ES2242604T3 - Microemulsiones con macroparticulas y microparticulas adsorbidas. - Google Patents

Microemulsiones con macroparticulas y microparticulas adsorbidas.

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ES2242604T3
ES2242604T3 ES00907228T ES00907228T ES2242604T3 ES 2242604 T3 ES2242604 T3 ES 2242604T3 ES 00907228 T ES00907228 T ES 00907228T ES 00907228 T ES00907228 T ES 00907228T ES 2242604 T3 ES2242604 T3 ES 2242604T3
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Abstract

Una emulsión que comprende gotitas menores que 1 ì de diámetro y que tiene una superficie adsorbente dicha emulsión que comprende: (a) un aceite metabolizable; (b) un agente emulsionante, que comprende un detergente iónico; y (c) al menos una macromolécula biológicamente activa seleccionada entre el grupo constituido por un polipéptido, un polinucleótido, un antígeno, un agente farmacéutico, una hormona, una enzima, un mediador de transcripción o traducción, un intermedio en la ruta metabólica, un inmunomodulador, y un adyuvante, en la que dicha macromolécula biológicamente activa está adsorbida sobre la superficie de la emulsión.

Description

Microemulsiones con macropartículas y micropartículas adsorbidas.
Campo técnico
En general, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas. En particular, la invención se refiere a micropartículas con superficies adsorbentes, procedimientos para preparar tales micropartículas, y usos de los mismos, tales como vacunas, adicionalmente, la presente invención se refiere a composiciones de adyuvantes que comprenden emulsiones de gotitas de aceite y sus de las mismas, tales como vacunas. Adicionalmente, la invención se refiere a composiciones que comprenden micropartículas biodegradables y /o microemulsiones en las que agentes biológicamente activos, tales como polinucleótidos, polipéptidos, antígenos, y adyuvantes terapéuticos, están adsorbidos a ellas.
Antecedentes
Se has usado vehículos particulados con el fin de lograr distribución controlada, parenteral de compuestos terapéuticos. Tales vehículos se diseñan para mantener el agente activo en el sistema de distribución durante un periodo extenso de tiempo. Los ejemplos de vehículos particulados incluyen los derivados de polímeros de metacrilato de polimetilo, así como micropartículas derivadas de poli (lactidas) (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 3.773.919), poli (lactida co - glicolidas), conocidas como PLG (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.767.628) y polietilenglicol, conocido como PEG, (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.648.095). Los polímeros de metacrilato de polimetilo son no degradables mientras que las partículas de PLG se biodegradan mediante hidrólisis no enzimática aleatoria de enlaces éster a ácidos láctico y glicólico que se excretan junto rutas metabólicas normales.
Por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.648.095 describe el uso de microesferas con agentes farmacéuticos encapsulados como sistemas de distribución de fármaco para distribución nasal, oral, pulmonar y oral. También se han descrito las formulaciones de liberación lenta que contienen diversos factores de crecimiento polipeptídicos. Véase, por ejemplo, la publicación internacional Nº WO 94/12158, la patente de Estados Unidos Nº 5.134.122 y la publicación internacional Nº WO 96/37216. El documento WO - A 9 904 761 describe un procedimiento para la preparación de una composición de partículas de lípidos que comprenden un agente lipídico y una proteína, el agente lipídico siendo una emulsión aceite en agua que comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 50% (p/p) de una fase oleosa y aproximadamente 0,5 a 10% (p/p) de un emulsionante fosfolípido, que da como resultado partículas que tienen un tamaño medio de partícula de menos que aproximadamente 1 \mum.
Fattal y col., Journal of Controlled Release 53: 137 - 143 (1998) describe nanopartículas preparadas a partir de poli (cicnoacrilatos de alquilo) (PACA) que tienen oligonucleótidos adsorbidos.
Los vehículos particulados, tales como micropartículas, también se han usado con antígenos atrapados en intentos para generar respuestas inmunes adecuadas. Tales vehículos presenten copias múltiples de un antígeno seleccionado entre al sistema inmune y promueven atrapamiento y retención de antígenos en ganglios linfáticos locales. Las partículas pueden ser fagocitadas por macrófagos y pueden potenciar la presentación de antígenos a través de la liberación de citoquinas. Por ejemplo, la solicitud de propiedad común con la presente, en tramitación con la presente, Nº 09/015.652, presentada el 29 de enero de 1998, describe el uso de micropartículas absorbidas en antígeno y encapsuladas en antígeno para estimular las respuestas inmunológicas mediadas por células, así como los procedimientos de preparación de las micropartículas.
En la solicitud provisional Nº 60/03616 del solicitante, por ejemplo, se describe un procedimiento de formación de micropartículas que comprende al combinación de un polímero con un disolvente orgánico, después añadiendo un estabilizador de emulsión, tal como poli (alcohol vinílico) (PVA), después evaporando el disolvente orgánico, formando por lo tanto micropartículas. La superficie de micropartículas comprende el polímero y el estabilizador. Después las macromoléculas tales como ADN, polipéptidos, y antígenos se pueden adsorber sobre aquellas superficies.
Aunque las micropartículas de PLG adsorbidas en antígeno ofrecen ventajas significativas sobre otros sistemas más tóxicos, la adsorción de agentes biológicamente activos a la superficie de micropartículas puede ser problemática. Por ejemplo, a menudo es difícil o imposible adsorber agentes biológicamente activos cargados o voluminosas, tales como polinucleótidos, grandes polipéptidos, y similares, a la superficie de micropartículas. De este modo, existe una necesidad continua de de sistemas de distribución flexibles para tales agentes y, particularmente para fármacos que sean altamente sensibles y difíciles de formular.
Los adyuvantes son compuestos que son capaces de potenciar una respuesta inmune a antígenos. Los adyuvantes pueden potenciar tanto la inmunidad humoral como la celular. Sin embargo, es preferible para ciertos patógenos estimular inmunidad, y de hecho, las células Th1. Los adyuvantes actualmente usados no inducen adecuadamente las respuestas de las células Th1, y/o tienen efectos secundarios perjudiciales.
Actualmente, los únicos adyuvantes aprobados para uso humano en los Estados Unidos son las sales de aluminio (alúmina). Estos adyuvantes han sido útiles para algunas vacunas incluyendo hepatitis B, difteria, polio, rabia, y gripe, pero pueden no ser útiles para otras, especialmente si se requiere para protección la estimulación de inmunidad mediada por células. Por ejemplo, las reseñas indican que la alúmina no mejora la eficacia de la vacuna de tos ferina y tifus y proporcionaba solamente un ligero efecto con vacunas de adenovirus. Adicionalmente, se han experimentado problemas tales como, inducción de granulomas en el sitio de inyección y variación entre lotes de las preparaciones de alúmina.
El adyuvante completo de Freund (CFA es un potente agente inmunoestimulador que se ha usado con éxito con muchos antígenos en base experimental. El CFA está compuesto por tres componentes: un aceite mineral, un agente emulsionante tal como Arlacel A, y micobacterias muertas tales como Mycobacterium tuberculosis. Las soluciones acuosas de antígeno se mezclan con estos componentes para crear una emulsión agua en aceite. Sin embargo, el CFA provoca graves efectos secundarios, incluyendo dolor, formación de abscesos, y fiebre, que impiden su uso en o bien vacunas humanas o veterinarias. Los efectos secundarios se deben principalmente a las reacciones del huésped con el componente micobacteriano de CFA. El adyuvante incompleto de Freund (IFA) es similar a CFA sin el componente bacteriano. Aunque no aprobado para uso en los Estados Unidos, el IFA se usado con éxito en seres humanos con vacunas de gripe y polio y varias vacunas animales incluyendo rabia, moquillo canino, y enfermedad de los pies y boca. Sin embargo los experimentos han mostrado, que tanto el aceite como el emulsionante usado en IFA pueden provocar tumores en ratones, indicando que un adyuvante alternativo sería una mejor elección para uso
humano.
El muramil dipéptido (MDP) representa la unidad mínima del complejo de pared celular micobacteriana que genera la actividad adyuvante observada en CFA. Ellouz y col., Biochen. Biophys. Res. Comm., 1974, 59, 1317. Se han generado muchos análogos sintéticos de MDP que muestran un amplio intervalo de potencia adyuvante y efectos secundarios. Chedid y col., Prog. Allergy, 1978, 25,63: Se ha mostrado que tres análogos de MDP - - derivados de treonilo de MDP (Byars y col., Vaccine, 1987, 5, 223); derivados de n-butilo de MDP (Chedid y col., Infect. Immun., 1982, 35, 417); y derivados lipofílicos de muramil tripéptido (Gisler y col., Immunomodulations of Microbial Products and Related Syntetic Compounds, Y. Yamamura y S. Kotani, Eds., Excerpta Medica, Amsterdam, 9. 167) - - estimulan la inmunidad humoral y mediada por células y muestran bajos niveles de toxicidad. Otro derivado de MDP, N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-[1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- 3(hidroxifosforil-oxi)]etilamina (MTP - PE) es lipófilo. La MTP - PE tiene colas fosfolipídicas que permiten la asociación de de la porción hidrófoba de la molécula con un entorno lipídico mientras que la porción de muramil péptido se asocia con el entorno acuoso. De este modo, la propia MTP - PE puede actuar como un agente emulsionante para generar emulsiones estables de aceite en agua.
Levamisol e isoprinosina son otros adyuvantes sintéticos que incrementan la inmunidad del huésped. Levamisol es el isómero levo de tetramisol y potencia la inmunidad humoral y celular a mediante un mecanismo dependiente de las células T. La isoprinosina, un complejo que contiene inosina, el precursor de purina de adenosina y guanosina, promueve la mitogénesis de las células T. Tufsina, un péptido de 4 aminoácidos (Thr - Lys - Pro - Arg) homólogo a una secuencia en al cadena pesada de inmunoglobulina (Ig), estimula principalmente macrófagos.
Las micropartículas preparadas a partir de polímeros biodegradables y biocompatibles, conocidos como el poli (lactida - co - glicolidos) (PLG), se ha demostrado que son vehículos eficaces de numerosos antígenos. Además, las micropartículas pueden controlar la velocidad de liberación de antígenos atrapados, y de este modo, ofrecen potencial para las vacunas de dosis única. Además, la administración de polímeros biodegradables con antígenos atrapados se ha demostrado en un intervalo de modelos animales que inducen respuestas potentes inmunes. O'Hagan y col., Advanced Drug Deliv. Rev., 1998, 32, 225 - 246 y Singh y col., Advanced Drug Deliv. Rev., 1998, 34, 285 - 304.
Una emulsión que comprende escualeno, trioleato de sorbitán (Span 85™, y polisorbato 80 (Tween 80™) se microfluidifica para proporcionar microgotitas de tamaño uniforme, es decir MF59, también se ha mostrado que induce potentes respuestas inmunes. Las formulaciones de MF59 se ha mostrado que induce títulos de anticuerpo 5 - > 100 veces mayor que las obtenidas con adyuvantes de sales de aluminio. MF59 se ha mostrado que potencia la respuesta inmune a antígenos a partir de numerosas fuentes incluyendo, por ejemplo, virus herpes simplex (VHS), virus de inmunodeficiencia humano (VIH), virus de al gripe, virus de la hepatitis C (VHC), citomegalovirus (CMV), virus de la hepatitis B (VHB), papilomavirus humano (VPH), y malaria. Ott y col., Vaccine Design: The Subunit And Adjuvant Approach, 1995, M. F. Powel y M. J. Newman, Eds., Plenum Press, Nueva York, p. 277 - 296; Singh y col., Vaccine, 1988, 16, 1822 - 1827; Ott y col., Vaccine, 1995, 13, 1557 - 1562; O'Hagan y col., Mol. Medicine Today, 1997, febrero, 69 - 75; y Traquina y col., J. Infect. Dis., 1996, 174, 1168 - 75. El adyuvante MF59 mejora la inmunogenicidad de antígenos subunitarios mientras mantienen el perfil de seguridad y tolerabilidad de adyuvante de alúmina. Van Nest y col., Vaccines , 92, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 57 - 62 y Valensi y col., J. Immunol., 1994, 153, 4029 - 39. El MF59 se describe además en la solicitud de Estados Unidos en tramitación con la presente Nº de serie 08/434.512, presentada el 4 de mayo de 1995, que se cede a la cesión de la presente invención. En estudios de animales, el MF59 no se ha encontrado que sea genotóxico, teratogénico, ni provoca sensibilización. El mecanismo de acción del MF59 parece ser dependiente de la generación de una fuerte respuesta de células T CD4+, es decir, una fuerte respuesta de célula Th2. Sin embargo los adyuvantes de MF59, generan poca, si las hay, respuestas de Th1, o respuesta citotóxica de linfocitos T (CTL).
Los oligonucleótidos que comprenden motivos CpG mezclados con antígenos han demostrado que inducen fuertes respuestas inmunes de Th1. Roman y col., Nat. Med., 1997, 3, 849 - 854; Weiner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 10833 - 10837; Davis y col., J. Immunol., 1998, 160, 870 - 876; Chu y col., J. Exp. Med., 1997, 186, 1623 - 1631; Lipford y col., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340 - 2344; y Moldoveanu y col.,Vaccine, 1988, 16, 1216 - 1224. Los dinucleótidos CpG no metilados son raramente comunes en el ADN bacteriano, pero están infra - representados y metilados en ADN de vertebrados. Bird, Trends Genet., 1987, 3, 342 - 347. El ADN bacteriano u oligonucleótidos sintéticos que contienen motivos CpG no metildados también se sabe que inducen respuestas inmunes incluyendo, por ejemplo, proliferación de células B, secreción de interleuquina - 6 e inmunoglobulina y resistencia a apoptosis. Krieg y col., Nature, 1995, 374, 546 - 549; Klinman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879 - 2883; Ballas y col., J. Immunol., 1996, 157, 1840 - 1845; Cowdery y col., J. Immunol., 1996, 156, 4570 - 4575; Halpern y col., Cell. Immunol., 1996, 167, 72 - 78; Yamamoto y col., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866 - 873; Stacey y col., J.Immunol., 1996, 157, 2116 - 2122; Messina y col., J. Immunol., 1991, 147, 1759 - 1764; Yi y col., J. Immunol., 1996, 157, 4918 - 4925; Yi y col., J. Immunol., 1996, 157, 5394 - 5402; Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 4755 - 4761; y Yi y col.,J.Immunol., 1998, 160, 5898 - 5906; publicación PCT WO 96/02555; publicación PCT WO 98/16247; publicación PCT WO 98/18810; publicación PCT WO 98/40100; publicación PCT WO 98/55495; publicación PCT WO 98/37919; y publicación PCT WO 98/52581.
El monofosforil lípido A (MPA) es conocido por los expertos en al técnica que induce una respuesta de linfocitos Th1. Ullrich y col., Monophosphoryl Lipid A as an Adjuvant in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, Eds. 1995, Plenum Press, Nueva York, p. 495 - 523.
También se ha mostrado que las emulsiones basadas en lípidos catiónicos se pueden usar como vehículos génicos. Véase, por ejemplo, Yi y col., Cationic Lipid Emulsion; a Novel Non - Viral, and Non - Liposomal Gene Delivery System; Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24: 653 - 654 (1997); Kim y col., In Vivo Gene Transfer Using Cationic Lipid Emulsion - Mediated Gene Delivery System by Intranasal Administration, Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 25: 344 - 345 (1998); Kim y col., In Vitro and In Vivo Gene Delivery Using Cationic Lipid Emulsion, Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 26: nº 5438 (1999).
Un adyuvante que da como resultado el incremento de una respuesta de células Th1 que se puede usar para tratamientos profilácticos y terapéuticos es, de este modo, todavía deseado. Tal respuesta sería de ayuda en el tratamiento de, por ejemplo, infecciones virales, así como para inmunizar individuos susceptibles a infecciones virales.
Sumario de la invención
Los inventores presentes han inventado un procedimiento de formación de micropartículas con superficies adsorbentes capaces de adsorber una diversidad de macromoléculas. Las micropartículas están compuestas de tanto un polímero como un detergente iónico. Las micropartículas de la presente invención adsorben tales macromoléculas más eficazmente que otras micropartículas actualmente disponibles.
Las micropartículas se derivan de un polímero, tal como poli (\alpha- hidroxi ácido), un ácido polihidroxibutírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido, un PACA, un policianoacrilato, y similares, y se forman con detergentes, tales como detergentes catiónicos, aniónicos, o no iónicos, dichos detergentes se pueden usar en combinación. Adicionalmente, los inventores han descubierto que estas micropartículas producen una mejor adsorción de antígenos virales, y proporcionan respuestas inmunes superiores, comparadas con las micropartículas formadas mediante un procedimiento que usa solamente PVA. Mientras que las partículas hechas usando solamente PVA pueden adsorber algunas macromoléculas, las micropartículas de la presente invención que usan otros detergentes solos, en combinación, o en combinación con PVA, adsorben una amplia diversidad de macromoléculas. Entonces, de acuerdo con lo anterior, la invención se refiere principalmente a tales micropartículas, así como a procedimientos para producir las mismas y procedimientos de uso de las micropartículas.
En una realización, la invención se refiere a una micropartícula con una superficie adsorbente, en la que la micropartícula comprende un polímero seleccionado entre el grupo constituido por un poli (\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxibutírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido, un policianoacrilato.
En otra realización, la invención se refiere a tales micropartículas que además comprenden una macromolécula seleccionada adsorbida sobre la superficie de la micropartícula, tal como un agente farmacéutico, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína, una hormona, una enzima, un mediador de transcripción o traducción, un intermedio en una ruta metabólica, un inmunomodulador, un antígeno, un adyuvante, o las combinaciones de los mismos, y
similares.
En otra realización, la invención se refiere a una composición de micropartículas que comprende una macromolécula seleccionada adsorbida a una micropartícula de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento de producción de una micropartícula que tiene una superficie adsorbente, el procedimiento comprende:
(a)
combinar una solución polimérica que comprende, un polímero seleccionado entre el grupo constituido por un poli (\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxibutírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido, y un policianoacrilato, en la que el polímero está presente a una concentración de aproximadamente 1% a aproximadamente 30% en un disolvente orgánico;
y un detergente aniónico, catiónico, o no iónico a la solución de polímero, en la que el detergente está presente en una relación de 0,001 a 10 (p/p) de detergente a polímero, para formar una mezcla de polímero/detergente;
(b)
dispersar la mezcla de polímero / detergente;
(c)
retirar el disolvente orgánico; y
(d)
recuperar la micropartícula.
Preferiblemente, la mezcla de polímero / detergente se emulsiona para formar una emulsión antes de retirar el disolvente orgánico.
En otra realización, la invención se refiere a una micropartícula producida por los procedimientos descritos anteriormente.
En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento de producción de una micropartícula con una macromolécula que comprende:
(a)
combinar una solución polimérica que comprende poli(D,L- lactida-co-glicolida), en la que el polímero está presente a una concentración de aproximadamente 10% en un disolvente orgánico;
y un detergente aniónico, catiónico, o no iónico a la solución de polímero, en la que el detergente está presente en una relación de 0,001 a 10 (p/p) de detergente a polímero, para formar una mezcla de polímero / detergente;
(b)
dispersar la mezcla de polímero / detergente;
(c)
retirar el disolvente orgánico de la emulsión;
(d)
recuperar la micropartícula; y
(e)
adsorber una macromolécula a la superficie de la micropartícula, en la que la micropartícula se selecciona entre el grupo constituido por un agente farmacéutico, un polinucleótido, un polipéptido, una hormona, una enzima, un mediador de transcripción o traducción, un intermedio en una ruta metabólica, un inmunomodulador, un antígeno, un adyuvante, y las combinaciones de los mismos. Preferiblemente, la mezcla de polímero / detergente se emulsiona para formar una emulsión antes de retirar el disolvente orgánico. En otra realización, la invención se refiere a una micropartícula con una macromolécula adsorbida producida por el procedimiento descrito anteriormente.
En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento de producción de una composición de micropartículas adsorbentes que comprende combinar una micropartícula adsorbente que tiene una micropartícula adsorbida sobre la superficie de la misma y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La composición de la invención se puede usar en un procedimiento de distribución de una macromolécula a un sujeto vertebrado.
La composición de la invención se puede usar en un procedimiento para generar una respuesta inmune celular en un sujeto vertebrado.
La composición de la invención se puede usar en un procedimiento de inmunización. La composición puede opcionalmente contener macromoléculas no unidas, y también opcionalmente contener adyuvantes, incluyendo sales de aluminio tales como fosfato de aluminio.
En una realización preferida, las micropartículas se forman a partir de un poli(\alpha-hidroxi ácido), más preferiblemente, una poli(D,L-lactida-co-glicolida), y más preferiblemente una poli(D,L-lactida-co-glicolida).
En otra realización de la presente invención, una preparación de micropartículas comprende emulsiones submicrónicas con tensioactivos iónicos. MF59 u otras se pueden usar como la partícula de base, mientras que los tensioactivos iónicos pueden inluir, pero no se limitan a, dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DEPC) y ácido dioleoil-fosfatídico (DPA), cada una de las cuales es soluble en escualeno.
Cada una de las micropartículas adsorbentes descritas anteriormente no exhaustivamente puede también tener macromoléculas atrapadas dentro de ellas.
La presente invención también se refiere a microemulsiones que comprenden una emulsión de gotas de aceite con un detergente iónico. Tales composiciones adsorben fácilmente macromoléculas tales como ADN, proteína, y otras moléculas antigénicas. Las composiciones de adyuvantes pueden comprender un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CpG. La composición de adyuvantes también puede comprender un componente opcional que da como resultado una emulsión cargada positivamente. La emulsión de gotitas de aceite preferiblemente comprende un aceite metabolizable y un agente emulsionante que están preferiblemente presentes en al forma de una emulsión de aceite en agua que tiene gotas de aceite sustancialmente todas las cuales tienen menos de 1 micrómetro de diámetro. Preferiblemente, la composición existe en ausencia de cualquier copolímero de bloque de polioxipropileno-polioxietileno. El aceite es preferiblemente un aceite animal, un hidrocarburo no saturado, un terpenoide tal como, por ejemplo, escualeno, o aceite vegetal. La composición preferiblemente comprende 0,5 a 20% por volumen del aceite en un medio acuoso. El agente emulsionante preferiblemente comprende un detergente no iónico tal como un mono-, di-, o triéster de polioxietilen sorbitán o un mono-, di-, o triéter de sorbitán. Preferiblemente, la composición comprende aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5% por peso del agente emulsionante. El oligonucleótido preferiblemente comprende al menos un enlace fósforotioato comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEQ ID números: 1 - 28. En otras realizaciones preferidas de la invención, el oligonucleótido comprende un motivo CpG flanqueado por dos purinas inmediatamente 5' al motivo y dos piridinas inmediatamente 3' al motivo. En otras realizaciones preferidas de la invención, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC ID números: 19 - 28. La secuencia más preferida es SEC ID Nº 28. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición de adyuvantes además comprende un agente inmunoestimulante separado que se selecciona preferiblemente entre el grupo constituido por alúmina, un componente de la pared celular bacteriana, y muramil péptido. La composición de adyuvantes puede estar en forma de una micropartícula.
La presente invención también se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden una cantidad inmunoestimulante de una sustancia antigénica, y una cantidad inmunoestimulante de una composición de adyuvantes descrita en esta memoria descriptiva. Preferiblemente, la sustancia antigénica se selecciona entre el grupo constituido por una proteína, proteína-polisacárido, proteína-lipopolisarárido, polisacárido, y lipopolisacárido. En algunas realizaciones de la invención, la composición inmunogénica comprende un oligonucleótido CpG en combinación con una sustancia antigénica adsorbida a partículas de poli(lactida-co-glicolida). La sustancia antigénica adsorbida es preferiblemente una proteína recombinante. En realizaciones preferidas de la invención, la sustancia antigénica es de un virus tal como, por ejemplo, virus de la hepatitis C(VHC), virus de la hepatitis B(VHB), virus simplex herpes (VHS), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), citomegalovirus (CMV), virus de la gripe (flu), y virus de la rabia. Preferiblemente, la sustancia antigénica se selecciona entre el grupo constituido por glicoproteína gD de VSH, grlicoproteína gp120 de VIH, y p55 gag de VIH. En otras realizaciones preferidas de la invención, la sustancia antigénica es de una bacteria tal como, por ejemplo, cólera, difteria, tétanos, tos ferina, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, y Haemophilus influenza. En otras realizaciones preferidas de la invención, la sustancia antigénica es de un parásito tal como, por ejemplo, un parásito de malaria.
La composición de la invención se puede usar en procedimientos de estimulación de una respuesta inmune en un animal huésped. El animal huésped es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano.
La composición de la invención se puede usar en procedimientos de inmunización de un animal huésped contra una infección viral, bacteriana, o parasitaria. El animal huésped es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano.
La composición de la invención se puede usar en procedimientos de incremento de una respuesta inmune en un animal huésped. El animal huésped es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano.
Éstas y otras realizaciones de la presente invención se producirán fácilmente para los expertos en la técnica en vista de la descripción en esta memoria descriptiva.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico de barras que muestra los resultados típicos de isotipos de inmunoglobulina generados por las composiciones inmunogénicas preferidas que comprenden micropartículas de PLG según la invención.
La figura 2 es un gráfico de barras que muestra los resultados típicos de isotipos de inmunoglobulina generados por las composiciones inmunogénicas preferidas que comprenden adyuvante el MF59 según la invención.
La figura 3 es un diagrama que muestra resultados representativos de título de suero IgG anti - p55 tras inmunización con un adyuvante de emulsión preferido.
La figura 4 es un diagrama que muestra resultados representativos de lisis de dianas por CTL tras inmunización con un adyuvante de emulsión preferido.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en los sorprendentes descubrimientos de que las micropartículas con macromoléculas adsorbidas generan respuestas inmunes mejoradas, y que un adyuvante que contiene una combinación de oligonucleótido CpG y aceite metabolizable o polímero biodegradable incrementa las respuestas inmunes. Adicionalmente, la combinación de micropartículas con macromoléculas adsorbidas y adyuvantes de emulsión en aceite es útil para generar una respuesta inmune fuerte.
La práctica de la presente empleará, salvo que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de química, química de polímeros, bioquímica biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en al bibliografía. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 18 (Easton, Pensilvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds, Academic Press, Inc.) Handbook of Experimental Immunology, Vols. I - IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K. S., ed, CRC Press, 1997) y Seymour / Carraher's Polymer Chemistry (4ª edición, Marcel Dekker Inc., 1996).
Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un (a)" y "el (la)" incluyen las referencias plurales salvo que se el contenido dicte claramente otra cosa. De este modo, por ejemplo, el término "micropartícula" se refiere a una o más micropartículas, y similares.
A Definiciones
En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretende que se definan como se indica a continuación.
El término "micropartícula" como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a una partícula de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 150 \mum de diámetro, más preferiblemente aproximadamente 200 nm a aproximadamente 30\mum de diámetro, y los más preferiblemente aproximadamente 500 nm a aproximadamente 10 \mum de diámetro. Preferiblemente, la micropartícula será de un diámetro que permita la administración por vía parenteral o mucosal sin ocluir las agujas y capilares. El tamaño de micropartícula se determina fácilmente mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como espectroscopía de correlación de fotones, difractometría por láser y / o microscopía electrónica de barrido. El término "partícula" también se puede usar para denotar una micropartícula como se define en esta memoria descriptiva.
Las micropartículas para uso en esta memoria descriptiva se formarán a partir de materiales que son esterilizables, no tóxicas y biodegradables. Tales materiales incluyen, sin limitación, poli (\alpha-hidroxi ácido), ácido polihidroxibutírico, policaprolactona, poliortoéster, polianhídrido, PACA, y policianoacrilato. Preferiblemente, las micropartículas para uso en la presente invención se derivan de un poli (\alpha-hidroxi ácido), en particular de una (poli (lactida) ("PLA") o un copolímero de D,L-lactida y glicolidao ácido glicólico, tal como una poli (D,L-lactida-co-glicolida) ("PLG" o "PLGA"), o un copolímero de D,L-lactida y caprolactona. Las micropartículas también se pueden derivar de diversos materiales de partida poliméricas que tienen una diversidad de pesos moleculares, en el caso de los copolímeros tales como PLG, una diversidad de relaciones de lactida : glicolida, cuya selección será en gran medida materia de elección, dependiendo en parte de la macromolécula coadministrada. Estos parámetros se describen más completamente más adelante.
El término "detergente" como se usa en esta memoria descriptiva incluye tensioactivos y estabilizantes de de emulsión. Los detergentes iónicos incluye, pero no se limitan a, SDS, SLD, DSS (disulfosuccinato), alcoholes grasos sulfatados, y similares. Los detergentes catiónicos incluyen, pero no se limitan a, cetrimida (CTBA), cloruro de benzalconio, DDA, (bromuro de dimetil dioctodecil amonio), DOTAP, y similares. Los detergentes no iónicos incluyen, pero no se limitan a, ésteres de sorbitán, polisorbatos, monoéteres de glicol polioxietilado, alquil fenoles polioxietilados, poloxámeros, y similares.
El término "carga positiva neta" como se usa en esta memoria descriptiva, significa que la carga sobre la superficie de la micropartícula es más positiva que la carga sobre a superficie de una micropartícula correspondiente hecha usando PVA. De manera similar, el término "carga negativa neta" como se usa en esta memoria descriptiva, significa que la carga sobre la superficie de la micropartícula es más negativa que la carga sobre a superficie de una micropartícula correspondiente hecha usando PVA. La carga neta se puede evaluar comparando el potencial zeta (también conocido como potencial electrocinética) de la micropartícula hecha usando un detergente catiónico o aniónico con una micropartícula correspondiente hecha usando PVA. De este modo, una superficie de micropartícula que tiene una "carga positiva neta" tendrá un potencial zeta mayor que el potencial zeta de la superficie de una micropartícula hecha usando PVA y una micropartícula que tiene una "carga negativa neta" tendrá un potencial zeta menor que el potencial zeta de la superficie de una micropartícula hecha usando PVA. Como es evidente, las cargas netas para las micropartículas de la invención se calculan con relación al potencial zeta de una micropartícula de PVA correspondiente.
El término "potencial zeta" como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere al potencial eléctrico que existe a través de la interfase de todos los sólidos y líquidos, es decir, el potencial a través de la capa difusa de iones que rodean una partícula coloidal cargada. El potencial Z se puede calcular a partir de movilidades electroforéticas, es decir, las velocidades a las que las partículas coloidales viajan entre electrodos cargados puestos en contacto con la sustancia a medir, usando técnicas bien conocidas en al técnica.
El término "macromolécula" como se usa en esta memoria descriptiva se refiere a, sin limitación, un agente farmacéutico, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína, una hormona, una enzima, un mediador de transcripción o traducción, un intermedio en una ruta metabólica, un inmunomodulador, un antígeno, un adyuvante, o las combinaciones de los mismos. Las macromoléculas particulares para uso con la presente invención se describen en más detalle más adelante.
El término "agente farmacéutico" se refiere a compuestos biológicamente activos tales como antibióticos, agentes antivirales, factores de crecimiento, hormonas, y similares, descritas en más detalle más adelante.
Un "polinucleótido" es una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína o polipéptido biológicamente activo (por ejemplo, inmunogénico o terapéutico). Dependiendo de al naturaleza del polipéptido codificado por el polinucleótido, un polinucleótido puede incluir como poco 10 nucleótidos, por ejemplo, cuando el polinucleótido codifica un antígeno. Además, un "polinucleótido" puede incluir secuencias tanto de doble cadena como de una sola y se refiere, pero no se limita a, ADNc de virus, ARNm procariótico o eucariótico, secuencias de ARN y ADN genómico virales (por ejemplo, virus y retrovirus de ARN y ADN) o ADN procariótico, y especialmente secuencias de ADN sintéticas especialmente. El término también comprende secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN, e incluye modificaciones, tales como supresiones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadoras por naturaleza), a la secuencia nativa, mientras que la molécula de ácido nucleico codifique una proteína terapéutica o antigénica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como a través de mutaciones que producen los antígenos.
El término "polipéptido" y "proteína" se refiere a un polímero de restos aminoácido y no se limitan a una longitud mínima del producto. De este modo, péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros, y similares, están incluidos dentro de la definición. Tanto las proteínas de longitud completa como fragmentos de los mismos están abarcados por las definiciones. Los términos también incluyen modificaciones, tales como supresiones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadoras por naturaleza), a la secuencia nativa, mientras que al proteína mantengan la capacidad de generar una respuesta inmunológica o tienen un efecto terapéutico sobre un sujeto al que se administra la proteína.
Por "antígeno" se entiende una molécula que contiene uno o más epítopes capaces de estimular un sistema inmune del huésped para hacer una respuesta inmune específica de antígeno celular cuando el antígeno se presenta de acuerdo con la presente invención, o una respuesta de anticuerpo humoral. Un antígeno puede ser capaz de generar una respuesta celular o humoral por sí mismo o cuando está presente en combinación con otra molécula. Normalmente, un epítope incluirá entre aproximadamente 3 - 15, generalmente 5 - 15, aminoácidos. Los epítopes de una proteína dada se pueden identificar usando un número de técnicas de mapeo de epítopes, bien conocidas en al técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epítopes lineales se pueden determinar mediante por ejemplo, sintetizando simultáneamente grandes números de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están unidos a los soportes. Tales técnicas son bien conocidas en la técnica y se describen en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.708.81; Geysen y col., (1984) Proc Natl Acad. Sci. USA 81: 3998 - 4002; Geysen y col., (1986) Molec. Immunol. 23: 709 - 715. De manera similar, los epítopes conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de aminoácidos tales como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de dos dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.
El término "antígeno" como se usa en esta memoria descriptiva denota ambas subunidades de antígenos, es decir, antígenos que están separados y discontinuos de un organismo completo en el que el antígeno está asociado por naturaleza, así como bacterias muertas, atenuadas o inactivadas, virus, parásitos u otros microbios. Los anticuerpos tales como anticuerpos anti - idiotipo, o los fragmentos de los mismos, y mimotopos de péptidos sintéticos, que pueden imitar un antígeno o determinante antigénico, también se encuentran dentro de la definición de antígeno como se usa en esta memoria descriptiva. De manera similar, un oligonucleótido o polinucleótido que expresa una proteína terapéutica o inmunogénica, o determinante antigénico in vivo, tal como terapia génica y aplicaciones de inmunización por ácidos nucleicos, también se incluyen en la definición de antígeno en esta memoria descriptiva.
Además, para propósitos de la presente invención, los antígenos se pueden derivar de cualquiera de los varios virus, bacterias, parásitos y hongos conocidos, así como cualquiera de los diversos antígenos tumorales. Además, para propósitos de al presente invención, un "antígeno" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como, adiciones y sustituciones (generalmente conservadoras por naturaleza), a la secuencia nativa, mientras que al proteína mantenga la capacidad de generar una respuesta inmunológica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida al sitio, o puede ser accidental, tal como mediante mutaciones de huéspedes que producen los antígenos.
Una "respuesta inmunológica" a un antígeno o composición es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmune humoral y / o celular a las moléculas presentes en la composición de interés. Para propósitos de la presente invención, una "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpo, mientras que una "respuesta inmune celular" es una mediada por linfocitos T y / o otros glóbulos blancos. Un aspecto importante de inmunidad celular implica una respuesta específica de antígeno por células T citolíticas ("CTL"). Las CTL tienen especificidad para antígenos de péptidos que están presentes en asociación con proteínas codificadas por el complejo de histocompatibilidad principal (MHC) y se expresa sobre la superficie de las células. Las CTL ayudan a inducir y promover la destrucción intracelular de microbios intracelulares, o la lisis de células infectadas con tales microbios. Otro aspecto de inmunidad implica una implica una respuesta específica de antígeno por células T auxiliares. Las células T auxiliares actúan para ayudar a estimular la función, y focalizan la actividad de, células efectoras no específicas contra las células que muestran antígenos de péptido en asociación con moléculas de MHC sobre su superficie. Una "respuesta inmune celular" también se refiere a la producción de citoquinas, quimioquinas y otras tales como moléculas producidas por células T activadas y / u otros glóbulos blancos, incluyendo las derivadas de células T CD4+ y CD8+.
Una composición, tal como una composición inmunogénica, o vacuna que genera una respuesta inmune celular puede servir para sensibilizar un sujeto vertebrado mediante la representación de antígeno en asociación con moléculas MHC en al superficie celular. La respuesta inmune mediada por células se refiere a, o está próximo a, células que presentan antígeno es su superficie. Además, los linfocitos T específicos de antígeno se pueden generar para que permitan la protección futura de un huésped inmunizado.
La capacidad de un antígeno particular o composición para estimular una respuesta inmunológica mediada por células se puede determinar mediante un número de ensayos, tal como mediante ensayos de linfoproliferación (activación de linfocitos), ensayos celulares citotóxicos de CTL, o ensayando para linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado. Tales ensayos los conocen bien los expertos en al técnica. Véase, por ejemplo, Erickson y col., J. Immunol.(1993) 151: 4189 - 4199; Doe y col., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 2369 - 2376; y los ejemplos más adelante.
De este modo, una respuesta inmunológica como se usa en esta memoria descriptiva puede ser una que estimule la producción de las CTL, y / o la producción o activación de células auxiliares T. El antígeno de interés también puede generar una respuesta inmune mediada por anticuerpos. Por lo tanto, una respuesta inmunológica puede incluir uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos por células B; y / o la activación de células T supresoras y / o células T \gamma\delta dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos presentasen al composición o vacuna de interés. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la infectividad, y / o mediar complemento de anticuerpo, o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) para proporcionar protección a un huésped inmunizado. Tales respuestas se pueden determinar usando inmunoensayos convencionales y ensayos de neutralización, bien conocidos en la técnica.
Una composición que contiene un antígeno seleccionado adsorbido a una micropartícula, muestra "inmunogenicidad potenciada" cuando posee una capacidad mayor para generar una respuesta inmune que la respuesta inmune generada por una cantidad equivalente del antígeno cuando se distribuye sin asociación con la micropartícula. De este modo, una composición puede mostrar "inmunogenicidad potenciada" debido a una dosis menor de antígeno si es necesario para lograr una respuesta inmune en el sujeto al que se administra. Tal inmunogenicidad potenciada se puede determinar administrando la composición de micropartícula / antígeno, y controles de antígenos a animales y comparar títulos de anticuerpos contra los dos ensayos convencionales tales como radioinmunoensayo y ELISA, bien conocidos en al técnica.
Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad farmacéuticamente eficaz" de una macromolécula / micropartícula, como se proporciona en esta memoria descriptiva, se refiere a una cantidad no tóxica pero suficiente de la macromolécula / micropartícula para proporcionar la respuesta deseada, tal como una respuesta inmunológica, y efecto terapéutico correspondiente, o en el caso de distribuir una proteína terapéutica, una cantidad suficiente para efectuar el tratamiento del sujeto, como se define más adelante. Como se señalará más adelante, la cantidad exacta requerida variará entre sujetos, dependiendo de la especie, edad, y condición general del sujeto, la gravedad de la afección que se está tratando, y la macromolécula particular de interés, modo de administración, y similares. Una cantidad apropiada "eficaz" en cualquier caso individual la pueden determinar los expertos en la técnica usando experimentación rutinaria.
Por "sujeto vertebrado" se entiende cualquier miembro del subfilo de los cordados, incluyendo, sin limitación, mamíferos tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, caballos, y seres humanos; animales domésticos tales como perros y gatos; y aves, incluyendo domésticos, salvajes y aves caza tales como gallos y gallinas incluyendo pollos, pavos y otras aves gallináceas. El término no denota una edad particular. De este modo, se pretende que se cubran los animales tanto adultos como recién nacidos.
Por "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se entiende un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable, es decir, el material se puede administrar a un individuo junto con la formulación de micropartículas sin provocar cualquier efecto biológico indeseable o interactuar de una manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composición en la que están contenidos.
Por "pH fisiológico" o un "pH en el intervalo fisiológico" se entiende un pH en el intervalo de aproximadamente 7,2 a 8,0 inclusive, más típicamente en el intervalo de aproximadamente 7,2 a 7,6 inclusive.
Como se usa en esta memoria descriptiva, "tratamiento" se refiere a cualquiera de (i) la prevención de infección o reinfección, como en una vacuna tradicional, (ii) la reducción o eliminación de síntomas, y (iii) la eliminación sustancial o completa del patógeno o trastorno en cuestión. El tratamiento se puede efectuar profilácticamente (antes de la invención) o terapéuticamente (después de al invención).
Como se usa en esta memoria descriptiva, la frase "ácido nucleico" se refiere a ADN, ARN, o quimeras formadas de los mismos.
Como se usa en esta memoria descriptiva, la frase "oligonucleótido que comprende al menos un motivo CpG" se refiere a un polinucleótido que comprende al menos un dinucleótido CpG. Los oligonucleótidos que comprenden al menos un motivo CpG pueden comprender múltiples motivos CpG. Estos oligonucleótidos también se conocen en la técnica como "oligonucleótidos CpG" en la técnica. Como se usa en esta memoria descriptiva, la frase "motivo CpG" se refiere a una porción de dinucleótido de un oligonucleótido que comprende un nucleótido de citosina seguido de un nucleótido de guanosina. 5-Metilcitosina también se puede usar en lugar de citosina.
Como se usa en esta memoria descriptiva, la frase "emulsión de gotitas de aceite" se refiere a una emulsión que comprende un aceite metabolizable y un agente emulsionante.
De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, se proporcionan composiciones y procedimientos que profiláctica y /o terapéuticamente inmunizan o tratan un huésped animal contra infecciones, virales, fúngicas, por micoplasma, bacteriana, o protozoaria, así como a tumores. Los procedimientos de la presente invención son útiles para conferir inmunidad profiláctica y/o terapéutica a un mamífero, preferiblemente un ser humano. Los procedimientos de la presente invención también se pueden practicar sobre mamíferos, distintos de seres humanos, para investigación biomédica.
B Procedimientos generales 1. Micropartículas con macropartículas adsorbidas
La presente invención se basa en es descubrimiento de que las micropartículas de PLA y PLG de la presente invención adsorben eficazmente macromoléculas biológicamente activas. Además, estas micropartículas adsorben una mayor variedad de moléculas, que incluyen macromoléculas cargadas y / o voluminosas, más fácilmente que las micropartículas preparadas con PVA. De este modo la macromolécula / macromolécula de la presente invención se puede usar como un sistema de distribución para distribuir los componentes biológicamente activos con el fin de tratar, prevenir y / o diagnosticar una amplia diversidad de enfermedades.
La presente invención se puede usar para distribuir una amplia diversidad de macromoléculas que incluye, pero no se limita a, agentes farmacéuticos tales como antibióticos y agentes antivirales, fármacos antiinflamatorios no esteroides, analgésicos, vasodilatadores, fármacos cardiovasculares, psicotrópicos, neurolépticos, antidepresivos, fármacos antiparquinson, bloqueadores beta, bloqueadores de los canales de calcio, inhibidores de braquinidina, inhibidores de ACE, vasodilatadores, inhibidores de prolactina, esteroides, antagonistas de hormonas, antihistaminas, antagonistas de serotonina, heparina, agentes quimioterapéuticos, antineoplásicos y factores de crecimiento, incluyendo pero sin limitación a PDGF, EGF, KGF, IGF-1 e IGF-2, FGF, polinucleótidos que codifican proteínas terapeúticas o inmunogénicas, proteínas inmunogénicas y epítopes de los mismos para uso en vacunas, hormonas que incluyen hormonas peptídicas tales como insulina, proinsulina, hormona de crecimiento, GHRH, LHRH, EGF, somastotina, SNX- 111, BNP, insulinotropina, ANP, FSH, LH, PSH y hCG, hormonas esteroides gonadales (andrógenos, estrógenos y progesterona), hormona estimulante de tiroide, inhibina, colecistoquinina, ACTH, CRF, dinorfinas, endorfinas, endotelina, fragmentos de fibronectina, galanina, gastrina, insulinotropina, glucagón, fragmentos de proteína de unión a GTP, guanilina, las leucoquininas, magainina, mastoparans, dermaseptina, sistemina, neuromedinas, neurotensina, pancreastatina, polipéptido pancreático, sustancia P, secretina, timosina, y similares, enzimas, mediadores de transcripción o traducción intermedios en rutas metabólicas, inmunomoduladores, tales como cualquiera de las diversas citoquinas que incluyen interleuquina-1, interleuquina-2, interleuquina-3, interlauquina-4, e interferón gamma, antígenos, y adyuvantes.
En una realización preferida la macromolécula es un antígeno. Una particular ventaja de al presente invención es al capacidad de las micropartículas con antígeno adsorbido para generar respuestas inmunes mediadas por células en un sujeto vertebrado. La capacidad del antígeno / micropartículas de la presente invención para generar una respuesta inmune mediada por células contra un antígeno seleccionado proporciona una herramienta potente contra infección mediante una diversidad de patógenos. De acuerdo con lo anterior, el antígeno / micropartículas de la presente invención se pueden incorporar en composiciones de vacunas.
De este modo, además de una respuesta de anticuerpo convencional, el sistema descrito en esta memoria descriptiva puede proporcionar, por ejemplo, la asociación de los antígenos expresados con las moléculas de MHC de la clase I de tal manera que una respuesta inmune celular in vivo al antígeno de interés se pueda montar para que estimule la producción de las CTL y permita el futuro reconocimiento del antígeno. Además, los procedimientos pueden generar una respuesta específica de antígeno mediante células T auxiliares. De acuerdo con lo anterior, los procedimientos de la presente invención encontrarán uso con cualquier macromolécula para la que se desea la respuesta celular y / o humoral, preferiblemente los antígenos derivados de patógenos virales que pueden inducir anticuerpos, epítopes auxiliares de células T y epítopes citotóxicos de células T. Tales antígenos incluyen, pero no se limitan a, los codificados por virus humanos y animales y pueden corresponder a proteínas o bien estructurales o no estructurales.
Las micropartículas de la presente invención son particularmente útiles para inmunización contra virus intracelulares que normalmente generan respuestas inmunes deficientes. Por ejemplo, la presente invenció encontrará uso para estimular una respuesta una respuesta inmune contra una amplia diversidad de proteínas de la familia herpesvirus, incluyendo proteínas derivadas de virus herpes simplex (VHS) tipos 1 y 2, tales como glicoproteínas gB, gD y gH de VSH-1 y VSH-2; antígenos derivados de virus zoster de varicela (VZV), virus Epstein-Barr (VEB) y citomegalovirus (CMV) que incluyen CMV gB y gH; y antígenos derivados de otros herpesvirus humanos tales como VHH6 y VHH7. (Véase, por ejemplo, Chee y col., Cytomegaloviruses (J. K. McDougall, ed., Springer-Verlag 1990) pp. 125 - 169, para una revisión de la proteína que codifica el contenido de citomegalovirus; McGeoch y col., J. Gen. Virol. (1988) 69:1531-1574, para una descripción de los diversas proteínas codificadas por VSH-1; patente de Estados Unidos Nº 5.171.568 para una descripción de proteínas gB y gD de VSH-1 y VSH-2 y los genes que codifican las mismas; Baer y col., Nature (1984) 310: 207-211, para la identificación de secuencias que codifican proteínas en un genoma de VEB; y Davidson y Scott, J. Gen. Virol. (1986) 67:1759-1816, para una revisión de VZV.)
Los antígenos de la familia de virus de hepatitis, que incluyen virus de la hepatitis A(VHA), virus de la hepatitis B(VHB), virus de la hepatitis C(VHC), y el virus de la hepatitis delta (VHD), virus de la hepatitis E(VHE) y virus de la hepatitis G(VHG), también se puede usar convenientemente en las técnicas descritas en esta memoria descriptiva. A modo de ejemplo, se conoce la secuencia genómica viral de VCH, como son procedimientos para obtener la secuencia. Véase, por ejemplo, las publicaciones internacionales números WO 89/04669; WO 90/11089; y WO 90/14436. El genoma de VCH codifica varias proteínas virales, incluyendo E1 (también conocido como E) y E2 (también conocido como E2/NSI) y una proteína de nucleocápsido N-terminal (denominado "núcleo") (véase, Houghton y col., Hepatology (1991) 14:381-388, para una descripción de las proteínas de VCH, incluyendo E1 y E2). Cada una de estas proteínas, así como fragmentos antigénicos de los mismos, encontrarán uso en la presente composición y procedimientos.
De manera similar, se conoce la secuencia para en antígeno \delta de VDH (véase, por ejemplo, la patente de Estados unidos Nº 5.378.814) y este antígeno también se puede usar convenientemente en la presente composición y procedimientos. De manera adicional, los antígenos derivados de VBH, tales como el antígeno del núcleo, el antígeno de superficie, sAg, así como las secuencias de pre-superficie, pre-S1 y pre-S2 (denominadas anteriormente pre-S), así como las combinaciones de los anteriores, tales como sAg / pre-S1, sAg/pre-S1 / pre-S2, y pre-S1 / pre-S2, encontrarán uso en esta memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, "HBV Vaccines-from the laboratory to license: a case study" en Mackett, M. y Williamson, J. D. Human Vacinnes and Vaccination, pp. 159-176, para una descripción de la estructura de VBH; y las patentes de Estados unidos números 4.722.840, 5.098.704, 5.324.513, Beames y col., J. Virol (1995) 69:6833-6838, Birnbaum y col., J. Virol(1990) 64: 3319 - 3330; y Zhou y col., J. Virol. (1991) 65: 5457 - 5464.
Los antígenos derivados de otros virus también encontrarán uso en las composiciones y procedimientos reivindicados, tales como sin limitación, proteínas de miembros de las familias Piconaviridae (por ejemplo, virus de la polio); Caliciviridae; Togaviridae (por ejemplo, virus de rubéola, virus del dengue, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhaboviridae (por ejemplo, virus de la rabia, etc); Filoviridae; Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincitiales respiratorios, etc); Ortomixoviridae (por ejemplo, virus de la gripe tipos A, B y C, etc.); Buniaviridae; Arenaviridae; Retroviridae (por ejemplo, VLTH-I; VLTH-II; VIH-1 (también conocidos como VLTH-III, VAL, VRA, hTLR, etc)), incluyendo pero sin limitación a antígenos de los aislamientos VIH_{IIIb}, VIH_{SF2}, VIH_{LAV}, VIH_{LAI}, VIH_{MN}); VIH-1_{CM235}, VIH-1_{US4}, VIH-2; virus de inmunodeficiencia se simio (VIS) entre otros. De manera adicional, los antígenos también se pueden derivar de papilomavirus humano (VPH) y los virus de encefalitis que llevan las garrapatas. Véase, por ejemplo, Virology, 3ª edición (W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2ª edición (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds. 1991), para una descripción de estos y otros virus.
Más particularmente, se conocen y se reseñan las proteínas de la envuelta gp120 de cualquiera de los aislamientos anteriores, incluyendo miembros de los diversos subtipos genéticos de VIH, (véase, por ejemplo, Myers y col., Los Álamos Database, Los Álamos National Laboratory, Los Álamos, Nuevo México (1992); Myers y col., Human Retroviruses and Aids, 1990, Nuevo México: Los Älamos National Laboratory; y Modrow y col., J. Virol (1987) 61:570-578, para una comparación de las secuencia de la envuelta de una diversidad de aislamientos de VIH) y antígenos derivados de cualquiera de estos aislamientos encontrarán uso en los procedimientos presentes. Además, la invención es igualmente aplicable a otras proteínas inmunogénicas derivadas de cualquiera de los diversos aislamientos de VIH, incluyendo cualquiera de las diversas proteínas de la envuelta tales como qp160 y gp41, antígenos gag tales como p24gag y p55gag, así como las proteínas derivadas de la región pol.
El virus de la gripe es otro ejemplo de in virus para el que la presente invención será particularmente útil. Específicamente, las glioproteínas de la envuelta HA y NA de gripe A son de particular interés para generar una respuesta inmune. Se han identificado numerosos subtipos HA de gripe A (Kawaoka y col., Virology (1990) 179:759-767; Webster y col., "Antigenic variation amog type A influenza viruses," p. 128-168. En: P. Palese y D. W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer - Verlag , Nueva York). De este modo, las proteínas derivadas cualquiera de estos aislamientos también pueden ser útiles en las composiciones y procedimientos descritos en esta memoria descriptiva.
Las composiciones y procedimientos descritos en esta memoria descriptiva encontrarán uso con numerosos antígenos bacterianos, talse como los derivados de organismos que provocan difteria, cólera, tuberculosis, tétanos, tos ferina, meningitis, y otros estados patogénicos, incluyendo, sin limitación, Bordetella pertussis, Neisseria meningitides(A, B, C, Y), Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, y Haemophilus influenza. Haemophilus influenza tipo B (HIB), Helicobacter pylori, y las combinaciones de los mismos. Los ejemplos de antígenos de Neisseria meningitides B se describen en las siguientes solicitudes de patente de propiedad común con la presente:
PCT/US99/09346; PCT/ IB98/01665; PCT PCT IB99/00103; y las solicitudes provisionales de Estados Unidos números de serie 60/083.758;60/094.869; 60/098.994; 60/103.749; 60/103.794; 60/103.796; y 60/121.528. Los ejemplos de antígenos parásitos incluyen los derivados de organismos que provocan malaria y enfermedad de Lyme.
Es fácilmente evidente que la invención sujeto se puede usar para distribuir una amplia diversidad de macromoléculas y por lo tanto para tratar, prevenir y /o diagnosticar un gran número de enfermedades. En una realización alternativa, las composiciones de macromoléculas / micropartículas de la presente invención se pueden usar para la distribución dirigida específica del sitio. Por ejemplo, la administración por vía intravenosa de las composiciones de macromoléculas / micropartículas se pueden usar para dirigir el pulmón, hígado, circulación sanguínea, o médula ósea.
La adsorción de macromoléculas a la superficie de las micropartículas adsorbentes (o a microemulsiones de la presente invención) se produce mediante cualquier mecanismo de interacción de enlace, incluyendo, pero sin limitación, enlace iónico, enlace de hidrógeno, enlace covalente, enlace de Van der Waals, y enlace a través de interacciones hirófilas / hirófobas. Los expertos en la técnica pueden fácilmente seleccionar detergentes apropiados para el tipo de macromolécula a adsorber.
Por ejemplo, las micropartículas fabricadas en presencia de detergentes cargados, tales como detergentes aniónicos o catiónicos, pueden producir micropartículas con una superficie que tiene una carga negativa neta o una carga positiva neta, que puede adsorber una amplia diversidad de moléculas. Por ejemplo, micropartículas fabricadas con detergentes iónicos, tales como dodecil sulfato sódico (SDS), es decir, micropartículas SDS-PLG, adsorben antígenos cargados positivamente, tales como proteínas. De manera similar, las micropartículas fabricadas con detergentes catiónicos, tales como bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB), es decir micropartículas CTAB-PLG, adsorben antígenos cargados negativamente, tales como ADN. Cuando las macromoléculas a adsorber tienen regiones de carga positiva y negativa, pueden ser apropiados detergentes o bien catiónicos o aniónicos.
Los polímeros biodegradables para fabricar micropartículas para uso con la presente invención son fácilmente disponibles comercialmente de, por ejemplo, Boehringer Ingelheim, Alemania y Birmingham Polymers, Inc, Birminham, AL. Por ejemplo, los polímeros útiles para formar las micropartículas en esta memoria descriptiva incluyen las derivadas de ácido polihidroxibutírico, policaprolactona, poliortoéster, polianhídrido; así como un poli(\alpha-hidroxi ácido), tal como poli(L-lactida), poli(D, L-lactida) (ambas conocidas como "PLA" en esta memoria descriptiva), poli(hidroxibutirato), copolímeros de D,L-lactida y glicolida, tales como poli(D,L-lactida-co-glicolida) (designada como "PLG" o "PLGA" en esta memoria descriptiva) o un copolímero de D,L-lactida y caprolactona. Los polímeros particularmente preferidos para uso en esta memoria descriptiva son los polímeros de PLA y PLG. Estos polímeros están disponibles en una diversidad de pesos moleculares para un uso dado se determinan fácilmente por los expertos en la técnica. De este modo, por ejemplo, para PLA, un peso molecular adecuado estará en el orden de aproximadamente 2000 a 5000. Para PLG, los pesos moleculares adecuados generalmente variarán entre aproximadamente 10.000 y aproximadamente 200.0000, preferiblemente aproximadamente 15.000 a aproximadamente 150.000, y lo más preferido aproximadamente 50.000 a aproximadamente 100.000.
Si se usa un copolímero tal como PLG para formar las micropartículas, una diversidad de relaciones lactida : glicolida encontrarán uso en esta memoria descriptiva y la relación es en gran medida una materia de elección, dependiendo en parte de la macromolécula coadministrada y la velocidad de degradación deseada. Por ejemplo, un polímero de PLG 50:50, que contiene D,L-lactida al 50% y glicolida al 50%, proporcionará un copolímero de reabsorción rápida mientras que PLG 75 : 25 se degrada más lentamente, y 85 : 15 y 90 : 10, incluso más lentamente, debido a incremento del componente de lactida. Será fácilmente evidente que una relación adecuada de lactida : glicolactida se determina fácilmente por los expertos en la técnica basándose en al naturaleza del antígeno y trastorno en cuestión. Además, en realizaciones de al presente invención en las que un antígeno o adyuvantes están atrapados dentro de las micropartículas, las mezclas de micropartículas con relaciones de lactida:glicolida encontrarán uso en esta memoria descriptiva con el fin de lograr la cinética de liberación deseada para una macromolécula deseada y proporcionar tanto una respuesta inmune primaria y secundaria. La velocidad de degradación de las microparticulas de la presente invención también se pueden controlar mediante factores tales como peso molecular del polímero y cristalinidad del polímero. Los copolímeros de PLG con relaciones variables de lactida : glicolida y pesos moleculares son fácilmente disponibles comercialmente de un número de fuentes que incluyen Boehringer Ingelheim, Alemania y Birmingham Polymers, Inc, Birminham, AL.. Estos polímeros también se pueden sintetizar mediante simple condensación del componente de ácido láctico usando técnicas bien conocidas en al técnica, tales como las descritas en Tabata y col., J. Biomed. Mater. Res. (1988) 22:837-858.
Las macromoléculas / micropartículas se preparan usando cualquiera de varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, técnicas de evaporación doble emulsión / disolvente, tales como las descritas en la patente de estados Unidos Nº 3.523.907 u Ogawa y col., Chem. Pharm. Bull (1988) 36:1095-1103, se puede usar en esta memoria descriptiva para preparar las micropartículas. Estas técnicas implican la formación de una emulsión primaria constituida por gotitas de solución de polímeros, que se mezcla posteriormente con una fase acuosa continua que contiene un estabilizante / tensioactivo en partículas.
Como alternativa, se puede usar un sistema de evaporación de disolvente agua en aceite en agua (ag / ac / ag) para formar la micropartículas, como describen O'Hagan y col., Vaccine (1993) 11:965-969 y Jeffery y col., Pharm. Res (1993) 10:362. En esta técnica, el polímero particular se combina con un disolvente orgánico, tal como acetato de etilo, dimetilcloruro (también llamado cloruro de metileno y diclorometano), acetonitrilo, acetona, cloroformo, y similares. El polímero se proporcionará en aproximadamente una solución al 1-30%, preferiblemente aproximadamente al 2-15%, más preferiblemente aproximadamente al 3-10%, y más preferiblemente, aproximadamente al 4%, en disolvente orgánico. La solución de polímero se emulsiona usando, por ejemplo, un homogenizador. Después la emulsión se combina opcionalmente con un gran volumen de una solución acuosa de un estabilizante de emulsión tal como poli (alcohol vinílico) (PVA), polivinilpirrolidona, y un detergente catiónico, aniónico, o no iónico. La emulsión se puede combinar con más de un estabilizante de emulsión y / o detergente, por ejemplo, una combinación de PVA y detergente. Ciertas macromoléculas se pueden adsorber más fácilmente a micropartículas que tienen una combinación de estabilizantes y / o detergentes. Cuando se usa un estabilizador de emulsión, se proporciona típicamente en una solución aproximadamente al 2-15%, más típicamente aproximadamente una solución al 4-10%. En general, se usará una relación de detergente a polímero peso a peso en el intervalo de entre aproximadamente 0,00001 : 1 y aproximadamente 0,1 : 1, más preferiblemente entre aproximadamente 0,0001 : 1 a aproximadamente 0,1 : 1, más preferiblemente entre aproximadamente 0,001 : 1 y aproximadamente 0,01 : 1, e incluso más preferiblemente entre aproximadamente 0,005 : 1 y aproximadamente 0,01 : 1. La mezcla después se homogeniza para producir una emulsión doble estable ag / ac / ag. Después los disolventes orgánicos se evaporan.
Los parámetros de formulación se pueden manipular para permitir la preparación de pequeñas partículas del orden de 0,05 \mum (50 nm) a partículas mayores que 50 \mum o incluso mayores. Véase, por ejemplo, Jeffrey y col., Pharm. Res. (1993) 10:362-368; McGee y col., J. Microencap. (1996). Por ejemplo, la agitación reducida da como resultado mayores micropartículas, como hace un incremento en el volumen de fase interna. Se producen partículas pequeñas mediante volúmenes de fase acuosa con altas concentraciones de estabilizantes de emulsión.
Las micropartículas también se pueden formar usando secado por pulverización y conservación como se describe en, por ejemplo, Thomasin y col., J. Controlled Release (1996) 41: 131, patente de Estados Unidos Nº 2.800.457; Masters, K. (1976) Spray Drying 2ª edición, Wiley, Nueva York; técnicas de revestimiento por suspensión en aire, tales como revestimiento en cubeta y revestimiento Wurster, como describen Hall y col., (1980) The "Wurster Processs" en Controlled Release Technologies: Methods, Theory, And Applications (A. F. Kydonieus, ed), vol. 2, pp. 133-154 CRC Press, Boca Ratón, Florida y Deasy, P. B., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst (1988) S (2): 99-139; y gelación iónica como describen, por ejemplo, Lim y col., Science (1980) 210: 908-910.
El tamaño de partícula se puede determinar mediante, por ejemplo, dispersión de luz lásr, usando por ejemplo, un espectrofotómetro que incorpora un láser de helio-neón. En general, el tamaño de partícula se determina a temperatura ambiente e implica análisis múltiple de la muestra en cuestión (por ejemplo, 5-10 veces) para producir un valor medio para el diámetro de la partícula. El tamaño de partícula también se determina fácilmente usando microscopía electrónica de barrido (SEM).
Una realización alternativa de la presente invención es una preparación de micropartículas que comprende emulsiones submicrónicas con tensioactivos iónicos. MF59 u otras se pueden usar como la partícula de base, mientras que los tensioactivos iónicos pueden incluir, pero sin limitación, dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP, dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DEPC) y ácido dioleoil-fosfatídico (DPA) cada uno de los cuales es soluble en escualeno. La emulsiones iónicas prototípicas se pueden formular disolviendo cada uno de los detergentes en escualeno / Span 85 al 10% a concentraciones que varían entre 4-52 mg/ml de escualeno. Las mezclas de escualeno / tensioactivo se pueden emulsionar con Tween 80 al 0,5% /H_{2}O a 5 ml de escualeno / 100 ml de H_{2}O. Una pre-emulsión se puede formar mediante homogenización con un homogenizador Silveron (5 minutos, 5000 rpm) y las emulsiones finales se pueden preparar mediante microfluidificación (aproximadamente 10.000 psi (68948 kPa), 5 pases, microfluidoficador 110S).
Después de la preparación, las micropartículas se pueden almacenar como está o secada por congelación para uso futuro. Con el fin de adsorber las macromoléculas a las micropartículas, la preparación de micropartículas se mezcla simplemente con la macromolécula de interés y la formulación resultante se puede liofilizar otra vez antes de uso. En general, las macromoléculas se añaden a las micropartículas para producir micropartículas con macromoléculas adsorbidas que tienen una relación peso a peso de entre aproximadamente 0,0001 : 1 a 0,25 : 1 de macromoléculas a micropartículas, preferiblemente 0,001 : 1 a 0,1, más preferiblemente 0,1 a 0,5. El contenido en macromoléculas de las micropartículas se puede determinar usando técnicas convencionales.
Las micropartículas de la presente invención puede tener macromoléculas atrapadas o encapsuladas entro de ellas, así como teniendo macromoléculas adsorbidas en ellas. De este modo, por ejemplo, los expertos en la técnica pueden preparar de acuerdo con la invención micropartículas que tienen adyuvantes encapsulados con proteínas adsorbidas en ellas, o micropartículas que tienen proteínas encapsuladas con adyuvantes adsorbidas en ellas.
Una vez que las micropartícuas adsorbidas en macromoléculas se producen, se formulan en composiciones farmacéuticas o vacunas, para tratar, prevenir y / o diagnosticar una amplia diversidad de trastornos, como se ha descrito anteriormente. Las composiciones generalmente incluirán uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables tales como agua, solución salina, glicerol, polietilenglicol, ácido hialurónico, etanol, etc. De manera adicional, se pueden presentar en tales vehículos, sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponación biológicas, y similares. Un tampón biológico puede ser virtualmente cualquier solución que es farmacológicamente aceptable y que proporciona la formulación con el pH deseado, por ejemplo, un pH en el intervalo fisiológico. Los ejemplos de soluciones tampón incluyen soluciones salinas, solución salina tamponada con fosfato solución salina tamponada con Tris, solución salina tamponada de Hank, y similares.
Se pueden usar adyuvantes para potenciar la eficacia de las composiciones farmacéuticas. Los adyuvantes se pueden administrar simultáneamente con las micropartículas de la presente invención, por ejemplo, en la misma composición o en composiciones separadas. Como alternativa, se puede administrar un adyuvante antes o después de las composiciones de micropartículas de al presente invención. En otra realización, el adyuvante, tal como un adyuvante inmunológico, se puede encapsular en al micropartícula. Los adyuvantes, como cualquier macromolécula, se pueden encapsular dentro de las micropartículas usando cualquiera de los varios procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 3.523.907; Ogawa y col., Chem Pharm. Bull. (1988) 36:1095-1103; O'Hagan y col., Vaccine(1993) 11:965-969 y Jeffery y col., Pharm. Res (1993) 10:362. Como alternativa, los adyuvantes se pueden adsorber sobre la micropartícula como se ha descrito anteriormente para cualquier micropartícula. Como alternativa, los adyuvantes pueden comprender las emulsiones de gotitas de aceite de la presente invención.
Los adyuvantes inmunológicos incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio (alúmina), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsiones aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como muramil péptidos (véase más adelante) o componente de las paredes celulares bacterianas), tales como por ejemplo (a) MF59 (publicación internacional Nº WO 90/14837), que contiene escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5%, Span 85 al 0,5% (conteniendo opcionalmente diversas cantidades de MTP - PE (véase más adelante), aunque no requerido) formulada en partículas submicrónicas usando un microfluidificador tal como el microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero L121 bloqueado con pluronic al 5%, y thr-MDP (véase más adelante) o bien microfluidificado en una emulsión submicrónica o agitada en un aparato vortex para generar una emulsión de tamaño de partícula superior, y (c) sistema de adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Inmunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2%, y uno o más componentes de la pared bacteriana del grupo constituido por monofosforilípido A (MLP), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de la pared bacteriana (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox™) (para una descripción adicional de las emulsiones aceite en agua submicrónicas adecuadas para uso en esta memoria descriptiva, véase la solicitud de patente de propiedad común con la presente Nº 09/015.736, presentada el 29 de enero de 1998); (3) adyuvantes de saponina, tales como Quil A, o QS21 (por ejemplo, Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA)) se puede usar o partícula generada de los mismos tales como los ISCOM (complejos inmunoestimulantes); (4) adyuvante completo de Freunds (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (5) ciqoquinas, tales como interleuquinas (IL - 1, IL - 2, etc.), factor estimulador de colonias de macrófagos (M - CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; (6) mutantes detoxificados de una toxina ribosilante de ADP bacteriana tal como una toxina de cólera (CT), una toxina de tos ferina (PT), o una toxina lábil al calor de E. coli (LT), particularmente LT - K63 (en la que la lisina está sustituida por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 63) LT - R72 (en la que la arginina está sustituida por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 72), CT - S109 (en la que la serina está sustituida por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 109), y PT - K9/G129 (en la que la lisina está sustituida por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 9 y glicina sustituida en la posición 129) (véase, por ejemplo, las publicaciones internacionales números WO 93/13202 y WO 92/19265); (7) oligonucleótidos CpG y otras secuencias inmunoestimulantes (ISS); y (8) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para potenciar la eficacia de la composición. Se prefieren alúmina y MF59.
Los muramil péptidos incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilnormuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-(1'-2'-
dipalmitoil- sn- glicero-3-hidroxifosforiloxi)etilamina (MTP-PE), etc.
Para ejemplos adicionales de adyuvantes, véase, por ejemplo Vaccine Design, The Subunit and the Adjuvant Approach, Powell, M. F. y Newman, M. J., eds., Plenum Press, 1995).
Las composiciones comprenderán una "cantidad terapéuticamente eficaz" de la macromolécula de interés. Es decir, una cantidad de macromolécula / micropartícula estará incluida en las composiciones que provocarán que el sujeto produzca una respuesta suficiente, con el fin de prevenir, reducir, eliminar o diagnosticar síntomas. La cantidad exacta necesariamente variará, dependiendo del sujeto que se está tratando; la edad y condición general del sujeto a tratar; la gravedad de la afección que se está tratando; en el caso de una respuesta inmunológica, la capacidad del sistema inmune del sujeto para sintetizar anticuerpos; el grado de protección deseada y el antígeno particular seleccionado y su modo de administración , entre otros factores. Una cantidad apropiada eficaz se puede determinar eficazmente por los expertos en la técnica. De este modo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" caerá en un intervalo relativamente grande que se puede determinar mediante ensayos rutinarios. Por ejemplo, para el propósito de la presente invención, cuando la macromolécula es un polinucleótido, una dosis eficaz típicamente variará entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 1 mg, más preferiblemente entre aproximadamente 10 ng y aproximadamente 1 \mug, y lo más preferiblemente aproximadamente 50 ng a aproximadamente 500 ng de la macromolécula distribuida por dosis; cuando la macromolécula es un antígeno, una dosis eficaz típicamente variará entre aproximadamente 1 \mug y aproximadamente 100 mg, más preferiblemente entre aproximadamente 10 \mug y aproximadamente 1 mg, y lo más preferiblemente aproximadamente 50 \mug a aproximadamente 500 \mug de la macromolécula distribuida por dosis.
Una vez formulada, las composiciones de la invención se pueden administrar por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección. Las composiciones se pueden inyectar o bien por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular. Otros modos de administración incluyen administración nasal, oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas. El tratamiento por dosificación puede ser un programa de dosis individual o programa de dosis múltiple. Un programa de dosis múltiple es uno que en un primer curso de administración puede ser con 1 - 10 dosis separadas, seguido de otras dosis proporcionadas a intervalos de tiempo posteriores, elegidos para mantener y / o reforzar la respuesta terapéutica, por ejemplo 1 - 4 meses para una segunda dosis, y si es necesario, una (s) dosis posteriores después de varios meses. El régimen de dosificación variará también, al menos en parte, se determinará mediante la necesidad del sujeto y ser dependiente del juicio del facultativo.
Además, si se desea la prevención de la enfermedad, las macromoléculas en las vacunas, se administran en general antes de la infección primaria con el patógeno de interés. Si se desea tratamiento, por ejemplo, la reducción de síntomas o recurrencias, las macromoléculas se administran generalmente después de la infección primaria.
2. Emulsiones de gotitas de aceite
En otra realización de la presente invención, la emulsión de gotitas de aceite se prepara comprendiendo un aceite metabolizable y un agente emulsionante. Las moléculas tales como un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CpG se puede combinar con la emulsión de gotitas de aceite para formar un adyuvante. La emulsión de gotitas de aceite preferiblemente comprende una aceite metabolizable y en agente emulsionante, en el que el aceite y el agente emulsionante están presentes en la forma de una emulsión aceite en agua que tiene dotitas de aceite sustancialmente todas las cuales tienen menos de un micrómetro de diámetro. Tales gotitas muestran una superioridad sorprendente sobre composiciones de adyuvantes que contienen aceite y agentes emulsionantes en los que las gotitas de aceite son significativamente mayores que las proporcionadas por la presente invención. En realizaciones preferidas, la emulsión está positivamente cargada como resultado de un detergente catiónico que se usa como agente emulsionante, o como alternativa, contiene detergente catiónico separado del agente emulsionante. Esto permite la adsorción de moléculas antigénicas de nucleótidos, tales como oligonucleótidos CpG o ADN viral. Como alternativa, el uso de un detergente aniónico permite la adsorción de moléculas tales como proteínas.
Aunque los componentes individuales de las composiciones de adyuvantes de al presente invención se conocen, tales composiciones no se han combinado de la misma manera. De acuerdo con lo anterior, los componentes individuales, aunque descritos más adelante tanto en general como en algún detalle por las realizaciones preferidas, se conocen bien en la técnica, y los términos usados en esta memoria descriptiva, tal como aceite metabolizable, agente emulsionante, agente inmunoestimulante, muramil péptido, y muramil péptido lipófilo, son suficientemente conocidos para describir estos compuestos por los expertos en la técnica sin descripción adicional.
Un componente de estas composiciones es un aceite metabolizable, aceite no tóxico, preferiblemente uno de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono incluyendo, pero sin limitación, alcanos, alóquenos, alquinos, y sus correspondientes ácidos y alcoholes, los éteres y ésteres de los mismos, y las mezclas de los mismos. El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o aceite preparado sintéticamente que los puede metabolizar el cuerpo del animal huésped al que se administrará el adyuvante y que no es tóxico para el sujeto. El animal huésped es típicamente un mamífero, y preferiblemente un ser humano. El aceite mineral y aceites destilados de petróleo tóxicos similares se excluyen expresamente de esta invención.
El componente oleoso de esta invención también puede ser alcano, alqueno,o alquilo de cadena larga, o un ácido o alcohol derivado de los mismos o bien como el ácido libre, su sal o un éster tal como un mono-, o, di-o triéster, tal como los triglicéridos y ésteres de 1,2-propanodiol o alcoholes polihidroxílicos similares. Los alcoholes se pueden acilar empleando ácido amino- o polifuncional, por ejemplo ácido acético, ácido propiónico, ácido cítrico o similares. Los éteres derivados de alcoholes de larga cadena que son aceites y cumplen los otros criterios expuestos en esta memoria descriptiva también se pueden usar.
El resto alcano, alqueno o alquino individual y sus derivados de ácido o de alcohol generalmente tendrán aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono. El resto puede tener una estructura de cadena lineal o ramificada. Puede ser completamente saturado o tener uno o más dobles o triples enlaces. Cuando se emplean aceites basados en mono o poli éster o éter, la limitación de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono se aplica a los restos de ácido graso individual o alcohol graso, no el número de carbonos total.
Cualquier aceite metabolizable, particularmente de una fuente animal, pescado o vegetal, se puede usar en esta memoria descriptiva. Es esencial que el aceite se metabolice por el huésped al que se administra, o de otra manera el componente oleoso puede provocar abscesos, granulomas o incluso carcinomas, o (cuando se usa en la práctica veterinaria) puede hacer la carne de aves vacunadas y animales inaceptables para consumo humano debido el efecto perjudicial que el aceite no metabolizado puede tener sobre el consumidor.
Las fuentes ejemplares para aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de coco, y aceite de oliva, la mayoría comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de nuez. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de granos, también se puede usar aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero el aceite de otros granos de cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, tritical y similares.
La tecnología para obtener aceites vegetales está bien desarrollada y bien conocida. Las composiciones de estos y otros aceites similares se pueden encontrar en, por ejemplo, el Merck Index, y materiales fuente en alimentos, nutrición y tecnología de alimentos.
Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no se produce naturalmente en los aceites de semillas, se pueden preparar mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de los aceites de nueces y semillas. Estos productos están comercialmente disponibles bajo el nombre de NEOBEE® de PVO International, Inc., Chemical Specialities Division, 416 Division Street, Boongon, NJ, y otros.
Los aceites de cualquier fuente animal también se pueden emplear en los adyuvantes y composiciones inmunogénicas de esta invención. Los aceites animales y grasas son usualmente sólidos a temperaturas fisiológicas debido al hecho de que existen como triglicéridos y tienen un grado mayor de saturación que los aceites de pescado y vegetales. Sin embargo, los ácidos grasos se pueden obtener a partir de grasas animales mediante saponificación parcial o completa de triglicérido que proporciona los ácidos grasos libres. Las grasas y aceites de leche de mamíferos se pueden metabolizar y por lo tanto se pueden usar en la práctica de esta invención. Los procedimientos para separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros a partir de fuentes animales se conocen bien en la técnica.
La mayoría de los pescados contienen aceites metabolizables que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, aceite de hígado de bacalao, aceites de hígado de tiburón, y aceite de ballena tal como espermaceti ejemplifican varios de los aceites de pescado que se pueden usar en esta memoria descriptiva. Un número de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y se denominan en general terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide ramificado, no saturado conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno que se prefiere particularmente en esta memoria descriptiva. El escualeno, el análogo saturado a escualeno es también un aceite particularmente preferido. Los aceites de pescado, que incluyen escualeno y escualano, están fácilmente disponibles a partir de fuentes comerciales o se pueden obtener mediante procedimientos conocidos en la técnica.
El componente oleoso de estos adyuvantes y composiciones inmunogénicas estarán presentes en una cantidad entre aproximadamente 0,5% y aproximadamente 20% por volumen pero preferiblemente no más que aproximadamente 15%, especialmente en una cantidad entre aproximadamente 1% y aproximadamente 12%. Lo más preferido es usar entre aproximadamente 1% y aproximadamente 4% de aceite.
La porción acuosa de estas composiciones de adyuvantes es preferiblemente solución salina tamponada o, más preferiblemente, agua no adulterada. Debido a que estas composiciones se proponen para administración parenteral, es preferible preparar soluciones tamponadas finales usadas como composiciones inmunogénicas de manera que la tonicidad, es decir, la osmolaridad, sea esencialmente la misma que los fluidos fisiológicos normales con el fin de prevenirle hinchazón después de la administración o adsorción rápida de las composiciones debido a las concentraciones de iones diferenciales entre las composiciones y los fluidos fisiológicos. También es preferible tamponar la solución salina con el fin de mantener el pH compatible con las condiciones filológicas normales. También, en ciertos casos, puede ser necesario mantener el pH a un nivel particular con el fin de asegurar la estabilidad de ciertos componentes de la composición tales como los glicopéptidos.
En esta memoria descriptiva se puede usar cualquier tampón fisiológicamente aceptable, pero se prefieren los tampones fosfato. Otros tampones aceptables tales como acetato, tris, bicarbonato, carbonato, o similares se pueden usar como sustitutos por tampones fosfato. El pH del componente acuoso estará preferiblemente entre aproximadamente 6,0 - 8,0.
Sin embargo, cuando la microemulsión se prepara inicialmente, se prefiere agua no adulterada como componente acuoso de la emulsión. Incrementando la concentración de sal hace más difícil lograr el tamaño de gota pequeño deseado. Cuando las composiciones finales inmunogénicas finales se prepara a partir del adyuvante, el material antigénico se puede añadir en un tampón a una osmolaridad apropiada para proporcionar la composición inmunogénica deseada.
La cantidad del componente acuoso empleado en esats composiciones será la cantidad necesaria para llevar el valor de la composición hasta la unidad. Es decir, una cantidad de componente acuoso suficiente para hacer que el 100% se mezcla, con los otros componentes enumerados anteriormente, con el fin se llevar las composiciones a volumen.
Se usan generalmente un número sustancial de agentes emulsionantes y de suspensión en las ciencias farmacéuticas. Éstos incluyen materiales derivados naturalmente tales como gomas de árboles, proteína vegetal, polímeros basados en azúcar tales como alginatos y celulosa, y similares. Ciertos oxipolímeros o polímeros que tienen un sustituyente hidróxido u otro hidrófilo sobre al estructura central de carbono tienen actividad tensioactiva, por ejemplo, povidona, poli (alcohol vinílico), y compuestos mono- y poli-funcionales basados en éter. Los compuestos derivados de ácidos grasos de cadena larga forman un tercer grupo sustancial de agentes emulsionantes y de suspensión que se podrían usar en esta invención. Cualquiera de los tensioactivos anteriores son útiles mientras que no sean tóxicos.
Los ejemplos específicos de agentes emulsionantes adecuados (también denominados tensioactivos o detergentes) que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyen los siguientes:
1.
Jabones solubles en agua, tales como las sales de sodio, potasio, amonio y alcanol amonio de ácidos grasos superiores (C_{10}-C_{22}) y, particularmente jabones de sebo de potasio y de coco.
2.
Los detergentes no jabones sintéticos aniónicos, que se pueden representar por las sales solubles en agua de productos de reacción de ácido sulfúrico orgánicos que tienen en su estructura molecular un radical alquilo que contiene entre aproximadamente 8 y aproximadamente 22 átomos de carbono y un radical seleccionado entre el grupo constituido por radicales éster de ácido sulfónico y ácido sulfúrico. Los ejemplos de éstos son alquilsulfatos de sodio o potasio, derivados de aceite de sebo o de coco; alquilbencenosulfonatos de sodio o potasio; alquil gliceril éter sulfonatos sódicos; monoglicérido sulfonatos y sulfatos de ácidos grasos de coco de sodio; sales de sodio y potasio de ésteres de ácido sulfúrico del producto de reacción de un mol de un alcohol graso superior y aproximadamente 1 a aproximadamente 6 moles de óxido de etileno; alquil fenol óxido de etileno éter sulfonatos de sodio o potasio, con 1 a aproximadamente 10 unidades de óxido de etileno por molécula y en los que los radicales alquilo contienen entre aproximadamente 8 y aproximadamente 12 átomos de carbono; el producto de reacción de ácidos grasos esterificados con ácido isetiónico y neutralizados con hidróxido sódico; sales de sodio o potasio de amidas de ácidos grasos de una taurida de metilo; y sales de sodio y potasio de \alpha-olefinas de C_{10}-C_{24} sulfonadas por SO_{3}-.
3.
Detergentes sintéticos no iónicos preparados mediante la condensación de grupos de óxido de alquileno con un compuesto orgánico hidrófobo. Los Grupos hidrófobos típicos incluyen productos de condensación de óxido de propileno con propilenglicol, alquilfenoles, producto de condensación de óxido de propileno y etilendiamina, alcoholes alifáticos que tienen aproximadamente 8 a aproximadamente 22 átomos de carbono, y amidas de ácidos grasos.
4.
Detergentes no iónicos, tales como óxidos de aminas, óxidos de fosfina y sulfóxidos, tienen características semipolares. Los ejemplos específicos de óxidos de aminas terciarias de cadena larga incluyen óxido de dimetildodecilamina y bis-(2-hidroxietil) dodecilamina. Los ejemplos específicos de de óxidos de fosfina se encuentran en la patente de Estados Unidos Nº 3.304.263 que se expidió el 14 de febrero de 1967, e incluyen óxido de dimetildodecilfosfina y óxido de dimetil-(2-hidroxidodecil) fosfina.
5.
Los sulfóxidos de cadena larga, que incluyen los correspondientes a la fórmula R^{1}-SO-R^{2} en la que R^{1} y R^{2} son radicales alquilo sustituidos o ono sustituidos, los anteriores conteniendo entre aproximadamente 10 y aproximadamente 28 átomos de carbono, mientras R^{2} contiene entre 1 y aproximadamente 3 átomos de carbono. Los ejemplos específicos de estos suslfóxidos incluyen sulfóxido de dodecilmetilo y sulfóxido de 3-hidroxi tridecil metilo.
6.
Los detergentes sintéticos anfolíticos, tales como 3-dodecilaminopropionato de sodio y 3-dodecilaminopropano sulfonato de sodio.
7.
Los detergentes sintéticos de iones bipolares, tales como 3-(N,N-dimetil-N-hexadecilamonio)propano-1-sulfonato y 3-(N,N-dimetil-N-hexadecilamonio)-2-hidroxipropano-1-sulfonato.
Adicionalmente, todos los tipos siguientes de agentes emulsionantes se pueden usar en una composición de la presente invención: (a) jabones (es decir, sales alcalinas) de ácidos grasos, ácidos de colofonia, y aceite de bogol; (b) alquil areno sulfonatos; (c) sulfatos de alquilo, incluyendo tensioactivos con grupos hidrófobos tanto de cadena lineal como ramificada, así como grupos sulfato primarios y secundarios; (d) sulfatos y sulfonatos que contienen un enlace intermedio entre los grupos hidrófobos e hidrófilos, tales como metil taurinas aciladas grasas y monoglicéridos grasos sulfatados; (e) ésteres de ácidos de cadena larga de polieteilen glicol, especialmente ésteres de aceite de bogol; (f) éteres de polietilenglicol de alquilfenoles; (g) éteres de polietilenglicol de alcoholes de cadena larga y mercaptanos; y (h) acildietanolamidas grasas. Ya que los tensioactivos se pueden clasificar en más de una manera, un número de clases de tensioactivos expuestos en este párrafo se sobreponen con clases de tensioactivos descritos
previamente.
Existe un número de agentes emulsionantes específicamente diseñados para y comúnmente usados en situaciones biológicas. Por ejemplo, se enumeran un número de detergentes biológicos (tensioactivos) tales como por Sigma Chemical Company en la página 310 - 316 de su catálogo de 1987 de compuestos bioquímicos y orgánicos. Tales tensioactivos se dividen en cuatro tipos básicos; aniónico, catiónico, bipolar, y no iónico. Los ejemplos de detergentes aniónicos incluyen, pero no se limitan a, ácido algínico, ácido caprílico, ácido cólico, ácido 1-decanosulfónico, ácido desoxicólico, ácido 1-dodecanosulfónico, N-lauroilsarcosina, y ácido taurocólico, y similares. Los detergentes catiónicos incluyen, pero no se limitan a, cetrimida (bromuro de hexadecil trimetilamonio - - CTAB), cloruro de benzalconio, bromuro de dimetil dioctodecil amonio (DDA), DOTAP, bromuro de dodeciltrimetilamonio, cloruro de bencildimetilhexadecilamonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de metilbencetonio, y sulfato de 4-picolin dodecilo, y similares. Los ejemplos de detergentes bipolares incluyen, pero no se limitan a, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato (comúnmente abreviado como CHAPS), 3-[cloramidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato (generalmente abreviado CHAPSO) N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1- propanosulfonato, y liso-\alpha-fosfatidilcolina, y similares. Los ejemplos de detergentes no iónicos incluyen, pero no se limitan a, decanoil-N-metilglucamida, dietilenglicol monopentil éter, n-dodecil \beta-D-glucopiranósido, condensados de óxido de etileno de alcoholes grasos (por ejemplo, vendido bajo el nombre comercial Lubrol), éteres de polioxietileno de ácidos grasos (particularmente ácidos grasos C_{12}-C_{20}), éteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán (por ejemplo, vendido bajo el nombre comercial Tween), y éteres de ácidos grasos de sorbitán (por ejemplo, vendido bajo el nombre comercial Span), y similares. El componente opcional de las composiciones de adyuvantes que dan como resultado una emulsión cargada positivamente pueden ser, por ejemplo, cualquiera de los detergentes catiónicos descritos anteriormente. Como alternativa, los detergentes catiónicos descritos anteriormente se pueden usar junto con cualquiera de las emulsiones de gotitas de aceite descritas anteriormente con el fin de hacer la emulsión cargada positivamente.
Un grupo particularmente útil de tensioactivos son los tensioactivos no iónicos basados en sorbitán. Estos tensioactivos se preparan mediante deshidratación de sorbitol proporcionando 1,4-sorbitán que después se hace reaccionar con uno o más equivalentes de un ácido graso. El resto de ácido graso sustituido se puede además hacer reaccionar con óxido de etileno proporcionando un segundo grupo de tensioactivos.
Los tensioactivos de sorbitán ácido graso sustituido se preparan haciendo reaccionar 1,4-sorbitán con un ácido graso tales como ácido láurico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, o un ácido graso similar de cadean larga proporcionando el monoéster de 1,4-sorbitán, sesquiéster de 1, g-sorbitán o triéster de 1,4-sorbitán. Los nombres comunes para estos tensioactivos incluyen por ejemplo, monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monooleato de sorbitán, sesquiolato de sorbitán, y trioleato de sorbitán. Estosa tensioactivos están comercialmente disponibles bajo el nombre SPAN® o ARLACEL®, usualmente con una designación de letra ó número que distingue entre los diversos sorbitánnos mono-, di- y triéster sustituidos.
Los tensioactivos SPAN® o ARLACEL® son hidrófilos y son generalmente solubles o dispersables en aceite. También son solubles en la mayoría de los disolventes orgánicos. En agua son generalmente insolubles pero sí dispersables. Generalmente estos tensioactivos tendrán un número de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) entre 1,8 y 8,6. Tales tensioactivos se pueden preparar fácilmente mediante medos conocidos en la técnica o están comercialmente disponibles de, por ejemplo, ICI America's Inc., Wilmington, DE balos la marca comercial ATLAS®.
Un grupo relacionado de tensioactivos comprende monoéteres de polioxietilen sorbitán y triésteres de polioxietilen sorbitán. Estos materiales se preparan mediante la adición de óxido de etileno a un monoéter o triéster de 1,4-sorbitán. La adición de polioxietileno convierte el tensioactivo de mono- o triéster de sorbitán lipófilo en un tensioactivo hidrófilo generalmente soluble en aceite dispersable en agua y soluble en grados variables en líquidos orgánicos.
Estos materiales, comercialmente disponibles bajo la marca TWEEN® son útiles para preparar emulsiones y dispersiones aceite en agua o para la solubilización de aceites y preparación de pomadas anhidras solubles en agua o lavables. Los tensioactivos TWEEN® se pueden combinar con tensioactivos monoéter o triéster de sorbitán para promover la estabilidad de la emulsión. Los tensioactivos TWEEN® generalmente tienen un valor de HLB que cae entre 9,6 y 16,7.
Un tercer grupo de tensioactivos no iónicos se pueden usar solos o en combinación con SPAN® , ARLACEL®, y TWEEN® son los ácidos grasos de polioxietileno preparados mediante la reacción de óxido de etileno con un ácido graso de cadena larga. El tensioactivo más comúnmente disponible de este tipo es sólido bajo el nombre de MYRJ® y es un derivado de polioxietileno de ácido esteárico. Los tensioactivos MYRJ® son hidrófilos y solubles o dispersables en agua como los tensioactivos TWEEN®. Los tensioactivos MYRJ® se pueden mezclar con tensioactivos TWEEN®, o con mezclas de tensioactivos TWEEN®/ SPAN® o ARLACEL® para uso en la formación de emulsiones. Los tensioactivos MYJR® se pueden preparar mediante procedimeintos conocidos en la técnica o están comercialmente disponibles de ICI America's Inc.
Un cuarto grupo de tensioactivos basados en polioxietileno son los éteres de ácidos grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurílicos, estearílicos, y oleílicos. Estos materiales se preparan como se ha descrito anteriormente mediante la adición de óxido de etileno a un alcohol graso. El nombre comercial para estos tensioactivos es BRIJ®. Los tensioactivos BRIJ® pueden ser hidrófilos o lipófilos dependiendo del tamaño del resto de polioxietileno en el tensioactivo. Mientras la preparación de estos compuestos está disponible en la técnica, también están fácilmente disponibles de fuentes comerciales tales como ICI America's Inc.
Otros tensioactivos no iónicos que se podrían usar potencialmente en la práctica de esta invención son por ejemplo: polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de poliol, éter de polioxietileno, éteres grasos de polioxipropileno, derivados de cera de abejas que contienen polioxietileno, derivado de polioxietilen lanolina, glicérido graso de polioxietilen, ésteres de ácidos grasos de glicerol u otros alcoholes ácidos de polioxietileno o derivados éter de ácidos grasos de cadena larga de 12-22 átomos de carbono.
Ya que el adyuvante y las composiciones inmunogénicas de esta invención se proponen para que sean sistemas multifase, es preferible elegir un tensioactivo no iónico formador de emulsión que tiene un valor de HLB en el intervalo entre aproximadamente 7 y aproximadamente 16. Este valor se puede obtener mediante el uso de un tensioactivo no iónico individual tal como TWEEN® o se puede lograr mediante el uso de una mezcla de tensioactivos con un tensioactivo basado en mono, di- o triéster de sorbitán; ácido graso de polioxietileno de éster de sorbitán; un éster de sorbitán en combinación con un tensioactivo derivado de polioxietilen lanolina; un tensioactivo de éster de sorbitán en combinación con un tensioactivo de éter graso de polioxietileno de alto HLB; o un tensioactivo de éter graso de polietileno o ácido graso de polioxietilen sorbitán.
Se prefiere más usar un solo tensioactivo no iónico, más particularmente un tensioactivo TWEEN®, como el tensioactivo no iónico estabilizador de la emulsión en la práctica de esta invención. El tensioactivo llamado TWEEN® 80, por lo demás conocidos como polisorbato 80 para monooleato de polioxietilen sorbitán 20, es el más preferido de estos tensioactivos anteriores.
La reducción del tamaño de gotita suficiente se puede usualmente efectuar teniendo el tensioactivo presente en una cantidad de 0,02% a 2,5% por peso (p/p). Se prefiere una cantidad de 0,05% a 1%, siendo especialmente preferido 0,01 a 0,5%.
La manera en la que se alcanza el tamaño de gotita de la invención no es importante para la práctica de la presente invención. Una manera en la que se pueden obtener las gotitas de aceite submicrónicas es mediante el uso de un emulsionante comercial, tal como el modelo número 110Y disponible de Microfluidics, Newton MA. Los ejemplos de otros emulsionantes comerciales incluyen Gaulin modelo 30 CD (Gaulin, Inc., Everett, MA) y Rainnie Minilab tipo 8.30H (Micro Atomizer Food and Daury, Inc., Hudson, WI). Estos emulsionantes actúan mediante el principio de altas fuerzas de cizalla desarrolladas forzando los fluidos a través de pequeñas aberturas a alta presión. Cuando el modelo 110Y se maneja a 5.000-30.000 psi (34474-206842 kPa), se proporcionan gotitas de aceite que tienen diámetros de 100-750 nm.
El tamaño de las gotitas de aceite se puede variar cambiando la relación de detergente a aceite (incrementando la relación disminuye el tamaño de gotita, presión de actuación (el incremento de la presión de actuación reduce el tamaño de la gotita), temperatura (el incremento de la temperatura disminuye el tamaño de la gotita), y la adición de un agente inmunoiestimulante anfipático (la adición de tales agentes disminuye el tamaño de la gotita). El tamaño de gota real variará con el detergente, aceite, y agente inmunoestimulante (si lo hay) particular y con las condiciones de actuación particulares seleccionadas. El tamaño de gotita se puede verificar mediante el uso de instrumentos de medida, tales como el analizador de partículas submicrónicas comercial (modelo N4MD) fabricado por la Coulter Corporation, y los parámetros se pueden variar usando las directrices expuestas anteriormente hasta que sustancialmente todas las gotitas sean menores que 1 micrómetro de diámetro, preferiblemente menor que 0,8 micrómetros de diámetro, y lo más preferiblemente menor que 0,5 micrómetros de diámetro. Por sustancialmente toso es se entiende al menos aproximadamente 80% (en número), preferiblemente al menos aproximadamente 90% (en número) y lo más preferiblemente al menos 98%. La distribución del tamaño de partícula es típicamente de tipo Gauss, de manera que el diámetro medio es más pequeño que los límites establecidos.
La presente invención se puede preferiblemente poner en práctica preparando una emulsión en aceite en ausencia de otros componentes previamente descritos en la técnica anterior para usarse con emulsiones submicrónicas para inmunidad satisfactoria, llamados polímeros de bloque de polioxipropileno-polioxietileno tales como los descritos para uso con adyuvantes en las patentes de Estados Unidos números 4.772.466 y 4.770.874 y en la solicitud de patente europea 0 315 153 A2.
Una composición de microemulsión de la invención pide comprender un aceite metabolizable en agua y un agente emulsionante distinto de un copolímero POP - POE. El agente emulsionante necesita no tener ninguna actividad inmunoestimulante específica, ya que la composición de aceite por sí misma puede funcionar como un adyuvante cuando las gotitas de aceite están en el intervalo submicrónico. Sin embargo, se puede conseguir actividad inmunoestimulante aumentada incluyendo cualquiera de los agentes inmunoestimulantes conocidos en la composición. Estos agentes inmunoestimulantes pueden o bien estar separados del agente emulsionante y del aceite o el agente inmunoestimulante y el agente emulsionante pueden ser uno en la misma molécula. Los ejemplos de la situación anterior incluyen aceites metabolizables mezclados con micobacterias muertas, tales como Mycobacterium tuberculosis, y los componentes subcelulares de la misma. Las sustancias inmunoestimulantes adicionales incluyen los muramil péptidos que son componentes de las paredes celulares de tales bacterias, e incluyen derivados de las mismas. Los ejemplos de la unión de agente emulsionante / agente inmunoestimulante son los muramil péptidos lipófilos descritos anteriormente descritos en Sánchez - Pescador y col., J. Immunol., 1988, 141, 1720 – 1727, cuya descripción se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad. Estos materiales comprenden el N-acetilmuramil péptido básico (un resto hidrófilo) que actúa como un grupo inmunoestimulante, pero también incluye un resto lipófilo que proporciona características tensioactivas al compuesto resultante. Tales compuestos. así como otros tipos de sustancias inmunoestimulantes antipáticas, actúan como tanto agentes inmunoestimulantes como agentes emulsionantes y se prefieren en la práctica de la presente invención. Además, también es posible poner en práctica la presente invención usando una sustancia inmunoestimulante antipática en combinación con una segunda sustancia inmunoestimulante en combinación con una segunda sustancia inmunoestimulante que no es antipática. Un ejemplo sería usar un muramil péptido lipófilo en combinación con un muramil dipéptido esencialmente no sustituido (es decir, esencialmente hidrófilo).
Una emulsión de gotitas de aceite preferida es MF59. La MF59 se puede preparar de acuerdo con los procedimientos descritos en, por ejemplo, Ott y col., Vaccine Design: The Subunit And Adjuvant Approach, 1995, M. F. Powell y M. J. Newman, Eds., Plenum Press, Nueva York, p. 277 - 296; Singh y col., Vaccine, 1998, 16, 1822 - 1827; Ott y col., Vaccine, 1995, 13, 1557 - 1562; y Valensi y col., J. Immunol., 1994, 153, 4029 - 39.
Otras emulsiones de gotitas de aceite incluyen, por ejemplo, SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero de bloque plurónico L121 al 5%, y thr-MDP o bien microfluidificado en una emulsión submicrónica o agitada en un aparto vortex para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula, y sistema de adyuvante Ribi® (RAS) (Ribi Inmunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2%, y uno o más componentes de la pared bacteriana del grupo constituido por monofosforilípido A (MLP), dimicolato de trahalosa (TDM), y esqueleto de la pared celular (CWS) preferiblemente MPL + CWS (DetoxJ) (para una descripción adicional de emulsiones aceite en agua submicrónicas para uso en esta memoria descriptiva, véase la solicitud de patente, de propiedad común con la presente Nº 09/015.736, presentada el 29 de enero de 1998).
Después de la preparación de la microemulsión de la invención, las macromoléculas se pueden adsorber en ella para incrementar el efecto adyuvante de la microemulsión. El componente adicional de las composiciones de la presente invención preferiblemente es un oligonucleótido que comprende al menos un motivo CpG. Como se usa en esta memoria descriptiva, la frase "motivo CpG" se refiere a una porción de dinucleótido de un oligonucleótido que comprende un nucleótido de citosina seguido de un nucleótido de guanosina. Tales oligonucleótidos se pueden preparar usando la síntesis de oligonucleótidos convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica. Preferiblemente, los oligonucleótidos de la invención comprenden una estructura central modificada, tal como fosforotioato o ácido péptido nucleico, de manera que confiera resistencia a nucleasa al oligonucleótido. Las estructuras centrales modificadas las conocen bien los expertos en al técnica. Los ácidos péptido nucleicos preferidos se describen en detalle en las patentes de Estados Unidos números 5.821.060, 5.789.573, 5.736.392, y 5.721.102, patente japonesa Nº 10231290, patente europea Nº 839.828, y publicaciones PCT números WO 98/42735, WO 98/42876, WO 98/36098, WO 98/27105, WO 98/20162, WO 98/16550, WO 98/15648, WO 98/04571, WO 97/41150, WO 97/39024, y WO 97/38013.
El oligonucleótido preferiblemente comprende entre aproximadamente 6 y aproximadamente 100 nucleótidos, más preferiblemente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 nucleótidos, y lo más preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 nucleótidos. Además los oligonucleótidos de la invención pueden comprender sustituciones de los restos azúcar y restos basados en nitrógeno. Los oligonucleotidos preferidos de describen en, por ejemplo, Krieg y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12631 - 12636, Klinman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879 - 2883, Weiner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 10833 - 10837, Chu y col., J. Exp. Med., 1997, 186, 1623 - 1631, Brazolot - Millan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15553 - 15558, Ballas y col., J. Immunol., 1996, 157, 1840 - 1845, Cowdery y col., J. Immunol., 1996, 156, 4570 - 4575, Halpern y col., Cell. Immunol., 1996, 167, 72 - 78, Yamamoto y col., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866 - 873, Stacey y col., J. Immunol., 1996, 157, 2116 - 2122, Messina y col., J.Immunol., 1991, 147, 1759 - 1764, Yi y col., J. Immunol., 1996, 157, 4918 - 4925, Yi y col., J. Immunol., 1996, 157, 5384 - 5402, Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 4755 - 4761, Roman y col., Nat. Med., 1997, 3, 849 - 854, Davis y col., J. Immunol., 1998, 160, 870 - 876, Lipford y col., Eur., J. Immunol., 1997, 27, 2340 - 2344, Moldovenanu y col., Vaccine, 1988, 16, 1216 - 1224, Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 5898 - 5906, Publicación PCT WO 96/02555, Publicación PCT WO 98/16247, Publicación PCT WO 98/18810, Publicación PCT WO 98/40100, Publicación PCT WO 98/55495, Publicación PCT WO 98/37919, y Publicación PCT WO 98/52581. Se entiende que los nucleótidos de la invención comprenden al menos un motivo CpG pero puede contener una pluralidad de motivos CpG.
Los oligonucleótidos preferidos comprenden secuencias tales como, por ejemplo,
1
la invención, el oligonucleótido comprende un motivo flanqueado por dos purinas en el lado 5' del motivo y dos pirimidinas en el lado 3' del motivo. Sin embargo, se entiende que cualquier oligonucleótido que comprende un motivo CpG se puede usar en la presente invención mientras que el oligonucleótido induzca un incremento de en la estimulación de linfocitos Th1 cuando se combinan con las emulsiones de gotitas de aceite descritas en esta memoria descriptiva.
En otra realización preferida, la macromolécula es ADN inmunogénico o proteína inmunogénica adsorbida en la microemulsión. Tal adsorción crea una microemulsión con un fuerte efecto adyuvante.
La presente invención también se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden las microemulsiones descritas anteriormente con moléculas antigénicas y / o inmunogénicas adsorbidas. Las composiciones de adyuvantes se preparan generalmente a partir de los ingredientes descritos anteriormente antes de combinar el adyuvante con la sustancia antigénica que se usará en la composición inmunogénica. La palabra antígeno o sustancia antigénica se refiere a cualquier sustancia, incluyendo una proteína o proteína-polisarárido, proteína-lipopolisacárido, polisacárido, lipopolisacárido, subunidad viral, virus entero o bacteria entera que, cuando penetra en la corriente sanguínea del animal, o tiene acceso al tejido de tal animal, estimula la formación de anticuerpos específicos y reacciona específicamente in vivo o in vitro con un anticuerpo homólogo. Además, estimula la proliferación de los linfocitos T, preferiblemente los linfocitos Th1, con receptores para el antígeno y puede reaccionar con los linfocitos para iniciar la serie de respuestas denominada inmunidad mediada por células.
Un hapteno está dentro del alcance de esta definición de antígeno. Un hapteno es la porción de una molécula antigénica o complejo antigénico que determina su especificidad inmunológica. Comúnmente, un hapteno es un péptido o polisacárido de antígenos de origen natural. En los antígenos artificiales puede ser una sustancia de bajo peso molecular tal como un derivado de ácido arsanílico. Un hapteno reaccionaré específicamente in vivo o in vitro con anticuerpos homólogos o linfocitos T. Las descripciones alternativas son determinante antigénico, agrupamiento estructural antigénico y agrupamiento hapténico.
En las realizaciones preferidas de la invención, la sustancia antigénica se deriva de un virus tal como, por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la hepatitis B (VBH), virus de la hepatitis C (VCH), virus herpes simples (VHS), citomegalovirus (CMV), virus de la gripe (flu), y virus de la rabia. Preferiblemente, la sustancia antigénica se selecciona entre el grupo constituido por glicoproteína gD de VHS, glicoproteína gp 120 de VIH, y p55 gag de VIH. En otras realizaciones preferidas de la invención, la sustancia antigénica se deriva de una bacteria tal como, por ejemplo, Helicobacter pylori, Haemophilus influenza, cólera, difteria, tétanos, Neisseria meningitidis, y tos ferina. En otras realizaciones preferidas de la invención, las sustancia antigénica es de un parásito tal como, por ejemplo, parásito de malaria. En otra realización preferidas de la invención, el antígeno se adsorbe a la superficie de una micropartícula de al presente invención.
Los antígenos se pueden producir mediante procedimientos conocidos en la técnica o se pueden comprar de fuentes comerciales. Los antígenos dentro del alcance de al presente invención incluyen partículas de virus inactivados enteros, proteínas de virus aislados y subunidades de proteínas, células enteras y bacterias, membrana celular y proteínas de la pared celular, y similares. Algunos antígenos preferidos se describen más adelante.
La rgD2 de virus herpes simplex (VHS) es una proteína recombinante producida en células de ovario de hámster chino. Esta proteína tiene la región de anclaje normal truncada, dando como dando como resultado una proteína glicosilada secretada en medio de cultivo de tejidos. La gD2 se puede purificar en el medio de CHO hasta una pureza mayor que el 90% La env-2-3 de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) es una forma recombinante de la proteína de la envuelta de VIH producida en Saccharomyces cerevisae modificado por ingeniería genética. Esta proteína representa la región proteica entera de gp 120 de VIH pero está no glicosilada y desnaturalizada purificada da partir de la levadura. La gp 120 de VIH es una forma completamente glicosilada, secretada de la gp 120 producida en células de CHO de una manera similar a la gD2 anterior. Los antígenos de VSH adicionales adecuados para uso en composiciones inmunogénicas se describen en las publicaciones PCT WO 85/04587 y WO 88/02634. Se prefieren particularmente las mezclas de antígenos gB y gD, que son antígenos de superficie truncados carecen de regiones de anclaje.
Los antígenos de la gripe adecuados para uso en composiciones inmunogénicas están comercialmente disponibles. Los antígenos que se pueden usar en los siguientes ejemplos incluyen, pero no se limitan a, FLUOGEN® (fabricado por Parke-Davis), Duphar (fabricado por Duphar B. V.), y lote A41 de la vacuna de al gripe (fabricado por el Instituto Vaccinogeno Pozzi).
Los antígenos de malaria adecuados para uso en composiciones inmunogénicas se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos número de serie 336.288, presentada el 11 de abril de 1989, y en la patente de Estados Unidos Nº 4.826.957.
Los antígenos de VIH adicionales adecuados para uso en composiciones inmunogénicas se describen en la solicitud de Estados Unidos número de serie 490.858, presentada el 9 de marzo de 1990, y la solicitud europea publicada número 181150 (14 de mayo de 1986).
Los antígenos de citomegalovirus adecuados para uso en las composiciones inmunogénicas se describen en patente de Estados Unidos Nº 4.689.225, solicitud de Estados Unidos Nº de serie 367.363, presentada el 16 de junio de 1989 y la publicación PCT WO 89/07143.
Los antígenos de la hepatitis C para uso en las composiciones inmunogénicas se describen en la PCT/US88/04125, la solicitud europea publicada número 318216 (31 de mayo de 1989), solicitud japonesa publicada número 1-500565 presentada el 18 de noviembre de 1988, solicitud canadiense 583.561, y documento EPO 388.232. Un conjunto diferente de antígenos de VCH se describe en la solicitud de patente europea 90/302866.0, presentada el 6 de marzo de 1990, y la solicitud de Estados Unidos Nº 456.637, presentada el 21 de diciembre de 1989, y PCT/US90/01348.
Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden usar para inmunizar aves y mamíferos contra enfermedades e infección, incluyendo sin limitación cólera, difteria, tétanos, tos ferina, gripe, sarampión, meningitis, paperas, peste, poliomielitis, rabia, fiebre maculosa de las montañas rocosas, rubéola, viruela, fiebres tifoideas, tifus, virus de leucemia felino, y fiebre amarilla.
Las composiciones de una composición inmunogénica de la invención emplearán una cantidad eficaz de un antígeno. Es decir, estará incluida en una cantidad de antígeno que, en combinación con el adyuvante, provocará que el sujeto produzca una respuesta específica e inmunológicamente suficiente, preferiblemente una respuesta de linfocitos Th1, de manera que imparta protección al sujeto de la exposición posterior o inmunizada contra virus, bacteria, hongos, micoplasma, parásitos.
No se puede asignar ninguna designación de dosis única que proveerá una guía específica para cada uno de los antígenos que se pueden emplear en esta invención. La cantidad eficaz de antígeno será una función de su actividad y pureza inherente y se determina empíricamente por los expertos en al técnica mediante experimentación rutinaria. Se contempla que las composiciones de adyuvantes de esta invención se pueden usar junto con las composiciones inmunogénicas de células completas o virales así como con antígenos purificados o composiciones inmunogénicas de subunidades de proteína o de péptidos preparados mediante técnicas o síntesis de ADN recombinante. Ya que las composiciones de adyuvantes de al invención son estables, el antígeno y emulsión se puede mezclar mediante agitación sencilla. Otras técnicas, tales como pasar una mezcla del adyuvante y solución o suspensión del antígeno rápidamente a través de una abertura pequeña (tal como aguja hipodérmica) proporciona fácilmente una composición inmunogénica útil.
Las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la presente invención comprenden aproximadamente 1 nanogramo a aproximadamente 1000 microgramos de ácido nucleico, preferiblemente ADN tal como, por ejemplo, oligonucleótidos CpG. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunogénicas contienen aproximadamente 10 nanogramos a aproximadamente 800 microgramos de ácido nucleico. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunogénicas contienen aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 microgramos de ácido nucleico. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunogénicas contienen aproximadamente 1 a aproximadamente 350 microgramos de ácido nucleico. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunogénicas contienen aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de ácido nucleico. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones inmunogénicas contienen aproximadamente 100 microgramos de ácido nucleico. Los expertos en al técnica pueden fácilmente formular una composición inmunogénica que comprende cualquier cantidad deseada de ácido nucleico. Las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la presente invención se proporcionan estériles y sin pirógenos. Las composiciones inmunogénicas se pueden administrar de manera conveniente en forma de dosificación unitaria y pueden preparar mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences. (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980).
La composición de la invención se puede usar en procedimientos de estimulación de una respuesta inmune en un animal huésped administrando la composición en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune. Las vías preferidas de administración incluyen, pero no se limita a , intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraocular y oral así como transdérmica o mediante inhalación o supositorio. Las vías más preferidas de administración incluyen inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la composición inmunogénica se administra a un animal huésped usando un dispositivo de inyección sin aguja, que son bien conocidos y ampliamente disponible. Los expertos en al técnica pueden, siguiendo las enseñanzas en esta memoria descriptiva, usar dispositivos de inyección sin aguja para distribuir las composiciones inmunogénicas a las células de un individuo.
La composición de la invención se puede usar en procedimientos de inmunización de un animal huésped contra una infección viral, bacteriana, o parásita administrando la composición en una cantidad eficaz para inducir una respuesta protectora. El animal huésped es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Las vías de administración se han descrito anteriormente. Aunque el tratamiento profiláctico o terapéutico del animal huésped se puede dirigir a cualquier patógeno, los patógenos preferidos, que incluyen, pero no se limitan a, son patógenos virales, bacterianos y parásitos descritos anteriormente.
La composición de la invención se puede usar en procedimientos de incremento de una respuesta inmune de Th1 en un animal huésped administrando la composición en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune de Th1. El animal huésped es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Las vías de administración se han descrito anteriormente. Los expertos en la técnica son fácilmente familiares con linfocitos Th1 y las respuestas y mediciones de los mismos.
Las micropartículas o microemulsiones con antígenos adsorbidos se pueden usar para generar una respuesta inmune solas, o en combinación una con otra. Es decir la invención abarca micropartículas con antígeno adsorbido, microemulsiones con antígeno adsorbido o molécula inmunoestimulante, y la combinación de micropartículas con antígeno adsorbido junto con microemulsiones con antígeno adsorbido o molécula inmunoestimulante.
Como se demuestra por los siguientes ejemplos, las micropartículas de la presente invención con macromoléculas adsorbidas generan fuertes respuestas inmunes. Adicionalmente, las emulsiones de gotitas de aceite de la presente invención con macromoléculas adsorbidas también generan fuerte respuestas inmunes. La combinación de las micropartículas de la presente invención con macromoléculas adsorbidas y adyuvantes de emulsiones de gotitas de aceite de la presente invención es por lo tanto una potente herramienta para generar respuestas inmunes. La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos que pretenden aclarar la invención. Los siguientes ejemplos significan que ilustran la invención y no se deben considerar que limiten la invención de ninguna manera.
C. Parte Experimental
A continuación están los ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente, y no se pretende que limite el alcance de la invención de ninguna manera.
Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc), pero se permitirá algún error experimental y desviación.
Ejemplo 1 Preparación de micropartículas de blanco usando PVA como estabilizador de emulsiones
Las micropartículas de blanco (por ejemplo, sin macromoléculas adsorbidas o atrapadas) se prepararon usando poli(vinil alcohol) (PVA) como sigue. Soluciones usadas:
(1) RG 504 PLG al 6% (Boehringer Ingelheim) en diclorometano.
(2) Poli (vinil alcohol) al 10% (PVA) (ICN) en agua.
En particular, las micropartículas se prepararon combinando 10 ml de solución de polímeros con 1,0 ml de agua destilada y homogeneizando durante 3 minutos usando un homogeneizador de banco de trabajo Omni con una sonda de 10 mm a 10 K rpm formando una emulsión agua / aceite (ag / ac). La emulsión ag / ac se añadió a 40 ml de la solución de PVA al 10%, y se homogeniza durante 3 minutos, formando una emulsión agua / aceite / agua (ag / ac / ag). La emulsión de ag / ac / ag se dejó en agitación durante toda una noche para la evaporación del disolvente, formando micropartículas. Las micropartículas formadas se lavaron con agua mediante centrifugación 4 veces y se liofilizaron. Después las micropartículas se calibraron en un calibrador Malvern Master para uso futuro.
Ejemplo 2 Preparación de micropartículas de blanco usando CTAB
Las micropartículas de blanco se produjeron usando CTAB como sigue. Soluciones usadas:
(1) RG 504 PLG al 4% (Boehringer Ingelheim) en cloruro de dimetilo.
(2) CTAB al 0,5% (Sigma Chemical Co., San Luis, MO) en agua.
En particular, las micropartículas se prepararon combinando 12,5 ml de solución de polímeros con 1,25 ml de agua destilada y homogeneizando durante 3 minutos usando un homogeneizador de banco de trabajo Omni con una sonda de 10 mm a 10 K rpm formando una emulsión agua / aceite. La emulsión ag / ac se añadió a 50 ml de la solución de CTAB al 0,5%, y se homogeniza durante 3 minutos, formando una emulsión agua / aceite / agua. La emulsión de ag / ac / ag se dejó en agitación durante toda una noche para la evaporación del disolvente, formando micropartículas. Después las micropartículas formadas se filtraron a través de una malla de 38 \mu, se lavaron con agua mediante centrifugación 4 veces y se liofilizaron. Después las micropartículas se calibraron en un calibrador Malvern Master para uso futuro.
Ejemplo 3 Preparación de micropartículas de blanco usando SDS
Las micropartículas de blanco se produjeron usando SDS como sigue. Soluciones usadas:
(1) RG 504 PLG al 6% (Boehringer Ingelheim) en cloruro de dimetilo.
(2) SDS al 1% (Sigma Chemical Co., San Luis, MO) en agua.
En particular, las micropartículas se prepararon combinando 12,5 ml de solución de polímeros con 50 ml de la solución de SDS y homogeneizando durante 3 minutos usando un homogeneizador de banco de trabajo Omni con una sonda de 10 mm a 10 K rpm. La emulsión se dejó en agitación durante toda una noche para la evaporación del disolvente. Las micropartículas formadas se filtraron a través de una malla de 38 \mu, se lavaron con agua mediante centrifugación 4 veces y se liofilizaron. Después las micropartículas se calibraron en un calibrador Malvern Master para uso futuro.
Ejemplo 4 Adsorción de proteínas a micropartículas de blanco
La proteína se adsorbió a las micropartículas como sigue.
A. 1% y 3% de carga teórica de p55 gag
Con el fin de lograr 1% y 3% de cargas teóricas, 50 mg de las micropartículas SDS / PLG de blanco liofilizado como en el ejemplo 3 se colocaron en un tubo de centrífuga Nalgeno y se añadieron 10 ml de tampón borato 25 mM, pH 9, con urea 6 M conteniendo la proteína p55gag (Chiron Corporation, Berkeley, CA): (a) para la carga teórica de 1% se usaron 10 ml de una solución de 50 \mug / ml de p55gag; y (b) para la carga teórica de 3% se usaron 10 ml de una solución de 150 \mug / ml de p55gag. La mezcla se incubó con agitación durante toda una noche a temperatura ambiente. El siguiente día, las micropartículas se centrifugaron y se analizaron para evaluar la carga de proteína mediante hidrólisis básica seguida de un ensayo de bicinconínico (BCA; Pierce, Rockfrod, IL), para determinar la cantidad adsorbida. Las micropartículas se lavaron dos veces con 10 ml de tampón Borato / urea 6 M y dos veces con 30 ml de agua, y se liofilizaron para uso futuro.
B. 1% de carga teórica de antígeno central de VCH
Con el fin de lograr 1% de carga teórica, 50 mg de las micropartículas SDS / PLG de blanco liofilizado como en el ejemplo 3 se colocaron en un tubo de centrífuga Nalgeno y se añadieron 10 ml de tampón citrato 30 mM, pH 6,5, con urea 6 M conteniendo la proteína central de VCH monomérica (10 ml de una solución de 50 \mug / ml de solución de proteína central de VCH; Chiron Corporation, Berkeley, CA). La mezcla se incubó con agitación durante toda una noche a temperatura ambiente. El siguiente día, las micropartículas se contrifugaron y se analizaron para evaluar la carga de proteína mediante hidrólisis básica seguida de un ensayo de bicinconínico (BCA; Pierce, Rockfrod, IL), para evaluar la concentración de VCH y determinar la cantidad adsorbida. Las micropartículas se lavaron dos veces con 30 ml de tampón Borato / urea 6 M y dos veces con 30 ml de agua, y se liofilizaron para uso futuro.
Ejemplo 5 Eficiencia de Adsorción de las micropartículas
Las micropartículas liofilizadas con proteína adsorbida del ejemplo 4 se analizaron para evaluar la proteína adsorbida total usando hidrólisis básica como sigue: 10 mg de las partículas adsorbidas liofilizadas se hidrolizaron durante cuatro horas en 2 ml de NaOH 0,2 N con SDS al 5%, se neutralizó, y se diluyó 1 : 10 y se analizó para evaluar el contenido de proteína usando el ensayo de proteína MicroBCA (Pierce, Rockford, IL). Como se muestra en la tabla 1, las micropartículas con superficies modificadas preparadas con detergentes como CTAB y SDS, ambos adsorbieron proteína más eficazmente que las micropartículas preparadas usando solamente PVA.
TABLA 1
Tipo de micropartícula Proteína Carga dirigida (% p/p) Carga real (% p/p)
PVA – PLG p55gag 3% 0,38%
CTAB – PLG p55gag 3% 1,58%
SDS – PLG p55gag 3% 1,36%
PVA – PLG p55gag 1% 0,18%
SDS – PLG p55gag 0,5% 0,45%
SDS – PLG p55gag 1% 0,72%
SDS – PLG p55gag 1% 0,79%
PVA – PLG p55gag 4% 0,3%
SDS – PLG p55gag 1% 0,7%
Ejemplo 6 A. Inmunogenocidad de micropartículas adsorbidas de gag
Las micropartículas adsorbidas de gag, producidas usando PVA o SDS, como se describen en el ejemplo 4, así como p55gaag sola, sin micropartículas asociadas (como control negativo) y controles gag-pol de vaccinia (como control positivo) se administraron por vía intramuscular a ratones.
Los animales se reinmunizaron los 7 y 14 días. La dosis total administrada se indica en las tablas 2 y 3. Se recogieron los bazos dos semanas después de la última inmunización y la actividad de CTL se ensayó como se describe en Doe y col., Proc. Natl.. Acad. Sci. (1996) 93: 8578 - 8583.
Los cultivos de linfocitos se prepararon como sigue. Células de bazo (sc) de ratones inmunizados se cultivaron en placas de 24 pocillos a 5 x 10^{6} células por pocillo. De esas células, 1 x 10^{6} se sensibilizaron con péptidos epitópicos sintéticos forman proteínas de VIH - 1SF2 a una concentración de 10 \muM durante 1 hora a 37ºC, se lavaron, y se cultivaron con el resto de la 4 x 10^{6} sc no tratadas en 2 ml de medio de cultivo [50% de RPMI 1640 y 50% de alfa-MEM (GIBCO)] suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor, 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M, antibióticos, e interleuquina 2 al 5% (Rat T - Stim, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA). Las células se alimentaron con 1 ml de medio de cultivo recién preparado los días 3 y 5, y se ensayó la citotoxicidad el
día 6.
El ensayo de células citotóxicas se llevó acabo como sigue. Células diana SvBALB (H-2^{d}) (SvB) y MC57 (H-2b) usadas en los ensayos de liberación de ^{51}Cr expresan moléculas MHC de la clase I pero no la clase II. Aproximadamente 1 x 10^{6} de células diana se incubaron en 200 \mul de medio que contiene 50 \muCi (1 Ci = 37 Gbp) de ^{51}Cr y péptidos sintéticos de VIH - 1 (1 mM) durante 60 minutos y se lavaron tres veces. Las células efectoras (E) se cultivaron con 5 x 10^{3} células diana (T) a diversa relaciones E / T en 200 \mul de medio de cultivo en placas de cultivo de tejidos de fondo redondo de 96 pocillos durante 4 horas. El valor de cpm promedio de pocillos por duplicado se usó para calcular el porcentaje de liberación específica de ^{51}Cr.
Como se muestra en las tablas 2 y 3, las micropartículas de SDS - PLG / p55 tenían una actividad comparable con el control de vaccinia y eran más activas que las micropartículas de PVA - PLG / p55y la formulación de proteína p55gag. Específicamente, como se muestra en al tabla 2, la proteína p55gag era inactiva a concentraciones de 10 \mug, 25 \mug y 50 \mug. Además, como se muestra en la tabla 3, las formulaciones SDS - PLG / p55 eran más activas que las formulaciones de proteína PVA - PLG / p55 y p55gag, indicando que las proteínas se adsorbieron más eficazmente a las micropartículas en las formulaciones SDS - PLG / p55 comparadas con formulaciones de proteína PVA - PLG / p55 y p55gag.
TABLA 2
2
3
Línea celular ^{a}SvB sin pulsación de péptidos
Línea celular ^{b}SvB pulsada con péptido p7g
Línea celular ^{c}MC57 pulsada con péptido p7g.
TABLA 3
Porcentaje de lisis específica de dianas
Efector Relación E : T MC57^{a} MC57+ gag b^{b} SVB+ gag b^{c}
PVA - PLG / p55 10 \mug 60 : 1 8 15 11
12 : 1 3 10 2
2,4 : 1 > 1 5 2
SDS - PLG / p55 10 \mug 60 : 1 6 35 4
12 : 1 3 12 > 1
2,4 : 1 > 1 3 2
Proteína p55gag 10 \mug 60 : 1 7 15 1
12 : 1 2 6 1
2,4 : 1 > 1 1 > 1
gag de Vaccinia 60 : 1 > 1 37 > 1
12 : 1 > 1 19 > 1
2,4 : 1 1 9 > 1
Línea celular ^{a}MC57 sin pulsación de péptidos
Línea celular ^{b}MC57 pulsada con péptido gag b
Línea celular ^{c}SVB pulsada con péptido gag b.
Ejemplo 7 Preparación de pCMV gp120 ADN – adsorbido Micropartículas con superficies modificadas
Las micropartículas con ADN de plásmido adsorbido que codifica gp120 se prepararon como sigue. 20 mg de micropartículas de blanco, preparadas como se describe en los ejemplos 1 y 2, se incubaron con concentraciones crecientes de ADN de pCMVgp120 en un volumen de 1,0 ml durante 3 horas a 4ºC. Después de la incubación, las micropartículas de centrifugaron, se lavaron dos veces con tampón Tris - EDTA y de secaron por congelación. Las micropartículas de hidrolizaron como se ha descrito en el ejemplo 5 y se analizaron para evaluar la cantidad de ADN adsorbido a A_{260} m.
La tabla 4 ilustra la eficacia de carga de las micropartículas PLG - PVA y PLG - CTAB. Como se indica en la tabla, las micropartículas PLG - CTAB se adsorben más eficazmente que las partículas PLG - PVA correspondientes.
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TABLA 4
Tipo de micropartícula Carga teórica (% p/p) Carga real (% p/p) Eficiencia de carga (% p/p)
PLG - PVA 1 0,44 44
PLG - CTAB 1 0,84 88
PLG - PVA 2 0,38 19
PLG - CTAB 2 1,23 62
PLG - PVA 3 0,33 11
PLG - CTAB 3 1,82 61
PLG - PVA 4 0,48 12
PLG - CTAB 4 2,36 59 
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Ejemplo 8 Adsorción en VCH - E2
Las micropartículas se prepararon usando PVA, y varios detergentes como se describe en los ejemplos previos. La proteína E2 del virus de la hepatitis C (VCH) se adsorbió sobre la superficie de las micropartículas como sigue: 0,2 mg/ml de E2 se añadieron a 20 mg de las micropartículas en PBS formando una solución al 0,5% p/p de E2 / PLG en un volumen total de 0,5 ml. Las soluciones se incubaron durante 1,5 horas a 37ºC, después se centrifugaron. Se recogieron los sobrenadantes y después se midieron para evaluar el contenido de proteína mediante microBCA. Los resultados se muestran en la tabla 5. Los resultados confirman la adsorción superior de macromoléculas por las micropartículas de la presente invención.
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TABLA 5
Tipo de micropartícula Proteína % de unión (E2 / PLG en p/p) % de unión total de E2
PVA - PLG E2 0,00 0,00
CTAB - PLG E2 0,43 96,00
SDS - PLG E2 0,14 31,00
Oleato de Na - PLG E2 0,36 81,00
Pluronic P84 - PLG E2 0,00 0,00
Pluronic L121 - PLG E2 0,00 0,00
Ejemplo 9 Adsorción de la proteína
Las micropartículas se prepararon usando PVA como se ha descrito en los ejemplos previos. Las micropartículas también se prepararon usando Oleato de Na, un detergente aniónico, como sigue: una emulsión de ag / ac / ag se preparó con 1,67 ml de citrato de Na 30 mM pH 6 como la fase acuosa interna, 16,7 ml de polímero RG 505 PLG al 6% (Boehringer Ingelheim) en diclorometano como disolvente (fase oleosa), y 66,8 ml de oleato de Na al 0,4% como la fase acuosa externa. Estas micropartículas aparecen en la tabla 6 a continuación como "oleato de Na - PLG (ag / ac / ag)". Adicionalmente, las micropartículas se prepararon usando oleato de Na en una formulación de aceite en agua, y estas micropartículas en la tabla 6 a continuación como "oleato de Na - PLG (aceite / agua)". La proteína gp 120 se adsorbió sobre la superficie de las micropartículas como sigue: 0,388 mg/ml de proteína se añadió a aproximadamente 20 mg de las micropartículas en PBS formando una solución a aproximadamente 1,4% p/p de gp120 / PLG en un volumen total de 0,8 ml. Las soluciones se incubaron durante 1,5 horas a 37ºC, después se centrifugaron. Los sobrenadantes se recogieron y después se midieron para evaluar el contenido de proteína mediante microBCA. Los resultados se muestran en la tabla 6. Los resultados confirman la adsorción superior de macromoléculas por las micropartículas de la presente invención.
TABLA 6
Tipo de micropartícula Proteína % de unión (E2 / PLG en p/p) % de unión total de E2
PVA - PLG gp120 0,01 0,00
PVA - PLG gp120 0,09 3,00
Oleato de Na - PLG gp120 1,33 96,00
(ag / ac / ag)
Oleato de Na - PLG gp120 1,24 95,00
(ag / ac / ag)
Oleato de Na - PLG gp120 0,41 31,00
(ac / ag)
Oleato de Na - PLG gp120 0,27 20,00
(ac / ag)
Oleato de Na - PLG gp120 0,36 28,00
(ac / ag)
Oleato de Na - PLG gp120 0,27 22,00
(ac / ag)
Oleato de Na - PLG gp120 0,34 26,00
(ac / ag)
Oleato de Na - PLG gp120 0,31 24,00
(ac / ag)
Oleato de Na - PLG gp120 -0,01 -1,00
(ac / ag)
Oleato de Na - PLG gp120 -0,09 -7,00
(ac / ag)
Ejemplo 10 Adsorción de la proteína listeriolisina
Las micropartículas se prepararon usando PVA y CTAB, como se ha descrito en los ejemplos previos. La proteína listeriolisina (LLO) de Listeria monocytogenes se adsorbió sobre la superficie de las micropartículas como sigue: 1,0 mg/ml de LLO se añadió a 100 mg de las micropartículas en POBS formando una solución al 1% p/p de LLO / PLG en un volumen total de 5 ml. Las soluciones se incubaron durante 1,5 horas a 37ºC, después se centrifugaron. Los sobrenadantes se recogieron y después se midieron para evaluar el contenido de proteína mediante microBCA. Los resultados se muestran en la tabla 7. Los resultados confirman la adsorción superior de macromoléculas por las micropartículas de la presente invención.
TABLA 7
Tipo de micropartícula Proteína Carga dirigida (% p/p) Carga real (% p/p) Eficiencia de carga
PVA - PLG LLO 0,10 0,10 100,0
PVA - PLG LLO 0,25 0,08 32,0
PVA - PLG LLO 0,50 0,12 24,0
PVA - PLG LLO 1,00 0,18 18,00
CTAB - PLG LLO 0,10 0,06 60,0
CTAB - PLG LLO 0,25 0,19 76,0
CTAB - PLG LLO 0,50 0,34 68,0
CTAB - PLG LLO 1,00 0,71 71,0
Ejemplo 11 Efecto de la sal de aluminio como adyuvante
Las micropartículas de PLG adsorbidas en p55 gag ADN se prepararon como se ha descrito anteriormente, usando CTAB. Las micropartículas se inyectaron por vía intramuscular en ratones a dos concentraciones, y como control, ADN solo se inyectó a las mismas dos concentraciones. Adicionalmente, en un ensayo, se añadieron 50 \mug de fosfato de aluminio a la composición de CTAB inyectada. Cada formulación se inyectó en diez ratones. Los ratones se reinmunizaron después de 28 días. Dos semanas después de la segunda inmunización, se recogió el suero y se midió la media geométrica del título (GMT) de cada suero, junto con su error estándar (SE). Los resultados se resumen en la tabla 8, presentados como valores tanto lineales como logarítmicos. Cada número es el promedio de los resultados obtenidos de los diez ratones.
TABLA 8
Formulación GMT SE Log GMT Log SE
ADN - CTAB 19546 5983 4,28 0,11
\mug
ADN - CTAB 54487 5510 4,73 0,04
10 \mug
ADN - CTAB 49765 10034 4,69 0,1
1 \mug + alúmina
50 \mug
ADN solo 1 \mug 10,6 2,7 1,01 0,07
ADN solo 10 \mug 230 395 2,15 0,3
Con el fin de comparar estos resultados estadísticamente, los valores P se generaron para ADN - CTAB frente ADN - CTAB + alúmina (valor P = 0,0017); ADN - CTAB + alúmina frente a ADN solo (valor de P < 0,0001); y ADN - CTAB (10 \mug) frente a ADN solo (10 \mug) (valor de P < 0,0001). Estos valores de P confirman la significación estadística de los valores en la tabla 8.
Ejemplo 12 Mediciones de los potenciales Z
Las mediciones de los potenciales Z se llevó a cabo sobre un aparato medidor del potencial zeta DELSA 440 SX de Coulter Corp., Miami, FL 33116. El sistema se calibra usando patrones de movilidad de Coulter (EMP SL7, una suspensión acuosa de perlas de látex de poliestireno). Después de enjuagar la celda de muestra con agua estéril, se añaden las muestras a la celda de muestra. Después el contador se ajusta a cero alineando el rayo a su valor más bajo. La corriente se fija a 0,7 mA para la referencia y 20 V para la muestra. Los niveles de detector de los cuatro rayos se verifica, después la muestra se ensaya seleccionando "ensayo" del software, y las mediciones de frecuencia de leen. Los rayos deben estar separados por 20 Hz. Después se lee el potencial Z promedio para cada muestra.
Se leyeron las mediciones para varias formulaciones de micropartículas de la presente invención, y los resultados se muestran en al tabla 9. Como indican los resultados, la absorbancia de las macromoléculas a las superficies de las micropartículas altera los potenciales de las partículas.
TABLA 9
Tipo de micropartícula Macromolécula adherente Potencial Z (mV)
PLG - PVA ninguna -26 \pm 8
PLG - CTAB ninguna +83 \pm 22
PLG - CTAB ADN de p55 +35 \pm 14
PLG - SDS ninguna -44 \pm 26
PLG - SDS Proteína p55 -32 \pm 18
PLG - Oleato Ninguna -64 \pm 24
PLG - Oleato Proteína gp120 -48 \pm 14
Ejemplo 13 Micropartículas con macromoléculas encapsuladas y adsorbidas
(A). Las micropartículas PLG se prepararon usando RG 505 PLG y PVA, y encapsulando el adyuvante LTK63. 100 mg de las micropartículas se incubaron con 5 ml de PBS que contiene 400 \mug/ml de proteína p24gag. Después la mezcla se incubó con agitación a temperatura ambiente durante toda una noche, se lavaron mediante centrifugación con 20 ml de PBS dos veces y una vez con agua, después se liofilizó. Después de hidrólisis básica y neutralización, se midieron el % de proteína adsorbida y % de adyuvante encapsulado; los resultados aparecen en la tabla 10.
(B). Las micropartículas PLG se prepararon usando SDS y RD 505 PLG y PVA, y encapsulando los oligonuclétidos CpG con el adyuvante como sigue: 5 ml de polímero RG505 al 6% en DCM se emulsionaron con 0,5 mg/ml de CpG en Tris 50 mM / EDTA, formando una emulsión ag / ac. La emulsión ag / ac se añadió a 20 ml de SDS al 1% y después se emulsionó, formando una emulsión ag / ac / ag. Las micropartículas se formaron mediante evaporación del disolvente durante toda una noche, después se lavaron, se centrifugaron, y se liofilizaron. 10 mg de las micropartículas encapsuladas con CpG se disolvieron en 1 ml de DCM. 0,5 ml de agua se añadieron al extracto de los oligonucleótidos, y después la mezcla se centrifugó y la fase acuosa se inyectó sobre una columna de exclusión por tamaño con PBS como fase móvil. 10 mg de partículas de placebo se mezclaron con 100 \mu de oligonucleótidos CpG y se extrajeron como se ha indicado anteriormente y se desarrollaron sobre la columna como un patrón. La cantidad de oligonucleótidos CpG presente en las partículas atrapadas se calculó contra el patrón.
Se adsorbió p55gag sobre las micropartículas encapsuladas con CpG como sigue: 50 mg de las micropartículas encapsuladas con CpG liofilizadas se incubaron durante toda una noche con 5 ml de Borato 25 mM con urea 6 M (pH9) conteniendo 140 \mug de proteína p55gag. La mezcla se incubó con agitación durante toda una noche a temperatura ambiente, se lavó con 20 ml de tampón borato / urea 6M dos veces, y 20 ml de agua una vez, después se liofilizó.
10 mg de las micropartículas adsorbidas en CpG - encapsulada / p55gag se sometieron a hidrólisis básica, y se realizaron las mediciones del % de macromoléculas atrapadas y % adsorbido. La carga dirigida era 0,1%, excepto que se indique otra cosa. Los resultados aparecen en la tabla 10.
TABLA 10
Tipo de micropartícula % encapsulado (p/p) % adsorbido (p/p)
(A). PLG - PVA LTK63 0,46 1,2*
encapsulado p24gag
adsorbida
(B). PLG - SDS CpG 0,41 1,0
encapsulada p55gag
adsorbida
* Carga dirigida = 2,0%.
Ejemplo 14 Micropartículas con dos macromoléculas adsorbidas
(A). De acuerdo con la presente invención, se pueden administrar dos o más macromoléculas en una composición que comprende micropartículas que han adsorbido ambas macromoléculas, o se pueden administrar en una composición que comprende dos o más micropartículas distintas, cada una teniendo adsorbida una única macromolécula. Por ejemplo, las micropartículas se prepararon adsorbiendo tanto el polipéptido E2 como los oligonucleótidos CpG con adyuvante como sigue: se prepararon PLG - CTAB blanco como se ha descrito previamente. Se incubaron 20 mg de las micropartículas liofilizadas durante 4 horas con 1 ml de 200 \mug/ml de E2 en solución salina. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, se lavó con 20 ml de solución salina normal en agua dos veces mediante centrifugación a 10000 G, y el sedimento se volvió a suspender en 1 ml de solución de CpG en tampón TE que contiene 20 \mug/ml de CpG durante 4 horas a temperatura ambiente. La suspensión final se lavó dos veces con tampón TE mediante centrifugación, y después se liofilizó. 10 mg de las micropartículas con CpG adsorbida y E2 se sometió a hidrólisis básica y se determinó la concentración de proteína mediante BCA, y la cantidad residual de CpG en el sobrenadante se analizó mediante HPLC para medir la cantidad de CpG adsorbida sobre las micropartículas. Los resultados aparecen en la tabla 11 demostrando la adsorción positiva para ambas macromo-
léculas.
(B). Las micropartículas se prepararon de acuerdo con la invención. Una porción se usó para adsorber el polipéptido E2, mientras otra porción se usó para adsorber los oligonucleótidos CpG con adyuvante. PLG - CTAB blanco se prepararon como se descrito anteriormente. 20 mg de las micropartículas liofilizadas se incubaron durante 4 horas con 1 ml de 220 \mug/ml de E2 en solución salina. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante cuatro horas, se lavó con 20 ml de solución salina en agua dos veces mediante centrifugación a 10.000 g, después se liofilizó. De manera separada, 20 mg de las micropartículas liofilizadas se incubaron durante 4 horas con 1 ml de 200 \mug/ml de CpG en tampón TE. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, se lavó con 20 ml de tampón TE dos veces mediante centrifugación a 10.000 g, después se liofilizó. Los resultados de las mediciones del porcentaje de macromoléculas adsorbidas aparece en la tabla 11.
TABLA 11
Tipo de micropartícula % de E2 adsorbida (p/p)* % de CpG adsorbida (p/p)*
(A). PLG - SDS E2 0,71 0,32
adsorbida CpG
adsorbida
(B). PLG - SDS E2 0,64 N.d
adsorbida
(B). PLG - SDS CpG N. d. 0,81
adsorbida
* Carga dirigida = 1,0%.
Ejemplo 15 Micropartículas formadas usando combinación de detergente y PVA
Se usó el siguiente procedimiento para formar micropartículas que comprenden dos tensioactivos: PVA y detergente: 10 ml de polímero PLG al 5% y 0,2% del detergente DOTAP en DCM se emulsionaron a 12.000 rpm durante 3 minutos con 0,1 de agua destilada para formar la emulsión de ag / ac primaria. La emulsión ag / ac se añadió a 40 ml de PVA al 0,8% y se emulsionó durante 3 minutos para formar la segunda emulsión de ag / ac / ag, que se agitó durante toda la noche para evaporar el disolvente, y se formaron las micropartículas. Las micropartículas se lavaron dos veces en agua destilada y se liofilizaron. Las micropartículas están así listas para adsorción de macromoléculas de acuerdo con la presente invención.
Se empleó el mismo procedimiento para formar las micropartículas que comprenden una combinación de PVA y el detergente DDA.
Ejemplo 16 Inmunogenicidad de micropartículas con ADN de p55 adsorbido
Las micropartículas se formaron como se ha indicado en los siguientes ejemplos usando los detergentes CTAB o DDA. ADN de p55 se adsorbió a las micropartículas y se evaluó la inmunogenicidad usando los procedimientos descritos en los ejemplos previos. Los resultados se resumen en la tabla 12 a continuación.
TABLA 12
Porcentaje específico de lisis de dianas
Efector Relación E : T Sv / B p7g^{a}
PLG - CTAB / ADN de p55 1 \mu 60:1 71
15:1 55
4:1 31
PLG - DDA / ADN de p551 \mu 60:1 70
15:1 54
4:1 17
ADN de p55 solo 1 \mu 60:1 3
15:1 1
4:1 0
Gag de Vaccinia 2 x 10^{7} pfu 60:1 64
15:1 35
4:1 11
^{a}SVB línea celular pulsada con péptido gag b.
Ejemplo 17 Expresión de la luciferasa in vivo usando micropartículas con ADN de luciferasa adsorbido
Se formaron las micropartículas usando los procedimientos descritos anteriormente usando PLG y el detergente CTAB. El ADN de luciferasa se adsorbió sobre ellas usando los procedimientos descritos anteriormente. La expresión de la luciferasa in vitro usando una dosis de 5 \mu de ADN de luciferaza se midió usando el ADN de la luciferasa solo (1248 pg) y las micropartículas con ADN de luciferasa adsorbidas en ellas (2250 pg). La expresión de la luciferasa in vivo se midió en músculo los días 1 y 14 después de la administración como sigue: Dos grupos de ratones (n = 5) se inyectaron cada uno con o bien 50 \mu de plásmido de luciferasa o 50 \mug de micropartículas PLG - CTAL - ADN de luciferasa sobre dos piernas. Ambos músculos de TA de cada ratón en los dos grupos de recogieron o bien el día 1 o el día 14 y se almacenaron en un congelador a -80ºC. Los músculos se molieron con un mortero y mano de almirez sobre hielo seco. Los músculos pulverizados se recogieron en tubos eppendorf con 0,5 ml de 1 x tampón de lisis Reporter. Las muestran se agitaron en un aparato Vortex durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de congelar / descongelas 3 veces, las muestras se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante de los músculos TA de cada ratón en cada momento se reunieron y 20 \mul de las muestras se ensayaron usando un ML3000 (Dynatech) con resplandor potenciado para evaluar la expresión de Luciferasa.
La determinación de luciferasa se realizó usando un ensayo de quimioluminiscencia. El tampón se preparó conteniendo 1 mg/ml de BSA en 1 X de Reperoter Lysis (Promega). La solución madre de la enzima luciferasa (Promega) a 10 mg/ml se usó como patrón, se diluyó hasta una concentración de 500 pg/20 \mul. Este patrón se diluyó en serie 1 : 2 en la placa Microlite 2 (Dynatech) creando una curva patrón. 20 \mul del blanco y las muestras también se colocaron sobre la placa y se diluyeron en serie 1 : 2. Las placas se colocaron en la ML3000 en la que se inyectaron por pocillo 100 \mul del reactivo de ensayo de luciferasa (Promega). Bajo resplandor potenciado, se midieron las unidades de luz relativas para cada muestra.
Los resultados se tabulan a continuación en al tabla 13.
TABLA 13
Tipo de micropartícula Expresión de la luciferasa Expresión de la luciferasa
in vivo el día 1 (pg) in vivo el día 14 (pg)
ADN de luciferasa adsorbiso 9,51 44,95
en PLG - CTAB
ADN de luciferasa sola (50 \mug)  6,78 9,29
Ejemplo 18 Inmunogenicidad de micropartículas con antígeno adsorbido frente a atrapado
Se formaron las micropartículas usando los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores. La proteína E2 se adsorbió después en ellas como se ha descrito anteriormente. Las micropartículas también se pueden preparar con E2 atrapada entro de ellas, en lugar de adsorberse sobre, como se ha descrito anteriormente. Las microparticulas se ensayaron para determinar su capacidad para inducir anticuerpos de IgG después de la inmunización de 10 ratones con cada tipo de micropartícula. Se midió la media geométrica del título (GMT) del suero de cada ratón, después se promedió para el grupo de 10 animales. También se calculo el error estándar (SE). PLSD de Fisher (nivel de significación 5%) se midió a p = 0,0006. Los resultados se muestran en la tabla 14 a continuación. Los resultados demuestran claramente una inducción superior de respuesta inmune humoral usando las micropartículas adsorbidas de la presente invención.
TABLA 14
Formulación GMT SE
PLG con E2 atrapada 293 270
PLG con E2 adsorbida 3122 1310
Ejemplo 19 Inmunogenicidad de micropartículas con proteína E1E2 de VHC adsorbida sobre ellas
Se formaron las micropartículas de PLG - CTAB usando los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores. La proteína E1E2 del virus de la hepatitis C (VHC) se adsorbieron sobre ellas. Las partículas se usaron también para inmunizar ratones, con o sin el adyuvante alúmina, en las dosificaciones de las micropartículas calculadas para proporcionar o bien 10 \mug o 100 \mug de proteína. Se midió la media geométrica del título, y los resultados se muestran en la tabla 15.
TABLA 15
Formulación GMT SE
PLG / CTAB E1E2 (10 \mug) 4117 558
PLG / CTAB E1E2 (100 \mug) 7583 659
PLG / CTAB E1E2 alúmina (10 \mug) 3356 436
PLG / CTAB E1E2 alúmina (100 \mug) 10485 1548
ADN de E1E2 de VHC (10 \mug) 87 63
ADN de E1E2 de VHC (100 \mug) 7621 571
Como indican los resultados, las micropartículas con proteína adsorbida en ellas producen una respuesta inmune superior a la dosis de 10 \mug. Esto demuestra que las micropartículas tienen la ventaja de ser útiles generando respuestas inmunes a bajas dosis en las que el ADN libre es incapaz de generar tales respuestas.
Ejemplo 20 Inmunogenicidad de micropartículas con proteína p24 gag adsorbida sobre ellas
Se formaron las micropartículas de PLG - CTAB usando los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores. La proteína p24 gag se adsorbieron después sobre ellas. Las micropartículas se ensayaron para determinar su capacidad de inducir anticuerpos IgG, IgG1, e IgG2a después de la inmunización de 10 ratones. Se midió la media geométrica (GMT) del suero recogido de los 2 ratones 2 semanas después de la segunda inmunización (2sp2) del título, y 2 semanas después de la tercera inmunización (2sp3), después se promediaron para el grupo de los diez animales. También se calculo el error estándar (SE). Los resultados se muestran en la tabla 16 a continuación. Los resultados demuestran claramente una inducción superior de respuesta inmune humoral usando las micropartículas adsorbidas de la presente invención.
TABLA 16
GMT de IgG SE de IgG GMT de IgG1 SE de IgG GMT de IgG2a SE de IgG2a
PLG - PVA / 5813,59 2400,58 3741,17 2039,08 755,3 587,21
p24 gag (2sp2)
p24 gag 6,6 7,91 6,51 6,85 5 1
sola (2sp2)
PLG - PVA / 26730,29 3443,67 40088,65 8989,07 6974,22 1457,74
p24 gag (2sp3)
p24 gag 7,15 5,59 8,22 12,3 5 1
sola (2sp3)
Ejemplo 21 Inmunización IM de la proteína p55 gag y diversos adyuvantes
Se formaron las micropartículas de PLG / CTAB, y PLG / PVA como se ha descrito en los ejemplos previos. Se prepararon ocho grupos de micropartículas con el fin de analizar los diferentes efectos de la inmunización de los ratones con proteína p55 gag de antígeno adsorbida sobre las micropartículas contra la p55 gag soluble libre, y para determinar los efectos de tener la CpG con adyuvante (oligonucleótidos de cadena sencilla de 20 bases de longitud con un motivo CpG) también adsorbido sobre otras micropartículas o proporcionado en al forma soluble. Los grupos diferentes se prepararon como sigue:
El grupo 1 usó proteína p55 gag soluble (proteína p55 gag de VIH recombinante producida en levadura a 2 mg/ml en tampón tris / NaCl con urea 2 M) mezclada con partículas PLG / CTAB con CpG adsorbida.
El grupo 2 usó partículas PLG / SDS con p55 gag adsorbida mezclada con partículas PLG / CTAB con CpG adsorbida.
El grupo 3 usó partículas PLG / SDS con p55 gag adsorbida mezclada con CpG libre.
El grupo 4 usó partículas PLG / SDS con p55 gag adsorbida y sin adyuvante.
El grupo 5 usó partículas PLG / PVA con p55 gag atrapada dentro de ellas mezclada con partículas PLG / CTAB con CpG adsorbida.
El grupo 6, un control no usó antígeno, y CpG soluble.
El grupo 7, otro control, usó proteína p55 gag y sin adyuvantes.
El grupo 8, otro control, usó solamente virus vaccinia (gag de vv) que expresa el gen gag, y sin adyuvantes.
Para cada grupo, se inmunizaron 10 ratones con cantidades suficientes de micropartículas o moléculas libres de manera que la dosificación de antígeno de p55 gag y adyuvante CpG eran 25 \mug cada uno (si está presente en el grupo), excepto para el grupo 8 que se usó a una dosificación de 10 x 10^{7} pfu. La vía de inmunización era IM, excepto para el grupo 8, que cuya vía era IP. Después de la inmunización, se midió el título de suero, anti - p55 IgG, cuyos resultados aparecen a continuación en la tabla 17A (3sp2, tres semanas después de la segunda inmunización). La tabla 17B proporciona los análisis de los isotipos de los componentes de IgG1 e IgG2a, incluyendo la relación de IgG2A/IgG1. La lisis de las dianas por CTL también se midió con cada grupo, cuyos resultados aparecen a continuación en al tablas 18 A y 18 B (dos experimentos separados).
TABLA 17 A
Título de IgG en suero
Grupo Forma de antígeno de Forma de adyuvante Título del suero
la proteína p55 gag CpG
1 soluble Adsorbida sobre partículas 43250
PLG / CTAB
2 Adsorbida sobre partículas Adsorbida sobre partículas 49750
PLG / SDS PLG / CTAB
3 Adsorbida sobre partículas Soluble 62750
PLG / SDS
4 Atrapada dentro Ninguna 7550
de partículas PLG / SDS
5 Atrapada dentro   Adsorbida sobre partículas 127000
de partículas PLG / PVA PLG / CTAB
6 Soluble Soluble 38
7 Soluble Ninguna 2913
8 Virus vaccinia ninguna 938
(gag de vv)
TABLA 17 B
GMT de IgG GMT de IgG1 GMT de IgG2a IgG2a / IgG1
PLG / CTAB - CpG 43.250 18.750 17.000 0,9333
más p55 soluble
PLG / CTAB - CpG 49.750 24.750 24.500 0,09899
más PLG / SDS – p55
PLG / SDS - p55 más 62.750 30.000 32.500 1,0833
CpG libre
PLG / SDS - p55 sin 7.550 18.600 350 0,0188
CpG
PLG / CTAB - CpG 127.000 72.750 49.250 0,6770
más PLG / PVA con
p55 atrapada
CpG1 libre 38 No 25 -
detectable
Sin adyuvante 2913 7.450 88 0,0117
Gag de vv, sin 938 488 375 0,7692
adyuvante
TABLA 18 A
4
TABLA 18 B
5 
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Ejemplo 22 Inmunización IM de proteína p55 gag o DNA de p55 y diversos adyuvantes
Las micropartículas de PLG se formaron como se ha descrito anteriormente en los ejemplos previos. Los grupos de micropartículas se prepararon con el fin de analizar los diferentes efectos de la inmunización de ratones con proteína p55 gag de antígeno adsorbido sobre las micropartículas contra la proporción de p55 gag soluble libre, y para determinar los efectos de tener el adyuvante CpG (CpG1 o CpG2, que representan grupos de oligonucleótidos) también adsorbido sobre otras micropartículas o proporcionadas en la forma soluble libre. Se inmunizaron 10 grupos de animales con diferentes formulaciones como sigue:
El grupo 1 usó partículas PLG / CTAB con CpG1 adsorbida mezclada con proteína p55 gag libre (proteína p55 gag de VIH recombinante producida en levadura a 2 mg/ml en tampón tris / NaCl con urea 2 M).
El grupo 2 usó partículas PLG / CTAB con CpG1 adsorbida mezclada con partículas PLG / SDS con proteína pa55 gag adsorbida.
El grupo 3 usó partículas PLG / SDS con proteína p55 gag adsorbida mezclada con CpG libre.
El grupo 4 usó partículas PLG / SDS con proteína p55 gag adsorbida y sin adyuvante.
El grupo 5 usó partículas PLG / CTAB con CpG1 absorbida y proteína p55 gag atrapada en PVA.
Grupo 6, partículas PLG / CTAB con CpG2 adsorbida mezclada con partículas PLG / SDS con proteína p55 gag adsorbida.
El grupo 7, un control, usó partículas PLG / SDS con p55 gag adsorbida y micropartículas PLG / CTAB blanco.
El grupo 8, otro control, usó solamente CpG2 libre.
El grupo 9, otro control, usó solamente CpG1 libre.
El grupo 10, otro control, usó solamente proteína p5 gag CpG1 soluble libre.
Para cada grupo, se inmunizaron 10 ratones con cantidades suficientes de micropartículas o moléculas libres de manera que la dosificación de antígeno de p55 gag y adyuvante CpG eran 25 \mug cada uno (si está presente en el grupo). La vía de inmunización era IM TA. Después de la inmunización, se midió el título de suero p55 anti - p55 IgG, cuyos resultados aparecen a continuación en la tabla 19A. El suero se midió a 2sp2 (dos semanas después de la segunda inmunización) y 2sp3 (dos semanas después de la tercera inmunización).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 19 A 
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6
7
Un experimento similar se realizó usando diversas micropartículas de PLG, usando CTAB como detergente, usando ADN de p55 gag como antígeno, usando CpG o LTK63 como adyuvante, y usando los siguientes grupos:
El grupo 1 usó partículas PLG / PVA / CTAB con ADN de p55 gag adsorbido en 1 \mu.
El grupo 2 usó partículas PLG / PVA / CTAB con ADN de p55 gag adsorbido en 10 \mu.
El grupo 3 usó partículas PLG / CTAB con ADN de p55 gag adsorbido en 1 \mu.
El grupo 4 usó partículas PLG / CTAB con ADN de p55 gag adsorbido en 10 \mu.
El grupo 5 usó ADN de p55 gag en 1 \mu sin partículas o adyuvantes.
El grupo 6 usó ADN de p55 gag en 10 \mu sin partículas o adyuvantes.
El grupo 7 usó partículas PLG / CTAB con ADN de p55 gag adsorbido en 1 \mu mezclado con CpG libre.
El grupo 8 usó partículas PLG / CTAB con ADN de p55 gag adsorbido en 1 \mu mezclado con partículas de PLG / CTAB con CpG1 adsorbida.
El grupo 9 usó partículas PLG / CTAB con ADN de p55 gag adsorbido en 1 \mu mezclado con LTK63 libre.
El grupo 10 usó partículas PLG / CTAB con ADN de p55 gag adsorbido en 1 \mu mezclado con partículas de PLG / CTAB con LTK63 adsorbida.
Para cada grupo, se inmunizaron 10 ratones con cantidades suficientes de micropartículas o moléculas libres de manera que la dosificación de antígeno de ADN de p55 gag era como se ha indicado, y adyuvante CpG eran 25 \mug cada uno (si está presente en el grupo). La vía de inmunización era IM TA. Después de la inmunización, se midió el título de suero anti - p55 IgG, cuyos resultados aparecen a continuación en la tabla 19B. El suero se midió a 2sp2 (dos semanas después de la segunda inmunización).
TABLA 19 B
Título de IgG en suero
Grupo Forma de Forma de Título del suero [GM/ / (SE)]
antígeno de ADN adyuvante
de p 55 gag
1 Adsorbida sobre Ninguna 22.900
partículas PLG / (8892)
PVA / CTAB
2 Adsorbida sobre Ninguna 81.700
partículas PLG / (8758)
PVA / CTAB
3 Adsorbida sobre Ninguna 18.100
partículas PLG / (12800)
CTAB
4 Adsorbida sobre Ninguna 101.000
partículas PLG / (10900)
CTAB
5 Soluble Ninguna 14
(130)
6 Soluble Ninguna 1.060
(1905)
7 Adsorbida sobre CpG soluble 50.400
partículas PLG / (19700)
CTAB
8 Adsorbida sobre CpG adsorbida 68.300
partículas PLG / sobre partículas (9534)
CTAB PLG / CTAB
9 Adsorbida sobre LTK63 soluble 109.000
partículas PLG / (15900)
CTAB
10 Adsorbida sobre LTK63 adsorbida 52.900
partículas PLG / en partículas PLG (9229)
CTAB /SDS
Un experimento similar se realizó usando diversas micropartículas de PLG, o microemulsiones MF59, usando ácido fosfatídico (PA), DSS, DOTAP, o CTAB como detergente, usando proteína gp 120 como antígeno, y usando los siguientes grupos:
El grupo 1 usó la emulsión MF59 con la proteína gp 120 libre.
El grupo 2 usó la emulsión MF59 / PA con la proteína gp 120 adsorbida.
El grupo 3 usó partículas PLG / PVA con gp 120 atrapada.
El grupo 4 usó partículas PLG / SDS con la proteína gp 120 atrapada y sin adyuvante.
El grupo 5 usó partículas PLG / SDS con la proteína gp 120 adsorbida y partículas PLG / CTAB con CpG adsorbida sobre ellas.
El grupo 6 usó partículas PLG / CTAB con CpG adsorbida.
El grupo 7 usó partículas PLG / DSS con la proteína gp 120 adsorbida con partículas MF59 / DOTAP 80 con CpG1 adsorbida.
El grupo 8 usó la emulsión MF59 / DOTAP 80 con CpG1 adsorbida.
El grupo 9 usó partículas PLG / CTAB con CpG adsorbida mezclada con partículas MF59 / PA con la proteína gp 120 adsorbida.
El grupo 10 usó CpG1 libre más la proteína gp 120 soluble.
Para cada grupo, se inmunizaron 10 ratones con cantidades suficientes de micropartículas o moléculas libres de manera que la dosificación de antígeno de gp 120 gag y adyuvante CpG eran 25 \mug cada uno (si está presente en el grupo). La vía de inmunización era IM TA. Después de la inmunización, se midió el título de suero anti-gp 120 Ig IgG, cuyos resultados aparecen a continuación en la tabla 19C. El suero se midió a 2sp2 (dos semanas después de la segunda inmunización) y 2sp3 (dos semanas después de la tercera inmunización).
TABLA 19 C
8
9
Los datos anteriores demuestran que en el caso del antígeno de la proteína gp 120, las mejores respuestas se generaron en el grupo inmunizado con antígeno adsorbido a partículas PLG, si los oligonucleótidos CpG se adsorbieron sobre otras partículas de PLG o emulsión MG59 / DOTAP. Por el contrario, cuando el antígeno se adsorbió sobre la emulsión MF59 / DOTAP y se adsorbieron los oligonucleótidos CpG sobre partículas PLG, la respuesta inmune era esencialmente insignificante. Equipado con las enseñanzas en esta memoria descriptiva, los expertos en la técnica pueden fácilmente determinar que la combinación de micropartícula y/o microemulsión adsorbida es lo más apropiado para cualquier antígeno particular.
Ejemplo 23 Adsorción y atrapamiento de ADN de p55
Las micropartículas PLG / CTAB con ADN de p55 adsorbido se formaron como se ha descrito en los ejemplos anteriores, y se ensayaron para inducción de anticuerpos a las cuatro semanas después de la Inmunización IM, y dos semanas después de la segunda inmunización frente a las partículas blanco, CTAB libre, y ADN de p55 libre. Los resultados aparecen a continuación en la tabla 20A, y muestra la clara ventaja de tener ADN p55 adsorbido sobre micropartículas en lugar de libre en solución.
TABLA 20 A
Formulación GMT SE GMT SE
4sp1 4sp1 2sp2 2sp2
PLG / CTAB 27 85 17.800 9156
con ADN de
p55 adsorbido
(1 \mug)
CTAB libre 8 25 181 653
(1 \mug)
PLG blanco 4 2 32 106
(1 \mug)
PLG blanco + 6 25 71 1631
CTAB libre
(1 \mug)
ADD de p 55 3 0 69 60
libre (1 \mug) 
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La inducción de CTL se examinó con las mismas formulaciones, y se midió a las 3 semanas después de la primera inmunización, usando relaciones de diana a efector de 4 : 1, 15 : 1, y 60 : 1. Los resultados aparecen a continuación en al tabla 20B, mostrando la ventaja de ADN de p55 adsorbido sobre micropartículas.
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TABLA 20B
Porcentaje de lisis específica de dianas
Formulación Relación E : T Lisis
PLG / CTAB - ADN de p55 (1 \mug) 60 : 1 33
15 : 1 11
4 : 1 1
CTAB libre 60 : 1 -1
15 : 1 1
4 : 1 0
PLG blanco 60 : 1 12
15 : 1 2
4 : 1 3
PLG + CTAB blanco 60 : 1 18
15 : 1 6
4 : 1 3
TABLA 20B (continuación)
Formulación Relación E : T Lisis
ADN de p 55 libre (1 \mug) 60 : 1 3
15 : 1 0
4 : 1 0
vv gag (2 x 10^{7} pfu) 60 : 1 59
15 : 1 24
4 : 1 9
Las micropartículas PLG / CTAB con ADN de p55 adsorbida, y micropartículas de PLG / PVA con ADN de p55 atrapado dentro, se formaron como se ha descrito en los ejemplos anteriores. La Inmunización IM de ratones e inducción de anticuerpos (recogida y análisis de suero) se realizó como se ha descrito en los ejemplos anteriores, a las cuatro semanas después de la primera inmunización (4sp1), y 2, 4, 6, 13, y 15 semanas después de la segunda inmunización (2sp2, 4sp2, 6sp2, 13sp2, y 15sp2 respectivamente). Los resultados, mostrados en la tabla 20C a continuación demuestran una clara ventaja de las micropartículas adsorbidas sobre p55 tanto atrapada como libre.
TABLA 20C
Formulación 4sp1 2sp2 4sp2 6sp2 13sp2 15sp2
PLG / CTAB 576 79300 156000 227000 988000 123000
con ADN de
p55 adsorbido
(1 \mug)
PLG / PVA 996 1815 2215 1376 25100 1084
con ADN de
p55 atrapado
(1 \mug)
Plásmido de 912 1149 1360 701 1075 742
p55 solo
(1 \mug)
Plásmido de 1489 10700 7885 26300 31600 17300
p55 solo
(10 \mug)
Las partículas de PLG / CTAB / PVA con ADD de p55 adsorbido (ADN al 1%) se prepararon como se ha descrito en los ejemplos previos, y se midió para evaluar varias características, los resultados aparecen en la tabla 20D.
TABLA 20D
% de % de Carga Carga Eficencia Tamaño Potencial Potencial CTAB
CTAB PVA de real de de carga medio Z sin Z con residual
(p/p) (p/p diana ADN de (%) (\mum) ADN ADN después
de ADN de p55 (mV) (mV) de 4
de p55 lavados
(% en
p/p)
0,2 0,8 1,0 0,74 74 1,86 46\pm14 24\pm14 0,42
Las partículas de PLG / CTAB y PLG / PVA / CTAB se prepararon como se ha descrito previamente, y ADN de p55 se adsorbió en ellas. Los ratones se inmunizaron con partículas de manera que la dosificación del ADN de p55 era o bien 1 \mug o 10 \mug. Los resultados de un experimento de inducción de anticuerpos 2 semanas después de la 2ª inmunización aparecieron anteriormente en la tabla 19B, y se resumen a continuación en la tabla 20E.
TABLA 20E
Formulación GMT de 2sp2 SE de 2sp2
PLG / PVA / CTAB con ADN 22.900 8.892
de p55 adsorbido (1 \mug)
PLG / PVA / CTAB con ADN 81.700 8.578
de p55 adsorbido (10 \mug)
PLG / CTAB con ADN de 18.100 12.800
p55 adsorbido (1 \mug)
PLG / CTAB con ADN de 101.000 10.900
p55 adsorbido (10 \mug)
ADN de p55 libre (1 \mug) 14 130
ADN de p55 libre (10 \mug) 1.060 1.905
Diversas micropartículas de PLG, o microemulsiones MF59, usando DOTAP o CTAB como detergente, y usando ADN de p55 como antígeno, se prepararon y usaron para inmunizar ratones como sigue:
El grupo 1 usó partículas PLG / CTAB con ADN de p55 adsorbido.
El grupo 2 usó partículas PLG / CTAB con ADN de p55 atrapado.
El grupo 3 usó partículas PLG / DOTAP con ADN de p55 adsorbido.
El grupo 4 usó partículas PLG con CTAB libre y ADN de p55 libre.
El grupo 5 usó la emulsión MF59 / DOTAP 80 con ADN de p55 libre.
El grupo 6 usó la emulsión MF59 con ADN de p55 libre.
El grupo 7 usó ADN de p55 libre solo.
El grupo 8 usó partículas PLG blanco y ADN de p55 libre.
El grupo 9 usó partículas PLG blanco, CTAB libre, y ADN de p55 libre.
Para cada grupo, se inmunizaron 10 ratones con cantidades suficientes de micropartículas o moléculas libres de manera que la dosificación de ADN de p55 era 1 \mug. La vía de inmunización era IM TA. Después de la inmunización, se midió el título de suero anti - ADN de p55, cuyos resultados aparecen a continuación en la tabla 20F. El suero se midió a 3sp1 (tres semanas después de la primera inmunización) y 3sp2 (tres semanas después de la segunda inmunización).
TABLA 20F
Grupo Forma de Título del suero [GM/ / (SE)]
antígeno de
ADN de p55 3sp1 3sp2
1 Adsorbida sobre 72 21.600
partículas PLG / CTAB (29) (18.400)
2 Atrapada en 148 20.200
partículas PLG / CTAB (95) (3048)
TABLA 20F (continuación)
Grupo Forma de Título del suero [GM/ / (SE)]
antígeno de
ADN de p55 3sp1 3sp2
3 Adsorbida 40 23800
sobre partículas (52) (2293)
PLG / DOTAP
4 Libre 5 7
(3) (30)
5 Adsorbida 96 31.000
sobre emulsión (7) (3267)
MF59 / DOTAP
6 Adsorbida 5 10
sobre emulsión (0) (19)
MF59
7 Libre 3 3
(0) (0)
8 Libre 3 5
(0) (2)
9 Libre 3 35
(0) (55)
Las micropartículas de PLG / CTAB y PLG, y microemulsiones MF59 usando DOTAP 40 o DOTAP 80 usando ADN de p55 como antígeno a una dosis de 1 \mug excepto cuando se indica otra cosa, se prepararon como se ha descrito previamente, y se usaron para inmunizar ratones como sigue:
El grupo 1 usó partículas PLG / CTAB con ADN de p55 adsorbido, sin estallar (es decir, dichas partículas se estallaron in vivo antes de inmunización).
El grupo 2 usó partículas PLG / CTAB con ADN de p55 adsorbido.
El grupo 3 usó partículas PLG / CTAB (no secadas por congelación) con ADN de p55 adsorbido.
El grupo 4 usó la emulsión MF59 / DOTAP 40 con ADN de p55 adsorbido.
El grupo 5 usó la emulsión MF59 / DOTAP 40 con ADN de p55 adsorbido, a una dosificación de 10 \mug.
El grupo 6 usó la emulsión MF59 / DOTAP 80 con ADN de p55 adsorbido.
El grupo 7 usó la emulsión MF59 / DOTAP 80 con ADN de p55 adsorbido, a una dosificación de 10 \mug.
El grupo 8 usó ADN de p55 libre.
El grupo 9 usó ADN de p55 libre a una dosificación de 10 \mug.
El grupo 10 usó la emulsión MF59 con ADN de p55 libre a una dosificación de 10 \mug.
Para cada grupo, se inmunizaron 10 ratones con cantidades suficientes de micropartículas o moléculas libres de manera que la dosificación de ADN de p55 era 1 ó 10 \mug cada uno, como se ha indicado. La vía de inmunización era IM TA. Después de la inmunización, se midió el título de suero anti - ADN de p55, cuyos resultados aparecen a continuación en la tabla 20G. El suero se midió a 4sp1 (cuatro semanas después de la primera inmunización) y 2sp2 (dos semanas después de la segunda inmunización).
TABLA 20G
10
Ejemplo 24 Inducción de micropartículas de respuesta inmune en cobayas
Las micropartículas de PLG / CTAB con ADN de gp 120 absorbido se formaron como se ha descrito en los ejemplos previos. Otras muestras son como se muestra en la tabla 20, e incluyen las micropartículas con y sin fosfato de aluminio, los controles de gp 120 soluble libre, con y sin fosfato de aluminio, y proteína MP59, codificada por ADN de gp 120. La inmunización IM de cobayas e inducción de anticuerpos (recogida y análisis de suero) se realizaron como se ha descrito en los ejemplos previos. Los resultados se muestran en la tabla 21 a continuación.
TABLA 21
Formulación GMT SE
PLG / CTAB gp 120 1435 383
adsorbido (25 \mug)
PLG / CTAB gp 120 3624 454
adsorbido (25 \mug)+
fosfato de alúmina
ADN de gp 120 soluble 119 606
(25 \mug) + fosfato de
alúmina
ADN de gp 120 soluble 101 55
(25 \mug) solo
Proteína MF59 (50 \mug) 3468 911
Ejemplo 25 Inmunización intranasal (IN) con ADN de p 55 adsorbido sobre microparticulas
Las micropartículas PLG / CTAB con ADN de p55 adsorbida, y micropartículas de PLG / DDA con ADN de p55 adsorbido, se formaron como se ha descrito en los ejemplos anteriores. La Inmunización IN de ratones con 25 o 100 \mug, inducción de anticuerpos (recogida y análisis de suero) e inducción de CTL se realizó como se ha descrito en los ejemplos anteriores, a las dos y cuatro semanas después de la primera inmunización (2sp1, 4sp1), y dos y cuatro semanas después de la 2ª inmunización (2sp2, 4sp2), y dos y cuatro semanas después de la 3ª inmunización (2sp3, 4sp3). Los controles incluían inmunización con ADN de p55 soluble solo o con 10 \mug de toxina de cólera. Los resultados para la inducción de anticuerpos se muestran en la tabla 22, y los resultados para la lisis por CTL (a las cuatro semanas después de la cuarta inmunización) se muestran en la tabla 23 a continuación.
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TABLA 22
Formulación 2sp1 4sp2 2sp2 4sp2 2sp3 4sp3
PLG / CTAB 189 529 1412 882 908 742
con ADN de
p55
adsorbido
(25\mug)
PLG / CTAB 128 383 3462 2887 289000 134000
con ADN de
p55
adsorbido
(100 \mug)
TABLA 22 (continuación)
Formulación 2sp1 4sp2 2sp2 4sp2 2sp3 4sp3
PLG / DDA 247 482 1223 338 940 545
con ADN de
p55
adsorbido
(25 \mug)
PLG / DDA 143 1351 2538 1341 357000 161000
con ADN de
p55
adsorbido
(100 \mug)
ADN de p55 195 270 2298 617 1549 862
soluble
(100 \mug) + toxina
de cólera
(10 \mug)
ADN de p55 362 260 618 190 285 263
soluble
(100 \mug) solo 
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TABLA 23
12
^{a} Línea celular SvB pulsada con péptido irrelevante
^{b} Línea celular SvB pulsada con péptido p7g.
Ejemplo 26 Preparación de composiciones de adyuvantes
MTP - PE se proporcionó por CIBA - GEYGY (Basilea, Suiza). Escualeno y TWEEN® 80 se obtuvieron de Signa Chemical Co. (San Luis, MO). CFA e IFA se obtuvieron de Gibco (Grad Island, NY). Hidróxido de aluminio (Rehsorptar) se obtuvo de Reheis Chemical Co. (Berkeley Heights NJ).
La preparación de las emulsiones de gotitas de aceite de realizó mediante numerosos procedimientos. En el primer procedimiento, una mezcla constituida por escualeno al 4%, TWEEN® 80 al 0,008%, 250 \mug/ml de MTP - PE y antígeno en solución salina tamponada con fosfato (PBS) se pasó a través de una aguja de galga 23 6 veces. Esta emulsión estaba constituida por tamaños de gota en el intervalo de 10 micrones y se denomina MTP - PE - LO. El segundo procedimiento comprende pasar la mezcla anteriormente descrita a través de un emulsificador Kirkland cinco veces. Esta emulsión está constituida por gotitas de aceite principalmente de 1 - 2 micrones y se denomina MTP - PE - LO - KE. El emulsificador KIrkland (Kirkland Product, Walnut Creek, CA) es una versión a pequeña escala del homogeneizador comercial con bordes de cuchilla (por ejemplo, Modelo 30CG de Gaulin y Tipo 8.30H de Rainnie Minilab) generando aproximadamente 1000 psi (6894,8 kPa) en la cámara de trabajo. En el tercer procedimiento, las mezclas que contienen escualeno al 0,3 - 18% y 0,2 - 1,0 mg/ml de MTP - PE con o sin TWEEN® 80 se pasaron a través del Microfluidificador (Modelo Nº 110Y Microfluidics, Newton, MA) a 5.000 - 30.000 psi (34474 - 206843 kPa). Típicamente, 50 ml de emulsión se mezcló durante 5 minutos o 100 ml durante 10 minutos en el microfluidificador. Las emulsiones resultantes estaban constituidas por gotitas de aceite de 100 - 750 nm dependiendo de la concentración de escualeno, MTP - PE, y detergente y la presión y temperatura de trabajo del microfluidificador. Esta composición se denomina MTP - PE - LO - MF.
Ejemplo 27 Preparación de micropartículas usando CTAB de adyuvantes
Las micropartículas de blanco se produjeron usando CTAB como sigue. Soluciones usadas:
(1) RG 504 PLG al 4% (Boehringer Ingelheim) en cloruro de dimetilo.
(2) CTAB al 0,5% (Sigma Chemical Co., San Luis, MO) en agua.
En partículas, las micropartículas se prepararon combinando 12,5 ml de solución de polímero con 1,25 ml de agua destilada y homogeneizando durante 3 minutos usando un homogeneizador de banco de trabajo Omni con una sonda de 10 mm a 10 K rpm formando una emulsión agua / aceite. La emulsión ag / ac se añadió a 50 ml de la solución de CTAB al 0,5%, y se homogenizó durante 3 minutos, formando una emulsión agua / aceite / agua. La emulsión de ag / ac / ag se dejó en agitación durante toda una noche para la evaporación del disolvente, formando micropartículas. Las micropartículas formadas se filtraron después a través de una malla de 38 \mu, se lavaron con agua mediante centrifugación 4 veces y se liofilizaron. Después las micropartículas se calibraron en un calibrador Malvern Master para uso futuro.
Ejemplo 28 Efecto de los oligonucleótidos MPL y CpG sobre el fenotipo de respuesta inmune
Se inmunizaron grupos de 10 ratones como sigue: Grupo 1) MF59 con proteína p55 gag de VIH en presencia o ausencia de oligonucleótidos CpG; Grupo 2) MF59 que incorpora lípido A monofosforilo (MPL) con proteína p55 gag de VIH; Grupo 3) micropartículas SDS / PLG con proteína p55 gag de VIH adsorbida a la superficie en presencia y ausencia de oligonucleótidos CpG; Grupo 4) micropartículas SDS / PLG con proteína p55 adsorbidas con MPL; Grupo 5) proteína recombinante con MPL; y Grupo 6) proteína recombinante sola. La dosis de MP59 era 25 \mul por animal, proteína p55 de VIH era 25 \mug por animal, oligonucleótido CpG era 50 \mug por animal, y MPL se proporciono a 10 \mug por animal. La micropartículas se proporcionaron a una dosis que contenía 25 \mug de proteína.
El MPL se obtuvo de Ribi Immunochem Res. Inc (Hamilton, Montana). MPL/MF59 se preparó disolviendo MPL en CHCl_{3}, transfiriendo la solución en escualeno/Span85 y formulando la emulsión de MF59 patrón con Tween 80 /H_{2}O.
Proteína p55 gag de levadura recombinante se produjo mediante técnicas de ferementación convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica en que la levadura se fragmenta por un molino de bolas Dynomill. La proteína p55 se extrajo de material sedimentado obtenido de lisado celular en tampón urea /NaCl. La proteína soluble en urea se purificó hasta > 90% de homogeneidad mediante cromatografía de intercambio aniónico en presencia de urea 6 M.
Los ratones recibieron tres inyecciones intramusculares a intervalos semanales, y se recogieron muestras de suero dos semanas después de la tercera inyección y se ensayaron para evaluar la IgG total (G + M + A), IgG1 e IgG2a usando un ELISA quimioluminiscente basándose en CA Aequorn (Sealite, Inc., Norcross, GA). Los resultados de un ensayo típico se muestran en las figuras 1 y 2. En el caso de las micropartículas adsorbidas, los animales que reciben los oligonucleótidos CpG mostraban una respuesta de IgG2a 19 veces mayor que la de las partículas adsorbidas solas, 7 veces mayor respuesta que als partículas adsorbidas con MPL, y respuesta 17 veces mayor que la proteína sola. En el caso de al proteína con MF59, los animales que reciben los oligonucleótidos CpG mostraban una respuesta de IgG2a 7 veces mayor que la inducida en ausencia los oligonucleótidos CpG, 2,6 veces mayor que la combinación de MF59 y MPL, 15 veces mayor que la proteína con MPL, y 23 veces mayor que la proteína sola. Los resultados indican que los oligonucleótidos CpG en combinación con micropartículas o bien MF59 o PLG estimulan una respuesta de linfocitos Th 1 que es significativamente mayor que al respuesta inducida por los MPL con micropartículas o bien MF59 o PLG.
Los oligonucleótidos se prepararon por Oligos Etc., Inc (Wilsonville, OR). CpG1 comprende la SEQ ID Nº 28. La CpG2 comprende la secuencia de no CpG tccaggacttctctcaggtt (SEQ ID Nº29).
Ejemplo 29 Inmunización IM de proteína p55 gag y diversos adyuvantes
Se inmunizaron grupos de 9 ratones intramuscularmente, excepto cuando se indica, como sigue: Grupo 1) MF59 con proteína p55 gag de VIH recombinante, y DOTAP 80 en presencia de Oligonucleótido CpG1; Grupo 2) MF59 con proteína p55 gag de VIH recombinante, y DOTAP 160 en presencia de Oligonucleótido CpG1; Grupo 3) MF59 con proteína p55 gag de VIH recombinante y DOTAP; Grupo 4) MF59 con proteína p55 gag de VIH recombinante; Grupo 5) MF59 con proteína p55 gag de VIH recombinante en presencia de Oligonucleótido CpG1; Grupo 6) proteína p55 gag de VIH recombinante y DOTAP 160; Grupo 7) proteína p55 gag de VIH recombinante y Oligonucleótido CpG1; Grupo 8) proteína p55 gag de VIH recombinante, y DOTAP 160 en presencia de Oligonucleótido CpG1; y Grupo 9) vv - gag - pol (2 x 10^{7} pfu) IP. La dosis de MP59 era 25 \mul por animal, proteína p55 de VIH era 25 \mug por animal, proteína p55 de VIH era 25 \mul por animal, y oligonucleótido CpG era 50 \mug por animal. Después de la inmunización, se midió el título del suero de anti - p55 IgG, cyuos resultados aparecen en la figura 3. Como se ha observado, el título del anticuerpo en presencia de una emulsión cargada positivamente (con DOTAP) es dos veces tan alta como en ausencia de una emulsión cargada negativamente (sin DOTAP). Lisis de dianas (línea celular SvB) mediante CTL se midió también con cada grupo, cuyos resultados aparecen en la figura 4. Como se puede observar, la adición de DOTAP da como resultado una emulsión cargada positivamente que incrementa la respuesta de CTL.
Ejemplo 30 Adyuvantes de emulsión iónicos
Emulsiones submicrónicas que contienen tensioactivos iónicos se formularon usando una formulación de MF59 estabilizada no iónicamente. Se analizaron varios tensioactivos iónicos para evaluar la solubilidad en escualeno. Se encontró que tres detergentes iónicos dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DEPC) y ácido dioleoil-fosfatídico (DPA) que eran solubles en escualeno. Las emulsiones iónicas prototípicas se formularon disolviendo cada uno de los detergentes en escualeno/Span 80 al 10% a concentraciones que variaban entre 4 - 52 mg/ml de escualeno. Las mezclas de escualeno/tensioactivo se emulsionaron con Tween 80 al 0,5%/H_{2}O a 5 ml de escualeno/100 ml de H_{2}O. Se formó una preemulsión mediante homogeneización con un homogeneizador Silverson (5 minutos, 5000 rpm) y las emulsiones finales se prepararon mediante fluidificación (aproximadamente 10.000 psi (68948 kPa), 5 pases, Microfluidificador 110S). Las emulsiones de cada tipo se analizaron para evaluar el tamaño de la gotita y el potencial Z. Los resultados se muestran en la tabla 24 a continuación.
TABLA 24
Emulsión Tamaño medio de gotita (nm) Potencial Z (mv)
MF / DOTAP / 160 210 +51
MF / DOTAP / 160 / Cpg 171 -2
MF / DOTAP / 80 145 +42
MF / DEPC / 160 168 +26,5
MF / DPA / 160 162 -35,7
MF59 Aprox. 150 -20
MF59 / DOTAP / 160 y MF59 / DOTAP / 80 se analizaron APRA evaluar la unión de tanto ADN como CpG ODN. Dos formulaciones de MF59 / DOTAP, 160 mg/100 ml de DOTAP y 80 mg/100 ml de DOTAO, se usaron para adsorber ADN de p55. Cada una de las emulsiones se incubó con ADN a 50 \mug/ml, 100 \mug/ml y 200 \mug/ml durante toda una noche a 4ºC. También se incubó un control de MF59/agua sin DOTAP con 50, 100 y 200 \mug de ADN. Las emulsiones se centrifugaron usando un "air fuge", y el sobrenadante para cada muestra se sometió a hidrósis ácida y se desarrolló sobre el ensayo de ADN. (Ya que no había suficiente turbidez para interferir en las mediciones a A260). La MF59 sin muestras de control de DOTAP se usaron para establecer una curva patrón a partir de la cual se calculó la cantidad de ADN que quedó en el sobrenadante de las muestras de MF59 / DOTAP, cuyos resultados se muestran en la tabla 25 a continuación.
TABLA 25
Formulación Entrada de \mu g de ADN \mug adsorbidos reales % de eficacia
59/160 50 49,7 99,56
59/160 100 99,6 99,6
59/160 200 132 66
59/80 50 48,5 97
59/80 100 67,6 67,6
59/80 200 73 36
MF59 se preparó con DOTAP en el escualeno. Esto se incubó con 0,5 mg/ml de CpG durante toda una noche, el siguiente día la emulsión se centrifugó en una centrífuga eppindorf durante 50 minutos, y el sobrenadante se desarrolló sobre una columna de GPC. Se añadieron 0,5 ml de CpG a la MF59 regular y después el centrifugado se analizó sobre la columna. La cantidad de CpG en el sobrenadante MF59 / DOTAP era 50% de la MF59 con la adición de CpG, indicando que aproximadamente el 50% de la entrada de CpG está realmente en la fase oleosa.
Se realizó a continuación una adsorción isoterma, en la que la CpG se añadió a MF59 / DOTAP a 100 \mug/ml, 500 \mug/ml, 1 mg/ml y 2 mg/ml. Esto se dejó a 4ºC durante aproximadamente 4 días, después las muestras se centrifugaron en un "air - fuge", junto con MF59 con la adición con 0,5 mg/ml de CpG.
El subnadante (que estaba más claro), se desarrolló sobre una columna de CPG junto con una curva patrón realizada con la MF59 añadida a 0,5 \mug, 1 \mug, 5\mug, 10 \mug y 20 \mug. El porcentaje de adsorción se midió y los resultados se muestran en la tabla 26 a continuación.
TABLA 26
Mg/ml de entrada de cpG % de adsorción
150 100
500 97
1000 65
2000 42

Claims (49)

1. Una emulsión que comprende gotitas menores que 1 \mu de diámetro y que tiene una superficie adsorbente dicha emulsión que comprende:
(a)
un aceite metabolizable;
(b)
un agente emulsionante, que comprende un detergente iónico; y
(c)
al menos una macromolécula biológicamente activa seleccionada entre el grupo constituido por un polipéptido, un polinucleótido, un antígeno, un agente farmacéutico, una hormona, una enzima, un mediador de transcripción o traducción, un intermedio en la ruta metabólica, un inmunomodulador, y un adyuvante,
en la que dicha macromolécula biológicamente activa está adsorbida sobre la superficie de la emulsión.
2. La emulsión de la reivindicación 1, en la que dicho aceite y dicho agente emulsionante están presentes en al forma de una emulsión de aceite en agua que tiene gotitas de aceite, en la que al menos aproximadamente 80% (en número) de las gotitas de aceite son menores que 1 \mum de diámetro, y en la que dicha composición existe en la ausencia de un copolímero de bloque polioxipropileno-polioxietileno.
3. La emulsión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho aceite es un miembro del grupo constituido por un aceite animal, un hidrocarburo insaturado, un terpenoide, y un aceite vegetal.
4. La emulsión de la reivindicación 3, en la que dicho aceite es un terpenoide que es escualeno.
5. La emulsión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha composición comprende 0,5 a 20% en volumen de dicho aceite en un medio acuoso.
6. La emulsión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha composición comprende 0,01 a 0,5% en peso de dicho agente emulsionante.
7. La emulsión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho agente emulsionante además comprende un detergente no iónico.
8. La emulsión de la reivindicación 7, en la que dicho agente emulsionante comprende un mono-, di-, o triéster de polioxietilen sorbitán o un mono-, di-, o triéter de sorbitán.
9. La emulsión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho agente emulsionante comprende un detergente catiónico.
10. La emulsión de la reivindicación 9, en la que dicho detergente catiónico se selecciona entre el grupo constituido por bromuro de hexadeciltrimetilamonio, cloruro de benzalconio, bromuro de dimetil dioctodecil amonio, dioeloil-3-trimetilamonio propano, bromuro de doodeciltrimetilamonio, cloruro de bencildiemtilhexadecil amonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de metilbencetonio, y sulafato de 4-picolin dodecilo.
11. La emulsión de la reivindicación 9 o reivindicación 10, en la que dicha composición comprende 0,01 a 0,5% por peso de dicho detergente catiónico.
12. La emulsión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho agente emulsionante comprende un detergente aniónico.
13. La emulsión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha macromolécula es un adyuvante seleccionado entre el grupo constituido por un oligonucleótido CpG, una sal de aluminio, un componente de la pared celular bacteriana, y muramil péptido.
14. La emulsión de la reivindicación 13, en la que dicho oligonucleótido comprende al menos un enlace fosforotioato.
15. La emulsión de la reivindicación 14, en la que dicho oligonucleótido comprende al menos un enlace de ácido péptido nucleico.
16. La emulsión de la reivindicación 15, en la que dicho oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo constituido por las SEQ ID números 1 - 28.
17. La emulsión de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en la que dicho oligonucleótido comprende un motivo de CpG flanqueado por dos purinas inmediatamente 5' a dicho motivo y dos pirimidinas inmediatamente 3' a dicho motivo.
18. La emulsión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho antígeno es de un virus.
19. La emulsión de la reivindicación 18, en la que dicho antígeno viral comprende una subunidad viral.
20. La emulsión de la reivindicación 18 o reivindicación 19 en la que el virus se selecciona entre el grupo constituido por virus de la hepatitis C (VIH), virus de la hepatitis B (VHB), virus herpes simples (VHS), virus de inmunodeficiencia humano (VIH), citomegalovirus (CMV), virus de la gripe (flu), y virus de la rabia.
21. La emulsión de la reivindicación 20, en la que dicho antígeno se selecciona entre el grupo constituido por glicoproteína gD de VHS, glicoproteína gp 120 de VIH, y p55 gag de VIH.
22. La emulsión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que dicho antígeno es de una bacteria.
23. La emulsión de la reivindicación 22, en la que dicha bacteria se selecciona entre el grupo constituido por cólera, difteria, tétanos, tos ferina, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae.
24. La emulsión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que dicho antígeno es de un parásito.
25. La emulsión de la reivindicación 24, en la que dicho parásito es un parásito de malaria.
26. La emulsión de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para uso en medicina.
27. Uso de la emulsión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para la fabricación de un medicamento para inmunizar un animal.
28. Uso de la reivindicación 27, en la que dicho animal es un mamífero.
29. Uso de la reivindicación 28, en la que dicho mamífero es un ser humano.
30. Una composición que comprende la emulsión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, y una micropartícula que tiene una superficie adsorbente, dicha micropartícula comprendiendo: un polímero seleccionado entre el grupo constituido por poli(\alpha-hidroxi ácido), un ácido polihidroxibutírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido, y un policianoacrilato; y un segundo detergente.
31. La composición de la reivindicación 30, en la que dicha micropartícula además comprende una primera molécula biológicamente activa adsorbida sobre la superficie de la misma, en la que la primera macromolécula biológicamente activa es al menos un miembro seleccionado entre el grupo constituido por un polipéptido; un polinucleótido, un polinucleósido, un antígeno, un agente farmacéutico, una hormona, una enzima, un mediador de transcripción o traducción, un intermedio en una ruta metabólica, un inmunomodulador, y un adyuvante.
32. La composición de la reivindicación 30 ó 31, en la que dicha micropartícula además comprende una segunda molécula biológicamente activa encapsulada dentro de dicha micropartícula, en la que las segunda macromolécula biológicamente activa es al menos un miembro seleccionado entre el grupo constituido por un polipéptido; un polinucleótido, un polinucleósido, un antígeno, un agente farmacéutico, una hormona, una enzima, un mediador de transcripción o traducción, un intermedio en una ruta metabólica, un inmunomodulador, y un adyuvante.
33. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, en la que la micropartícula comprende un poli(\alpha-hidroxi ácido) seleccionado entre el grupo constituido por poli(L-lactida), poli(D, L-lactida), y poli(D,L-lactida-co-glicolida).
34. La composición de la reivindicación 33, en la que la micropartícula comprende poli(D,L-lactida-co-glicolida).
35. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, en la que el segundo detergente es un detergente catiónico.
36. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, en la que el segundo detergente es un detergente aniónico.
37. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, en la que el segundo detergente es un detergente no iónico.
38. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 37, en la que la macromolécula biológicamente activa es un antígeno seleccionado entre el grupo constituido por gp120, p24gag, p55gag, y antígeno Infliuenza A hemaglutinina.
39. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 37, en la que la primera macromolécula biológicamente activa es polinucleótido que codifica gp120.
40. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 37, en la que la segunda macromolécula biológicamente activa es un adyuvante.
41. La composición de la reivindicación 40, en la que el adyuvante adsorbido a la micropartícula es una sal de aluminio.
42. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 41, que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
43. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 42, que comprende además un adyuvante no adsorbido.
44. La composición de la reivindicación 43, en la que el adyuvante no adsorbido es un miembro seleccionado entre el grupo constituido por oligonucleótidos CgP, LTK63, LTR72, MPL, QS21, QuilA, y una sal de aluminio.
45. La composición de la reivindicación 44, en la que el adyuvante no adsorbido es un fosfato de aluminio.
46. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 45, para uso en medicina o diagnosis.
47. Uso de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 45, para la fabricación de un medicamento para inmunizar un animal.
48. Uso de la reivindicación 47, en el que dicho animal es un mamífero.
49. Uso de la reivindicación 48, en el que dicho mamífero es un ser humano.
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