TR201802662T4 - Nükleik asitler içeren su içinde yağ emülsiyonları. - Google Patents

Abstract

Buluş genellikle bir RNA molekülü gibi nükleik asit moleküllerini vermek için kullanılabilen katyonik su içinde yağ emülsiyonları ile ilgilidir. Emülsiyon partikülleri, bir yağ göbeği ve bir katyonik lipit içerir. Emülsiyon partiküllerinin ortalama çapı, yaklaşık 80 nm ila yaklaşık 180 nm arasındadır ve emülsiyonun N/P oranı en az 1.1:1'dir.

Description

TARIFNAMENUKLEIK ASITLER ICEREN SU IÇINDE YAG EMULSIYONLARIBULUSUN GEÇMISINükleik asit terap'otikleri, kanser, enfeksiyöz bozukluklar (AIDS), kalp hastaligi, artrit ve nörodejeneratif bozukluklar (bin, Parkinson ve Alzheimer) gibi kalitsal bozukluklar ila edinilmis duruinlar araligindaki hastaliklarin tedavisinde umut vaat etmektedir. Sadece genetik bir kusuru onarniak veya eksogen gen ürünlerinin ekspresyonunu indüklemek için fonksiyonel genler verilmez ayni zamanda endogen gen ekspresyonunu inhibe ederek terapötik bir etki saglamak için nükleik asit de verilebilir. Gen ekspresyonu inhibisyonuna, örn., antisens oligonükleotitler, çift iplikçikli RNAlar(örn, SiRNAlar, miRNAlar) veya riboziinler aracilik edebilir.Bu tür bir terapi için temel bir adim, in vivo hücrelere nükleik asit moleküllerinin verilmesidir. Bununla birlikte nükleik asit moleküllerinin, özellikle RNA moleküllerinin in vivo verilmesinde birçok teknik zorlukla karsilasilir. Bunlardan ilki, hücre ve serum nükleazlarindan dolayi in vivo enjekte edilen RNA”nin yari Ömrünün, sadece yaklasik 70 saniye olmasidir (bakiniz örn., Kurreck, Eur. J .

Bioch. 270:1628-44 (2003)). Kimyasal modifikasyonlar kullanilarakenjekte edilen RNAsnin stabilitesi arttirilmaya çalisilmistir ancak kimyasal degisimlerin, sitotoksik etkilerin artmasina veya fonksiyon kaybina veya azalmasina yol açtigi birkaç 'Örnek mevcuttur. Spesifik bir örnekte hücreler, her saniye fosfat yerine fosforotiyoatin konuldugu RNAi dubleks dozlarini tolere etmedi (Harborth ve arkadaslari, Antisense Nucleic Acid Drug Rev. l3(2): 83-105 (2003)).

Bu yüzden terapötik bir tepki ortaya çikarmak içiii yeterli miktarlarda nükleik asit molekülünü (özellikle RNA moleküllerini) in vivo verebilen ve konakçi için toksik olmayan verme sistemlerigelistirilmesi gerekmektedir.Nükleik asit bazli asilar, asilama içiii çekici bir yaklasimdir. Örnegin anti jeiii sifreleyen plazmid DNA”nin intraniüsküler (IM) immünizasyonu, hücresel ve hüinoral immün tepkileri indükleyebilir ve tehdide karsi koruma saglayabilir. DNA asilari, protein aiitijenleri veya atenue patojenlerin kullanildigi klasik asilara göre bazi avantajlar sunar. Öriiegiii protein asilari ile kiyaslandiginda DNA asilari, dogal konformasyonunda düzgün sekilde katlaiimis bir anti jen üretilmesinde ve bir hücresel immün tepkisi üretmede daha etkili olabilir. DNA asilari ayrica ölü veya atenue patojenler ile baglantili bazi güveiilik problemlerini de tasimaz. Örnegiii bir ölü viral preparasyon, rezidual canli virüsler içerebilir ve bir atenue virüs, mutasyona ugrayarakpatojenik bir feiiotipe dönüsebilir.Nükleik asit bazli asilarla ilgili bir diger problem, insan disi primatlarda ve insanlarda güçlü immün tepkileri elde etmek için genellikle büyük nükleik asit dozlarinin gerekmesidir. Bu yüzden nükleik asit bazli asilarin potansini arttirmak için verme sistemleri veadjuvanlara gerek vardir. Nükleik asit moleküllerini hücrelere dahiletmek için kalsiyum fosfat transfeksiyonu, polipren transfeksiyonu, protoplast füzyonu, elektroporasyon, mikroenjeksiyon ve lipofeksiyongibi çesitli yöntemler gelistirilmistir.Katyonik lipitler yaygin sekilde genleri hücrelere verecek lipozomlar seklinde formüle edilmektedir. Bununla birlikte az miktarda serum bile (~%10) lipozom/DNA komplekslerinin transfeksiyon aktivitesini belirgin sekilde azaltabilir çünkü serum, aniyonik materyaller içerir.

Son zamanlarda DNA moleküllerini hücreler içerisine vermek için katyonik lipit einülsiyonu gelistirildi. Bakiniz örn., Kim ve arkadaslari, International Journal of Pharmaceutics, 295, 35-45(2005).ABD Patent No. 6,753,015 ve 6,855,492, nükleik asit moleküllerinin omurgali bir sü jeye katyonik mikropartiküller kullanilarak verilmesine yönelik bir yöntemi açiklar. Mikropartiküller, bir polimer, örn., bir poli(0(-hidroksi asit), bir polihidroksi butirik asit, bir polikaprolakton, bir poliortoester, bir polianhidrid ve benzerini içerir ve bunlar, katyonik surfektanlar kullanilarak olusturulur. Nükleik asitmolekülleri, mikropartiküllerin yüzeyleri üzerine adsorbe edilir.Kim ve arkadaslari (Pharmaceutical Research, cilt 18, sayfa 54-60, 2001) ve Chung ve arkadaslari (Journal of Controlled Release, cilt 71, sayfa 339-350, 2001), DNA moleküllerinin in vitro ve in vivo transfeksiyon verimliligini arttirmak için kullanilan çesitli su içindeyag emülsiyon formülasyonlarini açiklar.

Ott ve arkadaslari (Journal of Controlled Release, cilt 79, sayfa 1-5, 2002), DNA için bir verme sistemi/adjuvan olarak katyonik mikron alti bir emülsiyonu kapsayan bir yaklasimi açiklar. Mikron alti emülsiyon yaklasimi, büyük ölçekte üretilmekte ve ticari olarak onaylanmis bir ürün (Fluad®) içinde kullanilmakta olan güçlü bir su içinde skualen adjuvani MF59°a dayanir. Plazmid DNA”nin hücre içine verilmesini kolaylastirmak için l,2-dioleoil-3-trimetilamonyum-propan (DOTAP) kullanildi.DNA bazli asilar, hastaliklarin engellenmesi ve tedavisi için umut vaat etmeye devam etse de bunlarin güvenligiyle ilgili genel sorunlar giderek artinaktadir. Dahil edilen DNA molekülleri, potansiyel olarak konakçi genomuna entegre olabilir veya çesitli dokulara yayilmalarindan dolayi bunlar, anti jenlerin istenmeyen sekilde sürekli eksprese olmasina yol açabilir. Ek olarak SNA inoleküllerini vermek için bir araç olarak bazi DNA virüsleri de kullanilmaktadir.

Enfeksiyöz özelliklerinden ötürü bu tür virüsler, çok yüksek bir transfeksiyon oranina ulasir. Kullanilan virüsler, transfekte edilmis hücre içerisinde hiçbir fonksiyonel enfeksiyöz partikül olusmayacak sekilde genetik olarak modifiye edilir. Bununla birlikte bu önlemlere ragmen dahil edilen gen ve viral genlerin, örnegin potansiyel rekombinasyon olaylarindan ötürü kontrolsüz yayilma riskinin ortadan kalkmasi mümkün olinaz. Bu ayrica DNASnin örn., rekombinasyon yoluyla konakçi hücresi genomundaki saglam bir gene girme riskine de yol açar ve sonuçta bu gen mutasyona ugrayabilir ve böylelikle tamamen veya kismen eylemsizlesebilir veya yanlis bilgilendirmeye yol açabilir. Baska bir deyisle hücre için hayati olan bir gen ürünününsentezi tamamen baskilanabilir veya alternatif olarak modifiye olmus veya dogru olmayan bir gen ürünü ekssprese edilir. Ek olarak klinik evrede viral vektörlerin üretimini ve saflastirmasini büyütmek degenellikle zordur.DNA”nin, hücre büyümesinin regüle edilmesinde yer alan bir gen içerisine entegre edilmesi durumunda özel bir risk ortaya çikar. Bu durumda konakçi hücre, dejenere olabilir ve kanser veya tümör olusmasina yol açabilir. Ayrica hücre içerisine dahil edilen DNA°nin eksprese edilecek olmasi durumunda ilgili DNA aracinin viral CMV proinoteri gibi kuvvetli bir promoter içermesi gerekir. Bu tür promoterlerin, isleme tabi tutulan hücre genomu içerisine entegre edilmesi, hücre içerisinde gen ekspresyonunun regülasyonunda istenmeyen degisikliklere neden olabilir. Bir immün tepkisi indükleyecek bir ajan olarak (örn., bir asi olarak) DNA kullanilmasinin bir diger riski, içerisine yabanci DNA dahil edilmis olan hastada patojenik anti-DNA antikorlarinin indüklenmesi veböylelikle istenmeyen bir immün tepkisi ortaya çikmasidir.Bir antijeni veya bunun bir türevini sifreleyen RNA molekülleri de asilar seklinde kullanilabilir. RNA asilari, DNA asilarina kiyasla bazi avantajlar sunar. Ilk olarak RNA, konakçiya entegre edilemez, böylelikle malignanlik riski ortadan kalkar. Ikinci olarak RNA”n1n hizli degrade olmasindan ötürü yabanci transgenin ekspresyonu siklikla kisa ömürlü olur ve böylelikle anti jenin kontrolsüz uzun süreli ekspresyonundan kaçinilir. Uçüncü olarak RNA moleküllerinin, sifrelenmis anti jeni eksprese etmek için sadece sitoplazmaya verilmesigerekirken DNA molekülleri, nükleer membrandan geçmelidir.

Bununla birlikte DNA bazli asilara kiyasla RNA bazli asilara nispeten daha az dikkat gösterilmistir. RNAlar ve oligonükleotitler, bir terapötik veya asi seklinde uygulandiginda nükleazlar tarafindan degradasyona yüksek düzeyde duyarli olan hidrofilik, negatif yüklü moleküllerdir. Ek olarak RNAlar ve oligonükleotitler, hücrelere aktif sekilde aktarilmaz. Bakiniz örn., Vajdy, M. ve arkadaslari, Mucosal adjuvants aiid delivery systemsfor protein-, DNA- and RNA -based vaccines, Immunol Cell Biol, 2004. 82(6): sayfa 617-27.Ying ve arkadaslaru (Nature Medicine, cilt 5, sayfa 823-827, 1999), B- galaktosdazi sifreleyen çiplak RNA”nin verildigi ve CD8+ hücrelerinin indüklenmesiiiin rapor edildigi kendiliginden replike olanbir RNA asisini açiklar.Montana ve arkadaslari (Bioconjugate Chem. 2007, 18, sayfa 302- 308), gen transferi için RNA tasiyicilari olarak katyonik kati-lipit nanopartiküllerin kullanimini açiklar. Kati-lipit nanopartiküllerin, RNA molekülünü degradasyondan korudugu gösterildi ve RNA- partikül kompleksi deniz kirpisi yumurtalari içerisine mikro-enjekteedildikten sonra raport'or proteinin (floresin) eksprese oldugu saptandi.WO 2010/009277, (a) bir amfipatik peptit, (b) bir lipit ve (o) en az bir immünojenik tür içeren Nano Lipit Peptit Partiküllerini (NLPPler) açiklar. Bazi düzeneklerde NLPPler ayrica bir katyonik lipit gibi pozitif yüklü bir "yakalama ajani" da içerir. Yakalama ajani, negatif yüklü bir immünojenik türü (örn., bir DNA molekülü veya bir RNA molekülü) ankre etmek için kullanilir. NLPP preparasyoiiu, lipitbilesenini çözünürlestirmek ve nano-partiküller olusturmak içinkullanilan amfipatik peptitler gerektirir.

Bu yüzden nükleik asit molekülleri için verme sistemleri saglanmasi gerekmektedir. Verme sistemleri, nükleik asit bazli asilar, özellikle deRNA bazli asilar için faydalidir.BULUSUN OZETIBu açiklama genellikle bir nükleik asit molekülün'un emülsiyon partiküllerine komplekslestigi katyonik su içinde yag emülsiyonlari ile ilgilidir. Emülsiyonlar, bir RNA molekülü gibi nükleik asit moleküllerini hücrelere vermek için kullanilabilir. Emülsiyon partikülleri, bir yag göbegi ve bir katyonik lipit içerir. Katyonik lipit, negatif yüklü molekül ile etkileserek molekülü emülsiyon partiküllerine aiikre edebilir. Emülsiyon partiküllerinin ortalama çapi, yaklasik 80 nm ila yaklasik 180 nm arasindadir ve emülsiyonun N/Porani, en az 4: 1 ”dir.Bulus, 25°C°de sivi fazda olan bir yag göbegi ve bir katyonik lipit içeren emülsiyon partikülleri ve em'ulsiyon partiküllerine komplekslesen bir nükleik asit molekülü ihtiva eden immünojenik katyonik bir su içinde yag em'ûlsiyonu saglar; buradaki katyonik lipit, DOTAP, DOTMA, DOEPC, DSTAP, DODAC veya DODAP°dir ve su içinde yag emülsiyonu içerisindeki katyonik lipidin konsantrasyonu, 1.6 mg/ml ila 25 mg/ml arasindadir; buradaki nükleik asit molekülü, bir antijeni sifreleyen kendiliginden replike olan bir RNA”dir ve buradaki emülsiyon partiküllerinin ortalama çapi, 80 nm ila 180 nm arasindadir ve emülsiyonun N/P,si, en az 4:1”dir; buradaki N/P, katyonik lipit içindeki protonlanabilir iiitrojen atomlarinin molcinsinden miktari bölü RNA molekülü içerisindeki fosfatin mol cinsinden miktaridir; ancak nükleik asit molekülü, sekrete edilen alkalin fosfatazi sifrelememeli ve ayrica nükleik asit molekülü, sekansi SEK.KIM.NO.:l”de gösterilen (ABD Patent Basvurusu No. 61/361,892”deki Sekil 7A) plazinid A317”nin sifreledigi bir RNA olmamalidir. Bazi düzeneklerde bulus, nükleik asit molekül'unün, bir RSV F protein antijenini sifrelememesi gibi baska bir sarti ve/veya nükleik asit molekül'ûn'ün bir RSV proteinini sifreleinemesi gibi baskabir sarti da içerir.Immünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu tamponlanabilir Com., bir sitrat tainponu, bir sukinat tamponu, bir asetat tamponu ile) ve pH°si yaklasik 6.0 ila yaklasik 8.0, tercihen yaklasik 6.2 ila yaklasik 6.8 arasindadir. Istege göre immünojenik katyonik su içinde yag emi'ilsiyonu ayrica tercihen en fazla 30 mM°lik bir konsantrasyonda bir inorganik tuz da içerir. Alternatif veya ek olarak imm'ûnojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu, sulu fazda iyonik olmayan tonisifiye edici bir ajan, örn., bir seker, bir sekerli alkol veya bunlarin kombinasyonlarini veya bir polimer, örn., bir poloksamer de içerir. Eger varsa poliiner, yaklasik %005 ila yaklasik %20 (W/v) arasinda mevcut olabilir. Bazi düzeneklerde iinmünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu izotoniktir. Diger düzeneklerde immünojenikkatyonik su içinde yag emülsiyonlari, hipotonik veya hipertoniktir.Bazi düzeneklerde emülsiyon partiküllerinin yag göbegi, sunlarin olusturdugu gruptan seçilen bir yag içerir: Hint yagi, hindistan cevizi yagi, Misir yagi, Pamuk tohumu yagi, Çuha çiçegi yagi, Balik yagi, Jojoba yagi, domuz yagi, Bezir yagi, Zeyinyagi, Yerfistigi yagi, Aspir yagi, Susam yagi, Soya yagi, Skualen, Skualan, Ayçiçegi yagi, Bugday tohumu yagi ve bunlarin kombinasyonlari. Ozel düzeneklerde yag göbegi, skualendir. Katyonik lipit, sunlarin olusturdugu gruptan seçilebilir: l,2-dioleoiloksi-3-(trimetilamonyo)propan (DOTAP), 3ß- [N-(N”,N°-Dimetilaminoetan)-karbamoil]Kolesterol (DC Kolesterol), dimetildioktadesilamonyum (DDA), 1,2-Dimirist0il-3- TrimetilAmonyumPropan (DMTAP), dipalmitoil(Ci6;0)trimetil amonyum propan (DPTAP), distearoiltrimetilamonyum propan (DSTAP), N-[ 1 -(2,3-dioleiloksi)propi1]-N,N,N-trimetilamonyum klorid (DOTMA), N,N-diole0il-N,N-dimetilamoiiyum klorid (DODAC), l,2-dioleoil-sn-gliser0-3-etilfosfokolin (DOEPC), 1,2- dioleoil-3-dimetilamonyumpropan (DODAP), 1,2-dilinoleiloksi-3- dimetilaminopropan (DLinDMA), Lipitler EOOOl-EOl 18 ve bunlarin kombinasyonlari. Tercih edilen bir düzenekte katyonik lipit,DOTAP°dir.Emülsiyon partikülleri ayrica bir surfektan, Örn., iyonik olmayan bir surfektan da içerebilir. Tercihen surfektan, bir Polietilen Glikol (PEG)-lipit degildir. Surfektan, yaklasik %001 ila yaklasik %25 (a/h) arasindaki bir miktarda mevcut olabilir. Bazi düzeneklerde surfektan, SPAN85 (Sorbitan Trioleat), Tween 80 (polisorbat 80) veya bunlarin bir kombinasyonudur. Bazi düzeneklerde su içinde yag emülsiyonu, esit miktarlarda SPAN85 (Sorbitan Trioleat) ve Tween 80 (polisorbat 80) içerir, 'Örnegin her bir partikülün %0.5°i (a/h) ayrica bir surfektanda içerir.Bulus ayrica 25°C”de sivi fazda olan bir yag göbegi ve bir katyonik lipit içeren emülsiyon partikülleri ve emülsiyon partiküllerinekomplekslesen bir nükleik asit molekülü ihtiva eden immünojenik katyonik bir su içinde yag emülsiyonu yapmaya yönelik bir yöntem ile ilgilidir; buradaki katyonik lipit, DOTAP, DOTMA, DOEPC, DSTAP, DODAC veya DODAP°dir ve su içinde yag emülsiyonu içerisindeki katyonik lipidin konsantrasyonu, 1.6 mg/ml ila 25 mg/inl arasindadir; buradaki nükleik asit molekülü, bir antijeni sifreleyen kendiliginden replike olan bir RNA°dir ve buradaki emülsiyon partiküllerinin ortalama çapi, 80 nin ila 180 nm arasindadir ve em'ûlsiyonun N/P”si, en az 4:1”dir; buradaki N/P, katyonik lipit içindeki protonlanabilir nitro jen atomlarinin mol cinsinden miktari bölü RNA molekûlü içerisindeki fosfatin mol cinsinden miktaridir; ancak nükleik asit moleküli'i, sekrete edilen alkalin fosfatazi sifreleinemeli ve ayrica nükleik asit moleküli'i, sekansi SEK.KIM.NO.:l°de gösterilen (ABD Patent Basvurusu No. 61/361,892”deki Sekil 7A) plazmid A3l7snin sifreledigi bir RNA olmamalidir. Yöntem, (i) burada tarif edildigi gibi bir yag göbegi ve bir katyonik lipit içeren emülsiyon partikülleri ihtiva eden bir katyonik su içinde yag emülsiyonlari ve (ii) bir nükleik asit içeren sulu bir çözelti saglanmasini ve (i) ve (ii)”nin birlestirilmesiyle adi geçen immünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonununyapilmasini kapsar.Bulus ayrica bir süjede bir immün tepkisi üretmeye yönelik olup süjeye, etkin iniktarda burada tarif edilen immünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonunun uygulanmasini kapsayan bir yöntemde kullanim için burada tarif edildigi gibi bir immünojenik katyonik suiçinde yag emülsiyonu ile de ilgilidir.ÇIZIMLERIN KISA TARIFI SEKIL 1A, 10:] NZP oraninda CNE17 ile komplekslesmis 1 mg RNA llreplikon VA306 kullanilan bir in Vivo SEAP deneyinin sonuçlarini gösterir.SEKIL lB, BALB/c farelerinde, CNE17 ile komplekslesmis, RSV F proteinini sifreleyen RNA replikon A317 ile immünizasyon sonrasinda 2Wpl ve 2Wp2 zaman noktalarinda toplam IgG titerlerini gösterir. Bu veriler, partikül büyüklügü arttikça SEAP ekspresyonunun azaldigini ve RSV F proteinine karsi immün tepkisinin azaldigini gösterir.SEKIL 2A-2C, RNA komplekslesmesinin ve farkli tampon kompozisyonlarinin partikül büyüklügü üzerindeki etkilerini gösterir.

SEKIL 2A, RNA komplekslesmesinin, CNE17 emülsiyonunda partikül büyüklügünü arttirdigini ve seker ve/veya alt tuzun (NaCl, 10 HM) partikül büyüklügünü azalttigini gösterir. Pluronic Fl27 ilavesi, partikül büyüklügünü, komplekslesme öncesi büyüklüge düsürdü.

SEKIL 2B, sitrat tamponunun partikül büyüklügü üzerindeki etkisini gösterir. SEKIL 2C, polimerlerin partikül büyüklügü üzerindekietkisini gösterir.BULUSUN DETAYLI TARIFI1. GENEL BAKISBu açiklama genellikle bir nükleik asit molekülünün, emülsiyon partiküllerine komplekslestigi katyonik su içinde yag emülsiyonlari ile ilgilidir; einülsiyon partiküllerinin ortalama çapi, yaklasik 80 nm ila yaklasik 180 nin arasindadir ve emülsiyonun N/P orani en az 4:1”dir.

Emülsiyon partikülleri, bir yag göbegi ve bir katyonik lipit içerir.

Katyonik lipit, negatif yüklü molekül ile etkileserek molekülü emülsiyon partiküllerine ankre edebilir. Emülsiyonlar, bir RNAmolekülü gibi nükleik asit moleküllerini hücrelere vermek için kullanilabilir.Mevcut bulus, kendiliginden replike olan RNA”nin sifreledigi bir antijene karsi yükselen bir iinmün tepkisinin, antijeni sifreleyen kendiliginden replike olan bir RNA molekülü içeren bir katyonik su içinde yag eniülsiyonunun bir kisiye uygulandigi durumda, einülsiyon partiküllerinin ortalama çapi ve emülsiyon partiküllerine komplekslesen RNA miktari (yani N/P orani) dahil olmak üzere emülsiyonun özelliklerinden etkilendigi kesfine dayanir. Kasifler, einülsiyon partiküllerinin ortalama çapinin, RNA moleküllerinin emülsiyona komplekslestigi durumda arttigini ve çapi büyük partiküllerin, nötralizan titerlerin düsmesine neden oldugunu tespit etti. Ortalama partikül çapinin 80 nm ile 180 nm arasinda oldugu emülsiyonlar, iyi nötralizan titerler saglar. Bu aralik içerisinde bile ortalama partikül büyüklügü, araligiii yüksek ucunda olan emülsiyonlar daha az tercih edilir ve ortalama partikül büyüklügü yaklasik 100 nm olanlar 'Özellikle tercih edilir. Yine yaklasik 100 nm ile yaklasik 130 nm arasindaki bir ortalama partikül çapi tercih edilir.

Kasifler sasirtici sekilde immün tepkisinin, emülsiyona koinplekslesen RNA miktari ile dogrudan lineer bir iliskiye sahip olniadigini kesfettiler. 4:1”lik bir N/P oraiii, sifrelenmis antijene iyi bir immün tepkisi üretir ancak daha yüksek N/P oranlari, daha yüksek nötralizantiterlere neden olur diye bir sart yoktur.Katyonik su içinde yag emülsiyonunun ortalama çapi, RNA moleküllerinin emülsiyona komplekslestigi durumda artar. Bu etki, emülsiyona inorganik tuzlarin dahil edilmesiyle azaltilabilir. Bununla birlikte inorganik tuzlar, nükleik asit moleküllerinin emülsiyonpartiküllerine baglanmasini inhibe edebilir, bu yüzden inorganiktuz(lar), sadece düsük konsantrasyonlarda (öm., en fazla yaklasik 30 HM) mevcut olmalidir. Arzu edilirse nükleik asit komplekslesmesinin neden oldugu partikül büyüklügü artisini azaltmak içiii hidrofilik polimerler kullanilabilir. Yine hidrofilik polimerler, nükleik asit moleküllerinin emülsiyon partiküllerine baglanmasini inhibe edebilir ve bu yüzden hidrofilik polimer(ler), sadece düsük konsantrasyonlarda(Öm., yaklasik %005 ila yaklasik %20 (a/h)) mevcut olmalidir.Antijeni sifreleyen bir RNA molekülü içeren katyonik su içinde yag emülsiyonlari, bir kisiye, sifrelenmis anti jene karsi bir immün tepkisi indükleinek için uygulanabilir. Bu amaçla katyonik su içinde yag emülsiyonlarinin kullanildigi durumda bunlarin izotonik olmasi tercih edilir. Bununla birlikte inorganik tuzlar, nükleik asit moleküllerinin einülsiyon partiküllerine baglanmasini inhibe edebileceginden tercihen iyonik olmayan tonisifiye edici bir ajan ile tonisite ayarlanir.

Tercih edilen düzeneklerde bir RNA inolekülü içeren katyonik su içinde yag emülsiyonlari, bir seker, sekerli alkol veya bunlarin kombinasyonu kullanilarak 250 mOsm/kg su ila yaklasik 320 mOsm/kg°ye ayarlanir.2. TANIMLAR Burada kullanildigi gibi tekil "bir" ve “bu” formlari, içerik açik birsekilde aksini göstermedikçe çogul göndermeleri de kapsar.Burada kullanildigi gibi "yaklasik" terimi, bir degerin +/- %10”una karsilik gelir."Surfektari" terimi, teknolojik bir terimdir ve genellikle hem enerjik olarak su tarafindan solvasyonu seçen bir hidrofilik gruba (öm., bir polar grup) hem de su tarafindan iyi solvatlanmayan bir hidrofobik gruba sahip herhangi bir moleküle karsilik gelir. "Iyonik olmayan surfektan" terimi, teknolojide bilinen bir teriindir ve genellikle hidrofilik grubu Com., polar grubu) elektrostatik olarak yüklü olinayanbir surfektan molekülüne karsilik gelir."Polimer" terimi, ayni veya farkli olabilen, bir araya getirilebilen tek tek kimyasal yarimlarin olusturdugu bir moleküle karsilik gelir.

Burada kullanildigi gibi "polimer" terimi, uç uca birlestirilerek bir lineer molekül olusturan tek tek kimyasal yarimlara ve ayrica dalli (öm., "çok kollu" veya "yildiz seklinde") bir yapi seklinde bir araya getirilen tek tek kimyasal yarimlara karsilik gelir. Ornek polimerler arasinda örn., poloksamerler yer alir. Poloksamerler, ortasinda, iki hidrofilik polioksietilen (poli(etilen 0ksid)) zinciri tarafindan kusatilinis bir hidrofobik polioksipropilen (poli(propilen 0ksid))zinciri olan iyonik olmayan 'uç bloklu k0p01imerlerdir.Bir "tampon", çözeltinin pH”sindeki degisikliklere dirençli bir suluçözeltiye karsilik gelir.Burada kullanildigi gibi "nükleotit analogu" veya "modifiye edilmis nükleotit", nükleosidin (örn, sitosin (C), timin (T) veya urasil (U)), adenin (A) veya guanin (G)) nitrojenli bazi içerisinde veya üzerinde bir veya daha fazla kimyasal modifikasyonun (örn., ikaineler) oldugu bir nükleotide karsilik gelir. Bir nükleotit analogu ayrica nükleosidin seker yariini ('orn., riboz, deoksiriboz, modifiye edilmis riboz,modifiye edilinis deoksiriboz, alt üyeli seker analogu veya açik Zincirli seker analogu) veya fosfat içerisinde veya üzerinde dekimyasal modifikasyonlar içerebilir.Burada kullanildigi gibi "sakarid", bir sakarid zinciri olusturacak sekilde düz Zincirli veya halka forinlarinda veya bunlarin bir kombinasyonu halinde olan monosakaridleri, oligosakaridleri veya polisakaridleri kapsar. Oligosakaridler, iki veya daha fazla monosakarid tortusu olan sakaridlerdir. Sakaridlerin örnekleri arasindaglukoz, maltoz, maltotrioz, maltotetraoz, sukroz ve trehaloz yer alir."Kendiliginden replike olan RNA," "RNA replikonu" veya "RNA vektör'i'i" terimleri, teknolojik terimlerdir ve genellikle tipik olarak bir hedef hücre içerisinde kendi amplifikasyonunu veya in vivo kendiliginden replikasyonunu yönetebilen bir RNA inolekülüne karsilik gelir. RNA replikonu, DNAsnin bir hücre içerisine dahil edilinesi ve transkripsiyonun meydana gelecegi çekirdege tasinmasi gerekineden direkt olarak kullanilir. Konakçi hücrenin sit0plazmasi içine dogrudan verine için RNA vektörü kullanildiginda heterolog nükleik asit sekansinin otonoin replikasyonu ve translasyonu veriinli bir sekilde meydana gelir. Alfavirüs türevli kendiliginden replike olan bir RNA, asagidaki elementleri sirali sekilde içerebilir: replikasyon için cis olarak gerekli 5' Viral sekanslar (ayrica geçmiste 5” CSE olarak da anilir), eksprese edildiginde biyolojik açidan aktif alfavir'ûs yapisal olmayan proteinlerini (örn., nsPl, nsP2, nsP3, nsP4) kodlayan sekanslar, replikasyon için cis olarak gerekli 3, viral sekanslar (ayrica geçmiste 3” CSE olarak da anilir) ve bir poliadenilat sistemi. Alfavirüs türevli kendiliginden replike olan RNA ayrica bir viral genom alti"birlesme bölgesi" promoteri, bir veya daha fazla yapisal protein geninden veya bunlarin bölümlerinden sekanslar, rekombinant alfavirüs partiküllerinin üretilmesini saglamak için yeterli büyüklükte harici nükleik asit molekül(ler)i ve ayrica eksprese edilecek heterologsekans(lar) da içerebilir."Adjuvan" terimi, bir farmasötigin aktivitesine yardimci olan veya bunu modifiye eden, 'Örnegin ve bunlarla sinirli olamaniak üzere bir antijene yönelik iinmün tepkisini arttiran ve/Veya çesitlendiren inimünolojik adjuvanlar gibi herhangi bir maddeye karsilik gelir. Bu yüzden immünolojik adjuvanlar arasinda antijenlere yönelik bir immün tepkisini güçlendirebilen bilesikler yer alir. Immünolojik adjuvanlar, hümoral ve/veya hücresel iminüniteyi güçlendirebilir.

Dogustan gelen bir immün tepkisini uyaran maddeler, buradaki immünolojik adjuvanlarin tanimina dahildir. Immünolojik adjuvanlarayrica "immüno-güçlendiriciler" olarak da anilabilirBurada kullanildigi gibi bir "antijen", bir veya daha fazla epit0p (örn., lineer, konformasyonel veya her ikisi de) içeren bir moleküle karsilik gelir. Burada kullanildigi gibi bir "epit0p", verilen bir türün (6111., bir anti jenik inolekül veya anti jenik kompleks), immünolojik spesifitesini belirleyen bölümüdür. Bir epit0p, mevcut anti jen taniminin sahasinda yer alir. Burada kullanildigi gibi "antijen" terimi, alt birim antijenleri, yani anti jenin dogasinda birlikte oldugu bütün bir organizmadan ayrive ayrik anti jenleri kapsar.Bir "immünolojik tepki" veya "immün tepkisi", bir süjede, bir anti jene veya bir immünolojik ad juvana yönelik hümoral ve/Veya hücresel biriinmün tepkisi gelismesidir.

Iniinüii tepkileri arasinda dogustan gelen ve adaptif immün tepkileri yer alir. Dogustan gelen immün tepkileri, immün sistem için ilk savunma hattini olusturan hizli etkili tepkilerdir. Buna karsilik adaptif immünite, verilen bir patojen veya bozukluktan (örn, bir tümör) gelen antijenleri taniyan soinatik olarak yeniden düzenlenmis reseptör genlerine (öm., T ve B hücre reseptörleri) sahip immün hücrelerin seçimini ve kloiial genlestirilmesini kullanarak spesifite ve iminünolojik hafiza saglar. Çogu etkisi arasinda dogustan gelen iniinün tepkileri, enflamatuar sitokinlerden hizli bir patlamaya ve makrofajlar ve dendritik hücreler gibi antijen sunan hücrelerin (APCler) aktiflesmesine yol açar. Patojenleri bilesenlerin kendisinden ayirt etmek için dogustan gelen iinmün sistem, patojenle baglantili moleküler paternler veya PAMPler olarak bilinen patojenlerden gelen imzalari saptayan nispeten degisken olmayan çesitli reseptörleri kullanir. Deney asilarina mikrobiyal bilesen ilavesinin, saglam ve dayanikli adaptif immün tepkileri gelismesine yol açacagi bilinir. immün tepkilerinin bu sekilde güçlenmesinin arkasindaki mekanizmanin, nötrofiller, makrofajlar, dendritik hücreler, dogal katil hücreler, B hücreleri dahil olmak üzere çesitli immün hücreler ve bazi immün olmayan hücreler, örn., epitelyal ve endotelyal hücreler üzerinde farkli sekilde eksprese edilen patern tanima reseptörleri (PRRler) oldugu bildirilmistir. PRRlerin angaje edilmesi, bu hücrelerden bazilarinin aktiflesinesine ve bunlarin sitokin ve kemokin sekrete etmesine ve ayrica diger hücrelerin olgunlasmasina ve göçüne yol açar. Pesinden bu, adaptif immün sistemin kurulmasina yol açan bir enflamatuar ortam yaratir. PRRler arasinda fagositik olmayan reseptörler, örn., Çan benzeri reseptörler (TLRler) ve nükleotitbaglayici oligoinerizasyoii alani (NOD) proteinleri ve fagositozindükleyen reseptörler, örn., çöpçü reseptörler, manoz reseptörleri ve ß-glukan reseptörleri yer alir. Bildirilen TLRler (bulusun çesitli düzeneklerinde immünolojik molekül olarak kullanilabilen rapor edilmis bazi ligand örnekleri ile birlikte) arasinda sunlar yer alir: digerleri arasinda TLR] (Mycobacteria, Neisseria°dan bakteriyel lipoproteinler), TLR2 (ziinosan maya partikülleri, peptidoglikan, lipoproteinler, lipopeptitler, glikolipitler, lipopolisakarid), TLR3 (Viral çift iplikçikli RNA, polile), TLR4 (bakteriyel lipopolisakaridler, bitki ürünü taksol), TLR5 (bakteriyel flagelinler), TLR6 (inaya zimosan partikülleri, lipotekoik asit, mikoplazinadan lipopeptitler), TLR7 (tek iplikçikli RNA, imikimod, resimikimod ve diger sentetik bilesikler, örn., loksoribin ve bropirimin), TLR8 (tek iplikçikli RNA, resimikimod) ve TLR9 (CpG oligonükleotitler). Dendritik hücreler, naif CD4+ yardimci T (TH) hücrelerinin priine edilmesinin baslatilmasi ve CD8+ T hücrelerinin katil hücrelere farklilasinasinin indüklenmesinde en 'Önemli hücre tiplerinden bazilari olarak kabul edilir. Örnegin TLR sinyalinin dogasi, gözlenen spesifik TH tepki tipini belirlediginden (Öm., THl”e karsilik THZ tepkisi) TLR sinyallemesinin, bu yardiinci T hücre tepkilerinin kalitesinin belirlenmesinde 'Önemli bir rol oynadigi bildirilmistir. Antikor (hümoral) ve hücresel immüniteden olusan bir kombinasyon, THl tipi bir tepkinin bir parçasi olarak üretilirken TH2 tipi bir tepki, baskin sekilde bir antikor tepkisidir. CpG DNA (TLR9) ve iinidazokinolinler (TLR7, TLR8) gibi çesitli TLR ligandlarinin, in vitro immün hücrelerden sitokin üretimini uyardigi belgelenmistir.

Imidazokinolinler, TLR agonistleri olduklari gösterilmis ilk küçük, ilaç benzeri bilesiklerdir. Diger bilgiler için bakiniz om., A. Pashine,N. M. Valiante ve J. B. Ulmer, Nature Medicine 11, 863-868 (2005),K. S. Rosenthal ve D. H. Zimmerman, Clinical and VaccineImmunology, 13(8), 821-829 (2006) ve burada verilen referanslar.Mevcut bulusun amaçlari çerçevesinde bir hüinoral iniinün tepkisi, antikor moleküllerinin aracilik ettigi bir iminün tepkisine karsilik gelirken bir hücresel immün tepkisi, T-lenfositlerinin ve/Veya diger beyaz kan hücrelerinin aracilik ettigi tepkidir. Hücresel immünitenin önemli bir yönü, sitolitik T hücreleri (CTLler) tarafindan anti jene özel bir tepkiyi kapsar. CTLler, majör histo-uyumluluk kompleksi (MHC) tarafindan sifrelenen ve hücrelerin yüzeyleri üzerinde eksprese edilen proteinler ile baglantili olarak sunulan peptit anti jenleri için spesifite gösterirler. CTLler, hücre içi mikroplarin hücre içinde tahrip edilmesinin indüklenmesine ve proinote edilmesine veya bu tür mikroplarla enfekte olmus hücrelerin lizlenmesine yardimci olur.

Hücresel immünitenin baska bir yönü, yardimci T hücreleri tarafindan antijene 'Özel bir tepkiyi kapsar. Yardimci T hücreleri, spesifik olmayan efekt'or hücrelerin, yüzeyleri üzerindeki MHC molekülleri ile baglantili olarak peptit antijenleri gösteren hücrelere karsi fonksiyonlarinin uyarilmasina ve bunlarin aktivitesinin odaklanmasina yardiinci olma görevi görür.Bir "hücresel immün tepkisi" ayrica sitokinlerin, kemokinlerin ve aktiflesmis T hücreleri ve/Veya diger beyaz kan hücreleri, örnegin CD4+ ve CD8+ T hücrelerinden türetilenlerin ürettigi bu tür digermoleküllerin üretilmesine de karsilik gelir.Böylece bir hücresel immün tepkisi ortaya çikarak bir kompozisyon, örn., bir immünojenik kompozisyon veya bir asi, hücre yüzeyindeMHC molekülleri ile baglantili olarak anti jen sunuinuyla bir omurgalisüjeyi duyarlilastirma görevi görebilir. Hücre aracili iminün tepkisi, yüzeylerinde anti jen sunan hücrelere veya bunlarin yakinina yönlendirilir. Ek olarak iinmünize edilmis bir konakçinin gelecekte koruninasini saglamak için de antijene özel T lenfositleri üretilebilir. Özel bir anti jen veya kompozisyonun, hücre aracili bir iinmünolojik tepki uyarma kabiliyeti, bu konuda biliiien birçok deneyle, örn., lenfoproliferasyon (lenfosit aktiflestirme) deneyleri, CTL sitotoksik hücre deneyleriyle, duyarlilastirilmis bir süjede antijene özel T lenfositlerinin deneye tabi tutulmasiyla veya anti jen ile tekrar uyarilmaya tepki olarak T hücrelerinin sitokin üretiminin ölçülmesiyle belirlenebilir. Bu tür deneyler, bu konuda iyi bilinir. Bakiniz örn., Erickson ve arkadaslari (1993) J. lmmunol. 151:4189-4l99; Doe ve arkadaslari (1994) Eur. J. lmmunol. 24:2369-2376. Böylece burada kullanildigi gibi bir iininünolojik tepki, CTL üretimini ve/Veya yardiinci T hücrelerinin üretimini veya aktiflesmesini uyaran bir tepki olabilir. Ilgili anti jen ayrica antikor aracili bir immün tepkisi de ortaya çikarabilir. Bu yüzden bir immünolojik tepki, örnegin, digerleri arasinda asagidaki etkilerden birini veya daha fazlasini kapsayabilir: öriiegin B hücreleri tarafindan antikor üretimi; ve/veya ilgili kompozisyon veya asi içerisinde mevcut bir anti jene veya aiitijenlere spesifik olarak yönlendirilmis baskilayici T hücrelerinin ve/Veya 78 T hücrelerinin aktiflestirilmesi. Bu tepkiler, örnegin, enfektifligi nötralize etme ve/Veya antikor-komplemente veya antikora bagli hücre sitotoksisitesine (ADCC) aracilik etme görevi görerek immünize edilmis bir konakçiya koruma saglayabilir. Bu tür tepkiler, bu konuda iyi biliiien standart immünodeneyler ve nötralizasyon deneyleri kullanilarak belirlenebilir.Mevcut açiklamaya uygun kompozisyonlar, farkli bir kompozisyon içerisinde denk miktarda bir antijenin (öm., buradaki antijen, çözülebilir bir protein seklinde uygulanir) ortaya çikardigi immün tepkisinden daha büyük bir immün tepkisi ortaya çikarma kapasitesine sahip oldugunda verilen bir antijen için "artmis iinmünojeniklik" sergiler. Böylece bir kompozisyon, `Örnegin artmis iininünojeniklik sergileyebilir Çünkü kompozisyon, daha güçlü bir immüii tepkisi üretir veya çünkü uygulamanin yapildigi süjede bir immün tepkisine ulasmak için daha düsük dozda veya daha az dozda anti jeii gerekir. Bu tür bir immünojeniklik, örnegin, bulusa ait bir koinpozisyonuii ve bir antijen kontrolünün hayvanlara uygulanmasi ve ikisinin deneysonuçlarinin karsilastirilinasiyla belirlenebilir.3. KATYONIK SU IÇINDE YAG EMULSIYONLARIBurada açiklanan katyonik su içinde yag emülsiyonlari genellikle bu koiiuda bilinen bir sekilde, emülsiyoiilari hazirlamak için kullaiiilan bilesenlerin konsantrasyonlariyla açiklanir. Bu konuda, sterilizasyon ve diger asagi yöndeki prosesler dahil olmak üzere emülsiyon üretim prosesi sirasinda az miktarda yag (örn., skualen), katyonik lipit (örn., DOTAP) veya baska bilesenlerde kayip olabilecegi ve bu bilesenlerin son üründeki (öm., uygulama için hazir ambalajlanmis, sterilize edilmis bir emülsiyon) gerçek konsantrasyonlarinin, baslangiç niiktarlarindan, bazen yaklasik %10 kadar veya yaklasik %20 kadarolmak üzere biraz daha düsük olabilecegi anlasilir.Katyonik su içinde yag emülsiyonu partikülleri, bir yag göbegi ve bir katyonik lipit içerir. Katyonik lipit, nükleik asit molekülü ile 'Örnegin elektrostatik kuvvetler ve hidrofobik/hidrofilik etkilesiinler yoluylaetkilesebilir ve böylelikle nükleik asit iiiolekülü emülsiyon partiküllerine ankre edilebilir. Burada tarif edilen katyonik emülsiyonlar, bir antijeni sifreleyen bir RNA molekülü veya küçük müdahil RNA gibi bir iiükleik asit molekülünün in vivo hücrelere verilinesine özellikle uygundur. Örnegin burada tarif edilen katyonik emülsiyonlar, kendiliginden replike olan RNAlar dahil olinak üzere anti jenleri sifreleyen RNAlarin asilar seklinde verilmesinde avantajlarsunar.Su içinde yag einülsiyonlarinin partikülleri muhteinelen ortasinda bir yag göbegi olan bir miseli andirir. Yag göbegi, yag damlaciklarini sulu (sürekli) fazda misel benzeri damlaciklar seklinde disperse eden katyonik lipit ile kaplanir. Emülsiyon içerisinde asagida tarif edilen sekilde surfektanlar ve/veya fosfolipitler gibi bir veya daha fazla opsiyonel bilesen mevcut olabilir. Örnegin bir veya daha fazla surfektan, partikül olusmasini proiiiote etmek ve/veya emülsiyon partiküllerini stabilize etmek için kullanilabilir. Bu durumda yag göbegi, misel benzeri damlaciklar olusturmak için katyonik lipidin yani sira surfektan(1ar) ile de kaplanir. Benzer sekilde emülsiyoii partiküllerinin yüzeyi üzerinde bir veya daha fazla lipit (örn., nötr lipitler, glikol-lipitler veya fosfolipitler), bu tür lipitlerin yag damlaciklarini disperse etmek için emülsiferler olarak kullanilacagidurumda mevcut olabilir.Su içinde yag emülsiyoiilariiiin partiküllerinin ortalama çapi (yani ortalama sayisal çapi), 80 nm ila 180 nm, örnegin yaklasik 80 nm ila 150 nm, yaklasik 80 nm ila 130 nm veya yaklasik 80 nm ila 120 nm arasindadir. Ozellikle tercih edilen ortalama partikül çapi, yaklasik 100 nm°dir.

Emülsiyon partiküllerinin büyüklügü, surfektanin yaga oraninin (oraninin arttirilmasi, dainlacik büyüklügünü azaltir), homojenizasyon isletim basincinin (hoinojenizasyon isletim basincinin arttirilmasi tipik olarak damlacik büyüklügünü azaltir), sicakligin (sicakligin arttirilmasi, damlacik büyüklügünü azaltir) degistirilmesiyle, yag tipinin degistirilmesiyle, mikro-akiskanlastiricidan geçis sayisinin arttirilmasiyla ve burada tarif edilen diger proses parametrelerinin degistirilmesiyle degistirilebilir. Sulu faza bazi tampon tiplerinin dahiledilmesi de partikül büyüklügünü etkileyebilir.Burada tarif edilen einülsiyon partikülleri, burada daha detayli tarif edildigi üzere bir nükleik asit molekülü ile komplekslestirilebilir.

Genel olarak bir katyonik su içinde yag emülsiyonu, bir veya daha fazla türde nükleik asit molekülü içeren bir sulu çözelti ile birlestirilerek emülsiyon partiküllerine komplekslesen bir nükleik asit molekülü içeren emülsiyon olusturulur. Nükleik asit molekül(ler)i içeren sulu çözelti, N/P orani en az 4:1, 'Örnegin 4:1 ila 20:1 veya 4:1 ila 15tl olan komplekslesmis bir emülsiyon saglayacak konsantrasyonda nükleik asit ihtiva eder. Bu kolayca yapilabilir çünkü emülsiyoii içindeki nitro jeii (N) miktari, burada tarif edilen DOTAPH nicelemek için kullanilan HPLC yöntemi gibi uygun herhangi bir yöntem kullanilarak nicelenebilir. Sonra arzu edilen N/P oranina ulasmak için gereken fosfat (P) miktarini saglamak için yeterli miktarda nükleik asit içeren bir sulu nükleik asit molekülleri çözeltisihazirlanabilir.Bulusa ait bir 'Örnek katyonik emülsiyon burada "CMF32" olarak anilir. CMF32 yagi, skualendir (%43 a/h olarak) ve katyonik lipit, DOTAP°dir (3.2 mg/mL olarak). CMF32 ayrica SPAN85 (sorbitan trioleat, %05 h/h olarak) ve Tween 80 (polisorbat 80; polioksietilensorbitan monooleat; %05 h/h olarak) surfektanlarini da kapsar. Böylece CMF32 emülsiyon partikülleri, skualen, SPAN85, Tween80 ve DOTAP içerir. RNA moleküllerinin CMF32 partikülleri ile 4:1, 6:1, &1, 101, 12:1 ve 14:1”1ik N/P oranlarinda verimli bir sekilde komplekslestigi gösterildi. Diger örnek katyonik emülsiyonlar arasinda, örn., burada "CMF34" (%4.3 a/h skualen, %05 Tween 80, %05 SPAN85 ve 4.4 mg/mL DOTAP), "CMF35" (%43 a/h skualen, %05 Tween 80, %05 SPAN85, 5.0 mg/mL DOTAP) olarak anilanemülsiyonlar ve burada tarif edilen diger emülsiyonlar yer alir.Bulusa ait özel bir katyonik su içinde yag emülsiyonu, ayri ayri 2.1 ing/ml ila 2.84 ing/ml (tercihen 2.23 mg/ml ila 2.71 mg/ml) ve 30.92 mg/inl ila 41.92 ing/ml (tercihen 32.82 mg/ml ila yaklasik 40.02 mg/inl) arasindaki konsantrasyonlarda DOTAP ve skualen içerir ve ayrica esit miktarlarda SPAN85 ve Tween80 (örn, her biri yaklasik %05) içerir. Bulusa ait baska özel bir katyonik su içinde yag emülsiyonu, ayri ayri 2,78 mg/ml ila 3,76 mg/ml (tercihen 2,94 mg/ml ila 3,6 mg/ml) ve 18,6 mg/ml ila 25,16 mg/inl (tercihen 19,69 mg/ml ila yaklasik 24,07 mg/ml) arasindaki konsantrasyonlarda DOTAP ve skualen içerir ve ayrica esit miktarlarda SPAN85 ve Tween80 (örn., her biri yaklasik %05) içerir. Bu emülsiyonlarin partiküllerininortalama çapi, 80 nm ila 180 nm arasindadir.Mevcut bulusa ait su içinde yag emülsiyonlarinin ayri ayri bilesenleri, bu konuda bilinir ancak bu tür kompozisyonlar, burada tarif edilensekilde birlestirilineinistir. Buna göre ayri ayri bilesenler, asagida hem genel olarak hem de tercih edilen düzenekler için bir miktar detayla açiklanmis olinakla birlikte bu konuda iyi bilinir ve yag göbegi, surfektan, fosfolipitler, Vb. gibi burada kullanilan terimler, baska bir açiklama gerekmeksizin bu konuda uzman bir kisi tarafindan yeterince iyi bilinir. Ek olarak einülsiyonlarin ayri ayri bilesenlerinin iniktariyla ilgili tercih edilen araliklar verilmis olsa da özel bir emülsiyonun bilesenleriniii gerçek oranlarinin, arzu edilen büyüklük ve fiziksel özellikte emülsiyon partikülleri düzgünce olusturulabilecek sekilde ayarlanmasi gerekebilir. Örnegin özel bir miktarda yag kullanilmasi durumunda (örn., %5 h/h yag) surfektan miktari, yag damlaciklarini sulu faz içerisine disperse ederek stabil bir einülsiyon olusturmak için yeterli düzeyde olmalidir. Yag dainlaciklarini sulu faz içerisine disperse etmek için gerekli gerçek surfektan miktari, surfektanin tipine ve emülsiyon için kullanilan yag göbeginin tipine baglidir ve yag miktari ayrica damlacik büyüklügüne göre de degiskenlik gösterebilir (bu, iki faz arasindaki yüzey alanini degistirdiginden). Arzu edilen bir emülsiyonun bilesenlerinin gerçek miktarlari ve göreli oranlari, uzmanbir kisi tarafindaii kolayca belirlenebilir.A. Yag göbegi Katyonik su içinde yag emülsiyonlarinin partikülleri, bir yag göbegiiçerir.

Yag tercihen 1°C”de veya üzerinde suyu fazdadir ve suya karismaz.

Tercihen yag, metabolize olabilir, toksik olmayan bir yagdir; dahafazla tercihen yaklasik 6 ila yaklasik 30 karbon atomlu, örnegin vebunlarla sinirli olmamak üzere, alkanlar, alkenler, alkinler ve bunlarin ilgili asitleri ve alkolleri, bunlarin eterleri ve esterleri ve karisimlari gibi bir yagdir. Yag, bitkisel bir yag, balik yagi, hayvansal yag veya einülsiyonun uygulanacagi süjenin vücudu tarafindan metabolize edilebilen ve sü je için toksik olmayan sentetik olarak hazirlanmis bir yag olabilir. Sü je, bir hayvan, tipik olarak bir inemeli ve tercihen birinsan olabilir.Yag, 25°C ”de sivi fazdadir. Yag göbegi, 25°C ”de depolandiginda bir akiskanin `Özelliklerini sergiledigi (kati ve gazdan ayirt edilen; ve sinirli biçimde degil sinirli bir haciinde) 25°C,de sivi fazdadir.

Bununla birlikte emülsiyon, uygun herhangi bir sicakliktadepolanabilir ve kullanilabilir. Tercihen yag göbegi, 4°C°de sivifazdadir.Yag, uzun zincirli bir alkan, alken veya alkin veya bunlarin serbest asit, tuz veya bir ester, örn., bir mono- veya di- veya tri-ester seklinde bir asit veya alkol türevi ve 1,2-propandiolün veya benzer poli- hidroksi alkollerin esterleri olabilir. Alkoller, bir mono- veya poli- fonksiyonel asit, `Örnegin asetik asit, propaiioik asit, sitrik asit veya benzeri kullanilarak asile edilebilir. Yaglar gibi uzun zincirli alkollerden türetilen ve burada belirtilen diger kriterleri karsilayaneterler de kullanilabilir.Ayri ayri alkan, alken veya alkin yarimi ve bunun asit veya alkol türevleri genellikle yaklasik 6 ila yaklasik 30 karbon atoinuna sahip olacaktir. Yarim, düz veya dalli bir zincir yapisina sahip olabilir. Bu,tamamen doyinus veya bir veya daha fazla ikili veya üçlü baga sahipolabilir. Mono- veya poli-ester veya eter bazli yaglarin kullanilmasi durumunda yaklasik 6 ila yaklasik 30 karbon siniri, ayri ayri yagli asit veya yagli alkol yarimlari için geçerlidir, toplam karbon sayisi içindegil.Yagin, emülsiyonun uygulandigi konakçi tarafindan metabolizeedilebilir olmasi 'ozellikle istenir.Bir hayvan, balik veya bitkisel kayiiaktan uygun yaglar kullanilabilir.

Bitkisel yag kaynaklari arasinda kabuklu yemis, tohum ve tahillar ve yer fistigi yagi, soya yagi, hindistan cevizi yagi ve zeytinyagi ve benzeri gibi uygun yaglar yer alir. Diger uygun tohum yaglari arasinda aspir yagi, pamuk tohumu yagi, ayçiçegi tohumu yagi, susam tohumu yagi ve beiizeri yer alir. Tahil grubunda misir yagi ve bugday, yulaf, çavdar, pirinç, tef, tritikale ve benzeri gibi diger taneli tahillarin yaglari da kullanilabilir. Bitkisel yaglari elde etme teknolojisi iyice gelismistir ve iyi bilinir. Bu ve diger benzer yaglarin kompozisyonlari, örnegin Merck Index, and source materials on foods, nutrition andfood technology°de bulunabilir.Gliserol ve 1,2-pr0pandiolün yaklasik alti ila yaklasik on karbonlu yagli asit esterleri, tohum yaglari içinde dogal yollarla meydana gelmezken kabuklu yemis ve tohum yaglarindan baslanarak uygun materyallerin hidrolize edilmesi, ayrilmasi ve esterlenmesi suretiyle hazirlanabilir. Bu ürünler, PVO International, Inc., Chemical Specialties Division, 416 Division Street, Boongon, N.J. vedigerlerinden NEOBEES adi altinda ticari yollarla elde edilebilir.

Hayvansal yaglar ve kati yaglar, trigliseridler seklinde olduklari ve balik veya bitki yaglarindan daha yüksek bir doyina derecesine sahip olduklari gerçeginden ötürü fizyolojik sicakliklarda siklikla kati fazdadir. Bununla birlikte kati yagli asitler, hayvansal yaglardan, serbest yagli asitler saglayan kismi veya tam trigliserid sabunlastirina yoluyla elde edilebilir. Memeli sütünden gelen kati yaglar ve sivi yaglar metabolize olabilir ve bu yüzden bu bulusun uygulanmasinda kullanilabilir. Ayirma, saflastirma, sabunlastirma ve hayvan kaynaklarindan saf yaglar elde etmek için gerekli diger vasitalar, bukonuda iyi bilinir.Çogu balik, kolayca geri kazanilabilen metabolize edilebilir yaglar içerir. Ornegin morino baligi karaciger yagi, köpekbaligi karaciger yaglari ve balina yagi, örn., spermaseti, burada kullanilabilen balik yaglarindan birkaçini örnekler. Birçok dalli Zincirli yag,5 karbonlu izopren üniteleri içerisinde biyokimyasal olarak sentezlenir ve genellikle terpenoidler olarak anilir. Dalli, doymamis bir terpenoid olan skualen (2,6,10,15,19,23-heksameti1-2,6,lO,14,l 8,22- tetrakosaheksaen), burada özellikle tercih edilir. Baslica skualen kaynagi, kopek baligi karaciger yagi olmakla birlikte horozibigi tohumu, pirinç kepegi, bugday tohumu ve zeytinyagi dahil olmak üzere bitki yaglari (birincil olarak bitkisel yaglar) da uygun kaynaklardir. Skualen ayrica maya veya diger uygun mikroplardan da elde edilebilir. Bazi düzeneklerde Skualen tercihen zeytin, zeytinyagi veya maya gibi hayvan disi kaynaklardan elde edilir. Skualenin doymus analogu skualan da tercih edilir. Skualen ve skualan dahil olmak üzere balik yaglari, ticari kaynaklardan kolayca elde edilebilirveya bu konuda bilinen yöntemlerle elde edilebilir.Bazi düzeneklerde yag göbegi, sunlarin olusturdugu gruptan seçilen bir yag içerir: Hint yagi, hindistan cevizi yagi, Misir yagi, Pamuk tohumu yagi, Çuha çiçegi yagi, Balik yagi, Jojoba yagi, domuz yagi, Bezir yagi, Zeyinyagi, Yerfistigi yagi, Aspir yagi, Susam yagi, Soya yagi, Skualen, Skualan, Ayçiçegi yagi, Bugday tohuinu yagi ve Mineral yag. Ornek düzeneklerde yag göbegi, Suya yagi, Ayçiçegi yagi, Zeytinyagi, Skualen, Skualan veya bunlarin bir kombinasyonunu içerir. Skualan da yag olarak kullanilabilir. Omek düzeneklerde yaggöbegi, Skualen, Skualan veya buiilarin bir kombinasyonunu içerir.Emülsiyonun yag bileseni, yaklasik %02 ila yaklasik %20 (h/h) arasindaki bir miktarda mevcut olabilir. Örnegin katyonik su içinde yag emülsiyonu, yaklasik %02 ila yaklasik %20 (h/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %15 (h/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %10 (h/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %9 (h/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %8 (h/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %7 (h/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %6 (h/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %5 (h/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %43 (h/h) yag, yaklasik %03 ila yaklasik %20 (h/h) yag, yaklasik %04 ila yaklasik %20 (h/h) yag, yaklasik %05 ila yaklasik %20 (h/h) yag, yaklasik %1 ila yaklasik %20 (h/h) yag, yaklasik %2 ila yaklasik %20 (h/h) yag, yaklasik %3 ila yaklasik %20 (h/h) yag, yaklasik %4 ila yaklasik %20 (h/h) yag, yaklasik %43 ila yaklasik %20 (h/h) yag, yaklasik %5 ila yaklasik %20 (h/h) yag, yaklasik %05 (h/h) yag, yaklasik %1 (h/h) yag, yaklasik %15 (h/h) yag, yaklasik %2 (h/h) yag, yaklasik %2.5 (h/h) yag, yaklasik %3 (h/h) yag, yaklasik %35 (h/h) yag, yaklasik %4 (h/h) yag, yaklasik %43 (h/h) yag, yaklasik %5 (h/h) yag veya yaklasik %10 (h/h) yag içerebilir.

Alternatif olarak katyonik su içinde yag einülsiyonu, yaklasik %02 ila yaklasik %10 (a/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %9 (a/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %8 (a/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %7 (a/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %6 (a/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %5 (a/h) yag, yaklasik %02 ila yaklasik %43 (a/h) yag veya yaklasik %43 (a/h) yag içerebilir.Ornek bir düzenekte katyonik su içinde yag emülsiyonu, yaklasik %05 (h/h) yag içerir. Baska bir örnek düzenekte katyonik su içinde yag emülsiyonu, yaklasik %43 (h/h) yag içerir. Baska bir örnek düzenekte katyonik su içinde yag emülsiyonu, yaklasik %5 (h/h) yag içerir. Baska bir örnek düzenekte katyonik su içinde yag emülsiyonu,yaklasik %43› (a/h) skualen içerir.Yukarida kaydedildigi gibi yukarida tarif edilen yagin yüzdesi, emülsiyonlar hazirlamak için kullanilan yagin ilk miktarina göre belirlenir. Bu konuda, yagin son ürün (örn, uygulanmaya hazir ambalajlanmis, sterilize edilmis bir emülsiyonv) içindeki gerçek konsantrasyonunun, bazen yaklasik %10 veya yaklasik %20 kadarolmak üzere biraz daha düsük olabilecegi anlasilir.B. Katyonik LipitlerBurada tarif edilen emülsiyon partikülleri, negatif yüklü molekül ile etkileserek molekülü emülsiyon partiküllerine ankre edebilen bir katyonik lipit içerir. Katyonik lipit, DOTAP (1,2-dioleoiloksi-3- (trimetilamonyo)pr0pan), DOTMA (N-[l-(2,3-dioleiloksi)pr0pi1]- N,N,N-trimetilam0nyum klorid), DOEPC (l,2-diole0il-sn-gliser0-3- etilfosfokolin), DSTAP (distearoiltrimetilamonyum propan), DODAC (N,N-dioleoil-N,N- dimetilamonyum klorid) veya DODAP (1,2- dioleoil-3-dimetilainonyum-propan)”dir ve katyonik lipidin su içinde yag emülsiyonu içerisindeki konsantrasyonu, 1.6 mg/ml ila 25 mg/mlarasindadir.Katyonik lipitler, fizyolojik kosullar altinda pozitif yüklü bir nitrojen atomu içerir. Uygun katyonik lipitler arasinda benzalkonyum klorid (BAK), benzetonyum klorid, setrimid (tetradesiltriinetilanionyum bromid ve olasilikla az miktarda dodesiltrimetilamonyuin broinid ve heksadesiltrimetil amonyum bromid içerir), setilpiridinyum klorid (CPC), setil trimetilamonyum klorid. (CTAC), birincil aininler, ikincil aminler, üçüncü] aminler, örnegin ve bunlarla sinirli olmamak üzere, N,N”,N”-poli0ksietilen (10)-N-içyagi-l ,3-diamin0propan, diger dördüncül amin tuzlari, örnegin ve bunlarla sinirli olmamak üzere, dodesiltrimetilamonyum bromid, heksadesiltrimetilamonyuin bromid, karisik alkil-trimetil-ainonyuin bromid, benzildiinetildodesilainonyum klorid, benzildiinetilheksadesil-amonyuin klorid, benziltrimetilainonyum metoksid, setildimetiletilamonyum bromid, dimetildioktadesil amonyum bromid (DDAB), metilbenzetonyum klorid, dekametonyuin klorid, inetille karisik trialkil amonyuin klorid, metil trioktillamonyum klorid), N,N-dimetil-N-[2(2-metil-4- (1 ,1,3 ,3tetrainetilbutil)fen0ksi] -etoksi)etil]-benzeninetanaininyuinklorid (DEBDA), dialkildimetilainonyum tuzlari, [l-(2,3-dioleiloksi)- propil]-N,N,N,trimetilamonyum klorid, l,2-diasil-3-(trimetilamonyo) propan (asil grubu=dimiristoil, dipalmitoil, distearoil, dioleoil), 1,2- diasi1-3(dimetilamonyo)propan (asil grubu=dimiristoil, dipalmitoil, distearoil, dioleoil), l,2-di01e0i1-3-(4”-triinetil-ainonyo)butan0il-sn-gliserol, 1,2-diole0il 3-sukinil-sn-gliserol kolin ester, kolesteril (4,- trimetilamonyo) butanoat), N-alkil piridinyum tuzlari (öm., setilpiridinyuin broinid ve setilpiridinyuin klorid), N- alkilpiperidinyum tuzlari, dikatyonik bolaform elektrolitleri (C12M66; C12Bu6), dialkilglisetilfosforilkolin, lisolesitin, L-O( dioleoilfosfatidiletanolamin, kolesterol hemisukinat kolin ester, lipopoliaminler, örnegin ve bunlarla sinirli olinamak üzere, dioktadesilamidoglisilspermin (DOGS), dipalmitoil fosfatidiletanol- amidospermin (DPPES), lipopoli-L (veya D)-lisin (LPLL, LPDL), N- glutarilfosfatidiletanolainine konjuge edilmis poli (L (veya D)-lisin, pendant amino grubu ile didodesil glutainat ester (CizGluPhCUNÜ, pendant amino grubu ile ditetradesil glutamat ester (C14GluCnN+), katyonik kolesterol türevleri, `Örnegin ve bunlarla sinirli olmamaküzere, kolesteril-3ß-oksisukinainidoetilentriinetilainonyum tuzu,kolesteril-3 ß-oksisukinamidoetilendiinetilaniin, kolesteril-3 ß- karboksiamidoetilentriinetilainonyuin tuzu, kolesteril-3 ß- karboksiamidoetilendimetilarnin ve 3Y-[N-(N ' ,N- dimetilaminoetankarbomoil]kolesterol) (DC-Kolesterol), l ,2- dioleoiloksi-3 -(trimetilain0ny0)pr0pan (DOTAP), dimetildioktadesilamonyum (DDA), 1,2-Dimiristoil-3-TrimetilAmonyum Propan (DMTAP), dipalmitoil(C16:0)trimetil amonyum propan (DPTAP), distearoiltriinetilainonyum propan(DSTAP) ve bunlarin kombinasyonu yer alir.Diger katyonik lipitler arasinda, örn., ABD Patent Yayinlari 2008/0085870 (yayin tarihi 10 Nisan 2008) ve 2008/0057080”de (yayin tarihi 6 Mart 2008) tarif edilen katyonik lipitler yer alir.

Diger katyonik lipitler arasinda, örn., WO 2011/076807 (bu ayrica bu katyonik lipitleri yapma ve kullanma yöntemlerini de açiklar) tablo 6°da (sayfa 112-139) açiklanan EOOOl-E0118 veya E0119-E0180 Lipitleri yer alir. Ilave uygun katyonik lipitler arasinda N-[1-(2,3- dioleiloksi)pr0pil]-N,N,N-trimetilam0nyum klorid (DOTMA), N,N- dioleoil-N,N-dimetilam0nyum klorid (DODAC), 1,2-diole0il-sn- glisero-3-etilf0sf0kolin (DOEPC), 1,2-di01e0il-3-dimetilamonyum- propan (DODAP), 1,2-dilin01ei10ksi-3 -dimetilamin0pr0pan (DLinDMA) yer alir.Bulusa göre emi'ilsiyon, DOTAP (1 ,2-di01e0i10ksi-3- (trimetilammonyo)pr0pan), DOTMA (N-[l-(2,3-dioleiloksi)pr0pil]- N,N,N-trimetilam0nyum klorid), DOEPC (1,2-dioleoil-sn-gliser0-3- etilfosfokolin), DSTAP (distearoiltrimetilainonyum propan), DODAC (N,N-di01e0il-N,N-dimetilamonyum klorid) veya DODAP (1,2-dioleoil-3-dimetilamonyum-propan) içerir.Emülsiyon, bu katyonik lipitlerin burada tarif edilen diger katyoniklipitler ile herhangi bir kombinasyonunu da içerebilir.Bazi düzeneklerde katyonik lipit, DOTAP”t1r ve katyonik su içinde yag emülsiyonu, 1.6 mg/ml ila 25 mg/ml, `Örnegin yaklasik 1.7 mg/ml ila yaklasik 25 nig/ml, yaklasik 1.6 mg/ml, yaklasik 12 mg/ml, yaklasik 18 mg/ml, yaklasik 20 mg/ml, yaklasik 21.8 mg/ml, yaklasik 24 ing/ml, Vb. DOTAP içerir.Bazi düzeneklerde katyonik lipit, DOTMA”dir ve katyonik su içinde yag emülsiyonu, '1.6 mg/ml ila 25 mg/ml, örnegin yaklasik 1.7 mg/ml ila yaklasik 25 mg/ml, yaklasik 1.6 mg/ml, yaklasik 12 mg/ml, yaklasik 18 mg/ml, yaklasik 20 mg/inl, yaklasik 22,5mg/ml, yaklasik mg/ml, Vb. DOTMA içerir.Bazi düzeneklerde katyonik lipit, DOEPCdir ve katyonik su içinde yag emülsiyonu, 1.6 ing/ml ila 25 mg/ml, örnegin yaklasik 1.7 mg/ml ila yaklasik 25 mg/ml, yaklasik 1.6 ing/ml, yaklasik 1.7 mg/ml, yaklasik 1.8 mg/nil, yaklasik1.9 mg/nil, yaklasik 2.0 ing/m1, yaklasik 12 mg/inl, yaklasik 18 mg/ml, yaklasik 20 ing/m1, yaklasik 22,5mg/ml, yaklasik 25 mg/ml, Vb. DOEPC içerir.Bazi düzeneklerde katyonik lipit, DSTAP”tir ve katyonik su içinde yag emülsiyonu, 1.6 ing/n11 ila 25 ing/n11, örnegin yaklasik 1.7 mg/inl ila yaklasik 25 ing/m1, yaklasik 1.6 mg/ml, yaklasik 1.7 ing/ml, yaklasik 1.8 mg/ml, yaklasik1.9 mg/ml, yaklasik 2.0 mg/ml, yaklasik 12 mg/ml, yaklasik 18 ing/ml, yaklasik 20 ing/ml, yaklasik 22,5mg/ml, yaklasik 25 ing/ml, Vb. DSTAP içerir.Bazi düzeneklerde katyonik lipit, DODAC°dir ve katyonik su içinde yag emülsiyonu, 1.6 ing/ml ila 25 ing/ml, Örnegin yaklasik 1.7 nig/inl ila yaklasik 25 mg/ml, yaklasik 1.6 mg/ml, yaklasik 1.7 mg/ml, yaklasik 1.8 nig/ml, yaklasik1.9 mg/ml, yaklasik 2.0 ing/m1, yaklasik 12 mg/ml, yaklasik 18 mg/ml, yaklasik 20 mg/nil, yaklasik 22,5mg/ml, yaklasik 25 mg/ml, Vb. DODAC içerir.Bazi düzeneklerde katyonik lipit, DODAP,t1r ve katyonik su içinde yag eniülsiyonu, 1.6 mg/ml ila 25 mg/ml, örnegin yaklasik 1.7 mg/ml ila yaklasik 25 mg/nil, yaklasik 1.6 ing/n11, yaklasik 1.7 mg/inl, yaklasik 1.8 mg/ml, yaklasik] .9 mg/ml, yaklasik 2.0 mg/ml, yaklasik 12 mg/ml, yaklasik 18 mg/ml, yaklasik 20 mg/ml, yaklasik 22,5mg/ml, yaklasik 25 mg/ml, Vb. DODAP içerir.Bazi durumlarda yag göbegi içerisinde çözülebilen bir katyonik lipit kullanilmasi istenebilir. Öriiegin DOTAP, DOEPC, DODAC ve DOTMA, skualen veya skualan içerisinde çözülebilir. Diger durumlarda yag göbegi içerisinde çözülebilir olmayan bir katyonik lipit kullanilmasi isteiiebilir. Ömegin DDA ve DSTAP, skualen içinde çözülmez. Özel bir lipidiii yag içinde çözülebilir mi çözülemez mi oldugunun belirlenmesi ve buna göre uygun bir yag ve lipit koinbinasyonunun seçilmesi, bu konunun bilgisi dahilindedir. Örnegin çözünürlük, lipidin ve yagin yapilarina göre tahmin edilebilir (örn., bir lipidin çözünürlügü, kuyrugunun yapisiyla belirlenebilir). Örnegin bir veya iki doymainis yagli asit zinciriiie (öm., oleoil kuyruklari) sahip lipitler, örn., DOTAP, DOEPC, DODAC, DOTMA, skualen veya skualan içinde çözülebilirken doymus yagli asit zincirlerine (örn., stearoil kuyruklari) sahip lipitler, skualen içinde çözülebilir degildir.

Alternatif olarak çözünürlük, doymus bir çözelti olusturmak içinverilen miktarda yag içinde çözünen lipit miktarina göre belirlenebilir.Yukarida kaydedildigi gibi yukarida tarif edilen bir lipidin konsantrasyonu, emülsiyonlar hazirlamak için kullanilan lipidin ilk miktariiia göre belirlenir. Bu konuda, yagin son ürün (örn., uygulanmaya hazir ambalajlanmis, sterilize edilmis bir emülsiyon) içindeki gerçek konsantrasyonunun, bazen yaklasik %20 kadar olmak üzere biraz daha düsük olabilecegi anlasilir.C. Ilave BilesenlerBurada tarif edilen katyonik su içinde yag einülsiyonlari ayrica ilave bilesenler de içerebilir. Örnegin emülsiyonlar, partikül olusmasini proinote edebilen, nükleik asit molekülleri ile katyonik partiküller arasindaki komplekslesmeyi gelistirebilen veya nükleik asit molekülün'un stabilitesini arttirabilen (örn., bir RNA molekülünün degrade olmasini engellemek için) bilesenler içerebilir. Arzu edilirse katyonik su içinde yag eniülsiyonu, bir antioksidan, örii., sitrat,askorbat veya buiilarin tuzlarini içerebilir.Surfektanlar Bazi düzeneklerde katyonik su içinde yag emülsiyonunun partikülleri,bir surfektan içerir.Farmasötik bilimlerde 'Önemli sayida surfektan kullanilmaktadir.

Bunlar arasinda dogal yollarla türetilen materyaller, örii., agaçlardan zaniklar, bitkisel protein, seker bazli polimerler, örn., alginatlar ve selüloz ve benzeri yer alir. Karbon omurgasi üzerinde bir hidroksid veya baska bir hidrofilik ikame edici olan bazi oksipolimerler veya polimerler, örnegin povidon, poliviiiil alkol ve glikol eter bazli mono ve poli-fonksiyonlu bilesikler, surfektan aktivitesiiie sahiptir. Uzun Zincirli yagli asit türevli bilesikler, bu bulus dahilinde kullanilabilen üçüncü önemli bir emülsife edici ve süspanse edici ajan grubunuolusturur.Uygun surfektanlarin spesifik örnekleri arasinda sunlar yer alir: 1. Suyla çözülebilir sabunlar, örn., daha yüksek yagli asitlerin (Cm-CM) sodyum, potasyum, amonyum ve alkanol-amonyum tuzlari, özellikle sodyum ve potasyum içyagi ve hindistaiicevizisabunlari . 2. Anyonik sentetik sabun disi surfektanlar ki bunlar, moleküler yapilarinda yaklasik 8 ila 22 karbon atomu içeren bir alkil radikali ve sülfonik asit ve sülfürik asit ester radikallerinin olusturdugu gruptan seçilen bir radikal bulunan organik sülfürik asit reaksiyon ürünlerinin suyla çözülebilir tuzlari ile temsil edilebilir. Bunlarin örnekleri, içyagi veya hindistancevizi yagindan türetilmis sodyum veya potasyum alkil sülfatlar; sodyum veya potasyum alkil benzen sülfonatlar; sodyum alkil gliseril eter Sülfonatlar; sodyum hindistancevizi yagi yagli asit monogliserid sülfonatlar ve sülfatlar; bir mol daha yüksek yagli alkol ve yaklasik 1 ila 6 mol etilen oksidden olusan reaksiyon ürününün sülfürik asit esterlerinin sodyum ve potasyum tuzlari; molekül basina 1 ila 10 ünite etilen oksid olan ve alkil radikallerinin, 8 ila 12 karbon atomu içerdigi sodyum veya potasyum alkil fenol etilen oksid eter sülfonatlar; izetiyonik asit ile esterlenmis ve sodyum hidroksid ile nötralize edilmis yagli asitlerin reaksiyon ürünü; bir metil tauridin yagli asit amidinin sodyum veya potasyum tuzlari; ve 803- ile sülfonatlanmis C10- C24 0(-olefinlerin sodyum ve potasyum tuzlaridir.3. Alkilen oksid gruplarinin bir organik hidrofobik bilesik ile yogusturulmasiyla yapilan iyonik olmayan sentetik surfektanlar.

Tipik hidrofobik gruplar arasinda propilen oksidin propilen glikol ile yogusma ürünleri, alkil fenoller, propilen oksid ve etilen diaminin yogusma ürünleri, 8 ila 22 karbon atomuna sahip alifatik alkoller ve yagli asitlerin amidleri yer alir.4. Iyonik olmayan surfektanlar, örn., yari polar karakteristiklere sahip amin oksidler, fosfin oksidler ve sülfoksidler. UzunZincirli üçüncü] amin oksidlerin spesifik Örnekleri arasinda dimetildodesilamin oksid ve bis-(2-hidroksietil)dodesilamin yer alir. Fosfin oksidlerin spesifik 'Örnekleri, 14 Subat 1967 tarihinde çikarilmis ABD Pat. No. 3,304,263,te bulunur ve bunlar arasinda dimetildodesilfosfin oksid ve dimetil- (2hidr0ksidodesil) fosfin oksid yer alir.5. Uzun Zincirli sülfoksidler, örnegin Rl-SO-R2 formülüne karsilik gelenler; buradaki Rl ve R2, ikame edilmis veya edilmemis alkil radikalleridir; ilki, yaklasik 10 ila yaklasik 28 karbon atomu içerirken R2, 1 ila 3 karbon atomu içerir. Bu sülfoksidlerin spesifik örnekleri arasinda dodesil metil sülfoksid ve 3-hidroksi tridesil metil sülfoksid yer alir.6. Amfolitik sentetik surfektanlar, öm., sodyum 3- dodesilaininopropiyonat ve sodyum 3-d0desilamin0pr0pan sülfonat.7. Zwitteryonik sentetik surfektanlar, örn., 3-(N,N-dimetil-N- heksadesilamonyo)pr0pan- 1 -sülfonat ve 3 -(N,N-dimetil-N-heksadesilamonyo)-2-hidroksi prOpan- l -si'ilfonatEk olarak mevcut bulusa ait bir kompozisyon içerisinde asagidaki tiplerde surfektanlarin tamami da kullanilabilir: (a) yagli asitler, rosin asitleri ve içyagi içeren sabunlar (yani alkali tuzlar1); (b) alkil aren sülfonatlar; (c) alkil sülfatlar, örnegin hem dalli Zincirli hem de düz Zincirli hidrofobik gruplari ve ayrica birincil ve ikincil sülfat gruplari olan surfektanlar; (d) hidrofobik ile hidrofilik gruplar arasinda bir ara baglanti olan sülfatlar ve sülfonatlar, örn., yagli asile edilmis metil tauridler ve sülfatlanmis yagli monogliseridler; (e) polietilen glikolün uzun Zincirli asit esterleri, özellikle içyagi esterleri; (f) alkilfenollerinpolietilen glikol esterleri; (g) uzun Zincirli alkollerin polietilen glikol eterleri ve mersaptanlar; ve (h) yagli asil dietanol amidler.

Surfektanlar, birden fazla sekilde siniflandirilabileceginden bu paragrafta belirtilen birçok surfektan sinifi, daha önce tarif edilensurfektan siniflari ile çakisir.Biyolojik durumlar için spesifik olarak tasarlanmis ve buralarda yaygin sekilde kullanilan birçok surfektan vardir. Bu tür surfektanlar, dört temel tipe ayrilir: anyonik, katyonik, zwitteryonik (amfoterik) ve iyonik olmayan. Ornek anyonik surfektanlar arasinda, örn., perflorooktanoat (PFOA veya PFO), perflorooktansülfonat (PFOS), alkil sülfat tuzlari, örn., sodyum dodesil sülfat (SDS) veya ainonyum lauril sülfat, sodyum lauret sülfat (sodyum lauril eter sülfat, SLES olarak da bilinir), alkil benzen sülfonat ve yagli asit tuzlari yer alir.

Ornek katyonik surfektanlar arasinda, örn., alkiltriinetilamonyuin tuzlari, örn, setil trimetilamonyum bromid (CTAB veya heksadesil trimetil ainonyum bromid), setilpiridinyum klorid (CPC), polietoksile edilmis içyagi amini (POEA), benzalkonyuin klorid (BAC), benzetonyum klorid (BZT) yer alir. Ornek ZWitteryonik (amfoterik) surfektanlar arasinda örn., dodesil betain, kokamidopropil betain ve koko ainfo glisinat yer alir. Ornek iyonik olmayan surfektanlar arasinda örn., alkil poli(etilen oksid), alkilfenol poli(etilen oksid), poli(etilen oksid) ve poli(pr0pilen oksid)”in kopolimerleri (ticari olarak poloksamerler veya poloksaminler adiyla anilir), Aail poliglukosidler (öm., oktil glukosid veya desil maltosid), yagli alkoller (öm., setil alkol veya oleil alkol), kokamid MEA, kokamid DEA, Pluronic® F-68 (polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimeri) ve polisorbatlar, örn., Tween 20 (polisorbat 20), Tween80 (polisorbat 80; polioksietilensorbitan monooleat), dodesil dimetilamin oksid ve Vitamin E tokoferol propilen glikol sukinat(Vitamin E TPGS) yer alir.Ozellikle faydali bir surfektan grubunda sorbitan bazli iyonik olinayan surfektanlar yer alir. Bu surfektanlar, sorbitolün dehidre edilmesiyle hazirlanir ve böylelikle 1,4-sorbitan elde edilir ve bu daha sonra bir yagli asidin bir veya daha fazla dengi ile reaksiyona sokulur. Yagli asitle ikame edilmis yarim ayrica etilen oksid ile reaksiyona sokularakikinci bir grup surfektan elde edilebilir.Yagli asitle ikame edilmis sorbitan surfektanlari, 1,4-s0rbitanin bir yagli asit, örn., laurik asit, palmitik asit, stearik asit, oleik asit veya benzer uzun Zincirli bir yagli asit ile reaksiyona sokulmasiyla yapilir Ve böylece 1,4-sorbitan mono-ester, 1,4- sorbitan seskiester veya 1,4- sorbitan trimester elde edilir. Bu surfektanlarin genel adlari arasinda 'Örnegin sorbitan monolaurat, sorbitan monopalmitat, sorbitan monoestearat, sorbitan monooleat, sorbitan seskioleat ve sorbitan trioleat yer alir. Bu surfektanlar,SPAN® veya ARLACEL® adi altinda ticari yollarla elde edilebilir, çesitli mono-, di- ve tri-esterle ikame edilmis sorbitanlari ayirt etmek için bir harf veya sayikullanilir.SPAN® ve ARLACEL® surfektanlari, hidrofiliktir ve bunlar genellikle yag içinde çözülebilir veya disperse olabilir. Bunlar ayrica çogu organik solvent içinde de çözülebilir. Bunlar su içinde genellikle çözülebilir degildir ancak disperse olabilir. Genellikle bu surfektanlarin hidrofilik-lipofilik denge (HLB) sayisi 1.8 ila 8.6arasinda olacaktir. Bu tür surfektanlar, bu konuda bilinen vasitalarla kolayca yapilabilir veya ticari yollarla elde edilebilir.Ilgili bir surfektan grubunda olioksietilen sorbitaii monoesterler ve olioksietilen sorbitan triesterler yer alir. Bu materyaller, bir 1,4- sorbitan moiiester veya triestere etilen oksid ilave edilerek hazirlanir.

Polioksietileii ilavesi, lipofilik sorbitaii moiio- veya triester surfektani, genellikle su içinde çözülebilir veya disperse olabilir ve organik sivilar içiiide degisken derecelerde çözülebilir olan bir hidrofiliksurfektana döiiüstürür.TWEEN® markasi altinda ticari yollarla elde edilebilen bu materyaller, su içinde yag eniülsiyonlarinin ve dispersiyonlarinin hazirlanmasinda veya yaglarin çözünürlestirilmesinde ve susuz suyla çözülebilir veya yikanabilir merhemler yapilmasinda faydalidir.

TWEEN® surfektanlari, emülsiyon stabilitesiiii proniote etmek için ilgili bir sorbitan inonester veya triester surfektam ile birlestirilebilir.

TWEEN® surfektanlarinin HLB degeri genellikle 9.6 ila 16.7 arasina düsecektir. TWEEN® surfektanlari, ticari yollarla elde edilebilir.Tek basina veya SPAN®, ARLACEL® ve TWEEN® surfektanlari ile birlikte kullanilabilen üçüncü bir iyonik oliiiayan surfektan grubu, etilen oksidin uzun Zincirli bir yagli asit ile reaksiyona sokulmasiyla yapilan polioksietilen yagli asitleridir. Bu tipte en yaygin sekilde elde edilebilen surfektan, MYRJ® adi altinda katidir ve stearik asidin bir polioksietilen türevidir. MYRJ® surfektanlari, hidrofiliktir ve TWEEN® surfektanlari gibi su içerisinde çözülebilir veya disperse Olabilir. MYRJ® surfektanlari, TWEEN® surfektanlari ile veya TWEEN®/SPAN® veya ARLACEL® surfektan karisimlari ileemülsiyon olusturmak için kullanilmak üzere harmanlanabilir.

MYRJ® surfektanlari, bu konuda bilinen yöntemlerle yapilabilir veyaticari yollarla elde edilebilir.Dördüncü bir polioksietilen bazli iyonik olmayan surfektan grubu, lauril, asetil, stearil ve oleil alkollerden türetilen polioksietilen yagli asit eterleridir. Bu materyaller, yagli alkole etilen oksid ilave edilerek yukaridaki sekilde hazirlanir. Bu surfektanlariii ticari adi, BRIJ®°dir.

BRIJ® surfektanlari, surfektan içindeki polioksietilen yariminin ebadina bagli olarak hidrofilik veya lipofilik olabilir. Bu bilesiklerin preparasyonu, bu konuda mevcut iken bunlar ayrica ticarikaynaklardan da kolayca elde edilebilir.Potansiyel olarak kullanilabilen diger iyonik olmayan surfektanlar, örnegin, polioksietilen, poliol yagli asit esterleri, polioksietilen eter, polioksipropilen yagli eterleri, polioksietilen içeren balmumu türevleri, polioksietilen lanolin türevi, polioksietilen yagli gliseridleri, gliserol yagli asit esterleri veya 12-22 karbon atomlu uzun zincirliyagli asitlerin diger polioksietilen asit alkol veya eter türevleridir.Bulusa ait emülsiyonlar ve formülasyonlar, çok fazli sistemler olarak amaçlandigindan HLB degeri yaklasik 7 ila 16 araliginda olan emülsiyon Olusturucu iyonik olmayan bir surfektan seçilmesi tercih edilebilir. Bu deger, bir TWEEN® surfektani gibi tek bir iyonik olmayan surfektan kullanilarak elde edilebilir veya buna, örn., bir sorbitan mono, di- veya triester bazli surfektan ile bir surfektan harmani; bir sorbitan ester polioksietilen yagli asidi; bir polioksietilenlanolin türevli surfektan ile kombinasyon halinde bir sorbitan ester; HLB”si yüksek bir polioksietilen yagli eter surfektani ile kombinasyon halinde bir sorbitan ester; veya bir polietilen yagli eter surfektani veyapolioksietilen sorbitan yagli asidi kullaiiilarak ulasilabilir.Bazi düzeneklerde einülsiyon, eiiiülsiyon stabilize edici iyonik olmayan surfektan olarak tek bir iyonik olmayan surfektan, en 'Özel olarak da bir TWEEN® surfektani içerir. Ornek bir düzenekte em'ûlsiyon, diger türlü polisorbat 80 veya polioksietilen 20 sorbitan monooleat olarak bilinen TWEEN® 80 içerir. Diger düzeneklerde emülsiyon, iki veya daha fazla iyonik olmayan surfektan, Özellikle bir TWEEN® surfektani ve bir SPAN® surfektani içerir. Ornek bir düzenekte emülsiyon, TWEEN® 80 ve SPAN®85 içerir.Su içinde yag einülsiyonlari, yaklasik %001 ila yaklasik %2.5 surfektan (h/h veya a/h), yaklasik %001 ila yaklasik %2 surfektan, %001 ila yaklasik %1.5 surfektan, %001 ila yaklasik %1 surfektan, %001 ila yaklasik %05 surfektan, %005 ila yaklasik %05 surfektan, %008 ila yaklasik %05 surfektan, yaklasik %008 surfektan, yaklasik %01 surfektan, yaklasik %02 surfektan, yaklasik %03 surfektan, yaklasik %04 surfektan, yaklasik %05 surfektan, yaklasik %06 surfektan, yaklasik %07 surfektan, yaklasik %08 surfektan, yaklasik %09 surfektan veya yaklasik %1 surfektan içerebilir.Alternatif veya ek olarak su içinde yag emülsiyonlari, %005 ila yaklasik %1, %005 ila yaklasik %09, %005 ila yaklasik %08, %005 ila yaklasik %07, %005 ila yaklasik %06, %005 ila yaklasik %05, yaklasik %008, yaklasik %01, yaklasik %02, yaklasik %03, yaklasik %04, yaklasik %05, yaklasik %06, yaklasik %07, yaklasik %08, yaklasik %09 veya yaklasik %1 Tween 80 (polisorbat 80;polioksietilensorbitan monooleat) da içerebilir.Örnek bir düzenekte su içinde yag emülsiyonu, %008 Tween 80içerir.Alternatif veya ek olarak su içinde yag emülsiyonlari, %005 ila yaklasik %1, %005 ila yaklasik %09, %005 ila yaklasik %08, %005 ila yaklasik %07, %005 ila yaklasik %06, %005 ila yaklasik %05, yaklasik %008, yaklasik %01, yaklasik %02, yaklasik %03, yaklasik %04, yaklasik %05, yaklasik %06, yaklasik %07, yaklasik %08, yaklasik %09 veya yaklasik %1 SPAN85 (sorbitan trioleat) daiçerebilir.Alternatif veya ek olarak su içinde yag emülsiyonlari, burada tarif edilen bir surfektan kombinasyonunu da içerebilir. Örnegin Tween 80 (polisorbat 80; polioksietilensorbitan monooleat) ve SPAN85 (sorbitan trioleat) içeren bir kombinasyon kullanilabilir. Emülsiyonlar, bu surfektanlardan esit miktarlar da dahil olmak üzere degisken miktarlarda Tween® 80 ve SPAN85 (örn., yukarida ömeklenenler) içerebilir. Ornegin su içinde yag emülsiyonlari, yaklasik %005 Tween® 80 ve yaklasik %005 SPAN®85, yaklasik %01 Tween® 80 Ve yaklasik %01 SPAN®85, yaklasik %02 Tween® 80 ve yaklasik %02 SPAN®85, yaklasik %03 Tween® 80 ve yaklasik %03 SPAN®85, yaklasik %04 Tween® 80 ve yaklasik %04 SPAN®85, yaklasik %05 Tween® 80 ve yaklasik %05 SPAN®85, yaklasik %06 Tween® 80 ve yaklasik %06 SPAN®85, yaklasik %07 Tween® 80 ve yaklasik %07 SPAN®85, yaklasik %08 Tween® 80 ve yaklasik %08 SPAN®85, yaklasik %0.9 Tween® 80 ve yaklasik %0.9 SPAN®85 veya yaklasik %1 Tween® 80 ve yaklasik %10 SPAN®85 içerebilir.Polietilen Glikol (PEG)-lipitler, örn., dialkiloksipropillere birlestirilmis PEG (PEG-DAA), diasilgliserole birlestirilmis PEG (PEG-DAG), fosfatidiletanolamine (PE) (PEG-PE) veya diger bazi fosfolipitlere birlestirilmis PEG (PEG-fosfolipitler), seramidlere konjuge edilmis PEG (PEG-Cer) veya bunlarin bir kombinasyonu da surfektanlar olarak kullanilabilir (bakiniz öm., ABD Pat. No. ,885,613; U.S. patent basvuru yayini No. 2003/0077829, 2005/0175682 ve 2006/0025366). Diger uygun PEG-lipitler arasinda, örn., PEG-dialkiloksipropil (DAA) lipitler veya PEG-diasilgliserol (DAG) lipitler yer alir. Ornek PEG-DAG lipitler arasinda örn., PEG- dilauroilgliserol (Cu) lipitler, PEG-dimiristoilgliserol (CM) lipitler, PEG-dipalmitoilgliserol (C16) lipitler veya PEG-distearoilgliserol (C 18) lipitler yer alir. Ornek PEG-DAA lipitler arasinda örn., PEG- dilauriloksipropil (Ciz) lipitler, PEG-dimiristiloksipropil (CM) lipitler, PEG-dipalmitiloksipropil (Cm) lipitler veya PEG-disteariloksipropil (C 1 3) lipitler yer alir.PEGler, moleküler agirliklarina göre siniflandirilir; 'Örnegin PEG 2000”in ortalama moleküler agirligi yaklasik 2,000 daltondur ve PEG 5000°in ortalama moleküler agirligi yaklasik 5,000 daltondur. PEGler, Sigma Chemical C0. ve ayrica diger sirketlerden ticari yollarla elde edilebilir ve bunlar arasinda `Örnegin asagidakiler yer alir: monometoksipolietilen glikol (MePEG-OH), monometoksipolietilenglikol-sukinat (MePEG-S), monometoksipolietilen glikol-sukinimidil sukinat (MePEG-S-NHS), monometoksipolietilen glikol-amin (MePEG-NHZ), monometoksipolietilen glikol-tresilat (MePEG-TRES) ve monometoksipolietilen glikol-imidazolil-karbonil (MePEG-IM).

Ek olarak monometoksipolietilenglikol-asetik asit (MePEG- CHZCOOH) de PEG-DAA konjugatlari dahil olmak üzere PEG_lipitkonjugatlarinin hazirlanmasinda özellikle faydalidir.Tercihen PEG'nin ortalama moleküler agirligi yaklasik 1000 ila yaklasik 5000 dalton (örn., PEGiOOO, PEGzoOO, PEG3000, PEG4000, PEG5000) arasindadir. PEG istege göre bir alkil, alkoksi, asil veya aril grubu ile ikame edilebilir. PEG, direkt olarak lipide konjuge edilebilir veya lipide bir baglayici yarim yoluyla baglanabilir. PEG”nin bir lipide birlestirilmesi için uygun herhangi bir baglayici yarim, örn., ester içerikli olinayan baglayici yarimlar ve ester içerikli baglayiciyarimlar dahil olmak üzere kullanilabilir.Ornek düzeneklerde PEGZOOOPE, PEG5000PE, PEGIOOODMG, PEGZOOODMG, PEG3000DMG veya bunlarin bir kombinasyonu, bir surfektan olarak kullanilir. Örnek bazi düzeneklerde su içinde yag emülsiyonu, yaklasik 1 mg/inl ila yaklasik 80 mg/ml PEGZOOOPE, PEG5000PE, PEGIOOODMG, PEGZOOODMG veya PEG3000DMG içerir.Fosfolipitler Bazi düzeneklerde katyonik su içinde yag emülsiyonunun partikülleri,ayrica bir fosfolipit içerir.Fosfolipitler, molekülün alkol bileseninin bir fosfat grubu içerdigiyagli asitlerin esterleridir. Fosfolipitler arasinda gliserofosfatidler 47(gliserol içeren) ve sfingomiyelinler (sfingosin içeren) yer alir. Ornekfosfolipitler arasinda fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin,fosfatidilserin ve sfingomiyelin; ve dimiristoil fosfatidilkolin, dipalmitoil fosfatidilkolin, distearoil fosfatidilkolin, distearoil fosfatidilgliserol, dipalmitoil fosfatidilgliserol, dimiristoil fosfatidilserin, distearoil fosfatidilserin ve dipalmitoil serin içerensentetik fosfolipitler yer alir.Asagidaki `Örnek fosfolipitler kullanilabilir.

DDPC l ,Z-Didekanoil-sn-Glisero-3-fosfatidilkolinDEFA-NA 1,2-Dieruk0i1-sn-Glisero-3-Fosfat (Sodyuin Tuzu)DEPC 1,Z-Erukoil-sn-Gliser0-3-fosfatidilk01inDEPE l ,2-Dieruk0il-sn-Glisero-3 -fosfatidiletanolaminDEFG-NA 1,2-Dieruk0il-sn-Glisem-3 [Fosfatidil-rac-(l -gliser01...)DLOPC l,2-Linole0il-sn-Glisero-3-fosfatidilkolinDLPA-NA 1,2-Dilaur0il-sn-Gliser0-3-F0sfat (Sodyum Tuzu)DLPC l,2-Dilauroil-sn-Glisero-3-fosfatidilkolinDLPE l,2-Dilauroil-sn-Gliser0-3-fosfatidiletanolaminDLPG-NA 1 ,Z-Dilauroil-sn-Glisero-3 [F osfatidil-rac-( l -gliser01...) (Sodyum Tuzu)DLPG-NH4 l ,2-Dilauroil-sn-Glisero-3 [F osfatidil-raC-( l -gliser01...)DLPS-NA l,2-Dilauroil-sn-Glisero-3-fosfatidilserin (Sodyum Tuzu)DMPA-NA l,2-Dimiristoil-sn-Gliser0-3-Fosfat (Sodyum Tuzu)DMPC l,2-Din1irist0il-sn-Glisero-3-f0sfatidilkolinDMPE 1,2-Dimirist0il-sn-Gliser0-3-fosfatidiletanolaminDMPG-NA l ,2-Miristoi1-sn-Gliser0-3 [Fosfatidil-rac-( l -gliserol . .)DMPG-NH4 1,Z-Miristoil-sn-Gli'sero-3[Fosfatidil-rac-(1-gliserol...)DMPG-NH4/ NA l ,2-Mirist0il-sn-Glisero-3 [F osfatidil-rac-( l -gliserol.. .)DMPS-NA l,2-Dimiristoi1-sn-Gliser0-3-f0sfatidilserin (Sodyum Tuzu)DOPA-NA l,2-Diole0il-sn-Glisero-3-Fosfat (Sodyum Tuzu)DOPC l,2-Diole0il-sn-Gliser0-3-f0sfatidilkolinDOPE 1,2-Diole0il-sn-Gliser0-3-fosfatidiletanolamin DOPG-N A 1,2-Dioleoil-sn-Glisero-3[Fosfatidil-rac-( 1 -gliser01...)DOPS-NA l,2-Dioleoil-sn-Glisero-3-fosfatidilserin (Sodyum Tuzu)DPPA-NA l,2-Dipalmitoil-sn-Glisero-3-Fosfat (Sodyum Tuzu)DPPC l,2-dipalmitoil-sn-Glisero-3-fosfatidilkolinDPPE 1,2-Dipalmit0i1-sn-Gliser0-3-fosfatidiletanolaminDPPG-NA l,2-Dipalmitoil-sn-Gliser0-3[Fosfatidil-rac-( 1 -gliser01...)DPPG-NH4 1,2-Dipa1mit0i1-sn-G1isem-3[Fosfatidil-rac-(1 -gliser01...)DPPS-NA 1,2-Dipalrnit0il-sn-Glisero-S-fosfatidilserin (Sodyum Tuzu)DPyPE l,2-difitanoi1-sn-glisem-3 -fosfoetanolaminDSPA-NA 1,2-Distearoil-sn-Glisero-3-Fosfat (Sodyum Tuzu)DSPC l,2-Distearoil-sn-Gliser0-3-fosfatidilkolinDSPE 1 ,2-Distearoil-sn-Gliser0-3-fosfatidiletanolaminDSPG-NA l ,2-Distear0il-sn-Gliser0-3[Fosfatidil-rac-(1-gliserol...)DSPG-NH4 1,2-Distearoil-sn-Gliser0-3[Fosfatidil-rac-(1-gliserol...)DSP S-NA l,2-Distear0il-sn-Glisero-3-fosfatitilserin (Sodyum Tuzu)EPC Yumurta PC”siHEPC Hidrojene Yumurta PC 'siHSPC Yüksek safhkta Hidrojene Soya PC ”siHSPC Hidrojene Soya PC”siLYSOPC MYRISTIC l-Miristoil-sn-Gliser0-3-fosfatidilk01inLYSOPC PALMITIC l-Palmitoil-sii-Gliser0-3-fosfatidilkolinLYSOPC STEARIC I-Stearoil-sn-Gliser0-3-fosfatidi1k01inSüt Sfingomiyelin l-Mirist0i1,2-palmitoil-sn-Glisero 3-fosfatidilk01inMPPCMSPC 1-Miristoil,2-stear0i1-sn-Glisero -3-fosfatidi1kolinPMPC l-Palmitoil,2-miristoil-sn-Glisero-3-fosfatidilkolinPOPC l-Palinitoil,2-oleoil-sn-Gliser0-3-fosfatidilkolinPOPE l-Palinitoil-Z -oleoil-sn-Gliser0-3 -fosfatidiletanolaminPOPG-NA l,2-Dioleoil-sn-Gliser0-3[Fosfatidil-rac-( l -gliserol).. .] (Sodyum Tuzu)PSPC 1 -Palmitoi1,2-stear0il-sn-G1iser0-3-fosfatidilkolinSMPC 1-Stear0i1,2-miristoil-sn-Glisero-3 -fosfatidilkolinSOPC 1 -Stearoi1,2-oleoil-sn-G]iser0-3-fosfatidilkolinSPPC 1-Stearoil,2-palmitoil-sri-Glisero-3 -fosfatidilkolin Bazi düzeneklerde bir nötr lipit kullanilmasi avantajli olabilir. Ayrica bir zwitteryonik fosfolipit, örnegin boyu yaklasik 12 ila yaklasik 22 karbon atomu arasinda (örn., yaklasik 12 ila yaklasik 14, ila yaklasik 16, ila yaklasik 18, ila yaklasik 20, ila yaklasik 22 karbon) olan bir veya daha fazla alkil veya alkenil radikali içeren, ki bu radikaller, örnegin 0 ila 1 ila 2 ila 3 ikili bag içerebilir, bir fosfolipit gibi bir fosfolipit kullanilmasi da avantajli olabilir. Bir zwitteryonik fosfolipitkullanilmasi avantajli olabilir.Tercih edilen fosfolipitler arasinda örn., l,2-dioleoil-sn-glisero-3- fosfatidiletanolamin (DOPE), yumurta fosfatidilkolini (yumurta PC”si), palmitoil oleoil fosfatidilkolin (POPC), dimiristoil fosfatidilkolin (DMPC), dioleoil fosfatidilkolin (DOPC), DPPC, dipalmitoil fosfatidilkolin (DPPC), palmitoil linoleil fosfatidilkolin (PLPC), DPyPE veya bunlarin bir kombinasyonu yer alir.Bazi düzeneklerde fosfolipit, DOPE'dir. Katyonik su içinde yag emülsiyonu, yaklasik 0.1 mg/ml ila yaklasik 20 mg/ml DOPE içerebilir. Örnegin katyonik su içinde yag emülsiyonu, yaklasik 0.5 mg/ml ila yaklasik 10 mg/ml DOPE, yaklasik 0.1 mg/ml ila yaklasik mg/ml veya yaklasik 1.5 mg/ml ila yaklasik 7.5 mg/ml DOPEiçerebilir.Örnek bir düzenekte katyonik su içinde yag emülsiyonu, yaklasik 1.5mg/ml DOPE içerir.Bazi düzeneklerde fosfolipit, yumurta PCssidir. Katyonik su içinde yag em'ulsiyonu, yaklasik 0.1 mg/ml ila yaklasik 20 mg/ml yumurta PC ”si içerebilir. Örnegin katyonik su içinde yag emülsiyonu, yaklasik 0.1 mg/ml ila yaklasik 10 mg/ml yumurta PC”si, yaklasik 1.0 mg/ml ila yaklasik 10 mg/ml veya yaklasik 1.5 mg/ml ila yaklasik 3,5 mg/ml yumurta PC'si içerebilir.Örnek bir düzenekte katyoiiik su içinde yag emülsiyonu, yaklasik 1.55mg/ml yumurta PC ”si içerir.Bazi düzeneklerde fosfolipit, DPyPE”dir. Katyonik su içinde yag emülsiyonu, yaklasik 0.1 mg/ml ila yaklasik 20 mg/ml DPyPE içerebilir. Örnegin katyonik su içinde yag em'ulsiyonu, yaklasik 0.1 mg/ml ila yaklasik 10 mg/ml DPyPE, yaklasik 1.5 mg/ml ila yaklasik mg/ml veya yaklasik 1.5 mg/ml ila yaklasik 5 mg/ml DPyPEiçerebilir.Örnek bir düzenekte katyonik su içinde yag em'ûlsiyonu, yaklasik 1:6 mg/ml DPyPE içerir.Bazi düzeneklerde emülsiyon partikülleri, burada tarif edilen birsurfektan ve bir fosfolipitten olusan bir kombinasyon içerebilir.D. Sulu faz (Sürekli faz)Su içinde yag emülsiyonlarinin sulu fazi (sürekli faz), tamponlu bir tuz çözeltisi (om, tuz) veya sudur. Tamponlu tuz çözeltisi, bir tuz (Örn, NaCl), bir tampon (örn., bir sitrat tamponu) içeren ve ayrica bir ozmolalite ayarlama ajani (örn, bir sakarid), bir polimer, bir surfektan veya bunlarin bir kombinasyonunu da içerebilen bir sulu çözeltidir.Sulu faz, bir antioksidan, örn., sitrat, askorbat veya bunlariii tuzlarini içerebilir. Emülsiyonlarin, parenteral uygulama için formüle edilmesi durumunda nihai tamponlu çözeltilerin, toniklik, yani ozmolalite esasen normal fizyolojik akiskanlarla ayni olacak sekilde yapilmasi tercih edilerek uygulama sonrasi sisme veya kompozisyonun hizli absorbe olmasi gibi istenmeyen uygulama sonrasi sonuçlarin 'Önüne geçilebilir. Ayrica pH”yi normal fizyolojik kosullar ile uyumlu tutmak için de sulu fazin tamponlanmasi tercih edilebilir. Ayrica bazi durumlarda emülsiyonun bazi bilesenlerinin stabilitesini temin etmekiçin pH'nin özel bir seviyede tutulmasi arzu edilebilir.Örnegin izotonik (yani vücuttaki normal hücrelerle ve kanla ayni geçirgen solüt (örn., tuz) konsantrasyonunda) ve izozmotik olan bir emî'ilsiyon hazirlanmasi arzu edilebilir. Tonikligi kontrol altinda tutinak için emülsiyon, bir sodyum tuzu gibi bir fizyolojik tuz içerebilir. Sodyum klorid (NaCl), örnegin yaklasik %09 (a/h) (fizyolojik tuz) olarak kullanilabilir. Mevcut olabilen diger tuzlar arasinda potasyum klorid, potasyum dihidrojen fosfat, disodyuin fosfat, magnezyum klorid, kalsiyum klorid, vb. yer alir. Tonikligi kontrol altinda tutmak için iyonik olmayan tonikleme ajanlari da kullanilabilir. Bu konuda klasik olarak birçok iyonik olmayan toniklik modifiye edici ajan bilinir. Bunlar tipik olarak çesitli siniflardan karbohidratlardir (bakiniz örnegin Voet ve Voet (1990) Biochemistry (Johii Wiley & Sons, NeW York). Glukoz, inanoz ve riboz gibi aldozlar olarak siniflandirilan monosakarider ve ayrica fruktoz, sorboz ve ksiluloz gibi ketozlar olarak sinirlandirilanlar, mevcut bulusta iyonik olinayan tonikleme akanlari olarak kullanilabilir. Bir sukroz, maltoz, trehaloz ve laktoz gibi disakaridler de kullanilabilir. Ek olarakgliserol, manitol, ksilitol ve sorbitol gibi alditoller (sekerli alkoller olarak da anilan asiklik polihidroksi alkoller) de mevcut bulusta faydali iyonik olinayan tonikleme ajanlaridir. Iyonik olmayan toniklik modifiye edici ajanlar, kullanilan ajana bagli olarak yaklasik %01 ila yaklasik %10 veya yaklasik %1 ila yaklasik %10 arasindaki birkonsantrasyonda inevcut olabilir.Sulu faz tamponlanabilir. Burada su, sitrat tamponlari, fosfat tamponlari, asetat tamponlari, tris tamponlari, bikarbonat tamponlari, karbonat tamponlari, sukinat tainponlari veya benzeri gibi fizyolojik açidan kabul gören herhangi bir tampon kullanilabilir. Sulu bilesenin pH”si tercihen 6.0-80, tercihen yaklasik 6.2 ila yaklasik 6.8 arasinda olacaktir. Örnek bir düzenekte tampon, pH°si 6.5 olan lOmM sitrat tamponudur. Bir baska 'Örnek düzenekte sulu faz, RNase'siz su veya DEPC ile isleme tabi tutulmus su veya buiilar kullanilarak hazirlanmis tampondur. Bazi durumlarda tampon içindeki yüksek tuz, nükleik asidin emülsiyon partiküli'ine komplekslesmesine engel olabilir ve bu yüzden bundan kaçinilir. Diger durumlarda tampon içine belirli birmiktar tuz dahil edilebilir.Ornek bir düzenekte tampon, pH”si 6.5 olan lOmM sitrat tamponudur.

Bir baska 'Örnek düzenekte sulu faz, RNase”siz su veya DEPC ile isleme tabi tutulmus su veya bunlar kullanilarak hazirlanmistampondur.Sulu faz ayrica sulu fazin ozmolaritesini degistiren moleküller veya komplekslesme sonrasinda nükleik asidi stabilize eden moleküller gibi ilave bilesenler de içerebilir. Tercihen sulu fazin ozmolaritesi, birseker (öm., trehaloz, sukroz, dekstroz, fruktoz, indirgenmis palatinoz, Vb.), bir sekerli alkol ('orii., manitol, sorbitol, ksilitol, eritritol, laktitol, maltitol, gliserol, Vb.) veya bunlarin kombinasyonlari gibi iyonik olmayan bir tonikleme ajani kullanilarak ayarlanir. Arzu edilirse iyonik olmayan bir polimer (örn, bir poli(alkil glikol), örn., polietilen glikol, polipropileii glikol veya polibutilen glikol) veya iyonikolmayan surfektan kullanilabilir.Bazi durumlarda emülsiyon ilk hazirlanirken emülsiyonun sulu fazi olarak katisiksiz su tercih edilebilir. Örnegin tuz konsantrasyonunun veya seker konsantrasyonunun arttirilmasi, arzu edilen partikülebadina (Örn, yaklasik 200 nm'nin altinda) ulasmayi zorlastirabilir.Bazi düzeneklerde katyonik su içinde yag emülsiyonunun sulu fazi ayrica bir polimer veya bir surfektan veya bunlarin bir kombinasyonunu da içerebilir. Örnek bir düzenekte su içinde yag emülsiyonu, bir poloksamer içerir. Poloksamerler, ortasinda, iki hidrofilik polioksietilen (poli(etilen 0ksid)) zinciri tarafindan kusatilmis bir hidrofobik polioksipropilen (poli(propilen oksid)) zinciri olan iyonik olniayan üç bloklu kopolimerlerdir. Poloksamerler ayrica Pluronic® polimerleri ticari adiyla da bilinir. Poloksamer polimerleri, RNA komplekslesmesinin ardindan RNase direncininartmasina ve daha fazla stabiliteye yol açabilir.Alternatif veya ek olarak katyonik su içinde yag emülsiyonu, yaklasik %01 ila yaklasik %20 (a/h) polimer veya yaklasik %005 ila yaklasik %10 (a/h) polimer içerebilir. Omegin katyonik su içinde yag emi'ilsiyonu, yaklasik %01 ila yaklasik %20 (a/h), yaklasik %0.1 ila yaklasik %10 (a/h), yaklasik %005 ila yaklasik %10 (a/h) veyayaklasik %005 ila yaklasik %5 (a/h) arasinda bir polimer (öm., Pluronic® F127 gibi bir poloksamer) içerebilir.Ornek bir düzenekte su içinde yag emülsiyonu, yaklasik %4 (a/h) veya yaklasik %8 (a/h) Pluronic® F127 içerir.Bu kompozisyonlarda kullanilan sulu bilesen miktari, kompozisyonun degerini birime getirmek için gerekli miktar olacaktir. Yani %100 yapmak için yeterli bir sulu bilesen miktari, kompozisyonlari hacmegetirmek için yukarida siralanan diger bilesenler ile karistirilacaktir.4. NUKLEIK ASIT MOLEKULLERIHerhangi 'Özel bir teoriye bagli kalma arzusu güdülmese de nükleik asit moleküllerinin, kovalent olmayan, iyonik yük etkilesimleri (elektrostatik kuvvetler) yoluyla katyonik lipit ile etkilestigine ve kompleksin mukavemetinin ve ayrica bir partiküle komplekslesebilen nükleik asit miktarinin, partikül içindeki katyonik lipit miktari ile alakali olduguna inanilir. Ek olarak nükleik asit molekülü ile partiküllerin yüzeyi arasindaki hidrofobik/hidrofilik etkilesimler de rol oynayabilir.Nükleik asit molekülü, bir antijeni sifreleyen kendiliginden replike olan bir RNA molekülü, örn., bir peptidi, polipeptidi veya proteini sifreleyen bir RNA°d1r.Kompleks, ömekleri burada tarif edilen, bu konuda bilinen teknikler kullanilarak olusturulabilir. Örnegin bir nükleik asit-partikülkompleksi, bir katyonik einülsiyonun nükleik asit molekülü ile örnegin vorteksleme yoluyla karistirilmasi suretiyle olusturulabilir.

Emülsiyonlar içindeki nükleik asit molekülüni'in ve katyonik lipidin miktari, arzu edilen baglanma mukavemetini ve baglanma kapasitesini saglayacak sekilde ayarlanabilir veya optiinize edilebilir.Örnegin burada tarif edildigi ve örneklendigi gibi örnek RNA-partikül kompleksleri, RNAzkatyonik lipit oranlarinin degistirilmesi suretiyle ("N/P orani" ile ölçülen sekilde) 'üretildi, N/P orani terimi, katyonik lipit içindeki protonlanabilir nitrojen atoinu miktari (mol) bölü RNA üzerindeki fosfat miktarina (mol) karsilik gelir. N/P orani en az 4:1,`Örnegin 4:1 ila 20:] veya 4:] ila 15:] arasindadir.Burada tarif edilen katyonik su içinde yag emülsiyonlari, nükleik asit bazli asilarin (RNA asilari) formüle edilmesi için 'Özellikle uygundur.

Bir nükleik asit-emülsiyon partikülü koinpleksinin olusturulmasi, nükleik asidin konakçi hücreler içerisine alinmasini kolaylastirir ve nükleik asit moleküli'inü nükleaz degradasyonundan korur. Sonra transfekte edilmis hücreler, nükleik asit molekülünün sifreledigi antijeni eksprese edebilir ve bu, antijene yönelik bir immün tepkisi üretebilir. Canli veya atenue Virüsler gibi nükleik asit bazli asilar da hem MHC-I hem de MHC-II yolaklarina etkin sekilde angaje olarak CD8+ ve CD4+ T hücre tepkilerinin indüklenmesini saglayabilirken rekombinant protein gibi çözülebilir formda mevcut anti jen genelliklesadece antikor tepkilerini indükler.Nükleik asit molekülünün (RNA molekülü) sekansi, bir insan hücresi gibi arzu edilen bir konakçida ekspresyon için kodon optimizasyonunaveya de-optimizasyonuna tabi tutulabilir.

Nükleik asit molekülü, bir antijeni (peptit, polipeptit veya protein) sifreleyen kendiliginden replike olan bir RNA molekülüdür ve katyonik su içinde yag emülsiyonu, RNA bazli bir asi olarak kullanima uygundur. Kompozisyon, bir anti jeni sifreleyen birden fazla RNA molekülü, örn., emülsiyon partiküllerine koinplekslesen iki, üç, bes veya on RNA molekülü içerebilir. Yani kompozisyon, her biri farkli bir antijeni sifreleyen bir veya daha fazla farkli türden RNA molekülü içerebilir. Alternatif veya ek olarak bir RNA molekülü, birden fazla antijeni de sifreleyebilir, Örn., farkli veya ayni anti jenleri sifreleyen bir bisistronik veya trisistronik RNA inolekülü. Buna göre katyonik su içinde yag emülsiyonu, inonovalent veya multivalentRNA bazli bir asi olarak kullanima uygundur.RNA inolekülünün sekansi, `Örnegin RNA°nin ekspresyon veya replikasyon verimliligini arttirmak veya degradasyona ilave stabilite veya direnç saglamak için arzu edilirse modifiye edilebilir. Örnegin RNA sekansi, kodon kullanimina göre, örnegin RNA°nin Translasyon verimliligini ve yari ömrünü arttirmak için modifiye edilebilir. Yari ömrünü arttirinak için RNA°nin 3” ucuna bir poli A kuyrugu (örn., yaklasik 30 veya daha fazla adenosin tortulu (SEK.KIM.NO.:3)) takilabilir. RNA”nin 5” ucuna, yapi m7G (5”) ppp (5”) N (kapak 0 yapisi) veya bunun bir türevi ile modifiye edilmis bir ribonükleotit kapagi takilabilir; bu, RNA sentezi sirasinda dahil edilebilir veya RNA transkripsiyonundan sonra enzimatik olarak degistirilebilir (öm., N7-inon0metile edilmis kapak 0 yapilarinin yapilandirilmasini katalize eden mRNA trifosfataz, guanilil-transferaz ve guanine-7- metiltransfreazdan olusan Vaksinia Virüsü Kapaklama Enziini (VCE)kullanilarak). Kapak 0 yapisi, RNA niolekülünün stabilitesini ve translasyon verimliligini korumada önemli bir rol oynar. RNA molekülünüii 5” kapagi ayrica bir 2”-O-Metiltransferaz ile modifiye edilebilir ve bu, translasyon verimliligini daha fazla arttirabilen birkapak 1 yapisi (m7Gppp [m2”-O]N) üretilmesiyle sonuçlanir.Arzu edilirse RNA molekülü, herhangi bir 5 › kapak yapisina ek olarak bir veya daha fazla modifiye edilmis nükleotit de içerebilir. Memeli RNA°si üzerinde dogal yollarla meydana gelen 96”dan fazla nükleosid modifikasyonu bulunur. Bakiniz örn., Limbach ve arkadaslari, Nucleic Acids Research, 22(12):21 83-2196 (1994). Nükleotitlerin ve modifiye edilmis nükleotitlerin ve nükleosidlerin preparasyonu, örn., ABD Patent No. 4373071, 4458066, 4500707, 4668777, 4973679, 5047524, 5132418, 5153319, 5262530, 5700642°den olmak üzere bu konuda iyi bilinir ve birçok modifiye edilmis nükleosid ve modifiye edilmisiiükleotit, ticari yollarla elde edilebilir.Modifiye edilmis nükleosidler ve nükleotitler içerisine dahil edilebilen ve RNA molekülleri içerisinde mevcut olan modifiye edilmis nükleobazlar arasinda sunlar yer alir: m5C (5-metilsitidin), mSU (5- metilüridin), m6A (N6-metiladenosin), sZU (2-tiy0üridin), Um (2”-0- metilüridin), mlA (l-metiladenosin); m2A (2-metiladenosin); Am (2- l-O-metiladenosin); ms2m6A (2-metiltiyo-N6-metiladenosin); i6A (N6-izopenteniladenosin); ms2i6A (2-metiltiy0- N6izopenteniladenosin); i06A (N6-(cis-hidroksiizopentenil)adenosin); msZi06A (2-metiltiyo-N6-(cis-hidroksiizopenteni1)adenosine); g6A (N6-glisinilkarbamoiladenosin); t6A (N6-treonil karbamoiladenosin); ms2t6A (2-metiltiy0-N6-treonil karbamoiladenosin); in6t6A (N6- metil-N6-treonilkarbamoiladenosin); h116A(N6- hidroksinorvalilkarbamoil adenosin); mthn6A (2-meti1tiy0-N6- hidroksinorvalil karbamoiladenosin); Ar(p) (2”-O-ribosiladenosin (fosfat)); I (inosin); mlI (1-meti1in0sin); m”Im (1,23-O-dimeti1inosin); m3C (3-metilsitidin); Cm (2T-O-metilsitidin); s2C (2-tiy0sitidin); ac4C (N4-asetilsitidin); f5C (5-f0nilsitidin); mSCm (5,2-0- dimetilsitidin); ac4Cm (N4aseti12TOmetilsitidin); k2C (1isidin); mlG (l-metilguanosin); m2G (N2-metilguanosin); m7G (7- metilguanosin); Gm (2”-O-metilguanosin); n122G (N2,N2-dimetilguanosin); mZGm (N2,2”-O-diinetilguanosin); 1n22Gm (N2,N2,2s-O-trimetilguanosinx Gr(p) (2”-O-ribosi1guanosin (fosfat)); yW (wybutosin); 02yW (peroksiwybutosin); OHyW (hidroksiwybutosin); OHyW* (modifiye edilememis hidroksiwybutosin); imG (wyosin); mimG (1neti1guan0sin); Q (keuosin); OQ (epoksikeuosin); galQ (galtaktosil- keuosin); manQ (manosil-keuosin); preQo (7-siyan0-7- deazaguanosin); preQi (7-aminometi1-7-deazaguanosin); G* (arkaeosin); D (dihidroüridin); 1n5Um (5,2,-O-dimetilüridin); s4U (4- tiyoüridin); mSSZU (5-metil-2-tiyoüridin); sZUm (2-tiy0-2°-O- metilüridin); acp3U (3-(3-amin0-3-karboksipropil)üridin); h05U (5- hidroksiüridin); m05U (5-metoksiüridin); cmoSU (üridin 5-oksiasetik asit); 1ncm05U (üridin 5-0ksiasetik asit metil ester); chmSU (5- (karboksihidroksimeti1)`1`1ridin)); mchmSU (5- (karboksihidroksimetil)üridin inetil ester); mcinSU (S-metoksikarbonil metilüridin); incmSUm (S-metoksikarbonil- 1neti1-2-O-metilüridin); mcm5s2U (5-metoksikarbonilmeti1-2-tiy0üridin); nmSSZU (5- aminometil-2-tiy0üridin); mnmSU (5-metilaminometilüridin); mnmSSZU (5-metilaminometil-Z-tiyoüridin); mniseZU (5- metilaminometil-Z-selenoüridin); ncm5U (5-karbam0ilmeti1 üridin);ncm5 Um (5 -karbamoilmetil-Z ”-O-metilüridin); cmnm5 U (5- karboksimetilaminometilüridin); cnmm5 Um (5 - karboksimetilaminometil-2-L-Ometi1üridin); cmnm5 s2U (5- karboksimetilaminometil-2-tiyoüridin); 11162A (N6,N6-dimetiladenosin); Tm (2'-O-metilinosin); m4C (N4-metilsitidin); m4Cm (N4,2-O-dimetilsitidin); hm5C (5-hidroksimetilsitidin); m3U (3-metilüridin); cmSU (5-karboksimetilüridin); m6Am (N6,T-O- dimetiladenosin); m62Am (N6,N6,0-2-trimetiladenosin); m2”7G (N2,7-dimetilguanosin); m2°2”7G (N2,N2,7-trimetilguanosin); m3Um (3,2T-O-dimetilüridin); m5D (5-metildihidr0üridin); f5Cm (5-f0rmil- 2°-O-meti1sitidin); mlGm (l,2”-O-dimetilguanosin); m°Am (1,2-0- dimetil adenosin)irin0metili'iridin); tm552U (S-taurinometil-Z- tiyoüridin)); imG-l4 (4-demetil guanosin); imG2 (izoguanosin); ac6A (N6-asetiladenosin), hipoksantin, inosin, 8-0kso-adenin, bunun 7- ikame edilmis türevleri, dihidrourasil, psödourasil, 2-tiy0urasil, 4- tiyourasil, 5-amin0urasil, 5-(C1-C6)-alkilurasil, 5-meti1urasil, 5-(C2- C6)-alkenilurasil, 5-(C2-C6)-a1kinilurasil, 5-(hidr0ksimetil)urasil, 5- klorourasil, 5-flor0urasil, 5-br0m0urasil, 5-hidr0ksisit0sin, 5-(C1-C6)- alkilsitosin, 5-meti1sitosin, 5-(C2-C6)-a1kenilsit0sin, 5-(C2-C6)- alkinilsitosin, 5-klorositosin, 5- florositosin, 5-br0mositosin, N2- dimetilguanin, 7-deazaguanin, 8-azaguanin, 7-deaza-7-ikame edilmis guanin, 7-deaza-7-(C2-C6)a1kinilguanin, 7-deaza-8-ikame edilmis guanin, 8-hidr0ksiguanin, 6-tiy0guanin, 8-0ksoguanin, 2- aminopurin, 2-amin0-6-kloropurin, 2,4-diamin0purin, 2,6-diamin0purin, 8- azapurin, ikame edilmis 7-deazapurin, 7-deaza-7-ikame edilmis purin, 7-deaza-8-ikame edilmis purin, hidrojen (abazik tortu), m5C, mSU, m6A, SZU, W veya 2°-O-metil-U. Bu modifiye edilmis nükleobazlarm ve bunlarin ilgili ribon'ûkleosidlerinin çogu, ticari saticilardan eldeedilebilir. Bakiniz örn., WC 20] 1/005799.

Bulusla birlikte kullanilan bir RNA ideal olarak sadece nükleosidler arasinda fosfodiester baglantilari içerir ancak bazi düzeneklerde fosforamidat, fosforotiyoat ve/Veya metilfosfonat baglantilariiçerebilir.Bazi düzeneklerde RNA molekül'u, modifiye edilmis nükleotitler içermez, örn., modifiye edilinis nükleobazlar içermez ve RNA molekülü içindeki nükleotitlerin hepsi, örnegin 7-metilguaiiosin olabilen opsiyonel bir 5” kapagi disinda klasik standart A, U, G ve C ribonükleotitleridir. Diger düzeneklerde RNA, bir 7,- metilguanosinden olusan bir 5 ° kapagi içerebilir ve ilk 1, 2 veya 3 5”ribonükleotit, ribozun 2, pozisyonunda metile edilebilir.A. Kendiliginden Replike olan RNA Katyonik su içinde yag emülsiyonu, kendiliginden replike olan bir RNA molekülü içerir. Bazi düzeneklerde kendiliginden replike olanRNA molekülü, bir alfavirüsten türetilir veya ona dayanir.Kendiliginden replike olan RNA molekülleri, bu konuda iyi bilinir ve '6111., alfavir'uslerden türetilen replikasyon elementleri kullanilarak ve yapisal Viral proteinlerin ilgili bir proteini Sifreleyen bir nükleotit sekansi ile ikame edilinesiyle üretilebilir. Kendiliginden replike olan bir RNA molekülü tipik olarak bir hücreye verildikten sonra direkt olarak translate edilebilen bir (+) iplikçikli moleküldür ve bu translasyon, RNA'ya bagli bir RNA polimerazi saglar ki bu daha sonra verilen RNA'dan hem antisens hem de sens transkriptler üretir.Böylelikle verilen RNA, birçok yavru RNA üretilmesine yol açar. Bu yavru RNAlar ve ayrica kollineer alt genomik transkriptler, kendi kendilerine translate olarak sifrelenmis bir anti jenin yerinde eksprese edilmesini saglayabilir veya transkripte edilerek verilen RNA ile ayni senslikte, antijenin yerinde ekspresyonunu saglamak için translate edilen baska transkriptler saglanabilir. Bu transkripsiyon sekansinin genel sonucu, dahil edilmis olan replikon RNAlarin sayisinda muazzam bir amplifikasyondur ve böylece sifrelenmis anti jen, hücrelerin baslica polipeptit ürünü haline gelir. Kendiliginden replike olan RNA ile transfekte edilmis hücreler, apoptotik 'Ölüme girmeden önce kisa bir sure anti jen üretir. Bu ölüm, Dendritik Hücreleri süper aktive ettigi de gösterilmis olan gerekli çift iplikçikli (ds) RNA ara maddelerinin muhtemel bir sonucudur. Böylelikle kendiliginden replike olan RNA”n1n immünojenikliginin artmis olmasi, konakçi hücrelerdeki bir RNA-virüs enfeksiyonunu taklit eden pro-enflamatuardsRNA üretiminin bir sonucu olabilir.Avantajli sekilde kendiliginden replike olan RNA molekülleri, hücreler içerisinde birikebilen veya hücrelerden sekrete edilebilen proteinler veya antijenler gibi sifrelenmis gen ürünlerinde üslü bir artis üretmek için hücrenin mekanizmasini kullanir. Proteinlerin kendiliginden replike olan RNA molekülleri tarafindan asiri ekspresyonu, çan benzeri reseptörler (TLR) 3, 7 ve 8”in ve TLR disi yolaklarin (örn, RIG-l, MD-S), RNA replikasyonunun ve amplifikasyonunun ve transfekte edilmis hücrenin apoptozunu indükleyen translasyonun ürünleri tarafindan uyarilmasi dahil olmaküzere immüno-uyarici ad juvan etkilerinden avantaj saglar.Kendiliginden replike olan RNA genellikle viral replikazlar, viral proteazlar, viral helikazlar ve diger yapisal olinayan Viral proteinlerin olusturdugu gruptan seçilen en az bir veya daha fazla gen içerir ve ayrica 57- ve 3, ucu cis-aktif replikasyon sekanslari ve arzu edilen bir amino asit sekansini sifreleyen bir heterolog sekans (ilgili bir anti jen) da içerir. Heterolog sekansin ekspresyonunu yöneten bir genom alti promoter, kendiliginden replike olan RNA içerisine dahil edilebilir.

Arzu edilirse heterolog sekans (ilgili bir anti jen), kendiliginden replike olan RNA içindeki diger kodlayici bölgelere çerçeve halinde füzyonla birlestirilebilir ve/veya bir dahili ribozom giris sahasinin (IRES)kontrolü altinda olabilir.Bazi düzeneklerde kendiliginden replike olan RNA molekülü, virüs benzeri bir partikül içerisine kapsüle edilmemistir. Bulusa ait kendiliginden replike olan RNA molekülleri 'Öyle tasarlanabilir ki kendiliginden replike olan RNA molekülü, enfeksiyöz Viral partiküllerin üretimini indükleyemez. Bu, örnegin, kendiliginden replike olan RNA içinde Viral partiküllerin üretilmesi için gerekli olan yapisal proteinleri sifreleyen bir veya daha fazla viral genin ihmal edilmesiyle saglanabilir. Örnegin kendiliginden replike olan RNA molekülünün bir alfa virüsü, örn., bir Sinebis virüsü (SIN), Semliki forest virüsü ve Venezuella at ensefalit virüsüne (VEE) dayandigi durumda Viral yapisal proteinleri, Örn., kapsül ve/Veya sargiglikoproteinleri sifreleyen bir veya daha fazla gen ihmal edilebilir.Arzu edilirse bulusa ait kendiliginden replike olan RNA molekülleri ayrica atenue veya virülan olan enfeksiyöz viral partiküllerin üretimini indükleyecek veya müteakip tek bir raund enfeksiyon yapabilen Viralpartiküller üretecek sekilde de tasarlanabilir.

Bu sekilde kendiliginden replikasyon saglamak için uygun bir sistem, alfavirüs bazli bir replikon kullanilmasidir. Alfavir'üsler, Togaviridae familyasindan genetik, yapisal ve serolojik olarak alakali artropodla tasinan bir dizi Virüs içerir. AlfaVir'ûs cinsi içerisinde yirmi alti bilinen Virüs ve Virüs alt tipi, Sindbis Virüsü, Semliki Forest Virüsü, Ross River Virüsü ve Venezuella at ensefalit Virüsü dahil olmak üzere siniflandirilmistir. Bu sekilde bulusa ait kendiliginden replike olan RNA, semliki forest Virüsü (SFV), siiidbis Virüsü (SIN), Venezuella at ensefalit Virüsü (VEE), Ross-River virüsü (RRV), doguya özgü at ensefalit Virüsü veya alfavirüs familyasina ait diger virüslerdentüretilen bir RNA replikazi içerebilir.Alfavir'ûs bazli bir "replikon" ekspresyon vektörü, bulus içerisinde kullanilabilir. Replikon vektörleri, DNA, RNA ve rekombinant replikon partikülleri dahil olmak üzere birkaç formatta kullanilabilir.

Bu tür replikon vektörleri, örnegin Sindbis Virüsü (Xiong ve arkadaslari (1989) Science 243:1188-1191; Dubensky ve arkadaslari, (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan ve arkadaslari (1998) J. Virol. 72:950-958; Polo ve arkadaslari (1999) PNAS 96:4598-4603), Semliki Forest Virüsü (Liljestrom (1991) Bio/Technology 9:1356-1361; Berglund ve arkadaslari (1998) Nat. Biotech. 16:562-565) ve Venezuella at ensefalit Virüsü (Pushko ve arkadaslari (1997) Virology 239I389-401) dahil olinak üzere alfaVirüslerden türetilmistir.

Alfavirüs türevli replikonlar genellikle genel karakteristikleri bakimindan oldukça benzerdir (örn., yapi, replikasyon); ayri ayri alfavirüsler, benzersiz olan bazi özel özellikler (6111., reseptör baglama, interferon duyarliligi ve hastalik profili) sergileyebilir. Buyüzden farkli Virüs familyalarindan yapilan kiinerik alfavirüs replikonlari da faydali olabilir.Alfavirüs bazli RNA replikonlari tipik olarak bir hücreye verildikten sonra bir replikazin (veya replikaz-transkriptazin) translate olmasina yol açan (+) iplikçikli RNAlardir. Replikaz, otomatik klivaj olarak (+)iplikçikli verilen RNA'nin genomik (-)iplikçikli kopyalarini yaratan bir replikasyon kompleksi saglayan bir poliprotein seklinde translate edilir. Bu (ý)iplikçikli transkriptler, kendi baslarina transkripte olarak (+)iplikçikli ana RNA”nin baska kopyalarini verebilir ve ayrica anti jeni sifreleyen bir genom alti transkript de verebilir. Genom alti transkriptin translasyonu böylelikle antijenin enfekte olinus hücre tarafindan yerinde eksprese edilmesine yol açar. Uygun alfavirüs replikonlari, bir Sindbis virüsü, bir Semliki forest virüsü, bir doguya özgü at ensefalit virüsü, bir Venezuella at ensefalit virüsü, vb.'nden birreplikaz kullanabilir.Bir RNA replikonu tercihen bir pikorna virüsü, togavirüs, flavivir'ûs, koronavir'ûsü, paramiksovirüs, sarihumma virüsü veya alfavirüsten (Örn., Sindbis virüsü, Semliki Forest virüsü, Venezuella at ensefalit virüsü veya Ross River Virüsü), bir veya daha fazla yapisal protein geninin ilgili bir ürünü sifreleyen seçme bir heterolog nükleik asitsekansi ile degistirilmesiyle modifiye edilmis bir RNA genomu içerir.Tercih edilen bir replikon, (i) RNA”yi replikondan transkripte edebilen RNA”ya bagli bir RNA polimerazini ve (ii) bir antijeni sifreler. Polimeraz, örn., bir veya daha fazla alfavirüs proteini nsPl, nSP2, nsP3 ve nSP4 içeren bir alfavirüs replikazi olabilir. Dogalalfavirüs genomlari, yapisal olinayan replikaz poliproteinine ek olarak yapisal virion proteinleri de sifrelerken replikonun, alfavirüs yapisal proteinlerini sifrelemeinesi tercih edilir. Böylelikle tercih edilen bir replikon, bir hücre içerisinde kendinin genomik RNA kopyalarinin üretilmesine yol açabilir ancak RNA içerikli virionlarin üretilmesine yol açmaz. Bu virionlarin üretilememesi, bir vahsi tip alfavirüsün aksine tercih edilen replikonun, kendiiii enfeksiyöz formda idaine ettirememesi anlainina gelir. Vahsi tip virüslerde idame için gerekli alfavirüs yapisal proteinleri, tercih edilen replikonsan çikarilir ve bunlarin yerini, ilgili antijeni sifreleyen gen(ler) alir; böylece genom alti traiiskript, yapisal alfavirüs virion proteinlerinden çok aiitijenisifreler.Bulusta faydali bir replikon, iki açik okuma çerçevesine sahip olabilir.

Birinci (5”) açik okuma çerçevesi, bir replikazi sifreler; ikinci (3”) açik okuma çerçevesi, bir antijeiii sifreler. Bazi düzeneklerde RNA, öm., ilave anti jenleri sifrelemek veya yardiinci polipeptitleri sifrelemek içinilave (öm., asagi yönde) açik okuma çerçevelerine de sahip olabilir.Tercih edilen bir replikon, siklikla RNA'nin iii vivo translasyonunu arttirabilen bir 5' kapagina (örn., bir 7-metilguanosin) sahiptir. Bazi düzeneklerde replikonun 5' sekansimn, sifrelenmis replikaz ileuyumluluk saglamak amaciyla seçilmesi gerekebilir.

Bir replikon, bir 3” poli-A kuyruguna sahip olabilir. Bu ayrica 3” ucunun yaninda bir poli-A polimeraz tanima sekaiisi (örn. AAUAAA)da içerebilir.Replikoiilar, çesitli boylarda olabilir ancak bunlar tipik olarak 5000- 25000 nükleotit uzunlugunda, Örn., 8000-15000 nükleotit veya 9000- 12000 nükleotit uzunlugundadir.Replikon, in vitro transkripsiyon (IVT) yoluyla uygun sekilde hazirlanabilir. IVT, bakterilerde plazmid formunda yaratilan ve yayilan veya sentetik olarak yaratilan (örnegin gen senteziyle ve/veya polimeraz zincir reaksiyoiiu (PCR) mühendisligi yöntemleriyle) bir (CDNA) sablonu kullanabilir. Omegin replikonu bir DNA sablonundaii transkripte etmek için DNA'ya bagli bir RNA poliinerazi (örn., bakteriyofaj T7, T3 veya SP6 RNA polimerazlari) kullanilabilir.

Gerektiginde uygun kapaklama ve poli-A ilave reaksiyonlari kullanilabilir (replikonun poli-A°sinin genellikle DNA sablonu içinde sifrelenmesine ragmen). Bu RNA polimerazlariiiin transkripte olnius ' nükleotit(ler) içiii sert gereklilikleri olabilir ve bazi düzeneklerde bu gereklilikler, IVT ile transkripte edilmis RNA'nin, kendiliginden sifrelenmis kendi replikazi için bir substrat olarak verimli sekilde islev gösterebilmesini saglamak için sifrelenmis replikazin gerekliliklerine uygun olmalidir. Spesifik `Örnekler arasinda örnegin ABD Patent No. ,814,482 ve 6,0'15,686°da ve ayrica Uluslararasi Yayin No. WO 97/38087, WC 99/ 18226 ve WO 02/26209°da tarif edilen Sindbis virüsü bazli plazmidler (pSIN), örn., pSINCP yer alir. Bu tür replikonlarin yapilandirilmasi genel olarak ABD Patent No. 5 ,814,482 ve 6,015,686”da tarif edilir.Diger yönlerde kendiliginden replike olan RNA molekülü, alfavirüsten baska bir virüsten, tercihen pozitif iplikçikli bir RNA virüsünden ve daha fazla terciheii de bir pikornavirüsü, flavivir'usü,rubivirüsü, pestivirüs, hepakivirûs, kalisivirüs veya koronavirüsünden türetilir veya ona dayanir. Uygun vahsi tip alfavirüs sekanslari, iyi bilinir ve sekans depolarindan, örn., Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu, Rockville, Mdfden elde edilebilir. Uygun alfavirüslerin temsili `Örnekleri arasinda Aura (ATCC VR-368), Bebaru Virüsü (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou (ATCC VR-922), Chikungunya virüsü (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), Doguya özgü at ensefalomiyelit Virüsü (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), Getah Virüsü (ATCC VR-369, ATCC VR- 1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), Mayaro (ATCC VR-66), Mayaro virüsü (ATCC VR-1277), Middleburg (ATCC VR-370), Mucambo Virüsü (ATCC VR-580, ATCC VR-l244), Ndumu (ATCC VR-37l), Pixuna Virüsü (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), Ross River Virüsü (ATCC VR-373, ATCC VR1246), Semliki Forest (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), Sindbis Virüsü (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), Venezuella at ensefalomiyelit (ATCC VR-69, ATCC VR923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532), Batiya özgü at ensefalomiyelit (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa (ATCC VR-926) ve Y- 62-33 (ATCC VR-375) yer alir.Bulusa ait kendiliginden replike olan RNA molekülleri, modifiye edilmis nükleotitler kullanilarak hazirlanmis olan diger RNA tiplerinden (öm., mRNA) daha büyüktür. Tipik olarak bulusa ait kendiliginden replike olan RNA molekülleri en az yaklasik 4kb içerir. Örnegin kendiliginden replike olan RNA, en az yaklasik 5kb, en az yaklasik 6kb, en az yaklasik 7kb, en az yaklasik 8kb, en az yaklasik 9kb, en az yaklasik lOkb, en az yaklasik 11 kb, en az yaklasik '12kb veya 12kb°den daha fazlasini içerebilir. Bazi örneklerde kendiliginden replike olan RNA, yaklasik 4kb ila yaklasik 12kb, yaklasik 5kb ila yaklasik l2kb, yaklasik 6kb ila yaklasik leb, yaklasik 7kb ila yaklasik 12kb, yaklasik 8kb ila yaklasik 12kb, yaklasik 9kb ila yaklasik 12kb, yaklasik 10kb ila yaklasik 12kb, yaklasik llkb ila yaklasik 12kb, yaklasik 5kb ila yaklasik llkb, yaklasik 5kb ila yaklasik 10kb, yaklasik 5kb ila yaklasik 9kb, yaklasik 5kb ila yaklasik 8kb, yaklasik 5kb ila yaklasik 7kb, yaklasik 5kb ila yaklasik 6kb, yaklasik 6kb ila yaklasik 12kb, yaklasik 6kb ila yaklasik llkb, yaklasik 6kb ila yaklasik 10kb, yaklasik 6kb ila yaklasik 9kb, yaklasik 6kb ila yaklasik 8kb, yaklasik 6kb ila yaklasik 7kb, yaklasik 7kb ila yaklasik 11 kb, yaklasik 7kb ila yaklasik 10kb, yaklasik 7kb ila yaklasik 9kb, yaklasik 7kb ila yaklasik 8kb, yaklasik 8kb ila yaklasik 11 kb, yaklasik 8kb ila yaklasik 10kb, yaklasik 8kb ila yaklasik 9kb, yaklasik 9kb ila yaklasik llkb, yaklasik 9kb ila yaklasik 10kb veya yaklasik 10kb ila yaklasik llkb arasindadir.Bulusa ait kendiliginden replike olan RNA molekülleri, bir veya daha fazla tipte inodifiye edilmis nükleotit (örn., psödo'uridin, N6-metiladenosin, 5-metilsitidin, 5-1netil'ûridin) içerebilir.Kendiliginden replike olan RNA moleküli'i, tek bir heterolog polipeptit antijenini veya istege göre birbirine bir ainino asit sekansi olarak eksprese edildiginde sekanslarin her biri kendi kimligini muhafaza edecek sekilde (tüm, seri bagli) baglanmis iki veya daha fazla heterolog polipeptit antijenini sifreleyebilir. Sonra kendiliginden replike olan RNA'dan olusturulmus olan heterolog polipeptitler, bir füzyon polipeptit halinde üretilebilir veya ayri ayri polipeptit veya peptit sekanslari verecek sekilde degistirilebilir.Bulusa ait kendiliginden replike olan RNA, bir dizi epitop içeren bir veya daha fazla polipeptit anti jenini sifreleyebilir. Tercihen epitoplar, bir yardimci T hücre tepkisi veya bir sitotoksik T hücre tepkisi veyaher ikisini de ortaya çikarabilir.Burada tarif edilen kendiliginden replike olan RNA molekülleri, iki veya daha fazla açik okuma çerçevesinden birçok nükleotit sekansini eksprese ederek iki veya daha fazla anti jen ile birlikte sitokinler veya diger immüno-modülatörler gibi proteinlerin birlikte eksprese edilmesini saglayacak sekilde degistirilebilir ki bu, immün tepkisi üretiinini arttirabilir. Bu tür bir kendiliginden replike olan RNA molekülü, `Örnegin, bivalent veya multivalent bir asi olarak ayni anda çesitli gen ürünlerinin (örn., proteinler) üretilmesinde Özellikle faydaliolabilir.Bulusa ait kendiliginden replike olan RNA molekülleri, uygun herhangi bir yöntem kullanilarak hazirlanabilir. Modifiye edilmis nükleotitler içeren RNA molekülleri üretinek için bu konuda birkaç uygun yöntem bilinir. Örnegin modifiye edilmis nükleotitler içeren kendiliginden replike olan bir RNA molekülü, kendiliginden replike olan bir RNA molekülünü sifreleyen bir DNA°n1n, uygun bir DNAiya bagli RNA polimerazi, örn., T7 faj RNA polimerazi, SP6 faj RNA polimerazi, T3 faj RNA polimerazi ve benzeri veya bu polimerazlarin, modifiye edilmis nükleotitlerin RNA molekülleri içerisinde verimli sekilde dahil edilmesini saglayan mutantlari kullanilarak transkripteedilmesi (örn., in vitro transkripsiyon) suretiyle hazirlanabilir.

Transkripsiyon reaksiyonu, nükleotitler ve modifiye edilmis nükleotitler ve seçilen poliinerazin aktivitesini destekleyen baska bilesenler, örn., uygun bir tampon ve uygun tuzlar içerecektir.

Nükleotit analoglarinin kendiliginden replike olan bir RNA içerisine dahil edilmesi, örnegin bu tür RNA moleküllerinin stabilitesini degistirmek, RNase”lere karsi direnci arttirinak, uygun konakçi hücreler içerisine dahil edildikten sonra replikasyon olusturmak (RNA°nin "enfektifligi") ve/Veya dogustan gelen ve adaptif immüntepkilerini indüklemek veya azaltmak için degisiklige ugratilabilir.Uygun sentetik yöntemler, tek baslarina veya bir veya daha fazla yöntein (örn., rekombinant DNA veya RNA teknolojisi) ile kombinasyon halinde kullanilarak bulusa ait kendiliginden replike olan bir RNA moleküli'i üretilebilir. De novo sentez için uygun yöntemler, bu koiiuda bilinir ve özel uygulainalar için adapte edilebilir. Ornek yöntemler arasinda, örnegin, CEM gibi uygun korum gruplari kullanilan kimyasal sentez (Masuda ve arkadaslari, (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51:3-4), ß-siyanoetil fosforamidit yöntemi (Beaucage S L ve arkadaslari (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); nükleosid. H-fosfonat yöntemi (Garegg P ve arkadaslari (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler B C ve arkadaslari (1986) Nucl Acid Res 14:5399-407; Garegg P ve arkadaslari (1986) Tetrahedron Lett 27:4055-8; Gaffney B L ve arkadaslari (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-22) yer alir. Bu kimyalar, ticari yollarla elde edilebilen otoinatik nükleik asit sentezleyiciler ile kullanim için performe edilebilir veya adapte edilebilir. Ilave uygun sentetik yöntemler, Uhlmann ve arkadaslari (1990) Chem ReV 90:544-84 ve Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165°te açiklanmaktadir.

Nükleik asit sentezi ayrica polinükleotitlerin ve bu tür polinükleotitler tarafindan sifrelenen gen ürünlerinin klonlanmasi, islenmesi ve/veya eksprese edilmesi dahil olinak üzere bu konuda iyi bilinen ve klasik uygun rekombinant yöntemler kullanilarak da gerçeklestirilebilir.

Rasgele parçalama yoluyla DNA karma ve gen fragiiianlarinin ve sentetik polinükleotitlerin PCR ile yeiiiden düzenlenmesi, polinükleotit sekanslarinin tasarlanmasi ve degistirilmesinde kullanilabilen bilinen tekniklerin örnekleridir. Nükleik asitleri ve sifrelenmis proteinleri degistirmek, `Örnegin yeni kisitlama sahalari sokinak, glikosilasyon patemlerini degistirmek, kodon tercihini degistirmek, splays varyantlar üretmek, inutasyonlar sokmak ve benzeri için sahaya yönelik mutajenez kullanilabilir. Nükleik asit sekaiislariniii transkripte edilmesi, translate edilmesi ve eksprese edilmesi için uygun yöntemler, bu konuda bilinir ve klasiktir. (Bakiniz genellikle Current Protocols in Molecular Biology, Cilt 2, Ed. Ausubel ve arkadaslari, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Bölüm 13, 1988; Glover, DNA Cloning, Cilt II, IRL Press, Wash., D.C., Bölüm 3, 1986; Bitter ve arkadaslari, Methods in Enzymology 153z516-544 (1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern ve arkadaslari, Cold Spring Harbor Press, Cilt I ve II, 1982; ve Sambrook ve arkadaslari, MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989.)Kendiliginde replike olan bir RNA molekülü içinde bir veya daha fazla modifiye edilmis nükleotidiii varligi ve/Veya miktari, uygun herhangi bir yöntem kullanilarak belirlenebilir. Omegin kendiliginden replike olan bir RNA, monofosfatlara dijest edilebilir (örn, nükleazPl kullanilarak) ve defosforile edilebilir (örn., CIAP gibi uygun bir fosfataz kullanilarak) ve elde edilen nükleosidler, ters fazli HPLC ('om., bir YMC Pack ODS-AQ kolonu (5 mikron, 4.6 X 250 mm) kullanilarak ve %30 B (0-5 dak.) ila %100 B (5 - 13 dak.) ve %100 B (13-40 dak.) grayaninda elüte edilerek, akis Hizi (0.7 ml/dak.), UV saptama (dalga boyu: 260 nm), kolon sicakligi (30°C). Tampon A (20mM asetik asit-amonyum asetat pH 3.5), tampon B (20mM asetik asit-amonyum asetat pH 3.5/metanol [90/10])) ile analiz edilebilir.Istege göre bulusa ait kendiliginden replike olan RNA molekülleri, bir veya daha fazla modifiye edilmis nükleotit içerebilir, böylelikle kendiliginden replike olan RNA molekülü, bir konakçi hücre (örn., bir insan hücresi) içerisine sokulmasi veya girmesi üzerine, modifiye edilmis nükleosidler içermeyen ilgili kendiliginden replike olan RNA molekülüne kiyasla daha az immüno-modüle edici aktiviteye sahipolur.Arzu edilirse kendiliginden replike olan RNA molekülleri, bu konuda uzman kisilerce bilinen çesitli in vitro veya in Vivo test yöntemleri kullaiiilarak terapötik ve profilaktif özelliklerini dogrulamak için taranabilir veya analiz edilebilir. Örnegin keiidiliginden replike olan RNA molekülü içeren asilar, ilgili özel lenfosit tipinin, örn., B hücreleri, T hücreleri, T hücre çizgileri ve T hücre kloiilariiiin proliferasyonunun veya efektör fonksiyonunun indüklenmesi üzerindeki etkileri bakimindan test edilebilir. Örnegin immünize edilmis farelerden gelen dalak hücreleri izole edilebilir ve sitotoksik T lenfositlerinin, bir polipeptit anti jenini sifreleyen kendiliginden replike olan bir RNA molekülü içeren otolog hedef hücreleri lizlemekapasitesi. Ek olarak T yardimci hücre farklilasmasi, TH] (IL-2 ve IFN-Y) ve/Veya TH2 (IL-4 ve IL-5) sitokiiileriiiin proliferasyonunun veya üretiminin ELISA yoluyla veya direkt olarak CD4+ T hücrelerinde sitoplazmik sitokin boyama ve akis sitometrisiyleölçülmesi suretiyle analiz edilebilir.Bir polipeptit antijenini sifreleyen kendiliginden replike olan RNA molekülleri ayrica örnegin ilgili bir anti jene 'Özel antikorlarin B hücre üretiminin indüklenmesiyle kanitlandigi üzere hümoral immün tepkileri indükleme kabiliyeti bakimindan da test edilebilir. Bu deneyler, örnegin, immünize edilmis kisilerden gelen periferal B lenfositleri kullanilarak gerçeklestirilebilir. Bu tür deney yöntemleri, bu konuda uzman kisilerce bilinir. Bulusa ait kendiliginden replike olan RNA moleküllerinin karakterize edilmesi için kullanilabilen diger deneyler, sifrelenmis antijenin hedef hücreler tarafindan ekspresyonunun saptanmasini kapsayabilir. Örnegin hücre yüzeyi üzerinde veya hücre içinde anti jen ekspresyonunu saptamak için FACS kullanilabilir. FACS seçiminin bir diger avantaji, farkli ekSpresyon seviyeleri için çesitleme yapilabilmesidir; bazen daha düsük ekspresyon arzu edilebilir. Özel bir antijeni eksprese eden hücrelerin tanimlanmasi için uygun baska bir yöntem, monoklonal antikorlar kullanarak bir plaka üzerinde gezdirmeyi veya monoklonal antikorlar ile kaplanmis manyetik taneler kullanilarak yakalamayikapsar.B. Antijenler Burada tarif edilen nükleik asit molekülü, bir antijeni sifreleyen bir nükleik asit molekülüdür (kendiliginden replike olan bir RNAmolekülü). Uygun antijenler arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere bir bakteriyel anti jen, bir Viral anti jen, bir fungal anti jen, bir protozoan antijen, bir bitki antijeni, bir kanser antijeni veya bunlarin birkombinasyonu yer alir.Uygun anti jenler arasinda bir Virüs, bakteriler, inantar, protozoan, bitki veya bir tümör gibi bir patojenden proteinler ve peptitler yer alir.

Kendiliginden replike olan RNA molekülü tarafindan sifrelenebilen Viral anti jenler ve iminünojenler arasinda, bunlarla sinirli olinamak üzere, Ortoiniksovirüsler, örn., Influenza A, B ve C; Paramyxoviridae virüsleri, örn., Pnömovirüsler (RSV), Paramiksovirüsler (PIV), Metapnömovir'üs ve Morbilivir'üsler (om, kizamik); Pnömovir'üsler, örn., Respiratuar sinsitiyal virüs (RSV), Sigirlarda respiratuar sinsitiyal Virüs, farelerde Pnömoni Virüsü ve Hindilerde rinotrakeit Virüsü; Parainisovirüsler, örn., Parainfluenza Virüsü tip 1-4 (PIV), Kabakulak Virüsü, Sendai virüsleri, Siinian Virüsü 5, Sigirlarda parainfluenza Virüsü, Nipahvir'üsü, Henipavir'üs ve Newcastle hastaligi Virüsü; Poxviridae, 'Örnegin bir Ortopoksvirüsü, örn., Variola vera (örnegin ve bunlarla sinirli olmamak üzere, Variola majör ve Variola minör); Metapnömovirûsler, örn., insanlarda inetapn'omovirüs (hMPV) ve kuslarda inetapnömovirüsler (aMPV); Morbilivirüsler, om., Kizamik; Pikornavirüsleri, örn., Enterovir'usler, Rinoviri'isler, Heparnavirüs, Parekovirüs, Kardiyovir'usler ve Aftovir'ûsler; Enterovirüsler, öm., Poliovirüs tip 1, 2 veya 3, Coxsackie A Virüsü tip 1 ila 22 ve 24, Coxsackie B virüsü tip 1 ila 6, Echovirüs (ECHO) Virüsü tip 1 ila 9, 11 ila 27 ve 29 ila 34 ve Enterovirüs 68 ila 71, Bunyavirüsleri, örnegin bir Ortobunyavirüsü, örn., Kaliforniya ensefalit Virüsü; bir Flebovirüs, örn., Rift Vadisi Atesi Virüsü; birNairovirüsü, örn., Crimean-Congo hemorajik ates virüsü; Heparnavirüsleri, örn., Hepatit A Virüsü (HAV); Togavirüsleri (Kizamikçik), örn., bir Rubivirüs, bir AlfaVirüs veya bir Arterivirüs; FlaViVirüsler, örn., Keneyle geçen eiisefalit (TBE) Virüsü, Dengue (tip 1, 2, 3 veya 4) Virüsü, Sari Huinma Virüsü, Japon ensefalit Virüsü, Kyasanur Forest Virüsü, Bati Nil eiisefalit Virüsü, St. Louis ensefalit Virüsü, Ruslarda bahar-yaz ensefalit Virüsü, Powassan eiisefalit virüsü; Pestivirüsler, örii., Sigirlarda Viral ishal (BVDV), Klasik domuz atesi (CSF V) veya Sinir hastaligi (BDV); Hepadnavirüsler, örn., Hepatit B Virüsü, Hepatit C virüsü; Rabdovirüsler, örn., bir Lyssavirüs (Kuduz Virüsü) ve Vesikülovirüs (VSV), Caliciviridae, örn., Norwalk Virüsü ve Norwalk benzeri Virüsler, Örn., Hawaii Virüsü ve Snow Mountain Virüsü; Koronavirüsleri, örn., SARS, Insanlarda respiratuar koronavirüsü, Kuslarda enfeksiyöz bronsit (IBV), fare hepatit Virüsü (MHV) ve Domuzlarda bulasici gastroenterit Virüsü (TGEV); Retrovirüsler, örn., bir Onkovirus, bir Lentivirüs veya bir Spumavirüs; Reovirüsler, örn., bir Ortoreovirüs, bir Rotavirüsü, bir Orbivirüs veya bir Koltivirüs; Parvovirüsler, örn., Parvovirüs Bl9; Delta hepatit Virüsü (HDV); Hepatit E Virüsü (HEV); Hepatit G Virüsü (HGV); Insanlarda Herpesvirûsleri, örn., Herpes Simplex Virüsleri (HSV), Varicella-zoster Virüsü (VZV), Epsteiii-Barr Virüsü (EBV), Sitomegalovirüs (CMV), insan Herpesvirüsü 6 (HHV6), Insan Herpesvirüsü 7 (HHV7) ve Insan Herpesvirüsü 8 (HHV8); Papovavirüsleri, örn., Papillomavirüsleri ve Poliomavirüsleri,Adenovirüsler ve Arenavirüslerinden proteinler ve peptitler yer alir.Bazi düzeneklerde anti jen, asagidakiler gibi baliklari enfekte eden bir Virüse karsi bir immün tepkisi ortaya çikarir: enfeksiyöz somon aiieiniVirüsü (ISAV), soinon pankreas hastaligi Virüsü (SPDV), enfeksiyöz pankreatik nekroz virüsü (IPNV), kanal kedi baligi virüsü (CCV), baliklarda Ienfosistis hastaligi virüsü (FLDV), enfeksiyöz hematopoietik nekroz virüsü (IHNV), koi herpesvirüsü, somonlarda pikorna benzeri virüs (atlantik somonlarinin pikorna benzeri virüsü olarak da bilinir), karayla çevrili somon virüsü (LSV), atlantik somonu rotavirüsü (ASR), alabaliklarda çilek hastaligi virüsü (TSD), koho somonu tümör virüsü (CSTV) veya viral hemorajik septisemi virüsü (VHSV).Bazi düzeneklerde antijen, P.falciparum, P.vivax, P.malariae veya P.ovale gibi Plasmodium cinsinden bir parazite karsi bir immün tepkisi ortaya çikarir. Bu yüzden, bulus, malaryaya karsi immünizasyon için kullanilabilir. Bazi düzeneklerde antijen, Caligidae familyasindan bir parazite, özellikle Lepeophtheirus ve Caligus soyundan olanlara, örn. Lepeophtheirus salmonis veya Caligus rogercresseyi gibi deniz bitlerine karsi bir immün tepkisi ortaya çikarir.Kendiliginden replike olan RNA molekülü tarafindan sifrelenebilen bakteriyel antijenler ve immünojenler arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Burkholderia türü (örn.Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei ve Burkholderia cepacia), Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Haemophilus influenzae, Clostridium tetani (Tetanos), Clostridiumperfringens, Clostridiumbotulinums (Botulizml, Cornynebacteriumdiphtheriae (Difteri), Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella türü (örn. B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis ve B. pinnipediae,), Francisella türü (örn., F. novicida, F. philomiragia ve F. tularensis), Streptococcus agalactiae, Neiserria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum (Sifilis), Haemophilus ducreyi, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Helicobacter pylori, Staphylococcus suprophyticus, Yersinia enterocolitica, E. coli (öm, enterotoksigenik E. coli (ETEC), enteroagregatif E. coli (EAggEC), difûze olarak yapisan E. coli (DAEC), enteropatojenik E. coli (EPEC), ekstraintestinal patojenik E. coli (EXPEC; örn., üropatojenik E. coli (UPEC) ve menenjit/sepsis ile baglantili Ecoli (MNEC)) ve/Veya enterohemorajik E. coli (EHEC), Bacillus anthracis (antraks), Yersinia pestis (plak), Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia, Listeria monocytogenes, Chlamydia pneumoniae, Vibrio Cholerae, Salmonella typhi (tifo atesi), Borrelia burgdorfer, Porphyroinonas gingivalis, Klebsiella, Mycoplasma pneumoniae,Vb.°nde11 proteinler ve peptitler yer alir.Kendiliginden replike olan RNA molekülü tarafindan sifrelenebilen fungal antijenler ve iinmünojenler arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, Dermatophytres, örnegin: Epiderinophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton inegnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanuin, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton Vio laceum ve/VeyaTrichophyton faviforme°den; veya Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillusglaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliemondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoforinans, Geotrichum clavatuin, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneuinoniae, Microsporidia, Encephalitozoon türü, Septata intestinalis ve Enterocytozoon bieneus,den proteinler ve peptitler yer aliri; daha az yaygin olanlar, Brachiola türü, Microsporidium türü, Nosema türü, Pleistophora türü, Trachipleistophora türü, Vittaforina türü Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosuin, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporiuin apiosperum, Sporothrix schenckii, TrichOSporon beigelii, T0ks0plasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia türü., Fonsecaea türü, Wangiella türü, Sporothrix türü, Basidiobolus türü, Conidiobolus türü, Rhizopus türü, Mucor türü, Absidia türü, Mortierella türü, Cunninghamella türü, Saksenaea türü, Alternaria türü, Curvularia türü, Helminthosporium türü, Fusarium türü, Aspergillus türü, Penicillium türü, Monolinia türü, Rhizoctonia türü, Paecilomyces türü, Pithomyces türü ve Cladosporium türündenproteinler ve peptitler yer alir..Kendiliginden replike olan RNA molekülü tarafindan sifrelenebilen Protazoan antijenleri ve innn'ûnojenleri arasinda, bunlarla Sinirliolmamak üzere, Entamoeba histolytica, Giardia lainbli, Cryptosporidium parvuin, Cyclospora cayatanensis veToksoplaznia”dan proteinler ve peptitler yer alir.Kendiliginden replike olan RNA molekül'ü tarafindan sifrelenebilen bitki anti jenleri ve immünojenleri arasinda, bunlarla sinirli olinamaküzere, Ricinus communis°ten proteinler ve peptitler yer alir.Uygun antijeiiler arasiiida bir Virüs, ömegiii insan bagisiklik noksanligi virüsü (HIV), hepatit A Virüsü (HAV), hepatit B Virüsü (HBV), hepatit C virüsü (HCV), herpes simplex Virüsü (HSV), sitomegalovir'ûs (CMV), influenza Virüsü. (grip), respiratuar sinsitiyal Virüs (RSV), parvovürisü, norovirüsi'i, insan papilloina Virüsü (HPV), rinovir'ûs, sarihumnia Virüsü, kuduz Virüsü, Dengue atesi Virüsü, kizamik Virüsü, kabakulak Virüsü, kizamikçik Virüsü, varicella zoster Virüsü, enterovirüs (örn, enterovirî'is 71), ebola virüsü ve sigirlarda ishal Virüsûnden proteinler ve peptitler yer alir. Tercihen antijenik madde, HSV glik0proteini gD, HIV glikoproteini gp120, HIV glikoproteini gp 40, HIV p55 gag ve pol ve tat bölgelerinden polipeptitlerini olusturdugu gruptan seçilir. Bulusun tercih edilen diger düzeneklerinde antijen, örnegin Helicobacter pylori, Haemophilus influenza, Vibrio cholerae (kolera), C. diphtheriae (difteri), C. tetani (tetanos), Neisseria meningitidis, B. pertussis, Mycobacterium tuberculosis ve benzeri gibi bir bakterideii türetilmis bir proteiii veyapeptittir.Bulusa ait kendiliginden replike olan RNA molekülleri tarafindan sifrelenebilen HIV antijenleri, 9 Mart 1990 tarihinde dosyalanmis ABD basvurusu Ser. No. 490,858”de ve yayinlaninis Avrupa basvurusu no. 181 150°de (14 Mayis 1986) ve ayrica ABD basvurulari Seri No. 60/168,471; 09/475,515; 09/475,504; ve 09/610,313”te tarifedilir.Bulusa ait kendiliginden replike olan RNA molekülleri tarafindan sifrelenebilen sitomegalovirüs anti jenleri, ABD Pat. No. 4,689,225, 16 Haziran 1989 tarihinde dosyalanmis ABD basvurusu Seri No. 367,363 ve PCT Yayini WO 89/07143”te tarif edilir.Bulusa ait kendiliginden replike olan RNA molekülleri tarafindan sifrelenebilen Hepatit C antijenleri, PCT/US88/04125, yayinlanmis Avrupa basvuru no. 318216 (31 Mayis 1989), 18 Kasim 1988 tarihinde dosyalanmis yayinlanmis Japon basvurusu no. 1-500565, Kanada basvurusu 583,561 ve EPO 388,232”de tarif edilir. Farkli bir HCV antijenleri seti, 16 Mart 1990 tarihinde dosyalanmis Avrupa patent basvurusu 90/302866.0 ve 21 Aralik 1989 tarihinde dosyalanmis ABD basvurusu Seri No. 456,637 ve PCT/US90/01348°de tarif edilir.Bazi düzeneklerde anti jen, bir alerjenden, Örn., polen alerjenleri (agaç, bitki, yabani ot ve çimen poleni alerjenleri); böcek veya araknid alerjenleri (solunum, tükürük ve venom alerjenleri, örn., akar alerjenleri, karafatma ve tatarcik alerjenleri, hymenopthera venom alerjenleri); hayvan kili ve kepegi alerjenleri (örn, kopek, kedi, at, siçan, fare, Vb.°nden); ve gida alerjeiilerinden (tüm, bir gliadin) türetilir. Agaç, çimen ve bitkilerden gelen `Önemli polen alerjenleri, taksonomik siralarda Fagales, Oleales, Pinales ve platanaceae°den,'Örnegin ve bunlarla sinirli olinamak üzere, hus agaci (Betula), akça agaç (Alnus), findik agaci (Corylus), gürgen agaci (Carpinus) ve zeytin agaci (Olea), sedir agaci (Cryptomeria ve Juniperus), çinar agacindan (Platanus), Poales sirasindan, örnegin Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale ve Sorghuni türünden, Asterales ve Urticales sirasindan, Örnegin Ambrosia, Arteniisia ve Parietaria türü bitkilerden kaynaklananlardir. Diger önemli solunum alerjenleri, Derinatophagoides ve Euroglyphus türü eV toz akarlari, depo akarlari, örn., Lepidoglyphys, Glycyphagus ve Tyrophagus, karafatmalar, tatarciklar ve pireler, örn., Blatella, Periplaneta, Chironomus ve Ctenocepphalides ve kedi, kopek ve at gibi meinelilerden olanlar, venom alerjenleri, örnegin isiran veya sokan böceklerden kaynaklananlar, öm., taksonomik sirada Hymenoptera, örnegin arilar (Apidae), esek arilari (Vespidea) ve karincalardan(Formicoidae) olanlardir.Bazi düzeneklerde bir tümör irninünojeni veya anti jeni veya kanser immünojeni veya anti jeni, kendiliginden replike olan RNA molekülü tarafindan sifrelenebilir. Bazi düzeneklerde tümör immünojenleri ve anti jenleri, peptit içerikli tümör anti jenleri, örn., bir polipeptit tümöranti jeni veya glikoprotein tümör anti jenleridir.Burada kullanima uygun tümör immünojenleri ve antijenleri, çok çesitli molekülleri, örn., (a) polipeptit içerikli tümör antijenlerini, örnegin polipeptitleri (örnegin 8-20 amino asit boyunda olabilirler, bununla birlikte bu araliginda disinda kalan uzunluklar da yaygindir),lipopolipeptitleri ve glikoproteinleri kapsar.Bazi düzeneklerde tümör iminünojenleri, örnegin (a) kanser hücreleri ile baglantili tam boyda moleküller, (b) bunlarin, delete edilmis, eklenmis ve/Veya ikame edilmis kisimlari olan moleküller dahil olmak üzere homologlari ve modifiye edilmis formlari ve (c) bunlarin fragmanlaridir. Tümör iminünojenleri arasinda örnegin CD8+ lenfositleri tarafindan taninan sinif 1 ile sinirli antijenler veya CD4+lenfositleri tarafindan taninan sinif H ile sinirli anti jenler yer alir.Bazi düzeneklerde tümör immünojenleri arasinda, bunlarla sinirli olinamak üzere, (a) kanser-testis anti jenleri, örn., NY-ESO-l, SSXZ, SCP] ve ayrica RAGE, BAGE, GAGE ve MAGE familyasi polipeptitleri, örnegin GAGE-l, GAGE-Z, MAGE-l, MAGE-Z, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-S, MAGE-6 ve MAGE-lZ (bunlar, örnegin melanoma, akciger, bas ve boyun, NSCLC, gögüs, gastrointestinal ve mesane tüinörlerine yönelik olarak kullanilabilir), (b) mutasyona ugramis anti jenler, örnegin p53 (çesitli kati tümörler, örn., kolorektal, akciger, bas ve boyun kanseri ile baglantili), p21/Ras (örn., inelanoma, pankreas kanseri ve kolorektal kanser ile baglantili), CDK4 (örn., melanoina ile baglantili), MUM] (örn., melanoma ile baglantili), kaspaz-S (örn., bas ve boyun kanseri ile baglantili), CIA 0205 (örn., mesane kanseri ile baglantili), HLA-AZ-Rl70l, beta katenin (örn., melanoma ile baglantili), TCR (örn., T hücresi non- Hodgkins lenfoma ile baglantili), BCR-abl (örn., kronik miyelojen lösemi ile baglantili), triosefosfat izomerazi, KIA 0205, CDC-27 ve LDLR-FUT, (c) asiri eksprese edilmis antijenler, örnegin Galektin 4 (örn., kolorektal kanser ile baglantili), Galektin 9 (örn., Hodgkin”s hastaligi ile baglantili), proteinaz 3 (öm., kronik miyelojen lösemi ile baglantili), WT 1 (örn., çesitli lösemiler ile baglantili), karbonikanhidraz (örn., renal kanser ile baglantili), aldolaz A (örn., akciger kanseri ile baglantili), PRAME (örn., inelanoma ile baglantili), HER- 2/neu (öm., gögüs, kolon, akciger ve yuinurtalik kanseri ile baglantili), alfa-fetoprotein (öm., hepatoma ile baglantili), KSA (örn., kolorektal kanser ile baglantili), gastrin (öm., pankreas ve gastrik kanser ile baglantili), telomeraz katalitik proteini, MUC-l (örn., gögüs ve yumurtalik kanseri ile baglantili), G-250 (örn., renal hücre karsinomasi ile baglantili), p53 (örn., gögüs, kolon kanseri ile baglantili) ve karsinoembriyonik anti jen (örn., gögü kanseri, akciger kanseri Ve gastrointestinal sistem kanserleri, örn., kolorektal kanser ile baglantili), (d) patlatilmis antijenler, örnegin melanoma-melanosit farklilastirma antijenleri, örn., MART-l/Melan A, gplOO, MClR, melanosit uyarici hormon reseptörü, tirozinaz, tirozinaz ile alakali protein-l/TRPI ve tirozinaz ile alakali protein-2/TRP2 (örn., melanoma ile baglantili), (e) prostat ile baglantili anti jenler, örn., PAP, PSA, PSMA, PSH-Pl, PSM-P 1, PSM-P2 (örn., prostat kanseri ile baglantili), (f) immünoglobulin idyotipleri (örnegin miyeloma ve Bhücre lenfomalari ile baglantili) yer alir.Bazi düzeneklerde tümör immünojenleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A- PRL, H4-RET, IGH- IGK, MYL-RAR, Epstein Barr virüsü antijenleri, EBNA, insan papillomavirüsü (HPV) antijenleri, örnegin E6 ve E7, hepatit B ve C Virüsü anti jenleri, insan T hücre lenfotropik Virüs anti jenleri, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23Hl, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO- 029, FGF-S, Ga733 (EpCAM), HTgp-l75, M344, MA-50, MG7-Ag,MOVIS, NB/7OK, NY-CO-l, RCASl, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2 baglama proteini\siklofilin C ile baglantili protein), TAAL6, TAG72, TLP, TPS ve benzeri yer alir.C. Nîikleik asit molekül'i'i için sulu çözeltiNükleik asit molekülü (RNA) genellikle bir sulu çözelti fonnunda veya bir sulu çözelti içinde kolayca çözünebilecek bir formda (örn., liyofilize edilmis) saglanir. Sulu çözelti, su halinde veya bir tuz (örn., NaCl), bir tampon (örn., bir sitrat tamponu), iyonik olmayan bir tonikleme ajani (örn., bir sakarid), bir polimer, bir surfektan veya bunlarin bir kombinasyonu içeren bir sulu çözelti halinde olabilir.

Formülasyonun in vivo uygulama için amaçlanmasi durumunda sulu çözeltinin, normal fizyolojik kosullar ile uyumlu bir pH”yi muhafaza edeii fizyolojik açidan kabul gören bir tampon olmasi tercih edilebilir.

Ayrica bazi durumlarda fonnülasyonun bazi bilesenlerinin stabilitesinitemin etmek için pH'nin özel bir seviyede tutulmasi arzu edilebilir.Ornegin izotonik ve/Veya izozmotik bir sulu çözelti hazirlanmasi arzu edilebilir. Hipertonik ve hipotonik çözeltiler enjekte edildiklerinde bazen uygulama sonrasi sisme veya kompozisyon ile fizyolojik sivilar arasindaki farkli iyon konsantrasyonlarmdan dolayi kompozisyonun hizli absorbe edilmesi gibi komplikasyonlara ve istenmeyen etkilere neden olabilir. Tonikligi kontrol altinda tutmak için emülsiyon, bir sodyum tuzu gibi bir fizyolojik tuz içerebilir. Sodyum klorid (NaCl), örnegin yaklasik %09 (a/h) (fizyolojik tuz) olarak kullanilabilir.

Mevcut olabilecek diger tuzlar arasinda potasyum klorid, potasyum dihidrojen fosfat, disodyum fosfat dehidrat, magnezyum klorid, kalsiyum klorid, Vb. yer alir. Örnek bir düzenekte sulu çözelti, lO mM NaCl ve baska tuzlar veya iyonik olmayan tonikleme ajanlari içerir.

Burada tarif edildigi gibi iyonik olmayan tonikleme ajanlari, tonikligi kontrol altinda tutmak için de kullanilabilir. Bir düzenekte hipertonik ve hipotonik çözeltiler, karismalari üzerine bir izotonik çözelti olusturacaklari sekilde karistirilir (örn, hipertonik RNA ve hipotonikemülsiyon; hipotonik RNA ve hipertonik emülsiyon).Sulu çözelti tamponlanabilir. Burada sitrat tamponlari, fosfat tamponlari, asetat tamponlari, sukinat tamponlari, tris tamponlari, bikarbonat tamponlari, karbonat tainponlari veya benzeri gibi fizyolojik açidan kabul gören herhangi bir tampon kullanilabilir. Sulu çözeltinin pH”si tercihen 6.0-8.0, tercihen yaklasik 6.2 ila yaklasik 6.8 arasinda olacaktir. Bazi durumlarda tampon içine belirli bir miktar tuz dahil edilebilir. Baska duruinlarda tampon içindeki tuz, nükleik asit moleküllerinin emülsiyon partikülüne komplekslesmesine engelolabilir ve bu yüzden bundan kaçinilir.Sulu çözelti ayrica sulu çözeltinin ozmolaritesini degistiren moleküller veya komplekslesme sonrasinda nükleik asidi stabilize eden moleküller gibi ilave bilesenler de içerebilir. Ornegin ozmolalite, genellikle karbohidratlar olan ancak polimerler de olabilen iyonik olmayan bir tonikleme ajani kullanilarak ayarlanabilir. (Bakiniz örn., Voet ve Voet (1990) Biochemistry (John Wiley & Sons, New York.) Uygun iyonik olmayan tonikleme ajanlarinin örnekleri arasinda sekerler (öm., trehaloz, sukroz, dekstroz, fruktoz, indirgenmis palatinoz, Vb.), sekerli alkoller (örn, manitol, sorbitol, ksilitol, eritritol, laktitol, maltitol, gliserol, Vb.) ve bunlarin kombinasyonlariyer alir. Arzu edilirse iyonik olmayan bir polimer (Örn., bir poli(a1kil glikol), örn., polietilen glikol, polipropilen glikol veya polibutilen glikol) veya iyonik olinayan surfektan da kullanilabilir. Bu tip ajanlar, özellikle seker ve sekerli alkoller ayrica liyofilize edildiginde RNA”y1 ve diger nükleik asit moleküllerini koruyabilen kriyo-koruyuculardir.

Ornek düzeneklerde tampon, yaklasik 560 nM ila 600 mM arasindatrehaloz, sukroz, sorbitol veya dekstroz içerir.Bazi durumlarda bir hipertonik çözelti olarak nükleik asit molekülü içeren bir sulu çözelti hazirlanmasi ve katisiksiz su veya bir hipotonik tainpon kullanilarak katyonik emülsiyon hazirlanmasi tercih edilebilir.

Emülsiyonun ve nükleik asit moleküli'inün birlestirildigi durumda karisim, izotonik hale gelir. Omegin RNA içeren bir sulu çözelti, hipertronik çözeltinin 2 kati olabilir ve katyonik em'ûlsiyon lOmM sitrat tainponu kullanilarak hazirlanabilir. RNA çözeltisi ve emülsiyonun 1:1 (h/h) oraninda karistirildigi durumda kompozisyon, izotonik hale gelir. Emülsiyonun nükleik asit molekülü içeren sulu çözeltiye arzu edilen göreli iniktarlarina göre (öm., 121 (h/h) karisim, 221 (h/h) karisim, l:2 (h/h) karisim, Vb.) sulu çözeltinin, bir izotonikkarisima ulasmak için gerekli olan tonikligi kolayca belirlenebilir.Benzer sekilde fizyolojik ozmolaliteye sahip olan koinpozisyonlar, in Vivo uygulama için istenebilir. Fizyolojik ozmolalite, her bir kg su basina yaklasik 255 mOsm ila her bir kg su basina yaklasik 315 mOsm arasindadir. Bazen bir hiperozmolar çözelti olarak nükleik asit molekülü içeren bir sulu çözelti hazirlanmasi ve katisiksiz su veya bir hipoozmolar tampon kullanilarak katyonik emülsiyon hazirlanmasi tercih edilebilir. Emülsiyonun ve nükleik asit molekülününbirlestirildigi durumda fizyolojik ozinolalite elde edilir. Hiç süphesiz buna, bir hipoozmolar nükleik asit çözeltisi ve bir hiperozmolar tampon kullanilarak da ulasilabilir. Emülsiyonun nükleik asit molekülü içeren sulu çözeltiye arzu edilen göreli miktarlarina göre (örn., 1:1 (h/h) karisim, 2:1 (h/h) karisim, 122 (h/h) karisim, Vb.) sulu çözeltinin, bir izo-ozmolar karisima ulasmak için gerekli olanozmolalitesi kolayca belirlenebilir.Bazi düzeneklerde nükleik asit molekülü içeren sulu çözelti ayrica bir polimer veya bir surfektan veya bunlarin bir kombinasyonunu da içerebilir. Ornek bir düzenekte su içinde yag emülsiyonu, bir poloksamer içerir. Ozellikle kasifler, katyonik em'ulsiyon partiküllerine komplekslesme öncesinde RNA sulu çözeltisine Pluronic® F127 ilave edilmesinin, RNA molekülünün stabilitesiiiin daha fazla olinasina ve RNAse direncinin artmasina yol açtigini gözlemlemistir. RNA sulu çözeltisiiie pluronic F127 ilavesinin, RNA/CNB kompleksinin partikül ebadini küçültt'ûgü de bulundu.

Poloksamer polimerleri ayrica RNA molekülüni'in uygun sekilde komplekslikten ayrilmasini/salinmasini kolaylastirabilir, emülsiyon partiküllerinin toplasinasini engelleyebilir ve immün module edici etki gösterebilir. Kullanilabilen diger polimerler arasinda örn., Pluronic®F68 veya PEG300 yer alir.Alternatif veya ek olarak nükleik asit molekülü içereii sulu çözelti, yaklasik %005 ila yaklasik %20 (a/h) polimer de içerebilir. Örnegin katyonik su içinde yag emülsiyonu, bir polimeri (öm., bir poloksameri, örn., Pluronic® F127, Pluronic® F68 veya PEG300°ü), yaklasik %005 ila yaklasik %10 (a/h), örn., %005, %05, %1 veya%5 olarak içerebilir.

Tampon sistemi, yukarida tarif edilen iki veya daha fazla molekülün (tuz, tampon, sakarid, polimer, Vb.) herhangi bir kombinasyonunu içerebilir. Tercih edilen bir düzenekte tampon, burada tarif edilen bir katyonik su içinde yag emülsiyonu ile karistirilabilen 560 mM sukroz, 20mM NaCl ve 2mM Sitrat içerir ve böylelikle 280 mM sukroz, 10 mM NaCl ve 1 mM sitrat içeren bir nihai sulu faz üretilir. Baska düzeneklerde tampon, burada tarif edilen bir katyonik su içinde yag einülsiyonu ile karistirilabilen yaklasik 2-20 mM Sitrat içerir veböylelikle yaklasik 1-10 mM Sitrat içeren bir nihai sulu faz üretilir.5. PREPARASYON YÖNTEMLERIN/P orani en az 421 ve ortalama partikül büyüklügü yaklasik 80 nm ila yaklasik 180 nm arasinda olmak üzere bir katyonik su içinde yag emülsiyonunun bir partikülü ile komplekslesmis bir nükleik asit molekülü içeren bir kompozisyon hazirlamaya yönelik bir yöntem, sunlari kapsar: bir katyonik su içinde yag emülsiyonu hazirlanmasi; buradaki emülsiyon, sunlari içerir: (1) yaklasik %02 ila yaklasik %20 (h/h) yag, (2) yaklasik %001 ila yaklasik %2,5 (h/h) surfektan ve (3) bir katyonik lipit; ve katyonik su içinde yag einülsiyonuna nükleik asit molekülü ilave edilerek nükleik asit molekülünün, emülsiyonunpartikülü ile komplekslesmesinin saglanmasi.Katyonik su içinde yag emülsiyonu üretmeye yönelik örnek bir yaklasim, sunlari kapsayan bir prosesle olur: (1) yag ve katyonik lipidin birlestirilmesiyle emülsiyonun yag fazinin olusturulmasi; (2) bir sulu çözelti saglaninasiyla einülsiyonun sulu fazinin olusturulmasi;ve (3) yag fazinin sulu faz içinde Örnegin homojenlestirme yoluyla disperse edilmesi. Homojenlestirme, uygun herhangi bir yolla, örnegin ticari bir homojenlestirici (örn, IKA T25 homojenlestirici, VWR International (West Chester, PA)°da mevcuttur) kullanilarakyapilabilir.Katyonik lipit, uygun bir solvent, örn., kloroform (CHC13), diklorometan (DCM), etanol, aseton, Tetrahidrofuran (THF), 2,2,2 trifloroetaiiol, asetonitril, etil asetat, heksan, Dimetilformamid (DMF), Diinetil sülfoksid (DMSO), Vb. içinde çözündürülebilir ve direkt olarak emülsiyonun yag bilesenine ilave edilebilir. Alternatif olarak katyonik lipit, uygun bir solvente ilave edilerek bir lipozoin süspansiyonu olusturulabilir; sonra lipozom süspansiyonu, emülsiyonun yag bilesenine ilave edilebilir. Katyonik lipit ayricadirekt olarak yag içinde de çözündür'ûlebilir.Lipidin çözüninesini kolaylastirmak için yagin, yaklasik 30°C ilayaklasik 65°C arasindaki bir sicakliga isitilmasi arzu edilebilir.Arzu edilen katyonik lipit (örn., DOTAP) miktari ölçülebilir ve bir solvent , su içinde yada direkt olarak yag içinde çözündürülerek burada tarif edilen ve 'Örneklenen arzu edilen bir nihai konsantrasyonaulasilabilir.Kloroform (CHCl3) veya diklorometan (DCM) gibi solventler, yag fazindan, sulu faz ile yag fazi birlestirilmeden önce veya homojenlestirme öncesinde öm., buharlastirma yoluyla çikarilabilir.

Alternatif olarak lipit çözünürlügünün bir problem olabilecegidurumlarda solvent (örn., DCM) ile hala yag fazinda olan birincil bir emülsiyon yapilabilir. Bu tür durumlarda solvent, ikincil bir hoinojenlestirine öncesinde birincil emülsiyondan çikarilabilir (örn.,buharlasmasi saglanabilir).Emülsiyonun bir veya daha fazla surfektan içermesi duruinunda surfektan(lar), yag fazina veya sulu faza, bu konudaki klasik uygulamaya göre dahil edilebilir. Örnegin SPAN®85, yag fazinda (örn., skualen içinde) çözündür'i'ilebilir ve Tween® 80, sulu fazda(örn., bir sitrat tamponu içinde) çözündürülebilir.Baska bir yönde bulus, bir katyonik su içinde yag emülsiyonu ile komplekslesmis bir nükleik asit molekülü (RNA) içeren bir kompozisyon hazirlanmasina yönelik olup, sunlari kapsayan bir yöntem saglar: (i) burada tarif edildigi gibi bir katyonik su içinde yag emülsiyonu saglanmasi; (ii) nükleik asit molekülü (RNA) içeren bir sulu çözelti saglanmasi; ve (iii) (i),deki su içinde yag em'ulsiyonu ile (iii)”deki sulu çözeltinin birlestirilmesi, böylelikle nükleik asit molekülün'un, emülsiyonun partikülü ile komplekslesmesi. Örnegin bir katyonik su içinde yag emülsiyonu, bir nükleik asit molekülü içeren bir sulu çözelti (örn., sulu bir RNA çözeltisi) ile arzu edilen göreli miktarlarda, örn., yaklasik 1:] (h/h), yaklasik 1.5 :1 (h/h), yaklasik 2:] (h/h), yaklasik 2.521 (h/h), yaklasik 3:1 (h/h), yaklasik 3.521 (h/h), yaklasik 4:l (h/h), yaklasik 5:1 (h/h), yaklasik 1011 (h/h), yaklasik 1:1.5 (h/h), yaklasik l:2 (h/h), yaklasik 1:2.5 (h/h), yaklasik l:3 (h/h), yaklasik 113.5 (h/h), yaklasik 1:4 (h/h), yaklasik 1215 (h/h) veya yaklasik 1:1.10 (h/h), vb. olacak sekilde birlestirilebilir.Kompleks sonrasi kompozisyoiiun (örn., RNA-emülsiyon kompleksi)her bir bileseninin konsantrasyonu, kullanilan koinpleks öncesi su içinde yag emülsiyonunun ve nükleik asit moleküli'i içeren sulu çözeltinin (örn., sulu bir RNA çözeltisi) göreli miktarlarina göre kolayca belirlenebilir. Örnegin bir katyonik su içinde yag emülsiyonunun bir nükleik asit molekülü içeren bir sulu çözelti (örn., sulu bir RNA çözeltisi) ile 1:l (h:h) oraninda birlestirildigi durumda yag ve katyonik lipidin konsantrasyonlari, kompleks 'Öncesi em'ûlsiyonunkinin 1/2°si olur. Bu yüzden %4.3 (a/h) skualen, 1.4 mg/mL DOTAP, %0.5 h/h SPAN®85 ve %0.5 h/h Tween® 80 içeren bir emülsiyonun (burada "CNE17" olarak anilir) 560 mM sukroz, 20 mM NaCl, 2 mM Sitrat ve %1 (a/h) Pluronic F127 içeren bir sulu RNA çözeltisi ile 1:] (h:h) oraninda birlestirilmesi durumunda kompleks sonrasi kompozisyon, %2.15 (a/h) skualen, 0.7 mg/mL DOTAP, %025 11/11 SPAN®85, %025 h/h Tween® 80, 280 mM sukroz, 10 mM NaCl, lmM Sitrat ve %05 (21/11) Pluroiiic F127 içerir.Partiki'il olusumunu promote etmek, nükleik asit molekülleri ile katyonik partiküller arasindaki komplekslesmeyi gelistirmek, nükleik asit molekülünün stabilitesini arttirmak (örn., bir RNA molekülünün degradasyonunu engellemek), nükleik asit moleküllerinin (örn., bir RNA molekülü) uygun sekilde komplekslikten ayrilmasini/salinmasini kolaylastirmak veya emülsiyon partiküllerinin toplasmasini engellemek için ilave opsiyoiiel adinilar dahil edilebilir. Örnegin nükleik asi molekülü (öm., RNA) içeren sulu çözeltiye bir polimer (örn., Pluronic® F127) veya bir surfektan ilave edilebilir. Ornek bir düzenekte eniülsiyon partikülüne komplekslesmeden önce RNAmolekülüne Pluronic® F 127 ilave edilir.

Emülsiyon partiküllerinin büyüklügü, surfektanin yaga oraninin (oraninin arttirilmasi, dainlacik büyüklügünü azaltir), isletim basincinin (isletiin basincinin arttirilmasi, damlacik büyüklügünü azaltir), sicakligin (sicakligin arttirilmasi, damlacik büyüklügünü azaltir) ve diger islem parametrelerinin degistirilmesiyle degistirilebilir. Gerçek partikül büyüklügü ayrica kullanilan Özel surfektan, yag ve katyonik lipit ve seçilen 'özel isletim kosullari ile de degisecektir. Emülsiyonun partikül büyüklügü, ebatlandirma aletleri, örn., Coulter Corporation tarafindan üretilen ticari SubMicron Partikül Analizeri (Model N4MD) kullanilarak dogrulanabilir ve parametreler, partikülün ortalama çapi 80 nm ila 180 nm arasinda olana kadaryukarida verilen genel bilgiler kullanilarak degistirilebilir.Katyonik su içinde yag emülsiyonu (komplekslesme öncesi emülsiyon) veya nükleik asit molekülü-emülsiyon kompleksi hazirlamaya yönelik opsiyonel prosesler arasinda örn., sterilizasyon, partikül büyüklügü seçimi (örn., büyük partiküllerin çikarilmasi),doldurma, paketleme ve etiketleme, vb. yer alir.Örnegin komplekslesme öncesi emülsiyonun veya nükleik asit- emülsiyon kompleksinin in Vivo uygulama için formüle edilmesi durumunda bu, örn., sterilize etme ayarinda bir filtreden (örn., 0.22 mikronluk bir filtreden) filtre edilerek sterilize edilebilir. Diger sterilizasyon teknikleri arasinda steril bir kompozisyon üretmek için bir termal proses veya bir radyasyoiila sterilizasyon prosesi veyapulslu isik kullanilmasi yer alir.Burada tarif edilen katyonik su içinde yag emülsiyonu, asi üretiminde kullanilabilir. Steril ve/Veya klinik evrede katyonik su içinde yag emülsiyonlari, MF59 için tarif edilenlere benzer yöntemler kullanilarak hazirlanabilir. Bakiniz örn., Ott ve arkadaslari, Methods in Molecular Medicine, 2000, Cilt 42, 211-228, VACCINE ADJUVANTS (O°Hagan ed), Humana Press. Ornegin MF59”u üretim prosesine benzer sekilde emülsiyonun yag fazi ve sulu fazi birlestirilebilir ve ayni hatta olan bir homojenlestiricide isleme tabi tutularak kaba bir emülsiyon elde edilebilir. Kaba einülsiyon daha sonra bir mikro-akiskanlastiriciya beslenebilir ve burada da islemden geçirilerek stabil bir mikron alti emülsiyon elde edilebilir. Kaba emülsiyon, arzu edilen partikül büyüklügü elde edilene kadar tekrar tekrar mikro-akiskanlastiricinin etkilesim bölmesinden geçirilebilir.

Sonra yigin emülsiyon filtre edilerek (örn., nitro jen altinda 0.22 umslik bir filtreden geçirilerek) büyük partiküller çikarilabilir ve böylelikle uygun kaplar (örn., cam siseler) içerisine doldurulabilecek einülsiyon yigini elde edilebilir. Depoda su içinde yag emülsiyonu varliginda uzun süreli stabilite sergileyen asi anti jenlerinin durumunda anti jen ve emülsiyon birlestirilebilir ve steril filtre edilebilir (örn., 0.22 um°lik bir filtre membranindaii geçirilerek). Birlestirilen tek bir sise asi, tek dozluk kaplar içerisine doldurulabilir. Uzun süreli stabilite göstermemis olan asi antijenlerinin durumunda emülsiyon, ayri bir sise halinde tedarik edilebilir. Bu tür durumlarda emülsiyon yigini, filtrelenerek sterilize edilebilir (örn., 0.22um'lik bir filtre membranindan geçirilerek), doldurulabilir ve son tek dozluk siseleriçerisine ambalajlanir.Kalite kontrolü istege göre emülsiyon yigininin veya karistirilmisasinin küçük bir örnegi üzerinde yapilabilir ve yigin veya karistirilmis asi, sadece ömegin kalite kontrol testini geçmesi durumunda dozlarhalinde paketlenecektir.6. FARMASOTIK KOMPOZISYONLAR VE UYGULAMABulusa ait katyonik su içinde yag emülsiyonu, burada tarif edildigi gibi bir katyonik su içinde yag emülsiyonunun bir partikülü ile koinplekslesinis bir nükleik asit molekülü içeren ve ayrica bir veya daha fazla farmasötik açidan kabul gören tasiyici, seyreltici veya eksipiyan da içerebilen bir farmasötik kompozisyon içinde kullanilabilir. Tercih edilen düzeneklerde farmasötik kompozisyon, birasi olarak kullanilabilen bir immünojenik kompozisyondur.Burada tarif edilen kompozisyonlar, bir nükleik asit molekülünün hücrelere verilmesinde kullanilabilir. Örnegin nükleik asit inolekülleri (6111., DNA veya RNA), hücrelere çesitli amaçlarla, örn., arzu edilen bir gen ürününün (örn., protein) üretimini indüklemek, bir genin ekSpresyonunu regüle etmek, gen terapisi ve benzeri için verilebilir.

Burada tarif edilen kompozisyonlar ayrica bir nükleik asit molekülünün (öm., DNA veya RNA) hücrelere terapötik amaçlarla, örn., kanserler veya proliferatif bozukluklari, metabolik hastaliklar, kardiyovasküler hastaliklar, enfeksiyonlar, alerjiler gibi bir hastaligi tedavi etmek, bir immün tepkisi indüklemek ve benzeri için verilinesinde de kullanilabilir. Örnegin nükleik asit molekülleri hücrelere, bir hedef genin ekspresyonunu inhibe etmek için verilebilir.

Bu tür nükleik asit molekülleri arasinda, örn., antisens oligonükleotitler, çift iplikçikli RNAlar, örn., küçük müdahale edici RNAlar ve benzeri yer alir. Çift iplikçikli RNA molekülleri, örn., küçük müdahale edici RNAlar, ilgili hedef geni spesifik olarak sessizlestiren (gen yok etme) RNA müdahalesini tetikleyebilir.

Antisens oligonükleotitler, DNA veya RNA'nin, seçilen bir sekans için komplementer olan tekli iplikçikleridir. Genellikle antisens RNA, bazi haberci RNA iplikçiklerinin protein translasyonunu, bunlara baglanarak engelleyebilir. Antisens DNA, spesifik, koinplementer (kodlayici veya kodlayici olmayan) bir RNA°yi hedefleinede kullanilabilir. Böylelikle burada tarif edilen katyonik emülsiyonlar, antisens oligonükleotitlerin veya çift iplikçikli RNAlarin, örnegin bir onkolo ji hedefi üretiminin inhibe edilmesiyle kanserin tedavi edilmesiiçin verilmesinde faydalidir.Burada verilen farmasötik kompozisyonlar, tek baslarina veya bir veya daha fazla ilave terapötik ajan ile kombinasyon halinde uygulanabilir. Uygulama yöntemleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, oral uygulama, rektal uygulaina, parenteral uygulama, subkütan uygulama, intravenöz uygulama, intravitral uygulama, intrami'isk'ûler uygulama, inhalasyon, intranazal uygulama, t0pikaluygulama, oftalmik uygulama ve otik uygulama yer alir.Burada tarif edilen kompozisyonlarin terapötik açidan etkin bir miktari, digerleri arasinda, endike edilen hastaliga, hastaligin siddetine, süjenin yasina ve göreli sagligina, uygulanan bilesigin potansina, uygulama moduna ve arzu edilen tedaviye bagli olarakdegisecektir.Diger düzeneklerde burada tarif edilen farmasötik kompozisyonlar, bir veya daha fazla ilave terapötik ajan ile kombinasyon halindeuygulanabilir. Ilave terapötik ajanlar arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, antibiyotikler, antibakteriyel ajanlar, antiemetik ajanlar, antifungal ajanlar, anti-enflamatuar ajanlar, antiviral ajanlar, immünomodüle edici ajanlar, sitokinler, antidepresanlar, hormonlar, alkile edici ajanlar, antimetabolitler, antit'i'imör antibiyotikleri, antimitotik ajanlar, topoizomeraz inhibitörleri, sitostatik ajanlari, anti- envazyon ajanlari, antianjiyojenik ajanlar, büyüme faktörü fonksiyonu inhibitörleri, Viral replikasyon inhibitörleri, Viral enzim inhibitörleri, anti-kanser a janlari, Ot-interferonlar, ß-interferon, ribavirin, hormonlar, diger çan benzeri reseptör modülatörleri, immünoglobulinler (Igler) ve Ig fonksiyonunu modüle eden antikorlar (örn., bir anti-IgE(omalizumab)) yer alir.Bazi düzeneklerde burada verilen farmasötik kompozisyonlar, bunlarla sinirli olmamak üzere, burada açiklanan patojenlerin neden oldugu hastalik, örnegin Viral hastaliklar, örn., genital Sigiller, genel Sigiller, el-ayak sigilleri, kuduz, respiratuar sinsitiyal Virüs (RSV), hepatit B, hepatit C, Dengue virüsü, sari humma, herpes simplex Virüsü (sadece örnek olarak HSV-I, HSV-II, CMV veya VZV), molluscuin contagiosum, vaccinia, variola, lentivirüs, insan bagisiklik noksanligi Virüsü (HIV), insan papilloma Virüsü (HPV), hepatit Virüsü (hepatit C Virüsü, hepatit B Virüsü, hepatit A virüsü), sitomegalovir'ûs (CMV), varicella zoster virüsü (VZV), rinovirüs, enterovirüs (örn.

EV71), adenovir'us, koronavir'üsü (örn., SARS), influenza, parainfluenza, kabakulak Virüsü, kizamik virüsü, kizamikçik Virüsü, papovavir'ûsü, hepadnavirûsü, flavivir'ûs, retrovir'üs, arenavirüs'û (sadece örnek olarak LCM, Junin Virüsü, Machupo Virüsü, Guanarito Virüsü ve Lassa Atesi) ve filoviri'is (sadece örnek olarak ebola virüsüveya marburg Virüsü) gibi enfeksiyöz hastaliklarin tedavisinde kullanilir.Bazi düzeneklerde burada verilen farmasötik kompozisyonlar, bakteriyel, fungal ve protozoal enfeksiyonlarin, örnegin ve bunlarla sinirli olmamak üzere, inalarya, tüberküloz ve inycobacteriuin aVium, cüzzam; pneumocystis camii, kriptosporidiozis, histoplazmozis, toksoplazmozis, tripanozom enfeksiyonu, leismanyazis, Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus ve Chlamydia türü bakterilerin iieden oldugu enfeksiyonlar ve fungal enfeskiyonlarin, öm., kandidiazis, aspergillozis, histoplazmozis ve kriptokok menenjitin tedavisindekullanilir.Bazi düzeneklerde burada verilen farinasötik kompozisyonlar, respiratuar hastaliklarin ve/Veya bozukluklarin, dermatolojik bozukluklarin, Oküler hastaliklarin ve/Veya bozukluklarin, genitoüriner hastaliklarin ve/Veya bozukluklarin, örnegin allograft reddi, otoimmün ve alerjik, kanser veya hasar görmüs veya yaslanancilt, öm., skarlasma ve burusukluklarin tedavisinde kullanilir.Bir baska yönde açiklama, bir meineli gibi buna ihtiyaci olan bir sü jede bir immün tepkisi üretmeye veya bunu güçlendirmeye yönelik olup, burada açiklanan bir koinpozisyondan etkin bir miktarin uygulanmasini kapsayan bir yöntem saglar. Immün tepkisi tercihen koruyucudur ve tercihen antikorlari ve/veya hücre aracili immüniteyi kapsar. Yöntem, birincil bir immün tepkisi indüklemek ve/Veya birimmün tepkisinin boost etmek için kullanilabilir.

Bazi düzeneklerde burada açiklanan kompozisyonlar, örn., bir memeli gibi buna ihtiyaci olan bir süjede bir immün tepkisini yükseltmedeveya arttirmada kullanim amaçli bir ilaç olarak kullanilabilir.Bazi düzeneklerde burada açiklanan kompozisyonlar, örn., bir memeli gibi buna ihtiyaci olan bir süjede bir iinmüii tepkisi üretmeye veyabunu güçlendirmeye yönelik bir ilaç üretiminde kullanilabilir.Açiklama ayrica burada açiklanan bir kompozisyon veya bir asi ileönceden doldurulmus bir verme aygitini da sunar.Memeli tercihen bir insandir ancak örn., bir inek, tavuk, kedi veya kopek de olabilir çünkü burada verilen patojenler, genis bir tür araliginda problem yaratabilir. Asinin profilaktik kullanima yönelik olmasi durumunda insan tercihen bir çocuk (om, yeni yürüyen çocuk veya bebek), bir genç veya bir yetiskindir; asinin terapötik kullaniina yönelik olmasi durumunda insan tercihen bir genç veya bir yetiskindir. Çocuklar için amaçlanan bir asi ayrica örn., güvenligi, dozaji, immünojenikligi, vb.°ni degerlendirmek amaciyla yetiskinlere deuygulanabilir.Terapötik tedavinin etkinligini çek etmenin bir yolu, burada açiklanan kompozisyonlarin veya asilarin uygulanmasindan sonra patojen enfeksiyonunun izlenmesidir. Profilaktik tedavinin etkinligini çek etmenin bir yolu, antijene karsi immün tepkilerinin sistemik olarak (örn., IgGl ve IgGZa üretim düzeyinin izlenmesi) ve/veya mukoza] olarak (örn., IgA üretim seviyesinin izlenmesi) izlenmesidir. Tipikolarak anti jeiie 'Özel serum antikor tepkileri, immünizasyon soiirasinda ancak tehdit öncesinde belirlenirken antijene `Özel inukozal antikortepkileri, immünizasyon sonrasinda ve tehdit sonrasinda belirlenir.Nükleik asit molekülünün (Örn, RNA) bir protein anti jenini sifreledigi burada açiklanan koinpozisyonlarin veya asilarin immünojenikligini degerlendirmenin bir baska yolu, hasta seruinlarinin veya mukoza] sekresyonlarin immünoblot ve/Veya mikro-diziler yoluyla taranmasi içiii protein antijeninin rekoinbinant sekilde ekSprese edilmesidir.

Protein ile hasta örnegi rasindaki pozitif bir reaksiyon, hastanin, söz konusu proteine karsi bir immün tepkisi olusturdugunu isaret eder. Bu yöntem ayrica immüno-dominant anti jenleri ve/Veya proteinanti jenleri içindeki epitoplari tanimlamada da kullanilabilir.Kompozisyonlarin etkinligi ayrica ilgili enfeksiyon patojenli uygunhayvan modellerinin tehdit edilmesiyle in vivo da belirlenebilir.Dozaj, tek dozlu bir program veya çok dozlu bir programla olabilir. Çoklu dozlar, bir birincil immünizasyon programinda ve/Veya bir booster immünizasyon programinda kullanilabilir. Bir çoklu doz programinda çesitli dozlar ayni veya farkli yollarla, örn., bir parenteral prime ve mukozal boost, bir inukozal prime ve parenteral boost, Vb. seklinde verilebilir. Çoklu dozlar tipik olarak en az 1 hafta arayla (örn., yaklasik 2 hafta, yaklasik 3 hafta, yaklasik 4 hafta, yaklasik 6 hafta, yaklasik 8 hafta, yaklasik 10 hafta, yaklasik 12 hafta, yaklasik 16 hafta, Vb.) uygulanacaktir.Burada açiklana ve bir veya daha fazla anti jen içeren veya bir veyadaha fazla antijen ile birlikte kullanilan kompozisyonlar, hem çocuklarin hem de yetiskinlerin tedavisinde kullanilabilir. Bir insan sü je, 1 yasindan küçük, 1-5 yasinda, 5-15 yasinda, 15-55 yasinda veya en az 55 yasinda olabilir. Kompozisyonlari alinasi tercih edilen süjeler, yaslilar (örn., >50 yas, >60 yas ve tercihen >65 yas), gençler (örn., <5 yas), hastanede yatan hastalar, saglik çalisanlari, ordu ve askeri personel, hamile kadinlar, kronik hastaligi olanlar veya bagisikligi noksan hastalardir. Kompozisyonlar sadece bu gruplar içinuygun degildir, bir pOpülasyonda daha genel olarak da kullanilabilir.Burada açiklanan ve bir veya daha fazla anti jen içeren veya bir veya daha fazla anti jen ile birlikte kullanilan kompozisyonlar, hastalara, diger asilarla önemli ölçüde ayni anda (öm., bir saglik uzmanina veya asilama merkezine ayni tibbi danisma veya ziyaret sirasinda), örn., bir kizainik asisi, bir kabakulak asisi, bir kizamikçik asisi, bir MMR asisi, bir suçiçegi asisi, bir MMRV asisi, bir difteri asisi, bir tetanos asisi, bir bogmaca asisi, bir DTP asisi, bir kon juge edilmis H. influenza tip b asisi, eylemsizlestirilmis bir poliovirus asisi, bir hepatit B Virüsü asisi, bir meninjokok konjugat asisi (Örn., bir tetravalent A C W135 Y asisi), bir respiratuar sinsitiyal Virüs asisi, Vb. ile önemli ölçüde ayni andauygulanabilir.Bazi düzeneklerde burada verilen kompozisyonlar, adjuvanlar gibi bir veya daha fazla immüno-regüle edici ajani içerir veya istege göre içerir. Ornek adjuvanlar arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, asagida daha detayli müzakere edilen bir THl adjuvani ve/veya bir TH2 ad juvani yer alir. Bazi düzeneklerde burada verilen iinmünojenik koinpozisyonlar içerisinde kullanilan adjuvanlar arasinda, bunlarlasinirli olmainak üzere, sunlar yer alir: _L. Mineral Içerikli Kompozisyonlar;. Yag Emülsiyonlari;. Saponin Formülasyonlari;. Virozomlar ve Virüs Benzeri Partiküller;. Bakteriyel veya Mikrobiyal Türevler;. Biyo-adhesifler ve Muko-adhesifler;. Lipozomlar;. Polioksietilen Eter ve Polioksietilen Ester Formülasyonlari;. Polifosfazen (PCPP);@OOQONUI-IÄWNO. Muramil Peptitler;i-i i-.i. Imidazokinolon Bilesikleri;N. Tiyosemikarbazon Bilesikleri;i-i U.). Triptantrin Bilesikleri;;- .h. Insan Immünomodülatörleri;i-i UI. Lipopeptitler;i-i O\. Benzonaftiridinler; 17. Mikropartiküller 18. Immüno-uyarici polinükleotit (örn., RNA veya DNA; örn., CpGiçerikli oligonükleotitler)ÖRNEKLERSimdi genel anlamda tarif edilen bulus, sadece mevcut bulusa ait bazi yönlerin ve düzeneklerin gösterilmesi amaciyla dahil edilen ve bulusu sinirlamasi amaçlanmayan asagidaki örneklere gönderme yapilarakçok daha kolay anlasilacaktir.ÖRNEK 1: KATYONIK SU IÇINDE YAG EMULSIYONLARISkualen, sorbitan trioleat (Span 85), polioksi-etilen sorbitan monooleat (Tween 80), Sigma°dan (St. Louis, M0, ABD) elde edildi. 1,2-Dioleoil-3 -trimetilamonyum-propan (DOTAP), Lipoid°den(Ludwigshafen Almanya) satin alindi.Bu çalismalarda kullanilan emülsiyonlarin bilesenleri, Tablo l°de gösterilmistir.

Tablo 1 CN E Katyonik mg/mL+Lipit Surfektan Skualen Tampon/su Lipit (+) CNE17 DOTAP 1.40 %05 SPAN %43 lOmM sitrat (DCM içinde) 85 tamponu pH 6.5 %05 Tween 80 CMF32 DOTAP 3.2 %05 SPAN %43 lOmM sitrat 85 tamponu pH 6.5 %05 Tween 80 CMI-`34 DOTAP 4.4 %05 SPAN %43 lOmM sitrat 85 tamponu pl-l 6.5 %05 Tween 80 CMF35 DOTAP 5.0 %05 SPAN %43 lOmM sitrat 85 tamponu pl-l 6.5 %05 Tween 80 CNEler, 'onceden tarif edildigi gibi yüklenmis MF59”a benzer sekilde hazirlandi (Ott ve arkadaslari, Journal of Controlled Release, Cilt 79, sayfa 1-5, 2002). CMF 32, 34 ve 35, o proseste baslica bir modifikasyon yapilarak hazirlandi. DOTAP, direkt olarak skualeniçinde çözündürüldü ve organik hiçbir solvent kullanilmadi. 1.6 mg/ml”den fazla DOTAP içeren emülsiyonlara bir solvent dahil edilmesinin, bir emülsiyoii üretecek sekilde mikro-akiskan olmayabilen köpüklü bir besleme stoku ürettigi kesfedildi. Skualenin 37°C°ye isitilmasi, DOTAP”1n direkt olarak skualen içinde çözünmesini ve sonra yagi fazinin sulu faz içinde basarili sekilde disperse oliiiasiyla (örn, homojenlestirme yoluyla) bir emülsiyon üretilmesini sagladi. DOTAP, skualen içinde çözülebilirdir ve skualen içinde Tablo l”de siralananlardan daha yüksek DOTAP konsantrasyonlarina ulasilabilir. Bununla birlikte yüksek DOTAP dozunun, toksik etkiler gösterebilecegi bildirilmistir. bakiniz örn.,Lappalainen ve arkadaslari, Pharm. Res., cilt 1 l(8):l 127-31 (1994).Kisacasi skualen, 37°C'ye isitildi ve DOTAP direkt olarak SPAN 85 varliginda skualen içinde çözündürüldü. Elde edilen yag fazi daha sonra sulu faz (sitrat tamponu içinde Tween 80) ile birlestirildi ve hemen 24K RPM'de bir IKA T25 homojenlestirici kullanilarak 2 dakika süreyle hoinojenlestirildi ve böylelikle homojen bir besleme stoku (birincil emülsiyonlar) üretildi. Birinci] emülsiyonlar, yaklasik olarak 15K-20K PSI”lik bir hoinojenlestirme basincinda bir buz banyosu sogutma bobini olan bir M-l lOS Mikro-akiskanlastiricidan veya bir M-llOP Mikro-akiskanlastiricidan (Microfluidics, Newton, MA) üç ila bes kez geçirildi. 20 ml”1ik küme örnekleri, üniteden çikarildi ve 4°C”de saklandi.Tablo l,de açiklandigi gibi CNElerin bilesenlerinin konsantrasyonlari, emülsiyonlar hazirlamak için kullanilan bu bilesenlerin baslangiçmiktarlarina göre hesaplanan konsantrasyonlardir. Emülsiyon üretim prosesi sirasinda veya filtreli sterilizasyon prosesi sirasinda az miktarda skualen, DOTAP veya baska bilesenlerde kayip olabilecegi ve bu bilesenlerin son üründeki (örn., uygulama için hazir ambalajlanmis, sterilize edilmis bir emülsiyon) gerçek konsantrasyonlarinin, bazen yaklasik %20 kadar olinak üzere biraz daha düsük olabilecegi anlasilir. Bazen son ürüii içindeki bilesenlerin gerçek konsantrasyonlari, yaklasik %25 veya yaklasik %35 kadar olmak üzere biraz daha düsük olabilir. Bununla birlikte bu konudaki klasik uygulama, 'Özel bir bilesenin konsantrasyonunun, son ürün içindeki gerçek konsantrasyon yerine einülsiyonu hazirlamak içinkullanilan baslangiç miktarina dayanarak açiklamaktir.RNA senteziBir alfavirüs replikonunu (kendiliginden replike olan RNA) sifreleyen plazmid DNA, in vitro RNA sentezinde bir sablon olarak kullanildi.

Her bir replikon, RNA replikasyonu için gerekli genetik eleinentleri içerir ancak partikül birlesmesi için gerekli olan gen ürünlerini sifreleyen sekanslar içermez. AlfaVirüS genomunun yapisal genleri, bir heterolog proteini (ekspresyonu, alfavirüs genom alti proinoteri ile tahrik edilen) sifreleyen sekanslarla degistirildi. Replikonlarin ökaryotik hücrelere verilmesi üzerine pozitif iplikçikli RNA translate edilerek yapisal olmayan dört protein üretilir ve bunlar birlikte genoinik RNA7yi replike eder ve heterolog proteini sifreleyen bol miktarda genom alti mRNA”yi transkripte eder. AlfaVirüs yapisal proteinlerinin ekspresyonundan yoksun oldugundan replikonlar, enfeksiyöz partiküller üretemez. Bir bakteriyofaj T7 promoteri, alfavirüs cDNA°sindan yukari yönde konumlandirilarak in vitroreplikon RNA sentez kolaylastirilir ve poli(A) kuyrugundan hemen asagi konumlandirilan hepatit delta virüsü (HDV) ribozimi, kendikendini klivaj etme aktivitesiyle dogru 3” ucunu üretir.HDV riboziminden asagi yöndeki plazmid DNAsnin uygun bir kisitlama endonükleazi ile linearize edilinesini takiben akip giden transkriptle, T7 veya SP6 bakteriyofaji türevli DNA°ya bagli RNA polimerazi kullanilarak in vitro sentezlendi. Transkripsiyonlar, 2 saat süreyle 37°C ”de 7.5 mM (T7 RNA polimerazi) veya 5 niM (SP6 RNA polimerazi), nükleosit trifosfatlarin her birinden nihai konsantrasyon (ATP, CTP, GTP ve UTP) varliginda, üreticinin (Ambion, Austin, TX) tedarik ettigi talimatlar izleiierek yapildi. Transkripsiyonun ardindan sablon DNA, TURBO DNase (Ambion, Austin, TX) ile di jest edildi. Replikon RNA, LiCl ile çökeltildi ve nükleazsiz su içinde yeniden biçimlendirildi. Kapaksiz RNA, transkripsiyon sonrasinda kullanici el kitabinda belirtildigi gibi ScriptCap m7G Kapaklama Sistemi (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI) kullanilarak Vaksiiiia Kapaklama Enzimi (VCE) ile kapaklandi. Traiiskripsiyon sonrasiiida kapaklanmis olan RNA, LiCl ile çökeltildi ve nükleazsiz su ile yeniden biçimlendirildi. Alternatif olarak replikonlar, transkripsiyon reaksiyonlarinin 6 mM (T7 RNA polimerazi için) veya 4 mM (SP6 RNA polimerazi için) m7G(5,)ppp(5°)G, tersine çevrilemez bir kapak yapisi analogu (New England Biolabs, Beverly, MA) ile desteklenmesi ve guanosin trifosfat konsantrasyonunun 1.5 n1M°ye (T7 RNA polimerazi için) veya 1 mM°ye (SP6 RNA polimerazi için) düsürülmesi suretiyle de kapaklanabilir. Traiiskriptler daha sonra TURBO DNase (Ambion, Austin, TX) dijesyonu ile saflastirilabilir ve ardindan LiCl ile çökeltme ve %75 etanol içindeyikama yapilabilir.

RNA örneklerinin konsantrasyonu, optik yogunlugun 260 nm°de ölçülmesiyle belirlendi. In vitro transkriptlerin bütünlügü, tam boydayapi varligi için denatüre edici agaroz jel elektroforeziyle dogrulandi.RNA koniplekslesmesiÇözelti içindeki nitrojen sayisi, katyonik lipit konsantrasyonuiidan hesaplandi; örnegin DOTAP, molekül basina protonlanabileii l nitrojene sahiptir. Çözelti içindeki fosfat miktarini hesaplamak için her bir mikrogram RNA basina tahminen 3 nmol fosfat kullanmak suretiyle RNA konsantrasyonu kullanildi. RNAzLipit miktarinin degistirilmesiyle N/P orani modifiye edilebilir. RNA, CNElere bir nitrojen/fosfat oranlari araliginda (N/P) komplekslestirildi. N/P orani hesaplamasi, her bir mililitre emülsiyon basina protonlanabilir nitrojenlerin mol sayisinin hesaplanmasiyla yapildi. Fosfat sayisini hesaplamak için her bir mikrogram RNA basina sabit 3 nmol fosfat kullanildi. Degerler belirlendikten sonra uygun oranda emülsiyon, RNA°ya ilave edildi. Bu degerler kullanilarak RNA, uygun konsantrasyona kadar seyreltildi ve direkt olarak esit hacimde bir emülsiyona ilave edilirken hafifçe vorteksleme yapildi. Çözelti, yaklasik 2 saat süreyle oda sicakliginda oturmaya birakildi.

Komplekslesmesi üzerine elde edilen çözelti, uygun konsantrasyonakadar seyreltildi ve 1 saat içerisinde kullanildi.Partikül büyüklügü deneyiEmülsiyonun partikül büyüklügü, üreticinin talimatlarina göre bir Zetasizer Nano ZS (Malvem Instruments, Worcestershire, Ingiltere) kullanilarak ölçüldü. Partikül büyüklükleri, polidispersite endeksi (pdi) ile Z-Ortalama (ZAve) olarak bildirilir. Bütün örnekler, ölçümler öncesinde su içinde seyreltildi. Ek olarak emülsiyonun partikül büyüklügü, Horiba LA-930 partikül ebatlayici (Horiba Scientific, ABD) kullanilarak ölçüldü. Örnekler, ölçümler 'Öncesinde su içinde seyreltildi. Zeta potansiyeli, üreticinin talimatlarina göre seyreltilmisörnekler kullanilarak Zetasizer Nano ZS ile ölçüldü.Sekrete edilmis alkalin fosfataz (SEAP) deneyiAnti jeii üretiminin kinetiklerini ve miktarini degerlendirmek için SEAP”yi sifreleyen bir RNA replikonu, farelere formülasyon ile ve onsuz intramüsküler yoldan uygulandi. 8-10 haftalik ve yaklasik 20g agirliginda 3 veya 5 disi Balb/C faresinden olusan gruplar, SEAP°yi sifreleyen replikon RNA ile komplekslestirilmis CNEler ile immünize edildi. Çiplak RNA, RNase'siz lX PBS içinde formüle edildi. Her bir fareye (saha basina 50ul) kuadriseps kasindan 100 ml”lik bir doz uygulandi. Kan 'ornekleri, eiijeksiyonda l, 3 ve 6 gün sonra alindi.

Alindiktan hemeii sonra serum, kandan ayrildi ve kullanilana kadar -30°C9de saklandi.Seruinu analiz etmek içiii bir kemiluininesen SEAP deneyi Fosfa-Isik Sistemi (Applied Biosystems, Bedford, MA) kullanildi. Fare serumlari, IX Fosfa-Isik seyreltme tamponu içinde l:4 oraninda seyreltildi. Örnekler, alüminyum sizdirmaz folyo ile sizdirmaz hale getirilmis bir su banyosu içiiie konuldu ve 65 °C'de 30 dakika süreyle isiyla eyleinsizlestirildi. Buz üzerinde 3 dakika süreyle sogutulduktan ve oda sicakligina kadar dengelendikten sonra oyuklara, 50 uL Fosfa- Isik deney tamponu ilave edildi ve örnekler, 5 dakika süreyle oda sicakliginda birakildi. Sonra 1:20 CSPD® (kemiluminesen alkalinfosfat substrati) içeren 50 mL reaksiyon tamponu ilave edildi ve luminesen, oda sicakliginda 20 dakikalik inkübasyoiiun ardindan ölçüldü. Luminesen, oyuk basina 1 saniyeli bir entegrasyon ile bir Berthold Centro LE 960 lumiiiometre (Oak Ridge, TN) üzerinde ölçüldü. Her bir örnekteki SEAP aktivitesi, iki kez ölçüldü ve bu ikiölçümün ortalainasi gösterildi.DRNEK 2: PARTIKUL BUYUKLUGUNUN IMMUNOJENIKLIK UZERINDEKI ETKISIBu örnek, partikül büyüklügünün, CNB/RNA formülasyonlarinm immünojenikligini etkiledigini gösterir.A. Partikül büyüklügü deneyi ve in vivo SEAP deneyi ile ilgili protokoller, Ornek l”de açiklanmistir. Murin iminünojeniklik çalismalari ile ilgili protokoller, Ornek 3'te açiklanmistir. Sekil 1A, in vivo SEAP deneyinin sonuçlarinin (aritmetik ortalama) gösterir. Sekil lB, 2Wpl ve 2Wp2 zaman noktalarinda BALB/c farelerinde ayri ayri hayvanlarin toplam IgG titerlerini gösterir.RNA°nin CNE17 ile komplekslesmesi, emülsiyon partiküllerinin büyüklügüiiü yaklasik 220 nm ila yaklasik 300 nm arasinda arttirdi.

SEKIL 1A ve SEKIL lB°de gösterildigi gibi, partikül büyüklügü arttikça SEAP'niii ekspresyon seviyeleri düstü ve konakçi immüntepkileri de azaldi.B. Farkli büyüklüklerde hazirlanaii CMF34, RSV-Fsyi sifreleyen RNA ile 7:1”1ik teorik bir N/P oraninda komplekslestirildi ve Balb/C farelerinin kuadrisepsi kasina bilateral olarak (saha basina 0.05 ml) enjekte edildi. Emülsiyoiiuii partikül büyüklükleri, mikro- akiskanlastiricinin isleme basiiiciiiin arttirilmasiyla modüle edildi.Veriler (Tablo 2), emülsiyoiiun partikül büyüklügünün ilk 109immünizasyondan iki hafta sonra daha küçük oldugu (bakiniz 120 nm ve 90 nm'lik partiküller) durumda en yüksek anti-RSVF titerlerininüretildigini gösterir.

Tablo 2 F ormülasyoii RNA N/ P 2wp] 2wp2 dozu oraiii GMT GMT lug VA375 küme 1 lug 7:] 16 151 lug VA375 küme 1 + CMF34 (5k PS] isleme lug 7:] 162 1644 - 20011n1 büyüklügünde) lug VA375 küme ] + CMF34 (7k PS] isleme 1ug 7:] 183 2540 - 150nm büyüklügünde) lug VA375 küine 1 + CMF34 (12k PSI isleme lug 7:] 465 3563 - 120nm büyüklügünde) lug VA375 küme 1 + CMF34 (20k PS] lug 7:] 548 2542 isleine-90nm büyüklügünde) ORNEK 3: TAMPON KOMPOZISYONLARININ IMMUNOJENIKLIK VE PARTIKUL BUYUKLUGU ÜZERINDEKI ETKILERIBu örnekte CNEl7'ye dayanan ancak tampon bilesenleri farkli çesitli emülsiyonlar hazirlandi. Tablo 3, tamponun modifiye edildigiemülsiyonlarin kompozisyonlarini gösterir. 110 Tablo 3 Taban Emülsiyo Tampon/ su 80, 1,4 mg/ml DOTAPCNE17: %43 Skualen, %0.5 SPAN 85, %0.5 Tween0 mM sitrat tamponu (RNasesiz dHZO içinde, DCM yok) 80, 1.4 mg/ml DOTAPCNE17: %43 Skualen, %0.5 SPAN 85, %0.5 Tweenl mM sitrat tamponu (RNasessiz ngO içinde, DCM yok) 80, 1,4 mg/ml DOTAPCNE17: %4,3 Skualen, %0.5 SPAN 85, %0.5 Tween5 mM sitrat tamponu (RNasessiz dl-IZO içinde, DCM yok) 80, 1.4 mg/ml DOTAPCNE17: %4,3 Skualen, %0.5 SPAN 85, %0.5 Tween10n1M sitrat tamponu pH 6.5 300mMTrehaloz 80, 1.4 mg/ml DOTAPCNE17: %4,3 Skualen, %0.5 SPAN 85, %0.5 TweenlOmM sitrat tamponu pH 6.5 300mMSukroz 80, 1.4 mg/ml DOTAPCNE17: %4,3 Skualen, %0.5 SPAN 85, %0.5 TweenlOmM sitrat tamponu pH 6.5 300mM Sorbitol 80, 1.4 mg/ml DOTAP CNE17: %4,3 Skualen, %0.5 SPAN 85, %0.5 TweenIOmM sitrat tamponu pH 6.5 300mMDekstroz In vitro baglanma deneyi, sitrat tamponu konsantrasyonunun5 düsürülmesinin, RNA”nin daha siki baglanmasina neden oldugunugösterdi.Murin immünojeniklik çalismalarindan gelen sonuçlar, CNEl7”yeseker eklenmesinin,CNEl 7-formüleedilmis RNA”n1n10 immünojenikligini anlamli sekilde etkilemedigini gösterdi (Tablo 4,grup 9-12). Sorbitol ve dekstroz ilavesiyle IgG titerlerinde hafifartislar gözlendi.

Tablo 4 Grup 110. Açiklama 2Wp1 2Wp2 2Wp2/2Wp1 orani Emülsiyon N:P orani 1 lugVA317 - 77 1,710 22.2 2 RV01(15) - 3,441 59,557 17.3 3 CNE17DOTAP 10:1 1,474 6,512 4.4 4 CNE13DDA 1821 482 8,385 17.4 CMF37 DOTMA 1021 474 6,556 13.8 6 CNE16DOEPC 12:1 1,145 9,673 8.4 7 CMF42 DSTAP 1021 22 148 6.7 8 DDA Lipozoinlari 18:1 898 5,333 5.9 9 300mM Trehaloz ile birlikte CNE17 10:] 1,807 6,445 3.6 300mM Sukroz ile birlikte CNE17 1021 1,042 5,515 5.3 1 l 300mM Sorbitol ile birlikte CNE17 10:l 1,209 8,874 7.3 12 300mM Dekstroz ile birlikte CNE17 1021 1,247 7,956 6.4 1-8 arasi gruplarda grup basina 5 hayvan vardi ve 9-12 arasi gruplardagrup basina 10 hayvan vardi.Tablo 5, CNEl7-f0rm'ûle edilmis RNAlarin farkli tampon sistemleri kullanilarak hazirlandigi durumda murin immünojeniklikçalismalarinin sonuçlarini özetler. 112 Tablo 5 Grup 110. Açiklama 2Wpl 2Wp2 2Wp2/2Wp1 orani RNA Einülsiyon N:P orani lmg PBS - 100 2269 23 RSV- F* RV01 PBS - 8388 105949 13 (15) l ug 280 inM Sukroz ile birlikte CNE17 10:] 898 9384 10 RSV- F* 1 pg 280 mM sukroz, lOmM NaCl, lmM Sitrat 1011 1032 3184 3.1 RSV- ile birlikte CNE17 F** 280 mM sukroz, lOmM NaCl, lmM Sitrat, 10:] 79 895 113 %0.5 (a/h) Pluronic F 127 ile birlikte C NE17 *VA375 replikonu, ** VA317 replikonu. Replikonlar, HEPES tamponu içinde Ambion ile transkripte edildi, sonra (i) LiCl ile çökeltildi (ii) Tris tamponu içinde kapaklandi ve (iii) LiCl ile çökeltildi. Bütüngruplarda grup basina 8 hayvan vardi.

Farkli tampon kompozisyonlari da partikül büyüklügünü etkiledi.

SEKIL 2A,da gösterildigi gibi seker (sukroz) ilavesi, RNA/CNB kompleksinin partikül büyüklügünü azaltti; düsük NaCl konsantrasyonlarinin (lOmM) ilave edilmesi de RNA/CNB kompleksinin partikül büyüklügünü azaltti (SEKIL 2A). Sitrat tamponu, RNA/CNB kompleksinin partikül büyüklügünü etkilemedi (SEKIL 2B).Polimerlerin partikül büyüklügü üzerindeki etkileri, SEKIL 2C'de gösterilmistir. Ozellikle RNA tamponuna %05 pluronic F127 ilave edilmesi, RNA/CNB koinpleksinin partikül büyüklügünü, komplekslesme Öncesi büyüklüge (RNA°siz CNE partikülleri)düsürdü.Tercih edilen tampon sistemleri 280111M sukroz, 10mM NaCl ve lmM Sitrat; veya 280mM sukroz, 10mM NaCl, lmM Sitrat ve %0.5 (a/h) Pluronic F127 içinde CNE l7”nin toplam antikor titerleri ve nötralizeedici antikor titerleri, Tablo 5”te gösterilmistir (grup 4 ve 5).ÖRNEK 4; N/P ORANININ IMMUNOJENIKLIK ÜZERINDEKI ETKILERIBu örnekte bir RSV F antijenini sifreleyen RNA replikonu VA375, :1'1ik N/P'de CNE17 ile ve 12;l, 1021, 821, 6:1 ve 4:1”1ik teorik N/P”de CMF32 veya CMF34 ile komplekslesen lipozom (RVOl) seklinde formüle edildi. Teorik N/P oranlari, formülasyonlari hazirlamak için kullanilan DOTAP ve RNA°nin baslangiç miktarlarina göre hesaplanan N/P oranlarini yansitir. Gerçek N/P oranlari, teorik N/P oranlarindan biraz daha düsüktü çünkü emülsiyonlarin preparasyonu sirasinda az miktarda DOTAP kaybi oldu. GMT verileri, her bir grupta ayri ayri farelerin (grup basina 8 fare) ortalama loglo titerini yansitir. Bütün formülasyonlar, irmnünizasyon `Öncesinde sukroz ile 30 mOsm/kg”ye ayarlandi.

CMF32 yada CMF34 formülasyonlari ile açik bir tolere edebilirliksorunu gözlenmedi (örn., Vücut agirligi, erken serum sitokinleri).Gerçek N/P oranlari, CNE veya CMF kümeleri içindeki DOTAP içeriginin, sarjli bir aerosol detekt'orü (Corona Ultra, Chelmsford,MA) olan HPLC kullanilarak nicelenmesi suretiyle belirlendi. CNE ve 114CMF örnekleri, izopropanol içinde seyreltildi ve bir XTera C18 4.6 X 150mm 3.5um kolonuna (Waters, Milford, MA) enjekte edildi. Egri altindaki alan, kromatogramda DOTAP pikinden alindi vekonsantrasyon, bir DOTAP standart egrisinden ara degerlendi. Gerçek

Claims (13)

ISTEMLER

1. 25°C7de sivi fazda olan bir yag göbegi ve bir katyonik lipit içeren emi'ilsiyon partikülleri ve eniülsiyon partiküllerine komplekslesen bir nükleik asit inolekülü ihtiva eden immünojenik katyonik bir su içinde yag emülsiyonu; buradaki katyonik lipit, DOTAP, DOTMA, DOEPC, DSTAP, DODAC veya DODAP°dir ve su içinde yag emülsiyonu içerisindeki katyonik lipidin konsantrasyonu, 1.6 mg/ml ila 25 mg/ml arasindadir; buradaki nükleik asit molekül'u, bir antijeni sifreleyen kendiliginden replike olan bir RNA°d1r ve buradaki emülsiyon partiküllerinin ortalama çapi, 80 nm ila 180 nm arasindadir ve emülsiyonun N/P”si, en az 4:1”dir; buradaki N/P, katyonik lipit içindeki protonlanabilir nitrojen atomlarinin mol cinsinden miktari bölü RNA molekülü içerisindeki fosfatin inol cinsinden miktaridir; ancak nükleik asit molekülü, sekrete edilen alkalin fosfatazi sifrelememeli ve ayrica nükleik asit inolek'i'ilü, sekansi SEKKIMNO.: 1 ”de gösterilen plazmid A317°nin sifreledigi bir RNA olmamalidir.

2. Istem 1”e ait iminünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu; buradaki immünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu tamponlanir ve pH”si yaklasik 6.0 ila yaklasik 8.0 arasindadir, örnegin buradaki tampon, bir sitrat tamponu, bir sukinat tamponu, bir asetat tainponu veya bunlarin bir kombinasyonudur.

3. Istem 1 veya 2”ye ait immünojenik katyonik su içinde yag em'ûlsiyonu; buradaki eini'ilsiyon ayrica bir inorganik tuz da içerir, istege göre buradaki inorganik tuz konsantrasyonu, 30 mM”den fazla degildir.

4. Onceki isteinlerden herhangi birine ait immünojenik katyonik su içinde yag em'ulsiyonu; buradaki em'ulsiyon ayrica iyonik olmayan bir tonikleme ajani da içerir, 'Örnegin buradaki iyonik olmayan tonikleme ajani, bir seker, sekerli alkol veya bunlarin bir kombinasyonu, örnegin sukroz, trehaloz, sorbitol, dekstroz veya bunlarin bir kombinasyonudur.

5. Onceki istemlerden herhangi birine ait inimünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu; buradaki emülsiyon ayrica sulu fazda bir polimer içerir, örnegin buradaki polimer, bir poloksamerdir, istege göre buradaki emülsiyon, yaklasik %005 ila yaklasik %20 (a/h) polimer içerir.

6. Önceki istemlerin herhangi birine ait immünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu; burada: (i) em'ulsiyon partiküllerinin ortalama çapi, 80 nm ila 130 nm arasindadir; ve/Veya (ii) emülsiyonun N/P orani, 4:] ila 20:] arasindadir, Örnegin burada emülsiyonun N/P orani, 4:] ila 15:1 arasindadir; ve/Veya (iii) emülsiyon, izotoniktir.

7. Önceki istemlerin herhangi birine ait immünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu; buradaki yag göbegi, sunlarin olusturdugu gruptan seçilen bir yag içerir: Hint yagi, hindistan cevizi yagi, Misir yagi, Pamuk tohumu yagi, Çuha çiçegi yagi, Balik yagi, Jojoba yagi, domuz yagi, Bezir yagi, Zeyinyagi, Yerfistigi yagi, Aspir yagi, Susam yagi, Soya yagi, Skualen, Skualan, Ayçiçegi yagi, Bugday tohumu yagi ve bunlarin kombinasyonlari.

8. Önceki istemlerin herhangi birine ait iinmünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu; buradaki katyonik lipit, bir dördüncü] amin içerir, örnegin buradaki katyonik lipit, DOTAP”tir.

9. Önceki istemlerin herhangi birine ait immünojenik katyonik su içinde yag em'ûlsiyonu; buradaki partikül ayrica bir surfektan, örn., iyonik olmayan bir surfektan da içerir, `Örnegin buradaki surfektan, sorbitaii trioleat (SPAN85), polisorbat 80 (Tween 80) veya bunlarin bir kombinasyonudur.

10. Onceki istemlerin herhangi birine ait immünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu; buradaki emülsiyon ayrica bir antioksidan da

11. Önceki isteinlerin herhangi birinde tanimlandigi gibi bir immünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu yapmaya yönelik Olup, (i) bir yag göbegi ve bir katyonik lipit içeren emülsiyon partikülleri ihtiva eden bir katyonik su içinde yag emülsiyonu ve (ii) bir nükleik asit içeren bir sulu çözelti saglanmasini ve (i) ve (ii)'nin birlestirilmesiyle adi geçen immünojenik katyonik su içinde yag emi'ilsiyonunun yapilinasini kapsayan bir yöntem.

12. 1-10 istemlerinin herhangi birinde tanimlandigi gibi ilaç içerisinde kullaniin amaçli iinini'inojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu.

13. 1-10 istemlerinin herhangi birinde tanimlandigi gibi, bir süjede bir immün tepkisi üretmeye yönelik olup süjeye, etkin miktarda adi geçen immünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonunun uygulanmasini kapsayan bir yöntemde kullanim amaçli immünojenik katyonik su içinde yag emülsiyonu.