ES2260923T3 - Micorparticulas con superficies adsorbentes, procedimientos de fabricacion y uso de las mismas. - Google Patents
Micorparticulas con superficies adsorbentes, procedimientos de fabricacion y uso de las mismas.Info
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Abstract
Un procedimiento para la producción de una micropartícula con superficie adsorbente a la que se ha adsorbido una macromolécula biológicamente activa, dicho procedimiento comprendiendo las etapas de: (a) emulsionar una mezcla de una solución de polímero y un detergente iónico para formar una emulsión, en la que la solución de polímero comprende un polímero seleccionado del grupo constituido por un poli(hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido y un policianoacrilato, en la que el polímero está presente en una concentración de aproximadamente 1% a aproximadamente 30% en un solvente orgánico, y en la que el detergente está presente en la mezcla en una relación peso en peso de detergente a polímero de 0, 00001:1 a 0, 1:1; (b) eliminar el solvente orgánico de la emulsión, para formar dicha micropartícula con superficie adsorbente; y (c) adsorber la macromolécula en la superficie de la micropartícula.
Description
Micropartículas con superficies adsorbentes,
procedimientos de fabricación y uso de las mismas.
La presente invención se refiere en general a
composiciones farmacéuticas. En particular, la invención se refiere
a micropartículas con superficies adsorbentes, procedimientos para
preparar tales micropartículas y los usos de las mismas. Además, la
invención se refiere a composiciones que comprenden micropartículas
biodegradables en cuya superficie están adsorbidos agentes
biológicamente activos, tales como polinucleótidos, polipéptidos,
antígenos y adyuvantes terapéuticos.
Para obtener compuestos terapéuticos de
administración parenteral controlada se han usado vehículos
particulados. Tales vehículos están diseñados para mantener el
agente activo en el sistema de administración durante un período de
tiempo extenso. Los ejemplos de vehículos particulados incluyen
aquellos derivados de polímeros de polimetilmetacrilato, así como
micropartículas derivadas de poli(láctidos) (ver, por
ejemplo., La Patente de EEUU Nº 3.773.919),
poli(láctido-co-glicólidos),
conocidos como PLG (ver, por ejemplo., La Patente de EEUU Nº
4.767.628) y polietilenglicol, conocidos como PEG (ver, por
ejemplo., La Patente de EEUU Nº 5.648.095). Los polímeros de
polimetilmetacrilato no son degradables mientras que las partículas
de PLG se biodegradan por medio de hidrólisis no enzimática
aleatoria de los enlaces éster para dar ácidos láctico y glicólico
que se excretan a lo largo de las vías metabólicas normales.
Por ejemplo la Patente de EEUU Nº 5.648.095
describe el uso de microesferas con compuestos farmacéuticos
encapsulados como sistemas de administración de fármacos para
administración nasal, oral y pulmonar. También se describieron
formulaciones de liberación lenta conteniendo factores de
crecimiento polipeptídicos varios. Ver, por ejemplo., la Publicación
Internacional Nº WO 94/12158, la Patente de EEUU Nº 5.134.122 y la
Publicación Internacional Nº WO 96/37216.
En Journal of Controlled Release
53:137-143 (1998), Fattal y col., describen
nanopartículas preparas a partir de polialquilcianoacrilatos (PACA)
que tienen oligonucleótidos adsorbidos.
También se usaron vehículos particulados con
antígenos adsorbidos o atrapados en el intento de obtener respuestas
inmunes adecuadas. Tales vehículos presentan múltiples copias de un
antígeno seleccionado para el sistema inmunológico y promueven el
atrapamiento y retención de antígenos en los ganglios linfáticos
locales. Las partículas pueden ser fagocitadas por macrófagos y
pueden mejorar la presentación antigénica a través de la liberación
de citoquinas. Por ejemplo, la Solicitud en tramitación Nº
09/015.652 del solicitante, presentada el 29 de Enero de 1998,
describe el uso de micropartículas con antígenos adsorbidos y
antígenos encapsulados para estimular las respuestas inmunológicas
mediadas por células, así como los procedimientos para fabricar las
micropartículas.
En la Solicitud de Patente provisional Nº
60/036.316 del solicitante, por ejemplo se describe un procedimiento
para formar micropartículas que comprende la combinación de un
polímero con un solvente orgánico, con el agregado posterior de un
estabilizador de emulsión, tal como alcohol polivinílico (PVA), la
posterior evaporación del solvente orgánico y por ello la formación
de micropartículas. La superficie de las micropartículas comprende
el polímero y el estabilizador. Posteriormente pueden adsorberse a
aquellas superficies macromoléculas tales como ADN, polipéptidos y
antígenos.
Se ha demostrado también que pueden usarse
emulsiones catiónicas basadas en lípidos como vehículos de genes.
Ver, por ejemplo., Yi y col., Cationic Lipid Emulsión; a Novel
Non-Viral, y Non-Liposomal Gene
Delivery System, Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.,
24:653-654 (1997); Kim y col., In vivo Gene
Transfer Using Cationic Lipid Emulsión-Mediated Gene
Delivery System by Intra Nasal Administration, Proc. Int'l. Symp.
Control. Rel. Bioact. Mater., 25:344-345 (1998); Kim
y col., In vitro and In vivo Gene Delivery Using
Cationic Lipid Emulsión, Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact.
Mater., 26, #5438 (1999).
Mientras que las micropartículas de PLG con
antígenos adsorbidos ofrecen ventajas significativas sobre los
sistemas más tóxicos, la adsorción de agentes biológicamente activos
a la superficie de las micropartículas puede ser problemática. Por
ejemplo, a menudo es difícil o imposible adsorber a la superficie de
las micropartículas agentes biológicamente activos cargados o
voluminosos, tales como polinucleótidos, grandes polipéptidos y
similares. Por ello, existe una necesidad continua de sistemas de
administración flexibles para tales agentes y, particularmente para
fármacos altamente sensibles y difíciles de formular.
El documento WO 97/02810 describe partículas
laminares de un polímero biodegradable que son al menos en parte
cristalinas, en cuya superficie pueden adsorberse agentes
bioactivos.
El documento WO 96/20698 describe nanopartículas
para liberación sostenida de agentes bioactivos. Las nanopartículas
están formadas de una mezcla de polímero y agente bioactivo en un
solvente orgánico y los agentes bioactivos están incorporados,
incluidos, alojados o de lo contrario forman parte de la matriz
polimérica.
El documento WO 98/33487 describe procedimientos
para la adsorción de antígenos a micropartículas preparadas
previamente, que incluyen el uso de detergentes. Los detergentes se
eliminan tras la adsorción del antígeno a la micropartícula para
producir la composición de micropartículas final. Se usan
detergentes dializables para facilitar su eliminación.
Los autores del presente documento inventaron un
procedimiento para formar micropartículas con superficies
adsorbentes capaces de adsorber una amplia variedad de
macromoléculas. Las micropartículas comprenden un polímero y un
detergente. Las micropartículas de la presente invención adsorben
tales macromoléculas más eficazmente que otras micropartículas
actualmente disponibles.
Las micropartículas derivan de un polímero, tal
como un poli(\alphahidroxiácido), un ácido
polihidroxibutírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un
polianhídrido, un PACA, un policianoacrilato y similares, y están
formados con detergentes, tales como catiónicos, aniónicos o
detergentes no iónicos, los que pueden usarse en combinación.
Además, los inventores descubrieron que estas micropartículas tienen
un mejor rendimiento en la adsorción de antígenos virales y proveen
respuestas inmunes superiores, comparadas con las micropartículas
formadas por un procedimiento usando únicamente PVA. Mientras que
las micropartículas fabricadas usando sólo PVA pueden adsorber
algunas macromoléculas, las partículas de la presente invención
usando otros detergentes solos, en combinación o en combinación con
PVA, adsorben una amplia variedad de macromoléculas. De acuerdo con
esto, la invención está dirigida de manera primaria a tales
micropartículas, así como a los procedimientos para producirlas.
En una forma de realización, la invención está
dirigida a una micropartícula que tiene una superficie adsorbente y
que comprende:
un polímero biodegradable;
un detergente iónico; y
una primera molécula biológicamente activa
adsorbida en la superficie de la misma,
en la que la primera macromolécula
biológicamente activa es al menos un miembro seleccionado del grupo
constituido por un polipéptido, un polinucleótido, un
polinucleósido, un antígeno, un compuesto farmacéutico, una hormona,
una enzima, un mediador de transcripción o traducción, un
intermediario en una vía metabólica, un inmunomodulador y un
adyuvante.
En otra forma de realización, la invención está
dirigida a una composición de micropartículas que comprende una
micropartícula de la invención y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
En otra forma de realización, la invención está
dirigida a un procedimiento para producir una micropartícula que
tiene una superficie adsorbente a la que se han adsorbido
macromoléculas biológicamente activas, dicho procedimiento comprende
las etapas de:
(a) emulsionar una mezcla de una solución de
polímero y un detergente iónico para formar una emulsión, en la que
la solución de polímero comprende un polímero seleccionado del grupo
constituido por un poli(\alphahidroxiácido), un ácido
polihidroxibutírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un
polianhídrido y un policianoacrilato, en la que el polímero está
presente en una concentración de 1% a 30% en un solvente orgánico, y
en la que el detergente está presente en la mezcla en una relación
peso en peso de detergente a polímero de 0,00001:1 a 0,1:1;
(b) eliminar el solvente orgánico de la
emulsión, para formar dicha micropartícula con superficie
adsorbente; y
(c) adsorber la macromolécula en la superficie
de la micropartícula.
En otra forma de realización, la invención está
dirigida a un procedimiento para producir una composición de
micropartículas que comprende una micropartícula que tiene una
superficie adsorbente a la que se han absorbido macromoléculas
biológicamente activas, dicho procedimiento comprende las etapas (a)
a (c) definidas anteriormente y además comprende la etapa (d) de
combinar la micropartícula con la macromolécula adsorbida de la
etapa (c) con un excipiente farmacéuticamente aceptable para formar
dicha composición de micropartículas.
En otra forma de realización, la invención está
dirigida a una micropartícula producida mediante los procedimientos
descritos anteriormente.
La invención permite un procedimiento para
producir una composición de micropartículas adsorbentes que
comprende combinar una micropartícula adsorbente que tiene una
macromolécula adsorbida en la superficie de la misma y un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
La invención también permite un procedimiento
para administrar una macromolécula a un sujeto vertebrado que
comprende la administración a dicho sujeto de la composición
anterior.
La invención también permite un procedimiento
para obtener una respuesta inmune celular en un sujeto vertebrado
que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad
terapéuticamente eficaz de una macromolécula seleccionada adsorbida
a una micropartícula de la invención.
La invención también permite un procedimiento de
inmunización que comprende administrar a un sujeto vertebrado una
cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de
micropartículas descrita anteriormente. La composición puede
contener de manera opcional macromoléculas no unidas y adyuvantes,
incluyendo sales de aluminio tal como fosfato de aluminio.
En una forma de realización de preferencia, las
micropartículas están formadas a partir de un
poli(\alphahidroxiácido); de más preferencia, un
poli(D,L-láctido-co-glicólido);
y de mayor preferencia un
poli(D,L-láctido-co-glicólido).
En una forma de realización de preferencia, las
micropartículas son para uso en el diagnóstico de una
enfermedad.
En una forma de realización de preferencia, las
micropartículas son para uso en el tratamiento de una
enfermedad.
En una forma de realización de preferencia, las
micropartículas son para uso en una vacuna.
En una forma de realización de preferencia, las
micropartículas son para uso en el aumento de una respuesta
inmune.
Cada una de las micropartículas adsorbentes
descritas previamente de manera no exhaustiva pueden opcionalmente,
también tener macromoléculas atrapadas dentro de ellas.
Éstas y otras formas de realización de la
presente invención podrán ser realizadas fácilmente por aquellos
expertos en la técnica en vista de la descripción del presente
documento.
La práctica de la presente invención usará, a
menos que se indique de otra manera, procedimientos convencionales
de química, química de polímeros, bioquímica, biología molecular,
inmunología y farmacología, dentro de la técnica.
Tales técnicas se explican en su totalidad en la
bibliografía. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences,
18th Edition (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990); Methods
In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press,
Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vols.
I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986,
Blackwell Scientific Publications); Sambrook, y col., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Handbook of
Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K. S., ed, CRC Press, 1997)
y Seymour/Carraher's Polymer Chemistry (4th edition, Marcel Dekker
Inc., 1996).
Como se usan esta memoria y en las formas
singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen
las referencias en plural a menos que el contenido lo indique
claramente de otra manera. Así, por ejemplo, el término "una"
micropartícula se refiere a una o más micropartículas y similar.
En la descripción de la presente invención se
usarán los siguientes términos, los que intentan definirse como se
indica a continuación.
El término "micropartículas" como se usa en
este documento, se refiere a una partícula de 100 nm a 150 \mum de
diámetro, de más preferencia de 200 nm a 30 \mum de diámetro y de
mayor preferencia de 500 nm a 10 \mum de diámetro. De preferencia,
la micropartícula tendrá un diámetro que permita la administración
mucosa o parenteral sin ocluir agujas y capilares. El tamaño de las
micropartículas se determina fácilmente mediante procedimientos bien
conocidos en la técnica, tal como espectroscopia de correlación
fotónica, difractometría láser y/o microscopía electrónica de
barrido.
Las micropartículas para uso en este documento
estarán formadas a partir de materiales esterilizables, no tóxicos y
biodegradables. Tales materiales incluyen, pero no se limitan a
poli(\alphahidroxiácido), ácido polihidroxibutírico,
policaprolactona, poliortoéster, polianhídrido, PACA y
policianoacrilato. De preferencia, las micropartículas para uso en
la presente invención derivan de un
poli(\alphahidroxiácido), en particular de un
poli(láctido) ("PLA") o un copolímero de
D,L-láctido y glicólido o ácido glicólico, tal como
un
poli(D,L-láctido-co-glicólido)
("PLG" o "PLGA") o un copolímero de
D,L-láctido y caprolactona. Las micropartículas
pueden derivar de cualquiera de varios materiales de inicio
poliméricos que tienen una variedad de pesos moleculares y, en el
caso de copolímeros tal como PLG, una variedad de relaciones
láctido:glicólido, cuya selección será un motivo importante de
elección, dependiendo en parte de la macromolécula administrada
conjuntamente. Estos parámetros se discuten con más detalle a
continuación.
El término "detergente" como se usa en este
documento incluye tensioactivos y estabilizantes de emulsión. Los
detergentes aniónicos incluyen, pero no se limitan a, SDS, SLS,
alcoholes grasos sulfatados y similares. Los detergentes catiónicos,
pero no se limitan a, cetrimida (CTAB), cloruro de benzalconio, DDA
(bromuro de dimetil dioctodecil amonio), DOTAP y similares. Los
detergentes noiónicos incluyen, pero no se limitan a, ésteres de
sorbitan, polisorbatos, monoéteres de glicol polioxietilados, alquil
fenoles polioxietilados, poloxámeros y similares.
El término "carga positiva de red" como se
usa en este documento, significa que la carga en la superficie de la
micropartícula es más positiva que la carga en la superficie de una
micropartícula correspondiente hecha usando PVA. Asimismo, el
término "carga negativa de red" como se usa en este documento,
significa que la carga en la superficie de la micropartícula es más
negativa que la carga en la superficie de una micropartícula
correspondiente hecha usando PVA. La carga de red puede evaluarse
comparando el potencial zeta (también conocido como potencial
electrocinético) de la micropartícula fabricada usando un detergente
catiónico o aniónico con una micropartícula correspondiente
fabricada usando PVA. Así, una superficie de micropartícula que
tiene un "carga positiva de red" tendrá un potencial zeta mayor
que el potencial zeta de la superficie de una micropartícula
fabricada usando PVA y micropartícula que tiene un "carga negativa
de red" tendrá un potencial zeta menor que el potencial zeta de
la superficie de una micropartícula fabricada usando PVA. Como
resulta evidente, las cargas de red para las micropartículas de la
invención se calculan en relación al potencial zeta de una
micropartícula de PVA correspondiente.
El término "potencial zeta" como se usa en
este documento, se refiere al potencial eléctrico que existe a
través de la interfase de todos los sólidos y líquidos, es decir, el
potencial a través de la capa difusa de iones que rodean una
partícula coloidal cargada. El potencial zeta puede calcularse a
partir de movilidades electroforéticas, es decir, las velocidades a
las que las partículas coloidales se desplazan entre electrodos
cargados colocados en contacto con la sustancia que se quiere medir,
usando procedimientos bien conocidos en la técnica.
El término "macromolécula" como se usa en
este documento, se refiere, pero no se limita a, un compuesto
farmacéutico, un polinucleótido, un polipéptido, una hormona, una
enzima, un mediador de transcripción o traducción, un intermediario
en una vía metabólica, un inmunomodulador, un antígeno, un adyuvante
o combinaciones de los mismos. Las macromoléculas particulares para
uso con la presente invención se describen con mayor detalle a
continuación.
El término "producto farmacéutico" se
refiere a compuestos biológicamente activos tales como antibióticos,
agentes antivirales, factores de crecimiento, hormonas y similares,
que se discutirán en mayor detalle a continuación.
Un "polinucléotido" es una molécula de
ácido nucleico que codifica una proteína o polipéptido
biológicamente activo (por ejemplo, inmunogénico o terapéutico).
Dependiendo de la naturaleza del polipéptido codificado por el
polinucleótido, un polinucleótido puede incluir tan poco como 10
nucleótidos, por ejemplo, cuando el polinucleótido codifica un
antígeno. Además, un "polinucleótido" puede incluir secuencias
de cadena doble o de cadena simple y se refieren, pero no se limitan
a, secuencias de ADNc viral, ARNm procariótico o eucariótico,
secuencias de ARN y ADN genómico de ADN viral (por ejemplo, virus y
retrovirus de ARN y ADN) o ADN procariótico y especialmente
secuencias de ADN sintético. El término también abarca secuencias
que incluyen cualquiera de los análogos de bases de ADN y ARN
conocidos, e incluye modificaciones de la secuencia nativa, tales
como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente
conservativas en la naturaleza), mientras que la molécula de ácido
nucleico codifique una proteína terapéutica o antigénica. Estas
modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis
dirigida, o pueden ser accidentales, tales como a través de
mutaciones de huéspedes que producen los antígenos.
Los términos "polipéptido" y
"proteína" se refieren a un polímero de residuos aminoácidos y
no están limitados a una longitud mínima del producto. Así, están
incluidos dentro de la definición, péptidos, oligopéptidos, dímeros,
multímeros y similares. La definición abarca tanto a las proteínas
completas como a los fragmentos de las mismas. Los términos también
incluyen modificaciones, tales como deleciones, adiciones y
sustituciones (generalmente conservativas en la naturaleza), de la
secuencia nativa, mientras la proteína mantenga la capacidad de
obtener una respuesta inmunológica o tenga un efecto terapéutico en
un sujeto al que se le administra dicha proteína.
Se entiende por "antígeno" a una molécula
que contiene uno o más epitopes capaces de estimular el sistema
inmune para provocar una respuesta inmune celular específica de
antígeno cuando el antígeno es presentado de acuerdo con la presente
invención, o una respuesta humoral de anticuerpos. Un antígeno puede
ser capaz de obtener una respuesta celular o humoral por sí mismo o
cuando se presenta en combinación con otra molécula. Normalmente, un
epitope incluirá aproximadamente entre 3-15,
generalmente aproximadamente entre 5-15 aminoácidos.
Los epitopes de una proteína dada pueden identificarse usando una
cantidad de técnicas de mapeo de epitopes, bien conocidas en la
técnica. Ver, por ej., Epitope Mapping Protocols in Methods in
Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana
Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, los epitopes lineales pueden
determinarse mediante por ejemplo la síntesis de gran número de
péptidos concurrentemente en soportes sólidos, los péptidos
correspondientes con las porciones de la molécula de proteína, y
haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los
péptidos están unidos a los soportes. Tales procedimientos son
conocidos en la técnica y están descritos en, por ej., la Patente de
EEUU Nº 4.708.871; Geysen y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:3998-4002; Geysen y col. (1986) Molec. Immunol.
23:709-715. De manera similar, los epitopes
conformacionales se identifican fácilmente determinando la
conformación espacial de aminoácidos mediante, por ejemplo,
cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear en 2
dimensiones. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols,
supra.
El término "antígeno" como se usa en este
documento define tanto a los antígenos discretos y que están
separados de un organismo completo con el que están asociados en la
naturaleza, como también a bacterias, virus, parásitos y otros
microbios muertos, atenuados o inactivados. Los anticuerpos tales
como los anticuerpos anti-idiotipo o fragmentos de
los mismos, y mimotopes peptídicos sintéticos, que pueden imitar un
antígeno o determinante antigénico, son abarcados también bajo la
definición de antígeno como se usa en este documento. De manera
similar, también está incluido dentro de la definición de antígeno
como se usa en este documento un oligonucleótido o polinucleótido
que expresa una proteína terapéutica o inmunogénica, o un
determinante antigénico in vivo, tal como los usados en
aplicaciones de terapia génica e inmunización con ácidos
nucleicos.
Además, para los objetivos de la presente
invención, los antígenos pueden derivar de cualquiera de varios
virus, bacterias, parásitos y hongos conocidos, así como de
cualquiera de varios antígenos tumorales. Además, para los objetivos
de la presente invención, un "antígeno" se refiere a una
proteína que incluye modificaciones, tales como deleciones,
adiciones y sustituciones (generalmente conservativas en la
naturaleza), de la secuencia nativa, mientras que la proteína
mantenga la capacidad de obtener una respuesta inmunológica. Estas
modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis
dirigida, o pueden ser accidentales, tales como a través de
mutaciones de huéspedes que producen los antígenos.
Una "respuesta inmunológica" a un antígeno
o composición es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmune
humoral y/o celular a moléculas presentes en la composición de
interés. Para los objetivos de la presente invención, una
"respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune
mediada por moléculas de anticuerpos, mientras que una "respuesta
inmune celular" es una mediada por linfocitos T y/u otros
leucocitos sanguíneos. Un aspecto importante de la inmunidad celular
incluye una respuesta específica de antígeno mediante células T
citolíticas ("CTLs"). Las CTLs tienen especificidad para
antígenos peptídicos que se presentan asociados con proteínas
codificadas por el complejo mayor de histocompatibilidad (MCH) y que
se expresan en las superficies celulares. Las CTLs ayudan a inducir
y promover la destrucción intracelular de microbios intracelulares,
o la lisis de células infectadas con tales microbios. Otro aspecto
de la inmunidad celular incluye una respuesta específica de antígeno
mediante células T ayudantes. Las células T ayudantes actúan para
ayudar a estimular la función, y se centran en la actividad de,
células efectoras no específicas contra células que muestran
antígenos peptídicos asociados con moléculas del MHC en superficie.
Una "respuesta inmune celular" también se refiere a la
producción de citoquinas, quimioquinas y otras tales como moléculas
producidas por células T activadas y/u otros leucocitos sanguíneos,
incluyendo aquellos derivados de células T CD4+ y CD8+.
Una composición, tal como una composición
inmunogénica o vacuna que obtiene una respuesta inmune puede servir
para sensibilizar un sujeto vertebrado mediante la presentación del
antígeno asociado con moléculas del MCH en la superficie celular. La
respuesta inmune mediada por células está dirigida a, o cerca de,
células que presentan el antígeno en su superficie. Además, los
linfocitos T específicos de antígeno pueden generarse para permitir
una protección futura de un huésped inmunizado.
La capacidad de un antígeno o composición
particular para estimular una respuesta inmunológica mediada por
células puede determinarse por una cantidad de ensayos, tales como
ensayos de linfoproliferación (activación de linfocitos), ensayos de
células citotóxicas CTL, o realizando ensayos para linfocitos T
específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado. Tales
ensayos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Erickson
y col., J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe y
col., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376; y los
ejemplos a continuación.
Así, una respuesta inmunológica como se usa en
este documento puede ser una que estimula la producción de CTLs, y/o
la producción o activación de células T ayudantes. El antígeno de
interés puede también obtener una respuesta inmune mediada por
anticuerpos. Por lo tanto, una respuesta inmunológica puede incluir
uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos
por parte de células B; y/o la activación de células T supresoras
y/o células T \gamma\delta dirigidas específicamente a un
antígeno o antígenos presentes en la composición o vacuna de
interés. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la
infectividad, y/o mediar la citotoxicidad celular (ADCC)
anticuerpo-complemento o dependiente de anticuerpo
para proveer protección a un huésped inmunizado. Tales respuestas
pueden determinarse usando inmunoensayos estándar y ensayos de
neutralización, bien conocidos en la técnica.
Una composición que contiene un antígeno
seleccionado adsorbido a una micropartícula, muestra
"inmunogenicidad aumentada" cuando posee una capacidad mayor
para obtener una respuesta inmune que la respuesta inmune obtenida
por una cantidad equivalente cuando se administra sin asociación con
la micropartícula. Así, una composición puede mostrar
"inmunogenicidad aumentada" por que el antígeno es más
fuertemente antigénico en virtud de la adsorción a la
micropartícula, o por que es necesaria una cantidad menor de
antígeno para alcanzar una respuesta inmune en el sujeto al que se
lo administra. Tal inmunogenicidad aumentada puede determinarse
administrando la composición micropartícula/antígeno, y controles de
antígeno a animales y comparando los títulos de anticuerpos contra
los dos usando ensayos estándar tales como radioinmunoensayo y
ELISAs, bien conocidos en la técnica.
Los términos "cantidad eficaz" o
"cantidad farmacéuticamente eficaz" de una
macromolécula/micropartícula, como se proveen en este documento, se
refieren a una cantidad no tóxica pero suficiente de la
macromolécula/micropar-
tícula para proveer la respuesta deseada, tal como una respuesta inmunológica, y el efecto terapéutico correspondiente, o en el caso de la administración de una proteína terapéutica, una cantidad suficiente para tratar eficazmente al sujeto, como se definió anteriormente. Como se indicará a continuación, la cantidad exacta necesaria variará de sujeto a sujeto, dependiendo de las especies, edad y condición general del sujeto, la severidad de la afección a tratar y la macromolécula particular de interés, modo de administración y similar. Una cantidad "eficaz" adecuada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto en la técnica usando experimentación de rutina.
tícula para proveer la respuesta deseada, tal como una respuesta inmunológica, y el efecto terapéutico correspondiente, o en el caso de la administración de una proteína terapéutica, una cantidad suficiente para tratar eficazmente al sujeto, como se definió anteriormente. Como se indicará a continuación, la cantidad exacta necesaria variará de sujeto a sujeto, dependiendo de las especies, edad y condición general del sujeto, la severidad de la afección a tratar y la macromolécula particular de interés, modo de administración y similar. Una cantidad "eficaz" adecuada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto en la técnica usando experimentación de rutina.
Por "sujeto vertebrado" se entiende
cualquier miembro del subfilum cordata, incluyendo, pero no
limitando a, mamíferos tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos,
cabras, caballos y seres humanos; animales domésticos tales como
perros y gatos; y aves, incluyendo aves de caza domésticas y
salvajes y gallinas incluyendo pollo, pavos y otras aves
gallináceas. El término no denota una edad en particular. Por lo
tanto, es la intención abarcar tanto a animales adultos como a
recién nacidos.
Por "farmacéuticamente aceptable" o
"farmacológicamente aceptable" se entiende un material que no
es indeseable biológicamente, es decir, el material puede
administrarse a un individuo con la formulación con micropartículas
sin causar ningún efecto biológico indeseable o interacción de
alguna manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la
composición en la que está contenida.
Por "pH fisiológico" o un "pH en el
intervalo fisiológico" se entiende un pH en el intervalo de 7,2 a
8,0 inclusive, más típicamente en el intervalo de 7,2 a 7,6
inclusive.
Como se usa en este documento,
"tratamiento" se refiere a cualquiera de (i) la prevención de
infección o reinfección, como en una vacuna tradicional, (ii) la
reducción o eliminación de síntomas, y (iii) la eliminación completa
o sustancial del patógeno o trastorno en cuestión. El tratamiento
puede efectuarse de manera profiláctica (previo a la infección) o
terapéutica (tras la infección).
La presente invención está basada en el
descubrimiento de que las micropartículas de PLA y PLG de la
presente invención adsorben eficazmente macromoléculas
biológicamente activas. Además, estas micropartículas adsorben una
mayor variedad de moléculas, incluyendo macromoléculas cargadas y/o
voluminosas, más fácilmente que las micropartículas preparadas con
PVA. Por ello la macromolécula/micropartícula de la presente
invención puede usarse como un sistema de administración para
administrar componentes biológicamente activos con el objetivo de
tratar, prevenir y/o diagnosticar una amplia variedad de
enfermedades.
La presente invención puede usarse para
administrar una amplia variedad de macromoléculas incluyendo, pero
no limitando a, compuestos farmacéuticos tales como antibióticos y
agentes antivirales, fármacos antiinflamatorios no esteroides,
analgésicos, vasodilatadores, fármacos cardiovasculares,
psicotrópicos, neurolépticos, antidepresivos, fármacos
antiparkinsonianos, bloqueantes beta, bloqueantes de canales de
calcio, inhibidores de bradiquinina, inhibidores de ACE,
vasodilatadores, inhibidores de prolactina, esteroides, antagonistas
de hormonas, antihistamínicos, antagonistas de serotonina, heparina,
agentes quimioterapéuticos, factores de crecimiento y
antineoplásicos, incluyendo pero no limitando a PDGF, EGF, KGF,
IGF-1 y IGF-2, FGF, polinucleótidos
que codifican proteínas terapéuticas o inmunogénicas, proteínas
inmunogénicas y epitopes de las mismas para uso en vacunas, hormonas
incluyendo hormonas peptídicas tales como insulina, proinsulina,
hormona del crecimiento, GHRH, LHRH, EGF, somatostatina,
SNX-111, BNP, insulinotropina, ANP, FSH, LH, PSH y
hCG, hormonas esteroides gonadales (andrógenos, estrógenos y
progesterona), hormona estimulante de tiroides, inhibina,
colecistoquinina, ACTH, CRF, dinorfinas, endorfinas, endotelina,
fragmentos de fibronectina, galanina, gastrina, glucagon, fragmentos
de proteína ligadora de GTP, guanilina, leucoquininas, magainina,
mastoparanos, dermaseptina, sistemina, neuromedinas, neurotensinas,
pancreastatina, polipéptido pancreático, sustancia P, secretina,
timosina, y similares, enzimas, mediadores de transcripción o
traducción, intermediarios de vías metabólicas, inmunomoduladores,
tales como cualquiera de las varias citoquinas incluyendo
interleuquina 1, interleuquina 2, interleuquina 3, interleuquina 4,
e interferón gamma, antígenos y adyuvantes.
En una forma de realización de preferencia la
macromolécula es un antígeno. Una ventaja particular de la presente
invención es la capacidad de las micropartículas con antígenos
adsorbidos para generar respuestas inmunes mediadas por células en
un sujeto vertebrado. La capacidad de las micropartículas/antígeno
de la presente invención para obtener una respuesta inmune mediada
por células contra un antígeno seleccionado provee una poderosa
herramienta contra la infección por una amplia variedad de
patógenos. De acuerdo con esto, las micropartículas/antígeno de la
presente invención pueden incorporarse a composiciones de
vacunas.
Por ello, además de una respuesta de anticuerpos
convencional, el sistema descrito en este documento puede proveer,
por ej., la asociación de antígenos expresados con moléculas MHC
clase I de manera tal que la respuesta inmune celular in vivo
para el antígeno de interés puede diseñarse para estimular la
producción de CTLs para permitir el reconocimiento futuro del
antígeno. Además, los procedimientos pueden obtener una respuesta
específica de antígeno por parte de células T ayudantes. De acuerdo
con esto, los procedimientos de la presente invención encontrarán
uso con cualquier macromolécula para la que se desee una respuesta
inmune celular y/o humoral, de preferencia antígenos derivados de
patógenos virales que pueden inducir anticuerpos, epitopes ayudantes
de células T y epitopes citotóxicos de células T. Tales antígenos
incluyen, pero no se limitan a, aquellos codificados por virus
humanos y animales y pueden corresponder con proteínas estructurales
o no estructurales.
Las micropartículas de la presente invención son
particularmente útiles para la inmunización contra virus
intracelulares que normalmente logran respuestas inmunes pobres. Por
ejemplo, la presente invención encontrará uso para estimular una
respuesta inmune contra una amplia variedad de proteínas de la
familia de herpesvirus, incluyendo proteínas derivadas de los virus
herpes simplex (HSV) tipo 1 y 2, tales como las glicoproteínas gB,
gD y gH de HSV-1 y HSV-2; antígenos
derivados del virus varicella zóster (VZV), virus Epstein Barr (EBV)
y citomegalovirus (CMV) incluyendo gB y gH de CMV; y antígenos
derivados de otros herpesvirus humanos tales como HHV6 y HHV7. (Ver,
por ej., Chee y col., Cytomegaloviruses (J. K. McDougall, ed.,
Springer-Verlag 1990) pág. 125-169,
para una revisión del contenido proteico codificado de
citomegalovirus; McGeoch y col., J. Gen. Virol. (1988)
69:1531-1574, para una discusión acerca las
proteínas codificadas de HSV-1; la Patente de EEUU
Nº 5.171.568 para una discusión acerca de las proteínas gB y gD de
HSV-1 y HSV-2 y los genes que
codifican las mismas; Baer y col., Nature (1984)
310:207-211, para la identificación de secuencias
codificadoras de proteínas en un genoma de EBV; y Davison and Scott,
J. Gen. Virol. (1986) 67:1759-1816, para una
revisión de VZV).
También pueden usarse convenientemente en las
técnicas descritas en este documento los antígenos de la familia de
virus de hepatitis, incluyendo virus de hepatitis A (HAV), virus de
hepatitis B (HBV), virus de hepatitis C (HCV), virus de hepatitis
delta (HDV), virus de hepatitis E (HEV) y virus de hepatitis G
(HGV).
A modo de ejemplo, se conoce la secuencia
genómica del HCV, ya que existen procedimientos para obtener la
secuencia. Ver, por ej., las Publicaciones Internacionales Nº WO
89/04669; WO 90/11089; y WO 90/14436. El genoma del HCV codifica
varias proteínas, incluyendo proteína E1 (también conocida como E) y
E2 (también conocida como E2/NSI) y una proteína
N-terminal de la nucleocápside (llamada "core")
(ver, Houghton y col., Hepatology (1991) 14:381-388,
para una discusión acerca de las proteínas de HCV, incluyendo E1 y
E2). Cada una de estas proteínas, así como los fragmentos
antigénicos de las mismas, encontrarán uso en la presente
composición y procedimientos.
De manera similar, se conoce la secuencia para
el antígeno 6 de HDV (ver, por ej., la Patente de EEUU Nº 5.378.814)
y este antígeno puede también usarse convenientemente en la presente
composición y procedimientos. Además, tendrán uso en este documento
los antígenos derivados de HBV, tales como el antígeno core, el
antígeno de superficie, sAg, así como las secuencias de
presuperficie, pre-S1 y pre-S2
(anteriormente llamados pre-S), así como
combinaciones de los anteriores, tales como
sAg/pre-S 1, sAg/pre-S2,
sAg/pre-S1/pre-S2, y
pre-S1/pre-S2. Ver, por ejemplo,
"HBV Vaccines-from the laboratory to license: a
case study" en Mackett, M. y Williamson, J. D., Human Vaccines
and Vaccination, pág. 159-176, para una discusión
sobre la estructura del HBV; y las Patentes de EEUU Nº 4.722.840,
5.098.704, 5.324.513, incorporadas en este documento como
referencias en su totalidad; Beames y col., J. Virol. (1995)
69:6833-6838, Birnbaum y col., J. Virol. (1990)
64:3319-3330; y Zhou y col., J. Virol. (1991)
65:5457-5464.
Los antígenos derivados de otros virus también
encontrarán uso en las composiciones y procedimientos reivindicados,
tales como, pero no limitados a, proteínas de miembros de las
familias Picornaviridae (por ej., poliovirus, etc.);
Caliciviridae; Togaviridae (por ej., virus de rubéola,
virus de dengue, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae;
Birnaviridae; Rhabodoviridae (por ej., virus de rabia, etc.);
Filoviridae; Paramyxoviridae (por ej., virus de paperas,
virus de sarampión, virus sincitial respiratorio, etc.);
Orthomyxoviridae (por ej., virus de influenza tipos A, B y
C, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviradae (por ej.,
HTLV-1; HTLV-II;
HIV-1 (también conocidos como
HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc.)), incluyendo pero no
limitado a antígenos de HIV_{IIIlb}, HIV_{SF2}, HIV_{LAV},
HIV_{LAI}, HIV_{MN}) aislados; HIV-1_{CM235},
HIV-1_{US4}; HIV-2; virus de
inmunodeficiencia en simios (SIV) entre otros. Además, los antígenos
pueden también derivar de papilomavirus humano (HPV) y del virus de
encefalitis transmitida por garrapatas. Ver, por ejemplo, Virology,
3ª Edición (W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2ª Edición
(B. N. Fields y D. M. Knipe, eds. 1991), para una descripción de
éstos y otros virus.
Más particularmente, las proteínas de envoltura
gp120 de cualquiera de los HIV aislados mencionados anteriormente,
incluyendo miembros de varios subtipos genéticos de HIV, son
conocidas y están descritas (ver, por ej., Myers y col., Los Alamos
Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New México
(1992); Myers y col., Human Retroviruses and Aids, 1990, Los Alamos,
New México: Los Alamos National Laboratory; y Modrow y col., J.
Virol. (1987) 61:570-578, para una comparación de
las secuencias de proteínas de envoltura de una variedad de HIV
aislados) y antígenos derivados de cualquiera de estos virus
aislados encontrarán uso en el presente procedimiento. Además, la
invención es igualmente aplicable a otras proteínas inmunogénicas
derivadas de cualquiera de los varios HIV aislados, incluyendo
cualquiera de las proteínas de envoltura tales como gp160 y gp41,
antígenos gag tales como p24gag y p55gag, así como también proteínas
derivadas de la región pol.
El virus de influenza es otro ejemplo de virus
para el que puede resultar particularmente útil la presente
invención. Específicamente, las glicoproteínas de envoltura HA y NA
de influenza A son de particular interés para generar una respuesta
inmune. Se han identificado numerosos subtipos HA de influenza tipo
A (Kawaoka y col., Virology (1990) 179:759-767;
Webster y col., "Antigenic variation among type A influenza
viruses," pág. 127-168. En: P. Palese y D. W.
Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses.
Springer-Verlag, New York). Así, las proteínas
derivadas de cualquiera de estos virus aislados pueden también
usarse en las composiciones y procedimientos descritos en este
documento.
Las composiciones y procedimientos descritos en
este documento encontrarán también uso con numerosos antígenos
bacterianos, tales como aquellos derivados de organismos que causan
difteria, cólera, tuberculosis, tétanos, pertussis, meningitis y
otros estados patogénicos incluyendo, pero no limitando a,
Bordetella pertussis, Neisseria meningitides (A, B, C, Y),
Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, y Haemophilus
influenza. Hemophilus influenza tipo B (HIB), Helicobacter
pylori, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de antígenos
de Neisseria meningitides B se describen en las siguientes
solicitudes de patente de pertenencia común: PCT/EEUU99/09346; PCT
IB98/01665; PCT IB99/00103; y Solicitudes Provisionales de EEUU Nº
60/083.758; 60/094.869; 60/098.994; 60/103.749; 60/103.794;
60/103.796; y 60/121.528. Los ejemplos de antígenos parasitarios
incluyen aquellos derivados de organismos causantes de malaria y
enfermedad de Lyme.
Resulta fácilmente evidente que la invención
puede usarse para administrar una amplia variedad de macromoléculas
y por lo tanto tratar, prevenir y/o diagnosticar una gran cantidad
de enfermedades. En una forma de realización alternativa, las
composiciones de micropartícula/macromolécula de la presente
invención pueden usarse para administración dirigida a un sitio
específico. Por ejemplo, la administración intravenosa de
micropartícula/macromolécula puede usarse para dirigirla al pulmón,
hígado, bazo, circulación sanguínea o médula ósea como blanco.
La adsorción de macromoléculas a la superficie
de las micropartículas adsorbentes se produce por mecanismos de
interacción mediante enlaces, incluyendo, pero no limitando a,
enlaces iónicos, puentes de hidrógeno, enlaces covalentes, enlaces
de Van der Waals, y enlaces a través de interacciones
hidrofílica/hidrofóbica. Los expertos en la técnica pueden
seleccionar fácilmente detergentes adecuados para el tipo de
macromolécula a adsorber.
Por ejemplo, las micropartículas fabricadas en
presencia de detergentes cargados, tales como detergentes aniónicos
o catiónicos, pueden dar micropartículas con una superficie con
carga de red positiva o negativa, que pueden adsorber una amplia
variedad de moléculas. Por ejemplo, las micropartículas fabricadas
con detergentes aniónicos, tal como dodecil sulfato de sodio (SDS),
es decir micropartículas SDS-PLG, adsorben antígenos
cargados positivamente, tales como proteínas. De manera similar, las
micropartículas fabricadas con detergentes catiónicos, tal como
bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB), es decir micropartículas
CTAB-PLG, adsorben macromoléculas cargadas
negativamente, tal como ADN. Cuando las moléculas a adsorber tienen
regiones de carga positiva y negativa, los detergentes catiónicos o
aniónicos pueden resultar adecuados.
Los polímeros biodegradables para fabricar
micropartículas para uso con la presente invención están disponibles
comercialmente en, por ej., Boehringer Ingelheim, Alemania y
Birmingham Polymers, Inc., Birmingham, AL. Por ejemplo, los
polímeros útiles para formar las micropartículas de este documento
incluyen aquellos derivados de ácido polihidroxibutírico;
policaprolactona; poliortoéster; polianhídrido; así como un
poli(\alpha-hidroxiácido), tales como
poli(L-láctido),
poli(D,L-láctido) (ambos conocidos como
"PLA" en este documento), poli hidroxibutirato), copolímeros de
D,L-láctido y glicólido, tal como
poli(D,L-láctido-co-glicólido)
(designado como "PLG" o "PLGA" en este documento) o un
copolímero de D,L-láctido y caprolactona. Los
polímeros particularmente de preferencia para uso en este documente
son los polímeros PLA y PLG.
Estos polímeros están disponibles en una
variedad de pesos moleculares y el peso molecular adecuado para un
uso dado puede ser determinado fácilmente por un experto en la
técnica. Por ello, por ej., para PLA, un peso molecular adecuado
puede estar en el orden de 2000 a 5000. Para PLG, los pesos
moleculares adecuados estarán en el intervalo desde 10000 hasta
200000, de preferencia 15000 a 150000, y de más preferencia 50000 a
100000.
Si se usa un copolímero tal como PLG para formar
micropartículas, encontrarán uso en este documento una variedad de
relaciones láctido:glicólido y la relación es en gran parte materia
de elección, dependiendo en parte de la macromolécula administrada
conjuntamente y la tasa de degradación deseada. Por ejemplo, un
polímero PLG 50:50, conteniendo 50% de D,L-láctido y
50% de glicólido, proveerá un copolímero de rápida resorción
mientras que PLG 75:25 se degrada más lentamente, y uno 85:15 y
90:10, aún más lentamente, debido al aumento del componente láctido.
Resulta fácilmente evidente que un experto en la técnica puede
determinar la relación adecuada de láctido:glicólido en base a la
naturaleza del antígeno y el trastorno en cuestión. Más aún, las
mezclas de micropartículas con relaciones variables de
láctido:glicólido encontrarán uso en este documento para lograr la
cinética de liberación deseada para una macromolécula dada y para
proveer una respuesta inmune primaria y secundaria. La tasa de
degradación de las micropartículas de la presente invención puede
controlarse con factores tales como peso molecular del polímero y
cristalinidad del polímero. Los copolímeros PLG con relaciones de
láctido:glicólido y pesos moleculares variables están disponibles
comercialmente en una cantidad de fuentes incluyendo Boehringer
Ingelheim, Alemania y Birmingham Polymers, Inc. Birmingham, AL.
Estos polímeros pueden también sintetizarse por medio de
policondensación simple del componente ácido láctico usando técnicas
bien conocidas en la técnica, tales como las descritas en Tabata y
col., J. Biomed. Mater. Res. (1988) 22:837-858.
Las macromolécula/micropartículas pueden
prepararse usando cualquiera de los varios procedimientos bien
conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de
doble evaporación emulsión/solvente, tales como las descritas en la
Patente de EEUU Nº 3.523.907 y Ogawa y col., Chem. Pharm. Bull.
(1988) 36:1095-1103 para fabricar las
micropartículas de este documento. Estas técnicas incluyen la
formación de una emulsión primaria constituida por pequeñas gotas de
solución de polímero, que se mezcla subsiguientemente con una fase
acuosa continua que contiene un estabilizante/tensioactivo de
partículas.
De preferencia, se usa un sistema de evaporación
de solventes agua en aceite en agua (a/ac/a) para formar
micropartículas, como se describe en O'Hagan y col., Vaccine (1993)
11:965-969 y Jeffery y col., Pharm. Res. (1993)
10:362. En esta técnica, se combina el polímero en particular con un
solvente orgánico, tal como acetato de etilo, dimetilcloruro
(también llamado cloruro de metileno y diclorometano), acetonitrilo,
acetona, cloroformo, y similares. Se proveerá el polímero en una
solución al 1-30%, de preferencia
2-15%, de más preferencia 3-10% y
de mayor preferencia, 4% en el solvente orgánico. La solución de
polímero se emulsifica usando por ej. un homogeneizador.
Opcionalmente, la emulsión se combina posteriormente con un volumen
mayor de una solución acuosa de un estabilizante de emulsiones tal
como alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona y un
detergente catiónico, aniónico o noiónico. La emulsión puede
combinarse con más de un estabilizante de emulsiones y/o detergente,
por ej., una combinación de PVA y un detergente. Ciertas
macromoléculas pueden adsorberse más fácilmente a micropartículas
que tiene una combinación de estabilizantes y/o detergentes. Cuando
se usa un estabilizante de emulsiones, se provee típicamente en
solución al 2-15%, más típicamente una solución al
4-10%. Generalmente, puede usarse una relación peso
en peso de detergente a polímero en el intervalo de 0,00001:1 a
0.1:1, de más preferencia de 0,0001:1 a 0,01:1 y de mayor
preferencia de 0,001:1 a 0,01:1, siendo de mayor preferencia aún de
0,005:1 a 0,01:1. La mezcla se homogeneíza posteriormente para
producir una doble emulsión a/ac/a estable. Posteriormente se
evaporan los solventes orgánicos.
Los parámetros de formulación pueden manipularse
para permitir la preparación de micropartículas pequeñas del orden
de 0,05 \mum (50 nm) a micropartículas mayores de 50 \mum o aún
mayores. Ver, por ejemplo, Jeffery y col., Pharm. Res. (1993)
10:362-368; McGee y col., J. Microencap. (1996). Por
ejemplo, la agitación disminuida da como resultado micropartículas
mayores, ya que aumenta el volumen de la fase interna. Las
partículas pequeñas se producen con volúmenes bajos de fase acuosa
con concentraciones altas de estabilizantes de emulsiones.
Las micropartículas pueden también formarse
usando secado por vaporización y coacervación como se describe en,
por ej., Thomasin y col., J. Controlled Release (1996) 41:131;
Patente de EEUU Nº 2.800.457; Masters, K. (1976) Spray Drying 2ª Ed.
Wiley, New York; técnicas de recubrimiento con aire en suspensión,
tal como recubrimiento total y recubrimiento Wurster, como se
describe en Hall y col., (1980) The "Wurster Process" en
Controlled Release Technologies: Methods, Theory, and Applications
(A. F. Kydonieus, ed.), Vol. 2, pág. 133-154 CRC
Press, Boca Ratón, Florida and Deasy, P. B., Crit. Rev. Ther. Drug
Carrier Syst. (1988) S(2): 99-139; y gelación
iónica como se describe en, por ej., Lim y col., Science (1980)
210:908-910.
El tamaño de partículas puede determinarse, por
ejemplo, mediante dispersión de luz láser, usando por ejemplo, un
espectrómetro que incorpora un láser helio-neón.
Generalmente, el tamaño de partículas se determina a temperatura
ambiente e incluye múltiples análisis de la muestra en cuestión (por
ej. 5-10 veces) para dar un valor promedio de
diámetro de partículas. El tamaño de partículas se determina también
fácilmente usando microscopia electrónica de barrido (SEM).
Tras la preparación, las micropartículas pueden
almacenarse como tales o liofilizadas para usar en el futuro. Para
adsorber las macromoléculas a las micropartículas, las preparación
de micropartículas se mezcla con la macromolécula de interés y la
formulación resultante puede liofilizarse nuevamente previo a su
uso. Generalmente, las macromoléculas se agregan a las
micropartículas para dar micropartículas con macromoléculas
asdorbidas con una relación peso en peso de macromoléculas a
micropartículas de 0,0001:1 a 0,25:1, de preferencia, 0,001:1 a 0,1,
de más preferencia 0,01 a 0,05. El contenido de macromoléculas en
las micropartículas puede determinarse usando técnicas estándar.
Las micropartículas de la presente invención
pueden tener macromoléculas atrapadas o encapsuladas dentro de
ellas, así como macromoléculas adsorbidas sobre las mismas. Así, por
ejemplo, un experto en la técnica puede preparar, de acuerdo con la
invención, micropartículas con adyuvantes encapsulados con proteínas
adsorbidas sobre las mismas, o micropartículas con proteínas
encapsuladas con adyuvantes adsorbidos sobre las mismas.
Una vez producidas las micropartículas con
macromoléculas adsorbidas, éstas son formuladas en composiciones
farmacéuticas o vacunas, para tratar, prevenir y/o diagnosticar una
amplia variedad de trastornos, como se describió anteriormente. Las
composiciones generalmente incluirán uno o más "excipientes o
vehículos farmacéuticamente aceptables" tales como agua, solución
salina, glicerol, polietilenglicol, ácido hialurónico, etanol, etc.
Además, pueden estar presentes en tales vehículos sustancias
auxiliares, tales como agentes emulsionantes o humectantes,
sustancias tamponadoras biológicas y similares. Un tamponador
biológico puede ser cualquier solución farmacológicamente aceptable
que provee la formulación con el pH deseado, es decir, un pH en el
intervalo fisiológico. Los ejemplos de soluciones tamponadoras
incluyen solución salina, solución salina tamponada con fosfatos,
solución salina tamponada con Tris, solución salina tamponada de
Hank, y similares.
Los adyuvantes pueden usarse para mejorar la
eficacia de las composiciones farmacéuticas. Los adyuvantes pueden
administrarse concurrentemente con las micropartículas de la
presente invención, por ej., en la misma composición o en
composiciones separadas. Alternativamente, puede administrarse un
adyuvante previamente o subsiguientemente a las composiciones de
micropartículas de la presente invención. En otra forma de
realización, el adyuvante, tal como un adyuvante inmunológico, puede
estar encapsulado en la micropartícula. Los adyuvantes, como
cualquier macromolécula, pueden encapsularse dentro de la
micropartícula usando cualquiera de los procedimientos conocidos en
la técnica. Ver, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 3.523.907; Ogawa
y col., Chem Pharm. Bull (1988) 36:1095-1103;
O'Hagan y col., Vaccine (1993) 11:965-969 y Jefferey
y col., Pharm. Res. (1993) 10:362. Alternativamente, los adyuvantes
pueden estar adsorbidos sobre la micropartícula como se describió
anteriormente para cualquier macromolécula.
Los adyuvantes inmunológicos incluyen, pero no
están limitados a: (1) sales de aluminio (alum), tales como
hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio,
etc.; (2) formulaciones de emulsiones de aceite en agua (con o sin
otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de
muramilo (ver a continuación) o componentes de pared celular
bacteriana), tales como por ejemplo (a) MF59 (Publicación
Internacional Nº WO 90/14837), conteniendo 5% de Escualeno, 0,5% de
Tween 80 y 0,5% de Span 85 (opcionalmente conteniendo cantidades
varias de MTP-PE (ver a continuación), aunque no es
necesario) formulados en partículas submicrónicas usando un
microfluidizador tal como el Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA),
(b) SAF, conteniendo 10% de Escualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de
polímero L121 en bloque de pluronic y thr-MDP (ver a
continuación) ya sea microfluidizado en una emulsión submicrónica o
agitado en vórtex para generar una emulsión con partículas mayores,
y (c) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT)
conteniendo 2% de Escualeno, 0,2% de Tween 80 y uno o más
componentes de pared celular bacteriana del grupo constituido por
monofosforilipido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y
esqueleto de pared celular (CWS), de preferencia MPL+CWS (Detox™)
(para otra discusión sobre emulsiones submicrónicas adecuadas para
uso en este documento, ver la solicitud de patente Nº 09/015.736 del
solicitante, presentada el 29 de Enero de 1998); (3) pueden usarse
adyuvantes de saponina, tales como QS21 (por ej., Stimulon™
(Cambridge Bioscience, Worcester, MA.)) o partículas generadas de
los mismos tales como ISCOMs (complejos inmunoestimulantes); (4)
Adyuvante Completo de Freund (CFA) y Adyuvante Incompleto de Freund
(IFA); (5) citoquinas, tales como interleuquinas
(IL-1, IL-2, etc.), factor
estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF), factor
de necrosis tumoral (TNF), etc.; (6) mutantes detoxificados de una
toxina ADP-ribosilante bacteriana tal como la toxina
del cólera (CT), toxina pertussis (PT) o toxina termolábil de E.
coli (LT), particularmente LT-K63 (en la que
lisina está sustituida por el aminoácido de tipo salvaje en la
posición 63), LT-R72 (en la que arginina está
sustituida por el aminoácido de tipo salvaje en la posición 72),
CT-S109 (en la que serina está sustituida por el
aminoácido de tipo salvaje en la posición 109) y
PT-K9/G129 (en la que lisina está sustituida por el
aminoácido de tipo salvaje en la posición 9 y glicina sustituida en
la posición 129) (ver, por ej., las Publicaciones Internacionales Nº
WO93/13202 y WO92/19265); (7) oligonucleótidos CpG y otras
secuencias inmunoestimulantes (ISSs); y (8) otras sustancias que
actúan como agentes inmunoestimulantes para mejorar la eficacia de
la composición. Resultan de preferencia alum y MF59.
Los péptidos de muramilo incluyen, pero no se
limitan a,
N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina
(thr-MDP),
N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutame
(nor-MDP),
N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanine-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina
(MTP-PE), etc.
Para ejemplos adicionales de adyuvantes, ver
Vaccine Design, The Subunit and the Adjuvant Approach, Powell, M. F.
y Newman, M. J, eds., Plenum Press, 1995.
Las composiciones comprenderán una "cantidad
terapéuticamente eficaz" de la macromolécula de interés. Esto es,
se incluirá una cantidad de macromolécula/micropartícula en las
composiciones, que provocará que en el sujeto se produzca una
respuesta suficiente, con el objetivo de prevenir, disminuir,
eliminar o diagnosticar síntomas. La cantidad necesaria exacta
variará, dependiendo del sujeto tratado; la edad y condición general
del mismo, la capacidad del sistema inmune del sujeto para
sintetizar anticuerpos; el grado de protección deseado y el antígeno
en particular seleccionada y su modo de administración, entre otros
factores. Los expertos en la técnica pueden fácilmente determinar la
cantidad eficaz adecuada. Así, una "cantidad terapéuticamente
eficaz" caerá dentro de un amplio intervalo que puede
determinarse a través de ensayos de rutina. Por ejemplo, para los
objetivos de la presente invención, cuando la macromolécula es un
polinucleótido, una dosis eficaz típicamente está dentro del
intervalo de 1 ng a 1 mg, de más preferencia de 10 ng a 1 \mug, y
de mayor preferencia de 50 \mug a 500 \mug de macromolécula
administrada por dosis; cuando la macromolécula es un antígeno, una
dosis eficaz típicamente está dentro del intervalo de 1 \mug a 100
mg, de más preferencia de 10 \mug a 1 mg, y de mayor preferencia
de 50 \mug a 500 \mug de la macromolécula administrada por
dosis
Una vez formuladas, las composiciones de la
invención pueden administrarse por vía parenteral, por ej., mediante
inyección. Las composiciones pueden inyectarse por vía subcutánea,
intraperitoneal, intravenosa o intramuscular. Otras formas de
administración incluyen la administración por vía nasal, oral y
pulmonar, supositorios y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas.
Las dosificaciones de tratamiento pueden ser de una sola dosis o
mediante dosis múltiples. Un programa de dosis múltiple es uno en
el que la primera serie de administraciones puede ser con
1-10 dosis separadas, seguidas por otras dosis dadas
en intervalos de tiempo siguientes, elegidos de manera de mantener
y/o reforzar la respuesta terapéutica, por ejemplo en
1-4 meses para una segunda dosis, y si es necesario,
una o más dosis subsiguientes tras varios meses. El régimen de
dosificación se determinará también, al menos en parte, en base a la
necesitad del sujeto según el criterio médico.
Además, si se desea prevenir la enfermedad,
generalmente se administran las macromoléculas en vacunas
previamente a la infección primaria con el patógeno de interés. Si
se desea el tratamiento, por ej., la disminución de síntomas o
recurrencias, generalmente se administran las macromoléculas
subsiguientemente a la infección primaria.
A continuación se exponen ejemplos de formas de
realización específicas para llevar a cabo la presente invención.
Los ejemplos tienen un objetivo solamente ilustrativo, y no
pretenden limitar de ninguna manera el alcance de la presente
invención.
Se han realizado esfuerzos para asegurar
precisión con respecto a los números usados (por ejemplo,
cantidades, temperaturas, etc.), pero deberían admitirse, por
supuesto, algunos errores y desviaciones experimentales.
Ejemplo
1
Se fabricaron micropartículas blanco (por ej.,
sin macromoléculas adsorbidas o atrapadas) usando alcohol
polivinílico (PVA) de la siguiente manera. Soluciones usadas:
- (1)
- 6% RG 504 PLG (Boehringer Ingelheim) en diclorometano.
- (2)
- 10% alcohol polivinílico (PVA) (ICN) en agua.
En particular, las micropartículas se fabricaron
combinando 10 ml de solución de polímero con 1,0 ml de agua
destilada y homogeneizando durante 3 minutos usando un
homogeneizador de mesada Omni con una sonda de 10 mm a 10000 rpm
para formar una emulsión agua/aceite (a/ac). Se agregó la emulsión
a/ac a 40 ml de la solución de PVA 10% y se homogeneizó durante 3
minutos, para formar una emulsión agua/aceite/agua (a/ac/a). Se dejó
la emulsión a/ac/a en agitación durante la noche para evaporar
solventes, formando las micropartículas. Se lavaron las
micropartículas formadas 4 veces con agua y centrifugación y se
liofilizaron. Posteriormente se determinó el tamaño de las
micropartículas con un equipo Malvern Master para usarlas en el
futuro.
Ejemplo
2
Se fabricaron micropartículas blanco usando CTAB
de la siguiente manera. Soluciones usadas:
- (1)
- 4% RG 504 PLG (Boehringer Ingelheim) en cloruro de dimetilo.
- (2)
- 0.5% CTAB (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en agua.
En particular, las micropartículas se fabricaron
combinando 12,5 ml de solución de polímero con 1,25 ml de agua
destilada y homogeneizando durante 3 minutos usando un
homogeneizador de mesada Omni con una sonda de 10 mm a 10000 rpm
para formar una emulsión a/ac. Se agregó la emulsión a/ac a 50 ml de
la solución de CTAB 0,5% y se homogeneizó durante 3 minutos, para
formar una emulsión a/ac/a. Se dejó la emulsión a/ac/a en agitación
durante la noche para evaporar solventes, formando las
micropartículas. Se filtraron las micropartículas a través de una
malla de 38 \mu, se lavaron 4 veces con agua y centrifugación y se
liofilizaron. Posteriormente se determinó el tamaño de las
micropartículas con un equipo Malvern Master para usarlas en el
futuro.
Ejemplo
3
Se fabricaron micropartículas blanco usando SDS
de la siguiente manera. Soluciones usadas:
- (1)
- 6% RG 504 PLG (Boehringer Ingelheim) en cloruro de dimetilo.
- (2)
- 1% SDS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en agua.
En particular, las micropartículas se fabricaron
combinando 12,5 ml de solución de polímero con 50 ml de solución de
SDS y homogeneizando durante 3 minutos usando un homogeneizador de
mesada Omni con una sonda de 10 mm a 10000 rpm. Se dejó la emulsión
en agitación durante la noche para evaporar solventes. Se filtraron
las micropartículas formadas a través de una malla de 38 \mu, se
lavaron 4 veces con agua y centrifugación y se liofilizaron para
usarlas en el futuro. Posteriormente se determinó el tamaño de las
micropartículas con un equipo Malvern Master.
Ejemplo
4
Las proteínas se adsorbieron a las
micropartículas de la siguiente manera.
Con la finalidad de alcanzar las cargas teóricas
de 1% y 3%, se colocaron 50 mg de micropartículas blanco SDS/PLG
producidas como en el Ejemplo 3 en un tubo de centrífuga Nalgene y
se agregaron 10 ml de tampón borato 25 mM, pH 9, con urea 6 M
conteniendo proteína p55gag (Chiron Corporation, Berkeley, CA): (a)
para una carga teórica de 1% se usaron 10 ml de una solución de
p55gag de 50 \mug/ml; y (b) para una carga teórica de 3% se usaron
10 ml de una solución de p55gag de 150 \mug/ml. Se incubó la
mezcla con agitación durante la noche a temperatura ambiente. Al día
siguiente, se centrifugaron las micropartículas y se analizó el
sobrenadante con un ensayo bicinconínico (BCA; Pierce, Rockford,
IL), para la concentración de gag para determinar la cantidad
adsorbida. Se lavaron las micropartículas dos veces con 10 ml de
tampón borato/urea 6 M y dos veces con 30 ml de agua y se
liofilizaron para su uso en el futuro.
Con la finalidad de alcanzar la carga teórica de
1%, se colocaron 50 mg de micropartículas blanco SDS/PLG en un tubo
de centrífuga Nalgene y se agregaron 10 ml de tampón citrato 30 mM,
pH 6,5, con urea 6 M conteniendo proteína core monomérica de HCV (10
ml de una solución de proteína core de HCV de 50 \mug/ml; Chiron
Corporation, Berkeley, CA). Se incubó la mezcla con agitación
durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, se
centrifugaron las micropartículas y se analizó el sobrenadante con
un ensayo bicinconínico (BCA; Pierce, Rockford, IL), para la
concentración de HCV para determinar la cantidad adsorbida. Se
lavaron las micropartículas dos veces con 30 ml de tampón
citrato/urea 6 M y dos veces con 30 ml de agua y se liofilizaron
para su uso en el futuro.
Ejemplo
5
Se analizaron las micropartículas liofilizadas
con proteína adsorbida del Ejemplo 4 para determinar la proteína
total adsorbida usando hidrólisis alcalina de la siguiente manera.
Se hidrolizaron 10 mg de partículas adsorbidas liofilizadas durante
4 horas en 2 ml de NaOH 0,2 N con SDS al 5%, se neutralizó y se
diluyó 1:10 y analizó para determinar el contenido proteico usando
el ensayo de proteínas MicroBCA (Pierce, Rockford, IL). Como se
muestra en la Tabla 1, las micropartículas con superficies
modificadas preparadas con detergentes como CTAB y SDS, absorbieron
proteínas más eficazmente que las micropartículas fabricadas usando
únicamente PVA.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tipo de Micropartículas | Proteína | Carga Prevista (% peso/peso) | Carga Real (% peso/peso) |
| PVA-PLG | p55gag | 3% | 0,38% |
| CTAB-PLG | p55gag | 3% | 1,58% |
| SDS-PLG | p55gag | 3% | 1,36% |
| PVA-PLG | p55gag | 1% | 0,18% |
| SDS-PLG | p55gag | 0,5% | 0,45% |
| SDS-PLG | p55gag | 1% | 0,72% |
| SDS-PLG | p55gag | 1% | 0,79% |
| PVA-PLG | HCV Core | 4% | 0,3% |
| SDS-PLG | HCV Core | 1% | 0,7% |
Ejemplo
6
Las micropartículas con gag adsorbida,
producidas usando PVA o SDS, como se describió en el Ejemplo 4, así
como la p55gag sola, sin micropartículas asociadas (como control
negativo) y los controles gag-pol de vaccinia (como
control positivo) se administraron por vía intramuscular a ratones.
Los animales fueron estimulados en los días 7 y 14. La dosis total
administrada se indica en las Tablas 2 y 3. Tras dos semanas de la
última inmunización se recogieron los bazos y se evaluó la
actividad CTL como se describe en Doe y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
(1996) 93:8578-8583.
Los cultivos de linfocitos se prepararon de la
siguiente manera. Se cultivaron células del bazo (sc) de los ratones
inmunizados en placas de 24 pocillos a 5 x 10^{6} células por
pocillo. De esas células, se sensibilizaron 1 x 10^{6} con
péptidos epitópicos de proteínas HIV-1_{SF2} a una
concentración de 10 \muM durante 1 hora a 37ºC, se lavaron y
cocultivaron junto con las 4 x 10^{6} células sc restantes sin
tratar en 2 ml de medio de cultivo [50% RPMI 1640 y 50%
alfa-MEM (GIBCO)] suplementado con suero fetal de
ternero inactivado con calor, 2-mercaptoetanol 5 x
10-5 M, antibióticos y 5% de interleuquina 2 (Rat
T-Stim, Collaborative Biomedical Products, Bedford,
MA). Se agregó a las células 1 ml de medio de cultivo fresco en los
días 3 y 5 y se evaluó la citotoxicidad en el día 6.
El ensayo celular de citotoxicidad se llevó a
cabo de la siguiente manera. Las células blanco SvBALB
(H-2^{d}) (SvB) y MC57 (H-2^{b})
usadas en el ensayo de liberación de ^{51}Cr expresan moléculas de
MHC clase I y no de clase II. Se incubaron aproximadamente 1 x
10^{6} células blanco en 200 \mul de medio conteniendo 50
\muCi (1 Ci = 37 Gbq) de ^{51}Cr y péptidos de
HIV-1 (1 mM) durante 60 minutos y se lavaron 3
veces. Las células efectoras (E) se cultivaron con 5 x 103 células
blanco (T) en varias relaciones E/T en 200 \mul de medio de
cultivo en placas de cultivo tisular de fondo redondo de 96 pocillos
durante 4 horas. Se usó el cpm promedio por duplicado para calcular
el porcentaje de liberación de ^{51}Cr específico.
Como se muestra en las Tablas 2 y 3, las
micropartíclas SDS-PLG/p55 tuvieron actividad
comparable con el control vaccinia y fueron más activas que las
micropartículas PVA-PLG/p55 y que la formulación de
proteína p55gag. Específicamente, como se muestra en la Tabla 2, las
proteínas p55gag fueron inactivas en concentraciones de 10 \mug,
25 \mug y 50 \mug. Además, como se muestra en la Tabla 3, las
formulaciones con SDS-PLG/p55 fueron más activas que
las formulaciones con PVA-PLG/p55 y con proteína
p55gag, indicando que se adsorbieron las proteínas de manera más
eficaz a las micropartículas en las formulaciones con
SDS-PLG/p55 comparadas con las formulaciones con
PVA-PLG/p55 y con proteína p55gag.
Ejemplo
7
Se prepararon micropartículas con plásmido de
ADN que codifica gp 120 de la siguiente manera. Se incubaron 20 mg
de micropartículas blanco, preparadas como se describió en los
Ejemplos 1 y 2, con concentraciones crecientes de pCMVgp120 ADN en
un volumen de 1,0 ml durante 3 horas a 4ºC.
Tras la incubación, se centrifugaron las
micropartículas, se lavaron dos veces con tampón
Tris-EDTA se liofilizaron durante la noche. Se
hidrolizaron las micropartículas como se describió en el Ejemplo 5 y
se analizó la cantidad de ADN adsorbida a A_{260} nm.
La Tabla 4 ilustra la eficacia de carga de
micropartículas fabricadas con PLG-PVA y
PLG-CTAB. Como se indica en la tabla, las
micropartículas con PLG-CTAB adsorben más
eficazmente que las partículas con PLG-PVA
correspondientes.
| Tipo de Micropartícula | Carga Teórica (% p/p) | Carga Real (%p/p) | Eficacia de Carga (%p/p) |
| PLG-PVA | 1 | 0,44 | 44 |
| PLG-CTAB | 1 | 0,84 | 88 |
| PLG-PVA | 2 | 0,38 | 19 |
| PLG-CTAB | 2 | 1,23 | 62 |
| PLG-PVA | 3 | 0,33 | 11 |
| PLG-CTAB | 3 | 1,82 | 61 |
| PLG-PVA | 4 | 0,48 | 12 |
| PLG-CTAB | 4 | 2,36 | 59 |
Ejemplo
8
Las micropartículas se prepararon usando PVA y
varios detergentes diferentes, como se describió en varios ejemplos
anteriores. Se adsorbió proteína E2 de Virus de Hepatitis C (HCV) en
la superficie de micropartículas de la siguiente manera: se
agregaron 0,2 mg/ml de E2 a 20 mg de micropartículas en PBS para
formar una solución 0,5% p/p de E2/PLG en un volumen total de 0,5
ml. Se incubaron las soluciones durante 1,5 horas a 37ºC, y
posteriormente se centrifugaron. Se recogieron los sobrenadantes y
se midió el contenido de proteínas mediante microBCA. Los resultados
se muestran en la Tabla 5. Los resultados confirman la superior
adsorción de macromoléculas por parte de las micropartículas de la
presente invención.
| Tipo de Micropartícula | Proteína | Unión (E2/PLG p/p) % | E2 unida total % |
| PVA-PLG | E2 | 0,00 | 0,00 |
| CTAB-PLG | E2 | 0,43 | 96,00 |
| SDS-PLG | E2 | 0,14 | 31,00 |
| Oleato de Na-PLG | E2 | 0,36 | 81,00 |
| Pluronic P84-PLG | E2 | 0,00 | 0,00 |
| Pluronic L121-PLG | E2 | 0,00 | 0,00 |
Ejemplo
9
Se prepararon micropartículas usando PVA como se
describió en los ejemplos anteriores. Se prepararon también
micropartículas usando Oleato de Na, un detergente aniónico, de la
siguiente manera: se preparó una emulsión a/ac/a con 1,67 ml de
Citrato de Na 30 mM a pH 6 como fase acuosa interna, 16,7 ml de
polímero RG 505 PLG 6% (Boehringer Ingelheim) en diclorometano como
solvente (fase oleosa), y 66,8 ml de Oleato de Na 0,4% como fase
acuosa externa. Estas micropartículas aparecen en la Tabla 6
continuación como "Oleato de Na-PLG (a/ac/a)".
Adicionalmente, se prepararon micropartículas usando Oleato de Na en
una formulación de aceite en agua, estas micropartículas aparecen
en la Tabla 6 "Oleato de Na-PLG (ac/a)". Se
adsorbió proteína gp 120 en la superficie de las micropartículas
preparadas de la siguiente manera: se agregaron 0,388 mg/ml de
proteína a aproximadamente 20 mg de micropartículas en PBS para
formar una solución aproximadamente 1,4% p/p de gp 120/PLG en un
volumen total de 0,8 ml. Se incubaron las soluciones durante 1,5
horas a 37ºC, y posteriormente se centrifugaron. Se recogieron los
sobrenadantes y se midió el contenido de proteínas mediante
microBCA. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Los resultados
confirman la superior adsorción de macromoléculas por parte de las
micropartículas de la presente invención.
| Tipo de Micropartícula | Proteína | Unión % (gp120/PLG p/p) | E2 unida total % |
| PVA-PLG | gp120 | 0,01 | 0,00 |
| PVA-PLG | gp120 | 0,09 | 3,00 |
| Oleato de Na-PLG (a/ac/a) | gp120 | 1,33 | 96,00 |
| Oleato de Na-PLG (a/ac/a) | gp120 | 1,24 | 95,00 |
| Oleato de Na-PLG (ac/a) | gp120 | 0,41 | 31,00 |
| Oleato de Na-PLG (ac/a) | gp120 | 0,27 | 20,00 |
| Oleato de Na-PLG (ac/a) | gp120 | 0,36 | 28,00 |
| Oleato de Na-PLG (ac/a) | gp120 | 0,27 | 22,00 |
| Tipo de Micropartícula | Proteína | Unión % (gp120/PLG p/p) | E2 unida total % |
| Oleato de Na-PLG (ac/a) | gp120 | 0,34 | 26,00 |
| Oleato de Na-PLG (ac/a) | gp120 | 0,31 | 24,00 |
| Oleato de Na-PLG (ac/a) | gp120 | -0,01 | -1,00 |
| Oleato de Na-PLG (ac/a) | gp120 | -0,09 | -7,00 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se prepararon micropartículas usando PVA y CTAV,
como se describió en los ejemplos anteriores. Se adsorbió proteína
Listeriolisina (LLO) de Listeria monocytogenes en la
superficie de las micropartículas de la siguiente manera: se
agregaron 1,0 mg/ml de LLO a 100 mg de micropartículas en PBS para
formar una solución 1% p/p de LLO/PLG en un volumen total de 5 ml.
Se incubaron las soluciones durante 1,5 horas a 37ºC, y
posteriormente se centrifugaron. Se recogieron los sobrenadantes y
se midió el contenido de proteínas mediante microBCA. Los resultados
se muestran en la Tabla 7. Los resultados confirman la superior
adsorción de macromoléculas por parte de las micropartículas de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tipo de Micropartícula | Proteína | Carga Prevista (% p/p) | Carga Real (% p/p) | Eficacia de Carga |
| PVA-PLG | LLO | 0,10 | 0,10 | 10,0 |
| PVA-PLG | LLO | 0,25 | 0,08 | 32,0 |
| PVA-PLG | LLO | 0,50 | 0,12 | 24,0 |
| PVA-PLG | LLO | 1,00 | 0,18 | 18,0 |
| CTAB-PLG | LLO | 0,10 | 0,06 | 60,0 |
| CTAB-PLG | LLO | 0,25 | 0,19 | 76,0 |
| CTAB-PLG | LLO | 0,50 | 0,34 | 68,0 |
| CTAB-PLG | LLO | 1,00 | 0,71 | 71,0 |
Ejemplo
11
Se prepararon micropartículas con PLG con p55
gag ADN adsorbido como se describió anteriormente, usando CTAB. Se
inyectaron las micropartículas por vía intramuscular en ratones a 2
concentraciones, y, como control, se inyectó ADN solo a las mismas
dos concentraciones. Adicionalmente, en un ensayo, se agregaron 50
\mug de fosfato de aluminio a la composición de CTAB inyectada. Se
inyectó cada formulación a 10 ratones. Se estimularon los ratones
tras 28 días. Dos semanas tras la segunda inmunización, se
recolectó suero y se midió el título medio geométrico (GMT) de cada
suero, con su error estándar (EE). Los resultados se resumen en la
Tabla 8, presentados como valores lineales y logarítmicos. Cada
número es el promedio del resultado obtenido de los 10 ratones.
| Formulación | GMT | EE | log GMT | log EE |
| ADN-CTAB 1 \mug | 19546 | 5983 | 4,28 | 0,11 |
| ADN-CTAB 10 \mug | 54487 | 5510 | 4,73 | 0,04 |
| ADN-CTAB 1 \mug +ALUM 50\mug | 49765 | 10034 | 4,69 | 0,1 |
| ADN solo 1 \mug | 10,6 | 2,7 | 1,01 | 0,07 |
| ADN solo 10 \mug | 230 | 395 | 2,15 | 0,3 |
Para comparar estos resultados estadísticamente,
se generaron valores P para ADN-CTAB vs.
ADN-CTAB + ALUM (valor P = 0,0017);
ADN-CTAB + ALUM vs. ADN solo (valor P < 0,0001);
y ADN-CTAB (10 \mug) vs. ADN solo (10 \mug)
(valor P < 0,0001). Estos valores P confirman la significancia
estadística de los valores de la
Tabla 8.
Tabla 8.
Ejemplo
12
La medición de los potenciales zeta se llevó a
cabo en un medidor DELSA 440 SX de Coulter Corp., Miami, Fla. 33116.
El sistema está calibrado usando estándares de movilidad de Coulter
(EMP SL7, una suspensión acuosa de bolitas de látex poliestireno).
Tras aclarar la célula muestra con agua estéril, se agregaron las
muestras a la célula muestra. Se lleva posteriormente el contador a
cero alineando el haz a su valor inferior. La corriente se establece
en 0,7 mA para referencia y 20 V para la muestra. Se controlan los
niveles del detector para los cuatro haces, posteriormente se
analiza la muestra seleccionando "run" del programa informático
y se leen las mediciones de frecuencia. Los rayos deberían estar
separados 20 Hz. Posteriormente se lee el potencial zeta medio para
cada muestra.
Se leyeron mediciones para varias formulaciones
de micropartículas de la presente invención, los resultados se
muestran en la Tabla 9. Como indican los resultados, la adsorción de
macromoléculas a las superficies de micropartículas altera los
potenciales zeta de las micropartículas.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tipo de Micropartícula | Macromolécula Adherente | Potencial Zeta (mV) |
| PLG-PVA | ninguna | -26 \pm 8 |
| PLG-CTAB | ninguna | +83 \pm 22 |
| PLG-CTAB | p55 ADN | +35 \pm 14 |
| PLG-SDS | ninguna | -44 \pm 26 |
| PLG-SDS | proteína p55 | -32 \pm 18 |
| Oleato-PLG | ninguna | -64 \pm 24 |
| Oleato-PLG | proteína gp120 | -48 \pm 14 |
Ejemplo
13
(A). Se prepararon micropartículas PLG usando RG
505 PLG y PVA y encapsulando el adyuvante LTK63. Se incubaron 100 mg
de micropartículas con 5 ml de PBS conteniendo 400 \mug/ml de
proteína p24gag. Posteriormente se incubó la mezcla con agitación a
temperatura ambiente durante la noche, se lavó por centrifugación
con 20 ml de PBS dos veces y una vez con agua, luego se
liofilizaron. Tras hidrólisis alcalina y neutralización, se midieron
el % de proteína adsorbida y el % de adyuvante encapsulado; los
resultados se muestran en la Tabla 10.
(B). Se prepararon micropartículas PLG usando
SDS y RG 505 PLG y encapsulando oligonucleótidos CpG como adyuvante
de la siguiente manera: se emulsionaron 5 ml de polímero RG 505 al
6% en DCM con 0,5 ml de CpG 5 mg/ml en Tris/EDTA 50 mM, formando una
emulsión a/ac. Se agregó la emulsión a/ac a 20 ml de SDS al 1% y se
emulsionó, formando una emulsión a/ac/a. Las micropartículas se
formaron por evaporación del solvente durante la noche,
posteriormente se lavaron, centrifugaron y liofilizaron. Se
disolvieron 10 mg de micropartículas con CpG encapsulado en 1 ml de
DCM. Se agregaron 0,5 ml de agua para extraer los oligonucleótidos y
posteriormente se centrifugó la mezcla y se inyectó la capa acuosa
en una columna de exclusión por tamaño con PBS con fase móvil. Se
mezclaron 10 mg de micropartículas placebo con 100 \mug de
oligonucleótidos CpG y se extrajeron con DCM y se analizaron en la
columna como un estándar. Se calculó la cantidad de oligonucleótidos
CpG presente atrapado en las partículas frente al estándar.
Se adsorbió p55gag en las micropartículas con
CpG encapsulado de las siguiente manera: se incubaron 50 mg de
micropartículas con CpG encapsulado liofilizadas durante toda la
noche con 5 ml de Borato 25 mM con Urea 6 M (pH 9) conteniendo 140
\mug de proteína p55gag. Se incubó la mezcla con agitación durante
toda la noche a temperatura ambiente, se lavó con 20 ml de tampón
Borato/Urea 6 M dos veces, y dos veces con 20 ml de agua,
posteriormente se liofilizó.
Se realizó hidrólisis alcalina a 10 mg de
micropartículas con p55gag adsorbida y con CpG encapsulado y se
tomaron mediciones del % de atrapamiento y % de macromoléculas
adsorbidas. La carga prevista fue 1,0%, excepto que se indique de
otra manera. Los resultados se muestran en la Tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tipo de Micropartícula | % encapsulado (p/p) | % adsorbido (p/p) |
| (A). PLG-PVA | 0,46 | 1,2* |
| LTK63 encapsulado | ||
| p24gag adsorbida | ||
| B). PLG-SDS | 0,41 | 1,0 |
| CpG encapsulado | ||
| p55gag adsorbida | ||
| * carga prevista = 2,0% |
Ejemplo
14
(A). De acuerdo con la presente invención,
pueden administrarse dos o más macromoléculas en una composición que
comprende micropartículas que han adsorbido ambas macromoléculas o
pueden administrarse en una composición que comprende dos o más
micropartículas distintas, habiendo cada una adsorbido una única
macromolécula. Por ejemplo, se prepararon micropartículas
adsorbiendo polipéptido E2 y como adyuvante oligonucleótidos CpG de
la siguiente manera: se prepararon micropartículas
PLG-CTAB Blanco como se describió anteriormente. Se
incubaron 20 mg de las micropartículas liofilizadas durante 4 horas
con 1 ml de E2 200 \mug/ml en solución salina. Se agitó la mezcla
a temperatura ambiente durante 4 horas, se lavó con 20 ml de
solución salina normal dos veces por centrifugación a 10.000 G y se
resuspendió el sedimento en 1 ml de solución de CpG en tampón TE
conteniendo 200 \mug/ml de CpG durante 4 horas a temperatura
ambiente. Se lavó la suspensión final dos veces con tampón TE por
centrifugación y posteriormente se liofilizó. Se realizó hidrólisis
alcalina en 10 mg de las micropartículas con CpG y E2 adsorbidos y
se determinó la concentración de proteínas por BCA y se analizó la
cantidad residual de CpG por HPLC para medir la cantidad de CpG
adsorbido en las micropartículas. Los resultados se muestran en la
Tabla 11, demostrando adsorción positiva para ambas
macromoléculas.
(B). Se prepararon micropartículas de acuerdo
con la invención. Una parte se usaron para adsorber polipéptido E2,
mientras que otra parte se usó para adsorber oligonucleótidos CpG
como adyuvante. Las micropartículas PLG-CTAB Blanco
se prepararon como se describió anteriormente. Se incubaron 20 mg de
micropartículas liofilizadas durante 4 horas con 1 ml de E2 200
\mug/ml en solución salina. Se agitó la mezcla a temperatura
ambiente durante 4 horas, se lavó con 20 ml de solución salina
normal dos veces por centrifugación a 10.000 G, posteriormente se
liofilizó. Separadamente, se incubaron 20 mg de micropartículas
liofilizadas durante 4 horas con 1 ml de CpG 200 \mug/ml en tampón
TE. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 4 horas, se
lavó con 20 ml de tampón TE dos veces por centrifugación a 10.000 G,
posteriormente se liofilizó. Los resultados de las mediciones de %
adsorbido de macromoléculas se muestran en la Tabla 11.
| Tipo de Micropartícula | % de E2 adsorbido (p/p)* | % de CpG adsorbido (p/p)* |
| (A). PLG-SDS | 0,71 | 0,32 |
| E2 adsorbida | ||
| CpG adsorbido | ||
| (B). PLG-SDS | 0,64 | n/d |
| E2 adsorbida | ||
| B). PLG-SDS | n/d | 0,81 |
| CpG adsorbida | ||
| *carga prevista = 1,0% |
Ejemplo
15
Se usó el siguiente procedimiento para formar
micropartículas que comprenden dos tensioactivos: PVA y un
detergente: se emulsionaron 10 ml de polímero PLG al 5% y 0,2% del
detergente DOTAP en DCM a 12.000 rpm durante 3 minutos con 1,0 ml de
agua destilada para formar la emulsión primaria a/ac. Se agregó la
emulsión a/ac a 40 ml de PVA al 0,8% y se emulsionó durante 3
minutos para formar la segunda emulsión a/ac/a, la que se agitó
durante toda la noche para evaporar el solvente, con lo que se
formaron las micropartículas. Se lavaron las micropartículas dos
veces en agua destilada y se liofilizaron. Entonces las
micropartículas están listas para la adsorción de macromoléculas, de
acuerdo con la presente invención.
Se usó el mismo procedimiento para formar
micropartículas que comprenden una combinación de PVA y el
detergente DDA.
Ejemplo
16
Se formaron las micropartículas como en los
ejemplos anteriores usando los detergentes CTAB o DDA. Se adsorbió
p55 ADN a las micropartículas y se evaluó la inmunogenicidad usando
los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores. Los
resultados se resumen en la Tabla 12 a continuación.
Ejemplo
17
Se formaron micropartículas usando los
procedimientos descritos anteriormente usando PLG y el detergente
CTAB. Se adsorbió ADN de luciferasa a las mismas usando los
procedimientos descritos anteriormente. Se midió la expresión de
luciferasa in vivo con una dosis de 5 \mug de ADN de
luciferasa usando solo ADN de luciferasa (1248 pg) y las
micropartículas con ADN de luciferasa adsorbido a las mismas (2250
pg). Se midió la expresión de luciferasa in vivo en músculo
en los días 1 y 14 tras la administración de la siguiente manera: se
inyectaron dos grupos de ratones (n = 5) con 50 \mug de plásmido
de Luciferasa o 50 \mug de micropartículas
PLG-CTAB con ADN de Luciferasa. Se inyectó a ambos
grupos de ratones por vía intramuscular en el músculo anterior de la
tibia (TA) en dos patas. Se extirparon ambos músculos TA de cada uno
de los ratones en los dos grupos ya sea en el día 1 ó en el día 14 y
se conservaron a -80ºC. Se molieron los músculos con el pilón en un
mortero en hielo seco. Se recogieron los músculos en polvo en tubos
eppendorf con 0,5 ml de Tampón 1X Reporter Lysis. Se agitaron las
mezclas en vórtex durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras 3
etapas de congelación/descongelación, se centrifugaron las muestras
a 14.000 rpm durante 10 minutos. Se combinaron los sobrenadantes de
los músculos TA de cada ratón correspondientes a cada tiempo puntual
y se analizaron 20 \mul de muestras para determinar la expresión
de Luciferasa usando un luminómetro ML3000 (Dynatech).
La determinación de Luciferasa se llevó a cabo
usando un ensayo de quimioluminiscencia. Se preparó el tampón
conteniendo 1 mg/ml de BSA en 1X Reporter Lysis (Promega). Se usó
enzima luciferasa patrón (Promega) a 10 mg/ml como estándar, se
diluyó a una concentración de 500 pg/20 \mul. Se realizaron
diluciones seriadas 1:2 de este estándar en la placa Microlite 2
(Dynatech) para crear una curva estándar. También se colocaron 20
\mul de blanco y muestra en la placa y se diluyeron de la misma
manera, 1:2. Se colocaron las placas en el ML3000 y se inyectaron
100 \mul de Reactivo para Ensayo de Luciferasa (Promega) por
pocillo. Bajo luz potenciada, se midieron las unidades de luz
relativas para cada muestra.
Los resultados se muestran en la Tabla 13 a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tipo de Micropartícula | Expresión de luciferasa in vivo. | Expresión de luciferasa in vivo. |
| Día 1 (pg) | Día 14 (pg) | |
| PLG-CTAB | 9,51 | 44,95 |
| ADN de luciferasa | ||
| adsorbido (50 \mug) | ||
| Sólo ADN de luciferasa | 6,78 | 9,29 |
| (50 \mug) |
Ejemplo
18
Se prepararon micropartículas usando los
procedimientos descritos en los ejemplos anteriores. Posteriormente
se adsorbió proteína E2 a las mismas como se describió
anteriormente. También se prepararon micropartículas con E2 atrapada
dentro de las mismas, en vez de adsorbida sobre ellas, como se
describió anteriormente. Se evaluaron las micropartículas en su
capacidad para inducir anticuerpos IgG tras inmunización de 10
ratones con cada tipo de micropartículas. Se midió el título medio
geométrico (GMT) del suero de cada ratón y se promediaron para el
grupo de 10 animales. También se calculó el error estándar (SE). Se
midió el PLSD de Fisher (nivel de significancia de 5%) con p =
0,0006. Los resultados se muestran en la Tabla 14 a continuación.
Los resultados demuestran claramente la inducción superior de
respuesta inmune humoral usando micropartículas adsorbidas de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
| Formulación | GMT | SE |
| PLG con E2 atrapada | 293 | 270 |
| PLG con E2 adsorbida | 3122 | 1310 |
\global\parskip0.950000\baselineskip
Ejemplo
19
Se prepararon micropartículas
PLG-CTAB usando los procedimientos descritos en los
ejemplos anteriores. Se adsorbió proteína E1E2 de Virus de Hepatitis
C (HCV) en las mismas. Se usaron las partículas para inmunizar
ratones, con o sin adyuvante Alum, en dosificaciones de
micropartículas calculadas para proveer 10 \mug ó 100 \mug de
proteína. Se midió el título medio geométrico y los resultados se
muestran a continuación en la Tabla 15.
| Formulación | GMT | SE |
| PLG/CTAB E1E2 (10 \mug) | 4117 | 558 |
| PLG/CTAB E1E2 (100 \mug) | 7583 | 659 |
| PLG/CTAB E1E2 (10 \mug) | 3356 | 436 |
| PLG/CTAB E1E2 (100 \mug) | 10485 | 1548 |
| ADN de HCV E1E2 (10 \mug) | 87 | 63 |
| ADN de HCV E1E2 (100 \mug) | 7621 | 571 |
Como indican los resultados, las micropartículas
con proteína adsorbida producen respuesta inmune superior en dosis
de 10 \mug. Esto demuestra que las micropartículas tienen la
ventaja de ser útiles para obtener respuestas inmunes a bajas dosis
en las que el ADN libre es incapaz de generar tales respuestas.
Ejemplo
20
Se prepararon micropartículas
PLG-PVA usando los procedimientos descritos en los
ejemplos anteriores. Posteriormente se adsorbió proteína p24gag a
las mismas como se describió anteriormente. Se evaluaron las
micropartículas en su capacidad para inducir anticuerpos IgG, IgG1 e
IgG2a tras inmunización de 10 ratones. Se midió el título medio
geométrico (GMT) de los sueros recogidos de los ratones 2 semanas
tras la 2ª inmunización (2wp2) y 2 semanas tras la 3ª inmunización
(2wp3), luego se promediaron para el grupo de 10 animales. Se
calculó también el error estándar (SE). Los resultados se muestran
en la Tabla 16 a continuación y demuestran claramente la superior
inducción de respuesta inmune humoral usando las micropartículas
adsorbidas de la presente invención.
| IgG | IgG | IgG1 | IgG1 | IgG2a | IgG2a | |
| GMT | SE | GMT | SE | GMT | SE | |
| PLG-PVA/p24 gag (2wp2) | 5813,59 | 2400,58 | 3741,17 | 2039,08 | 755,3 | 587,21 |
| Sólo p24 gag (2wp2) | 6,6 | 7,91 | 6,51 | 6,85 | 5 | 1 |
| PLG-PVA/p24 gag (2wp3) | 26730,29 | 3443,67 | 40088,65 | 8989,07 | 6974,22 | 1457,74 |
| Sólo p24 gag (2wp3) | 7,15 | 5,59 | 8,22 | 12,3 | 5 | 1 |
Ejemplo
21
Se prepararon micropartículas PLG/CTAB, PLG/SDS
y PLG-PVA usando los procedimientos descritos en los
ejemplos anteriores. Se formaron ocho grupos de micropartículas con
el fin de analizar los diferentes efectos de inmunización en ratones
con antígeno proteína p55 gag adsorbida en las micropartículas vs.
proveyendo p55 gag soluble libre, y para determinar los efectos de
tener el adyuvante CpG (oligonucleótidos de 20 bases de longitud de
cadena simple con motivo CpG) también adsorbido en otras
micropartículas o proveyéndolo en forma soluble libre. Se prepararon
los diferentes grupos de la siguiente manera:
El Grupo 1 usó proteína p55 gag soluble
(proteína recombinante p55 gag de HIV en levaduras a 2 mg/ml en
tampón tris/NaCl con urea 2M) mezclada con partículas PLG/CTAB con
CpG adsorbido.
El Grupo 2 usó partículas PLG/SDS con p55 gag
adsorbida mezcladas con partículas PLG/CTAB con CpG adsorbido.
El Grupo 3 usó partículas PLG/SDS con p55 gag
adsorbida mezcladas con CpG libre.
El Grupo 4 usó partículas PLG/SDS con p55 gag
adsorbida y sin adyuvante.
El Grupo 5 usó partículas PLG/SDS con p55 gag
atrapada dentro de las mismas mezcladas con partículas PLG/ CTAB con
CpG adsorbido.
El Grupo 6, un control, con CpG soluble y no usó
antígeno.
El Grupo 7, otro control, usó proteína p55 gag
soluble y no usó adyuvantes.
El Grupo 8, otro control, usó sólo virus
vaccinia (vv gag) expresando el gen de gag y no usó adyuvantes.
Para cada grupo, se inmunizaron 10 ratones con
cantidades suficientes de micropartículas o moléculas libres tales
que la dosificación de antígeno p55 gag y adyuvante CpG fue de 25
\mug cada uno (si estaban presentes en el grupo), excepto en el
Grupo 8 que se usó a una dosificación de 10 x 10^{7} pfu. La vía
de inmunización fue IM, excepto para el Grupo 8, cuya vía fue IP.
Tras la inmunización, se midió el título de IgG anti p55, los
resultados se muestran en la Tabla 17 a continuación. También se
midió la lisis de blancos por CTL en cada uno de los grupos y los
resultados se muestran en la Tabla 18.
\global\parskip0.990000\baselineskip
Ejemplo
22
Se formaron micropartículas PLG/CTAB con ADN de
p55 y micropartículas PLG/PVA con p55 atrapado dentro de las mismas,
como se describió en los ejemplos anteriores. Se llevó a cabo la
inmunización de ratones por vía IM y la inducción de anticuerpos
(recolección y análisis de sueros) como se describió en los ejemplos
anteriores, cuatro semanas tras la 1ª inmunización (4wp1), y 3, 4,
6, 13 y 15 semanas tras la 2ª inmunización (2wp2, 4wp2, 6wp2, 13wp2
y 15wp2 respectivamente). Los resultados se muestran en la Tabla 19
a continuación y demuestran una clara ventaja de las micropartículas
adsorbidas sobre las que tienen p55 atrapado y sobre p55 libre.
| Formulación | 4wp1 | 2wp2 | 4wp2 | 6wp2 | 13wp2 | 15wp2 |
| PLG/CTAB con ADN de p55 adsorbido (1 \mug) | 576 | 79300 | 156000 | 227000 | 988000 | 123000 |
| PLG/PVA con ADN de p55 atrapado (1 \mug) | 996 | 1915 | 2215 | 1376 | 25100 | 1084 |
| sólo plásmido p55 (1 \mug) | 912 | 1149 | 1360 | 701 | 1075 | 742 |
| sólo plásmido p55 (10 \mug) | 1489 | 10700 | 7885 | 26300 | 31600 | 17300 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
23
Se formaron micropartículas PLG/CTAB con ADN de
gp120 como se describió en los ejemplos anteriores. Se muestran
otras muestras en la Tabla 20 e incluyen las micropartículas con o
sin fosfato de aluminio, controles de gp120 soluble libre, con o sin
fosfato de aluminio y proteína MF59, codificada por ADN de gp120. La
inmunización IM de cobayos y la inducción de anticuerpos
(recolección y análisis de sueros) se realizó como se describió en
los ejemplos anteriores. Los resultados se muestran en la Tabla 20 a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
| Formulación | GMT | SE |
| PLG/CTAB gp120 adsorbida (25 \mug) | 1435 | 383 |
| PLG/CTAB gp120 adsorbida (25 \mug) + fosfato de aluminio | 3624 | 454 |
| ADN de gp120 soluble (25 \mug) + fosfato de aluminio | 119 | 606 |
| sólo ADN de gp120 soluble (25 \mug) | 101 | 55 |
| proteína MF59 (50 \mug) | 3468 | 911 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
24
Se formaron micropartículas PLG/CTAB con ADN de
p55 adsorbido y micropartículas PLG/DDA con ADN de p55 adsorbido,
como se describió en los ejemplos anteriores. Se realizó la
inmunización de ratones con 25 ó 100 \mug y la inducción de
anticuerpos (recolección y análisis de sueros) y la inducción CTL
como se describió en los ejemplos anteriores, a las dos y cuatro
semanas tras la 1ª inmunización (2wp1, 4wp1), dos y cuatro semanas
tras la 2ª inmunización (2wp2, 4wp2), y dos y cuatro semanas tras la
3ª inmunización (2wp3, 4wp3). Los controles incluyeron la
inmunización con ADN de p55 soluble o con 10 \mug de toxina
colérica. Los resultados de la inducción de anticuerpos se muestran
en la Tabla 21 y los resultados de la lisis por CTL (a 4 semanas
tras la 4ª inmunización) se muestran en la Tabla 22 a
continuación.
| Formulación | 2wp1 | 4wp2 | 2wp2 | 4wp2 | 2wp3 | 4wp3 |
| PLG/CTAB con ADN de p55 | 189 | 529 | 1412 | 882 | 908 | 742 |
| adsorbido (25 \mug) | ||||||
| PLG/CTAB con ADN de p55 | 128 | 383 | 3462 | 2887 | 289000 | 134000 |
| adsorbido (100 \mug) | ||||||
| PLG/DDA con ADN de p55 | 247 | 482 | 1223 | 338 | 940 | 545 |
| adsorbido (25 \mug) | ||||||
| PLG/DDA con ADN de p55 | 143 | 1351 | 2538 | 1341 | 357000 | 161000 |
| adsorbido (100 \mug) | ||||||
| ADN de p55 soluble (100 \mug) + | 195 | 270 | 2298 | 617 | 1549 | 862 |
| toxina colérica (10 \mug) | ||||||
| sólo ADN de p55 soluble (100 \mug) | 362 | 260 | 618 | 190 | 285 | 263 |
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque se han descrito con cierto detalle las
formas de realización de preferencia de la invención, se entiende
que pueden realizarse variaciones obvias sin apartarse de la
invención como se define en las reivindicaciones.
Claims (52)
1. Un procedimiento para la producción de una
micropartícula con superficie adsorbente a la que se ha adsorbido
una macromolécula biológicamente activa, dicho procedimiento
comprendiendo las etapas de:
(a) emulsionar una mezcla de una solución de
polímero y un detergente iónico para formar una emulsión, en la que
la solución de polímero comprende un polímero seleccionado del grupo
constituido por un poli(\alphahidroxiácido), un ácido
polihidroxibutírico, una policaprolactona, un poliortoéster, un
polianhídrido y un policianoacrilato, en la que el polímero está
presente en una concentración de aproximadamente 1% a
aproximadamente 30% en un solvente orgánico, y en la que el
detergente está presente en la mezcla en una relación peso en peso
de detergente a polímero de 0,00001:1 a 0,1:1;
(b) eliminar el solvente orgánico de la
emulsión, para formar dicha micropartícula con superficie
adsorbente; y
(c) adsorber la macromolécula en la superficie
de la micropartícula.
2. Un procedimiento para la producción de una
composición de micropartículas que comprende una micropartícula con
superficie adsorbente a la que se ha adsorbido una macromolécula
biológicamente activa, dicho procedimiento comprendiendo las etapas
(a) a (c) como se definieron en la reivindicación 1 y que además
comprende la etapa de (d) combinar la micropartícula con la
macromolécula adsorbida de la etapa (c) con un excipiente
farmacéuticamente aceptable para formar dicha composición de
micropartículas.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o de
la reivindicación 2, en el que la macromolécula es al menos un
miembro seleccionado del grupo constituido por un producto
farmacéutico, un polinucleótido, un polinucleósido, un polipéptido,
una hormona, una enzima, un mediador de transcripción o traducción,
un intermediario en una vía metabólica, un inmunomodulador, un
antígeno y un adyuvante.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que la macromolécula es un antígeno seleccionado del grupo
constituido por gp120, p24gag, p55gag y antígeno hemaglutinina de
Influenza A.
5. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que la macromolécula es un polinucleótido que codifica gp120.
6. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que la macromolécula es un polinucleótido que codifica un
antígeno tumoral.
7. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, en el que el detergente está
presente en una relación peso en peso de detergente a polímero desde
aproximadamente 0,0001:1 hasta aproximadamente 0,01:1.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en
el que el detergente está presente en una relación peso en peso de
detergente a polímero desde aproximadamente 0,001:1 hasta
aproximadamente 0,01:1.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que el detergente está presente en una relación peso en peso de
detergente a polímero desde aproximadamente 0,005:1 hasta
aproximadamente 0,01:1.
10. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, en el que el detergente es un
detergente aniónico.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que el detergente es un alcohol graso sulfatado.
12. El procedimiento de la reivindicación 10 ó
reivindicación 11, en el que la macromolécula es un polipéptido.
13. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, en el que el detergente es un
detergente catiónico.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que la macromolécula es un polinucleósido.
15. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el polímero comprende un
poli(\alphahidroxiácido) seleccionado del grupo constituido
por poli(L-láctido),
poli(D,L-láctido) y
poli(D,L-láctido-co-glicólido).
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que el polímero comprende
poli(D,L-láctido-co-glicólido).
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en
el que el polímero comprende
poli(D,L-láctido-co-glicólido)
presente en una concentración de aproximadamente 3% hasta
aproximadamente 10%.
18. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la micropartícula es una
partícula con diámetro desde aproximadamente 100 nm hasta
aproximadamente 150 \mum.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que la micropartícula es una partícula con diámetro desde
aproximadamente 200 nm hasta aproximadamente 30 \mum.
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en
el que la micropartícula es una partícula con diámetro desde
aproximadamente 500 nm hasta aproximadamente 10 \mum.
21. Una micropartícula obtenible por un
procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones
1-20.
22. Una micropartícula con una superficie
adsorbente, dicha micropartícula comprendiendo:
un polímero biodegradable;
un detergente iónico; y
una primera macromolécula biológicamente activa
adsorbida en la superficie de la misma, en la que la primera
macromolécula biológicamente activa es al menos un miembro
seleccionado del grupo constituido por un polipéptido, un
polinucleótido, un polinucleósido, un antígeno, un producto
farmacéutico, una hormona, una enzima, un mediador de transcripción
o traducción, un intermediario en una vía metabólica, un
inmunomodulador y un adyuvante.
23. La micropartícula de la reivindicación 22,
que además comprende una segunda macromolécula biológicamente activa
encapsulada dentro de dicha micropartícula, en la que la segunda
macromolécula biológicamente activa es al menos un miembro
seleccionado del grupo constituido por un polipéptido, un
polinucleótido, un polinucleósido, un antígeno, un compuesto
farmacéutico, una hormona, una enzima, un mediador de transcripción
o traducción, un intermediario en una vía metabólica, un
inmunomodulador y un adyuvante.
24. La micropartícula de la reivindicación 23,
en la que la segunda macromolécula biológicamente activa es un
adyuvante.
25. La micropartícula de la reivindicación 24,
en la que la primera macromolécula biológicamente activa es un
antígeno.
26. La micropartícula de la reivindicación 23,
en la que la segunda macromolécula biológicamente activa es un
antígeno.
27. La micropartícula de la reivindicación 26,
en la que la primera macromolécula biológicamente activa es un
adyuvante.
28. La micropartícula de una cualquiera de las
reivindicaciones 22-27, en la que el detergente es
un detergente catiónico.
29. La micropartícula de la reivindicación 28,
en la que la macromolécula es un polinucleótido.
30. La micropartícula de una cualquiera de las
reivindicaciones 22-27, en la que el detergente es
un detergente aniónico.
31. La micropartícula de la reivindicación 30,
en la que el detergente es un alcohol graso sulfatado.
32. La micropartícula de la reivindicación 30 o
reivindicación 31, en la que la macromolécula es un polipéptido.
33. La micropartícula de una cualquiera de las
reivindicaciones 22-32, en la que la primera
macromolécula biológicamente activa es un antígeno seleccionado del
grupo constituido por gp120, p24gag, p55gag y antígeno hemaglutinina
de Influenza A.
34. La micropartícula de una cualquiera de las
reivindicaciones 22-31, en la que la primera
macromolécula biológicamente activa es un polinucleótido que
codifica gp120.
35. La micropartícula de una cualquiera de las
reivindicaciones 22-31, en la que la macromolécula
es un polinucleótido que codifica un antígeno tumoral.
36. La micropartícula de una cualquiera de las
reivindicaciones 22-35, en la que dicho polímero
está seleccionado del grupo constituido por un
poli(\alphahidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, una
policaprolactona, un poliortoéster, un polianhídrido y un
policianoacrilato.
37. La micropartícula de la reivindicación 36,
en la que la micropartícula comprende un
poli(\alphahidroxiácido) seleccionado del grupo constituido
por poli(L-láctido),
poli(D,L-láctido) y
poli(D,L-láctido-co-glicólido).
38. La micropartícula de la reivindicación 37,
en la que la micropartícula comprende
poli(D,L-láctido-co-glicólido).
39. La micropartícula de una cualquiera de las
reivindicaciones 22-38, en la que la micropartícula
es una partícula con diámetro desde aproximadamente 100 nm hasta
aproximadamente 150 \mum.
40. La micropartícula de la reivindicación 39,
en la que la micropartícula es una partícula con diámetro desde
aproximadamente 200 nm hasta aproximadamente 30 \mum.
41. La micropartícula de la reivindicación 40,
en la que la micropartícula es una partícula con diámetro desde
aproximadamente 500 nm hasta aproximadamente 10 \mum.
42. Una composición de micropartículas que
comprende una micropartícula de cualquiera de las reivindicaciones
18-41 y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
43. Una composición de micropartículas que
comprende una micropartícula de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 22-41 o una composición de
micropartículas de la reivindicación 40, que además comprende un
adyuvante.
44. Una micropartícula de las reivindicaciones
22-41 o una composición de micropartículas de la
reivindicación 43, en la que el adyuvante es un miembro seleccionado
del grupo constituido por oligonucleótidos CpG, LTK63, LTR72, MPL y
una sal de aluminio.
45. La micropartícula o composición de
micropartículas de la reivindicación 44, en la que el adyuvante es
una sal de aluminio.
46. Una composición de micropartículas de la
reivindicación 45, en la que la sal de aluminio es fosfato de
aluminio.
47. Una composición de micropartículas que
comprende dos o más micropartículas distintas, cada una teniendo
adsorbida una macromolécula diferente.
48. Una composición de micropartículas de una
cualquiera de las reivindicaciones 42-47 para uso en
terapia.
49. Una composición de micropartículas de una
cualquiera de las reivindicaciones 42-47 para uso en
diagnóstico de una enfermedad.
50. Una composición de micropartículas de una
cualquiera de las reivindicaciones 42-47 para uso en
tratamiento de una enfermedad.
51. Una composición de micropartículas de una
cualquiera de las reivindicaciones 42-47 para uso
como una vacuna.
52. Una composición de micropartículas de una
cualquiera de las reivindicaciones 42-47 para uso en
el aumento de una respuesta inmune.
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