JP2008536874A - 中性脂質組成物によるsiRNAの送達 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般に、分子生物学、医学、腫瘍学、および治療化合物の送達の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、中性脂質組成物またはリポソームを介する、siNA(例えば、siRNA)を含む阻害性核酸の送達に関する。
短い干渉性RNA(siRNA)は当技術分野において周知であるが、インビボでのsiRNAの送達は非常に困難であることが判明しており、従って、siRNAの治療的潜在能力を制限する。C.elegans(Fire,1998)および哺乳動物細胞(Elbashir et al.,2001)におけるその記載以来、遺伝子サイレンシングの方法としてのsiRNAの使用は、タンパク質機能描写、遺伝子発見、および薬物開発において迅速に強力なツールとなった(Hannon,2004)。特異的RNA分解の有望性もまた、治療的様式としての可能な使用に対してかなりの刺激を生じたが、インビボsiRNA送達は困難なことが判明した(Ryther,2005)。
本発明は、短い干渉性リボ核酸(siRNA)、またはsiRNAをコードする核酸を含む、阻害性核酸の送達のための組成物および方法を提供する。ある態様において、阻害性核酸は、非荷電(中性)リポソームを介して細胞に送達することができる。本発明者らは、非荷電リポソームを用いて、siNAまたはsiRNAのような阻害性核酸をインビボにて細胞に効果的に送達することができることを発見した。特別な局面において、中性リポソームを用いるsiNA送達の結果、インビボにてカチオン性リポソームと比較して送達の有意な(約10倍)改良がもたらされる。また、本発明の方法は、癌または他の過形成疾患の治療に特に適していることも確認された。
本発明者らは、短い干渉性RNA(siRNA)のような阻害性核酸の使用に特に関連して、インビボ治療剤として用いるためのさらなる遺伝子サイレンシング組成物および方法を開発した。本発明の局面は、遺伝子発現の阻害剤の送達のために中性脂質組成物を利用する。特別な局面において、脂質組成物は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(DOPC)を含む。態様は、癌細胞生存、癌細胞成長および/または癌細胞転移、例えば、卵巣癌細胞において役割を演じる遺伝子の発現/翻訳をサイレンシングするまたは低下させることを含む。ある局面において、標的化すべき遺伝子は、限定されることなく、病巣接着キナーゼ(FAK)遺伝子、EphA2遺伝子、および/またはβ2AR遺伝子を含む。本発明のなおさらなる局面は、遺伝子発現療法の阻害剤を、一つまたは複数の抗癌剤と組み合わせることを含む。抗癌剤は化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子治療等を含む。特別な態様において、遺伝子発現の阻害剤をドセタキセルまたはパクリタキセル療法と組み合わせる。
19981年におけるFireおよび同僚によるRNAiの発見以来、生化学メカニズムは迅速に特徴付けられてきた。長い二本鎖RNA(dsRNA)は、RNAaseIIIファミリーリボヌクレアーゼであるダイサーによって切断される。このプロセスは、長さが約21ヌクレオチドのsiRNAを生じる。これらのsiRNAは、mRNAを標的化するのにガイドされる多タンパク質RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に取り込まれる。RISCは相補的領域の中央において標的mRNAを切断する。哺乳動物細胞において、関連するミクロRNA(miRNA)は短いRNA断片(約22ヌクレオチド)であることが見出されている。MiRNAは、不完全なヘアピンRNA構造を持つより長い(約70ヌクレオチド)前駆体のダイサー媒介切断後に生じる。miRNAはmiRNA-タンパク質複合体(miRNP)に取り込まれ、これは標的mRNAの翻訳抑制に導く。
siRNA媒介遺伝子サイレンシングの有効性を改良するために、mRNA上の標的部位の選択のためのガイドラインがsiRNAの最適な設計のために開発されている(Soutschek et al.,2004;Wadhwa et al.,2004)。これらの戦略は、最大遺伝子ノックダウンを達成するためのsiRNA配列を選択する合理的アプローチを可能とすることができる。細胞および組織へのsiRNAのエントリーを容易とするために、プラスミド、およびアデノウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルスベクターを含む種々のベクターが用いられてきた(Wadhwa et al.,2004)。これらのアプローチの多くはインビトロ研究で成功してきたが、インビボ送達は、腫瘍のミクロ環境の複雑性に基づいてさらなる挑戦をもたらす。
本発明者らは最近、卵巣腫瘍モデルを用いて脈管形成を促進することによって、慢性ストレスが腫瘍成長を加速することを示した。本発明者は、RT-PCRによって19の卵巣癌細胞系を、β1およびβ2アドレナリン作動性受容体(βAR)の存在または非存在についてスクリーニングした。βARヌル(A2780およびRMG2)および陽性(HeyA8およびSKOV3ip1)卵巣癌細胞を、ストレス開始から10日後にマウスに腹腔内注射した。β1、β2または双方の受容体に対するリポソーム(DOPC)siRNAを用いるブロッキング実験を行った。顕著には、β2 siRNAは、腫瘍重量、節の数、癌の転移の侵入パターンのストレス誘導増加を完全にブロックした。組み合わせたβ1およびβ2 siRNAで処理したマウスはβ2 siRNAのみの群と同様な結果を有した。これらの研究は、慢性ストレスの効果が、主として、卵巣癌細胞上のβ2ARを通じて媒介されることを示す。従って、βARの標的化は卵巣癌の管理のための治療的重要性を有し得る。
本発明は、siNA(例えば、siRNA)のような阻害性核酸を脂質および/またはリポソームと会合させるための方法および組成物を提供する。siNAはリポソームの水性内部にカプセル化することができ、リポソームの脂質二重層内に介在させることができ、リポソームおよびポリヌクレオチド双方と会合する連結分子を介してリポソームに付着させることができ、リポソームに捕獲することができ、リポソームと複合体化することができ、脂質を含有する溶液中に分散させることができ、脂質と混合することができ、脂質と組み合わせることができ、脂質中に懸濁液として含有することができ、ミセルと共に含有させ、またはそれと複合体化させることができ、あるいはそうでなければ脂質と会合させることができる。本発明のリポソームまたはリポソームsiNA会合組成物は溶液中のいずれかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは二重層構造中に、ミセルとして、または「崩壊した」構造にて存在させることができる。また、それらは溶液中に単純に介在させることもでき、場合により、サイズまたは形状が不均一な凝集体を形成する。
本明細書において、「中性リポソームまたは脂質組成物」、あるいは「非荷電リポソームまたは脂質組成物」は、本質的に中性の正味の電荷を生じる一つまたは複数の脂質を有するリポソームまたは脂質組成物と定義される(実質的に非荷電)。「本質的に中性」、または「本質的に非荷電」とは、所与の集団(例えば、リポソームの集団)内の、もしあれば、少数の脂質が、もう1つの成分の反対電荷によって相殺されない電荷を含むことを意味する(例えば、成分の10%よりも少数が、より好ましくは5%よりも少数が、最も好ましくは1%よりも少数が非相殺電荷を含む)。本発明のある態様において、組成物を調製することができ、該組成物の脂質成分は本質的に中性であるが、リポソームの形態ではない。
本発明の脂質組成物はリン脂質を含むことができる。ある態様において、単一種類またはタイプのリン脂質を、リポソームのようなある種の脂質組成物で用いることができる(例えば、中性リポソームを生じさせるのに用いるDOPC)。他の態様において、1より多い種類またはタイプのリン脂質を用いることができる。
本発明のリポソームおよび脂質組成物は異なる方法によって作成することができる。例えば、ヌクレオチド(例えば、siRNA)は、エタノールおよびカルシウムが関連する方法を用いて中性リポソームにカプセル化することができる(Bailey and Sullivan,2000)。リポソームのサイズは、合成の方法に依存して変化する。水性溶液に懸濁させたリポソームは、一般には、球状小胞の形状であり、脂質二重層分子の一つまたは複数の同心層を有することができる。各層は式XYによって表される分子の平行アレイからなり、Xは親水性部分であって、Yは疎水性部分である。水性懸濁液において、同心層は、親水性部分が水相と接触したままにある傾向があり、疎水性領域が自己会合する傾向があるように配置される。例えば、水相はリポソーム内および外双方に存在する場合、脂質分子は、配置XY-YXのラメラとして公知の二重層を形成することができる。脂質の凝集体は、1より多い脂質分子の親水性および疎水性部分が相互に会合するようになると形成され得る。これらの凝集体のサイズおよび形状は、溶媒の性質、および溶液中の他の化合物の存在のような多くの異なる変数に依存する。
本明細書において、阻害性核酸または「siNA」は、短い干渉性核酸と定義される。siNAの例は、限定されることなく、RNAi、二本鎖RNA、およびsiRNAを含む。siNAは細胞中での遺伝子の転写または翻訳を阻害することができる。siNAは16〜1000以上のヌクレオチドの長さとすることができ、ある態様において、18〜100ヌクレオチド長とすることができる。ある態様においては、siNAは16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチド長とすることができる。siNAは核酸および/または核酸アナログを含むことができる。典型的には、siNAは細胞内での単一遺伝子の翻訳を阻害する;しかしながら、ある態様においては、siNAは細胞内で1より多い遺伝子の翻訳を阻害する。
本発明の方法を実施するのに有用な本発明の剤は、限定するものではないが、FAKのsiRNA、EphA2、またはβ2ARを含む。典型的には、そのような剤は(i)各mRNAに結合し、(ii)シグナリングに干渉し、および/または(iii)増殖癌または腫瘍細胞を阻害することができる。好ましい態様において、細胞増殖を阻害する剤はFAKのsiRNAである。本発明は、RNA干渉を用いてFAK発現を変調する組成物および方法を提供する。これらの方法および組成物は、病気(例えば、癌)の治療、アポトーシスの誘導、および/または生物学的経路との干渉で有用である。
である。
本発明は、中性リポソームを介するsiNAの送達のための方法および組成物を提供する。siNAは核酸から構成されるので、核酸に関連する方法(例えば、核酸の生産、核酸の修飾、等)をsiNAの関連で用いることもできる。
本明細書において、「ヌクレオベース」とは、例えば、少なくとも1つの天然の核酸(すなわち、DNAおよびRNA)に見出される天然のヌクレオベース(すなわち、A、T、G、CまたはU)およびそのようなヌクレオベースの天然のまたは非天然の誘導体およびアナログのような複素環塩基をさす。ヌクレオベースは、一般には、天然のヌクレオベース対合のために置き換えることができるように、少なくとも1つの天然のヌクレオベースとで一つまたは複数の水素結合を形成(「アニール」または「ハイブリダイズ」)することができる(例えば、AおよびT、GおよびC、ならびにAおよびUの間の水素結合)。
本明細書において、「ヌクレオシド」とは、ヌクレオベースリンカー部分に共有結合したヌクレオベースを含む個々の化学ユニットをさす。「ヌクレオベースリンカー部分」の非限定的例は、限定されることなく、デオキシリボース、リボース、アラビノース、または5-炭素糖の誘導体もしくはアナログを含む5-炭素原子を含む糖(すなわち、「5-炭素糖」)である。5-炭素糖の誘導体またはアナログの非限定的例は2’-フルオロ-2’-デオキシリボースまたは炭素環糖を含み、炭素は糖環において酸素原子と置き換えられる。
本明細書において、「ヌクレオチド」とは、さらに、「骨格部分」を含むヌクレオシドをいう。骨格部分は、一般には、ヌクレオチドを、ヌクレオチドを含むもう1つの分子に、またはもう1つのヌクレオチドに共有結合させて、核酸を形成する。天然のヌクレオチドにおける「骨格部分」は、典型的には、5’-炭素糖に共有結合するリン部分を含む。骨格部分の結合は、典型的には、5’-炭素糖の3’-または5’-位置いずれかで起こる。しかしながら、特に、ヌクレオチドが天然の5-炭素糖、またはリン部分の誘導体またはアナログを含む場合に、他のタイプの結合が当技術分野において公知である。
核酸は、ヌクレオベースの誘導体またはアナログ、ヌクレオベースリンカー部分および/または天然の核酸に存在してもよい骨格部分と含むことができ、または全部がそれから構成され得る。本明細書において、「誘導体」とは、天然の分子の化学的に修飾された、または改変された形態をさし、他方、用語「ミミック」または「アナログ」とは、天然の分子または部分に構造的に類似してもしなくてもよいが、同様な機能を保有する分子をいう。本明細書において、「部分」とは、一般には、より大きな化学的または分子構造のより小さな化学的または分子成分をさす。ヌクレオベース、ヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログまたは誘導体は当技術分野において周知であり、記載されてきた(例えば、参照により本明細書に組み入れるScheit,1980参照)。
ある態様において、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの誘導体またはアナログを含む核酸は本発明の方法および組成物で用いることができると考えられる。非限定的例は参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,908,845号に記載された「ポリエーテル核酸」である。ポリエーテル核酸においては、一つまたは複数のヌクレオベースが、ポリエーテル骨格中のキラル炭素原子に連結されている。
核酸は、化学合成酵素生産または生物学的生産のような当業者に公知のいずれかの技術によって作成することができる。合成核酸(例えば、合成オリゴヌクレオチド)の非限定的例は、ホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホルアミダイト化学を用いるインビトロ化学的合成、および参照により本明細書に組み入れるEP266,032に記載されたような固相技術によって、あるいは各々参照により本明細書に組み入れるFroehler et al.,1986および米国特許第5,705,629号によって記載されたようなデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体を介して作成される核酸を含む。本発明の方法において、一つまたは複数のオリゴヌクレオチドを用いることができる。オリゴヌクレオチド合成の種々の異なるメカニズムは、その各々を参照により本明細書に組み入れる、例えば、米国特許第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813号、第5,264,566号、第4,959,463号、第5,428,148号、第5,554,744号、第5,574,146号、第5,602,244号に開示されている。
核酸は、ポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム遠心グラジエントで、あるいは当業者に公知のいずれかの他の手段(例えば、参照により本明細書に組み入れるSambrook et al.2001参照)によって精製することができる。
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズできる」は、二本鎖または三本鎖分子、または部分的な二本鎖または三本鎖性質を持つ分子を形成することを意味すると理解される。本明細書において、用語「アニールする」は「ハイブリダイズする」と同義語である。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズできる」は、用語「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」を包含する。
本発明を用いて、癌のような病気を治療することができる。例えば、siRNAを非荷電リポソームを介して送達して癌を治療することができる。癌は固形腫瘍、転移性癌、または非転移性癌であってもよい。ある態様において、癌は膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮に由来するものであってもよい。ある態様において、癌はヒト卵巣癌である。加えて、癌は、具体的には、限定されることなく、以下の組織学的タイプのものであってもよい;新生物悪性;癌腫;癌腫、未分化;巨細胞および紡錘細胞癌腫;小細胞癌腫;乳頭癌腫;扁平細胞癌腫;リンパ系上皮癌腫;基底細胞癌腫;毛質細胞マトリックス癌腫;転移細胞癌腫;乳頭転移細胞癌腫;腺癌;ガストリノーマ悪性;胆管癌腫;肝細胞癌腫;組み合わせた肝細胞癌腫および胆管癌腫;小柱腺癌;アデノイド嚢胞性癌腫;腺腫様ポリープにおける腺癌;腺癌、家族性結腸ポリポージス;固体癌腫;類癌腫、悪性;気管支-肺胞腺癌;乳頭腺癌;嫌色素性癌腫;好酸性癌腫;好酸性腺癌;好塩基性癌腫;透明細胞腺癌;顆粒細胞癌腫;小胞腺癌;乳頭および小胞腺癌;非カプセル化硬化性癌腫;副腎皮質癌腫;類内膜癌腫;皮膚付属器官癌腫;アポクリン腺癌;皮脂腺癌;耳垢腺癌;粘膜表皮癌腫;嚢胞腺癌腫;乳頭嚢胞腺癌腫;乳頭血清嚢胞腺癌腫;ムチン沈着症嚢胞腺癌腫;ムチン沈着症腺癌;環状体細胞癌腫;浸潤性管癌腫;髄質癌腫;小葉癌腫;炎症性癌腫;パジェット病、乳房;腺房細胞癌腫;アデノ鱗状癌腫;腺癌w/鱗状化生;胸腺腫、悪性;卵巣支質腫瘍、悪性;莢膜細胞腫、悪性;顆粒層細胞腫、悪性;男性ホルモン産生細胞腫、悪性;セルトリ細胞腫;ライディッヒ細胞腫、悪性;脂質細腫、悪性;パラガングリオーマ、悪性;乳房外パラガングリオーマ、悪性;褐色細胞腫;血管球血管肉腫;悪性メラノーマ;メラニン欠乏性メラノーマ;表層拡大メラノーマ;巨大色素性母斑における悪性メラノーマ;類上皮細胞メラノーマ;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胚横紋筋肉腫;肺胞横紋筋肉腫;支質肉腫;混合腫瘍、悪性;ムルクリアン混合腫瘍;腎芽細胞腫;肝芽細胞腫;癌腫肉腫;間葉腫、悪性;ブレンナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胚肉腫;奇形腫、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛癌;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周囲細胞腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;皮質近接骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉軟骨肉腫;骨の巨細胞腫;ユーイング肉腫;歯牙形成腫瘍、悪性;エナメル芽細胞歯牙形成腫瘍;エナメル上皮腫、悪性;エナメル芽細胞線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;脳室上衣芽細胞腫;神経膠星状細胞腫;原形質神経膠星状細胞腫;原線維神経膠星状細胞腫;神経膠星状芽細胞腫;神経膠芽細胞腫;希突起神経膠腫;希突起神経膠芽細胞腫;原始神経外胚葉;小脳肉腫;神経節神経芽細胞腫;神経芽細胞腫;網膜芽細胞腫;嗅覚神経形成腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞腫、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;ホジキン;副肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球;悪性リンパ腫、大細胞、散漫;悪性リンパ腫、小胞;菌状息肉腫;他の特定非ホジキンリンパ腫;悪性組織球増殖症;多発性ミエローマ;肥満細胞肉腫;免疫増殖小腸;白血病;リンパ系白血病;形質細胞白血病;赤白血病;リンパ系細胞白血病;骨髄性白血病;好塩基性白血病;好酸性白血病;単球白血病;肥満細胞白血病;巨核芽球白血病;骨髄性白血病;および毛様細胞白血病。それにもかかわらず、本発明を用いて、非癌性病(例えば、真菌感染、細菌感染、ウイルス感染、および/または神経変性病)を治療することもできると認識される。
siNAを含有する(例えば、リポソームの形態の)非荷電脂質成分の臨床的適用を行う場合、一般には、対象とする用途に適した薬学的組成物として脂質複合体を調製するのが有利である。これは、典型的には、発熱性物質、ならびにヒトまたは動物にとって有害であり得るいずれかの他の不純物を本質的に含まない薬学的組成物を調製することを伴う。適当な緩衝液を使用して、複合体を安定とし、標的細胞による取込みを可能することもできる。
ある態様において、本発明の組成物および方法は、第2のまたはさらなる療法と組み合わせた遺伝子発現の阻害剤、または遺伝子発現の阻害剤を発現することができる構築体を含む。組合せ療法を含む方法および組成物は、治療または保護効果を増強させ、および/またはもう1つの抗癌または抗過剰増殖療法の治療効果を増大させる。治療および予防方法および組成物は、癌細胞の殺傷および/または細胞過剰増殖の阻害のような、所望の効果を得るのに有効な組合せ量で提供することができる。このプロセスは、細胞を、遺伝子発現の阻害剤および第二の療法の双方と接触させることを含むことができる。組織、腫瘍、または細胞は、一つまたは複数の剤(すなわち、遺伝子発現の阻害剤または抗癌剤)を含む一つまたは複数の組成物または薬理学的処方と接触させることができ、あるいは組織、腫瘍および/または細胞を2以上の区別される組成物または処方と接触させることによることができ、ここに、1つの組成物は1)遺伝子発現の阻害剤;2)抗癌剤、または3)遺伝子発現の阻害剤および抗癌剤の双方を提供する。また、そのような組合せ療法は、化学療法、放射線療法、外科的療法、または免疫療法と組み合わせて用いることができる。
癌療法は、化学的および放射線ベースの治療両方との種々の組合せ療法を含む。化学療法は、例えば、シスプラチン(CDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド(VP16)、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルメシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、あるいは前記のいずれかのアナログ、誘導体または変種を含む。
DNA損傷を引き起こし、広範に用いられてきた他の因子は、γ線、X線、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の指向された送達として通常は公知のものを含む。マイクロ波、プロトンビーム照射(米国特許第5,760,395号および第4,870,287号)およびUV照射のような、DNA損傷因子の他の形態も考えられる。これらの因子の全てはDNA、DNAの前駆体、DNAの複製および修復および染色体の組み立ておよび維持に対して広い範囲の損傷を最も可能性が高い。X線についての用量範囲は、延長された期間(3〜4週間)についての50〜200レントゲンの日用量、から2000〜6000レントゲンの単一用量に及ぶ。放射性同位体についての用量範囲は広く変化し、同位体の半減期、発せられる放射線の強さおよびタイプおよび新形成細胞による取込みに依存する。
癌治療の関係では、免疫治療剤は、一般には、癌細胞を標的化し、それを破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依拠する。トラスツズマブ(Herceptin(商標))はそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面のいくつかのマーカーに対して特異的な抗体であってもよい。抗体単独は療法のエフェクターとして働くことができ、あるいはそれは他の細胞を動員して、現実に細胞殺傷を行うことができる。抗体は薬物またはトキシン(化学治療剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラトキシン、百日咳トキシン等)にコンジュゲートすることもでき、単に、標的化剤として働かせることができる。あるいは、エフェクターは腫瘍細胞標的と直接的にまたは間接的にのいずれかで相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞は細胞傷害性T細胞およびNK細胞を含む。治療様式、すなわち、直接的な細胞傷害性活性および阻害、またはErbB2の低下の組合せは、ErbB2過剰発現癌の治療において治療的有効性を提供する。
癌を持つ個人のほぼ60%は、予防的、診断的または段階的、治癒的および軽減的、外科的療法を含む、いくつかのタイプの外科的処置を受ける。治癒的外科的処置は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および/または別の療法のような他の療法と組み合わせて用いることができる癌治療である。
他の剤を本発明と組み合わせて用いて、治療の治療効果を改良することができると考えられる。これらのさらなる剤は免疫変調剤、細胞表面受容体およびGAP接合のアップレギュレーションを行う剤、細胞静止および分化剤、細胞接着の阻害剤、過剰増殖細胞のアポトーシスインデューサーに対する感受性を増加させる剤、または他の生物学的剤を含む。免疫変調剤は腫瘍壊死因子;インターフェロンα、β、およびγ;IL-2および他のサイトカイン;F42Kおよび他のサイトカインアナログ;またはMIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES、および他のケモカインを含む。さらに、細胞表面受容体、あるいはFas-Fasリガンド、DR4またはDR5/TRAIL(Apo-2リガンド)のようなそれらのリガンドのアップレギュレーションは、過剰増殖細胞に対するオートクリンまたはパラクリン効果の確立によって、本発明のアポトーシス誘導能力を増強すると考えられる。GAP接合の数を上昇させることによる細胞間シグナリングの増加は隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させる。他の態様において、細胞静止または分化剤を本発明と組み合わせて用いて、治療の抗過剰増殖効果を改良することができる。細胞接着の阻害剤は、本発明の効果を改良すると考えられる。細胞接着阻害剤の例は病巣接着キナーゼ(FAK)阻害剤およびロバスタチンである。抗体c225のような、過剰増殖細胞のアポトーシスに対する感受性を増加させる他の剤を、本発明と組み合わせて用いて、治療効果を改良することができるとさらに考えられる。
本発明の種々の局面において、治療剤および/または他の治療および送達剤を含有するキットが考えられる。いくつかの態様において、本発明では、本発明の療法を調製し、および/または投与するためのキットが考えられる。該キットは、本発明の活性なまたは有効な剤を投与するのに用いることができる試薬を含むことができる。キットの試薬は、遺伝子発現の少なくとも1つの阻害剤、一つまたは複数の脂質成分、組合せ療法の一つまたは複数の抗癌成分、ならびに本発明の成分を調製し、処方し、および/または投与しあるいは、本発明の方法の一つまたは複数の工程を行うための試薬を含むことができる。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含める。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施でよく機能する本発明者によって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができるのは当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示の観点から、開示された具体的な態様において多くの変形を成すことができ、本発明の精神および範囲を逸脱することなく類似または同様な結果を依然として得ることができると認識すべきである。
中性リポソームsiRNA送達を用いるインビボでの治療EphA2遺伝子標的化
I. 材料および方法
細胞系および培養。卵巣癌細胞系HeyA8およびSKOV3ip1(Apte,2004)を、15%FBSおよび0.1%ゲンタマイシン硫酸(Gemini Bioproducts,Calabasas,CA)を補足したRPMI-1640中で維持した。全てのインビトロ実験は60〜80%密集で行った。インビボ注射のために、細胞をトリプシン処理し、1000rpmにて4℃で7分間遠心し、2回洗浄し、200μlの腹腔内注射のために、5×106細胞/ml(SKOV3ip1)または1.25×106細胞/ml(HeyA8)の濃度にて、無血清ハンクスの平衡塩溶液(Gibco,Carlsbad,CA)中で戻した。
siRNAは、3つの処方において、Qiagen(Valencia,CA)から購入した。いずれかの公知のヒトmRNA
と配列相同性を共有しないことがBLASTサーチによって示され、かつAlexa-555のタグを付した非サイレンシングsiRNA配列を用いて、インビボで投与した場合に、種々の組織における取込みおよび分布を決定した。受容体チロシンキナーゼEphA2のmRNAを標的化するように設計され、かつそのように示された(Duxbury,2004)標的配列
を持つsiRNAを用いて、インビトロおよびインビボにてEphA2をダウンレギュレートした。非サイレンシングsiRNA構築体(Alexa-555タグがない前記した配列)を、EphA2標的化実験用の対照として用いた。インビトロ送達のために、5μg siRNAを30μlのリポフェクタミン2000(Qiagen)と共に室温にて10分間インキュベートし、35mm培養プレート中の80%密集の培養中の細胞に加えた。培地を6時間後に変化させ、ウエスタンブロット分析用の溶解物として細胞を48時間後に収集した。
インビボ送達のためのsiRNAを裸で(トランスフェクション剤なしで)投与し、DOTAP(N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムメチルスルフェート;Roche,Indianapolis,IN)に取り込み、あるいはDOPCいずれかに取り込んだ。DOPCおよびsiRNAを、1:10 siRNA:DOPC(重量:重量)の比率にて、過剰の第三級ブタノールの存在下で混合した。Tween-20を、1:19 Tween-20:siRNA/DOPCの比率にて混合物に加えた。混合物をボルテックスし、アセトン/ドライアイス浴中で凍結し、凍結乾燥した。インビボ投与に先立って、この調製物を15μg/mlの濃度にて通常の0.9%生理食塩水で水和して、注射当たり150〜200μlにおいて所望の用量を達成した。リポソームに取り込まれなかったsiRNAの量を見積もるために、30,000公称分子量限界(NMWL)フィルターユニット(Millipore Corp,Billerica,MA)を用いて遊離siRNAをリポソームから分離した。リポソーム懸濁液をフィルターに加え、5,000gにて室温で40分間遠心した。画分を収集し、フィルターに捕獲された物質を0.9%生理食塩水で戻し、収集された画分および溶出物のsiRNAを分光光度法によって測定した。
雌無胸腺ヌードマウス(NCr-nu)はthe National Cancer Institute-Frederick Cancer Research and Development Center(Frederick,MD)から購入し、特異的病原体-フリー条件で収容した。それらを、the American Association for Accreditation of Laboratory Animal Careおよびthe U.S.Public Health Service Policy on Human Care and Use of Laboratory Animalsによって記載されたガイドラインに従ってケアし、全ての実験はthe MDACC Institutional Animal Care and Use Committeeによって認められ、監督された。組織における単一用量蛍光siRNAの取込み、またはEphA2に対する単一用量siRNAのサイレンシング能力を決定するための実験は、触診によって評価して、一旦、腹腔内腫瘍が0.5〜1.0cm3のサイズに到達すれば開始した。リポソームsiRNA(5μg)を、通常の圧力下で、200μlの静脈内ボーラスとして尾静脈に投与し、腫瘍および他の組織を注射後種々の時点で(1時間、6時間、48時間、4日、7日または10日)収穫した。組織検体を溶解物調製のためにスナップ凍結し、パラフィン包埋のためにホルマリン中で固定し、あるいは凍結されたスライド調整物のためにOCT培地中で凍結した。腫瘍の成長を評価するための長期実験のために、細胞注射から1週間後に療法を開始した。パクリタキセル100μgまたはビヒクルを1週間に1回腹腔内注射し;リポソーム中のsiRNA(非特異的またはEphA2標的化、150μg/kg)、または空のリポソームを、正常な圧力にて(マウス体重に依存して)150〜200μl容量で1週間当たり2回静脈内注射した。マウス(n=10/群)を有害作用についてモニターし、4週間の療法の後に、あるいはマウスのいずれかが瀕死のように見え始めた場合に腫瘍を収穫した。マウス体重、腫瘍重量、および腫瘍の分布を記録した。生きた器官も収穫し、組織毒性の証拠のために病理学者によって剖検を行った。
免疫蛍光(IF)のための組織を屠殺したマウスから収集し、OCT培地中に直ちに入れ、迅速に凍結した。凍結されたセクションを従来の顕微鏡観察のために8μmセクションに切断し、共焦点顕微鏡観察のために30μmセクションに切断した。組織をアセトンで固定し、直ちに調べるか、あるいは(スカベンジングマクロファージを検出するための)f4/80または(内皮細胞を検出するための)CD31について共染色した。IF検出のために、スライドをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中の5%正常ウマ血清および1%正常ヤギ血清(Invitrogen,Carlsbad,CA)でブロックし、ブロッキング溶液中の10μg/ml抗-f4/80抗体(Serotec,Oxford,UK)または0.625μg/mlの抗-CD31抗体に4℃にて1晩暴露し、PBSで洗浄し、ブロッキング溶液中の4μg/ml抗-ラット抗体-Alexa488(Molecular Probes,Eugene,OR)に室温にて1時間暴露した。スライドをPBSで洗浄し、1.0μg/ml Hoescht(Molecular Probes,PBS中)または10nM Sytoxグリーン(Molecular Probes,PBS中)いずれかに10分間暴露して、核を染色し、洗浄し、顕微鏡評価のためにプロピルガレートおよびカバーガラスで被覆した。従来の顕微鏡観察をZeiss AxioPlan 2顕微鏡、Hamamatsu ORCA-ER Digitalカメラ(Hamamatsu Corp,日本)、およびImageProソフトウェア(Media Cybernetics,Silver Spring,MD)で行った。30μmセクション内の三次元における蛍光をZeiss LSM 510共焦点顕微鏡およびLSM 510 Image Browserソフトウェア(Carl Zeiss,Inc.,Germany)で調べた。
PBSで細胞を洗浄し、続いて、修飾されたRIPA溶解緩衝液(50mMトリス、150mM NaCl、1%トリトン、0.5%デオキシコレート+25μg/mlロイペプチン、10μg/mlアプロチニン、2mM EDTA、および1mMオルトバナジン酸ナトリウム(Sigma Chemical Co,St,Louis,MO))中で4℃にて10分間インキュベートすることによって、培養された細胞の溶解物を調製した。細胞をプレートから掻き取り、13,000rpmにて4℃で20分間遠心し、-80℃で上清を貯蔵した。スナップ凍結組織から溶解物を調製するために、ほぼ30mm3切断の組織をRIPA中にて氷上で3時間インキュベートし、乳鉢および乳棒で破壊し、ホモジナイズし、遠心し、上清を-80℃で貯蔵した。腫瘍の3つの領域からの試料を収集し、個々にテストした。BCA Protein Assay Reagentキット(Pierce Biotechnology,Rockford,IL)を用いてタンパク質濃度を測定し、10%SDS-PAGE分離に供した。半乾燥電気詠動(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)によってニトロセルロース膜に移した試料を、0.625μg/ml抗-EphA2抗体(Upstate,Lake Placid,NY)と共に4℃にて1晩インキュベートし、1μg/ml HRPコンジュゲーテッド抗-マウスIgG(Amersham,Piscataway,NJ)で検出し、増強されたケミルミネセンス検出キット(ECL,Pierce)を用いて発色させた。膜をβ-アクチン(0.1μg/ml抗-β-アクチン一次抗体(Sigma))についてテストして、同等な負荷を確認した。
ホルマリン固定したパラフィン包埋セクションを、キシレン、100%エタノール、95%エタノール、80%エタノール、およびPBSで順次洗浄することによって脱パラフィン化した。0.2MトリスHCl(pH9.0)中のスチームクッカーで20分間加熱することによって、抗原検索を行った。冷却およびPBS洗浄の後に、内因性ペルオキシドをメタノール中の3%H2O2で5分間ブロックした。非特異的タンパク質および暴露された内因性マウスIgG抗体を、0.5%ブロッキング剤(TSAビオチン系キット,Perkin Elmer,Boston,MA)中の0.13μg/mlマウスIgG Fcブロッカー(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)で4℃にて1晩ブロックした。スライドを一次抗体、5μg/mlのマウス抗-EphA2クローンEA5、Michael Kinch博士(MedImmune,Inc.,Gaithersburg,MD)の親切な贈物中で4℃にて4時間インキュベートし、洗浄し、続いて、1.5μg/mlビオチニル化ウマ抗-マウス(Vector Labs,Burlingame,CA)と共に室温にて1時間インキュベートした。二次抗体シグナルを0.75μg/mlストレプトアビジン-HRP(DakoCytomation,Carpinteria,CA)で30分間増強させ、DAB(Phoenix Biotechnologies,Huntsville,AL)基質で7分間検出し、Gil No.3ヘマトキシリン(Sigma)で20秒間対比染色した。
インビボ療法実験のために、腫瘍サイズの50%低下を検出するための電力分析によって示されるように(β誤差0.8)、各群において10匹のマウスを用いた。値が正規分布していればステューデントのt検定にて、そうでなければマン-ホイットニーランク総和検定にて、平均腫瘍サイズを、STATA8ソフトウェア(College Station,TX)を用いて統計学的有意性について分析した(p<0.05であれば達成された)。
C.elegans(Fire,1998)および哺乳動物細胞(Elbashir,2001)におけるその記載以来、遺伝子サイレンシングの方法としての短い干渉性RNA(siRNA)の使用は、タンパク質機能描写、遺伝子発見、および薬物開発において強力なツールに早々となった(Hannon,2004)。特異的RNA分解の有望性は、治療様式としての可能な使用についてかなりの刺激をやはり生じたが、インビボsiRNA送達は困難なことが判明した(Ryther,2005)。他の核酸について効果的な送達方法はsiRNAについて必ずしも効果的ではない(Hassani,2005)。従って、siRNAをインビボで用いるほとんどの研究は、動物モデルへの導入に先立っての細胞系における遺伝子発現の操作(Brummelkamp,2002;Yang,2003)、またはsiRNAのウイルスベクターの取り込み(Xia,2002;Devroe,2004)を含む。「裸の」siRNAのインビボでの送達は部位特異的注射、または臨床的に現実的でない高圧手段を介するものに制限されてきた。通常の全身投与後における内因性タンパク質のインビボ取り込みおよび標的ダウンレギュレーションを示す唯一の実験は、未知の毒性を有し、siRNAの活性または寿命に影響し得るsiRNAの化学的変調を必要とした(Soutschek,2004)。
有効な送達ビヒクルがインビボ送達で必要である。カチオン性リポソームは、核酸を効果的に取り込むが、場合により、それらの安定な細胞内性質および結果としてsiRNAの内容物を放出できないため、インビボ遺伝子ダウンレギュレーションについて制限された成功しか有さなかった。本発明者らは、この分子を成功して用いて、インビボにてアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達した(Gutierrez-Puente,1999)ので、DOPCを選択した。一緒に混合すると、90%を超えるリポソームが、蛍光につき顕微鏡で調べると、自然に蛍光タグを付けたsiRNAを取り込む。リポソームによって取り込まれなかったsiRNAの量を見積もるために、遊離siRNAをカラム濾過によってリポソームから分離し、siRNAを分光光度法によって測定した。siRNAの約65%がリポソームに取り込まれると見積もられる。本発明者らは、リポソーム核酸複合体が、-20℃で貯蔵した場合に少なくとも4週間安定であることを観察した。
siRNAが腫瘍細胞へ効果的に送達できるかを調べるために、本発明者らは、DOPC複合体中のフルオロクロームAlexa-555をタグを付けた非サイレンシングsiRNAを利用した。HeyA8同所性腫瘍を持つマウス(腫瘍細胞の腹腔内接種から15日後、図1A)に5μgのDOPCコンジュゲーテッド非サイレンシングsiRNA/Alexa-555を静脈内注射した。腫瘍を1時間、および4、7、または10日に収穫し、蛍光について調べた。注射から1時間後と早く、siRNAの点状発光が、非蛍光siRNAを注射した腫瘍の発光パターンには存在しない(図1B)個々の細胞の核周囲領域で認められた(図1C)。siRNAは調べた40×視野の80%で見られ、全ての腫瘍細胞の30%と見積もられた。蛍光は血管系に直ぐに隣接する双方の領域に存在し、また、CD31免疫蛍光共-局所化によって示されるように、腫瘍床には深かった。さらに、本方法はsiRNAの血管内皮細胞への送達も示した。
他の器官における分布を調べるために、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺および脳のセクションをDOPC中のAlexa-555-siRNAの単一用量後に蛍光について調べた。非蛍光siRNAで処理したマウスからの検体を調べて、バックグラウンド蛍光を測定した。肝臓、腎臓、および肺において有意なsiRNA取り込みおよび細胞質分布があった(各々、図2A、図2B、および図2C)。心臓においては少量の取り込みがあったが、未処理心臓組織のそれよりも有意に大きかった。脾臓、膵臓、および脳における内因性タンパク質産物によって発せられる蛍光は評価をより困難とし、リポソームがこれらの組織に取り込まれるというはっきりとした結論を排除する。
本発明者らは、以前、EphA2が卵巣癌を持つ患者のかなりのパーセンテージによって過剰発現されること、および過剰発現は貧弱な結果を予測することを示した(Thaker,2004)。さらに、このタンパク質は成人における低い相対的発現を有し、従って、魅力的な腫瘍選択的標的である。従って、本発明者らはモデルとしてEphA2を用いて、siRNA療法の効率をテストした。インビトロにて、EphA2 siRNAでトランスフェクトされたHeyA8およびSKOV3ip1双方の卵巣癌細胞系は、ウエスタンブロット分析によって測定して、対照siRNAでのトランスフェクションと比較してEphA2発現の95%減少を示した(データは示さず)。引き続いて、本発明者らは、同所性インビボモデルにおいてEphA2をサイレントとするDOPCリポソームsiRNAの能力をテストした。EphA2標的化siRNA-DOPCを腫瘍担持マウスに与え、種々の時点に腫瘍を収集した。腫瘍溶解物のウエスタンブロットによる(図3A)および免疫組織化学による(図3D)によるEphA2の測定は、単一用量抗-EphA2 siRNAの投与から48時間後に収集された腫瘍が、非特異的siRNAでの(図3B)または裸のsiRNAでの(図3C)処理と比較して、EphA2の発現を有意に減少させた。4日において抑制されたままでいたEphA2の発現は7日後においてより高く、10日までに正常なレベルに復帰した。従って、本発明者らは、引き続いての療法実験のために、抗-EphA2 siRNAの毎週2回の投与を用いた。
雌ヌードマウス(細胞系当たりn=50、群当たり10)の腹腔にHeyA8またはSKOV3ip1細胞を注射した。腫瘍細胞注射から1週間後に、動物を5つの処理群:1)空のリポソーム、2)非特異的siRNA-DOPC、3)EphA2標的化siRNA-DOPC、4)パクリタキセルおよび非特異的siRNA-DOPC、および5)パクリタキセルおよびEphA2標的化siRNA-DOPCにランダムに割り当てた。4週間の療法の後、動物を屠殺し、剖検を行った。腫瘍を切り出し、重量を測定した。抗-EphA2 siRNA、パクリタキセル+対照siRNA、およびパクリタキセル+抗-EphA2 siRNAでの処理は、全て腫瘍サイズを低下するのに有効であり、組合せ療法は対照siRNA単独での処理と比較して86〜91%低下に導いた(図4A、図4B)。EphA2のsiRNA単独での標的化は、対照siRNA単独と比較した場合、双方の系における腫瘍成長を減少させた(HeyA8:0.98g v.1.51g、各々、p=0.155;SKOV3ip1:0.35g v.0.70g、各々、p=0.020)。パクリタキセルと組み合わせたEphA2標的化siRNAは、非特異的siRNAおよびパクリタキセルと比較して腫瘍成長を有意に低下させた(HeyA8:0.21g v.0.84g、各々、p<0.003;SKOV3ip1:0.04g v.0.22g、各々、p<0.001)。腫瘍成長阻害(EphA2標的化単独での中程度の阻害、パクリタキセルと組み合わせた顕著な阻害)のこのパターンは、このマウスモデルにおける抗体ベースのEphA2-ダウンレギュレーションで観察されたのと同様である(データは示さず)。興味深いことに、非特異的siRNA-DOPCの投与の結果、腫瘍成長のいくらかの低下がもたらされたが、空のリポソームと比較した場合、HeyA8モデルにおいてのみ統計学的に有意であった。これらのデータは、特異的mRNA標的なしのsiRNAは、腫瘍成長に影響する非特異的効果を有することができるという以前の報告を裏付けることができ(Hannon,2004)、さらに、siRNA-DOPCが腫瘍実質に送達されるという本発明者らの仮説を裏付ける。
FAK標的化および組合せ療法
1. 材料および方法
細胞系および培養
樹立されたヒト卵巣癌細胞系SKOV3、SKOV3ip1およびHeyA8の誘導および源は先に記載した。タキサン耐性細胞系であるSKOV3-TR(Michael Seiden博士,Massachusetts General Hospital,Boston,MAの贈物)およびHeyA8-MDR(Isaiah Fidler博士,Department of Cancer Biology,University of Texas M.D. Anderson Cancer Centerからの贈物)も用いた。15%胎児ウシ血清および0.1%ゲンタマイシン硫酸を補足したRPMI 1640または修飾されたイーグル培地(Gemini Bioproducts;Calabasas,CA)における連続継代によって、全ての細胞系をインビトロにて維持し、増殖させた。全てのインビトロ実験は70〜80%密集培養で行った。
siRNAを合成し、次いで、高速液体クロマトグラフィー(Qiagen-Xeragon,Germantown,MD)を用いて精製した。FAK siRNAセンス:
;アンチセンス:
および対照siRNAセンス;
アンチセンス:いずれかの公知のヒトmRNA配列に対して配列相同性を有さない
を緩衝液(100ミリモル/L酢酸カリウム30ミリモル/L HEPES水酸化カリウム、2ミリモル/L酢酸マグネシウム、pH7.4)に20ピコモル/Lの最終濃度まで溶解させ、60秒間で90℃まで加熱し、37℃で60分間インキュベートし、さらに使用するまで-20℃で貯蔵した。
インビボ送達用のsiRNAをリン脂質1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(DOPC)に取り込んだ。従前に記載されているように(Landen et al.,2005)、1:10(wt:wt)の比率にて、DOPCおよびsiRNAを過剰の第三級ブタノールの存在下で混合した。Tween-20を1:19の比率で混合物に加えた。混合物をボルテックスし、アセトン/ドライアイス浴中で凍結し、凍結乾燥した。インビボ投与の前に、この調製物を15μg/mlの濃度にて生理食塩水(0.9%)で水和して、注射当たり150〜200μlの所望の用量を達成した。リポソームによって取り込まれなかったsiRNAの量を見積もるために、30,000公称分子量限界を持つフィルターユニット(Millipore Corp,Billerica,MA)を用いることによって遊離siRNAをリポソームから分離した。リポソーム懸濁液をフィルターに加え、5,000gにて室温で40分間遠心した。画分を集め、フィルターに捕獲された物質を0.9%食塩水で戻し、集められた画分および溶離剤中のsiRNAの量を分光光度法によって測定した。
ロイペプチン、アプロチニン、およびオルトバナジン酸ナトリウムはSigma Aldrich(St.Louis,MO)から入手し、EDTAはGibco-Invitrogen(Carlsbad,CA)から入手し、ドセタキセルはSanofi-Aventis(Bridgewater,NJ)から入手し、およびシスプラチンはLKT Laboratoriesから入手した。用いた一次抗体はマウス抗-FAK(Biosource International Camarillo,CA)、マウス抗増殖細胞核抗原(PCNA)クローンPC 10(Dako A/S,Copenhagen,Denmark)およびマウス抗-CD31(Pharmingen,San Diago,CA)であった。以下の二次抗体を比色免疫組織化学(IHC)分析で用いた:ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲーテッドヤギ抗-ウサギ免疫グロブリンG(IgG);F(ab)2 Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,(West Grove,PA);ビオチニル化マウス抗ヤギ(Biocare Medical,Walnut Creek,CA);HRPコンジュゲーテッドストレプトアビジン(Dako A/S);HRPコンジュゲーテッドラット抗マウスIgG2a(Serotec,Harlan Bioproducts for Science,Inc.,Indianapolis,IN);HRPコンジュゲーテッドヤギ抗-ラットIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)および蛍光Alexa 488コンジュゲーテッドヤギ抗ウサギIgG(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)。
従前に記載されているように(Sood et al.,2004;Sood et al.,2002)、細胞を修飾されたRIPA緩衝液(50mMトリス、150mM NaCl、1%トリトン、0.5%デオキシコレート+25pg/mlロイペプチン、10pg/mlアプロチニン、2mM EDTA、および1mMオルトバナジン酸ナトリウム(Sigma Chemical Co,St.Louis,MO))に溶解させた。細胞掻き取りによって試料を培養皿から取り出し、12,500rpmにて30分間遠心した。上澄みのFAKタンパク質濃度を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ試薬キット(Pierce,Rockford,IL)を用いて測定し、全細胞溶解物を7.5%SDS-PAGEによって分析した。次いで、半乾燥移動によって試料をニトロセルロース膜に移した(BioRad Laboratories,Hercules,CA)。膜を5%無脂肪乳でブロックし、0.25μg/mL抗-FAK抗体(Biosource,International Camarillo,CA)と共に室温にて1時間インキュベートした。抗体を0.167μg/mL HRPコンジュゲーテッド抗-マウス二次抗体(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)で検出し、増強されたケミルミネセンス検出キット(Pierce)で発色させた。β-アクチン(0.1μg/ml、抗-β-アクチン抗体、Sigma Chemical)の検出によって、同等な負荷を確認した。Scion Imagingソフトウェア(Scion Corporation,Frederick,MD)を用いて、デンシトメトリー分析を行った。
異なる条件下で細胞傷害性薬物のIC50濃度を決定するために、2×103細胞を96ウエルプレートに蒔き、37℃にて一晩インキュベートし、その後、対照またはFAK標的化siRNAいずれかを加えた。培地を、エタノールに溶解させた(Aventis Pharma,Bridgewater,NJから入手した)増大させる濃度のドセタキセル(最終の濃度範囲、培地中で調整された0.1〜10,000ナノモル/L)または水に溶解させた(LKT Laboratories,Inc.,St.Paul,MNから購入した)シスプラチンと48時間後に交換した。96時間のインキュベーション後に50μLの0.15%臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)2,5-ジフェニルテトラゾリウムを各ウェルに加え、2時間インキュベートした。上清を除去し、細胞を100μLのDMSOに溶解させた。570nmにおける吸光度をFALCONマイクロプレートリーダー(Becton Dickinson Labware,Bedford,MA)を用いて記録し、細胞生存を、ブランクA570読みを差し引いた後に、対照状態を超えるパーセント増加または減少として表した。IC50濃度は最大および最小の読みの間のA570読みの中点を見出し、そのA570読みにおける成長曲線を横切る化学療法濃度を見出すことによって決定した。
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ニック末端標識陽性細胞を、製造業者の指示に従って、Dead End Fluorometricターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ニック末端標識システム(APO-DIRECT,BD Biosciences/PharMingen,San Diego,CA)を用いて検出した。簡単に述べると、培養中の卵巣癌細胞を変化させる濃度のドセタキセルで処理し、12、24、48、または96時間後に収穫した。細胞を氷上で4%パラホルムアルデヒド溶液で25分間固定した。次いで、細胞をフルオレセイン-12-dUTPに暴露することによって細胞内DNA断片を標識し、ヨウ化プロピジウムおよびRNaseA溶液で処理し、フローサイトメトリー(EPICS XL,Beckman Coulter,Miami,FL)によって分析した。アポトーシス細胞のパーセンテージを3回の連続実験にわたって平均した。
培養中の卵巣癌細胞(1×106)(6ウエルプレート)を細胞系特異的IC50またはIC90濃度においてドセタキセルの有無にて24時間処理した。PBSで洗浄した後、細胞を提供された50μLの細胞溶解緩衝液中で溶解させた。カスパーゼ-3、カスパーゼ-8、およびカスパーゼ-9活性を、カスパーゼ-3については基質DEVD-AFC、カスパーゼ-8についてはIETD-AFC、およびカスパーゼ-9についてはLEHD-AMCを用い、適当なアポトーシス検出キット(BD Biosciences/Clontech,Palo Alto,CA)で測定した。
雌無胸腺ヌードマウス(NCr-nu)はthe National Cancer Institute-Frederick Cancer Research and Development Center(Frederick,MD)から購入した。該マウスを収容し、the American Association for Accreditation of Laboratory Animal Careによって認可され、かつthe U.S. Department of Agriculture,the U.S. Department of Health and Human Services, and the National Institutes of Healthの現在の規制および標準に従った施設において特異的病原体フリー条件下で維持した。全ての実験は、The University of Texas M.D. Anderson Cancer Center,Institutional Animal Care and Use Committeeによって認可され、監督された。マウスが8〜12週齢になると、該マウスをこれらの実験で用いた。
マウスモデルにおいてFAK siRNAおよびドセタキセルの組合せの治療効果を評価するために、予備的用量応答実験を行い、FAK siRNAのための実験について、HeyA8細胞を腹腔内移植し、腹腔内腫瘍を触診によって評価できる場合に腫瘍注射から21日後に処理を開始した。マウスを3つの群(群当たりn=10)にランダムに分布させ、PBS、200μl容量の150μg/kgで対照siRNAまたはFAK siRNAの単一用量によって処理した。処理の後に、有限の時点(24時間、48時間、96時間および6日)に3匹のマウスを屠殺した。蛍光IHC分析を、後に記載するように、いずれかの切り出された腹腔腫瘍で行った。
PCNA発現はパラフィン包埋腫瘍を用いてIHC分析によって測定した。セクション(8μm厚み)をキシレン中で脱パラフィン化し、アルコールの段階的シリーズ[100%、95%、80%エタノール/二重蒸留水(v/v)]で処理し、PBS(pH7.5)中で再度水和させた。0.1Mクエン酸緩衝液pH6.0中での5分間のマイクロ波加熱、続いての、メタノール中での3%H2O2での5分間の内因性ペルオキシドのブロッキングによって抗原の検索を行った。PBS洗浄×2後に、スライドをPBS中の5%正常ウマ血清および1%正常ヤギ血清で室温にて15分間ブロックし、続いて、ブロッキング溶液中で一次抗体(抗-PCNA、PC-10、マウスIgG、Dako)と共に4℃にて一晩インキュベートした。2回のPBS洗浄の後に、ブロッキング溶液中のホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした適当な二次抗体を室温にて1時間で加えた。HRPをDAB(Phoenix Biotechnologies,Huntsville,AL)基質で5分間検出し、洗浄し、Gil No3ヘマトキシリン(Sigma)で20秒間対比染色した。CD31についてのIHCを新たにカットした凍結組織で行った。これらのスライドを冷アセトン中で10分間固定し、抗原検索を必要としなかった。用いた一次抗体は抗-CD31(PECAM-1、ラットIgG,Pharmingen)であった。PCNAおよびCD31についての染色は4週間の療法試験の最後に集められた腫瘍で行った。二次抗体単独に暴露された対照腫瘍は特異的染色を示さなかった。
MVDを定量するために、×100最終倍率の10のランダム0.159mm2視野を各腫瘍について調べ(マウス当たり1つのスライド、群当たり5スライド、視野当たりの微小血管の数をカウントした。単一の微小血管はCD31に対して陽性に染色された区別されるクラスターまたは単一細胞と定義され、ルーメンの存在は微小血管としてのスコアリングに必要であった。PCNA発現を定量するために陽性細胞(DAB染色)の数を×100倍率の10のランダム0.159mm2視野でカウントした。TUNEL陽性細胞を定量するために緑色蛍光陽性細胞の数を×400倍率の10のランダムな0.011mm2視野でカウントした。
3,3-ジアミノベンジジン染色セクションを、3チップ電荷カップルドデバイスカラービデオカメラ(モデルDXC990;Sony,東京,日本)を備えたMicrophot-FX顕微鏡(Nikon,Garden City,NY)上で10×対物レンズで調べた。免疫蛍光顕微鏡観察は、HBO 100水銀ランプおよび緑色、赤色、青色蛍光(Chroma Technology,Brattleboro,VT)について個々に選択するための狭いバンドパスフィルターを備えたMicrophot-FXA顕微鏡(Nikon)上で20×対物レンズで行った。イメージは冷却された電荷カップルドデバイスカメラ(モデル5810;Hamamatsu,Bridgewater,NJ)およびOptimas Image Analysisソフトウェア(Media Cybernetics,Silver Spring,MD)を用いて捉えた。フォトモンタージュはMicrografx Picture Publisher(Corel,Dallas,TX)およびAdobe Photoshopソフトウェア(Adobe Systems,Inc.,San Jose,CA)を用いて調製した。フォトモンタージュはデジタルカラープリンター(モデルUP-D7000;Sony)で印刷した。
インビボ実験では、連続的変数(平均体重、腫瘍重量、MVD、PCNA)の差は、2つの群を比較するためのステューデントのt検定を用い、かつ統計学的に有意と考えられる0.05未満のp値との複数群比較のためのANOVAによって解析した。正規分布しなかった値については、マン-ホイットニーランク総和検定を用いた。the Social Sciences(SPSS: SPSS Inc.,Chicago,IL)についての統計学的パッケージを全ての統計学的解析で用いた。
PCNAの発現は、パラフィン包埋腫瘍を用いるIHC分析によって測定した。セクション(8μm厚み)を正に荷電したSuperfrostスライド(Fisher Scientific Co.,Houston,TX)に設置し、一晩乾燥した。セクションをキシレン中で脱パラフィン化し、段階的シリーズのアルコール[100%、95%、80%エタノール/二重蒸留水で(v/v)で処理し、PBS(pH7.5)中で再度水和させた。スライドを水に入れ、次いで、それを高出力のマイクロ波で5分間沸騰させることによって抗原を検索した。CD31の発現は、4μm厚みセクションに切断し、正に荷電したスライド上に設置された新鮮な凍結された組織を用いて測定した。スライドは-80℃で貯蔵し;セクションを冷アセトン中で10分間固定し、次いで、PBSで2回、各3分間洗浄した。陽性反応は、スライドを安定な3,3ジアミノベンジジンと共に10〜20分間インキュベートすることによって可視化した。セクションを蒸留水で濯ぎ、ギル(Gill)ヘマトキシリンで1分間対比染色し、Universalマウント(Research Genetics)で設置した。二次抗体単独に暴露された対照試料は特異的な染色を示さなかった。
ドセタキセルに対する卵巣癌細胞系のインビトロ感受性
本発明者らは、まず、0.1〜10,000ナノモル/Lの範囲の用量にて、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムアッセイを用いることによって卵巣癌細胞系の成長に対するドセタキセルの効果を分析した。卵巣癌細胞の成長は、用量依存的に阻害された(図5)。SKOV3およびHeyA8細胞についてのIC50値は、各々、6.2および1ナノモル/Lであった。SKOV3-TRおよびHeyA8-MDRについてのIC50レベルは、各々、225および450ナノモル/Lであった(図5)。従って、SKOV3-TRおよびHeyA8-MDR細胞系は、各々、ドセタキセルに対して36倍および300倍より耐性であった。
本発明者らは、ドセタキセルと組み合わせたFAK発現の阻害、およびインビボ治療剤能力を調べた。療法実験の開始に先立って、インビボでのFAKをダウンレギュレートするDOPCに取り込まれたFAK標的化siRNAの能力を評価した。腹腔内HeyA8腫瘍を担うヌードマウスに単一用量のFAK siRNA i.p.を注射し、FAK発現のレベルを評価するためのウエスタンブロット分析および免疫組織化学のための注射から1、2、4、および6日後に腫瘍を収穫した。ウエスタンブロット分析は48時間以内にFAKレベルの>80%低下を明らかとし、これは少なくとも4日間持続した(図12A)。FAK発現は単一処理後6日までに基礎レベルに戻り始めた。同様な結果が免疫組織化学で認められた(図12B)。FAK発現は対照siRNAによって影響されなかった。siRNA(150μg/kg)の毎週2回の投与を、引き続いての療法実験のための例示的な投与スケジュールとして選択した。
遺伝子発現のFAK標的化阻害の治療的潜在能力をテストするのに設計された実験のために、SKOV3ip1またはHeyA8卵巣癌細胞を無胸腺ヌードマウスの腹腔に移植した。数日後に、以下の5つの治療群:1)空のリポソーム;2)非特異的siRNA-DOPC;3)ドセタキセル+非特異的siRNA-DOPC;4)FAK標的化siRNA-DOPC;および5)ドセタキセル+FAK標的化siRNA-DOPCに従って、療法を開始した。動物を療法の4週間後に屠殺し、剖検を行った。SKOV3ip1およびHeyA8に対するこれらの療法の効果についてのデータを、各々、図6Aおよび6Bにまとめる。対照siRNA療法単独は、空のリポソームと比較してSKOV3ip1腫瘍に対して効果的でなかったが、約39%低下がHeyA8腫瘍で認められた(図6Aおよび6B)。FAK siRNA単独またはドセタキセル+対照siRNAでの処理は、対照と比較して双方の細胞系で腫瘍の成長を阻害するのに効果的であった(54〜74%)(図13)。しかしながら、ドセタキセルと組み合わせたFAK siRNAでの処理の結果、腫瘍重量のより大きな低下さえもたらされた(94〜98%)(双方の細胞系について全ANOVAp値<0.001)。さらに、組合せ療法は、2つの試験の各々においてドセタキセル+対照siRNAよりも統計学的に優れていた(HeyA8についてp=0.04、SKOV3ip1についてp=0.02)。
FAK抑制は直接的な抗-腫瘍効果を有することが示されているが、出現証拠は、腫瘍ミクロ環境に対する効果も存在することを示す。抗-FAKベースの療法の効果の基礎となる潜在的メカニズムを決定するために、いくつかの生物学的終点に対するその効果を調べ、これは、脈管形成(MVD)、増殖(PCNA)およびアポトーシス(TUNEL)を含む。FAKおよび腫瘍脈管形成に関する増大する証拠のため(Kornberg et al.,2004;Mitra et al.,2005)、本発明者らは、前記した実験から収穫した腫瘍における血管密度を評価した(図14B)。空のリポソームと比較して、平均MVDがFAK siRNA単独またはドセタキセルと共にsiRNAで処理した腫瘍で低下した(各々、p値0.008および0.009)。MVDの最も有意な低下は組合せ療法群で起こった(6±2、p<0.001)。VEGFおよびMMPの抑制を示唆する最近の実験に基づき(Mitra et al.,2005a; Mitra et al.,2005b,Shibata et al.,1998;Sein et al.,2000)、本発明者らは、これらのタンパク質について全ての群から収穫された腫瘍を調べた。事実、VEGFおよびMMP-9の双方の発現(図7C〜7D)は、単独、またはドセタキセルと組み合わせたFAK siRNA-DOPCで処理した動物からの腫瘍で実質的に低下し、抗血管メカニズムを示唆する。抗血管メカニズムをさらに特徴付けるために、本発明者らは、全ての群における処理の後にデュアル局所化(CD31およびTUNEL)免疫蛍光実験を行った。対照siRNAで処理した腫瘍は、内皮細胞で見られたアポトーシスを伴わない顕著な血管系を有した(図14E)。しかしながら、内皮細胞アポトーシスは、FAK siRNAおよびFAK siRNA+ドセタキセル処理群双方において有意に増加した。内皮細胞に対するFAK siRNA媒介インビボ効果が直接的かを判断するために、本発明者らは、ImmortoMice(H-2k(b)-ts A58)(Langley et al.,2003)の卵巣から摘出されたマウス内皮細胞をFAK siRNAで処理した。ネズミFAKレベルは、インビボ実験のために用いたFAK siRNAによって変化されなかった(データは示さず)。
βアドレナリン作動性受容体、および癌細胞成長のストレス関連増悪
本発明者らは、最近、卵巣腫瘍モデルを用いて、慢性ストレスが脈管形成を促進することによって腫瘍成長を加速することを示した。本発明者は、β1およびβ2アドレナリン作動性受容体(βAR)の存在または非存在についてRT-PCRによって19の卵巣癌細胞系をスクリーニングした。雌ヌードマウスを入手し、使用する前に1週間馴化させ、次いで、以下の群(n=10)に分けた。対照(食物および水を与えず)および毎日2時間のストレス(物理的拘束、食物および水を与えず)。βARヌル(A2780およびRMG2)および陽性(HeyA8およびSKOV3ip1)卵巣癌細胞をストレス開始から10日後に腹腔内注射した。加えて、リポソーム(DOPC)siRNA〜β1、β2、または双方の受容体を用いるブロッキング実験を行った。全てのマウスを注射から21日後に剖検した。
卵巣癌細胞系および培養条件
HeyA8、SKOV3ip1、A2780およびRMG-IIヒト卵巣癌細胞系(Thaker et al.,2005)は、10%胎児ウシ血清(FBS)、ビタミン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、非必須アミノ酸(Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY)およびペニシリン-ストレプトマイシン(Flow Laboratories,Rockville,MD)を補足した完全最小必須培地(CMEM)(Gibco,Grand Island,NY)中で単層培養として成長させた。RMG-II細胞系はNaoto UenoおよびHiroaki Itamochi博士(M.D.Anderson Cancer Center,Houston,TX)からの親切な贈物として入手した。(Science Applications International Corporation,Frederick,MDによってアッセイして)腫瘍細胞はマイコプラズマおよび公知の病原性ネズミウイルスを含まなかった。
10匹の12週齢雌無胸腺ヌードマウス(NCr-nu)はthe Animal Production Area of the National Cancer Institute-Frederick Cancer Research and Development Center(Frederick,MD)から由来した。全ての実験は、Texas Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。
マウスに、Alzet浸透圧ミニポンプ(DURECT Co.,Cupertino CA)の挿入に先立って、少なくとも21グラムの体重を達成させた。毎日2時間の拘束ストレスの開始から7日先立って、ポンプを首筋に挿入した。マウスを吸入させたメトキシプルラン(Medical Developments Australia Pty.Ltd,Melbourne,Australia)で麻酔し、PBS、または2mg/kg/日の用量のPBS中に希釈されたS-プラプラノロール塩酸(Sigma Co.,St.Louis,MO)を含有するAlzetポンプを移植し、これは、28日間の慢性連続受容体遮断を可能とする(Aarons and Molinoff,1982;Exton et al.,2002)。
β1AR
またはβ2AR
に対して標的化されたsiRNAはQiagen(Valencia,CA)から購入し、従前に記載されているように(Laden et al.,2005)、中性リポソーム1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(DOPC)に取り込んだ。
VEGF-Rシグナリングは、毎日、50mg/kgのVEGF-R249の経口チロシンキナーゼ阻害剤、PTK787/ZK232394(1-[4-クロロアニリノ]-4-[ピリジルメチル]フタラジン二塩酸)を用いてブロックした。
全RNAを抽出し(Trizol試薬;Invitrogen Co,Carlsbad,CA)、20μlの最終反応用量にてオリゴ(dT)プライマーおよびM-MLV逆転写酵素(Life Technologies,Inc.,Rockville,MD)を用いて逆転写した(42℃において60分)。PCR増幅はTaqMan 1工程RT-PCRマスターミックス試薬キット(PE Applied Biosystems,Foster City,CA)を備えたABI Prism 7700配列検出システムを用いて行う。定量的な値は、PCR産物の指数関数的成長に関連する蛍光シグナルの増加が、製造業者の指示に従った分析ソフトウェアを用いて、配列検出システムのレーザーディテクターによって検出し始めるCt値から得られる(各試料は、そのI8S含有量に基づいて正規化する)。VEGFプライマーは、Applied Biosystems(製品番号HS00173626-ml)から入手した。βAR発現は、以下のプライマー:β1AR
;β2AR
を用いる半定量的RT-PCRで調べた。
VEGFプロモーターは、Lee Ellis博士(M.D.Anderson Cancer Center,Houston,TX)からの親切な贈物であった。卵巣癌細胞をVEGFプロモーター受容体構築体で一過的にトランスフェクトし(Invitrogen Lipofectamine 2000)、ルシフェラーゼの活性を従前に記載されているように三連で測定した(Reinmuth et al.,2001)。
器官ノルエピネフリン、エピネフリン、およびコルチコステロンのレベルは、HPLC(Agilent 1100 バイナリー HPLC,Wilmington,DE)タンデムマススペクトロメトリー(Waters QuattroUltima,Waters,Milford,MA)を用いて定量した。凍結された粉砕卵巣、脾臓、および網組織の重量を測定し、HPLCグレードのメタノール(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)に懸濁させ、Misonix 3000組織ホモジナイザー(Misonix,Farmingdale,NY)を用いる超音波破壊によってホモジナイズした。試料を15000×gにおいて5℃で5分間遠心して、細胞デブリをペレット化し、次いで、0.1ml上清を分析のために20mM酢酸アンモニウム(pH3.5)と1:1混合した。
パラフィンセクションをCD31(1:800希釈,Pharmingen,San Jose,CA)、MMP-2(1:500希釈,Chemicon,Temecula,CA)、MMP-9(1:200希釈,Calbiochem,San Diego,CA)、VEGF(1:500希釈,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)およびbFGF(1:1,000希釈,Sigma,St.Louis,MO)について4℃で染色した。試料をビオチニル化ヤギ抗-ウサギ抗体で30分間染色し(予め希釈)、続いて、ストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼで30分間染色し(1:300希釈)、3,3’-ジアミノベンジジン(DAB)中で5〜10分間可視化した。対照試料を二次抗体単独に曝露し、それは非特異的染色を示さなかった。
特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドDNAプローブは、脈管形成遺伝子VEGFのmRNA転写体に対して相補的に設計された、
。オリゴヌクレオチド配列の特異性は、FastAアルゴリズム(Radinsky,1993)を用いるGenEMBLデータベースによって最初に決定され、それは、標的遺伝子に対して100%相同性、および非特異的哺乳動物遺伝子配列に対して最小の相同性を示した。d(T)20オリゴヌクレオチドを用いて、各試料におけるmRNAの一体性を確認した。インサイチューハイブリダイゼーションは、最小の修飾を施こして従前に記載されているように行った(Radinsky,1993)。Microprobe手動染色システム(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)を用いて、組織セクションを染色した。このアッセイにおいて陽性反応は赤色に染色された。試料は対比染色されず;従って、吸光度はISH反応の産物のみに帰属できた。
セクションは、3チップ電荷カップルドデバイスカラービデオカメラ(モデルDXC990,Sony Corp.,東京,日本)を備えたNikon Microphot-FX顕微鏡(Nikon Inc.,Garden City,NY)で調べた。フォトモンタージュは、Micrografx Picture Publisher(Corel Inc.,Dallas,TX)およびAdobe Photoshopソフトウェア(Adobe Systems Inc.,San Jose,CA)を用いて調製した。イメージはOptimasイメージ分析ソフトウェア(Bothell,WA)を用いて分析した。
MVDを定量するために、100×倍率の10のランダムな0.159mm2視野を各腫瘍について調べ、視野内の微小血管をカウントした。単一の微小血管はCD31(+)に染色された細胞の区別されるクラスターと定義され、ルーメンの存在が微小血管としてのスコアリングのために必要であった。
平均腫瘍重量および腫瘍小節の数の比較は、SPSS(SPSS Inc.,Chicago,IL)を用いて偏差分析(ANOVA)およびt検定によって解析した。平均MVDおよびVEGF定量化の比較では、ステューデントt検定を利用した。p<0.05は統計学的に有意と考えた。
インビボ慢性ストレスモデルの特徴付け
以前の研究で、卵巣癌腫モデルにおける慢性ストレスの役割を分析したものがなく、従って、本発明者らは、動物を個々のルーサイトチャンバー中に毎日2〜6時間固定化した新規な物理的拘束モデルを開発した(図15A)。ヌードマウスにおけるカテコールアミンおよびコルチコステロンレベルに関するデータの不足のため、これらのホルモンの変化はストレスモデルにおいて特徴付けた。育成設定に対する1週間の馴化の後、動物に毎日の拘束ストレスを1、3、7、および14日与え、その後、組織カテコールアミン、およびコルチコステロンレベルを、卵巣、脾臓、および網を含む、腹腔(卵巣癌転移の部位)中の種々の組織においてHPLCによってアッセイした(血漿中カテコールアミンレベルはかなり不安定であったが、組織レベルはより信頼できることが公知である)(Cao et al.,2002;Paredes et al.,1998)。ストレスに続き、ノルエピネフリンレベルをこれらの器官において255〜358%だけ増加させ(図15B)、コルチコステロンレベルを488〜789%だけ増加させた(図15C)。同様な増加が6時間ストレスを与えた動物で見られた(データは示さず)が、対照マウスにおいては見られなかった。従って、拘束は、慢性ストレスに特徴的なHPAおよびSNS活性を誘導した。
引き続いての実験では、拘束ストレスの開始から7日後に、HeyA8卵巣癌細胞を接種したマウスにおいて腫瘍重量、腫瘍小節の数、および転移のパターンに対する効果を調べた。全てのマウスに、ストレスを与えた動物を拘束している時間の間には食物および水を与えず;従って、唯一の実験変数は拘束の存在対非存在であった。最初の実験においては、マウスを、0、2、または6時間の拘束ストレスを毎日合計して21日間受けるようにランダム化した(図16A)。腫瘍小節の数は2時間ストレス群においては2.5倍だけ増加し(p=0.005)、6時間ストレス群においては3.6倍増加した(p<0.001)。平均腫瘍重量もまた双方のストレスを与えた群において有意により高かった(2時間群において2.5倍、p=0.01;6時間群において2.8倍、p=0.005)。病気は全ての対照マウスにおいては腹腔に閉じ込められたが、ストレスを与えたマウスの50%においては肝臓または脾臓の実質まで拡大した(p=0.01)。腫瘍小節の数および重量は、動物について、1日当たり2時間ストレスを与えたのと6時間ストレスを与えたのでは異なった。従って、2時間の拘束を引き続いての実験でルーチン的に使用した。
ノルエピネフリンおよびエピネフリンが卵巣癌細胞によるVEGFの分泌を促進できることを示す以前のインビトロデータ(Lutgendorf et al.,2003)に基づいて、本発明者らは、ストレスがインビボにて同様な効果を誘導するか否かを判断しようと望んだ。血管内皮細胞マーカーCD31を免疫組織化学によってアッセイし、平均血管密度(MVD)を、対照、およびプラセボまたはプロプラノロールで処理したストレスを与えた動物からのHeyA8腫瘍試料においてカウントした(図18A)。プラセボで処理した動物の中では、平均MVDカウントはストレスを与えない動物において9.1±3.0(レーン5〜13)であったのに対し、ストレスを与えた動物においては27.1±10.7(レーン9〜37)であった(p<0.001)(図18A)。しかしながら、プロプラノロールはMVDカウントのストレス誘導増加を効果的にブロックした(図18A)。同様に、毎日のイソプロテレノールまたはテルブタリンで処理した動物から収穫した腫瘍は、対照と比較して有意により高いMVDカウントを有し(p<0.001)、プロプラノロールは同様にその増大をブロックした(図18B)。ストレスを与えた対対照腫瘍試料における増大した脈管形成は、インサイチューハイブリダイゼーションによって測定されたようにVEGFの有意な上昇が伴った(p<0.001、図18A)。ストレスを与えた動物からの腫瘍試料の免疫組織化学もまた、VEGF、MMP-2、およびMMP-9の増大したタンパク質レベルを示した(図19)。
Claims (38)
- (a)siRNAを含む短い阻害性リボ核酸(siRNA)成分、またはsiRNAをコードする核酸;および
(b)一つまたは複数のリン脂質を含む脂質成分を含み、該脂質成分は実質的に中性の電荷を有することを含む組成物。 - 脂質成分がリポソームを形成する、請求項1記載の組成物
- siRNA成分が脂質成分にカプセル化される、請求項1記載の組成物。
- 組成物が薬学的に許容される担体に含まれる、請求項1記載の組成物。
- 脂質成分が中性リン脂質を含む、請求項1記載の組成物。
- 中性リン脂質がホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンである、請求項5記載の組成物。
- 中性リン脂質が卵ホスファチジルコリン(「EPC」)、ジラウリロイルホスファチジルコリン(「DLPC」)、ジミリストイルホスファチジルコリン(「DMPC」)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(「DPPC」)、ジステアロイルホスファチジルコリン(「DSPC」)、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(「MPPC」)、1-パルミトイル-2-ミリストイルホスファチジルコリン(「PMPC」)、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン(「PSPC」)、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(「SPPC」)、ジミリスチルホスファチジルコリン(「DMPC」)、1,2-ジスエテアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(「DAPC」)、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(「DBPC」)、1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(「DEPC」)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(「POPC」)、リソホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(「DSPE」)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(「DMPE」)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(「DPPE」)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(「POPE」)、またはリソホスファチジルエタノールアミンである、請求項6記載の組成物。
- ホスファチジルコリンがDOPCである、請求項6記載の組成物。
- ホスファチジルエタノールアミンがジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(「DOPE」)である、請求項6記載の組成物。
- リン脂質成分が2以上のタイプの中性リン脂質を含む、請求項5記載の組成物。
- 脂質成分が正に荷電した脂質またはリン脂質、および負に荷電した脂質またはリン脂質を含む、請求項1記載の組成物。
- 脂質成分が、さらに、中性に荷電した脂質を含む、請求項11記載の組成物。
- 負に荷電したリン脂質がホスファチジルセリンまたはホスファチジルグリセロールである、請求項11記載の組成物。
- 負に荷電したリン脂質がジミリストイルホスファチジルセリン(「DMPS」)、ジパルミトイルホスファチジルセリン(「DPPS」)、脳ホスファチジルセリン(「BPS」)、ジラウロイルホスファチジルグリセロール(「DLPG」)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(「DPPG」)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(「DSPG」)、またはジオレオイルホスファチジルグリセロール(「DOPG」)である、請求項11記載の組成物。
- 組成物が、さらに、コレステロールまたはポリエチレングリコール(PEG)を含む、請求項1記載の組成物。
- siRNAが18〜100ヌクレオベースの二本鎖核酸である、請求項1記載の組成物。
- siRNAが18〜30ヌクレオベースである、請求項16記載の組成物。
- siRNAが、過形成または癌性哺乳動物細胞の成長を促進する遺伝子の翻訳を阻害する、請求項1記載の組成物。
- 遺伝子がEphA2、病巣接着キナーゼ(FAK)、またはβ2アドレナリン作動性受容体(β2AR)である、請求項18記載の組成物。
- siRNA成分が少なくとも2つのsiRNA、またはsiRNAをコードする核酸を含む、請求項1記載の組成物。
- さらに化学療法剤を含む、請求項1記載の組成物。
- 細胞を請求項1〜21の治療組成物と接触させることを含む、治療上有効量のsiRNAを細胞に送達する方法。
- 細胞がヒト対象に含まれる、請求項22記載の方法。
- 方法が、癌を治療する方法である、請求項23記載の方法。
- 癌の起源が膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮である、請求項24記載の方法。
- 癌が卵巣癌である、請求項25記載の方法。
- 方法が、過形成疾患を治療する方法である、請求項23記載の方法。
- 過形成疾患が前癌疾患である、請求項27記載の方法。
- 組成物が、細胞の成長を阻害するか、または細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項24記載の方法。
- siRNAが遺伝子の翻訳を阻害し、該遺伝子の発現は癌性細胞の成長を促進する、請求項24記載の方法。
- 方法が、さらに、第二の抗癌療法を対象に投与することを含む、請求項24記載の方法。
- 第二の抗癌療法が外科的処置、放射線療法、免疫療法、化学療法、または遺伝子治療を含む、請求項31記載の方法。
- 化学療法がドセタキセル、パクリタキセル、シスプラチン(CDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド(VP16)、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、またはその組合せの投与を含む、請求項32記載の方法。
- 化学療法がドセタキセルまたはパクリタキセルの投与を含む、請求項33記載の方法。
- 化学療法がsiRNA組成物の前に、間に、または後に送達される、請求項32記載の方法。
- 化学療法がsiNA組成物の24、48、または72時間内に送達される、請求項35記載の方法。
- 治療組成物が静脈内または腹腔内投与される、請求項22記載の方法。
- 癌を有すると同定された、癌を有することが疑われると同定された、または癌を発症する傾向を有すると同定された対象に、有効量の請求項1〜21の組成物を投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法。
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