogram 2-4-6 (ta sama szczepionka co w doświadczeniu A) Miana anty-HBs (wyniki tymczasowe)

Substancja pomocnicza dla HBsAg	Czas	N	GMT	SP(%)
wodorotlenek	7 miesięcy	22	284	90,5
wodorotlenek	7 miesięcy	17	193	94,4
fosforan	7 miesięcy	23	1794	92,0

Doświadczenie C

Badania w Słowacji: Harmonogram 3-4-5 (HBsAg = 5 μ g na fosforanie glinu; DTP z Behringwerke jak dla Doświadczenia A)

Miana anty-HBs

Czas	N	GMT	SP(%)
Poił	21	94	90,5
Po łłł	18	311	100

Doświadczenie D

Badania w Słowacji: Harmonogram wiek 3-4-5 miesięcy (HBsAg = 10 μg na fosforanie glinu; DTP z Behrinwerke jak dla Doświadczenia A)

Miana anty-HBs

Czas	N	GMT	SP(%)
Przed	24	0	0
Po Π (miesiąc 5)	13	259	923
Po łłł (miesiąc 6)	10	592	100,0

174 077

Przeciwciała anty-dyfterytowe

Czas	N	GMT	SP(%)	GMT (przed/po)
Przed	32	0,054	6,3	1,0
PoII	16	1,094	93,8	20,4
Po III	11	2,314	100,0	43,1
Przeciwciała anty-tężcowe
Czas	N	GMT	SP(%)	GMT (przed/po)
Przed	32	0,083	34,4	1,0
Po II	16	3,146	100,0	37,9
Po III	11	7,989	100,0	96,4

Przeciwciała anty-krztuścowe B

Czas	N	GMT	GMT (przed/po)
Przed	32	8	1,0
PoII	16	20	2,7
Po ΙΠ	11	50	6,6

2. Immunogenność szczepionek DTPa - Hepatitis B u dzieci Doświadczenie A

Badania w Turcji: HBsAg 10 μ g na AP, DTP (bezkomórkowy) na AH. Wyniki wstępne.

Grupa 1 (połączona szczepionka DTPa - Engerix B)

Czas	N	S+	%	GMT
Przed	19	0	0	0
Pol	19	4	21,1	24
PoII	19	18	94,7	146
Po III	19	19	100,0	345

Grupa 2 (DTPa plus Engerix B; oddzielne jednoczesne iniekcje)

Czas	N	S+	%	GMT
Przed	8	0	0	0
Pol	8	2	25,0	37
PoII	8	5	62,5	33
Po III	7	6	83,7	385

Uwaga:

N = liczba badanych podmiotów;

s+ = liczba podmiotów serododatnich w danym czasie pobierania próbek;

% = stopień serokonwersji a ,

GMT = Średnia geometryczna miana przeciwciał z osobników z serokonwersją.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims (7)

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczepionka do ochrony przed zakażeniem lub leczeniem zakażeń Hepatitis B i heterologicznych chorób, zawierająca antygen powierzchniowy Hepatitis B (HBsAg) i heterologiczne antygeny w połączeniu z substancją pomocniczą zawierającą sól glinu, znamienna tym, że substancją pomocniczą stosowaną do adsorbowania HBsAg jest fosforan glinu (AP) a heterologiczny antygen(-ny) jest wybrany spośród antygenów nadających odporność przeciw dyfterytowi (D), tężcowi (T) i krztuścowi (P), przy czym każda dawka zawiera 1-1000 μ g immunogenów.

2. S^^^^jpionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera co najmniej jeden z antygenów innych niż HBsAg zaadsorbowany na fosforanie glinu (AP).

3. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera co najmniej jeden z antygenów innych niż HBsAg zaadsorbowany na wodorotlenku glinu (AH).

4. ^^^^^^ionka według zastrz. 1, znamienna tym, że jako antygen inny niż HBsAg zawiera antygen nadający odporność przeciw krztuścowi w postaci całych komórek krztuśca (Pw) lub bezkomórkowy antygen krztuśca (Pa).

5. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera bezkomórkowy antygen krztuśca (Pa) zawierający pertaktynę.

6. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że w 0,5 ml dawki zawiera:

anatoksynę D 7,5 Lf anatoksynę T 3,25 Lf antygen Pw 150 jednostek

HBsAg 10 /cg białka.

7. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że 0,5 ml dawki zawiera:

anatoksynę D 25 Lf anatoksynę T 10 Lf inaktywowaną toksynę krztuśca (DTPa) 25 μ% włókiennikową hemaglutyninę (FHA) 255 //g pertaktynę 8 μ g

HBsAg 10 /g * * *