ES2770335T3 - Administración de ARN para desencadenar múltiples vías inmunológicas - Google Patents

Abstract

Un ARN auto-replicante que codifica un inmunógeno para su uso en un procedimiento profiláctico o terapéutico de aumento de una respuesta inmunitaria en un vertebrado, en el que el ARN tiene una protección en 5', en el que el inmunógeno da lugar a una respuesta inmunitaria contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito, en el que dicho procedimiento comprende la administración de un ARN que codifica un inmunógeno al vertebrado en combinación con una emulsión de aceite en agua catiónica submicrométrica, de manera que el ARN: (i) estimula el receptor de inmunidad innata endosómico TLR7; (ii) estimula el receptor de inmunidad innata citoplasmático RIG-1 o MDA5; y (iii) está traducido para proporcionar la expresión del inmunógeno, a condición de que el ARN no incluya nucleótidos modificados que no sean la protección en 5'.

Description

DESCRIPCIÓN

Administración de ARN para desencadenar múltiples vías inmunológicas

Campo de la técnica

La presente invención está en el campo del suministro no vírico de ARN para la inmunización.

Técnica antecedente

El suministro de ácidos nucleicos para la inmunización de animales ha sido un objetivo durante varios años. Se han ensayado distintas estrategias, incluyendo el uso de ADN o ARN, de vehículos de suministro víricos o no víricos (o incluso sin vehículo de suministro, en una vacuna “desnuda”), o vectores de replicación o no replicación, o de vectores víricos o no víricos.

Sigue existiendo la necesidad de más vacunas de ácidos nucleicos mejoradas.

Divulgación de la invención

De acuerdo con la invención, se suministra un ARN que codifica un inmunógeno a las células para desencadenar múltiples rutas de respuesta inmunitaria innata. El ARN suministrado desencadena tanto un receptor de inmunidad innata endosómico (TLR7) como también un receptor de inmunidad innata citoplasmático (MDA5 o RIG-I), aumentando de esta manera la respuesta inmunitaria que se produce cuando se expresa el inmunógeno codificado por el ARN.

La invención proporciona un ARN auto-replicante que codifica un inmunógeno para su uso en un procedimiento profiláctico o terapéutico de aumento de una respuesta inmunitaria en un vertebrado en el que el ARN tiene una protección en 5', en el que el inmunógeno da lugar a una respuesta inmunitaria contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito, en el que dicho procedimiento comprende la administración de ARN que codifica el inmunógeno a un vertebrado en combinación con una emulsión de aceite en agua catiónica submicrométrica de manera que el ARN: (i) estimula el receptor de inmunidad innata endosómico TLR7; (ii) estimula el receptor de inmunidad innata citoplasmático RIG-I o MDA5; y (iii) se traduce para proporcionar la expresión del inmunógeno, a condición de que el ARN no incluya nucleótidos modificados que no sean la protección en 5'.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un ARN autorreplicativo que codifica el inmunógeno para su uso en un procedimiento profiláctico o terapéutico de generación de una respuesta inmunitaria en un vertebrado, en la que el ARN tiene una protección en 5', en la que el inmunógeno desencadena una respuesta inmunitaria frente a una bacteria, un virus, un hongo o un parásito, en el que dicho procedimiento comprende administrar un ARN que codifica un inmunógeno a un vertebrado en combinación con una emulsión de aceite en agua catiónica submicrométrica de manera que el ARN: (i) estimula el receptor de inmunidad innata endosómico TLR7; (ii) estimula el receptor de inmunidad innata citoplasmático RIG-I o MDA5; y (iii) se traduce para proporcionar la expresión del inmunógeno, a condición de que el ARN no incluya nucleótidos modificados que no sean la protección en 5'.

Administración

La divulgación describe la administración de una molécula de ARN a un vertebrado. El sitio de administración será habitualmente el tejido muscular, tal como el músculo esquelético. Las alternativas a la administración intramuscular incluyen, pero no se limitan a: la administración intradérmica, intranasal, intraocular, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intersticial, bucal, transdérmica, o sub-lingual. La administración intradérmica e intramuscular son dos vías preferidas.

La administración se puede conseguir mediante distintas maneras. Por ejemplo, se puede utilizar la inyección mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), particularmente para la administración intramuscular, subcutánea, intraocular, intraperitoneal o intravenosa. Se puede utilizar la inyección sin aguja como alternativa. La inyección intramuscular es la manera de administración de ARN de acuerdo con la divulgación.

La inyección en el músculo superior del brazo, deltoides o muslo (por ejemplo, el muslo anterolateral) es típica. El sitio de administración incluye células no inmunitarias, tal como las células musculares (que pueden estar multinucleadas y se pueden disponer en fascículos) y/o fibroblastos. El ARN entra en el citoplasma de estas células después de (o mientras) administrarse. La entrada puede ser mediante endocitosis, por ejemplo, a través del sarcolema de una célula muscular, o a través de la membrana celular de un fibroblasto. El ARN escapa de los endosomas en el citoplasma, donde se puede unir mediante una ARN helicasa (por ejemplo, en la familia del receptor tipo RIG-I, es decir, RLR) tal como RIG-I (RLR-1), MDA5 (RLR-2) y/o LGP2 (RLR-3). Esta unión inicia la señalización mediada por RLR, desencadenando de esta manera una primera ruta inmunitaria innata que aumenta el efecto inmunogénico del ARN suministrado. Incluso si el ARN suministrado es de cadena sencilla, forma un ARN de doble cadena durante la replicación o debido a su estructura secundaria, lo que significa que el ARN puede iniciar también la señalización mediada por PKR, dando de nuevo lugar al desencadenamiento de una ruta inmunitaria innata citoplasmática. Tanto la señalización mediada por RLR como la mediada por PKR puede dar lugar a la secreción de interferones de tipo I (por ejemplo, el interferón a y/o p) por las células no inmunitarias. Las células no inmunitarias pueden sufrir apoptosis después de la transfección. La señalización mediada por RLR en las células no inmunitarias en presencia de un inmunógeno expresado es una combinación potente para iniciar una respuesta inmunitaria eficaz.

El sitio de administración también incluye células inmunitarias, tales como macrófagos (por ejemplo macrófagos derivados de médula ósea), células dendríticas (por ejemplo células dendríticas plasmacitoides derivadas de médula ósea y/o células dendríticas mieloides derivadas de médula ósea), monocitos (por ejemplo, monocitos humanos de sangre periférica), etc.

Estas células inmunitarias pueden estar presentes en el momento de la administración, pero habitualmente se infiltrarán en el sitio tras la administración. Por ejemplo, el daño tisular causado por la administración invasiva (por ejemplo, causado por la aguja en el sitio de administración) puede hacer que las células inmunitarias se infiltren en el área dañada. Estas células infiltrantes se encontrarán con el ARN que está en ese momento en el sitio de suministro y el ARN puede entrar en las células inmunitarias mediante endocitosis. Dentro de los endosomas el ARN se puede unir a TLR7 (ssARN), TLR8 (ssARN) o TLR3 (dsARN), desencadenando de esta manera una segunda ruta inmunitaria innata. Estas células pueden secretar entonces interferones tipo I y/o citocinas pro-inflamatorias. El ARN puede producir este efecto mediante receptores de reconocimiento del patrón, tal como receptores tipo toll (por ejemplo, TLR7), helicasas intracelulares (por ejemplo, RIG-I) y adicionalmente PKR (proteína cinasa dependiente de dsARN). El ARN puede traducirse o no en las células inmunitarias, y por tanto, las células inmunitarias pueden expresar o no el inmunógeno. Si el inmunógeno se expresa por la célula inmunitaria puede presentarse por el MHC-I y/o MHC-II de las células inmunitarias. Si el inmunógeno no se expresa por la célula inmunitaria entonces puede como alternativa capturarse por la célula inmunitaria a partir de otras células (por ejemplo, células no inmunitarias) que ha captado el ARN y expresado el inmunógeno, y el inmunógeno se puede presentar de esta manera por el MHC-II y/o MHC-I de las células inmunitarias. La presentación de antígenos se producirá en general en los ganglios linfáticos de drenaje después de que las células inmunitarias hayan migrado del sitio de administración.

Por lo tanto, el ARN puede desencadenar por separado dos rutas inmunitarias innatas: una mediante señalización citoplasmática (por ejemplo, mediada por RLR y adicionalmente mediada por PKR) y la otra mediante señalización endosómica (por ejemplo, mediada por TLR7). Estos dos desencadenantes separados crean un ambiente inmunoestimulante que aumenta la respuesta inmunitaria que se produce cuando el inmunógeno codificado por el ARN se expresa como un polipéptido. Los dos desencadenantes se pueden proporcionar por el mismo tipo celular o por diferentes tipos celulares, por ejemplo, el primer desencadenante podría estar en un fibroblasto mientras que el segundo desencadenante podría estar en una célula dendrítica plasmacitoide. Cuando los dos desencadenantes se proporcionan por el mismo tipo celular, se pueden proporcionar incluso por la misma célula individual. Habitualmente, sin embargo, los dos desencadenantes se proporcionan por tipos celulares diferentes. Por ejemplo, el primer desencadenante (señalización mediada por RLR) se produce en células negativas a TLR7 y el segundo desencadenante (señalización mediada por TLR7) se produce en células negativas a RIG-I (o, más generalmente, en células negativas a RLR).

La capacidad de un ARN para estimular un receptor de inmunidad innata endosómico tal como el TLR7, o un receptor de inmunidad innata citoplasmático tal como RIG-I, se puede detectar por ensayos in vitro conocidos. La detección indirecta de la interacción ARN/receptor se puede basar en la detección de eventos corriente abajo que siguen a la estimulación del receptor, tal como la detección in vitro o in vivo de señales de citocina específicas o señales de expresión genética asociadas con receptores particulares. Se prefiere que el ARN “estimule” un receptor de inmunidad innata endosómico o un receptor de inmunidad innata citoplasmático por unión a ese receptor, es decir, el ARN “se une” al receptor más que simplemente “estimularlo”. Los ensayos para la unión de los ARN a estos receptores se conocen en la técnica.

Para aumentar la entrada tanto en células inmunitarias como no inmunitarias y también los efectos intercelulares posteriores, el ARN se administra en combinación con un sistema de administración que es una emulsión de aceite en agua catiónica submicrométrica.

Liposomas (no es una realización de la invención)

Distintos lípidos anfifílicos forman bicapas en un ambiente acuoso para encapsular un corazón acuoso que contiene el ARN como un liposoma. Estos lípidos pueden tener un grupo de cabeza aniónico, catiónico, o zwitteriónico hidrófilo. La formación de liposomas a partir de fosfolípidos aniónicos se remonta a los 60, y los lípidos que forman liposomas catiónicos se han estudiado desde los 90. Algunos fosfolípidos son aniónicos mientras que otros son zwitteriónicos y otros son catiónicos. Las clases de fosfolípidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a fosfatidiletanolaminas, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas, y fosfatidil-gliceroles, y se enumeran algunos fosfolípidos útiles en la Tabla 1. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a dioleoiltrimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-diesteariloxi-N, N-dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DODMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA). Los lípidos zwitteriónicos incluyen, pero no se limitan a, lípidos acil zwitteriónicos y lípidos éter zwitteriónicos. Ejemplos de lípidos zwitteriónicos útiles son DPPC, DOPC y dodecilfosfocolina. Los lípidos pueden ser saturados o insaturados. Se prefiere el uso de al menos un lípido insaturado para la preparación de liposomas. Si un lípido insaturado tiene dos colas, ambas colas pueden estar insaturadas, o puede tener una cola saturada y la otra cola insaturada.

Los liposomas se pueden formar a partir de un único lípido o de una muestra de lípidos. Una mezcla puede comprender (i) una mezcla de lípidos aniónicos (ii) una mezcla de lípidos catiónicos (iii) una mezcla de lípidos zwitteriónicos (iv) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos catiónicos (v) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos zwitteriónicos (vi) una mezcla de lípidos zwitteriónicos y lípidos catiónicos o (vii) una mezcla de lípidos aniónicos, lípidos catiónicos y lípidos zwitteriónicos. De manera similar, una mezcla puede comprender lípidos tanto saturados como insaturados. Por ejemplo, una mezcla puede comprender DSPC (zwitteriónico, saturado), DlinDMA (catiónico, insaturado), y/o DMG (aniónico, saturado). Cuando se utiliza una mezcla de lípidos se puede mezclar con colesterol. La parte hidrófila de un lípido puede éster PEGilada (es decir, modificada por la unión covalente de un polietilenglicol). Esta modificación puede aumentar la estabilidad y evitar la adsorción no específica de los liposomas. Por ejemplo, los lípidos se pueden conjugar con el PEG utilizando técnicas tales como las que se desvelan en las referencias 1 y 2. Se pueden utilizar PEG de distintas longitudes, por ejemplo, entre 0,5-8 kDa. Se utiliza en los ejemplos una mezcla de DSPC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol.

Los liposomas se dividen habitualmente en tres grupos: vesículas multilaminares (MLV); vesículas unilaminares pequeñas (SUV); y vesículas unilaminares grandes (LUV). Las MLV tiene múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimentos acuosos separados. Las SUV y LUV tienen una única bicapa que encapsula un corazón acuoso; las SUV normalmente tienen un diámetro < 50 nm, y las LUV tienen un diámetro > 50 nm. Los liposomas útiles con la invención son idealmente LUV con un diámetro en el intervalo de 50-220 nm. Para una composición que comprende una población de LUV de diferentes diámetros: (i) al menos un 80 % por cantidad deberían tener diámetros en el intervalo de 20-220 nm, (ii) el diámetro medio (Zav, por intensidad) de la población idealmente está en el intervalo de 40-200 nm, y/o (iii) se espera que los diámetros deberían tener un índice de polidispersión < 0,2. Los complejos liposoma/ARN de la referencia 37 tengan un diámetro en el intervalo de 600-800 nm y que tengan una alta polidispersión.

Las técnicas para la preparación de liposomas adecuados se conocen bien en la técnica, por ejemplo, véase las referencias 3 a 5. Un procedimiento útil se describe en la referencia 6 e implica mezclar (i) una solución etanólica de los lípidos (ii) una solución acuosa del ácido nucleico y (iii) un tampón, seguido por mezclado, equilibrado, dilución y purificación. Los liposomas preferidos se obtienen por este procedimiento de mezclado.

El ARN se encapsula preferentemente en los liposomas, y de esta manera el liposoma una capa externa alrededor del núcleo acuoso que contiene el ARN. Se ha descubierto que esta encapsulación protege al ARN de la digestión por RNasa. Los liposomas pueden incluir algunos ARN externos (por ejemplo en la superficie de los liposomas), pero al menos la mitad del ARN (e idealmente todos) está encapsulado.

Partículas poliméricas (no es una realización de la invención )

Diversos polímeros pueden formar micropartículas para encapsular o adsorber ARN. El uso de un polímero sustancialmente no tóxico significa que un receptor puede recibir de manera segura las partículas, y el uso de un polímero biodegradable significa que las partículas se pueden metabolizar tras la administración para evitar la persistencia a largo plazo. Los polímeros útiles también son esterificables, para ayudar en la preparación de formulaciones de grado farmacéutico.

Los polímeros biodegradables y no tóxicos adecuados incluyen, pero sin limitación, poli(a-hidroxiácidos), ácidos polihidroxibutíricos, polilactonas (incluyendo policaprolactonas), polidioxanonas, polivalerolactona, poliortoésteres, polianhídridos, policianoacrilatos, policarbonatos derivados de tirosina, polivinilpirrolidinonas o poliesteramidas, y combinaciones de los mismos.

En algunos casos, las micropartículas se forman a partir de poli(a-hidroxiácidos) tales como poli(lactidas) (“PLA), copolímeros de lactida y glicolida tales como poli(D,L-lactida-co-glicolida) (“PLG”), y copolímeros de D,L-lactida y caprolactona. Los polímeros de PLG útiles incluyen aquellos que tienen una proporción molar de lactida/glicolida que varía, por ejemplo, de 20:80 a 80:20, por ejemplo, 25:75, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 75:25. Los polímeros de PLG útiles incluyen aquellos que tienen un peso molecular entre, por ejemplo, 5.000-200.000 Da, por ejemplo, entre 10.000-100.000, 20.000-70.000, 30.000-40.000, 40.000-50.000 Da.

Las micropartículas idealmente tienen un diámetro en el intervalo de 0,02 mm a 8 mm. Para una composición que comprende una población de micropartículas con diferentes diámetros, al menos el 80 % en número deberían tener diámetros en el intervalo de 0,03-7 pm.

Las técnicas para preparar micropartículas adecuadas son bien conocidas en la materia, por ejemplo, véase las referencias 5, 7 (en particular, el capítulo 7) y 8. Para facilitar la adsorción del ARN, una micropartícula puede incluir un tensioactivo catiónico y/o un lípido, por ejemplo, tal como se desvela en las referencias 9 y 10. Una forma alternativa de crear micropartículas poliméricas es por moldeo y secado, por ejemplo, tal como se desvela en la referencia 11.

Las micropartículas de la invención pueden tener un potencial zeta de entre 40-100 mV.

Una ventaja de las micropartículas sobre los liposomas es que se liofilizan fácilmente para el almacenamiento estable. El ARN puede estar adsorbido a las partículas, y la adsorción se facilita incluyendo materiales catiónicos (por ejemplo, lípidos catiónicos) en la micropartícula.

Emulsiones de aceite en agua

Las emusiones de aceite en agua son conocidas como adyuvante de las vacunas de la gripe, por ejemplo, el adyuvante MF59™ en el producto FLUAD™, y el adyuvante AS03 en el producto PREPANd RiX™. La administración de ARN de acuerdo con la presente divulgación utiliza una emulsión de aceite en agua, siempre que la emulsión incluya una o más moléculas catiónicas. Por ejemplo, se puede incluir un lípido catiónico en la emulsión para proporcionar una superficie de gota positiva a la que se pueda unir el ARN cargado negativamente.

La emulsión comprende uno o más aceites. El(los) aceite(s) adecuado(s) incluye aquellos, por ejemplo, de origen animal (tal como un animal marino) o vegetal. El aceite es idealmente biodegradable (metabolizable) y biocompatible. Las fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, el más comúnmente disponible, ejemplifican los aceites de frutos secos. El aceite de jojoba se puede usar, por ejemplo, obtenido del frijol de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de algodón, aceite de sésamo y similares. En el grupo de los granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también se puede usar el aceite de otros granos cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, teff, triticale y similares. Los ésteres de ácidos grasos de glicerol de 6-10 carbonos y 1.2- propanodiol, aunque no son de origen natural en aceites de semillas, se pueden preparar mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de aceites de frutos secos y de semillas. Las grasas y aceites de leche de mamífero son metabolizables y, por lo tanto, se pueden usar. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de origen animal son bien conocidos en la materia.

La mayoría de los animales marinos contienen aceites metabolizables que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón y el aceite de ballena tal como esperma de ballena ejemplifican varios de los aceites de animales marinos que se pueden usar en el presente documento. Una serie de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y genenralmente se citan como terpenoides. Las emulsiones preferidas comprenden escualeno, un aceite de hígado de tiburón que es un terpenoide ramificado insaturado (C³⁰H⁵⁰; [(CH³)²C[=CHCH²CH²C(CH³)]²=CHCH²-]²; 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno; CAS RN 7683-64-9). El escualano, el análogo saturado del escualeno, también se puede usar. Los aceites de animales marinos, incluyendo el escualano y el escualeno, están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o se pueden obtener mediante procedimientos conocidos en la materia.

Otros aceites útiles son los tocoferoles, en particular, en combinación con el escualeno. Cuando la fase oleosa de una emulsión incluye un tocoferol, se puede usar cualquiera de a, p, ^y, 5, £, o ^tocoferoles, pero los preferidos son los a-tocoferoles. También se pueden usar D-a-tocoferol y DL-a-tocoferol. Un a-tocoferol preferido es DL-a-tocoferol. Se puede usar una combinación de aceites que comprenda escualeno y un tocoferol (por ejemplo, DL-a-tocoferol). El aceite en la emulsión puede comprender una combinación de aceites, por ejemplo, escualeno y al menos un aceite adicional.

El componente acuoso de la emulsión puede ser agua corriente (por ejemplo, a.p.i.) o puede incluir componentes adicionales, por ejemplo, solutos. Por ejemplo, puede incluir sales para formar un tampón, por ejemplo, sales de citrato o de fosfato, tales como sales de sodio. Normalmente, los tampones incluyen: un tampón de fosfato; un tampón de Tris; un tampón de borato; un tampón de succinato; un tampón de histidina; o un tampón de citrato. Se prefiere una fase acuosa tamponada, y los tampones típicamente se incluirán en el intervalo de 5-20 mM.

La emulsión también incluye un lípido catiónico. Preferentemente, este lípido es un tensioactivo para que pueda facilitar la formación y la estabilización de la emulsión. Los lípidos catiónicos útiles generalmente contienen un átomo de nitrógeno que está cargado positivamente en condiciones fisiológicas, por ejemplo, como una amina terciaria o cuaternaria. Este nitrógeno puede estar en el grupo de la cabeza hidrófila de un tensioactivo anfifílico. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a: 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 3'-[N-(N',N'-Dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (Colesterol DC), dimetildioctadecil-amonio (d Da por ejemplo, el bromuro), 1.2- Dimiristoil-3-Trimetil-Amonio Propano (DMTAP), dipalmitoil(C16:0)trimetil amonio propano (DPTAP), distearoiltrimetilamonio propano (DSTA^p ). Otros lípidos catiónicos útiles son: cloruro de benzalconio (BAK), cloruro de benzetonio, cetramida (que contiene bromuro de tetradeciltrimetilamonio y posiblemente pequeñas cantidades de bromuro de dodeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetil amonio), cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de cetil trimetilamonio (CTAC), N,N',N'-polioxietileno (10)-N-sebo-1,3 -diaminopropano, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de hexadeciltrimetil-amonio, bromuro de alquil-trimetil-amonio mezclado, cloruro de bencildimetildodecilamonio, cloruro de bencildimetilhexadecil-amonio, metóxido de benciltrimetilamonio, bromuro de cetildimetiletilamonio, bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDAB), cloruro de metilbenzetonio, cloruro de decametonio, cloruro de metiltrialquilamonio mezclado, cloruro de metil trioctilamonio), cloruro de N,N-dimetil-N-[2(2-metil-4-(1,1,3,3tetrametilbutil)-fenoxi]-etoxi)etil]-bencenometanaminio (DEBDA), sales de dialquildimetilamonio, cloruro de [1-(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N,trimetilamonio, 1,2-diacil- 3-(trimetilamonio) propano (grupo acilo=dimiristoilo, dipalmitoilo, distearoilo, dioleoilo), 1,2-diacil-3 (dimetilamonio)propano (grupo acilo=dimiristoilo, dipalmitoilo, distearoilo, dioleoilo), 1,2-dioleoil-3-(4'-trimetil-amonio)butanoil- sn-glicerol, 1,2-dioleoil 3-succinil-snglicerol colina éster, colesteril(4'-trimetilamonio)butanoato), sales de N-alquil piridinio (por ejemplo, bromuro de cetilpiridinio y cloruro de cetilpiridinio), sales de N-alquilpiperidinio, electrolitos dicatiónicos de bolaform (C12Me6; C12BU6), dialquilglicetilfosforilcolina, lisolecitina, L-adioleoilfosfatidiletanolamina, éster de hemisuccinato de colina, lipopoliaminas, incluyendo pero sin limitación, dioctadecilaminoglicilespermina (DOGS), dipalmitoil fosfatidiletanolamidoespermina (DPPES), lipopoli-L (o D)-lisina (LPLL, LPDL), poli (L (o D)-lisina conjugada con N-glutarilfosfatidiletanolamina, éster de didodecil glutamato con grupo amino colgante (Ci²GluPhCnN+), éster de ditetradecil glutamato con grupo amino colgante (Ci²GluPhCnN+), derivados catiónicos de colesterol, incluyendo pero sin limitación sal de colesteril-3 p-oxisuccinamidoetilenotrimetilamonio, colesteril-3 p-oxisuccinamidoetilenodimetilamina, sal de colesteril-3 p-carboxiamidoetilentrimetilamono, y colesteril-3 p-carboxiamidoetilenodimetilamina. Otros lípidos catiónicos útiles se describen en las referencias 12 y l3.

El lípido catiónico preferentemente es biodegradable (metabolizable) y biocompatible.

Además del aceite y del lípido catiónico, una emulsión puede incluir un tensioactivo no iónico y/o un tensioactivo zwitteriónico. Tales tensioactivos incluyen, pero sin limitación: los tensioactivos de polioxietilen sorbitán (comúnmente citados como Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) y/u óxido de butileno (BO), comercializados bajo la marca DOWFAX™, tales como copolímeros de bloque lineal de EO/PO; octoxinoles, que pueden variar en el número de repeticiones de los grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) siendo de particular interés el octoxinol-9 (Triton X100, o t.octilfenoxipolietoxietanol); (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes de laurilo, cetilo, estearilo y oleilo (conocidos como tensioactivos Brij), tales como trietilenglicol monolauril éter (Brij 30); polioxietilen-9-lauril éter; y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como los Spans), tales como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Los tensioactivos preferidos para incluir en la emulsión son polisorbato 80 (Tween 80; monooleato de polioxietilen sorbitán), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Triton X-100.

Las mezclas de estos tensioactivos se pueden incluir en la emulsión, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85, o mezclas de Tween 80/Tritón-X100. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietilensorbitán tal como monooleato de polioxietilensorbitán (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Tritón X-100). Otra combinación útil comprende lauretil 9 más un éster de polioxietilensorbitán y/o un octoxinol. Las mezclas útiles pueden comprender un tensioactivo con un valor de HLB en el intervalo de 10-20 (por ejemplo, polisorbato 80 con un HLB de 15,0) y un tensioactivo con un valor de HLB en el intervalo de 1-10 (por ejemplo, trioleato de sorbitán con un HLB de 1,8).

Las cantidades preferidas de aceite (% en volumen) en la emulsión final están entre el 2-20 %, por ejemplo, el 5-15 %, el 6-14 %, el 7-13 %, el 8-12 %. Un contenido de escualeno de aproximadamente el 4-6 % o aproximadamente el 9-11 % es particularmente útil.

Las cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) en la emulsión final están entre el 0,001 % y el 8 %. Por ejemplo: los ésteres de polioxietilensorbitán (tales como polisorbato 80) del 0,2 al 4 %, en particular, entre el 0,4-0,6 %, entre el 0,45-0,55 %, aproximadamente el 0,5 % o entre el 1,5-2 %, entre el 1,8-2,2 %, entre el 1,9-2,1 %, aproximadamente el 2 %, o el 0,85-0,95 %, o aproximadamente el 1 %; los ésteres de sorbitán (tales como trioleato de sorbitán) del 0,02 al 2 %, en particular de aproximadamente el 0,5 % o aproximadamente el 1 %; octil- o nonilfenoxipolioxietanoles (tales como Triton X-100) del 0,001 al 0,1 %, en particular, del 0,005 al 0,02 %; éteres de polioxietileno (tales como laureth 9) del 0,1 al 8 %, preferentemente del 0,1 al 10 % y en particular, del 0,1 al 1 % o aproximadamente el 0,5 %.

Las cantidades absolutas de aceite y tensioactivo y su proporción pueden variar dentro de amplios límites mientras que aún formen una emulsión. Un experto puede variar fácilmente las proporciones de los componentes para obtener una emulsión deseada, pero una proporción de peso de entre 4:1 y 5:1 para el aceite y el tensioactivo es típica (exceso de aceite).

Un parámetro importante para asegurar la actividad inmunoestimuladora de una emulsión, particularmente en animales grandes, es el tamaño de la gota de aceite (diámetro). Las emulsiones más eficaces tienen un tamaño de gota de intervalo submicrométrico. De manera adecuada, los tamaños de gota estarán en el intervalo de 50-750 nm. De manera más útil, el tamaño de gota promedio es menor de 250 nm, por ejemplo, menor de 200 nm, menor de 150 nm. El tamaño de gota promedio útilmente está en el intervalo de 80-180 nm. De forma ideal, al menos el 80 % (en número) de las gotas de aceite de la emulsión son de menos de 250 nm de diámetro, y preferentemente al menos el 90 %. Los equipos para determinar el tamaño promedio de la gota en una emulsión y la distribución de tamaños están comercialmente disponibles. Éstos típicamente usan las técnicas de dispersión dinámica de la luz y/o de la detección óptica de partículas individuales, por ejemplo, la serie de equipos Accusizer™ y Nicomp™ disponibles de Particle Sizing Systems (Santa Barbara, EE.UU.), o los equipos Zetasizer™ de Malvern Instruments (Reino Unido), o los instrumentos de analizador de distribución de tamaño de partícula de Horiba (Kyoto, Japón). De forma ideal, la distribución de los tamaños de partícula (en número) solo tiene un máximo, es decir, hay una sola población de gotas distribuidas alrededor de un promedio (moda), en lugar de tener dos máximos. Las emulsiones preferidas tienen una polidispersión de <0,4, por ejemplo, 0,3, 0,2 o menos.

Las emulsiones adecuadas con gotas submicrométricas y una estrecha distribución de tamaños se pueden obtener mediante el uso de microfluidización. Esta técnica reduce el tamaño promedio de las gotas de aceite impulsando flujos de componentes de entrada a través de canales geométricamente fijados a alta presión y alta velocidad. Estos flujos contactan las paredes del canal, las paredes de la cámara y entre sí. Los resultados de las fuerzas de cizalla, impacto y cavitación provocan una reducción en el tamaño de la gota. Se pueden realizar etapas repetidas de microfluidización hasta que se logre un tamaño promedio de gota y una distribución deseada.

Como alternativa a la microfluidización, se pueden usar procedimientos térmicos para provocar la inversión de fase, tal como se desvela en la referencia 14. Estos procedimientos también pueden proporcionar emulsiones con una distribución de tamaño de partícula ajustada.

Las emulsiones preferidas se pueden esterilizar por filtración, es decir, sus gotas pueden pasar a través de un filtro de 220 nm. Así como proporcionar una esterilización, este procedimiento también elimina cualquier gota grande en la emulsión.

En algunos caos, el lípido catiónico en la emulsión es DOTAP. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml de DOTAP. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DOTAP de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,9 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,1 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,2 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,3 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,4 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,6 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 24 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 22 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 18 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1.9 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,8 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,7 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1.6 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,7 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,0 mg/ml, aproximadamente 1,1 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,3 mg/ml, aproximadamente 1,4 mg/ml, aproximadamente 1,5 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21,8 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, etc. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml de DOTAP, tal como 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml o 1,6 mg/ml.

En algunos casos, el lípido catiónico es colesterol DC. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender colesterol DC de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de colesterol DC. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender colesterol DC de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,62 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2,46 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,92 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2,46 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 0,62 mg/ml, aproximadamente 0,15 mg/ml, aproximadamente 0,3 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,62 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 2,46 mg/ml, aproximadamente 4,92 mg/ml, etc. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende de aproximadamente 0,62 mg/ml a aproximadamente 4,92 mg/ml de colesterol DC, tal como 2,46 mg/ml.

En algunos casos, el lípido catiónico es DDA. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de DDA. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DDA de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,45 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,73 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,9 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,45 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,45 mg/ml, etc. Como alternativa, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DDA a aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 21,5 mg/ml, aproximadamente 21,6 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende de aproximadamente 0,73 mg/ml a aproximadamente 1,45 mg/ml de DDA, tal como 1,45 mg/ml.

Determinadas composiciones preferidas de la invención para la administración a un paciente comprenden escualeno, span 85, polisorbato 80 y DOTAP. Por ejemplo: el escualeno puede estar presente a 5-15 mg/ml; span 85 puede estar presente a 0,5-2 mg/ml; polisorbato 80 puede estar presente a 0,5-2 mg/ml; y DOTAP puede estar presente a 0,1-10 mg/ml. La emulsión puede incluir la misma cantidad (en volumen) de span 85 y polisorbato 80. La emulsión puede incluir más escualeno que tensioactivo. La emulsión puede incluir más escualeno que DOTAP. El ARN

La divulgación describe el suministro in vivo de ARN auto-replicante que codifica un inmunógeno. El ARN desencadena dos rutas de inmunidad innata separadas y también se traduce, dando lugar a la expresión del inmunógeno.

El ARN es -catenario, y por lo tanto se puede traducir sin necesitar la intervención de etapas de replicación tales como la transcripción inversa.

Los ARN -catenarios son auto-replicantes. Una molécula de ARN auto-replicante (replicón) puede, cuando se suministra a una célula de vertebrado incluso sin ninguna proteína, dar lugar a múltiples ARN hermanos por transcripción de sí mismo (mediante una copia antisentido que se genera de sí mismo). Una molécula de ARN autoreplicante es por tanto una molécula -catenaria que se puede traducir directamente después del suministro en la célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que entonces produce transcripciones tanto antisentido como en sentido a partir del ARN suministrado. Por lo tanto, el ARN suministrado da lugar a la producción de múltiples ARN hermanos. Estos ARN hermanos, así como las transcripciones subgenómicas co-lineales, se pueden traducir por sí mismas para proporcionar la expresión in situ de un inmunógeno codificado, o pueden transcribirse para proporcionar transcripciones adicionales con el mismo sentido que el ARN suministrado que se traduce para proporcionar la expresión in situ del inmunógeno. Los resultados totales de esta secuencia de transcripciones es una gran amplificación del número de ARN replicones introducidos y por lo tanto el inmunógeno codificado se convierte en el producto polipeptídico principal de las células.

Un sistema adecuado para conseguir la auto-replicación es utilizar un replicón de ARN basado en alfavirus. Estos replicones -catenarios se traducen tras el suministro en una célula para dar lugar a una replicasa (o replicasatranscriptasa). La replicasa se traduce como una poliproteína que se auto-escinde para proporcionar un complejo de replicación que crea copias --catenarias del ARN -catenario suministrado. Estas transcripciones --catenarias pueden transcribirse ellas mismas para dar copias adicionales del ARN -catenario parental y también para dar una transcripción subgenómica que codifica el inmunógeno. La traducción de la transcripción subgenómica da lugar de esta manera a la expresión in situ del inmunógeno por la célula infectada. Los replicones de alfavirus adecuados pueden utilizar una replicasa de un virus sindbis, un virus de la selva semliki, un virus de encefalitis equina oriental, un virus de encefalitis venezolana, etc. Se pueden utilizar secuencias víricas mutantes o de tipo silvestre, por ejemplo, se ha utilizado la mutante TC83 atenuada del VEEV [15].

Una molécula de ARN auto-replicante preferida codifica de esta manera (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molécula de ARN auto-replicante y (ii) un inmunógeno. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus, por ejemplo, que comprende una o más proteínas de alfavirus nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4.

Como los genomas naturales de alfavirus codifican proteínas estructurales del virión además de la replicasa poliproteica no estructural, se prefiere que una molécula de ARN auto-replicante para su uso de acuerdo con la invención no codifique proteínas estructurales del alfavirus. Por lo tanto, un ARN auto-replicante preferido puede dar lugar a la producción de copias del propio ARN genómico en una célula, pero no a la producción de viriones que contengan el ARN. La incapacidad para producir estos viriones significa que, a diferencia del alfavirus de tipo silvestre, la molécula de ARN auto-replicante no puede perpetuarse ella misma en forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfavirus que son necesarias para la perpetuación en los virus de tipo silvestre están ausentes en los ARN auto-replicantes para su uso de acuerdo con la invención, y tiene lugar por codificación genética del inmunógeno de interés, de manera que la transcripción subgenómica codifica el inmunógeno más que las proteínas estructurales del virión de alfavirus.

Por lo tanto una molécula de ARN auto-replicante útil en la invención puede tener dos fases de lectura abierta. La primera fase de lectura abierta (5') codifica una replicasa; la segunda fase de lectura abierta (3') codifica un inmunógeno. En algunos casos, el ARN puede tener fases de lectura abiertas adicionales (por ejemplo, corriente abajo) por ejemplo para codificar inmunógenos adicionales (véase posteriormente) o para codificar polipéptidos accesorios.

Una molécula de ARN auto-replicante puede tener una secuencia 5' que sea compatible con la replicasa codificada. Las moléculas de ARN auto-replicante pueden tener distintas longitudes pero son normalmente de 5000-25000 nucleótidos de longitud, por ejemplo 8000-15000 nucleótidos, o 9000-12000 nucleótidos. Por lo tanto el ARN es más largo que el que se ve en el suministro de ARNip.

Una molécula de ARN útil en la invención tiene una protección en 5' (por ejemplo, una 7-metilguanosina). Esta protección aumenta la traducción in vivo del ARN.

El nucleótido 5' de una molécula de ARN útil en la invención puede tener un grupo trifosfato 5'. En un ARN protegido este puede estar unido a una 7-metilguanosina mediante un puente 5'-5'. Un trifosfato en 5' puede aumentar la unión con RⁱG-I.

Una molécula de ARN puede tener una cola poli-A 3'. Puede incluir también una secuencia de reconocimiento de Poli-A polimerasa (por ejemplo, AAUAAA) cerca de su extremo 3'.

Una molécula de ARN útil en la invención será normalmente de cadena sencilla. Los ARN de cadena sencilla pueden iniciar en general un efecto adyuvante uniéndose a TLR7, TLR8, ARN helicasas y/o PKR. El ARN suministrado en forma de doble cadena (dsARN) se puede unir a TLR3, y este receptor también puede desencadenarse por el dsARN que se forma durante la replicación de un ARN de cadena sencilla o con la estructura secundaria de un ARN de cadena sencilla.

Una molécula de ARN útil en la invención se puede preparar convenientemente por transcripción in vitro (IVT). La IVT puede utilizar una matriz (ADNc) creado y propagado en forma de plásmidos en bacterias, o se crea sintéticamente (por ejemplo, por síntesis genética o por procedimientos de modificación con una reacción en cadena de polimerasa (PCR)). Por ejemplo, una ARN polimerasa dependiente de ADN (tal como la ARN polimerasas de bacteriófago T7, T3, o SP6) se pueden utilizar para transcribir el ARN a partir de una matriz de ADN. Las reacciones de protección y adición de poli-A apropiadas se pueden utilizar según se necesite (aunque la poli-A del replicón se codifica habitualmente en la matriz de ADN). Estas ARN polimerasa pueden tener necesidades rigurosas para el nucleótido transcrito 5' y en algunos casos estas necesidades pueden coincidir con las necesidades de la replicasa codificada, para asegurar que el ARN transcrito por IVT puede funcionar eficazmente como sustrato para su replicasa auto-codificada.

Tal como se trata en la referencia 16, el ARN autorreplicante puede incluir (además de cualquier estructura de protección en 5'), uno o más nucleótidos que tienen una nucleobase modificada, sin embargo, esto no está dentro del alcance de la invención. Según la presente invención, el ARN incluye nucleobases no modificadas, e incluyen nucleótidos no modificados es decir, todos los nucleótidos de la ARN son los ribonucleótidos A, C, G y U convencionales (excepto para cualquier estructura protectora 5', que pueden incluir una 7'-metil-guanosina). El ARN incluye una protección en 5' que puede comprender 7'-metilguanosina.

Idealmente, el ARN administrado incluye menos de 10 especies diferentes de ARN, por ejemplo, 5, 4, 3, o 2 especies diferentes; más preferentemente, una composición incluye una única especie de ARN, es decir, todas las moléculas de ARN de la composición tienen la misma secuencia y la misma longitud.

El inmunógeno

Las moléculas de ARN que se utilizan en la invención codifica un inmunógeno polipeptídico. Tras la administración del ARN el inmunógeno se traduce in vivo y puede dar lugar a una respuesta inmunitaria contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito. La respuesta inmunitaria puede comprender una respuesta de anticuerpos (habitualmente incluyendo una IgG) y/o una respuesta inmunitaria mediada por células. El inmunógeno polipeptídico normalmente dará lugar a una respuesta inmunitaria que reconozca el correspondiente polipéptido bacteriano, vírico, fúngico o parasitario, pero en algunos casos el polipéptido puede actuar como un mimótopo para dar lugar a una respuesta inmunitaria que reconozca un sacárido bacteriano, vírico, fúngico o parasitario. El inmunógeno será normalmente un polipéptido de superficie, por ejemplo, una adhesina, una hemaglutinina, una glucoproteína de envoltura, una glucoproteína de fijación, etc.

Las moléculas de ARN pueden codificar un único inmunógeno polipeptídico o múltiples polipéptidos. Los múltiples inmunógenos se pueden presentar como un único inmunógeno polipeptídico (fusión polipeptídica) o como polipéptidos separados. Si los inmunógenos se expresan como polipéptidos separados, entonces uno o más de estos se pueden proporcionar con un IRES corriente arriba o un elemento promotor vírico adicional. De manera alternativa, se pueden expresar múltiples inmunógenos a partir de una poliproteína que codifica inmunógenos individuales fusionados a una proteasa autocatalítica corta (por ejemplo una proteína del virus 2A de la enfermedad de pies y boca), o como inteínas.

A diferencia con las referencias 37 y 17, el ARN codifica un inmunógeno. Para evitar toda duda, la invención no engloba el ARN que codifica una luciferasa de luciérnaga o que codifica una proteína de fusión de p-galactosidasa de E. coli o que codifica una proteína fluorescente verde (GFP). también, el ARN no es un ARN total de timo de ratón.

En algunos casos, el inmunógeno da lugar a una respuesta inmunitaria contra una de estas bacterias:

Neisseria meningitidis: los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, las proteínas de membrana tales como adhesinas, auto-transportadores, toxinas, proteínas de adquisición de hierro, y proteínas de unión al factor H. Una combinación de tres polipéptidos útiles se desvela en la referencia 18.

Streptococcus pneumoniae: Los inmunógenos polipeptídicos útiles se desvelan en la referencia 19. Estos incluyen, pero no se limitan a, la subunidad PrgB pilosa, el precursor beta-N-acetil-hexosaminidasa (spr0057), spro096, proteína general de estrés GSP-781 (spr2021, SP2216), serina/treonina cinasa StkP (SP1732), y adhesina de superficie neumocócica PsaA.

Streptococcus pyogenes: los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos desvelados en las referencias 20 y 21.

Moraxella catarrhalis.

Bordetella pertussis: Los inmunógenos útiles de pertussis incluyen, pero no se limitan a, la toxina o toxoide pertussis (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina, y aglutinógenos 2 y 3.

Staphylococcus aureus: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos desvelados en la referencia 22, tal como hemolisina, esxA, esxB, proteína de unión a ferricromo (sta006) y/o la lipoproteína sta011.

Clostridium tetani: el inmunógeno típico es el toxoide tetánico.

Corynebacterium diphtheriae: el inmunógeno típico es el toxoide diftérico.

Haemophilus influenzae: los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos desvelados en las referencias 23 y 24.

Pseudomonas aeruginosa

Streptococcus agalactiae: los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos desvelados en la referencia 20.

Chlamydia trachomatis: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, tipo OmpH, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA y MurG (por ejemplo, como se desvelan en la referencia 25. LcrE [26] y HtrA [27] son dos inmunógenos preferidos.

Chlamydia pneumoniae: los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos desvelados en la referencia 28.

Helicobacterpylori: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a CagA, VacA, NAP, y/o ureasa [29]. Escherichia coli: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, inmunógenos derivados de la E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroagregadora (EAggEC), E. coli adherente difusamente (DAEC), E. coli enteropatogénica (EPEC), E. coli patogénica extraintestinal (ExPEC) y/o E. coli enterohemorrágica (EHEC). Las cepas ExPEC incluyen la E. coli uropatogénica (UPEC) y las E. coli asociada con meningitis/sepsis (MNEC). Los inmunógenos polipeptídicos UPEC útiles se desvelan en las referencias 30 y 31. Los inmunógenos MNEC útiles se desvelan en la referencia 32. Un inmunógeno útil para varios tipos de E. coli es el AcfD [35].

Bacillus anthracis

Yersinia pestis: Los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los desvelados en las referencias 34 y 35. Clostridium perfringens o Clostridium botulinum

Legionella pneumophila

Coxiella burnetii

Brucella, tal como B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis, B. pinnipediae.

Francisella, tal como F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis.

Neisseria gonorrhoeae

Treponema pallidum

Haemophilus ducreyi

Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium

Staphylococcus saprophyticus

Yersinia enterocolitica

Mycobacterium tuberculosis

Rickettsia

Listeria monocytogenes

Vibrio cholerae

Salmonella typhi

Borrelia burgdorferi

Porphyromonas gingivalis

Klebsiella

En algunos casos el inmunógeno da lugar a una respuesta inmunitaria contra uno de estos virus:

Ortomixovirus: Los inmunógenos útiles pueden ser de un virus influenza A, B o C, tal como la hemaglutinina, neuraminidasa o proteínas M2 de la matriz. Cuando el inmunógeno es una hemaglutinina del virus influenza A puede ser de cualquier subtipo, por ejemplo, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16.

Virus Paramixoviridae: Los inmunógenos víricos incluyen pero no se limitan a, los derivados de Pneumovirus (por ejemplo, virus respiratorio sincitial, RSV), Rubulavirus (por ejemplo, virus de las paperas), Paramixovirus (por ejemplo, virus para influenza), Metapneumovirus y Morbilivirus (por ejemplo, sarampión).

Poxviridae: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de Ortopoxvirus tal como Variola vera, incluyendo pero sin limitarse a Variola major y Variola minor.

Picornavirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de Picornavirus, tales como Enterovirus, Rinovirus, Heparnavirus, Cardiovirus, y Aftovirus. Por ejemplo, el enterovirus es un poliovirus, por ejemplo un poliovirus tipo 1, tipo 2, y/o tipo 3. En otro caso, el enterovirus es un enterovirus EV71. En otro caso el enterovirus en un virus coxsackie A o B.

Bunyavirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Ortobunyavirus, tal como el virus de la encefalitis de California, un Flebovirus, tal como el virus de la fiebre del Valle del Rift, o un Nairovirus, tal como el virus de la fiebre hemorrágica Crimea-Congo.

Heparnavirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Heparnavirus, tales como el virus de la hepatitis A (VHA).

Filovirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un filovirus, tal como un virus de Ébola (incluyendo un ebolavirus de Zaire, Costa de Marfil, Reston o Sudán) o un virus de Marburgo.

Togavirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Togavirus, tal como un Rubivirus, un Alfavirus, o un Arterivirus. Este incluye el virus de la rubeola.

Flavivirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a los derivados de Flavivirus, tales como el virus de encefalitis producida por bacterias (TBE), virus del Dengue (tipos 1, 2, 3, o 4), virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la selva Kyasanur, virus de la encefalitis del Nilo occidental, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis de primavera-verano Rusa, virus de la encefalitis Powassan.

Pestivirus: Los inmunógenos víricos incluyen pero no se limitan a, los derivados de un Pestivirus, tal como el de la diarrea vírica bovina (BVDV), fiebre porcina clásica (CDFV) o enfermedad fronteriza (BDV).

Hepadnavirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Hepadnavirus, tales como el virus de la Hepatitis B. Una composición puede incluir un antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg).

Otros virus de hepatitis: Una composición puede incluir un inmunógeno de un virus de hepatitis C, virus de hepatitis delta, virus de hepatitis E, o virus de hepatitis G.

Rabdovirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Rabdovirus, tal como un Lyssavirus (por ejemplo, virus de la rabia) y Vesiclovirus (VSV).

Caliciviridae: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de Caliciviridae, tal como el virus Norwalk (Norovirus), y virus tipo Norwalk, tal como el virus Hawai y el virus de Snow Mountain.

Coronavirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un coronavirus SARS, bronquitis infecciosa aviar (IBV), virus de la hepatitis del ratón (MHV), y virus de la gastroenteritis transmisible porcina (TGEV). El inmunógeno de coronavirus puede ser un polipéptido de fijación.

Retrovirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de Oncovirus, un Lentivirus (por ejemplo, VIH-1 o VIH-2) o un Espumavirus.

Reovirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un Ortorreovirus, un Rotavirus, un Orbivirus, o un Coltivirus.

Parvovirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados del Parvovirus B19.

Herpesvirus: Los inmunógenos incluyen pero no se limitan a, los derivados de un herpesvirus humano, tal como, a modo de ejemplo solo, virus del herpes simple (HSV) (por ejemplo, HSV tipo 1 y 2), virus de la varicela-zoster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), Citomegalovirus (CMV), herpesvirus humano 6 (HHV6), herpesvirus humano 7 (HHV7), y herpesvirus humano 8 (HHV8).

Papovavirus: Los inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de Papolomavirus y Poliomavirus. El papilomavirus (humano) puede ser del serotipo 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 o 65, por ejemplo de uno o más de los serotipo 6, 11, 16 y/o 18.

Adenovirus: Los inmunógenos víricos incluyen los derivados de adenovirus serotipo 36 (Ad-36).

En algunos casos, el inmunógeno da lugar a una respuesta inmunitaria contra un virus que infecta peces, tales como: el virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV), el virus de la enfermedad pancreática del salmón (SPDV), virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), virus del pez gato del canal (CCV), virus de la enfermedad linfoquística de peces (FLDV), virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), herpesvirus de la carpa koi, virus tipo picorna del salmón (también conocido como virus tipo picorna del salmón atlántico), virus del salmón de interior (LSV), rotavirus de salmón atlántico (ASR), virus de la enfermedad fresa de la trucha (TSD), virus del tumor de salmón coho (CSTV), o virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV).

Los inmunógenos fúngicos se pueden derivar de Dermatofitos, que incluyen: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, y/o Trichophyton faviforme; o from Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusi; the less common are Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaría spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp, y Cladosporium spp.

En algunos casos, el inmunógeno da lugar a una respuesta inmunitaria contra un parásito del género Plasmodium, tal como P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. Por lo tanto, la invención puede utilizarse para la inmunización contra la malaria. En algunos casos, el inmunógeno da lugar a una respuesta inmunitaria contra un parásito de la familia Galigidae, particularmente los de los géneros Lepeophtheirus y Caligus, por ejemplo, los piojos marinos tales como Lepeophtheirus salmonis o Caligus regercersseyi.

Composiciones farmacéuticas

El ARN se administrará como un componente en una composición farmacéutica para inmunizar sujetos contra distintas enfermedades. Estas composiciones incluirán normalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable además del ARN, a menudo como parte de un sistema de suministro como se ha descrito anteriormente. Una exposición completa de los vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 36.

Una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la invención puede incluir una o más moléculas pequeñas inmunopotenciadoras. Por ejemplo, la composición puede incluir un agonista de TLR2 (por ejemplo, Pam3CSK4), un agonista de TLR4 (por ejemplo un fosfato de aminoalquil glucosaminida, tal como E6020), un agonista de TLR7 (por ejemplo, imiquimod), un agonista de TLR8 (por ejemplo, resiquimod) y/o un agonista de TLR9 (por ejemplo, IC31). Cualquiera de dichos agonistas tiene un peso molecular de <2000 Da. Cuando se encapsula un ARN, dichos agonistas también se pueden encapsular con el ARN, pero como alternativa pueden estar sin encapsular. Cuando un ARN se adsorbe a una partícula, dichos agonistas también pueden estar adsorbidos con el ARN, pero como alternativa, están no adsorbidos.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la invención pueden incluir las partículas en agua normal (por ejemplo, api) o en un tampón, por ejemplo, un tampón de fosfato, un tampón Tris, un tampón de borato, un tampón de succinato, un tampón de histidina, o un tampón de citrato. Las sales del tampón normalmente se incluyen en un intervalo de 5-20 mM.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la invención pueden tener un pH entre 5,0 y 9,5, por ejemplo, entre 6,0 y 8,0.

Las composiciones para su uso de acuerdo con la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro sódico) para darles tonicidad. Es típica una concentración de 10 ± 2 mg/ml de NaCl, por ejemplo, aproximadamente 9 mg/ml.

Las composiciones para su uso de acuerdo con la invención pueden incluir quelantes de iones metálicos. Estos pueden prolongar la estabilidad del ARN retirando iones que pueden acelerar la hidrólisis fosfodiéster. Por lo tanto, una composición puede incluir uno o más de EDTA, EGT^a , BAPTA, ácido pentético, etc. Dichos quelantes están presentes normalmente entre 10-500 pM, por ejemplo, 0,1 mM. Una sal de citrato, tal como el citrato sódico, también puede actuar como un quelante, mientras que también proporciona ventajosamente una actividad tampón.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la invención pueden tener una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo, entre 240-360 mOsm/kg, o entre 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la invención pueden incluir uno o más conservantes, tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Se prefieren las composiciones libres de mercurio, y se pueden preparar vacunas libres de conservantes.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la invención son preferentemente estériles.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la invención son preferentemente no pirógenas por ejemplo, que contengan <1 UE (unidad endotóxica, una medida convencional) por dosis, y preferentemente <0,1 EU por dosis.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la invención son preferentemente libres de gluten. Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la invención se pueden preparar en forma de dosis unitarias. En algunos casos una dosis unitaria puede tener un volumen de entre 0,1-1,0 mg, por ejemplo, aproximadamente 0,5 ml.

Las composiciones se pueden preparar como inyectables, sean soluciones o suspensiones. La composición se puede preparar para la administración pulmonar, por ejemplo, mediante un inhalador, utilizando un pulverizador fino. La composición se puede preparar para la administración nasal, auricular, u ocular, por ejemplo, como un pulverizador o gotas. Los inyectables para la administración intramuscular son típicos.

Las composiciones comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de ARN, así como otros componentes, según sea necesario. Por “cantidad inmunológicamente eficaz” se quiere significar que la administración de esa cantidad a un individuo, sea en una única dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y estado físico del individuo que se va a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica del médico encargado, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encontrará en un amplio intervalo que se puede determinar mediante ensayos de rutina. El contenido de ARN de las composiciones para su uso de acuerdo con la invención se expresará en general en términos de la cantidad de ARN por dosis. Una dosis preferida tiene < 10 |jg de ARN, y la expresión se puede ver a niveles mucho más bajos por ejemplo, < 1 jg/dosis, < 100 ng/dosis, < 10 ng/dosis, < 1 ng/dosis, etc. Los ARN no se suministran en combinación con ribosomas y por tanto las composiciones farmacéuticas están libres de ribosomas.

Procedimientos de tratamiento y usos médicos

El suministro de ARN tal como se describe en el presente documento es para dar lugar a una respuesta inmunitaria in vivo contra un inmunógeno de interés. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y preferentemente implica anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El procedimiento puede aumentar una respuesta de refuerzo.

Aumentando la respuesta inmunitaria el vertebrado puede protegerse contra distintas enfermedades y/o infecciones, por ejemplo, contra enfermedades bacterianas y/o víricas, como se ha expuesto anteriormente. Las composiciones que contienen ARN son inmunogénicas, y son más preferentemente composiciones vacunales. Las vacunas pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero serán normalmente profilácticas.

El vertebrado es preferentemente un mamífero, tal como un ser humano o un mamífero grande veterinario (por ejemplo, caballos, ganado bovino, ciervos, cabras, cerdos). Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño en edad de gatear o un bebé) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna concebida para niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.

Las vacunas preparadas tal como se describe en el presente documento se pueden utilizar para tratar tanto niños como adultos. Por lo tanto un paciente humano puede ser menor de 1 año de edad, menor de 5 años de edad, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad, o al menos de 55 años de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, > 50 años de edad, > 60 años de edad, y preferentemente > 65 años de edad), los jóvenes (por ejemplo, < 5 años de edad), pacientes hospitalizados, trabajadores sanitarios, servicio amado y personal militar, mujeres embarazadas, pacientes enfermos crónicamente o inmunodeficientes. Sin embargo, las vacunas son adecuadas no solamente para estos grupos, y se pueden utilizar más generalmente en una población.

Las composiciones para su uso de acuerdo con la invención se administrarán en general directamente al paciente. El suministro directo preferentemente se puede conseguir por inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, o en el espacio intersticial de un tejido, o preferentemente en el músculo esquelético; a diferencia de la referencia 37, la inyección intraglosal no se utilizan normalmente en la presente divulgación), o mucosa, tal como por administración rectal, oral (por ejemplo, comprimido, pulverizador), vaginal, tópica, transdérmica, o transcutánea, intranasal, ocular, auricular, pulmonar u otra administración mucosa. La inyección es preferentemente mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero se puede utilizar alternativamente la inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0,5 ml.

El ARN o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con las reivindicaciones se puede utilizar para dar lugar a una inmunidad sistémica o mucosa, preferentemente para dar lugar a una inmunidad sistémica y/o mucosa aumentada.

La dosificación puede ser mediante un calendario de dosis única o un calendario de múltiples dosis Las múltiples dosis se pueden utilizar en un calendario de inmunización primaria y/o en un calendario de inmunización de refuerzo. En un calendario de dosis múltiples las distintas dosis se pueden dar por la misma o diferentes vías, por ejemplo una primaria parenteral y un refuerzo mucoso, una primaria mucosa y un refuerzo parenteral, etc. Las dosis múltiples se administrarán normalmente al menos con una semana de separación (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En un caso, las dosis múltiples se pueden administrar aproximadamente 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas después del nacimiento, por ejemplo a una edad de 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas, como se utiliza a menudo en el Programa de Inmunización Expandida de la Organización Mundial de la Salud (“EPI”).Como alternativa, se administran dos dosis primarias con aproximadamente dos meses de separación, por ejemplo, aproximadamente con 7, 8 o 9 semanas de separación, seguido por una o más dosis de refuerzo aproximadamente de 6 meses a 1 año después de la segunda dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente 6, 8 ,10 o 12 meses después de la segunda dosis primaria. Como alternativa, se administran tres dosis primarias aproximadamente con dos meses de separación, por ejemplo con aproximadamente 7, 8 o 0 semanas de separación, seguido por una o más dosis de refuerzo aproximadamente de 6 meses a 1 año después de la tercera dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente 6, 8, 10, o 12 meses después de la tercera dosis primaria.

General

La práctica de la presente invención empleará, a menos de que se indique otra c osa, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, en la experiencia de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, las referencias 38-44, etc.

La expresión “que comprende” engloba “que incluye” así como “que insiste”, por ejemplo, una composición que “comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y..

El término “aproximadamente” en relación a un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x ± 10 %. La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente” por ejemplo, una composición que está “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Si es necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definición de la invención.

Las referencias para carga, para cationes, para aniones, para zwitteriones, etc., se toman a pH 7.

TLR3 es el receptor 3 tipo Toll. Es un único receptor que abarca la membrana que tiene un papel clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas de TLR3 conocidos incluyen poli(I:C). “TLR3” es el nombre de HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su HGNC ID único es HGNC: 11849. La secuencia RefSeq para el gen TLR3 humano es GI: 2459625.

TLR7 es el receptor 7 tipo Toll. Es un único receptor que abarca la membrana que tiene un papel clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas de TLR7 conocidos incluyen, por ejemplo, el imiquimod. “TLR7” es el nombre de HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su único HGNC ID es HGNC: 15631. La secuencia RefSeq para el gen TLR7 humano es GI: 67944638.

TLR8 es el receptor 8 tipo Toll. Es un único receptor que engloba la membrana que tiene un papel clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas de TLR8 conocidos incluyen, por ejemplo, el resiquimod. “TLR8” es el nombre de HGNC aprobado para el gen que codifica este receptor, y su único HGNC ID es HGNC: 15632. La secuencia RefSeq para el gen del TLR8 humano es GI: 20302165.

La familia del receptor tipo RIG-I (“RLR”) incluye varias ARN helicasas que tienen papeles clave en el sistema inmunitario innato [45]. El RLR-1 (también conocido como RIG-I o gen I inducible por ácido retinoico) tiene dos dominios de reclutamiento de caspasa cerca de su extremo N. El nombre de HGNC para el gen que codifica la RLR-1 helicasa es “DDX58” (por el polipéptido box DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 58) y e1HGNC ID único es HGNC: 19102. La secuencia RefSeq para el gen de RLR-1 humano es GI: 77732514. El RLR-2 (también conocido como MDA5 o gen 5 asociado con la diferenciación del melanoma) también tiene dos dominios de reclutamiento de caspasa cerca de su extremo N. El nombre HGNC aprobado para el gen que codifica la RLR-2 helicasa es “IFIH1” (por interferón 1 inducido con el domino 1 de helicasa C) y el HGNC ID único es HGNC: 18873. La secuencia RefSeq para el gen de RLR-2 humano es GI: 27886567. El RLR-3 (también conocido como LGP2 o laboratorio de genética y fisiología 2) no tiene dominios de reclutamiento de caspasa. El nombre HNGC aprobado para el gen que codifica la RLR- helicasa es “DHX58” (por polipéptido box DEXH (Asp-Glu-X-His) 58) y el HGNC ID único es H^g NC: 29517. La secuencia RefSeq para el gen de R^lR-3 humano es GI: 149408121.

PKR es una proteína cinasa dependiente de ARN de cadena doble. Tiene un papel clave en el sistema inmunitario innato. “EIF2AK2” (por alfa cinasa 2 del factor 2 de inicio de la traducción en eucariotas) es el nombre HGNC aprobado para el gen que codifica esta enzima, y su único HGNC ID es HGNC: 9437. La RefSeq para el gen PKR humano es GI: 208431825.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un gel con ARN teñido. Las calles muestran (1) marcadores (2) replicón desnudo (3) replicón tras el tratamiento con RNasa (4) replicón encapsulado en un liposoma (5) liposoma tras el tratamiento con RNasa (6) liposoma tratado con RNasa y luego sometido a extracción con fenol/cloroformo.

La Figura 2 es una micrografía electrónica de liposomas.

La Figura 3 muestra la expresión proteica (como unidades de luz relativas, RLU) los días 1, 3 y 6 tras el suministro de ARN como replicones empaquetados en viriones (cuadrados), ARN desnudo (triángulos), o como micropartículas (círculos).

La Figura 4 muestra un gel con ARN teñido. Las calles muestran (1) marcadores (2) replicón desnudo (3) replicón encapsulado en liposoma (4) liposoma tratado con RNasa y luego sometido a extracción con fenol/cloroformo.

La Figura 5 muestra la expresión proteica los días 1, 3, y 6 tras el suministro de ARN como un replicón empaquetado en un virión (cuadrados), como ARN desnudo (rombos), o en liposomas (+ = 0,1 |jg, x = 1 |jg). La Figura 6 muestra la expresión proteica los días 1, 3 y 6 tras el suministro de cuatro dosis diferentes de ARN encapsulado en liposomas.

La Figura 7 muestra los títulos de IgG anti-F en animales que recibieron el replicón empaquetado en viriones (VRP o VSRP), 1 jg de ARN desnudo, y 1 jg de ARN encapsulado en liposomas.

La Figura 8 muestra los títulos de IgG anti-F en animales que recibían VRP, 1 jg de ARN desnudo, y 0,1 g o 1 jg de ARN encapsulado en liposomas.

La Figura 9 muestra los títulos de anticuerpo neutralizante en animales que recibían VRP o 0,1 g o 1 jg de ARN encapsulado en liposomas.

La Figura 10 muestra los niveles de expresión tras el suministro de un replicón como ARN desnudo (círculos), ARN encapsulado en liposomas (triángulo y cuadrado), o como un lipoplex (triángulo invertido).

La Figura 11 muestra los títulos de IgG especifica de F (2 semanas después de la segunda dosis) tras el suministro de un replicón como ARN desnudo (0,01-1 jg), ARN encapsulado en liposomas (0,01-10 jg ) o empaquetado como un virión (VRP, 106 unidades infecciosas o UI).

La Figura 12 muestra los títulos de IgG específica de F (círculos) y títulos de PRNT (cuadrados) tras el suministro de un replicón como ARN desnudo (Vg), ARN encapsulado en liposomas (0,1 o Vg) o empaquetado como un virión (VRP, 106 UI). También se muestran los títulos en ratones intactos. Las líneas continuas muestran las medias geométricas.

La Figura 13 muestra la producción intracelular de citocina tras la re-estimulación con péptidos sintéticos que representan los epítopos principales de la proteína F, 4 semanas después de una segunda dosis. El eje y muestra el % de citocina de CD8+ CD4-.

La Figura 14 muestra los títulos de IgG específica de F (títulos medios de Log-iü ± desv. est.) sobre 63 días (Figura 14A) y 210 días (Figura 14B) tras la inmunización de terneros. Las cuatro líneas se distinguen fácilmente el día 63 y son, de abajo a arriba: control negativo PBS; ARN suministrado en liposomas; ARN suministrado en emulsión; y el producto “Triángulo 4”.

La Figura 15 muestra (A) IFN-p y (B) IL-6 liberado por fibroblastos. Los gráficos incluyen dos grupos de 4 barras. El cuarto izquierdo es para los ratones de control; el cuarto derecho es para los ratones inmunizados con ARN. Las 4 barras de cada cuarto, de izquierda a derecha, muestran los datos de los ratones rig-i +/-, rig-i -/-, mda5 +/-y mda5 -/-. Las figuras son pg/ml.

La Figura 16 muestra (A) IL-6 y (B) IFN-a (pg/ml) liberados por pDC. Hay 4 pares de barras, de izquierda a derecha; control; inmunizados con ARN+DOTAP; inmunizados con ARN+lipofectamina; e inmunizados con ARN en liposomas. En cada par la barra negra es de los ratones tipo silvestre, gris es el mutante rsql.

Modos de llevar a cabo la invención

Replicones ARN

Se utilizan distintos replicones posteriormente. En general se basan en un genoma de alfavirus híbrido con proteínas no estructurales del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), una señal de empaquetamiento de virus sindbis, y una 3' UTR de virus Sindbis o un mutante de VEEV. El replicón tiene aproximadamente 10 kb de longitud y tiene una cola poli-A.

El ADN plasmídico que codifica replicones de alfavirus (llamados pT7-mvEEV-FLRSVF o A317; pT7-mVEEV-SEAP o A306; pSP6-VCR-GFP o A50) servían como matriz para la síntesis de ARN in vitro. Los replicones contienen los elementos genéticos de alfavirus necesarios para la replicación de ARN pero carecen de los productos genéticos codificantes necesarios para el ensamblaje de partículas; las proteínas estructurales se remplazan en su lugar por una proteína de interés (sea un indicador, tal como SEAP o GFP, o un inmunógeno, tal como la proteína F de RSV de longitud completa) y así los replicones son incapaces de inducir la generación de partículas infecciosas. Un promotor de bacteriófago (T7 o SP6) corriente arriba del ADNc de alfavirus facilita la síntesis del replicón de ARN in vitro y una ribozima del virus de hepatitis delta (HDV) inmediatamente corriente debajo de la cola poli(A) genera el extremo 3' correcto mediante su actividad de auto-escisión.

A continuación del alineamiento del ADN plasmídico corriente debajo de la ribozima de HDV con una endonucleasa de restricción adecuada, se sintetizaron in vitro las transcripciones utilizando la ARN polimerasa dependiente de ADN derivado de bacteriófagos T7 o SP6. Las transcripciones se llevaron a cabo durante 2 horas a 37 °C en presencia de 7,5 mM (ARN polimerasa de T7) o 5 mM de (ARN polimerasa de SP6) de cada uno de los trifosfatos de nucleósido (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion).

A continuación de la transcripción la matriz de ADN se digirió con TURBO DNasa (Ambion). El replicón de ARN se precipitó con LiCl y se reconstituye en agua libre de nucleasas. El ARN no protegido se protegió posttranscripcionalmente con enzima de protección Vaccinia (VCE) utilizando el sistema de protección ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies) como se destaca en el manual del usuario; los replicones protegidos de esta manera tienen el prefijo “v”, por ejemplo, vA317 es el replicón A317 protegido mediante VCE. El ARN protegido posttranscripcionalmente se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua libre de nucleasas. La concentración de las muestras de ARN se determinaro midiendo la DO²⁶⁰nm. La integridad de las transcripciones in vitro se confirmaró por desnaturalización por electroforesis en gel de agarosa.

Adsorción de PLG (ejemplo de referencia)

Se produjeron micropartículas utilizando 500 mg de PLG RG503 (relación molar láctido/glicólido 50:50, PM ~ 30 kDa) y 20 mg de DOTAP utilizando un Homogeneizador Omni Macro. La suspensión de partículas se agitó a 150 rpm durante una noche y entonces se filtró a través de un filtro estéril de 40 pm para almacenarlo a 2-8 °C. El ARN auto-replicante se adsorbió a las partículas. Para preparar 1 ml de suspensión de PLG/ARN se añadió el volumen de suspensión de partículas PLG a un vial y se añadió agua libre de nucleasas hasta un volumen de 900 pl. Se añadieron 100 pl de ARN (10 pl/ml) gota a gota a la suspensión de PLG, con agitado constante. Se incubó la PLG/ARN a temperatura ambiente durante 30 min. Para 1 ml de suspensión reconstituida, se añadieron 45 mg de manitol, 15 mg de sacarosa y 250-500 pg de PVA. Los viales se congelaron a -80 °C y se liofilizaron.

Para evaluar la adsorción de ARN, se centrifugaron 100 pl de suspensión de partículas a 10.000 rpm durante 5 min y se recolectó el sobrenadante. Se reconstituyó el PLG/ARN utilizando 1 ml de agua libre de nucleasa. Se añadió a 100 pl de suspensión de partículas (1 pg de ARN), 1 mg de sulfato de heparina. La mezcla se removió y se permitió que se asentara a temperatura ambiente durante 30 min para la desorción de ARN. La suspensión de partículas se centrifugó y se recolectó el sobrenadante.

Para la estabilidad de la RNasa, se incubaron 100 pl de suspensión de partículas con 6,4 mAU de RNasa A a temperatura ambiente durante 30 min. La RNasa se inactivó con 0,126 mAU de Proteinasa K a 55 °C durante 10 min. Se añadió 1 mg de sulfato de heparina para des-adsorber el ARN seguido por centrifugación. Las muestras del sobrenadante que contenían ARN se mezclaron con colorante cargado con formaldehído, se calentó a 65 °C durante 10 min y se analizó utilizando un 1 % de gel desnaturalizante (460 ng de ARN cargado por calle).

Para evaluar la expresión, se inmunizaron ratones Balb/c con 1 pg de ARN en 100 pl de volumen de inyección intramuscular (50 pl/pata) el día 0. Se recolectaron los sueros los días 1, 3 y 6. La expresión proteica se determinó utilizando un ensayo de quimioluminiscencia. Como se muestra en la Figura 3, la expresión era mayor cuando el ARN se suministraba mediante PLG (triángulos) que sin la partícula de suministro (círculos).

Nanoemulsión catiónica

Se preparó una emulsión de aceite en agua por microfluidificación de escualeno, span 85, polisorbato 80 y cantidades variables de DOTAP. En resumen, los componentes solubles en aceite (escualeno, span 84, lípidos catiónicos, tensioactivos lipídicos) se combinaron en un matraz, se disolvieron los componentes lipídicos en un disolvente orgánico. La solución lipídica resultante se añadió directamente a la fase oleosa. Se permitió que el disolvente se evaporara a temperatura ambiente durante 2 horas en una campana de extracción antes de combinar la fase acuosa y la homogeneización de la muestra para proporcionar una materia prima homogénea. Las emulsiones primarias se pasaron de tres a cinco veces a través de un Microfluidificador con un calderín en un baño de hielo. Los lotes de muestras se retiraron de la unidad y se almacenaron a 4 °C.

Esta emulsión es por tanto similar al adyuvante comercial MF59, pero se suplementa con un DOTAP catiónico para proporcionar una nanoemulsión catiónica (“CNE”). La composición final de la emulsión “CNE17” era escualeno (un 4,3 % por peso), span 85 (un 0,5 % por peso), polisorbato 80 (un 0,5 % por peso), DOTAP (1,4 mg/ml), en 10 mM de tampón de citrato, pH 6,5.

El ARN se adsorbe a la superficie de las gotículas de aceite en estas emulsiones catiónicas. Para adsorber el ARN se diluyó una solución de ARN hasta una concentración apropiada con agua libre de RNasa y entonces se añadió directamente en un volumen igual de emulsión mientras se removía ligeramente. Se permitió que la solución se asentara a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas para permitir la adsorción. La solución resultante se diluyó hasta la concentración de ARN necesaria antes de la administración.

Encapsulación liposómica (ejemplo de referencia)

El ARN se encapsuló en liposomas producidos por el procedimiento de las referencias 6 y 46. Los liposomas se fabricaron con un 10 % de DSPC (zwitteriónico), un 40 % de DlinDMA (catiónico), un 48 % de colesterol y un 2 % de DMG conjugado con PEG (PEG de 2 kDa). Estas proporciones se refieren al % molar en el liposoma total.

Se sintetizó el DlinDMA (1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano) utilizando el procedimiento de la referencia 1. Se obtuvo el DSPC (1,2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) en Genzyme. El colesterol se obtuvo en Sigma-Aldrich. El DMG conjugado con PEG (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol), sal amónica), el DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio propano), sal de cloruro) y DC-chol (3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil] hidrocloruro de colesterol) eran de Avanti Polar Lipids.

En resumen, los lípidos se disolvieron en etanol (2 ml), se disolvió un replicón de ARN en tampón (2 ml, 100 mM de citrato sódico, pH 6) y se mezclaron con 2 ml de tampón seguido por 1 hora de equilibrado. La mezcla se diluyó con 6 ml de tampón y entonces se filtró. El producto resultante contenía liposomas con una eficacia de encapsulación de ~95 %.

Por ejemplo, en un procedimiento particular, se prepararon soluciones lipídicas madre recientes en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DSPC, 27,8 mg de colesterol y 8,07 mg de PEG-DMG y se disolvieron en 7,55 ml de etanol. La solución lipídica madre recién preparada se agitó suavemente a 37 °C durante aproximadamente 15 min para formar una mezcla homogénea. Después, 755 pl de la solución madre se añadió a 1,245 ml de etanol para producir una solución lipídica madre de trabajo de 2 ml. Esta cantidad de lípidos se utilizó para formar liposomas con 250 pg de ARN. También se prepararon 2 ml de solución de ARN de trabajo a partir de una solución madre de ~1 pg/ pl en 100 mM de tampón de citrato (pH 6). Se enjuagaron tres viales de cristal de 20 ml (con barras de remover) con solución RNase Away (Molecular BioProducts) y se lavaron con agua completa de MillQ antes de su uso para descontaminar los viales de RNasas. Uno de los viales se utilizó para la solución de ARN de trabajo y los otros para recolectar las mezclas de lípido y ARN (como se describe posteriormente). Las soluciones de trabajo de lípidos y ARN se calentaron a 37 °C durante 19 min antes de cargarse en jeringas con boquilla luer de 3 cc. Se cargaron 2 ml de tampón citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 cc. Las jeringas que contenían el ARN y los lípidos se conectaron a un mezclador T (PEEK™ unión ID 500 mm, Idex Health Science) utilizando un tubo FEP (etileno-propileno fluorado, todos los tubos FEP tenían un diámetro interno de 2 mm y un diámetro externo de 3 mm; obtenido en Idex Health Science). La conexión del mezclador T también tenía tubos FEP. La tercera jeringa que contenía en tampón de citrato se conectó a una pieza de tubo distinta.

Todas las jeringas se dirigieron a un caudal de 7 ml/min utilizando una bomba de jeringas. Las conexiones de los tubos se posicionaron para recolectar las mezclas en un vial de 30 ml (mientras se agitaba). Se sacaron las barras de agitado y se permitió que la solución acuosa/etanol se equilibrara a temperatura ambiente durante 1 h. Se cargaron 4 ml de la mezcla en una jeringa de 5 cc, que se conectó a una pieza de tubo FEP y en otra jeringa de 5 ccc conectada a un tubo FEP de igual longitud, se cargó una cantidad igual de 100 mM de tampón citrato (pH 6). las dos jeringas se dirigieron a un caudal de 7 ml/min utilizando la bomba de jeringas y la mezcla final se recolectó en un vial de cristal de 20 ml (mientras se agitaba). A continuación, la mezcla recolectada de la segunda etapa de mezclado (liposomas) se pasó por una membrana Mustang Q (un soporte de intercambio aniónico que retira las moléculas aniónicas, obtenida en Pall Corporation). Antes de utilizar esta membrana para los liposomas, se pasaron sucesivamente 4 ml de NaOH 1 M, 4 ml de NaCl 1 M y 10 ml de tampón de citrato 100 mM (pH 6) a través de la misma. Los liposomas se calentaron durante 10 min a 37 °C antes de pasarlos a través de la membrana. A continuación, los liposomas se concentraron a 2 ml y se dializaron contra 10-15 volúmenes de 1x PBS utilizando una filtración por flujo tangencial antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y las membranas de filtración de fibras huecas se adquirieron en Spectrum Labs (Rancho Dominguez) y se utilizaron de acuerdo con las directrices del fabricante. Se utilizaron membranas de filtración de fibra hueca de Polisulfona con un tamaño de corte de poro de 100 kD y un área de superficie de 8 cm2. Para los experimentos in vitro e in vivo las formulaciones se diluyeron a las concentraciones de ARN necesarias con 1x de PBS.

La Figura 2 muestra un ejemplo de micrografía electrónica de liposomas preparados por estos procedimientos. Estos liposomas contienen ARN encapsulado que codifica el antígeno F de RSV de longitud completa. La dispersión de luz dinámica de un lote mostraba un diámetro de 141 nm (por intensidad) o 78 nm (por número).

El porcentaje de ARN encapsulado y la concentración de ARN se determinaron con el kit de reactivo ARN Quant-iT RiboGreen (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. La referencia de ARN ribosómico proporcionado en el kit se utilizó para generar una curva de referencia. Los liposomas se diluyeron 10x o 100x en 1x de tampón TE (del kit) antes de la adición del colorante. Por separado, se diluyeron los liposomas 10x o 100x en 1x de tampón TE que contenía un 0,5% de Triton X antes de la adición del colorante (para destruir los liposomas y así ensayar el ARN total). A continuación se añadió una cantidad igual de colorante a cada solución y entonces se cargaron ~180 pl de cada solución tras la adición del colorante por duplicado en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos. Se leyó la fluorescencia (Ex 485 nm, Em 528 nm) en un lector de microplacas. Todas las formulaciones de liposomas se dosificaron in vivo basándose en la cantidad de ARN encapsulado.

Se demostró que la encapsulación en liposomas protegía al ARN de la digestión con RNasa. Los experimentos utilizaron 3,8 mAU de RNasa A por microgramo de ARN, se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La RNasa se inactivó con Proteinasa K a 55 °C durante 10 minutos. Se añadió entonces una mezcla 1:1 v/v de muestra a 25:24:1 v/v/v, fenol:cloroformo:alcohol isoamílico para extraer el ARN de los lípidos en la fase acuosa. Las muestras se mezclaron removiendo unos segundos y entonces se colocaron en una centrífuga durante 15 minutos a 12k RPM. La fase acuosa (que contenía el ARN) se retiró y se utilizó para analizar el ARN. Antes de la carga (400 ng de ARN por pocillo) todas las muestras se incubaron con el colorante que carga formaldehído, se desnaturalizaron durante 10 minutos a 65 °C y se enfrió a temperatura ambiente. Se utilizaron marcadores Ambion Millenium para aproximar el peso molecular de la construcción de ARN. El gel se ejecutó a 90 V. El gel se tiñó utilizando un 0,1 de SYBR oro de acuerdo con las directrices del fabricante en agua agitando a temperatura ambiente durante 1 hora. La Figura 1 muestra que la RNasa digería completamente el ARN en ausencia de encapsulación (calle 3). El ARN es indetectable tras la encapsulación (calle 4), y no se ve ningún cambio si los liposomas se tratan con RNasa (calle 4). Después, los liposomas tratados con RNasa se sometieron a extracción con fenol, se ve el ARN sin digerir (calle 6). Incluso tras 1 semana a 4 °C el ARN se podía ver sin ninguna fragmentación (Figura 4, flecha): La expresión proteica in vivo no cambiaba tras 6 semanas a 4 °C y un ciclo de congelación-descongelación. Por lo tanto el ARN encapsulado es estable.

Para evaluar la expresión in vivo de ARN se codificaba un enzima indicadora (SEAP; fosfatasa alcalina secretada) en el replicón, más que un inmunógeno. Los niveles de expresión se midieron en suero diluido 1:4 en 1x de tampón de dilución Phospha-Light utilizando un sustrato de fosfatasa alcalina quimioluminiscente. Se inyectó por vía intramuscular a ratones BALB/c de 8-10 semanas de edad (5/grupo) el día 0, con una dosis de 50 j l por pata de 0,1 |jg o 1 jg de ARN. También se administró el mismo vector sin liposomas (en 1x de PBS libre de RNasa) a 1 jg. También se ensayaron los replicones empaquetados en viriones. Los replicones empaquetados en viriones que se utilizan en el presente documento (a los que se hace referencia como “VRP”) se obtuvieron por los procedimientos de la referencia 47, en los que el replicón de alfavirus se deriva del VEEV mutante o una quimera derivada del genoma del VEEV modificado para que contenga la 3' UTR del virus Sindbis y una señal de empaquetamiento del virus Sindbis (PS), empaquetándolos por co-electroporación en células BHK con ARN auxiliares que codifican la cápside del virus Sindbis y genes de glucoproteínas deficientes.

Como se muestra en la Figura 5, la encapsulación aumentaba los niveles de SEAP aproximadamente 1/2 log a la dosis de 1 jg, y la expresión el día 6 de una dosis encapsulada de 0,1 jg se veían niveles coincidentes con una dosis no encapsulada de 1 jg. El día 3, los niveles de expresión excedían los conseguidos con VRP (cuadrados). Por tanto, la expresión aumentaba cuando el ARN se formulaba en liposomas con respecto al ARN desnudo de control, incluso a una dosis 10x menor. La expresión también era mayor con respecto al control de VRP, pero las cinéticas de expresión eran muy diferentes (véase la Figura 5). El suministro del ARN con electroporación daba como resultado un aumento de la expresión con respecto al ARN desnudo de control, pero estos niveles eran menores que con los liposomas.

Para evaluar si el efecto que se ve en los grupos de liposomas era simplemente debido a los componentes de los liposomas, o estaba ligado a la encapsulación, se administró el replicón en forma encapsulada (con dos protocolos de purificación diferentes, 0,1 jg de ARN), o se mezcló con liposomas después de su formación (un “lipoplex” no encapsulado, 0,1 jg de ARN), o como ARN desnudo (1 jg). La Figura 10 muestra que el lipoplex daba los niveles de expresión más bajos, demostrando que la encapsulación es esencial para una expresión potente.

Experimentos con SEAP adicionales demostraban una clara respuesta a la dosis in vivo, con expresión que se ve tras el suministro de tan poco como 1 ng de ARN (Figura 6). Experimentos adicionales que comparaban la expresión e replicones encapsulados y desnudos indicaban que 0,01 jg de ARN encapsulado era equivalente a 1 jg de ARN desnudo. A una dosis de 0,5 jg de ARN el material encapsulado daba una expresión 12 veces mayor el día 6; a niveles de dosis de 0,1 jg era 24 veces mayor el día 6.

Más que mirar los niveles medios del grupo, también se estudiaron los animales individuales. Mientras que varios animales no respondían a los replicones desnudos, la encapsulación eliminaba los que no respondían.

Experimentos adicionales remplazaban el DlinDMA con DOTAP. Aunque los liposomas con DOTAP daban una expresión mejor que el replicón desnudo, eran inferiores a los liposomas con DlinDMA (2 a 3 veces de diferencia el día 1).

Para evaluar la inmunogenicidad in vivo se construyó un replicón que expresaba la proteína F de longitud completa del virus respiratorio sincitial (RSV). Este se suministró desnudo (1 jg), encapsulado en liposomas (0,1 o 1 jg), o empaquetado en viriones (106 UI; “VRP”) los días 0 y 21. La Figura 7 muestra los títulos de IgG anti-F, 2 semanas después de la segunda dosis, y los liposomas aumentaban claramente la inmunogenicidad. La Figura 8 muestra los títulos 2 semanas después, en cuyo punto no había una diferencia estadística entre el ARN encapsulado a 0,1 jg, el ARN encapsulado a 1 jg, o el grupo VRP. Los títulos de neutralización (medidos como la reducción de placas del 60 %, “PRNT60”) no eran significativamente diferentes en estos tres grupos, 2 semanas después de la segunda dosis (Figura 9). La Figura 12 muestra los títulos de IgG y PRNT, 4 semanas después de la segunda dosis.

La Figura 13 confirma que el ARN da lugar a una respuesta de linfocitos T CD8 robusta.

Experimentos adicionales comparaban los títulos de IgG específica de F en ratones que recibían VRP, 0,1 |jg de ARN encapsulado en liposomas, o 1 jg de ARN encapsulado en liposomas. Las relaciones de título (VRP: liposomas) en distintos momentos después de la segunda dosis eran las siguientes:

2 semanas 4 semanas 8 semanas

0,1 pg 2,9 1,0 1,1

1 pg 2,3 0,9 0,9

Por lo tanto, el ARN encapsulado en liposomas induce esencialmente la misma magnitud de respuesta inmunitaria que se ve en el suministro con viriones.

Experimentos adicionales demostraban respuestas de IgG específica de F superiores con una dosis de 10 jg, respuestas equivalentes para dosis de 1 jg y 0,1 jg, una respuesta más baja con una dosis de 0,01 jg. La Figura 11 muestra los títulos de IgG en ratones que recibieron el replicón en forma desnuda con 3 dosis diferentes en liposomas con 4 dosis diferentes, o como VRP (106 UI). La respuesta que se ve con 1 jg de ARN encapsulado en liposomas era estadísticamente insignificante (ANOVA) cuando se comparaba con VRP, pero se veía la respuesta mayor con 10 jg de ARN encapsulado en liposomas era estadísticamente significativa (p<0,05) en comparación con ambos de estos grupos.

Un estudio adicional confirmaba que 0,1 jg de ARN encapsulado en ribosomas daba respuestas mucho más altas (15 días después de la segunda dosis) que 0,1 jg de ADN suministrado, e incluso era más inmunogénico que 20 jg de ADN plasmídico que codifica el antígeno F, suministrado por electroporación (Sistema de suministro de a Dn Elgen™, Inovio).

Un estudio adicional se llevó a cabo en ratas algodón (Sigmodon hispidis) en vez de en ratones. A una dosis de 1 jg de encapsulación en liposomas aumentaba los títulos de IgG específica de F unas 8,3 veces en comparación con el ARN desnudo y aumentaba los títulos de PRNT unas 9,5 veces. La magnitud de la respuesta de anticuerpos era equivalente a la inducida por 5 x 106 UI de VRP. Tanto el ARN desnudo como el encapsulado en liposomas eran capaces de proteger las ratas algodón del desafío con RSV (con 1 x 105 unidades formadoras de placas), reduciendo la carga vírica pulmonar al menos unos 3,5 logs. La encapsulación aumentaba la reducción aproximadamente unas 2 veces.

Estudio en animales grandes

Se llevó a cabo un estudio de grandes animales en ganado bovino. Las vacas se inmunizaron con 55 jg de replicón que codificaba la proteína F de RSV de longitud completa los días 0, 21, 86 y 146, formulado dentro de liposomas o con la emulsión CNE17. El PBS solo se utilizó como control negativo, y una vacuna con licencia se utilizó como control positivo (“Triangle 4” de Fort Dodge, que contenía virus inactivados). La Figura 14 muestra los títulos de IgG específicos de F durante los primeros 63 días. El replicón ARN era inmunogénico en las vacas utilizando ambos sistemas de suministro, aunque daba títulos más bajos que la vacuna con licencia. Todas las vacas vacunadas presentaban anticuerpos específicos de F tras la segunda dosis, y los títulos eran muy estables desde el periodo de 2 a 6 semanas después de la segunda dosis (y eran particularmente estables para las vacunas con ARN). Los títulos con el sistema de suministro en liposomas estaban agrupados más estrechamente que con la emulsión.

Los datos de este estudio proporcionan pruebas del concepto de las vacunas con un replicón ARN RSV en grandes animales, demostrando dos de cinco terneras del grupo adyuvado con la emulsión buenos títulos de anticuerpos neutralizantes después de la tercera vacunación, según se medía por el ensayo de neutralización de HRSV independiente del complemento. En un ensayo de neutralización de HRSV amplificado por complemento todas las terneras vacunadas tenían buenos títulos de anticuerpos neutralizantes después de la segunda vacunación con ARN independientemente de la formulación. Además, ambas vacunas con ARN daban lugar a títulos de IgG en el suero específicos de F que se detectaban en unas cuantas terneras después de la segunda vacunación y en todas las terneras después de la tercera vacunación. La F de RSV adyuvada con MF59 era capaz de reforzar la respuesta de IgG en todas las terneras vacunadas previamente y reforzar los títulos de neutralización de HRSV independiente de complemento de terneras vacunadas previamente con ARN.

Mecanismo de acción

Se obtuvieron células dendríticas derivadas de médula ósea (pDC) a partir de ratones de tipo silvestre o de la cepa mutante “Resq” (rsql). La cepa mutante tenía una mutación puntual en el extremo amino de su receptor TLR7 que abolía la señalización de TLR7 sin afectar la unión al ligando [48]. Las células se estimularon con el replicón ARN formulado con DOTAP, lipofectamina 2000 o en un liposoma. Como se muestra en la Figura 16, se inducían IL-6 e IFN-a en células TS pero esta respuesta se anulaba casi completamente en los ratones mutantes. Estos resultados demuestran que el TLR7 es necesario para el reconocimiento del ARN en las células inmunitarias, y que los replicones encapsulados en liposomas produce que las células inmunitarias secreten altos niveles tanto de interferones como de citocinas pro-inflamatorias.

La implicación de TLR7 se investigó adicionalmente, comparando las respuestas en ratones C57BL/6 de tipo silvestre (TS) y en la cepa mutante “Resq”. Se les administraron a los ratones (5 por grupo) vacunas bilaterales intramusculares (50 j l por pata) los días 0 y 21 con 1 |jg de ARN auto-replicante (“vA317”, que codifica la glucoproteína de fusión de RSV) formulado en liposomas (un 40% de DlinDMA, un 10% de DSPC, un 48% de colesterol, un 2 % de conjugado PEG-DMG), o con 2 jg de proteína F de RSV adyuvada con hidróxido de aluminio. Se recolectó el suero para los análisis inmunológicos los días 14 (2wp1) y 35 (2wp2). Los títulos de IgG en el suero específicos de F (GMT) eran los siguientes:

Con la vacuna proteica, los títulos de IgG específica de F en el suero eran comparables entre los ratones de tipo silvestre y los C56BL/6 Resq, es decir, la inmunogenicidad de la vacuna de proteína no era dependiente de TLR7. Por el contrario el ARN auto-replicante formulado en liposomas mostraba una disminución de 7 veces en los títulos de IgG específica de F en el suero tras ambas vacunaciones, indicando al menos una dependencia parcial del TLR7 para la inmunogenicidad de la vacuna de ARN.

Los resultados también muestran que la vacuna ARN puede dar lugar primariamente a una respuesta inmunitaria tipo Th1.

Se llevaron a cabo experimentos adicionales con el mismo ARN y los mismos ratones mutantes. Los ratones recibieron vacunas intramusculares bilaterales (50 j l por pata) los días 0 y 21 con 1 jg del replicón ARN, formulado con una nanoemulsión de aceite en agua catiónica submicrométrica (escualeno, span 85, polisorbato 80, DOTAP) o con liposomas (un 40 % DlinDMA, un 10 % de DSPC, un 48 % de colesterol, un 2 % de DMG conjugado con PeG). Se utilizaron 2 jg de proteína F adyuvada con aluminio para la comparación. Los sueros se recolectaron para los análisis inmunológicos los días 14 (2wp1) y 35 (2wp2).

Los títulos de IgG, IgG1 e IgG2c específicas de F en el suero (GMT) eran los siguientes:

Estos resultados confirman los hallazgos previos que, a diferencia de que la vacuna proteica, la vacuna de ARN muestra al menos una dependencia parcial del t LR7 para su inmunogenicidad, particularmente con la emulsión adyuvante.

Respuestas adicionales de receptores y citocinas de inmunidad innata

Como se muestra anteriormente, un replicón que se suministra puede estimular las células dendríticas del ratón tipo silvestre para que secreten IFN-a e IL-6, pero la misma respuesta no se veía en células dendríticas de ratones que albergaban la mutación Resq en TLR7.

De manera similar, los replicones vA317 suministrados con lipofectamina pueden estimular los fibroblastos de ratón de tipo silvestre para secretar altos niveles de IFN-p e IL-6, pero los replicones estimulaban niveles mucho más bajos de estas citocinas en fibroblastos que carecían de MDA5 o RIG-I, es decir, receptores citoplasmáticos de ARN (véase la Figura 15). Estos fibroblastos son células no inmunitarias que no responden a los ligandos TLR7. Los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) de ratones knockout RIG-I y m DA5 (-/-) se estimularon con el ARN formulado con lipofectamina 2000. Los hermanos heterocigotos (+/-) se utilizaron como controles. El ARN estimulaba IL-6 e IFN-p en los ratones heterocigotos pero en los ratones knockout la activación estaba casi completamente anulada. Por lo tanto estas helicasas son importantes para el reconocimiento del ARN en células no inmunitarias. En general, los replicones ARN suministrados en liposomas demostraban inducir varias citocinas séricas en 24 horas de la inyección intramuscular (IFN-a, IP-10 (^cX^c L-10), IL-6, KC, IL-5, IL-13, MCP-1, y MIP-a), mientras que solo la MIP-1 era inducida por el ARN desnudo y el liposoma solo inducía la IL-6 solamente.

Se demostró que el IFN-a contribuía a la respuesta inmunitaria del replicón que codifica la F de RSV encapsulado en liposomas debido a que anticuerpo anti-receptor de IFNa (IFNAR1) reducía la IgG específica de F del suero con una reducción de 10 veces después de 2 vacunaciones.

Cinética de expresión

Experimentos sobre la cinética de expresión utilizaba ARN que codificaba GFP o la enzima indicadora SEAP. El replicón “vA306” codifica SEAP; el replicón “vA17” codifica GFP; el replicón “vA336” codifica GFP pero no se autoreplica; el replicón “vA336*” es el mismo que el vA336 pero se preparó con un 10 % de uridina sustituidas por 5-metiluridinas; el replicón “vA336**” es el mismo que el vA336 pero el 100% de sus restos de uridina son M5U. Se pusieron a los ratones BALB/c vacunas intramusculares bilaterales (50 pl por pata) el día 0. Los animales, 35 en total, se dividieron en 7 grupos (5 animales por grupo) y se inmunizaron de la siguiente manera.

Grupo 1 Control intacto.

Grupo 2 se les puso vacunas intramusculares bilaterales (50 pl por pata) el día 0 con ARN (vA306, 0,1 pg, SEAP) formulado en liposomas mezclados con ARN auto-replicante (vA17, 1,0 pg, GFP) formulado en liposomas.

Grupo 3 se les puso vacunas intramusculares bilaterales (50 pl por pata) el día 0 con ARN (vA306, 0,1 pg, SEAP) formulado en liposomas mezclados con ARN auto-replicante (vA336, 1,0 pg, GFP) formulado en liposomas.

Grupo 4 se les puso vacunas intramusculares bilaterales (50 pl por pata) el día 0 con ARN (vA306, 0,1 pg, SEAP) formulado en liposomas mezclados con ARN auto-replicante (vA336*, 1,0 pg, GFP) formulado en liposomas.

Grupo 5 se les puso vacunas intramusculares bilaterales (50 pl por pata) el día 0 con ARN (vA306, 0,1 pg, SEAP) formulado en liposomas mezclados con ARN auto-replicante (vA336**, 1,0 pg, GFP) formulado en liposomas.

Grupo 6 se les puso vacunas intramusculares bilaterales (50 pl por pata) el día 0 con ARN (vA306, 0,1 pg, SEAP) formulado en liposomas mezclados con liposomas vacíos a la misma dosis de lípidos que los grupos 2-5. Grupo 7 se les puso vacunas intramusculares bilaterales (50 pl por pata) el día 0 con ARN (vA306, 0,1 pg, SEAP) formulado en liposomas mezclados con ARN auto-replicante (vA17, 1,0 pg, GFP) formulado en liposomas.

Estos experimentos ayudaron a ver si las respuestas del huésped al ARN podían limitar la expresión proteica. Por lo tanto la expresión se siguió solamente durante 6 días, antes de que fuera evidente una respuesta adaptativa (anticuerpos, linfocitos T). La actividad de SEAP en el suero (unidades de luz relativas) los días 0, 3 y 6 eran las siguientes (GMT):

El ARN competente para replicación que codifica GFP suprimía la expresión de SEAP más que el ARN de GFP deficiente para replicación, sugiriendo una respuesta fuerte de defensa del huésped contra el ^a Rⁿ replicante que da lugar a la supresión de la expresión de SEAP. Es posible que los interferones inducidos en respuesta al ARN GFP suprimieran la expresión de SEAP. En el modelo de supresión /respuesta del huésped, se esperaría que el bloqueo del reconocimiento del ARN por el huésped diera lugar a una expresión aumentada de SEAP, pero la metilación 5' de los restos de U en el ARN de GFP no se asociaba con el aumento de SEAP, sugiriendo que el reconocimiento de ARN por el huésped era insensible a la metilación en 5'.

Tabla 1: fosfolípidos

DDPC 1.2- Didecanoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

DEPA 1.2- Dierucoil-sn-Glicero-3-Fosfato

DEPC 1.2- Erucoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

DEPE 1.2- Dierucoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

DEPG 1.2- Dierucoil-sn-Glicero-3 [Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)

DLOPC 1.2- Linoleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

DLPA 1.2- Dilauroil-sn-Glicero-3-Fosfato

DLPC 1.2- Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

DLPE 1.2- Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

DLPG 1.2- Dilauroil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)

DLPS 1.2- Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina

DMG 1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina

DMPA 1.2- Dimiristoil-sn-Glicero-3-Fosfato

DMPC 1.2- Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

DMPE 1.2- Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

DMPG 1.2- Miristoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1 -glicerol...)

DMPS 1.2- Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina

DOPA 1.2- Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfato

DOPC 1.2- Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

DOPE 1.2- Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

DOPG 1.2- Dioleoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1 -glicerol...)

DOPS 1.2- Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina

DPPA 1.2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfato

DPPC 1.2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

DPPE 1.2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

DPPG 1.2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1 -glicerol...) DPPS 1.2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina

DPyPE 1.2- difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina

DSPA 1.2- Distearoil-sn-Glicero-3-Fosfato

DSPC 1.2- Distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

DSPE 1.2- Distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

DSPG 1.2- Distearoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)

DSPS 1.2- Distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina

EPC PC de huevo

HEPC PC de huevo hidrogenada

HSPC PC de soja hidrogenada de alta pureza

HSPC PC de soja hidrogenada

LYSOPC MIRÍSTICO 1 -Miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

LYSOPC PALMÍTICO 1-Palmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

LYSOPC ESTEÁRICO 1-Estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

Esfingomielina de leche MPPC 1-Miristoil,2-palmitoil-sn-Glicero 3-fosfatidilcolina

MSPC 1-Miristoil,2-estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

PMPC 1-Palmitoil,2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

POPC 1-Palmitoil,2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

POPE 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

POPG 1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1 -glicerol)...]

PSPC 1-Palmitoil,2-estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

SMPC 1-Estearoil,2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

SOPC 1-Estearoil,2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

SPPC 1-Estearoil,2-palmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

Referencias

[1] Heyes y col. (2005) J Controlled Release 107:276-87.

[2] Documento WO2005/121348.

[3] Liposomes: Methods and Protocols, Volumen 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods and Protocols. (Ed. Weis-sig). Humana Press, 2009. ISBN 160327359X.

[4] Liposome Technology, volúmenes I, II y III. (ed. Gregoriadis). Informa Healthcare, 2006.

[5] Functional Polymer Colloids and Microparticles volumen 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (Eds. Arshady y Guyot). Citus Books, 2002.

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Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un ARN auto-replicante que codifica un inmunógeno para su uso en un procedimiento profiláctico o terapéutico de aumento de una respuesta inmunitaria en un vertebrado, en el que el ARN tiene una protección en 5', en el que el inmunógeno da lugar a una respuesta inmunitaria contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito, en el que dicho procedimiento comprende la administración de un ARN que codifica un inmunógeno al vertebrado en combinación con una emulsión de aceite en agua catiónica submicrométrica, de manera que el ARN: (i) estimula el receptor de inmunidad innata endosómico TLR7; (ii) estimula el receptor de inmunidad innata citoplasmático RIG-1 o MDA5; y (iii) está traducido para proporcionar la expresión del inmunógeno, a condición de que el ARN no incluya nucleótidos modificados que no sean la protección en 5'.

2. Un ARN autorreplicante que codifica un inmunógeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ARN se administra al tejido muscular esquelético.

3. Un ARN autorreplicante que codifica un inmunógeno para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el ARN se administra mediante inyección.

4. Un ARN autorreplicante que codifica un inmunógeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la inyección es mediante una aguja.

5. Un ARN autorreplicante que codifica un inmunógeno para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que el ARN es de hebra -.

6. Una composición farmacéutica que comprende un ARN autorreplicante que codifica un inmunógeno para su uso en un procedimiento profiláctico o terapéutico de generar una respuesta inmunitaria en un vertebrado, en el que el ARN tiene una protección en 5', en el que el inmunógeno genera una respuesta inmunitaria frente a una bacteria, un virus, un hongo o un parásito, en el que dicho procedimiento comprende administrar un ARN que codifica un inmunógeno al vertebrado en combinación con una emulsión de agua en aceite catiónica submicrométrica, de tal manera que el ARN: (i) estimula el receptor endosómico de inmunidad innata TLR7; (ii) estimula el receptor citoplásmico de inmunidad innata RIG-1 o MDA5; y (iii) es traducido para proporcionar la expresión del inmunógeno, siempre que el ARN no incluya nucleótidos modificados que no sean la protección en 5'.

7. Un ARN autorreplicante que codifica un inmunógeno para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la protección en 5' incluye una 7-metilguanosina.