JP2004535388A - 脂質含有薬物送達複合体およびそれらの生成方法 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
(関連出願の相互参照)
本願は、2001年4月30日に出願された米国仮出願第60/287,786号の利益を主張する。この米国仮出願第60/287,786号の開示は、その全てが本明細書中に参考として援用される。
(連邦政府委託研究の下でなされた発明に対する権利の陳述)
該当無し。
【0002】
(技術分野)
本発明は、脂質、および細胞内への核酸の移行のためのビヒクル(vehicle)としてのそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、安定で、生物学的に活性で、かつ濃縮され得る脂質含有薬物送達複合体、およびその生産方法に関する。本発明の複合体は、炎症性サイトカイン(例えば、腫瘍壊死因子−α(TNF−α))のレベルを低下させ得る。
【背景技術】
【0003】
(背景技術)
高分子(例えば、タンパク質または核酸)を治療薬として使用する新たな治療剤形態の開発は、このような高分子をそれらの適切な細胞標的に送達する新たな効果的手段の開発の必要性を生み出した。存在しない遺伝子または欠損遺伝子を置換するかまたは補充するための、特定のポリペプチド増殖因子または特定の遺伝子のいずれかの使用に基づく治療剤は、このような新たな送達系を必要とし得る治療剤の例である。このような治療の臨床適用は、新たな送達系の効力にだけでなく、それらの安全性および容易さにも依存し、これらと共に、これらの系を構成する技術が、大規模な薬剤の生産、保存、および治療処方物の流通に適用され得る。遺伝子治療は、種々の遺伝子障害を処置する、ますます重要な方法(mode)となっている。有効な治療を提供する可能性、さらに治癒をも提供する可能性は、この技術を、有効な治療が存在しない疾患に適用するための強い努力を促した。この領域における最近の進歩は、遺伝子治療が、単一の遺伝子障害の処置だけでなく、他のより複雑な疾患(例えば、癌)および免疫調節、および感染性疾患の処置に対して顕著な影響を有し得ることを示す。しかし、有効な遺伝子治療の実現における重大な障害は、治療核酸を細胞標的に送達する新たな有効な手段を設計する難しさであった。従って、外因性遺伝子の、細胞および組織への送達のための理想的なビヒクルは、核酸送達において高性能で、使用に安全で、大量生産が容易でかつ医薬として実用可能であるに十分な安定性を有するべきである。さらに、これは、特定の細胞標的部位へ薬物送達を局在化させるために有利である。
【0004】
カチオン性のリポソーム処方物によって主に代表される非ウイルス性のビヒクルは、以下の理由のために、遺伝子治療における使用について考慮されている1つの型のビヒクルである。第1に、リポソームが媒介する遺伝子治療に必要とされるプラスミドDNAは、広く、そして日常的に、大量に調製され得、そして単純であり、そしてウイルスベクター(例えば、レトロウイルス)の使用よりも低い危険性を保持し得る。第2に、リポソームが媒介する遺伝子送達は、レトロウイルスが媒介する遺伝子送達とは異なり、一本鎖もしくは二本鎖のRNAもしくはDNAのいずれかを送達し得る。従って、DNA、RNA、またはオリゴヌクレオチドは、直接、細胞内に導入され得る。さらに、レトロウイルスが媒介する遺伝子送達とは異なり、リポソームによって送達され得る核酸のサイズを制限しない。さらに、カチオン性のリポソームは、大部分が非毒性であり、非免疫原性であり、従って、カテーテル処置した血管(Nabel,E.G.ら、(1990)Science,249:1285−1288)への、肺上皮細胞(Brigham,K.L.ら、(1989)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,195−200,Stribling,R.ら、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,89:11277−11281)への遺伝子の首尾よいインビボ送達、およびカチオン性のリポソームの他の全身使用(Zhu,N.ら、(1993)Science,261:209−211,Philip,R.ら、(1993)Science,261:209−211;Nabel,G.ら(1994)Hum.Gene Ther.,5:57−77)によって立証されるように、インビボで繰り返し使用され得る。
【0005】
リポソーム処方物を利用しない非ウイルス性の遺伝子治療処方物の例も存在する。例えば、Kircheisら(2001)Gene Therapy Molec.Biol.6:159−167;Rungsardthongら(2001)Brit.Pharm.Conf.Abstract Book:78を参照のこと。重症複合型免疫不全症候群に対して、首尾よいエキソビボの遺伝子治療処置が報告された(Hacein−Bey−Abinaら(2002)NEJM 346(16):1185−1193)。
【0006】
種々のカチオン性のリポソーム処方物は、当該分野で公知であり、市販のカチオン性のリポソーム試薬である、DOTMA/DOPE(N−1,−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド/ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)、(Felgner,P.L.ら、(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:7413−7417)、およびDC−Chol/DOPEと称するカチオン性のリポソーム処方物(3βN−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイルコレステロール/ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)(Gao,X.,およびHuang,L.(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.,179:280−285)が挙げられる。このDC−Chol/DOPEは、比較的、非毒性であり、そしてDOTMA/DOPEよりも効果的であることが示された。多数のインビボ研究(Plautz,G.E.ら、(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:4645−4649,Stewart,M.J.ら、(1992)Hum.Gene Ther.,3:267−275)(ここで、DC−Chol/DOPEは、安全でありかつ核酸送達系として有効でもあると実証されている)を受けて、この処方物は、米国食品医薬品局(FDA)および英国医薬品庁(MCA)によって認可され、そして2つの別個の遺伝子治療臨床試験において使用された(Nabel,G.J.ら、(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:11307−11311、Caplen,N.J.ら、(1995)Nature Medicine,1:39−46)。しかし、脂質(例えば、DOTAP/コレステロール)を含むカチオン性のリポソームは、炎症性サイトカイン(例えば、TNF−α)の産生を刺激すると知られている(Whitmore,M.ら、Gene Therapy 1999 Nov;6(11):1867−75)。
【0007】
アニオン性のリポソームは、過去30年間の間に、薬物送達系としてよく特徴付けられており(Lasic,D.D.(1998)Trends in Biotechnology 16:307−321)、そして、カチオン性のリポソームよりも長い循環存続期間(circulation lifetime)を有し得る。しかし、アニオン性のリポソームは、DNAとの静電相互作用を有さず、そしてカチオン性のリポソームと比較してより低い細胞結合能力を有する。これらの因子は、非ウイルス性の遺伝子送達系に関するそれらの進歩を制限してきた(Legendre,J.Y.およびSzoka,F.C.,Jr.(1992)Pharm Res 9:1235−42)。しかし、アニオン性の脂質によって囲まれた、予めコンパクト化された(pre−compacted)DNAを用いた最近の研究は、トランスフェクション能力に関する有望な結果を示した。
【0008】
【数1】
米国特許第5,795,587号および同第6,008,202号は、核酸/脂質/ポリカチオンの薬物送達複合体、ならびに核酸または他の高分子を細胞内へ導入するためのビヒクルとしての、それらの使用を開示する。リポソーム処方物はまた、米国特許第5,753,262号、同第6,056,973号、同第6,147,204号、同第6,011,020号、同第5,013,556号、および同第5,976,567号ならびにWO 93/05162、WO 97/11682、およびWO 98/00110において記載される。カチオン性および/または中性の脂質を組み込んでいる処方物はまた、米国特許第5,939,401号、同第6,071,533号、同第5,948,767号、および同第5,059,591号において記載される。
【0009】
正に荷電した表面を示す複合体は、中性または負に荷電した表面を有する複合体よりも、細胞表面への高い結合親和性を有する。しかし、それらはまた、インビボで他の血清成分とも相互作用し、循環存続期間を減少させる。親水性ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)の取り込み、または血清タンパク質結合に対する立体障害(steric barrier)を提供する他の表面構造は、リポソーム循環存続期間を有意に増加させる(Harasym,T.O.ら、(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32:99−118)。
【0010】
ポリエチレングリコール(PEG)改変脂質の使用は、リポソーム被包性薬物についてよく確立されており、そして腫瘍部位への抗癌剤の送達を増大するその能力が、証明されている(Lasic,D.D.,Trends in Biotechnology,(1998)16(7):307−321)。さらに、リポソームにPEGを含ませることは、リポソーム粒子のサイズを減少させ得、そしてリポソーム安定性を増加させ得る(Harvieら(2000)J.Phar Sci.89(5):652−663)。ペグ化(pegylated)脂質もまた、脂質ベースの遺伝子移入系の表面特性を制御することが知られている。しかし、脂質−DNA複合体中へのペグ化脂質の組み込みは、インビボでのトランスフェクション活性の濃度依存的減少を引き起こす。これは、細胞への粒子の結合の減少にも一部起因し得る(Harvie,P.ら、(2000)J.Phar Sci.89(5):652−663)。
【0011】
ペプチドまたはタンパク質は、リポソームを特定の細胞型へと標的化する目的のために、リポソーム処方物に付着される。最近のレビューは、リポソームへのタンパク質結合体化の方法およびリポソームの生物学的挙動に対する表面結合タンパク質の効果を調査している(Harasym,T.O.ら、(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32:99−118)。結合体化されたタンパク質の存在は、標的化リポソームの特性を顕著に改善し得る。詳細には、タンパク質結合体は、リポソームサイズの著しい増加、免疫原性の増大、および血漿除去の増加を生じ得る。タンパク質より小さなペプチドは、タンパク質よりも粒子サイズおよび免疫原性の増加をさほど引き起こし得ない。標的化されたアニオン性の脂質キャリアは、DOPE−PEG−葉酸をリガンドとして用いて生成され得、そしてインビボでのトランスフェクション活性増大が観察された(Lee,R.J.およびHuang,L.(1996)Journal of Biological Chemistry 271;8481−8487;および米国特許第5,908,777号)。
【0012】
LHRHレセプターは、乳房、子宮内膜、卵巣および前立腺の癌細胞において高い割合で発現されることが知られている(Schally,A.V.およびA.Nagy,(1999)Eur J Endocrinol.141(1):1−14)。アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)モチーフは、αVβ3インテグリンレセプターおよびαVβ5インテグリンレセプターと相互作用することが知られており、これらのレセプターは、固形腫瘍の血管および腫瘍細胞自体において、しばしば上方制御される。RGDモチーフは、インビボでの薬物送達および抗癌活性の増大に効果的であると既に示されている(Arap,W.,R.Pasqualini,およびE.Ruoslahti,(1998)Science 279(5349):377−80)。このRGDモチーフはまた、ポリ−L−リジンと共有結合しており、そしてンビトロでのカチオン性リポソームとの結合におけるその活性は、以前に実証されている(Colin,M.ら(2000)Gene Ther.7(2):139−52;Harbottle,R.P.ら、,(1998)Hum Gene Ther.9(7):1037−47)。
【0013】
細胞膜移行(translocating)ペプチド(MTLP)は、細胞膜脂質二重層の脂質と直接相互作用し、そしてそれらを貫通する(Fongら(1994)Drug Development Research 33:64)。カポージ(Kaposi’s)線維芽細胞増殖因子のシグナル配列の中心の疎水性のh−領域(AAVLLPVLLAAP)は、膜移行ペプチドであると考えられる。このペプチドは、細胞内のタンパク質機能および細胞内プロセスを研究するために、種々の短いペプチド(25マー未満)を、脂質二重層を通って生存細胞内へと送達するためのキャリアとして使用されている(Linら(1996)J.Biol.Chem.271:5305;Liuら(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA 93:11819;Rojasら(1997)Biochem.Biophys.Res Commun.234:675)。
【0014】
脂質膜を貫通する多数の合成ポリマーが知られている。これらのポリマーは、膜を通した移行を介して画分に入るかまたは画分から出るのを促進するMTLPに例えられ得る。しかし、これらのポリマーは、天然に存在する種ではなく、合成である。多数のこれらの合成ポリマーは、エンドソーム膜を破壊する(エンドソームのpHで膜を破壊する)が、細胞膜に対しては非破壊性である(中性pHで非膜破壊性である)それらの能力について研究されており、薬物送達系におけるそれらの使用が示唆されており(Staytonら(2000)J.Controll.Release 65:203−220;WO 99/34831)、そして特定のカチオン性脂質処方物において試験されている(Cheungら(2001)Bioconj.Chem.12:906−910)。これらのポリマーは、インビトロで赤血球溶血を誘導し得ることが見出されており(Lackeyら(1999)Bioconj.Chem.10:401−405;Murthyら(1999)J.Controll.Release 61:137−143;Mouradら(2001)Macromolecules 34:2400−2401;Sekiら(1984)Macromolecules 17:1692−1698)、そしてさらに、細胞への核酸送達における使用のために、カチオン性のリポソーム処方物に取り込まれている(Staytonら、(2001)Molec.Therapy vol 3 May pg S194 Poster Abstract ASGT「Ph−Sensitive Polymer Additives for Enhancing Lipoplex Transfections」;Staytonら(2000)Molec.Therapy vol 1 May pg.S243 poster Abstract ASGT 2000「A Nonviral Liposomal Complex Designed to Overcome the Multiple Barriers to Gene Transfer」)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
高濃度で処方され得る、安定で、生物学的に活性な、脂質含有薬物送達複合体について絶え間ない必要性が存在する。また、高濃度レベルの核酸を達成し得る、安定で、生物学的に活性な、脂質含有薬物送達複合体の必要性も存在する。さらに、トランスフェクションの活性および特異性を増大した、安定な脂質含有薬物送達複合体の必要性が存在する。また、炎症性サイトカインの産生レベルの低下を誘発し、そしてインビボで投与された場合、炎症応答の減少を生じさせる、安定な脂質含有薬物送達複合体の必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【0016】
(発明の開示)
特定の細胞への生物学的に活性な核酸の送達のための脂質複合体が提供される。この脂質複合体は、生物学的に活性でかつインビトロ、エキソビボ、またはインビボで特定の細胞に送達され得る形態で核酸を細胞に送達するように処方され、そして特に、インビボでの使用のために静脈内に送達され得る処方物である。この脂質複合体は、核酸がその生物学的活性を保持するように、血清成分による分解から核酸を保護するように処方され;それらが特にインビボでの場合に、RES系または最初に通過する循環クリアランス器官であることが当該分野で公知の他の器官によって循環から直ちに排除されないように、適切なサイズであり;そして治療有効量または診断有効量の生物学的に活性な核酸を、特定の細胞内に送達する。これらの特性は、インビトロまたはインビボでの脂質複合体のトランスフェクションレベルを測定することによって、血清中でのインキュベーション後に細胞の平均直径を測定することによって、そして脂質複合体による補体オプソニン作用の量を決定することによって、アッセイされ得る。低い毒性でかつ高い標的細胞特異性をも有する脂質複合体が好ましい。
【0017】
これらの特性を示す脂質複合体は、特定の脂質処方物およびコンパクト化された(compacted)核酸を生成するために、本明細書中に記載されるような成分および方法を用いて生成され得る。本明細書中に記載されるように、これらの成分の特定の組み合わせは、種々の疾患、状態、または症候群の処置または診断における使用のために、有効量の生物学的に活性な核酸を特定の細胞型または組織型に送達し得る安定な複合体を生じる。
【0018】
本明細書中に記載される実施形態において、本発明の脂質/コンパクト化DNA複合体は、本明細書中に記載される特性または本明細書中に記載される特性と等価な特性を有することを特徴とし、そしてさらに、これらの特性を示すように再現可能に(reproducibly)処方され得る。
【0019】
必要に応じてポリカチオンを含む本発明の薬物/脂質/標的化因子(targeting factor)の複合体は、一般的に、安定で、比較的高い濃度で生産され得、そして長期間の保存において生物学的活性を保持する。これらの複合体はさらに、炎症性サイトカイン(例えば、TNF−α)の産生レベルを低下させ得、そしてインビボで投与される場合、例えば、標的化因子を含まないLPD処方物と比較して、炎症性応答を減少させ得る。核酸と一緒に処方される場合、これらの複合体は、高濃度の核酸レベルを達成し得、トランスフェクションの活性および特異性の増大を示し得、そしてまた、標的細胞および標的組織への標的化送達も増大し得、そしてこのような標的細胞および標的組織での細胞内取り込みも増大し得る。送達されるべき薬物が核酸である場合、この複合体は、送達された遺伝子の細胞内での発現レベルを増加し得、その結果、治療効果および/または予防効果および/または診断効果を生じさせる。これらの複合体はさらに、標的組織および薬物充填量(load)に依存して循環時間および組織標的化能力を最適化し得るように調整され得る。このような複合体は、細胞および組織への核酸、タンパク質および他の高分子の送達において有用な複合体である。細胞および組織への核酸の送達は、治療使用、予防的使用、および診断目的のために有用である。
【0020】
従って、特定の実施形態において、コンパクト化された核酸、ポリカチオン、標的化因子、および脂質を含む脂質−核酸複合体が提供され、ここで:
この標的化因子は、特定の細胞外表面膜レセプターとの相互作用以外の手段で核酸の細胞バイオアベイラビリティを増加させ;この複合体はプロタミンもその塩も含まず;そして、この複合体の平均直径は、約100nmより大きくかつ400nmより小さい。
【0021】
本明細書中に記載される実施形態の特定の例において、この標的化因子は、膜破壊性ポリマーである。
【0022】
他の例において、この複合体の平均直径は、約300nm以下である。特定の他の実施形態において、この複合体の平均直径は、約200nm以下である。
【0023】
本明細書中に記載される複合体の特定の例において、この複合体はさらに、遮蔽部分(shielding moiety)を含む。
【0024】
特定の実施形態において、この遮蔽部分は、複合体の循環半減期を増加させるか、複合体への血清成分の結合を減少させるか、または複合体の補体オプソニン作用を減少させる。
【0025】
特定の例において、この遮蔽部分は、ポリエチレングリコール(PEG)を含む。他の例において、この遮蔽部分は、PEGである。複合体のなお他の例において、この遮蔽部分は、ペグ化脂質を含む。
【0026】
特定の実施形態において、ポリカチオンは、合成ポリカチオン、ポリカチオン性ポリペプチドまたはそれらの塩である。特定の例において、このポリカチオンは、合成ポリカチオンである。特定の複合体において、この合成ポリカチオンは、ポリカチオン性メタクリルオキシポリマー、ポリカチオン性メタクリレートポリマーおよびポリカチオン性ポリ(アルケニルイミン)からなる群より選択される。
【0027】
複合体の特定の例において、このポリカチオン性メタクリレートポリマーは、ジメチルアミノメタクリレートから構成される。他の例において、この合成ポリカチオンは、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリ(2−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムブロミド)(PMOETMAB)、ならびにジメチルアミノメタクリレートとメタクリルエステル(methacrylic ester)とのコポリマーからなる群より選択される。
【0028】
本明細書中に記載される特定の実施形態において、この標的化因子は、膜破壊性合成ポリマーである。
【0029】
本明細書中に記載される特定の実施形態において、この標的化因子は、複合体の核酸の転写を増加させることによってか、核酸の細胞内への取り込みを増加させることによってか、細胞画分内への取り込みを増加させることによってか、細胞画分からの核酸の排出を増加させることによってか、または細胞膜を横切る核酸の輸送を増加させることによって、細胞バイオアベイラビリティを増加させるように機能する。
【0030】
複合体の特定の実施形態において、この標的化因子は、膜移行ペプチド(MTLP)である。いくつかの実施形態において、この膜移行ペプチドは、以下からなる群より選択される:H2N−KKAAAVLLPVLLAAP−COOH(Elan094)、H2N−KKKAAAVLLPVLLAAP(ZElan094)、H2N−kkkaavllpvllaap(ZElan207)、およびH2N−KKKAAAVLLPVLLAAPREDL(ZElan094R)。
【0031】
特定の他の例において、この標的化因子は、核局在化配列を含む。特定の複合体において、この核局在化配列は、SV40 NLSである。
【0032】
本明細書中に記載される複合体の特定の例において、この複合体はさらに、共脂質(co−lipid)を含む。
【0033】
本明細書中に記載される複合体の特定の例において、この標的化因子は、PEG部分に結合体化され得る。
【0034】
本明細書中に記載される複合体の特定の例において、この脂質は、カチオン性脂質である。
【0035】
特定の複合体において、このカチオン性脂質は、1,2−ビス(オレオイルオキシ)−3−トリメチルアンモニオプロパン(DOTAP)である。特定の実施形態において、このカチオン性脂質は、DOTAPである。
【0036】
複合体の特定の例において、この共脂質は、以下からなる群より選択される:コレステロール、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン(diphytanoyl phosphatidylethanolamine)(DPHPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジラウリルホスファチジルエタノールアミン(DLPE)、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DPME)。
【0037】
本明細書中に記載される複合体の他の実施形態において、コンパクト化された核酸および融合性(フソジェニック)(fusogenic)である少なくとも1つの脂質種を含む、脂質−核酸複合体が提供され、ここで:この複合体は、水性コアを有し;そしてこの複合体の平均直径は、約100nmより大きく、かつ400nmより小さい。
【0038】
なお他の実施形態は、コンパクト化された核酸、ポリカチオン、標的化因子および少なくとも1つの脂質種を含む脂質−核酸複合体を提供し、ここで:この少なくとも1つの脂質種は、アニオン性脂質であり;この複合体は、水性コアを有し;この複合体は、少なくとも1つの融合性部分(fusogenic moiety)を含み;この複合体の平均直径は、約100nmより大きく、かつ400nmより小さく;そしてここで、この複合体は、プロタミンもその塩も含まない。
【0039】
この複合体の特定の例において、この複合体の平均直径は、約100nmより大きく、かつ200nmより小さい。本明細書中に記載される複合体の特定の例において、この複合体の平均直径は、50%血清の緩衝液中での約1時間のインキュベーションによって決定される。
【0040】
特定の例において、この複合体は、補体C3Aおよび補体C5Aへの結合を減少させた。
【0041】
本明細書中に記載される複合体の特定の実施形態において、この融合性脂質は、錐体形成脂質(cone forming lipid)である。この複合体の特定の例において、この錐体形成脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−L−セリン](DOPS)、またはN,Nジオレイル−N,N−ジメチル−1,6−ヘキサンジアンモニウムクロリド(TODMAC6)である。
【0042】
他の実施形態において、この融合性脂質は、pH感受性である。
【0043】
特定の実施形態において、この脂質は、生理的pHでアニオン性であり、そして融合性(fusogenicity)は、生理的pHと比較して、約pH5.5〜約pH4.5で増加される。特定の例において、約pH4.5で、この脂質は、中性またはカチオン性である。アニオン性脂質を含む複合体(融合性アニオン性脂質を含む)に関して、ポリカチオンは、首尾よい処方のために必要とされる。上記複合体は、必要に応じて、特異的または非特異的のいずれかの標的化因子を含み得、この標的化因子は、複合体の任意の他の成分と結合体化されても、されなくてもよい。
【0044】
特定の例において、脂質は、コレステリルヘミコハク酸(CHEMS)、または1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホエタノールアミン−N−ドデカノイル(NC12−DOPE)である。
【0045】
本明細書中に記載される複合体の特定の例において、この脂質は、中性またはカチオン性である。
【0046】
複合体の特定の例において、この複合体が融合性部分(融合性脂質を含む)を含む場合、ポリカチオンは、以下からなる群より選択される:合成ポリカチオン、ポリカチオン性ポリペプチド、およびそれらの塩。特に、ここで、このポリカチオンは、合成ポリカチオンである。特定の例において、この合成ポリカチオンは、以下からなる群より選択される:ポリカチオン性メタクリルオキシポリマー、ポリカチオン性メタクリレートポリマーおよびポリカチオン性ポリ(アルケニルイミン)。他の例において、この合成ポリカチオン性メタクリレートポリマーは、ジメチルアミノメタクリレートを含むポリマーである。特定の例において、この合成ポリカチオンは、以下からなる群より選択される:ポリエチレンイミン(PEI)、ポリ(2−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムブロミド)(PMOETMAB)、ならびにジメチルアミノメタクリレートとメタクリルエステルとのコポリマー。
【0047】
本明細書中に記載されるような、複合体の特定の例において、この複合体はさらに、少なくとも1つの共脂質を含む。
【0048】
特定の例において、この複合体は、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)を含む。
【0049】
なお他の例において、この複合体はさらに、核酸の細胞バイオアベイラビリティを増加させる少なくとも1つの標的化因子を含む。この複合体の特定の例において、この標的化因子の存在は、核酸の転写の増加、核酸の細胞への取り込みの増加、細胞画分内への核酸の取り込みの増加、細胞画分からの核酸の排出の増加、または膜を横切る核酸の輸送の増加を生じさせる。
【0050】
特定の例において、標的化因子は、以下からなる群より選択される:葉酸、インスリン、Arg−Gly−Asp(RGD)ペプチド、黄体化ホルモン放出ホルモン(LHRH)、膜移行ペプチド(MTLP)および核局在化配列を含む化合物。特定の例において、この標的化因子は、以下からなる群より選択される:ガラクトース−H2N−KKAAAVLLPVLLAAP−COOH(Elan094)、ガラクトース−H2N−KKKAAAVLLPVLLAAP(ZElan094)、ガラクトース−H2N−kkkaavllpvllaap(ZElan207)、およびガラクトース−H2N−KKKAAAVLLPVLLAAPREDL(ZElan094R)。
【0051】
特定の例において、脂質が融合性である場合、この脂質は、生理的pHとpH約4.5との間で構造変化を起こし、その結果、融合性を増加させる。
【0052】
本明細書中に記載される複合体の特定の例において、この複合体は、遮蔽されている。
【0053】
特定の例において、複合体が遮蔽されている場合、この複合体はさらに、ポリエチレングリコール成分を含む化合物を含む。いくつかの例において、この化合物は、ペグ化脂質である。
【0054】
別の局面において、コンパクト化された核酸および融合性である少なくとも1つの脂質種を含む脂質−核酸複合体を調製する方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する:
a)脂質および少なくとも1つの親油性界面活性剤を含む水性ミセル混合物を、核酸を含む核酸混合物と混合する工程であって、ここでこの脂質は、融合特性を有するかまたは呈し、そしてここで少なくとも1つの混合物が、核酸をコンパクト化にする成分を含む、工程;および
b)この混合する工程の後で、工程a)から得た混合物から親油性界面活性剤を除去する工程。
【0055】
上記方法の特定の実施形態において、この方法はさらに、工程a)の少なくとも1つの混合物中に少なくとも1つのターゲティング薬剤を含む。
【0056】
特定の実施形態において、上記方法によって調製された脂質−核酸複合体が提供される。
【0057】
本明細書中に記載されるように、上記方法によって調製された複合体もまた提供される。
【0058】
別の局面において、細胞を本明細書中に記載されるような複合体と接触させる工程を包含する、核酸を細胞に送達する方法が提供される。
【0059】
上記方法のさらなる実施形態は、送達が、インビボで個体に対するものである場合を含む。
【0060】
上記方法のなお別の実施形態は、送達が、静脈内である場合を含む。
【0061】
上記方法の特定の実施形態において、個体はヒトである。
【0062】
特定の実施形態は、疾患、状態または症候群の処置または診断のための医薬の製造における本明細書中に記載されるような複合体を使用をさらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0063】
(発明を実施するための最良の形態)
特定の細胞または組織に対する生物学的に活性な核酸の送達のための脂質複合体を提供する。この脂質複合体は、生物学的に活性な形態で細胞に核酸を送達し、そしてインビトロ、エキソビボ、またはインビボで特定の細胞に送達され得、そして特に、インビボでの使用のために静脈内送達され得る処方物であるように処方される。脂質複合体は、インビボまたはインビトロで血清中に存在する種による分解から核酸を保護するように処方され、その結果、核酸は細胞中に首尾よくトランスフェクトされ得;適切な平均直径を有し、特にインビボでの場合、治療効果または診断効果を達成する前に循環から排泄されず;そして特定の細胞中に有効量の生物学的に活性な核酸を送達する。これらの特性は、インビトロまたはインビボでの脂質複合体のトランスフェクションのレベルを測定すること、血清中でのインキュベーション後に細胞の平均直径を測定すること、および脂質複合体による捕体オプソニン作用の量を決定することによって、アッセイされ得る。毒性が低くかつ高い標的細胞特異性をも有する脂質複合体が好ましい。
【0064】
これらの特性を示す脂質複合体は、脂質およびコンパクト化核酸を生成するために、本明細書中に記載されるような成分および方法を用いて作製され得、これは以下の成分の1つ以上をさらに含み得る:共脂質(co−lipid)、遮蔽部分、融合性部分、および特異的標的化因子または非特異的標的化因子、ならびに核酸のコンパクト化を達成するためのポリカチオン。本明細書中に記載されるように、これらの成分の特定の組み合わせは、種々の疾患、状態または症候群の処置あるいは診断における使用のために、有効な量の生物学的に活性な核酸を所望の細胞または組織型に送達し得る、安定な複合体を生じる。
【0065】
(脂質複合体の特徴づけ)
治療的または診断的に有効な量の生物学的に活性な核酸を細胞に送達する脂質複合体は、インビトロおよびインビボの両方の方法で、特定の細胞への特定の核酸のインビボまたはエキソビボでの首尾よい送達を示す多数の特性によって、特徴付けられる。細胞への核酸の首尾よい送達を示す特性としては:血清中でのインキュベーションの前および後の両方での複合体の平均直径;インビボおよび/またはインビトロでの核酸のトランスフェクション効率;血清種による分解からの核酸の保護;ならびに補体オプソニン作用のレベルが挙げられる。
【0066】
本明細書中で使用される場合、当該分野で十分に理解されるように、細胞へ送達される核酸の「治療的に有効な量」は、有益な結果または所望の結果(臨床結果を含む)が得られるような量である。本発明の目的のために、有益または所望の臨床結果は、以下の1つ以上を含み得るが、それらに限定されない:検出可能であろうと、検出不可能であろうと、1つ以上の症状の軽減または改善、状態の程度の減少、状態の安定化(すなわち、悪化させないこと)、疾患の拡大の予防、疾患の進行の遅延(delay)または遅らせること(slowing)、個体が罹患している疾患状態(state)または状態(condition)の改善または緩和、および寛解(remission)(部分的または全体的のいずれか)。
【0067】
用語「診断的に有効な量」の核酸は、核酸の存在が、特定の細胞、その核酸が発現される組織または腫瘍において当該分野での従来技術によって検出され得るような、特定の細胞において発現される核酸のレベルを記載するために本明細書中で使用される。例えば、腫瘍組織のみでの核酸の発現は、腫瘍に関連する状態の診断を可能にするか、腫瘍位置の同定を可能にする。
【0068】
上記で列挙された特性の測定は、診断または治療の有用性を有する脂質複合体の同定を可能にする。例えば、血清中でのインキュベーション前に400nm未満である複合体の平均直径は、いくつかの理由で重要である。一般に、400nmよりも大きい直径の粒子は、類似のより小さいサイズの(例えば、電荷、標的化因子、遮蔽部分)複合体と比較して減少された循環半減期を通常有する。平均粒子直径またはサイズおよび補体オプソニン作用を含む多数の因子が複合体の循環半減期に影響する。より大きい粒子、または補体を固定する粒子(補体オプソニン作用)は、RES系によってより迅速に排出され、そしてまた第1に通過するクリアランス器官(第1通過輸送器官ともいわれる)(例えば、静脈内投与の際の肺または肝臓)によって除去される可能性が高い。さらに、細胞取り込みのいくつかの機構は、大きい粒子では進行不可能であるか、または効果が少なく、従って核への核酸の送達の量または速度を減少する。さらに、基本の脂質複合体処方物(脂質/DNA/必要に応じて存在するポリカチオン)が、400nmよりも大きい場合、この複合体は、さらなる部分(例えば、標的化因子および/または複合体の脂質成分に結合体化され得るか、または脂質に結合しないが脂質複合体の外側と結合し得る遮蔽部分)の取り込みに余り適切でない。遮蔽部分と標的化因子の両方が、緩衝液または血清中において脂質複合体の有効平均直径を増加し得る。
【0069】
血清中でのインキュベーション後の脂質複合体の平均直径は、複合体に結合するか、または複合体と会合する血清中に存在する種の量を示し、従って複合体と相互作用し得るか、結合し得るか、または複合体と会合するインビボに存在する種を示す。このような相互作用の1つの結果(「相互作用」およびその同族語は、本明細書中で用語「結合」および「会合」を包含するとして使用される)は、平均直径を増加する。上記で考察された理由について、400nmよりも大きい平均直径は、インビボまたはエキソビボ投与について意図される処方について禁忌を示す。これらの種を有する複合体の非特異的相互作用は、粒子サイズの増加を生じ、これは粒子の循環半減期または凝集を短縮することを導き得、そして細胞に取り込まれる核酸の速度または量を減少することによって、核酸の細胞バイオアベイラビリティをも減少し得る。さらに、発明の背景で指摘されるように、より小さい粒子は、より大きい粒子よりもより大きいサイズ安定性を示す傾向がある。
【0070】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞バイオアベイラビリティ」は、生物学的に活性な形態(すなわち、生物学的に機能性であり得る形態)での核酸を有する脂質複合体の特定の細胞の規定された画分における利用能をいう。
【0071】
複合体と相互作用し得る血清に存在する種としては、例えば、血清タンパク質(例えば、アルブミン、血清補体)、ホルモン、ビタミン、補因子などが挙げられる。複合体が、1つ以上のこれらの種と相互作用する場合、複合体のサイズは、血清中での事前インキュベーションなしの緩衝液中で測定された粒子サイズと比較して、血清中でのインキュベーション後増加し得る。血清中でのインキュベーション後の複合体のサイズの測定は、当該分野において公知の技術(例えば、上記のような技術、および実施例に記載されるような技術)を用いて達成され得る。
【0072】
本明細書中に記載される複合体は、マウス、ヒト、ウマ、ウサギまたは当該分野で使用される他の血清処方物中でインキュベートされ得る。この溶液は、代表的に、緩衝液(例えば、HEPESまたは本明細書中に記載される他の緩衝液、および特定のリポソーム処方物に適切であると当該分野で公知の他の緩衝液)を含む溶液で平衡化した約50%の血清を含む。溶液はまた、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、または少なくとも70%の血清を含み得る。複合体は、代表的に血清中で約1時間インキュベートされる。インキュベーション時間は、少なくとも30分間、少なくとも45分間、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも6時間、少なくとも8時間、または少なくとも12時間であり得る。インキュベーション時間はまた、約1時間、約2時間、約6時間、約8時間または約12時間であり得る。
【0073】
本発明の方法によって生成される複合体の直径は、例えば、約20nm〜約500nm、約150nm〜約200nm、約400nm未満、約350nm未満、約300nm未満、約250nm未満、約200nm未満、約150nm未満、約100nm未満であり得る。特定の好ましい実施形態において、複合体の平均直径は、約350nm〜約50nm、約300nm〜約100nm、約200nm〜約100nmである。
【0074】
さらに、より小さい粒子は、核酸送達ビヒクルとしての使用により適切であり得る。粒子直径は、複合体中の核酸/脂質/ポリカチオン/標的化因子の比を調節することによってか、またはサイズ排除法(例えば、複合体をフィルターに通すことによる方法)によって、制御され得る。所望の粒子直径はさらに、標的化される細胞または組織型に依存し得る。例えば、約100〜200nmの粒子直径は、腫瘍細胞の標的化のために特に好ましいが、一方で他のサイズもまた適切であり得ることが理解される。リンパ節を標的化するために、約100nmの粒子直径が特に好ましいが、その一方で他のサイズもまた適切であり得ることが理解される。肝臓細胞を標的化するために、約20nmのより小さい粒子が特に好ましいが、その一方で他のサイズもまた、適切であり得ることが理解される。
【0075】
この複合体の平均直径は、当業者に公知の方法によって測定され得、この方法としては、例えば、電子顕微鏡法、ゲルろ過クロマトグラフィーまたは準弾性光分散手段(例えば、実施例に記載されるような、Coulter N4SD粒子サイズアナライザーを使用する)が挙げられる。
【0076】
上述のように、より小さい複合体は、長い時間にわたってより安定である傾向がある。本発明の複合体の安定性は、保存の長時間にわたる複合体の物理学的安定性および生物学的活性を決定する特定のアッセイによって測定される。複合体の物理学的安定性は、当業者に公知の方法によって、複合体の直径および電荷を決定することによって測定され、この方法としては、例えば、電子顕微鏡法、ゲルろ過クロマトグラフィーまたは例えば、Coulter N4SD粒子サイズアナライザーを用いる準弾性光分散手段、または実施例に記載されるように、Malvernζサイザーを用いてζ電位を測定することによる手段が挙げられる。複合体の物理学的安定性は、保存された複合体の直径が、複合体を調製した時点で決定された複合体の直径に対して100%より多く、好ましくは50%より多く、そして最も好ましくは30%よりも多く増加しない場合、保存中「実質的に非荷電」である。
【0077】
複合体の生物学的活性の決定において利用されるアッセイは、複合体に含まれる薬剤が何であるかに非常に依存する。例えば、薬剤が、遺伝子産物をコードする核酸である場合、生物学的活性は、DNAおよびリポソーム複合体の混合物を用いて細胞をトランスフェクションする当業者によって利用される、トランスフェクション条件下でインビトロで細胞を処理することによって、決定され得る。例えば、核酸を含む複合体のトランスフェクション活性は、レポーター遺伝子を含む複合体を用いて試験され得、このレポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ヒト成長ホルモン遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、赤色蛍光タンパク質遺伝子、および緑色蛍光タンパク質遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。複合体によってトランスフェクトされ得る細胞としては、DNA/リポソーム複合体混合物によってトランスフェクトされ得る細胞が挙げられる。次いで、保存された複合体の活性は、混合物によって調製された複合体のトランスフェクション活性と比較される。薬剤が、アンチセンスデオキシリボ核酸である場合、生物学的活性は、薬剤に相補的な外来遺伝子の発現の阻害によって決定され得る。
【0078】
核酸送達複合体としての効果について、脂質複合体はまた、複合体が核酸に提供する、血清中の種による分解からの保護を含むさらなる特性について特徴づけられなければならない。分解からの保護はまた、遮蔽部分(例えば、PEG含有化合物)によって提供され得る複合体の「遮蔽」の局面である。この薬剤が核酸である場合、核酸は、例えば、RNAaseもしくはDNAase、または血清中に存在する他の種を含むヌクレアーゼによる分解を受け易い。本明細書中に記載されるように、脂質複合体それ自体が、ヌクレアーゼを含む血清または他の生物学的液体中の成分による分解からの核酸または他の薬剤の保護を提供する。さらに、本明細書中に記載されるように、遮蔽部分の組込みはまた、分解からの核酸の保護または「遮蔽」を助け得る。分解に対する核酸の感受性、または核酸の分解の量は、当業者に公知の技術によって測定され得、この技術としては、上述のようなトランスフェクション活性の測定(例えば、Pico Green(登録商標)染色、エチジウムブロミド染色およびゲル電気泳動)が挙げられる。
【0079】
治療的または診断的に有効な核酸について、十分な量のインタクトな核酸または生物学的に活性な核酸(例えば、正確に転写される状態でのデオキシリボ核酸について)は、細胞に送達されなければならない。従って、特定の量の核酸は、ヌクレアーゼまたは血清中に存在する他の種によって分解されてはならず、その結果、核酸の活性は、発現される核酸の治療的な量または診断的な量に十分となる。従って、特定の実施形態において、脂質複合体中に存在する核酸の5%未満、10%未満、20%未満、または30%未満が、分解される。複合体の有効な使用のために送達されなければならない核酸の正確な量は、意図される特定の使用、および核酸が送達される細胞型に依存する。核酸の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%が生物学的に活性であることが好ましい。
【0080】
脂質複合体を特徴づけるためのさらなる特性は、トランスフェクション活性(これは、トランスフェクション効率ともいわれ得る)の測定である。トランスフェクション活性は、複合体のトランスフェクション活性における血清成分の可能なインビボ効果を決定、および活性に対するインビボ効果を予測するために血清中でのインキュベーション後に測定され得るか、あるいは血清中での予めのインキュベーションなしで測定され得る。トランスフェクション活性を測定するための方法は、当該分野において公知であり、そして本明細書中(特に実施例中)に記載される。トランスフェクション活性の測定前の血清中でのインキュベーションは、上記のような血清の持続時間および処方のためであり得る。
【0081】
例えば、ルシフェラーゼ遺伝子のトランスフェクション活性を測定する場合、合計5×104個の細胞当たりの0.1〜10μgの間のDNAについてのインビトロでのトランスフェクション活性の代表的なレベルは、1×104〜1×106RLU/mgのタンパク質である。
【0082】
好ましい実施形態において、脂質複合体のトランスフェクション活性は、上記のような所望の治療的または診断的結果が達成されるようなものであるべきである。例えば、細胞に送達される診断的核酸が、緑色蛍光タンパク質をコードする場合、このタンパク質は、蛍光のバックグラウンドレベルを超えて検出され得るレベルで細胞中で発現されなければならない。当業者は、トランスフェクション活性が、診断または処置の目的のために所望の効果を生じるのに十分であるか否かを決定するために適切なレベルを決定し得る。
【0083】
複合体を特徴づけるさらなる特性は、補体オプソニン作用である。標準的な補体オプソニン作用アッセイは、当該分野で公知である(例えば、Ahlら(1997)Biochemica et Biophysica Acta 1329:370〜382を参照のこと)。例示的なアッセイとしては、補体固定、さもなければ当該分野において周知の補体オプソニン作用アッセイが挙げられる。補体オプソニン作用アッセイにおいて、脂質複合体は、予め決定された量の血清(例えば、ウサギ、ヒトまたはモルモット)と共にインキュベートされる。赤血球の種と特異的に反応する抗体(例えば、ヒツジ赤血球が使用される場合、二次抗体はウサギ−抗−ヒツジ赤血球抗体である)を用いて処置された赤血球(例えば、ヒツジ、ウサギ、ヒト)は、次いで血清で処理された脂質複合体と共にインキュベートされる。初めに言及した予め決定された血清のレベルは、緩衝液のみと共に予めインキュベートされた場合に、約95%の二次抗体処理赤血球を溶解するのに必要な血清レベルに基づく。脂質複合体が、血清補体タンパク質とオプソニン作用するか/結合するか/または相互作用する場合、補体成分は、制限されるようになり、そして二次抗体でコーティングされた赤血球と共にインキュベートした場合、赤血球の溶解の程度(例えば、溶血反応)は、緩衝液コントロールと比較して減少される。溶血反応の程度は、分光光度法を含む当該分野において公知の多数の方法によって測定され得る。血清の希釈を変えることによって、検量線が、コントロール緩衝液またはコントロール脂質処方物を用いて作成され得る。50%の溶血を生じる血清の希釈は、CH50といわれ、そして脂質処方物を比較するために使用され得る。一般に、本発明の脂質処方物は、コントロール緩衝液の2倍〜1000倍の間のCH50を有する。
【0084】
血清中の補体オプソニン作用のレベルは、相互作用、特に、複合体がインビボで血清中に存在する種と有する非特異的相互作用の程度を示す。初めに記載されたように、血清中に存在する種との非特異的相互作用は、細胞に送達される核酸の循環半減期および/または細胞バイオアベイラビリティを減少し得る。遮蔽部分は、細胞中の種との相互作用の数または強度を減少するために脂質複合体中に組み込まれ得、従って核酸の循環半減期および/または細胞バイオアベイラビリティを増加する。
【0085】
上記のように、代表的に、複合体は、分解からの核酸保護、血清中でのインキュベーション後および/または前の平均直径、補体オプソニン作用のレベルならびにトランスフェクション活性に関して特徴づけられるべきである。複合体はまた、本明細書中に記載され、そして実施例中に示されるような細胞毒性について試験され得る。毒性は、生存性の確率として表現され得る。特定の実施形態において、最小で50%の生存率が好ましい。特定の実施形態において、60〜80%の生存率が好ましい。
【0086】
上記のように、複合体の循環半減期は、多数の因子によって影響され、この因子としては、平均直径、遮蔽、標的化因子などが挙げられる。従って、複合体は、その循環半減期の測定によってさらに特徴づけられ得る。一般に、より長い循環半減期が好ましい。すなわち、PEGのような遮蔽部分の組込みにおける、複合体の循環半減期の増加は、特定の細胞へのより多くの核酸送達を代表的に生じる。しかし、特定の処方物について、複合体は、細胞に決して生物利用され得(例えば、摂取され得)ないように十分遮蔽されることも可能である。循環半減期の測定は、この場合と、複合体が特定の条件下で凝集される場合との間を区別し得る。
【0087】
循環系半減期を測定する方法は、当該分野で公知であり、そして放射線トレーサー蒸着、HPLC、またはPCRが挙げられる。複合体の好ましい循環系半減期の長さは、種々の因子に依存して変化する。このような因子としては、処置または診断するための条件、状態の重症度、標的化細胞型、標的化細胞型の位置、複合体の送達方法、複合体送達の頻度、送達される薬物の量、および送達される薬物の毒性、そして、インビボまたはエキソビボ送達については、複合体が投与される個体の性別、体重、年齢および身体の健康が挙げられる。当業者は、使用される複合体の型ならびに複合体の送達量および送達頻度を決定する場合、これらの因子を考慮し得るべきである。
【0088】
特定の実施形態において、脂質複合体サイズの好ましい性質としては、400nm未満の平均径、血清中ではないトランスフェクションと比較して、少なくとも70%の血清中のトランスフェクション効果、少なくとも50%の核酸保護、および少なくとも50%の補体固定能力が挙げられる。
【0089】
特定の実施形態において、複合体は、以下の特徴を有する:減少された補体のオプソニン作用は、50%血清中での1時間のインキュベーション後、400nm未満、300n標的化因子m未満、200nm未満、150nm未満、または100nm未満の平均径を有し;血清の非存在下では1%〜100%のトランスフェクション活性を有し、好ましくは、血清の存在下で、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%のトランスフェクション活性を有する。
【0090】
本明細書中に記載される方法によって形成される複合体はまた、本明細書中に記載されるように、その毒性、循環系半減期および長期にわたる安定性と関連して特徴付けられ得る。本明細書中に記載されるような用途、特に、インビボの診断または処置の用途に適した複合体については、その複合体はまた、「1バイアル」処方物としての調製に適している。「1バイアル」処方物は、所望の用途、ならびに低毒性および治療効力または診断効力のための効果に加えて、インビボでの用途のための全ての処方物として、複合体の全ての成分が共に処方される場合に、長期間にわたって安定であるべきである。上記のように、安定性は、物理学的特性(例えば、平均径)と生物学的活性(例えば、トランスフェクションレベル)の両方のことをいう。
【0091】
用語「再現性複合体」およびその同族体(cognate)は、本明細書中に記載される方法によって調製される複合体の特性を通常有する複合体を記載するために使用され、前の章に記載されるとおりである。例えば、複合体は、アッセイ法および本明細書中に記載されるとおりの測定法によって特徴付けられ、血清中でのインキュベーション後のサイズ、トランスフェクションレベル、および補体オプソニン作用を含む。この複合体はまた、前の章に記載される特性と同等の特性を有し得るが、異なるアッセイ方法によって得られる。例えば、複合体の特性は、血清中でのインキュベーション後の平均径の測定以外の手段によってかまたは補体オプソニン作用によって、あるいは本明細書中に記載される細胞以外の細胞(例えば、KB、LL2またはMDA−231細胞以外の細胞)中のトランスフェクションレベルの測定によって、および/あるいはトランスフェクションレベルを測定するための異なるレポーター遺伝子もしくはプローブを使用して決定される。当業者は、このような特徴を比較し得、同等のように決定し得る。本明細書中に記載される実施形態において、本発明の脂質/核酸複合体は、上記の特徴または上記の特性と同等の特性を有し、さらに再現可能的に処方され得、これらの特徴を示すことによって特徴付けられる。
【0092】
本発明の薬物送達複合体を試験するのに適切なさらなる方法は、米国特許第5,795,587号および同第6,008,202号に見出され、これらは、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【0093】
本発明の複合体を使用する治療的処方物は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、等張生理食塩水、または低イオン強度緩衝液(例えば、H2O(pH7.4〜7.6)中またはHEPES(pH7〜8、より好ましくは6.8〜7.4のpH)中の5%デキストロースまたは10%スクロース)のような生理学的に適合性の緩衝液中に複合体を含む。
【0094】
(薬物輸送複合体)
少なくとも1つの融合性脂質(fusogenic lipid)と上記の特性または同等の特性を有するコンパクト化された核酸の複合体は、本発明の特定の実施形態によって提供され、この複合体は、少なくとも1つのアニオン性融合性脂質もしくはpH感受性脂質を含む。非融合性アニオン脂質と上記の特性または同等の特性を有するコンパクト化された核酸の複合体がまた、本発明の特定の実施形態によって提供され、この複合体は、少なくとも1つの融合性部分をさらに含む。特定の実施例において、融合性部分は、融合性脂質であり得る。他の実施例において、標的化因子または遮蔽因子は、本明細書中に記載するような融合性部分を含み得る。アニオン脂質を含む複合体については、融合性アニオン脂質が挙げられ、ポリカチオンは、核酸をコンパクト化するために必要とされる。上記の複合体は、必要に応じて標的化因子(特異的または非特異的のいずれか)を含み得、その因子は、複合体の他の任意の成分と結合し得るかまたはしなくてもよい。記載される複合体はまた、必要に応じて遮蔽部分を含み、この遮蔽部分は、複合体の他の任意の成分に結合し得るかまたはしなくてもよい。この複合体はまた、1つ以上の共脂質(co−lipid)を含み得る。
【0095】
別の実施形態において提供される複合体は、上記の特性または上記と同等の特性を有し、脂質、コンパクト化された核酸、および遺伝子発現における増加によって測定されるように、特定の細胞表面レセプターの標的化以外の手段によって細胞内バイオアベイラビリティーを増加する標的化因子を含む。この複合体は、必要に応じて、ポリカチオン、および/または遮蔽因子および/または融合性部分および/または一つ以上の共脂質を含み得る。
【0096】
本明細書中に記載される複合体の各々は、遮蔽部分をさらに含み得る。遮蔽部分の例としては、ポリエチレングリコールを含む化合物、および複合体とインビボもしくはインビトロに存在する種との相互作用または結合を減少する他の化合物(例えば、血清補体タンパク質、補因子、ホルモンまたはビタミン)が挙げられる。
【0097】
特定の実施形態において、脂質種が、ペグ化脂質(pegylated lipid)を含む場合、ペグ化脂質の総含有量は、0%〜約20%の範囲である。他の実施形態において、ペグ化脂質の範囲は、約0〜10%、約0〜6%、約0〜5%、約0〜4%、約0〜3%である。特定の実施形態において、ペグ化脂質の総含有量は、約2.5%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%である。複合体は、特定の型のペグ化脂質および非ペグ化脂質、例えば、ペグ化DSPEおよび非ペグ化DSPEの両方を含み得る。特定の実施形態において、総ペグ化脂質含有量は、約10%以下である。
【0098】
特定の実施形態において、核酸の分解は、当業者に周知の技術(例えば、Pico Green(登録商標)染色、臭化エチジウム染色もしくはゲル電気泳動)によって測定され得る。特定の複合体によって固定された補体の量を測定する技術は、本明細書中に記載され、そして当該分野で周知である。例えば、Ahlら(1997)Biochemica et Biophysica Acta 1329:370−381を参照のこと。
【0099】
本明細書中に記載される複合体の特定の実施形態において、少なくとも1つの共脂質は、非融合性であり得、他の実施形態において、少なくとも1つの共脂質は、癒合誘導であり得る。特定の実施形態において、少なくとも1つの共脂質は、中性リン脂質であり得る。
【0100】
本明細書中に記載されるような薬物送達複合体は、以下のいずれかと共に処方され得る:脂質;標的化因子;ポリカチオン;遮蔽部分;薬物(特に核酸);他に示されない限り、本明細書中に記載のもの。さらに、本明細書中に記載される薬物送達複合体は、本明細書中で述べられるガイドラインに従って記載される本明細書中の方法によって作製され得、そして使用され得る。
【0101】
特定の実施形態は、疾患、状態、または症候群の処置または診断のための医薬の製造において、本明細書中に記載されるような複合体の使用をさらに提供する。
【0102】
明細書および特許請求の範囲を通して使用される場合、「薬物(drug)」は、モノマーもしくはオリゴマーである任意の分子実体であり、その分子実体は、脂質、最適なポリカチオン、および標的化因子と共に複合体化される場合、レシピエントに対して治療効果または予防効果を提供する目的のために個体に投与され得るか、または、診断目的のために投与され得る。従って、全体的に正味の負の電荷または陰性領域を有する高分子は、、本発明の送達複合体を形成し得ることが予想される。本発明の複合体と共に使用するのに特に適切な高分子は、例えば、DNA,RNA、オリゴヌクレオチドもしくは負に荷電したタンパク質である。しかし、正電荷を有する高分子(例えば、大カチオンタンパク質)はまた、カチオン高分子と、アニオン分子もしくはアニオンポリマー、次いで、カチオン脂質を連続的に複合体化することによって、またはカチオン高分子を、アニオンポリマーもしくは脂質を含む複合体中に導入することによって、本発明の複合体を形成し得ることが予想され得る。好ましい実施形態において、薬物は核酸であり、用語、核酸、および薬物は、この点から交換可能に使用される。
【0103】
「ポリエチレングリコール」および「PEG」は、一般式H(OCH2CH2)nOHの化合物をいい、ここでnは、1より大きい任意の整数であり得る。好ましいPEG処方物は、約750〜20,000の平均分子量を有する。本明細書中で使用される場合、「PEG」および「ポリエチレングリコール」は、PEG組成物を包含することを意味し、これは必要に応じて1つ以上の官能基(例えば、メトキシ、ビオチン、スクシニル、ニッケルまたは別の部分(例えば、脂質または標的化因子)への結合体化PEGを含み得る。
【0104】
本明細書中で使用される「ペグ化脂質」は、ポリエチレングリコール(PEG)部分に結合される脂質を示す。
【0105】
本明細書中で使用される「標的化因子−ペグ化脂質結合体」は、ペグ化脂質に結合している標的化因子を示す。この標的化因子は、例えば、ペグ化脂質のPEG部分に結合し得る。
【0106】
本明細書中で使用される「標的化因子−脂質結合体」は、脂質に結合している標的化因子を示す。
【0107】
本明細書中で使用されるような「標的化因子」は、薬物の細胞(例えば、細胞内)バイオアベイラビリティーを増加する、合成部分または天然に存在する部分を示す。この標的化因子は、細胞膜(例えば、細胞外表面膜、核膜またはエンドソーム膜)との特異的および/または非特異的相互作用を介して、所望の位置で増加された細胞バイオアベイラビリティーをもたらし得る。この標的化因子は、具体的には、例えば、他の型の細胞よりも特定の型の細胞(例えば、癌細胞)を優先的に結合し、他の細胞型よりも少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも200倍の親和性で、標的化因子を標的化細胞型に結合するかまたは標的化細胞型と相互作用することによって作用し得る。標的化因子はまた、薬物の細胞取りこみを増加する、(例えば、細胞膜(例えば、細胞外表面膜、核膜またはエンドソーム膜)を横切る薬物輸送を促進し、(例えば、MTLPペプチドを参照のこと)それによって細胞中の治療効果および/または予防効果および/または診断レベルを提供する)ことによって、作用し得る。他の実施形態において、標的化因子は、薬物が細胞区画に入るかまたは細胞区画から出る速度または量を増加する。標的化因子はまた、核酸の転写の増加を介して細胞バイオアベイラビリティーを増加し得る。標的化因子はまた、多機能性であり得、特異的標的要素および非特異的要素の両方を含み、それらの要素は、特定の細胞型の標的化に続いて、標的細胞または標的部位での薬物の取りこみを増加する。多機能性標的化因子の非限定的な例は、下記の実施例に詳細に記載するようなガラクトース−Elan094である。非特異的要素の例としては、特異的細胞外膜レセプター(例えば、pH感受性膜破壊性合成ポリマーを含む、膜破壊性合成ポリマー)以外の手段によって細胞バイオアベイラビリティーを増加する標的化因子が挙げられる。1つより多い標的化因子は、特異的標的または非特異的標的のいずれかを増強するために、複合体中に取り込まれ得る。
【0108】
本明細書中で使用される場合、用語「膜破壊性(disruptive)合成ポリマー」または「膜破壊(disrupting)合成ポリマー」は、ポリ(アリルキルアクリル酸)ポリマーのような合成ポリマーをいい、このポリマーは、典型的な生理学的条件(例えば、pH、温度または光条件)下で細胞膜を破壊しないが、その条件が変化する場合、細胞膜を破壊する。例えば、pH感受性膜破壊性合成ポリマーは、生理学的pH(例えば、約pH7〜約pH8.5)においては細胞膜を破壊しないが、異なるpH(例えば、エンドソームのpH(例えば、約pH4.5〜約pH6))においては細胞膜を破壊する。pH感受性エンドソーム膜破壊性合成ポリマーは、上記のようなポリマーをいい、このポリマーは、エンドソームのpHにおいてエンドソーム膜を破壊するが、細胞表面または核膜をインタクトに残す。
【0109】
「RGDモチーフ」は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)配列のペプチドを示す。
【0110】
本明細書中で使用される「DSPE−PEG5K−RGD」は、DSPE−PEG5k−スクシニル−ACDCRGDCFCG−COOHを示す。
【0111】
本明細書中で使用される「DSPE−PEG5k−LHRH」は、pyrGLU−HWSYDK(εNH−スクシニル−PEG5k−DSPE)LRPG−COOHNH2を示す。
【0112】
本明細書中で使用される「MTLP」は、膜移行ペプチド(すなわち、脂質/薬物複合体および/または細胞膜を横切る薬物の移行を促進するペプチド)を示す。
【0113】
本明細書中で使用される「MTLP−脂質」は、MTLP配列に結合する脂質を示す。
【0114】
「DOPE−094」および「Elan219」は、本明細書中で交換可能に使用され、DOPE−スクシニル−KKAAAVLLPVLLAAPを示す。
【0115】
本明細書中で使用される「Elan094」は、ペプチド配列、KKAAAVLLPVLLAAPを示す。
【0116】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。そのポリマーは、線形または分枝であり得、修飾されたアミノ酸を含み得、1つ以上の非ペプチド結合を含み得、そして1つより多いポリペプチド鎖の複合体中に構築され得る。この用語はまた、天然に、または介入によって;例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化(lipidation)、アセチル化、リン酸化、プレニル化、ミリストイル化、パルミトイル化、または標識成分との結合のような他の任意の操作または修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、例えば、1つ以上のアミノ酸のアナログ(例えば、非天然アミノ酸などを含む)を含むポリペプチド、非ペプチド結合、ならびに当該分野で公知の他の修飾物が、定義内に含まれる。その定義は、L−アミノ酸および/またはD−アミノ酸から作製されるポリマーを、さらに含む。
【0117】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、本明細書中で交換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、当該分野で公知のオリゴヌクレオチドのアナログおよび誘導体を含む。
【0118】
「カチオン性複合体」は、本明細書中で使用される場合、正味の正の電荷および/または正に荷電した表面を有するポリカチオンを必要に応じて含む、薬物/脂質/標的化因子複合体を含むことを意味する。これは、カチオン性のリポソーム、ミセル、コロイド溶液、混合ミセル、およびよりアモルファスな脂質構造を含むことを意味する。複合体の正味の電荷は、ζ電位測定(Martin,A.,Swarick,J.,およびCammarata,A.,Physical Pharmacy&Physical Chemical Principles in the Pharmaceutical Sciences,第3版.LeaおよびFebiger,Philadelphia,1983)のような当業者に公知の方法によって、電場における複合体の移動によって測定され得る。
【0119】
「アニオン性複合体」は、本明細書中で使用される場合、正味の負の電荷および/または負に荷電した表面を有する、薬物/脂質/ポリカチオン/標的化因子複合体を含むことを意味する。これは、アニオン性のリポソーム、ミセル、コロイド溶液、混合ミセル、およびよりアモルファスな脂質構造を含むことを意味する。
【0120】
本明細書中で使用される場合、用語「アニオン性脂質」は、生理学的pH(これは、約pH7と約8.5の間である)において陰性である脂質をいう。
【0121】
同様に、「中性脂質」は、生理学的pHにおいて中性または電荷バランスのとれた脂質であり、そして「カチオン脂質」は、生理学的pHにおいて正に荷電している脂質である。
【0122】
「pH感受性」脂質として記載される脂質はまた、生理学的pHにおけるそれらの電荷に依存して、「アニオン性」、「カチオン性」または「中性」に分類される。例えば、DOPEは、約pH7において中性であるので、中性脂質と呼ばれ得るが、それは、pH約9においてはアニオン性である、pH感受性脂質である。
【0123】
用語「融合性(fusogenic)」は、本明細書中に記載される脂質または複合体の他の成分のいずれかを記載するために使用され得る。用語「融合性部分」は、そうでないと記されるかまたは脈略に示されない限り、融合性脂質と複合体の他の融合性成分の両方をいう。本明細書中で使用される場合、用語「融合性」は、細胞膜を横切って、複合体(または薬物)の転移を増強するかまたは可能にする部分をいう。この膜は、細胞外表面膜、エンドソーマル膜または核膜のいずれかであり得る。この融合性部分は、細胞表面膜を横切って細胞の内部への複合体または複合体の成分(例えば、核酸)の輸送を増加し得るかあるいは細胞成分への侵入または細胞成分からの抜け出しを増加する。このような区画は、例えば、エンドソームまたは核であり得る。融合し得る複合体成分の例としては、例えば、脂質、標的化因子、または遮蔽部分が挙げられる。特定の実施形態において、融合性部分は、例えば、膜破壊性合成ポリマーのような標的化因子、または例えば、膜移行配列(例えば、MTLP)を含む標的化因子であり得る。
【0124】
使用され得る用語「融合性脂質」は、生理学的pHにおいてそれらの電荷または構造と比較する場合、エンドソームpHにおける構造または電荷における変化を起こし、より融合性である脂質を生じる脂質をいう。これらの融合性脂質は、アニオン性脂質、中性脂質またはpH感受性脂質であり得、これらは、pHが、約pH7〜約pH4.5まで変化する場合、その脂質は、より融合性であるような電荷または構造への変化を起こすことで特徴付けられる。電荷または構造における変化はまた、pHが約4.5〜約6で生じ得る。いくつかの実施形態において、電荷または構造における変化は、例えば、エンドソームに入るために連結され、そして初期から後期のエンドソームのpH(例えば、約pH4.5、5、5.5または6)の範囲であり得る。特定の実施形態において、複合体は、少なくとも1つの融合性脂質、例えば、1,2−ジオレオイルホスファージチジルエタノールアミン(DOPE)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホエタノールアミン−N−ドデカノイル(NC12−DOPE)、コレステリルヘミスクシネート(CHEMS)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−L−セリン](DOPS)を含む。特定の実施形態において、pHが、約pH4.5より低い場合、融合性アニオン性脂質は、中性またはカチオン性になるために電荷の変化を起こす。他の実施形態において、融合性pH感受性脂質は、約4.5までpHを下げることによって、電荷に変化を起こし得、その結果中性またはアニオン性脂質は、カチオン性または中性になる。他の実施形態において、pHが約4.5に下げられる場合、融合性脂質は、構造に変化を起こし、その結果、六方晶形構造または錐体形状構造をとる。この型のさらなる融合性脂質は、当該分野において公知であり、そして本明細書中に記載される処方物、複合体および方法において使用され得る。これらの「融合性」脂質のいくつかの例は、六方晶形構造に適合するために構造を変化するが、これらの脂質の他の例は、負に荷電したアニオン性脂質から中性脂質へ、または中性脂質から正に荷電したカチオン正脂質に電荷の変化を起こす。これらの融合性脂質はまた、当該分野において「錐体形状」脂質として呼ばれているものを含む。この用語「融合性脂質」はまた、錐体形成の分子形状特性を示す脂質をいうために使用され得、その結果、脂質フレームワークは、小断面頭部群および大アシル鎖断面領域を含む。理論によって結合されることを望まれないが、これらの脂質は、非二重層六方晶形HII相を誘導することが考えられる。
【0125】
脂質または脂質の組み合わせの電荷における変化は、上記および実施例に示されるように、ζ電位を測定することによって決定され得る。異なるpH条件下での脂質の構造または脂質の組み合わせは、当業者に公知の方法によって決定され得、そして実施例に記載されるとおりである。このような方法は、例えば、電子顕微鏡、特に逆染色電子顕微鏡(例えば、Lee&Huang(1996)前述)、およびその他(原子間力顕微鏡、クライオエレクトロン顕微鏡、凍結割断顕微鏡、31P NMRおよび脂質混合実験が挙げられるが、これらに限定されない)を含む。
【0126】
本明細書中で使用される場合、「コンパクト化核酸」、およびその同族は、「コンパクト化された」または「濃縮された(condensed)」核酸をいう。「コンパクト化」剤または「濃縮」剤の例としては、合成ポリカチオンのようなポリカチオン(例えば、ポリカチオン性メタクリルオキシポリマー、ポリカチオン性メタクリレートポリマーおよびPEIのようなポリカチオン性ポリ(アルケニルイミン)、ジメチルアミノメタクリレートおよびメタクリルエステル(例えば、Eugadrit(登録商標)100、Eugadrit(登録商標)EPO)のコポリマーのようなジメチルアミノメタクリレートを含むポリマー、ならびにポリ(2−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムブロミド(PMOETMAB));ポリカチオン性ポリペプチド(例えば、ヒストン、プロタミン、スペルミジン、ポリアルギニン、ポリリジンなど);ポリカチオン性ポリペプチド塩、が挙げられる。用語「濃縮された」および「コンパクト化された」ならびにそれらの同族体および「コンパクト化剤」または「濃縮剤」などのような組み合わせは、本明細書中で他に示されない限り、交換可能に使用され得る。プロタミンおよびその塩以外のポリカチオンが好ましい。
【0127】
用語「合成ポリカチオン」は、核酸をコンパクト化し得、脂質と共に使用するのに適し、リポソームの形態であるポリカチオンを記載するために使用され得る。合成ポリカチオンの例としては、ポリ(アルケニルイミン)(例えば、ポリエチレンイミン(PEI))、ポリカチオン性メタクリレートポリマー(例えば、ジメチルアミノメタクリレートを含むポリマーおよびジメチルアミノメタクリレートとメタクリルエステルとのコポリマー(例えば、Eudragit(登録商標)ポリカチオン、Eudragit(登録商標)E100、Eudragit(登録商標)EPO)、およびポリカチオン性メタクリルオキシポリマー(例えば、ポリ(2−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムブロミド(PMOETMAB))が挙げられる。この用語合成ポリカチオンは、ポリカチオン性ポリペプチドおよびその塩(例えば、プロタミン、ヒストン、ポリ−L−リジンなど)を含むことを意図しない。
【0128】
用語「ミセル」またはその同族体は、脂質二重層であるリポソームと区別される脂質単層を記載するために使用され得る。
【0129】
(標的化因子)
標的化因子は、例えば、修飾脂質、ペプチド、タンパク質、ポリカチオン、合成ポリマー、合成化合物、レセプターリガンド、低分子、ビタミン、ホルモン、金属、炭水化物、膜破壊性合成ポリマー、膜破壊性ポリマーもしくはエンドソーム膜破壊性合成ポリマー、または特性の組織または細胞型に複合体を指向させるために機能する核酸もしくは細胞膜を横切って薬物輸送を容易にする核酸を含み得るが、細胞外表面膜、核膜もしくはエンドソーム膜に限定されない。他の実施形態において、標的化因子は、細胞区画に入るかまたは細胞区画から出る薬物の速度または量を増加させる。標的化因子はまた、核内の転写を増加させ得る。潜在的な標的としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:肝臓細胞、血液細胞、腎臓細胞、前立腺細胞、肺上皮細胞、肺内皮細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮、繊維芽細胞および腫瘍細胞。好ましい実施形態において、標的は、腫瘍細胞である。
【0130】
適切な標的化因子の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:アシアロ糖タンパク質、インスリン、低密度リポタンパク質(LDL)、増殖因子、ガラクトース、接着分子、レクチン、核酸、葉酸、MTLP、膜破壊性合成ポリマー、膜破壊性ポリマー、エンドソーム膜破壊性合成ポリマー、ポリ(アルキルアクリル酸)および細胞表面分子に対して指向されるモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体。好ましい実施形態において、標的化因子は、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)である。別の好ましい実施形態において、標的化因子は、接着分子を含む。別の実施形態において、標的化因子は、pH感受性膜破壊性合成ポリマーである。pH感受性膜破壊性合成ポリマーの非限定的な例は、ポリ(アルキルアクリル酸)である。特定の実施形態において、ポリアクリル酸(polycrylic acid)は、ポリ(プロピルアクリル酸)(PPAA)、ポリ(エチルアクリル酸)(PEAA)であり得る。他の実施形態において、ポリ(アルキルアクリル酸)は、PPAAである。他の膜破壊性合成ポリマーは、当該分野で公知であり、例えば、Lackeyら(1999)Bioconj.Chem.10:401−405;MurthyらControll. Release 61:137−143;Staytonら(2000)J.Controll.Release 65:203−220;およびWO 99/34831.(Cheungら(2001)Bioconj.Chem.12:906−910),Lackeyら(1999)(前出)に記載され、そしてMurthyら(1999)(前出)もまた、pH感受性膜破壊性合成ポリマーの調製を記載する。
【0131】
接着分子の非限定的な例は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)モチーフを含むペプチドである。適切なRGDモチーフペプチドの非限定的な例は、H2N−ACDCRGDCFCG−COOH(RGD4C)である。MTLPの非限定的な例は、H2N−KKAAAVLLPVLLAAP−COOH(Elan094)である。MTLP−含有標的化因子の他の適切な例としては以下が挙げられる:H2N−KKAAAVLLPVLLAAP−COOH(Elan094)、H2N−KKKAAAVLLPVLLAAP(ZElan094)、H2N−kkkaavllpvllaap(ZElan207)、H2N−KKKAAAVLLPVLLAAPREDL(ZElan094R);H2N−GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG−COOH(インフルエンザHA−2(INF6));H2N−GLFEALLELLESLWLLEA−COOH(JTS1);H2N−HHHHHWYG−COOH(H5WYG);H2N−WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA−COOH(GALA);H2N−WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA−COOH(KALA);VP22(HSV−1);H2N−CPCILNRLVQFVKDRISVVQAL−COOH(レトロウイルス細胞内ドメイン(Mo−MuLv));H2N−RQIKIWFQNRRMKWKK−COOH(ホメオボックスドメイン侵入);H2N−RQPKIWFPNRRKPWKK−COOH(ホメオボックスドメイン侵入);H2N−PLSSIFSRIG−COOH(PreS2ドメイン);H2N−RGGRLSYSRRRFSTSTGR−COOH(SynBl));タンパク質形質導入ドメイン(PTD)(例えば、H2N−YGRKKRRQRRR−COOH(TAT);H2N−RQIKIWFQNRRMKWKK−COOH(Antp);H2N−RRRRRRR−COOH(Arg);およびH2N−HHHHHHHHH−COOH(His)。特定の実施形態において、MTLPは、H2N−KKKAAAVLLPVLLAAP(ZElan094)、H2N−kkkaavllpvllaap(ZElan207)、またはH2N−KKKAAAVLLPVLLAAPREDL(ZElan094R)であり、ここで小文字は、D−アミノ酸を示す。さらなる標的化因子としては、以下:H2N−K(ダンシル)KKAAAVLLPVLLAAP(ZElan094)、H2N−k(ダンシル)kkaavllpvllaap(ZElan207)、H2N−K(ダンシル)−H2N−KKKAAAVLLPVLLAAP(ZElan094)、H2N−kkkaavllpvllaap(ZElan207)、H2N−K−KKAAAVLLPVLLAAPREDL(ZElan094R)、des−Pro−KKAAAVLLPVLLAAS−ガラクトース(Elan094G)、S(ガラクトース)KKAAAVLLPVLLAAP(Gelan094)、コレステリル−スクシニル−KKAAAVLLPVLLAAP(Elan218)、DOPE−スクシニル−KKAAAVLLPVLLAAP(Elan219)、コレステリル−スクシニル−kkaaavllpvllaap(全てd−Elan218)、DSPE−PEG5K−スクシニル−KKAAAVLLPVLLAAP(DSPE−PEG5K−Elan218)、DMPE−PEG5K−スクシニル−KKAAAVLLPVLLAAP(DSPE−PEG5K−Elan218)、DSPE−PEG5K−スクシニル−KKAAAVLLPVLLAAP(DSPE−PEG5K−Elan219)、およびDMPE−PEG5K−スクシニル−KKAAAVLLPVLLAAP(DSPE−PEG5K−Elan219)、からなる群から選択される標的化因子含有化合物が挙げられ、ここで、小文字で表されるアミノ酸は、D−アミノ酸を示す。ダンシル(ダンシル化塩化物)および上で「タグ」として列挙されるElan部分中のdes−Proタグの取りこみは、分子を標識し、その結果この部分はこれらのタグを含み、実験的に追跡/モニタリングされ得る。当業者は、これが、診断もしくは治療のいずれかのインビボでの用途に依存して処方物中に取りこまれ得るかまたは取りこまれないかを理解する。1つの実施形態において、複合体は、ペグ化脂質をさらに含む。別の実施形態において、この複合体は、DSPE−PEG5K−LHRHをさらに含む。
【0132】
標的化因子がペプチドである場合、L−アミノ酸および/またはD−アミノ酸が使用され得る。一般的に、L−アミノ酸からなるペプチドは、D−アミノ酸で作製されるペプチドに比べ、血清中であまり安定ではない。従って、このペプチドは、より短い循環半減期を必要とする複合体のために好ましいかあるいは、肺細胞、肝臓細胞、または心臓細胞を標的化する場合、所望の細胞中での最適な組織取りこみが、比較的短い寿命のペプチドに関する投与処方物に曝されるかまたはその処方物と接触される組織中で生じる場合のために好ましくあり得る。あるいは、D−アミノ酸からなるペプチドは、より長い循環半減期が必要とされる場合に好ましくあり得る。
【0133】
膜移行ペプチドまたは標的化因子ペプチドを、化学的方法(例えば、米国特許第4,244,946号、同4,305,872号および同4,316,891号;Merrifieldら,J.Am.Chem.Soc.85:2149,1964;Valeら,Science 213:1394,1981;Markiら,J.Am.Chem.Soc.103:3178,1981を参照のこと);組換えDNA方法(例えば、Maniatis,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,1990)または他の当業者に公知の方法を使用して、合成し得る。
【0134】
化学的方法としては、固相ペプチド合成方法が挙げられるが、これに限定されない。簡潔に述べると、固相ペプチド合成方法はC末端アミノ酸のカルボキシル基を樹脂とカップリングする工程して、そして首尾良くN−α保護されたアミノ酸に付加する工程からなる。保護基は当該分野で公知の任意の基であり得る。アミノ酸を、成長しているペプチド鎖に付加する前に、1つ前のアミノ酸の保護基を取り除く(Merrifield J.Am.Chem.Soc.85:2149 1964;Valeら,Science 213:1394,1981;Markiら,J.Am.Chem.Soc.103:3178,1981)。次いで、合成されたペプチドを、当該分野で公知の方法によって精製する。
【0135】
好ましくは、固相ペプチド合成を、ABIによって供給される「Fastmoc」合成プロトコルを使用するApplied Biosystems Inc.(ABI)モデル431Aのような自動ペプチド合成機を使用してなされる。このプロトコルは、カップリング剤として、2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)を使用する(Knorrら,Tet.Lett.30:1927,1989)。合成を、0.25mmolの市販の4−(2’,4’−ジメトキシフェニル(dimethoxyphenyi)−(9−フルオレニル−エトキシカルボニル)−アミノメチル)フェノキシポリスチレン樹脂上で実行し得る(Rink H. Tet.Lett.28:3787,1987)。Fmocアミノ酸(1mmol)を、Fastmocプロトコルに従ってカップリングする。N−メチルピロリドン(NMP)を溶媒として使用して、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中にHBTUを溶解する。Fmocアミノ酸誘導体で保護された以下の側鎖を使用する:FmocArg(Pmc)OH;FmocAsn(Mbh)OH;FmocAsp(tBu)OH;FmocCys(Acm)OH:FmocGlu(tBu)OH;FmocGln(Mbh)OH;FmocHis(Tr)OH,FmocLys(Boc)OH;FmocSer−(tBu)OH;FmocThr(tBu)OH;FmocTyr(tBu)OH(略号:Acm:アセトアミドメチル;Boc:tert−ブトキシカルボニル;tBu:tert−ブチル;Fmoc:9−フルオレニルメトキシカルボニル;Mbh;4,4’−ジメトキシベンズヒドリル;Pmc:2,2,5,7,8−ペンタメチルクロ−マン(pentamethylchro−man)−6−スルホニル;Tr:5トリチル)。
【0136】
Fmoc基の脱保護を、NMP中の約20%のピペリジンを使用して行う。それぞれの合成の終結に、ペプチド量を紫外線分光法を使用してアッセイする。乾燥ペプチド樹脂のサンプル(約3〜10mg)を秤量して、次いでDMA(10ml)中の20%ピペリジンを添加する。30分の超音波処理の後、ジベンゾフルベン−ピペリジン付加物(N末端Fmoc基の切断により形成される)のUV(紫外線)吸収を301nmで記録する。ペプチド置換値(mmol/gで)を等式:
【0137】
【化1】
に従って計算する。
【0138】
ここで、Aは301nmでの吸収、vはDMA中の20%ピペラジンのml、7800はジベンゾフルベン−ピペラジン付加物の吸光係数(mol/dm3/cm)、そしてwはペプチド−樹脂サンプルのmgである。N末端Fmoc基を、DMA中の20%ピペリジンを使用して切断し、次いで無水酢酸およびDMA中のピリジンを使用してアセチル化する。このペプチド樹脂を、DMA、CH2Cl2およびジエチルエーテルを用いて徹底的に洗浄する。
【0139】
切断および脱保護の方法(Kingら,Int.J.Peptide Protein Res.36:255.1990)としては、空気乾燥したペプチド樹脂を、エチルメチルスルフィド(EtSMe)、エタンジオール(EDT)およびチオアニソール(PhSMe)で、約20分間処理する工程および95%トリフルオロ酢酸水溶液(TFA)を添加する工程が挙げられるが、これらに限定されない。約50mlのこれらの試薬を1gのペプチド−樹脂当たり、比率TFA:EtSMe:EDT:PhSme(10:0.5:0.5:0.5)で使用する。この混合物を、窒素雰囲気下で室温にて3時間攪拌し、濾過し、そしてTFAで洗浄する(2×3ml)。混ぜ合せた濾液を減圧下でエバポレートして、そして黄橙色の残渣に無水ジエチルエーテルを添加する。生じた白色沈殿物を濾過により単離する。合成されたペプチドの精製を、標準的な方法によって行い、その方法としては、イオン交換カラム、アフィニティーカラム、サイズ分画カラムおよび高速液体クロマトグラフィー、遠心分離または溶解度差が挙げられるが、これらに限定されない。
【0140】
標的化因子を、例えば、PEG化(pegylate)脂質のPEG部分に結合し得る。例えば、Harasym,T.O.ら,(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32,99−118およびこれに記載される参考文献を参照のこと。これは、PEG部分上で、官能基とのリンカーに適切なペプチド官能基、または下記のようなペプチド官能基を記載する。官能化されたPEG部分に対するペプチド標的化因子の合成の他の方法としては、以下が挙げられる:
(アミン特異的なPEG化mPEG−ALD)
(mPEG−プロピンオンアルデヒド(mPEG−ALD)の合成)
アルデヒド基を有するPEGは、シアノボロ水素化ナトリウムの存在下において、1級アミンと還元的アミン化反応を受ける。他の求電子的に活性化される基とは異なって、このアルデヒドは、アミンとのみ反応する。アルデヒドはNHSエステルよりもずっと反応性が低いが、この反応は穏和な条件下(pH6〜9.5、6〜24時間)で生じ、そしてPEGを表面(Harris,J.M.ら,(1984)J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22:341)およびタンパク質(米国特許第5,824,784号;Wirth,P.ら,(1991)Bioorg.Chem.19:133)に結合するために有用であることが示されている。より低いpHでは、N末端での選択的な反応が可能となる。接続部の安定性(第2のアミンが還元の際に形成される)は、アフィニティー支持体および固定化酵素の調製のような適用に重要である。この様式で改変されたタンパク質は、溶液中でアミン基および関連の電荷を有し、このことはタンパク質の構造および活性を維持するために重要であり得る。これらの結合は、アミノ酸分析によって、加水分解産物中のリジン残基の定量によって便宜的に特徴付けられ得る。mPEG−ALDをまた使用して、ポリビニルアルコールのヒドロキシル基とアセタール結合を形成した(Llanos,G.R.およびSefton,J.V.(1991)Macromol.24:6065)。ここで提供されるプロピオンアルデヒド誘導体は、アセトアルデヒド誘導体よりも塩基性媒質中でよりずっと安定であるという利点を有する(Llanos,G.R.およびSefton,J.V.(1991)Macromol.24:6065;Harris,J.M.ら,(1991)「Water−Soluble Polymers」,S.W.Shalaby,C.L.McCormick,およびG.B.Butlerら編,ACS,Washington,D.C.,Chapter 27)。mPEG−ALDは、タンパク質のN末端PEG化について非常に評判が良く、20,000Daおよび30,000Daの2つのmPEG−ALDがそれぞれ2つの異なるタンパク質と一緒になって、フェーズIIIおよびフェーズIIの臨床試験において使用されている。
【0141】
(アミン特異的PEG化mPEG−BTC)
【0142】
【化2】
(mPEG−ベンゾトリアゾールカーボネート)
mPEGのベンゾトリアゾールカーボネート誘導体(mPEG−BTC)は、スクシンイミジルカーボネート(mPEG−SC)に対して例外的な代替である。いくつかのNHS活性エステルほどの反応性はないが、mPEG−BTCは、ペプチドおよびタンパク質のアミノ基の効果的な修飾因子であり、安定なウレタン結合(カルバメート結合)を生じる。mPEG−BTCは、穏和な条件下で短時間で、極度に修飾されたPEG−タンパク質を生じるのに十分に反応性である。このmPEG−BTCは、いくつかのcGMP合成に関する中間体であり、そして2001年中に、決定的な生産物としてcGMP合成を開始することが予想される。5,000Daおよび20,000Daが、最も通常使用される分子量である。
【0143】
(アミン特異的PEG化mPEG−SPAおよびmPEG−SBA)
【0144】
【化3】
(mPEG−スクシンイミジルプロピオネート(mPEG−SPA))
【0145】
【化4】
(mPEG−スクシンイミジルブタノエート(mPEG−SBA))
PEGカルボン酸のNHSエステルは、PEGをタンパク質にカップリングするための、最も評判の良い誘導体である。リジンおよび末端アミンと活性なエステルとの間の反応は、安定なアミド結合を形成する(Olson,K.ら,(1997),J.M.HarrisおよびS.Zalipsky編,Poly(ethylene glycol),Chemistry & Biological Applications,170−181頁,ACS,Washington,DC.;米国特許第5,672,662号)。PEGカルボン酸のNHSエステルは、いくつかのヒトへの適用において使用されている:mPEG−SPA 5,000をタンパク質アンタゴニストへの結合のために使用しており、これは臨床試験を首尾良く完了し、そしてNDAに登録されている(このmPEG−SPA 5,000のプロセスは確認されており、そして商用のために適切である)。
【0146】
あるいは、標的化因子を別の部分(例えば、脂質、疎水性アンカーまたはポリマー)と結合され得る。非限定的な例としては、コレステリル−スクシニル−KKAAAVLLPVLLAAP(Elan218)、DOPE−スクシニル−KKAAAVLLPVLLAAP(Elan219)、およびコレステリル−スクシニル−kkaaavllpvllaap(All d−Elan218)。これらの標的化因子−脂質結合体は、複合体中に含まれ得るか、または複合体の封入のために、さらにPEG化脂質に結合体化され得る。例えば、標的化因子を脂質と結合体化する方法の総説についての、Harasym,T.O.ら,(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32,99−118を参照のこと。標的化因子(例えば、MTLP)を脂質と結合体化する特定の実施例は、本実施例に見出され得る。標的化因子はまた、以下の適切なリンカーによって、この部分とリンカーされ得る:例えば、炭素スペーサー、細胞表面に存在する酵素(例えば、メタロプロテアーゼ)によって酵素的に切断され得る切断可能なリンカー、またはpH変化もしくは温度変化によって切断され得る切断可能なリンカー、アミド−アミドリンカー、アミド−ジスルフィドリンカー、カルバメート−ジスルフィドリンカー、グリコールアミドエステルリンカー、エステル−アミドリンカー、エステル−ジスルフィドリンカー、ヒドラゾンリンカー、およびアミド−チオエステルリンカー。
【0147】
特定の実施形態において、標的化因子は、複合体の任意の他の成分にはリンカーされない。
【0148】
本発明の標的化因子はまた、特異的な標的エレメント、および特定の細胞型の標的化の後、標的の細胞または部位での薬物取り込みを増加させる非特異的なエレメントの両方を含む、多機能性であり得る。
【0149】
「特異的な」標的化因子の例はとしては、本明細書中で記載される任意の型の細胞表面レセプターのリガンド(例えば、天然または合成の核酸、タンパク質、ペプチド、低分子など)、例えば、アシアロ糖タンパク質、インスリン、低密度リポタンパク質(LDL)、増殖因子、ガラクトース、レクチン、葉酸塩、ならびに細胞表面分子等に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体(本明細書中で開示され、当該分野で公知のように、これらは改変されていてもされていなくてもよい)が挙げられるが、これらに限定されない。このような標的化因子はまた、細胞表面膜レセプターに結合した標的化因子、または外側細胞表面膜レセプターの特異的な外部によって媒介される標的化因子、または特異的な外側細胞表面膜レセプターの標的化によって細胞のバイオアベイラビリティーを増加させる標的化因子としていわれる。「特異的な」外側細胞表面膜レセプターを標的化する標的化因子の例としては、ホルモン、抗体、ビタミンなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの分子はまた、「古典的な」外側細胞表面膜レセプターに結合することが述べられ得る。
【0150】
「非特異的な」標的化エレメントの例としては、特異的な外側細胞表面膜レセプターの標的化以外の手段によって、薬物(特に核酸)の細胞のバイオアベイラビリティーを増加させる標的化因子を含む。核内で核酸の転写を増加させるか、細胞内への核酸の取り込みを増加させるか、細胞区画内への核酸の取り込みを増大させるか、細胞区画からの核酸の流出(exit)を増大させるか、または膜(例えば、細胞表面膜、核膜またはエンドソーム膜)を横切る核酸の移送を増大させる標的化因子が含まれる。非特異的な標的化因子(外側の細胞表面膜レセプターの標的化以外の手段によって薬物(得に核酸)の細胞のバイオアベイラビリティーを増大させる標的化因子)の非限定的な例としては、膜破壊性合成ポリマー(pH感受性膜破壊性合成ポリマー(例えば、
【0151】
【化5】
を含む)、が挙げられる。このような標的化因子はまた、非外側細胞表面レセプター媒介性(または会合性)標的化因子としていわれ得る。非特異的な標的化因子は、複合体の別の成分(例えば、脂質、PEG化された脂質(副脂質を含む)またはPEG化された副脂質)と結合体化され得るか、または複合体の任意の他の成分とは結合体化されずに存在し得る。
【0152】
デオキシリボ核酸についての細胞のバイオアベイラビリティーにおける「増大」または「増強」は、核酸の遺伝子発現の増加によって測定され得、これは当業者に周知の技術である。所定の細胞区画の転写、取り込み、または流出に関する「増大」、または先のパラグラフ中に記載されるような、膜を横切る移送に関する増大は、転写されるか、取り込まれるか、放出されるかまたは移送される核酸の速度の増加および総量の増加をいう。核酸ではない薬物の細胞のバイオアベイラビリティーの増加を測定する技術もまた、当該分野で公知である。このような技術としては、プローブ(例えば、蛍光プローブまたは放射性プローブ)を有する薬物の標識化および標的細胞または細胞区画の内でのプローブ量の測定が挙げられる。
【0153】
単一の標的化因子は、1つ以上の型の特異的および/もしくは非特異的な標的化活性を包含し得るか、または2つの別々の標的化因子が一緒に結合体化して多機能性の標的化因子を形成し得る。本明細書中で記載される複合体はまた、複合体の別の成分と結合体化されてもされなくてもよい、単一の非特異的な標的化因子(例えば、脂質種またはPEG化された脂質種)をまた含み得る。さらに、複合体が1つより多くの標的化因子を含む場合、個々の標的化因子はお互いと結合体化されてもよいしされなくてもよい。複合体が1つより多くの標的化因子を包含する場合、個々の標的化因子は独立して特異的であっても非特異的であってもよいし、そして独立して脂質もしくはPEG化脂質と結合体化されてもよいし、脂質もしくはPEG化脂質と結合体化されなくてもよい。特異的な標的化因子および非特異的な標的化因子の両方は、標的化される特定の細胞型において増大した細胞のバイオアベイラビリティーを生じるべきである。
【0154】
特定の標的化因子または特定の細胞型に対するリガンドの例は、当該分野で周知である。例えば、Kichlerら((2000)Journal of Liposome Research 10,443−460)およびArapら(Nature Med.(2002)8(2):121−127)は各々、特定の器官または細胞型を標的化するために使用され得る特定のモチーフを記載する。例えば、Arapら、上述は、特定の器官、組織、または細胞型(例えば、骨髄、筋肉、前立腺、脂肪または皮膚)の標的化のために、標的化因子の中に包含され得るペプチド配列を記載する。Kichlerら(上述)は、標的細胞、例えば、肝細胞、マクロファージ、乳癌細胞/膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、肺上皮細胞、Tリンパ球、肺内皮細胞、肺胞マクロファージ、ニューロンおよび繊維芽細胞)に対する種々のリガンドの使用を記載する。標的化因子としての使用のための所定の配列の選択が、標的化される特定の器官、細胞または組織型、および処置もしくは診断される疾患、状態または症候群に依存する場合、当該分野で公知のこれらのリガンド配列および他のリガンド配列を、本明細書中で記載される複合体中の標的化因子として使用され得る。
【0155】
多機能な標的化因子の非限定的な例としては、KKAAAVLLPVLLAAS−ガラクトース(Elan094G)、およびS(ガラクトース)KKAAAVLLPVLLAAP(Gelan094)が挙げられる。あるいは、1つより多い標的化因子は、多機能な標的化活性を有する複合体を生成するように複合体中に含まれ得る。
【0156】
1つの実施形態において、標的化因子は、例えば、約0.01μM〜約50mMの濃度で複合体中に存在し得、例えば、約0.01μM〜約1mM、例えば、約0.01μM〜約500μM、例えば、約5μM〜約200μM、例えば、約10μM〜約100μM(例えば、約100μM)の濃度である。
【0157】
(PEG化される脂質)
PEG部分は、例えば、750〜20,000の分子量のPEG、好ましくは1000〜10,000分子量のPEG、より好ましくはより好ましは2K〜5Kの分子量のPEGからなる群より選択され得る。1つの実施形態において、複合体は、1つより多い型のPEG部分(例えば、PEG分子量5KおよびPEGの分子量2K)を含み得る。このPEG部分はさらに、脂質または標的化因子とのPEGの結合体化を容易にするために、適切な官能基(例えば、メトキシ、N−ヒドロキシルスクシンイミド(NHS)、カルボジイミド、など)を含み得る。例えば、適切な官能基の例については、Harasym,T.O.ら,(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32:99−118の表2を参照のこと。官能化されたPEG部分は、例えばShearwater Polymer Inc.(Huntsville,AL)およびAvanti Polar Lipid Inc.(Alabaster,AL)から購入され得る。好ましい実施形態において、PEG部分は、N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−5k](PEG5k)である。疎水性ポリマーの他の型は、PEG部分を置換され得、例えば、ポロキサマーおよびポロキサミンが挙げられる。例えば、Feldman,L.J.ら,(1997)Gene Therapy 4(3):189−198;Lemieux,P.ら,(2000)Gene Therapy 7(11):986−91;Moghimi,M.ら,(2000)Trends In Biotechnology 18:412−420;Torchilin,V.P.(1998)Journal of Microencapsulation 15(1):1−19;Claesson,P.M.ら,(1996)Colloids & Surfaces A−Physicochemical & Engineering Aspects 112(2):−3,131−139を参照のこと。
【0158】
PEG部分は、任意の適切な脂質(例えば、「PEG化脂質」を形成することが本明細書中で記載される脂質)に結合体化され得る。好ましくは、PEG部分は脂質と共有結合で結合される。好ましい脂質としては、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン(DOPE)、コレステロールおよびセラミドが挙げられる。PEGと結合体化するために利用され得る、極性末端を含む脂質(例えば、DOPE、DPPEおよびDSPEを含むホスファチジルエタノールアミン)は、PEG化脂質の合成を容易にするために好まれる。例えば、適切な官能化した脂質の非限定的な例については、(Harasym,T.O.ら,(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32:99−118)中の表2およびそこに記載される参考文献を参照のこと。好ましい実施形態において、この脂質は、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)またはジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)である。好ましい実施形態において、PEG化脂質は、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−5k](DSPE−PEG5k)またはジミリストイルホスファチジルエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−5k](DSPE−PEG5k)を含む。
【0159】
PEG部分を、当該分野で公知の方法によって脂質と結合体化し得る。例えば、以下を参照のこと:Woodle,M.C.(1998)Adv.Drug Delivery Reviews 32:139−152、およびこれに記載される参考文献;Haselgruber,T.ら,(1995)Bioconjug Chem 6:242−248;Shahinian,S.ら,(1995)Biochim Biophys Acta 1239:157−167;Zalipsky,S.;ら,(1994)FEBS Lett.353:71−74;Zalipsky,S.;ら,(1997)Bioconjug Chem.8(2):111−118;Zalipsky,S.;ら,(1995)Bioconjug Chem.6():705−708;Hansen,C.B.;ら,(1995)Biochim Biophys Acta.1239(2):133−44;Allen,T.M.;ら,(1995)Biochim Biophys Acta 1237(2):99−108;Zalipsky,S.(1995)Bioconjug Chem 6(2):150−65;Zalipsky,S.(1993)Bioconjug Chem 4(4):296−9;そしてStealth Liposomes.(編者:Lasic,D.ら)CRC Press,Boca Raton,FL.,93−102頁のZalipsky,S.(1995)。PEG化脂質はまた、例えば、Shearwater Polymer Inc.(Huntsville,AL)から市販される。
【0160】
脂質以外の化合物(例えば、ペプチド、疎水性アンカーもしくはポリマー、炭水化物、金属または他のイオン)は、本発明の複合体を形成するために、PEGとの結合体化のために使用され得ることが理解され、但し、この化合物はPEGを脂質複合体にアンカーさせ、そしてPEGが脂質複合体の表面上に提示され得る。
【0161】
理論に束縛されることを望まないが、PEGによって提供される荷電遮蔽(shielding)効果は、複合体の循環中の半減期を増強し得る。遮蔽はまた、例えば、インビトロまたはインビボに存在するヌクレアーゼまたは他の種(例えば、ヒアルロン酸(hyuraloic acid)またはポリ(Asp))によって、核酸の分解に対する抵抗性を増加(感受性を減少)し得、そして/あるいは個々の複合体粒子間の相互作用、または複合体の粒子径もしくは複合体粒子の凝集の増加を導き得るインビトロまたはインビボの存在する他の種との相互作用を、低下もしくは防止し得る。従って、好ましい実施形態において、複合体は中性の表面を備える。別の好ましい実施形態において、複合体は荷電遮蔽される。
【0162】
特定の実施形態において、複合体は、その複合体の循環半減期を増加するように遮蔽されるか、または核酸の分解(例えば、ヌクレアーゼによる分解)に対する耐性を増加するように遮蔽される。
【0163】
本明細書中で使用される場合、用語「遮蔽すること」および「遮蔽される」のような同語源語は、本明細書中に記載される複合体の、血清補体との、またはインビボもしくはインビトロで血清中に存在する他の種との非特異的な相互作用を低減させる、「遮蔽部分」の能力をいう。遮蔽部分は、1つ以上の機構を介した、これらの種との複合体相互作用または結合を低下させ得、例えば、非特異的な立体相互作用または非特異的な電気的相互作用を含む。このような相互作用の例としては、非特異的に静電的相互作用、電荷相互作用、ファンデルワールス力の相互作用、立体障害などが挙げられる。遮蔽部分として作用する部分については、この部分が血清補体もしくは他の種との相互作用、会合または結合を低減し得る機構は、同定される必要はない。複合体が血清の種を結合するかどうかを決定するための方法、従ってある部分が遮蔽部分として作用するかどうかを決定するための方法は、当該分野において、そして本明細書中、特に実施例において記載されるように、公知である。例えば、血清中でのインキュベーション後の複合体サイズの測定、または補体のオプソニン作用アッセイである。
【0164】
遮蔽部分として作用する他の部分を、血清補体の結合をブロックするそれらの能力、または血清補体の経路によって同定し得る。例えば、補体の経路のC3Aタンパク質またはC5タンパク質である。ある部分が、血清補体の成分または血清補体の経路の少なくとも1つによっては認識されない(例えば、結合しない)場合、その部分は遮蔽部分として作用するはずである。特定の例において、ある部分がC3Aタンパク質またはC5タンパク質のうちの少なくとも1つと結合または相互作用しない場合、その部分は、血清補体によって結合されないか、または血清補体と相互作用しないはずである。ある部分が血清補体(例えば、タンパク質C3AまたはC5)と結合するかどうか、または相互作用するかどうかを決定するための方法は、当業者に公知である。当該分野において標準的な方法および技術を使用して、このような結合または相互作用を測定し得る。例えば、Ahlら、(1997)Biochemica et Biophysica Acta 1329:370−382を参照のこと。
【0165】
本明細書中に記載される複合体の表面上での、血清補体または他の血清の種とは、結合も、会合も相互作用もしない部分の包含は、複合体の遮蔽を生じる。言い換えると、血清成分によって認識されるか、または血清成分と相互作用する複合体の成分(例えば、脂質)は、その代わりに血清成分(例えば、血清タンパク質(例えば、アルブミン、血清補体)、ホルモン、ビタミン、補因子など)から遮蔽され、従って血清成分に接近可能ではなく、このようにして血清補体を含めたこれらの成分によって結合されず、これらの成分と会合せず、また相互作用もしない。従って、この複合体は「遮蔽される」として記載され得る。遮蔽を提供し得る部分は、「遮蔽部分」と称され得る。
【0166】
上記のような遮蔽はまた、本明細書中に記載されるような補体のオプソニン作用のレベルによって測定され得る。特定の実施形態において、遮蔽部分は補体のオプソニン作用を、約30%、約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、低減し得る。他の実施形態において、遮蔽部分は補体のオプソニン作用を少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、低減させる。
【0167】
「遮蔽部分」が多機能性であり得ることが記されるべきである。例えば、遮蔽部分はまた、例えば、標的化因子として機能し得る。遮蔽部分はまた、これが複合体を遮蔽する機構に関して、多機能性であるといわれ得る。提案される機構または理論によって限定されることは所望しないが、このような多機能性の遮蔽部分の一例は、pH感受性のエピソームの膜破壊性合成ポリマー(例えば、PPAAまたはPEAA)である。特定のポリ(アルキルアクリル酸)は、外側の細胞表面膜をインタクトなままにして、エピソームの膜を破壊することが示されており(Staytonら、(2000)J.Controll.Release 65:203−220;Murphyら,(1999)J.Controll.Release 61:137−143;WO 99/34831)、従って、細胞のバイオアベイラビリティーを増加させ、そして標的化因子として機能する。しかし、実施例に示されるように、PPAAは、これが含まれる複合体との血清補体の結合を低減させ、従って上記のように遮蔽部分として機能する。
【0168】
当業者に理解されるように、遮蔽部分の包含が、細胞へ送達される複合体の能力を排除しないことが重要である。従って、幾つかの実施形態において、遮蔽部分を包含する複合体は、さらに標的化因子を含む。例えば、複合体は、細胞表面レセプターのリガンド(例えば、葉酸塩、RGDペプチド、LHRHペプチドなど)を含み得、この複合体は例えば、脂質またはPEG化脂質と結合体化され得、そしてまた必要に応じてPPAAを含み得る。特定の実施形態において、この脂質−標的化因子の結合体は、DSPE−PEG5k−RGDまたはDSPE−PEG5k−葉酸塩である。
【0169】
他の実施形態において、複合体処方物中に含まれる遮蔽部分の量または比率は、その複合体の、細胞への送達能力を排除しないように制限される。従って、特定の例において、複合体は約15%未満、約12%未満、約10%未満、約8%未満、約7%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、または約2%未満の遮蔽部分を含む。特定の実施形態において、遮蔽部分の量は、約10%、約8%、約5%または約2%である。複合体はまた、1つより多くの遮蔽部分を含み得る。特定の実施形態において、遮蔽部分の量は、少なくとも2%、または少なくとも5%、または少なくとも8%、または少なくとも10%である。
【0170】
特定の実施形態において、遮蔽部分は複合体の別の成分(例えば、脂質またはPEG化脂質)と結合体化され得る。特定の例において、遮蔽部分は、副脂質またはPEG化副脂質と結合体化され得る。他の実施形態において、遮蔽部分は、複合体の全ての他の成分と結合体化されない。
【0171】
特定の実施形態において、複合体は、ポリエチレングリコール(PEG)部分を含む化合物の包含によって、または合成ポリマーの包含によって遮蔽される。本明細書中に記載される複合体の特定の例において、遮蔽複合体は、1つ以上の合成ポリマーを含み得、例えば、膜破壊性合成ポリマー、pH感受性膜破壊性合成ポリマー、pH感受性エピソームの膜破壊性合成ポリマー、またはポリ(アルキルアクリル酸)ポリマーを含む。膜破壊性ポリマーの特定の例としては、ポリ(アルキルアクリル酸)ポリマー、ポリ(エチルアクリル酸)(PEAA)およびポリ(プロピルアクリル酸)(PPAA)が挙げられる。他の適切な合成ポリマー(特に、ポリ(アルキルアクリル酸)ポリマー)は、当該分野で記載されており、そして当業者に公知である。従って、特定の実施形態において、遮蔽部分はpH感受性の膜破壊性合成ポリマー、pH感受性のエピソームの膜破壊性合成ポリマー、またはポリ(アルキルアクリル酸)ポリマーである。他の実施形態において、遮蔽部分はPPAAであり得る。他の実施形態において、遮蔽部分はポリエチレングリコール部分を含む化合物である。
【0172】
複合体を遮蔽することによって、複合体の毒性を減少し得ることもまた、可能である。
【0173】
ペグ化(pegylated)脂質および/または標的化因子−ペグ化脂質結合体および/または標的化因子−脂質結合体は、例えば、全脂質の約0.01〜約30モル百分率、より好ましくは全脂質の約1〜約30モル百分率を包含し得る。ペグ化脂質および/または標的化因子−ペグ化脂質結合体および/または標的化因子−脂質結合体は、例えば、約1〜約20モル百分率、全脂質の約1〜約10モル百分率、約2〜約5モル百分率、全脂質の約1モル百分率、約2モル百分率、約3モル百分率、約4モル百分率、約5モル百分率、約10モル百分率、約15モル百分率、約20モル百分率を含み得る。この複合体は、結合体化された標的化因子を含まないペグ化脂質および標的化因子−ペグ化脂質結合体を含み得る。この複合体はまた、標的化因子−ペグ化脂質結合体および標的化因子−脂質結合体を含み得る。この複合体は、1つを超える標的化因子ペグ化脂質または標的化因子−脂質結合体を含み得る。PEG部分は、複合体中に1つを超えるペグ化脂質が存在する場合、同じかまたは異なり得る。1つの非限定的な例において、標的化因子−ペグ化脂質結合体は、PEG分子量5Kを含み得、そして結合体化した標的化因子を含まないペグ化脂質は、PEG分子量750−2Kを含み得る。この複合体はまた、ペグ化脂質および脂質に結合体化した標的化因子を含み得る。1つの実施形態において、この複合体は、標的化因子−ペグ化脂質結合体および標的化因子−脂質結合体を含む。あるいは、他の実施形態において、この複合体は、脂質またはペグ化脂質に結合体化しない標的化因子を含み、ペグ化脂質を含む。
【0174】
(薬物)
薬物は、例えば、核酸またはタンパク質であり得る。好ましい実施形態において、薬物は核酸である。核酸は、例えば、DNAまたはRNAであり得る。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、直線状または閉環構造状であり得る。好ましい実施形態において、薬物は、治療的有効性を有する遺伝子産物をコードする核酸配列である。別の好ましい実施形態において、薬物は、予防的有効性を有する遺伝子産物をコードする核酸配列である。別の好ましい実施形態において、薬物は、診断的有効性を有する遺伝子産物をコードする核酸配列である。別の好ましい実施形態において、薬物は、標的細胞または疾患組織もしくは疾患細胞において発現される、別の標的mRNAを指向するアンチセンスmRNAをコードする核酸配列である。別の好ましい実施形態において、核酸は、E1A遺伝子を含む。他の好ましい遺伝子としては、例えば、腫瘍抑制タンパク質、抗脈管形成タンパク質、抑制性タンパク質、自殺タンパク質、レポーター遺伝子、標的mRNAに指向するアンチセンスRNA(例えば、チミジンキナーゼ)、サイトカイン(例えば、β−インターフェロン)、他の免疫調節体、抗原、アジュバント、またはそのペプチドフラグメントをコードする遺伝子、および抗原をコードする遺伝子が挙げられる。別の好ましい実施形態において、薬物は、2つ以上の異なるタンパク質をコードする、1つを超える遺伝子を含み得る。
【0175】
診断的有用性を有する複合体の例としては、当該分野で公知の方法によって、定性的または定量的のいずれかで、検出可能なレポータータンパク質を含むタンパク質を発現する遺伝子を含む複合体が挙げられる。そのような方法としては、インビトロ技術、インビボ技術、またはエキソビボ技術が挙げられ得る。例示的なレポータータンパク質(およびこれらをコードする遺伝子)としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ヒト成長ホルモン遺伝子、アルカリ性ホスファターゼ遺伝子、レッド蛍光タンパク質遺伝子、およびグリーン蛍光タンパク質遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。レポーター遺伝子(例えば、ルシフェラーゼ遺伝子)の検出の例は、実施例に記載される。
【0176】
本発明において、好ましい核酸配列は、タンパク質発現を指向し得る核酸配列であることは理解される。このような配列は、脂質および/またはポリカチオンおよび/または標的化因子と混合する前に、慣用的な方法論によって、当業者に公知のプラスミド発現ベクターへ挿入され、本発明の脂質含有薬物送達複合体を形成し得る。目的の核酸が、プラスミド発現ベクター中に含まれる場合、本明細書中に列挙される核酸の量は、目的の核酸を含むプラスミドをいうことが理解される。
【0177】
(ポリカチオン)
本発明の複合体中にポリカチオンが包含されることによって、処方されるべき複合体を高濃度にすることが可能になり、粒子径もまた減少され得る。さらに、核酸をポリカチオンで濃縮することによって、核酸を分解から保護することを補助し得、核酸をその作用部位へと送達することを補助し得る。さらに、複合体は、好ましくはポリカチオンを含む。カチオン性複合体を処方する場合、ポリカチオンの添加が好ましいが、ポリカチオンの添加はオプションである。アニオン性複合体を処方する場合、ポリカチオンの添加は必須である。核酸を含むアニオン性複合体を形成する場合、カチオン性複合体を形成する場合より、核酸由来の負電荷を中和するために、より多くの量のポリカチオンが必要とされることは一般的に理解されるべきである。好ましくは、アニオン性複合体を形成する場合、少なくとも約0.8:1のポリカチオン:核酸、少なくとも約1:1のポリカチオン:核酸、少なくとも約2:1のポリカチオン:核酸、少なくとも約4:1のポリカチオン:核酸、少なくとも約6:1のポリカチオン:核酸、少なくとも約12:1のポリカチオン:核酸、少なくとも約20:1のポリカチオン:核酸、少なくとも約30:1のポリカチオン:核酸の過剰電荷比が形成される。
【0178】
ポリカチオンが核酸および脂質と混合される場合、ポリカチオンは、約300と約200,000との間の分子量を有する有機ポリカチオンから選択され得る。好ましくは、これらのポリカチオンはまた、pH7.0で約3と約1000との間の価数を有する。ポリカチオンは、中性アミノ酸または合成アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ポリアミン、炭水化物および任意の合成カチオン性ポリマーであり得る。ポリカチオンの非限定的な例としては、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミンおよびポリリジン、ポリブレン(ヘキサジメトリン(hexadimethrine)ブロミド)、ヒストン、カチオン性デンドリマー、ポリヒスチジン、スペルミン、スペルミジンおよび過剰の陽電荷を有し、核局在化シグナルを示す、SV40ラージT抗原由来の合成ポリペプチド、合成ポリカチオンならびに無機カチオン(例えば、Ca++イオンのような)が挙げられる。1つの実施形態において、ポリカチオンは、ポリ−L−リジン(PLL)である。好ましい実施形態において、ポリカチオンは、プロタミンでもプロタミン塩でもない。
【0179】
特定の実施形態において、ポリカチオンは、例えば、ポリカチオン性ポリ(アルケニルイミン)(例えば、ポリエチレンイミン)、ポリカチオン性メタクリレートポリマー(例えば、ジメチルアミノメタクリレートを含むポリマーまたはジメチルアミノメタクリレートとメタクリル酸エステルとのコポリマー)、またはポリカチオン性メタクリロキシポリマー(例えば、ポリ(2−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムブロミド)(PMOETMAB))のような合成ポリカチオンであるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ポリカチオン性メタクリレートポリマーは、ジメチルアミノメタクリレートを含むポリマーである。特定の実施形態において、合成ポリカチオンは、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリ(2−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムブロミド)(PMOETMAB)、およびジメチルアミノメタクリレートとメタクリル酸エステルとのコポリマーからなる群から選択される。特定の実施形態において、ジメチルアミノメタクリレートとメタクリル酸エステルとのコポリマーは、約25%のジメチルアミノエチルポリマーおよび残りの割合のメタクリル酸エステルを含む。特定の実施形態において、合成ポリマーは、PEIおよびPMOETMABからなる群から選択される。
【0180】
別のより好ましい実施形態において、ポリカチオンは、アルギニン残基が少なくとも30%のポリペプチドのアミノ酸残基を構成し、リジン残基が5%未満のポリペプチドのアミノ酸残基を構成するアミノ酸組成物を有するポリカチオン性ポリペプチドである。さらに、好ましくは、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンは、合わせて、約45%〜約85%のポリペプチドのアミノ酸残基を構成し、そしてセリン、スレオニンおよびグリシンは、約10%〜約25%のポリペプチドのアミノ酸残基を構成する。より好ましくは、アルギニン残基は、約65%〜約75%のポリペプチドのアミノ酸残基を構成し、リジン残基は、約0%〜約3%のポリペプチドのアミノ酸残基を構成する。
【0181】
上記に列挙されるアルギニン残基およびリジン残基の百分率に加えて、本発明のポリカチオン性ポリペプチドはまた、約20%〜約30%の疎水性残基、より好ましくは約25%の疎水性残基を含み得る。薬物/脂質/ポリカチオン/標的化因子複合体を生成するために使用されるポリカチオン性ポリペプチドは、500アミノ酸長までであり、好ましくは約20〜約100アミノ酸長であり;より好ましくは、約25〜約50アミノ酸長であり;そして最も好ましくは、約25〜約35アミノ酸長であり得る。
【0182】
1つの実施形態において、ポリカチオン性ポリペプチド中に存在するアルギニン残基は、3〜8の連続したアルギニン残基クラスター中に、そしてより好ましくは4〜6の連続したアルギニン残基クラスター中に見出される。
【0183】
別の実施形態において、ポリカチオン性ポリペプチドは、約25〜約35アミノ酸長であり、このポリペプチドの残基の約65〜約70%は、アルギニン残基であり、そしてこのポリペプチドの残基の約0〜約3%は、リジン残基である。
【0184】
本発明の複合体の処方において使用されるポリカチオン性ポリペプチドは、天然に存在するタンパク質として提供され得、特に特定のプロタミンは、化学的に合成されたポリペプチドとして、ポリペプチドをコードする核酸配列から発現される組換えポリペプチドとして、または任意の上記ポリペプチドの塩(そのような塩としては、リン酸塩、塩酸塩および硫酸塩が挙げられるがこれらに限定されない)として、上記に考察されるような高いアルギニン対リジンの比を有する。例えば、米国特許第6,008,202号および同第5,795,587号を参照のこと。
【0185】
1つの実施形態において、薬物(例えば、DNA)は、過剰のポリカチオンと複合体化され得、その結果、正味正に荷電された複合体が生成される。この複合体は、その正電荷の性質によって、負に荷電した脂質と有利に相互作用し得、DNA/脂質/ポリカチオン/標的化因子複合体を形成する。
【0186】
(脂質)
適切なカチオン性脂質種としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:3β[4N−(1N,8N−ジグアニジノスペルミジン)−カルバモイル]コレステロール(BGSC);3β[N,N−ジグアニジノエチル−アミノエタン)−カルバモイル]コレステロール(BGTC);N,N1,N2,N3テトラメチルテトラパルミチルスぺルミン(セルフェクチン);N−t−ブチル−N’−テトラデシル−3−テトラデシル−アミノプロピオン(aminopropion)−アミジン(CLONfectin);ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド(DDAB);1,2−ジミルスチルオキシプロピル−3−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE);2,3−ジオレオイルオキシ−N−[2(スぺルミンカルボキサミド)エチル]−N,N−ジメチル−1−プロパンアミニウムトリフルオロセタート(trifluorocetate)(DOSPA);1,3−ジオレオイルオキシ−2−(6−カルボキシスペルミル)−プロピルアミド(DOSPER);4−(2,3−ビス−パルミトイルオキシ−プロピル)−1−メチル−1H−イミダゾール(DPIM)N,N,N’,N’−テトラメチル−N,N’−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2,3ジオレオイルオキシ−1,4ブタンジアンモニウムヨージド)(Tfx−50);1,2ビス(オレオイルオキシ)−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP);N−1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)もしくは他のN−(N,N−1−ジアルコキシ)−アルキル−N,N,N−三置換アンモニウム界面活性剤;1,2ジオレオイル−3−(4’−トリメチルアンモニオ)ブタノール−sn−グリセロール(DOBT)もしくはコレステリル(4’トリメチルアンモニア)ブタノエート(ChOTB)(ここで、トリメチルアンモニウム基は、ブタノールスペーサーアームを介して、二重鎖(double chain)(DOTBについて)またはコレステリル基(ChOTBについて)のいずれかに結合される);WO93/03709に開示されるようなDORI(DL−1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム)もしくはDORIE(DL−1,2−O−ジオレオイル−3−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム)(DORIE)またはそれらのアナログ;1,2−ジオレオイル−3−スクシニル−sn−グリセロールコリンエステル(DOSC);コレステリルヘミスクシナートエステル(ChOSC);リポポリアミン(例えば、ジオクタデシルアミドグリシルスぺルミン(DOGS)およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)または米国特許第5,283,185号に開示されるカチオン性脂質、コレステリル−3β−カルボキシル−アミド−エチレントリメチル−アンモニウムヨージド、1−ジメチルアミノ−3−トリメチルアンモニオ−DL−2−プロピル−コレステリルカルボキレートヨージド、コレステリル−3 β−カルボキシアミドエチレンアミン、コレステリル−3β−オキシスクシンアミド−エチレントリメチルアンモニウムヨージド、1−ジメチルアミノ−3−トリメチルアンモニオ−DL−2−プロピル−コレステリル−3β−オキシスクシナートヨージド、2−(2−トリメチルアンモニオ)−エチルメチルアミノエチル−コレステリル−3β−オキシスクシナートヨージド、3β−N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)カルバモイルコレステロール(DC−chol)、ならびに3β−N−(ポリエチレンイミン)−カルバモイルコレステロール)。
【0187】
好ましいカチオン性脂質の例としては、N−t−ブチル−N’−テトラデシル3−テトラデシル−アミノプロピオン−アミジン(CLONfectin)、2,3−ジオレオイルオキシ−N[2(スぺルミンカルボキサミド)エチル]−N,N−ジメチル−1−プロパンアミニウムトリフルオロアセタート(DOSPA)、1,2−ビス(オレオイルオキシ)−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン(DOTAP)、N−[1−(2,3,ジオレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド)(DOTMA)、コレステリル−3β−カルボキシアミドエチレントリ−メチルアンモニウムヨージド、1−ジメチルアミノ−3−トリメチルアンモニオ−DL−2−プロピル−コレステリルカルボキレートヨージド、コレステリル−3β−カルボキシアミドエチレンアミン、コレステリル−3β−オキシスクシン−アミドエチレントリメチル−アンモニウムヨージド、1−ジメチルアミノ−3−トリメチルアンモニオ−DL−2−プロピル−コレステリル−3β−オキシスクシナートヨージド、2−(2−トリメチルアンモニオ)エチルメチルアミノエチル−コレステリル−3β−オキシスクシナートヨージド、3βN−(N’,N’ジメチル−アミノエタン)−カルバモイル−コレステロール(DC−chol)、および3βN−(ポリエチレンイミン)−カルバモイルコレステロールが挙げられる。
【0188】
特定の複合体処方物において、カチオン性脂質は、DOTAPである。他の特定の複合体処方物において、カチオン性脂質は、DOTAPであり、複合体は、さらに1つ以上の共脂質(co−lipid)を含む。特定の実施例において、共脂質は、中性またはpH感受性である。いくつかの実施例において、共脂質は、ペグ化され得る。特定の実施形態において、共脂質は、例えば、コレステロール、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジラウリルホスファチジルエタノールアミン(DLPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジフィタノイル(phytanoyl)ホスファチジルエタノールアミン(DPHPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、および1,2−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)から選択された少なくとも1つの脂質である。共脂質は、いくつかの処方物において、中性脂質(例えば、CHOL、DSPEまたはDMPE)であり得る。特定のDOTAP処方物は、1つを超える共脂質(例えば、CHOLまたはDSPE)を含み得、そしてDSPEは、ペグ化されていてもされていなくてもよい。共脂質は、膜破壊性合成ポリマー(例えば、膜破壊性ポリマー、エンドソーム膜破壊性合成ポリマー、またはポリ(アルキルアクリル酸)(例えば、PPAAまたはPEAA))へ結合し得る。
【0189】
特定の例において、複合体が、カチオン性脂質である少なくとも1つの脂質を含み、標的化因子が、膜破壊性合成ポリカチオン(例えば、PPAA、PEAA)である場合、この複合体は、少なくとも1つのさらなる脂質(共脂質または補助脂質)をさらに含む。適切な共脂質の例としては、本明細書中に記載されるさらなるカチオン性脂質または中性脂質が挙げられる。特定の実施例において、共脂質は、中性またはpH感受性である。特定の実施形態において、共脂質は、例えば、コレステロール、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジラウリルホスファチジルエタノールアミン(DLPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、1,2−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン(DPHPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)のような少なくとも1つの脂質である。共脂質は、ペグ化されていてもされていなくてもよく、標的化因子に結合体化されていても、ペグ化された標的化因子脂質結合体であってもよい。特定の例において、共脂質は、DSPEである。
【0190】
いくつかの場合において、使用される好ましい脂質または脂質の組合せは、複合体の投与の経路に依存する。例えば、DOTAP/コレステロールは、血清中で比較的より安定であり、従って、リポソームが静脈投与される場合、好ましい脂質組合せである。DC−Chol/DOPEは、DOTAP/コレステロールより、血清中で比較的より不安定であり、従って、より速い薬物送達速度が好ましい場合、腫瘍内注射または腹腔内注射について好ましくあり得る。静脈送達について、DSPE−PEGを含む複合体が好ましくあり得るのに対して、腫瘍内送達について、DMPE−PEGを含む複合体が好ましくあり得る。
【0191】
当業者は、1つを超えるカチオン性脂質種を包含するリポソームがまた、本発明の複合体を生成するために使用され得ることを容易に理解する。例えば、2つのカチオン性脂質種(リジル−ホスファチジルエタノールアミンおよびβ−アラニルコレステロールエステル)を包含するリポソームが、開示されている(Brunette,E.ら、(1992)Nucl.Acids Res.,20:1151)。
【0192】
本発明の複合体を形成するために使用され得るアニオン性脂質としては、コレステリルヘミスクシナート(CHEMS)、N−グルタリルホスファチジルエタノールアミン(NGPE)、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシチル、カルジオリピン、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−L−セリン](DOPS)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−rac−1−グリセロール](DOPG)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホエタノールアミン−N−ドデカノイル(NC12−DOPE)、およびホスファチジン酸または類似するリン脂質アナログ(例えば、1,2−ジアシル−SN−グリセロ−3−ホスフェート誘導体;ホスファチジルグリセロールおよび1,2−ジアシル−SN−グリセロ−3−[ホスホ−RAC(1−グリセロール)]誘導体);ホスファチジルセリンならびに全ての1,2−ジアシル−SN−グリセロ−3−[ホスホ−L−セリン]誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中に記載される複合体における使用のさらなるアニオン性脂質は、カルジオリピン、テトラオレオイル−カルジオリピンおよびそれらの誘導体;ならびに、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−スクシナートおよび誘導体を含む。好ましい実施形態において、アニオン性脂質は、CHEMSである。別の好ましい実施形態において、アニオン性脂質は、DOPSである。別の好ましい実施形態において、アニオン性脂質は、DOPGである。
【0193】
本発明の複合体を形成するために使用され得る中性脂質としては、リソホスファチジルコリン(1−オレオイルリソホスファチジルコリン)が例であるリソ脂質、コレステロールまたは1,2−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジラウリルホスファチジルエタノールアミン(DLPE)もしくはジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)およびポリエチレングリコール部分を含む種々の脂肪親和性界面活性剤(Tween−80が1つの例である)を含む中性リン脂質が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい中性脂質としては、例えば、コレステロール、DOPE、DSPE、DMPE、DPHPEおよびDLPEが挙げられる。
【0194】
少なくとも1つの脂質は、融合性(fusogenic)脂質であり得る。特定の実施形態において、融合性脂質は、pHがpH約7からpH約4.5へと変化する場合、脂質が電荷または構造において変化し、その結果、より融合性になるという点で特徴付けられる、アニオン性脂質またはpH感受性脂質である。構造または電荷の融合性変化が生じるpHは、エンドソームのpH範囲を含み、このpHは、後期エンドソームpHおよび初期エンドソームpHの両方(例えば、約4.5から6)を含む。そのような脂質は、当業者に周知である。特定の実施形態において、脂質は、1,2−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホエタノールアミン−N−ドデカノイル(NC12−DOPE)、コレステリルヘミスクシナート(CHEMS)、および1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−L−セリン](DOPS)の少なくとも1つである。さらなる融合性アニオン性脂質としては、1,2−ジアシル−SN−グリセロ−3−ホスフェート誘導体;ホスファチジルグリセロールおよび1,2−ジアシル−SN−グリセロ−3−[ホスホ−RAC−(1−グリセロール)]誘導体;ホスファチジルセリンならびに全ての1,2−ジアシル−SN−グリセロ−3−[ホスホ−L−セリン]誘導体が挙げられる。本明細書中に記載される複合体における使用のさらなるアニオン性脂質としては、カルジオリピン、テトラオレオイル−カルジオリピンおよびその誘導体;ならびに1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−スクシナートおよび誘導体が挙げられる。特定の実施形態において、pHが約pH4.5に低下される場合、融合性アニオン性脂質は、電荷の変化を受け、中性またはカチオン性になる。他の実施形態において、融合性pH感受性脂質は、pHが約pH4.5に低下される際に電荷の変化を受け、その結果中性脂質またはアニオン性脂質は、カチオン性または中性になり得る。他の実施形態において、pHが約4.5に低下される場合、脂質は、構造変化を受け、その結果六角柱の構造をとる。
【0195】
融合性脂質はまた、生理学的pH(例えば、約pH7〜約pH8.5)からエンドソームのpH(例えば、約pH4.5〜約pH6.5)へのpH変化の際に、電荷または構造の変化を受ける脂質として記載され、その結果、より融合性になり得る。
【0196】
融合性脂質はまた、円錐形成の分子形態特性を示す脂質として記載され、その結果、脂質骨格は、小さな断面積のヘッドグループ(head group)およびより大きなアシル鎖断面積を含み得る。理論によって束縛されることが求められないが、これらの脂質は、非二分子層六角柱のHII相を誘導すると考えられる(Bioconj.Chem.April 5,2002に対してインターネット上で公開された、Gaucheron,J.ら、「Synthesis and Properties of Novel Tetraalkyl Cationic Lipids」(http://pubs3.acs.org/acs/journals/toc.page?incoden=bcches & indecade= & involume=0 & inissue=0))。これら融合性脂質は、しばしば当該分野で「円錐形成性」脂質と名づけられる。円錐形成性脂質はまた、カチオン性であり得る。
【0197】
生理学的pHでアニオン性であるpH感受性脂質は、アニオン性脂質として分類され得る。同様に、生理学的pHで中性であるpH感受性脂質はまた、中性脂質として分類される。
【0198】
特定の実施形態において、複合体がアニオン性(正味負電荷)の場合、脂質種が、pH感受性脂質を含む、少なくとも1つのアニオン性脂質または中性脂質を含み、この脂質種は、上記のように生理学的pHからエンドソームのpHへと変化する際に電荷または構造の変化を受ける。特定の実施形態において、融合性脂質は、DOPE、DOPS、CHEMSまたはNC12−DOPEである。
【0199】
本明細書に記載される複合体の特定の実施形態が、アニオン性の融合性脂質(例えば、NC12−DOPE)を含むのに対して、他の実施形態において、複合体は、融合性ではないアニオン性の脂質(例えば、DOPG)を含み得る。非融合性アニオン性脂質を含む複合体の特定の実施形態において、複合体は、融合性(融合性部分)である構成成分をさらに含むはずである。そのような融合性部分の例は、特定の標的化因子を含む。当業者が理解するように、細胞膜を横切る薬物(特に、核酸)の輸送を増加する標的化因子は、融合性構成成分と考えられ得、含まれ得る他の融合性因子は、MTLPである。例えば,本明細書に記載される合成ポリマー(例えば、膜破壊性合成ポリマー)は、複合体の融合性能力を増加し得る。従って、特定の実施形態において、脂質が非融合性脂質である場合、複合体は、ポリ(アルキルアクリル酸)をさらに含む。特定の実施形態において、複合体は、pH感受性エンドソーム膜破壊性合成ポリマーをさらに含み得る。
【0200】
複合体の脂質および他の構成成分(例えば、ポリカチオン、標的化因子、遮蔽因子)のさらなる組合せは、当業者に明らかであり、そのような組合せは、特定の複合体の意図される使用によく合う。例えば、複合体がインビトロ、インビボ、またはエキソビボで使用されるかどうか、標的化される特定の細胞型、あるいは複合体が診断的複合体または治療的複合体として機能することが意図されるかどうかを考慮に入れること。
【0201】
本発明の複合体は、正味、正電荷、中性電荷または負電荷を有し得る。好ましい実施形態において、複合体は、正味、正電荷を有する。別の好ましい実施形態において、複合体は、正味、負電荷を有する。
【0202】
本発明の薬物/脂質/標的化因子複合体を生成するために使用されるカチオン性リポソームにおいて(この複合体は、必要に応じてポリカチオンを含み得る)、カチオン性脂質は、リポソーム中に、全リポソーム脂質の約0.1〜約100モル%で、好ましくは約7〜約70モル%で、そして最も好ましくは約20〜約50モル%で存在する。リポソーム中に含まれる場合、中性脂質は、全リポソーム脂質の約0〜約99.9モル%の濃度で、好ましくは約30〜約90モル%で、そして最も好ましくは約50〜約70モル%で存在し得る。負に荷電した脂質は、カチオン性複合体に含まれる場合、全リポソーム脂質の約0.1〜約100モル%で、好ましくは約7〜約70モル%で、そして最も好ましくは約20〜約50モル%で存在し得る。例えば、リポソームは、カチオン性脂質および中性脂質(例えば、DOTAPおよびコレステロールまたはDC−CholおよびDOPE)を含み得る。DOTAP:コレステロールのモル比は、例えば、約1:1〜約5:3の間、例えば、約5:4であり得る。
【0203】
本発明の複合体を形成するために使用されるカチオン性複合体に対する、脂質の比は、コレステロールまたはリソ脂質もしくは中性脂質の混合物と一緒に大部分のカチオン性脂質を含むように変化し得る。選択されたカチオン性脂質が、別の脂質と組合わせられる場合、好ましい脂質としては、コレステロール、DOPE、およびDLPEが挙げられる。1つの実施形態において、カチオン性複合体は、約6.0〜8.0のpHで負に荷電している脂質を含まない。
【0204】
本発明の複合体を生成するために使用される、アニオン性リポソーム、ミセル、または混合されたミセルにおいて、アニオン性脂質は、リポソーム、ミセル、または混合されたミセル中に、全脂質の約0.1〜約100モル%、好ましくは全脂質の約20〜約75モル%、そして最も好ましくは全脂質の約30〜約65モル%で存在する。中性脂質は、リポソーム、ミセル、または混合されたミセル中に、含まれる場合、全脂質の約0〜約99.9モル%、好ましくは全脂質の約25〜約80モル%、そして最も好ましくは全脂質の約35〜約70モル%の濃度で存在し得る。正に荷電した脂質は、アニオン性複合体に含まれる場合、全脂質の約0.1モル%〜約10モル%の範囲にわたる濃度で存在し得る。例えば、リポソーム、ミセル、または混合されたミセルは、アニオン性脂質として例えば、CHEMSまたはDOPS、および中性脂質としてDOPE、コレステロール、またはDLPEのようなアニオン性脂質および中性脂質を含み得る。CHEMS:DOPEまたはDLPEについてのモル濃度比は、例えば、約1:10〜約10:1、例えば、約2:8〜約4:6、例えば、約3:7であり得る。DOPS:コレステロールについてのモル濃度比は、例えば、約25:75〜約85:15、例えば、約50:50〜約60:40、例えば、約55:45であり得る。種々の脂質の比および脂質対ポリカチオン対薬物の比は、好ましい電荷、粒子径、トランスフェクション活性などを達成するために変化し得る。1つの実施形態において、アニオン性複合体は、約6.0〜8.0のpHで正に荷電している脂質を含まない。
【0205】
カチオン性複合体についての脂質:ポリカチオン:核酸比の例としては、例えば、約12nmol:0.1μg:1μg〜約12nmol:10μg:1μg、例えば、約12nmol:1μg:1μg、例えば、約12nmol:0.97μg:1μg、例えば、約12nmol:0.9μg:1μg、例えば、約12nmol:0.6μg:1μgが挙げられ得る。
【0206】
このアニオン性複合体のための、脂質:ポリカチオン:核酸の比の例としては、例えば、おおよそ、50nmol:2μg:1μg〜おおよそ、70nmol:2μg:1μg、例えば、おおよそ、53nmol:2μg:1μg、例えば、おおよそ、65nmol:2μg:1μgが挙げられる。
【0207】
本発明の核酸/脂質/標的化因子複合体(これは、必要に応じてポリカチオンを含み得る)は、処方物によって変動する直径の粒子を生成する。発明の背景で指摘されるように、小さい粒子が、大きい粒子よりも大きなサイズ安定性を示す傾向がある。さらに、小さい粒子は、核酸送達ビヒクルとしての用途のためにより適切であり得る。粒径は、複合体内のこの核酸/脂質/ポリカチオン/標的化因子の比を調整することによって、または、サイズ排除法(例えば、この複合体をフィルターに通過させること)によって、制御され得る。所望の粒径は、さらに、標的化される、細胞型または組織型に依存し得る。例えば、約100〜200nmという粒径は、腫瘍細胞を標的化する為に特に好ましいが、他のサイズもまた、適切であり得ることを理解すべきである。リンパ節を標的化するために、約100nmという粒径は、特に好ましいが、他のサイズもまた、適切であり得ることを理解すべきである。肝臓を標的化するために、約20nmの粒径のより小さい粒子が特に好ましいが、他のサイズも適切であり得ることを理解すべきである。本発明の方法によって生成される複合体の直径は、約20nm〜約500nm、約150nm〜約200nm、約400nm未満、約350nm未満、約300nm未満、約250nm未満、約200nm未満、約150nm未満、約100nm未満であり得る。
【0208】
本発明の方法によって形成される複合体は、例えば、4℃で貯蔵される場合に、好ましくは、約6ヶ月間まで、約1年間まで、少なくとも約1年間まで、安定である。これらの複合体は、スクロース勾配により回収するとき、例えば、10%スクロース、5%デキストロース、または他の適切な緩衝剤(例えば、HEPES)中で貯蔵され得るか、あるいは、これらの複合体が乾燥凍結され得、次いで、使用前に等張性溶液中で再構築され得る。好ましい実施形態において、これらの複合体は、溶液として貯蔵される。アニオン性複合体を貯蔵するための好ましい緩衝液は、HEPES(pH7.2)である。本発明の複合体の電荷は、複合体の液体成分のみでなく、この複合体を形成する溶液のpHによっても影響され得ることをさらに理解すべきである。例えば、pHを高くする(より塩基性とする)ことによって、カチオン性脂質DC−Cholの第3級アミンの正電荷が徐々に中和される。好ましいpHの範囲は、例えば、約pH1〜約pH14であり、約pH2〜約pH9であり得る。1つの実施形態において、カチオン性複合体にとって、このpHは、好ましくは、約pH7である。アニオン性複合体について、好ましいpH範囲は、約pH6.8〜約pH7.4であり、例えば、約7.2である。好ましいpH範囲は、この複合体の脂質組成に依存し、かつ、この好ましいpHが、この複合体の脂質および/または他の成分の不安定性を制限するように選択されることを、当業者はさらに理解する。
【0209】
(結合モデル)
これらの複合体を生成する方法は、2つの相反して荷電したポリマー(例えば、負に荷電した核酸および正に荷電した脂質)の間の結合モデルに基づいており、ここで、大量の不安定な凝集体の形成が、カチオン性リポソームまたはポリカチオンあるいはカチオン性リポソームまたはポリカチオンの形態における過剰量の正電荷を使用することを介して、この薬物の負電荷を中和することによって、回避され得る。
【0210】
正味の正電荷を有する、薬物/脂質/標的化因子の複合体または薬物/脂質/ポリカチオン/標的化因子の複合体を生成するために、薬物に対する脂質の正の電荷過剰、あるいは、薬物に対する、脂質およびポリカチオンの正電荷過剰は、薬物に対する総ての脂質の複合体、または薬物に対する総ての、脂質およびポリカチオンの、複合体における正電荷の約30倍までの電荷過剰であり得、好ましくは、約2〜10倍の電荷過剰であり得、そして、最も好ましくは、約2〜6倍の電荷過剰であり得る。カチオン性複合体は、好ましくは、約20〜50mVのζ(ゼータ)電位を有している。その表面に正電荷を保持している複合体は、薬物に対して、表面電荷過剰における類似の好ましい範囲を有し得る。例えば、核酸に対する脂質の正電荷過剰を有している、核酸/脂質複合体を生成するために、pH6.0〜8.0にて核酸に対する脂質の過剰な正電荷を有する核酸/脂質複合体を生成するための、1μgの核酸と混合されるカチオン性リポソーム脂質のモル量は、カチオン性リポソームの正電荷含有量に依存して、0.1nmol〜約200nmolの脂質であり得、好ましくは、約5nmol〜約100nmolの脂質の範囲であり得る。当然のこととして、この薬物がタンパク質である場合、1μgの負に荷電したタンパク質と混合され得る脂質の量は、1μgのDNAと混合される脂質の量よりも少なくとも10分の1であり、上述のように、これは、タンパク質は核酸よりも低い電荷密度を有しているからである。当業者は、カチオン性リポソームの正の電荷含有量に依存して、様々なカチオン性リポソームの様々なモル量が、薬物に対する脂質の正の電荷過剰を生じるために等量の薬物と混合される必要があることを容易に理解する。
【0211】
正味の正電荷および/または正に荷電した表面を有する、薬物/脂質/ポリカチオン/標的化因子複合体が生成されなければならない場合、ポリカチオンの封入によって、この脂質による正電荷が、この薬物による負の電荷よりも小さくなる程度までこの薬物と混合されなければならない脂質の量が、低減され得る。脂質量の低減によって、ポリカチオン含有処方物の毒性が低減される。核酸/脂質/ポリカチオン/標的化因子複合体を処方するときに使用されるべきカチオン性リポソームのモル量は、カチオン性リポソームの正電荷含有量に依存して、1μgの核酸につき、約0.1nmol〜約200nmolの脂質、好ましくは、1μgの核酸につき、約1〜約25nmol脂質の範囲である。核酸/脂質/ポリカチオン/標的化因子複合体を処方するときに使用されるべきアニオン性リポソームのモル量は、アニオン性リポソームの負電荷含有量に依存して、1μgの核酸につき、約0.1nmol〜約150nmolの脂質、より好ましくは、1μgの核酸につき、約50〜約150nmol脂質の範囲であり得る。本発明の、核酸/脂質/標的化因子複合体および核酸/脂質/ポリカチオン/標的化因子複合体を生成するときに、これらの複合体を生成するために必要とされるリポソームのモル量は、これらのリポソームと混合される核酸の濃度が増大するにつれて、増大することが一般的に理解される。脂質、核酸、およびポリカチオンの量が、標的化因子の電荷および濃度に依存して変動され得ることがさらに理解される。
【0212】
本発明の複合体が精製されたときに、混合直前の薬物に対するカチオン性リポソームの正電荷過剰、またはその薬物に対する、カチオン性リポソームおよびポリカチオンの正電荷過剰は、精製された複合体の正電荷過剰よりも大きく、これは、この精製工程によって、過剰な、遊離脂質および/または遊離ポリカチオンおよび/または遊離標的化因子の除去が得られるためであることを、当業者は容易に理解する。類似の効果が、アニオン性複合体についての観測され得る。
【0213】
いかにして、カチオン性脂質、薬物、およびポリカチオンに寄与する電荷が、pH6.0〜8.0で決定される得るかを例示するために、以下の実施例が提供される。送達されるべき薬物がDNAである場合、混合されるDNAの量または複合体中のDNAの量を単一のヌクレオチドの分子量である330で除算(ここで、1ヌクレオチドは、1負電荷に匹敵する)して、送達されるDNAの負電荷を決定する。従って、1μgのDNAについての負電荷は、3.3nmolである。
【0214】
10nmolのDC−Chol/DOPE(2:3)リポソームに関して、総リポソーム脂質の量(10nmol)に0.4(40%の総リポソーム脂質がカチオン性脂質DC−Cholである)を乗算して、このリポソーム中の4nmolのDC−Chol脂質を得ることによって、脂質の有効電荷を計算する。pH6〜8で、DC−Cholの1分子が1個の正電荷を有するので、混合した時点におけるリポソーム脂質の、またはその複合体における、有効正電荷が、4.0nmolである。当然のこととして、他のカチオン性脂質がpH6〜pH8.0におけるカチオン性脂質の1分子当たりの、DC−Cholとは異なる量の正電荷を有し得ることを、当業者は容易に理解する。
【0215】
この複合体を形成するために混合されるポリカチオンがポリL−リジン(PLL)の臭化物塩であるとすると、混合されるPLLの量を、1個のリジル残基の分子量である207で除算する(ここで、1リジル残基は1電荷に匹敵する)ことによって、混合したときのPLLの正電荷が得られる。したがって、1μgのPLLについての正電荷は、約5.0nmolである。形成された複合体におけるリジル残基により寄与を受ける正電荷を計算するために、(存在する場合は)対イオンの重量を考慮して1個のリジン残基の分子量でこの複合体に存在するリジンの量を除算する。
【0216】
適切な分析技術の利用(例えば、各成分の放射線同位体標識の使用)によるか、または元素分析により、この複合体における、DNA、脂質、標的化因子、およびポリカチオン(存在する場合)の量を測定することによって、この複合体の正味の電荷は決定され得ることが理解される。一旦、所定のpHにおける、複合体中の、各成分(DNA、脂質、標的化因子、およびポリカチオン(存在する場合))の量が既知となると、既知であるかまたは分析的に決定し得る成分のpKを考慮して所望のpHにおけるその複合体のおおよその正味の電荷を計算し得る。
【0217】
あるいは、正味の負電荷または負に荷電した表面を有する複合体は、少なくとも0.8倍の正電荷過剰でポリカチオンを核酸に混合すること(すなわち、負の電荷を有する、ポリカチオン/核酸複合体を得ること)によって、生成され得る。好ましくは、核酸に対するポリカチオンは、少なくとも1倍の正電荷過剰(すなわち、中性の電荷を有する、ポリカチオン/核酸複合体を生じる)、少なくとも2倍の正電荷過剰、少なくとも4倍の正電荷過剰、少なくとも6倍の正電荷過剰、少なくとも12倍の正電荷過剰、少なくとも20倍の正電荷過剰、少なくとも30倍の正電荷過剰で、混合される。アニオン性リポソーム、ミセル、または混合物ミセルは、その後、ポリカチオン/核酸と混合され得、少なくとも1倍の負電荷過剰(すなわち、中性電荷を有する、脂質/ポリカチオン/核酸複合体を生じる)で、少なくとも2倍の負電荷過剰、少なくとも5倍の負電荷過剰、少なくとも10倍の負電荷過剰で混合され得る。より好ましくは、ポリカチオン・核酸に対する脂質は、約3倍〜約7倍の電化過剰で混合され得、さらに好ましくは、少なくとも4倍の正電荷過剰、または少なくとも6倍の正電荷過剰で、混合され得る。これらの範囲は、この複合体における標的化因子の、濃度および電荷に従って、調節され得る。形成されたアニオン性複合体は、好ましくは、約−20mV〜約−50mVのζ電位を有する。負電荷をそれらの表面に保持する複合体は、薬物に対して類似の好ましい範囲の表面電荷過剰を有し得る。当業者は、アニオン性脂質の負電荷含有量に依存して、様々なアニオン性リポソームの様々なモル量が、負電荷過剰を生じるために等量の薬物/ポリカチオン/標的化因子と混合される必要があることを理解する。
【0218】
(薬物送達複合体の製造方法)
本明細書中に記載の複合体を製造する方法が提供され、この方法は、薬物、脂質、必要に応じてポリカチオン、ならびに標的化因子を併せてこの複合体を形成する工程を包含する。
【0219】
これらの複合体は、例えば、リポソーム/ポリカチオン/標的化因子の溶液に核酸をゆっくりと添加する工程、ならびに混合する工程によって製造され得、ここで、この混合工程は、DNAを添加した直後に進められる。このリポソーム/ポリカチオン/標的化因子混合物が、この核酸が第2の入口からチャンバに添加されると同時に、第1の入口から単一のチャンバに添加され得る。これらの成分は、次いで、チャンバ内の機械的手段によって同時に混合される。これらの複合体を製造する好ましい方法は、まずはじめに、そのポリカチオンと核酸とを混合し、次いで、脂質/標的化因子化因子懸濁物添加する工程を包含する。これらの複合体を生成する別の好ましい方法は、まずはじめに、そのポリカチオンと核酸とを混合し、次いで、脂質懸濁物を添加し、そして、標的化因子懸濁物を続いて添加する工程を包含する。本明細書中で記載の方法は、標的化因子が存在しない場合、またはポリカチオンが存在しない場合にこれらの処方物を適用させるように改変され得る。同様に、これらの方法はまた、1より多くの標的化因子または脂質またはコリピド(co−lipid)が存在する場合、あるいは遮蔽因子が含まれる場合に、適応する。
【0220】
上記に説明される方法の特定の実施形態において、核酸およびポリカチオンが混合され、その後、少なくとも1つの脂質および少なくとも1つの脂肪親和性界面活性剤を含む水溶性ミセル混合物が、コンパクトな核酸/ポリカチオン混合物と混合される。次いで、得られた混合物は、この脂肪親和性界面活性剤を取り除く為に処理され、リポソームを生じる。この方法の具体的なバリエーションにおいて、この脂肪親和性界面活性剤は、透析によって取り除かれる。脂質混合物を透析する方法は、当該分野において周知である。
【0221】
特定実施形態において、コンパクトな核酸および少なくとも1種の融合性(fusogenic)である脂質を含む、脂質−核酸複合体を調製する方法が提供され、この方法は、以下を包含する:
a)核酸を含む核酸混合物と、脂質および少なくとも1つの脂肪親和性界面活性剤を含む水溶性ミセル混合物を混ぜる工程であって、ここで、この脂質が、融合性因子特性を有するかまたは、それを仮定し、そして、ここで、この混合物のうちの少なくとも1つは、核酸をコンパクトにする成分を含む、工程;および
b)混ぜる工程の後に、a)により得られた混合物から脂肪親和性界面活性剤を取り除く工程。
【0222】
上述の方法の特定の実施形態において,この方法は、さらに、少なくとも1つの標的化因子を、工程a)から得られた少なくとも1つの混合物中に含む。
【0223】
上述の方法、または「ミセル−脂質親和性界面活性剤法」はまた、脂質種がカチオン性である場合、このポリカチオンを含むことがあっても、なくても実施され得る。この脂質種が生理学的pHにおいてアニオン性である場合、ポリカチオンの封入が必要とされ、そして、ミセル−脂肪親和性界面活性剤法の使用は、再生可能な複合体の製造にとって重要である。しかし、この方法は、このミセル脂質親和性界面活性剤法を使用して行われた実施例における結果によって示されるように、pHに敏感な、融合性かつカチオン性である脂質を含む複合体について再生可能な複合体を同様に生成する。
【0224】
ミセル脂肪親和性界面活性剤法の特定の実施形態において、この脂肪親和性界面活性剤は、N−オクチル−B−D−グルコピラノシド(OGP)である。他の実施形態において、この脂肪親和性界面活性剤は、非イオン性の界面活性剤(例えば、OPG、Triton(登録商標)X−100、Tween20、Tween40、Tween80、NP−40および当該分野で公知の他のもの)であり得るが、これらに限定されない。脂肪親和性界面活性剤の除去の範囲は、少なくとも90%であり、少なくとも92%であり、少なくとも95%である。
【0225】
上述の方法はまた、遮蔽(シールド)部分の取り込みを含むため、当業者が理解するように、改変され得る。この遮蔽部分は、ミセル混合物またはDNA混合物のいずれかに含まれ得る。
【0226】
本発明の脂質含有薬物送達複合体の製造において使用されるリポソームおよび混合ミセルを製造するための方法は、当業者に知られている。リポソーム調製の方法論の概説は、Liposome Technology(CFC Press NY 1984);OstroによるLiposomes(Marcel Dekker,1987);Methods Biochem Anal.33:337〜462(1998)および米国特許第5,283,185号に見出され得る。このような方法は、凍結融解押し出し成形および超音波処理を含む。単層リポソーム(平均直径200nm未満)および多層リポソーム(平均直径300nmを超える)は、出発成分として使用され得、本発明の複合体を生成し得る。
【0227】
本発明はさらに、これらの複合体を生成するための方法に関連し、ここでこの方法は、これらの処方物を過剰の個々の成分から精製する工程を必要に応じて包含し得る。本発明の複合体を製造する為に、この精製工程の取り込みは好ましい実施形態である。
【0228】
過剰の、遊離DNA、遊離脂質、遊離標的化因子、および/または遊離ポリカチオンからこの複合体を精製することが所望される場合、精製は、スクロース密度勾配または密度勾配を形成するのに適切な他の媒体を介する遠心分離によって達成され得る。しかし、他の精製方法(例えば、クロマトグラフィー、濾過、相分離、沈澱、または吸着)が使用され得ることが理解される。精製方法としては、例えば、スクロース密度勾配を介した遠心分離が使用される精製、または、サイズ排除カラム(例えば、Sepharose CL4Bカラム(Sigma,St Lous,MO))を介する精製が挙げられる。このスクロース勾配は、約0%スクロース〜約60%スクロース、好ましくは、約5%スクロース〜約30%スクロースの範囲に及び得る。このスクロース勾配が使用される緩衝液は、この複合体を含有する画分の貯蔵のために適切な任意の水溶性緩衝液であり得、そして、好ましくは、上述されたような細胞および組織に対して複合体を投与するために適切な緩衝液であり得る。好ましい緩衝液としては、5%デキストロースおよびpH6.8〜7.4 HEPESが挙げられ得る。
【0229】
本発明の薬物送達複合体を製造するのに適切なさらなる方法は、例えば、以下を含む(これらは、全体が参考として援用される):米国特許第5,554,382号;同5,776,486号;同5,795,587号;同6,008,202号;欧州特許番号703,778号;”Liposomes and Vesicles:Fundamentals and Applications”と題するシンポジウム(AIChE Annual Meeting,San Francisco,CA,1994年11月13日〜18日)で提示された、Castor,T.P.:”Supercritical Fluid Liposome Formulations”;第12回熱力学的特性シンポジウム(Boulder,CO,1994年6月19日〜24日)で提示された、Chu,LおよびCastor,T.P.:”Solubility of Phospholipids in Supercritical Fluids”、ならびに、Castor,T.P.:”An Improved Liposome Manufacturing Process”,NSF Phase I SBIR Report on Grant No.ISTI8961217(1990年12月)。
【0230】
(薬物送達複合体の投与方法)
本発明の複合体は、細胞とこの複合体とを接触することによって、薬物を細胞に送達する為に使用され得る。好ましい実施形態において、本発明の複合体は、遺伝子治療法のベクターとしてインビボで使用され得る。あるいは、これらの細胞は、インビトロまたはエキソビボでこの複合体と接触され得る。これらの複合体は、疾患、病状、または症候群を処置、診断または予防する為に使用され得、これらの疾患、病状、または症候群の非限定的な例としては、癌、細菌感染、ウイルス感染(これらは、例えば、DNAワクチンを用いて処置、診断または予防される)、寄生生物感染、免疫不全、遺伝子欠失(例えば、第VIII因子、また第Xa因子を投与することによって処置、診断または予防される)ならびに遺伝子欠失(例えば、遺伝性遺伝疾患)が挙げられる。
【0231】
これらの細胞は、インビボでこの複合体と接触され得、この方法は、この薬物をヒトまたは哺乳動物の細胞に送達するのに有効量で動物またヒトにこの複合体を投与する工程を包含する。個体に投与される薬物の量は、個体の型、処置される病状、使用される具体的な薬物、患者の健康状態などに依存する。例えば、核酸を投与するときに、核酸の濃度は、例えば、約1μg/ml〜約5mg/ml、約150μg/ml〜約500μg/ml、約200μg/ml、約150μg/ml、約125μg/ml、少なくとも約150μg/ml、少なくとも約200μg/mlの範囲にあり得る。1回の投薬におけるマウスに投与される核酸の総量は、例えば、約20μg〜約300μgであり、例えば、おおよそ100μgであり得る。1回の投薬におけるヒトに投与される核酸の総量は、例えば、約1.32mg〜約19.8mgであり、例えば、おおよそ6.6mgであり得る。
【0232】
これらの細胞はまた、エキソビボでこの複合体と接触され得、動物またはヒトから回収された細胞を使用する。この方法は、薬物細胞に送達するのに有効な量でエキソビボにてこの複合体を細胞に加える工程を包含する。エキソビボにて細胞に投与される薬物の量は、細胞型、細胞量、処置される病状、使用される具体的な薬物、細胞が再投与される患者の健康状態などに依存する。例えば、核酸を投与するときに、核酸の濃度は、例えば、約1μg/ml〜約5mg/ml、約150μg/ml〜約500μg/ml、約200μg/ml、約150μg/ml、約125μg/ml、少なくとも約150μg/ml、少なくとも約200μg/mlの範囲にあり得る。1回の投薬におけるマウスに投与される核酸の総量は、例えば、約20μg〜約300μgであり、例えば、おおよそ100μgであり得る。1回の投薬におけるヒト細胞に投与される核酸の総量は、例えば、約1.32mg〜約19.8mgであり、例えば、おおよそ6.6mgであり得る。
【0233】
この複合体は、例えば、経口的に、皮下的に、経鼻的に、腫瘍内に、静脈内に、気管内に、腹腔内に、頭蓋内に、表皮内に、筋肉内に、または髄液に注入することにより、投与され得る。好ましい実施形態において、この複合体は、静脈内、例えば、門脈に投与され得る。この複合体は、例えば、エアロゾル、液体溶液、乾燥粉末、またはゲルで投与され得る。
【0234】
インビボで投与される場合、この複合体は、好ましくは、低レベルの炎症性サイトカイン(例えば、TNFα)を含む。これらの複合体は、炎症応答の低減をさらに誘発する。本発明の複合体は、マウスの静脈内に投与されると、注射後2時間の血漿レベルは好ましくは、送達されたDNA当たり約2000pg TNFα/ml血漿/μg未満であり、より好ましくは、送達されたDNA当たり約1000pg TNFα/ml血漿/μg未満、より好ましくは、送達されたDNA当たり約500pg TNFα/ml血漿/μg未満、より好ましくは、送達されたDNA当たり約200pg TNFα/ml血漿/μg未満、より好ましくは、送達されたDNA当たり約100pg TNFα/ml血漿/μg未満、送達されたDNA当たり約50pg TNFα/ml血漿/μg未満、さらにうより好ましくは、送達されたDNA当たり約20pg TNFα/ml血漿/μg未満である。
【0235】
本明細書中で言及した、全ての文書、特許出願、または特許は、本明細書中で参考として全体が援用される。
【0236】
以下の実施例は、本発明の種々の局面を例示するが、これらは、その請求の範囲を限定することは決してないことが意図される。
【実施例】
【0237】
(標的化因子ペグ化(Pegylated)脂質結合体)
黄体化ホルモン放出ホルモン(LHRH)および1つのアルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)モチーフを含む11アミノ酸ペプチドを、標的化因子ペグ化脂質結合体を含む複合体を試験する為のリガンドモデルとして選択した。このリガンド選択は、これらのレセプターおよびこれらの小さなサイズに対するこれらの特異的に基づく。これらのリガンドは、DSPE−PEG5k脂質アンカー(Shearwater Polymer,Inc.,Huntsville,AL)に結合し、そして、以下に記載されるように、1〜20モルパーセント脂質濃度の範囲にある様々な濃度で脂質:硫酸プロタミン:DNA(LPD)処方物および透析した脂質:硫酸プロタミン:DNA(DLPD)処方物に組み込んだ。
【0238】
DSPE−PEG5k−スクシニル−ACDCRGDCFCG−COOH(DSPE−PEG5k−RGD)およびpyrGLU−HWSYDK(εNH−スクシニル−PEG5k−DSPE)LRPG−COOHNH2(DSPE−PEG5k−LHRH)を、Integrated Biomolecules(Tucson,AZ)から入手した。
【0239】
(膜移行ペプチドの合成)
以下の膜移行ペプチドを、fmoc化学合成法を使用するAnaspec(San Jose,CA)によって合成した。適切なfmoc化学合成法は、上述した。大文字の文字は、L−アミノ酸を示し、そして小文字のD−アミノ酸を示す。
ZElan094:H2N−KKKAAAVLLPVLLAAP
ZElan207:H2N−kkkaavllpvllaap
ZElan094R:H2N−KKKAAAVLLPVLLAAPREDL
(膜移行ペプチド−ガラクトース結合体の合成)
以下の2つの膜移行ペプチド−ガラクトース結合体を、以下のようにIntegrated Biomolecules Corporation(Tucson,AZ)によって合成した:
Elan094G:des−Pro−KKAAAVLLPVLLAAS−ガラクトース(式量:1660)
Gelan094:S(ガラクトース)KKAAAVLLPVLLAAP(式量:1757)。
【0240】
Elan094−ガラクトース(Elan094G)結合体を、超酸不安定Wang型樹脂を使用する固相Fmoc化学法により合成した。Fmoc−セリン(テトラ−アセチル−ガラクトース)をDMAPおよびDlPCDlを使用してカップリングした。カップリングされていない部位を無水酢酸を用いてキャップした。その後の鎖伸長を、Fmocアミノ酸カップリングによる通常のサイクルによって実施した。二重カップリングを、カップリング効率が97%を下回って観察された場合に実施した。リジン残基に対する側鎖の保護は、酸性条件下、すなわち、ヒドラジンハイドレートを使用することなしに直交して切断され得るDdeを使用した。同一条件によって、炭水化物部分から同時にアセテート保護を取り除いた。脱保護ペプチドを、ジメチルホルムアミドおよびメタノールを大量に用いて洗浄し、全ての脱保護夾雑物を取り除く。このペプチドの最終的な切断を、ジクロロメタン中の2%TFAを用いて実施して、ピペラジン中ですぐに中和する。生成物を、C18固相支持体におけるHPLCによる精製の前に、溶媒蒸発法により単離する。
【0241】
ガラクトース−Elan094(GalElan094)結合体を、プロリンを予めロードした超酸不安定Wang型樹脂を使用して固相Fmoc化学法により合成する。
次の中間体2アミノ酸(Ala−Ala)を、保護化したジペプチド単位(Fmoc−Ala−Ala)として結合して、ジケトピペラジン形成によるプロリンの除去を防ぐ。その後の鎖伸長を、Fmocアミノ酸カップリングによる通常のサイクルによって実施する。二重カップリングを、カップリング効率が97%を下回って観察された場合に実施した。Fmoc−セリン(テトラ−アセチル−ガラクトース)を、理論的なペプチド置換よりもわずか多くPyBOPを使用してカップリングした。リジン残基に対する側鎖の保護は、酸性条件下、すなわち、ヒドラジンハイドレートを使用することなしに直交して切断され得るDdeを使用した。同一条件によって、炭水化物部分から同時にアセテート保護を取り除いた。樹脂結合脱保護ペプチドを、ジメチルホルムアミドおよびメタノールを大量に用いて洗浄し、全ての脱保護夾雑物を取り除く。このペプチドの最終的な切断を、ジクロロメタン中の2%TFAを用いて実施して、ピペラジン中ですぐに中和する。生成物を、C18固相支持体におけるHPLCよる精製の前に、溶媒蒸発法により単離する。
【0242】
(膜移行配列−脂質結合体の合成)
以下の3つの脂質−MTLP結合体は、Integrated Biomolecule Corporationによって以下に用に合成した。:
Elan218:コレステリル(cholosteryl)−スクシニル−KKAAAVLLPVLLAAP(式量:1943.5)
Elan219:DOPE−スクシニル−KKAAAVLLPVLLAAP(式量:2299.4)
全てのd−Elan218:コレステリル−スクシニル−kkaaavllpvllaap(式量:1943.5)
Elan218結合体を、プロリンを予めロードした超酸不安定Wang型樹脂を使用して固相Fmoc化学法により合成する。次の中間体2アミノ酸(Ala−Ala)を保護化したジペプチド単位(Fmoc−Ala−Ala)として結合して、ジケトピペラジン形成によるプロリンの除去を防ぐ。その後の鎖伸長を、Fmocアミノ酸カップリングによる通常のサイクルによって実施した。二重カップリングを、カップリング効率が97%を下回って観察された場合に実施した。コレステリル−(C3)−ヘミスクシネートを、理論的なペプチド置換よりもわずか多くPyBOPを使用してカップリングした。リジン残基に対する側鎖の保護は、酸性条件下、すなわち、ヒドラジンハイドレートを使用することなしに直交して切断され得るDdeを使用した。脱保護ペプチドを、蒸留水(DW)およびメタノールを大量に用いて洗浄し、全ての脱保護夾雑物を取り除く。このペプチドの最終的な切断を、ジクロロメタン中の2%TFAを用いて実施して、ピペラジン中ですぐに中和する。生成物を、C4固相支持体でのHPLCによる精製の前に、溶媒蒸発法およびメタノール中での再懸濁により単離する。
【0243】
Elan219結合体を、プロリンを予めロードした超酸不安定Wang型樹脂を使用して固相Fmoc化学法により合成する。次の中間体2アミノ酸(Ala−Ala)を保護化したジペプチド単位(Fmoc−Ala−Ala)として結合して、ジケトピペラジン形成によるプロリンの除去を防ぐ。その後の鎖伸長を、Fmocアミノ酸カップリングによる通常のサイクルによって実施した。二重カップリングを、カップリング効率が97%を下回って観察された場合に実施した。DOPE−スクシネートを、理論的なペプチド置換よりもわずか多くPyBOPを使用してカップリングした。リジン残基に対する側鎖の保護は、酸性条件下、すなわち、ヒドラジンハイドレートを使用することなしに直交して切断され得るDdeを使用した。脱保護ペプチドを、DMFおよびメタノールを大量に用いて洗浄し、全ての脱保護夾雑物を取り除く。このペプチドの最終的な切断を、ジクロロメタン中の2%TFAを用いて実施して、ピペラジン中ですぐに中和する。生成物を、C4固相支持体でのHPLCによる精製の前に、溶媒蒸発法およびメタノール中への再懸濁により単離する。
【0244】
全てのD−Elan218結合体:この全てのD−アミノ酸結合体を、Wang型樹脂を使用して、固体相F−moc化学によって合成する。Fmoc−D−プロリンをDMAPおよびDIPCDIを用いて結合する。非結合部位を、無水酢酸でキャップする。次に、ジケトピペリジン形成を介するプロリンの除去を防ぐために、保護したジペプチド単位(Fmoc−D−Ala−D−Ala)として、2つのアミノ酸(D−Ala−D−Ala)をすぐに結合する。Fmoc−D−Ala−D−Alaを、溶液相化学によって合成し、精製し、そして固体相合成系への組み込みの前に、特徴付ける。保護したジペプチド単位(Fmoc−D−Ala−D−Ala)の結合を、理論的なペプチド置換をわずかに超えるだけのPyBOPで実行する。後の鎖伸長は、Fmocアミノ酸結合の正常なサイクルを経由する。結合効率が97%以下で観察される場合、二重結合が起こった。ペプチドの最後の切断は、2.5%TISおよび2.5%H2Oと共に95%TFAで実行された。産物を溶媒エバポレーション、t−ブチルエーテルでの沈殿による粗精製によって単離する。最終の精製を、C18固体支持体上でHPLCにより実行した。
【0245】
(カチオン性複合体についての方法および材料)
(カチオン性リポソーム複合体の調製)
リポソームを以下の通り調製した:クロロホルム中、20mg/mlの6000nmolの1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン(DOTAP)(Avanti Polar Lipid Inc.,Alabaster,AL)およびクロロホルム中、20mg/mlの6000nmolコレステロール(Avanti Polar Lipid Inc.,Alabaster,AL)をまた調製し(J.T.Baker,Phillipsburg NJ)、ホウケイ酸チューブ内で混合させ、そしてN−EVAPTM(Organomation,Berlin,MA)を用いて、1分あたり(LPM)4リットルの窒素下で1時間乾燥させた。得られた脂質フィルムを、2mlの5% USPデキストロース(Abbott Laboratories,North Chicago,IL)に水和して6mMの最終脂質濃度を達成した。多重膜ビヒクル(MLVs)を、超音波槽(Laboratory Supplies Co,Inc,Hicksville,NY)を用いて30秒間、超音波処理して生成した。得られた脂質ビヒクルを一定のサイズに作り、そしてこれは、代表的に、Coulter Sizer N4Plus(Beckman Coulter,Miami,FL)を用いて、単様式において決定されるように300〜500nmの直径を有した。
【0246】
10mol%のペグ化脂質を含むリポソームのために、6000nmol DOTAP、4800nmolコレステロールおよび1200nmolの1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(phosphotidylethanolamine)−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−5k](DSPE−PEG5k)(Shearwater Polymer,Inc.,Huntsville,AL)を、上記の通り調製した。代表的に、10mol%標的化因子−ペグ化脂質結合体または標的化因子−脂質結合体を含む標的化リポソームを、6000nmol DOTAP、4800nmolコレステロールおよびDSPE−PEG5k−スクシニル−ACDCRGDCFCG−COOH(DSPE−PEG5K−RGD)、pyrGLU−HWSYDK(εNH−スクシニル−PEG5K−DSPE)LRPG−COOHNH2(DSPE−PEG5K−LHRH)、コレステリル−スクシニル−KKAAAVLLPVLLAAP、DOPE−スクシニル−KKAAALLPVLLAAP、またはコレステリル−スクシニル−kkaaavllpvllaapのいずれかの1200nmolを用いて調製した。標的化因子−ペグ化脂質結合体または標的化因子−脂質結合体のmol%を、コレステロールのmol%の50〜30%範囲に対応して、0〜20%に変動させた。標的化因子−ペグ化脂質結合体を、Integrated Biomolecule Corporation(Tucson, AZ)によって合成した。要するに、リポソームを標的化するために、DOTAP、コレステロールおよびDSPE−PEG5k−RGDまたはDSPE−PEG5K−LHRHおよび/もしくはMTLP−脂質を20 mg/mlにてクロロホルムに可溶化し、そして上記の通り、窒素下でエバポレートした。次いで、脂質フィルムを、メタノール:ジクロロメタン1:1(メタノール、VWR製,West Chester,PAおよびジクロロメタンEM Science製,Gibbstown,NJ)中に再溶解し、5%デキストロースUSPでの水和の前に、窒素下で再エバポレートし、その後、DOTAP:コレステロールリポソームについて上記の通り処理した。
【0247】
(DNA−プロタミン複合体の調製)
CMVプロモーター制御下にホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpCMVinLUCを、以下の通り構築した:ルシフェラーゼ遺伝子を、pGL3−ベーシックベクター(Promega,Madison,WI,Genebank登録番号;U47295)から、1982塩基対のSma I〜Sal I制限フラグメントとして取り出した。同様に、ベクター骨格およびCMVプロモーター/SV−40イントロン配列を含むpUCCMVb(Clontech,Palo Alto,CA,GeneBank登録番号;U02451)のSal I〜Sma I制限フラグメント(3482bp)を取り出し、そしてこれらの2つのSma I〜Sal Iフラグメントを一緒に連結した。得られた5464 bpのプラスミドpCMVinLUCを、標準的な分子技術(Sambrook et al.,1989)によって単離し、Althea Technologies(San Diego, CA)によって精製した。
【0248】
プラスミドDNA pCMVinLUCを、硫酸プロタミンUSP(Elkins−Sinn,Cherry Hill,NJ)と、記載されるように1:1、1:0.9、1:0.97の質量比で、Orion SageTMシリンジ混合デバイス(VWR,West Chester,PA)を用いて(20mlシリンジを用いて25ml/分の流速で)混合した。要するに、DNAおよび硫酸プロタミンを、別々に2×最終濃度までミリQ水(pH7)に希釈した。各溶液の等量をシリンジ内に充填し、Orionシリンジポンプ(VWR,West Chester,PA)を流速25ml/分で用いて、T−フィッティングを介してガラスレザバ内に混合した。必要に応じて、この溶液を2倍希釈し、過剰なプロタミンを15mlのSlide−A−Lyzer(登録商標)透析カセット、10,000 MWCO(Pierce,Rockford,IL)を用いて除去し、5%デキストランpH 7対して透析した。DNA/プロタミン複合体を、使用の前に4℃で2週間まで保管し、そして最終DNA濃度をPicoGreen(登録商標)アッセイ(Molecular Probes製、P−7589 PicoGreen(登録商標)dsDNA Quantitation Kit,Eugene,OR)によって決定した。
【0249】
(脂質−プロタミン−DNA(LPD)処方物の調製)
LPDを、Li,S.,らGene Therapy,1998.5(7):930−937頁に記載されるように調製した。脂質:プロタミン:DNAの比(12nmol:0.9μg:1μg,12nmol:0.97μg:1μg、および12nmol:1μg:lμg)を、示されるように、これらの実験のために使用した。代表的な例として、150μlの6mMのリポソームを、197μlの5%デキストロースUSPと混合し、続いて、490μg/mlの予め圧縮したDNA(153μl)を添加した。この操作を、ボルテックッス攪拌(速度#3)下で実施し、そして得られたLPD溶液は150μgDNA/mlを含んだ。LPDを、単一様式でN4Plus Coulter Sizerを使用して一定のサイズに作り、これは、代表的に、150〜250nmの平均直径を有した。表面ζ電位を、Malvern zeta sizer(Malvern Instrument Inc,Sacramento,CA)を用いて決定した。代表的に、LPD処方物は、ペグ化脂質または標的化因子−ペグ化脂質結合体を伴ってか、または伴わずに、25−45+/−5.0 mVoltの平均ζ電位を示した。
【0250】
(透析した脂質−プロタミン−DNA(DLPD)の調製)
DLPDを、Harvie,P.,F.M.WongおよびM.B.Bally,Biophys J,1998.75(2):1040−51頁に先に記載される方法の改変したバージョンによって生成した。要するに、900nmolの全脂質を、上記のように窒素下で乾燥させ、そして200 mMのN−オクチル−B−D−グルコピラノシド(OGP Sigma,St.Louis MO)中に再懸濁し、ミセル溶液を形成した。350μlのプロタミンの予め圧縮したDNAを、0.9:1のプロタミン:DNA比で、穏やかなボルテックス攪拌下(速度3)で、脂質ミセル溶液に添加した。粒子は自然に形成された(すなわち、溶液は濁った)。次いで、この混合物を5%デキストロースで、500μl Slide−A−Lyzer(登録商標)透析カセット(MWカットオフ10,000)(Pierce,Rockford,IL)を用いて4℃で48時間透析した。デキストロース溶液を1日に2回取り換えた。粒子のサイズを上記のように評価し、代表的に150−300 nmの範囲であった。
【0251】
(フローサイトメトリーによるLHRHレセプターおよびインテグリンレセプターの発現)
組織培養培地を、Biowhittaker(Walkersville,Maryland)から得た。
【0252】
MDA−MB−231細胞(ヒト乳癌腫細胞株)、LL/2(ルイス肺癌腫)、NCI−H69(小細胞癌腫細胞株)およびSkov3−ipl(卵巣腺癌細胞株)(全てATCCから,Manassas,VA)を、150cm3フラスコ中、DMEM 10% FBS(ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質を含む)において、37℃にて5%または10% CO2で増殖させた。細胞を、5mlのEDTA 0.5Mまたは5mlのトリプシン−EDTA(0.05%トリプシン0.53mM EDTA.4Na)を用いて剥がし、その後1×106細胞を、14mlのFalcon FACSチューブ内に配分し、1%FBS(FACS緩衝液)を含むPBSで1回洗浄し、そして氷上において100μl FACS緩衝液に懸濁した。細胞を、適切な抗体(5μl)と共に氷上で1時間インキュベートした。この適切な抗体は、抗αVβ3FITC−結合体化または抗αVβ5 FITC−結合体化(Chemicon International,Temecula,CA)、あるいは抗ヒトLHRHレセプタークローンA9E4(Biogenesis,Kingston,NH)由来の抗体のいずれかである。10μlの整合するアイソタイプ抗体の抗−CD8 IgGlK(Pharmingen,San Diego,CA)をコントロールとして使用した。適切な抗体を用いたインキュベーションの後、細胞を0.095MのPBSで3回洗浄し、そして1.0mlの2%パラホルムアルデヒド溶液に再懸濁した。10,000個の細胞を、BD FACScan(Becton Dickson,San Jose,CA)で実験し、そしてデータをFACSNetTM(Becton Dickson,San Jose,CA)を用いて分析した。
【0253】
(SQ MDA−MB−231を有するヌードマウスから単離した標的細胞上でのLHRHレセプターおよびインテグリンレセプターの発現)
雌性Balb/Cヌードマウスに、適切なフランク中の1×107細胞を皮下に注射した。腫瘍の平均体積は1cm3に達した場合、細胞注射の8週間後に、腫瘍細胞を回収した。細胞を、F12−DMEM(Biowhittaker,Walkersville,Maryland)に、ガラスパスツールDounceホモジナイザーを用いて再懸濁した。その後、1×106細胞をFalcon FACSチューブに配分し、1% FBS(FACS緩衝液)を含むPBSで1回洗浄し、そして氷上で、100μlのFACS緩衝液に懸濁した。細胞を、上記のように、5μlの適切な抗体または整合する適切なアイソタイプと共に氷上で1時間インキュベートし、FACS緩衝液で3回洗浄し、そして0.5mlの2%パラホルムアルデヒドに再懸濁した。10,000個の細胞を、上記のようにBD FACScanで分析した。
【0254】
(細胞に結合するDi−I標識化LPD)
LPDを、1,1’−ジオクタデシル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニンパーコレート(DiI)(Molecular Probes,Eugene,OR)で標識した。Di−Iは、非交換性、非代謝性の蛍光脂質トレーサーである(Claassen,E.,JImmunol Methods,1992.147(2):231−40頁)。代表的には、6.67μlのLPD(1μgのDNAを含む)を、93μlの5% デキストロース USPに希釈し、そして1μlのDiI保存溶液(メタノール中、50μg/ml)をLPD溶液に添加した。DiIの添加後、LPDを、使用前に30分間室温でインキュベートした。100μlの蛍光LPDを、37℃にて1時間、1×106細胞と共にインキュベートし、その後、0.095MのPBSで3回洗浄し、そして1.0mlの2%パラホルムアルデヒド溶液に再懸濁した。1サンプルあたり10,000個の細胞を、上記のようにBD FACScanで分析した。
【0255】
(インビトロでのトランスフェクション)
トランスフェクションの16〜24時間前に、10% FBSを含む適切な培養培地(500μl/ウェル)(各細胞型について適切な培養培地はATCCカタログに記載される)中、5×104個の細胞(MDA−MB−231、LL/2またはHepG−2(ATCC,Manassas,VA))を、48ウェルプレート(Costar,Corning,NY)に播種し、そして37℃にて、5%または10% CO2で一晩インキュベートした。翌日、培養培地を除去し、そして500μlの新鮮な無血清培地で置換した。トランスフェクションを、0.01と1μg DNA/ウェルとの間(代表的には、150μg/mlでDNAを含むLPD保存溶液から6.67μl)を用いて実施し、そして細胞を37℃にて4時間、5%または10% CO2内でインキュベートした。1LPDあたりまたは1DLPD処方物あたり6つの複製で試験した。トランスフェクション後、ルシフェラーゼ活性を記載されたように評価した(Promega Luciferase Assay Kit,Cat.No.E1501,Madison,WI)。まとめると、細胞培養培地を除去し、10%FBSを含む新鮮な培養培地で置換し、そして細胞を、37℃にて5%または10% CO2内でさらに48時間インキュベートした。各ウェルを1mlのPBS(0.095M、pH7.4)(Biowhittaker,Walkersville,Maryland)で洗浄し、そして200μlの1×ルシフェラーゼレポーター緩衝液(RLB)(Promega,Madison,WI)に懸濁した。次いで、細胞を、3サイクルの凍結/融解(それぞれ、−70℃/37℃)に供した。細胞を回収し、そして14,000rpmで10分間、遠心分離した。20μlの上清を、100μlのルシフェラーゼ基質(Promega,Madison,WI)の添加によって、ルシフェラーゼについて評価し、Berthold(Aliquippa,PA)autolumat B953 luminometerを用いて、発光相関単位を測定する前に、室温で10秒間のインキュベートに供した。1サンプルあたりの全タンパク質濃度を、市販のキットであるCoomassie plus dye(Pierce,Rockford,IL)を用いて決定した。
【0256】
(血清インキュベーション後のインビトロでのトランスフェクション評価)
無血清培養培地におけるトランスフェクションの前に、100μlのLPDを、100μlの5%デキストロース USPまたは100μlの50%マウス血清(Cederlane,Hornby,ON,Canada)中で、37℃で1時間インキュベートしたことを除いて、トランスフェクションを上記の通り実施した。血清インキュベーションの後、LPD処方物の平均直径を、上記のように、Coulter Sizerを用いて実行した。
【0257】
(競合アッセイ)
3つの競合アッセイを、MDA−MB−231細胞を用いて実施し、トランスフェクション−媒介−DSPE−PEG5K−LHRHまたはDSPE−PEG5K−RGDの特徴を評価した。培養培地を、遊離LHRHまたは遊離RGDペプチド、あるいは競合剤としてのLHRHまたはインテグリンレセプターに対する抗体で補充したことを除いて、トランスフェクションを上記の通り実施した。10mol%のペグ化脂質または標識化因子−ペグ化脂質結合体を、各実験で使用した。
【0258】
第一の競合アッセイを、1μgDNA/ウェルを用いて実行した。このDNA濃度は、100倍過剰な遊離LHRH(細胞にとって毒性である)を達成するために、遊離LHDHの高濃度を必要とした。同様に、RGD処方物では、このDNA濃度は、100倍過剰な、H2O中5mg/mlの溶液からの遊離RGD(3.25μ1のダンシル−標識化RGD((Integrated Biomolecule Corporation,Tucson,AZ)(細胞にとって毒性である)を達成するために、遊離RGDの高濃度を必要とした。
【0259】
LHRHに付随する毒性を減少するために、第二の競合アッセイを、0.1μg DNA/ウェル(図6Aおよび6B)を用いて実行した。0.1μg DNA/ウェルを、12nmol:1μg脂質:DNA比および10 mol% DSPE−PEG5k−LHRH(処方物中の全脂質において)を用いて、1ウェルあたり、862.62ng DSPE−PEG5K−LHRHまたは168.6ng LHRHに一致させた。トランスフェクションを、上記のように実施した。第二の競合アッセイを、17.5μg/ウェル(5μl)の抗LHRHレセプターF1G4および15μg/ウェル(50μl)の抗LHRHレセプターA9E4(Biogenesis製(Kingston,NH))を用いて実施した。抗体に整合する適切なアイソタイプ((17.5 g/ウェル)、抗CD3 IgGlK(Pharmingen,San Diego,CA)を、コントロールとして使用した。さらに、100倍および1000倍過剰なLHRHを、競合試薬として用いた:培養培地を、2.5mg/mlの[D−Trp]−LHRH保存溶液(6.5μlまたは65μl)(Sigma製(St.Louis,MO))で補充した。さらに、この特定の実験において、2つの抗LHRHレセプターポリクローナル血清を試験した:5μl/ウェルのウサギ血清抗LHRHレセプター(Biogenesis,Kingston,NH)および50μl/ウェルのヒツジ血清抗LHRHレセプター(Biogenesis,Kingston,NH)。コントロール血清に対応する体積を、アイソタイプコントロールとして使用した。コントロール血清は、Sigma(St.Louis,MO)から購入した。
【0260】
LPDをまた、LPDの細胞への添加前に、LPD表面上のLHRH分子をブロックするために、抗LHRH抗体またはアイソタイプコントロール(抗IgG)抗体と共に直接インキュベートした。まとめると、6.67μlの10倍希釈したDSPE−PEH5K−LHRH LPD(150μg DNA/ml)を、50μlのマウス抗LHRH抗体またはコントロール(Dako Corporation,Carpinteria,CA)と混合し、そして上記のようにトランスフェクションするまで、室温で1時間インキュベートした。
【0261】
トランスフェクションをまた、0.1μg DNA/ウェルを用いて実施し、減少したRGDを誘導された細胞を培養プレートから剥がし、トランスフェクション媒介性DSPE−PEG5K−RGDを、3つの異なるRGDペプチドでブロッキングした:GRGESP、GRGDSPおよびGRGDNP(Gibco、Life Science,Gettysburg,MD)を、競合剤として使用した(図7)。培養培地を、10,000倍または1000倍の過剰ペプチド(6.5μl(保存溶液からH2Oで10倍希釈した)、6.5μlまたはペプチド溶液(2.5mg/ml)の65μlに対応する)で補充したことを除いて、トランスフェクションを上記の通り実行した。
【0262】
(アニオン性複合体についての方法および材料)
(アニオン性混合ミセル複合体の調製)
混合ミセルを、以下の通り調製した:2191.5nmolの1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−(ホスホ−L−セリン)(DOPS)または1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3(ホスホ−rac−1−グリセロール)(DOPG)(Avanti Polar Lipid Inc.,Alabaster,AL)(両方ともクロロホルム(J.T.Baker,Phillipsburg NJ)中、20mg/ml)を、1793.05nmolのコレステロール(Avanti Polar Lipid Inc.,Alabaster,AL)(これもクロロホルム中で20mg/mlで調製した)と混合した。脂質を、ホウケイ酸チューブ内で混合させ、そしてN−EVAPTM(Organomation,Berlin,MA)を用いて、4LPMの窒素下で1時間、乾燥させた。得られた脂質フィルムを、0.15 mlの200 mM N−オクチル−B−D−グルコピラノシド(OGP)(Sigma,St Louis,MO)で水和し、26.56 mMの最終脂質濃度を達成した。ミセル溶液を、超音波槽(Laboratory Supplies Co,Inc,Hicksville,NY)を用いて30秒間、超音波処理して生成した。
【0263】
10mol%のペグ化脂質処方物のために、2191.5nmolのDOPSまたはDOPGおよび1394.59nmolのコレステロールおよび398.45nmolの1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−5000 (DSPEPEG5K)(Shearwater Polymer Inc.,Huntsville,AL)を、上記の通り調製した。代表的に、10mol%標的化因子−ペグ化脂質結合体のために、標的化DLPDを、2191.5nmolのDOPSまたはDOPG、1394.59nmolのコレステロールおよび398.45nmolのDSPE−PEG5K−スクシニル−ACDCRGDCFCG−COOH(DSPE−PEG5K−RGD)または398.45nmolのpyrGLU−HWSYDK(εNH−スクシニル−PEG5K−DSPE)LRPG−COOHNH2(DSPE−PEG5K−LHRH)のいずれか2191.5nmolを用いて調製した。結合した脂質を、Integrated Biomolecule Corporation(Tucson,AZ)によって合成した。要するに、標的化リポソーム、アニオン性脂質、コレステロールおよびDSPE−PEG5K−LHRHまたはDSPE−PEG5K−RGDを、クロロホルム中に20 mg/mlで溶解し、上記のように窒素下でエバポレートした。次いで、脂質フィルムを、メタノール:ジクロロメタン1:1(メタノール、VWR製,West Chester,PAおよびジクロロメタンEM Science製,Gibbstown,NJ)中に再溶解し、0.15ml 200mMのOGPでの水和の前に、窒素下で再エバポレートし、その後、上記の通り処理した。
【0264】
pH感受性ミセルを、1461.0nmole CHEMS(Sigma,St Louis,MO)(200mM OGP中、20mg/mlのコレステリルヘミスクシネートトリス塩またはクロロホルム中、20mg/mlのコレステリルヘミスクシネートモルホリン塩のいずれか)、および3409.0nmole DOPE(Avanti Polar Lipid Inc.,Alabaster,AL)を用いて、DOPS/コレステロール混合ミセルについて上記のように調製し、32.47 mMの最終脂質濃度を達成した。
【0265】
(DNAプロタミン複合体の調製)
プラスミドDNA pCMVinLUCを、硫酸プロタミンUSP(Elkins−Sinn,Cherry Hill,NJ)と2:1の質量比で混合したことを除いて、DNA−プロタミン複合体をカチオン複合体について上記のように調製した。
【0266】
(透析した脂質−プロタミン−DNA(DLPD)処方物の調製)
脂質:プロタミン:DNAの比を、6:1の負電荷の過剰な比を与えるように調製した。これは、DOPG/コレステロールおよびDOPS/コレステロールの処方物について、約53nmolの脂質:2μgプロタミン:1μg DNAの比に一致する。ペグ化脂質を伴わない複合体について、脂質比は、DOPG:chol 5.5:4.5またはDOPS:chol 5.5:4.5であった。ペグ化脂質を含む複合体について、コレステロールの量は、結果的に減少した。例えば、全脂質の10mol%でペグ化脂質を含む複合体について、その脂質比は、DOPGもしくはDOPS:chol:ペグ化脂質 5.5:3.5:1であった。
【0267】
代表的に、上記のように調製した0.15mlの混合ミセルを、350μlのプロタミンの予め圧縮したDNA(2:1のプロタミン:DNA比)と、穏やかなボルテックス攪拌下(速度3)で混合した。粒子は自然に形成された(すなわち、溶液は濁った)。次いで、混合物を、500μl Slide−A−Lyzer透析カセット(MWカットオフ10,000)(Pierce,Rockford,IL)を用いて、4℃にて48時間にわたってミリQ水で再び透析した。ミリQ水を2日間静置し、最後の透析工程において、ミリQ水を5%デキストロースUSPで置換した。粒子のサイズを上記のように評価し、そして単一様式で、N4Plus Coulter Sizer(Beckman Coulter Miami,FL)を用いて決定したように、代表的に100−200nmの範囲であった。表面ζ電位を、Malvern zeta sizer(Malvern Instrument Inc,Sacramento,CA)を用いて決定した。代表的に、DLPD処方物は、ペグ化脂質を伴ってか、または伴わずに、−35.0〜−45.0+/−5.0 mVoltの平均ζ電位を示した。
【0268】
(pH感受性DLPD処方物の調製)
脂質:プロタミン:DNAの比を、4:1の負電荷の過剰な比を与えるように調製した。これは、CHEMS/DOPE処方物について、約65nmolの脂質:2μgプロタミン:1μg DNAの比に一致する。ペグ化脂質を伴わない複合体について、脂質比は、CHEMS:DOPE 3:7であった。ペグ化脂質を含む複合体について、DOPEの量は、結果的に減少した。例えば、全脂質の10mol%でペグ化脂質を含む複合体について、その脂質比は、CHEMS:DOPE:ペグ化脂質 3:6:1であった。
【0269】
代表的に、4870nmolの全脂質(例えば、1461nmol CHEMSおよび3409nmol DOPE)を、上記のように窒素下で乾燥させ、そして150μlの200 mMのN−オクチル−B−D−グルコピラノシド(OGP Sigma,St.Louis MO)中に再懸濁し、ミセル溶液を形成した。350μlのプロタミンの予め圧縮したDNAを、0.9:1のプロタミン:DNA比で、穏やかなボルテックス攪拌下(速度3)で、脂質ミセル溶液に添加した。粒子は自然に形成された(すなわち、溶液濁った)。次いで、混合物を、溶液を5%デキストロース(pH7.4)に対して、500μl Slide−A−Lyzer(登録商標)透析カセット(MWカットオフ10,000)(Pierce,Rockford,IL)において、4℃で48時間透析した。粒子のサイズを上記のように評価し、単一様式でN4Plus Coulter Sizerを用いて決定したように、代表的に200−300 nmの範囲であった。表面ζ電位を、Malvern zeta sizer(Malvern Instrument Inc,Sacramento,CA)を用いて決定した。代表的に、これらのアニオンDLPD処方物は、ペグ化脂質を伴ってか、または伴わずに、−35.0〜−40.0+/−5.0 mVoltの平均ζ電位を有した。
【0270】
(コントロールカチオン性LPD処方物の調製)
DOTAP:Cholを含むカチオンLPD処方物を、脂質:プロタミン:DNA比が、12nmol:2μg:1μgであることを除いて、上記の通り調製した。
【0271】
(細胞に結合するDi−I標識化DLPD)
DLPDを、1,1’−ジオクタデシル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニンパーコレート(DiI)(Molecular Probes,Eugene,OR)で標識した。代表的には、13.3μlのDLPD(1μgのDNAを含む)を、86.7μlの5% デキストロース USPに希釈し、そして1μlのDiI保存溶液(メタノール中、50μg/ml)をDLPD溶液に添加した。DiIの添加後、DLPDを、使用前に30分間室温でインキュベートした。100μlの蛍光DLPDを、37℃にて1時間、1×106細胞と共にインキュベートし、その後、0.095MのPBSで3回洗浄し、そして1.0mlの2%パラホルムアルデヒド溶液に再懸濁した。10,000個の細胞を、BD FACScan(Becton Dickinson,San Jose,CA)で実験し、そしてデータをFACSNetTM(Becton Dickinson,San Jose,CA)を用いて分析した。
【0272】
(インビトロでのトランスフェクション)
トランスフェクションの16時間前に、10% FBSを含む適切な培養培地(500μl/ウェル)中、5×104個の細胞(CHO−K1細胞(生体チャイニーズハムスターから単離した卵巣癌細胞株)、MDA−MB−231(ヒト乳癌腫細胞株)、KB細胞、またはHepG−2(肝細胞癌腫細胞株)(全ての細胞株はATCC由来,Manassas,VA))を、48ウェルプレート(Costar,Corning,NY)に播種し、そして37℃にて、5%または10% CO2で一晩インキュベートした。翌日、培養培地を除去し、そして500μlの新鮮な無血清培地で置換した。トランスフェクションを、1μg DNA/ウェル(代表的には、DLPD保存溶液(75μg DNA/ml)からの13.3μl)を用いて実施し、そして細胞を37℃にて4時間5%または10% C02でインキュベートした。1DLPD処方物あたり6つの複製で試験した。トランスフェクション後、ルシフェラーゼ活性を上に記載したように評価した。まとめると、トランスフェクション細胞培養培地を除去し、10%FBSを含む新鮮な培養培地で置換し、そして細胞を、37℃にて5%または10% CO2でさらに48時間インキュベートした。各ウェルを1mlのPBS(0.095M、pH7.4)(Biowhittaker,Walkersville,Maryland)で洗浄し、そして200μlの1×ルシフェラーゼレポーター緩衝液(RLB)(Promega,Madison,WI)に懸濁した。次いで、細胞を、3サイクルの凍結/融解(それぞれ、−70℃/37℃)に供した。細胞を回収し、そして14,000rpmで10分間、遠心分離した。20μlの上清を、100μlのルシフェラーゼ基質(Promega,Madison,WI)の添加によって、ルシフェラーゼについて評価し、Berthold(Aliquippa,PA)autolumat B953 luminometerを用いて発光相関単位を測定する前に、室温で10秒間のインキュベートに供した。1サンプルあたりの全タンパク質濃度を、市販のキットであるCoomassie plus dye(Pierce,Rockford,IL)を用いて決定した。
【0273】
(血清インキュベーション後のインビトロでのトランスフェクション評価)
無血清培養培地におけるトランスフェクションの前に、100μlのDLPDを100μlの5%デキストロース USPまたは100μlの50%マウス血清(Cederlane,Hornby,ON,Canada)中で、37℃1時間インキュベートしたことを除いて、トランスフェクションを上記の通り実施した。DLPD処方物の平均直径およびζ電位測定を、血清インキュベーションの1時間後に、上記のように実行した。
【0274】
(実施例1)
(LPDおよびDLPDの物理的特性)
LPDおよびDLPD処方物を一定のサイズに作り、ζ電位を、5%デキストロースUSP(pH5.0)において測定した。全脂質の割合として10mol%のペグ化脂質を含む処方物についての、平均粒子サイズおよび集団のサイズ分布(多分散性値によって示される)を、表1に示す。代表的に、ζ電位は、12nmol脂質(DOTAP:CHOL 1:1 mol比):0.9μgプロタミン:1.0μgDNAを含む従来のLPDについて35〜45mVの範囲である。DSPE−PEG5K取り込みは類似の結果であった。DSPE−PEG5K−LHRH取り込みのみが、わずかにLPD表面電位を改変した。しかし、DSPE−PEG5K−RGDを用いた場合、ζ電位の15mVの減少を観察した。表1に示すデータは、単一の実験から得る。サイジングデータを、各々の示された実験について繰り返した(データは示さず)。
【0275】
図1に示したデータは、表1に示されるのと同じ実験の異なる実施に由来する。
【0276】
図1Aおよび1Bは、全脂質の10mol%までの、LPD処方物における標的化因子−ペグ化脂質結合体(DSPE−PEG5K−LHRHまたはDSPE−PEG5K−RGD)の取り込みが、粒子サイズに有意な影響を与えなかったことを示す。しかし、LPDにおける20mol%の標的化因子−ペグ化脂質結合体の取り込みは、DSPE−PEG5Kペグ化処方物を超える有意なサイズ増加を生じた。DLPD処方物は、図1Cおよび1Dに示すように、同様のサイズ増大で、20mol%まで標的化因子−ペグ化脂質結合体の取り込みをもたらすことを実証しなかった。LPD処方物およびDLPD処方物は両方とも、処方のサイズ範囲内であった(<350nm)。
【0277】
達成可能なDNA濃度におけるLPD処方物への10mol%DSPE−PEG5Kの添加の効果は、表2に示される。
【0278】
この複合体は、12nmol脂質:1μgプロタミン:1μgDNAの比を含む。PEGを含まないLPD処方物は、150μg DNA/mlの最大濃度を達成することが可能なだけであった(データは示さず)。上記の処方物は、少なくとも200μgDNA/mlでDNAを含む処方物を生成することが可能であった。
【0279】
(実施例2)
(異なる細胞におけるLHRHレセプターおよびαVβインテグリンレセプターの発現)
MDA−MB−231細胞、Skov3−ip1(SKOV3−ip1)細胞、LL/2細胞、およびNCI−H69(H−69)細胞を、それらのLHRHレセプターおよびインテグリンレセプターの発現についてFACS分析により調査した。表3に示されるように、MDA−MB−231細胞およびSKOV3−IP1細胞は、αVβ3およびαVβ5インテグリンレセプターの両方を発現する。興味深いことに、αVβ3インテグリンレセプターの発現は、より高いレベルのαVβ5インテグリンレセプターを発現するSKOV3−IP1細胞よりもMDA−MB−231細胞においてより高い。LHRHレセプターの発現レベルは、MDA−MB−231において、このインテグリンレセプターの発現よりも低いが、MDA−MB−231*およびMDA−MB−231**においては、抗αvβ5レセプターは、LHRHレセプターよりもわずかに低いレベルで発現された。SKOV3−IP1は、LHRHを発現する細胞集団の89.4%を示した。H−69およびLL/2は、ヒト抗ヒトLHRHレセプターを用いて、LHRHレセプター発現を示さなかった。表3に示されるデータは、単一の代表的な実験からのデータである(n=1実験/細胞株)。
【0280】
(実施例3)
(脂質マーカーとしてDiIを用いるLPD細胞結合)
LPD(脂質:プロタミン:DNA比=12nmol:1μg:1μg)を、DiI(蛍光脂質トレーサー)を用いて上記のように標識し、そして細胞へのLPD結合を、フローサイトメトリーにより評価した。表4に示す結果は、DSPE−PEG5Kペグ化LPD処方物と比較して、より高パーセントの従来のLPDに結合した細胞を示した。これらの結果は、ペグ化脂質が、従来のLPDと比較して、静電気的LPD−細胞結合を減少させるという概念を支持する。LPD処方物におけるDSPE−PEG5K−LHRHの添加は、LPD−細胞結合を有意に回復した。LPD処方物におけるDSPE−PEG5K−RGDは、DSPE−PEG5KLPDよりもLPD−細胞結合を部分的に回復したが、DSPE−PEG5K−LHRHと比較した場合、より低い細胞結合を示した。同じ傾向は、表5に示されるような平均蛍光強度について観察される。
【0281】
(実施例4)
(インビトロルシフェラーゼ発現)
2つの異なる細胞株(MDA−231、LL/2)におけるDSPE−PEG5Kに対するLPD(図2)およびDLPD(図3)のトランスフェクション活性および折り畳みの増強を示す。LPD処方物およびDLPD処方物は、12nmolの脂質:1μgのプロタミン:1μgのDNAを含み、そして総脂質の1〜20mol%のペグ化脂質を組み込んだ。Nは、処方物群当たりの6つの独立したトランスフェクションである。図2A、2C、3A、および3Cにおける実線は、ペグ化脂質を含まないDOTAP/コレステロールLPDおよびDPLDにおけるルシフェラーゼの発現を示す。LPD処方物における10mol%の標的化因子ペグ化脂質結合体までの用量効果が、MDA−MB−231細胞のトランスフェクションについて見られる(図2Aおよび2B)。ずっと小さな効果が、MDA−MB−231細胞におけるDLPD処方物について、20mol%の標的化因子ペグ化脂質結合体まで観察される(図3Aおよび3B)。最初の実験における迅速に増殖する細胞は、コンフルエントを超える細胞密度を生じたので、LL/2トランスフェクション実験を繰り返した(第2の実験のみを、図2および3に示す)。第2のLL/2実験において、コンフルエントを超えるプレートを回避するために、トランスフェクションを24時間後に停止し、そしてこの結果は、標的化されたLPD処方物について10mol%までの用量効果を示した(図2Bおよび2D)。より小さい用量効果を、DLPD処方物について観察した(図3Bおよび3D)。HEPG−2細胞株において、LPD処方物またはDLPD処方物のいずれについても効果が観察されなかった(データは示していない)。しかし、HEPG−2細胞株は、低いレベルのLHRHおよびインテグリンレセプターを発現するかまたはそれらを発現しないことが知られている。
【0282】
(実施例5)
(マウス血清におけるLPDの安定性)
インビボでのLPDの安定性についてのモデルとして、LPDを、無血清培地中でのトランスフェクションの前に、37℃にて1時間、マウス血清中で予めインキュベートした。この実験において、細胞を、トランスフェクションの24時間後に収集した。粒子サイズおよびMDA−MB−231細胞に対するトランスフェクション能力を評価した。DOTAP:CHOL媒体は、プロタミン/DNAを含まない。示される比は、プロタミン対DNAの比を示す(例えば、DOTAP:CHOL 0.9:1は、この処方物における0.9:1のプロタミン:DNA比を示す)。全ての処方物は、12nmolの脂質:0.9μgまたは0.6μgのプロタミン:1μgのDNAを含み、そしてペグ化脂質を、総脂質の10mol%で含んだ。Nは、処方物当たりの6つの独立したトランスフェクションである。LPD処方物における10mol%でのDSPE−PEG5Kの添加は、血清により媒介されるサイズの増加を防いだ(図4A)。LPD処方物へのDSPE−PEG5K−LHRHの添加は、DSPE−PEG5Kを含まない処方物に匹敵する、血清インキュベーション後のサイズ拡大を生じた。しかし、粒子サイズは、脂質の比、および脂質:プロタミン:DNAの比を調整することによって調整され得る。DSPE−PEG5K−RGDを含む処方物は、LHRH処方物よりも血清に対してより低い感受性である。
【0283】
予想された通り、LPD処方物における10mol%でのDSPE−PEG5Kの添加は、トランスフェクション活性に関して、基準DOTAP:CHOL LPD処方物の活性と比較して、2logの減少を引き起こした(図5)。しかし、LPD処方物へのDSPE−PEG5K−LHRHの添加は、従来のLPD(DOTAP:Chol)処方物について5%デキストロースにおいて観察されたレベルに匹敵する程度に、トランスフェクションレベルを回復した。DSPE−PEG5K−RGDの添加は、わずかにより低いトランスフェクションレベルの回復を示した。アッセイの変動性(±1 SD)内で、LHRH保有処方物のトランスフェクション能力は安定性を維持し、RGD保有処方物においてわずかな減少が見られた。
【0284】
(実施例6)
(競合アッセイ)
DSPE−PEG5K−LHRHおよびDSPE−PEG5K−RGDにより媒介されるトランスフェクションに対するLHRHおよびRGDの特異性を評価するために、本発明者らは、上記のような競合アッセイを実施した。Nは、処方物群当たりの3つの独立したトランスフェクションである。全て処方物は、12nmolの脂質:0.9μgのプロタミン:1μgのDNAを含み、そしてペグ化脂質を、総脂質の10mol%で含んだ。
【0285】
この結果は、1000倍過剰のLHRHを用いた、1000倍の競合効果を実証した(図6A)。しかし、LHRHレセプターまたはLHRHレセプターに特異的な抗体は、リガンド媒介トランスフェクションをブロックし得なかった。100倍および1000倍のLHRH過剰からのデータを、図6Bに再度表す。図6Bは、1000倍過剰のLHRHを用いた、トランスフェクション活性の明らかな阻害を示す。図7は、1000倍過剰の遊離RGDペプチド(GRGDSPおよびGRGDNP)による、DSPE−PEG5K−RGD含有複合体のトランスフェクション活性の阻害を示す。予想された通り、1000倍過剰の遊離RGEペプチド(GRGESP)は、トランスフェクション活性を阻害しなかった。
【0286】
(実施例7)
(LPD細胞結合競合アッセイ)
トランスフェクション活性の減少と、細胞に対するLPD結合の減少とを相関させるために、Di−I標識LPDを用いて競合アッセイを実施した。競合アッセイを、10mol%のDSPE−PEG5K−LHRH LPDを用いて実施し、そして競合試薬は、1000倍過剰のLHRHであった。本発明者らは、SKOV3−IP1細胞へのLPD結合のパーセンテージに関して、または本発明者らがMDA−MB−231細胞におけるトランスフェクション活性の阻害を明らかに実証した条件下での平均蛍光強度に関して、有意な減少を実証することができなかった(データは示していない)。しかし、表3に示されるように、SKOV3−IP1細胞は、MDA−MB−231細胞よりもずっと高い密度のレセプターを有し、従って、1000倍過剰のLHRHは、必ずしもMDA−MB−231細胞と同じくらいLHRH媒介結合を阻害しない。
【0287】
(実施例8)
(LPD処方物に対するTNFα応答)
この処方物に対するTNF−α応答のレベルを決定するために、異なるLPD処方物を、マウスに静脈内注射した。異なるレベルのエンドトキシンを含有する2つの異なるpCMV−In−LucルシフェラーゼDNA調製物(ロット番号CP991216A(83EU/mg含有)、およびロット番号CP000907A(0.17EU/mg含有)(Althea Technologies,San Diego,CA))を用いて、エンドトキシンレベルがTNFα応答に影響したか否かを決定した。
【0288】
プロタミンをカチオン性リポソームに添加した後にDNAを添加したことを除いて、全てのLPD処方物を上記の通り調製した。DNAを含有する全ての処方物は、4.15EU/mgのエンドトキシンレベルを有した(0.0085EU/mgのエンドトキシンレベルを含む低エンドトキシン(低EU)処方物群を除いて)。LPDは、12nmol:0.6μg:1μgの脂質:プロタミン:DNA比を有し、脂質は、1:1のモル比でDOTAP:コレステロールを含んだ。ペグ化脂質またはDOPE−094(Elan 219)を脂質に添加する場合、コレステロールの量を、それに準じて減少させた。例えば、10mol%のDSPE−PEG5Kを含むLPDについて、脂質比は、5:4:1のDOTAP:コレステロール:DSPE−PEG5Kであった。LPD処方物を上記のような大きさにし、そしてこれを表6に表す。
【0289】
未処置の雌性C57B/6マウスに、333μl(50μgのpCMVinLUC DNAを含有する)の処方物を静脈内注射した(N=3匹のマウス/処方物)。2時間後、マウスを麻酔し、そして血液サンプルを、心臓棒(cardiac stick)を介して獲得した。この血液サンプルを遠心分離して血清を獲得し(この血清は、−70℃で保存され得る)、赤血球細胞を廃棄し、そしてR&D Systems(Minneapolis,MN)からの市販のキット(カタログ番号MTA00 Mouse TNFα Immunoassay)を用いて、TNFαについてのELISAアッセイを、血清に対して実施した。
【0290】
簡単にいうと、ELISAアッセイを以下の通り実施した:全ての試薬を室温にし、そして試薬および標準希釈液を調製した。50μLのアッセイ希釈液を各ウェルに添加した。50μLのスタンダード、血清コントロール、または血清サンプルを、各ウェルに添加した。この溶液を、プレートの縁を1分間穏やかに叩くことによって混合し、次いでこのプレートを、提供された接着ストリップを用いて覆い、その後、室温にて2時間インキュベートした。各ウェルを吸引し、そして400μLの洗浄緩衝液で5回洗浄した。100μLのマウスTNF−α結合体を、各ウェルに添加した。このプレートを、新しい接着ストリップで覆い、そして室温にてさらに2時間インキュベートした。吸引洗浄工程を、上記のように繰り返した。100μLの基質溶液を各ウェルに添加し、そしてサンプルを室温にて30分間インキュベートした。100μLの停止溶液を各ウェルに添加し、そしてこのプレートを穏やかに叩いて、完全な混合を確実にした。光学密度を、450nmで読み取った(補正波長を540nmまたは570nmに設定した)。
【0291】
図8に示されるように、標準DOTAP/CHOL LPD処方物の注入は、強いTNFα応答を引き起こし、そしてプロタミンコンパクションなしのリポソーム処方物は、LPDよりもさらに高いTNF−α応答を生じた。DOTAP/CHOL LPD処方物の個々の成分(裸のプラスミドDNA、脂質+プロタミン、およびプロタミン圧縮したDNA)は、有意なTNF−α応答を引き起こさなかった。より低いエンドトキシンレベル(「低EU LPD」)を有するLPD処方物は、より高いエンドトキシンレベルを有するLPDと同様のTNF−α応答を生じた。このことは、TNF−α応答が、LPD処方物に起因し、エンドトキシンレベルに起因しなかったことを示す。10%DSPE−PEG5K、10%DSPE−PEG5K−LHRH、および/または10%DOPE−094(Elan 219)を含む処方物は、TNF−α応答を有意に減少させた。
【0292】
(実施例9)
(ある時間にわたる血清中でのMTLPペプチドの安定性の分析)
MTLPペプチド溶液を、1mg/mLで調製し、そして20μLのアリコートを試験管内に入れた。1セットの試験管に、等量のマウス血清を添加し、そして第2のセットに、ネガティブコントロールとして0.9%の生理食塩水溶液を添加した。この試験管を、37℃にてインキュベートした。コントロール試験管およびサンプル試験管を、種々の時点(10、30、60、および120分)で取り除き、そして全ての反応を、70:30のアセトニトリル:水(160μL)を用いてクエンチした。次いで、各々のクエンチしたサンプルを、C18カラム(5μm、300Å、250×4.6mm id)を用いて45分間にわたり、220nmでのHPLC−UVにより分析した。移動相Aは、10:90のアセトニトリル:0.1%トリフルオロ酢酸水溶液であり、移動相Bは0.1%トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリルであった。
【0293】
図9は、ZElan207(D形態)が、マウス血清中で2時間まで安定であることを示す。ZElan094(L形態)は、2時間以上で、マウス血清中で分解し、その分解は10分後に開始する(図10)が、60%までのリガンドは、インキュベーション後30分でなおも検出可能である。従って、ZElan207は、静脈内投与を介したインビボでの使用に(特に、より延長された循環半減期が必要とされる場合に)、適切に安定である。Zelan094は、より短い血清半減期が必要とされるかまたは最適な組織取り込みが、インビボでの静脈内投与の30分以内に投与された処方物に曝されたかまたはそれと接触した組織中で起こる場所(例えば、肝臓)での静脈内投与を介してインビボで適切であり得る。
【0294】
(実施例10)
(遺伝子複合体をインビトロで肝細胞に送達するためにLPDに吸収されたMTLP−ガラクトース結合体の使用)
ガラクトシル化ペプチドのインビトロの細胞試験について、以下の細胞株を使用した:HepG2(ATCC,Manassas,VA):アシアロ糖タンパク質(asialyglycoprotein)(ASGP)レセプターを発現する肝臓癌細胞株、Hep−SK1(ATCC,Manassas,VA):ASGPレセプターを発現しない肝臓腺癌細胞株。これらの2つの細胞株を、Calbiochem(Nottingham,UK)由来の抗アシアロ糖タンパク質レセプター抗体を用いたウェスタンブロットによって、ASGPレセプターの存在について試験した。このことは、HepG2細胞におけるこのレセプターの存在およびHep−SK1細胞からのレセプターの非存在を確かにした(データは示していない)。
【0295】
LPDを上記の通りに生成した。ここで、脂質は、DC−Chol/DOPEおよび必要に応じて標的化因子を含んだ。ZElan094を用いた用量適定研究は、10uM MTLPペプチドが、最適なインビトロ細胞トランスフェクションを与えたことを示した。この例を、図11に示す。
【0296】
ガラクトシル化リガンド(dH2O中の2mg/mlストック)を希釈して、1mMの作用希釈液にし、これから、リガンドをLPD処方物に添加して100μMの終濃度を与え、そしてこの処方物を、室温にて30分間インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄し、そしてOptiMEM中に1μgのDNAおよび100μMのMTLP−ガラクトース結合体を含む250μlの最終LPD処方物を、各ウェルの細胞に添加した(n=6)。この処方物を、細胞と共に4時間インキュベートし、その時点で、処方物を吸引し、そして完全培地を含む新鮮な血清を細胞に添加した。細胞を、トランスフェクションの48時間後に収集し、そして総細胞タンパク質発現およびルシフェラーゼレポーター遺伝子発現についてアッセイした。グリコシル化Elan094リガンド、Elan094リガンド、およびZElan207リガンドを、DC−Chol:DOPE LPDを用いてスクリーニングした。代表的な実験からの結果を、100uMのガラクトシル化−Elan094リガンドを含有するLPD処方物を用いて、図12および13に概説する。増加したトランスフェクションを、HepG2細胞において、Elan094G、GElan094、およびリガンドZElan094R(ZElan094のC末端に結合されたエンドソームエスケープペプチド配列を含む)について観察した(図12)が、非ASGPR含有細胞、Hep−SK1において、トランスフェクションの増加を観察しなかった(図13)。従って、多機能性標的化因子(例えば、ガラクトース−Elan094)は、単一機能性標的化因子よりもトランスフェクション活性を増加し得る。
【0297】
DC−chol:DOPE LPDと組み合わせて使用された、Elan094Gの用量適定研究は、用量応答が存在することを示し(図14)、最適なトランスフェクションは、50uMで獲得された(10uMおよび100uMの用量は非常に類似した)。20mMの遊離ガラクトースの添加は、100uMのLPD−GElan094と競合し、そしてトランスフェクションをバックグラウンドレベルまで減少させた。このことは、GElan094と遊離ガラクトースとの競合を示す。
【0298】
(実施例11)
(LPDへの脂質−MTLPの用量適定およびインビトロトランスフェクション)
LPD処方物を、Elan218またはElan219を添加して、上記の通りに生成した。インビトロでの細胞トランスフェクションを、多くの細胞型において、上記の通りに実施した。標的化因子を、標的化因子−脂質結合体またはペグ化脂質に結合した標的化因子−脂質結合体のいずれかとして加えた。Elan218またはElan219の最適なパーセンテージは、LPD基準処方物および細胞型の両方に依存した。2つの異なる細胞型(ヒト肝臓細胞株(HepSK1)およびヒト胸部細胞株(MDA−MB−231))についての結果を、表7および8に示す。DOTAP:Chol:DMPE−PEG:Elan218 LPDにおける、Hep SK1細胞およびMD−MBA−231細胞とのElan218結合体の至適濃度は、10mol%(それぞれ、表7および8)である。DOTAP:CHOL:DMPE−PEG:Elan219 LPDにおけるMDA−MB−231細胞とのElan219結合体の至適濃度は、5mol%である。
【0299】
(実施例12)
(インビボでの遺伝子送達のためのLPDの使用)
LPD処方物を、記載されるようにして生成した。50ugのルシフェラーゼDNAを含むLPDの腫瘍内注射の6週前に、BalbCヌードマウスに4×106のMDA−MB−231ヒト胸部細胞を植え付けた。「DOTAP:CHOL:プロタミンコントロール」は、DNAを有さない脂質/プロタミン処方物である。図15は、投与の16時間後のルシフェラーゼレポーター遺伝子の腫瘍発現を示す。10% Elan219を含有するLPD処方物で処理した動物は、他の処方物よりも、腫瘍細胞においてより高いレベルのルシフェラーゼ発現を示した。
【0300】
(実施例13)
(アニオン性DLPDの物理的特性)
アニオン性DLPD処方物の大きさを整え、そしてゼータポテンシャルを、5%デキストロースUSP中で測定した。平均粒子サイズおよび集団サイズ分布(多分散値により表される)を、表9に示す。代表的に、ゼータポテンシャルは、pH4.5または7.5のいずれかで、5%デキストロース中のDOPS:CHOLまたはDOPG:CHOL(55:45の脂質モル比)のいずれかで構成されるアニオン性DLPDについて、−15〜−50mVの範囲である。pH感受性処方物(CHEMS/DOPE)について、pH7.5での−42.0mVからpH4.5での+26.0mVへのゼータポテンシャルの移動は、pH感受性の効果をはっきりと示した。コントロールのカチオン性LPDを、6nmol:2μg:1μgの脂質:プロタミン:DNAの比で調製した。表9に示されるデータは、単一の実験由来のものであり、そしてこれらの処方物を生成した5つのさらなる実験について観察されたデータの代表である。ゼータポテンシャルについてのSDを、同一サンプルからの5回の読み取りに基づいて算出した。
【0301】
DSPE−PEG5Kの添加は、粒子サイズを増加させなかった。10mol%の標的化因子−ペグ化脂質結合体を含有する上記処方物は、大きな粒子サイズを有した。しかし、粒子サイズは、脂質の比および総脂質:ポリカチオン:核酸の比を調整することによって調整され得る。
【0302】
(実施例14)
(最大DNA濃度)
DNA用量適定を、10mol%のDSPE−PEG5Kを有するかまたは有さないDOPS:CHOLまたはDOPG:CHOLアニオン性処方物中で達成可能な最大DNA濃度を決定するために実施した。表10に示される結果は、約125μg DNA/mlのDNA濃度までまたは10mol%のDPSE−PEG5Kを有する少なくとも150μg DNA/mlまでのDOPS:CHOL DLPDを生成することが可能であることを示す。DOPG/CHOL処方物は、少なくとも約150ug DNA/ml、および10mol%のDPSE−PEG5Kを有する約125μg DNA/mlのDNA濃度を実証した。本明細書中にアニオン性複合体について以下で示されるさらなる実験を、75ug DNA/mlで調製されたDLPDを用いて調製した。
【0303】
(実施例15)
(アニオン性DLPDトランスフェクション活性)
図16に示されるように、アニオン性DLPDおよび標的化されたアニオン性DLPDは、MDA−MB−231細胞において、脂質としてDOTAP:CHOLを含有する従来のカチオン性LPDに匹敵するレベルでトランスフェクションコンピテントである。
【0304】
アニオン性脂質としてのDOPSまたはCHEMSの使用により、DOPGと比較してより高いトランスフェクション活性を有する処方物が生成された(図16A)。DOPS:Chol DLPDへのDSPE−PEG5K−LHRHの添加は、MDA−MB−231細胞において、DSPE−PEG5Kを含むかまたは含まない基準処方物よりも、1logよりも大きなトランスフェクションの増強を実証した。CHEMS処方物については、僅かなトランスフェクションの増強のみが、DSPE−PEG5K−LHRHの存在下で観察された(図16B)。しかし、DSPE−PEG5K−RGDリガンドによるトランスフェクションの増強は、DOPS処方物またはCHEMS処方物のいずれにおいても観察されなかったが、これらの処方物は、なおも高いトランスフェクションレベルを維持していた。
【0305】
DiI−標識DLPDへの細胞の結合を、FACS分析により調査した(表11)。表11に示されるデータは、単一の実験からのものである。アニオン性DLPDは、DOTAP:CHOL LPDを比較してより低い細胞結合を有することが示されたが、等価なレベルのトランスフェクション活性を実証した。これらのデータは、アニオン性DLPDが、カチオン性LPDと比較してトランスフェクション活性に関してより強力であることを示す。
【0306】
(実施例16)
(粒子サイズに対するアニオン性DLPDへの血清添加の効果)
インビボでのDLPD安定性についてのモデルとして、無血清培地でトランスフェクションを実施する前に、DLPDを、マウス血清中で37℃にて1時間予めインキュベートした。アニオン性DLPDは、DOTAP:CHOLカチオン性LPDと比較して、粒子サイズの増加に関して、血清により影響を受けなかった。DOPS:CHOLまたはDOPG:CHOL DLPDへの5mol%の標的化因子−ペグ化脂質結合体の添加によって、血清でのインキュベーションに関わらず粒子サイズが増加した(示していない)。しかし、2mol%のリガンドおよび8%の遊離の過剰DSPE−PEG5Kを使用することによって、本発明者らは、血清により媒介されるDLPDサイズの増加を回避することができた(図17)。示される処方物は、許容範囲内の粒子サイズを有した。
【0307】
(実施例17)
(DLPDトランスフェクション活性に対する血清添加の効果)
DLPDのインビボでのトランスフェクション活性に対する血清の効果を評価するために、無血清培地でトランスフェクションを実施する前に、DLPDを、マウス血清中で37℃にて1時間予めインキュベートした。カチオン性LPDについて観察されたように、血清でのインキュベーションは、トランスフェクション活性を減少させたが、この特定の実験において、血清でのインキュベーション後のトランスフェクション活性における減少は、通常観察されるものよりも小さかった(図18)。DOPS:CHOL処方物は、評価した他のアニオン性処方物と比較して、血清により媒介されるトランスフェクションの減少に対してより感受性であることが示された。この効果は、DLPDの粒子サイズにおける変化に関連しないようであった。さらに、予想された通り、10mol%のDSPE−PEG5KのDLPD処方物への添加は、1〜2logのトランスフェクション活性の減少を生じた。これは、DOTAP:CHOL:DSPE−PEG5Kで観察される減少に匹敵する。興味深いことに、5mol%のDSPE−PEG5K−LHRHのDLPD処方物への添加は、5%の過剰遊離DSPE−PEG5K−存在下でさえも、トランフェクションレベルを2log増強した。この効果は、標的化されたカチオン性LPDについて先に観察された効果に匹敵する(DOPG:CHOLおよびDOPS:CHOLについてのデータは示してない)。
【0308】
(実施例18)
(さらなるアニオン性処方物における粒子サイズおよびトランスフェクション活性に対する血清添加の効果)
MBA−MD−231細胞におけるLPDサイズおよびトランスフェクション活性に対する血清添加の効果を、図11Aおよび11Bに示す。アニオン性DLPD処方物は、カチオン性LPDと比較して、血清により媒介される粒子の凝集に対してより低い感受性であった。DOPS:CHOL処方物については、10%の過剰ペグ化脂質は、5%のDSPE−PEG5K−LHRHの存在と関連する、血清により媒介されるDLPDサイズの増加を防止することができなかった(示していない)。血清でのインキュベーション後のアニオン性DLPDのトランスフェクション活性は、血清に対してより低い感受性であるようである。しかし、pH感受性処方物については、サイズ増加に対する保護が観察されるものの、トランスフェクション活性は、CHEMS:DOPE処方物についての活性よりも低かった。2つの異なるCHEMSの塩を、上記のようにこの実験において試験し、そしてこれらの両方は、デキストロースにおける同一のトランスフェクション活性を実証した(CHEMS:DOPE***はモルホリン塩を示す)。しかし、モルホリン塩は、血清効果に対してより感受性のようであった。なぜならば、トランスフェクションが血清インキュベーション後に減少したからである(図19B)。
【0309】
(実施例19)
(CHO−K1細胞におけるアニオン性トランスフェクション)
トランスフェクション実験を、CHO−K1細胞において上記のように実施した。図20Aおよび20Bで観察されるように、MDA−MB−231細胞について先に示した結果と同様に、アニオン性CHEMS:DOPE処方物およびDOPS:CHOL DLPD処方物への10mol%のDSPE−PEG5Kの添加は、トランスフェクション活性において、2logの減少を生じた。この効果は、DOTAP:CHOL:DSPE−PEG5Kを用いて観察される効果に匹敵する。しかし、DLPD処方物への5%molのDSPE−PEG5K−LHRHの添加は、5%の過剰遊離DSPE−PEG5Kの存在下でさえも、全ての処方物について、トランスフェクションレベルを2log増強した(DOPS:CHOLおよびDOPG:CHOLのデータは示されていない)。この効果は、カチオン性LPDを用いて先に観察された効果に匹敵する。しかし、示される全ての処方物は、CHO−K1細胞におけるトランスフェクション活性を実証する。
【0310】
(実施例20)
(DNA/脂質/プロタミン/標的化因子複合体による腫瘍のインビボトランスフェクション)
6週齢と12週齢との間のヌードマウスに、0.5mlのPBSの総注射量で、2×106SKOV3−IP1ヒト卵巣癌細胞を腹腔内接種した。腫瘍細胞移植の6〜7週後、動物に、pCMV−lucプラスミドDNAおよびDNA/脂質/プロタミン/標的化因子の異なる処方物を、1.0mlの総量で注射した(5%デキストロースの最終的な等張性溶液)。動物を、処方物注射の16時間後に屠殺する。腫瘍塊を取り出し、そして溶解する。ルシフェラーゼタンパク質濃度を、上記のルシフェラーゼアッセイに従って決定した。
【0311】
あるいは、この動物に、治療的有用性を有する遺伝子(例えば、E1A遺伝子を含むプラスミド(Althea,San Diego,CA))を含むLPD処方物を注射し、腫瘍サイズおよび動物生存率をモニターし、そしてコントロール動物と比較して、この脂質複合体の治療効果を決定した。
【0312】
(実施例21)
(さらなるアニオン性透析DNA/脂質/プロタミン複合体のインビトロでの特徴付け)
表12に列挙されるような処方物のために、アニオン性透析DNA/脂質/プロタミン複合体(DLPD)を調製し、そして以下に記載される式に従って上記のように分析した。
【0313】
アニオン性脂質(DOPSまたはDOPG)およびコレステロール(55:45のモル比)またはCHEMS:DOPE(7:3のモル比)(pH感受性処方物)で構成される混合ミセルを、200mMのN−オクチル−B−D−グルコピラノシド(OGP)中で調製した。OGPにおける脂質の可溶化後、プロタミン:DNA複合体を混合ミセル溶液に添加し、そしてMilli−Q水(3回の溶液交換)に対して48時間かけて透析した。最後の溶液交換において、水を、20mM HEPES pH7.2で置換した。
【0314】
アニオン性DLPDの物理的特性を、上記のように評価し、処方物を、5%デキストロースUSP中でサイズ決定し、ゼータ電位を測定した。平均粒子サイズおよび(多分散値によって表した)集団サイズ分布を、表12に示す。代表的には、ゼータ電位は、pH4.5か7.5かのいずれかの5%デキストロース中において、DOPS:CHOLまたはDOPG:CHOL(55:45脂質モル比)のいずれかから構成されるアニオン性DLPDについて、−15〜−50mVの範囲である。興味深いことに、pH感受性処方物について、ゼータ電位は、pH7.5にて−42.0mV〜pH4.5にて+26.0mVまでシフトし、これは、pH感受性効果を明確に示している。表12に示したデータは、単回実験からのデータであり、これらの処方物を生成する5回の追加実験について観察されたデータを示している。ゼータ電位についてのSDを、同じサンプルからの5回の読み出しに基づいて算出した。
【0315】
DNAの最大到達濃度を決定するために、DNA用量滴定を、10mol%のDPSE:PEG5Kを含むか含まない、DOPS:CHOLまたはDOPG:CHOLのアニオン性処方物について行った。結果を表13に示し、この結果は、PEG処方物を用いて、1mlあたり125μgのDNAから1mlあたり150μgのDNAまでのDNA濃度まで、DOPS:CHOL DLPDを生成することが可能であることを示している。
【0316】
MDA−MB−231とともに1時間インキュベートした後に標識化されたアニオン性DLPD Di−Iに対する細胞結合%を表すFACS分析を、表14に示す。
【0317】
(実施例22)
(アニオン性透析DNA/脂質/プロタミン複合体のインビトロトランスフェクション)
アニオン性DLPDを、上で議論されるように調製した。5×104個のMDA−MB−231細胞を、24時間プレートし、その後、48ウェルプレート中で1ウェルあたり1μgのDNAを送達する処方物を用いてトランスフェクトした。細胞を、血清を含まない培地中で4時間トランスフェクトし、トランスフェクションから48時間後、ルシフェラーゼ発現のために収集した。Nは、1処方物群あたり6回の独立したトランスフェクションである。DOTAP処方物を、一般式:12ナノモル脂質(DOTAP:CHOL);2μgプロタミン:1μg DNAを使用して、生成した。アニオン性DLPDについて、53ナノモルの脂質;2μgのプロタミン:アニオン性DLPDについて1μg DNA、Xは、DSPE−PEG5Kを表し、そして10モル%にて取り込まれたDSPE−PEG5K−RGD/LHRHを使用した。
【0318】
図21に示されるように、アニオン性DLPDおよび標的化されたDLPDを、従来のカチオン性LPD(DOTAP処方物)に匹敵するレベルにて、MDA−MB−231細胞中で適切にインキュベートした。棒線は、MBA−MD−231細胞のアニオン性DLPDとのトランスフェクション後の、RLU/mgルシフェラーゼ発現を表す。さらに、DOPSまたはCHEMSをアニオン性脂質として使用することによって、DOPGと比較してより高いトランスフェクション活性を有する処方物を生成した。DSPE−PEG5K−LHRHをDOPS:Chol DLPDに加えることによって、DSPE−PEG5Kを含むか含まないベース処方物について、MDA−MB−231細胞中で、1logより大きいトランスフェクション増加が証明された。しかし、DSPE−PEG5K−RGDリガンドとのトランスフェクションの増加は、DOPS処方物においてもCHEMS処方物においても観察されなかった。CHEMS処方物について、DSPE−PEG5K−LHRHの存在下で、わずかなトランスフェクション増加のみが観察された。
【0319】
(実施例23)
(アニオン性透析DNA/脂質/プロタミン複合体に対する50%マウス血清の効果)
インビボでのDLPD安定性についてのモデルとして、DLPDを、50%マウス血清中で37℃にて1時間プレインキュベートし、その後、血清を含まない培地中でトランスフェクションを行った。結果を図22に示す。ここで、棒線は、5%デキストロース(黒棒)もしくは50%血清(斜線棒)中での37℃でのDLPDのインキュベーション後の、平均直径(nm)またはDLPDの多分散性を表わす。アニオン性DLPDは、DOTAP:CHOLカチオン性LPD(これは、血清インキュベーション後のサイズ増加に影響される)と比較して、粒子のサイズ増加について、血清によって影響を受けなかった。5mol%のリガンドを、DOPS:CHOLまたはDOPG:CHOL DLPDに加えることによって、血清インキュベーションを用いても用いなくても、粒子サイズの増加が生じた。しかし、2mol%のリガンドおよび8%の過剰遊離PEG血清媒介性DLPDを使用することによって、サイズ増加が回避された。
【0320】
インビボトランスフェクション活性についてのモデルとして、マウス血清中でのインキュベーション後のDLPDのトランスフェクション活性を測定した。DLPDを、50%マウス血清中で37℃にて1時間プレインキュベートし、その後、血清を含まない培地中でトランスフェクションを行い、結果を図23に示す。棒線は、5%デキストロース(黒棒)もしくは50%血清(斜線棒)中での37℃でのDLPDのインキュベーション後の、RLU/mgルシフェラーゼ発現(A)またはDLPDについてのベースPEG処方物(B)の倍数増加を表わす。5×104個のMDA−MB−231細胞を、24時間プレートし、その後、48ウェルプレート中で1ウェルあたり1μgのDNAを送達する処方物を用いてインキュベートした。細胞を、血清を含まない培地中で4時間トランスフェクトし、そしてトランスフェクションから48時間後に、ルシフェラーゼ発現のために収集した。Nは、1処方物群あたり6回の独立したトランスフェクションである。DOPS:CHOL処方物およびDOPG:CHOL処方物を、一般式:53ナノモル脂質(DOPS/G:CHOL:X);2μgプロタミン:1μg DNAを使用して、生成した。pH感受性処方物を、一般式:64.9ナノモル脂質(CHEMS:DOPE:X);2μgプロタミン:1μg DNAを使用して、生成した。DSPE−PEG5K−RGD/LHRHを、2mole%または5mole%で取り込み、そして非結合体化DSPE−PEG5Kを使用して、10mol%にて完了した。
【0321】
カチオン性LPDについて観察されるように、血清インキュベーションは、トランスフェクション活性を減少させるが、この特定の実験において、血清インキュベーション後のトランスフェクション活性の減少は、通常観察されるよりも小さかった。DOSP:CHOLは、評価された他のアニオン性処方物と比較して、血清インキュベーション後のトランスフェクション少により影響されやすいことが示された。この効果は、DLPD粒子サイズの変化とは無関係であるようであった。2mol%または5mol%にてDSPE−PEG5KをDLPD処方物に加えることによって、DOTAP:CHOL:DSPE−PEG5Kを用いた以前の観察に匹敵するトランスフェクション活性の2log減少が生じる。さらに5%の過剰遊離DSPE−PEG5Kの存在下にて、5%molのDSPE−PEG5K−DSPE−PEG5KLHRHをDLPD処方物に加えることによって、2logまでトランスフェクションレベルが増加し、この効果は、標的化カチオン性LPDについて観察されるトランスフェクショレベルに匹敵する。
【0322】
図24A)は、LPDサイズに対する血清の効果を表し、そして図24B)は、MBA−MD−231細胞のトランスフェクション活性に対する血清の効果を表す。棒線は、5%デキストロース(黒棒)もしくは50%血清(斜線棒)中での37℃でのDLPDのインキュベーション後の、A)における粒子の平均直径を表すか、またはB)におけるRLU/mgルシフェラーゼ発現を表わす。
【0323】
5×104個のMDA−MB−231細胞を、24時間プレートし、その後、48ウェルプレート中で1ウェルあたり1μgのDNAを送達する処方物を用いてインキュベートした。細胞を、血清を含まない培地中で4時間トランスフェクトし、そしてトランスフェクションから48時間後に、ルシフェラーゼ発現のために収集した。Nは、1処方物群あたり6回の独立したトランスフェクションである。DOPS:CHOL処方物およびDOPG:CHOL処方物を、一般式:53ナノモル脂質(DOPS/G:CHOL:X);2μgプロタミン:1μg DNAを使用して、生成した。pH感受性処方物を、一般式:64.9ナノモル脂質(CHEMS:DOPE:X);2μgプロタミン:1μg DNAを使用して、生成した。DSPE−PEG5K−RGD/LHRHを、5mole%にてインキュベートし、そして10mol%のDSPE−PEG5Kを使用した。***は、CHEMSモルホリン塩を表す。
【0324】
以前に観察されたように、アニオン性DLPDは、カチオン性LPDと比較して、血清媒介性粒子の濃縮に対してほとんど感受性ではなかった。DOPS:CHOL処方物について、10%の過剰PEGを加えることによって、DSPE−PEG5K−LHRHの存在と関連する血清媒介性DLPDサイズ増加を防ぐことができなかった。血清インキュベーション後のアニオン性DLPDトランスフェクション活性は、図23において以前に報告された結果とは反対に、血清に対してほとんど感受性ではなかった。しかし、pH感受性処方物についは、サイズ増加に対する保護が観察されたが、標的化効果は生じなかった。CHEMSの2つの異なる塩を、この実験において試験し、それら両方が、デキストロースにおいて同じトランスフェクション活性を有するようであるのに対して、モルホリン塩は、血清インキュベーション後にトランスフェクションが減少した場合、血清効果に対してより感受性であるようである。
【0325】
(実施例24)
(CHO−K1細胞おけるアニオン性DLPDトランスフェクション活性)
5×104個のMDA−MB−231細胞を、24時間プレートし、その後、48ウェルプレート中で1ウェルあたり1μgのDNAを送達する処方物とともにトランスフェクトした。細胞を、血清を含まない培地中で4時間トランスフェクトし、トランスフェクションから48時間後、ルシフェラーゼ発現のために収集した。Nは、1処方物群あたり6回の独立した処方物である。DOPS:CHOL処方物およびDOPG:CHOL処方物を、一般式:53ナノモル脂質(DOPS/G:CHOL:X);2μgプロタミン:1μg DNAを使用して、生成した。pH感受性処方物を、一般式:64.9ナノモル脂質(CHEMS:DOPE:X);2μgプロタミン:1μg DNAを使用して、生成した。DSPE−PEG5K−RGD/LHRHを、2mole%または5mole%で取り込み、そして非結合体化DSPE−PEG5Kを使用して、10mol%にて完了した。
【0326】
MDA−MB−231について図23および24B)に観察されるように、2mol%または5mol%のDSPE−PEG5Kをアニオン性DLPD処方物に加えることによって、図25に示されるように、CHO−K1細胞において、トランスフェクション活性の2log減少が生じる(棒線は、A)においてRLU/mgルシフェラーゼ発現を表すか、または5%デキストロース中で37℃にてDLPDインキュベートした後のDLPDに対するベース処方物を越える倍数増加B)を表す)。この効果は、DOTAP:CHOL:DSPE−PEG5Kでの以前の観察に匹敵する。しかし、5%の過剰遊離DSPE−PEG5Kの存在下でさえ、5%molのDSPE−PEG5K−LHRHをDLPD処方物に加えることによって、2logまでトランスフェクションレベルが増加した。この効果は、カチオン性LPDを用いた以前の観察に匹敵する。DSPE−PEG5K−LHRH媒介性トランスフェクション増加は、DOPS処方物またはDOPG処方物の存在によってのみ見られるようであり、この効果は、pH感受性処方物については、中程度であった。
【0327】
(実施例25)
(粒子サイズおよびトランスフェクション活性に対するアニオン性DNA濃度の効果)
上記のように調製されるアニオン性DLPDにおいて到達可能な最大DNA濃度を、下記のように試験した。DLPDを、75μg、100μg、125μg〜150μg DNA/mlの範囲のDNA濃度にて調製した。データを、表13および図26に示し、ここで、黒棒は、平均直径(nm)を表し、斜線棒は、アニオン性DLPDについての多分散性を表す。CHEMS:DOPE処方物について、150μg DNA/mlまでの濃度および150μg DNA/mlを含む濃度にて小粒子(<200nm)を調製することが可能だった。150μgより高い濃度は、濃縮した。しかし、DOPS:CHOL処方物およびDOPG:CHOL処方物について、濃縮は、150μg DNA/mlにて観察されなかった。DSPE−PEG5Kを、これらの処方物中に10mol%にて加えることによって、DLPDサイズは減少するようである。10mol%のDSPE−PEG5Kを使用することによって、125μg/mlにて、200nmより小さい平均粒子径を有する、DOPS:CHOL処方物およびDOPG:CHOL処方物を調製することが可能になった。
【0328】
異なるDNA濃度がDLPD活性に影響を及ぼすか否かを決定するために、Skov3−ip1細胞中で、インビトロトランスフェクションを実現した。5×104個のSkov3−ip1細胞を、24時間プレートし、その後、48ウェルプレート中で1ウェルあたり1μgのDNAを送達する処方物とともにトランスフェクトした。細胞を、血清を含まない培地中で4時間トランスフェクトし、トランスフェクションから48時間後、ルシフェラーゼ発現のために収集した。Nは、1処方物群あたり6回の独立したトランスフェクションである。DOPS:CHOL処方物およびDOPG:CHOL処方物を、一般式:53ナノモル脂質(DOPS/G:CHOL:X);2μgプロタミン:1μg DNAを使用して、生成した。pH感受性処方物を、一般式:64.9ナノモル脂質(CHEMS:DOPE:X);2μgプロタミン:1μg DNAを使用して、生成した。DSPE−PEG5Kを、処方物中に10molで取り込んだ。処方物の間にはトランスフェクション活性の有意な差異は観察されなかった(図27を参照のこと:ここで棒線は、DLPDについてのRLU/mgルシフェラーゼ発現を表す)。
【0329】
予測されるように、DSPE−PEG5KをDLPD処方物10mol%に加えることによって、DSPE−PEG5Kを含まないベース処方物と比較した以前の観察に匹敵するトランスフェクション活性の2log減少が生じる。DOPG処方物は、MDA−MB−231細胞において以前に観察されたように、トランスフェクション活性について機能しなかった。
【0330】
実施例21〜25によって例示されるように、アニオン性透析脂質−プロタミン−DNA(DLPD)処方物を生成し、そしてインビトロおよびインビボにおいて特徴付けた。DOPS(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−L−セリン])、DOPG(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−rac−1−グロセロール])およびCHEMS(ヘミコハク酸コレステリル)を、2:1(μgプロタミン:μg DNA)比で調製された正に帯電した硫酸プロタミン−DNA複合体と相互作用するように、アニオン性脂質として選択した。アニオン性脂質(DOPSまたはDOPG)および55:45のモル比のコレステロールまたは7:3のモル比のCHEMS:DOPE(pH感受性処方物)からなる混合ミセルを、200mMのN−オクチル−B−D−グルコピラノシド(OGP)中で調製した。OGP中の脂質溶解度に従って、プロタミン:DNA複合体を混合ミセル溶液に加え、そして3回の溶液交換を行いながら、Milli−Q水に対して48時間の間透析した。最終溶液交換において、水を、20mMのHEPES(pH7.2)と置き換えた。混合ミセルは、リポソーム配置の同じ脂質と比較して、粒子の濃縮を防止する点で、開始するのにより良好な脂質構造であるようである。プロタミン:DNAが2:1である過剰な硫酸プロタミンカチオン電荷に対するアニオン性脂質の6:1の電荷比を、DOPS:CHOLまたはDOPG:CHOLから構成されるアニオン性DLPDを生成するのに最も有効であることを示した(すなわち、2:1 μgプロタミン:μg DNAの1μg DNAについて、本発明者らは、8.2nmolの硫酸プロタミンと相互作用する、3.03nmolの負電荷を用いる)。この得られた複合体は、5.17nmolの過剰な正電荷を有する。DOPS:CHOLまたはDOPG:CHOLから構成されるアニオン性LPDを生成するために、アニオン性脂質から6倍の過剰なアニオン電荷が必要である。使用されるアニオン性脂質が、脂質1nmolあたり1nmolの正電荷を有する場合、DNA1μgあたり31.02nmolのDOPSまたはDOPGが必要であった。しかし、CHEMS:DOPE処方物について、過剰な硫酸プロタミンに対するアニオン性脂質の4:1の電荷比が、アニオン性DLPDを生成するのに十分であった(例えば、使用される1μgのDNAについて、20.68nmolのCHEMS(pH7.2)を使用した)。DPLD粒子サイズは、代表的には、200nm〜300nmの平均粒子径の範囲であり、それらのゼータ電位は、−35mV〜−50mVの範囲であった。
【0331】
アニオン性DLPDのトランスフェクション特性は、DLPD細胞結合がカチオン性LPDと比較して低いという観察にも関わらず、異なる細胞株(CHO−K1、MBA−MD−231)におけるインビトロのカチオン性LPDに匹敵する。LPDと比較して、DLPDの細胞への結合の減少は、DiI蛍光標識化DLPDを使用するフローサイトメトリによって証明された。5mol%の脂質結合体化リガンド(例えば、DSPE−PEG5K−黄体形成ホルモン(luteinizing hormone)放出ホルモン(DSPE−PEG5K−LHRH)またはDSPE−PEG5K−RGD(DSPE−PEG5K脂質アンカーに共有結合した1つのRGDモチーフを含有する11アミノ酸ペプチド))をアニオン性DLPD処方物中に加えることによって、巨大直径(0.5〜1μm)を有する粒子が生成された。これらの処方物において、脂質標的リガンドは、ベース処方物に対して、2logまでトランスフェクション活性を増加した。続いて、標的リガンドを含まない過剰なDSPE−PEG5KをDLPD処方物中に加えることによって(総DSPE−PEG5Kの10mol%まで)、標的リガンド含有DPLD処方物の粒子サイズは減少しなかった。しかし、10mol% DSPE−PEG5Kをアニオン性DLPD処方物に加えることによって、125μg DNA/mlまでのDNA濃度が可能になる。このような処方物の平均直径は、200nmより小さい。
【0332】
実施例21〜25において、インビトロにてカチオン性LPDと同じトランスフェクション活性を有するアニオン性DLPDの生成を、明確に実証する。アニオン性DLPDは、DOTAP:CHOL LPDと比較して、より低い細胞結合を有することが示されたが、同等レベルのトランスフェクション活性が証明された。これらのデータは、アニオン性DLPDが、カチオン性LPDと比較してトランスフェクション能力の点でより強力であることを示唆する。DSPE−PEG5K−RGDとは対照的に、DLPDへのSPE−PEG5K−LHRHの取り込みは、DSPE−PEG−DLPD処方物に対するトランスフェクション活性の増加を生じた。しかし、10mol% DSPE−PEG5Kの添加は、150μg DNA/mlにて調製されたこれらの処方物の調製を容易にする。
【0333】
(実施例26)
(NC12−DOPEおよびDSPE−PEG5K−フォレートを取り込んだアニオン性透析DNA/脂質/ポリカチオン複合体のインビトロでの特性付け)
NC12−DOPE(Shangguanら、(1998)Biochim Biophys Acta 1368,171−83)およびDSPE−PEG5K−フォレートを取り込んだアニオン性透析DNA/脂質/ポリカチオン複合体を、アニオン性DLPDについての上記の技術および以下に詳述される技術を使用して調製し、そしてNC12−DOPEおよびDSPE−PEG5K−フォレートの量を、以下のように処方した。
【0334】
代表的には、2922nmolのNC12−DOPE(1,2−ジオレオル−sn−グリセロ−3−[ホスホエタノールアミン−N−ドデカノイル](Avanti Polar lipid Inc,Alabaster Al、製品番号790384、ロット番号181PE−N120−15)を、クロロホルム(J.T.Baker,Phillipsburg NJ、カタログ番号9180)中で、2890nmolのDOPE(Avanti Polar lipid Inc,Alabaster Al、製品番号850725)とともに混合した。ホウケイ酸チューブ内の脂質混合物を、窒素下にて1時間、N−EVAPTMOrganomation(Berlin,MA)を使用して、4 LPMで乾燥した。形成された、得られた脂質フィルムを、200mMのN−オクチル−B−D−グルコピラノド(ODP,Sigma、St−Louis MO、カタログ番号O90001)0.15ml中で水和させ、3.874mMの最終脂質濃度を達成した。生成したミセル溶液を、超音波処理用浴槽(Laboratory supplies Co Inc.,Hicksville,NY、シリアル番号11463)を使用して、30秒間超音波処理した。pH感受性ミセルを、上記のように、1461.0nmolのヘミコハク酸コレステリルモルホリン塩(CHEMS)(Sigma,St−Louis MO、カタログ番号C−5763)および3409.0nmolのDOPEを使用して生成し、3.246mMの最終脂質濃度を達成した。
【0335】
ペグ化処方物について、ミセルを、上記および以下で簡単に要約されるように調製した。代表的には、標的DLPDを、2922nmolのNC12−DOPE、2893nmolのDOPE、および22.2nmolの1,2−ジステラオル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−5000(DSPE−PEG5K)(Avanti Polar lipid Inc,Alabaster Al、製品番号880220)を使用するか、または22.2nmolのDSPE−PEG5K−フォレート(ロット番号10107601)を使用して、調製した。DSPE−PEG5K−フォレートを、Northern Lipid Incorporated(Vancouver,BC)によって合成した。脂質混合物を、窒素下でエバポレートし、その後脂質を、200mM OGP中0.15mlの脂質と膜水和し(filmhydration)、そして上記のように処理した。
【0336】
アニオン性DLPDを用いてNC12−DOPE処方物が生成される可能性を評価するために、脂質比(アニオン性脂質 対 カチオン電荷のコンパクト化(compacted)DNA)の滴定を、この処方物中のヘルパー脂質の影響と比較して行った。アニオン性脂質:プロタミンコンパクト化DNAの電荷比(4:1、6:1および8:1)を評価し、ここで、これらの処方物は、NC12−DOPE:CHOL(1:1 mol比)、NC12−DOPE:DOPE(1:1 mol比)およびNC12−DOPE:DOPC(7:3 mol比)、から構成された。これらの処方物を、それらの平均粒子径および(多分散性の値によって表した)集団サイズ分布について特徴付けた。データを、表15に示し、ここで、NC12−DOPEベースのDLPD処方物を、38.9:2:1、58.9:2:1および77.9:2:1の比(nmolのアニオン性脂質:μgプロタミン:μg DNA)にて調製した。最終DNA濃度は、75μg/mlであった。処方物に従う数値比は、電荷比(プロタミンコンパクト化DNAの正電荷に対するアニオン性脂質の負電荷の比)を表す。NC12−DOPE:CHOLおよびNC12−DOPE:DOPEを、1:1の脂質mol比にて調製した。NC12−DOPE:DOPCを、7:3のmol比にて調製した。代表的には、DLPD平均直径は、100nm〜150nmの間であった。多分散値は、代表的には、0.5より低かった。
【0337】
(実施例27)
(NC12−DOPEを含有するアニオン性DNA/ポリカチオン複合体のトランスフェクション活性)
KB細胞中のNC12−DOPE含有LPDのトランスフェクション活性を、上記のように決定した。5×104個の細胞を、24時間プレートし、その後、48ウェルプレート中で1ウェルあたり1μgのDNAを送達する処方物とともにトランスフェクトした。細胞を、血清を含まない培地中で4時間トランスフェクトし、トランスフェクションから48時間後、ルシフェラーゼ発現のために収集した。Nは、1処方物群あたり6である。アニオン性脂質のナノモル:μgプロタミン:μg DNAの比が38.9:2:1、58.9:2:1および77.9:2:1であるNC12−DOPE:Xアニオン性DLPDを、調製した。脂質処方において、Xは、DOPC、DOPE、またはCHOLを表す。CHEMS:DOPE処方物について、129ナノモルの総脂質:2μgのプロタミン:1μg DNAのみを使用した。2:1のμgプロタミン:μg DNAの比の1μg DNAについて、3.03nmolの電荷が、8.2nmolの硫酸プロタミンと相互作用する。この得られた複合体は、アニオン性脂質を加える前に、5.17nmolの過剰な正電荷を有する。
【0338】
図28に示されるように、アニオン性DLPDは、KB細胞中で適切なトランスフェクション体であった。コレステロールおよびDOPEは、NC12−DOPEと併用して使用されるDOPCよりもより有効なヘルパー脂質(共脂質(co−lipid))であるようである。
【0339】
NC12−DOPE:Xから構成されるアニオン性DOPCを、3つの異なる電荷比(プロタミンコンパクト化DNA正電荷に対して、4倍、6倍および8倍の過剰なアニオン性脂質の負電荷)にて評価した。これらのアニオン性脂質が、脂質1nmolあたり1nmolの負電荷を有する場合、8nmolの負電荷が、最適なトランスフェクションを得るために必要であり、これは、プロタミンコンパクト化DNA1μgあたり77.92nmolのNC12−DOPEが受容可能なトランスフェクション活性を有するアニオン性DLPDを生成するのに最適であることを示している。
【0340】
(実施例28)
(NC12−DOPEを含有するアニオン性DLPDの細胞毒性)
インビトロアニオン性LPD処方物の細胞毒性を、1ウェルあたり3つの異なるDNA用量にてカチオン性LPDまたはアニオン性DLPDを有する、MTSアッセイを使用して決定した。MTSアッセイを、上記の方法の節で詳細に記載し、下記で要約する。図29において、縦列は、490nmにて読み出される、最適な密度(OD)を表す。5×103個のKB細胞を、24時間プレートし、その後、96ウェルプレート中で1ウェルあたり、0.1μg、1μgまたは5μgのDNAを送達する処方物を用いてインキュベートした。細胞を、血清を含まない培地中で37℃にて4時間、LPD処方物またはDLPD処方物とともにトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞培養培地を取り除き、そして、20μlのMTS試薬を含有する100μlの新鮮な細胞培養培地を、細胞に加え、そしてOD読み出しの前に、37℃にて2時間さらにインキュベートした。vNは、1処方物群あたり4個の独立したウェルである。
【0341】
結果は、DOTAP:CHOLカチオン性LPD処方物について、5μg DNA/ウェルのDNA濃度にて、明確なインビトロ細胞毒性を示す。CHEMS:DOPE処方物およびNC12−DOPE:DOPE処方物は、評価した全てのDNA濃度において、細胞毒性ではなかった。DOPS:CHOLは、5μg DNA/ウェルにおいて、いくつかのレベルの細胞毒性を示している。
【0342】
(実施例29)
(CHEMS:DOPE処方物におけるDSPE−PEG5K−フォレートのインビトロ滴定)
異なる濃度のDSPE−PEG5K−フォレートを含有するCHEMS:DOPEアニオン性DLPDを、KB細胞中でのトランスフェクション活性について評価した。この細胞株を、その高レベルのフォレートレセプター発現について選択した。わずかなリガンド用量効果が、0.1mol%〜10mol%の脂質結合体化リガンドで観察され、最大トランスフェクション増加は、図30に示されるように、0.1mol%および0.5mol%のDSPE−PEG5K−フォレートを含有する処方物で観察された。
【0343】
図30において、縦列は、KB細胞におけるRLU/mgルシフェラーゼ発現(A)またはベースPEG処方物(B)に対する倍数トランスフェクション増加を表す。5×104個の細胞を、24時間プレートし、その後、48ウェルプレート中で1ウェルあたり1μgのDNAを送達する処方物を用いてトランスフェクトした。細胞を、血清を含まない培地中で4時間トランスフェクトし、トランスフェクションから48時間後、ルシフェラーゼ発現のために収集した。Nは、1処方物群あたり6回の独立した処方物である。全ての処方物を、一般式:一般式:129ナノモル脂質(CHEMS:DOPE:X);2μgプロタミン:1μg DNAを使用して、生成した。DSPE−PEG5K−フォレートを、0.1mole%〜10mole%の範囲の濃度にて、処方物中に取り込んだ。
【0344】
(実施例30)
(異なるDNA濃縮剤を使用するコンパクト化DNAの調製)
種々のDNA濃縮剤の、DNAをコンパクト化する能力を、調査した。表16に示されるデータについて、濃縮されたDNAを、ポリカチオン:DNAが2:1および3.5:1の重量比にて濃縮、および0.143μg DNA/mlのDNA濃度にて、調製した。PEI、Eudgragit(登録商標)EPO、Eudragit(登録商標)、E100、およびPMOETMABを、Elan Pharmaceuticals(Dublin,IR)によって供給した。RRRRRRRHペプチドおよびKHKHKHKHKGKHKHKHKHKペプチドを、Research Genetics(ResGen,Invitrogen Corporation,Huntsville,AL)によって合成し、一方、スペルミジンをSigma(St.Louis,MO)から購入した。全てのカチオン性ポリマーを、H2O USP中に可溶化し、そしてpHを、5.5(硫酸プロタミンUSP溶液に匹敵するpH)に調整した。プラスミドDNAを、硫酸プロタミンについて上記のような、Orion SageTM(VWR、West Chester,PA)シリンジポンプ混合デバイスを使用して、これらのカチオン性ポリマーと、2:1の比で混合した。PEI、Eudgragit(登録商標)E100を、H2O USP中に可溶化し、そしてこの溶液を、HClで酸性化して安定性を増加させた。これらのポリマー溶液の最終pHは、pH3.0であった。評価した他のポリマーは、硫酸プロタミンUSP(pH約5.5)に匹敵するpHを有した。ポリマーDNA複合体を、直ちにサイズ決定し、そしてアニオン性脂質と混合してDLPDを生成した。
【0345】
これらの処方物を、プロタミンコンパクト化DNAベースの処方物と比較した。図16に示されるように、評価した全てのポリマーは、2:1または3.5:1のμg:μg比を使用した場合はいずれも、76nm〜300nmの範囲の平均直径を有する粒子内へと、DNAをコンパクト化することができた。例外は、スペルミジンを用いて作製した複合体(いずれかの電荷比にて巨大粒子が形成される)、およびPEIを用いて作製した複合体(3.5:1のμg:μg比)であり、巨大粒子の形成が、ポリマーをDNA溶液に加えた後に観察された。
【0346】
(実施例31)
(種々のDNA濃縮剤を用いたアニオン性DNA調製)
種々のDNA濃縮剤(カチオン性ポリマー/多合成ポリカチオン)を、プロタミンDNA複合体を他のカチオン性ポリマー−濃縮DNA複合体と置き換えることによって、それらのCHEMS:DOPEアニオン性DLPDトランスフェクション能力を増加させる能力について評価した。100nmから300nmの範囲の平均直径を有するアニオン性DLPDを、上記のように生成した。DNAは、処方物(この処方物は、コンパクト化されたDNA複合体に脂質を添加した直後に濃縮が見られる)がPEIまたはEudragit(登録商標)E100を含有すると予測した。
【0347】
10mol% DSPE−PEG5KをCHEMS:DOPE処方物に加えることによって、評価した両方の電荷比にて、PEI処方物の濃縮が回避された。同じ効果が、3.5:1の電荷比にて調製されたEudragit(登録商標)E100処方物について観察された。10mol% DSPE−PEG5Kは、3.5:1の電荷比にて調製されたスペルミン含有アニオン性脂質処方物の濃縮を回避するのに有効ではなかった。結果を、表17に示す。
【0348】
(実施例32)
(異なるDNA濃縮剤を使用したアニオン性DLPDの調製、SKOV3−ip1細胞におけるトランスフェクション活性に対する効果)
図31に示されるように、選択されたほとんどのカチオン性ポリマーは、プロタミンコンパクト化DNAに対して4〜5logまで遺伝子発現を増加させた(スペルミンコンパクト化DNA複合体は除く)。5×104個のSKOV3−ip1細胞を、24時間プレートし、その後、48ウェルプレート中で1ウェルあたり1μgのDNAを送達する処方物を用いてインキュベートした。細胞を、血清を含まない培地中で4時間トランスフェクトし、そしてトランスフェクションから48時間後に、ルシフェラーゼ発現のために収集した。Nは、1処方物群あたり6回の独立したトランスフェクションである。CHEMS:DOPE pH感受性処方物を、一般式:129ナノモルの総脂質;2μgのプロタミン:1μg DNAを使用して、生成した。
【0349】
CHEMS:DOPE脂質またはCHEMS:DOPE:DSPE−PEG5K脂質をポリマーコンパクト化DNAに加えることによって、ポリマーのみの処方物と比較して3〜4logまで、遺伝子発現が減少した。プロタミンコンパクト化DNAを除いて、CHEMS:DOPEの添加は、2:1の電荷比で調製された脂質を用いることなく、プロタミンコンパクト化DNAに対して3倍までトランスフェクションを増加した。10mol% DSPE−PEG5KをCHEMS:DOPEプロタミンコンパクト化ベース処方物に加えることによって、トランスフェクション活性は1/3に減少した。
【0350】
評価した他のポリマーは、プロタミンコンパクト化アニオン性処方物に対して、トランスフェクション増加を示さなかった(DSPE−PEG5Kを含むかまたは含まない、CHEMS:DOPE処方物中に取り込まれたPMOETMABを除く)。この特定の場合において、プロタミンコンパクト化DNA処方物を含有するCHEMS:DOPEアニオン性処方物に対して、3logのトランスフェクション増加が観察された。
【0351】
(実施例33)
(様々なDNA濃縮剤を用いるアニオン性DLPD調製、KB細胞におけるトランスフェクション活性に対する効果)
図32に示されるように、CHEMS:DOPEへのPMOETMABの添加は、DNAを3.5:1のμg:μg比でコンパクト化した場合に、遺伝子発現を、プロタミンDNA CHEMS:DOPE処方物より4倍増加させた。しかし、2:1の電荷比において、カチオン性ポリマーと濃縮したDNAを含有する処方物の評価されたもの全てに対して、プロタミンでコンパクト化されたアニオン性DLPD処方物を超える有意なトランスフェクション増強は、観察されなかった。
【0352】
トランスフェクションを、上記のように実施し、そしてCHEMS:DOPE pH感受性処方物を、一般的な処方(129ナノモルの全脂質 2μgプロタミン:1μg DNA)を使用して作製した。
【0353】
(実施例34)
(様々なDNA濃縮剤を用いるDNAのコンパクト化)
第二の実験において、様々なDNA濃縮剤の有効性を評価した。2つのカチオン性ペプチドである、RRRRRRRHおよびKHKHKHKHKGKHKHKHKHKを評価した。次いで、ペプチドでコンパクト化したDNA粒子を、プロタミンでコンパクト化したDNA粒子と比較し、その後、脂質を添加した。
【0354】
PEI、Eudgragit(登録商標)EPO、Eudragit(登録商標)E100、PMOETMAB、RRRRRRRHおよびKHKHKHKHKGKHKHKHKHKペプチドを、H2O USPに溶解し、そしてpHを5.5(硫酸プロタミンUSPに匹敵するpH)に調整した。硫酸プロタミンについて上に記載のように、プラスミドDNAを、これらのカチオン性ポリマーと、2:1の比(μg:μg)で、0.143mg/mlのDNA濃度で、Orion SageTM(VWR,West Chester,PA)シリンジポンプ混合デバイスを使用して混合した。ポリマー−DNA複合体を、即座にサイズ決定し、そしてアニオン性脂質と混合した。
【0355】
表18に示されるように、評価された全てのカチオン性ポリマーまたはDNA濃縮剤は、2:1のμg:μg比で使用した場合、DNAを、25nm〜121nmの範囲の平均直径の粒子にコンパクト化し得た。
【0356】
KHKHKHKHKGKHKHKHKHKペプチドは、DNAを、25nmの平均直径を有する非常に小さな粒子にコンパクト化した。
【0357】
(実施例35)
(種々の濃縮剤を用いる、NC12−DOPE含有脂質DNA複合体)
様々なDNA濃縮剤を用いて処方されたNC12−DOPEおよびCHEMSベースのアニオン性DLPDを、表19に示されるように処方した。0.5mol%のDSPE−PEG5KまたはDSPE−PEG5K−フォレートを含む処方物を調製した。粒子サイズの特徴付けおよび集団のサイズ分布(多分散性値によって表される)のデータを、表19に示す。代表的に、DLPDの平均直径は、100nmと300nmとの間であり、ほとんどの処方物が、0.5未満の多分散性値を示した。作製した全ての処方物は、−15〜−50mVの範囲の負のζ電位の値を示す。
【0358】
(実施例36)
(トランスフェクション活性に対する種々のポリマー−濃縮DNA複合体の評価)
図33は、コンパクト化されたDNAへの脂質の添加なしでの、コンパクト化されたDNAの様々な処方物のKB細胞におけるトランスフェクション活性を示す。図33において、棒は、KB細胞トランスフェクションの後の、ルシフェラーゼ発現のRLU/mgを表す。5×104個の細胞を24時間プレート化し、その後、48ウェルプレート中で、1μg DNA/ウェルを送達するポリマーでコンパクト化されたDNA処方物で、トランスフェクトした。細胞を、無血清培地中で4時間トランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ発現のためのトランスフェクションの48時間後に採取した。1つの処方物群あたりN=6の独立したトランスフェクション。KHは、KHKHKHKHKGKHKHKHKHKペプチドを表す。
【0359】
PEIでコンパクト化されたDNAは、硫酸プロタミンでコンパクト化されたDNAより2log増強されたトランスフェクションを示す。Eudragit(登録商標)EPOまたはE100でコンパクト化されたDNAは、硫酸プロタミンでコンパクト化されたDNAより1log増強されたトランスフェクションを示す。評価された他のポリマーは、硫酸プロタミンでコンパクト化されたDNAより増強されたトランスフェクションを示さなかった。全てのポリマー−DNA複合体を、2:1 μg:μgの比で調製した。
【0360】
(実施例37)
(様々なDNA濃縮剤を使用するアニオン性DLPD調製、CHEMS:DOPE処方物でのトランスフェクション活性に対する効果)
図34に示されるように、CHEMS:DOPE脂質を、ポリマーでコンパクト化されたDNAに添加することによって、遺伝子発現が、プロタミンでコンパクト化されたDNA単独の3分の1に減少する。図34において、棒は、KB細胞トランスフェクションの後のルシフェラーゼ発現のRLU/mgを表す。
【0361】
5×104個の細胞を24時間プレート化し、その後、48ウェルプレート中で、1μg DNA/ウェルを送達する処方物でトランスフェクトした。細胞を、無血清培地中で4時間トランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ発現のためのトランスフェクションの48時間後に採取した。1つの処方物群あたりN=6の独立したトランスフェクション。CHEMS:DOPE pH感受性処方物を、一般的な処方(129ナノモルの脂質 2μgカチオン性ポリマー:1μg DNA)を使用して作製した。KHは、KHKHKHKHKGKHKHKHKHKペプチドを表す。
【0362】
脂質を含まない、PEIでコンパクト化されたDNAの2logの減少が、PEIベースのアニオン性DLPD処方物と比較して、観察された。Eudragit(登録商標)EPO、Eudragit(登録商標)E100およびPMOETMABベースのアニオン性DLPD処方物は、脂質を添加しない、対応するポリマーでコンパクト化されたDNA単独より1logの減少を示した。RRRRRRRHペプチドの使用は、CHEMS:DOPEを用いて処方される場合に、ペプチドでコンパクト化されたDNA単独と比較して、トランスフェクション活性の2倍の増加を示した。トランスフェクション活性の変化は、KHKHKHKHKGKHKHKHKHKペプチドを含む処方物について、観察されなかった。
【0363】
(実施例38)
(様々なDNA濃縮剤を使用するアニオン性DLPD調製、CHEMS:DOPE:DSPE−PEG5K処方物でのトランスフェクション活性に対する効果)
図35において、棒は、KB細胞トランスフェクションの後のルシフェラーゼ発現のRLU/mgを表す。5×104個のKB細胞を24時間プレート化し、その後、48ウェルプレート中で、1μg DNA/ウェルを送達する処方物でトランスフェクトした。細胞を、無血清培地中で4時間トランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ発現のためのトランスフェクションの48時間後に採取した。1つの処方物群あたりN=6の独立したトランスフェクション。
【0364】
CHEMS:DOPE:DSPE−PEG5K pH感受性処方物を、一般的な処方(129ナノモルの脂質(CHEMS:DOPE:DSPE−PEG5K);2μgカチオン性ポリマー:1μg DNA)を使用して作製した。DSPE−PEG5Kを、0.5mol%でDLPD処方物に組み込んだ。KHは、KHKHKHKHKGKHKHKHKHKペプチドを表す。
【0365】
0.5mol%のペグ化(pegylated)脂質を、プロタミンでコンパクト化されたDNAを含有するCHEMS:DOPEアニオン性処方物に添加することによって、PEGを含まない同じ処方物と比較して、トランスフェクション活性の5分の1への減少を生じた。しかし、アニオン性DLPDがDSPE−PEG5Kの存在下で、DNA濃縮剤としてPEIを使用して処方される場合、トランスフェクション活性の減少は観察されなかった。Eudragit(登録商標)E100またはPMOETMABを使用して、DNAをコンパクト化し、非PEG保有処方物を超える、PEG保有処方物についてのトランスフェクション増強は、トランスフェクション活性の1logの増加を生じ、PEI含有アニオン性DLPDを用いて観察された絶対的なトランスフェクションレベルに近付いた。
【0366】
(実施例39)
(様々なDNA濃縮剤を使用するアニオン性DLPD調製、CHEMS:DOPE:DSPE−PEG5K−フォレート処方物でのトランスフェクション活性に対する効果)
図36において、棒は、KB細胞トランスフェクションの後のルシフェラーゼ発現のRLU/mgを表す。KB細胞のトランスフェクションは、実施例38に記載されるとおりであった。CHEMS:DOPE:DSPE−PEG5K−フォレート pH感受性処方物を、一般的な処方(129ナノモルの脂質(CHEMS:DOPE:DSPE−PEG5K−フォレート);2μgカチオン性ポリマー:1μg DNA)を使用して作製した。DSPE−PEG5K−フォレートを、DLPD処方物に0.5mol%で組み込んだ。KHは、KHKHKHKHKGKHKHKHKHKペプチドを表す。
【0367】
0.5mol%のDSPE−PEG5K−フォレート脂質リガンドを、本研究において評価されたほとんどのポリマーでコンパクト化されたDNAを用いて処方したCHEMS:DOPEアニオン性処方物に添加することによって、Eudragit(登録商標)E100またはPMOETMABでコンパクト化されたDNAを含有する処方物を除いて、ベース処方物より2〜20倍増加したトランスフェクションを生じた。図34および35において先に観察されたように、DNAコンパクト化剤としてPEIを使用して、アニオン性DLPDを処方した場合、トランスフェクションは、プロタミンでコンパクト化されたDNAを含有する同じ脂質処方物より1log増加した。
【0368】
(実施例40)
(様々なDNA濃縮剤を使用するアニオン性DLPD調製、NC12−DOPE:DOPE処方物でのトランスフェクション活性に対する効果)
図37において、棒は、KB細胞トランスフェクションの後のルシフェラーゼ発現のRLU/mgを表す。KB細胞トランスフェクションを、上記実施例においてと同様に実施した。NC12−DOPE:DOPE処方物を、一般的な処方(156ナノモルの脂質 2μgカチオン性ポリマー:1μg DNA)を使用して作製した。KHは、KHKHKHKHKGKHKHKHKHKペプチドを表す。
【0369】
図37に示されるように、NC12−DOPE:DOPEアニオン性脂質処方物の使用は、Eudragit E100を含む処方物を除いて、評価される全てのカチオン性ポリマーを用いて、CHEMS:DOPEアニオン性脂質を用いて処方された、同じポリマーと濃縮したDNAより、トランスフェクション活性を、2〜7倍増加させる。図33〜36において先に観察されたように、PEIは、最も高い絶対トランスフェクションレベルを、一定して与えた。
【0370】
(実施例41)
(様々なDNA濃縮剤を使用するアニオン性DLPD調製、NC12−DOPE:DOPE:DSPE−PEG5K処方物でのトランスフェクション活性に対する効果)
トランスフェクションを上記のように実施し、そして結果を図38に与える。
【0371】
0.5mol%のペグ化脂質を、カチオン性ポリマーでコンパクト化したDNAを含有するNC12−DOPE:DOPEアニオン性処方物に添加することによって、DSPE−PEG5K脂質添加なしの同じ処方物と比較して、2〜12倍のトランスフェクション活性の減少が生じる。DNAがPMOETMABでコンパクト化された処方物について、DSPE−PEG5K脂質添加なしの処方物より5倍増加したトランスフェクションが、観察された。図33〜37において先に観察されたように、PEIは、最も高い絶対トランスフェクションレベルを、一定して与えた。
【0372】
(実施例42)
(様々なDNA濃縮剤を使用するアニオン性DLPD調製、NC12−DOPE:DOPE:DSPE−PEG5K−フォレート処方物でのトランスフェクション活性に対する効果)
トランスフェクションを、上記のように調製された処方物を使用して、上記のように実施した。結果を図39に示す。ここで、棒は、KB細胞トランスフェクションの後のルシフェラーゼ発現のRLU/mgを表す。
【0373】
0.5mol%のDSPE−PEG5K−フォレート脂質リガンドを、様々なポリカチオン性DNAコンパクト化剤を用いて処方されたNC12−DOPE:DOPEアニオン性処方物に添加することによって、DSPE−PEG5Kを含有する対応するベース処方物より18〜2倍のトランスフェクションの増強が生じた。興味深いことに、プロタミンでコンパクト化されたDNAベースの処方物は、最も高いフォレート効果(18倍の増強)を示したが、PEIベースの処方物は、最も高い絶対トランスフェクションレベルを示す。PEI含有処方物についてのトランスフェクション活性データを、図40に示す。平均すると、PEI含有処方物は、プロタミンベースのアニオン性DLPD処方物と比較して、3〜20倍高いトランスフェクションレベルを示す。この効果は、DSPE−PEG5K保有処方物について、より顕著であった。
【0374】
図41は、様々なカチオン性ポリマーと濃縮したDNAを用いて作製された、CHEMS:DOPEおよびNC12−DOPEベースの処方物における、フォレートにより媒介されるトランスフェクション増強を示す。DSPE−PEG5K−フォレートをNC12−DOPE:DOPE処方物に組み込むことによって、DNAが硫酸プロタミンでコンパクト化された場合より18倍増強されたフォレート媒介トランスフェクションを示す。
【0375】
(実施例43)
(アニオン性DLPDζ電位に対するpHの影響)
アニオン性DLPDの正味の電荷に対するpHの効果を評価するために、ζ電位測定を、20mM HEPES緩衝液(pH7.2および4.2)において得た。表20に実証されるように、CHEMS:DOPEアニオン性処方物は、pHに対する感受性を示したが、NC12−DOPE:DOPEからなる処方物は、pH4.2において、ζ電位の変化を示さなかった。
【0376】
DLDPの平均直径を、単峰モードを使用して、pH7.2において測定した。CHEMS:DOPE pH感受性処方物を、一般的な処方(129ナノモルの脂質(CHEMS:DOPE)::2μgカチオン性ポリマー;1μg DNA)を使用して、作製した。NC12−DOPE:DOPE処方物を、一般的な処方(156ナノモルの脂質(NC12−DOPE::DOPE);2μgカチオン性ポリマー:1μg DNA)を使用して、作製した。ζ電位に対するSDを、同じサンプルからの5つの読み取りに基づいて計算した。n.d.とは、決定されなかったということである。
【0377】
実施例26〜43は、アニオン性脂質N−ドデカノイル−DOPE(NC12−DOPE)(フソジェニック(fusogenic)脂質)の、アニオン性の透析された脂質−プロタミン−DNA(DLPD)処方物への組み込みを詳述する。これらの結果を、CHEMS:DOPEからなる第一世代のアニオン性DLPDの最初の作製と比較した。先に記載されたように、混合ミセル形態のアニオン性脂質NC12−DOPE:DOPEは、2:1の比(μgプロタミン:μg DNA)で調製された正に荷電した硫酸プロタミン−DNA複合体と相互作用して、トランスフェクション可能なアニオン性脂質ベース粒子を生じる。
【0378】
NC12−DOPEからなるアニオン性粒子は、100〜300nmの範囲の平均直径値および−35〜−50mVの範囲のζ電位を有する。KB細胞における、NC12−DOPEアニオン性DLPDトランスフェクション特徴は、CHEMSベースの処方物に匹敵した。
【0379】
MTSアッセイにおいて決定されるように、アニオン性DLPDは、DOPS:CHOLからなるアニオン性処方物を除いて、DOTAP:CHOLカチオン性LPDと比較して、インビトロでの細胞傷害性が低いようであった。
【0380】
0.5mol%の脂質結合体化リガンド(例えば、DSPE−EPG5K−フォレート)を、アニオン性DLPD処方物に添加することによって、認容可能なサイズ100〜250nmの粒子を生じた。より興味深いことに、これらの脂質結合体化標的化因子は、ベース処方物より4〜6倍、トランスフェクション活性を増強させた。
【0381】
アニオン性DLPDへの、様々なカチオン性ポリマー(これらは、単独でトランスフェクション成分である)の組み込みもまた、調査され、そしてプロタミンでコンパクト化されたDNAベースの処方物と比較された。カチオン性ポリマー/DNAのこれらの新たな複合体を、NC12−DOPEおよびCHEMS:DOPE処方物に組み込み、その後、KB細胞におけるトランスフェクションを評価した。PEIを、DNAコンパクト化剤として、アニオン性脂質に添加して、アニオン性DLPD処方物を作製した。この処方物は、硫酸プロタミンベースの処方物と比較して、より高いトランスフェクション活性を示す。PMOETABでコンパクト化されたDNAもまた、アニオン性DLPDトランスフェクションを増強し得た。アニオン性脂質処方物に組み込まれたEudragit(登録商標)EPOおよびE100は、硫酸プロタミン含有処方物と比較して、KB細胞において、より低いトランスフェクション活性を有した。
【0382】
これらの実施例(実施例26〜43)において、アニオン性DLPDは、NC12−DOPEを使用して作製され得ることが、明らかに実証された。この新たなDLPD処方物は、CHEMS:DOPEアニオン性DLPD処方物に匹敵するか、またはそれより良好なレベルのトランスフェクションを示す。
【0383】
DSPE−PEG5K−フォレートは、試験された全てのNC12−DOPE処方物と適合性であり、そして18倍までのトランスフェクション増強を示す。0.1〜0.5mol%のDSPE−PEG5K−フォレートは、アニオン性DLPD処方物における使用のために最適な、DSPE−PEG5K−フォレートの濃度であるようである。
【0384】
PEI含有アニオン性DLPDは、硫酸プロタミン含有DLPDより高いトランスフェクションレベルを与えるようである。
【0385】
(実施例44)
(ポリ(プロピルアクリル酸)PPAAの、カチオン性DNA/脂質/プロタミン複合体への組み込み)
(リポソーム調製:) 6000nmolの1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン(DOTAP)(Avanti Polar lipid Inc,Alabaster Al,製品番号;890890、クロロホルム中20mg/ml)および6000nmolのコレステロール(Avanti Polar lipid Inc,Alabaster Al,製品番号;700000)をまた、クロロホルム(J.T.Baker,Phillipsburg NJ,カタログ番号;9180)中20mg/mlで調製した。これらの脂質を、ホウケイ酸ガラスチューブ中で混合し、そしてN−EVAPTM Organomation(Berlin,MA)を使用して、4LPMで窒素下で1時間乾燥した。得られた脂質フィルムを、2mlの5% USPブドウ糖(Abbott,Laboratories,North Chicago,Il カタログ番号;NDC−0074−7922−03 Lot 55−531−FW)中で水和して、6mMの最終脂質濃度を得た。生成した多重ラメラ小胞(MLV)を、超音波処理浴(Laboratory Supplies Co INC,Hicksville,NY,シリアル番号;11463)を使用して、30秒間超音波処理した。得られた脂質小胞をサイズ決定し、そして代表的に、Coulter sizer N4Plus(Beckman Coulter,Miami,FL,シリアル番号;AC52049)を使用して単峰モードで決定した場合に、300〜500nmの直径を有した。ペグ化されたリポソームについては、6000nmol DOTAP、4800nmolコレステロールおよび1200nmolの1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−5k](1,2−disteraoyl−sn−glycero−3−phosphoethanolamine−N−[methoxy(polyethylene glycol)−5k)(DSPE−PEG5k)(Avanti Polar lipid Inc,Alabaster Al,製品番号;880220)を、上記のように調製した。代表的に、標的化リポソームを、6000nmol DOTAP、4800nmolコレステロールおよび1200nmol DSPE−PEG5k−フォレート(ロット番号10107601)を使用して調製した。DSPE−PEG5k−フォレートを、Northern Lipid Incorporated(Vancouver,BC)によって合成した。
【0386】
標的化リポソームについて、DOTAP、コレステロール脂質フィルムおよびDSPE−PEG5k−フォレートを、20mg/mlでクロロホルムに可溶化し、そして上記のように、窒素下でエバポレートした。標的化リポソーム複合体を、HEPES 20mM(pH7.2)中で水和し、そしてDOTAP:コレステロールリポソームについて上に記載されるように、処理した。
【0387】
予めコンパクト化したDNA−プロタミン複合体の調製:を、方法において上に記載されるように実施した。
【0388】
(脂質−プロタミン−DNA(LPD)調製:) LPDを、Liら(1998)Gene Therapy 5:930−937)に記載されるように、調製した。簡単に言えば、脂質:プロタミン:DNA:の比の、12nmolの全脂質:1μgプロタミン:1μg DNAを、これらの実験のために使用した。代表的に、6mMの150μlのリポソームを、326μlの予めコンパクト化したDNA(230μg/ml)および22.5μlの20mM HEPES(pH7.2)と混合した。PPAA含有LPDについては、22.5μlのPPAA溶液(20mM HEPES中10mg/ml)を、上記のような22.5μlの20mM HEPESの代わりに、コンパクト化DNAに添加した。
【0389】
PPAAポリマーを、Allan Hoffman博士の研究室(University of Washington,Seattle,WA)から得た。PPAAの合成および特徴付けは、Lackeyら(1999)Bioconj.Chem.10:401−405;Murthyら(1999)J.Controll.Release 61:137−143およびWO 99/34831に記載されている。最終のLPD調製物を、サイズ決定し、そして代表的に、単峰モードを使用するN4Plus Coulterサイザーで、150〜200nmの平均直径を有した。表面ζ電位を、Malvernζサイザー(Malvern Instrument Inc,Sacramento,CA)を使用して決定した。代表的に、LPD処方物は、ペグ化脂質または脂質結合体化リガンドありおよびなしでは、正のζ電位を示し、そして20mM HEPES(pH7.2)中のPPAAの存在下では、負のζ電位を示した。
【0390】
(インビトロトランスフェクション:) トランスフェクションの16時間前に、500μl/ウェルの適切な培地(10% FBSを含む)中の5×104個の細胞、MDA−MB−231またはKB細胞(ATTC,Manassas,VA,カタログ番号HTB−26およびカタログ番号CCL−17)を、48ウェルプレート(Costar,Corning,NY,カタログ番号;3548)に播種し、そして10% CO2中37℃で一晩インキュベートした。翌日、培地を除去し、そして500μlの新鮮な無血清培地と交換した。トランスフェクションを、1μg DNA/ウェル(代表的に、LPDストック溶液から6.67μl)を使用して実施し、そして細胞を、10% CO2中37℃で4時間インキュベートした。1つのLPD処方物あたり6つの複製を試験した。
【0391】
トランスフェクション後、ルシフェラーゼ活性を、上記のようにアッセイした。
【0392】
(血清インキュベーション後のインビトロトランスフェクション評価:) 100μlのLPDを、トランスフェクション前に、100μlの20mM HEPES(pH7.2)または100μlの50%マウス血清(Cederlane Hornby,ON,カタログ番号CL8000 ロット番号;1054)中で、37℃で1時間インキュベートしたことを除いて、上記のように、トランスフェクションを実施した。血清インキュベーションの後のLPD処方物の平均直径を、上記のように、Coulterサイザーを使用して実施した。
【0393】
(MTS試薬を使用する細胞増殖アッセイ:) LPD細胞の毒性を、Promega(Promega Corporation,Madison,WI カタログ番号G5421)製の細胞タイター96 Aqueous非放射性細胞増殖アッセイを使用して、評価した。簡単に言えば、5×103個のKB細胞を、24時間プレート化し、その後、96ウェルプレート中で、1μg DNA/ウェルまたは5μg DNA/ウェルを送達する処方物と共に、インキュベートした。細胞を、無血清培地中で、LPD処方物と共に37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞培養培地を除去し、そして100μlの新鮮な細胞培養培地(20μlのMTS試薬を含む)を細胞に添加し、そして37℃で2時間インキュベートし、その後、OD(光学濃度)の読み取りを行った。
【0394】
(Di−Iで標識されたLPDの、細胞への結合:) LPDを、1,1’−ジオクタデシル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン過ヨウ素酸塩(DiI)(Molecular Probes,Eugene,OR,カタログ番号D−282)で標識した。Di−Iは、交換可能ではなく、代謝されない蛍光性脂質トレーサーである(Claassen(1992)J Immunol Methods 147:231−40)。
【0395】
代表的に、6.67μlのLPD(1μgのDNAを含む)を、93μlの20mM HEPES(pH7.2)中に希釈し、そしてメタノール中500μg/ml DiIの1μlのDiIストック溶液を、このLPD溶液に添加した。LPDを、使用前に、室温で30分間インキュベートした。100μlの蛍光性LPDを、1×106個の細胞と共に、37℃で1時間インキュベートし、次いでPBS中で3回洗浄し、そして1.0mlの2%パラホルムアルデヒド溶液中に再懸濁させた。1サンプルあたり10000個の細胞を、上記のように、BD FACSで分析した。
【0396】
LPD処方物へのPPAAの用量滴定を実施し、そして処方物をサイズ決定し、そしてζ電位を、20mM HEPES(pH7.2およびpH4.2)中で測定した。平均粒子サイズおよび集団サイズ分布(多分散性値によって表される)を評価し、そしてその結果を表21に示す。代表的に、DOTAP:CHOLからなるLPDは、150〜300nmの平均直径を示した。PPAAを処方物に添加することによって、処方物のサイズが、400〜500nmの範囲に増加した。LPDのζ電位は、以前に、1:1の脂質モル比および12:1:1nmol脂質:μgプロタミン:μg DNA中のDOTAP:CHOLからなる処方物について、+30〜+45mVの範囲であると報告されている。PPAAを、このようなLPD処方物に、3μg以上のPPAA/μgプロタミンコンパクト化DNAの比で組み込むことによって、LPD表面電位が、−35〜−20mVの範囲の負の値に変化した。ζ電位を、HEPES(pH4.2)中で測定した場合、正のζ電位値が得られた。表21に示されるデータは、単一の実験からのものである。
【0397】
図42AおよびBは、PPAAのLPD処方物への組み込みが、PPAAが予めコンパクト化されたDNAに直接添加された場合に、KB細胞におけるインビトロでのトランスフェクションを、3μg PPAA/μgコンパクト化プロタミン−DNAの比で、10倍増加させることを示す。対照的に、1μgのDNAあたり6μg PPAAの比での、完全LPDへのPPAAの添加はまた、12:1:1(nmol脂質;μgプロタミン:μg DNA)で、10倍のトランスフェクション増強を生じた。しかし、LPDが12:2:1の比で調製された場合、3.75μg PPAA/μg DNAが、ベースのLPD処方物より10倍増強したトランスフェクションを得るために必要とされた。図42AおよびBにおける縦の列は、KB細胞におけるトランスフェクションの後のルシフェラーゼ発現のRLU/mgを表す。図42CおよびDは、KB細胞においてベースPEG処方物と比較されたAおよびBにおいて与えられたデータの、増強の倍数を表す。5×104個の細胞を、24時間プレート化し、その後、48ウェルプレートにおいて、0.1μg DNA/ウェルを送達する処方物でトランスフェクションした。細胞を、無血清培地中で4時間トランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ発現のために、トランスフェクションの48時間後に採取した。1つの処方物群あたりN=6の独立したトランスフェクション。全ての処方物を、一般的な処方(12ナノモルの脂質(DOTAP:CHOL);1μgプロタミン:1μg DNA)を使用して作製した。様々な比のPPAA:μg DNAを、上記のように、LPD処方物に組み込んだ。
【0398】
(実施例45)
(カチオン性DNA/脂質/プロタミン複合体におけるポリ(アクリル酸)PPAAのプロトン化)
PPAA含有カチオン性LPDを、実施例44に記載されるように調製した。7.2〜4.2の範囲の様々なpH値で調製された20mM HEPES使用するpH滴定によって、PPAA含有LPDのプロトン化を決定し、そして処方物のζ電位の付随する変化もまた、モニタリングした。線は、図43Aにおいてはζ電位を表し、そして図43Bにおいては平均LPD直径を表す。全ての処方物を、一般的な処方(12ナノモルの脂質(DOTAP:CHOL);1μgプロタミン:1μg DNA;および3μg PPAA/プロタミンでコンパクト化されたDNAのμg)を使用して調製した。この特定の実験において、PPAAを直接、コンパクト化DNAに添加し、その後、リポソームを添加した。データは、PPAAを含むLPDが、5.5未満のpHにおいて電荷を逆転させ、一方で従来のLPDは、評価された全てのpHにおいて、同じ電荷を維持したことを示す(図43A)。この効果はまた、LPD平均直径に反映された。PPAAを含有する粒子は、pHの低下に比例するサイズ増加を示したが、従来のPPAAを含まないLPDの平均直径は、影響を受けなかった(図43B)。
【0399】
(実施例46)
(マウス血清における、ポリ(アクリル酸)PPAA含有カチオン性DNA/脂質/プロタミン複合体の安定性)
インビボでのLPD安定性のモデルとして、予めコンパクト化されたDNAに添加された、PPAAを含まないかまたは含むLPDを、マウス血清中で37℃で1時間予備インキュベートし、その後、サイズ測定およびトランスフェクション評価を行った。表22に示されるように、DSPE−PEG5kまたはDSPE−PEG5k−フォレートを、LPD処方物に、2mol%および10mol%で添加して、血清中での粒子安定性を増加させ、そして類似のサイズの粒子の形成を促進した。予測どおりに、LPD処方物へのDSPE−PEG5kの添加は、PPAAを含むか含まないかにかかわらず、150〜300nmの範囲の大きさのLPDを生じた。PPAAを含まないPEG保有処方物は、約150nmの平均粒子サイズを有する傾向があるが、PPAAの存在下では、平均粒子サイズは、200〜300nmの範囲である傾向がある。表22は、PPAAのLPDへの組み込みの、単峰モードで測定された場合の粒子平均直径およびζ電位に対する効果を示す。LPDを、12:1:1の比(nmol脂質;μgプロタミン:μg DNA)で調製した。LPD処方物中の最終的なDNA濃度は、150g DNA/mlであった。
【0400】
KB細胞におけるインビトロトランスフェクションの際の、LPD、LPD−PEGまたはLPD−PEG−フォレートへの、PPAAの添加を評価し、そしてその結果を図44に示す。マウス血清における評価のために、LPDを、50% HEPES 20mM(pH7.2)中または50%マウス血清中で、37℃で1時間インキュベートし、その後、0.1μg DNA/ウェルを使用して、細胞をトランスフェクションした。5×104個の細胞を、24時間プレート化し、その後、48ウェルプレートにおいて、0.1μg DNA/ウェルを送達する処方物でトランスフェクションした。細胞を、無血清培地中で4時間トランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ発現のために、トランスフェクションの24時間後に採取した。1つの処方物あたりN=6の独立したトランスフェクション。全ての処方物を、一般的な処方(12ナノモルの脂質(DOTAP:CHOL:X);1μgプロタミン:1μg DNA)を使用して作製した。DSPE−PEG5KおよびDSPE−PEG5K−フォレートを、2モル%および10モル%の比で組み込んだ。3μg PPAA/プロタミンでコンパクト化されたDNAのμgを、この特定の実験において使用した。PPAAを、コンパクト化DNAに直接添加し、その後、リポソームを添加した。PPAAを含むLPDは、PPAAを含まない同じ処方物より1〜3log増強したトランスフェクションを示す。さらに、この効果は、血清で処理されたサンプルと類似であるか、またはこのサンプルより優れていた。LPD、LPD−PEGおよびLDP−PEG−フォレートへの、PPAAの組み込みの、KB細胞のインビトロトランスフェクションに対する効果を、図44に示す。縦の列は、ルシフェラーゼ発現のRLU/mg、またはPPAAを含まないベース処方物より増強したトランスフェクションの倍数を表す。細胞を、0.1μg DNA/ウェルでトランスフェクトし、その後、トランスフェクションLPDを、20mM HEPES(pH7.2)中または50%マウス血清中で、37℃で1時間インキュベートした。
【0401】
(実施例47)
(KB細胞におけるインビトロトランスフェクションに対する、PPAAを含むLPDまたはPPAAを含まないLPDへのDSPE−PEG5K−葉酸添加の効果)
5×104KB細胞を、48ウェルプレート中1μgDNA/ウェルを送達する処方物でのトランスフェクションの24時間前にプレートした。細胞を、無血清培地中で4時間トランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ発現のためにトランスフェクション24時間後に収集した。1処方物グループあたりN=6の独立したトランスフェクションであった。すべての処方物を、一般式:12ナノモル脂質(DOTAP:CHOL:X);1μgプロタミン:1μgDNAを使用して生成した。DSPE−PEG5KおよびDSPE−PEG5K−葉酸を、2モル%比よび10モル%比で組み込んだ。図45は、2モル%または10モル%のDSPE−PEG5K−葉酸を含むLPD処方物についてベースPEG処方物に対するトランスフェクションの倍数増加を示す。
【0402】
(実施例48)
(細胞毒性に対するPPAAの効果)
MTSアッセイを実施して、細胞毒性に対するPPAAの効果を決定した。96ウェルプレート中に1μgDNA/ウェルまたは5μgDNA/ウェルを送達する処方物でのインキュベーションの24時間前に、5×103KB細胞をプレートした。細胞を、無血清培地中で37℃にて4時間LPD処方物とともにインキュベートし、インキュベーション後に、細胞培養培地を除去し、そして20μlのMTS試薬を含む100μlの新鮮な細胞培養培地を細胞に添加し、そしてOD読み取りの前に37℃にて2時間インキュベートした。1処方物グループあたりN=6の独立したトランスフェクションであった。すべての処方物を、一般式:12ナノモル脂質(DOTAP:CHOL:X);1μgプロタミン:1μgDNAを使用して生成した。DSPE−PEG5KおよびDSPE−PEG5K−葉酸を、2モル%比よび10モル%比で組み込んだ。
【0403】
図46に示される結果は、上記のように調製された(PPAAを含むかまたは含まない)DOTAP:CHOL LPD中へのDSPE−PEG5KまたはDSPE−PEG5K−葉酸の添加が、5μgDNAウェル濃度でLPD関連細胞毒性を減少したことを示す。興味深いことに、PEG含有脂質を含まないPPAAもまた、インビトロでLPD関連細胞毒性を減少した。カラムは、490nmでの光学密度(OD)読み取りを示す。
【0404】
(実施例49)
(細胞結合に対するインビトロでのPPAAの効果)
上記のように調製したLPDを、蛍光脂質トレーサーであるDiIで標識し、そして細胞へのLPD結合を、フローサイトメトリーにより評価した。表23に示される結果は、ペグ化LPD処方物と比較した従来のLPDによる、より高いパーセンテージの細胞への結合を示す。これらの結果は、非特異的静電的LPD細胞結合を減少するためにペグ化脂質を使用する概念を支持する。予期されるように、LPD処方物中へのDSPE−PEG5K−葉酸の添加は、LPD細胞結合を有意に回復した。しかし、PPAAの使用は、LPD細胞結合を減少させた。興味深いことに、PPAAの存在下で、PEGベース処方物を超えるDSPE−PEG5K−葉酸媒介細胞結合は、優れており、PPAAを含まない処方物について1.2倍優れているのと比較して、PPAA含有処方物について2.3倍増加した。しかし、総平均蛍光強度に関して、PPAA含有複合体を含む細胞へのLPD結合は、評価したすべての処方物について、2分の1から5分の1であった。
【0405】
(実施例49)
(PPAA含有LPD平均直径およびζ電位に対する、DSPE−PEG5K−葉酸の%比の効果)
2モル%比のDSPE−PEG5K−葉酸が、インビトロで特異的葉酸媒介トランスフェクション増加を示すに十分であったことが、上記に示された。しかし、インビボでマウス腫瘍モデルにおいて、2モル%のDSPE−PEGは、静脈内LPD投与後の腫瘍遺伝子発現を可能にするに十分ではなかった。より低いリガンドモル比でLPD安定性を増加させかつLPD標的化効果を有するために、異なるパーセンテージのDSPE−PEG2Kを、2モル%のDSPE−PEG5K−葉酸を含有するLPD処方物中に組み込んだ。結果を、表24中に示す。これらのDSPE−PEG2K含有LPDについて、粒子サイズに対する有意な効果は観察されなかった。
【0406】
ζ電位測定は、pH7.2の負のζ電位からpH4.2の正のζ電位へのシフトを示す。興味深いことに、このζ電位シフトは、PEG保有処方物と比較して、非保有PEG処方物についてより顕著であった。試験した処方物すべてについて、PPAAを含まない処方物について予期されたように、そのpHの関数としてのζ電位のシフトは観察されなかった。
【0407】
LPDは、12:1:1の比(ナノモル脂質;μgプロタミン:μgDNA)で調製した。LPD処方物中の最終DNA濃度は、150μgDNA/mlであった。結果を、表24中に要約する。
【0408】
低いリガンド:モル比でLPD安定性を増加させかつLPD標的化効果を有するために、異なるパーセンテージのDSPE−PEG2Kを、2モル%のDSPE−PEG5K−葉酸を含有するLPD処方物中に組み込んだ。PPAAを含む処方物またはPPAAを含まない処方物についてのトランスフェクション活性を、KB細胞において調査した。5×104KB細胞を、48ウェルプレート中0.1μgDNA/ウェルを送達する処方物でのトランスフェクションの24時間前にプレートした。細胞を、無血清培地中で4時間トランスフェクトし、そしてルシフェラーゼ発現のためにトランスフェクション24時間後に収集した。1処方物グループあたりN=6の独立したトランスフェクションであった。すべての処方物を、一般式:12ナノモル脂質(DOTAP:CHOL:X;Y);1μgプロタミン:1μgDNAを使用して生成した。XおよびYは、上記に示されるような異なるモル%比でLPD処方物中に組み込んだPSPE−PEG5KおよびDSPE−PEG5K−葉酸を表す。3μgPPAA/μgのプロタミンコンパクト化DNAを、この特定の実験において使用し、PPAAを、リポソーム添加の前にコンパクト化DNAに直接添加した。
【0409】
LPD、LPD−PEG、またはLPD−PEG−葉酸へのPPAAの添加は、PPAAを含まない同じ処方物に対して1log〜2logのトランスフェクション増加を示す(図47)。カラムは、図47A)においてRLU/mgルシフェラーゼ発現を示し、図47B)においてベースPEG処方物を超えるトランスフェクション倍数増加を示す。DSPE−PEG5Kを含む処方物またはDSPE−PEG5K−葉酸を含む処方物へのDSPE−PEG2Kの添加の効果もまた、決定した。LPD処方物中へのDSPE−PEG2K添加は、より良好な膜表面遮蔽を生じ、結果として、リポソーム膜との血液タンパク質の相互作用を減少した。図47中に示されるように、5モル%および8モル%のDSPE−PEG2Kを含む処方物ならびに2モル%のDSPE−PEG5K−葉酸を含む処方物は、PPAAトランスフェクション増加を示さなかった。しかし、2モル%のDSPE−PEG2Kを含むLPD処方物ならびに2モル%のDSPE−PEG5K−葉酸を含むLPD処方物について、PPAAの添加は、PPAAを含まない同じ処方物に対して1log分、トランスフェクションを増加した。
【0410】
(実施例50)
(PPAA含有LPDの平均直径、ζ電位、およびトランスフェクション活性に対する、PPAA/DNA比の効果)
DOTAP:CHOL含有LPD、DOTAP:CHOL−DSPE−PEG含有LPD、およびDOTAP:CHOL:DSPE−PEG−葉酸PPAA含有LPDを、上記のように調製し、KB細胞のトランスフェクションもまた、上記のようにそして表25に列挙されるように実施した。処方物を、2%PEG組み込み(図48A〜C)および10%PEG組み込み(図48DおよびE)の両方で調製した。
【0411】
図48A〜Cに示されるように、PPAA/DNA比を減少させると、インビトロトランスフェクション活性の増加を生じた。しかし、2.5μg未満のPPAA/μgDNAは、その処方物中へのPEGの組み込みにも関わらず、平均直径の増加をもたらした(表25)。
【0412】
(実施例51)
(インビトロでのPPAA媒介トランスフェクションに対するリソソーム破壊剤(Lysomotrophic)の効果)
DOTAP:CHOL含有LPD、DOTAP:CHOL−DSPE−PEG含有LPD、およびDOTAP:CHOL:DSPE−PEG−葉酸PPAA含有LPDを、上記のように調製し、そして0.1μg/ウェルDNAでのKB細胞のトランスフェクションもまた、上記のように実施した。エンドソーム酸性化を予防可能であるリソソーム破壊剤((クロロキン(エンドソーム中で弱塩基性プロトン化された抗マラリア薬)またはバフィロマイシンA(エンドソームに侵入するプロトンの量を減少する特異的ATPアーゼインヒビター)のいずれか)を、細胞にLPDを添加する1時間半前に、種々の量でトランスフェクション混合物に添加した。
【0413】
結果を、図49〜51に示す。1600nMのクロロキンは、PPAA媒介トランスフェクションをブロックし、PPAA媒介トランスフェクション増加を排除した。10ng/ウェルのバフィロマイシンAもまた、PPAA媒介トランスフェクションをブロックするようであった。これらの結果から、PPAA媒介トランスフェクション増加は、エンドソーム酸性化に依存するようである。
【0414】
(実施例52)
(インビトロ補体活性化に対する、LPD処方物中へのDSPE−PEG5K組み込みおよびDSPE−PEG5K−葉酸組み込みの効果)
プラスミドDNApCMVinlucを含むLPD処方物、プラスミドDNApCMVinlucを含む遮蔽されたLPD処方物(2モル%または10モル%のいずれかで組み込まれたLPD−PEG5K)、そしてプラスミドDNApCMVinlucを含む標的化遮蔽されたLPD処方物(2モル%または10モル%のいずれかで組み込まれたLPD−PEG5K−葉酸)を、記載されるように調製した。脂質:プロタミン:DNA比が12nmol総脂質:1μgプロタミン:1μgDNAを、すべての実験について使用した。
【0415】
補体オプソニン作用を、Ahlら(Ahlら、1997(上記))に記載されるように実施した。簡単に述べると、アッセイされるべき、LPD処方物、遮蔽されたLPD処方物(2モル%または10モル%のいずれかで組み込まれたLPD−PEG5K)、そして標的化遮蔽されたLPD処方物(2モル%または10モル%のいずれかで組み込まれたLPD−PEG5K−葉酸)を、まず、新たに再構成した凍結乾燥補体ポジティブヒト血清(Sigma,St.Louis,MO)とともに37℃で30分間インキュベートした。最終LPD脂質濃度は、これらのインキュベーションにおいて常に0.9mMであった。そのヒト血清を、ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)(Life Technologies,Gaithersburg,MD)を使用して6倍希釈した。その後、このLPD処方物とのインキュベーション後のこの血清中の補体レベルを、活性化ヒツジ赤血球(BioWhittaker,Inc.,Walkersville,MD)の補体依存性溶血を使用して、標準的臨床手順(Stites and Rogers,1991)に従って決定した。50%溶血を生じる血清希釈物(すなわち、CH50値)は、血清補体レベルと正比例する。LPD処方物とのインキュベーション後の血清CH50値中のパーセンテージの減少は、LPD誘導補体活性化のレベルを示し、従って、LPD補体オプソニン作用のレベルを示す。CH50値を、フォン・クロフ方程式のlog−logバージョンへの直線適合によって計算した。すべてのLPD−PEG5K処方物またはLPD−PEG5K−葉酸処方物を、ポジティブコントロールとしてのPBS緩衝液および非改変LPD処方物とともにアッセイした。非活性LPD処方物は、常に、高レベルのヒト補体オプソニン作用を有した。非改変LPDは、代表的には、本発明者らの実験条件下で、少なくとも90%、血清CH50レベルを減少した。すべてのLPD−PEG5K処方物またはLPD−PEG5K−葉酸処方物のオプソニン作用パーセンテージを、その処方物およびコントロールについてのCH50値を使用して、下記に示される方程式によって計算した。
【0416】
オプソニン作用=100×(CH50PBS−CH50LPC処方物)/CH50PBS−CH50非改変LPD)。
【0417】
LPD処方物を、遮蔽された処方物または標的化遮蔽された処方物と比較するために、ベースLPD処方物についてのCH50の減少を、100%オプソニン作用として規定した。表26中に示されデータは、DSPE−PEG5K LPD処方物またはDSPE−PEG5K−葉酸LPD処方物中に2モル%のPEG5Kを組み込むと、その複合体のオプソニン作用に対して感知できる効果をほとんど有さなかったことを示す。10モル%のDSPE−PEG5KまたはDSPE−PEG5K−葉酸を含むLPD処方物は、そのオプソニン作用レベルを、60%および77%の非改変LPD処方物にまで有意に減少させることが見出された。
【0418】
実施例44〜52において、LPD処方物中へのポリ(アクリル酸)PPAAの組み込みを記載し、生じる処方物を特徴付ける。PPAAは、エンドソームのpHでの膜破壊能力について公知のpH感受性ポリマーである(Staytonら(2000)J.Controll.Release 65:203〜220)。そのようなポリマーの添加は、特定の比≧3μgPPAA/μgDNAでのLPD処方物と匹敵した。この比は、トランスフェクション増加に関して最適の結果を生じるようである(PPAAを含まない処方物を1log上回る)。LPD中にPPAAを組み込む2つの方法を調査し。PPAAを、リポソーム添加の前にプロタミンコンパクト化DNAにかまたは最終LPD処方物に直接にかのいずれかで、添加した。結果は、PPAAがコンパクト化DNAに直接添加された最初のアプローチが、さらなる研究のためにより適切であったことを示した。処方物中へのPPAAの添加は、LPD平均直径を、従来のLPDについての約200nmから、PPAA含有LPD処方物についての400〜800nmまで増加させる。しかし、2モル%から10モル%の範囲のモル比のDSPE−PEG5Kまたは脂質−結合体化リガンド(例えば、DSPE−PEG5K−葉酸)の添加は、PPAA媒介LPDサイズ増加を防いだ。LPD中へのPPAA組み込みは、KB細胞におけるインビトロトランスフェクションを10〜100倍増加した。さらに、PPAAを含むLPD処方物中へのDSPE−PEG5KまたはDSPE−PEG5K−葉酸の添加は、PPAAを含まないDOTAP:COHL:DSPE−PEG5Kベース処方物またはPPAAを含まないDOTAP:COHL:DSPE−PEG5K−葉酸LPDベース処方物を2〜3log超えるまでトランスフェクションを増加した。このトランスフェクション増加は、トランスフェクション評価前にマウス血清中に37℃にて1時間インキュベーションした後でさえ、保存または改善された。興味深いことに、PPAAを含有するトランスフェクション増加処方物が、pH7.2での負のζ電位からpH4.2での正のζ電位への、そのζ電位のシフトを示した。このことは、おそらくpH感受性ポリマーに関連するpH感受性効果を示した。
【0419】
実施例44〜52において、PPAAが、対応するLPDベース処方物を超えてトランスフェクション活性を増強する能力が、示される。3:1μg PPAA:μgDNA比でのプロタミンコンパクト化DNAへのPPAAの添加は、LPD媒介KB細胞トランスフェクションを10〜100倍増強した。他の比もまた、トランスフェクションを増加することが観察された。
【0420】
ζ電位測定値により示されるように、PPAAは、約5.5のpKaを有するようである。PPAAは、MTSアッセイを使用して示されるように、LPDと関連するインビトロ細胞毒性を減少するようである。この結果は、FACS分析により示されるように、より低い粒子結合と相関付けられ得る。興味深いことに、DSPE−PEG5KまたはDSPE−PEG5K−葉酸の添加は、PPAA媒介LPDサイズ増加を減少するようである。何の血清媒介凝集も、PPAAを含むPEG LPDについて観察されなかった。PPAAを含むLPDは、中性pHでの負から酸性pHでの正へのζ電位のシフトを示したが、LPD−PPAAへのDSPE−PEG5K添加は、このζ電位シフトを減少した。
【0421】
(実施例53)
(治療遺伝子をコードする核酸を含むカチオン性LPDによる腫瘍保有マウスの、非標的化および標的化、静脈注射および腫瘍内注射)
99匹の雌性Balb/c無胸腺ヌードマウスを、この研究において使用した。マウスに、5×106個のMDA−MB−231腫瘍細胞を、右脇腹に皮下注射した。腫瘍接種の5日間後、動物を、下記のようにDCC処方物またはLPD処方物で処理した。
群 注射数 DNAμg
1.)未処置(ガンシクロビルなし) 0
2.)ビヒクル+ガンシクロビル 3× 0
3.)DCC−TK(*腫瘍内) 3× 25
4.)LPD−TK 3× 25
5.)LPD−TK+10%PEG 3× 100
6.)LPD−ヌル+10%PEG 3× 100
7.)DCC−TK(*腫瘍内) 1× 25
8.)LPD−TK 1× 25
9.)LPD−TK+10%PEG 1× 100
10.)LPD−ヌル+10%PEG 1× 100。
【0422】
DC−Chol(DCC)リポソームを、Yooら(2001)Clinical Cancer Rsearch 7:1237−1245に記載されるように調製し、そしてLPDを、DOTAP:CHOLに用いて上で記載したように、25μg(3群、4群、7群、8群)または100μg(5群、6群、9群、10群)のプラスミドDNAと共に、脂質:プロタミン:DNAの比が12:1:1で調製した。3〜5群および7〜9群において、処方物中に含まれるプラスミドDNAは、モデル治療用遺伝子構築物として、CMVプロモーターの制御下で、Herpes Simplex Type Iチミジンキナーゼ遺伝子を表す、pk2 CMV TK1プラスミド(Celltech,Santa Ana,CA)であった。6群および10群に関して、このプラスミドは、遺伝子産物をコードしないE1A遺伝子のヌル欠失変位体を表す、コントロールヌルプラスミドp(e1a)K2であった。このプラスミドは、DNAコントロールとして役に立つ。TK遺伝子治療の作用の機構は、HSV−1 TK酵素をコードする遺伝子の細胞中への導入に基づく。このTKは、哺乳動物TKよりも基質を識別せず、そして非毒性プロドラック(例えば、ガンシクロビル(GCV))を、その毒性代謝物であるガンシクロビルトリホスフェート(GCV−TP)に特異的に変換する。GCV_TPは、細胞DNAに取りこまれ、複製依存性DNA二重鎖の切断物の形成を生じ、そしてS期またはG/2M期において細胞増殖阻止、およびアポトーシス細胞死をもたらす(Tomicicら(2002)Oncogene21:2141−2153)。
【0423】
7〜10群に対して、コントロール処方物、DCC処方物、またはLPD処方物の注射を、1週間当たり1回、または1〜6群に対して1週間当たり3回実施した。LPD処方物およびコントロール処方物を、静脈内(IV)に注射し、そしてDCC処方物を、腫瘍内に注射した。ガンシクロビルを、2〜6群に対して、腹腔内(IP)に、1日に2回、全部で8日間(100mg/kgで)、または7〜10群に対して、IPに、1日に2回、全部で2日間(100mg/kgで)注射した。1群は、処置せず、ガンシクロビルを与えなかった。2群は、コントロール群であり、ビヒクル(DOTAP:CHOL+PEG)およびガンシクロビルを与えなかった。本研究における全ての群を、生存について毎日、ならびに当該分野で実施されるようにキャリパーを使用して測定される腫瘍の増殖(個々の動物の腫瘍の容積、ならびに各群の平均、中央値、および標準偏差を測定した)、および体重について毎週評価した。腫瘍の増殖を、腫瘍のキャリパー測定によって毎週決定した。腫瘍容積(mm3)を、各腫瘍の長さ、幅、および深さを乗算し、次いで2で除算すること[(L×W×D)/2]によって計算した。当該分野で公知の良好な動物実験に従って、一旦、腫瘍のサイズが総体重の10%に達するか、または動物が瀕死状態になると、動物を本研究から取り除いた。表27に示されるデータは、各処置された群に関して、研究の56日目の腫瘍サイズの中央値を示す。
【0424】
未処置の動物またはビヒクルコントロールで処置した動物を示す、1群および2群は、それぞれ、進行性の腫瘍増殖を示す1303または1250の腫瘍サイズの中央値を有する。
【0425】
3群および7群の動物を、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子を有するDCC処方物の直接的な腫瘍内注射により処置した。腫瘍サイズの中央値は、それぞれ、402および255まで減少しているので、これらの群の動物は、TK遺伝子およびガンシクロビルによる処置の治療学的有効性を示す。DCC処方物は、腫瘍内に注射された場合、治療学的な利点を示すが、この処方物は、当該分野で述べられているように、静脈内送達のために適切ではない。
【0426】
4群および8群は、治療用TK遺伝子を含む、非PEG化LPD処方物または非遮蔽LPD処方物を示し、これらは、静脈内に注射され、そしてガンシクロビルとともに処置される。これらの群において、腫瘍サイズの中央値は、それぞれ、1250および345である。
【0427】
5群および9群は、10モル%のPEG5Kで遮蔽されたLPD処方物を示す。これらの群の動物は、56日目に、それぞれ、616および345の腫瘍サイズの中央値を有し、これらは、TK遺伝子およびガンシクロビルの処置の治療学的有効性を示す。この複合体をPEG5Kで遮蔽することにより、LPD処方物の治療学的能力が増加した。
【0428】
5〜9群および6〜10群は、100μgの治療用遺伝子構築物(TK1)をPEGで遮蔽されたLPD中に処方し、(ベースLPD処方物に処方された治療用遺伝子25μgのみを含む)4群および8群と比較した。ベースLPD処方物が、投与された場合の毒性に起因して、25μgより高いDNA濃度でインビボ使用のために処方され得ないことに注目することは、重要である。
【0429】
6群および10群は、ヌルプラスミドを含む、PEGで遮蔽されたLPDコントロール処方物を表し、そしてそれぞれ、616および820の腫瘍サイズの中央値を有する。
【0430】
(実施例54)
(葉酸標的化したチミジンキナーゼをコードする核酸含有LPDの腫瘍保持マウスへの静脈内注射および腫瘍内注射)
110匹の雌性Balb/c胸腺欠損ヌードマウスを、本研究において使用した。マウスの右横腹に、5×106のMDA−MB−231腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍接種の7日後に、動物を以下に記載されるように、DCC処方物またはLPD処方物で処置した:
群 DNAμg
1.)未処置 0
2.)ビヒクル(Dotap/Chol+PEG) 0
3.)DCC−TK(*腫瘍内) 25
4.)LPD−TK 25
5.)LPD−TK+10%PEG 25
6.)LPD−TK+10%PEG 50
7.)LPD−TK+10%PEG 100
8.)LPD−TK+10%PEG−葉酸 50
9.)LPD−ヌル+10%PEG 100
10.)LPD−ヌル+10%PEG−葉酸 50。
【0431】
DC−Chol(DCC)リポソームを、Yooら(2001)Clinical Cancer Rsearch7:1237−1245に記載されるように調製し、そしてLPDを、DOTAP:CHOL、DOTAP:CHOL:DSPE:PEG、またはDOTAP:CHOL:DSPE:PEG:FOLATEを用いて上で記載したように、25μg(3群、4群)、50(6群、8群、10群)または100μg(7群、9群)のプラスミドDNAと共に、脂質:プロタミン:DNAの比が12:1:1で調製した。3〜8群において、処方物中に含まれるプラスミドDNAは、モデル治療用遺伝子構築物として、pk2 CMV TK1プラスミド(Celltech)であった。9群および10群に関して、このプラスミドは、コントロールヌルプラスミドp(e1a)K2であった。プラスミド構築物およびTK遺伝子治療の理論は、上に記載されている。
【0432】
コントロール処方物、DCC処方物、またはLPD処方物の注射を、3週間の間、週に1回実施し、そして3群(腫瘍内に注射されたDCCを受容した)を除く全ての群に対して静脈内に与えた。ガンシクロビルを、2日間連続して1日に2回、腹腔内投与し、その処方物の投与の開始から、3週間、脂質処方物を100mg/kgの用量で投与した。1群は、処置せず、ガンシクロビルを受容させなかった。2群は、コントロール群であり、ビヒクル(DOTAP:CHOL:PEG)およびガンシクロビルを受容させた。本研究における全ての群を、生存について毎日、ならびに当該分野で実施されるようにキャリパーを使用して測定された腫瘍の増殖(個々の動物の腫瘍の容積、ならびに各群の平均、中央値、および標準偏差が測定された)、および体重について毎週評価した。腫瘍の増殖を、腫瘍のキャリパー測定によって毎週決定した。腫瘍容積(mm3)を、各腫瘍の長さ、幅、および深さを乗算し、次いで2で除算すること[(L×W×D)/2]によって計算した。当該分野で公知の良好な動物実験に従って、一旦、腫瘍のサイズが総体重の10%に達するか、または動物が瀕死状態になると、動物を本研究から取り除いた。1〜3群、6群、8群、10群に関して、図52に示されるデータは、各処置された群に関して、研究の70日目の腫瘍増殖曲線を示す。1〜3群、6群、8群、10群について示されるデータは、遮蔽LPD(PEG LPD)および標的化された遮蔽LPD(PEG−葉酸LPD)の50μgDNA用量に匹敵する。
【0433】
図52および表28に示されるように、TKプラスミドを含むLPD−PEG−葉酸処方物は、対応する非標的化LPD−PEG処方物よりも高い程度で腫瘍増殖を減少させ、重要なことには、ヌルプラスミドを含む同一のLPD−PEG処方物が、腫瘍増殖に対して最小の効果しか有さなかった。70日目に、腫瘍サイズデータは、LPD−PEG処方物に関しての37mm3(0〜239mm3の範囲)およびLPD−PEG−葉酸処方物に関しての18mm3(0〜199mm3の範囲)と比較して、ビヒクルコントロール群に関して174mm3の腫瘍サイズの中央値(40〜586mm3の範囲)を示すのに対して、LPD−PEG−葉酸中に処方されたコントロールプラスミドは、142mm3(0〜1250mm3の範囲)の腫瘍サイズの中央値を有した。これらのデータは、明らかに、この葉酸で標的化されたLPD処方物が、リガンド非保持処方物の有効性よりも、実質的に良好なレベル(8倍の改善)でインビボにおける腫瘍増殖を減少させるのに有効であることを示唆した。
【0434】
(実施例55)
(腫瘍保持マウスにおける標的化されたアニオン性LPD処方物のトランスフェクション効率)
6週齢の雌性ヌードBalb/C胸腺欠損ヌードマウスの右横腹に、5×106SKOV3−ipl細胞を皮下注射した。細胞注射した5週間後に、マウスに以下に記載されるような75.0μgDNA/mlに調製された種々のDLPD処方物中に処方された50μgのDNA(666μl)(pCMV Luc)を、尾部の静脈を介して注射した。DLPD注射の直後に、Sonitron 100(Rich−Mar Corporation,Inola,OK)を使用して、マウスの腫瘍部位を局所超音波に供した(1.5W/cm2で5分間)。このマウスを、以下の処置群(n=4〜6匹の動物/群)に無作為化した:(1)未処置の動物、(2);ビヒクル(CHEMS:DOPEリポソームおよびプロタミンスルフェート)、(3);CHEMS:DOPE ALPD処方物、(4)CHEMS:DOPE:DSPE−PEG5K ALPD処方物、(4)CHEMS:DOPE DSPE−PEG5K−葉酸ALPD処方物。平均直径およびζ電位を、表29に報告する。選択された組織を、ALPD投与の16時間後に収集し、そして上記のようにルシフェラーゼ発現をについて処置させた。
【0435】
表30に示されるように、10モル%のDSPE−PEG5K−葉酸(標的化−遮蔽ドDLPD)処方物の添加により、腫瘍部位において、10モル%DSPE−PEG5K DLPD(遮蔽DLPD)に対して2倍、および未改変のベースDLPD処方物に対して5倍のルシフェラーゼ発現の増加を生じる。他の組織の遺伝子発現は、最小であった。
【0436】
(実施例56)
(治療用遺伝子(標的されていない遺伝子および標的された遺伝子)をコードする核酸を含有するアニオン性LPDの腫瘍保持マウスへの静脈内注射および腫瘍内注射)
マウスの右横腹に、5×106のMDA−MD−231腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍接種の7日後に、動物を以下に記載されるように、アニオン性LPD(DLPD)処方物で処置した:
処方物 DNAμg
1.)未処置 0
2.)ビヒクル(CHEMS:DOPE:PEG) 0
3.)DCC−TK(*腫瘍内) 25
4.)LPD−TK+10%PEG−葉酸 50
5.)CHEMS:DOPE(3:7) 50
6.)CHEMS:DOPE:DSPE:PEG(3:6:1) 50
7.)CHEMS:DOPE:DSPE:PEG:葉酸
(3:6:1) 50
8.)NC12−DOPE(1:1) 50
9.)NC12−DOPE:DSPE:PEG
(1:0.8:0.2) 50
10.)NC12−DOPE:DSPE:PEG:葉酸
(1:0.8:0.2) 50。
【0437】
DC−Chol(DCC)リポソームを、Yooら(2001)Clinical Cancer Rsearch 7:1237−1245,2001に記載されるように調製し、そしてLPDを、DOTAP:CHOL、DOTAP:CHOL:DSPE−PEG、またはDOTAP:CHOL:DSPE:PEG−葉酸を用いて上で記載したように、脂質:プロタミン:DNAの比が12:1:1で調製した。DLPDを、3群(この3群は、上述のように25μgで処方される)を除く全てに群に対して、NC12−DOPE、NC12−DOPE:DSPE−PEGおよびNC12−DOPE:DSPE−PEG−葉酸と、治療用遺伝子(例えば、pk2CMV TK1)をコードする50μgのプラスミドDNAとを用いて上述のように調製した。コントロール処方物、DCC処方物、LPD処方物、またはDLPD処方物の注射を、3週間の間、週に1回実施し、そして3群(腫瘍内に注射された受容したDCC)を除く全ての群に対して静脈内に与えた。ガンシクロビルを、2日間連続して1日に2回、腹腔内投与し、その処方物の投与の開始から、3週間、脂質処方物を100mg/kgの用量で投与した。1群は、処置せず、ガンシクロビルを受容させない。2群は、コントロール群であり、ビヒクル(CHEMS:DOPE−PEG)およびガンシクロビルを受容させる。本研究における全ての群を、生存について毎日、ならびに当該分野で実施されるようにキャリパーを使用して測定される腫瘍の増殖(個々の動物の腫瘍の容積、ならびに各群の平均、中央値、および標準偏差が測定される)、および体重について毎週評価した。腫瘍の増殖を、腫瘍のキャリパー測定によって毎週決定した。腫瘍容積(mm3)を、各腫瘍の長さ、幅、および深さを乗算し、次いで2で除算すること[(L×W×D)/2]によって計算した。当該分野で公知の良好な動物実験に従って、一旦、腫瘍のサイズが総体重の10%に達するか、または動物が瀕死状態になると、動物を本研究から取り除いた。
【0438】
【表1】
【0439】
【表2】
【0440】
【表3】
【0441】
【表4】
(表5:DiI標識化LPDとの37℃にて1時間のインキュベーション後の細胞の平均蛍光強度を表わすFACS分析)
【0442】
【表5】
n.d=決定されず;*腫瘍保有マウスから単離された細胞のデータ。代表的には、評価された全ての細胞株についてのネガティブコントロールは、6.0未満の平均蛍光強度を示した。
【0443】
(表6:5%デキストロースUSPにおける平均LPD直径)
【0444】
【表6】
(表7:脂質−Elan094の割合の増加したベースLPD処方物に対する、HepSK1細胞の倍数トランスフェクション増加)
【0445】
【表7】
*Elan218=コレステリル−スクシニル−Elan094
**Elan219=DOPE−スクシニル−Elan094
(表8:脂質−Elan094の割合の増加したベースLPD処方物に対する、MD−MBA−231細胞の倍数トランスフェクション増加)
【0446】
【表8】
*Elan218=コレステリル−スクシニル−Elan094
**Elan219=DOPE−スクシニル−Elan094
(表9:アニオン性DLPD処方物の生物理学的特性)
【0447】
【表9】
N.D.=決定されず;Prot=硫酸プロタミンUSP;Polydis=サイズ多分散性;**SD=ゼータ電位について±5mV
(表10:DLPD平均直径に対するDNA濃度の効果)
【0448】
【表10】
(表11:MDA−MB−231細胞との1時間のインキュベーション後に標識化されたDLPD Di−Iに対する細胞結合の割合を表わすFACS分析)
【0449】
【表11】
代表的には、非標識化リポソームを使用して評価された全ての細胞株についてのネガティブコントロールは、2%未満のポジティブ細胞を示した。
【0450】
【表12】
【0451】
【表13】
【0452】
【表14】
【0453】
【表15】
【0454】
【表16】
【0455】
【表17】
【0456】
【表18】
【0457】
【表19】
表19の説明:DLPDを、129ナノモルの総脂質(CHEMS:DOPEの比が、2μgのカチオン性ポリマー:1μgのDNA)および156ナノモルの総脂質(NC12−DOPE:DOPE処方物の比が、2μgのカチオン性ポリマー:1μgのDNA)で調製した。両方のDLPD処方物のDNA濃度は、75μg/mlであった。ζ電位の測定を、20mMのHEPES緩衝液pH7.5で実施した。このζ電位についてのSDを、同一のサンプルからの5回の読み取りに基づいて計算した。DSPE−PEG5KまたはESPE−PEG5K−葉酸を、LPD処方物中に0.5モル%で組み込んだ。
【0458】
(表20:HEPES 20mM中でのアニオン性DLPDのζ電位に対するpHの効果、DLPDを、PEI圧密DNA(2:1(μg:μg)の比)で処方した)
【0459】
【表20】
(表21:PPAAのLPDへの組み込み、単一モードの粒子の平均直径およびζ電位に対する影響)
【0460】
【表21】
LPDを、12:1:1(nmol脂質:μgプロタミン:μgDNA)で調製した。LPD処方物における最終のDNA濃度は、150μgDNA/mlであった。
ζ電位のSDは、同一のサンプルからの5回の読み取りに基づいて計算した。Agg=LPDの凝集。n.d.=測定されず。
【0461】
(表22:粒子平均直径に対するPPAAのLPDへの組み込みの影響)
【0462】
【表22】
ζ電位の関するSDを、同一サンプルからの5回の読み取りに基づいて計算した。全てのζ電位の測定は、血清の非存在下で実施した。
【0463】
(表23:標識された標的LPD Di−Iを用いて37℃で1時間インキュベートした後における、KB細胞の平均蛍光強度を示す、FACS分析)
【0464】
【表23】
n.d.=測定されず。代表的に、評価された全ての細胞株のネガティブコントロールは、2%未満のポジティブ細胞を示した。
【0465】
(表24:種々のDSPE−PEGの%比を有する、PPAA含有LPDに関する平均直径およびζ電位)
【0466】
【表24】
【0467】
【表25】
【0468】
【表26】
【0469】
【表27】
【0470】
【表28】
【0471】
【表29】
【0472】
【表30】
【図面の簡単な説明】
【0473】
【図1】図1A〜1Dは、脂質−プロタミン−DNA(LPD)および透析された脂質−プロタミン−DNA(DLPD)複合体のサイズ分布(平均直径)および多分散性に対する標的化因子−ペグ化脂質結合体取り込みの効果を示す。
【図2】図2A〜2Dは、異なる濃度のDSPE−PEG5K−LHRHまたはDSPE−PEG5K−RGDを含むLPDでトランスフェクトされた後のMDA−MB−231およびLL/2細胞におけるインビトロでのルシフェラーゼ発現および増大倍率を示す。
【図3】図3A〜3Dは、異なる濃度のDSPE−PEG5K−LHRHまたはDSPE−PEG5K−RGDを含むDLPDでトランスフェクトされた後のMDA−MB−231およびLL/2細胞におけるインビトロでのルシフェラーゼ発現および増大倍率を示す。
【図4】図4Aおよび4Bは、LPD平均直径および粒子多分散性に対する血清の効果を示す。
【図5】図5Aおよび5Bは、MDA−MB−231細胞におけるLPD処方物のトランスフェクション活性および増大倍率に対する血清の効果を示す。
【図6A】図6Aは、競合アッセイにおけるDSPE−PEG5K−LHRHを含むLPDでトランスフェクトされた後のMDA−MB−231細胞におけるインビトロでのルシフェラーゼ発現を示す。
【図6B】図6Bは、競合アッセイにおけるDSPE−PEG5K−LHRHでトランスフェクションされた後のMDA−MB−231細胞におけるインビトロでのルシフェラーゼ発現を示す。
【図7】図7は、競合アッセイにおけるDSPE−PEG5K−RGDでのトランスフェクション後のMDA−MB−231細胞におけるインビトロでのルシフェラーゼ発現を示す。
【図8】図8は、50μgのDNAを含む処方物の静脈内注射後2時間での血清TNF−αレベルを示す。
【図9】図9は、10、30、60、および120分の時点でのコントロール溶液(白棒)およびマウス血清(黒棒)からのZElan207の回収を示すグラフである。
【図10】図10は、10、30、60および120分の時点でのコントロール溶液(白棒)およびマウス血清(黒棒)からのZElan094の回収を示すグラフである。
【図11】図11は、ZElan094MTSペプチドの増加濃度を含むDC−chol:DOPE LPDでのHEPG2細胞のトランスフェクションレベルを示す用量滴定研究である。
【図12】図12は、種々の吸着されたMTLP−ガラクトース標的化リガンドを含むDC−chol:DOPE LPD複合体でのASGPR保有肝細胞(HepG2細胞)のトランスフェクションを示す。
【図13】図13は、種々の吸着されたMTLP−ガラクトース標的化リガンドを含むDC−chol:DOPE LPD複合体でのASGPR非保有肝細胞(HepSK1細胞)のトランスフェクションを示す。
【図14】図14は、増大した濃度のElan094−Galを含むDC−chol:DOPE LPD複合体でのASGPR保有肝細胞(HepG2細胞)のトランスフェクションを示す用量滴定研究である。
【図15】図15は、MDA−MB−231胸部腫瘍を移植されたBalbCマウスへの直接的な腫瘍内注射によるElan219含有LPD(DOPE−Elan094)のインビボ投与後の腫瘍でのルシフェラーゼ発現を示す。
【図16】図16は、MDA−MB−231細胞でのアニオン性DLPD処方物のインビトロでのルシフェラーゼ発現を示す。
【図17】図17Aおよび17Bは、アニオン性DLPD処方物の平均直径および粒子多分散性に対する血清の効果を示す。
【図18】図18は、MDA−MB−231細胞におけるアニオン性DLPD処方物のトランスフェクション活性に対する血清の効果を示す。
【図19】図19は、MDA−MB−231細胞におけるアニオン性DLPD処方物のトランスフェクション活性に対する血清の効果を示す。
【図20】図20Aおよび20Bは、CHO−K1細胞におけるアニオン性DLPD処方物のトランスフェクション活性を示す。
【図21】図21は、MDA−MB−231細胞におけるアニオン性DLPDおよび標的化されたアニオン性DLPDのトランスフェクション活性を示す。
【図22】図22は、2および5%の脂質リガンドの添加後のトランスフェクションアッセイの前におけるDLPD平均直径(A)および粒子多分散性(B)に対する血清の効果を示す。
【図23】図23は、2または5mol%の脂質リガンドの添加後の標的化LPDについてのMDA−MB−231細胞におけるトランスフェクション活性に対する血清の効果を示す。ベースのPEG処方物に対するRLU/mgのルシフェラーゼ発現(A)、または増大倍率(B)。
【図24】図24は、10個の遊離DSPE−PEGおよび5%脂質リガンドの添加後の標的化LPDについてのMBA−MD−231細胞でのLPDサイズ(A)トランスフェクション活性(B)におけるおよびに対する血清効果を示す。
【図25】図25は、CHO−K1細胞におけるアニオン性DLPDトランスフェクション活性を示す。
【図26】図26は、DLPD平均直径(A)および粒子多分散性(B)に対するDNA濃度の効果を示す。
【図27】図27は、異なるDNA濃度でのアニオン性DLPDについてのSkov3−ipl細胞におけるトランスフェクション活性を示す。
【図28】図28は、KB細胞中のアニオン性DLPDおよび標的化アニオン性DLPDのトランスフェクション活性を示す。(A)ルシフェラーゼ発現、(B)CHEMS:DOPEベースの処方物に対する増大倍率。
【図29】図29は、MTS細胞毒性アッセイにおけるインビトロでの細胞増殖に対するカチオン性LPD対アニオン性DLPDの効果の比較を示す。
【図30】図30は、CHEMS:DOPEアニオン性DLPD処方物におけるDSPE−PEG5K−葉酸滴定を示す。
【図31】図31は、ルシフェラーゼ発現、およびアニオン性DLPDへの異なるカチオン性ポリマー濃縮DNAの取り込みに後のSKOV3−ipl細胞におけるルシフェラーゼの発現の増大倍率を示す。
【図32】図32は、アニオン性DLPDへの異なるカチオン性ポリマー濃縮DNAの取り込みに後のKB細胞におけるルシフェラーゼ発現を示す。
【図33】図33は、KB細胞におけるトランスフェクション活性に対する種々のポリマー濃縮DNA複合体の効果を示す。
【図34】図34は、KB細胞におけるCHEMS:DOPEアニオン性LPDトランスフェクション活性への種々のポリマー濃縮DNA取り込みの効果を示す。
【図35】図35は、KB細胞におけるCHEMS:DOPE:0.5%DSPE−PEG5Kアニオン性LPDトランスフェクション活性への種々のポリマー濃縮DNA取り込みの効果を示す。
【図36】図36は、KB細胞におけるCHEMS:DOPE:0.5%DSPE−PEG5Kアニオン性LPDトランスフェクション活性への種々のポリマー濃縮DNA取り込みの効果を示す。
【図37】図37は、KB細胞におけるNC12−DOPE:DOPEアニオン性DLPEトランスフェクション活性への種々のポリマー濃縮DNA取り込みの効果を示す。
【図38】図38は、KB細胞におけるNC12−DOPE:DOPE:0.5%;DSPE−PEG5Kアニオン性LPDトランスフェクション活性への種々のポリマー濃縮DNA取り込みの効果を示す。
【図39】図39は、KB細胞におけるNC12−DOPE:DOPE:0.5%;DSPE−PEG5K−葉酸アニオン性LPDトランスフェクション活性への種々のポリマー濃縮DNA取り込みの効果を示す。
【図40】図40は、プロタミンコンパクト化DNAで調製した従来のアニオン性LPDに対してPEIでDNAをコンパクト化した場合のアニオン性DLPDの増大倍率を示す。図34〜39からのルシフェラーゼデータ。
【図41】図41は、KB細胞におけるトランスフェクション後のLPD−PEGに対するアニオン性LPD PEG−葉酸の増大倍率を示す。
【図42A】図42AおよびBは、インビトロでのトランスフェクションでのKB細胞に対するLPDへのPPAA取り込みの効果を示し、細胞を、0.1μgDNA/ウェルでトランスフェクトした。
【図42B】図42AおよびBは、インビトロでのトランスフェクションでのKB細胞に対するLPDへのPPAA取り込みの効果を示し、細胞を、0.1μgDNA/ウェルでトランスフェクトした。
【図42C】図42CおよびDは、AおよびBからのKB細胞におけるトランスフェクション増大に対するLPD処方物へのPPAA取り込みの増大倍率を示す。
【図42D】図42CおよびDは、AおよびBからのKB細胞におけるトランスフェクション増大に対するLPD処方物へのPPAA取り込みの増大倍率を示す。
【図43】図43は、pHの滴定を介したPPAAを伴なう、およびPPAAを伴なわないLPDのζ電位(A)および平均直径(B)を示す。
【図44】図44は、LPD、LPD−PEGおよびLDP−PEG葉酸処方物中へのPPAA取り込みの効果、ならびにインビトロでのトランスフェクションでのKB細胞に対する効果を示す。
【図45】図45は、インビトロでの細胞増殖に対するPPAAを伴なう、およびPPAAを伴なわないLPDへのDSPE−PEG5K−葉酸添加の効果を示す。
【図46】図46は、インビトロでの細胞増殖に対してPPAAを含むか、またはPPAAを含まないLPDへのDSPE−PEG5K−葉酸添加の効果を示す。
【図47】図47は、KB細胞におけるトランスフェクション活性に対する過剰DSPE−PEG2Kを含むLPD処方物中へのPPAA添加の効果を示す。
【図48A】図48A〜Eは、2%(BおよびC)ならびに10%(DおよびE)PEG取り込みの両方での、KB細胞におけるトランスフェクション活性に対するPPAA/DNA比の効果を示す。
【図48B】図48A〜Eは、2%(BおよびC)ならびに10%(DおよびE)PEG取り込みの両方での、KB細胞におけるトランスフェクション活性に対するPPAA/DNA比の効果を示す。
【図48C】図48A〜Eは、2%(BおよびC)ならびに10%(DおよびE)PEG取り込みの両方での、KB細胞におけるトランスフェクション活性に対するPPAA/DNA比の効果を示す。
【図48D】図48A〜Eは、2%(BおよびC)ならびに10%(DおよびE)PEG取り込みの両方での、KB細胞におけるトランスフェクション活性に対するPPAA/DNA比の効果を示す。
【図48E】図48A〜Eは、2%(BおよびC)ならびに10%(DおよびE)PEG取り込みの両方での、KB細胞におけるトランスフェクション活性に対するPPAA/DNA比の効果を示す。
【図49】図49は、KB細胞におけるトランスフェクション活性に対するクロロキンの効果を示す。
【図50】図50AおよびBは、PPAAを伴なわない(A)、およびPPAAを伴なう(B)LPDにおいて、MDA−MB−231細胞におけるトランスフェクション活性に対するバフィロマイシンの効果を示す。
【図51】図51A〜Cは、PPAAを伴なう、およびPPAAを伴なわないLPDにおける、KB細胞でのトランスフェクション活性に対するバフィロマイシンの効果を示す。
【図52】図52は、LPD−葉酸HSV TK1処方物の投与後の、インビボでの腫瘍増殖におけるMDA−MB−231の70日目の平均直径を示す。
Claims (94)
- コンパクト化核酸、ポリカチオン、標的化因子および脂質を含む脂質−核酸複合体であって、ここで:
(a)該標的化因子は、特定の外側細胞表面膜レセプターとの相互作用以外の手段によって、該核酸の細胞バイオアベイラビリティーを増大させ;
(b)該複合体は、プロタミンもその塩も含まず;そして
(c)該複合体の平均直径は、約100nmより大きくかつ約400nmより小さい、
複合体。 - 前記標的化因子が膜破壊性ポリマーである、請求項1に記載の複合体。
- 前記複合体の直径が、約300nm以下である、請求項1に記載の複合体。
- 前記複合体の直径が、約200nm以下である、請求項1に記載の複合体。
- 遮蔽剤をさらに含む、請求項1に記載の複合体。
- 請求項5に記載の複合体であって、前記遮蔽剤が、該複合体の循環半減期を増加させるか、該複合体への血清成分の結合を減少させるか、または該複合体の完全なオプソニン作用を減少させる、複合体。
- 前記遮蔽剤が、ポリエチレングリコール(PEG)を含む、請求項5に記載の複合体。
- 前記遮蔽剤が、PEGである、請求項5に記載の複合体。
- 前記遮蔽剤が、ペグ化脂質を含む、請求項5に記載の複合体。
- 前記ポリカチオンが、合成ポリカチオン、ポリカチオン性ポリペプチドまたはこれらの塩である、請求項1に記載の複合体。
- 前記ポリカチオンが、合成ポリカチオンである、請求項10に記載の複合体。
- 請求項11に記載の複合体であって、前記合成ポリカチオンが、ポリカチオン性メタクリルオキシポリマー、ポリカチオン性メタクリレートポリマーおよびポリカチオン性ポリ(アルケニルイミン)からなる群より選択される、複合体。
- 前記ポリカチオン性メタクリレートポリマーが、ジメチルアミノメタクリレートから構成される、請求項12に記載の複合体。
- 請求項11に記載の複合体であって、前記合成ポリカチオンが、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリ(2−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムブロミド)(PMOETMAB)およびジメチルアミノメタクリレートとメタクリル酸エステルとのコポリマーからなる群より選択される、複合体。
- 前記標的化因子が、膜破壊性合成ポリマーである、請求項1に記載の複合体。
- 請求項1に記載の複合体であって、前記標的化因子が、該複合体の核酸の転写を増加させること、前記細胞への該核酸の取り込みを増加させること、細胞区画への取り込みを増加させること、細胞区画からの該核酸の排出を増加させること、または細胞膜を通る核酸の輸送を増加させることによって、細胞バイオアベイラビリティーを増加させるように機能する、複合体。
- 前記標的化因子が、膜移行ペプチド(MTLP)である、請求項1に記載の複合体。
- 請求項14に記載の複合体であって、前記膜移行ペプチドが、H2N−KKAAAVLLPVLLAAP−COOH(Elan094)、H2N−KKKAAAVLLPVLLAAP(ZElan094)、H2N−kkkaavllpvllaap(ZElan207)およびH2N−KKKAAAVLLPVLLAAPREDL(ZElan094R)からなる群より選択される、複合体。
- 前記標的化因子が、核局在化配列を含む、請求項1に記載の複合体。
- 前記核局在化配列が、SV40 NLSである、請求項19に記載の複合体。
- 共脂質をさらに含む、請求項1に記載の複合体。
- 前記標的化因子が、PEG部分に結合体化されている、請求項1に記載の複合体。
- 前記脂質が、カチオン性脂質である、請求項1〜22のいずれか1項に記載の複合体。
- 前記カチオン性脂質が、1,2−ビス(オレオイルオキシ)−3−トリメチルアンモニオプロパン(DOTAP)である、請求項23に記載の複合体。
- 前記カチオン性脂質が、DOTAPである、請求項23に記載の複合体。
- 請求項23に記載の複合体であって、前記共脂質が、コレステロール、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン(DPHPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジラウリルホスファチジルエタノールアミン(DLPE)、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DPME)からなる群より選択される、複合体。
- 脂質−核酸複合体であって、該複合体は、コンパクト化核酸および融合性である少なくとも1種の脂質種を含み、ここで:
a)該複合体は、水性コアを有し;そして
b)該複合体の平均直径は、約100nmより大きくかつ約400nmより小さい、
複合体。 - 脂質−核酸複合体であって、該複合体は、コンパクト化核酸、ポリカチオン、標的化因子および少なくとも1種の脂質種を含み、ここで:
a)該少なくとも1種の脂質種は、アニオン性脂質であり;
b)該複合体は、水性コアを有し;
c)該複合体は、少なくとも1種の融合性部分を含み;
d)該複合体の平均直径は、約100nmより大きくかつ約400nmより小さく;そして
ここで、該複合体は、プロタミンもその塩も含まない、
複合体。 - 請求項27に記載の複合体であって、該複合体の平均直径は、約100nmより大きくかつ約200nmより小さい、複合体。
- 請求項27に記載の複合体であって、該複合体の平均直径は、緩衝液中50%血清中での約1時間のインキュベーションによって決定される、複合体。
- 前記複合体が、補体C3AおよびC5Aへの減少した結合を有する、請求項27に記載の複合体。
- 前記融合性脂質が、コア形成脂質である、請求項27〜31のいずれか1項に記載の複合体。
- 請求項27に記載の複合体であって、該コア形成脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホ−L−セリン](DOPS)またはN,Nジオレイル−N,N−ジメチル−1,6−ヘキサンジアンモニウムクロリド(TODMAC6)である、複合体。
- 前記融合性脂質が、pH感受性である、請求項27に記載の複合体。
- 前記脂質が、生理学的pHにおいてアニオン性であり、そして融合性が、生理学的pHと比較して、約pH5.5〜約pH4.5にて増加する、請求項34に記載の複合体。
- 約pH4.5にて、前記脂質が中性またはカチオン性である、請求項35に記載の複合体。
- 前記脂質が、コレステリルヘミスクシネート(CHEMS)または1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−[ホスホエタノールアミン−N−ドデカノイル](NC12−DOPE)である、請求項35に記載の複合体。
- 前記脂質が中性またはカチオン性である、請求項27に記載の複合体。
- 前記ポリカチオンが合成ポリカチオン、ポリカチオン性ポリペプチドおよびこれらの塩からなる群より選択される、請求項27に記載の複合体。
- 前記ポリカチオンが、合成ポリカチオンである、請求項39に記載の複合体。
- 請求項40に記載の複合体であって、前記合成ポリカチオンが、ポリカチオン性メタクリルオキシポリマー、ポリカチオン性メタクリレートポリマーおよびポリカチオン性ポリ(アルケニルイミン)からなる群より選択される、複合体。
- 前記ポリカチオン性メタクリレートポリマーが、ジメチルアミノメタクリレートを含むポリマーから構成される、請求項41に記載の複合体。
- 請求項40に記載の複合体であって、前記合成ポリカチオンが、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリ(2−メタクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムブロミド)(PMOETMAB)およびジメチルアミノメタクリレートとメタクリル酸エステルとのコポリマーからなる群より選択される、複合体。
- 請求項39〜43のいずれか1項に記載の複合体であって、該複合体が、少なくとも1種の共脂質をさらに含む、複合体。
- 請求項44に記載の複合体であって、該複合体は、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)を含む、複合体。
- 請求項27に記載の複合体であって、該複合体は、前記核酸の細胞バイオアベイラビリティーを増大させる少なくとも1種の標的化因子をさらに含む、複合体。
- 請求項46に記載の複合体であって、前記標的化因子の存在が、前記核酸の転写の増加、前記細胞への核酸の取り込みの増加、細胞区画への核酸の取り込みの増加、細胞区画からの該核酸の排出の増加、または膜を通る核酸の輸送の増加を生じる、複合体。
- 請求項46に記載の複合体であって、前記標的化因子が、葉酸、インスリン、Arg−Gly−Asp(RGD)ペプチド、黄体化ホルモン放出ホルモン(LHRH)、膜移行ペプチド(MTLP)および核局在化配列を含む化合物からなる群より選択される、複合体。
- 請求項46に記載の複合体であって、前記標的化因子が、ガラクトース−H2N−KKAAAVLLPVLLAAP−COOH(Elan094)、ガラクトース−H2N−KKKAAAVLLPVLLAAP(ZElan094)、ガラクトース−H2N−kkkaavllpvllaap(ZElan207)およびガラクトース−H2N−KKKAAAVLLPVLLAAPREDL(ZElan094R)からなる群より選択される、複合体。
- 請求項27に記載の複合体であって、前記脂質が、生理学的pHとpH約4.5との間で構造変化して、増加した融合性を生じる、複合体。
- 前記複合体が遮蔽されている、請求項1に記載の複合体。
- 前記複合体が遮蔽されている、請求項27に記載の複合体。
- 請求項51に記載の複合体であって、ポリエチレングリコール部分を含む化合物をさらに含む、複合体。
- 請求項52に記載の複合体であって、ポリエチレングリコール部分を含む化合物をさらに含む、複合体。
- 前記化合物が、ペグ化脂質である、請求項53に記載の複合体。
- 前記化合物が、ペグ化脂質である、請求項54に記載の複合体。
- コンパクト化核酸および融合性である少なくとも1種の脂質種を含む脂質−核酸複合体を調製するための方法であって、該方法は、以下:
a)脂質および少なくとも1種の脂肪親和性界面活性剤を含む水性ミセル混合物を、核酸を含む核酸混合物と混合する工程であって、該脂質は、融合性特徴を有するかまたは融合性特徴を有するかのように挙動し、そして該混合物の少なくとも1つが、該核酸をコンパクト化する成分を含む、工程;および
b)該混合する工程の後、工程a)から得られた混合物から、該脂肪親和性界面活性剤を除去する工程、
を包含する、方法。 - 請求項57に記載の方法であって、工程a)の混合物の少なくとも1つ中に、少なくとも1種の標的化剤を含める工程をさらに包含する、方法。
- 請求項57に記載の方法によって調製される、脂質−核酸複合体。
- 請求項58に記載の方法によって調製される、脂質−核酸複合体。
- 請求項57に記載の方法によって調製される、請求項27〜31、33〜43または46〜56のいずれか1項に記載の複合体。
- 請求項57に記載の方法によって調製される、請求項44に記載の複合体。
- 請求項57に記載の方法によって調製される、請求項45に記載の複合体。
- 請求項58に記載の方法によって調製される、請求項46〜49のいずれか1項に記載の複合体。
- 核酸を細胞に送達する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項1〜22、27〜31、33〜43または46〜56のいずれか1項に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。
- 核酸を細胞に送達する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項23に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。
- 核酸を細胞に送達する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項24に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。
- 核酸を細胞に送達する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項25に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。
- 核酸を細胞に送達する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項26に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。
- 核酸を細胞に送達する方法であって、該方法は、該細胞を、請求項44に記載の複合体と接触させる工程を包含する、方法。
- 前記送達が、個体にとってインビボである、請求項65に記載の方法。
- 前記送達が、個体にとってインビボである、請求項66に記載の方法。
- 前記送達が、個体にとってインビボである、請求項67に記載の方法。
- 前記送達が、個体にとってインビボである、請求項68に記載の方法。
- 前記送達が、個体にとってインビボである、請求項69に記載の方法。
- 前記送達が、個体にとってインビボである、請求項70に記載の方法。
- 前記送達が静脈内である、請求項71に記載の方法。
- 前記送達が静脈内である、請求項72に記載の方法。
- 前記送達が静脈内である、請求項73に記載の方法。
- 前記送達が静脈内である、請求項74に記載の方法。
- 前記送達が静脈内である、請求項75に記載の方法。
- 前記送達が静脈内である、請求項76に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項71に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項72に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項73に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項74に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項75に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項76に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項77に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項78に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項79に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項80に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項81に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項82に記載の方法。
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