CN1468089A - 用于传送异源核酸的微粒体 - Google Patents

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Abstract

公开了具有吸附表面的微粒体、制备这种微粒体的方法以及它们的用途。所述微粒体含有一种聚合物，如聚(α－羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐等等，是使用阳离子、阴离子或非离子型去污剂形成。还提供了成油滴乳剂的亚微粒体乳剂形式的微粒体，这种微粒体含有可代谢的油和乳化剂。所述微粒体的表面有效地吸附多肽(如抗原)和核酸(如ELVIS载体和其它载体构建物)，含有编码生物学活性大分子(如多肽、抗原)的异源核苷酸序列和佐剂。还提供了刺激免疫反应的方法、使宿主动物针对病毒、细菌或寄生虫感染产生免疫的方法，以及这些微粒体组合物在疫苗中的用途。

Description

用于传送异源核酸的微粒体
                             技术领域
本发明总的涉及药物组合物。具体而言，本发明涉及具有吸附表面的聚合物微粒体或亚微粒体乳剂，在所述表面上，吸附有生物学活性试剂，具体是核酸，如质粒DNA、真核生物层状载体起始系统(ELVIS载体)或RNA载体构建物。本发明还涉及制备所述微粒体和亚微粒体乳剂的方法，以及它们的用途，包括用于诱导免疫反应、疫苗和传送异源核苷酸序列给真核生物细胞和动物。
                               背景
为了获得受控的、胃肠外传递的治疗用化合物，使用了微粒体载体。将这种载体设计为在传递系统中长时间地保持活性剂。微粒体载体的例子包括衍生自聚甲基丙烯酸甲酯聚合物的微粒体载体，以及衍生自聚(丙交酯)(见美国专利3,773,919)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(被称做PLG，见美国专利4,767,628)和聚乙二醇(被称作PEG、见美国专利5,648,095)的微粒体。聚甲基丙烯酸甲酯聚合物是不可降解的，而PLG颗粒则通过酯键的随机非酶促水解成乳酸和羟基乙酸而被生物降解，所生成的乳酸和羟基乙酸沿着正常的代谢途径排泄。
例如，美国专利5,648,095描述了具有胶囊化药物的微球体作为药物传递系统在鼻、口、肺和口腔的传递中的用途。还描述了含有各种多肽生长因子的缓释制剂。见例如，国际出版号WO 94/12158，美国专利5,134,122和国际出版号WO 96/37216。
Fattal等，Journal of Controlled Release 53：137-143(1998)描述了从吸附了寡核苷酸的聚烷基氰基丙烯酸酯(PACA)制备的极小颗粒。
还已使用了具有吸附或嵌入抗原的微粒体载体，试图引发适当的免疫反应。这种载体给免疫系统提供了一个选择性抗原的多个拷贝，并促进局部淋巴结中抗原的引入和保持。这些颗粒可以被巨噬细胞吞噬，并且可以通过细其中划成虚线的键是单键或E/Z-双键，这里在双键位于环上时，该化合物可以E和Z型存在，以及具有手性中心的化合物不但可以(R)-或(S)-型而且还可以作为对映体混合物存在，R1和R2相同或不同，表示氢或低级烷基，x表示具有1至4个碳原子的饱和亚烷基链和y表示具有4至10个碳原子的饱和亚烷基链，这里不包括其中R1和R2表示氢且x+y＝11个碳原子和其中R1表示甲基和R2表示氢且x+y＝8个碳原子的饱和化合物。
低级烷基通常表示具有1至6个碳原子的饱和烃基。例如可提及的是：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、己基和异己基。
优选的基团是氢、甲基和乙基。
具有1至4个碳原子的亚烷基链通常表示亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚丁基。
这里优选的是：亚甲基、亚乙基和亚丁基。
具有4至10个碳原子的亚烷基链通常表示亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基和亚癸基。
这里优选亚丁基、亚辛基和亚壬基。
因此，本发明新的1，4-二噁环烷-2-酮和1，4-二噁环烯-2-酮包括14-至18-元饱和或不饱和、未取代或被低级烷基取代的1，4-二噁环烷-2-酮和1，4-二噁环烯-2-酮。
特别地可提及下列1，4-二噁环烷-2-酮和1，4-二噁环烯-2-酮：
1，4-二噁-(E/Z)-9-环十四烯-2-酮
1，4-二噁环十四烷-2-酮
3-甲基-1，4-二噁-(E/Z)-6-环十五烯-2-酮
3-甲基-1，4-二噁环十五烷-2-酮
1，4-二噁-(E/Z)-6-环十五烯-2-酮
1，4-二噁环十五烷-2-酮
3-甲基-1，4-二噁-(E/Z)-6-环十六烯-2-酮
3-甲基-1，4-二噁环十六烷-2-酮
1，4-二噁-(E/Z)-6-环十六烯-2-酮
1，4-二噁环十六烷-2-酮
1，4-二噁-(E/Z)-7-环十六烯-2-酮
1，4-二噁-(E/Z)-7-环十七烯-2-酮
3-甲基-1，4-二噁-(E/Z)-7-环十六烯-2-酮
3-甲基-1，4-二噁-(E/Z)-7-环十七烯-2-酮
3-甲基-1，4-二噁环十七烷-2-酮。
本发明其中官能团相互紧密邻近的1，4-二噁环烷-2-酮和1，4-二噁环烯-2-酮以理想的方式完成本发明的任务。除在香味上感兴趣的类麝香味的特点外，它们的特点还在于非常好的附着性以及低的阈值。
饱和的在3-位上被甲基取代的1，4-二噁环烷-2-酮，特别是3-甲基-1，4-二噁环十五烷-2-酮和3-甲基-1，4-二噁环十六烷-2-酮具有嗅觉上特别吸引人的气味。它与众不同之处在于其甜的、木香-龙涎香、动物性、性感的和因此非常自然的麝香特点。不饱和3-甲基-1，4-二噁环烯-2-酮的嗅觉上的特征非常类似于饱和化合物，但是其强度较低。为了进行比较，合成类似的3-位上无甲基取代的1，4-二噁环烷-2-酮和1，4-二噁环烯-2-酮。令人惊奇地，在不饱和1，4-二噁环烯-2-酮的情况下，为了嗅觉上所描述的金属味暖香、熨斗味香，性感的、动物性暖香方面却变得无足轻重。与此相反饱和的1，4-二噁环烷-2-酮，这里特别是1，4-二噁环十六烷-2-酮再次以其非常宜人的类天然麝香性而引人注目。
与已知的1，4-二噁环十七烷-2-酮和3-甲基-1，4-二噁环十四烷-2-酮相比，令人惊奇的是，本发明的1，4-二噁环烷-2-酮和1，4-二噁J.Immunol.，1998，160，5898-5906；PCT出版物WO 96/02555；PCT出版物WO 98/16247；PCT出版物WO 98/18810；PCT出版物WO 98/40100；PCT出版物WO 98/55495；PCT出版物WO 98/37919；和PCT出版物WO 98/52581，本文将上述公开的全部内容纳入作为参考。
还已显示，可将阳离子性脂质基的乳剂用作基因载体。参见，例如Yi等，Proc.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater，24：653-654(1997)；Kim等，Proc.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater，25：344-345(1998)；Kim等，Proc.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater，26，#5438(1999)。阳离子亚微粒体乳剂是最近用于传送药物的一种方法，这种乳剂首次显示出携带小分子药物的能力(Elbaz等，1993，Int.J.Pharm.，96 R1-R6)。已证明小的寡聚物〔Teixera等(1999)，Pharm Res，16，30-36〕和质粒DNA〔Yi等(2000)，Pharm Res，17，314-320〕两者都可使用带电表面来稳定结合和保护血清中的寡核苷酸。已显示DOTAP基的乳剂能在体外和体内增强转染(Kim等，同上)。
因而需要能引起Th1细胞应答增加并可用于预防和治疗的佐剂。这种应答有助于治疗如病毒感染，以及使易受病毒感染的个体产生免疫。
美国专利5,814,482和6,015,686公开了真核生物分层载体起始系统(ELVIS载体)，特别是从α病毒基因组(如新德比斯病毒)衍生和构建得到的载体，用于刺激针对抗原的免疫反应、抑制病原体的方法、以及向(尤其是)真核生物的细胞和动物传递异源核苷酸序列。
共同拥有的国际专利申请PCT/US99/17308和美国专利申请09/715,902公开了吸附了大分子的微粒体的制备方法，这些大分子例如药物、多核苷酸、多肽、蛋白质、激素、酶、转录或翻译介质、代谢途径的中间体、免疫调节剂、抗原、佐剂或它们的组合物等。
共同拥有的国际专利申请PCT/US00/03331公开了制备吸附了大分子的亚微粒体乳剂的方法，所述大分子例如药物、多核苷酸、多肽、蛋白质、激素、酶、转录或翻译介质、代谢途径的中间体、免疫调节剂、抗原、佐剂或它们的组合物等。
                          发明综述
本发明者发现，通过使载体构建物吸附到具有吸附表面的聚合物微粒体或亚微粒体乳剂上，可增强核酸，尤其是能表达核酸序列的载体构建物(更具体是含有编码抗原的异源核酸序列的载体构建物，如pCMV载体、ELVIS载体或RNA载体构建物)的各种用途的有效性，这种有效性有利于这些载体构建物和含于该载体构建物的异源核酸序列导入动物细胞中。
如上述国际专利申请PCT/US99/17308中所述，已发明了制备具有吸附表面的能吸附各种大分子的微粒体的方法。在一个实施例中，这些微粒体由聚合物和去污剂组成。本发明的微粒体相对于目前能获得的微粒体，能更有效地吸附这类大分子。
本发明的几个实施例利用从聚合物衍生得到的与去污剂形成的微粒体，这些聚合物如聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、多酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯等等，所述去污剂如阳离子、阴离子或非离子去污剂，这些去污剂可混合使用。本发明者还发现，这些微粒体提供载体构建物(如ELVIS载体，RNA载体构建物)以及病毒抗原的改善的吸附，并提供优良的免疫反应。
如上述国际专利申请PCT/US00/03331所述，已发明了含有具有离子表面活性剂的油滴亚微粒体乳剂的微粒体制品。这种组合物容易吸附大分子，如DNA、蛋白质和其它抗原分子。本发明的几个实施例利用由油滴乳剂衍生得到的微粒体，该乳剂较佳含有可代谢的油和乳化剂，该微粒体较佳是成水包油乳剂形式，基本上所有的油滴的直径都小于1微米，较佳小于250纳米。较佳的是，该组合物处于缺乏任何聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物的状态之下。油较佳是动物油、未饱和的烃类、萜类，如角鲨烯，或者是植物油。该组合物较佳在水性介质中含有0.5-20体积％的油。乳化剂较佳含有非离子去污剂，如聚氧乙烯山梨糖醇单酯、二酯或三酯，或者山梨糖醇单酯、二酯或三酯、较佳的是，该组合物含有约0.01-5重量％的乳化剂。
因此，在一些实施例中，本发明组合物的颗粒部分是具有吸附表面的微粒体，其中该微粒体含有选自聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、多酐、聚氰基丙烯酸酯的聚合物。
在其它一些实施例中，本发明组合物的颗粒部分是亚微粒体乳剂，它含有与离子型去污剂配置而成的油滴乳剂。
在其它一些实施例中，所述微粒体还含有能表达核酸序列(如吸附于该微粒体表面上的选择的ELVIS载体或RNA载体构建物)的载体构建物，该载体构建物含有编码多肽、蛋白质、激素、酶、转录或翻译介质、代谢途径中间物、免疫调节子、抗原、佐剂或它们的组合等等的异源核苷酸序列。
在其它实施例中，本发明涉及含有核酸、较佳是能表达吸附于本发明的微粒体上的核酸序列的载体构建物(如选择的pCMV载体、ELVIS载体或RNA载体构建物)和药学上可接受的赋形剂的微粒体组合物。
在其它实施例中，本发明涉及生产吸附了核酸、较佳是能表达核酸序列的载体构建物(如ELVIS载体或RNA载体构建物)的微粒体的方法，该方法包括：
(a)将聚合物溶液与阴离子、阳离子或非离子去污剂混合，形成聚合物/去污剂混和物；其中，所述聚合物溶液含有选自聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯的聚合物，该聚合物的浓度为约占有机溶剂的1-30％，该去污剂与聚合物的比值为0.001-10(w/w)；
(b)分散所得聚合物/去污剂混合物；
(c)除去有机溶剂；
(d)回收微粒体；
(f)将ELVIS载体或RNA载体构建物吸附到微粒体的表面上，其中所述ELVIS载体或RNA载体构建物含有编码多肽、蛋白质、激素、酶、转录或翻译介质、代谢途径中间物、免疫调节子、抗原、佐剂或它们的组合等等的异源核苷酸序列。
较佳的是，在除去有机溶剂之前，先将该聚合物/去污剂混合物乳化形成乳剂。
在其它实施例中，本发明涉及由上述方法产生的微粒体。更佳的是，产生还含有药学上可接受的赋形剂的微粒体组合物。
在其它实施例中，本发明涉及一种传送异源核苷酸序列给脊椎动物的方法，该方法包括向脊椎动物对象给予上述任何一种组合物。
在额外的实施例中，本发明涉及一种在脊椎动物对象中引起细胞免疫反应的方法，该方法包括向所述脊椎动物对象给予治疗有效量的吸附于本发明的微粒体上的选择异源核苷酸序列。
在其它实施例中，本发明涉及一种免疫法，该方法包括向脊椎动物对象给予治疗有效量的上述任一种微粒体组合物。该组合物可任选地含有游离的大分子，还可任选地含有佐剂(包括铝盐，如磷酸铝)，或者含有至少一个CpG基序的寡核苷酸。
在几个优选的实施例中。所述微粒体由聚(α-羟基酸)形成，较佳的是由聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)形成，最佳是由聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)形成。
先前有限描述的各个吸附微粒体还可任选地含有包埋于其中或存在于自由溶液中的大分子。因此，本发明包括各种组合，其中核酸分子被吸附在微粒体上，其它核酸分子被俘获或吸附。此外，本发明的微粒体可具有一种以上核酸吸附于其上，以及其它的抗原大分子吸附于其上。此外，微粒体中可具有几种核酸和/或其它抗原大分子包埋于其中。
在其它优选的实施例中，以上述亚微粒体乳剂的形式制备所述微粒体。
本发明还涉及含有免疫刺激量的核酸(如能表达核酸序列的载体构建物，如选择的ELVIS载体或RNA载体构建物，其中ELVIS载体或RNA载体构建物的异源核酸序列部分可编码抗原)和本文所述的免疫刺激量的佐剂组合物的免疫原性组合物。在本发明的一些实施例中，所述免疫原性组合物含有CpG寡核苷酸以及吸附于微粒体上的核酸。吸附的大分子本身较佳是编码抗原性多肽的ELVIS载体或RNA载体构建物。
在本发明一些优选的实施例中，抗原性多肽从以下的病毒获得：C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)、疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、流感病毒(flu)、狂犬病毒。较佳的是，抗原性多肽选自HSV糖蛋白gD、HIV糖蛋白gp120、HIV糖蛋白gp140、HIV p55 gg，以及从pol与tat区域获得的多肽。在本发明其它优选的实施例中，抗原性多肽从细菌得到，如霍乱、白喉、破伤风、链球菌(如B链球菌)、百日咳、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria Meningitidis)(如B型脑膜炎)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)、幽门螺旋菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)。在本发明其它优选的实施例中，抗原性多肽从寄生虫获得，如疟疾寄生虫。
佐剂组合物可包括如铝盐。或者，佐剂组合物可包括含有至少一个CpG基序的寡核苷酸。佐剂组合物还含有产生正电荷乳剂的任选组分。寡核苷酸较佳含有至少一个硫代磷酸酯键或肽核酸键。在本发明优选的实施例中，寡核苷酸含有选自SEQ ID NO：1-28的核苷酸序列。在本发明的其它优选实施例中，寡核苷酸含有在其5′端直接连接两个嘌呤、在其3′端直接连接两个嘧啶的CpG基序。在本发明其它优选的实施例中，寡核苷酸含有选自SEQ ID NO：19-28的核苷酸序列。最佳的序列是SEQ ID NO：28。在本发明的一些优选实施例中，佐剂组合物还含有分离的免疫刺激剂，该刺激剂优选选自铝盐、细菌细胞壁成分和胞壁酰肽。佐剂组合物本身可以是第二种微粒体的形式。所述第二种微粒体可吸附和/或俘获各种核酸和/或抗原性多肽，或者其它抗原性大分子。此外，免疫原性组合物可含有存在于溶液中的游离核酸。
本发明还涉及在宿主动物中刺激免疫反应的方法，该方法包括向该动物给予有效诱导免疫反应的量的本文所述免疫原性组合物。所述宿主动物较佳是哺乳动物，更佳是猕猴，仍更佳是人。
本发明还涉及使宿主动物针对病毒、细菌或寄生虫产生免疫的方法，该方法包括向所述动物给予其量能有效诱导保护性反应的本文所述免疫原性组合物。所述宿主动物较佳是哺乳动物，更佳是猕猴，还更佳是人。
本发明还涉及增加宿主动物中的Th1免疫反应或CTL反应或淋巴细胞增殖或细胞因子生产的方法，该方法包括向所述动物给予其量能有效诱导Th1免疫反应或CTL反应或淋巴细胞增殖或细胞因子生产的本文所述的免疫原性组合物。所述宿主动物较佳是哺乳动物，更佳是猕猴，还更佳是人。
本发明还涉及增强宿主动物中的免疫反应的方法，该方法包括：先给予所述动物其量能有效引起免疫反应的含有编码第一抗原的异源核酸序列的吸附于微粒体上的大分子(如质粒DNA、如pCMV或ELVIS载体，或者RNA载体构建物)。接着给予该动物第二种抗原。
这些实施例中的第一种抗原和第二种抗原可以相同或不同，较佳是相同。较佳的抗原包括细菌和病毒抗原，如HIV抗原(如gp120、gp140、gp160、p24gag和p55gag)、C型肝炎病毒抗原、A型流感病毒抗原、B型脑膜炎细菌抗原和B型链球菌细菌抗原。第二种抗原较佳吸附在本文所述的微粒体上，或者与佐剂如MF59一同给予。如果需要，该大分子还可以与佐剂一同给予。在一些优选的实施例中，该大分子在给予该第二抗原之前可给予2次或多次，而该第二抗原也可以给予2次或多次。
根据一个特殊的实施例：(1)该大分子(a)在初次给予时给予；(b)在初次给予后1-8周的时间范围内给予；(c)在初次给予后4-32周的时间范围内给予；和(2)第二抗原(a)在初次给予后8-50周的时间范围内给予；和(b)在初次给予后8-100周的时间范围内给予。
可采用任何已知方法传送本发明微粒体组合物，包括直接注射(如皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内)，还可使用电穿孔来增强这种传送(参见，如美国专利申请09/499023，本文将该文的全部公开内容纳入作为参考)。电穿孔向细胞施加短的电脉冲，以增加细胞膜的渗透性，从而促进细胞摄取DNA。最近已发现，对体内组织施加电场明显增加了DNA的摄取和基因表达(Mathiesen，I.，1999，Gene Therapy，6：508)。作为体内电穿孔的目标的组织有皮肤、肝、肿瘤和肌肉。对于DNA疫苗的应用，Widera等已显示，体内电穿孔大大增强了DNA疫苗在小鼠、豚鼠和兔子中的效力(Widera，G.等，2000，J.Immunol.，164：4635)。
上述实施例的ELVIS载体通常是含有在真核细胞中起作用的启动子、其转录产物是RNA载体构建物(如α病毒RNA载体复制子)的cNDA序列和3′终止区域的DNA分子。该RNA载体构建物较佳含有从小RNA病毒、披膜病毒、黄病毒、冠形病毒、副粘病毒、黄热病毒或α病毒(新德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒或罗斯河病毒)得到的RNA基因组，更佳是α病毒基因组，该基因组已通过用编码感兴趣的基因产物的选定的异源核酸序列取代一个或多个结构蛋白基因而产生变异。本发明的RNA载体构建物通常从DNA模板体外转录获得。
在阅读了本文的公开内容后，本领域熟练的技术人员将易于理解本发明的这些和其它方面。
                       附图的简单描述
图1提供编码变异的HIV-1 p55gag多肽的DNA序列(SEQ ID NO：63)。
图2提供编码变异的HIV-1 p55gag多肽的DNA序列(SEQ ID NO：64)。
图3提供编码变异的HIV-1包膜多肽的DNA序列(SEQ ID NO：65)。
图4提供编码变异的HIV-1包膜多肽的DNA序列(SEQ ID NO：66)。
图5提供编码变异的HIV-1 p5gag多肽的DNA序列(SEQ ID NO：67)。
图6提供编码变异的HIV-1 p55gag多肽的DNA序列(SEQ ID NO：68)。
                        发明的详细描述
本发明以吸附了核酸分子〔较佳是能表达核酸序列的载体构建物，更佳是含有编码抗原的异源核酸序列的载体构建物，如pCMV载体、ELVIS载体或RNA载体构建物)的微粒体引起增强的免疫反应这一惊人发现为基础。此外，吸附了核酸分子的微粒体(如吸附了pCMV载体、ELVIS载体或RNA载体构建物的微粒体)和佐剂的混合物也可用于引起增强的免疫反应。
本发明还以含有编码抗原的核酸序列的载体构建物(如pCMV载体、ELVIS载体或RNA载体构建物)与随后给予的抗原能引起增强的免疫反应的惊人发现为基础。
除非另外说明，否则本发明的实施将使用，本领域技术人员所熟知的化学、聚合物化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学等常规方法。这些技术在文献中有全面的解释。见如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)；Handbook ofExperimental Immunology，I-IV卷，(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，Blackwell科学出版社)，Sambrook，等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，1989)；Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(Birdi，K.S.编，CRC Press，1997)和Seymour/Carraher’s Polymer Chemistry(第四版，MarcelDekker Inc.，1996).
本文引用的所有出版物、专利和专利出版物，不论是上文或下文中的，全部引入以作参考。
本说明书和附带的权利要求书中使用的单数形式“一个”和“该”包括其复数形式，除非文中另外明确指出。因此，例如，术语“微粒体”指一个或很多微粒体，等等。
A. 定义
描述本发明时将使用下列术语，定义如下：
除非另外说明，本文所用的所有百分比和比值都为重量比。
本文所用的术语“微粒体”指直径为约10nm到150μm的微粒体，更佳是直径约为200nm到30μm，最佳是直径约为500nm到10μm。较佳的是，微粒体具有允许肠胃外或粘膜给予而不阻塞针头和毛细管的直径。微粒体的大小可通过本领域熟知的技术，如光子相关光谱、激光衍射和/或扫描电镜容易地测定。术语“颗粒”也可使用于指这里所定义的微粒体。微粒体还指本文所述的亚微粒体乳剂组合物。
本文所使用的聚合物微粒体是由无菌、无毒和可生物降解的材料制得的。这类材料包括(不仅限于此)聚(α-羟基酸)、多羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、多酐、PACA、和聚氯基丙烯酸酯。较佳的是，本发明使用的微粒体是衍生自聚(α-羟基酸)，特别是由聚(丙交酯)(“PLA”)或D，L-丙交酯和乙交酯或羟基乙酸的共聚物，如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”或“PLGA”)，或D，L-丙交酯和己酸内酯的共聚物衍生得到的聚合物微粒体。这些聚合物微粒体可衍生自任何各种聚合起始材料，这些材料具有各种分子量，就共聚物如PLG而言，为各种丙交酯与乙交酯的比值，聚合起始材料的选择将是一个大问题，部分依赖于共给予的大分子。下面更全面地讨论这些参数。或者，本发明的微粒体包含于亚微粒体乳剂中。
本文所用词组“油滴乳剂”指含有可代谢的油和乳化剂的乳剂。术语“亚微粒体乳剂”在本文中指含有大小约为10-1000nm的液滴的本发明油滴乳剂。
术语“微粒体”在本文中可指本文所述的聚合物微粒体或者亚微粒体乳剂组合物。
本文所用的术语“去污剂”包括表面活性剂、分散剂、悬浮剂和乳剂稳定剂。阴离子去污剂包括，但不仅限于此，SDS(十二烷基硫酸钠)，SLS(月桂基硫酸钠)，DSS(二磺基琥珀酸酯)、硫酸脂肪化醇等。阳离子去污剂包括，但不仅限于，溴棕三甲铵(十六烷基三甲基溴化铵或“CTAB”)、氯化苯甲烷铵(benzalkonium chloride)、DDA(二甲基2-十八烷基溴化铵)、DOTAP(二油酰基-3-三甲基铵-丙烷)等等。非离子去污剂包括，但不仅限于，PVA、聚维酮(也称做聚乙烯吡咯烷酮或PVP)、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯化乙二醇单醚、聚氧乙烯化烷基苯酚、聚羟亚烃等。
术语“ζ电势”在本文中指在所有的固体和液体界面间存在的电势，即带电胶体颗粒周围的离子扩散层之间的电势。可采用本领域周知的技术，由电泳淌度(即胶体颗粒在与要测量的物质接触的带电电极之间运行的速率)算得ζ电势。
这里所用的术语“大分子”是指(不限于此)药物、多核苷酸、多肽、激素、酶、转录和翻译介质、代谢途径的中间体、免疫调节剂、抗原、佐剂或他们的组合物。下面将更详细地描述本发明使用的具体的大分子。
术语“药物”指生物活性化合物，如抗生素、抗病毒剂、生长因子、激素等等，将在下文做更详细讨论。
术语“佐剂”指辅助或调节药物作用的任何物质，包括但不仅限于免疫学佐剂，它使对抗原的免疫反应增强或免疫反应多样化。
“多核苷酸”是一种核苷酸聚合物，它典型地编码生物活性(如免疫性的或治疗性的)蛋白质或多肽。依据多核苷酸编码的多肽的性质，一个多核苷酸包括的核苷酸可少到10个，例如多核苷酸编码抗原。另外，“多核苷酸”可包括双链和单链序列，并涉及(但不仅限于)病毒cDNA、原核或真核生物mRNA、病毒的基因组RNA和DNA序列(例如RNA和DNA病毒以及逆转录酶病毒)或原核生物DNA，特别是合成的DNA序列。该术语还包括任何已知的DNA和RNA的碱基类似物的序列。该术语还包括对天然序列的变异，如缺失，添加和替换(自然情况下通常是保守的)，较佳是使核酸分子编码治疗用的或抗原性蛋白质。这些变异可以是蓄意的，如通过定点诱变，或偶然突变，如通过产生抗原的宿主的突变。
术语“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物，并不限于最小长度的产物。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等都包括在此定义中。该定义包含全长蛋白质及其片段。该定义还包括对天然序列的变异，如缺失，添加和替换(自然情况下通常是保守的)，较佳是使蛋白质保持引起免疫反应的能力或对所给予的对象具有治疗效果。
“抗原”意指一个分子，该分子含有一个或多个表位，当根据本发明抗原存在时，所述表位能够刺激宿主免疫系统产生细胞抗原-特异性免疫反应，或体液抗体反应。抗原本身或当与另一分子结合存在时，能够引起细胞或体液应答。正常地，一个表位包括约3-15个，较佳地约5-15个，更佳地7-15个氨基酸。给定蛋白质的表位可以用本领域熟知的各种表位定位技术进行鉴别。例如，可参见Methods in Molecular Biology，66卷中的Epitope MappingProtocols(Glenn E.Morris编，1996)Humana Press，Totowa，New Jersey。例如，可通过如在固体支持物上同时合成大量的肽(该肽对应于蛋白质分子的一部分)，并在肽还结合在支持物上时，使肽与抗体反应而测定线性表位。本领域已知这些技术，并描述在如美国专利4,708,871；Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：3998-4002；Geysen等(1986)Molec.Immunol.23：709-715，本文将它们的全部内容引用以做参考。类似地，通过测定氨基酸的空间构象，如使用X-射线晶体学和二维核磁共振，可容易地鉴别出构象表位。例如，可参见Epitope Mapping Protocols，同上。
本文术语“抗原”是指双亚基的抗原，也就是从其天然所结合的完整机体、以及被杀死的、减毒的或者灭活的细菌、病毒、寄生虫或其它微生物中分离得到的抗原。抗体如抗-独特型抗体或其片段，和可模拟抗原或抗原决定子的合成肽模拟型(mimotope)也包括在本文的抗原定义之中。类似地，表达治疗性的或免疫遗传蛋白、或体内的抗原决定子(如在基因治疗和核酸免疫应用中)的寡聚核苷酸或多核苷酸也包括在本文的抗原定义中。
另外，为了本发明的目的，抗原可以衍生自任何一些已知的病毒、细菌、寄生虫和真菌，以及任何各种肿瘤抗原。并且，为了本发明的目的，“抗原”指一种蛋白质并包括对其天然序列的变异，如缺失、添加和替换(通常自然条件下是保守的)，只要该蛋白质保持引发免疫反应的能力。这些变异可以是故意的，通过定点突变或偶然突变如通过产生抗原的宿主突变实现。
对抗原或组合物的“免疫反应”是在对象的体液和/或细胞免疫反应中产生的针对存在于感兴趣的组合物中的分子的反应。为了本发明的目的，“体液免疫反应”指抗体分子介导的免疫反应，而“细胞免疫反应”是由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫反应。细胞免疫的一个重要方面涉及由溶细胞性T细胞(“CTL”)引起的抗原特异性反应。CTL对肽抗原具有特异性，该抗原与由主要组织相容性复合物(MHC)编码并在细胞表面表达的蛋白质结合并递呈。CTL帮助诱导和促进细胞内微生物的细胞内破坏，或者感染这种微生物的细胞溶解。细胞免疫的另一个方面涉及由辅助T细胞引起的抗原特异性反应。辅助T细胞协助刺激非特异性效应细胞对抗那些在其表面上具有与MHC分子结合的肽抗原的细胞的功能，并且集中于此活性上。“细胞免疫反应”还指细胞因子、趋化因子和由活化的T-细胞和/或其它白细胞产生(包括衍生自CD4+和CD8+T-细胞)的其它这类分子的生产。
一种组合物，例如一种免疫原性组合物，或引起细胞免疫反应的疫苗，可以通过在细胞表面呈递与MHC分子结合的抗原而使脊椎动物对象敏感。细胞介导的免疫反应就在其表面呈递抗原的细胞中发生，或者在接近的位置上发生。另外，可以产生抗原特异性T-淋巴细胞，以使免疫宿主将来得到保护。
可通过一些分析测定具体的抗原或组合物刺激细胞介导的免疫反应的能力，如通过淋巴增殖(淋巴细胞活化)分析，CTL细胞毒性细胞分析，通过在一个致敏的对象体内分析对抗原特异的T-淋巴细胞，或者通过测量T细胞应答抗原的重复刺激而产生的细胞因子。这种分析在本领域是熟知的。见如Erickson等，J.Immunol.(1993)151：4189-4199；Doe等，Eur.J.Immunol.(1994)24：2369-2376；以及下面的实施例。
因此，本文所使用的免疫反应可以是刺激CTL的生产的反应，和/或是刺激辅助T-细胞的生产或活化的反应。感兴趣的抗原也可引发抗体介导的免疫反应。所以，免疫反应可以包括一个或多个以下效果：B-细胞引起的抗体的生产，和/或抑制性T细胞和/或特异性地针对一种抗原或存在于感兴趣的组合物或疫苗中的抗原的γδT细胞的活化。这些反应可用于中和感染，和/或调节抗体-补体，或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，以给免疫的宿主提供保护。可以用本领域熟知的标准免疫分析和中和分析测定这些反应。
含有吸附于微粒体上的选择抗原的一种组合物，当它拥有的引起免疫反应的能力比不与微粒体一起传递的等量抗原引起的免疫反应能力强的时候，显示“增强的免疫原性”，因此，一种组合物可以显示“增强的免疫原性”是因为由于抗原吸附到微粒体上而具有更强的免疫原性的缘故，或者是因为为了在所给予的对象中引发免疫反应而需要使用低剂量的抗原的缘故。通过给予动物微粒体/抗原组合物和抗原对照，然后采用本领域所熟知的两种正在使用的标准分析方法(如放射免疫分析和ELISA)比较抗体的滴度，从而可测定这种增强的免疫原性。
本文术语，所给组合物的“有效量”或“药物学有效量”是指无毒但足以提供所需反应(如免疫学反应)和产生相应的治疗效果的组合物的量，或者在传递治疗蛋白质的情况下，足以影响对象的治疗效果的组合物的量，如下文所述。下文将要指出的是，所需的确切量随患者不同而不同，依据它们的物种、年龄、对象的总体条件、要治疗的病症的严重程度、以及感兴趣的具体大分子、给药的方式等等。在任何个别的案例中合适的“有效”量可以由本领域的普通技术人员使用常规实验方法进行测定。
“脊椎动物对象”是指科达(cordata)亚门的任何成员，包括但不限于哺乳动物如牛、绵羊、猪、山羊、马和人；家养动物如狗和猫；和鸟类，包括驯化的、野生的和比赛鸟类如公鸡和母鸡包括小鸡、火鸡和其它鸡形目鸟类。该术语不指定具体年龄，因此，包括成体和新生的动物。
“药学上可接受的”或“药理学可接受的”指非生物学的或不理想的材料，即材料可以和微粒体制剂一起给予个体，而不会在个体体内引起不理想的生物反应，或与组合物中含有的任何其它成分进行有害的相互作用。
术语“赋形剂”指通常在完成剂型中提供的物质，包括赋形药、粘合剂、崩散剂，填充剂(稀释剂)、滑润剂、助流剂(流动增强剂)、浓缩助剂、颜料、甜味剂、防腐剂、悬浮/分散剂、膜形成器/包衣、调味剂和印刷墨水。
“生理学pH”或“生理学范围内的pH”指约7.2-8.0范围内(包括本数)的pH，更典型为约7.2-7.6范围内(包括本数)的pH。
本文所用的“治疗”指任何(i)感染和再感染的预防，如传统疫苗中进行的，(ii)症状的减少或消除，和(iii)所怀疑的病原体或病症的基本或完全消除。治疗可以是预防性的(感染前)或治疗性的(感染后)。
本文使用的短语“核酸”指DNA、RNA，或它们形成的嵌合体。
本文使用的短语“含有至少一个CpG基序的寡聚核苷酸”指含有至少一个CpG二核苷酸的多核苷酸。含有至少一个CpG基序的寡聚核苷酸可含有多个CpG基序。这些寡聚核苷酸在本领域中也被称作“CpG寡聚核苷酸”。本文所用的短语“CpG基序”指胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷依次连接的寡聚核苷酸的二核苷酸部分。在胞嘧啶的位置上可用5-甲基胞嘧啶替代。
本文中“α病毒RNA载体复制子”、“RNA载体复制子”、“RNA载体构建物”和“复制子”指在靶细胞中能指导自身进行扩增或体内自我复制的RNA分子。α病毒衍生的RNA载体复制子应含有如下顺序的元件：复制所需的顺式5’病毒序列(也称作5’CSE)，表达时编码生物活性α病毒非结构蛋白(如nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)的序列，复制所需的顺式3’病毒序列(也称作3’CSE)，和聚腺苷酸化序列。α病毒衍生的RNA载体复制子还可含有病毒亚基因组“连接区域”启动子、来自一个或多个结构蛋白基因或其部分的序列、具有足够大小以产生活病毒的外部核酸分子，以及要表达的异源序列。
本文中“真核生物分层载体起始系统”、“ELVIS”或“ELVIS载体”指能指导感兴趣的序列或基因表达的系统。真核生物分层载体起始系统应包含：能够在体内(即细胞内)启动cDNA合成RNA的5’启动子，和在真核细胞内能够指导其自身复制并表达异源序列的病毒载体序列。在较佳的实施例中，核酸载体序列是α病毒衍生序列，含有能够启动α病毒RNA的转录的5’序列(也称作5’CSE)，以及当表达时编码生物活性α病毒非结构蛋白(即nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)的序列，和α病毒RNA聚合酶识别序列(也称作3’CSE)。另外，载体序列可包括病毒亚基因组“连接区域”启动子、从一个或多个结构蛋白基因或其部分得到的序列、具有足够大小以允许最佳扩增的外部核酸分子、要表达的异源序列、用于插入异源序列的一个或多个限制位点，以及聚腺苷酸化序列。真核生物分层载体起始系统还可包括剪接识别序列、催化性核酶加工序列、核输出信号和转录终止序列。
“α病毒载体构建物”指能够指导感兴趣的序列或基因表达的装配物。这种载体构建物通常含有能够启动α病毒RNA的转录的5’序列(也称作5’CSE)、以及当表达时编码生物活性α病毒非结构蛋白(即nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)的序列、和α病毒RNA聚合酶识别序列(也称作3’CSE)，以及聚腺苷酸序列。另外，这种载体构建物可包括病毒亚基因组“连接区域”启动子、从一个或多个结构蛋白基因或其部分得到的序列、具有足够大小以允许产生活病毒的外部核酸分子、体外或体内能够启动从cDNA合成病毒RNA的5’启动子、要表达的异源序列，以及用于插入异源序列的一个或多个限制位点。
本文使用的短语“载体构建物”通常指能指导感兴趣的核酸序列或基因的表达的任何装配物。载体构建物一般包括转录启动子/增强子或位点限定元件，或者用其它方法(如交替剪接、核RNA输出、信使RNA的翻译后修饰或蛋白质的转录后修饰)控制基因表达的其它元件。此外，载体构建物通常包括在转录时操作性连接于感兴趣的序列或基因的序列，起到翻译启动序列的作用。载体构建物还可任选地含有指导多腺苷酸化的信号、可选择的标记物，以及一个或多个限制性位点和翻译终止序列。此外，如果将载体构建物放置到逆转录病毒中，该载体构建物可含有包装的信号、长末端重复序列(LTR)，以及适用于所使用的逆转录病毒的正链和反链引物结合位点(如果还未存在的话)。载体构建物的例子包括ELVIS载体(该载体含有RNA载体构建物的cDNA补体)、RNA载体构建物本身、α病毒载体构建物、CMV载体构建物等。
载体构建物的一种特殊类型是“质粒”，质粒指环状的双链DNA，它与可连接的额外DNA片段形成环状。下面描述的特殊的质粒包括pCMV和pSINCP。
根据本发明的一些实施例，提供了治疗(包括预防性和/或治疗性免疫)宿主动物使其抵抗病毒、真菌、支原体、细菌或原生动物感染以及肿瘤的组合物和方法。本发明的方法可用于赋予哺乳动物(较佳是人)以预防性的和/或治疗性的免疫。本发明的方法还可在除人以外的哺乳动物上实施，包括生物医学研究领域使用的哺乳动物。
B. 总的方法
1. 吸附了大分子的聚合物微粒体
聚合物微粒体，包括PLA和PLG微粒体，能有效地吸附生物活性大分子。此外，这些微粒体吸附各种分子，包括带电的和/或庞大的大分子。因此，可将用于本发明的大分子/微粒体用作传送系统，用于传送生物活性成分，以治疗、预防和/或诊断各种疾病。
本发明可用于通过与微粒体结合传送各种各样的大分子，包括但不仅限于药物如抗生素和抗病毒剂、非类固醇抗炎药、止痛剂、血管扩张剂、心血管药物、治精神病的药、精神抑制药、抗抑郁剂、抗帕金森症药、β-受体阻断剂、钙通路阻断剂、舒缓激肽抑制剂、ACE-抑制剂、血管扩张剂、促乳素抑制剂、类固醇、激素对抗剂、抗组胺剂、血清素对抗剂、肝素、化疗剂、抗肿瘤药和生长因子，包括但不仅限于PDGF、EGF、KGF、IGF-1和IGF-2、FGF、编码治疗性或免疫原性蛋白的多核苷酸、用于疫苗的免疫原性蛋白质及其表位，包括肽激素的激素，如胰岛素、胰岛素原、生长激素、GHRH、LHRH、EGF、生长激素抑制素、SNX-111、BNP、促胰岛素、ANP、FSH、LH、PSH和hCG、性腺类固醇激素(雄激素、雌激素和黄体酮)、甲状腺-刺激激素、抑制素、胆囊收缩素、ACTH、CRF、强啡肽、内啡肽、内皮素、纤连蛋白片段、甘丙肽、胃泌素、促胰岛素、胰高血糖素、GTP-结合蛋白片段、鸟苷蛋白、白细胞激肽、爪蟾抗菌肽、肥大细胞脱粒肽、皮抑菌肽(dermaseptin)、系统素、神经调节肽、神经降压肽、胰抑制素、胰多肽、P物质、促胰液素、胸腺素等，酶、转录或翻译介质、代谢途径的中间体、免疫调节剂，如各种细胞因子，包括白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4，和γ-干扰素、抗原和佐剂。
在本发明一些优选实施例中，大分子是核酸，更佳是载体构建物，如ELVIS载体或RNA载体构建物。本发明的具体的优越性是在脊椎动物对象中，吸附了ELVIS载体的微粒体产生细胞-介导的免疫反应的能力。本发明的抗原/微粒体针对选择性抗原引发细胞介导的免疫反应的能力，提供了抵抗各种各样的病原体感染的强有力的工具。因此，本发明的抗原/微粒体可以掺和入疫苗组合物。
所以，除了常规的抗体反应，本文描述的系统还可以提供如表达的抗原与I类MHC分子的结合，这样就可以产生(mount)针对感兴趣的抗原的体内细胞免疫反应，这种反应刺激CTL的生产，以在将来识别该抗原。另外，通过辅助T-细胞该方法可引发抗原特异性反应。因此，对于需要细胞和/或体液免疫反应的情况，本发明的方法将使用任何大分子，较佳是衍生自可诱导抗体的病毒病原体的抗原、T-细胞辅助表位和T-细胞细胞毒素表位。这些抗原包括但不仅限于由人和动物病毒编码的抗原，对应于结构蛋白或非结构蛋白。
本发明的微粒体对于针对通常引起弱的免疫反应的细胞内病毒的免疫特别有用。例如，本发明将可用于刺激针对来自疱疹病毒家族的各种蛋白质的免疫反应，这些蛋白质包括衍生自单纯疱疹病毒(HSV)类型1和2的蛋白质，如HSV-1和HSV-2糖蛋白gB、gD和gH；衍生自水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)的抗原，包括CMV gB和gH；以及衍生自其它人疱疹病毒的抗原，如HHV6和HHV7〔例如，可参见Chee等，Cytomegaloviruses(J.K.McDougall编，Springer-Verlag 1990)125-169页，一篇关于巨细胞病毒蛋白质编码内容的综述；McGeoch等，J.Gen.Virol.(1988)69：1531-1574，关于各种HSV-1编码蛋白质的讨论；美国专利5,171,568，关于HSV-1和HSV-2 gB和gD蛋白及其编码基因的讨论；Baer等Nature(1984)310：207-211，EBV基因组中蛋白质编码序列的识别；和Davison和Scott，J.Gen.Virol.(1986)67：1759-1816关于VZV的综述〕。
肝炎病毒家族〔包括肝炎A病毒(HAV)、肝炎B病毒(HBV)、肝炎C病毒(HCV)、δ肝炎病毒(HDV)、肝炎E病毒(HEV)、和肝炎G病毒(HGV)〕的抗原也可以方便地用于本发明描述的方法。作为例子，HCV的病毒基因组序列是已知的，获得序列的方法也是已知的。见如，国际出版物WO89/04669；WO90/11089；和WO90/14436。HCV基因组编码几种蛋白质，包括E1(也称E)和E2(也称E2/NS1)和N-末端核壳蛋白(称为“核心”)〔见Houghton等，Hepatology(1991)14：381-388，关于HCV蛋白(包括E1和E2)的讨论〕。这些蛋白质中的每一种以及它们的抗原片段将在本发明的组合物和方法中使用。
类似地，来自HDV的δ-抗原序列是已知的(见如美国专利5,378,814)并且该抗原也可方便地用于本发明的组合物和方法。另外，衍生自HBV的抗原，如核心抗原、表面抗原(sAg)、以及前表面(presurface)序列(pre-S1和pre-S2，以前称作pre-S)，以及上述的组合，如sAg/pre-S1、sAg/pre-S2、sAg/pre-S1/pre-S2和pre-S1/pre-S2将在本文所用。见如“HBV疫苗-从实验室到获得许可——一个案例的研究”，Mackett，M.和Williamson，J.D.，HumanVaccines and Vaccination，159-176页，关于HBV结构的讨论；美国专利4,722,840，5,098,704，5,324,513，本文将它们的全部内容引入以作参考；Beames等，J.Virol.(1995)69：6833-6838，Birnbaum等，J.Virol.(1990)64：3319-3330；和Zhou等，J.Virol.(1991)65：5457-5464。
衍生自其它病毒的抗原也可用于本公开的组合物和方法中，例如，但不限于此，来自小RNA病毒科成员的蛋白质(如脊髓灰质炎病毒等)；杯状病毒科；披盖病毒科(如：风疹病毒、登革病毒等)；黄病毒科；冠形病毒科；呼肠弧病毒科；双RNA病毒科；弹状病毒科(如狂犬病毒等)；线状病毒科；副粘病毒科(如流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸合胞病毒等)；正粘病毒科(如流感病毒A、B、C型等)；本雅病毒科；沙粒病毒科；反转录病毒科〔HTLV-I；HTLV-II；HIV-1(也称作HTLV-III，LAV，ARV，hTLR等)〕，包括但不仅限于，来自分离物HIVIIIb，HIVSF2，HIVLAV，HIVLAI，HIVMN)的抗原；HIV-1CM235，HIV-1US4；HIV-2；尤其是猿免疫缺陷病毒(SIV)。另外抗原也可衍生自人乳头瘤病毒(HPV)和蜱媒脑炎病毒。见如Virology，第3版(W.K.Joklik编，1988)；Fundamental Virology，第2版(B.N.Fields和D.M.Knipe编，1991)，关于这些和其它病毒的描述。
更具体地说，已知和报道了来自任何上述HIV分离物的gp120或gp140包膜蛋白，包括各种HIV遗传亚类成员〔见如Myers等，Los Alamos Database，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，New Mexico(1992)；Myers等，Human Retroviruses and Aids，1990，Los Alamos，New Mexico：Los AlamosNational Laboratory；和Modrow等J.Virol.(1987)61：570-578，关于HIV分离物的多样性的包膜序列的比较)，衍生自任何这些分离物的抗原将用于本方法。另外，本发明同样适用于衍生自任何各种HIV分离物的其它免疫原性的蛋白质，包括任一不同的胞膜蛋白如gp160和gp41，gag抗原如p24gag和p55gag，以及衍生自pol和tat区域的蛋白质。任何这些蛋白质和抗原还可改变，以用于本发明。例如图1、2、5和6提供了编码修饰的gag抗源的DNA序列(SEQ ID No：63，64，67和68)，图3和4提供了编码修饰的包膜抗原的DNA序列(SEQ DI No：65和66)。
流感病毒是本发明特别使用的病毒的又一个例子。具体地说，对于免疫反应的产生，特别感兴趣的是A型流感病毒的包膜糖蛋白HA和NA。已鉴别了大量的A型流感病毒的HA亚类(Kawaoka等，Virology(1990)179：759-767；Webster等，“A型流感病毒中的抗原变化”127-168页，P.Palese和D.W，Kingsbury(编)，Genetics of influenza viruses.Springer-Verlag，纽约)。因此，衍生自任何这些分离物的蛋白质也用于这里所描述的组合物和方法。
本文描述的组合物和方法还使用了大量的细菌抗原，例如衍生自引起白喉、霍乱、肺结核、破伤风、百日咳、脑膜炎和其它疾病的生物的抗原，包括但不限于，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides，A、B、C、Y)，淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)、幽门螺旋菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、B型流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza type B，HIB)、幽门螺旋菌以及它们的组合物。衍生自脑膜炎奈瑟球菌B抗原的例子在如下共同拥有的专利申请中公开：PCT/US99/09346；PCT IB98/01665；PCT IB99/00103。寄生虫抗原的例子包括衍生自引起疟疾和莱姆病的生物的抗原。
本发明使用的其它抗原，其中一些也列在本申请的其它地方，包括如下(参考文献如下所列)：
-衍生自脑膜炎奈瑟球菌血清组B的蛋白质抗原，如下文参考文献中1-7。
-衍生自脑膜炎奈瑟球菌血清组B的外膜载体(OMV)制剂，如下文参考文献8，9，10，11等所公开的。
-衍生自脑膜炎奈瑟球菌血清组A、C、W135和/或Y的糖类抗原，如下文参考文献12中所公开的衍生自血清组C的寡糖(也见参考文献13)。
-衍生自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖类抗原[如参考文献14，15，16]。
-衍生自淋病奈瑟球菌的抗原[如参考文献1，2，3]。
-衍生自肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[如参考文献17，18，19，20，21，22，23]。
-衍生自沙眼衣原体的抗原[如24]。
-衍生自A型肝炎病毒的抗原，如灭活病毒[如参考文献25，26]。
-衍生自B型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如参考文献26，27]。
-衍生自C型肝炎病毒的抗原[如参考文献28]。
-衍生自百日咳杆菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳全毒素(PT)和衍生自百日咳杆菌的丝状血细胞凝集素(FHA)，还任意地与维持素(pertactin)和/或凝集元2和3结合[如参考文献29，30]。
-白喉抗原，如白喉类毒素[如参考文献31的第3章]，如CRM197突变体[如参考文献32]。
-破伤风抗原，如破伤风类毒素[如参考文献31的第4章]。
-衍生自幽门螺旋菌的蛋白质抗原，如CagA[如参考文献33]，VacA[如参考文献33]，NAP[如参考文献34]，HopX[如参考文献35]，HopY[如参考文献35]，和/或尿素酶。
-衍生自流感嗜血杆菌B的糖类抗原[如参考文献13]。
-衍生自牙龈卟啉单胞菌(Porphyramonas gingivalis)的抗原[如参考文献36]。
-脊髓灰质炎抗原[如参考文献37，38]如IPV或OPV。
-狂犬病抗原[如参考文献39]，如冻干灭活病毒[如参考文献40，RabavertTM]。
-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献31的第9，10和11章]。
-流感抗原[如参考文献31的第19章]，如红血球凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
-衍生自粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)[如参考文献41]。
-衍生自无乳链球菌的抗原(B组链球菌)[如参考文献42，43]。
-衍生自化脓链球菌的抗原(A组链球菌)[如参考文献43，44，45]。
-衍生自金黄色葡萄球菌的抗原[如参考文献46]。
-含有一种或多种这些抗原的组合物。
当使用糖类或碳水化合物抗原时，较佳的是这类抗原与载体蛋白偶联，以增强免疫原性[如参考文献47-56]。较佳的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。CRM197白喉类毒素是特别优选的。其它适合的载体蛋白包括脑膜炎外膜蛋白[如参考文献57]，合成肽[如参考文献58，59]，热休克蛋白[如参考文献60]，百日咳蛋白[参考文献61，62]，衍生自流感嗜血杆菌的蛋白质D[参考文献63]，衍生自C.difficile的毒素A或B[参考文献64]等。当一种混合物含有来自血清组A和C的囊糖类时，较佳是的MenA糖与MenC糖的比(w/w)大于1(如2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，10∶1或更高)。从不同的脑膜炎血清组得到的糖类可以与相同或不同的载体蛋白偶联。
可以使用任何一种适合的偶联反应，所需之处可以配有任意适合的连接子。
需要时毒性蛋白抗原可被脱毒(如：用化学和/或方法脱去百日咳毒素的毒性)[参考文献30]。
当组合物含有白喉抗原时，较佳的是该组合物还含有破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，当组合物含有破伤风抗原时，较佳的是该组合物还含有白喉抗原和百日咳抗原。类似地，当组合物含有百日咳抗原时，较佳的是该组合物还含有白喉抗原和破伤风抗原。
很明显本发明可用于传递各种大分子，因此而治疗、预防和/或诊断大量的疾病。在一些实施例中本发明的大分子/微粒体组合物可用于定点特异性靶位传递。例如，静脉内给予大分子/微粒体组合物可用于针对肺、肝、脾、血液循环或骨髓。
通过任何结合-相互反应机制，使大分子吸附到吸附的微粒体表面(或吸附到本发明的亚微粒体乳剂)，这些机制包括但不仅限于，离子键结合、氢键结合、共价键结合、范德华力结合、物理捕获和通过亲水/疏水基相互作用结合。本领域普通的技术人员可以容易地选择适合于要吸附的大分子类型的去污剂。
例如，在带电的去污剂(如阴离子或阳离子去污剂)中生产微粒体，可产生能够吸附各种分子的表面带有净负电荷或净正电荷的微粒体。例如，用阴离子去污剂如十二烷基硫酸钠(SDS)生产的微粒体(如SDS-PLG的微粒体)吸附带正电的抗原(如蛋白质)。类似地，用阳离子去污剂如CTAB生产的微粒体(如CTAB-PLG微粒体)吸附带负电的大分子(如DNA)。如果要吸附的大分子具有正电荷和负电荷区域，那么阳离子或阴离子、非离子或两性离子去污剂都适用。
本发明使用的用于生产微粒体的可生物降解的聚合物很容易地从Boehringer Ingelheim、Germany and Birmingham Polymers，Inc.、Birmingham，AL.购得。例如，本文使用的形成微粒体的聚合物包括均聚物、共聚物和衍生自如下物质的聚合物混合物：多羟基丁酸、聚羟基戊酸、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚二噁酮(polydioxanone)、聚己酸内酯、聚原酸酯、和多酐。更佳的是聚(α-羟基酸)，如聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)(本文将这两者都称作“PLA”)，多(羟基丁酸)，D，L-丙交酯和乙交酯的共聚物，如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(本文称作“PLG”或“PLGA”)或D，L-丙交酯和己酸内酯的共聚物。本文使用的特别优选的聚合物是PLA和PLG聚合物。这些聚合物以各种分子量存在，本领域熟练的技术人员很容易测定用于给定用途的适当的分子量。因此，如对于PLA，适合的分子量将在2000-5000数量级。对于PLG，合适的分子量通常在约10,000-200,000范围内，较佳的约15,000-150,000。
如果使用一种共聚物如PLG形成微粒体，则在本文中可使用各种丙交酯和乙交酯比值，该比值很达程度上是选择的结果，部分依赖于共给予的大分子和所需降解的比例。例如，一个50∶50的PLG聚合物，含有50％的D，L-丙交酯和50％的乙交酯，将提供一个快速消融的共聚物，而由于增加了丙交酯成分，75∶25的PLG降解得比较慢，85∶15和90∶10的降解得更慢。很显然，本领域熟练的工作人员可根据例如抗原的特性和怀疑的病症，容易地测定适合的丙交酯和乙交酯的比例。另外，在本发明的抗原或佐剂捕获于微粒体中的实施例中，为了获得给定大分子期望的释放动力学并提供初级和次级免疫反应，本文使用具有各种丙交酯∶乙交酯比例的微粒体混合物。本发明的微粒体的降解速率还可通过聚合物分子量和聚合物结晶性等因子得到控制。具有各种丙交酯∶乙交酯比例和分子量的PLG共聚物可以容易地从包括BoehringerIngelheim、Germany and Birmingham Polymers，Inc.、Birmingham，AL.等的许多地方购得。这些聚合物也可以使用本领域已知的技术，简单缩聚乳酸成分而合成，如Tabata等，J.Biomed.Mater.Res.(1988)22：837-858中所描述的。
当使用时，优选的聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物的丙交酯/乙交酯的摩尔比为30∶70到70∶30，更佳为40∶60到60∶40，并且分子量为10,000到100,000道尔顿，更佳为30,000到70,000道尔顿。
使用本领域熟知的任何几种方法制备聚合物微粒体，例如，在一些实施例中，可以使用双重乳剂/溶剂蒸发技术，如美国专利3,523,907和Ogawa等，Chem.Pharm.Bull.(1988)36：1095-1103中所描述制备微粒体。这些技术涉及由聚合物溶液微滴组成的初级乳剂的形成，该乳剂随后与含有微粒体稳定剂/表面活性剂的连续水相混合。
或者，根据O′Hagan等，Vaccine(1993)11：965-969，PCT/US99/17308(WO00/06123)，O′Hagan等和Jeffery等，Pharm.Res.(1993)10：362.描述的方法，可使用一种水包油包水溶剂(w/o/w)蒸发系统形成微粒体。在此技术中，通常将具体的聚合物与有机溶剂混合，所述有机溶剂如乙酸乙酯、二甲基氯(也称作亚甲基氯和二氯甲烷)、乙腈、丙酮、氯仿等。有机溶剂中提供的聚合物约占1-30％，较佳约占2-15％，更佳约占3-10％，最佳约占4-6％。然后将聚合物溶液与水溶液混合并乳化形成o/w乳剂。该水溶液可以是，例如，去离子水、生理盐水，或缓冲溶液如磷酸盐缓冲溶液(PBS)、柠檬酸钠/EDTA缓冲溶液。较佳的是，聚合物溶液与水溶液的体积比范围约为5∶1到20∶1，更佳约为10∶1。使用任何适合的设备进行乳化，典型的是一个高剪切装置，如匀浆器。
然后较佳地使一体积的o/w乳剂与较大体积的水溶液混合，该水溶液较佳地含有阳离子、阴离子或非离子去污剂。水溶液与o/w乳剂的体积比典型的约为2∶1到10∶1，更典型的约为4∶1。适合用于实施本发明的阴离子、阳离子和非离子去污剂的例子在上文已列出，分别包括SDS、CTAB和PVA。一些大分子可更容易地吸附到具有稳定剂和/或去污剂混合物的微粒体上，例如，PVA和DOTAP的混合物。另外，在一些例子中，可能需要将去污剂加入到上述有机溶剂中。在使用非离子去污剂如PVA时使用了乳剂稳定剂，其在溶液中的浓度典型地约为2-15％，更典型的约为4-10％。使用阳离子或阴离子去污剂时，其在溶液中的浓度典型地约为0.05-5％，更典型地约为0.25-1％。通常，使用的去污剂与聚合物的重量比约为0.00001∶1到约0.5∶1，较佳约为0.0001∶1到0.5∶1，更佳约为0.001∶1到0.5∶1，更佳约为0.005∶1到0.5∶1。
然后匀浆复合物以生产稳定的w/o/w双重乳剂。然后蒸发有机溶剂。可以控制配方参数，使制备的小微粒体在0.05μm(50nm)到较大微粒体50μm或更大的范围内。见如，Jeffery等，Pharm.Res.(1993)10：362-368；McGee等，J.Microencap.(1996)。例如，减少搅拌产生了较大的微粒体，增加了内部相体积。使用具有高浓度的乳剂稳定剂的低水相体积生产小微粒体。
其它的制剂可在2001年9月28日提交的题为《吸附了大分子的微粒体》的美国申请系列号＿＿＿、代理案卷号PP16502.002中获得。
可以控制配方参数，使制备的小微粒体在0.05μm(50nm)到较大微粒体50μm或更大的范围内。见如，Jeffery等，Pharm.Res.(1993)10：362-368；McGee等，J.Microencap.(1996)。例如，减少搅拌产生了较大的微粒体，增加了内部相体积。使用具有高浓度的乳剂稳定剂的低水相体积生产小微粒体。
在其它的实施例中，还可使用Thomasin等J.Controlled Release(1996)41：131；美国专利2,800,457；Masters，K.(1976)Spray Drying第二版，Wiley，New York中描述的喷干和凝聚技术，以及Hall等，(1980)”Wurster Process”，Controlled Release Technologies：Methods，Theory，and Applications(A.F.Kydonieus编)，第二卷，133-154页，CRC Press，Boca Raton，Florida和Deasy，P.B.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.(1988)S(2)：99-139)描述的空气-悬浮涂层技术，如全涂层(pan coating)和Wurster涂层，以及离子凝胶化技术〔描述于如Lim等Science(1980)210：908-910.〕来制备微粒体。
可通过如激光散射，使用例如氦-氖激光分光剂测定粒径。通常，在室温测定粒径粒径，测定涉及对该样品进行多次分析(如5-10次)，以获得这些粒径的平均值。还可使用扫描电镜(SEM)容易地测定粒径。
本发明的其它实施例利用含有亚微粒体乳剂的微粒体制品，该制品较佳包含离子型表面活性剂。例如，可使用MF59或其它作为基本的含油亚微粒体乳剂，而离子型表面活性剂可包括但不限于二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DEPC)和二油酰基-磷脂酸(DPA)，各表面活性剂都可溶解于角鲨烯中。通过将各去污剂溶解在角鲨烯/10％Span 85(角鲨烯的浓度为4-52mg/ml)中，可配制原型离子型乳剂。可使用0.5％Tween 80/H2O在5毫升角鲨烯/100毫升H2O中的溶液乳化该角鲨烯/表面活性剂混合物。使用Silverson均化器均化(5分钟，5000RPM)，形成初步的乳剂，然后进行微流化(～10000psi，5遍，Microfluidizer 110S)，得到最终的乳剂。下文描述了关于亚微粒体乳剂的其它讨论。
制备后，微粒体可以原样保存或冻干以备将来使用。通常，为了使大分子吸附到微粒体上，可使微粒体制备物简单地与感兴趣的大分子混合，得到的制剂在使用前可再冻干。通常，将大分子加到微粒体中，以获得大分子与微粒体的重量比为0.0001∶1到0.25∶1、较佳是0.001∶1到0.1、更佳是0.01到0.05的吸附了大分子的微粒体。可采用标准的技术测定微粒体中大分子的含量。
如上所述，用于本发明的大分子包括蛋白质(较佳是抗原分子)和核酸(较佳是能表达核酸序列的载体构建物，如CMV基的载体、ELVIS载体或RNA载体构建物)。
本发明的聚合物微粒体可含有嵌于其中或包裹于其中的大分子，以及吸附于其上的大分子。因此，例如，本领域熟练的技术人员可以依据本发明制备具有ELVIS载体吸附于其上的包裹了佐剂的微粒体，或者具有RNA载体构建物吸附于其上的包裹了抗原的微粒体。本发明设计吸附于微粒体上或嵌于微粒体中的核酸大分子以及其它核酸和其它抗原分子的各种组合物。在一些优选的实施例中，本发明的微粒体具有ELVIS载体或RNA载体构建物吸附于其上。
此外，发明的微粒体的任何实施例都借助电穿孔而传送。
如上所述，一旦生产出吸附了大分子的微粒体和/或微粒体乳剂微粒体，就将它们与所需的佐剂一起制成药物组合物(包括疫苗)，用于治疗、预防和/或诊断各种各样的疾病。该组合物通常包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。例如，可使用的载体如水、盐水、甘油、聚乙二醇、透明质酸、乙醇等。其它赋形剂如湿润剂或乳化剂、生物缓冲剂等也可存在于这种载体中。生物缓冲剂实际上可以是药学上可接受的和使制剂具有所需的pH(即生理范围内的pH)的任何溶液。缓冲溶液的例子包括盐、磷酸缓冲盐溶液、Tris缓冲盐溶液、Hank’s缓冲盐溶液等。也可将本领域已知的其它的赋形剂引入最终的剂型中，包括粘合剂、崩解剂、填充物(稀释剂)、润滑剂、助流剂(流动增强剂)、压缩辅助剂、颜料、甜味剂、防腐剂、悬浮/分散剂、膜形成剂/包衣、调味剂和印刷油墨。
本发明的组合物将含有治疗有效量的一种或多种感兴趣的大分子。即，组合物中大分子/微粒体的量将使对象产生足够的反应，以预防、减少、除去或诊断症状。所需的适当的量是变化的，依赖于接受治疗的对象；接受治疗的对象的年龄和大体的条件；治疗状况的严重程度；在免疫反应的情况下，对象免疫系统合成抗体的能力；希望保护的程度和选择的具体抗原以及给予的方式；以及其它的因素。本领域熟练的技术人员可以容易地测定适合的有效量。因此，治疗有效量通常在一个较大的范围内，该范围可由常规试验测定。例如，为了本发明的目的，大分子是多核苷酸，每剂传送的大分子有效剂量典型地在1ng-10mg范围内，更佳的约在10ng-1mg，最佳的约100μg-1mg；大分子是抗原时，每剂传送的大分子有效剂量典型地在约1μg-100mg范围内，更佳的约在10μg-1mg，最佳的约50μg-1mg。
一旦制得本发明的组合物，可将其肠胃外给予，如通过注射。组合物可皮下注射、腹膜内注射、静脉注射或肌肉注射。其它给药方式包括鼻、粘膜、直肠、阴道、口和肺部给予，栓剂和经真皮或表皮应用。可以使用单剂量方案或多剂量方案进行剂量治疗。多剂量方案是指在初期疗程中可以分1-10次剂量分期服药，在随后的时间间隔里，根据所选择维持和/或加强治疗效应的目的，施以其它给药剂量，例如，在1-4个月内施以第二剂量，如果需要，几个月后给予又一个剂量。
在本发明的一些实施例中，在注射一系列的一次或多次载体构建物(含有编码抗原的异源核酸序列)后，接着注射一系列的一次或多次抗原(在本文中也称为“强化”)。根据一个特殊的实施例，可以三次注射给予载体构建物：(a)在初次给予时给予；(b)在初次给予后1-8周的时间范围内给予；(c)在初次给予后4-32周的时间范围内给予；而抗原则可以在两次注射中给予：(a)在初次给予后8-50周的时间范围内给予；和(b)在初次给予后8-100周的时间范围内给予。
剂量方案将(至少部分)根据对象所需的程度和从事者的判断而定。
如果希望预防疾病，通常在用感兴趣的病原体初步感染前给予吸附了载体构建物的微粒体。如果需要治疗疾病(除了预防以外)，如症状还原或复发，通常初步感染后给予吸附了载体构建物的微粒体。
2. 油滴乳剂
在本发明的其它实施例中，制备的油滴乳剂(具体而言，亚微粒体乳剂)含有可代谢的油和乳化剂。可使如含有至少一个CpG基序的寡核苷酸的分子与油滴乳剂混合，形成佐剂。
油滴乳剂较佳含有可代谢的油和乳化剂，其中，该油和乳化剂形成基本上所有的油滴的直径都小于1微米的水包油乳剂。具有此优选的大小范围的液滴的亚微粒体乳剂显示出比其它含有油和乳化剂、但其油滴明显大于本发明的乳剂的惊人的优越性。在优选的实施例中，由于使用阳离子去污剂作为乳化剂，或者除了乳化剂外还含有阳离子去污剂的缘故，所得的乳剂带正电荷。这使得核苷酸抗原分子(如CpG寡核苷酸)或载体构建物被吸附。或者，阴离子去污剂的使用使如蛋白质之类的分子被吸附。
虽然本发明亚微粒体乳剂组合物的各种成分是通常所知的，但是这些组合物并未以相同的方式混合。因此，虽然下文作出了一般的描述，并在优选的实施例中有详细的描述，但是单独的成分在本领域中是已知的，对于本领域熟练的技术人员来说，用于本文的术语，如可代谢的油、乳化剂、免疫刺激剂、胞壁酰肽和亲脂性胞壁酰肽，都能足够了解，而勿需进一步的描述。
这些组合物的一种成分是可代谢的、无毒的油，较佳是一种约6-30个碳原子的油，包括但不限于链烷、链烯、炔，以及它们的相应的酸和醇及其醚和酯，以及它们的混合物。油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成制得的油，这些油可被给予佐剂的宿主动物代谢，它们对对象是无毒的。宿主动物通常是哺乳动物，较佳是人。在此明确表示，本发明不包括矿物油和类似的有毒的石油蒸馏油。
本发明的油成分还可以是任何长链链烷、链烯或炔，或者是它们的酸或醇衍生物，不论是游离的酸、其盐还是酯，如单酯、二酯或三酯，如甘油三酯1，2-丙二醇的酯，或者类似的多羟基醇。可使用氨基或多官能团酸使醇酰化，如乙酸、丙酸、柠檬酸等。也可使用从长链醇衍生得到的、属于油的并满足本文所述的其它标准的醚。
通常，单独的链烷、链烯或烷部分及其酸或醇衍生物具有约6-30个碳原子。该部分可具有直链或支链结构。它可以是全饱和的，或者具有一个或多个双键或三键。当使用单或多酯或醚基的油时，约6-30个碳原子的限制也适用于单独的脂肪酸或脂肪醇部分，并不是所有的碳原子都包括在内。
本文可使用任何可代谢的油，尤其是从动物、鱼或植物来源获得的油。油需要能被所给予的宿主代谢，否则该油成分可导致脓肿、肉芽肿甚或肿瘤或者(当用于医兽时)可能使接种的鸟类和动物的肉由于该不可代谢的油可能对消费者产生不利的影响的缘故而不能让人消费。
关于这类亚微粒体乳剂的详细描述，可参见国际出版物WO 90/14837和共同拥有的国际专利申请PCT/US00/03331。
这些佐剂和免疫原性组合物的油成分将以约0.5-20体积％、但较佳不超过约15％、通常约为1-12％的量存在。最佳的是使用约1-4％的油。
这些亚微粒体乳剂组合物的水性部分较佳是缓冲盐溶液，或者，更佳的是未掺杂的水。因为这些组合物用于肠胃外给药，所以较佳的是，为了预防由于组合物和生理液体之间的离子浓度不同而导致的组合物的给药后膨胀或快速吸收，需要补充用作免疫原性组合物的最终的缓冲溶液，以使其张力(即重量摩尔渗透压浓度)基本上与正常的生理液体相同。还较佳的是，为了维持pH与正常生理条件向适配，应使该盐水缓释。还有，在某些例子中，为了确保某种组合物成分如糖肽的稳定性，需要将pH维持在特定的水平。
任何生理上可接受的缓冲液都可用于本文，优选磷酸盐缓冲液。其它可接受的缓冲液如乙酸酯、Tris、碳酸氢盐、碳酸盐等可用来代替磷酸盐缓冲液。水性成分的pH优选约为6.0-8.0。
但是，当开始制备亚微粒体乳剂时，较佳使用未掺杂的水作为乳剂的水性成分。增加盐浓度使得更加难以获得所需小的液滴大小。当由佐剂制备最终的免疫原性组合物时，可将抗原性物质加到处于适当的重量摩尔渗透压浓度的缓冲液中，以提供所需的免疫原性组合物。
在这些组合物中使用的水性成分的量将是使该组合物的值统一所需的量。即，为了使该组合物产生所需的体积，使足以产生100％的量的水性成分与上述其它成分混合。
各种各样的乳化剂和悬浮剂通常用于药物科学中。这些包括天然的物质，如从树得到的树胶、植物蛋白、糖基聚合物如藻酸盐和纤维素等。某些氧代聚合物或者在其碳骨架上具有氢氧化物或其它亲水取代基的聚合物具有表面活性剂的活性，如聚维酮、聚乙烯醇和乙二醇醚基的单或多官能团化合物。由长链脂肪酸衍生的化合物形成大量的第三类乳化剂和悬浮剂，这些都可用于本发明。只要前述任一种表面活性剂是无毒的，它们都可使用。
可用于本发明的合适的乳化剂(也称为表面活性剂或去污剂)的特殊例子公开在共同拥有的国际专利申请PCT/US00/0331中。通常将表面活性剂分成4个基本的类别：阴离子、阳离子、两性离子和非离子。阴离子去污剂的例子包括但不限于藻酸、辛酸、胆酸、1-癸烷磺酸、脱氧胆酸、1-十二烷磺酸、N-月桂酰基肌氨酸和牛磺胆酸等等。阳离子去污剂包括但不限于溴棕三甲铵(十六烷基三甲基溴化铵或“CTAB”)、氯化苯甲烷铵、二甲基2-十八烷基溴化铵(DDA)、DOTAP、十二烷基三甲基溴化铵、苄基二甲基十六烷基氯化铵、鲸蜡基氯化吡啶、甲基苯索氯铵和4-甲基吡啶十二烷基硫酸盐等等。两性离子去污剂的例子包括但不限于3-[(3-胆氨基丙基)-二甲基胺基]-1-丙烷磺酸盐(常缩写为CHAPS)、3-[(胆氨基丙基-二甲基胺基]-2-羟基-丙烷磺酸盐(常缩写为CHAPSO)、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-胺基-1-丙烷磺酸盐和溶血-α-磷脂酰胆碱等。非离子去污剂的例子包括但不限于癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、二乙二醇单戊酯、正十二烷基β-D-吡喃型葡糖苷、脂肪醇的环氧乙烷缩合物(如以商品名Lubrol销售的)、脂肪酸(具体是C12-C20脂肪酸)的聚氧乙烯醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(如以商品名Tween销售的)和脱水山梨糖醇脂肪酸醚(如以商品名Span出售的)等等。
特别有用的表面活性剂组是基于脱水山梨糖醇的非离子表面活性剂，如从市场上购得的SPAN或ARLACEL，通常有一个字母或数字符号起将各种单、二和三酯取代的脱水山梨糖醇区别开。相关的表面活性剂组包括以TWEEN出售的聚氧乙烯脱水山梨糖醇单酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇三酯。TWEEN表面活性剂可与相关的山梨糖醇单酯或三酯表面活性剂混合，以促进乳剂稳定性。
通过改变去污剂和油的比值(增加比值则油滴大小减小)、工作压力(增加工作压力则油滴变小)、温度(增加温度则油滴变小)以及加入两性免疫刺激剂(加入这些制剂将减少油滴大小)可改变油滴的大小。实际的油滴大小将根据具体的去污剂、油和免疫刺激剂(如果有的话)以及所选择的具体的工作条件而改变。可采用大小测量仪器来确定液滴的大小，如Coulter公司制造的Sub-MicronParticle Analyzer(N4MD型)，并可根据前述原则改变它们的参数，直到基本上所有的液滴的直径都小于1微米、较佳是小于0.8微米、最佳是小于0.5微米。“基本上所有”是指至少约80％(数量)、较佳至少约90％、更佳至少约95％、最佳至少约98％。粒径通常是高斯曲线分布，这样其平均直径小于所述的限度。
优选的油滴乳剂是MF59。可根据以下文献所述的方法制备MF59，如Ott等，Vaccine Design：The Subunit And Adjuvant Approach，1995，M.F.Powell和M.Newman编辑，Plenum出版社，纽约，第277-296页；Singh等，Vaccine，1998，16，1822-1827；Ott等，Vaccine，1995，13，1557-1562；Valensi等，J.Immunal，1994，153，4029-39，本文将这些文献的全部公开内容纳入作为参考。
其它油滴乳剂包括如SAF，含有10％的角鲨浠、0.4％Tween 80，5％的聚醚-阻断聚合物L121和thr-MDP，微流化成亚微型乳剂或涡旋产生较大粒径的乳剂；和RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immuochem，Hamilton，MT)含有2％的角鲨浠、0.2％Tween 80以及一种或多种细菌细胞壁成分，选自单磷酰基酯A(MPL)，海藻糖二聚月桂烯(TDM)，和细胞壁骨架(CWS)，较佳是MPL+CWS(Detox J)(关于本文使用的适合的亚微型水包油乳剂的进一步讨论见共同拥有的1998年1月29日提交的专利申请09/015,736)。
在制得本发明的微粒体后，不管是什么聚合物类型或亚微粒体乳剂类型，大分子如多肽和载体构建物都可如先前所述吸附于其上。本发明的亚微粒体乳剂微粒体还可将大分子俘获或包埋于其中，以及吸附于其上。因此，例如本领域熟练的技术人员可以依据本发明制备具有ELVIS载体吸附于其上的包裹了佐剂的微粒体，或者具有RNA载体构建物吸附于其上的包裹了抗原的微粒体。本发明设计吸附于微粒体上或嵌于微粒体中的核酸大分子以及其它的核酸和其它抗原分子的各种组合物。此外，本发明的微粒体的任何实施例可通过电穿孔传送。
3. ELVIS载体
ELVIS载体是真核生物分层载体起始系统，在上述美国专利5814482和6015686以及国际专利申请WO 97/38087和WO 99/18226中有总的描述。在一个实施例中，ELVIS载体从α病毒的基因组得到，更佳从新德比斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEE)或罗斯河病毒(RRV)的基因组得到。α病毒是长度大约为11-12kb的RNA病毒，它含有5′帽和3′多腺苷酸化尾。成熟的感染病毒由被核壳和包膜蛋白包膜的基因组RNA组成。宿主细胞通过受体特异性事件被α病毒感染，并在基因组RNA释放到胞质中时达到高峰。在病毒复制过程中，合成了病毒编码的包膜糖蛋白E1和E2，这两种蛋白被包埋在宿主细胞膜中，其后代病毒粒子通过此而萌发，并释放到该宿主细胞的外部。
病毒基因组的复制以基因组RNA链作为合成互补的负RNA链的模板开始。然后负RNA链作为全长基因组RNA的模板，以及内部启动的正链亚基因组RNA的模板。非结构蛋白由基因组链翻译，而结构蛋白由亚基因组链翻译。所有的病毒基因都首先表达为多蛋白，然后在翻译后通过蛋白酶剪切被加工成单个蛋白质。
通过使用选择的异源核酸序列替换病毒基因组的某些部分(如结构蛋白基因)，可以构建α病毒载体复制子。因此，在某些实施例中，α病毒复制子载体可含有能启动α病毒转录的5′序列、编码α病毒非结构蛋白的核苷酸序列、α病毒连接区域启动子、α病毒RNA聚合酶识别位点，以及3′多腺苷酸化序列。此外，在α病毒载体构建物中可含有用于cDNA复制的α病毒载体复制子。这类载体构建物通常含有能启动cDNA合成RNA的位于上游并操作性连接于该载体cDNA的5′启动子，这样转录将产生载体复制子RNA。载体构建物还可含有控制转录终止的3′序列。在病毒连接区域的上游或下游可存在异源核酸序列。
ELVIS载体利用RNA病毒复制的机制，通过双层方法(如，以上述α病毒载体构建物为基础)实现感兴趣的异源核苷酸序列的传送。总而言之，由于第一层启动了第二层的转录的缘故，ELVIS载体提供一个能使编码感兴趣的基因产物的RNA的量扩增的层状表达系统。因此，典型的ELVIS载体含有能启动cDNA转录为RNA的合成的5′启动子、能在细胞中自我复制并能表达异源核酸序列的构建物的cDNA补体，以及控制转录终止的3′序列。能使选择的核酸序列自我复制和表达的构建物可以是α病毒载体构建物。因此，DNA ELVIS载体的第一层转录RNAα病毒载体构建物，由此使选择的异源核酸序列表达。
可首先制备与α病毒基因组互补的cDNA，从而构建α病毒基的ELVIS载体。然后删掉对应于基因组RNA的cDNA中编码一个或多个病毒结构蛋白的序列，然后在缺失的位置上插入编码感兴趣的基因产物的异源DNA，从而阻止成熟的病毒包装，并使该异源序列扩增。然后将含有异源序列的修饰的cDNA插入ELVIS载体的第一层中。在ELVIS载体进入细胞和核中后，它将被转录，所产生的mRNA分子(是一种能自我复制的RNA载体)将开始复制，并翻译出多肽，包括感兴趣的异源基因。
虽然典型的新德比斯衍生的α病毒载体构建物是优选的，但是根据本文所述，也可使用其它α病毒种类。或者，可使用从任何RNA病毒衍生得到的载体，尤其是从正链病毒衍生得到的。
总的来说，关于ELVIS载体的构建的内容在美国专利5814482和6015686中有描述。简言之，从RNA病毒获得RNA，然后使用针对具体的基因或RNA病毒的某部分的适当的引物，通过PCR扩增合成cDNA，根据需要，这些引物也可含有额外的限制性位点。然后将所得cDNA片段克隆到质粒中，然后将质粒转化到适当的宿主中，如大肠杆菌。将阳性菌落用于质粒纯化，然后将质粒装配到所需的ELVIS载体中，该载体存在具有异源DNA如报道基因(如GFP)或编码抗原的所需基因的部分。下面的实施例3描述了用于本发明的特别优选的ELVIS载体(pSINCP)。
4. RNA和pCMV载体构建物
在本发明的其它实施例中，RNA载体构建物或RNA复制子载体被直接使用，而不需要将DNA导入细胞并转移到转录可能发生的核中。通过将该RNA载体用于直接传送到宿主细胞的胞质中，可有效地使异源核酸序列自动进行复制和翻译。在此实施例中，通过在体外由DNA基的载体构建物进行转录，获得RNA载体构建物或RNA复制子载体。较佳的是，从α病毒的基因组衍生得到该RNA载体构建物或RNA复制子载体，更佳的是从新德比斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEE)或罗斯河病毒(RRV)的基因组得到。在其它实施例中，RNA载体构建物从α病毒以外的其它病毒获得。较佳的是，用于衍生RNA载体构建物的这些其它病毒是正链RNA病毒，更佳的是，它们是小RNA病毒、黄病毒、风疹病毒或冠形病毒。用于体外转录α病毒基的RNA载体的组合物和方法在其它地方有详细描述(参见美国专利5842723，和Polo等，1999，96：4598-603)。然后将RNA载体吸附到本文所述的用于传送的本发明微粒体上。虽然从SIN、SFV、VEE或RRV获得的典型α病毒RNA载体是优选的，但是可容易地使用从其它α病毒种类获得的类似载体替代。
在本发明的其它实施例中使用pCMV载体构建物。这类载体构建物在本领域中是周知的。特别优选的pCMV载体含有CMV立即早期增强子/启动子和牛生长激素终止子。在Chapman，B.S.等，1991，《从人巨细胞病毒(Towne)立即早期基因获得的内含子A对哺乳动物细胞中的异源表达的作用》，Nucleic Acids Res.，19：3979-86中有关于此的详细描述。
5. 佐剂
可任选地使用佐剂来增强药物组合物的效果，特别优选的是Th1刺激佐剂。佐剂可以与本发明的微粒体同时给予，如佐剂在同一组合物中或分离的组合物中。另外，佐剂也可在给予本发明的微粒体组合物前或后给予。在另一个实施例中，佐剂，如免疫学佐剂，可包裹于微粒体内。可使用本领域已知的任何几种方法使佐剂与任何一种大分子一样包裹在微粒体内。见如美国专利3,523,907；Ogawa等Chem Pharm.Bull.(1988)36：1095-1103；O’Hagan等Vaccine(1993)11：965-969和Jefferey等Pharm.Res(1993)10：362。另外，如上述任何大分子一样，佐剂可以吸附于微粒体。或者，佐剂可含有本发明的油滴乳剂。
免疫学佐剂包括但不仅限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)其它水包油乳剂制剂〔含有或不含有其它特异性免疫刺激剂如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁成分〕，例如(a)使用微流化剂如110Y型微流化剂(Microfluidics，Newton，MA)制备成亚微型颗粒的MF59，含有5％的角鲨浠、0.5％Tween 80，和0.5％的Span85〔尽管不需要，但可任选地含有各个量的MTP-PE(见下文)〕(国际出版物WO90/14837，Vaccine design中第10章：the subunit an adjuvant approach，Powell和Newman编，Plenum Press1995)；(b)SAF，含有10％的角鲨浠、0.4％Tween 80，5％的聚醚-阻断聚合物L121和thr-MDP(见下文)，也微流化成亚微型乳剂或涡旋产生较大粒径的乳剂；和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi Immuochem，Hamilton，MT)含有2％的角鲨浠、0.2％Tween 80以及一种或多种细菌细胞壁成分，选自单磷酰基酯A(MPL)，海藻糖二聚月桂烯(TDM)，和细胞壁骨架(CWS)，较佳是MPL+CWS(DetoxTM)(关于本文使用的适合的亚微型水包油乳剂的讨论见共同拥有的1 998年1月29日提交的专利申请09/015,736)；(3)可使用皂角苷佐剂，如Quil A或QS21〔(如StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)〕，或由其产生的微粒体如ISCOM(免疫刺激复合物)，该ICOMS可不具有另外的去污剂，如WO00/07621；(4)弗氏完全佐剂(CFA)以及弗氏不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白细胞介素〔如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12(WO99/44636)等〕、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)单磷酰基酯A(MPL)或3-O-去酰基化MPL(3dMPL)，如GB-2220221、EP-A-0689454，当使用肺炎球菌糖类时，基本上没有alum，如WO00/56358；(7)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合，如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(8)含有CpG基序的寡聚核苷酸(Roman等，Nat.Med.，1997，3，849-854；Weiner等，PNAS USA，1997，94，10833-10837；Davis等，J.Immunol.1988，160，870-876；Chu等，J.Exp.Med.，1997，186，1623-1631；Lipford等，Eur.J.Immunol.1997，27，2340-2344；Moldoveanu等，Vaccine，1988，16，1216-1224，Krieg等，Nature，1995，374，546-549；Klinman等，PNAS USA，1996，93，2879-2883：Ballas等，J.Immunol.，1996，157，1840-1845；Cowdery等J.Immunol.，1996，156，4570-4575；Halpern等，CellImmunol.，1996，167，72-78；Yamamoto等，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey等，J.Immunol，1996，157，2116-2122；Messina等，J.Immunol.，1991，147，1759-1764；Yi等，J.Immunol.，1996，157，4918-4925；Yi等J.Immunol.，1996，157，5394-5402；Yi等J.Immunol.，1998，160，4755-4761；和Yi等J.Immunol.，1998，160，5898-5906；国际专利申请WO/96/02555，WO 98/16247，WO98/18810，WO 98/40100，WO 98/55495，WO 98/37919和WO 98/52581)，即含有至少一个CG二核苷酸，可任选地用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶；(9)聚氧乙烯乙醚或聚氧乙烯酯如WO 99/52549；(10)结合了辛苯聚糖(octoxynol)的聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂(WO 01/21207)，或与至少一种另外的非离子表面活性剂如辛苯聚糖结合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)；(11)皂角苷和免疫刺激寡聚核苷酸(如CpG寡核苷酸)(WO00/62800)；(12)免疫刺激物和金属盐颗粒，如WO 00/23105；(13)皂角苷和水包油乳剂如WO 99/11241；(14)皂角苷(如QS21)+3dMPL  +IL-12(任意地加上固醇)如WO 98/57659；(15)细菌ADP-核糖基化毒素的脱毒突变体，如霍乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌热不稳定毒素(LT)，特别是LT-K63(在63位赖氨酸代替野生型氨基酸)，LT-R72(在72位精氨酸代替野生型氨基酸)，CT-S109(在109位丝氨酸代替野生型氨基酸)，和PT-K9/G129(在9位赖氨酸代替野生型氨基酸和在129位甘氨酸代替野生型氨基酸)(见如国际出版物WO 93/13202和WO 92/19265)；和(16)其它作为增强组合物效果的免疫刺激剂的物质。较佳的是alum(特别是磷酸铝和/或氢氧化铝)和MF59。
胞壁酰肽包括但不仅限于N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基(normuranmyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)等。
佐剂的其它例子见Vaccine Design，The Subunit and the AdjuvantApproach，Powell，M.F和Newman，M.J.编，Plenum Press，(1995)。
因此，本发明组合物的任选的额外组分较佳是佐剂(如铝盐)或含有至少一个CpG基序的寡核苷酸。在本文中，短语“CpG基序”指寡核苷酸的二核苷酸部分，该部分含有胞嘧啶核苷酸，与其连接的是鸟嘌呤核苷酸。可采用本领域熟练的技术人员已知的常规的寡核苷酸合成制备这些寡核苷酸。较佳的是，本发明的寡核苷酸含有修饰的骨架，如硫代磷酸酯或肽核酸，以赋予该寡核苷酸以核酶抗性。修饰的骨架在本领域中是已知的。优选的肽核酸如下列文献中所述：美国专利5821060、5789573、5736392和5721102、日本专利10231290、欧洲专利839828和PCT出版物WO 98/42735、WO 98/42876、WO 98/36098、WO 98/27105、WO98/20162、WO 98/16550、WO 98/15648、WO 98/04571、WO 97/41150、WO 97/39024和WO 97/38013，本文将这些文献的全部公开内容纳入作为参考。
寡核苷酸较佳含有约6-100个核苷酸，更佳是约8-50个核苷酸，最佳是约10-40个核苷酸。此外，本发明的寡核苷酸在糖部分和含氮碱基部分可含有取代基。优选的寡核苷酸在以下文献中公开，例如Krieg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，12631-12636；Klinman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，2879-2883；Weiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，10833-10837；Chu等，J.Exp.Med.，1997，186，1623-1631；Brazolot-Millan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，15553-15558；Ballas等，J.Immunol.，1996，157，1840-1845，Cowdery等，J.Immunol.，1996，156，4570-4575；Halpern等，Cell.Immunol.，1996，167，72-78；Yamamoto等，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey等，J.Immunol.，1996，157，2116-2122；Messina等，J.Immunol，1991，147，1759-1764，Yi等，J.Immunol.，1996，157，4918-4925，Yi等，J.Immunol.，1996，157，5394-5402；Yi等，J.Immunol.，1998，160，4755-4761；Roman等，Nat.Med.，1997，3，849-854；Davis等，J.Immunol.，1998，160，870-876；Lipford等，Eur.J.Immunol.，1997，27，2340-2344；Moldoveanu等，Vaccine，1988，16，1216-1224；Yi等，J.Immunol.，1998，160，5898-5906；PCT出版物WO 96/02555；PCT出版物WO98/16247；PCT出版物WO98/18810；PCT出版物WO98/40100；PCT出版物WO98/55495；PCT出版物WO98/37919；PCT出版物WO98/52581；本文将这些文献的全部公开内容纳入作为参考。应理解，本发明的寡核苷酸含有至少一个CpG基序，但可含有多个CpG基序。
优选的寡核苷酸含有核苷酸序列，如：tccatgacgttcctgacgtt(SEQ ID NO：1)，ataatcgacgttcaagcaag(SEQ ID NO：2)，ggggtcaacgttgagggggg(SEQ ID NO：3)，tctcccagcgtgcgccat(SEQ ID NO：4)，gagaacgctcgaccttcgat(SEQ ID NO：5)，tccatgtcgttcctgatgct(SEQ ID NO：6)，tccatgacgttcctgatgct(SEQ ID NO：7)，gctagacgttagcgt(SEQ ID NO：8)，atcgactctcgagcgttctc(SEQ ID NO：9)，gaaccttccatgctgttccg(SEQ ID NO：10)，gctagatgttagcgt(SEQ ID NO：11)，tcaacgtt(SEQ IDNO：12)，gcaacgtt(SEQ ID NO：13)，tcgacgtc(SEQ ID NO：14)，tcagcgct(SEQ ID NO：15)，tcaacgct(SEQ ID NO：16)，tcatcgat(SEQ ID NO：17)，tcttcgaa(SEQ ID NO：18)，tgactgtgaacgttcgagatga(SEQ ID NO：19)，tgactgtgaacgttagcgatga(SEQ ID NO：20)，tgactgtgaacgttagagcgga(SEQ ID NO：21)，gtttgcgcaacgttgttgccat(SEQ ID NO：22)，atggcaacaacgttgcgcaaac(SEQ ID NO：23)，cattggaaaacgttcttcgggg(SEQ ID NO：24)，ccccgaagaacgttttccaatg(SEQ ID NO：25)，attgacgtcaat(SEQ ID NO：26)，ctttccattgacgtcaatgggt(SEQ ID NO：27)， and tccatacgttcctgacgtt(SEQ ID NO：28)
在本发明的优选实施例中，寡核苷酸含有其5′端连接两个嘌呤、3′端连接两个嘧啶的CpG基序。但应理解，含有CpG基序的任何寡核苷酸都可用于本发明，只要该寡核苷酸在与本文所述的微粒体组合物混合时能诱导Th1淋巴细胞刺激的增加。
6. 抗原
本发明还涉及含有吸附了大分子(较佳是编码抗原的载体构建物和/或抗原本身)的微粒体的免疫原性组合物。通常，抗原与其受体刺激T淋巴细胞(较佳是Th1淋巴细胞)的增殖，并可与淋巴细胞反应，引起一系列的称为细胞介导的免疫的反应。因此抗原可诱导CTL反应和/或体液反应，并可诱导产生细胞因子。
表位也在本发明的抗原的定义之内。表位是决定免疫特异性的抗原分子或抗原复合物的部分。通常，表位是天然抗原的肽或多糖。在人工抗原中，它可以是低分子量物质，如阿散酸衍生物。表位将在体内或体外特异性地与T淋巴细胞的同源抗体反应。其它的描述是抗原决定子、抗原结构基团和半抗原基团。
在本发明优选的实施例中，抗原性物质从病毒衍生得到，所述病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、流感病毒(flu)和狂犬病毒。较佳的是，抗原性物质选择HSV糖蛋白gD、HIV糖蛋白gp120、HIV p55gag和从pol与tat区域得到的多肽。在部分的优选实施例中，抗原性物质从细菌如幽门螺旋菌、流感嗜血杆菌、霍乱、白喉、破伤风、脑膜炎奈瑟氏球菌和百日咳获得。在本发明的其它优选实施例中，抗原性物质从寄生虫获得，如疟疾寄生虫。在本发明其它优选的实施例中，抗原吸附在本发明的微粒体的表面上。
可采用本领域已知的方法生产抗原，或者可从市场上购得。本发明范围内的抗原包括全灭活的病毒粒子、分离的病毒蛋白和蛋白亚单元、全细胞和细菌、细胞膜和细胞壁蛋白等等。下面描述了一些优选的抗原。
单纯疱疹病毒(HSV)rgD2是一种在遗传工程用的中国仓鼠卵巢细胞中产生的重组蛋白质。这种蛋白质的正常的锚定区域被截短，导致糖基化蛋白质被分泌到组织培养基中。可在CHO培养基中纯化得到大于90％纯度的gD2。人免疫缺陷病毒(HIV)env-2-3是由遗传工程用的酿酒酵母(Saccharomyces cereisae)产生的重组形式的HIV包膜蛋白。这种蛋白质代表HIV gp120的整个蛋白质区域，但是并未糖基化，并且从酵母纯化时变性。HIV gp 120是一种完全糖基化的gp120的分泌形式，它以与上述gD2相似的方式在CHO细胞中产生。适用于免疫原性组合物中的其它HSV抗原在PCT出版物WO85/04587和WO88/02634中有描述，本文将这两篇文献的全部内容纳入作为参考。特别优选gB和gD抗原的混合物，这两种抗原是缺少锚定区域的截短的表面抗原。
适用于免疫原性组合物的其它HIV抗原在以下文献中描述：1990年3月9日提交的美国申请系列号490858、已出版的欧洲申请号181150(1986年5月14日)，以及美国申请系列号60/168471、09/475515、09/475504和09/610313，本文将这些公开的全部内容纳入作为参考。
适用于免疫原性组合物的巨细胞病毒抗原在以下文献中描述：美国专利4,689,225，美国申请系列号367363(1989年6月16日提交)，和PCT出版物WO89/07143。本文将这些公开的全部内容纳入作为参考。
适合用于免疫原性组合物的C型肝炎抗原在下列文献中描述：PCT/US88/04125、已出版的欧洲专利申请号318216(1989年5月31日)、1988年11月18日提交的已出版的日本申请号1-500565、加拿大申请583561和EPO388232，本文将公开的全部内容纳入作为参考。在以下文献中描述了不同组的HCV抗原：欧洲专利申请90/302866.0(1990年3月16日提交)和美国申请系列号456637(1989年12月21日提交)和PCT/US90/01348，本文将公开的全部内容纳入作为参考。
本发明的免疫原性组合物可用于使鸟类和哺乳动物针对疾病和感染产生免疫，所述疾病和感染包括但不限于霍乱、白喉、破伤风、百日咳、流感、麻疹、脑膜炎、腮腺炎、瘟疫、小儿麻痹、狂犬病、洛基山斑疹热(Rocky Mountain spottedfever)、风疹、天花、伤寒、斑疹伤寒、猫白血病毒、黄热病。
本发明某些免疫原性组合物将使用有效量的抗原。例如，组合物中将含有有效量的抗原和佐剂，该组合物将引起对象产生特异的和足够的免疫反应，从而使该对象在随后暴露于病毒、细菌、真菌、支原体或寄生虫时具有保护作用。
在其它实施例中，将使用含有抗原的组合物强化先前给予载体构建物产生的免疫反应，该组合物较佳含有编码该抗原的异源核酸序列。更佳的是，该抗原与本文所述的微粒体结合(或吸附于其上)，和/或该抗原与佐剂一同给予。
对于可用于本发明的各种或每一种抗原，本文并未为它们提供特殊的准则以指定简单的剂量规定。抗原的有效量将是其天生的活性和纯度的函数，并可由本领域熟练的技术人员进行常规试验，凭经验而定。应理解，本发明的佐剂组合物可与全细胞或病毒免疫组合物以及纯化的抗原或蛋白质亚单元或者由重组DNA技术或合成制备的肽免疫原性组合物一起使用。
当抗原与乳剂一起提供时，由于本发明的佐剂组合物稳定的缘故，通常简单地摇动该抗原和乳剂即可使它们混合。其它技术，如使佐剂和抗原的溶液或悬浮液的混合物快速通过小的出口(如皮下注射用针头)很容易提供一种有用的免疫原性组合物。
本发明的免疫原性组合物含有约1纳克到约1000微克的核酸，较佳是DNA，如CpG寡核苷酸。在一些优选的实施例中，该免疫原性组合物含有约10纳克到约800微克的核酸。在一些优选的实施例中，该免疫原性组合物含有约0.1-500微克的核酸。在一些优选的实施例中，该免疫原性组合物含有约1微克到10毫克的核酸。在一些优选的实施例中，该免疫原性组合物含有约250微克到约1毫克的核酸。在一些优选的实施例中，该免疫原性组合物含有约500微克到1毫克的核酸。本领域熟练的技术人员可容易地配制含有所需量的核酸的免疫原性组合物。本发明的免疫原性组合物是无菌和无致热原的。可方便地以单位剂量的形式给予免疫原性组合物，可采用药学领域中已知的任何方法制备该免疫原性组合物，如Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，Easton，PA，1980)，本文将其全部内容纳入作为参考。
本发明还涉及刺激宿主动物中的免疫反应的方法，该方法包括向该动物给予有效引起免疫反应的量的上述一种或多种免疫原性组合物。该宿主动物较佳是哺乳动物，更佳是人。优选的给药途径包括但不限于肌肉内、腹膜内、皮下、经皮、静脉内、动脉内、眼眶内和口腔以及经真皮，或者吸入或栓剂给药。最佳的给药途径并可肌肉内、腹膜内、皮下和经皮注射。根据本发明的一些实施例，使用无针注射装置向宿主动物给予免疫原性组合物，这是周知的并广泛使用。根据本文的讲义，本领域普通的技术人员可使用无针注射装置将免疫原性组合物传送给个体的细胞。此外，本发明的实施例还可与电穿孔一起传送。
本发明还涉及使宿主动物针对病毒、细菌或寄生虫感染产生免疫的方法，该方法包括向所述动物给予其量能有效引起保护反应的上述一种或多种免疫原性组合物。该宿主动物较佳是哺乳动物，更佳是人。优选的给予途径如上述。虽然针对宿主动物的预防性的或治疗性的治疗可针对任何病原体，但是优选的病原体包括但不限于上述病毒、细菌和寄生虫病原体。
本发明还涉及诱导宿主动物的免疫反应的方法，该方法包括向上述动物给予其量能有效引起免疫反应的上述一种或多种免疫原性组合物。该宿主动物较佳是哺乳动物，更佳是人。优选的给药途径如上述。本领域熟练的技术人员将很容易熟悉免疫反应及其测量。
本发明考虑使用具有吸附的大分子的聚合物微粒体或亚微粒体乳剂微粒体单独或者与其它大分子一起引起免疫反应。即本发明包括吸附了核酸的微粒体、吸附了核酸或免疫刺激分子的亚微粒体乳剂，和吸附了核酸的微粒体与吸附了核酸或免疫刺激分子的亚微粒体乳剂的混合物、还采用电穿孔来提高核酸的传送。
由下面的实施例可以证明，本发明的吸附了大分子的聚合物微粒体可引起强烈的免疫反应。此外，本发明的亚微粒体乳剂微粒体也引起强烈的免疫反应。因此，本发明的吸附了大分子的微粒体的混合物是一种引起免疫反应的强有力的工具。
本文将所引用的所有参考文献的全部内容都纳入作为参考。
C. 试验
下面是实施本发明的具体实施例。这些实施例仅仅是阐述性的，无论如何都不能认为它们限制了本发明的范围。本领域熟练的技术人员将认识到在本发明的精神和范围之内的变动。
已作出努力，以确保所使用的数值(如数量、温度等)的准确，但是当然应当考虑到一些试验误差和偏差。实施例1 吸附有核酸的微粒体的制备
采用经改动的溶剂蒸发法制备PLG-CTAB。简言之，通过使用IKA匀浆器以高速用1毫升T.E.缓冲液乳化10毫升5％w/v的聚合物在二氯甲烷中的溶液，从而制得这些微粒体。然后将原始的乳剂加到50毫升的蒸馏水中，该蒸馏水中含有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(0.5％w/v)。由此得到水/油/水乳剂，在室温以6000rpm搅拌该乳剂12小时，使二氯甲烷蒸发。将所得微粒体放到在蒸馏水，通过以10000g离心洗涤2次，然后冻干。
对于100毫克吸附了DNA的微粒体的典型批次，称量100毫克的PLG-CTAB阳离子微粒体，将其放到玻璃瓶中，用5毫升、200微克/毫升的DNA溶液(即，含有gp140或者p55gag的质粒pCMV或pSINCP)在T.E.缓冲液中再悬浮。使所得悬浮液涡旋1分钟，以使这些微粒体均匀地分散在该DNA溶液中。然后将该瓶放到摇动器上，在4℃(低速)摇动，使其过夜吸附。第二天，在Beckman离心机上以8000rpm离心该溶液10分钟，使所述微粒体沉淀，收集上清液，用于DNA定量。将所得沉积物再悬浮在1X TE缓冲液中，用刮勺将该沉积物弄散开，然后以8000rpm离心10分钟，从而对其进行1次洗涤。通过用刮勺将最终所得的沉积物打散，从而使其再悬浮在最少量的去离子水(约2毫升)中，然后在台式冻干机(Labconco)上将其冻干24小时。
在260纳米读取吸光度，从而检测上清液中的DNA含量。将DNA加入总量(1毫克/100毫克微粒体)减去上清液中的量，从而计算得吸附在微粒体上的DNA的量。通过将5毫克最终制剂溶解在0.5M NaOH/1％SDS溶液中，然后在260纳米读取水解后的清晰溶液的吸光度，从而评估总负荷。实施例2 吸附了核酸的亚微粒体乳剂微粒体的制备
将DOTAP(在氯仿中)加到烧杯中，然后使其蒸发到体积为200微升，从而制得由MF59和DOTAP形成的亚微粒体乳剂。加入Tween(0.Sw/w)、角鲨烯(5.0％w/w)和山梨糖醇酯类(0.5％w/w)，为了获得用于最终乳化作用的均质原液，用具有10毫米探头的Omni匀浆器以10K转速/分钟将所得溶液均化1分钟。使所得乳剂通过～800psi下的显微流化器M11OS匀浆器(Microfluidics Co.，Newton，MA)5次、在Coulter的DELSA 440 SX Zetasizer上测得该乳剂的ζ势能(净表面电荷的测量值)大约为+55毫伏。
通过使DNA(1毫克HIV-1 gp140 DNA或0.5毫克p55gag DNA，存在于pCMV或pSINCP中)在4℃过夜与所述亚微粒体乳剂一起培育，从而将这些DNA吸附到亚微粒体上。实施例3 用于吸附到微粒体上的ELVIS载体和其它载体构建物的制备
使用辛德比斯病毒作为代表性例子，构建基于α病毒的ELVIS载体和复制子载体。较佳的是，本领域熟练的技术人员可容易地采用以下步骤由任何α病毒衍生得到载体。用新德比斯病毒的SINDCchiron株(ATCC保藏号VR-2643，1999年4月13号)感染大约107个BHK-21细胞，MOI为1PFU/细胞。感染24小时后，在CPE发展后，根据制造商的建议，使用TRIzo1试剂(GIBCO/BRL)从这些细胞中分离出总RNA。纯化后，将病毒RNA溶解在没有核酶的水中，将所得溶液分成等分，然后在-80℃保存，以在接下来的cDNA克隆中使用。
采用PCR扩增进行cDNA合成，使用以下引物(表示各引物的新德比斯核苷酸编号)：1    CCAC AAGCTTGATCTAATGTACCAGCCTGATGC 11472-11450(SEQ ID NO：29)1.1  CCAC GAATTCAGCCAGATGAGTGAGGC       10364-10381(SEQ ID NO：30)2    CCAC AAGCTTCAATTCGACGTACGCCTCAC    10394-10375(SEQ ID NO：31)2.1  CCAC GAATTCATATGGGGAAATCATGAGCC    9614-9634(SEQ ID NO：32)3    CCAC AAGCTTCATAGACCCTCACTGGCTC     9648-9630(SEQ ID NO：33)3.1  CCAC GAATTCAAGATTAGCACCTCAGGACC    8878-8899(SEQ ID NO：34)4    CCAC AAGCTTCTACACGGTCCTGAGGTGC     8908-8887(SEQ ID NO：35)4.1  CCAC GAATTCCGTCCGATCATGGTAACTCC    8294-8315(SEQ ID NO：36)5    CCAC AAGCTTGCGCCACCGAGGAC          8347-8334(SEQ ID NO：37)5.1  CCAC GAATTCACTGCCATGTGGAGGCC       7797-7814(SEQ ID NO：38)6    CCAC CTCGAGTTTACCCAACTTAAACACGC    7368-7348(SEQ ID NO：39)6.1  CCAC GAGCTCGCGACATTCAATGTCGAATGC   6426-6446(SEQ ID NO：40)7    CCAC CTCGAGGAACTCCTCCCAATACTCGTC   6488-6468(SEQ ID NO：41)7.1  CCAC GAGCTCGACCTTGGAGCGCAATGTCC    5843-5862(SEQ ID NO：42)8    CCAC CTCGAGTTTCGACGTGTCGAGCACC     5900-5882(SEQ ID NO：43)8.1  CCAC GAGCTCGACCATGGAAGCAATCCGC     4814-4832(SEQ ID NO：44)9    CCACCTCGAGACGACGGGTTATGGTCGAC       4864-4845(SEQ ID NO：45)9.1  CCAC GAGCTCCACGGAGACAGGCACCGC      4246-4264(SEQ ID NO：46)10   CCAC CTCGAGGATCACTTTCTTTCCTAGGCAC  4299-4277(SEQ ID NO：47)10.1 CCAC GAGCTCGAACTCTCCCGTAGATTTCC    3407-3427(SEQ ID NO：48)11   CCAC CTCGAGATCAAGTTGTGTGCCCTTCC    3464-3445(SEQ ID NO：49)11.1 CCAC GAGCTCCCAGGGGATATCATCCTGAC    2742-2761(SEQ ID NO：50)12   CCAC CTCGAGGCTGTCATTACTTCATGTCCG   2825-2804(SEQ ID NO：51)12.1 CCAC GAGCTCGAACCGCAAACTATACCACATTGC 1976-1999(SEQ ID NO：52)13   CCAC CTCGAGCTTGTACTGCTCCTCTTCTG     2042-2023(SEQ ID NO：53)13.1 CCAC GAGCTCGGAGAACGGGTATCGTTCC      1029-1047(SEQ ID NO：54)14   CCAC CTCGAGCCGGGATGTACGTGCAC        1069-1052(SEQ ID NO：55)14.1 CCAC GAGCTCATTGACGGCGTAGTACACAC     1-20(SEQ ID NO：56)
使用引物对1-5来克隆病毒结构蛋白基因，而将引物对6-14用于病毒非结构蛋白基因。引物对1-5中的寡核苷酸含有代表EcoRI和HindIII的限制酶切位点的额外序列，这些序列在新德比斯病毒的亚基因组RNA中并不存在。寡核苷酸6-14含有SacI和XhoI的位点，这些位点在新德比斯病毒目前的已测序的链的整个基因组中也不存在(这些位点用下滑线标出)。
根据制造商的建议，使用SuperscriptII酶(GIBCO/BRL)进行各反转录(RT)反应，体积为50微升。反应混合物含有等价于106个细胞的RNA的量和50pmol的下述各引物。
混合物1：引物1、3和5
混合物2：引物2和4
混合物3：引物6、9和12
混合物4：引物8、11和14
将所得RT反应物冷却，然后用于PCT扩增。根据制造商的建议，使用VentDNA聚合酶(NEB)进行PCR反应。每50微升PCR反应物含有3微升的上述RT混合物和50pmol的引物。总共进行14个反应(表1)。
                                       表1
片段的编号 引物 RT反应的数量 片段的长度(bp.)
1 1和1.1 1 1128
2 2和2.1 2 800
3 3和3.1 1 789
4 4和4.1 2 644
5 5和5.1 1 670
6 6和6.1 3 962
7 7和7.1 3 666
8 8和8.1 4 1107
9 9和9.1 3 638
10 10和10.1 3 912
11 11和11.1 4 743
12 12和12.1 3 870
13 13和13.1 3 1034
14 14和14.1 4 1088
片段1-5的PCR反应条件如下：以95℃30秒、56℃30秒、74℃90秒为一轮，共12轮。对于片段6-14，循环由12轮增加到15轮。通过琼脂糖凝胶电泳分析各反应混合物的小等分试样，其证实所需大小的片段的存在。用苯酚-氯仿抽提余下的反应混合物，用乙醇沉淀出DNA片段。
对于克隆，使用HindIII和EcoRI消化片段1-5，然后使它们与经相同的酶处理的质粒pRS2(在多接头上具有额外的限制位点的pUC19)连接。用SacI和XhoI消化片段6-14，然后使它们与经SacI和XhoI处理的相同的pRS2质粒连接。将所有的重组质粒转化到大肠杆菌XL-1 Blue株(Stratagene，La Jolla，CA)中。
此外，还使用以下引物对产生代表亚基因组启动子区域和3′端非翻译区的cDNA克隆：
YSIN1F：5’-GATTCGGTTACTTCCACAGC(SEQ ID NO：57)
YSIN1R：5’-ACTGACGGCTGTGGTCAGTT(SEQ ID NO：58)
YSIN2F：5’-GATGTACTTCCGAGGAACTG(SEQ ID NO：59)
YSIN2R：5’-CCACAAGCTTGAATGTTAAAAACAAAATTTTGT(SEQ ID NO：60)
使各转化物的阳性菌落生长，根据制造商的建议，使用QIAGEN试剂金纯化质粒。然后，分别将标记为p1-p14的片段装配成适当的载体构型。
使用新德比斯病毒cDNA克隆p1-p14加上下面的亚基因组和3′端区域片段，构建用于体外转录复制子载体RNA的真核生物分层载体起始系统(EukaryoticLayered Vector Initiatien System，ELVIS)和α病毒载体构建物。使含有SP6 RNA聚合酶的启动子和新德比斯病毒基因组RNA起点的ApaI-MscI片段与克隆的片段14的MscI-XhoI片段在ApaI-XhoI消化的质粒pRS2中连接。所得质粒称为p15。接着，将p8的SacI-EcoRI片段、p7的EcoRI-NsiI片段以及p6的NsiI-XhoI片段连接到SacI-XhoI消化的pRS2中。所得的质粒称为p16。接着，将p12的SacI-MunI片段、p11的MunI-NheI片段和p10的NheI-XhoI片段连接到SacI-XhoI消化的pRS2质粒中。所得的质粒称为p17。将p15的ApaI-ApaLI片段和p13的ApaLI-XhoI片段连接到ApaI-XhoI处理的pRS2中，所得的质粒称为p18。接着，将p18的ApaI-NsiI片段和p17的NsiI-XhoI片段一起连接到ApaI-XhoI处理的pRS2中。所得的质粒称为p19。最后，将p19的ApaI-AvrII片段、p9的AvrII-SalGI片段和p16的SalGI-BamHI片段一起连接到先前构建的表达GFP报道基因的新德比斯复制子载体中(参见Dubensky等，J.Virol.，70：508-519，1996；Polo等，1999，同前；和美国专利5843723)，该载体已经被ApaI-BamHI消化，除去了先前存在的非结构蛋白基因。所得的新德比斯载体构建物含有从SINDCchrion病毒株获得的序列，还编码GFP报道基因，称为SINCR-GFP(也已知为DCSP6SINgfp)。使用PmeI使该DNA直线化，接着如先前所述(Polo等，同前；Dubensky等)，使用噬菌体SP6聚合酶进行体外转录，从而从上述报道基因构建物制备复制子RNA，以及表达各种其它异源序列(如抗原，详见本说明书中的描述)的新德比斯载体构建物。
类似地，将新德比斯序列装配到基于α病毒的真核生物分层载体起始系统(参见美国专利5814482和6015686)中，在该系统中，自增大的载体RNA在ELVIS质粒DNA-转染的真核生物细胞中经由真核生物启动子(如RNA聚合酶II启动子)直接进行转录。通过用上面获得的相应的SINCR-GFP序列取代已存在的ELVIS载体中的新德比斯衍生序列，可以构建一种也表达GFP报道基因的ELVIS质粒DNA。以之前描述的ELVIS载体pSINI1.5(Hariharan等，J.Virol.，72：950-958，1998)开始，使用各质粒中发现的两个SacI位点，用从pCMVLink得到的骨架(zurMegede等，J.Virol.，74：2628-2635，2000)取代原质粒骨架，从而对其进行修饰，以产生中间构建物，即ELVIS1.5CB。接着，用SacI部分消化ELVIS1.5CB，用T4DNA聚合酶产生粘性末端，然后使其连接到修饰位点PmeI接头5′-GTTTAAAC-3′上，从而将ELVIS1.5CB的两个SacI位点中的一个消除(接近SIN 3′端的位点)。将没有靶定的SacI位点的正确的质粒称为ELVIS1.5CbdlSac。然后用SacI和XhoI进行消化，将这种中间质粒制备成新的SIN非结构蛋白基因的插入子。采用PCR扩增，由SINCR-GFP获得相应的非结构基因，使用到以下寡核苷酸引物：5′CCTATGAGCTCGTTTAGTGAACGTATTGACGGCGTAGTACACAC(SEQ  IDNO：61)和5′CCTATCTCGAGGGTGGTGTTGTAGTATTAGTC(SEQ ID NO：62)，接着用SacI和XhoI消化，连接，得到中间构建物SINCP-Not。最后，通过部分消化此构建物，然后加入Klenow片段，将此构建物两个NotI位点中的一个除去，仅留下位于多接头中的NotI位点。将这种新构建的ELVIS载体称为SINCP(或pSINCP)。
首先用XhoI/NotI或XhoI/XbaI消化SINCR或SINCP α病毒载体，接着将其与所需的仍具有XhoI/NotI或XhoI/XbaI末端的DNA片段连接，从而可将异源序列(如编码抗原的基因)插入其中。或者，可将这些位点变为粘性末端，或者可使用其它多接头位点(或者可取代其它异源序列)，以使大量插入子的克隆得以进行。例如，将HIV-1 p55gag(SF2株)和gp140 env(SF162株)编码基因插入这些载体中。具体而言，通过用XhoI/XbaI消化该载体，然后在由SalI/XbaI消化获得的p55gagmod片段中进行连接，从而可将密码子优化的HIV p55gagmod序列(参见共同拥有的美国专利申请09/475515；zur Megede等，同前)插入。所得的载体称为SINCR-p55gag和SINCP-p55gag。类似地，将密码子优化的HIV gp140序列(在实施例10中描述，以及Banett等，2001，J.Virol.，75：5526-40)插入SINCR和SINCP质粒中，产生构建物SINCR-gp140和SINCP-gp140。如实施例中所述，制备由SINCR质粒体外转录得到的ELVIS质粒DNA(pSINCP)和RNA载体复制子。实施例4 使用微粒体或亚微粒体乳剂用具有pCMV或pSINCP质粒的抗原免疫猕猴
如前面实施例1和2所述，制备PLG聚合物微粒体和MF59亚微粒体乳剂。为了分析具有存在于微粒体上或亚微粒体乳剂中的质粒载体构建物、pCMV-gp140或pCMV-p55gag(参见共同拥有的美国专利申请09/475515)的免疫猕猴的不同效果，以及比较使用上面构建的ELVIS质粒、pSINCP-gp140或pSINCP-p55gag的效果，制备了多组微粒体和亚微粒体乳剂。使用下述不同的制剂免疫6组动物：
第1组使用了pCMV-gp140和pCMV-p55gag，没有微粒体或亚微粒体乳剂；
第2组使用了吸附在PLG/CTAB微粒体上的pCMV-gp140和pCMV-p55gag；
第3组使用了吸附在MF59-DOTAP亚微粒体乳剂中的pCMV-gp140和pCMV-p55gag；
第4组使用了没有微粒体或亚微粒体乳剂的pSINCP-gp140和pSINCP-p55gag；
第5组使用了吸附在PLG/CTAB微粒体上的pSINCP-gp140和pSINCP-p55gag；
第6组为对照，没有使用抗原，也没有使用微粒体和亚微粒体乳剂。
对于各组动物，用足量的物质免疫5只猕猴(第6组仅有4只)，这样使具有gp140 DNA的载体的剂量达到每只1.0毫克，使含有p55gag DNA的载体的剂量达到每只0.5毫克，但是对照组除外。第一次免疫后4周进行第二次免疫，第一次免疫后14周进行第三次免疫。分析第2周(2wp1)、第6周(2wp2)、11-12周(7wp2)和第16周(2wp3)的血清。免疫途径是IM TA。免疫后，测量血浆抗-p55gag和抗-gp140 IgG滴度，结果列在表2和3中，这些结果为几何平均滴度。
                                  表2
                       抗-p55gag的血清IgG滴度(几何平均值)
组别 DNA形式 2wp1 2wp2 7wp2 2wp3
1 PCMV，在盐水溶液中 7 19 19 118
2 PCMV，吸附在PLG/CTAB微粒体上 490 10770 4360 1637
3 PCMV，吸附在MF59/DOTAP乳剂中 142 5702 1480 3536
4 pSINCP，在盐水溶液中 8 7 8 45
5 pSINCP，吸附在PLG/CTAB颗粒上 728 19256 3426 856
6 无 12 9 8 7
                                  表3
                    抗-gp140的血清IgG滴度(几何平均值)
组别 DNA形式 2wp1 2wp2 7wp2 2wp3
1 PCMV，在盐水溶液中 5 517 81 2460
2 PCMV，吸附在PLG/CTAB微粒体上 5 2762 5290 1913
3 PCMV，吸附在MF59/DOTAP乳剂中 5 564 112 4823
4 pSINCP，在盐水溶液中 8 48 20 70
5 pSINCP，吸附在PLG/CTAB颗粒上 15 11289 4266 1002
6 无 12 14 11 11
使用与前述相同的动物组分析CTL反应的诱导。效应器∶靶标比(E∶T)的范围为大约4∶1到100∶1。CTL试验的结果显示在表4和5中。“应答者”是其靶标在两个或更多个连续的E∶T比中显示出10％或更多的特异性裂解的猕猴。
                                表4
                        应答者的数量(p55gag)
组别 DNA形式 2wp1 2wp2 7wp2 2wp3
1 PCMV，在盐水溶液中 0 4 1 4
2 PCMV，吸附在PLG/CTAB微粒体上 3 3 2 3
3 PCMV，吸附在MF59/DOTAP乳剂中 0 1 1 0
4 pSINCP，在盐水溶液中 0 1 0 0
5 pSINCP，吸附在PLG/CTAB颗粒上 0 3 1 1
6 无 0 0 0 0
                                表5
                         应答者的数量(gp140)
组别 DNA形式 2wp1 2wp2 7wp2 2wp3
1 PCMV，在盐水溶液中 0 0 0 0
2 PCMV，吸附在PLG/CTAB微粒体上 0 0 0 0
3 PCMV，吸附在MF59/DOTAP乳剂中 0 0 0 0
4 pSINCP，在盐水溶液中 0 0 0 1
5 pSINCP，吸附在PLG/CTAB颗粒上 0 1 0 1
6 无 0 0 0 0
还使用相同的动物进行淋巴增殖分析。这种试验测量T细胞在体外对抗原的再刺激作出响应而产生的特异性增殖。通过在Ficoll-Hypaque梯度上离心，从肝素化的全血中纯化出猕猴外周血单核细胞(PBMC)。在平底微滴定板上在存在和缺乏3微克/毫升的纯化的重组p55gag蛋白的情况下，以2×105个细胞/孔的数量培育PBMC。每种条件进行6组相同培育。培育4天后，加入氚化的胸苷{[3H]TdR}(每孔1微居里)。继续过夜培育，第二天收集。将细胞沉积到玻璃微纤维滤片上。使滤片暴露在闪烁液体中，在液体闪烁计数器下计数。对于加入[3H]TdR的各条件，计算6组中以每分钟的平均计数(cpm)测得的数值。所得的结果列在表6中。用p55gag刺激的细胞的每分钟计数(cpm)除以未刺激细胞的cpm，计算几何平均刺激指数(Geometric Mean Stimulation Index，GMSI)，因此，GMSI越大，其结果越显示为阳性。
                                       表6
                                       GMSI
组别 DNA形式 2wp1 2wp2 7wp2 2wp3
1 PCMV，在盐水溶液中 2.6 5.1 3.0 3.2
2 PCMV，吸附在PLG/CTAB微粒体上 6.6 15.4 5.9 4.6
3 PCMV，吸附在MF59/DOTAP乳剂中 9.1 29.5 13.6 10.5
4 pSINCP，在盐水溶液中 7.5 6.6 4.1 4.3
5 pSINCP，吸附在PLG/CTAB颗粒上 10.4 13.8 5.4 4.4
6 无 1.4 1.5 1.3 1.2
还使用相同的动物来分析胞内细胞因子生产的诱导。这种试验测量T细胞体外针对抗原的短暂再刺激作出响应而产生的细胞因子的特异性生产。通过在Ficoll-Hypaque梯度上离心，从肝素化的全血中纯化出猕猴外周血单核细胞(PBMC)。在共刺激性抗-CD28单克隆抗体的存在下，用横跨gag(或env)蛋白序列的合成性重叠肽刺激1×106PBMC的等分试样。加入布雷菲德菌素A，以使新合成的细胞因子在细胞中积聚。过夜培育PBMC后，用市售获得的用于检测胞内干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(THF-α)以及细胞表面CD4和CD8标记物的荧光标记的单克隆抗体进行染色。在流式细胞器上分析染色的细胞样品，获得大约50000-100000PBMC的数据。使用市售获得的软件测定各样品中细胞因子阳性细胞的频率。gp140和p55gag的结果分别列在表7和8中。这两个表显示了响应动物的数量，其中应答者被定义为具有以下动物分值的动物：采用细胞内染色的方法，每100000个CD4细胞中有100个以上表达THF-α和IFN-γ。
                            表7
                      gp140细胞因子应答者
组别 DNA形式 2wp2 7wp2 2wp3
1 PCMV，在盐水溶液中 1 0 0
2 PCMV，吸附在PLG/CTAB微粒体上 1 2 0
3 PCMV，吸附在MF59/DOTAP乳剂中 0 0 0
4 pSINCP，在盐水溶液中 0 0 0
5 pSINCP，吸附在PLG/CTAB颗粒上 0 1 0
6 无 0 0 0
                             表8
                     p55gag细胞因子应答者
组别 DNA形式 2wp1 7wp2 2wp3
1 pCMV，在盐水溶液中 0 0 0
2 pCMV，吸附在PLG/CTAB微粒体上 2 1 0
3 pCMV，吸附在MF59/DOTAP乳剂中 0 0 0
4 pSINCP，在盐水溶液中 0 0 0
5 pSINCP，吸附在PLG/CTAB颗粒上 1 1 0
6 无 0 0 0
实施例5 RNA载体构建物
可将RNA载体构建物(如复制子)吸附到微粒体上，以用于将异源核酸序列传送到动物的细胞中。RNA载体构建物通常含有病毒RNA，该病毒RNA中的基因组RNA区域(如结构蛋白基因)被选择的异源序列取代，该异源序列衍生自用于感兴趣的基因产物的DNA编码序列。RNA载体构建物的代表性例子包括但不限于α病毒RNA载体(例如，可参见美国专利5843723，PCT出版物WO 99/18226，和Polo等，1999，PNAS，96：4598-4603)、小RNA病毒RNA载体(例如，可参见美国专利6156538，和Vignuzzi等，2001，J Gen Virol.，82：1737-47)、黄病毒RNA载体(例如，可参见Vamavski等，1999，Virology，255：366-75)、和风疹病毒RNA载体(例如，可参见Pugachev等，2000，J.Virol.，74：10811-5)。用于本发明的RNA载体构建物通常可采用标准的体外转录，由作为原料的质粒cDNA构建物获得(参见上面的文献)。与质粒DNA类似，可将这些RNA载体构建物吸附到本发明的微粒体上，如实施例中所述。例如，通过在1毫克/毫升的DNA溶液中，在4℃培育100毫克的阳离子微粒体6小时，从而可将这些RNA载体构建物吸附到所述微粒体上。然后离心分离这些微粒体，用TE缓冲液洗涤所得沉淀，然后冻干微粒体。PLG-配制的RNA载体构建物的重新配制和传送与DNA的相似，使用例如至少1微克、10微克、100微克或1000微克的配制的RNA载体构建物用于传送。实施例6 小鼠中的佐剂
使用小鼠进行试验，分析佐剂磷酸铝(alum)在小鼠中的作用。如上述制得聚合物微粒体，其上吸附或没有吸附pCMV-p55gag。在第0周和第6周，将10微克DNA(不管是裸的还是吸附在PLG微粒体上的)注射给6 CB6 F1组的小鼠，其中存在或不存在磷酸铝。结果显示在表9中，以几何平均滴度计。
                                     表9
                           抗-p55gag的血清IgG
组别 DNA形式 3周 6周 9周 12周
1 pCMV，在盐水溶液中 28 149 6238 5274
2 pCMV，吸附在PLG微粒体上 5022 21992 346856 171301
3 pCMV，在加了铝盐的盐溶液中 1536 3039 195070 92438
实施例7 用微粒体和ELVIS载体和RNA载体构建物进行电穿孔
电穿孔可以与与上述任何核酸(如质粒DNA、ELVIS载体和RNA载体构建物)一起制得的聚合物微粒体或亚微粒体乳剂微粒体一起使用。实施例8 用初次和强化免疫诱导猕猴的免疫应答
进行试验，以测定初次用DNA免疫，接着用吸附在PLG微粒体上的蛋白质强化的效果。具体而言，如上文以及共同拥有的国际专利申请PCT/US99/17308所述制得PLG-SDS微粒体，然后使纯化的重组p55gag蛋白吸附到这些微粒体的上面。用1毫克pCMV-p55gag免疫一组动物。在第4周再次免疫这些动物，然后在第8周再免疫一次。在第41周，用吸附在PLG微粒体上的p55gag蛋白强化免疫这些动物。结果显示在表-10中，其中显示了应答者的抗体滴度、辅助T细胞淋巴增殖的诱导(应答者的平均刺激指数)以及CTL的诱导(应答者的数量，以在两个或多个连续的E∶T比中大于10％的裂解计)。结果是在第3次初次刺激后14周测得的初次体积，以及在强化刺激后2周测得的强化体积。圆括号中的数值是总的4只动物中应答动物的数量。
                                      表10
             疫苗      抗体滴度     淋巴增殖(SI)      CTL
初次 强化 初次 强化 初次 强化 初次 强化
pCMV-p55gag PLG/p55gag 44(1) 1777(4) 2.5(2) 21.8(4) 4 4
实施例9 中和抗体的诱导
用上面实施例5的猕猴的血清测试对两种不同的HIV-1株(SF2和SF162)的抑制作用，使用到PMBC-生长的病毒原液和基于CCR5+/CXCR4+/CD4+T细胞系的试验。将血清以1∶20稀释。测量抑制活性，并以抑制百分数表达。将各动物所得的结果减去各动物免疫前的血清的抑制活性。各组5只动物中每只动物的结果列在表11中。
                                 表11
                               抑制百分数
  组别   DNA形式     HIV-1SF2   HIV-1SF162
 2wp2  2wp3  2wp2  2wp3
1 pCMV，在盐水溶液中  00000  00800  00000  01701252
2 pCMV吸附在PLG/CTAB微粒体上  58007248  404107961  360011  000010
3 pCMV吸附在MF59/DOTAP乳剂中  00768115  100010010093  00300  00400
4 pSINP，在盐水溶液中  00000  00000  0012016  00100
5 pSINCP吸附在PLG/CTAB微粒体上  7343916991  5000023  1929432无效  00060
实施例10 质粒的制备
使由人巨细胞病毒(CMV)启动子驱动、编码HIV-1 p55gag和gp140env的质粒在大肠杆菌DH5α株中生长，用Qiagen Endofee Plasmid Giga试剂盒(Qiagen，Inc.)进行纯化，然后再悬浮在0.9％氯化钠中(Abbott Laboratories，North Chicago，Ill.)。所使用的pCMV载体含有CMV的立即早期增强子/启动子和牛生长激素终止子，这在别处有详细的描述〔Chapman，B.S.等，1999，《从人巨细胞病毒(Towne)立即早期基因获得的内含子A在哺乳动物细胞中对异源表达的影响》(Effeet of intronA from human cytomegalovirus(Towne)immediate-early gene on heterologousexpression in mammalian cells)，《核酸参考》(Nucleic Acids Res.)，19：3979-86〕。HIV gag质粒DNA疫苗(pCMVgag)含有合成构建的p55gag基因，和反映哺乳动物用途的密码子，该密码子如先前所述从HIV-1 SF2株衍生得到〔zur Megede，J.等，2000，《序列修饰的人免疫缺陷病毒1型gag基因的增加表达和免疫原性》(Increased expression and immunogenicity of sequence-modified humanimmunodeficiedcy virus type 1 gag gene)，J.Virol.，74：2628-35〕。HIV env质粒DNA疫苗(pCMVgp140)由人组织纤溶酶原激活物(tPA)信号序列和从HIV-1 SF162株获得的gp140组成，其密码子被优化，以在哺乳动物细胞中获得高水平的表达〔Barnett，S.W.等，2001，《寡聚人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜抗原引起针对初次HIV-1分离物的中和抗体的能力通过部分删除第二高度可变区而得到提高》(The ability of an oligomeric human immunodeficiecy virus type 1(HIV-1)envelopeantigen to elicit neutralizing antibodies against primary HIV-1 isolates is improvedfollowing partial deletion of the second hypervariable region)，J.Virol.，75：52526-40〕。在实施例3中已经描述了具有HIV-1 p55gag或gp140env的SINCP质粒载体。实施例11 蛋白质的制备
gp160envSF162的蛋白质和cDNA序列已由Cheng Mayer、C.M.Quiroga、J.W.Tung、D.Dina和J.A.Levy在1990年在《人免疫缺陷病毒1型T细胞的病毒决定子或巨噬细胞向性，致细胞病性，以及CD4抗原调节》(Viral determinants of humanimmuodeficiency virus type 1 T-cell or macrophage tropism cytopathogenicity，andCD4 antigen modulation)(J.Virol.，64：4390-8)中公开。这些序列可在Genbank中找到，保藏号为M65024。使重组HIV-1g140.SF162(dV2)蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中表达，然后如先前所述进行纯化(Barnett，S.W.，ET.，2001，J.Virol.，75：5526-40)。
使重组HIV-1.SF2 p55gag蛋白在酵母中表达，然后采用阳离子交换色谱法进行纯化(希龙公司，Emeryville，CA)。将从HIV-1的SF2株获得的p55gag cDNA序列(Genbank保藏号K02007)克隆到遍在蛋白质表达载体中，得到在野生型序列的N末端上加入了甘氨酸和精氨酸的序列。使用50mM磷酸盐、6M尿素(pH7.9)从酵母细胞沉淀物中抽提出重组的p55gag蛋白，接着进行S-fractogel(阳离子性)离子交换色谱法纯化。使用线性NaCl梯度得到p55gag的洗脱液(峰值出现在0.4m的NaCl)。采用SDS-PAGE评估纯度为90％。实施例12 吸附了DNA的聚(丙交酯-共-乙交酯)PLG微粒体
从Boehringer Ingelheim获得PLG聚合物(RG505)。采用改动的溶剂蒸发法制备阳离子型微粒体。简言之，通过使用IKA匀浆器以高速用1毫升磷酸盐缓冲液(PBS)乳化10毫升5％w/v的聚合物在二氯甲烷中的溶液，从而制得这些微粒体。然后将原始的乳剂加到50毫升的蒸馏水中，该蒸馏水中含有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(0.5％w/v)。由此得到水包油包水乳剂，在室温以6000rpm搅拌该乳剂12小时，使二氯甲烷蒸发。将所得微粒体放入蒸馏水，通过以10000g离心洗涤2次，然后冻干。通过在4℃使100毫克的阳离子型微粒体在5毫升200微克/毫升的实施例11的质粒DNA溶液中培育6小时，从而使该质粒DNA吸附到所述微粒体上。然后离心分离这些微粒体，用TE(Tris-EDTA)缓冲液洗涤所得沉淀物，冻干这些微粒体。实施例13 吸附了蛋白质的PLG微粒体
采用溶剂蒸发技术制备空白微粒体。简言之，使用10毫米探针，以高速使10毫升6％w/v的聚合物在二氯甲烷中的溶液与40毫升含有SDS(1％w/v)的蒸馏水搅拌均匀，从而制得所述微粒体。所得溶液为水包油乳剂，然后在室温以1000rpm搅拌所得乳剂12小时，使二氯甲烷蒸发。用38um目的筛过滤所得的微粒体，用蒸馏水洗涤3次，然后冻干。使用粒径分析器(Master sizer，Malvern Instruments，UK)测得所得微粒体的大小分布。
使50毫克冻干的SDS空白微粒体与0.5毫克实施例12的p55gag蛋白在10毫升pH为9的25mM硼酸盐缓冲液(加了6M的尿素)中培育。在室温将颗粒放在实验用振荡器(Aliquot mixer，Miles labs)上5小时。离心使所得微粒体从培育培养基中分离，用含有6M尿素的硼酸盐缓冲液洗涤SDS沉淀物1次，然后用蒸馏水洗涤3次，冻干。
通过在室温将10毫克所得微粒体溶解在2毫升5％SDS-0.2M氢氧化钠溶液中，从而测定蛋白质吸附到微粒体上的负荷水平。采用BCA蛋白质检测(Pierce，Rockford，Illinois)测量蛋白质的浓度。使用Malvemζ分析器(Malvern Instruments，UK)测量空白的微粒体和吸附了蛋白质的微粒体的ζ势能。实施例14 具有MF59佐剂的蛋白质的制备
如先前所述(Barnett，S.W.等，2001，J.Virol.，75：5526-40)，将实施例12的重组HIV-1 g140.SF162(dV2)蛋白与MF59佐剂混合。实施例15 免疫
在Southern Research Institute(Frederick，MD)饲养雄性和雌性猕猴。
在第0、4和14周进行质粒DNA免疫。给猕猴肌肉内注射0.5毫克实施例11的pCMV gag(在盐水中，或者如实施例13与PLG/CTAB微粒体一起配制，或者如实施例2所述与MF59/DOTAP一起配制)和1.0毫克实施例11的pCMV env(在盐水中，或者如实施例13所述与PLG/CTAB微粒体一起配制)，每只动物在4个分离位置上进行注射(在右上臂和右上腿分别注射0.25毫克的pCMV gag；在左上臂和左上腿分别注射0.5毫克的pCMV env)。或者，给猕猴肌肉内注射0.5毫克实施例11的pSINCPgag(在盐水中，或者如实施例13所述与PLG/CTAB微粒体一起配制)和1.0毫克实施例11的pSINCP env(在盐水中，或者如实施例13所述与PLG/CTAB微粒体一起配制)，也在每只动物的4个不同位置上进行注射。
在第29周给猕猴肌肉内注射0.2毫克实施例14的重组p55gag蛋白/PLG微粒体，在第38周给它们肌肉内注射0.1毫克实施例15的重组gp140env(dV2)蛋白/MF59佐剂，以进行强化。实施例16 抗体反应
在免疫后各任何时间，从麻醉的动物收集肝素化的血液，离心回收血浆。采用酶联免疫吸附检测(ELISA)测量抗-HIV Gag和Env抗体，具体如下。用5微克/毫升的重组HIV-1.SF2 p55gag蛋白或重组HIV-1.SF162 gp140env蛋白在PBS中的溶液包涂微滴定板的孔，每孔50微升，然后在4℃过夜培育。用洗涤缓冲液(PBS，0.3％Tween 20)洗涤平板6次，然后在37℃每孔用200微升阻断缓冲液(PBS，0.3％Tween 20，5％山羊血清)阻断1小时。以1∶25稀释测试样品，然后逐次在阻断缓冲液中稀释3倍。吸出该阻断溶液，然后在室温培育这些平板1小时，该平板每孔具有70微升的上述血浆稀释液。洗涤6次后，将平板在37℃与偶联了辣根过氧化物酶的抗-IgG(1∶8000稀释度)培育1小时。洗涤6次后，用TMB底物发展这些平板15分钟。用2N HCl中止反应，在450纳米波长测量光密度(OD)。以获得0.5的OD 450nm时的稀释液的倒数计为滴度。
                                                       表12
                                             猕猴抗-gag血浆抗体滴度
时间(1) 初次   第1次后2周   第2次后2周   第2次后7周   第3次后2周   第3次后6周   第3次后10周   第3次后13周   蛋白(4)后2周
  质粒DNA   制剂   周   0   2   6   11   16   20   24   27   31
  pCMV-p55gag   盐水   几何平均值(2)   5   6   19   19   118   66   91   41   1684
  LL(3)   5   5   8   8   68   32   60   22   955
  UL(3)   5   8   42   41   206   133   138   78   2971
  pCMV-p55gag   PLG/CTAB   几何平均值   6   490   10770   4360   1637   550   349   286   9968
  LL   5   302   6672   2325   970   340   190   188   7370
  UL   8   795   17384   8179   2762   890   642   435   13484
  pCMV-p55gag   MF59/DOTAP   几何平均值   7   142   5702   1479   3536   1481   1183   854   2126
  LL   5   35   2275   577   1158   535   478   235   468
  UL   9   568   14293   3796   10797   4098   2931   3103   9664
  pSINCP-p55gag   盐水   几何平均值   6   8   7   8   45   24   42   32   1003
  LL   5   5   5   5   18   13   23   14   386
  UL   8   11   11   13   114   46   78   72   2606
  pSINCP-p55gag   PLG/CTAB   几何平均值   8   728   19256   3427   856   489   648   687   23543
  LL   6   635   10711   2259   596   331   431   396   13750
  UL   11   835   34619   5199   1229   723   975   1194   40312
  无   几何平均值   9   12   9   8   7   7   8   8   7
  LL   6   7   5   5   5   5   5   5   5
  UL   13   19   16   14   9   11   14   14   9
(1)  相对于在第0、4和14周进行的质粒免疫
(2)  各组的几何平均值
(3)  由对数转化滴度计算得到的组算术平均值和标准误差，LL＝算术平均值-标准误差的反对数；UL＝算术平均值+标准误差的反对数
(4)  在第29周给予吸附到阴离子性PLG微粒体上的重组p55gag蛋白
                                                              表13
                                                    猕猴抗-env血浆抗体滴度
时间(1) 初次   第1次后2周   第2次后2周   第2次后7周   第3次后2周 第3次后6周 第3次后10周 第3次后13周 第3次后17周 第3次后23周   蛋白(4)后2周  蛋白(4)后8周
  质粒DNA   制剂   周   0   2   6   11   16   20   24   27   31   37   40  46
  pCMV-gp140env 盐水   几何平均值(2) 5 5 589 81 2460 342 30 26 24 13 35827 17926
  LL(3)   5   5   273   32   1703   227   10   9   9   5   28151  14079
  UL(3)   5   5   1272   202   3555   515   94   72   69   31   45544  22824
  pCMV-gp140env   PLG/CTAB   几何平均值 6 5 3200 5290 1913 236 261 43 42 29 27939 13992
  LL   5   5   1306   2430   879   87   201   18   17   13   18016  9019
  UL   8   5   7841   11515   4163   640   338   105   101   64   43329  21707
pCMV-gp140env   MF59/DOTAP 几何平均值 7 5 659 112 4823 589 258 223 171 121 5698 3301
  LL   5   5   176   51   2125   169   90   79   64   48   972  645
  UL   9   5   2461   248  10946   2052   742   630   451   304   33409  16903
  pSINCP-gp140env   盐水   几何平均值 6 5 44 20 70 36 12 12 14 12 15294 7660
  LL   5   5   12   8   13   10   5   5   5   5   7853  3931
  UL   8   5   168   49   366   127   31   30   37   31   29787  14926
  pSINCP-gp140env   PLG/CTAB   几何平均值 8 15 8735 4266 1002 228 20 33 18 15 33801 16921
  LL   6   8   5015   2817   656   152   8   15   8   8   27002  13521
  UL   11   30   15214   6459   1531   341   46   74   38   31   42313  21175
无   几何平均值 9 12 11 11 11 11 11 11 10 13 12 12
  LL   6   5   5   5   5   5   5   5   5   5   5  5
  UL   13   28   23   25   26   24   22   25   22   32   29  30
(1)  相对于在第0、4和14周进行的质粒免疫
(2)  各组的几何平均值
(3)  由对数转化滴度计算得到的组算术平均值和标准误差，LL＝算术平均值-标准误差的反对数；UL＝算术平均值+标准误差的反对数
(4)在第38周给予重组寡聚gp140env(ΔV2)蛋白/MF59佐剂实施例17 溶细胞性T淋巴细胞(CTL)反应
制备51条长各20个氨基酸(aa)、有10个氨基酸重叠并横跨p55gag的合成肽的混合物，和66条长各20个氨基酸、有10个氨基酸重叠、并横跨gp140的合成肽的混合物。在Ficoll-Paque(Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J.)梯度上离心，从肝素化的血液中分离出猕猴外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC放到24孔平板中培育8天，每孔3×106个细胞、1.5毫升AIMV/RPMI 1640(50∶50)培养基(Gibco-BRL，Grand Island，N.Y.)，该培养基补充了10％的胎牛血清。加入上述gag肽混合物刺激gag特异性CTL，加入上述env肽混合物刺激env特异性CTL。用重组的人白介素-7(IL-7，15纳克/毫升；R & D Systems，Minneapolis，Minn.)补充该培养基。在第1、3和6天加入人重组IL-2(20IU/毫升，Proleukin，希龙)。将PBMC暴露于含有狒狒疱疹病毒培养基上清液中，在0.5微克/毫升的环菌素A(Sigma，St.Louis，MO)的存在下，从S594细胞系〔Falk，L.等，1976，《涉及EB病毒的狒狒嗜淋巴细胞性疱疹病毒的特性》(Properties of a baboon lymphotropic herpesvirusrelated to Epstein-Barr virus)，Int J Cancer.，18：798-807；Rabin，H.等，1976，《狒狒(Papio hamadryas)淋巴瘤的病毒学研究：泡沫病毒的分离和表征》，(Virologicalstudies of baboon(Papio hamadryas)lymphoma：isolation and characterization offoamyviruses)，J Med Primatol，5：13-22〕衍生得到稳定的猕猴B-类淋巴母细胞系(B-LCL)。使自体B-LCL感染上编码HIV-1/SF2 gag-pol(rVVgag-pol)或HIV-1.SF162 gp160env(rVVgp160env)重组牛痘病毒(rVV)(PFU：细胞比为10)，该病毒同时还标记了Na[51Cr]2O4(NEN，Boston，MA)，每1×106B-LCL为25微居里。在37℃过夜培育后，洗出rVV-感染的51Cr标记的B-LCL，然后加到含有3倍逐次稀释的培育的PBMC的孔中(每个圆底孔2500个)，做2组平行实验。然后将105未标记、未感染的B-LCL加到各孔中，以抑制非特异性细胞裂解。在37℃培育4小时后，收集50微升的培养物上清液，然后将其加到LumaPlates(Packard，Meriden，CT)中，使用Microbeta 1450液体闪烁计数器(Wallac，Gaithersburg，MD)计算其放射性。采用下式将从裂解靶标中释放出来的51Cr归一化：特异性51Cr释放％＝100％×(平均试验cpm-SR)/(MR-SR)，其中SR＝从单独的靶标得到的平均cpm，MR＝从暴露于Triton X-100的靶标得到的平均cpm。如果在gag肽混合物刺激的PBMC的两个连续的稀释度中，rVVgag-pol感染的B-LCL的裂解超过rVVgp160env感染的B-LCL的裂解至少10％，并且如果在培育的PBMC的两个连续稀释度中，由gag肽混合物刺激的PBMC引起的rVVgag-pol感染的B-LCL的裂解超过由env肽混合物刺激的B-LCL引起的rVVgag-pol感染的B-LCL的裂解至少10％，则可以确定该动物具有阳性的p55gag特异性应答。如果在env肽混合物刺激的PBMC的两个连续的稀释度中，rVVgp160env感染的B-LCL的裂解超过rVVgag-pol感染的B-LCL的裂解至少10％，以及如果在培育的PBMC的两个连续的稀释度中，由env肽混合物刺激的PBMC引起的rVVgp160env感染的B-LCL的裂解超过gag肽混合物刺激的B-LCL引起的rVVgp160env感染的B-LCL的裂解至少10％，则可以确定该动物具有阳性的gp160特异性应答。
                                    表14  gag-特异性CTL
                           疫苗引起的p55gag特异性CTL的诱导
                               每组(n＝5)阳性动物的数量
  第-2周   第2周   第6周   第11周   第16周   第20周   第24周
  疫苗   时间：初次   第1次后2周   第2次后2周   第2次后7周   第3次后2周   第3次后6周   第3次后10周
  PSINCP   0   0   1   0   0   0
  pSINCP/PLG   0   0   3   1   1   0
  pCMV   0   0   4   1   4   3   1
  pCMV/PLG   0   3   3   2   3   1   1
  pCMV/MF59   0   0   1   1   0   0
  无   0   0   0   0   0   0
                               表15 env-特异性CTL
                      疫苗引起的gp140env特异性CTL的诱导
                           每组(n＝5)阳性动物的数量
  第-2周   第2周   第6周   第11周   第16周   第20周   第24周
  疫苗   时间：初次   第1次后2周   第2次后2周   第2次后7周   第3次后2周   第3次后6周   第3次后10周
  PSINCP   0   0   0   0   1   0
  PSINCP/PLG   0   0   1   0   1   0
  PCMV   0   0   0   0   0   1   1
  PCMV/PLG   0   0   0   0   0   0   0
  PCMV/MF59   0   0   0   0   0   0
  无   0   0   0   0   0   0
实施例18 淋巴增殖检测(LPA)
在重组p55gag蛋白或合成的env肽的混合物的存在或缺乏的条件下以每孔2×105个细胞的数量培育猕猴的PBMC。每种培育条件进行6组平行试验。培育4天后，以1微居里/孔的[3H]TdR过夜向培养物施加脉冲。采用液体闪烁计数(Betaplate，Wallac，Gaithersburg，MD)测定掺入细胞中的[3H]TdR。以SI＝平均cpm(gag或env刺激)/平均cpm(未刺激)计算刺激指数(SI)。
                                                   表16：猕猴抗gag淋巴增殖刺激指数
时间(1) 初次   第1次后2周   第2次后2周   第2次后7周   第3次后2周 第3次后6周 第3次后10周 第3次后13周 蛋白(4)后4周 蛋白(4)后8周   蛋白(4)后11周 蛋白(4)后17周
  质粒DNA   传送   周   0   2   6   11   16   20   24   27   31   37   40  46
  pCMV-p55gag 盐水   几何平均值(2) 1 3 5 3 3 2 5 2 7 9 4 2
  LL(3)   1   2   4   2   3   2   3   2   4   6   2  2
  UL(3)   1   3   7   4   4   3   6   3   11   13   7  3
  pCMV-p55gag   PLG/CTAB   几何平均值 2 7 15 6 5 5 4 2 8 7 5 4
  LL   1   3   7   3   3   3   2   2   4   3   2  2
  UL   2   16   34   12   7   8   8   4   17   15   11  8
  pCMV-p55gag   MF59/D0TAP   几何平均值 1 9 30 14 11 10 9 11 19 10 8 5
  LL   1   5   13   7   6   6   5   6   9   4   4  3
  UL   1   18   65   27   17   15   15   21   42   25   14  7
  pSINCP-p55gag 盐水   几何平均值 1 8 6 4 4 6 6 3 11 6 6 5
  LL   1   4   3   2   3   3   3   2   6   4   3  3
  UL   1   15   13   8   6   10   12   4   17   9   12  8
  pSINCP-p55gag   PLG/CTAB   几何平均值 1 10 14 5 4 6 7 6 13 6 5 6
  LL   1   7   9   4   3   4   4   4   10   5   3  4
  UL   1   15   21   7   6   9   12   11   16   7   8  9
无   几何平均值 1 1 2 1 1 1 2 1 2 1 1 1
  LL   1   1   1   1   1   1   1   1   2   1   1  1
  UL   2   2   2   2   1   1   2   1   3   1   1  1
(1)  相对于在第0、4和14周进行的质粒免疫
(2)  各组的几何平均值
(3)  由对数转化滴度计算得到的组算术平均值和标准误差，LL＝算术平均值-标准误差的反对数；UL＝算术平均值+标准误差的反对数
(4)  在第29周给予吸附到阴离子性PLG微粒体上的重组p55gag蛋白
                                              表17：猕猴抗env淋巴增殖刺激指数
时间(1) 初次   第1次后2周  第2次后2周   第2次后7周   第3次后2周 第3次后6周 第3次后10周 第3次后13周 第3次后17周 第3次后23周   蛋白(4)后2周   蛋白(4)后8周
  质粒DNA   传送   周   0   2  6   11   16   20   24   27   31   37   40   46
pCMV-gp140env 盐水   几何平均值(2， 5) 4 4 3 4 4 4 4 22 9
  LL(3，5)   3   3   2   3   3   2   2   12   6
  UL(3，5)   6   6   4   5   6   6   5   40   15
  pCMV-gp140env   PLG/CTAB   几何平均值 5 2 3 3 2 3 2 15 8
  LL   3   2   2   2   1   2   2   8   4
  UL   9   3   4   4   2   5   3   31   16
pCMV-gp140env   MF59/DOTAP 几何平均值 6 5 5 5 7 7 4 18 12
  LL   4   4   4   3   5   5   3   13   9
  UL   9   7   7   7   10   10   6   25   16
  pSINCP-gp140env 盐水   几何平均值 9 6 7 8 5 5 4 41 23
  LL   5   4   4   5   3   3   3   23   12
  UL   15   9   12   14   9   8   6   74   45
  pSINCP-gp140env   PLG/CTAB   几何平均值 10 3 4 6 6 4 3 34 26
  LL   7   3   3   4   3   3   2   19   15
  UL   15   4   6   10   9   6   4   62   47
无   几何平均值 2 2 1 2 1 2 1 1 1
  LL   1   1   1   1   1   2   1   1   1
  UL   3   2   1   2   1   3   1   1   1
(1)相对于在第0、4和14周进行的质粒免疫
(2)  各组的几何平均值
(3)  由对数转化滴度计算得到的组算术平均值和标准误差，LL＝算术平均值-标准误差的反对数；UL＝算术平均值+标准误差的反对数
(4)  在第38周给予重组寡聚gp140env(ΔV2)蛋白/MF59佐剂
(5)  空白值：非检测实施例19 胞内细胞因子免疫荧光和流式细胞术
在布雷菲德菌素A(Pharmingen，San Diego，CA)和抗-CD28单克隆抗体(mAb)(Pharmingen)的存在下，以及在gag肽或env肽混合物的存在或缺乏的情况下，过夜培育猕猴PBMC(1×106个细胞/孔)。每种刺激条件下进行两组平行试验。第二天，用偶联了多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)的抗-CD8 mAb和偶联了别藻蓝蛋白(APC)的抗-CD4 mAb(Becton Dickinson，San Jose，CA)给这些细胞染色，然后进行固定和透化处理(Cytofix/Cytoperm，Pharmingen)，再用偶联了异硫氰酸荧光素(FITC)的抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mAb和偶联了藻红蛋白(PE)的抗-干扰素-γ(IFN-γ)mAb(Pharmingen)染色。使用FACSCaliburTM流式细胞器和CellQuestTM软件(Becton Dickinson)分析染色了的细胞样品。将对IFN-γ和TNF-α染色成阳性的细胞分数计为CD4+8-和CD8+4-T细胞亚类。用gag刺激的细胞或env刺激的细胞中得到的平均IFN-γ和TNF-α分数减去未刺激细胞中得到的平均IFN-γ/TNF-α分数，计算得到gag特异性细胞或env特异性细胞的数量。
对于给定的T细胞亚类(CD4+8-或CD8+4-)以及抗原(gag或env)，当抗原特异性细胞的分数至少为0.1％时，可认为所发生的响应为阳性的。
           表18：gag特异性IFNγ + /TNFα + CD4+T细胞
          疫苗引起的p55gag特异性IFNγ+/TNFα+CD4+T细胞的诱导
                      每组阳性动物(n＝5)的数量*
初次 第1次后 第2次后 第3次后 蛋白质后
PSINCP 0 0 0 0 1
PSINCP/PLG 0 0 2 0 0
pCMV 0 0 0 0 0
pCMV/PLG 0 0 2 0 1
pCMV/MF59 0 0 0 0 0
无 0 0 0 0 0
*阳性    频率≥0.1％
           表19：env特异性IFNγ + /TNFα + CD4+T细胞
         疫苗引起的gp140env特异性IFNγ+/TNFα+CD4+T细胞的诱导
                     每组阳性动物(n＝5)的数量*
初次 第1次后 第2次后 第3次后 蛋白质后
PSINCP 0 0 0 0 3
PSINCP/PLG 0 0 1 0 3
PCMV 0 0 1 0 2
PCMV/PLG 0 0 2 0 3
PCMV/MF59 0 0 0 0 0
无 0 0 0 0 0
*阳性    频率≥0.1％
           表20：gag特异性IFNγ + /TNFα + CD8+T细胞
         疫苗引起的p55gag特异性IFNγ+/TNFα+CD8+T细胞的诱导
                   每组阳性动物(n＝5)的数量*
初次 第1次后 第2次后 第3次后 蛋白质后
PSINCP 0 0 0 0 0
PSINCP/PLG 0 0 0 0 0
PCMV 0 0 0 1 0
PCMV/PLG 0 0 1 0 0
PCMV/MF59 0 0 0 0 0
无 0 0 0 0 0
*阳性    频率≥0.1％
               表21：env特异性IFNγ + /TNFα + CD8+T细胞
          疫苗引起的gp140env特异性IFNγ+/TNFα+CD8+T细胞的诱导
                       每组阳性动物(n＝5)的数量*
初次 第1次后 第2次后 第3次后 蛋白质后
PSINCP 0 0 0 1 0
PSINCP/PLG 0 0 0 0 0
PCMV 0 0 0 0 0
PCMV/PLG 0 0 0 0 0
PCMV/MF59 0 0 0 0 0
无 0 0 0 0 0
*阳性    频率≥0.1％
虽然已详细地描述了本发明的优选实施例，但是应理解，在不偏离由附带的权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可对本发明作出显而易见的改动。
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Claims (77)

1.一种在宿主动物中引起免疫反应的方法，其特征在于，该方法包括：
向所述动物给予其量有效引起免疫学反应的载体构建物，该构建物含有编码第一抗原的异源核酸序列，其中所述载体构建物吸附在微粒体上，所述微粒体含有(i)选自聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯的聚合物，和(ii)去污剂；和
接着向所述动物给予第二抗原，强化免疫学反应，其中所述第一抗原和第二抗原可以相同或不同。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和第二抗原相同。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体构建物选自质粒DNA和RNA载体构建物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述质粒DNA是ELVIS载体。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述ELVIS载体含有一补充RNA载体构建物的cDNA，该RNA载体构建物由选自α病毒、小RNA病毒、披膜病毒、黄病毒、冠状病毒、副粘病毒和黄热病毒的病毒衍生得到。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述α病毒选自新德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒或罗斯河病毒。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述质粒DNA含有CMV启动子/增强子。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和第二抗原选自HIV抗原、C型肝炎病毒抗原和A型流感病毒抗原。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和第二抗原选自HIV抗原gp120、gp140、gp160、p24gag和p55gag。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和第二抗原是HIVp55gag。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗原和第二抗原是HIVgp140。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二抗原吸附在含有以下物质的微粒体上：(i)选自聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯的聚合物，和(ii)去污剂。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二抗原与佐剂一同给予。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述佐剂是MF59。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合物是选自聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)的聚(α-羟基酸)，其中所述去污剂含有选自CTAB、氯化苯甲烷铵、DDA和DOTAP的阳离子去污剂。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在给予所述第二抗原之前，给予所述载体构建物两次或多次。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，也给予所述第二抗原两次或多次。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述载体构建物在以下时间给予：(a)在初始给药时；(b)在初始给药后1-8周的时间范围内给予；(c)在初始给药后4-32周的时间范围内给予；
所述第二抗原在以下时间给予：(a)在初始给予后8-50周的时间范围内给予；(b)在初始给药后8-100周的时间范围内给予。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物是选自猕猴和人的哺乳动物。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体构建物和第二抗原以皮下、腹膜内、皮内、静脉内或肌肉内的方式给予。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述载体构建物和第二抗原以肌肉内的方式给予。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体构建物与佐剂一同给予。
23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫反应是Th1免疫反应。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫反应是CTL免疫反应。
25.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫反应是针对病毒、细菌或寄生虫感染而引起。
26.一种微粒体，该微粒体具有吸附表面，在该表面上已经吸附了第二生物学活性大分子，其特征在于，该微粒体包括：
选自(a)聚合物微粒体和(b)亚微粒体乳剂的微粒体，其中，该聚合物微粒体含有(i)选自聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯的聚合物，和去污剂；所述亚微粒体乳剂含有(i)可代谢的油，和(ii)一种或多种乳化剂；和
第一生物学活性大分子，其中所述第一生物学活性大分子是一种核酸分子，该核酸分子含有至少一种选自ELIVS载体和RNA载体构建物的载体构建物。
27.如权利要求26所述的微粒体，其特征在于，所述微粒体为所述亚微粒体乳剂。
28.如权利要求26所述的微粒体，其特征在于，所述微粒体为所述聚合物微粒体。
29.如权利要求28所述的微粒体，其特征在于，所述聚合物微粒体是选自聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)的聚(α-羟基酸)。
30.如权利要求28所述的微粒体，其特征在于，所述聚合物是聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)。
31.如权利要求28所述的微粒体，其特征在于，所述微粒体还含有第二生物学活性大分子，这种大分子被捕获在所述微粒体中，其中该大分子选自多核苷酸、多核苷、药物、多肽、激素、酶、转录介体或翻译介体、代谢途径中间物、免疫调节子、抗原以及佐剂。
32.如权利要求28所述的微粒体，其特征在于，所述载体构建物是ELVIS载体。
33.如权利要求28所述的微粒体，其特征在于，所述载体构建物是ELVIS载体，它含有一补充RNA载体构建物的cDNA，该RNA载体构建物由选自α病毒、小RNA病毒、披膜病毒、黄病毒、冠状病毒、副粘病毒和黄热病毒的病毒衍生得到，且所述RNA载体构建物还含有选择的异源核苷酸序列。
34.如权利要求33所述的微粒体，其特征在于，所述ELVIS载体由选自新德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒或罗斯河病毒的α病毒衍生获得。
35.如权利要求28所述的微粒体，其特征在于，所述载体构建物是RNA载体构建物，它由选自α病毒、小RNA病毒、披膜病毒、黄病毒、冠状病毒、副粘病毒和黄热病毒的病毒衍生得到。
36.如权利要求35所述的微粒体，其特征在于，所述RNA载体构建物由选自新德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒或罗斯河病毒的α病毒衍生获得。
37.如权利要求32所述的微粒体，其特征在于，所述载体构建物含有异源核酸序列，该序列编码选自以下的成员：药物、多肽、激素、酶、转录介体或翻译介体、代谢途径的中间物、免疫调节子、抗原和佐剂。
38.如权利要求37所述的微粒体，其特征在于，所述异源核酸序列编码抗原。
39.如权利要求38所述的微粒体，其特征在于，所述抗原选自HIV gp120、gp140、HIV p24gag和HIV p55gag和A型流感血凝素抗原。
40.如权利要求32所述的微粒体，其特征在于，所述载体构建物选自ELVIS载体pSINCP-gp 140和pSINCP-p55gag。
41.如权利要求28所述的微粒体，其特征在于，所述微粒体还含有至少一种吸附于其表面上的第二生物学活性大分子，其中所述第二生物学活性大分子是选自多肽、多核苷酸、多核苷、抗原、药物、激素、酶、转录介体或翻译介体、代谢途径的中间物、免疫调节子和佐剂的至少一种。
42.如权利要求41所述的微粒体，其特征在于，所述第二生物学活性大分子是抗原。
43.如权利要求42所述的微粒体，其特征在于，所述第二生物学活性大分子是选自HIV gp120、gp140、HIV p24gag和HIV p55gag和A型流感血凝素抗原的抗原。
44.如权利要求41所述的微粒体，其特征在于，所述第二生物学活性大分子是编码HIV gp140的多核苷酸。
45.如权利要求41所述的微粒体，其特征在于，所述第二生物学活性大分子是佐剂。
46.如权利要求45所述的微粒体，其特征在于，所述佐剂是铝盐。
47.一种微粒体组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求26所述的微粒体和药学上可接受的赋形剂。
48.如权利要求47所述的微粒体组合物，其特征在于，所述组合物还含有佐剂。
49.如权利要求48所述的微粒体组合物，其特征在于，所述佐剂选自由CpG寡核苷酸组成的成员。
50.如权利要求48所述的微粒体组合物，其特征在于，所述佐剂是铝盐，该铝盐为磷酸铝。
51.一种生产具有吸附表面的微粒体的方法，该微粒体的表面上已经吸附了能表达选择的核酸序列的载体构建物，其特征在于，所述方法包括：
(a)将聚合物溶液和去污剂的混合物乳化，形成乳剂；其中，所述聚合物溶液含有选自聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚己内酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯的聚合物，有机溶剂中该聚合物的浓度约为1-30％；混合物中所述去污剂与所述聚合物的重量比约为0.00001∶1到0.5∶1；
(b)从所述乳剂中除去有机溶剂，形成所述微粒体；
(c)将所述载体构建物吸附到所述微粒体的表面，其中所述载体构建物选自ELVIS载体和RNA载体构建物。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述载体构建物是ELVIS载体或RNA载体构建物，含有编码药物、多肽、激素、酶、转录介体或翻译介体、代谢途径的中间物、免疫调节子、抗原和佐剂的异源核酸序列。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述异源核酸序列编码选自HIV gp120、HIV gp140、HIV p24gag和HIV p55gag和A型流感血凝素抗原的抗原。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述抗原是HIV gp140。
55.一种微粒体，其特征在于，该微粒体采用权利要求51所述的方法制得。
56.一种微粒体组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求55所述的微粒体和药学上可接受的赋形剂。
57.一种诱导宿主动物中的免疫反应的方法，其特征在于，所述方法包括向所述动物给予权利要求47所述的微粒体组合物。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
59.一种使宿主动物针对病毒、细菌或寄生虫感染产生免疫的方法，其特征在于，所述方法可向所述动物给予权利要求47中所述的微粒体组合物。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
61.一种在宿主动物中诱导产生Th1免疫反应的方法，其特征在于，所述方法包括向所述动物给予权利要求47所述的微粒体组合物。
62.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
63.一种在宿主动物中诱导产生CTL免疫反应的方法，其特征在于，所述方法包括向所述动物给予权利要求47所述的微粒体组合物。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
65.一种向宿主动物传送治疗有效量的大分子的方法，其特征在于，所述方法包括向脊椎动物对象给予权利要求47所述的微粒体组合物。
66.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
67.一种治疗受到病毒、细菌或寄生虫感染的宿主动物的方法，其特征在于，所述方法包括向所述动物给予其量有效减少该动物感染水平的权利要求47所述的微粒体组合物。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。
69.权利要求47所述的微粒体组合物的用途，其特征在于，用于治疗一种疾病。
70.权利要求47所述的微粒体组合物的用途，其特征在于，用作疫苗。
71.权利要求47所述的微粒体组合物的用途，其特征在于，用于引起免疫反应。
72.如权利要求39所述的微粒体，其特征在于，所述异源核酸序列编码HIVgag多肽，它含有与选自下列序列至少有90％同一性的序列：SEQ ID NO：63的第844-903个核苷酸、SEQ ID NO：64的第841-900个核苷酸、SEQ ID NO：65的第1513-2547个核苷酸、SEQ ID NO：66的第1210-1353个核苷酸、SEQ ID NO：67的第1213-1353个核苷酸以及SEQ ID NO：68的第82-1512个核苷酸。
73.如权利要求39所述的微粒体，其特征在于，所述异源核酸序列编码HIV包膜多肽，它含有与选自下列序列至少有90％同一性的序列：SEQ ID NO：63的第844-903个核苷酸、SEQ ID NO：64的第841-900个核苷酸、SEQ ID NO：65的第1513-2547个核苷酸、SEQ ID NO：66的第1210-1353个核苷酸、SEQ ID NO：67的第1213-1353个核苷酸以及SEQ ID NO：68的第82-1512个核苷酸。
74.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述异源核酸序列编码HIV gag多肽，它含有与选自下列序列至少有90％同一性的序列：SEQ ID NO：63的第844-903个核苷酸、SEQ ID NO：64的第841-900个核苷酸、SEQ ID NO：65的第1513-2547个核苷酸、SEQ ID NO：66的第1210-1353个核苷酸、SEQ ID NO：67的第1213-1353个核苷酸以及SEQ ID NO：68的第82-1512个核苷酸。
75.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述异源核酸序列编码HIV包膜多肽，它含有与选自下列序列至少有90％同一性的序列：SEQ ID NO：63的第844-903个核苷酸、SEQ ID NO：64的第841-900个核苷酸、SEQ ID NO：65的第1513-2547个核苷酸、SEQ ID NO：66的第1210-1353个核苷酸、SEQ ID NO：67的第1213-1353个核苷酸以及SEQ ID NO：68的第82-1512个核苷酸。
76.如权利要求27所述的微粒体，其特征在于，(a)所述油是萜类化合物，(b)所述一种或多种乳化剂含有一种或多种非离子型去污剂和一种或多种阳离子型去污剂。
77.如权利要求76所述的微粒体，其特征在于，所述油是角鲨烯，所述一种或多种乳化剂含有：聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯和DOTAP。
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