JPH10231290A - 核酸結合化合物の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】特異的保護／脱保護戦略を用いる核酸結合化合
物の調製方法、かかる合成のために用いる化合物及び選
択的二重標識核酸結合化合物の調製方法を提供するこ
と。 【解決手段】水素結合を介して核酸のヌクレオ塩基への
結合が可能な、バックボーンに結合した複数のリガンド
を含有してなり、該リガンドの少なくとも１つは、中程
度の強塩基により除去可能な第１保護基Ｐ１により保護
された１級又は２級アミノ基を含み、該バックボーン
は、式（Ｏ）： 【化１】 （Ｘ¹ は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基及び中
程度の強酸により除去可能なアミノ保護基Ｐ２から選択
され、Ｘ² は、中程度の強酸により除去可能なアミノ保
護基Ｐ３である）で表される保護されたアミノ基をさら
に含有してなる保護された核酸結合化合物を調製する工
程；該中程度の強酸により除去可能な保護基を除去する
工程；並びに該中程度の強塩基により除去可能な保護基
を除去する工程を含む核酸結合化合物の調製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特異的保護／脱保
護戦略を用いる核酸結合化合物の調製方法、かかる合成
のために用いる化合物および選択的二重標識核酸結合化
合物の調製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】最近、かなり安定な方法でヌクレオ塩基
対形成を介して核酸を結合している化合物が開発された
（国際公開第９２／２０７０２号パンフレット）。かか
る化合物は、固相に結合した出発官能基へのモノマーの
続いて起こる付加に基づく方法で調製される。ペプチド
核酸（ＰＮＡ）の合成において、Ｂｏｃ基により保護さ
れたアミノ基を含むモノマーが使用される。該モノマー
は、遊離のカルボン酸基を含み、出発官能基であるか、
合成の早期に付着したモノマーを脱保護することにより
遊離となるかのいずれかの固相上のアミノ基と反応す
る。カップリング後、モノマーのＢｏｃ保護基を、例え
ば、トリフルオロ酢酸等の中程度の強酸により成長鎖か
ら除去する。

【０００３】国際公開第９３／１２１２９号パンフレッ
トにおいて、前記合成中にシトシン、アデニンおよびグ
アニンを保護するためにＺ基を使用することが提唱され
ている。該基は、例えば、トリフルオロメタンスルホン
酸等の非常に強力な酸により環外アミンにおけるアミノ
基から除去される。

【０００４】国際公開第９５／１７４０３号パンフレッ
トにおいて、選択的カルバメート保護グアニンモノマー
によるＰＮＡの調製が記載されている。バックボーン上
のアミノ基は、Ｂｏｃ基により保護される。

【０００５】欧州特許出願公開第０ ６７２ ６７７号
明細書において、バックボーンのアミノ基上の保護基が
中程度の強塩基により（Ｆｍｏｃ）または弱酸により
（Ｔｒ）切断され、塩基の環外アミノ基における保護基
が弱酸により（Ｔｒ）または中程度の強塩基により（Ａ
ｃｙｌ）除去される、核酸類似体の合成方法が記載され
ている。

【０００６】現在までに提唱されたこれらの方法は、い
くつかの欠点を有している。それらは、ＰＮＡ合成にと
って最適でないモノマーを生ずる複雑で高価なモノマー
合成に基づいているか、ＰＮＡ合成に適するが高含有量
の残留物で汚染している低い回収量の粗材料を生ずる合
成方法に基づくかのいずれかである。塩基のアミノ基に
対する通常用いられるカルバメート保護基（Ｚ）は、厳
しい条件である強酸で切断可能である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、前
記従来技術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的
は、特異的保護／脱保護戦略を用いる核酸結合化合物の
調製方法を提供することにある。また、本発明の目的
は、かかる合成のために用いる化合物を提供することに
ある。また、本発明の目的は、選択的二重標識核酸結合
化合物の調製方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の要旨
は、 〔１〕 下記工程： ａ）水素結合を介して核酸のヌクレオ塩基への結合が可
能な、バックボーンに結合した複数のリガンドを含有し
てなり、該リガンドの少なくとも１つは、中程度の強塩
基により除去可能な第１保護基Ｐ１により保護された１
級または２級アミノ基を含み、該バックボーンは、式
（Ｏ）：

【０００９】

【化７】

【００１０】（式中、Ｘ¹ は、水素原子、炭素数１〜３
のアルキル基および中程度の強酸により除去可能なアミ
ノ保護基Ｐ２から選択され、Ｘ² は、中程度の強酸によ
り除去可能なアミノ保護基Ｐ３である）で表される保護
されたアミノ基をさらに含有してなる、保護された核酸
結合化合物を調製する工程； ｂ）該中程度の強酸により除去可能な保護基を除去する
工程；ならびに ｃ）該中程度の強塩基により除去可能な保護基を除去す
る工程を含む核酸結合化合物の調製方法、 〔２〕 該中程度の強酸により除去可能な保護基がウレ
タン型のアミノ保護基である、前記〔１〕記載の調製方
法、 〔３〕 該ウレタン型の保護基がＢｏｃ基である前記
〔２〕記載の調製方法、 〔４〕 該第１保護基が式（IV）：

【００１１】

【化８】

【００１２】（式中、Ｘは、ＯおよびＳから選択され、
Ｒは、非置換または炭素数１〜４のアルコキシ基もしく
は置換芳香族基により置換されていてもよい直鎖状また
は分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキル基、および非置換
または炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアル
コキシ基、ハロゲンもしくはニトロ基で置換されていて
もよい６〜１０個の芳香族炭素原子を含む芳香族基から
選択される）で表される基である、前記〔１〕〜〔３〕
いずれか記載の調製方法、 〔５〕 保護型の該核酸結合化合物が、他のアミノ保護
基のいずれもまたは両方（即ち、Ｐ１およびＰ３、Ｘ１
がＰ２である場合、さらにＰ２）とも除去されない条件
下で除去可能な第２保護基により保護された１級アミノ
基または２級アミノ基を含有するリガンドをさらに含
む、前記〔１〕記載の調製方法、 〔６〕 該第１および第２保護基が同じ型の塩基に、但
し、異なる位置で結合する、前記〔５〕記載の調製方
法、 〔７〕 該化合物が固相に結合している前記〔１〕記載
の調製方法、 〔８〕 一般式（IIIa）、（IIIb）または（IIIc）：

【００１３】

【化９】

【００１４】〔式中、ＡおよびＢは、それぞれ、下記： （ａ）Ａは、式（Ｉ／Ａ）、（Ｉ／Ｂ）もしくは（Ｉ／
Ｃ）の基で、Ｂは、ＮもしくはＲ³ Ｎ⁺ である；または （ｂ）Ａは、式（Ｉ／Ｄ）の基で、Ｂは、ＣＨである；
のように選択され、

【００１５】

【化１０】

【００１６】（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³ 、Ｃ
Ｈ₂ またはＣ（ＣＨ₃ ）₂ であり；Ｙは、単結合、Ｏ、
ＳまたはＮＲ⁴ であり；ｐおよびｑは、それぞれ、０ま
たは１〜５の整数であり；ｒおよびｓは、それぞれ、０
または１〜５の整数であり；Ｒ¹ およびＲ² は、それぞ
れ独立して、水素、ヒドロキシ−もしくは炭素数１〜４
のアルコキシ−もしくは炭素数１〜４のアルキルチオ−
置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基、ヒド
ロキシル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜
４のアルキルチオ基、アミノ基およびハロゲンからなる
群より選択され；ならびにＲ³ およびＲ⁴ は、それぞれ
独立して、水素、炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキ
シ−もしくはアルコキシ−もしくはアルキルチオ−置換
された炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシル基、炭
素数１〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルチ
オ基およびアミノ基からなる群より選択される） Ｃは、（ＣＲ⁶ Ｒ⁷ ）_y であり、ここで、Ｒ⁶ は水素、
Ｒ⁷ は天然のαアミノ酸の側鎖からなる群より選択され
るか、Ｒ⁶ とＲ⁷ は、独立に、水素、炭素数１〜６のア
ルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール
基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭
素数１〜６のアルキルチオ基、ＮＲ³ Ｒ⁴およびＳＲ⁵
からなる群より選択され、ここで、Ｒ³ とＲ⁴ は前記の
ように定義され、Ｒ⁵ は、水素、炭素数１〜６のアルキ
ル基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、
または炭素数１〜６のアルキルチオ置換された炭素数１
〜６のアルキル基であるか、Ｒ⁶ とＲ⁷ は、一緒になっ
て脂環系もしくは複素環系を形成し；またはＣは、Ｃ
Ｏ、ＣＳ、ＣＮＲ³ である；Ｄは、、（ＣＲ⁶ Ｒ⁷ ）_z
であり、ここで、Ｒ⁶ とＲ⁷ は、前記定義するとおりで
あり；ｙおよびｚは、それぞれ、０または１〜１０の整
数であり、ｙ＋ｚの合計は少なくとも２であり、Ｅは、
ＣＯＯＨ、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ₂ ＯＨまたはそれ
らの活性化誘導体であり、Ｆは、式（Ｏ）：

【００１７】

【化１１】

【００１８】（式中、Ｘ¹ は、水素原子、炭素数１〜３
のアルキル基および中程度の強酸により除去可能なアミ
ノ保護基Ｐ２から選択され、Ｘ² は、中程度の強酸によ
り除去可能なアミノ保護基Ｐ３である）で表される基で
あり、ならびにＬは、式（Ｖ）：

【００１９】

【化１２】

【００２０】（式中、Ｘ’およびＸ”は、独立してＯ−
Ｒ’およびＮＨ−Ｒ”であり、ここで、Ｒ’およびＲ”
は、保護基であり、Ｚは、ＣＨまたはＮであり、および
Ｒは、水素、炭素数１〜４のアルキル基、アリール基、
アルキル−アリール基、ハロゲン、ヒドロキシル基、ア
ルコキシ基または標識である）で表される基である〕で
表される化合物、

〔９〕 下記工程： − 水素結合を介して核酸のヌクレオ塩基への結合が可
能な、バックボーンに結合した複数のリガンドを含有し
てなり、該リガンドの少なくとも１つは、中程度の強塩
基により除去可能な第１保護基Ｐ１により保護された１
級または２級アミノ基を含み、少なくとも１つのさらな
るリガンドは、他のアミノ保護基が除去されない条件下
で除去可能な第２保護基により保護された１級または２
級アミノ基を含む、保護された核酸結合化合物を提供す
る工程； − 第１未保護アミノ基を産する該第２保護基を除去す
る工程； − 第１標識を第１未保護アミノ基に結合する工程； − 第２未保護アミノ基を産する該第１保護基を除去す
る工程；ならびに − 第２標識を第２未保護アミノ基に結合する工程を含
む、リガンドの２つの選択された部分で標識されている
核酸結合化合物の調製方法、に関する。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明の主題は、下記工程： ａ）水素結合を介して核酸のヌクレオ塩基への結合が可
能な、バックボーンに結合した複数のリガンドを含有し
てなり、該リガンドの少なくとも１つは、中程度の強塩
基により除去可能な第１保護基Ｐ１により保護された１
級または２級アミノ基を含み、該バックボーンは、式
（Ｏ）：

【００２２】

【化１３】

【００２３】（式中、Ｘ¹ は、水素原子、炭素数１〜３
のアルキル基および中程度の強酸により除去可能である
ことが好ましいアミノ保護基Ｐ２からなる群より選択さ
れ、Ｘ ² は、中程度の強酸により除去可能なアミノ保護
基Ｐ３である）で表される保護されたアミノ基をさらに
含有してなる、保護された核酸結合化合物を調製する工
程； ｂ）該中程度の強酸により除去可能な保護基Ｐ３および
存在するならばＰ２を除去する工程；ならびに ｃ）該中程度の強塩基により除去可能な保護基Ｐ１を除
去する工程を含む核酸結合化合物の調製方法である。

【００２４】本発明の目的は、直交の保護基戦略が適用
される合成戦略を提供することにある。

【００２５】Ｐ２およびＰ３の一方のみが保護基である
ことが好ましい。

【００２６】本発明のさらなる目的は、モノマーおよび
オリゴマー合成を改良することにある。従って、モノマ
ー合成は、前向きに真っ直ぐであり、ＰＮＡ合成におけ
るこれらのオリゴマー化は、高純度で高収量の粗材料を
提供する。

【００２７】本発明のさらなる主題は、シトシン
（Ｃ）、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）または／およ
びジアミノプリン（Ｄ）からなるモノマーを含むオリゴ
マーの容易な合成を提供することにある。

【００２８】本発明のさらなる目的は、例えば、ＰＮＡ
／ＤＮＡキメラおよびジスルフィドを含有する分子のよ
うなコンジュゲート等、強酸に感受性である分子を調製
するための新規な分子の道具を提供することにある。ま
た、直交保護戦略は、選択的に除去可能で、選択的に二
重標識オリゴマーを調製するために使用可能ないくつか
の異なる保護基で操作する可能性を提供する。

【００２９】定義 本発明の保護基とは、付着している官能基を予定外の化
学反応に関与することから防ぐ化学基をいう。該保護基
は、核酸結合化合物の核酸結合特性を破壊することな
く、核酸結合化合物からのバックボーンユニットの予定
外の除去なしに、かかる官能基から除去することができ
る。本発明において、焦点は、モノマーからオリゴマー
の合成中にモノマーのアミノ基を保護する保護基に置か
れる。かかる保護基の例は、Ｐ１、Ｐ２およびＰ３であ
る。

【００３０】本発明の核酸結合化合物は、塩基対形成を
介して核酸に結合可能な分子である。かかる塩基対形成
は、通常、ＡとＴとの塩基対形成およびＣとＧとの塩基
対形成等の相補的ヌクレオ塩基間の水素結合により起こ
る。核酸結合化合物は、原理的には２つの方法で核酸に
結合できる。第１の場合、核酸結合化合物の一方の鎖が
核酸の一方の鎖の選択された領域に結合し、そうするこ
とにより、二重らせん鎖、即ち、二本鎖を形成し、また
は、核酸結合化合物の２つの分子が核酸の選択された領
域と複合体を形成し、そうすることにより、三重らせん
鎖、即ち、三本鎖を形成する。かかる核酸結合化合物
は、当該技術分野において、例えば、国際公開第９２／
２０７０２号パンフレットから公知のものであってもよ
い。同一に繰り返されたバックボーン部分を有するＰＮ
Ａのみならず、バックボーンが異なるモノマーバックボ
ーンサブユニットにより作られる核酸結合化合物も本発
明により包含される。かかる化合物は、例えば、国際公
開第９５／１４７０６号パンフレットに記載されてお
り、その内容は、核酸結合化合物の構造を定義するため
に本明細書に取り込まれる。さらに、ペプチド結合モノ
マーとオリゴヌクレオチドサブユニットの混合構造が開
示されている欧州特許出願公開第０ ６７２ ６７７号
明細書に開示された化合物も包含される。さらに、国際
公開第９６／２０２１２号パンフレット及び欧州特許出
願公開第０ ７００ ９２８号明細書に開示された化合
物も包含される。

【００３１】リガンドは、水素、フェニル基、融合芳香
族基、複素環基、天然のヌクレオ塩基および非天然のヌ
クレオ塩基ならびにレポーター基からなる群より優先的
に選択される。天然のヌクレオ塩基の例は、例えば、チ
ミン、シトシン、アデニンおよびグアニン等の主要なヌ
クレオ塩基またはイノシン、５−メチルシトシンもしく
はチオウラシル等のまれな塩基である。非天然のヌクレ
オ塩基の例は、７−デアザ−グアニンである。融合芳香
族基の例は、ナフトールである。複素環基は、ピリジン
である。レポーター基は、フルオレッセイン等の蛍光化
合物のような検出可能な基、またはハプテンに対する抗
体により認識可能なハプテンのような別の分子存在によ
り認識可能な基である。核酸結合化合物の核酸に対する
結合を達成させるために、核酸結合化合物は、通常、核
酸のヌクレオ塩基への塩基対形成のためのリガンドとし
て十分な数の、例えば、少なくとも６個のヌクレオ塩基
を含む。例えば、付着したヌクレオ塩基を有するバック
ボーンの末端に、該バックボーンは、ヌクレオ塩基以外
のリガンドを含んでもよい。

【００３２】核酸結合化合物のバックボーンは、リガン
ドが異なる部位で結合してもよい直線様式で配置された
サブユニットを含む基が好ましい。本発明の核酸結合化
合物のバックボーンは、末端の一方で少なくとも１つの
１級アミノ基または２級アミノ基を含む。しかしなが
ら、該バックボーンは、追加のアミノ基、具体的には、
該サブユニットの別のサブユニットへの付着に使用され
る１つのモノマーサブユニットのアミノ基を含むことが
好ましく、この別のサブユニットのカルボン酸基を介す
ることが好ましい。該バックボーンのサブユニットは、
リガンドを考慮することなく同一であることが好まし
い。しかしながら、アミノ基とカルボキシル基を含むサ
ブユニットは、付着のための他の官能基を含むサブユニ
ットと混合してもよい。

【００３３】標識は、通常、核酸結合化合物の存在を決
定するために検出可能であるか検出可能に作製され得る
基であるとして、当業者に公知である。従って、標識
は、光度計または核酸結合化合物の残部由来の免疫反応
性および核酸のような決定対象のいかなる化合物による
ような他の手段により、識別可能であるべきである。よ
く知られた標識は、フルオレッセイン等の蛍光標識、ル
テニウム錯体等の電気化学発光、ビオチンまたはジゴキ
シゲニンである。

【００３４】本発明における粗材料とは、さらなる作製
もなく、合成された固相から直接溶出された核酸結合化
合物である。かかる粗材料の収量は、使用したモノマー
の量から計算された理論収量から計算され、溶出液中に
含まれる核酸結合化合物の量と比較する。

【００３５】カルボン酸（ＣＯＯＨ）基とアミノ（ＮＨ
₂ ）基との反応は、当業者によく知られているので、ポ
リマーバックボーンが隣接モノマーサブユニット（モノ
マー）のカルボン酸基とアミノ基との間のアミド結合を
含む核酸結合化合物は、最近重要になっている。一般的
な反応は、例えば、ある蛋白質の特異的エピトープ部分
であってもよいペプチドを生成させるためのアミノ酸の
重合化の合成からよく知られている。しかしながら、ペ
プチド合成は、通常、核酸に対するいかなる塩基対形成
も斟酌しない。核酸への塩基対形成は、核酸上のヌクレ
オ塩基に結合可能な複数のリガンドがペプチドバックボ
ーンまたは偽ペプチドバックボーンに付着したことによ
り達成可能である。かかる鎖間の結合は、反応性アミノ
基（プロトン供与体）と酸素または窒素（プロトン受容
体）のいずれかを要する水素結合を介して提供されるこ
とが多い。

【００３６】本発明により製造され得る核酸結合化合物
は、国際公開第９２／２０７０２号パンフレットに例示
されている。好ましいペプチド核酸は、アザ窒素原子を
介して偽ペプチドバックボーンに連結するリガンドを含
むということを特徴とする。かかるアザ窒素原子の他
に、少なくともいくつかのモノマービルディングブロッ
クがアミド結合（−ＣＯＮＨ−）を用いて互いに連結し
ていることが最も好ましい。好ましいペプチド核酸を、
式（Ｉ）で示す：

【００３７】

【化１４】

【００３８】〔式中、ｎは、少なくとも３以上の整数で
あり、ｘは、２〜ｎ−１の整数であり、Ｌ¹ 〜Ｌⁿ は、
それぞれ独立して、水素、ヒドロキシル基、炭素数１〜
４のアルカノイル基、天然のヌクレオ塩基、非天然のヌ
クレオ塩基、芳香族基、ＤＮＡインターカーレーター、
ヌクレオ塩基結合基、複素環基、レポーターリガンドお
よびキレート基からなる群より選択されたリガンドであ
り、少なくとも１つのＬ¹〜Ｌⁿ は１級または２級アミ
ノ基を含有し；Ｃ¹ 〜Ｃⁿ は、それぞれ、（ＣＲ
⁶ Ｒ⁷ ）_y （ＣＲ⁶ Ｒ⁷ 、ＣＨＲ⁶ ＣＨＲ⁷ またはＣＲ
⁶ Ｒ⁷ ＣＨ₂ が好ましい）であり、ここで、Ｒ⁶ は水
素、Ｒ⁷ は天然のαアミノ酸の側鎖からなる群より選択
されるか、Ｒ⁶ とＲ⁷ は、独立に、水素、炭素数１〜６
のアルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリ
ール基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ
基、炭素数１〜６のアルキルチオ基、ＮＲ³ Ｒ⁴ および
ＳＲ⁵ からなる群より選択され、ここで、Ｒ³ とＲ⁴ は
以下のように定義され、Ｒ⁵ は、水素、炭素数１〜６の
アルキル基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキ
シ基、または炭素数１〜６のアルキルチオ置換された炭
素数１〜６のアルキル基であるか、Ｒ⁶ とＲ⁷ は、一緒
になって脂環系もしくは複素環系を形成し；またはＣ¹
〜Ｃⁿ は、ＣＯ、ＣＳ、ＣＮＲ³ である；Ｄ¹ 〜Ｄ
ⁿ は、それぞれ、（ＣＲ⁶ Ｒ⁷ ）_z （ＣＲ⁶ Ｒ⁷ 、ＣＨ
Ｒ⁶ ＣＨＲ⁷ またはＣＨ₂ ＣＲ⁶ Ｒ⁷ が好ましい）であ
り、ここで、Ｒ⁶ とＲ⁷ は、前記定義するとおりであ
り；ｙおよびｚは、それぞれ、０または１〜１０の整数
であり、ｙ＋ｚの合計は少なくとも２であり、好ましく
は、２を越えるが１０以下であり、Ｇ¹ 〜Ｇ^n-1 は、そ
れぞれ、−ＮＲ³ ＣＯ−、−ＮＲ³ ＣＳ−、−ＮＲ³ Ｓ
Ｏ−または−ＮＲ³ ＳＯ₂ −のいずれの向きでもよく、
ここで、Ｒ³ は、以下に定義するとおりであり；Ａ¹ 〜
Ａⁿ とＢ¹ 〜Ｂⁿ は、それぞれ、下記： （ａ）Ａ¹ 〜Ａⁿ は、式（Ｉ／Ａ）、（Ｉ／Ｂ）もしく
は（Ｉ／Ｃ）の基で、Ｂ ¹ 〜Ｂⁿ は、ＮもしくはＲ³ Ｎ
⁺ である；または （ｂ）Ａ¹ 〜Ａⁿ は、式（Ｉ／Ｄ）の基で、Ｂ¹ 〜Ｂⁿ
は、ＣＨである；ように選択される。

【００３９】

【化１５】

【００４０】（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³ 、Ｃ
Ｈ₂ またはＣ（ＣＨ₃ ）₂ であり；Ｙは、単結合、Ｏ、
ＳまたはＮＲ⁴ であり；ｐおよびｑは、それぞれ、０ま
たは１〜５の整数であり（ｐ＋ｑの合計は、５以下であ
ることが好ましい）；ｒおよびｓは、それぞれ、０また
は１〜５の整数であり（ｒ＋ｓの合計は、５以下である
ことが好ましい）；Ｒ¹ およびＲ² は、それぞれ独立し
て、水素、ヒドロキシ−もしくは炭素数１〜４のアルコ
キシ−もしくは炭素数１〜４のアルキルチオ−置換され
ていてもよい炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシル
基、炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のアル
キルチオ基、アミノ基およびハロゲンからなる群より選
択され；ならびにＲ³ およびＲ⁴ は、それぞれ独立し
て、水素、炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシ−も
しくはアルコキシ−もしくはアルキルチオ−置換された
炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシル基、炭素数１
〜６のアルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルチオ基お
よびアミノ基からなる群より選択され；ＱおよびＩは、
独立して、ＮＨ₂ 、ＣＯＮＨ₂ 、ＣＯＯＨ、水素、炭素
数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のＯ−アルキル
基、アミノ保護基により保護されたアミノ基、レポータ
ーリガンド、インターカーレーター、キレート剤、ペプ
チド、蛋白質、炭水化物、脂肪、ステロイド、ヌクレオ
シド、ヌクレオチド、ヌクレオチドジホスフェート、ヌ
クレオチドトリホスフェート、オリゴリボヌクレオチド
とオリゴデオキシリボヌクレオチドの両方を含むオリゴ
ヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび可溶性および
非可溶性ポリマーならびに核酸結合基からなる群より選
択され、ｘ１およびｙ１は、それぞれ、０〜１０までの
整数である）

【００４１】最も好ましい核酸結合化合物は、一般式
（II）：

【００４２】

【化１６】

【００４３】（式中、Ｌは、Ｌ¹ 〜Ｌⁿ に対して前記定
義されたリガンドであり、ｋ、ｌおよびｍは、独立に０
または１〜５までの整数であり、ｐは、０または１であ
り、Ｒ⁷ は、水素および天然のαアミノ酸の側鎖からな
る群より選択される）で表されるモノマーサブユニット
の少なくとも１つを含むものである。

【００４４】本発明の保護された核酸結合化合物は、該
リガンドの少なくとも１個の１級または２級アミンが、
中程度の強塩基により除去可能な第１保護基Ｐ１により
保護され、バックボーンが式（Ｏ）：

【００４５】

【化１７】

【００４６】（式中、Ｘ¹ は、水素原子、炭素数１〜３
のアルキル基および中程度の強酸により除去可能である
ことが好ましいアミノ保護基Ｐ２からなる群より選択さ
れ、Ｘ ² は、中程度の強酸により除去可能なアミノ保護
基Ｐ３である）で表される保護されたアミノ基を含む。

【００４７】これらの保護された化合物は、例えば、非
可溶性ポリマー等の固相に付着されることが好ましく、
保護された核酸結合化合物の一方の末端が固相に結合さ
れる、即ち、式（Ｉ）中のＩまたはＱが、例えば、化合
物がＤⁿ とＩまたはＣ¹ とＱの間のカルボニル基を介し
て結合した官能アミノ基を含有するポリスチレン等の非
可溶性ポリマーであるように定義することが最も好まし
い。かかる固相への結合は、よく知られており、ＰＮＡ
に対する従来技術で適用される。これらの化合物は、さ
らなる保護官能基を含んでもよい。

【００４８】さらに、本発明は、該保護された核酸結合
化合物の調製を含む該核酸結合化合物の調製方法を示
す。この化学合成中に、モノマーバックボーンビルディ
ングブロック上のアミノ基の保護が必要である。該モノ
マービルディングブロックの付着中に、保護基は付着し
たままであるが、モノマービルディングブロックの付着
後に保護基が除去され、続くモノマービルディングブロ
ックの付着等により、バックボーンはさらに伸長され
る。この合成の間に、国際公開第９２／２０７０２号明
細書に開示されたモノマービルディングブロックを、い
かなる遊離の１級または２級アミノ基も含まない付着リ
ガンドを有するいかなるモノマー化合物にも使用でき
る。最高の効率を達成させるために、例えば、式（Ｉ）
内のバックボーンでの保護基が、中程度の強塩基により
除去可能な第１保護基により保護された１級または２級
アミノ基を含むリガンドを有するモノマー中のものと同
一となるように選択されることが好ましい。従って、少
なくとも１個のモノマーが、一般式（IIIa）、（IIIb）
および（IIIc）：

【００４９】

【化１８】

【００５０】（式中、Ａは、式（Ｉ）のＡ¹ 〜Ａⁿ の定
義から選択され、Ｂは、式（Ｉ）のＢ¹ 〜Ｂⁿ の定義か
ら選択され、Ｃは、式（Ｉ）のＣ¹ 〜Ｃⁿ の定義から選
択され、Ｄは、式（Ｉ）のＤ¹ 〜Ｄⁿ の定義から選択さ
れ、Ｅは、ＣＯＯＨ、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ₂ ＯＨ
またはそれらの活性化誘導体、例えば、Ｎ−ヒドロキシ
ルスクシンイミドエステルのような活性化エステルであ
り、Ｆは、式（Ｏ）で表される基であり、およびＬは、
中程度の強塩基により除去可能な第１保護基により保護
されることが好ましい１級または２級アミノ基を含むリ
ガンドである）の１つを有する。

【００５１】保護された核酸結合化合物Ｅの化学合成に
おいて、活性化Ｅを固相または該反応基Ｅと反応可能な
調製対象の核酸結合化合物の成長鎖と反応させ、そうす
ることにより、該モノマービルディングブロックを固相
または調製対象の核酸結合化合物の成長鎖に付着させ
る。該反応基と反応させるつもりの基以外のすべての基
が、かかる反応に対して保護されていることが好まし
い。

【００５２】かかる反応後、調製対象の核酸結合化合物
が現に付着しているよりも多くのモノマーユニットを含
んでいるならば、中程度の強酸を用いてバックボーンア
ミノ保護基を除去する。ウレタン型の保護基が好まし
い。かかる保護基は、通常、ペプチド合成ならびに国際
公開第９２／２０７０２号パンフレットに開示された合
成から公知である。有用なアミノ保護基は、以下の必要
条件をおおまかに満たすものである：（１）穏和な酸に
対する安定性（有意にカルボキシル基により攻撃されな
い）；（２）穏和な塩基または求核物に対する安定性
（有意に該当アミノ基により攻撃されない）；（３）ア
シル化に対する耐性（有意に活性化カルボン酸により攻
撃されない）；および（４）保護基は重大な副反応なし
にほとんど定量的に除去されなければならない。かかる
保護基の好ましい種は、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート
（Ｂｏｃ）基である (Carpino, J. Am. Chem. Soc., 19
57, 79, 4427; McKay ら、J. Am. Chem. Soc., 1957, 7
9, 4686; Anderson ら、J. Am.Chem. Soc., 1957, 79,
6180)。他の好適なカルバメートは、１−メチル−１−
フェニルエチルカルバメート、１−メチル−１−（４−
ビフェニルイル）エチルカルバメート、１−メチルシク
ロブチルカルバメート、アリルカルバメート、シンナミ
ルカルバメート、８−キノリルカルバメート、５−ベン
ズイソオキサゾリルメチルカルバメート、Ｎ−ピバロイ
ルオキシメチル、Ｎ，Ｎ’−イソプロピリデンおよびＮ
−ベンジリデンである（Greene & Wuts,「有機合成にお
ける保護基」、John Wiley & sons, 1991)。また、１−
メチルシクロヘキシルカルバメート、１−メチル−１−
シクロプロピルカルバメート（Brady ら、J. Org. Che
m., 1977, 143, 42) 、１，１−ジフェニルメチルカル
バメート、１，１−ジ（４−メチルフェニル）メチルカ
ルバメート、１，１−ジメチルプロペニルカルバメート
（Sieber & Iselin, Helv. Chim. Act., 1968, 614, 5
1) 、１−アダマンチルカルバメート (J. Am. Chem. So
c., 1966, 79, 1988)は最も好ましい化合物である。

【００５３】本発明の中程度の強酸は、通常、２〜−４
のｐＫａ値を有し、２〜−２のｐＫａ値が好ましい。か
かる中程度の強酸は、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）およびトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）である。中間体核
酸結合化合物から保護基を除去するために、オリゴマー
に連結した樹脂（固相）を好ましい酸と合計５〜１０分
間処理するように、これらを処理することが好ましい。
酸処理は、全体で５〜１０分間の２つの連続した処理に
より行なわれることが好ましい。カップリング工程の前
に、樹脂を有機溶媒を用いて徹底的に洗浄する。かかる
条件下では、保護基Ｐ１は、リガンドの１級または２級
アミノ基から除去されないことが好ましい。

【００５４】かかる条件は、例えば、国際公開第９２／
２０７０２号パンフレットに記載されている。

【００５５】式（Ｏ）においては、Ｘ¹ とＸ² の１つの
みを保護基となるように選択すること（立体的理由等の
ため）が好ましい。他の基は、Ｘ² の窒素原子に対する
結合を本質的に阻害しない部分の基から選択される。か
かる他の基は、水素および低級アルキル基（炭素数１〜
６）から選択されることが好ましい。

【００５６】中程度の強塩基により除去可能な保護基Ｐ
１は、該モノマーのカルボン酸基と反応すること等によ
る鎖の伸長に予定されたモノマーとの反応から、リガン
ドＬの１級または２級アミノ基を保護する。かかる１級
または２級アミノ基は、ヌクレオ塩基上の環外アミノ基
であることが好ましい。好ましい保護基Ｐ１は、式（I
V）：

【００５７】

【化１９】

【００５８】（式中、Ｘは、ＯまたはＳであり、Ｒは、
非置換または炭素数１〜４のアルコキシ基もしくは置換
芳香族基により置換されていてもよい直鎖状または分枝
鎖状の炭素数１〜６のアルキル基、および非置換または
炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ
基、ハロゲン（好ましくはＣｌ）もしくはニトロ基で置
換されていてもよい６〜１０個の芳香族炭素原子を含む
芳香族基から選択される）で表される。

【００５９】式（IV）で表される最も好ましい保護基
は、アシル基であり、アセチル、イソブタノイル、ベン
ゾイル、フェノキシアセチル、４−（ｔ−ブチル）−ベ
ンゾイル、４−（ｔ−ブチル）−フェノキシアセチルお
よび４−（メトキシ）−ベンゾイルが特に好ましい。

【００６０】本発明の中程度の強塩基は、通常、８〜１
５のｐＫａ値を有し、８〜１２のｐＫａ値が好ましい。
かかる中程度の強塩基は、例えば、それぞれが水溶液／
有機溶液中のアンモニア、メチルアミン、エチルアミ
ン、ピレリジンおよびジメチルアミンである。

【００６１】リガンド保護基Ｐ１の除去は、数分から数
時間にわたる時間で保護ユニットの塩基処理により行な
われる。必要な脱保護時間は、中程度の強塩基の活量に
より決定される。アンモニアを保護されたリガンドの脱
保護のために使用した場合、条件は、通常、６０℃で一
晩の処理を含む。アルキルアミンは、通常、より低温で
より速く脱保護する。アミンは、水または有機溶媒、好
ましくはアルコールのいずれかに溶解させる。オリゴマ
ーが樹脂から切断されず、特異的リガンド保護基のみが
除去されるならば、溶液（脱保護混合物）を濾過により
除去し、オリゴが連結した樹脂のさらなる操作を行なう
ことができる。オリゴマーが塩基処理の間樹脂から切断
されるならば、オリゴマーを含む脱保護混合物を樹脂か
ら洗い出して、溶媒を蒸発により除去することができ
る。

【００６２】１級アミノ基は、−ＮＨ₂ 基である。２級
アミノ基は、−ＮＨ−基である。好ましい塩基不安定保
護基により保護された１級アミノ基を含む好ましいリガ
ンドは、アデニン（６位に環外アミノ基）、グアニン
（２位に環外アミノ基）、シトシン（４位に環外アミノ
基）およびジアミノプリン（２位および６位の一方また
は両方に環外アミノ基）である。グアニンに対しては、
前記アルキル基の第１セットにより、またはＯ−ベンジ
ル等の他の適当な酸素保護基により６位のヒドロキシル
基を保護することも可能である。

【００６３】式（IIIa）〜（IIIc）のモノマーは、収束
合成戦略により調製されることが好ましく、従って、保
護されたバックボーンユニットおよび保護されたリガン
ド（塩基等）をまず別々の経路で調製し、次いで、一緒
に連結する。バックボーンを、Ｂｏｃ保護アミノ−アセ
トアルデヒドをアルキルグリシネート等の保護α−アミ
ノ酸と反応させることにより調製する。塩基を、まずα
−ハロ酢酸誘導体でアルキル化し、次いで、反応性位置
で保護することが好ましい。次いで、保護かつアルキル
化されたリガンド（塩基）を、アミド結合を介して、バ
ックボーンユニットの中心の２級アミンにカップリング
する。

【００６４】予定したまたは必要とされる数のモノマー
サブユニットを固相へ付着したときに、最終保護核酸結
合化合物が準備される。それは、アミノ基、特にリガン
ドにおける保護型のアミノ基を含む。ほとんどの場合、
かかる保護化合物は、所望の核酸結合特性を有さないで
あろう。従って、最終核酸結合化合物を調製するため
に、保護基を除去することが必要である。保護基Ｐ１を
除去するために、化合物を中程度の塩基での処理に供す
る。

【００６５】固相上で核酸結合化合物を合成するなら
ば、合成した固相から化合物を切断することが望まれ
る。この切断のための条件は、第１モノマーの固相への
付着に使用されるリンカーに依存する。かかる結合と切
断も、国際公開第９２／２０７０２号パンフレットに開
示されている。

【００６６】さらに、直交保護戦略により、本発明は、
異なる保護基により１つの核酸結合化合物内で異なるリ
ガンドを保護する方法を提供する。該方法は、１つの配
列内に特異的かつ一定の位置で標識リガンドの調製を可
能にする。保護型の核酸結合化合物は、化学合成中に、
保護された１級または２級アミノ基を有するリガンドを
結合した第１モノマーバックボーンユニット、次いで、
第１モノマーバックボーンユニットと同一または好まし
くは異なってもよいリガンドを産する次のモノマーバッ
クボーンユニットを使用することにより調製される。次
の付着モノマーユニットが、第１保護基が除去される条
件とは異なる条件下で除去可能な保護基により保護され
た１級または２級アミノ基を含むならば、この保護基を
選択的に除去することができる。

【００６７】本発明の方法の第１の態様において、第１
モノマー塩基ユニット上に位置する第１保護基Ｐ１は、
前に開示したような中程度の強塩基により除去可能であ
るが、第２モノマー塩基ユニット上に位置する第２保護
基Ｐ２は、強酸により除去可能である。バックボーン上
のアミノ保護基は、両モノマーに対して中程度の強酸に
より除去可能である。

【００６８】本発明の第２の態様において、第１モノマ
ー塩基ユニットの塩基上に位置する第１保護基Ｐ１は、
前に開示したような中程度の強塩基により除去可能であ
るが、第２モノマーユニットの塩基上に位置する第２保
護基は、他の塩基により除去可能である。後者の例は、
ピペリジンおよび１，８−ジアザビシクロ（５，４，
０）ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）等の立体障害性の中
程度の強塩基により除去可能なＦｍｏｃ基である。バッ
クボーン上のアミノ保護基は、両モノマーに対する中程
度の強酸により除去可能である。この保護基の組み合わ
せは、Ｆｍｏｃ基をバックボーン上の１級アミンを保護
するために使用し、前記定義されたような中程度の強塩
基により除去可能な基と中程度の強酸で除去可能な基と
の組み合わせにより塩基が保護されるように組むことも
可能である。

【００６９】本発明のさらに別の態様において、第１モ
ノマー塩基ユニット上に位置する第１保護基Ｐ１は、前
に開示したような中程度の強塩基により除去可能である
が、第２モノマー塩基ユニット上に位置する第２保護基
は、弱酸により除去可能である。後者の例は、トリフェ
ニルメチル（Ｔｒｔ），モノ−またはジ−メトキシ−ト
リフェニルメチル（Ｍｍｔ，Ｄｍｔ）であってもよい。
次いで、バックボーン上のアミノ保護基は、Ｆｍｏｃで
あってもよい。この態様において、組み合わせは、バッ
クボーン上の１級アミンを保護するための弱酸により除
去可能な保護基を有することにより構成されてもよく、
塩基は、中程度の強塩基により除去可能な保護基とＦｍ
ｏｃ基との組み合わせにより保護されてもよい。

【００７０】弱酸とは、２〜６のｐＫａ値を有すると定
義される。

【００７１】選択的または非選択的に除去可能なさらに
異なる保護基により保護されるさらなるモノマーバック
ボーンユニットが存在してもよい。すべて異なったリガ
ンドで保護されたモノマーバックボーンユニットは、決
定対象の核酸に対する相補性等の特別な目的に要求され
るヌクレオ塩基配列に依存して、保護される核酸結合化
合物内のいかなる位置に位置してもよい。

【００７２】選択的に切断可能な保護基を有する保護型
のかかる核酸結合化合物を用いることは、異なる標識の
核酸結合化合物の調製を容易にする。かかる方法におい
て、該第１および第２保護基の一方のみを選択的に除去
し、バックボーンのアミノ保護基を除去しない条件下
で、保護型の核酸結合化合物をインキュベートする。こ
れらの条件下では、核酸結合化合物の結合している固相
からのいかなる切断も起こらないことが好ましい。弱酸
により除去可能な保護基である第２保護基の好ましい場
合において、保護型の核酸結合化合物を、例えば、モノ
−／またはジ−／またはトリ−クロロ酢酸等の弱酸と接
触させる。次いで、リガンド上のヒドロキシル基または
環外アミノ基等の現未保護官能基を、この基への付着対
象の第１標識の反応種と反応させる。

【００７３】次の工程において、他のリガンドのいかな
る第１保護基も除去する。好ましい場合において、この
ことは、保護型の核酸結合化合物を中程度の強塩基に適
用することによりなされ、そうすることにより、該リガ
ンドで遊離の１級または２級アミノ基を用意するが、前
もって付着させた標識基、即ち、バックボーン上のアミ
ノ保護基Ｘ¹ とＸ² の結合に影響せず、オリゴマーが依
然として固相に結合しているならば、固相への付着も損
なわれていない。

【００７４】次いで、リガンドの現利用可能な１級また
は２級アミノ基を、第２標識の反応種と反応させる。次
いで、現ビス−標識保護核酸結合化合物を、Ｘ¹ および
Ｘ²等のいかなるさらなる保護基も除去することによ
り、全体的に脱保護してもよく、オリゴマーが依然とし
て固体支持体に結合しているならば、オリゴマーは、支
持体から除去される。さらに、具体的にはバックボーン
上で保護基が除去されるアミノ基は、該標識の反応種と
この基を反応させることにより第３のまたはさらなる標
識を付着させるために用いることができる。その後、オ
リゴマーが固体支持体に結合するならば、該化合物を固
相から除去してもよい。この戦略は、ヒドロキシル基ま
たはアミノ基が、バックボーンおよび／またはリガンド
内で利用可能であるとき、官能基と同じ数の標識に適用
してもよい。保護基の除去条件が互いに異なるにつれ
て、標識の結合選択性が高くなることは、当業者にとっ
て明らかである。

【００７５】脱保護された官能基への標識の付着は、リ
ガンドまたはバックボーンでの官能基の縮合を誘導する
化合物、例えば、標識上のカルボン酸により達成されて
もよい。標識を結合する別の様式は、活性化エステル等
の該標識の反応種を使用することである。かかる反応種
は、当業者によく知られている。

【００７６】本発明のさらなる主題は、リガンドの２つ
の選択的部分で標識された核酸結合化合物（オリゴマ
ー）の調製方法である。この方法は、下記工程： １．水素結合を介して核酸のヌクレオ塩基への結合が可
能な複数のリガンドを有するバックボーンを含み、該リ
ガンドの少なくとも１つは、中程度の強塩基により除去
可能な第１保護基Ｐ１により保護された１級または２級
アミノ基を含み、少なくとも１つのさらなるリガンド
は、第１アミノ保護基Ｐ１が除去されない条件下で除去
可能な第２保護基により保護された１級または２級アミ
ノ基を含む保護された核酸結合化合物（オリゴマー）を
提供する工程、 ２．該第２保護基を除去し、そうすることにより第１未
保護１級または２級アミノ基を生ずる工程、 ３．第１標識（例えば、ビオチン）を該第１未保護アミ
ノ基に結合する工程、 ４．該第１保護基Ｐ１を除去し、そうすることにより第
２未保護アミノ基を生ずる工程、 ５．第２標識（例えば、ルテニウム錯体）を該第２未保
護アミノ基に結合する工程を含む。

【００７７】次いで、必要ならば、生成した化合物を完
全に脱保護し、化合物が生成した固相から切断する。

【００７８】本発明のさらなる主題は、一般式（IVa
）、（IVb ）または（IVc ）：

【００７９】

【化２０】

【００８０】〔式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦは、
式（IIIa）、（IIIb）および（IIIc）に対して定義され
たとおりであり、Ｌは、式（Ｖ）：

【００８１】

【化２１】

【００８２】（式中、Ｘ’およびＸ”は、独立して、Ｏ
−Ｒ’およびＮＨ−Ｒ”から選択され、ここで、Ｒ’お
よびＲ”は保護基であり、Ｚは、ＣＨまたはＮであり、
Ｒは、水素、炭素数１〜４のアルキル基、アリール基、
アルキル−アリール基、ハロゲン、ヒドロキシル基、ア
ルコキシ基または前記定義された標識である）で表され
る基である〕で表される化合物である。

【００８３】式（Ｖ）において、保護基Ｒ’およびＲ”
は異なることが好ましい。従って、Ｒ’は中程度の強酸
により除去可能なベンジル等の保護基であることが好ま
しく、Ｒ”は、中程度の強塩基により除去可能な、例え
ば、アセチル、イソブチリルおよびベンゾイルのアシル
基またはアロイル基等の保護基であることが好ましく、
Ｒ”は水素であってもよい。

【００８４】Ｘ’およびＸ”が両方ともＮＨ−Ｒ”であ
る場合は、Ｒ”は、同一または異なってもよい。Ｒ”
は、式（IV）：

【００８５】

【化２２】

【００８６】（式中、ＸはＯおよびＳであり、Ｒは、非
置換または炭素数１〜４のアルコキシ基もしくは置換芳
香族基により置換されていてもよい直鎖状または分枝鎖
状の炭素数１〜６のアルキル基、および非置換または炭
素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ
基、ハロゲン（好ましくはＣｌ）もしくはニトロ基で置
換されていてもよい６〜１０個の芳香族炭素原子を含む
芳香族基から選択される）で表される基であることが好
ましい。

【００８７】イソブチルまたはアセチル基であることが
最も好ましい。

【００８８】一般式（Ｖ）のリガンドの好ましい例は、
ジ／モノ−保護ジアミノプリンおよびジ保護グアノシン
である。

【００８９】新規な戦略の有利な点は、粗生成物の高収
量、モノマーの迅速なカップリング速度および大量生産
の容易性である。さらに、キメラ化合物も調製すること
ができる。Ｓ−Ｓ含有化合物等の非常に感受性のある化
合物でさえも、この戦略を使用して調製することができ
る。さらに、新規な戦略は、塩基としてＡ、ＧまたはＤ
を含む混合配列核酸結合パートナーの調製に有利であ
る。

【００９０】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明する。

【００９１】一般 使用したすべての試薬は、分析等級であり、アルドリッ
チ（Aldrich)製である。ＨＡＴＵは、パーセプティブ
バイオシステムズ(PerSeptive Biosystems、MA) から購
入した。ＭＢＨＡ樹脂は、ノババイオケム(NovaBioche
m、スイス) から購入した。ＥＺ−Ｌｉｎｋ^TMＮＨＳ−
ＳＳ−ビオチンは、ピアース(Pierce 、IL) から購入し
た。ビス−（２，２’−ビピ）−４−（４−（４’−Ｍ
ｅ−２，２’−ビピ））−ブタン酸−ルテニウム(II)−
ビス−ヘキサフルオロホスフェートは、ベーリンガーマ
ンハイム(Boehringer Mannheim) ＧｍｂＨから購入し
た。Ｎ−ＭＭＴ−（ＣＨ２）−アミノモディファイヤー
は、クローンテック パロ アルト(Clontech Palo Alt
o 、CA、米国) から購入した。実施例に使用したオリゴ
マーは、直鎖状で、一本鎖である。

【００９２】実施例において例示された反応に対して、
合成の流れ図と化合物番号を示す図が参照される。

【００９３】略号： ＨＯＢｔ： １−ヒドロキシルベンゾトリアゾール ＤＣＭ： ジクロロメタン ＭＢＨＡ： メチル−ベンズヒドリルアミン ＰＡＭ： フェニルアセトアミドメチル ＨＡＴＵ： Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１
−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウム
ヘキサフルオロホスフェート ＤＩＥＡ： ジイソプロピルアミン Ａｄｏ： ８−アミノ−３，６，−ジオキサ−オク
タン酸

【００９４】実施例１ モノマーの調製 １−（ベンジルオキシカルボニルメチル）−４−アミノ
−２−オキソ−ピリミジン（２） ＤＭＦ（４００ｍＬ）中のシトシン（１）（２０ｇ、１
８０ｍｍｏｌ）溶液に、磁石で攪拌しながら、水素化ナ
トリウム（８．３５ｇの６０％懸濁液）を添加した。混
合物を、さらなるＨ₂ の発生が見られなくなった後、５
０℃で２時間維持した。冷却（３０℃未満）後、ベンジ
ル−２−ブロモアセテート（４５．７５ｇ、３１．６ｍ
Ｌ、２００ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下して加え、溶
液を室温で一晩攪拌した。冷却後、粗生成物を濾過によ
り得て、炭酸水素ナトリウム溶液（６％、４００ｍＬ）
とともに攪拌し、濾過して水とジエチルエーテルで洗浄
した。収量：２０ｇ（４３％）。

【００９５】１−（ベンジルオキシカルボニルメチル）
−Ｎ⁴ −（ベンゾイル）−４−アミノ−２−オキソ−ピ
リミジン（３） ピリジン（１００ｍＬ）中の１−（ベンジルオキシカル
ボニルメチル）−４−アミノ−２−オキソ−ピリミジン
（２）（１０．０ｇ、３８．６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、
１０分間かけてベンゾイルクロリド（５．２ｍＬ）を滴
下して加えた。室温で３時間放置した後、追加のベンゾ
イルクロリド（１ｍＬ）を添加し、混合物を１時間攪拌
した。メタノール（１０ｍＬ）を添加し、減圧下での蒸
発により溶媒を除去した。粗生成物を、トルエンで共蒸
発させた。エタノール（約１Ｌ）からの再結晶化により
純粋な生成物（３）を得た。収量：１２．１ｇ（８６
％）。

【００９６】１−（カルボキシメチル）−Ｎ４−（ベン
ゾイル）−４−アミノ−２−オキソ−ピリミジン（４） １−（ベンジルオキシカルボニルメチル）−Ｎ⁴ −（ベ
ンゾイル）−４−アミノ−２−オキソ−ピリミジン
（３）（９．２ｇ、２５．３ｍｍｏｌ）を、水（４００
ｍＬ）およびＴＨＦ（５０ｍＬ）の混合液中で懸濁した
後、ＬｉＯＨ（１Ｍ溶液、７５ｍＬ、７５ｍｍｏｌ）を
添加した。１時間後、溶液を濾過し、減圧下で濃縮し
た。粗生成物を水に再溶解させ、２Ｎ ＮａＨＳＯ₄ 水
溶液でｐＨを２．８に調整すると生成物（４）が沈澱し
た。収量：５．１ｇ（７８％）。

【００９７】Ｎ−（（Ｎ⁴ −（ベンゾイル）−４−アミ
ノ−２−オキソ−ピリミジン−１−イル）アセチル）−
Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−グリシンメチルエ
ステル（６） Ｂｏｃバックボーン（５）（１．０ｇ、４．３ｍｍｏ
ｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、ＨＯＢｔ（６７０ｍ
ｇ、５ｍｍｏｌ）、１−（カルボキシメチル）−Ｎ⁴ −
（ベンゾイル）−４−アミノ−２−オキソ−ピリミジン
（４）（１．１２ｇ、４．１ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ
（１．０ｇ、４．８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室
温で３時間攪拌した後、ＤＣＭ（２０ｍＬ）を添加し
た。有機相を濾過し、ＮａＨＣＯ₃ 水溶液（２ｘ２０ｍ
Ｌ）およびＮａＨＳＯ₄ 水溶液（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄
した。ＭｇＳＯ₄ で乾燥させた後、減圧下での蒸発によ
り粗生成物（６）を単離した。収量：４．５５ｇ（５７
％）。

【００９８】Ｎ−（（Ｎ⁴ −（ベンゾイル）−４−アミ
ノ−２−オキソ−ピリミジン−１−イル）アセチル）−
Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−グリシン（Ｎ⁴ −
（ベンゾイル−Ｂｏｃ−Ｃ−モノマー（７） Ｎ−（（Ｎ⁴ −（ベンゾイル）−４−アミノ−２−オキ
ソ−ピリミジン−１−イル）アセチル）−Ｎ−（２−Ｂ
ｏｃ−アミノエチル）−グリシンメチルエステル（６）
（２．０ｇ、４．１ｍｍｏｌ）を、ＮａＯＨ（２Ｍ、１
０ｍＬ）に溶解し、室温で１時間攪拌後、混合物を濾過
してＮａＨＳＯ₄ （２Ｍ）水溶液でｐＨを２．５に調整
した。濾過により粗生成物を単離した。該生成物を最少
量の酢酸エチルに溶解し、ｎ−ヘキサンに滴下添加する
ことにより沈澱させた。収量：１．４ｇ（７２％）。

【００９９】９−（エチルオキシカルボニルメチル）−
６−アミノプリン（９） 機械的攪拌子、窒素導入管および滴下ロートを備えた三
つ口丸底フラスコで、ＤＭＦ（７５０ｍＬ）中で、アデ
ニン（８）（５０ｇ、０．３７ｍｏｌ）を懸濁した。水
素化ナトリウム（１６ｇ、０．４０ｍｏｌ、６０％懸濁
液）を、１０℃で１時間かけて、少量ずつ添加した。混
合物を室温で１時間攪拌した後、２−ブロモ酢酸エチル
エステル（１２３ｇ、８２ｍＬ、０．７４ｍｏｌ）を３
時間かけて滴下して加え、次いで、室温で２０時間放置
した。黄色溶液を蒸発させて乾燥させ、水（５００ｍ
Ｌ）で２時間攪拌した。粗生成物を濾過により回収し、
水と冷エタノールで洗浄した。収量：３６ｇ（４４
％）。

【０１００】９−（エチルオキシカルボニルメチル）−
（Ｎ⁶ −ベンゾイル）−６−アミノプリン（１０） ベンゾイルクロリド（７．２７ｇ、６．０ｍＬ、５．１
７ｍｍｏｌ）を、ピリジン（１５０ｍＬ）中の９−（エ
チルオキシカルボニルメチル）−６−アミノプリン
（９）（１０ｇ、４．５ｍｍｏｌ）溶液に０℃で滴下し
て加え、室温で一晩攪拌した。メタノール（１０ｍＬ）
を添加し、混合物を蒸発させて乾燥させた。粗生成物を
熱エタノール（２５０ｍＬ）に再溶解させ、０℃で一晩
沈澱させた。濾過およびエタノールとジエチルエーテル
での洗浄後、生成物を単離した。収量：９．０ｇ（６２
％）。

【０１０１】９−（カルボキシメチル）−（Ｎ⁶ −ベン
ゾイル）−６−アミノプリン（１１） ９−（エチルオキシカルボニルメチル）−（Ｎ⁶ −ベン
ゾイル）−６−アミノプリン（１０）（９．０ｇ）を水
（２００ｍＬ）に溶解した後、ＮａＯＨ（２Ｍ、６０ｍ
Ｌ）を０℃で滴下添加した。３０分後、温度が室温に達
するようにさせ、１時間溶液を放置した。次いで、Ｎａ
ＨＳＯ₄ （２Ｍ）水溶液でｐＨを２．５に調整し、冷却
（０℃）後、生成物を沈澱させ、濾過により回収して冷
水で洗浄した。収量：３．５ｇ（５６％）。

【０１０２】Ｎ−（（Ｎ⁶ −（ベンゾイル）−６−アミ
ノプリン−９−イル）アセチル）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−
アミノエチル）−グリシンメチルエステル（１２） Ｂｏｃバックボーン（５）（１．０ｇ、４．３ｍｍｏ
ｌ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、ＨＯＢｔ（６７０
ｍｇ、５ｍｍｏｌ）、９−（カルボキシメチル）−Ｎ⁶
−（ベンゾイル）−６−アミノプリン（１．２ｇ、４．
１ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ（１．０ｇ、４．８ｍｍｏ
ｌ）を添加した。混合物を、室温で３時間攪拌した後、
ＤＣＭ（２０ｍＬ）を添加し、沈澱物を濾別した。溶液
を、ＮａＨＣＯ₃ 水溶液（２ｘ２０ｍＬ）およびＮａＨ
ＳＯ₄ 水溶液（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。ＭｇＳＯ₄
で乾燥させた後、減圧下での蒸発により粗生成物（１
２）を単離した。収量：１．４ｇ（６７％）。

【０１０３】Ｎ−（（Ｎ⁶ −（ベンゾイル）−６−アミ
ノプリン−９−イル）アセチル）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−
アミノエチル）−グリシン（Ｎ⁶ −ベンゾイル−Ｂｏｃ
−Ａ−モノマー（１３） 粗製Ｎ−（（Ｎ⁶ −（ベンゾイル）−６−アミノプリン
−９−イル）アセチル）−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエ
チル）−グリシンメチルエステル（１２）（９００ｍ
ｇ）を、ＴＨＦ（２．５ｍＬ）と水（５ｍＬ）との混合
液に溶解した後、ＬｉＯＨ（１Ｍ、５ｍＬ）を添加し
た。室温で１時間攪拌した後、ＴＨＦを蒸発により除去
した。ＮａＨＳＯ₄ （２Ｎ）水溶液でｐＨを２．８に調
整することにより、生成物を沈澱させた。粗生成物を最
少量のＤＣＭに再溶解し、ｎ−ヘキサン（２００ｍＬ）
の添加により沈澱させた。

【０１０４】９−（エチルオキシカルボニルメチル）−
２−アミノ−６−クロロプリン（１５） ＤＭＦ（５００ｍＬ）中の２−アミノ−６−クロロプリ
ン（１４）（２５ｇ、１４３ｍｍｏｌ）の懸濁液を、炭
酸カリウム（４１ｇ、０．４０ｍｏｌ）と１時間攪拌し
た。エチル２−ブロモアセテート（３０ｇ、２０ｍＬ、
１８０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２０時間放
置した。生じた混合物をシーライトにより濾過し、減圧
下で濃縮した。粗生成物を無水エタノールから再結晶し
た。収量：２５．６ｇ（７０％）。

【０１０５】９−（カルボキシメチル）−２−アミノ−
６−Ｏ−ベンジルプリン（１６） ９−（エチルオキシカルボニルメチル）−２−アミノ−
６−クロロプリン（１５）（１０ｇ、３９．１ｍｍｏ
ｌ）を、ベンジルアルコール（１００ｍＬ）とナトリウ
ム（２．７ｇ）との混合物に添加した。これにより、濃
い黄色の混合物が得られ、このものを室温で一晩放置し
た。水（２００ｍＬ）の添加後、溶液をジエチルエーテ
ル（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。ＮａＨＳＯ₄ （２
Ｍ）水溶液で水相のｐＨを２に調整し、生成物を濾過に
より単離した。該生成物をエタノール（約１Ｌ）から再
結晶した。収量：１０．９ｇ（９３％）。

【０１０６】９−（カルボキシメチル）−２−イソブチ
リル−６−Ｏ−ベンジル−２−アミノプリン（１７） ９−（カルボキシメチル）−２−アミノ−６−Ｏ−ベン
ジルプリン（１６）（２．５ｇ、８．３６ｍｍｏｌ）
を、ピリジン（２５ｍＬ）に溶解し、０℃で冷却した。
イソブチリルクロリド（１．５ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）を
１０分間かけて滴下して加え、２時間後、混合物の温度
を室温に到達させて一晩放置した。溶媒を減圧下で蒸発
させ、残留物をＮａＨＣＯ₃ （０．５Ｍ）に再懸濁させ
た。溶液を濾過し、２Ｎ ＮａＨＳＯ₄ でｐＨを２．５
に調整した。粗生成物を濾過で回収した。収量：１．６
ｇ（５２％）。

【０１０７】Ｎ−（（Ｎ² −（イソブチリル）−６−Ｏ
−ベンジル−２−アミノプリン−９−イル）アセチル）
−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−グリシンメチル
エステル（１８） Ｂｏｃバックボーン（５）（１．０ｇ、４．３ｍｍｏ
ｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、ＨＯＢｔ（６７０ｍ
ｇ、５ｍｍｏｌ）、９−（カルボキシメチル）−２−イ
ソブチリル）−６−Ｏ−ベンジル−２−アミノプリン
（１７）（１．５ｇ、４．１ｍｍｏｌ）およびＤＣＣ
（１．０ｇ、４．８ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を室
温で３時間攪拌した。反応混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）
で希釈して濾過した。有機相を、ＮａＨＣＯ₃ 水溶液
（２ｘ２０ｍＬ）およびＮａＨＳＯ₄ 水溶液（２ｘ２０
ｍＬ）で洗浄した。ＭｇＳＯ₄ で乾燥させた後、減圧下
での蒸発により粗生成物を単離した。収量：８５０ｍｇ
（３６％）。

【０１０８】Ｎ−（（Ｎ² −（イソブチリル）−６−Ｏ
−ベンジル−２−アミノプリン−９−イル）アセチル）
−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−グリシン（Ｎ²
−（イソブチリル）−６−Ｏ−ベンジル−Ｂｏｃ−Ｇ−
モノマー（１９） 粗製Ｎ−（（Ｎ² −（イソブチリル）−６−Ｏ−ベンジ
ル−２−アミノプリン−９−イル）アセチル）−Ｎ−
（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−グリシンメチルエステ
ル（１８）（４００ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を、ＴＨ
Ｆ（２ｍＬ）と水（２．５ｍＬ）との混合液に溶解し、
ＬｉＯＨ（１Ｍ、２ｍＬ）の添加により加水分解した。
室温で１時間攪拌した後、混合物を濾過してＴＨＦを蒸
発により除去した。水（１０ｍＬ）を添加し、ＮａＨＳ
Ｏ₄ （２Ｎ）水溶液でｐＨを２．５に調整して生成物を
沈澱させた。収量：３５０ｍｇ（８８．４％）。

【０１０９】９−（エトキシカルボニル）−２，６−ジ
アミノプリン（２０） ＤＭＦ（２５ｍＬ）中の２，６−ジアミノプリン（１５
ｇ、１００ｍｍｏｌ）の懸濁液に、Ｋ₂ ＣＯ₃ （４１
ｇ、３００ｍｍｏｌ）を添加した。該懸濁液を室温で１
時間攪拌し、エチル−２−ブロモアセテート（１３．３
ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液をさらに３
時間攪拌した。反応混合物を濾過し、回収物をＤＭＦ
（１００ｍＬ）で洗浄した。固体を無水エタノール（２
００ｍＬ）に懸濁して加熱した後、還流懸濁液を熱濾過
した。濾液を活性炭とともに沸騰させ、シーライト層を
通して濾過した。濾液の体積を３０ｍＬまで減少させ、
冷却して生成物を沈澱させた。収量：１２．５ｇ（５３
％）。

【０１１０】¹Ｈ ＮＭＲ、^6dＤＭＳＯ、４００ＭＨ
ｚ：７．６９ｐｐｍ（１Ｈ，Ｈ−８）；６．７２ｐｐｍ
（２Ｈ，ＮＨ₂ ）；５．８３ｐｐｍ（２Ｈ，ＮＨ₂ ）；
４．８５ｐｐｍ（２Ｈ，ＣＨ₂ ＣＯ）；４．１５ｐｐｍ
（２Ｈ，ＯＣＨ₂ ）；１．２ｐｐｍ（３Ｈ，ＣＨ₂ ＣＨ
₃ ）。

【０１１１】９−（エトキシカルボニル）−（Ｎ² ，Ｎ
⁶ −ジイソブチリル）−２，６−ジアミノプリン（２
１） ピリジン（２０ｍＬ）中の９−（エトキシカルボニル）
−２，６−ジアミノプリン（１．６ｇ、６．８ｍｍｏ
ｌ）の懸濁液を０℃で攪拌し、イソブチリルクロリド
（２．９ｍＬ、２７．４ｍｍｏｌ）を添加した。該混合
物をさらに２時間攪拌した。反応混合物を蒸発させて乾
燥させ、残留物をＤＣＭに再溶解させて、希塩酸で抽出
した。有機相をＭｇＳＯ₄ で乾燥させ、蒸発させて乾燥
させた。残留物を無水エタノールから結晶化した。収
量：２．３５ｇ（９２％）。

【０１１２】分子量、Ｃ₁₇Ｈ₂₄Ｎ₆ Ｏ₄ 計算値／
実測値：３７６／３７７¹ Ｈ ＮＭＲ、^6dＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ：１０．４８
ｐｐｍと１０．９９ｐｐｍ（１Ｈ，ＮＨ）；８．２９ｐ
ｐｍ（１Ｈ，Ｈ−８）；５．０９ｐｐｍ（２Ｈ，ＣＨ₂
ＣＯ）；４．１８ｐｐｍ（２Ｈ，ＯＣＨ₂ ）；３．０６
ｐｐｍと２．９３ｐｐｍ（１Ｈ，ＣＨ）；１．２２ｐｐ
ｍ（３Ｈ，ＣＨ₂ ＣＨ₃ ）；１．１０ｐｐｍ（３Ｈ，Ｃ
Ｈ₃ ）。

【０１１３】９−（カルボキシメチル）−（Ｎ² ，Ｎ⁶
−ジイソブチリル）−２，６−ジアミノプリン 水／ＴＨＦ（５０ｍＬ、２：１）中の９−（エトキシカ
ルボニル）−（Ｎ² ，Ｎ⁶ −ジイソブチリル）−２，６
−ジアミノプリン（２．２ｇ、５．８５ｍｍｏｌ）を、
２時間攪拌し、ＬｉＯＨ（１Ｍ、１６ｍＬ）を添加し
た。固体が直ちに溶解した。溶液を、ＮａＨＳＯ₄ （２
Ｍ）水溶液でｐＨ２．５に調整した後、ＤＣＭ（２ｘ５
０ｍＬ）で抽出した。有機相を合わせて食塩水で抽出
し、ＭｇＳＯ ₄ で乾燥させた。溶媒を蒸発により除去し
た。無水エタノールから再結晶化した。収量：１．９ｇ
（９５．５％）。 分子量、Ｃ₁₅Ｈ₂₀Ｎ₆ Ｏ₄ 計算値／実測値：３４
８／３４９

【０１１４】Ｎ−（（Ｎ² ，Ｎ⁶ −ジイソブチリル−
２，６−ジアミノプリン−９−イル）アセチル）−Ｎ−
（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−グリシン（Ｎ² ，Ｎ⁶
−ジイソブチリル−Ｂｏｃ−Ｄ−モノマー（２２） ９−（カルボキシメチル）−（Ｎ² ，Ｎ⁶ −ジイソブチ
リル）−２，６−ジアミノプリン（１．５ｇ、４．４ｍ
ｍｏｌ）、ＤＣＣ（１ｇ、４．８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ
（０．６６ｇ、４．８ｍｍｏｌ）およびメチルＮ−Ｂｏ
ｃ−アミノエチルグリシネート（１．２３ｇ、５．３ｍ
ｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３０ｍＬ）中で一晩攪拌した。反
応混合物を濾過し、回収物をＤＣＭ（２ｘ３０ｍＬ）で
洗浄した。濾液を、希ＮａＨＣＯ₃ 水溶液（３ｘ２０ｍ
Ｌ）、ＮａＨＳＯ₄ 水溶液（２Ｍ、２ｘ２０ｍＬ）およ
び食塩水（３０ｍＬ）で抽出した。有機相をＭｇＳＯ₄
で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。エタノールからの
再結晶により、Ｎ−（（Ｎ ² ，Ｎ⁶ −ジイソブチリル−
２，６−ジアミノプリン−９−イル）アセチル）−Ｎ−
（Ｂｏｃ−アミノエチル）メチルグリシネートを得た。
収量：２．２ｇ（９０％）。 分子量、Ｃ₂₅Ｈ₃₈Ｎ₈ Ｏ₇ 計算値／実測値：５６
２／５６２

【０１１５】さらに精製することなく、Ｎ−（（Ｎ² ，
Ｎ⁶ −ジイソブチリル−２，６−ジアミノプリン−９−
イル）アセチル）−Ｎ−（Ｂｏｃ−アミノエチル）メチ
ルグリシネート（２．０ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を、水／
ＴＨＦ（４０ｍＬ、１０／１）に懸濁し、ＬｉＯＨ（１
Ｍ、６ｍＬ）を添加して、化合物を徐々に溶液にした。
溶液を、ＮａＨＳＯ₄ （２Ｍ）水溶液でｐＨ２．８に調
整し、ＤＣＭ（２ｘ３０ｍＬ）で抽出した。有機相をＭ
ｇＳＯ₄ で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。生成物を
エタノールから再結晶した。収量：１．８ｇ（９２
％）。

【０１１６】¹Ｈ ＮＭＲ、^6dＤＭＳＯ、４００ＭＨ
ｚ：１０．５１ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；１０．３２
ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；８．１６ｐｐｍと８．１５
ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ，Ｈ−８）；７．０４ｐｐｍと６．７
６ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ，ＢｏｃＨＮ）；５．２１ｐｐｍと
５．１０ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ ＣＯ）；４．３５ｐ
ｐｍと４．００ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ ＣＯ）；３．
１ｐｐｍ（ｍ，４Ｈ，ＣＨ ₂ ）；１．３５ｐｐｍと１．
３３ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ）；１．１ｐｐｍ（ｍ，
１２Ｈ，ｉｓｏｂｕｔ．）。 分子量、Ｃ₂₄Ｈ₃₆Ｎ₈ Ｏ₇ 計算値／実測値：５４
８／５４８

【０１１７】モノ−イソブチリル保護ジアミノプリン
を、室温で１時間、１０％アンモニア水で処理すること
により、化合物（２２）から調製した。

【０１１８】Ｂｏｃ−Ｔｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨの合
成 Ｎα−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノエチ
ル）−Ｎα−（１−チミニルアセチル）−Ｎε−（９−
フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｄ−リジン
（図８） Ｎα−（２−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ
エチル）−Ｎα−（１−チミニルアセチル）−Ｎε−
（２−クロロベンジルオキシカルボニル）−Ｄ−リジン
（１ｇ、１．６ｍｍｏｌ）を、メタノール中４．４％の
ギ酸アンモニウム溶液（２０ｍＬ）に溶解した。Ｐｄ−
ブラック（２００ｍｇ）を溶液に添加し、懸濁液を１時
間攪拌した。懸濁液をシーライトを通して濾過し、蒸発
させて乾燥させた。固体をＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解
し、ＤＩＥＡ（０．４ｍＬ）とＦｍｏｃ−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（８００ｍｇ）を添加し、混合物を２
時間攪拌した。反応混合物を蒸発させ、炭酸水素ナトリ
ウム水溶液（５０ｍＬ、０．５Ｍ）で抽出した。水相を
濾過し、硫酸水素ナトリウム水溶液（２Ｍ）の添加によ
りｐＨを２．８に調整し、それにより標的分子を沈澱さ
せた。沈澱物を酢酸エチル（５ｍＬ）に溶解し、ヘキサ
ン（１００ｍＬ）を溶液に滴下して加え、それにより標
的分子を沈澱させた。生成物を濾過し、ヘキサンで洗浄
した。収量：８８５ｍｇ（１．３ｍｍｏｌ、７５％）。

【０１１９】¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆ ／ＴＭ
Ｓ）：δ＝１．２３（ｍ，７Ｈ，ＣＨ₂ ）、１．３５と
１．３８（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ）、１．７３と１．７５
（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ）、３．００（ｍ，２Ｈ，Ｃ
Ｈ₂ ）、３．２１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ ）、４．２７
（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ ＣＯ）、４．６４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ
ＣＯ）、６．８３と６．８８（ｍ，１Ｈ，ＢｏｃＮ
Ｈ）、７．２４〜７．４３（ｍ，９Ｈ，芳香環）、７．
６６と７．６９（ｄ，１Ｈ，６−Ｈ）、７．８７と７．
９０（ｄ，１Ｈ，ＣＯＮ）、１１．２６と１１．２８
（ｄ，１Ｈ，イミドＮＨ）。 ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ：７１６（Ｍ＋
Ｋ）。

【０１２０】実施例２ オリゴマー（ＰＮＡ）合成 前もって負荷したＭＢＨＡ支持体上での標準合成サイク
ルを用いて、ＰＮＡを組み立てた。前もって負荷するこ
とは、既報〔国際公開第９２／２０７０２号パンフレッ
トおよびクリステンセン（Christensen)ら、(1995) J.
pep. sci., 3,175-183 〕のように、Ｔモノマーで行な
った。モノマーのＨＡＴＵとの前活性化時間は、１〜５
分間延長した。最初のカップリングにおいて、Ｂｏｃ−
Ｇｌｙ−ＰＡＭをＴ樹脂に連結させた。最終工程におい
て、すべてのＰＮＡオリゴマーをアセチル化し、塩基に
よる脱保護と支持体からの除去の間での最終モノマーの
転位を防いだ。ＰＮＡモノマーのオリゴマー化は、ＰＮ
Ａ合成工程の操作用に改変したソフトウエアを用いてＡ
ＢＩ４３３Ａペプチドシンセサイザーで行なった。ＰＮ
Ａモノマーを前もって溶解させ、ピペットで別々、即
ち、カップリング毎に１個のカートリッジに入れた。

【０１２１】反応スケールは、５μｍｏｌで、全反応容
量は、４４０μｌであった。３ｍＬの反応容器を用い
て、測定ループは、１５０μｌの容量を有する。ＴＦＡ
／ｍ−クレゾール（９５／５；２×１８０ｓ）を、Ｂｏ
ｃ保護基を脱保護するために使用した。脱保護とカップ
リングモジュールの間に、２洗浄モジュール、即ち、そ
れぞれ５回の連続洗浄からなる１ ＤＣＭと１ ＮＭＰ
モジュールを挿入する。各カップリングにおいて、１４
０μｌの０．２６Ｍモノマー（３６μｍｏｌ；ＮＭＰ
中）、１５０μｌの０．２１Ｍ ＨＡＴＵ（３２μｍｏ
ｌ；ＮＭＰ中）および１５０μｌの０．５０Ｍ ＤＩＥ
Ａ（７５μｍｏｌ；ピリジン中）を加える。モノマー
を、合成カートリッジ中で１分間前もって活性化した。
樹脂の中和と活性化モノマーの添加を同時に行なった。
カップリング時間は１０分であり、樹脂の初期置換に対
して７倍過剰のＰＮＡモノマーを使用する。カップリン
グの間、モノマー濃度は０．０８Ｍである。キャッピン
グ（無水酢酸／ＮＭＰ／ピリジン（１：２５／２５））
は、１分間行なう。

【０１２２】合成サイクルのまとめ １．Ｂｏｃ基の除去（２ｘ３分） ２．洗浄（ＤＣＭとＤＭＦ） ３．１５分間のカップリング ４．洗浄（ＤＣＭとＤＭＦ） ５．キャッピング（１分） ６．洗浄（ＤＣＭとＤＭＦ）

【０１２３】特に述べない限り、反応収量は、定量カイ
ザー（Ｋａｉｓｅｒ）検定により評価する。オリゴマー
化の間のオリゴマーの生成物の収量と平均カップリング
収量は、ＨＰＬＣ分析および／または２６０ｎｍでのＯ
Ｄ測定により決定する。

【０１２４】マススペクトルは、ヒューレット−パッカ
ード（Hewlett-Packard)製ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペ
クトロメーター（Ｇ２０２５Ａ）で記録する。マトリッ
クスは、１０ｎＭ〜１００μＭのＰＮＡ溶液と１：１の
比で混合したシナピン酸（１００ｍＭ；アセトニトリル
／メタノール／水（６０／３２／８）中）からなる。

【０１２５】ＰＮＡオリゴマーの分析ＲＰ−ＨＰＬＣ
を、ヒューレット−パッカード製ＨＰＬＣシステム（１
０５０）を用いるＤｅｌｔａｐａｋ（Ｃ₁₈、１００Å、
５μｍ、３．９×１５０、１ｍＬ／分（Waters製）)
で、５０℃で行なう。２つの溶離液：Ａ，水中０．１％
ＴＦＡおよびＢ，アセトニトリル中０．１％ＴＦＡを用
いる。３０分間の０〜４０％の溶離液Ｂの直線勾配を用
い、溶離液は、２６０ｎｍでモニターする。保護された
ＰＮＡオリゴマーの樹脂からの切断は、前記のように行
なう。

【０１２６】実施例３ ＰＮＡ部分とオリゴヌクレオチド部分を有するオリゴマ
ーの合成（キメラ分子；キメラ） ＤＮＡ部分は、ＣＰＧ支持体上で、標準ホスホロアミダ
イト合成を用いて合成した。５’−アミノ官能基の導入
は、特異的６−（Ｍｍｔ−アミノ）ヘキシルホスホロア
ミダイトを用いて行なった。支持体を反応容器に移し、
ＤＣＭ中の３％トリクロロ酢酸での処理中に、Ｍｍｔ基
を除去した。前記サイクルを用いてＰＮＡモノマーを加
えた。また、合成は、ＣＰＧ樹脂上でＤＮＡを使用可能
にするために、ボルテックスによる混合を窒素パージに
置き換えた方法を用いて、ＡＢＩ４３３Ａペプチドシン
セサイザーで行なった。

【０１２７】ＨＡＴＵによるルテニウムコンジュゲート
上のカルボキシル基の活性化により、ＰＮＡモノマーの
末端側のＮ末端にルテニウム錯体をカップリングさせ、
ビオチンもＨＡＴＵにより活性化させたが、二重カップ
リングであり、フルオレッセインイソチオシアネート
は、さらなる活性化なしに、触媒量のＤＩＥＡのみで２
４時間カップリングさせた。ビオチンまたはフルオレッ
セインをカップリングしたときは、最終ＰＮＡモノマー
は、無水酢酸でキャップしなかった。

【０１２８】最終のキメラを支持体から除去し、アンモ
ニア水（３２％）を用いて６０℃で２０時間またはメチ
ルアミン（４０％）を用いて室温で４時間脱保護した。

【０１２９】Ａｃ−ＴＧＴ−ＡＣＧ−ＴＣＡ−ＣＡＡ−
ＣＴＡ−Ｇｌｙの合成 ＰＮＡ合成は、本質的に前記のように行なった。

【０１３０】全収量は、粗生成物を５％酢酸に再溶解し
て、２６０ｎｍでのＵＶ吸収を測定し、ＤＮＡに対して
通常使用する４個のヌクレオ塩基に由来する吸収に対す
る標準値を用いることにより見積もった。ＨＰＬＣによ
り測定した粗生成物の純度は、９０．７％であった。Ｏ
Ｄにより測定された粗物質の全回収率は、６８％であっ
た。

【０１３１】キメラ：前記方法を用いて、以下のキメラ
を合成した（ＰＮＡを下線で示す）。 Ａ：フルオレッセイン−ＴＡＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡ−Ｎ
Ｈ−（ＣＨ₂ ）₆ −ＴＴＴＴＴ Ｂ：ビオチン−ＣＣＴＧＡＴＡＧＡＣＧＧ−ＮＨ−（Ｃ
Ｈ₂ ）₆ −ＴＴＴＴＴ Ｃ：ビオチン−ＴＧＴＴＡＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡ−ＮＨ
−（ＣＨ₂ ）₆ −ＴＴＴＴＴ Ｄ：ルテニウム−ＴＧＴＴＡＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡ−Ｎ
Ｈ−（ＣＨ₂ ）₆ −ＴＴＴＴＴ

【０１３２】また、前記キメラＣおよびＤは、すべての
ボルテックスによる混合工程を窒素パージに置き換えた
方法を用いて、ＡＢＩ４３３Ａペプチドシンセサイザー
を使用して合成した。すべてのキメラの純度は、ＨＰＬ
Ｃによりチェックし、構造は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量
分析により確認した。

【０１３３】キメラ分子に関して、ＰＮＡセグメントを
まず製造すること、または最初に製造したＤＮＡセグメ
ントはピリミジン塩基のみを含むが、次に製造したＰＮ
Ａセグメントはあらゆる選択塩基を有することができる
ように配列を選択することが賢明である。

【０１３４】Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＡＭ：ＤＭＦ（５ｍ
Ｌ）に溶解したＢｏｃ−グリシン（１．１２ｇ、６．４
ｍｍｏｌ）溶液に、アセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解
した４−ブロモメチルフェニル酢酸フェナシルエステル
（１．５ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を添加した後、フッ化カ
リウム二水化物（９００ｍｇ、９．５６ｍｍｏｌ）を添
加した。混合物を５０℃で２０時間攪拌した。固体の無
機物を濾過により除去し、酢酸エチル（６０ｍＬ）と水
（６０ｍＬ）を添加した。水層を酢酸エチル（３ｘ５０
ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を水（３ｘ５０ｍＬ）
で洗浄した。過剰のＢｏｃ−グリシンを、緩衝溶液（３
００ｍＬ水中、６．９ｇＫ₂ ＣＯ₃ と８．４ｇＮａＨＣ
Ｏ₃ ）を用いる洗浄（３ｘ１００ｍＬ）により除去し
た。硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒をロータリーエバ
ポレーションにより除去し、黄色の固体として生成物が
得られた。収量＝１．７ｇ（９０％）。

【０１３５】生成物（１．６ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を、
酢酸（４０ｍＬ）と水（８５：１５）に溶解した後、亜
鉛粉末（５ｇ）を添加した。混合物を室温で４時間攪拌
した。濾過後、酢酸エチル（１５０ｍＬ）と水（１５０
ｍＬ）を添加し、水相をＨＣｌ水溶液（０．５Ｍ）の添
加により酸性（ｐＨ約１．５）にした。水相を酢酸エチ
ル（３ｘ１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機相を水
（１０ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。硫酸マグネシウムでの
乾燥およびロータリーエバポレーターを用いる濃縮後に
粗生成物が得られた。粗生成物を最少量の酢酸エチルに
再溶解し、ｎ−ヘキサンへの滴下添加により沈澱させ
た。これにより、ＨＰＬＣにより確認した純粋な生成物
が８５０ｍｇ（７３％）得られた。

【０１３６】Ｂｉｏ−Ｓ−Ｓ−Ｌｙｓ−（Ｔ）₇ −Ａｄ
ｏ−Ｌｙｓ−Ａｄｏ−Ｌｙｓ−Ａｄｏ−（Ｔ）₇ −Ａｄ
ｏ−Ｇｌｙ−ＮＨＣＨ₃ の合成 Ｂｉｏ−Ｓ−Ｓ−Ｌｙｓ−ＴＴＴ ＴＴＴ Ｔ−Ａｄｏ
−Ｌｙｓ−Ａｄｏ−Ｌｙｓ−Ａｄｏ−Ｔ ＴＴＴ ＴＴ
Ｔ−Ａｄｏ−Ｇｌｙ−ＮＨＣＨ₃ （５μｍｏｌ）の合成
は、前記のように、Ｔモノマーで前もって負荷したＨＭ
ＢＡ支持体上で行なった。塩基不安定なリンカーＢｏｃ
−Ｇｌｙ−ＰＡＭを第１残基としてカップリングさせ
た。Ａｄｏ−およびＴ−モノマーは、Ｂｏｃ保護されて
おり、リジンは、α−Ｂｏｃ、γ−Ｆｍｏｃ保護されて
いた。Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル
（ＥＺ−Ｌｉｎｋ、１０ｍｇ、１６．５μｍｏｌ）を反
応させることにより、Ｓ−Ｓ−ビオチン部分を末端Ｂｏ
ｃ脱保護リジンとカップリングさせた。反応は、塩基性
条件を保持するためにＤＩＥＡを添加して、ＮＭＰ中で
１時間行なった。ＰＮＡを樹脂から切断し、４０％メチ
ルアミン水溶液で０．５時間処理することにより、Ｆｍ
ｏｃ−リジンを脱保護した。

【０１３７】この保護と切断の戦略は、樹脂上のＰＮＡ
に対する−Ｓ−Ｓ−部分の直接の連結を提供する。

【０１３８】

【発明の効果】本発明により、特異的保護／脱保護戦略
を用いる核酸結合化合物の調製方法、かかる合成のため
に用いる化合物および選択的二重標識核酸結合化合物の
調製方法が提供される。本発明で用いられる新規な戦略
の有利な点は、粗生成物の高収量、モノマーの迅速なカ
ップリング速度および大量生産の容易性である。さら
に、キメラ化合物も調製することができる。Ｓ−Ｓ含有
化合物等の非常に感受性のある化合物でさえも、この戦
略を使用して調製することができる。さらに、新規な戦
略は、塩基としてＡ、ＧまたはＤを含む混合配列核酸結
合パートナーの調製に有利である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、新規な合成戦略の実施例で使用される
ヌクレオ塩基Ａ、Ｃ、ＧおよびＴに対するＰＮＡモノマ
ーを示す。

【図２】図２は、ＰＮＡモノマーによる固相に結合した
リンカーの伸長反応および固体支持体からのオリゴマー
の切断の概略を示す。

【図３】図３は、ＰＮＡモノマーによる固体支持体に結
合したオリゴヌクレオチドの伸長反応および生じたキメ
ラ分子のかかる支持体からの切断の概略を示す。

【図４】図４は、保護Ｃモノマーの合成経路を示す。

【図５】図５は、保護Ａモノマーの合成経路を示す。

【図６】図６は、保護Ｇモノマーの合成経路を示す。

【図７】図７は、保護Ｄモノマーの合成経路を示す。Ｄ
とはジアミノプリンを意味する。

【図８】図８は、保護Ｔリジンモノマーの調製の流れ図
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 (72)発明者 オルム，ヘンリック デンマーク国 ヴォルロース デーカー− 3500 ヴィルドロスヴェイ ３ (72)発明者 コッホ，トロエルス デンマーク国 コーベンハーベン エス デーカー−2300 フンキアヴェイ 47 (72)発明者 コフォエド，トーマス デンマーク国 オーデンセ エス デーカ ー−6260 エゲリッケヴェイ 11

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記工程： ａ）水素結合を介して核酸のヌクレオ塩基への結合が可
   能な、バックボーンに結合した複数のリガンドを含有し
   てなり、該リガンドの少なくとも１つは、中程度の強塩
   基により除去可能な第１保護基Ｐ１により保護された１
   級または２級アミノ基を含み、該バックボーンは、式
   （Ｏ）： 【化１】 （式中、Ｘ¹ は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基
   および中程度の強酸により除去可能なアミノ保護基Ｐ２
   から選択され、Ｘ² は、中程度の強酸により除去可能な
   アミノ保護基Ｐ３である）で表される保護されたアミノ
   基をさらに含有してなる、保護された核酸結合化合物を
   調製する工程； ｂ）該中程度の強酸により除去可能な保護基を除去する
   工程；ならびに ｃ）該中程度の強塩基により除去可能な保護基を除去す
   る工程を含む核酸結合化合物の調製方法。
2. 【請求項２】 該中程度の強酸により除去可能な保護基
   がウレタン型のアミノ保護基である、請求項１記載の調
   製方法。
3. 【請求項３】 該ウレタン型の保護基がＢｏｃ基である
   請求項２記載の調製方法。
4. 【請求項４】 該第１保護基が式（IV）： 【化２】 （式中、Ｘは、ＯおよびＳから選択され、Ｒは、非置換
   または炭素数１〜４のアルコキシ基もしくは置換芳香族
   基により置換されていてもよい直鎖状または分枝鎖状の
   炭素数１〜６のアルキル基、および非置換または炭素数
   １〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、ハ
   ロゲンもしくはニトロ基で置換されていてもよい６〜１
   ０個の芳香族炭素原子を含む芳香族基から選択される）
   で表される基である、請求項１〜３いずれか記載の調製
   方法。
5. 【請求項５】 保護型の該核酸結合化合物が、他のアミ
   ノ保護基のいずれもまたは両方とも除去されない条件下
   で除去可能な第２保護基により保護された１級アミノ基
   または２級アミノ基を含有するリガンドをさらに含む、
   請求項１記載の調製方法。
6. 【請求項６】 該第１および第２保護基が同じ型の塩基
   に、但し、異なる位置で結合する、請求項５記載の調製
   方法。
7. 【請求項７】 該化合物が固相に結合している請求項１
   記載の調製方法。
8. 【請求項８】 一般式（IIIa）、（IIIb）または（III
   c）： 【化３】 〔式中、ＡおよびＢは、それぞれ、下記： （ａ）Ａは、式（Ｉ／Ａ）、（Ｉ／Ｂ）もしくは（Ｉ／
   Ｃ）の基で、Ｂは、ＮもしくはＲ³ Ｎ⁺ である；または （ｂ）Ａは、式（Ｉ／Ｄ）の基で、Ｂは、ＣＨである；
   のように選択され、 【化４】 （式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³ 、ＣＨ₂ またはＣ
   （ＣＨ₃ ）₂ であり；Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ
   ⁴ であり；ｐおよびｑは、それぞれ、０または１〜５の
   整数であり；ｒおよびｓは、それぞれ、０または１〜５
   の整数であり；Ｒ¹ およびＲ² は、それぞれ独立して、
   水素、ヒドロキシ−もしくは炭素数１〜４のアルコキシ
   −もしくは炭素数１〜４のアルキルチオ−置換されてい
   てもよい炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシル基、
   炭素数１〜４のアルコキシ基、炭素数１〜４のアルキル
   チオ基、アミノ基およびハロゲンからなる群より選択さ
   れ；ならびにＲ³ およびＲ⁴ は、それぞれ独立して、水
   素、炭素数１〜４のアルキル基、ヒドロキシ−もしくは
   アルコキシ−もしくはアルキルチオ−置換された炭素数
   １〜４のアルキル基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６の
   アルコキシ基、炭素数１〜６のアルキルチオ基およびア
   ミノ基からなる群より選択される） Ｃは、（ＣＲ⁶ Ｒ⁷ ）_y であり、ここで、Ｒ⁶ は水素、
   Ｒ⁷ は天然のαアミノ酸の側鎖からなる群より選択され
   るか、Ｒ⁶ とＲ⁷ は、独立に、水素、炭素数１〜６のア
   ルキル基、アリール基、アラルキル基、ヘテロアリール
   基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭
   素数１〜６のアルキルチオ基、ＮＲ³ Ｒ⁴およびＳＲ⁵
   からなる群より選択され、ここで、Ｒ³ とＲ⁴ は前記の
   ように定義され、Ｒ⁵ は、水素、炭素数１〜６のアルキ
   ル基、ヒドロキシル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、
   または炭素数１〜６のアルキルチオ置換された炭素数１
   〜６のアルキル基であるか、Ｒ⁶ とＲ⁷ は、一緒になっ
   て脂環系もしくは複素環系を形成し；またはＣは、Ｃ
   Ｏ、ＣＳ、ＣＮＲ³ である；Ｄは、、（ＣＲ⁶ Ｒ⁷ ）_z
   であり、ここで、Ｒ⁶ とＲ⁷ は、前記定義するとおりで
   あり；ｙおよびｚは、それぞれ、０または１〜１０の整
   数であり、ｙ＋ｚの合計は少なくとも２であり、Ｅは、
   ＣＯＯＨ、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ₂ ＯＨまたはそれ
   らの活性化誘導体であり、Ｆは、式（Ｏ）： 【化５】 （式中、Ｘ¹ は、水素原子、炭素数１〜３のアルキル基
   および中程度の強酸により除去可能なアミノ保護基Ｐ２
   から選択され、Ｘ² は、中程度の強酸により除去可能な
   アミノ保護基Ｐ３である）で表される基であり、ならび
   にＬは、式（Ｖ）： 【化６】 （式中、Ｘ’およびＸ”は、独立してＯ−Ｒ’およびＮ
   Ｈ−Ｒ”であり、ここで、Ｒ’およびＲ”は、保護基で
   あり、Ｚは、ＣＨまたはＮであり、およびＲは、水素、
   炭素数１〜４のアルキル基、アリール基、アルキル−ア
   リール基、ハロゲン、ヒドロキシル基、アルコキシ基ま
   たは標識である）で表される基である〕で表される化合
   物。
9. 【請求項９】 下記工程： − 水素結合を介して核酸のヌクレオ塩基への結合が可
   能な、バックボーンに結合した複数のリガンドを含有し
   てなり、該リガンドの少なくとも１つは、中程度の強塩
   基により除去可能な第１保護基Ｐ１により保護された１
   級または２級アミノ基を含み、少なくとも１つのさらな
   るリガンドは、他のアミノ保護基が除去されない条件下
   で除去可能な第２保護基により保護された１級または２
   級アミノ基を含む、保護された核酸結合化合物を提供す
   る工程； − 第１未保護アミノ基を産する該第２保護基を除去す
   る工程； − 第１標識を第１未保護アミノ基に結合する工程； − 第２未保護アミノ基を産する該第１保護基を除去す
   る工程；ならびに − 第２標識を第２未保護アミノ基に結合する工程を含
   む、リガンドの２つの選択された部分で標識されている
   核酸結合化合物の調製方法。