DE102009056871A1

DE102009056871A1 - Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben

Info

Publication number: DE102009056871A1
Application number: DE102009056871A
Authority: DE
Inventors: Gottfried 35043 Kraus; Robert 35287 Eskes
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2009-12-03
Filing date: 2009-12-03
Publication date: 2011-06-22
Also published as: US8678184B2; US20110162982A1

Abstract

Ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion umfasst drei Vorgehensweisen: (i) Herstellung einer vorläufigen Emulsion; (ii) Mikrofluidisierung der vorläufigen Emulsion zur Verringerung der Tröpfchengröße; und (iii) Filtration der mikrofluidisierten Emulsion durch eine hydrophile Membran.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Herstellung von Öl-in-Wasser-Emulsions-Adjuvantien für Impfstoffe durch Mikrofluidisierung.
STAND DER TECHNIK
Das als ”MF59” bekannte Impfstoff-Adjuvans [1–3] ist eine Submikron-Öl-in-Wasser-Emulsion aus Squalen, Polysorbat 80 (auch als Tween 80 bekannt) und Sorbitantrioleat (auch als Span 85 bekannt). Sie kann ferner Citrat-Ionen umfassen, z. B. 10 mM Natrium-Citratpuffer. Die Zusammensetzung der Emulsion kann etwa 5 Vol.-% Squalen, etwa 0,5 Vol.-% Tween 80 und etwa 0,5 Vol.-% Span 85 umfassen. Das Adjuvans und seine Herstellung werden ausführlicher in Kapitel 10 von Literaturstelle 4, in Kapitel 12 von Literaturstelle 5 und in Kapitel 19 von Literaturstelle 6 beschrieben.
Wie in Literaturstelle 7 beschrieben ist, wird MF59 im kommerziellen Maßstab hergestellt, indem man Span 85 in die Squalen-Phase und Tween 80 in die wässrige Phase dispergiert, und anschließend mit hoher Geschwindigkeit mischt, um eine Roh-Emulsion zu bilden. Diese Roh-Emulsion wird anschließend wiederholt durch eine Mikrofluidisierungs-Vorrichtung geleitet, um eine Emulsion herzustellen, die eine gleichförmige Größe der Öltröpfchen aufweist. Wie in Literaturstelle 6 beschrieben ist, wird die mikrofluidisierte Emulsion anschließend durch eine Membran von 0,22 μm filtriert, um sämtliche großen Öltröpfchen zu entfernen, und die durchschnittliche Tröpfchengröße der resultierenden Emulsion bleibt für mindestens drei Jahre bei 4°C unverändert. Der Squalen-Gehalt der finalen Emulsion kann gemessen werden, wie es in Literaturstelle 8 beschrieben wird.
Verschiedene Dokumente (z. B. Literaturstellen 9–12) offenbaren, dass MF59 durch Mikrofluidisierung und anschließender Filtersterilisation durch einen Polysulfonfilter von 0,22 μm hergestellt werden kann. Polysulfone sind Polymere, die Sulfongruppen (SO₂) im Hauptpolymerrückgrat enthalten, und Polysulfonfilter sind hinreichend bekannte hydrophobe Filter.
Es ist Ziel der vorliegenden Erfindung, weitere und verbesserte Verfahren zur Herstellung von mikrofluidisierten Öl-in-Wasser-Emulsionen (wie beispielsweise MF59) bereitzustellen, insbesondere Verfahren, die zur Verwendung im kommerziellen Maßstab geeignet sind und eine Filtration einsetzen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer Squalen enthaltenden Öl-in-Wasser-Emulsion bereit, bei dem man: (i) eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße herstellt, die auch als vorläufige Emulsion oder Prä-Emulsion bekannt ist; (ii) die erste Emulsion mikrofluidisiert, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße; und (iii) die zweite Emulsion unter Verwendung einer hydrophilen Membran filtriert.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion bereit, bei dem man: (i) eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße von 5000 nm oder weniger herstellt, die auch als vorläufige Emulsion oder Prä-Emulsion bekannt ist; (ii) die erste Emulsion mikrofluidisiert, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese geringer ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße; und (iii) die zweite Emulsion unter Verwendung einer hydrophilen Membran filtriert.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion bereit, bei dem man: (i) eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße bereitstellt, wobei diese auch als vorläufige Emulsion oder Prä-Emulsion bekannt ist; (ii) die erste Emulsion mikrofluidisiert, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese geringer ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße; und (iii) die zweite Emulsion unter Verwendung einer hydrophilen Polyethersulfon-Membran filtriert.
Die erste Emulsion kann wahlweise unter Verwendung eines wie nachstehend beschriebenen Homogenisators hergestellt werden.
Wie nachstehend ausführlicher beschrieben ist, kann die erste Emulsion eine durchschnittliche Öltröpfchengröße von 5000 nm oder weniger aufweisen, z. B. eine durchschnittliche Größe zwischen 300 nm und 800 nm. Die Anzahl der Öltröpfchen in der ersten Emulsion mit einer Größe > 1,2 μm kann 5 × 10¹¹/ml oder weniger betragen, wie nachstehend beschrieben wird. Die Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm sind unvorteilhaft, da sie aufgrund von Agglomeration und Koaleszenz von Tröpfchen eine Instabilität der Emulsion verursachen [14].
Nach ihrer Bildung kann die erste Emulsion mindestens einmal einer Mikrofluidisierung unterzogen werden, um eine zweite Emulsion mit einer verringerten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden. Wie nachstehend beschrieben ist, beträgt die durchschnittliche Öltröpfchengröße der zweiten Emulsion 500 nm oder weniger. Die Anzahl der Öltröpfchen in der zweiten Emulsion mit einer Größe > 1,2 μm kann 5 × 10¹⁰/ml oder weniger betragen, wie es nachstehend beschrieben wird. Um diese Eigenschaften zu erreichen, kann es notwendig sein, die Bestandteile der Emulsion mehrere Male durch die Mikrofluidisierungs-Vorrichtung zu leiten, z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7 Mal.
Die zweite Emulsion kann anschließend durch eine hydrophile Membran gefiltert werden, z. B. durch eine hydrophile Polyethersulfon-Membran, wobei eine Öl-in-Wasser-Emulsion entsteht, die zur Verwendung als Impfstoff-Adjuvans geeignet ist. Die durchschnittliche Öltröpfchengröße der Öl-in-Wasser-Emulsion, die nach der Filtration erzeugt wird, kann 220 nm oder weniger betragen, z. B. zwischen 135–175 nm, zwischen 145–165 nm oder etwa 155 nm. Die Anzahl der Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm, die in der nach Filtration erzeugten Öl-in-Wasser-Emulsion vorhanden ist, kann 5 × 10⁸/ml oder weniger betragen, z. B. 5 × 10⁷/ml oder weniger, 5 × 10⁶/ml oder weniger, 2 × 10⁶/ml oder weniger, oder 5 × 10⁵/ml oder weniger.
Die finale Öl-in-Wasser-Emulsion, die nach der Filtration gebildet wird, kann mindestens 10² Mal weniger Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm im Vergleich zur ersten Emulsion aufweisen, und idealerweise 10³ Mal weniger (z. B. 10⁴ Mal weniger).
In einigen Ausführungsformen wird mehr als ein Zyklus aus den Schritten (i) und (ii) vor Schritt (iii) verwendet. In ähnlicher Weise können mehrere Wiederholungen der einzelnen Schritte (i) und (ii) verwendet werden.
Das Verfahren wird im Allgemeinen zwischen 20–60°C durchgeführt, und idealerweise bei 40 ± 5°C. Obwohl die Bestandteile der ersten und zweiten Emulsion selbst bei hohen Temperaturen verhältnismäßig stabil sein können, kann immer noch ein temperaturbedingter Abbau einiger Bestandteile auftreten; daher sind niedrigere Temperaturen bevorzugt.
Bestandteile der Emulsion
Die durchschnittliche Größe der Öltröpfchen (d. h. der durchschnittliche Durchmesser der Öltröpfchen der Emulsion) kann unter Verwendung eines Verfahrens der dynamischen Lichtstreuung gemessen werden, wie es in Literaturstelle 13 beschrieben wird. Ein Beispiel für eine Vorrichtung zur Messung der dynamischen Lichtstreuung ist das Nicomp 380 Submikron-Partikelgrößen-Analysegerät (von Particle Sizing Systems).
Die Anzahl der Partikel mit einer Größe von > 1,2 μm kann unter Verwendung eines Partikel-Zählers, wie beispielsweise unter Verwendung des Accusizer^TM 770 (von Particle Sizing Systems), gemessen werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden für die Herstellung von Öl-in-Wasser-Emulsionen verwendet. Diese Emulsionen umfassen drei Grundbestandteile: ein Öl; einen wässrigen Bestandteil; und ein Tensid.
Da die Emulsionen für die pharmazeutische Verwendung bestimmt sind, wird das Öl üblicherweise biologisch abbaubar (metabolisierbar) und biokompatibel sein.
Das verwendete Öl kann Squalen (ein Öl aus der Haileber) umfassen, wobei es sich um ein verzweigtes, ungesättigtes Terpenoid handelt (C₃₀H₅₀; [(CH₃)₂C[=CHCH₂CH₂C(CH₃)]₂=CHCH₂-]₂; 2,6,10,15,19,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaen; CAS RN 7683-64-9). Squalen ist besonders für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet.
Das Öl der vorliegenden Erfindung kann eine Mischung (oder eine Kombination) von Ölen umfassen, welche z. B. Squalen und mindestens ein weiteres Öl umfasst.
Statt der Verwendung von Squalen (oder zusätzlich zur Verwendung von Squalen) kann eine Emulsion ein Öl oder Öle umfassen, einschließlich solcher, die z. B. von einem Tier (wie z. B. von einem Fisch) oder von einer Pflanze stammen. Bezugsquellen für pflanzliche Öle umfassen Nüsse, Samen und Getreide. Erdnussöl, Sojabohnenöl, Kokosnussöl und Olivenöl, die am häufigsten verfügbaren Öle, stehen beispielhaft für Nussöle. Es kann Jojobaöl verwendet werden, das von der Jojobabohne erhalten wurde. Samenöle umfassen Distelöl, Baumwollsamenöl, Sonnenblumensamenöl, Sesamsamenöl und Ähnliche. In der Getreidegruppe ist Maisöl das am häufigsten verfügbare Öl, wobei das Öl von anderen Getreidekörnern, wie beispielsweise von Weizen, Hafer, Roggen, Reis, Teff, Triticale und Ähnlichem, ebenfalls verwendet werden kann. Obwohl diese nicht natürlicherweise in Samenölen vorkommen, können Fettsäureester von Glycerol und 1,2 Propandiol mit 6-10 Kohlenstoffatomen durch Hydrolyse, Abtrennung und Veresterung geeigneter Materialien ausgehend von Nuss- und Samenöl hergestellt werden. Fette und Öle von Säugetiermilch sind metabolisierbar und können daher verwendet werden. Die Verfahren für die Abtrennung, Aufreinigung und Verseifung sowie andere Mittel, die notwendig sind, um reine Öle aus tierischen Bezugsquellen zu erhalten, sind im Stand der Technik bekannt.
Die meisten Fische enthalten metabolisierbare Öle, die leicht gewonnen werden können. Lebertran, Haifischleberöl und Walöl (wie beispielsweise Spermaceti) sind Beispiele für einige der Fischöle, die vorliegend verwendet werden können. Mehrere Öle mit verzweigten Ketten werden biochemisch in Isopren-Einheiten mit 5 Kohlenstoffatomen synthetisiert; diese werden im Allgemeinen als Terpenoide bezeichnet. Squalan, das gesättigte Analogon zu Squalen, kann ebenfalls verwendet werden. Fischöle, einschließlich Squalen und Squalan, sind kommerziell problemlos verfügbar, oder sie können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erhalten werden.
Weitere nützliche Öle sind Tocopherole, insbesondere in Kombination mit Squalen. Wenn die Ölphase einer Emulsion ein Tocopherol enthält, kann ein beliebiges der α-, β-, γ-, δ-, ε- oder ξ-Tocopherole verwendet werden, wobei jedoch α-Tocopherole bevorzugt sind. Sowohl D-α-Tocopherol als auch DL-α-Tocopherol kann verwendet werden. Ein bevorzugtes α-Tocopherol ist DL-α-Tocopherol. Das Tocopherol kann mehrere Formen annehmen, z. B. verschiedene Salze und/oder Isomere. Salze umfassen organische Salze, wie beispielsweise Succinat, Acetat, Nikotinat, usw. Wenn ein Salz dieses Tocopherols verwendet werden soll, so ist das bevorzugte Salz das Succinat. Es kann eine Öl-Kombination verwendet werden, die Squalen und ein Tocopherol (z. B. DL-α-Tocopherol) umfasst.
Der wässrige Bestandteil kann einfaches Wasser sein (z. B. Wasser für Injektionszwecke, w. f. i.), oder es kann weitere Bestandteile umfassen, z. B. Solute. Beispielsweise kann es Salze umfassen, um einen Puffer zu bilden, z. B. Citrat- oder Phosphatsalze, wie beispielsweise Natriumsalze. Übliche Puffer umfassen: einen Phosphat-Puffer; einen Tris-Puffer; einen Borat-Puffer; einen Succinat-Puffer; einen Histidin-Puffer; oder einen Citrat-Puffer. Die Puffer können üblicherweise in einem Bereich von 5–20 mM vorhanden sein.
Das Tensid ist vorzugsweise biologisch abbaubar (metabolisierbar) und biokompatibel. Tenside können anhand ihrer ”HLB” (hydrophil/lipophil Balance) klassifiziert werden, wobei eine HLB im Bereich von 1–10 üblicherweise bedeutet, dass das Tensid besser in Öl als in Wasser löslich ist, und wobei eine HLB im Bereich von 10–20 bedeutet, dass das Tensid besser in Wasser als in Öl löslich ist. Emulsionen umfassen vorzugsweise mindestens ein Tensid, das eine HLB von mindestens 10 aufweist, z. B. mindestens 15 oder vorzugsweise mindestens 16.
Die Erfindung kann mit Tensiden verwendet werden, welche die folgenden einschließen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind: die Polyoxyethylensorbitanester-Tenside (üblicherweise als Tweens bezeichnet), insbesondere Polysorbat 20 und Polysorbat 80; Copolymere von Ethylenoxid (EO), Propylenoxid (PO) und/oder Butylenoxid (BO), die unter dem Handelsnamen DOWFAX^TM vertrieben werden, wie beispielsweise lineare EO/PO-Block-Copolymere; Octaxynole, die sich hinsichtlich der Anzahl der sich wiederholenden Ethoxy(oxy-1,2-ethandiyl)-Gruppen unterscheiden, wobei Octoxynol-9 (Triton X-100, oder t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) von besonderem Interesse ist; (Octylphenoxy)-Polyethoxyethanol (IGEPAL CA-630/NP-40); Phospholipide, wie beispielsweise Phosphatidylcholin (Lecithin); Polyoxyethylen-Fettsäureether, die von Lauryl-, Cetyl-, Stearyl- und Oleyl-Alkoholen (die auch als Brij-Tenside bekannt sind) abgeleitet sind, wie beispielsweise Triethylenglycolmonolaurylether (Brij 30); Polyoxyethylen-9-laurylether; und Sorbitanester (die auch als Spans bekannt sind), wie beispielsweise Sorbitantrioleat (Span 85) und Sorbitanmonolaurat. Bevorzugte Tenside für die Einbringung in die Emulsion sind Polysorbat 80 (Tween 80; Polyoxyethylensorbitanmonooleat), Span 85 (Sorbitantrioleat), Lecithin und Triton X-100.
Es können Mischungen aus Tensiden in die Emulsion eingebracht werden, z. B. Mischungen aus Tween 80/Span 85 oder Mischungen aus Tween 80/Triton X-100. Eine Kombination aus einem Polyoxyethylensorbitanester, wie beispielsweise Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween 80), und einem Octoxynol, wie beispielsweise t-Octylphenoxy-Polyethoxyethanol (Triton X-100), ist ebenfalls geeignet. Andere nützliche Kombinationen umfassen Laureth 9 und einen Polyoxyethylensorbitanester und/oder ein Octoxynol. Nützliche Mischungen können ein Tensid mit einem HLB-Wert in einem Bereich von 10–20 (z. B. Tween 80 mit einer HLB von 15,0) und ein Tensid mit einem HLB-Wert im Bereich von 1–10 (z. B. Span 85 mit einer HLB von 1,8) umfassen.
Bildung der ersten Emulsion
Vor dem Schritt der Mikrofluidisierung können Bestandteile der Emulsion gemischt werden, sodass eine erste Emulsion gebildet wird.
Die Öltröpfchen in der ersten Emulsion können eine durchschnittliche Größe von 5000 nm oder weniger aufweisen, z. B. 4000 nm oder weniger, 3000 nm oder weniger, 2000 nm oder weniger, 1200 nm oder weniger, 1000 nm oder weniger, z. B. eine durchschnittliche Größe zwischen 800 und 1200 nm oder zwischen 300 nm und 800 nm.
Die Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm kann in der ersten Emulsion 5 × 10¹¹/ml oder weniger betragen, z. B. 5 × 10¹⁰/ml oder weniger, oder 5 × 10⁹/ml oder weniger.
Die erste Emulsion kann anschließend mikrofluidisiert werden, um eine zweite Emulsion zu bilden, die eine geringere durchschnittliche Öltröpfchengröße aufweist als die erste Emulsion und/oder weniger Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm.
Die durchschnittliche Größe der Öltröpfchen in der ersten Emulsion kann erreicht werden, indem man die Bestandteile der ersten Emulsion in einem Homogenisator mischt. Beispielsweise können diese wie in 1 gezeigt in einem Mischbehälter (12) kombiniert werden, und anschließend können die kombinierten Bestandteile in einen mechanischen Homogenisator eingebracht werden (13), wie beispielsweise in einen Rotor-Stator-Homogenisator (1).
Die Homogenisatoren können in vertikaler und/oder horizontaler Weise betrieben werden. In einem kommerziellen Umfeld werden praktischerweise Durchfluss-Homogenisatoren (in-line homogenizers) bevorzugt.
Die Bestandteile werden in einen Rotor-Stator-Homogenisator eingebracht und treffen auf einen schnell rotierenden Rotor, der Schlitze und Löcher enthält. Die Bestandteile werden nach Art einer Pumpe zentrifugal nach außen gedrückt und bewegen sich durch die Schlitze/Löcher. In einigen Ausführungsformen umfasst der Homogenisator mehrere Kombinationen von Rotoren und Statoren, z. B. eine konzentrische Anordnung von Kammzahn-Ringen, wie es durch die Merkmale (3) & (4); (5) & (6) und (7) & (8) in 1 und von 2 gezeigt wird. Die Rotoren in geeigneten großtechnischen Homogenisatoren können Kammzahn-Ringe am Rand eines horizontal ausgerichteten Rührers mit mehreren Blättern aufweisen (z. B. Merkmal (9) in 1), die mit enger Toleranz in Bezug auf passende Zähne in einem statischen Einsatzstück ausgerichtet sind. Die erste Emulsion bildet durch eine Kombination von Turbulenz, Kavitation und mechanischer Scherung, welche in der Lücke zwischen Rotor und Stator auftreten, die erste Emulsion. Die Bestandteile werden in nützlicher Weise in einer Richtung parallel zur Achse des Rotors eingebracht.
Ein wichtiger Leistungsparameter bei Rotor-Stator-Homogenisatoren ist die Spitzengeschwindigkeit des Rotors (Umfangsgeschwindigkeit). Dieser Parameter hängt sowohl von der Rotationsgeschwindigkeit als auch vom Rotordurchmesser ab. Eine Spitzengeschwindigkeit von mindestens 10 ms^–1 ist nützlich, und üblicherweise ist sie schneller, z. B. ≥ 20 ms^–1, ≥ 30 ms^–1, ≥ 40 ms^–1, usw. Eine Spitzengeschwindigkeit von 40 ms^–1 kann leicht bei 10000 UpM mit einem kleinen Homogenisator erreicht werden, oder bei geringeren Rotationsgeschwindigkeiten (z. B. bei 2000 UpM) mit einem größeren Homogenisator. Geeignete Homogenisatoren mit hoher Scherung sind kommerziell erhältlich.
Für die Herstellung im kommerziellen Maßstab sollte der Homogenisator idealerweise eine Flussrate von mindestens 300 l/h, z. B. ≥ 400 l/h, ≥ 500 l/h, ≥ 600 l/h, ≥ 700 l/h, ≥ 800 l/h, ≥ 900 l/h, ≥ 1000 l/h, ≥ 2000 l/h, ≥ 5000 l/h oder sogar ≥ 10000 l/h aufweisen. Geeignete Homogenisatoren mit hoher Kapazität sind kommerziell erhältlich.
Ein bevorzugter Homogenisator stellt eine Schergeschwindigkeit von zwischen 3 × 10⁵ und 1 × 10⁶ s^–1 bereit, z. B. zwischen 3 × 10⁵ und 7 × 10⁵ s^–1, zwischen 4 × 10⁵ und 6 × 10⁵ s^–1, z. B. etwa 5 × 10⁵ s^–1.
Obwohl Rotor-Stator-Homogenisatoren verhältnismäßig wenig Wärme während des Betriebs erzeugen, kann der Homogenisator während der Verwendung gekühlt werden. Idealerweise wird die Temperatur der ersten Emulsion während der Homogenisierung unterhalb von 60°C gehalten, z. B. unterhalb von 45°C.
In einigen Ausführungsformen können die Bestandteile der ersten Emulsion mehrere Male homogenisiert werden, z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 Mal oder öfter). Um die Notwendigkeit für eine lange Reihe von Behältern und Homogenisatoren zu vermeiden, kann man die Bestandteile der Emulsion zirkulieren lassen (z. B. Merkmal (11) in 1). Die erste Emulsion kann insbesondere dadurch gebildet werden, dass man die Bestandteile der ersten Emulsion mehre Male durch einen Homogenisator zirkulieren lässt (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100 Mal, usw.). Zu viele Zyklen können jedoch unerwünscht sein, da dies zu einer erneuten Koaleszenz führen kann, wie es in Literaturstelle 14 beschrieben wird. Somit kann bei Verwendung einer Zirkulation durch den Homogenisator die Größe der Öltröpfchen verfolgt werden, um zu bestätigen, dass eine gewünschte Tröpfchengröße erreicht wird und/oder dass keine erneute Koaleszenz auftritt.
Eine Zirkulation durch den Homogenisator ist vorteilhaft, weil dies die durchschnittliche Größe der Öltröpfchen in der ersten Emulsion verringern kann. Die Zirkulation ist ferner vorteilhaft, weil sie die Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm in der ersten Emulsion verringern kann. Diese Verringerung der durchschnittlichen Tröpfchengröße und der Anzahl von Tröpfchen > 1,2 μm in der ersten Emulsion kann vorteilhaft für nachfolgende Prozesse sein. Die Zirkulation der Bestanteile der ersten Emulsion durch einen Homogenisator kann insbesondere zu einem verbesserten Mikrofluidisierungsprozess führen, der dann in einer verringerten Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm in der zweiten Emulsion (d. h. nach der Mikrofluidisierung) resultiert. Diese Verbesserung der Parameter der zweiten Emulsion kann zu einer verbesserten Filtrationsleistung führen. Eine verbesserte Filtrationsleistung kann zu weniger Verlusten hinsichtlich der Inhaltsstoffe während der Filtration führen, z. B. Verlusten von Squalen, Tween 80 und Span 85, wenn die Öl-in-Wasser-Emulsion MF59 ist.
Zwei bestimmte Zirkulationstypen werden vorliegend als ”Typ I” und ”Typ II” bezeichnet.
Die Zirkulation der Bestandteile der ersten Emulsion kann eine Zirkulation vom Typ I umfassen, bei der man die Bestandteile der ersten Emulsion zwischen einem ersten Vormischungsbehälter und einem Homogenisator überträgt. Der erste Vormischungsbehälter kann eine Größe von 50 bis 500 l aufweisen, z. B. 100 bis 400 l, 100 bis 300 l, 200 bis 300 l, 250 l oder 280 l. Der Vormischungsbehälter kann aus rostfreiem Stahl hergestellt sein. Eine Zirkulation vom Typ I kann von 10 bis 60 Minuten andauern, z. B. 10–40 Minuten oder 20 Minuten.
Die Zirkulation der Bestandteile der ersten Emulsion kann eine Zirkulation vom Typ II umfassen, bei der man die Bestandteile der ersten Emulsion von einem ersten Vormischungsbehälter durch einen ersten Homogenisator zu einem zweiten Vormischungsbehälter (der wahlweise die gleichen Eigenschaften aufweist wie der erste Vormischungsbehälter) und anschließend durch einen zweiten Homogenisator leitet. Der zweite Homogenisator wird üblicherweise derselbe sein, wie der erste Homogenisator, wobei sich jedoch in einigen Anordnungen der erste und der zweite Homogenisator unterscheiden werden. Nachdem die Bestandteile der ersten Emulsion durch den zweiten Homogenisator geleitet wurden, können die Bestandteile der ersten Emulsion zurück in den ersten Vormischungsbehälter überführt werden, z. B. wenn der Zirkulationsprozess vom Typ II wiederholt werden soll. Daher können die Bestandteile der Emulsion zwischen dem ersten und dem zweiten Vormischungsbehälter durch einen einzelnen Homogenisator einen Weg in Form einer Acht durchlaufen. Eine Zirkulation vom Typ II kann einmal oder mehrere Male ausgeführt werden, z. B. 2, 3, 4, 5 Mal, usw.
Eine Zirkulation vom Typ II ist im Vergleich zu einer Zirkulation vom Typ I vorteilhaft, weil sie dabei helfen kann, sicherzustellen, dass alle Bestandteile der ersten Emulsion durch den Homogenisator geleitet werden. Das Leeren des ersten Vormischungsbehälters bedeutet, dass der gesamte Emulsionsinhalt durch den Homogenisator in den zweiten Vormischungsbehälter geleitet wurde. In ähnlicher Wiese kann der Inhalt des zweiten Vormischungsbehälters geleert werden, wobei wiederum sichergestellt wird, dass dieser vollständig den Homogenisator durchläuft. Somit kann eine Anordnung vom Typ II in geeigneter Weise sicherstellen, dass alle Bestandteile der Emulsion mindestens zweimal homogenisiert werden, was sowohl die durchschnittliche Größe der Öltröpfchen als auch die Anzahl der Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm in der ersten Emulsion verringert.
In einigen Ausführungsformen wird eine Kombination von Zirkulationen vom Typ I und Typ II verwendet, und diese Kombination kann eine erste Emulsion mit guten Eigenschaften bereitstellen. Diese Kombination kann insbesondere die Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm in der ersten Emulsion stark verringern. Diese Kombination kann eine beliebige Reihenfolge von Zirkulationen vom Typ I und Typ II umfassen, z. B. Typ I gefolgt von Typ II, Typ II gefolgt von Typ I, Typ I gefolgt von Typ II wiederum gefolgt von Typ I, usw. In einer Ausführungsform umfasst die Kombination 20 Minuten Zirkulation vom Typ I gefolgt von einer einzelnen Zirkulation vom Typ II, d. h. ein einmaliges Überführen der zirkulierten Bestandteile aus dem ersten Vormischungsbehälter durch einen ersten Homogenisator zu einem zweiten Vormischungsbehälter und anschließend durch einen zweiten Homogenisator.
Der erste und der zweite Vormischungsbehälter können unter einem inerten Gas gehalten werden, z. B. Stickstoff, z. B. bei bis 0,5 Bar. Dies kann verhindern, dass die Bestandteile der Emulsion oxidieren, was insbesondere vorteilhaft ist, wenn einer der Bestandteile der Emulsion Squalen ist. Dies kann die Stabilität der Emulsion erhöhen.
Wie oben erwähnt ist, kann die anfängliche Eingabe in den Homogenisator eine nicht homogenisierte Mischung der Bestandteile der ersten Emulsion sein. Diese Mischung kann hergestellt werden, indem man die einzelnen Bestandteile der ersten Emulsion einzeln mischt, wobei jedoch in einigen Ausführungsformen mehrere Bestandteile vor diesem Mischen miteinander kombiniert werden können. Wenn beispielsweise die Emulsion ein Tensid mit einer HLB unterhalb von 10 umfasst, dann kann dieses Tensid vor dem Mischen mit einem Öl kombiniert werden. Wenn die Emulsion ein Tensid mit einer HLB oberhalb von 10 umfasst, dann kann das Tensid vor dem Mischen mit einem wässrigen Bestandteil kombiniert werden. Puffersalze können vor dem Mischen mit einem wässrigen Bestandteil kombiniert werden, oder sie können getrennt zugesetzt werden.
Nach ihrer Bildung kann die erste Emulsion mikrofluidisiert werden, oder sie kann bis zur Mikrofluidisierung gelagert werden.
In einigen Ausführungsformen, insbesondere in solchen, bei denen mehrere Zyklen der Schritte (i) und (ii) verwendet werden, wird der Eingang für den Homogenisator der Ausgang einer Mikrofluidisierungs-Vorrichtung sein, sodass die erste Emulsion mikrofluidisiert und anschließend erneut einer Homogenisierung unterzogen wird.
Mikrofluidisierung
Nach ihrer Bildung wird die erste Emulsion mikrofluidisiert, um ihre durchschnittliche Öltröpfchengröße zu verringern und/oder um die Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm zu verringern.
Geräte für die Mikrofluidisierung verringern die durchschnittliche Öltröpfchengröße, indem sie Ströme von Eingangsbestandteilen bei hohem Druck und hoher Geschwindigkeit durch geometrisch feststehende Kanäle treiben. Der Druck am Einlass in die Interaktionskammer (auch als ”erster Druck” bezeichnet) kann für mindestens 85% derzeit, während der die Bestandteile in die Mikrofluidisierungs-Vorrichtung geleitet werden, im Wesentlichen konstant sein (d. h. ±15%; z. B. ±10%; ±5%; ±2%), z. B. für mindestens 87%, für mindestens 90%, für mindestens 95%, für mindestens 99% oder für 100% der Zeit, während der die Emulsion in die Mikrofluidisierungs-Vorrichtung geleitet wird.
In einer Ausführungsform beträgt der erste Druck für 85% der Zeit, während der die Emulsion in die Mikrofluidisierungs-Vorrichtung geleitet wird, 1300 Bar ± 15% (18 kPSI ± 15%), d. h. zwischen 1100 Bar und 1500 Bar (zwischen 15 kPSI und 21 kPSI). Zwei geeignete Druckprofile sind in 3 gezeigt. In 3A ist der Druck für mindestens 85% der Zeit im Wesentlichen konstant, während der Druck in 3B dauerhaft im Wesentlichen konstant bleibt.
Ein Gerät für die Mikrofluidisierung umfasst üblicherweise mindestens eine Verstärkungspumpe (vorzugsweise zwei Pumpen, die synchron sein können) und eine Interaktionskammer. Die Verstärkungspumpe, die idealerweise elektrohydraulisch angetrieben wird, sorgt für einen hohen Druck (d. h. den ersten Druck), um eine Emulsion in und durch die Interaktionskammer zu treiben. Die synchrone Arbeitsweise der Verstärkungspumpen kann verwendet werden, um für den im Wesentlichen konstanten Druck der oben beschriebenen Emulsion zu sorgen, was bedeutet, dass die Emulsionströpfchen während der Mikrofluidisierung alle einem im Wesentlichen identischen Maß an Scherkräften ausgesetzt werden.
Ein Vorteil bei der Verwendung eines im Wesentlichen konstanten Drucks besteht darin, dass Ermüdungsfehler in der Mikrofluidisierungs-Vorrichtung verringert werden können, was zu einer längeren Lebensdauer der Vorrichtung führen kann. Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung eines im Wesentlichen konstanten Drucks besteht darin, dass die Parameter der zweiten Emulsion verbessert werden können. Insbesondere kann die Anzahl der in der zweiten Emulsion vorhandenen Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm verringert werden. Des Weiteren kann die durchschnittliche Größe der Öltröpfchen der zweiten Emulsion verringert werden, wenn ein im Wesentlichen konstanter Druck verwendet wird. Die Verringerung der durchschnittlichen Größe der Öltröpfchen und der Anzahl der Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm in der zweiten Emulsion kann für verbesserte Filtrationsleistungen sorgen. Eine verbesserte Filtrationsleistung kann zu weniger Verlusten bei der Filtration führen, z. B. zu Verlusten von Squalen, Tween 80 und Span 85, wenn die Emulsion MF59 ist.
Die Interaktionskammer kann eine Vielzahl (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, usw.) von Kanälen mit feststehender Geometrie enthalten, durch welche die Emulsion geleitet wird. Die Emulsion tritt durch eine Einlass-Leitung in die Interaktionskammer ein, die einen Durchmesser von 200 bis 250 μm aufweist. Die Emulsion teilt sich bei Eintritt in die Kammer in Ströme und wird unter hohem Druck auf eine hohe Geschwindigkeit beschleunigt. Bei Durchtritt durch die Kanäle können die durch den hohen Druck erzeugten Kräfte dazu führen, dass sich die Größe der Öltröpfchen der Emulsion verringert und dass sich die Anzahl der Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm verringert. Diese Kräfte können folgendes umfassen: Scherkräfte, die bei Deformation des Emulsionsstroms durch Kontakt mit den Wandungen der Kanäle auftreten; Stoßkräfte, die bei Kollisionen entstehen, welche auftreten, wenn die Emulsionsströme bei hoher Geschwindigkeit miteinander kollidieren; und Kavitationskräfte, die durch Bildung und Zerfall von Kavitäten innerhalb des Stroms verursacht werden. Die Interaktionskammer enthält normalerweise keine Teile, die sich bewegen. Es kann Keramik (z. B. Aluminiumoxid)- oder Diamant(z. B. polykristalliner Diamant)-Kanaloberflächen umfassen. Andere Oberflächen können aus rostfreiem Stahl bestehen.
Die feststehende Geometrie der Vielzahl von Kanälen in der Interaktionskammer kann eine Geometrie vom Typ ”Y” oder eine Geometrie vom Typ ”Z” sein.
In einer Interaktionskammer mit einer Geometrie vom Typ Y wird ein einzelner Eingangsemulsionsstrom in einen ersten und in einen zweiten Emulsionsstrom geteilt, wobei diese anschließend wieder zu einem einzigen Ausgangsemulsionsstrom vereinigt werden. Vor der Vereinigung können der erste und auch der zweite Emulsionsstrom unabhängig voneinander in eine erste und in eine zweite Vielzahl (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 usw.) von Unterströmen geteilt werden. Wenn die Emulsionsströme wieder vereinigt werden, fließen der erste und der zweite Emulsionsstrom (oder deren Unterströme) idealerweise in im Wesentlichen entgegengesetzten Richtungen (z. B. fließen der erste und der zweite Emulsionsstrom oder deren Unterströme im Wesentlichen in derselben Ebene (±20°), und die Flussrichtung des ersten Emulsionsstroms unterscheidet sich um 180 ± 20° von der Flussrichtung des zweiten Emulsionsstroms). Die Kräfte, die erzeugt werden, wenn die Emulsionsströme wieder vereinigt werden, können so wirken, dass sie die Größe der Öltröpfchen der Emulsion verringern und die Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm verringern.
In einer Interaktionskammer mit einer Geometrie vom Typ Z umläuft der Emulsionsstrom eine Vielzahl (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, usw.) von im Wesentlichen rechtwinkligen Ecken (d. h. 90 ± 20°). 4 zeigt eine Interaktionskammer mit einer Geometrie vom Typ Z und zwei rechtwinklige Ecken in Flussrichtung. Während des Umlaufens der Ecken kann ein Eingangsemulsionsstrom in eine Vielzahl (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, usw.) von Unterströmen geteilt werden und anschließend wieder zu einem einzigen Ausgangsemulsionsstrom vereinigt werden (z. B. wie in 4 mit 4 Unterströmen (32) gezeigt ist). Die Teilung und die anschließende erneute Vereinigung (31) kann an einem beliebigen Punkt zwischen dem Einlass und dem Auslass erfolgen. Die Kräfte, die erzeugt werden, wenn die Emulsion mit den Wandungen des Kanals in Kontakt kommt, während sie die Ecken umläuft, können so wirken, dass sie die Größe der Öltröpfchen der Emulsion verringern und die Anzahl der Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm verringert. Ein Beispiel für eine Interaktionskammer vom Typ Z ist die E230Z Interaktionskammer von Microfluidics.
In einer Ausführungsform umläuft der Emulsionsstrom zwei im Wesentlichen rechtwinklige Ecken. An dem Punkt, an dem der Eingangsemulsionsstrom den ersten im Wesentlichen rechtwinkligen Eckpunkt umläuft, wird dieser in 5 Unterströme geteilt. An dem Punkt, an dem die Unterströme den zweiten im Wesentlichen rechtwinkligen Eckpunkt umlaufen, werden sie wieder in einen einzigen Ausgangsemulsionsstrom vereinigt.
Im Stand der Technik war es üblich, für Öl-in-Wasser-Emulsionen wie die der vorliegenden Erfindung Interaktionskammern vom Typ Y zu verwenden. Es ist jedoch von uns herausgefunden worden, dass es vorteilhaft ist, eine Interaktionskammer mit einer Geometrie vom Typ Z für Öl-in-Wasser-Emulsionen zu verwenden, da diese im Vergleich zu einer Interaktionskammer mit einer Geometrie vom Typ Y zu einer stärkeren Verringerung der Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm führen kann, die in der zweiten Emulsionslösung vorhanden sind. Die Verringerung der Anzahl der Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm in der zweiten Emulsion kann zu einer verbesserten Filtrationsleistung führen. Eine verbesserte Filtrationsleistung kann zu weniger Verlusten bei der Filtration führen, z. B. Verlusten von Squalen, Tween 80 und Span 85, wenn die Emulsion MF59 ist.
Eine bevorzugte Mikrofluidisierungs-Vorrichtung arbeitet bei einem Druck zwischen 170 und 2750 Bar (ungefähr 2500 psi bis 40000 psi), z. B. bei etwa 345 Bar, bei etwa 690 Bar, bei etwa 1380 Bar, bei etwa 2070 Bar, usw.
Eine bevorzugte Mikrofluidisierungs-Vorrichtung arbeitet bei einer Flussrate von bis zu 20 l/min, z. B. bis zu 14 l/min, bis zu 7 l/min, bis zu 3,5 l/min, usw.
Eine bevorzugte Mikrofluidisierungs-Vorrichtung weist eine Interaktionskammer auf, die eine Scherrate oberhalb von 1 × 10⁶ s^–1, z. B. ≥ 2,5 × 10⁶ s^–1, ≥ 5 × 10⁶ s^–1, ≥ 10⁷ s^–1, usw., aufweist.
Eine Mikrofluidisierungs-Vorrichtung kann mehrere Interaktionskammern umfassen, die parallel verwendet werden, z. B. 2, 3, 4, 5 oder mehr, wobei es jedoch nützlicher ist, eine einzelne Interaktionskammer vorzusehen.
Die Mikrofluidisierungs-Vorrichtung kann ein Hilfsverarbeitungsmodul (auxiliary processing module; APM) umfassen, das mindestens einen Kanal umfasst. Das APM trägt zur Verringerung der durchschnittlichen Größe der Öltröpfchen in der Emulsion, die durch die Mikrofluidisierungs-Vorrichtung geleitet wird, bei, obwohl der Großteil der Verringerung in der Interaktionskammer auftritt. Wie oben aufgeführt, werden die Emulsionsbestandteile durch die Verstärkungspumpe(n) unter einem ersten Druck in die Interaktionskammer geleitet. Die Emulsionsbestandteile treten im Allgemeinen mit einem zweiten Druck aus dem APM aus, der geringer ist als der erste Druck (z. B. atmosphärischer Druck). Im Allgemeinen gehen zwischen 80% und 95% der Druckdifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Druck über die Interaktionskammer verloren (z. B. von P₁ zu P₂ in 4), und zwischen 5 und 20% der Druckdifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Druck gehen über das Hilfsverarbeitungsmodul verloren; z. B. kann die Interaktionskammer für ungefähr 90% des Druckverlustes sorgen, während das APM für ungefähr 10% des Druckverlustes sorgt. Wenn der über die Interaktionskammer verlorene Druck und der über das Hilfsverarbeitungsmodul verlorene Druck nicht für die gesamte Druckdifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Druck verantwortlich sind, kann dies an einem begrenztem Druckverlust über die Verbindungsstücke zwischen Interaktionskammer und Hilfsverarbeitungsmodul liegen.
Das APM umfasst normalerweise keine Teile, die sich bewegen. Es kann Keramik (z. B. Aluminiumoxid)- oder Diamant(z. B. polykristalliner Diamant)-Kanaloberflächen aufweisen. Andere Oberflächen können aus rostfreiem Stahl bestehen.
Das APM ist im Allgemeinen stromabwärts von der Interaktionskammer positioniert, kann aber auch in Bezug auf die Interaktionskammer aufeinanderfolgend angeordnet sein. Im Stand der Technik werden APMs im Allgemeinen stromabwärts von Interaktionskammern, die Kanäle vom Y-Typ umfassen, positioniert, um die Kavitation zu unterdrücken und dadurch die Flussrate in der Kammer vom Y-Typ um bis zu 30% zu erhöhen. Des Weiteren werden die APMs im Stand der Technik im Allgemeinen stromaufwärts von Interaktionkammern, die Kanäle vom Z-Typ umfassen, positioniert, um die Größe von großen Agglomeraten zu verringern. Im letztgenannten Fall verringert das APM die Flussrate in der Kammer vom Typ Z lediglich um bis zu 3%. Es ist jedoch herausgefunden worden, dass die Positionierung des APM stromabwärts von einer Interaktionskammer, die eine Vielzahl von Kanälen vom Typ Z umfasst, im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft ist, da dies zu einer stärkeren Verringerung in der durchschnittlichen Größe der Öltröpfchen und zu einer stärkeren Verringerung der Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm, welche in der zweiten Emulsion vorhanden sind, führt. Wie oben erläutert ist, kann die Verringerung der Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm in der zweiten Emulsion zu einer verbesserten Filtrationsleistung führen. Eine verbesserte Filtrationsleistung kann zu geringeren Verlusten bei der Filtration führen, z. B. geringeren Verlusten von Squalen, Tween 80 und Span 85, wenn die Öl-in-Wasser-Emulsion MF59 ist. Ein weiterer Vorteil dieser Positionierung der Interaktionskammer vom Typ Z und einem stromabwärts gelegenem APM besteht darin, dass dies zu einem langsameren Druckabbau in der Interaktionskammer führen kann. Der langsamere Druckabbau kann zu einer Erhöhung der Produktstabilität führen, da weniger Gas in der Emulsion eingeschlossen ist.
Ein APM enthält mindestens einen Kanal mit feststehender Geometrie, in den die Emulsion läuft. Das APM kann eine Vielzahl (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, usw.) von Kanälen mit feststehender Geometrie enthalten, in welche die Emulsion läuft. Der Kanal oder die Kanäle des APM können linear oder nicht-linear sein. Geeignete nicht-lineare Kanäle weisen eine Geometrie vom Typ ”Z” oder eine Geometrie vom Typ ”Y”, wobei es sich dabei um solche handelt, die oben für die Interaktionskammer beschrieben wurden. In einer Ausführungsform weist der Kanal oder weisen die Kanäle des APM eine Geometrie vom Typ Z auf. Eine Vielzahl von Kanälen vom Typ Z teilt die Emulsion in Ströme, sobald sie in das APM eintritt.
Im Gegensatz zu den Empfehlungen des Herstellers ist die Verwendung eines APM, das eine Vielzahl von Kanälen mit feststehender Geometrie umfasst, im Vergleich zu einem APM mit einem einzelnen Kanal mit feststehender Geometrie vorteilhaft, weil es zu einer stärkeren Verringerung der Anzahl der Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm führt, die in der zweiten Emulsion vorhanden sind. Wie oben diskutiert ist, kann die Verringerung der Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm in der zweiten Emulsion zu einer verbesserten Filtrationsleistung führen. Eine verbesserte Filtrationsleistung kann zu weniger Verlusten bei der Filtration führen, z. B. weniger Verlusten von Squalen, Tween 80 und Span 85, wenn die Öl-in-Wasser-Emulsion MF59 ist.
Eine Mikrofluidisierungs-Vorrichtung erzeugt während des Betriebs Wärme, welche die Temperatur einer Emulsion im Vergleich zur ersten Emulsion um 15–20°C erhöhen kann. Daher ist es vorteilhaft, die mikrofluidisierte Emulsion so schnell wie möglich zu kühlen. Die Temperatur der zweiten Emulsion kann unterhalb von 60°C gehalten werden, z. B. unterhalb von 45°C. Daher können der Ausgang einer Interaktionskammer und/oder der Ausgang eines APMs in einen Kühlmechanismus geleitet werden, wie beispielsweise in einen Wärmetauscher oder in eine Kühlschleife. Der Abstand zwischen dem Austrag und dem Kühlmechanismus sollte so kurz wie möglich gehalten werden, um die Gesamtzeit zu verringern, indem man Verzögerungen bezüglich der Kühlung verringert. In einer Ausführungsform beträgt der Abstand zwischen dem Ausgang der Mikrofluidisierungs-Vorrichtung und dem Kühlmechanismus zwischen 20 und 30 cm. Ein Kühlmechanismus ist insbesondere nützlich, wenn eine Emulsion mehrfachen Mikrofluidisierungsschritten unterzogen wird, um damit eine Überhitzung der Emulsion zu vermeiden.
Das Ergebnis der Mikrofluidisierung ist eine Öl-in-Wasser-Emulsion (die zweite Emulsion), in der die durchschnittliche Größe der Öltröpfchen 500 nm oder weniger beträgt. Diese durchschnittliche Größe ist besonders nützlich, da sie eine Filtersterilisation der Emulsion ermöglicht. Emulsionen, in denen mindestens 80% der Öltröpfchen eine Durchschnittsgröße von 500 nm oder weniger aufweisen, z. B. 400 nm oder weniger, 300 nm oder weniger, 200 nm oder weniger oder 165 nm oder weniger, sind besonders nützlich. Des Weiteren ist die Anzahl der Öltröpfchen in der zweiten Emulsion, die eine Größe von > 1,2 μm aufweisen, 5 × 10¹⁰/ml oder weniger, z. B. 5 × 10⁹/ml oder weniger, 5 × 10⁸/ml oder weniger.
Der anfängliche Eintrag in die Mikrofluidisierungs-Vorrichtung kann die erste Emulsion sein. In einigen Ausführungsformen wird jedoch die mikrofluidisierte Emulsion erneut einer Mikrofluidisierung unterzogen, sodass mehrere Runden einer Mikrofluidisierung erfolgen können. Die zweite Emulsion kann insbesondere gebildet werden, indem man die Bestandteile der zweiten Emulsion mehrere Male durch eine Mikrofluidisierungs-Vorrichtung zirkulieren lässt, z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Mal, usw. Die zweite Emulsion kann gebildet werden, indem man die Bestandteile der zweiten Emulsion 4 bis 7 Mal durch eine Mikrofluidisierungs-Vorrichtung zirkulieren lässt.
Die Zirkulation der Bestandteile der zweiten Emulsion kann eine Zirkulation vom Typ I umfassen, bei der man die Bestandteile der zweiten Emulsion zwischen einem ersten Emulsionsbehälter (der wahlweise die gleichen Eigenschaften aufweist wie der erste Vormischungsbehälter) und der Mikrofluidisierungs-Vorrichtung überträgt.
Die Zirkulation der Bestandteile der zweiten Emulsion kann eine Zirkulation vom Typ II umfassen, bei der die Bestandteile der zweiten Emulsion von einem ersten Emulsionsbehälter durch eine erste Mikrofluidisierungs-Vorrichtung zu einem zweiten Emulsionsbehälter (der wahlweise die gleichen Eigenschaften aufweist wie der erste Vormischungsbehälter) und anschließend durch eine zweite Mikrofluidisierungs-Vorrichtung geleitet werden.
Die zweite Mikrofluidisierungs-Vorrichtung kann dieselbe Vorrichtung sein wie die erste Mikrofluidisierungs-Vorrichtung. Alternativ dazu kann sich die zweite Mikrofluidisierungs-Vorrichtung von der ersten Mikrofluidisierungs-Vorrichtung unterscheiden.
Der erste Emulsionsbehälter kann derselbe Behälter sein, wie der erste Vormischungsbehälter. Alternativ dazu kann der erste Emulsionsbehälter derselbe Behälter sein, wie der zweite Vormischungsbehälter.
Der zweite Emulsionsbehälter kann derselbe Behälter sein wie der erste Vormischungsbehälter. Alternativ dazu kann der zweite Emulsionsbehälter derselbe Behälter sein wie der zweite Vormischungsbehälter.
Der erste Emulsionsbehälter kann derselbe Behälter sein wie der erste Vormischungsbehälter und der zweite Emulsionsbehälter kann derselbe Behälter sein wie der zweite Vormischungsbehälter. Alternativ dazu kann der erste Emulsionsbehälter derselbe Behälter sein wie der zweite Vormischungsbehälter und der zweite Emulsionsbehälter kann derselbe Behälter sein wie der erste Vormischungsbehälter.
Als eine Alternative können sich der erste und der zweite Emulsionsbehälter von dem ersten und dem zweiten Vormischungsbehälter unterscheiden.
Nach dem Durchleiten der Bestandteile der zweiten Emulsion durch die zweite Mikrofluidisierungs-Vorrichtung können die Bestandteile der zweiten Emulsion zurück in den ersten Emulsionsbehälter geleitet werden, beispielsweise wenn der Zirkulationsprozess vom Typ II wiederholt werden soll. Eine Zirkulation vom Typ II kann einmal oder mehrere Male durchgeführt werden, z. B. 3, 4, 5 Mal, usw.
Eine Zirkulation vom Typ II ist vorteilhaft, da sie sicherstellt, dass alle Bestandteile der zweiten Emulsion mindestens zweimal durch die Mikrofluidisierungs-Vorrichtung geleitet wurden, was die durchschnittliche Größe der Öltröpfchen und die Anzahl der Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm in der zweiten Emulsion verringert.
Es kann während der Mikrofluidisierung eine Kombination einer Zirkulation vom Typ I und einer Zirkulation vom Typ II verwendet werden. Diese Kombination kann eine beliebige Reihenfolge von Zirkulationen vom Typ I und vom Typ II umfassen, z. B. Typ I gefolgt von Typ II, Typ II gefolgt von Typ I, Typ I gefolgt von Typ II wiederum gefolgt von Typ I, usw.
Der erste und der zweite Emulsionsbehälter können unter einem Inert-Gas gehalten werden, z. B. bis zu 0,5 Bar Stickstoff. Dies verhindert, dass die Bestandteile der Emulsion oxidieren, was insbesondere vorteilhaft ist, wenn einer der Bestandteile Squalen ist. Dies führt zu einer Erhöhung der Stabilität der Emulsion.
Filtration
Nach der Mikrofluidisierung wird die zweite Emulsion filtriert. Diese Filtration entfernt sämtliche große Öltröpfchen, die den Schritt der Homogenisierung und der Mikrofluidisierung überstanden haben. Obwohl diese Öltröpfchen in geringer Anzahl vorliegen, können sie hinsichtlich des Volumens groß sein, und sie können als Ausgangspunkte für eine Aggregation dienen, was zu einem Abbau der Emulsion bei Lagerung führt. Darüber hinaus kann dieser Filtrationsschritt eine Filtersterilisation erreichen.
Die jeweilige Filtrationsmembran, die für eine Filtersterilisation geeignet ist, hängt von den Fluid-Eigenschaften der zweiten Emulsion und vom erforderlichen Filtrationsgrad ab. Die Eigenschaften eines Filters können seine Eignung für die Filtration der mikrofluidisierten Emulsion beeinflussen. Beispielsweise können seine Porengröße und seine Oberflächeneigenschaften von Bedeutung sein, insbesondere wenn eine auf Squalen basierende Emulsion filtriert wird.
Die Porengröße der Membranen, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden, sollten den Durchtritt der gewünschten Tröpfchen ermöglichen, während unerwünschte Tröpfchen zurückgehalten werden. Sie sollte beispielsweise Tröpfchen mit einer Größe von ≥ 1 μm zurückhalten, während der Durchtritt von Tröpfchen < 200 nm ermöglicht wird. Ein Filter mit 0,2 μm oder 0,22 μm ist ideal und kann darüber hinaus eine Filtersterilisation erreichen.
Die Emulsion kann vorfiltriert werden, z. B. durch einen Filter von 0,45 μm. Die Vorfiltration und die Filtration können in einem Schritt erreicht werden, indem man bekannte doppellagige Filter verwendet, die eine erste Membranlage mit größeren Poren und eine zweite Membranlage mit kleineren Poren enthalten. In einem Beispiel stellt die erste Membranlage mit den größeren Poren einen Filter mit 0,45 μm bereit, während die zweite Membranlage mit den kleineren Poren einen Filter mit 0,22 μm bereitstellt.
Die Filtrationsmembran und/oder die Vorfiltrationsmembran können asymmetrisch sein. Eine asymmetrische Membran ist eine solche, in der die Porengröße von einer Seite der Membran zur anderen Seite variiert. Eine Seite der asymmetrischen Membran kann als die ”grobporige Oberfläche” bezeichnet werden, während die andere Seite der asymmetrischen Membran als die ”feinporige Oberfläche” bezeichnet werden kann.
Die Filtrationsmembran kann porös oder homogen sein. Eine homogene Membran ist üblicherweise ein dichter Film, der von 10 bis 200 μm reicht. Eine poröse Membran hat eine poröse Struktur. In einer Ausführungsform ist die Filtrationsmembran porös.
In einer Ausführungsform wird die zweite Emulsion durch eine asymmetrische, hydrophile poröse Membran vorfiltriert und anschließend durch eine weitere asymmetrische, hydrophile poröse Membran mit kleineren Poren als die der Vorfiltrationsmembran filtriert.
Die Filtermembran kann vor der Verwendung autoklaviert werden, um sicherzustellen, dass sie steril ist.
Filtrationsmembranen werden üblicherweise aus polymeren Trägermaterialien, wie beispielsweise PTFE (Polytetrafluorethylen), PES (Polyethersulfon), PVP (Polyvinylpyrrolidon), PVDF (Polyvinylidenflourid), Nylon (Polyamide), PP (Polypropylen), Cellulosen (einschließlich Cellulose-Ester), PEEK (Polyetheretherketon), Nitrocellulose, usw. Diese haben voneinander abweichende Eigenschaften, wobei einige Träger an sich hydrophob sind (z. B. PTFE), und andere an sich hydrophil sind (Cellulose-Acetate). Diese intrinsischen Eigenschaften können jedoch durch Behandlung der Membranoberfläche modifiziert werden. Beispielsweise ist es bekannt, hydrophilisierte oder hydrophobisierte Membranen herzustellen, indem man diese mit anderen Materialien behandelt (wie z. B. mit anderen Polymeren, mit Graphit, mit Silikon, usw.), um die Membranoberfläche zu beschichten, siehe z. B. Abschnitt 2.1 von Literaturstelle 15.
Ein idealer Filter zur Verwendung im Rahmen der Erfindung weist eine hydrophile Oberfläche auf, was im Gegensatz zur Lehre der Literaturstellen 9–12 steht, denen zu entnehmen ist, dass hydrophobe (Polysulfon-)Filter verwendet werden sollen. Filter mit hydrophilen Oberflächen können aus hydrophilen Materialien gebildet werden oder durch Hydrophilisierung von hydrophoben Materialien, und ein bevorzugter Filter zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist eine hydrophile Polyethersulfon-Membran. Mehrere verschiedene Verfahren sind bekannt, um hydrophobe PES-Membranen in hydrophile PES-Membranen umzuwandeln. Oftmals wird dies erreicht, indem man die Membran mit einem hydrophilen Polymer beschichtet. Um für eine permanente Anheftung des hydrophilen Polymers an das PES zu sorgen, wird eine hydrophile Beschichtungslage üblicherweise entweder einer Quervernetzungsreaktion oder einem Grafting unterzogen. Literaturstelle 15 offenbart ein Verfahren zur Modifizierung der Oberflächeneigenschaften eines hydrophoben Polymers mit funktionalisierbaren Kettenenden, bei dem man das Polymer mit einer Lösung einer Linker-Gruppe in Kontakt bringt, um eine kovalente Verknüpfung zu bilden, und anschließend das umgesetzte hydrophobe Polymer mit einer Lösung eines modifizierenden Mittels in Kontakt bringt. Literaturstelle 16 offenbart ein Verfahren zur Hydrophilisierung von PES-Membranen durch direkte Membran-Beschichtung, das eine Vorbenetzung mit Alkohol und ein anschließendes Eintauchen in eine wässrige Lösung umfasst, welche ein hydrophiles Monomer, ein polyfunktionales Monomer (Quervernetzer) und einen Polymerisationsauslöser enthält. Das Monomer und der Quervernetzer werden anschließend unter Verwendung einer durch die Temperatur oder durch UV ausgelösten Polymerisation polymerisiert, wobei eine Beschichtung aus quervernetzten hydrophilen Polymeren auf der Membranoberfläche entsteht. In ähnlicher Weise offenbaren Literaturstellen 17 und 18 die Beschichtung einer PES-Membran durch Eintauchen in eine wässrige Lösung eines hydrophilen Polymers (Polyalkylenoxid) und mindestens eines polyfunktionalen Monomers (Quervernetzer) und die anschließende Polymerisierung eines Monomers, wobei eine nicht extrahierbare hydrophile Beschichtung bereitgestellt wird. Literaturstelle 19 beschreibt die Hydrophilisierung einer PES-Membran durch eine Grafting-Reaktion, bei der eine PES-Membran einer Heliumplasma-Behandlung bei niedriger Temperatur unterzogen wird, gefolgt von einem Grafting des hydrophilen Monomers N-Vinyl-2-Pyrrolidon (NVP) auf die Membranoberfläche. Weitere solche Verfahren werden in den Literaturstellen 20–26 offenbart.
In Verfahren, die nicht auf einer Beschichtung beruhen, kann PES in einem Lösungsmittel gelöst und mit einem löslichen hydrophilen Additiv vermischt werden; anschließend wird die gemischte Lösung verwendet, um eine hydrophile Membran zu gießen, z. B. durch Präzipitation oder durch Auslösen einer Co-Polymerisierung. Solche Verfahren werden in den Literaturstellen 27–33 beschrieben. Beispielsweise offenbart Literaturstelle 33 ein Verfahren zur Herstellung einer hydrophilen, bezüglich der Ladung modifizierten Membran, die wenige Substanzen aufweist, welche aus der Membran extrahierbar sind, und die eine schnelle Wiedergewinnung der Widerstandfähigkeit gegenüber ultrareinem Wasser ermöglicht, mit einer quervernetzten ineinandergreifenden Polymernetzwerkstruktur, die durch Herstellen einer Polymerlösung aus einer Mischung aus PES, PVP, Polyethylenimin, und aliphatischem Diglycidylether gebildet wird, wobei ein dünner Film der Lösung gebildet wird und der Film als Membran präzipitiert wird. Ein ähnlicher Prozess wird in Literaturstelle 34 offenbart.
Es können hybride Ansätze verwendet werden, bei denen hydrophile Additive während der Membranbildung vorliegen und auch später als Beschichtung zugefügt werden, siehe beispielsweise Literaturstelle 35.
Die Hydrophilisierung einer PES-Membran kann auch durch eine Behandlung mit Niedrigtemperaturplasmen erreicht werden. Literaturstelle 36 beschreibt die hydrophile Modifikation einer PES-Membran durch Behandlung mit einem Niedrigtemperatur-CO₂-Plasma.
Die Hydrophilisierung einer PES-Membran kann auch durch Oxidation erreicht werden, wie es in Literaturstelle 37 beschrieben ist. Dieses Verfahren umfasst die Vorbenetzung einer hydrophoben PES-Membran in einer Flüssigkeit mit einer geringen Oberflächenspannung, die Zugabe einer wässrigen Lösung des Oxidationsmittels zu der benetzten PES-Membran und eine anschließende Erhitzung.
Die Phaseninversion kann ebenfalls verwendet werden, wie es in Literaturstelle 38 beschrieben wird.
Eine ideale hydrophile PES-Membran kann durch eine Behandlung von PES (hydrophob) mit PVP (hydrophil) erhalten werden. Es ist herausgefunden worden, dass die Behandlung mit PEG (hydrophil) anstelle von PVP eine hydrophilisierte PES-Membran ergibt, die leicht verschmutzbar ist (insbesondere wenn eine Squalen enthaltene Emulsion verwendet wird), und die darüber hinaus in unvorteilhafter Weise während des Autoklavierens Formaldehyd freisetzt.
Bekannte hydrophile Membranen umfassen Bioassure (von Cuno); EverLUX^TM Polyethersulfon; STyLUX^TM Polyethersulfon (beide von Meissner); Millex GV-, Millex HP-, Millipak 60-, Millipak 200- und Durapore CVGL01TP3-Membranen (von Millipore); die Flurodyne^TM EX EDF-Membran, Supor^TM EAV; Supor^TM EBV; Supor^TM EKV (alle von Pall); Sartopore^TM (von Sartorius); die hydrophilen PES-Membranen von Sterlitech; und die WFPES-PES-Membran von Wolftechnik.
Während der Filtration kann die Emulsion bei einer Temperatur von 40°C oder weniger gehalten werden, z. B. bei 30°C oder weniger, um eine erfolgreiche Sterilfiltration zu erreichen. Es ist möglich, dass einige Emulsionen nicht durch einen Sterilfilter durchtreten, wenn sie eine Temperatur von mehr als 40°C aufweisen.
Es ist vorteilhaft, den Filtrationsschritt innerhalb von 24 Stunden, z. B. innerhalb von 18 Stunden, innerhalb von 12 Stunden, innerhalb von 6 Stunden, innerhalb von 2 Stunden, innerhalb von 30 Minuten, ab Herstellung der zweiten Emulsion durchzuführen, da es nach Ablauf dieser Zeit möglicherweise nicht mehr möglich ist, die zweite Emulsion durch den Sterilfilter zu leiten, ohne dass es zur Verstopfung des Filters kommt, wie es in Literaturstelle 39 diskutiert wird.
Die finale Emulsion
Das Ergebnis der Mikrofluidisierung und der Filtration ist eine Öl-in-Wasser-Emulsion, in der die durchschnittliche Größe der Öltröpfchen weniger als 220 nm sein kann, z. B. 155 ± 20 nm, 155 ± 10 nm oder 155 ± 5 nm, und in der die Anzahl der Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm 5 × 10⁸/ml oder weniger, z. B. 5 × 10⁷/ml oder weniger, 5 × 10⁶/ml oder weniger, 2 × 10⁶/ml oder weniger, oder 5 × 10⁵/ml oder weniger betragen kann.
Die durchschnittliche Größe der Öltröpfchen der vorliegend beschriebenen Emulsionen (einschließlich der ersten und der zweiten Emulsion) beträgt üblicherweise nicht weniger als 50 nm.
Sobald die Öl-in-Wasser-Emulsion gebildet wurde, kann sie in sterile Glasflaschen überführt werden. Die Glasflaschen können eine Größe von 5 l, 8 l oder 10 l aufweisen. Alternativ dazu kann die Öl-in-Wasser-Emulsion in einen sterilen flexiblen Beutel (flex bag) überführt werden. Der flexible Beutel kann 50 l, 100 l oder 250 l groß sein. Darüber hinaus kann der flexible Beutel mit einem oder mit mehreren sterilen Anschlüssen ausgestattet sein, um den flexiblen Beutel mit dem System zu verbinden. Die Verwendung eines flexiblen Beutels mit sterilen Anschlüssen ist gegenüber der Verwendung von Glasflaschen vorteilhaft, weil der flexible Beutel größer ist als die Gasflaschen, was bedeutet, dass es nicht erforderlich sein muss, den flexiblen Beutel zu wechseln, um die gesamte Emulsion, welche in einem einzelnen Produktionslauf hergestellt wurde, zu lagern. Dies kann ein steriles, geschlossenes System für die Herstellung einer Emulsion bereitstellen, was die Wahrscheinlichkeit verringert, dass Verunreinigungen in der finalen Emulsion vorliegen. Dies ist insbesondere wichtig, wenn die finale Emulsion für pharmazeutische Zwecke verwendet wird, z. B. wenn die finale Emulsion das MF59-Adjuvans ist.
Bevorzugte Mengen an Öl (in Vol.-%) in der finalen Emulsion liegen zwischen 2–20%, z. B. bei etwa 10%. Ein Squalen-Gehalt von etwa 5% oder etwa 10% ist besonders nützlich.
Bevorzugte Mengen an Tensid (in Gew.-%) in der finalen Emulsion sind: Polyoxyethylensorbitanester (wie beispielsweise Tween 80) 0,02–2%, insbesondere etwa 0,5% oder etwa 1%; Sorbitanester (wie beispielsweise Span 85) 0,02–2%, insbesondere etwa 0,5 oder etwa 1%; Octyl- oder Nonylphenoxypolyoxyethanole (wie beispielsweise Triton X-100) 0,001% bis 0,1%, insbesondere 0,005% bis 0,02%; Polyoxyethylenether (wie beispielsweise Laureth 9) 0,1 bis 20%, vorzugsweise 0,1% bis 10%, insbesondere 0,1 bis 1% oder etwa 0,5%.
Das Verfahren ist insbesondere für die Herstellung einer der folgenden Öl-in-Wasser-Emulsionen nützlich:

• Eine Emulsion, die Squalen, Polysorbat 80 (Tween 80) und Sorbitantrioleat (Span 85) umfasst. Die Zusammensetzung der Emulsion kann etwa 5 Vol.-% Squalen, etwa 0,5 Vol.-% Polysorbat 80 und etwa 0,5 Vol.-% Sorbitantrioleat umfassen. Bezogen auf das Gewicht entsprechen diese Mengen 4,3% Squalen, 0,5% Polysorbat 80 und 0,48% Sorbitantrioleat. Dieses Adjuvans ist als ”MF59” bekannt. Die MF59-Emulsion umfasst in vorteilhafter Weise Citrat-Ionen, z. B. 10 mM Natriumcitratpuffer.
• Emulsionen, die Squalen, ein α-Tocopherol (idealerweise DL-α-Tocopherol) und Polysorbat 80 umfassen. Diese Emulsionen können von 2 bis 10 Gew.-% Squalen umfassen, von 2 bis 10 Gew.-% α-Tocopherol und von 0,3 bis 3 Gew.-% Polysorbat 80, z. B. 4,3 Gew.-% Squalen, 4,7 Gew.-% α-Tocopherol, 1,9 Gew.-% Polysorbat 80. Das Gewichtsverhältnis von Squalen:Tocopherol ist vorzugsweise ≤ 1 (z. B. 0,90), da dies eine stabilere Emulsion bereitstellt. Squalen und Polysorbat 80 können in einem Volumenverhältnis von etwa 5:2 oder bei einem Gewichtsverhältnis von etwa 11:5 vorliegen. Eine solche Emulsion kann hergestellt werden, indem man Polysorbat 80 in PBS zu einer 2%igen Lösung löst, und anschließend 90 ml dieser Lösung mit einer Mischung von (5 g von DL-α-Tocopherol und 5 ml Squalen) mischt, und die Mischung anschließend mikrofluidisiert. Die resultierende Emulsion kann Öltröpfchen im Submikronbereich aufweisen, d. h. mit einer Größe zwischen 100 und 250 nm, vorzugsweise etwa 180 nm.
• Eine Emulsion aus Squalen, einem Tocopherol und einem Triton-Detergens (z. B. Triton X-100). Die Emulsion kann ferner ein 3-O-deacyliertes Monophosphoryl-Lipid A (”3d-MPL”) umfassen. Die Emulsion kann ferner einen Phosphatpuffer umfassen.
• Eine Emulsion, die Squalen, ein Polysorbat (z. B. Polysorbat 80), ein Triton-Detergens (z. B. Triton x-100) und ein Tocopherol (z. B. ein α-Tocopherol-Succinat) umfasst. Die Emulsion kann diese drei Bestandteile in einem Massenverhältnis von etwa 75:11:10 umfassen (z. B. 750 μg/ml Polysorbat 80, 110 μg/ml Triton X-100 und 100 μg/ml α-Tocopherol-Succinat), und diese Konzentrationen sollten jeglichen Beitrag dieser Bestandteile von Antigenen einschließen. Die Emulsion kann ferner ein 3d-MPL enthalten. Die Emulsion kann auch ein Saponin enthalten, wie beispielsweise QS21. Die wässrige Phase kann einen Phosphatpuffer enthalten.
• Eine Emulsion, die Squalen, ein wässriges Lösungsmittel, ein hydrophiles nicht-ionisches Polyoxyethylenalkylether-Tensid (z. B. Polyoxyethylen (12) Cetostearylether) und ein hydrophobes nichtionisches Tensid (z. B. einen Sorbitanester oder einen Mannitester, wie beispielsweise Sorbitanmonooleat oder ”Span 80”) umfasst. Die Emulsion ist vorzugsweise thermoreversibel und/oder sie weist mindestens 90 Vol.-% der Öltröpfchen mit einer Größe von weniger als 200 nm auf [40]. Die Emulsion kann ferner ein oder mehrere von folgenden Substanzen umfassen: Alditol; ein kryoprotektives Mittel (z. B. einen Zucker, wie beispielsweise Dodecylmaltosid und/oder Saccharose), und/oder ein Alkylpolyglycosid. Sie kann ferner einen TLR4-Agonisten umfassen, wie beispielsweise einen solchen, dessen chemische Struktur keinen Zuckerring umfasst [41]. Solche Emulsionen können lyophilisiert sein.

Die Zusammensetzungen dieser Emulsionen, die oben in prozentualen Anteilen ausgedrückt werden, können durch Verdünnung oder Aufkonzentrierung modifiziert werden (z. B. durch eine ganze Zahl wie beispielsweise 2 oder 3, oder durch eine Bruchzahl, wie beispielsweise 2/3 oder 3/4), wobei ihre Verhältnisse gleich bleiben. Beispielsweise würde ein zweifach konzentriertes MF59 etwa 10% Squalen, etwa 1% Polysorbat 80 und etwa 1% Sorbitantrioleat enthalten. Konzentrierte Formen können verdünnt werden (z. B. mit einer Antigenlösung), um eine gewünschte finale Konzentration der Emulsion bereitzustellen.
Die Emulsionen der vorliegenden Erfindung werden idealerweise bei zwischen 2°C und 8°C gelagert. Sie sollten nicht eingefroren werden. Sie sollten idealerweise von direkter Lichteinstrahlung ferngehalten werden. Squalen-haltige Emulsionen und Impfstoffe der vorliegenden Erfindung sollten geschützt werden, um den photochemischen Abbau von Squalen zu verhindern. Wenn die Emulsionen der vorliegenden Erfindung gelagert werden, erfolgt dies vorzugsweise in einer Inert-Athmosphäre, z. B. Stickstoff oder Argon.
Impfstoffe
Obwohl es möglich ist, Öl-in-Wasser-Emulsions-Adjuvantien als solche an Patienten zu verabreichen (z. B. um eine Adjuvans-Wirkung für ein Antigen bereitzustellen, welches getrennt an den Patienten verabreicht wurde), ist es üblicher, das Adjuvans vor der Verabreichung mit einem Antigen zu vermischen, um eine immunogene Zusammensetzung zu bilden, z. B. einen Impfstoff. Das Mischen von Emulsion und Antigen kann unmittelbar zum Zeitpunkt der Verwendung erfolgen, oder es kann während der Herstellung des Impfstoffs vor der Abfüllung erfolgen. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können in beiden Situationen verwendet werden.
Somit kann ein erfindungsgemäßes Verfahren einen weiteren Verfahrensschritt umfassen, bei dem die Emulsion mit einem Antigen-Bestandteil vermischt wird. Als Alternative kann es einen weiteren Schritt umfassen, bei dem das Adjuvans als ein Kit-Bestandteil zusammen mit einem Antigen-Bestandteil in einen Kit verpackt wird.
Insgesamt kann die Erfindung somit verwendet werden, wenn gemischte Impfstoffe hergestellt werden oder wenn Kits hergestellt werden, die Antigen und Adjuvans in einer für die Mischung fertigen Form umfassen. Wenn das Mischen während der Herstellung erfolgt, dann werden die Volumina von Bulk-Antigen und Emulsion, die miteinander vermischt werden, üblicherweise größer sein als 1 Liter, z. B. ≥ 5 Liter, ≥ 10 Liter, ≥ 20 Liter, ≥ 50 Liter, usw. Wenn das Mischen zum Zeitpunkt der Verwendung erfolgt, dann werden die Volumina, die miteinander vermischt werden, üblicherweise kleiner als 1 ml sein, z. B. ≤ 0,6 ml, ≤ 0,5 ml, ≤ 0,4 ml, ≤ 0,3 ml, ≤ 0,2 ml, usw. In beiden Fällen ist es üblich, dass im Wesentlichen gleiche Volumina von Emulsion und Antigenlösung miteinander vermischt werden, d. h. im Wesentlichen 1:1 (z. B. zwischen 1,1:1 und 1:1,1, vorzugsweise zwischen 1,05:1 und 1:1,05 und insbesondere bevorzugt zwischen 1,025:1 und 1:1,025). In einigen Ausführungsformen jedoch kann ein Überschuss von Emulsion oder ein Überschuss von Antigen verwendet werden [42]. Wenn ein überschüssiges Volumen eines Bestandteils verwendet wird, dann wird der Überschuss im Allgemeinen mindestens 1,5:1 betragen, z. B. ≥ 2:1, ≥ 2,5:1, ≥ 3:1, ≥ 4:1, ≥ 5:1, usw.
Wenn Antigen und Adjuvans als getrennte Bestandteile innerhalb eines Kits bereitgestellt werden, so liegen diese getrennt voneinander innerhalb des Kits vor, und diese Trennung kann auf verschiedene Weise erreicht werden. Beispielsweise können die Bestandteile in getrennten Behältern, wie beispielsweise Fläschchen, vorliegen. Die Inhalte von zwei Fläschchen können bei Bedarf miteinander vermischt werden, z. B. durch Entfernen des Inhalts eines Fläschchens und Überführen dieses Inhalts in das andere Fläschchen, oder durch getrenntes Entfernen der Inhalte beider Fläschchen und Mischen derselben in einem dritten Behälter.
In einer anderen Ausgestaltung liegt einer der Kit-Bestandteile in einer Spritze vor, und der andere liegt in einem Behälter, wie beispielsweise in einem Fläschchen, vor. Die Spritze kann so verwendet werden (z. B. mit einer Nadel), dass man zum Zwecke der Vermischung ihren Inhalt in den Behälter einbringt, und die Mischung kann dann in die Spritze aufgezogen werden. Der gemischte Inhalt der Spritze kann anschließend an einen Patienten verabreicht werden, üblicherweise mit einer neuen sterilen Nadel. Die Verpackung eines Bestandteils in eine Spritze macht das Erfordernis der Verwendung einer getrennten Spritze für die Verabreichung an den Patienten überflüssig.
In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung werden die beiden Kit-Bestandteile gemeinsam, jedoch getrennt voneinander in der gleichen Spritze gehalten, z. B. in einer Spritze mit zwei Kammern, wie beispielsweise solchen, die in den Literaturstellen 43–50, usw. beschrieben sind. Wenn die Spritze betätigt wird, z. B. während der Verabreichung an einen Patienten, werden die Inhalte der beiden Kammern vermischt. Diese Ausgestaltung vermeidet das Erfordernis nach einem separaten Mischschritt zum Zeitpunkt der Verwendung.
Die Inhalte der verschiedenen Kit-Bestandteile werden im Allgemeinen alle in wässriger Form vorliegen. In einigen Ausgestaltungen liegt ein Bestandteil (üblicherweise der Antigen-Bestandteil eher als der Emulsions-Bestandteil) in trockener Form vor (z. B. in einer lyophilisierten Form), während der andere Bestandteil in wässriger Form vorliegt. Die beiden Bestandteile können vermischt werden, um den trockenen Bestandteil zu reaktivieren und eine wässrige Zusammensetzung zur Verabreichung an einen Patienten bereitzustellen. Ein lyophilisierter Bestandteil wird Üblicherweise in einem Fläschchen vorliegen und nicht in einer Spritze. Getrocknete Bestandteile können Stabilisationsmittel, wie beispielsweise Laktose, Saccharose oder Mannitol enthalten, sowie auch Mischungen derselben, z. B. Laktose/Saccharose-Mischungen, Saccharose/Mannitol-Mischungen, usw. Eine mögliche Ausgestaltung verwendet einen wässrigen Emulsions-Bestandteil in einer vorgefüllten Spritze und einen lyophilisierten Antigen-Bestandteil in einem Fläschchen.
Wenn Impfstoffe neben dem Adjuvans und dem Antigen weitere Bestandteile umfassen, dann können diese weiteren Bestandteile in einem der beiden Kit-Bestandteile eingebracht werden, oder sie können Teil eines dritten Kit-Bestandteils sein.
Geeignete Behälter für erfindungsgemäß gemischte Impfstoffe oder für einzelne Kit-Bestandteile umfassen Fläschchen und Einwegspritzen. Diese Behälter sollten steril sein.
Wenn eine Zusammensetzung/ein Bestandteil in einem Fläschchen vorliegt, dann besteht das Fläschchen vorzugsweise aus einem Glas- oder Kunststoffmaterial. Das Fläschchen wird vorzugsweise sterilisiert, bevor die Zusammensetzung in dieses eingebracht wird. Um Probleme bei Latex-empfindlichen Patienten zu vermeiden, werden die Fläschchen vorzugsweise mit einem latexfreien Stopfen versiegelt, und das Fehlen von Latex in allen Verpackungsmaterialien ist bevorzugt. Das Fläschchen kann eine einzelne Dosis von Impfstoff/Bestandteil umfassen, oder es kann mehr als eine Dosis umfassen (ein ”Mehr-Dosen”-Fläschchen), z. B. 10 Dosen. In einer Ausführungsform umfasst ein Fläschchen 10 × Dosen von 0,25 ml der Emulsion. Bevorzugte Fläschchen werden aus farblosem Glas hergestellt.
Ein Fläschchen kann über einen Verschluss verfügen (z. B. über ein Luer-Lock), der so angepasst ist, dass eine vorgefüllte Spritze in den Verschluss eingeführt werden kann, wodurch der Inhalt der Spritze in das Fläschchen eingebracht werden kann (z. B. um lyophilisiertes Material in dem Fläschchen zu rekonstituieren), und der Inhalt des Fläschchens kann zurück in die Spritze gezogen werden. Nach Entfernung der Spritze aus dem Fläschchen kann eine Nadel angebracht werden, und die Zusammensetzung kann an einen Patienten verabreicht werden. Der Verschluss liegt vorzugsweise innerhalb einer Dichtung oder Abdeckung, so dass die Dichtung oder die Abdeckung entfernt werden muss, bevor man zu dem Verschluss gelangt.
Wenn eine Zusammensetzung/ein Bestandteil in eine Spritze verpackt wird, dann wird die Spritze normalerweise über eine Nadel verfügen, die daran angebracht ist, obwohl mit der Spritze eine separate Nadel zum Zusammenbau und zur Verwendung geliefert werden kann. Sicherheitsnadeln sind bevorzugt. 1-Inch 23-Gauge-, 1-Inch 25-Gauge- und 5/8-Inch 25-Gauge-Nadeln sind üblich. Die Spritzen können mit entfernbaren Aufklebern versehen sein, auf denen die Chargennummer, die Influenza-Saison und das Ablaufdatum des Inhalts aufgedruckt sein können, um das Führen von Aufzeichnungen zu gewährleisten. Der Kolben in der Spritze verfügt vorzugsweise über einen Stopper, um zu verhindern, dass der Kolben unbeabsichtigt während des Aufziehens entfernt wird. Die Spritzen können einen Latexgummiverschluss und/oder -kolben aufweisen. Einwegspritzen enthalten eine Einzeldosis des Impfstoffs. Die Spritze wird üblicherweise über einen Verschluss an der Spitze verfügen, um die Spitze vor Anbringung einer Nadel abzudichten, und der Verschluss der Spitze ist vorzugsweise aus einem Butylgummi gefertigt. Wenn die Spritze und die Nadel getrennt voneinander verpackt werden, dann ist die Nadel vorzugsweise mit einem Butylgummi-Schutz ausgestattet.
Die Emulsion kann vor der Verpackung in ein Fläschchen oder eine Spritze mit einem Puffer verdünnt werden. Übliche Puffer umfassen: einen Phosphatpuffer; einen Tris-Puffer; einen Borat-Puffer; einen Succinat-Puffer; einen Histidin-Puffer oder einen Citrat-Puffer. Die Verdünnung kann die Konzentration der Bestandteile des Adjuvans verringern, während deren relativen Anteile zueinander beibehalten werden, um beispielsweise ein Adjuvans mit ”halber Stärke” bereitzustellen.
Die Behälter können markiert sein, um ein Halb-Dosis-Volumen anzuzeigen, z. B. um die Verabreichung an Kinder zu ermöglichen. Eine Spritze, die eine Dosis von 0,5 ml enthält, kann beispielsweise eine Markierung aufweisen, die ein Volumen von 0,25 ml anzeigt.
Wenn ein Glasbehälter, z. B. eine Spritze oder ein Fläschchen, verwendet wird, dann ist es bevorzugt, einen Behälter zu verwenden, der aus Borsilikat-Glas besteht, und keinen Behälter, der aus Kalk-Natronglas besteht.
Verschiedene Antigene können mit Öl-in-Wasser-Emulsionen verwendet werden, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf): virale Antigene, wie beispielsweise virale Oberflächen-Proteine; bakterielle Antigene, wie beispielsweise Protein- und/oder Saccharid-Antigene; fungale Antigene; Parasiten-Antigene und Tumor-Antigene. Die Erfindung ist insbesondere nützlich für Impfstoffe gegen Influenza-Virus, HIV, Hakenwurm, Hepatitis B-Virus, Herpes-Simplex-Virus, Tollwut, respiratorisches Syncytialvirus, Cytomegalie-Virus, Staphylococcus aureus, Chlamydia, SARS, Coronavirus, Varicella-Zoster-Virus, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, Epstein-Barr-Virus, humanes Papillomavirus, usw. Beispielsweise:

• Influenza-Virus-Antigene. Diese können in Form eines lebendigen Virus oder in Form eines inaktivierten Virus vorliegen. Wenn ein inaktiviertes Virus verwendet wird, kann der Impfstoff das gesamte Virion, ein Spalt-Virion (split virion) oder gereinigte Oberflächen-Antigene (einschließlich Hämagglutinin und normalerweise auch Neuraminidase) umfassen. Influenza-Antigene können darüber hinaus auch in Form von Virosomen präsentiert werden. Die Antigene können jeden beliebigen Hämagglutinin-Subtypen aufweisen, der ausgewählt ist aus H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 und/oder H16. Der Impfstoff kann ein Antigen oder Antigene von einem oder von mehreren (z. B. 1, 2, 3, 4 oder mehr) Influenza-Virus-Stämmen enthalten, einschließlich Influenza A-Virus und/oder Influenza B-Virus, z. B. ein monovalenter A/H5N1- oder ein A/H1N1-Impfstoff, oder ein trivalenter Impfstoff aus A/H1N1 + A/H3N2 + B. Das Influenza-Virus kann ein Reassortanten-Stamm sein, und dieser kann durch reverse genetische Verfahren erhalten worden sein [z. B. 51–55]. Daher kann das Virus ein oder mehrere RNA-Segmente aus einem A/PR/8/34-Virus enthalten (üblicherweise 6 Segmente aus A/PR/8/34, wobei das HA- und das N-Segment von einem Impfstoff-Stamm stammen, d. h. ein 6:2 Reassortante). Die Viren, die als Quelle für die Antigene verwendet werden, können entweder in Eiern (z. B. in embryonierten Hühner-Eiern) oder in Zellkultur gezüchtet werden. Bei Verwendung einer Zellkultur wird das Zellsubstrat üblicherweise eine Säugetier-Zelllinie sein, wie beispielsweise MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38; usw. Bevorzugte Säugetier-Zelllinien zur Anzüchtung von Influenza-Viren umfassen: MDCK-Zellen [56–59], die von Madin-Darby-Hundenieren abgeleitet sind; Vero-Zellen [60–62], die von der Niere der afrikanischen grünen Meerkatze abgeleitet sind; oder PER.C6-Zellen [63], die von humanen embryonalen Retinoblasten abgeleitet sind. Wenn das Virus in einer Säugetier-Zelllinie angezüchtet wurde, dann wird die Zusammensetzung in vorteilhafter Weise frei von Hühner-Proteinen sein (z. B. Ovalbumin und Ovomucoid), sowie frei von Hühner-DNA, wodurch die Allergenität verringert wird. Einheitsdosen von Impfstoffen werden üblicherweise in Bezug auf den Gehalt an Hämagglutinin (HA) standardisiert, wobei dies üblicherweise mit SRID gemessen wird. Bestehende Impfstoffe enthalten üblicherweise etwa 15 μg HA pro Stamm, obwohl geringere Dosen verwendet werden können, insbesondere wenn ein Adjuvans verwendet wird. Fraktionierte Dosen, wie beispielsweise 1/2 (d. h. 7,5 μg HA pro Stamm), 1/4 und 1/8 sind verwendet worden [64, 65] sowie auch höhere Dosen (z. B. 3 × oder 9 × Dosen [66, 67]) Somit können Impfstoffe zwischen 0,1 und 150 μg HA pro Influenza-Stamm enthalten, vorzugsweise zwischen 0,1 sind 50 μg, z. B. 0,1–20 μg, 0,1–15 μg, 0,1–10 μg, 0,1–7,5 μg, 0,5–5 μg, usw. Besondere Dosen umfassen z. B. etwa 15, etwa 10, etwa 7,5, etwa 5, etwa 3,8, etwa 3,75, etwa 1,9, etwa 1,5 usw. pro Stamm.
• Humanes Immundefizienzvirus, einschließlich HIV-1 und HIV-2. Das Antigen wird üblicherweise ein Antigen der Hülle sein.
• Hepatitis B-Virus-Oberflächen-Antigene. Dieses Antigen wird vorzugsweise durch rekombinante DNA-Verfahren erhalten, z. B. nach Expression in einer Saccharomyces cerevisiae-Hefe. Im Gegensatz zu nativem, viralem HBsAg ist das rekombinante, in der Hefe exprimierte Antigen nicht glykosyliert. Es kann in Form von im Wesentlichen sphärischen Partikeln vorliegen (durchschnittlicher Durchmesser von etwa 20 nm), die eine Lipid-Matrix umfassen, welche Phospholipide enthält. Im Gegensatz zu nativen HBsAg-Partikeln können die in Hefe exprimierten Partikel Phosphatidylinositol enthalten. Das HBsAg kann von einem beliebigen der Subtypen ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq– und adrq+ stammen.
• Hakenwurm, insbesondere solche, die in Hunden (Ancylostoma caninum) beobachtet werden. Das Antigen kann rekombinantes Ac-MTP-1 (Astacin-ähnliche Metalloprotease) und/oder eine Aspartat-Hämoglobinase (aspartic hemoglobinase, Ac-APR-1) sein, das/die in einem Baculovirus/Insekten-Zellsystem als Sekretionsprotein exprimiert werden kann [68, 69].
• Herpes-simplex-Virus-Antigene (HSV). Ein bevorzugtes HSV-Antigen zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist das Membran-Glykoprotein gD. Es wird bevorzugt, gD aus einem HSV-2-Stamm (”gD2”-Antigen) zu verwenden. Die Zusammensetzung kann eine Form von gD verwenden, bei dem die C-terminale Membranankerregion deletiert wurde [70], z. B. ein trunkiertes gD, das die Aminosäuren 1–306 des natürlichen Proteins umfasst, und bei dem Asparagin und Glutamin am C-Terminus zugefügt wurden. Diese Form des Proteins umfasst das Signalpeptid, welches abgespalten wird, wobei ein reifes Protein mit 283 Aminosäuren entsteht. Die Deletion des Ankers ermöglicht es, das Protein in löslicher Form herzustellen.
• Antigene von humanem Papillomavirus (HPV). Bevorzugte HPV-Antigene zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind L1-Kapsid-Proteine, die sich zusammenlagern können, wobei Strukturen gebildet werden, die als Virus-ähnliche Partikel (virus-like particles, VLPs) bekannt sind. Die VLPs können durch rekombinante Expression von L1 in Hefezellen (z. B. in S. cerevisiae) oder in Insektenzellen (z. B. in Spodoptera-Zellen, wie beispielsweise in S. frugiperda, oder in Drosophila-Zellen) erzeugt werden. Bei Hefe-Zellen können die Plasmidvektoren das/die L1-Gen(e) tragen; bei Insektenzellen können Baculovirus-Vektoren das/die L1-Gen(e) enthalten. Es wird bevorzugt, dass die Zusammensetzung L1-VLPs sowohl von HPV-16- als auch von HPV-18-Stämmen enthält. Es wurde gezeigt, dass diese bivalente Kombination hochwirksam ist [71]. Zusätzlich zu HPV-16- und HPV-18-Stämmen ist es möglich, L1-VLPs von HPV-6- und HPV-11-Stämmen einzubringen. Die Verwendung von onkogenen HPV-Stämmen ist ebenfalls möglich. Ein Impfstoff kann zwischen 20–60 μg/ml (z. B. etwa 40 μg/ml) L1 pro HPV-Stamm umfassen.
• Anthrax-Antigene. Anthrax wird durch Bacillus anthracis verursacht. Geeignete Antigene von B. anthracis umfassen A-Bestandteile (letaler Faktor (LF) und Ödem-Faktor (EF)), wobei beiden ein üblicher B-Bestandteil gemein sein kann, der als protektives Antigen (PA) bekannt ist. Die Antigene können wahlweise detoxifiziert sein. Weitere Details können in den Literaturstellen [72–74] gefunden werden.
• S. aureus-Antigene. Eine Vielzahl von Antigenen von S. aureus ist bekannt. Geeignete Antigene umfassen Kapselsaccharide (z. B. von einem Stamm vom Typ 5 und/oder von einem Stamm vom Typ 8) und Proteine (z. B. IsdB, Hla, usw.). Kapselsaccharid-Antigene sind idealerweise an ein Trägerprotein konjugiert.
• S. pneumoniae-Antigene. Eine Vielzahl von Antigenen von S. pneumoniae ist bekannt. Geeignete Antigene umfassen Kapselsaccharide (z. B. von einem oder von mehreren der Serotypen 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F und/oder 23F) und Proteine (z. B. Pneumolysin, detoxifiziertes Pneumolysin, Polyhistidin-Triad-Protein D (PhtD), usw.). Kapselsaccharid-Antigene sind idealerweise an ein Trägerprotein konjugiert.
• Krebs-Antigene. Eine Vielzahl von Tumor-spezifischen Antigenen ist bekannt. Die Erfindung kann mit Antigenen verwendet werden, die eine immuntherapeutische Antwort gegen Lungenkrebs, Melanom, Brustkrebs, Prostatakrebs, usw., zeigen.

Eine Lösung des Antigens wird normalerweise mit der Emulsion gemischt, z. B. bei einem Volumenverhältnis von 1:1. Diese Vermischung kann entweder vom Hersteller des Impfstoffs vor der Abfüllung vorgenommen werden, oder sie kann zum Zeitpunkt der Verwendung durch eine Fachkraft im Gesundheitswesen vorgenommen werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung
Zusammensetzungen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, sind pharmazeutisch akzeptabel. Sie können weitere Bestandteile neben der Emulsion und dem wahlweise vorhandenen Antigen umfassen.
Die Zusammensetzungen können einen Konservierungsstoff, wie beispielsweise Thiomersal oder 2-Phenoxyethanol, enthalten. Es ist jedoch bevorzugt, dass der Impfstoff im Wesentlichen frei von (d. h. weniger als 5 μg/ml) Quecksilbermaterial ist, z. B. Thiomersal-frei [75, 76]. Impfstoffe und Bestandteile, die kein Quecksilber umfassen, werden stärker bevorzugt.
Der pH-Wert der Zusammensetzung wird üblicherweise zwischen 5,0 und 8,1 liegen, wobei ein pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 noch üblicher ist, z. B. zwischen 6,5 und 7,5. Ein Verfahren der Erfindung kann somit einen Schritt umfassen, bei dem der pH-Wert des Ausgangsimpfstoffs vor der Verpackung eingestellt wird.
Die Zusammensetzung ist vorzugsweise steril. Die Zusammensetzung ist vorzugsweise nicht-pyrogen; sie enthält z. B. < 1 EU (Endotoxin-Einheiten, eine Standard-Einheit) pro Dosis, und vorzugsweise < 0,1 EU pro Dosis. Die Zusammensetzung ist vorzugsweise Gluten-frei.
Die Zusammensetzung kann Material für eine einzelne Immunisierung enthalten, oder sie kann Material für mehrere Immunisierungen enthalten (d. h. ein ”Mehr-Dosen”-Kit). Die Einbringung eines Konservierungsmittels ist bei Mehr-Dosen-Ausgestaltungen bevorzugt.
Die Impfstoffe werden üblicherweise in einem Dosis-Volumen von etwa 0,5 ml verabreicht, obwohl eine halbe Dosis (d. h. etwa 0,25 ml) an Kinder verabreicht werden kann.
Verfahren der Behandlung und Verabreichung des Impfstoffs
Die Erfindung stellt Kits und Zusammensetzungen bereit, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden. Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Zusammensetzungen sind für die Verabreichung an humane Patienten geeignet, und die Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung einer Immunantwort in einem Patienten bereit, bei dem eine solche Zusammensetzung an den Patienten verabreicht wird.
Die Erfindung stellt ferner diese Kits und Zusammensetzungen zur Verwendung als Medikamente bereit.
Die Erfindung stellt ferner die Verwendung von Folgendem bereit: (i) einer wässrigen Zubereitung eines Antigens; und (ii) eines Öl-in-Wasser-Emulsions-Adjuvans, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Erhöhung einer Immunantwort in einem Patienten.
Die Immunantwort, die durch diese Verfahren und Verwendungen erzeugt wird, wird Üblicherweise eine Antikörper-Antwort umfassen, vorzugsweise eine protektive Antikörper-Antwort.
Die Zusammensetzungen können auf verschiedene Arten verabreicht werden. Der am meisten bevorzugte Immunisierungsweg erfolgt durch intramuskuläre Injektion (z. B. in den Arm oder in das Bein), wobei andere verfügbare Wege die subkutane Injektion, die intranasale [77–79], die orale [80], die intradermale [81, 82], die transkutane, die transdermale [83], usw. Verabreichung umfassen.
Die erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffe können verwendet werden, um sowohl Kinder als auch Erwachsene zu behandeln. Der Patient kann weniger als 1 Jahr alt sein, 1–5 Jahre alt sein, 5–15 Jahre alt sein, 15–55 Jahre alt sein oder mindestens 55 Jahre alt sein. Der Patient kann älter sein (z. B. ≥ 50 Jahre, vorzugsweise ≥ 65 Jahre), er kann jung sein (z. B. ≤ 5 Jahre) und es kann sich um Patienten im Krankenhaus handeln, um Angestellte im Gesundheitswesen, um Armeeangehörige und militärisches Personal, um schwangere Frauen, um chronisch Kranke, um immundefiziente Patienten, oder um Menschen, die ins Ausland reisen. Die Impfstoffe sind jedoch nicht nur für diese Gruppen geeignet, sondern sie können in breiterer Form in einer Population Verwendung finden.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können im Wesentlichen gleichzeitig mit anderen Impfstoffen an Patienten verabreicht werden (z. B. während des gleichen Besuchs oder der gleichen Vorstellung bei medizinischem Fachpersonal).
Intermediäre Verfahren
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren für die Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion bereit, bei dem man eine erste Emulsion mikrofluidisiert, um eine zweite Emulsion zu bilden, und die zweite Emulsion filtriert. Die erste Emulsion weist die oben beschriebenen Eigenschaften auf.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion bereit, bei dem man eine zweite Emulsion filtriert, d. h. eine mikrofluidisierte Emulsion. Die mikrofluidisierte Emulsion weist die oben beschriebenen Eigenschaften auf.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs bereit, bei dem man eine Emulsion mit einem Antigen kombiniert, wobei die Emulsion die oben beschriebenen Eigenschaften aufweist.
Spezifische Ausführungsformen
Spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen:

• Ein Verfahren zur Herstellung einer Squalen enthaltenden Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man (i) eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße bildet; (ii) die erste Emulsion mikrofluidisiert, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße; und (iii) die zweite Emulsion unter Verwendung einer hydrophilen Membran filtriert.
• Ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man (i) eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße von 5000 nm oder weniger bildet; (ii) die erste Emulsion mikrofluidisiert, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße; und (iii) die zweite Emulsion unter Verwendung einer hydrophilen Membran filtriert.
• Ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man (i) eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße bildet; (ii) die erste Emulsion mikrofluidisiert, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittliche Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße; und (iii) die zweite Emulsion unter Verwendung einer hydrophilen Polyethersulfon-Membran filtriert.
• Ein Verfahren zur Herstellung einer Squalen enthaltenden Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man (i) eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße unter Verwendung eines Homogenisators bildet, wobei die erste Emulsion gebildet wird, indem man die Bestandteile der ersten Emulsion mehrere Male durch einen Homogenisator zirkulieren lässt.
• Ein Verfahren zur Herstellung einer Squalen enthaltenden Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man (b) eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße mikrofluidisiert, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße, wobei die zweite Emulsion gebildet wird, indem man die Bestandteile der zweiten Emulsion zirkulieren lässt, indem man die Bestandteile der zweiten Emulsion von einem ersten Emulsionsbehälter durch eine erste Mikrofluidisierungs-Vorrichtung zu einem zweiten Emulsionsbehälter und anschließend durch eine zweite Mikrofluidisierungs-Vorrichtung leitet, wobei die erste und die zweite Mikrofluidisierungs-Vorrichtung identisch sind.
• Ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man: eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße durch eine Mikrofluidisierungs-Vorrichtung leitet, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße; wobei die Mikrofluidisierungs-Vorrichtung eine Interaktionskammer umfasst, die eine Vielzahl von Kanälen vom Z-Typ und ein Hilfsverarbeitungsmodul umfasst, welches mindestens einen Kanal umfasst; wobei das Hilfsverarbeitungsmodul stromabwärts von der Interaktionskammer positioniert ist.
• Ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße durch eine Mikrofluidisierungs-Vorrichtung leitet, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße; wobei die Mikrofluidisierungs-Vorrichtung eine Interaktionskammer und ein Hilfsverarbeitungsmodul umfasst, welches eine Vielzahl von Kanälen umfasst.
• Ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße durch eine Mikrofluidisierungs-Vorrichtung leitet, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße; wobei die Mikrofluidisierungs-Vorrichtung eine Interaktionskammer umfasst, und wobei der Druck der Bestandteile am Einlass in die Interaktionkammer für mindestens 85% der Zeit, während der die Emulsion in die Mikrofluidisierungs-Vorrichtung geleitet wird, im Wesentlichen konstant ist.
• Ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße bildet, wobei die Bildung der ersten Emulsion unter einem Inert-Gas durchgeführt wird, z. B. Stickstoff, z. B. bei einem Druck von bis zu 0,5 Bar.
• Ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße durch eine Mikrofluidisierungs-Vorrichtung leitet, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße, wobei die Bildung der zweiten Emulsion unter einem Inert-Gas durchgeführt wird, z. B. Stickstoff, z. B. bei einem Druck von bis zu 0,5 Bar.
• Ein Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man (i). eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße bildet, (ii) die erste Emulsion mikrofluidisiert, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße, (iii) die zweite Emulsion filtriert; (iv) die Öl-in-Wasser-Emulsion in einen sterilen flexiblen Beutel (flex bag) überführt.

Allgemeines
Der Begriff ”umfassen” schließt ”enthalten” sowie ”bestehen aus” ein; z. B. kann eine Zusammensetzung, die X ”umfasst” ausschließlich aus X bestehen, oder sie kann neben X etwas anderes enthalten, z. B. X + Y.
Der Begriff ”im Wesentlichen” schließt ”vollständig” nicht aus; z. B. kann eine Zusammensetzung, die ”im Wesentlichen frei” von Y ist, vollständig frei von Y sein. Falls notwendig kann der Begriff ”im Wesentlichen” bei der Definition der Erfindung ausgelassen werden.
Der Begriff ”etwa” bedeutet in Bezug auf einen numerischen Wert x beispielsweise x ± 10%.
Sofern nicht ausdrücklich angegeben, erfordert ein Prozess, bei dem zwei oder mehrere Bestandteile miteinander vermischt werden, keine spezifische Reihenfolge bei der Mischung. Die Bestandteile können daher in jeder beliebigen Reihenfolge miteinander vermischt werden. Wenn es drei Bestandteile gibt, können zwei Bestandteile miteinander vermischt werden, und die Kombination kann dann mit dem dritten Bestandteil kombiniert werden, usw.
Wenn tierische (insbesondere bovine) Materialien bei der Kultivierung von Zellen verwendet werden, dann sollten diese von Bezugsquellen erhalten werden, die frei von transmissiblen spongiformen Encephalopathien (TSEs) sind, und insbesondere frei von der bovinen spongiformen Encephalopathie (BSE). Insgesamt wird es bevorzugt, die Zellen in völliger Abwesenheit von Materialien, die von Tieren erhalten wurden, zu kultivieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein spezifisches Beispiel für einen Homogenisator, der verwendet werden kann, um eine erste Emulsion zu bilden.
2 zeigt Details zu einem Rotor und einem Stator, die in einem solchen Homogenisator verwendet werden können.
3 zeigt 2 Druckprofile für einen synchronen Modus der Verstärkungspumpe.
4 zeigt eine Interaktionskammer mit einem Kanal vom Typ Z.
ARTEN DER DURCHFÜHRUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Beispiel 1
Eine mikrofluidisierte Emulsion, die Squalen, Polysorbat 80, Sorbitantrioleat und Natriumcitratpuffer umfasst, wurde gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt. Die Emulsion wurde mikrofluidisiert, bis sie eine durchschnittliche Öltröpfchengröße von 165 nm oder weniger und eine Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm von 5 × 10⁸/ml oder weniger aufwies.
Die Emulsion wurde durch eine Filterkartusche vom Sterilisationsgütegrad (Filter A) filtriert, die eine Vorfiltermembran aus hydrophilem, asymmetrischem, porösem Polyethersulfon mit einer Porengröße von 0,45 μm und eine Endfiltermembran aus hydrophilem, asymmetrischem Polyethersulfon mit einer Porengröße von 0,2 μm umfasste. Während der Filtration wurde die Emulsion bei einer Temperatur von 40 ± 5°C gehalten.

Das obige Verfahren wurde für vier getrennte Läufe durchgeführt, und die Eigenschaften der filtrierten Emulsion wurden gemessen und sind in Tabelle 1 gezeigt.

Testparameter	tatsächlicher Wert
Testparameter	Lauf 1	Lauf 2	Lauf 3	Lauf 4
durchschnittliche Öltröpfchengröße	148	144	144	150
Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 um	0,08 × 10⁶	0,08 × 10⁶	0,12 × 10⁶	0,20 × 10⁶

Tabelle 1

Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, verringerte Filter A durchweg die durchschnittliche Größe der Öltröpfchen in der Emulsion. Darüber hinaus verringerte Filter A durchweg die Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm in der Emulsion um etwa das 10³ fache.
Beispiel 2
Die gleiche mikrofluidisierte Emulsion, die in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde durch eine andere Filterkartusche vom Sterilisationsgütegrad (Filter B) filtriert. Filter B umfasste eine Vorfiltermembran aus hydrophilem, asymmetrischem, porösem Polyethersulfon und eine Endfiltermembran aus hydrophilem, asymmetrischem, porösem Polyethersulfon mit einer Porengröße von 0,2 μm. Während der Filtration wurde die Emulsion bei einer Temperatur von 40 ± 5°C gehalten.

Das obige Verfahren wurde für vier getrennte Läufe durch geführt, und die Eigenschaften der filtrierten Emulsion wurden gemessen und sind in Tabelle 2 gezeigt.

Testparameter	tatsächlicher Wert
Testparameter	Lauf 1	Lauf 2	Lauf 3	Lauf 4
Durchschnittliche Öltröpfchengröße	142	143	141	141
Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm	0,23 × 10⁶	0,15 × 10⁶	0,20 × 10⁶	0,23 × 10⁶

Tabelle 2

Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, verringerte Filter B durchweg die durchschnittliche Größe der Öltröpfchen in der Emulsion. Darüber hinaus verringerte Filter B durchweg die Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm in der Emulsion um etwa das 10³ fache.
Den Beispielen 1 und 2 kann entnommen werden, dass Filter B zu einer geringfügig kleineren Öltröpfchengröße führte, jedoch zu einer geringfügig höheren Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm. Sowohl Filter A als auch Filter B zeigten jedoch exzellente Resultate.
Beispiel 3
Die gleiche mikrofluidisierte Emulsion, die für Beispiel 1 verwendet wurde, wurde durch noch eine andere Filterkartusche vom Sterilisationsgütegrad (Filter C) filtriert. Filter C umfasste eine Vorfiltermembran aus hydrophilem, asymmetrischem, porösem Polyethersulfon mit einer Porengröße von 0,5 μm und eine Endfiltermembran aus hydrophilem, asymmetrischem, porösem Polyethersulfon mit einer Porengröße von 0,2 μm. Während der Filtration wurde die Emulsion bei einer Temperatur von 40 ± 5°C gehalten.
Darüber hinaus wurde die gleiche mikrofluidisierte Emulsion, die in Beispiel 1 verwendet wurde, noch durch eine andere Filterkartusche vom Sterilisationsgütegrad (Filter D) filtriert. Filter D umfasste eine Vorfiltermembran aus hydrophilem, asymmetrischem, porösem Polyethersulfon und eine Endfiltermembran aus hydrophilem, porösem PVDF. Während der Filtration wurde die Emulsion bei einer Temperatur von 40 ± 5°C gehalten.
Filter C zeigte exzellente Filtrationsergebnisse, wobei eine filtrierte Emulsion mit einer durchschnittlichen Tröpfchengröße von 155 ± 20 nm und eine Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm von 5 × 10⁶/ml oder weniger erhalten wurde. Obwohl Filter D ebenfalls eine filtrierte Emulsion bereitstellte, die den oben aufgeführten Kriterien entsprach, wurde herausgefunden, dass dieser schneller verstopfte, was den Austausch der Membran von Filter D erforderlich machte. Somit waren alle Polyethersulfon-Filter diesem PVDF-Filter überlegen.
Es wird verständlich sein, dass diese Erfindung lediglich beispielhaft beschrieben wurde, und dass Modifikationen vorgenommen werden können, die sich im Rahmen des Bereichs und der Idee der vorliegenden Erfindung bewegen.
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Claims

Verfahren zur Herstellung einer Squalen enthaltenden Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man (i) eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße bildet; (ii) die erste Emulsion mikrofluidisiert, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße; und (iii) die zweite Emulsion unter Verwendung einer hydrophilen Membran filtriert.
Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man: (i) eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße von 5000 nm oder weniger bildet; (ii) die erste Emulsion mikrofluidisiert, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße; und (iii) die zweite Emulsion unter Verwendung einer hydrophilen Membran filtriert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die hydrophile Membran eine hydrophile Polyethersulfon-Membran ist.
Verfahren zur Herstellung einer Öl-in-Wasser-Emulsion, bei dem man: (i) eine erste Emulsion mit einer ersten durchschnittlichen Öltröpfchengröße bildet; (ii) die erste Emulsion mikrofluidisiert, um eine zweite Emulsion mit einer zweiten durchschnittlichen Öltröpfchengröße zu bilden, wobei diese kleiner ist als die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße; und (iii) die zweite Emulsion unter Verwendung einer hydrophilen Polyethersulfon-Membran filtriert.
Verfahren nach Anspruch 1, 3 oder 4, bei dem die erste durchschnittliche Öltröpfchengröße 5000 nm oder weniger beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm in der ersten Emulsion 5 × 10¹¹/ml oder weniger beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die zweite durchschnittliche Öltröpfchengröße 500 nm oder weniger beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Anzahl von Öltröpfchen mit einer Größe von > 1,2 μm in der zweiten Emulsion 5 × 10¹⁰/ml oder weniger beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die durchschnittliche Öltröpfchengröße nach der Filtration weniger als 220 nm beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Anzahl der Öltröpfchen mit einer Größe > 1,2 μm nach der Filtration 5 × 10⁸/ml oder weniger beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die zweite Emulsion vor der Filtration durch eine Membran vorfiltriert wird.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Vorfiltrations- und Filtrationsschritte unter Verwendung eines doppellagigen Filters durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die Vorfiltrationsmembran asymmetrisch und/oder porös ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Filtrationsmembran asymmetrisch und/oder porös ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Filtrationsmembran und wahlweise die Vorfiltrationsmembran ein polymeres Trägermaterial umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Impfstoff-Zusammensetzung, bei dem man eine Emulsion nach einem beliebigen der Ansprüche 1–15 herstellt und die Emulsion mit einem Antigen kombiniert.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoff-Kits, bei dem man eine Emulsion nach einem der Ansprüche 1–15 herstellt und die Emulsion als Kit-Bestandteil zusammen mit einem Antigen-Bestandteil in einen Kit verpackt.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Kit-Bestandteile in getrennten Fläschchen vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem die Fläschchen aus Borsilikat-Glas hergestellt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17–19, bei dem das Adjuvans ein Bulk-Adjuvans ist und das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man Einheits-Dosen vom Bulk-Adjuvans für die Verpackung als Kit-Bestandteile extrahiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16–21, bei dem das Antigen ein Influenza-Virus-Antigen ist.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem die Kombination aus der Emulsion und dem Antigen eine Impfstoff-Zusammensetzung bildet, und wobei die Impfstoff-Zusammensetzung etwa 15 μg, etwa 10 μg, etwa 7,5 μg, etwa 5 μg, etwa 3,8 μg, etwa 3,75 μg, etwa 1,9 μg oder etwa 1,5 μg Hämagglutinin pro Influenza-Virus-Stamm umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, bei dem die Kombination aus der Emulsion und dem Antigen eine Impfstoff-Zusammensetzung bildet, und wobei die Impfstoff-Zusammensetzung ein Thiomersal- oder ein 2-Phenoxyethanol-Konservierungsmittel umfasst.