KR20050084607A - 인플루엔자 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 RNA 간섭(RNAi) 현상에 기초하여 인플루엔자 감염 및/또는 복제를 저해하는 방법과 조성물, 인플루엔자 바이러스를 저해하는데 효과적인 siRNA와 shRNA를 확인하는 시스템, 인플루엔자 바이러스 감염 기전을 조사하기 위한 시스템을 제시한다. 또한, 본 발명은 다른 감염성 병원체, 특히 체외로부터 직접적으로 접근가능한 세포, 예를 들면, 피부 세포 또는 점막 세포를 감염시키는 병원체의 감염, 병원성 및/또는 복제를 저해하는 방법과 조성물을 제시한다. 이에 더하여, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 전사체를 표적으로 하는 RNAi-유도 물질, 예를 들면, siRNA, sRNA 또는 RNAi-유도 벡터 및 다양한 운반제를 함유하는 조성물을 제시한다. 더 나아가, 본 발명은 인플루엔자 치료를 위한 조성물의 용도를 제시한다.

Description

인플루엔자 치료제{INFLUENZA THERAPEUTIC}

본 출원은 2002년 9월 28일자 출원된 U.S. 예비 특허 출원 60/414,457 및 2003년 2월 10일날 60/446,377을 우선권으로 주장한다. 각 출원 내용을 참고문헌으로 첨부한다.

미합중국 정부는 본 발명 개발에 이용된 자금 지원을 하였다. 특히, 본 발명의 개발에 있어서 미국립보건원 지원번호하에 5-ROI-AI44477, 5-ROI-AI44478, 5-ROI-CA60686, I-ROlAI50631를 지원받았다. 미합중국 정부는 본 발명에 대해 일부 권한을 행사할 수 있다.

인플루엔자는 전세계적으로 가장 널리 퍼져있는 감염원중에 하나이다. 인플루엔자는 치명적인 것으로, 1918년 인플루엔자 A 바이러스때문에 약 20만 내지 40만명이 사망하였다. 미합중국에서 매년 약 2만 내지 4만명이 인플루엔자 A 바이러스 감염 및 이의 합병증으로 사망한다. 인플루엔자 유행시기에는 한철 겨울에 인플루엔자로 인한 입원환자가 300,000명 이상이 된다.

인플루엔자 바이러스가 이와 같이 유행 원인은 몇 가지 특징때문이다. 우선, 공기(방울 감염)에 의해 사람간에 용이하게 전파된다. 둘째, 인플루엔자 바이러스 항원에 작은 변이가 빈번하게 발생되어(항원성 변이) 상이한 바이러스 변이체에 기존에 노출되어 형성된 면역 보호 기능으로부터 바이러스가 용이하게 빠져나갈 수 있다. 세째, 상이한 균주간에 유전 물질 혼합(항원성 변이) 또는 재분류등을 통하여 새로운 인플루엔자 바이러스 균주가 쉽게 생성될 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스의 경우에, 이와 같은 혼합은 서브타입 또는 균주간에서 일어날 수 있고, 상이한 종에 영향을 줄 수 있다. 1918 인플루엔자 유행은 돼지 인플루엔자 A 바이러스와 사람 인플루엔자 A 바이러스간에 재분류에 의해 만들어진 바이러스 균주에 의한 것으로 보인다.

상당한 연구 노력에도 불구하고, 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 효과적인 치료방법이 아직까지 없으며, 상기에서 설명한 것과 같이 항원성 변이 및 전이 성질때문에 기존 백신도 일부만 사용할 수 있는 한계가 있다. 이와 같은 이유로 인하여 인플루엔자 A 바이러스를 글로벌 차원에서 수년간 조사하였으며, 미국립보건원은 이 바이러스를 생체 방어에 공격하는 최우선 병인균중에 하나로 지목하였다.

비활성 바이러스에 근거한 현제 백신은 65세 이하의 건강한 개체의 경우에 70-80% 정도 질병을 예방할 수 있는 능력이 있지만, 연로하거나 면역 상충되는 개체에서는 예방 수치가 상기보가 훨씬 낮아진다. 또한, 백신 투여에 관련되는 비용 및 가망 부작용이 적정 수준에 못미친다. 미국에서 인플루엔자 치료 및 예방을 위해 현재 승인을 받은 4가지 항-바이러스 약물이 도움이 되기는 하지만, 부작용, 적응력, 저항 균주의 출현등의 문제점으로 인하여 이들 약물의 사용이 제한된다.

따라서, 인플루엔자 치료 및 예방에 효과적인 치료법을 개발할 필요성이 여전히 남아있다.

발명의 요약

본 발명은 RNA 간섭 현상(RNAi)에 근거하여, 인플루엔자 바이러스 타입 A, B, C에 근거하여 인플루엔자 치료에 효과적인 신규한 치료법을 제공한다. 특히, 본 발명은 바이러스 생산, 복제, 감염, 바이러스 RNA 전사와 연관한 한개 이상의 목표 전사체를 표적으로 하는 짧은 간섭 RNA(siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 제공한다. 또한 본 발명은 벡터를 제공하는데, 이 벡터가 세포내에 존재하면, 바이러스 생산, 복제, 감염, 바이러스 RNA 전사와 연관한 적어도 한개의 표적 이상의 목표 전사체의 발현을 저해하는 shRNA 또는 siRNA를 형성하기 위해 자가 하이브리드되는 또는 서로 하이브리드되는 한 가지 이상의 RNA를 전사하게 된다.

본 발명은 본 발명의 siRNAs, shRNAs, 벡터를 포함하는 다양한 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명의 특정 구체예에서, siRNA은 서로 상보적인 부분을 가지는 두개 RNA 가닥으로 구성되어, 이들 상보적인 부분이 서로 하이브리드되어 길이가 약 19개 뉴클레오티드가 되는 이중 나선 구조를 형성하는데, 이때 각 가닥은 단일 가닥 부분의 돌출(overhang)을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, shRNA는 서로 상보적인 부분을 가지는 두개 RNA 가닥으로 구성되어, 이들 가닥의 상보적 부분이 서로 하이브리드되어 길이가 약 19개 뉴클레오티드가 되는 이중 나선 구조와 단일 가닥 루프가 있는 헤어핀(스템/루프)를 형성한다. 이와 같은 RNA 분자는 자가-하이브리드된다고 할 수 있다. shRNA에는 선택적으로 RNA의 5' 또는 3' 일부분에 한개 이상의 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 본 발명에는 본 발명의 siRNAs, shRNAs, 벡터로 구성된 조성물과 이와 같은 조성물의 운반 방법을 제공한다.

본 발명의 한 특징에서, 본 발명은 목표 전사체를 표적으로 하는 siRNA 또는 shRNA를 제공하는데, 이때 목표 전사체는 병원체-특이적 전사체가 되며, 이 전사체는 감염성 병원체의 생성, 복제 및 병원체에 의한 발병 및 감염에 관여하거나, 병원체-특이적 RNA 전사에 관여한다. 설명을 위해 감염성 병원체의 생성, 복제 및 병원체에 의한 발병 및 감염에 관여하는 목표 전사체 발현을 저해하여, 감염성 병원체 생성, 복제, 및 병원체에 의한 발명 및 감염이 저해되는 siRNA 또는 shRNA를 병원성 감염체를 저해한다고 표현한다. 본 발명의 특정 구체예에 따르면, 감염성 병원체는 바이러스이다. 본 발명의 특정 구체예에 따르면, 감염성 병원체는 폐 또는 호흡기 통로의 세포 예를 들면, 호흡기 상피 세포에 감염되는 바이러스 예를 들면, 인플루엔자 바이러스가 된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 목표 전사체는 폴리메라제, 뉴클레오캡시드 단백질, 뉴라미니다제, 헤마글루티닌, 매트릭스 단백질, 비-구조 단백질에서 선택된 단백질을 인코드한다. 본 발명의 특정 구체예에 따르면, 목표 전사체는 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 막 단백질 1, 막 단백질 2, 비-구조 단백질 1, 비-구조 단백질 2, 폴리메라제 단백질 PB1, 폴리메라제 단백질 PB2, 폴리메라제 단백질 PA, 폴리메라제 단백질 NP에서 선택된 단백질을 인코드한다.

또 다른 한 특징에서 본 발명은 세포에서 활성이 있는 시그날(예를 들면, 프로모터 또는 프로모터/인헨서) 발현에 기능적으로 연결된 핵산으로 구성된 벡터를 제공하는데, 벡터가 세포로 도입되면, 병원체-특이적 전사체를 표적으로 하는 siRNA 또는 shRNA가 숙주 세포내에서 생산되고, 이들 전사체는 감염성 병원체 생산, 복제, 감염 및 감염성 병원체-특이적은 RNA의 전사에 관계한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 감염성 병원체는 인플루엔자 바이러스와 같은 바이러스이다. 특정 구체예에서, siRNA 또는 shRNA는 인플루엔자 바이러스를 저해한다. 전술한 것과 같은 전사체중 하나를 siRNA 또는 shRNA가 표적으로 삼는다. 일반적으로 벡터는 DNA 플라스미드 또는 레트로바이러스(예를 들면 렌티바이러스), 아데노바이러스, 아데노-연합 바이러스 등과 같은 바이러스성 벡터이고, 이들 벡터가 세포에 존재하면, 자가-하이브리드되거나 서로 하이브리드되는 한가지 이상의 리보핵산(RNA)의 전사에 의해 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA)가 형성되거 세포에서 적어도 한가지 인플루엔자 바이러스 전사체의 발현이 저해된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 벡터는 프로모터에 기능적으로 연결된 핵산 단편을 포함하는데, 프의 전사(프로모터에 의해 바로 전사됨)로 인하여 하이브리드되는 상보적 부분을 가지는 RNA가 합성되어 목표 전사체를 표적으로 하는 shRNA가 합성된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 렌티바이러스성 벡터는 반대 방향으로 있는 프로모터에 인접한 핵산으로 구성되고, 프로모터는 핵산에 기능을 하도록 연결되어 있어, 프로모터에서 전사되어 서로 하이브리드될 수 있는 두개 상보적인 RNA를 합성하게 되고, 목표 전사체를 표적으로 하는 siRNA가 형성된다. 본 발명은 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 여기에서 설명하는 siRNAs, shRNAs, 벡터를 포함하는 본 발명의 조성물을 제공하는데, 이때 조성물에는 siRNAs, shRNAs, 벡터를 수취 또는 운반할 수 있는 임의의 다양한 물질이 추가 포함된다(운반 물질로 명명). 이와 같은 물질에는 양이온 폴리머; 아르기닌이 풍부한 펩티드 및 히스티딘이 풍부한 펩티드를 포함하는 펩티드 분자 운반물질; 리포좀; 특정 비-양이온성 폴리머; 탄수화물; 계면활성제 물질등이 포함된다. 또한 본 발명에는 다양한 방법 예를 들면, 운반 물질에 운반을 강화시키는 모이어티를 첨가하는 등의 방식으로 변형된 운반 물질을 이용하는 것도 포함된다.

본 발명의 특정 구체예에서, 운반 물질은 조성물의 안정성을 강화시키고, 세포 수취를 촉진시키고, 세포내에서 siRNA, shRNA, 벡터 방출을 촉진시키고, 세포 독성을 감소시키고, 특정 세포, 조직 또는 기관에 조성물이 제공되도록 다양한 방식으로 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 특정 구체예에서, 운반 물질은 변형된 양이온 폴리머(폴리머의 양이온 성질을 감소시켜, 세포 독성을 감소시키는 선별된 한개 이상의 군으로 치환된 양이온성 고분자)이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 운반 물질은 항체, 항체 단편 또는 호흡기 상피 세포와 같은 세포 표면상에 존재하는 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드와 같은 운반 강화 모이어티로 구성된다.

본 발명은 감염성 질환, 특히 인플루엔자와 같은 호흡계 감염 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공하는데, 감염성 병원체에 노출되기 전, 노출이 발생된 경우 또는 노출된 후 또는 개체가 감염성 병원체에 의한 질병의 징후를 나타내는 시점에 적절한 시간동안에 개체에 본 발명의 임의 조성물을 투여하는 것으로 구성된다. in vitro 전사, in vitro 합성을 이용하여 화학적으로 siRNAs 또는 shRNAs를 합성하거나 세포내에서 합성할 수도 있다. 조성물은 정맥, 흡입, 에어로졸을 이용한 비강 투여, 복막, 근육, 경피, 구강등의 다양한 경로를 통하여 투여할 수 있다.

본 발명은 감염성 병원체에 의한 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는데, 예를 들면 유전자 요법을 이용하여 인플루엔자 바이러스에 의한 질환의 치료 또는 예방법을 제공한다. 이와 같은 특정 방법에 따르면, 세포(감염된 또는 감염되지 않는)는 본 발명의 siRNA 또는 shRNA를 합성할 수 있도록 조작된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 세포에 벡터가 포함되도록 세포를 조작하는데, 세포내에 벡터가 존재하면 서로 또는 자가-하이브리드될 수 있는 한 가지 이상의 RNA가 합성되어, 적절한 목표 전사체를 표적으로 하는 한개 이상의 siRNAs 또는 shRNAs를 형성하게 된다. 세포는 in vitro 상태에서 만들어지거나 개체의 호흡통로와 같은 치료를 받게 되는 개체내에서 만들어진다.

또 다른 측면에서 본 발명은 감염성 병원체를 저해하는 바람직한 siRNAs 또는 shRNAs 서열을 선별하거나 고안하는 방법을 제공한다. 본 발명은 감염성 병원체를 저해하는 바람직한 siRNAs 또는 shRNAs 서열을 선별하거나 고안하는 방법을 제공하는데, 다양한 상이 균주 또는 변이체 감염성 병원체가 존재하고, 이때 유전적인 혼합 또는 재분류에 의해 균주 변이가 생성되는 것을 특징으로 한다. 이와 같은 방법은 감염성 병원체와 싸울 수 있는 siRNA 또는 shRNA 서열을 선별하고 고안하는데 특히 유용하고, 이와 같은 개놈은 다중 상이한 단편으로 구성되며, 유전적 재분류는 한개 서브타입에서 다른 서브타입으로 대체시켜 신속하고 예상치 않는 방식으로 발생한다. 본 발명의 이와 같은 특징은 감염성 병원체의 게놈이 다중 독립적인 단편으로 구성된 경우에 특히 적합한데, 이는 게놈이 서로 공유적으로 결합하지 않는 물리적으로 별개의 핵산분자로 구성된다. 본 발명은 또한 플라스미드 예를 들면 치료 화합물에 저항성을 부여하는 유전자를 인코드하는 플라스미드를 전달하여 유전 정보를 교환하는 감염성 병원체에 특히 유용하다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 전사체를 표적으로 하는 siRNA 또는 shRNA와 같은 한개 이상의 RNAi-유도 물질로 구성된 조성물을 동정하는 시스템을 제공하는데, 이 시스템은 벡터를 포함하고, 벡터가 세포내에 존재함으로써 서로 하이브리드되거나 자가-하이브리드되는 한개 이상의 RNA를 만들고, 이들 RNA는 인플루엔자 바이러스 전사체를 표적으로 하는 siRNA 도는 shRNA를 형성하고, 이때 조성물은 인플루엔자 바이러스 저해에 유용하다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스 RNA의 전사 및 인플루엔자 복체 기전 분석 및 특징을 조사하고 뿐만 아니라 바이러스 라이프 사이클에 연관된 관련 바이러스 성분의 분석 및 특징을 조사하는 시스템을 추가로 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 다중 변이 감염성 변이체가 존재하는 경우에 감염성 병원체를 저해하는 siRNA 또는 shRNA를 고안하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 이중 나선을 일부 가지는 shRNA 또는 siRNA를 고안하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 i) 목표 전사체의 일부분을 확인하고, 이 일부분은 적어도 15개 연속 뉴클레오티드로 구성된 다중 변이 감염성 병원체간 보존성이 높은 부분이며; (ii) siRNA 또는 shRNA를 선별하고, 이때 siRNA의 센스 가닥 또는 shRNA의 센스 가닥 일부분은 상당히 보존된 서열로 구성된다.

본 발명의 또 다른 특징에 있어서, 본 발명은 siRNAs 및 shRNAs를 제공하고, 이를 고안하는 방법을 제공하는데, 이때 siRNA 또는 shRNA는 전사체를 표적으로 하여, 전사체를 저해함으로써 다중 또는 전체 다른 바이러스성 전사체를 저해하게 된다. 특히, 본 발명은 바이러스성 폴리메라제(DNA 또는 RNA 폴리메라제) 또는 뉴클레오캡시드 단백질을 인코드하는 전사체를 표적으로 하는 siRNA 및 shRNA를 포함하는 siRNAs 또는 shRNAs 조성물을 제공한다.

본 출원은 다양한 특허, 문헌 및 공보를 언급한다. 이를 모두 참고문헌으로 첨부한다. 또한, 다음의 문헌은 작업에 기본으로 참고한 자료들이다; Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Immunology, Current Protocols in Protein Science, and Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, N.Y., edition as of July 2002; Sambrook, Russell, and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 ded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001.

도 1A는 Julkunen, I., et al.(문헌이 본 명세서 여러 부분에서 언급된)에서 발췌한 것으로 인플루엔자 바이러스를 나타낸 것이다.

도 1B는 Fields' Virology (문헌이 본 명세서 여러 부분에서 언급된)에서 발췌한 것으로 인플루엔자 바이러스의 구조 및 인플루엔자 게놈으로부터 유도된 전사체의 게놈 구조를 나타낸 것이다. mRNA의 5' 말단와 3' 말단는 해독되지 않은 부분을 나타낸다. 검은 부분이나 빗금친 부분은 각각 0 및 +1 리딩 프레임을 나타낸다. 인트론은 V-자형의 선으로 나타내었다. mRNA의 5' 말단에 있는 작은 직각은 바이러스 핵산에 공유적으로 연결된 이형 세포 RNA를 나타낸다. A(,,)는 폴리A 꼬리를 나타내는 것이다.

도 2는 Julkunen, I., et al.,(문헌이 본 명세서 여러 부분에서 언급된)에서 발췌한 것으로 인플루엔자 바이러스 복제 과정을 나타내는 것이다.

도 3은 초파리(Drosophila)에서 관찰된 siRNA의 구조를 나타낸 것이다.

도 4는 초파리에서 RNA 간섭을 단계별로 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명에 유용한 다양한 siRNA 및 shRNA 구조를 예시적으로 나타낸 것이다.

도 6은 또 다른 저해 과정을 나타내는 것으로, DICER 효소는 스템에서 염기 미스매치를 가지는 기질을 절단하여 목표 전사체의 3'UTR에 결합하는 저해 생성물을 만들고, 해독을 저해한다.

도 7은 본 발명의 siRNA의 양 가닥의 직접적인 전사에 이용될 수 있는 예시적인 구조를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명에 따른 shRNA를 형성하기 위해 합성되는 단일 RNA 분자의 전사체에 바로 이용되는 예시적인 구조를 나타낸 것이다.

도 9는 사람에서 기인하는 인플루엔자 바이러스 A의 6가지 균주간에 서열을 비교한 것이다. 검은 부분을 이용하여 실시예 2에서 설명하는 것과 같이 시험되는 siRNA를 고안하였다. 염기 서열은 균주 A/Puerto Rico/8/34의 서열이다. 밝은 부분의 문자는 염기서열간에 상이한 뉴클레오티드를 나타낸다.

도 10은 사람 기원의 인플루엔자 바이러스의 두가지 균주와 동물 기원의 인플루엔자 바이러스 5가지 균주간에 서열을 비교한 것이다. 짙은 부분은 실시예 2에서 설명하는 것과 같이 테스트되는 siRNAs를 고안하는데 이용된다. 염기 서열은 균주 A/Puerto Rico/8/34의 서열이다. 밝은 부분의 문자는 기본 염기 서열과 상이한 뉴클레오티드를 나타낸다.

도 11A-F는 MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산을 siRNA가 저해한다는 것을 보여주는 실험 결과이다. 전기천공을 이용하여 MDCK 세포로 다양한 바이러스 전사체를 표적으로 하는 6가지 상이한 siRNA를 도입시키고, 8시간 후에 세포에 바이러스를 감염시킨다. 도 11A는 다양한 siRNA 또는 대조군 siRNA 유무하에 감염다중도( multiplicity of infection ) 0.01에서 바이러스 균주 A/PR/8/34 (HlN1) (PR8)로 세포를 감염시킨 후에 다양한 시간대별로 헤마글루티닌 검사를 통하여 측정한 세포 상청액에서의 바이러스 역가를 시간대별로 나타내는 그래프이다. 도 11B는 다양한 siRNA 또는 대조군 siRNA 유무하에 감염다중도( multiplicity of infection ) 0.01에서 인플루엔자 바이러스 균주 A/WSN/33 (HlNl) (WSN)로 세포를 감염시킨 후에 다양한 시간대별로 헤마글루티닌 검사를 통하여 측정한 세포 상청액에서의 바이러스 역가를 시간대별로 나타내는 그래프이다. 도 11C는 가사 트랜스펙션시킨 또는 siRNA NP-1496으로 트랜스펙션 시킨 바이러스 감염된 세포의 배양 상청액에 있는 바이러스 역가를 나타내는 플락 검사이다. 도 11D는 siRNA의 양을 달리하였을 때 인플루엔자 바이러스 생산 저해를 보여주는 그래프이다. MDCK 세포에 지정된 양의 NP-1496 siRNA를 트랜스펙션 시키고, MOT 0.01에서 PR8 바이러스로 감염시켰다. 감염 48시간 후에 바이러스 역가를 측정하였다. 두 가지 실험 결과중 대표적인 한가지 결과를 나타낸 것이다. 도 11E는 바이러스 감염 후에 투여된 siRNA에 의해 인플루엔자 바이러스 생산 저해를 나타낸 것이다. 2시간 동안 MOT 0.01에서 PR8 바이러스를 MDCK 세포에 감염시키고, 그 다음 NP-1496(2.5mnol)으로 트랜스펙션 시켰다. 감염 후 지정된 시간대에 바이러스 역가를 측정하였다. 두 가지 실험 결과중 대표적인 한가지 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 사람 또는 동물 기원의 12가지 인플루엔자 A 바이러스 서브타입 또는 분리체중에 NP 서열의 3'부분의 일부를 서열 비교한 것이다. 짙은 부분은 실시예 2와 3에서 설명하는 것과 같이 테스트되는 siRNA를 고안하는데 이용된 것이다. 짙은 부분은 실시예 2에서 설명하는 것과 같이 테스트되는 siRNAs를 고안하는데 이용된다. 염기 서열은 균주 A/Puerto Rico/8/34의 서열이다. 밝은 부분의 문자는 기본 염기 서열과 상이한 뉴클레오티드를 나타낸다.

도 13은 인플루엔자 바이러스 유전자 단편에 대해, 인플루엔자 바이러스를 저해시키는 효과와 연관이 있는 다양한 siRNA 위치를 나타낸 것이다.

도 14A는 siRNA 및 siRNA/운반 물질 조성물을 주사 부위를 나타내는 병아리 배 발생 과정을 나타낸 것이다.

도 14B는 병아리 배 발생에 있어서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해시키는 다양한 siRNA의 능력을 보여주는 것이다.

도 15는 바이러스 RNA 분자와 뉴클레오프로테인의 상호작용을 나타낸 것이다.

도 16A와 16B는 인플루엔자 바이러스 RNA, mRNA, cRNA(주형 RNA)간에 차이와 이들 사이의 상관관계를 설명하는 도면이다. 도 16B에서는 각 인플루엔자 A 바이러스 vRNA 단편의 5' 말단에 13개 뉴클레오티드과 3' 말단의 12개 보존된 뉴클레오티드를 나타낸다. mRNAs에는 숙주 세포 RNA의 서브 세트에서 유도된 평균 10 내지 13개 뉴클레오티드 길이로 구성된 m⁷GpppN^m 캡 구조가 포함된다. mRNA의 폴리아데닐화반응은 vRNA 단편의 5' 말단전에 15 내지 22개 뉴클레오티드위치에 상응하는 mRNA 부위에서 일어난다. 화살표는 각 RNA 종에 특이적인 프라이머 위치를 나타내는 것이다 (참고문헌(1)의 것은 인용).

도 17에서는 감염 전에 가사 트랜스펙션 시킨 또는 siRNA NP-1496으로 트랜스펙션 시킨 세포에 바이러스를 감염시킨 후에 다양한 시간대에서 바이러스 NP 및NS RNA 종의 양을 나타낸 것이다.

도 18A는 이중 나선 siRNA에서 야생형(WT) 안티센스 가닥이 인플루엔자 바이러스 생산을 저해하는데 필요하다는 것을 보여준다. 우선 MDCK 세포를 wt 및 변형(m) 균주에서 형성된 siRNA로 트랜스펙션 시키고, 8시간 후에 MOI 0.1에서 PR8 바이러스로 감염시킨다. 배양 상청액에서 바이러스 역가는 감염후 24시간에 검사한다. 두가지 실험 결과중 대표로 한가지 결과를 나타낸 것이다. 도 18B에서는 M-특이적 siRNA가 특이적 mRNA 축적을 저해한다는 것을 보여준다. MDCK 세포를 M-37로 트랜스펙션 시키고, MOI 0.01에서 PR8 바이러스로 감염시키고, 감염 후 1, 2, 3시간에 RNA 분리체를 회수한다. RNA-특이적 프라이머를 이용한 역 전사와 실시간 PCR을 통하여 M-특이적인 mRNA, cRNA, vRNA를 측정하였다. 각 바이러스 RNA의 양을 동일 샘플에 있는 γ-액틴 mRNA(맨아래 도면)의 수준에 맞게 표준화시킨다. RNA의 상대적 양을 평균치+ S.D.로 나타낸 것이다. 두가지 실험 결과중 대표로 한가지 결과를 나타낸 것이다.

도 19A-D에서는 NP-특이적 siRNA가 NP-뿐만 아니라 M- 및 NS-특이적 mRNA, vRNA, cRNAm 축적을 저해한다는 것을 보여준다. MDCK(A-C) 및 Vero(D) 세포에 NP-1 496으로 트랜스펙션 시키고, PR8 바이러스로 감염시키고(MOI는 0.1), 감염 후 1, 2, 3시간 후에 RNA 분리체를 회수한다. RNA-특이적 프라이머를 이용한 역 전사와 실시간 PCR을 통하여 NP, M, NS-특이적인 mRNA, cRNA, vRNA를 측정하였다. 각 바이러스 RNA의 양을 동일 샘플에 있는 γ-액틴 mRNA(나타내지 않음)의 수준에 맞게 표준화시킨다. RNA의 상대적 양을 평균치+ S.D.로 나타낸 것이다. 세가지 실험 결과중 대표로 한가지 결과를 나타낸 것이다.

도 19E-G는 PA-특이적 siRNA가 PA-뿐만 아니라 M- 및 NS-특이적 mRNA, vRNA, cRNAm 축적을 저해한다는 것을 보여준다. MDCK(A-C) 세포에 NP-1496으로 트랜스펙션 시키고, PR8 바이러스로 감염시키고(MOI는 0.1), 감염 후 1, 2, 3시간 후에 RNA 분리체를 회수한다. RNA-특이적 프라이머를 이용한 역 전사와 실시간 PCR을 통하여 PA, M, NS-특이적인 mRNA, cRNA, vRNA를 측정하였다. 각 바이러스 RNA의 양을 동일 샘플에 있는 γ-액틴 mRNA(나타내지 않음)의 수준에 맞게 표준화시킨다. RNA의 상대적 양을 나타낸 것이다.

도 19H에서는 NP-특이적 siRNA가 PB1-(상단 그림), PB2-(중간 그림), PA- (하단 그림) 특이적 mRNA 축적을 저해한다는 것을 나타낸 것이다. MDCK(A-C) 세포에 NP-1496으로 트랜스펙션 시키고, PR8 바이러스로 감염시키고(MOI는 0.1), 감염 후 1, 2, 3시간 후에 RNA 분리체를 회수한다. RNA-특이적 프라이머를 이용한 역 전사와 실시간 PCR을 통하여 PB1, PB2, PA mRNA를 측정하였다. 각 바이러스 RNA의 양을 동일 샘플에 있는 γ-액틴 mRNA(나타내지 않음)의 수준에 맞게 표준화시킨다. RNA의 상대적 양을 나타낸 것이다.

도 20A에서는 siRNA CD8-61와 이의 헤어핀 유도체 CDS-61F의 서열을 나타낸 것이다.

도 20B에서는 CD8-61 및 CD8 61F에 의해 CD8α발현이 저해되는 것을 나타낸 것이다. CD8⁺CD4⁺ T 세포주에 CD8-61 또는 CD8-61F를 전기천공을 통하여 감염시켰다. CD8α발현을 48시간 후에 유세포분석기(flow cytometry)를 통하여 검사하였다. 라벨안된 라인은 가사 트랜스펙션 된 것이다.

도 20C에서는 pSLOOP III 벡터의 도면인데, CD8-61F 헤어핀 RNA의 발현은 Hl RNA pol III 프로모터, 종결인자, 종료 시그날 서열에 의해 유도된다.

도 20D는 pSLOOP III를 이용하여 HeLa 세포에서 CD8α접합(splicing)을 나타낸 것이다. 감염안된 세포는 CD8α를 발현시키지 않는다. 세포에 CD8α발현 벡터와 프로모터없는 pSLOOP III-CD8-61F 구조체, 합성 siRNA, 프로모터를 포함하는 pSLOOP III-CD8-61F중의 하나와 함께 트랜스펙션 시킨다.

도 21A에서는 NP-1496, GFP-949 siRNA 및 이들의 헤어핀 유도체/전구물질을 나타낸 것이다.

도 21B에서는 두 가지 다른 순서로 된 NP-1496H 및 GFP-949H의 직렬 배열을 나타낸 것이다.

도 21C에서는 pSLOOP III 발현벡터를 나타낸 것이다. siRNA 헤어핀 전구물질을 pSLOOP III 벡터에만 클론시킨 것(상단 그림), 직렬 배열로 나타낸 것과(중앙 그림), 또는 독립 프로모터 및 종료 서열과 함께 클론된 것을 나타낸 것이다(하단 그림)

도 22A에서는 생쥐에 인플루엔자 바이러스 감염 전에 양이온 폴리머 PEI 와 함께 siRNA가 투여된 경우에 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. ■(처리 없음); □(GFP siRNA); ○(30 ㎍ NP siRNA); ●(60 ㎍ NP siRNA). 각 심볼은 개별 동물을 나타낸대. 상이한 그룹단에 p 값을 나타낸 것이다.

도 22B에서는 생쥐에 인플루엔자 바이러스 감염 전에 양이온 폴리머 PPLL 와 함께 siRNA가 투여된 경우에 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. ■(처리 없음); □(GFP siRNA); ●(60 ㎍ NP siRNA). 각 심볼은 개별 동물을 나타낸대. 상이한 그룹단에 p 값을 나타낸 것이다.

도 22C에서는 생쥐에 인플루엔자 바이러스 감염 전에 양이온 폴리머 jetPEI 와 함께 siRNA가 투여된 경우에 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해시킨다는 것을 보여주는 그래프이다. □(처리 없음); △(GFP siRNA+jetPEI); ●(NP siRNA+jetPEI). 각 심볼은 개별 동물을 나타낸대. 상이한 그룹단에 p 값을 나타낸 것이다.

도 23은 인플루엔자 바이러스 NP 및 PA 전사체를 표적으로 하는 siRNAs가 인플루엔자 바이러스로 감염시키기 전에 함께 투여하였을 경우에 추가 효과를 가진다는 것을 보여주는 그래프이다. ■(처리 없음); ○(60㎍ NP siRNA); △(60㎍ PA siRNA); ●(60㎍ NP siRNA+ 60㎍ PA siRNA). 각 심볼은 개별 동물을 나타낸대. 상이한 그룹단에 p 값을 나타낸 것이다.

도 24는 인플루엔자 바이러스 감염후에 siRNA를 생쥐에 투여하였을 때 인플루엔자 바이러스 생산이 저해된다는 것을 보여주는 그래프이다. ■(처리 없음); (60㎍ GFP siRNA); △(60㎍ PA siRNA); ○(60㎍ NP siRNA); ●(60㎍ NP+ 60㎍ PA siRNA). 각 심볼은 개별 동물을 나타낸대. 상이한 그룹단에 p 값을 나타낸 것이다.

도 25A는 shRNA를 발현시키는 렌티바이러스 벡터를 나타낸 것이다. shRNA 전사는 U6 프로모터에 의해 유도된다. EGFP 발현은 CMV 프로모터에 의해 유도된다. SIN-LTR, Ψ, cPPT, WRE는 렌티바이러스 성분이다. NP-1496 shRNA의 서열을 나타내었어다.

도 25B에서는 유세포측정기의 결과를 나타낸 것으로 도 25B에서 설명하는 렌티바이러스에 감염된 Vero 세포가 약량 의존적인 방식으로 EGFP를 발현시킨다는 것을 설명한다. NP-1496a shRNA를 인코드하는 DNA 벡터와 패키지 벡터를 293T세포로 동시 트랜스펙션 시켜 렌티바이러스를 만든다. 배양 상청액(0.25 ml 또는 1.0 ml)을 이용하여 Vero 세포를 감염시켰다. 감염된 Vero 세포주(Vero-NP0.25 및 Vero-NP 0), 대조군(감염안된 Vero 세포)를 유세포측정기를 이용하여 GFP 발현에 대해 분석하였다. Vero-NP-0.25(도면의 상말단분) 및 Vero-NP 1.0(도면의 하말단분) 세포의 평균 형광 강도를 나타내었다. 빗금 부분은 대조군(감염안된 Vero 세포)의 평균 형광 강도를 나타낸 것이다.

도 25C는 NP-1496 shRNA를 발현시키는 Vero 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산 저해를 나타내는 그래프이다. 모체 및 NP-1496 shRNA를 발현시키는 Vero세포를 PR8 바이러스로 감염시켰다(MOI는 0.04, 0.2, 1). 감염 48시간 후에 헤마글루타닌(HA) 검사를 통하여 바이러스 역가를 측정하였다.

도 26은 인플루엔자 바이러스 전사체를 표적으로 하는 siRNA를 발현시키는 DNA 벡터를 투여하여 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산이 저해된다는 것을 나타내는 그래프이다. RSV, NP-1496(NP), PBI-2257(PBI) shRNA를 인코드하는 60㎍ DNA를 40 ㎕ Infasurf와 혼합시키고, 생쥐에 점적 투여하였다. 조치를 하지 않은 대ㅗ군(NT) 생쥐에는 5% 포도당 60㎕를 점적 투여하였다. 13시간 후에 생쥐의 비강으로 PR8 바이러스(생쥐한마리당 12000 pfu)를 감염시키고, 24시간 후에 MDCK/헤마글루타닌 검사를 이용하여 폐에서 바이러스 역가를 측정하였다. 각 데이타는 한 마리 생쥐를 나타낸다. 그룹간의 p 값을 나타내었다.

도 27A에서는 siRNA와 poly-L-lysine(PLL)간에 복합체 형성을 감지하는 전기영동적인 이동성 변이 검사 결과를 나타낸 것이다. 실온에서 30분간 폴리머의 양을 증가시키면서(0-1200ng) 150ng NP-1496 siRNA와 혼합시키면 SiRNA-폴리머 복합체가 형성된다. 반응 혼합물을 4% 아가로즈 겔 전기영동시키고, 에티디움-브로마이드 착색으로 siRNAs를 볼 수 있다.

도 27B에서는 siRNA와 poly-L-아르기닌(PLA)간에 복합체 형성을 감지하는 전기영동적인 이동성 변이 검사 결과를 나타낸 것이다. 실온에서 30분간 폴리머의 양을 증가시키면서(0-1200ng) 150ng NP-1496 siRNA와 혼합시키면 SiRNA-폴리머 복합체가 형성된다. 반응 혼합물을 4% 아가로즈 겔 전기영동시키고, 에티디움-브로마이드 착색으로 siRNAs를 볼 수 있다.

도 28A에서는 siRNA/PLL 복합체의 세포 독성을 나타내는 그래프이다. 96-웰 플레이트상에서 Vero 세포를 6시간 동안 siRNA(400 pmol)/폴리머 복합체로 처리하였다. 폴리머를 포함하는 매체를 DMEM-10% FCS로 대체시킨다. MTT 검사를 이용하여 24시간 후에 세포의 대사 활성을 측정하였다. □ = PLL (MW AK); ○ = PLL (MW -42K) ■ =25%; △ = 50%; ▲ = 75%; X = 95%. 3회 실험의 평균을 데이타로 나타낸 것이다.

도 28B는 도 28A에서는 siRNA/PLA 복합체의 세포 독성을 나타내는 그래프이다. 96-웰 플레이트상에서 Vero 세포를 6시간 동안 siRNA(400 pmol)/폴리머 복합체로 처리하였다. 폴리머를 포함하는 매체를 DMEM-10% FCS로 대체시킨다. MTT 검사를 이용하여 24시간 후에 세포의 대사 활성을 측정하였다. 3회 실험의 평균을 데이타로 나타낸 것이다.

도 29A는 PLL이 세포의 siRNA 수취를 촉진시킨다는 것을 보여준다. 24-웰 플레이트상에서 Vero 세포를 Lipofectainine+siRNA(400 pmol) 또는 siRNA(400 pmol)/폴리머 복합체와 6시간 동안 배양시켰다. 그 다음 세포를 세척하고, PR8 바이러스(MOI 0.04)를 감염시켰다. 감염 후 상이한 시간대별로 배양 상청액에서 바이러스 역가를 HA 검사를 이용하여 측정하였다. siRNA에 대한 폴리머 비율을 나타내었다. ○ = 처리없음; ■: Lipofectamine; ▲ = PLL (MW ,42K); △ = PLL (MW -8K).

도 29B는 PLA이 세포의 siRNA 수취를 촉진시킨다는 것을 보여준다. 24-웰 플레이트상에서 Vero 세포를 Lipofectainine+siRNA(400 pmol) 또는 siRNA(400 pmol)/폴리머 복합체와 6시간 동안 배양시켰다. 그 다음 세포를 세척하고, PR8 바이러스(MOI 0.04)를 감염시켰다. 감염 후 상이한 시간대별로 배양 상청액에서 바이러스 역가를 HA 검사를 이용하여 측정하였다. 0, 25, 50, 75, 95%는 이미다졸 아세틸 기로 대체된 PLL상에 ε-아미노기의 비율을 나타낸 것이다. ● = 처리없음; ○: Lipofectamine; □+■ = 0%, 25%(0%와 25%에서 데이타가 동일); ▲=50% ; △=75%; X=95%.

약어

DNA: 데옥시리보핵산

RNA: 리보핵산

vRNA: 인플루엔자 바이러스 게놈에서 비리온 RNA, 네가티브 가닥

cRNA: 상보 RNA, vRNA의 직접 전사체, 포지티브 가닥

mRNA: 메신저 RNA(vRNA 또는 세포 유전자에서 전사됨), 단백질 합성의 주형

dsRNA: 이중 가닥 RNA

siRNA: 짧은 간섭 RNA

shRNA: 짧은 헤어핀 RNA

RNAi: RNA 간섭

정의

"항체"란 일반적으로 자연적으로 만들러지거나 전부 또는 일부분이 합성되어 만들어지건 간에 이뮤노글로블린을 말한다. 본 발명의 특정 구체에에서 "항체"에는 이뮤노글로블린 결합 도메인을 포함하는 임의 단백질도 포함된다. 이와 같은 단백질은 자연에서 기인되거나 또는 일부 또는 전부가 합성에 의해 만들어질 수 있다. 항체는 사람의 경우 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE를 포함하는 임의 면역글로블린의 구성원이 된다. 항체는 Fab', F(ab')₂, scFv(single-chain variable) 또는 항원 결합 부위를 보유하는 임의 단편 또는 재조합에 의해 만들어진 scFv 단편을 포함하는 항체 단편이 될 수 있다(참고 Allen, T., Nature Reviews Cancer, Vol.2, 750-765, 2002) 본 발명의 특정 구체예에서 "인간화("humanized") 항체"는 예를 들면 설치류 기원의 가변 도메인이 사람 기원의 항상(constant) 도메인과 융합되어 구성되고, 설치류 항체의 특이성을 유지하는 항체도 포함된다. 사람 기원의 도메인은 사람에서 처음으로 합성되었기 때문에 사람으로부터 기인될 필요는 없다. 대신 "사람" 도메인이 사람 이뮤노글로블린 유전자에 결합되는 설치류 게놈에서 만들어질 수도 있다(Vaughan, et al., (1998), Nature Biotechnology, 16: 535 -539). 항체는 단클론 또는 다클론 항체가 될 수 있는데, 본 발명의 목적에는 단클론 항체가 일반적으로 적절하다.

여기에서 말한 것과 같이, 숫자를 언급할 때 "대략" 또는 "약"의 의미는 다른 언급이 없는 한 숫자 범위의 5%(이상 또는 이하)내에 포함되는 수를 말한다. 또한 가능한 값의 범위가 100%를 초과하는 경우를 제외한다. 범위가 언급된 경우에 양 범위 끝수도 다른 언급이 없는 한 그 범위내에 포함된다.

여기에서 사용되는 "하이브리드"는 두가지 상보 핵산 서열간에 상호작용을 말하는 것이다. "높은 스트린젼트 조건하에 하이브리드되는"이란 말은 당분야에서 인지되는 높은 스트린젼트 조건하에서 안정적으로 유지되는 상호작용을 말한다. 하이브리드 반응을 실행하는 지침서는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1989, 최신판 포함, Sambrook, Russell, and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001을 참고한다. 참고문헌에서 언급된 수용성 및 비-수용성 방법을 이용할 수도 있다. 일반적으로, 길이가 50-100 뉴클레오티드이상인 핵산 서열의 경우에, 다양한 수준의 스트린젼트 조건을 정의할 수 있다. 예를 들면, 낮은 스트린젼트(6X sodium chloride/sodium citrate (SSC) , 45℃, 0.2X SSC, 0.1% SDS, 50℃에서 2회 세척(세척 온도는 중간-낮은 스트린젼트 조건에서 55℃까지 증가될 수 있다); 중간 스트린젼트(6X SSC, 45℃, 0.2X SSC, 0. I% SDS, 60℃에서 1내지 2회 세척; 높은 스트린젼트 하이브리드 반응(6X SSC, 45 ℃, 0.2X SSC, 0.1% SDS, 65 ℃에서 1 내지 2회 세척; 매우 높은 스트린젼트 조건 (0.5M 인산나트륨, 0.1% SDS, 65 ℃, 0.2X SSC, 1% SDS, 65℃에서 1 내지 2회 세척.) 서열 상보성 정도가 아주 높은 서열간에만 높은 스트린젼트 조건하에서 하이브리드 반응이 일어난다. 당업자는 상이한 스트린젼트 정도의 변수는 하이브리드되는 서열의 길이, 서열에 RNA 또는 DNA가 포함되어 있는지 등과 같은 다양한 인자에 근거한다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 예를 들면, 서열의 길이가 긴 것보다는 짧은 서열의 경우에 높은, 중간, 낮은 스트린젼트 하이브리드 반응의 적절한 온도가 낮아진다는 것이 일반적이다.

"인플루엔자 바이러스"는 사람 또는 동물에 질병을 일어킬 수 있는 또는 실험 분석에서 후보물질이 될 수 있는 임의 인플루엔자 바이러스 균주를 말하는 것이다. 인플루엔자 바이러스는 Fields, B., et al., Fields' Virology, 4th. ed., Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; ISBN: 0781718325, 2001에서 설명하고 있다. 특히, 인플루엔자 바이러스에는 사람 또는 동물에 질병을 일어킬 수 있는 또는 실험 분석에서 후보물질이 될 수 있는 인플루엔자 A 바이러스의 임의 균주가 포함된다. 인플루엔자 A 바이러스 분리체의 상당수가 완전히 또는 일부 서열이 밝혀져있다. 첨부 A에는 공지 데이타베이스에 기탁된 인플루엔자 A 게놈 단편의 일부 경우만의 완전한 서열을 나타낸 것이다(The Influenza Sequence Database (ISD), see Macken, C., Lu, H., Goodman, J., & Boykin, L., "The value of a database in surveillance and vaccine selection." in Optionsfor the Control ofInj7uenza IV. A.D.M.E. Osterhaus, N. Cox & A.W. Hampson (Eds.) Amsterdam: Elsevier Science, 2001, 103-106). 이와 같은 데이타베이스에는 인플루엔자 B 및 C 게놈 단편의 완전한 서열로 포함된다. http://www.flu.lanl.gov/ 에서 데이타 베이스를 확인할 수 있고, 통상의 서치 엔진에서 사용자는 게놈 단편, 바이러스에 감염된 종, 분리 연도등일 이용하여 조사할 수 있다. 인플루엔자 서열은 또한 Genbank도 얻을 수 있다. 따라서, 인플루엔자 유전자 서열은 당업자가 용이하게 이용하거나 결정할 수 있다.

"분리체"는 다음의 3가지 1) 자연계에 존제하는 성분의 일부에서 분리된; 2) 사람에 의해 실시되는 과정에서 준비된 또는 정제된; 3) 자연계에서는 발생되지 않는다는 의미를 가진다.

"리간드"는 항원-항체 상호작용이외의 기전을 통하여 폴리펩티드 또는 이의 일부분 예를 들면 탄수화물과 같은 제2 분자에 특이적으로 결합하는 분자를 말한다. 리간드에는 자연계에서 생성된 또는 합성된(사람에 의해 발명된 일부 구조 포함) 폴리펩티드, 펩티드, 소분자를 포함한다. 이 용어는 수용체 및 이들과 상호작용하여 활성을 조절하는(항진제 또는 길항제) 분자에 흔히 사용되지만, 여기에서는 좀더 일반적인 의미를 가진다.

"작동상 연결된"이란 두개 핵산 서열의 상관관계를 설명하는 것으로, 한 핵산의 발현이 다른 제 2 핵산에 의해 조절, 제어되는 것을 말한다. 예를 들면, 핵산 서열의 전사는 작동상 연결된 프로모터 서열에 지시를 받거나; 핵산의 후-전사는 작동상 연결된 프로세싱 서열에 지시를 받거나; 핵산의 해독이 작동상 연결된 해독 조절 서열의 지시를 받거나; 핵산 또는 폴리펩티드의 운반 또는 배치가 작동상 연결된 운반 또는 배치 서열에 지시를 받거나; 폴리펩티드의 해독후 프로세싱이 작동상 연결된 프로세싱 서열의 지시를 받는다. 제 2 핵산 서열에 작동상 연결되는 핵산 서열은 제 2 서열에 직간접적으로 공유결합되는데, 3차원적으로 효과적으로 연합된다.

"정제된"이란 의미는 많은 다른 화합물로부터 분리된다는 것을 의미한다. 화합물 또는 물질이 부분적으로 정제된, 실질적으로 정제된 또는 순수한 이란 임의 다른 물질로부터 떼어내어 적어도 90%, 좀더 적절하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99%이상의 순도를 가진다는 것을 말한다.

"조절 서열(regulatory sequence)"은 작동상 연결된 서열의 발현(특히 전사, 그러나 일부 경우에는 접합 또는 다른 프로세싱과 같은 사건)을 지시, 강화 또는 저해하는 핵산의 일부를 말한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 조절 서열은 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하고, 다른 구체예에서는 조절 서열은 조직 특이적 또는 유도성 발현을 지시한다. 예를 들면, 포유류 세포에서 이용할 수 있는 적절한 조직-특이적인 프로모터에는 임파-특이적 프로모터(참고 Calame et al.,,4dv. Immunol. 43:235, 1988), 예를 들면 T 세포 수용체의 프로모터(참고 Winoto et al., EMBO J 8:729, 1989), 이뮤노글로블린의 프로모터(참고 Banerji et al., Cell 33:7295 1983; Queen et al., Cell 33:741, 1983), 뉴우런-특이적 프로모터(참고the neurofilament promoter; Byrne et al., Proc. NatI. Acad Sci. USA 86:5473, 1989)등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 발생학적으로 조절되는 프로모터도 포함되는데 예를 들면, 뮤린 hox 프로모터(Kessel et al., Science 249:374, 1990) α-feto 단백질 프로모터(Campes et al., Genes Dev. 3:537, 1989)등이 포함된다. 본 발명의 일부 구체예에서, 조절 서열은 감염성 병원체에 감염된 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시한다. 예를 들면 조절 서열은 바이러스 단백질 가령, 바이러스 폴리메라제, 전사 인자와 같은 단백질에 의해 인지되는 바이러스-특이적 프로모터 또는 인핸서로 구성된다. 또는, 조절 서열은 비강 통로, 호흡기관 또는 폐의 상피 세포에 활성이 있는 프로모터, 인헨서로 구성될 수 있다.

여기에서 언급한 것과 같이, "RNAi-유도 물질"에는 RNA 분자 및 벡터가 포함되는데(사람에 의해 변형되지 않은 자연 발생 분자이외의) 이와 같은 물질이 세포에 존재하면, RNAi가 일어나고, RNAi- 유도 물질이 표적으로 하는 전사체의 발현이 감소된다. 이 용어에는 특히 siRNA, shRNA, RNAi-유도 벡터가 포함된다.

"RNAi-유도 벡터"는 세포내에 이 벡터가 존재하면 자가-하이브리드 또는 서로 하이브리드되어 shRNA 또는 siRNA를 형성하는 한개 이상의 RNAs 전사가 일어난다. 본 발명의 다양한 구체예에서, 이 용어에는 DNA 벡터(이 벡터의 서열은 바이러스에서 유도된 서열 단편을 포함할 수 있다) 또는 바이러스( 사람에 의해 변형되지 않은 자연 발생 분자이외의)의 플라스미드를 포함하는데, 세포에 이러한 플라스미드가 존재하면, 자가-하이브리드 또는 서로 하이브리드되어 shRNA 또 siRNA를 형성하는 한개 이상의 RNAs가 생성된다. 일반적으로 벡터는 발현 시그날에 작동상 연결된 핵산 서열로 구성되어 벡터가 세포내에 있을 때 자가-하이브리드 또는 서로 하이브리드되어 shRNA 또 siRNA를 형성하는 한가지 이상의 RNA 분자가 전사된다. 따라서, 벡터는 RNA 또는 이의 전구물질의 세포내 합성을 위한 주형을 제공한다. RNAi 유도를 위해, 세포에 바이러스 게놈을 있게 하는 것으로(가령, 세포막과 바이러스 외피를 융합 시킨 후), 세포내에서 바이러스가 구성적으로 존재할 수 있게 하는데 충분하다. 또한, RNAi를 유도하기 위해, 벡터는 세포내로 도입된다면, 세포에 들어가거나 모 세포에서 유전되는 것은 세포내에서 변형 또는 프로세싱되는 것의 유무에 관계없이, 세포내에 벡터가 존재하는 것으로 간주한다. RNAi-유도 벡터는 세포내에 벡터가 존재하는 경우에, 전사체를 표적으로 하여 자가-하이브리드 또는 서로 하이브리드되어 전사체를 표적으로 하는 shRNA 또 siRNA를 형성하는 RNA를 생산하게 한다. 세포내에 백터가 존재하는 경우에 전사체를 표적으로 하는 shRNA 또 siRNA를 만든다.

짧은 간섭 RNA(siRNA)는 길이가 약 19개 염기쌍이고, 한개 또는 ㄷ개의 단일 가닥으로 된 어버행(overhangs)이 포함된 RNA 이중나선이다. siRNA는 서로 하이브리드되는 두개 RNA 분자에서 만들어질 수도 있도, 일부분이 자가-하이브리드되는 단일 RNA 분자에서 만들어질 수도 있다. 일반적으로 siRNA 분자의 자유 5' 말단에는 인산기가 있으며, 자유 3' 말단에는 하이드록실기를 가지는 것이 바람직하다. 일반적으로는 포함되어 있지는 않지만, siRNA의 이중 가닥 부분에는 한개 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드가 있다. siRNA의 한 가닥에는 표적 전사체와 하이브리드되는 부분이 포함된다. 적절한 구체예에서, siRNA의 한 가닥은 표적 전사체와 정확하게 상보적이고, 이는 siRNA가 단 한개의 미스매치없이 목표 전사체에 하이브리드할 수 있다는 것을 말한다. 본 발명의 다른 구체예에서, siRNA와 목표 전사체의 표적된 일부분 사이에 미스매치가 존재할 수도 있다. 본 발명의 대부분의 구체예에서 완벽한 상보성을 가지지는 못하고, 일반적으로는 siRNA tennini에 또는 이 부근에 미스메치가 위치하는 것이 바람직하다.

짧은 헤어핀 RNA는 RNAi를 중개할 수 있는 충분한 길이(일반적으로 적어도 19개 뉴클레오티드)를 가지는 이중-가닥 나선 구조를 형성하는 적어도 하이브리드되는 두개 상보적 부분을 포함하거나 하이브리드할 수 있는 RNA 분자를 말하는데, 고리(루프)를 만들 수 있는 일반적으로 약 1 내지 10개 뉴클레오티드 길이로 된 단일 가닥 부분을 말한다. 일반적으로는 포함되지 않지만, 이중나선 부분에서는 한개 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드로 구성된 한개 이상의 불룩한 부분이 포함되어 있다. 하기에서 설명하는 것과 같이, shRNAs는 보존된 세포 RNAi 기전에 의해 siRNAs로 프로세스되는 것으로 보인다. 따라서, shRNAs는 siRNAs의 전구물질이며, 일반적으로 목표 전사체의 발현을 유사한 방식으로 저해할 수 있다.

"특이적 결합"이란 표적 폴리펩티드(또는 일반적으로 표적 분자)와 항체, 리간드, 길항제, 항진제와 같은 결합 분자간에 상호작용을 말하는 것이다. 이와 같은 항호작용은 결합 분자가 인지하는 항원 결정부위 또는 에피토프와 같은 목표 폴리펩티드의 특정 구조적 특징에 따라 달라진다. 예를 들면, 항체가 에피토프 A에 특이적인 경우에, 에피토프 A를 가지는 폴리펩티드 또는 자유 라벨된 A와 이에 결합되는 항체를 포함하는 반응에서 자유 라벨안된 A가 존재하는 경우에, 항체에 라벨된 A가 결합되는 양이 감소된다. 특이성은 절대성이 아니라 일반적인 결합의 형성을 말한다. 예를 들면, 대부분의 항체는 목표 분자가 존재하는 에피토프이외에도 다른 에피토프에도 교차 반응한다는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 교차 반응성은 항체가 이용되는 분야에 따라 수용가능하다. 당업자는 임의 주어진 분야(예를 들면, 치료목적으로 목표 분자를 감시하기 위한 용도)를 적절히 수행하기 위한 충분한 정도의 특이성을 가지는 항체를 선별할 수 있을 것이다. 경쟁물질로써 다른 목표 분자에 대해 결합 분자의 친화역에 대해 목표 폴리펩티드에 대한 결합 분자의 친화력과 같은 인자를 통하여 특이성을 평가할 수 있을 것이다. 감지대상이 되는 목표 분자에 결합 분자가 높은 친화력을 가지고, 비-목표 분자에 대한 친화력이 낮다면, 항체는 면역 진단 목적에 사용할 수 있는 물질로 간주된다. 한가지 이상의 경우에 결합 분자의 특이성이 확립된 경우 추가 특이성을 평가하지 않고도 다른 유사한 방식에 이 결합 분자를 이용할 수 있을 것이다.

"개체"란 감염성 병원체에 감염이 잘되는 개체를 말하는데, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스와 같은 바이러스에 감염되기 쉬운 개체를 말한다. 개체에는 새, 동물, 예를 들면, 가금류 및 가축(병아리, 포유류(돼지, 말, 개, 고양이), 야생 동물, 사람이 아닌 영장류, 사람 등이 포함된다.

1) siRNA 또는 shRNA가 없는 대조 경우와 비교하였을 때 siRNA 또는 shRNA가 있는 경우에, 목표 전사체의 안정성이 감소되거나 2) 적어도 15개, 좀더 바람직하게는 17개, 좀더 적절하게는 약 18개 또는 19개 내지 21-23개 뉴클레오티드에서 siRNA 또는 shRNA가 적어도 90%, 좀더 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 목표 전사체와 상보성을 이루는 경우 3) siRNA의 한가닥 또는 shRNA의 상보적은 부분 중 하나가 in vitro에서 작은 RNA(50< 뉴클레오티드) 하이브리드를 위한 스트린젼트 조건하에 또는 세포질 또는 포유류 세포의 핵내에서 볼 수 있는 일반적인 조건하에서 목표 전사체에 하이브리드된다면, 여기에서 설명하는 목적의 목표 전사체를 siRNA, shRNA 또는 siRNA, shRNA 서열이 표적한다고 말한다. 세포내에 RNA-유도 벡터가 존재함으로써, 전사체를 표적으로 하는 siRNA 또는 shRNA가 만들어지게 되고, 이는 목표 전사체를 표적으로 한다고 볼 수 있다. 전사체를 표적으로 하면, 전사체 합성을 명령하는 유전자 발현을 저해 또는 감소시키게 되고, 전사체를 표적으로 하는 siRNA 또는 shRNA는 전사체 합성을 명령하는 유전가를 표적한다고 볼 수 있는데, 이때 유전자 자체(게놈 DNA)가 siRNA, shRNA, 또는 세포 접합 기전의 성분과 직접적으로 상호작용하지는 않는다. 여기에서 사용된 바와 같은 전사체를 표적으로 하는 siRNA, shRNA, RNAi-유도 벡터는 전사체 합성을 위한 주형을 제공하는 유전자를 표적으로 한다고 이해해도 된다.

"치료"는 질환, 질병 또는 상태 및 이와 연관된 한 가지 이상의 증상을 역전, 경감, 진행 저해, 예방, 감소등이 포함된다.

일반적으로, "벡터"는 세포로 제 2 핵산 분자의 운반, 전달 등의 세포 유입을 조절할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 전단되는 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 삽입되는 등의 방법으로 연결된다. 벡터에는 자다 복제를 명령하는 서열이 포함되거나, 숙주 세포 DNA에 삽입을 허용하는 서열이 포함될 수 있다. 유용한 벡터에는 예를 들면, 플라스미드(RNA 플라스미드도 공지되어 있지만, 일반적으로 DNA 플라스미드), 코스미드, 바이러스 벡터등이 포함된다. 당분야에 공지된 것과 같이, 바이러스 벡터는 핵산 분자의 전달 또는 삽입을 실행하는 바이러스에서 유도된 핵산 성분을 포함하는 핵산 분자를 말하거나(예를 들면 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 포함) 또는 핵산 전달을 중개하는 바이러스 입자(레트로바이러스 또는 렌티바이러스 포함)을 말한다. 당업자는 바이러스 벡터에 핵산에 추가하여 다양한 바이러스 성분이 포함될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

1. 인플루엔자 바이러스 라이프 사이클 및 특징

인플루엔자 바이러스는 외피에 싸인 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae) 패밀리의 네가티브-가닥의 RNA 바이러스이다. 인플루엔자 타입 A, B, C로 분류할 수 있는데, 이중 인플루엔자 A가 가장 강력한 병인성을 가지며, 동물 균주에서 유전자 재분류 능력을 가지는 유일한 타입으로 보고 있다. 인플루엔자 타입 A, B, C는 이들의 핵단백질 및 매트릭스 단백질에서 차이가 난다(도 1).

하기에서 추가로 설명되겠지만, 인플루엔자 A 서브타입은 이들의 헤마글루타닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA) 유전자의 변이로 정의되는데, 상응하는 단백질에 결합되는 항체에 의해 통상 구별된다.

인플루엔자 A 바이러스 게놈은 8개 RNA 단편에 분포된 10개 유전자로 구성된다. 유전자는 10개 단백질을 인코드하는데, 외피 당단백질 헤마글루타닌(HA), 뉴라미니다제(NA); 매트릭스 단백질(Ml); 핵단백질(NP); 세개 폴리메라제(PB1, PB2, PA)-RNA-의존적 RNA 전사체의 성분으로 폴리메라제 또는 폴리메라제 복합체라고 한다; 이온 채널 단백질(M2), 비-구조 단백질(NSl 및 NS2).(Julkunen, I., et al., Cytokine and Growth Factor Reviews, 12: 171-180, 2001-인플루엔자 A 바이러스 및 이의 분자 병인성에 대해 상세하게 나옴)(Fields, B., et al., Fields' Virology, 4th. ed., Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; ISBN: 0781718325, 2001). 인플루엔자 B 바이러스 게놈의 조직은 인플루엔자 A 바이러스의 것과 상당히 유사한데 반하여, 인플루엔자 C 바이러스 게놈은 7개 RNA 성분으로 구성되며 NA 유전자가 결손되어 있다.

인플루엔자 A 바이러스는 헤마글루타닌(Hl-H15) 및 뉴라미니다제(N1- N9) 유전자에 기초하여 분류한다. 세계 보건기구(WHO)는 각 바이러스 균주의 이름을 기원이 되는 동물(사람이 아닌 경우에 명시), 원산지역, 균주 번호, 분리 년도, HA 및 NA의 항원 설명등으로 명명하기로 정의하였다. 예를 들면, A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)는 1934년 푸에트리코에서 사람에서 발견된 균주 A, 분리체 8로 HA 및 NA의 서브타입 1 항원을 가진다는 것이다. 또 다른 예를 들면, A/Chicken/Hong Kong/258/97(H5NI)는 1997년 홍콩의 병아리에서 발견된 바이러스 A, 분리체 258고 HA 서브타입 5, NA 서브타입 1의 항원을 가진다. 사람에게 유행되는 것은 HA 타입 H1, H2, H3 및 NA 타입 N1, N2의 바이러스에 의한 것이다.

상기에서 설명한 것과 같이, 인플루엔자 바이러스 A의 두 가지 주요 기전에 의해 유전적 변이가 일어난다. 점 돌연변이에 의한 유전자 변이는 숙주 면역 반응의 선별적 압력 및 유전자 전이(재분류로 명함)로 인하여 항원적으로 상당한 위치에서 발생되는데, 한개 서브타입에서 다른 서브타입으로 전체 바이러스 게놈의 치환이 관계된다. 많은 상이한 타입의 동물 종에는 사람, 돼지, 새, 말, 수상 포유류등이 포함되고, 인플루엔자 바이러스 A에 감염되는 다른 동물도 포함된다. 일부 인플루엔자 A 바이러스는 특정 종에 한정되어 다른 종에는 보통 감염되지 않는다.

그러나, 일부 인플루엔자 A 바이러스는 몇 가지 상이한 동물 종 특히, 새(철새), 돼지, 사람등의 종에 감염될 수 있다. 이와 같은 능력은 인플루엔자 A 바이러스에서 주요 항원 전이로 인한 것으로 볼 수 있다. 예를 들면, 사람의 인플루엔자 A 바이러스에 돼지가 감염되는 경우 동시에 오리에서 상이한 인플루엔자 A 바이러스에도 감염될 수 있다. 두 가지 바이러스가 돼지 세포에서 만들어지는 경우에 사람 및 오리 균주의 유전자가 "혼합"되어 독특한 RNA 단편을 가지는 새로운 바이러스가 생성된다. 이와 같은 과정을 유전적 재분류(reassortment)하고 한다. (이와 같은 유전적 재분류는 유사분역동안에 염색체간의 유전 정보 교환과는 별개의 것임을 알아야 한다.

다른 바이러스 및 세균 종에서와 같이, 인플루엔자 바이러스는 세포내에서 복제한다. 인플루엔자 A 바이러스는 상측 호흡기관의 상피세포에서 복제한다. 그러나, 단세포/대식세포/ 다른 백혈구 세포에도 감염될 수 있다. 시알산을 포함하는 세포 표면 당단백질을 가지는 많은 다른 세포 형도 이들 바이러스가 수용체로 이와 같은 분자들을 이용할 수 있기 때문에 in vitro 에서 감염될 수 있다.

인플루엔자 A 감염/복제 과정은 도 1에서 설명하고 있다. 도 1A를 참고하면, 인플루엔자 A 비리온(100)은 게놈(101)을 포함하는데, 게놈은 8개 네가티브 가닥 RNA 분자 즉, PB2 (102), PB1(103), PA(104), HA(105). NP(106). NA(107), M (108), NS(109)로 구성된다. 이는 통상 1번부터 8번까지 번호를 부여하였는데, 예를 들면 PB2 = 1, PB1 = 2, PA = 3, HA = 4, NP 5, NA = 6, M = 7, NS = 8이다. 게놈 RNA 단편은 막 단백질 M1(120)의 층안에 싸여있고, 막 단백질은 지질 층(130)에 에워싸여 있고, 지질 이중층으로부터 외피 당단백질 HA(140) 및 NA(150), 이온 채널 M2(160)이 돌출되어 있다. RNA 단편(102 - 108)은 핵단백질 MP 170(도 15에서 더 상세하게 볼 수 있다)에 의해 덮혀있고, 폴리메라제 PB1, PB2, PA로 구성된 바이러스 폴리메라제 복합체(18)을 포함한다. 비-구조 단백질 NS2(190)도 비리온안에서 볼 수 있다. 비-구조 단백질 NS1(나타내지 않은)도 감염된 세포에서 볼 수 있다.

도 1B에서는 인플루엔자 바이러스의 게놈 구조와 인플루엔자 게놈에서 발생된 전사체를 볼 수 있다. 8개 게놈 RNA 단편중 6개(PB1(102), PB2(103), PA(104), HA(105), NP(106), NA(107))각각이 이에 상응하는 단백질을 인코드하는 단일, 접합안된 전사체에 대해 주형으로 작용한다. 3개 mRNA 전사체가 인플루엔자 바이러스 A 단편 M(108)에서 유도된 것이 확인되었고; M1 단백질을 인코드하는 공동 선형 전사체(191); M2 단백질을 인코드하고, 689개 뉴클레오티드 인트론을 포함하는 접합된 mRNA(192); 바이러스 감염된 세포에서는 감지되지 않지만, 9개 아미노산 펩티드(M3)을 인코드하는 또 다른 접합에 의한 mRNA(193)가 확인되었다. 두개 mRNA 전사체를 인플루엔자 바이러스 A 단편 NS에서 유도하였는데: NS를 인코드하는 접합안된 mRNA(194); NS2 단백질을 인코드하고, 473개 인트론을 포함하는 접합된 mRNA(195)가 유도되었다.

감염 과정(도 2)은 세포 표면 단백질에 포함된 시알산과 상호작용을 통하여 감염될 세포의 표면에 헤마글루타닌을 통하여 비리온(100)이 부착되는 것으로 시작된다. 부착된 바이러스는 클라트린-의존성 엔도사이토시스를 통하여 피복된 소포(200)로 엔도사이토시스된다. 엔도좀의 낮은 pH가 바이러스와 엔도좀 막의 융합을 촉진시켜, 세포질로 바이러스 리보핵산(vRNP) 복합체(뉴클레오캡시드)(210)가 유리된다. 바이러스 뉴클레오캡시드가 세포 핵으로 이동되고, PB1, PB2, PA 폴리메라제로 구성된 바이러스 RNA 폴리메라제 복합체에 의해 주요 바이러스 mRNA 합성이 개시된다. 숙주 세포 pre-mRNA상에서 앤도뉴클레아제 활성에 의해 생성되는 프라이머를 이용하여 바이러스 RNA을 주형으로 삼아 바이러스 mRNA 합성이 개시된다. PB1 단백질은 바이러스 특이적인 mRNA(230) 합성을 촉진시키고, 합성된 mRNA는 세포질로 이동되어 해독된다.

새로이 합성된 폴리메라제 NP, NS1, NS2는 핵으로 이동되어, 복제 및 2차 바이러스 mRNA 합성을 조절한다. 바이러스 RNA(vRNA)의 상보적 RNA(cRNA)(240) 합성은 PB1, PB2, PA,NP에 의해 개시되고, 그 다음 새로운 vRNA 분자(250)가 합성된다. 바이러스 폴리메라제 복합체는 이와 같은 vRNAs을 주형으로 이용하여 2차 mRNA (260)를 합성한다. 따라서, 바이러스에 의해 인코드된 전사효소에 의한 vRNA 전사로 바이러스 단백질 합성에 주형 역할을 하는 mRNA가 생성되고, 또한, 상보적인 RNA(cRNA)를 생산하는데, 이 cRNA는 5' 캡과 3' 폴리 A 꼬리가 없어 mRNA와는 상이하고, 새로운 바이러스 생산을 위해 추가 vRNA를 합성하는데 주형으로 작용된다. 나중에 감염시에 NS1 단백질은 M 및 NS mRNA의 접합을 조절하여, M2 및 NS2 mRNAs가 생성된다. 바이러스 mRNAs는 세포질로 이동되고, 이곳에서 바이러스 단백질(270)이 만들어진다. 단백질 PB1, PB2, PA, NP가 핵의 vRNP 복합체(뉴클레오캡시드)(280)가 어셉플리되는 부위로 이동된다. M1 및 NS2 단백질이 핵으로 이동되고, 이 곳에서 vRNPs와 상호작용하여 핵의 유출을 조절한다. 바이러스 vRNA-M1 단백질 복합체는 세포직 막에서 HA 및 NA 분자의 세포질 부분과 상호작용하고, 이 곳에서 성숙한 비리온의 버딩되어 바이러스 입자의 방출이 일어난다.

인플루엔자 A 바이러스는 세포에서 신속하게 복제되어, 아프톱시스 또는 세포 치사 효과로 인하여 숙주 세포를 죽게한다. 감염은 세포의 다양한 활성 및 숙주 세포 유전자 발현을 포함하는 프로세스에 다양한 변화의 원인이 된다. 바이러스 폴리메라제 복합체가 핵에서 새로 압성된 세포 폴리메라제 II 전사체에 결합하여 이를 절단한다. NS1 단백질은 pre-mRNA 접합을 차단하고, 숙주 mRNA의 핵 유출을 저해한다. 세포 mRNA의 해독이 상당히 방해를 받고, 반면에 바이러스 mRNA는 효과적으로 해독된다. 바이러스에 의해 감염된 세포에서 일반적으로 숙주에 의해 해독을 저해하는 숙주 세포 반응인 세포 엔터페론(IFN)반응의 바이러스에 의한 하향 조절을 통하여 일부 바이러스 mRNAs의 효과적인 해독이 유지된다. 특히 바이러스 NS1 단은 IFN-유도된 PKR에 결합되어 이의 활성을 저해한다. 따라서, 인플루엔자 바에 의한 감염으로 세포의 생합성 예를 들면, 세포 mRNA의 프로세싱 및 해독에서 일어나는 변화를 포함하는 심각한 변화가 일어난다.

감염된 세포는 바이러스의 전파를 제한시키는 여러 방식으로 반응한다. 핵산 인자 카파(NF_KB), 활성화 단백질(AP)-1, 인터페론 조절 인자, 전사의 시그날 유도인자 및 활성인자(STATs) 및 핵 인자-IL-6를 포함하는 몇 가지 전자 인사 시스템이 활성화된다. 이와 같은 전사 인자 결로가 활성화되면, 감염 부위에 염증 세포 이동을 자극하고, 여러가지 항바이러스 효과를 발휘하고, 바이러스 감염에 대해 면역 반응 역할을 하는 화학적 항-바이러스 사이토킨 및 프로-염증 사이토킨의 생산을 유도한다. 인플루엔자 A 바이러스에 감염된 상피 세포에서 생산되는 사이토킨은 Type I(IFN-α/β), RANTES, MCP-1, IL-8이다. 인플루엔자 A 바이러스 감염된 단세포/대식세포에서는 MIP-1 α/β, MIP-3α, MCP-1, MCP-3, IP-10, IL-1β, IL-6, TNF- α, IL-18을 포함하는 다양한 추가 사이토킨이 생산된다.

인플루엔자 A 바이러스에 감염된 결과로 바이러스 복제, 바이러스 입자 생성, 지속적인 바이러스 단백질 합성, 숙주 단백질 합성 차단등의 순서로 발생되어 일반적으로 약 20-40시간 정도에면 세포가 죽게된다. 크로마틴 응축, DNA 분절화, 세포 수축, 대식세포에 의한 아포트톱시스 제거등의 아포프톱시스 변화가 일어난다.

II. siRNA의 선별, 고안 및 합성

본 발명은 한 가지 이상의 인플루엔자 바이러스 전사체를 표적으로 하는 siRNA 및 shRNA를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기에서 설명한 인플루엔자 바이러스 복제 과정에서 설명한 것과 같이, 다양한 타입의 바이러스 RNA 전사체(1차 및 2차 vRNA, 1차 및 2차 바이러스 mRNA, 바이러스 cRNA)가 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포에 존재하여, 바이러스 라이프 사이클에 중요한 역할을 한다. 이들 임의 전사체는 본 발명에 따른 직간접적인 기전에 의한 siRNA 중개된 저해에 중요한 표적이 된다. 임의 바이러스 mRNA 전사체를 표적으로 하는 siRNAs 및 shRNAs는 직접적인 방식 예를 들면, 전사체를 분해시켜 전사체 자체의 양을 감소시킨다. 또한, 하기에서 설명하는 것과 같이, 특정 바이러스 전사체(가령, NA, PA, PBl)를 표적으로 하는 siRNAs 및 shRNAs는 이들이 특이적으로 표적으로 삼지 않은 바이러스 전사체의 수준을 간접적으로 감소시킨다. 유전자형 변이(alternative splicing)가 가능하다면 M₁, M₂를 인코드하는 mRNA 및 NS₁, NS₂를 인코드하는 mRNA의 경우에, 접합안된 전사체 또는 접합된 전사체가 목표 전사체가 될 수 있다.

본 발명에 따른 RNAi 요법에서 표적으로 사용될 수 있는 가망 바이러스 전사체에는 1) 임의 인플루엔자 바이러스 게놈 단편; 2) 단백질 PB1, PB2, PA, NP, NS1, NS2, M1, M2, HA, NA를 인코드하는 전사체를 포함하는 임의 바이러스 단백질을 인코드하는 전사체가 포함된다. 인지하는 바와 같이, 하기에서 추가 설명하겠지만, 단일 siRNA 또는 shRNA에 의해 전사체의 vRNA, cRNA, mRNA 형으로 표적될 수 있다. 발명자가 얻은 결과에 따르면, 바이러스 mRNA가 절대적인 또는 1차 표적 RNAi라는 것이다.

선택된 임의 특정 유전자 표적의 경우에, 본 발명에 따라 이용할 수 있는 siRNAs 또는 shRNAs 고안은 다음의 지침에 따르는 것이 바람직하다. 일반적으로 바에 특이적인(숙주와 비교하여) 서열을 표적으로 하고, 적절하게는 바이러스 기능에 중요한 또는 필수적인 서열을 표적으로 삼는다. 특정 바이러스 유전자 특히, HA 및 NA를 인코드하는 것은 돌연변이 비율이 높고, 돌연변이에 내성이 있지만, 특정 부분 또는 서열은 보존되는 경행이 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 이와 같은 서열이 특히 적절한 표적이 될 수 있다. 하기에서 설명하는 것과 같이 이와 같은 보존된 부분은 인플루엔자 유전자 서열의 비교 및 문헌을 참고하여 확인할 수 있고, 본 발명에 따른 세포로 전달되는 물질은 활성 억제 물질(하기에서 추가 논의)로 되지 전에 한가지 이상의 프로세싱 단계를 거치게된다. 이와 같은 경우에 당업자는 관련 물질에 이와 같은 프로세싱에 필수적인 서열이 포함되도록 고안할 수 있을 것이다.

발명자는, 여기에서 설명된 고안 변수를 이용하여 선별된 서열의 상당 비율이 하기에서 설명하는 것과 같이 테스트되는 siRNA 및 shRNA를 포함하고 있을 때 효과적인 억제 서열이라는 것을 증명하였다. 테스트된 siRNA 중 약 15%에서 인플루엔자 바이러스 PR8 또는 WSN 균주에 감염된 세포에서 바이러스 생산을 강력하게 저해시켰다; 약 40%는 PR8 또는 WSN 균주에 감염된 세포에서 siRNA 없는 경우와 있는 경우에서 바이러스 생산을 비교하였을 때 상당한 통계학적으로 유의성이 있었다 (p < 0.5). 약 45%는 효과가 없거나 미미하였다. 따라서, 본 바렴ㅇ에서는 적어도 두 가지 상이한 인플루엔자 바이러스 서브타입중 하나에 감염된 세포에서 바이러스 생산을 저해할 수 있는 siRNAs 및 shRNAs를 제공한다.

본 발명에 따른 siRNAs 및 shRNAs의 일반적이고, 특이적인 특징을 설명할 것이다. 짧은 간섭 RNAs(siRNAs)는 초파리(Drosophila)에서 RNA 간섭(RNAi) 현상 연구에서 처음으로 발견되었다(WO 01/75164). 특히, 초파리(Drosophila)에서 DICER로 불리는 RNase III형 효소에 의해 긴 이중가닥 RNA가 (Bernstein et al., Nature 409:3 63, 200 1)두개 21nt 가닥으로 된 더 작은 dsRNAs로 프로세스되는데, 각 가닥에는 5'인산기와 3'하이드록시기를 포함하고, 다른 가닥과 정확하게 상보적인 19 nt 부분을 포함하여, 2nt-3'돌출에 인접한 19nt 이중 나선 부분이 있다. 도 3에서는 초파리(Drosophila)에서 볼 수 있는 siRNAs의 도면을 나타낸 것이다. 구조에는 19개 뉴클레오티드 이중 가닥(DS) 부분(300)을 포함하는데, 이 부분에는 센스 가닥(310) 및 안티센스 가닥(315)으로 구성된다. 각 가닥에는 2nt-3'돌출이 있다.

이와 같은 짧은 dsRNAs(siRNAs)는 dsRNA 가닥 중 하나에 상보적인 부분을 포함하는 임의 유전자의 발현을 잠재우는데, 그 이유는 헬리카제 활성이 siRNAdml 19bp 이중 나선을 풀고, siRNA의 한 가닥과 표적 전사체의사이에 유전자 변이 이중나선이 만들어지기 때문인 것으로 보인다. 새로운 이중나선이 엔도뉴클레아제 복합체 RISC를 표적 RNA로 안내하여, 단일 위치에서 절단("slices")이 일어나고, 세포 기전에 의해 바로 분해되는 비보호 RNA 말단가 생성된다(도 4). 하기에서 언급하겠제만, 짧은 RNA 종(microRNAs)에 의해 중개되는 침묵 기전은 공지되어 있다( Ruvkun, G., Science, 294, 797-799, 200 1; Zeng, Y., et al., Molecular Cell, 9, 1-20, 2002). 기전 및 이를 설명하는 도면으로 본 발명의 작용 기전에 임의 제한을 두고자 함이 아님을 인지할 것이다.

C. elegans에서 사람에 이르기까지 다양한 종에서 DICER 효소 상동체가 발견되었는데(Sharp, Genes Dev. 15;485, 2001; Zamore, Nat. Struct. Page 29 of 183 Blol. 8:746, 200 1), 이는 RNAi-유사 기전이 포유류 및 심지어 사람을 포함하는 다양한 여러 다른 세포형에서 유전자 발현을 잠재울 수 있는 능력이 있을 것이라는 가능성을 말하는 것이다. 그러나, 긴 dsRNAs(예를 들면, 약 30-50개 뉴클레오티드보다 긴 길이의 이중 가닥 부분을 가지는 dsRNAs)는 포유류 세포에서 인터페론 반응을 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 초파리 RNAi 기전에서 관찰된 특이적인 유전자 침묵보다는 포유류 세포에 길이가 긴 dsRNAs가 있다는 것은 인터페론-중개된 비-특이적인 해독 억제를 유도하는 것으로 보이고, 이로써 세포는 죽게된다. 따라서 길이가 긴 dsRNAs는 포유류 세포에서 특정 유전자 발현을 저해하는데 유용할 것 같지는 않다.

그러나, 발명자 및 다른 연구자들은 포유류 세포내로 siRNAs가 도입되면 바이러스 유전자를 포함하는 목표 유전자의 발현을 효과적으로 감소시킬 수 있다는 사실을 밝혀냈다. 발명자는 RNA-의존적인 RNA 전사효소, 뉴클레오단백질 NP를 포함하는 다양한 인플루엔자 바이러스를 표적으로 하는 siRNAs가 감염된 포유류 세포에서 생산되는 바이러스의 양을 급격하게 감소시킨다는 사실을 알아냈다(실시예 2, 4, 5, 6). 발명자는 또한 인플루엔자 바이러스 전사체를 표적으로 하는 siRNAs가 고유 유기체 즉, 인플루엔자 바이러스에 감염된 병아리 배에서 인플루엔자 바이러스 복제를 저해할 수 있다는 것을 알아내었다(실시예 3). 또한, 발명자는 인플루엔자 바이러스 전사체를 표적으로 하는 siRNAs는 바이러스 감염 전후에 생쥐에 투여되면 바이러스 생산을 저해할 수 있다는 것을 설명하였다 (실시예 12, 14).

또한, 발명자들은 siRNA 전수물질(shRNAs)가 발현되는 DNA 벡터를 투여하면 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해된다는 것을 보여주었다. 따라서, 본 발명은 세포내에 siRNA, shRNA, 또는 벡터를 삽입시켜 siRNA 또는 shRNAs 발현이 유도시켜 인플루엔자 바이러스 감염 또는 복제를 저해시킬 수 있는 유용한 전략을 제공한다.

임의 이론에 국한시키지는 않지만, 본 발명자는 이와 같은 발견이 예를 들면, 상기에서 설명한 것과 같이 인플루엔자 바이러스에 감염시에 발생되는 대사 및 생합성 활성과 같은 세포 활성에 심각한 변화 측면에서 특별한 의미가 있다고 제의하였다. 인플루엔자 바이러스에 감염되면 세포 mRNA 접합, 이동, 해독 등과 같은 기초적인 세포 프로세싱을 저해하여, 세포 단백질 합성을 저해하게 된다. 이와 같은 변화에도 불구하고, 인플루엔자 바이러스 전사체를 표적으로 하는 siRNA가 바이러스 복제를 저해한다는 것은 RNAi-중개된 유전자 발현을 저해하는 세포 기전이 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포에서 인플루엔자 유전자 발현을 저해하는데 충분한 수준으로 계속된다는 것을 말하는 것이다.

본 발명에서 사용할 수 있는 바람직한 siRNAs 및 shRNAs에는 대략 길이가 19 nt인 염기쌍 부분이 포함되는데, 선택적으로 한 개 이상의 자유 또는 고리형(루프) 말단를 가질 수도 있다. 예를 들면, 도 5에서는 본 발명에 따른 siRNA 또는 shRNAs로 이용할 수 있는 다양한 구조를 나타내고 있고, 포유류 세포에서 활성을 가지는 siRNA 종을 제시한다. 본 발명에서는 인플루엔자 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위해 포유류 세포로 도 5A에서 설명하는 구조의 siRNA를 투여하는 것이 포함된다. 그러나, 반드시 이와 같은 구조의 물질을 투여해야하는 것은 아니다. 예를 들면, 투여되는 조성물이 인터페론 반응 유도와 같은 원하지 않는 또는 유해한 결과를 초래하지 않는 한 도 5A의 구조로 in vivo에서 프로세싱될 수 있는 임의 구조를 포함할 수도 있다(“in vivo”는 세포없는 시스템과는 반대되는 개념으로 세포내에서 발생되는 siRNA 또는 shRNAs의 합성, 프로세싱 및 활성을 말한다. 일반적으로 세포는 조직 배양물에서 유지되거나 고유 유기체의 일부분이 될 수 있다). 본 발명에는 투여되는 물질이 여기에서 언급하는 정도의 바이러스 전사체 수준을 감소시키기만 한다면 도 5A의 구조로 정확하게 프로세싱되지 않는 물질을 투여하는 것도 포함된다.

도 5B 및 5C에서는 RNA 간섭을 중개하는데 이용될 수 있는 추가 구조를 나타낸 것이다. 이와 같은 헤어핀(스템-루프) 주고는 직접적으로 저해성 RNA 기능을 할 수도 있고 또는 도 5A에서 설명하는 것과 같은 siRNA 구조를 생산하기 위해 세포내에서 프로세스될 수도 있다. 도 5B는 두 개 상보적인 부분을 가지고 있어 서로 하이브리드되어 스템(400), 로프(410), 돌출(320)과 같은 이중 나선 영약을 형성하는 RNA 분자로 구성되는 물질을 보여준다.

이와 같은 분자는 자가-하이브리드될 수도 있고, 이런 종류의 구조를 shRNAs라고 한다. 적절하게는 스템은 약 19bp 정도되고, 루프는 1 내지 20, 적절하게는 약 4-10, 가장 적절하게는 6-8nt정도가 되고, 돌출은 약 1-20, 적절하게는 2-15nt 길이를 가진다. 특정 구체예에서, 스템은 최소 19개 뉴클레오티드 길이가 되고, 최고 약 29개 뉴클레오티드 길이가 될 수도 있다. 당업자는 4개 뉴클레오티드 또는 그이상의 길이를 가지는 루프가 짧은 루프보다 공간적으로 압박을 덜 받기 때문에 바람직하다는 것을 인지할 것이다. 특정 구체예에서, 돌출은 5‘인산기 및 3’ 하이드록시기를 포함한다. 하기에서 설명하는 것과 같이 도 5B의 구조를 가지는 물질은 in vivo 또는 in vitro 전사에 의해 바로 만들어질 수 있고, 몇몇 적절한 구체예에서, 돌출에는 전사체 꼬리가 포함될 수 있기 때문에 종종 돌출은 여러 개의 U 잔기, 예를 들면 1 내지 5개의 U잔기로 구성될 수 있다. 포유류에서 연구된 합성 siRNA는 2개 돌출 U잔기를 가지는 것으로 알려져있다. 도 20 및 21의 shRNA 구조 예시를 참고한다. 루프는 저해시킬 목표 전사체에 상보적인 부분의 5‘ 또는 3’ 부분에 위치할 수 있다(예를 들면 shRNAs의 안티센스 부분). 도 5C에서는 약 19개 bp 길이의 스템(400)을 형성하는데 충분한 상보 원소를 포함하는 RNA 고리로 구성된 물질을 보여준다. 이와 같은 물질은 여기에서 설명하는 다른 다양한 siRNA보다 개량된 안정성을 가진다.

siRNAs 설명함에 있어서, siRNA의 안티센스 및 센스 가닥으로 언급하는 것이 편의적이다. 일반적으로 siRNA의 센스 가작의 이중가닥 서열은 실질적으로 목표 전사체의 표적 부분과 동일하고, siRNA의 안티센스 가닥은 목표 전사체에 실질적으로 상보적이다(하기에서 추가 설명). shRNAs가 자가 하이브리드되는 단일 RNA 분자를 포함하기는 하나, 생성된 이중나선 구조는센스 및 안티센스 가닥으로 구성된 것으로 간주된다. 따라서, 여기에서 shRNAs의 센스 및 안티센스 가닥 또는 센스 및 안티센스 일부분으로 언급하는 것이 편리하고, 안티센스 가닥 또는 이의 일부분은 목표 전사체의 표적 부분에 실질적으로 상보적이고 이중 나선을 형성할 수 있는 분자의 일부분이 되고, 센스 가닥 또는 일부분은 안티센스 가닥 또는 이의 일부분은 목표 전사체의 표적 부분의 서열에 실질적으로 상보적이고 이중 나선을 형성할 수 있는 분자의 일부분이 된다.

설명을 목적으로, 하기 토론 부분에서는 siRNA 또는 shRNAs 대신에 siRNA만을 자주 언급하게 될 것이다. 그러나, 당업자는 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥 부분에 대한 개념을 상응하는 shRNA의 스템 일부분의 센스 및 안티센스 에 적용할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 따라서, 하기에서 설명하는 것은 본 발명의 shRNAs의 고안, 선별, 운반에서 적용시킬 수 있다.

당업자는 도 5의 구조를 가지는 임의 물질 또는 여기에서 설명하는 것과 같은 다른 효과적인 구조를 가지는 물질에는 전적으로 자연 RNA 뉴클레오티드로 구성되거나 또는 한 개이상의 뉴클레오티드 유사체로 구성될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이와 같은 다양한 유사체가 당분야에 공지되어 있고, 치료 핵산 연구에서 가장 흔히 이용되는 것은 포스포로티오네이트( phosphorothioate)(포스포로티오네이트를 이용하는 경우에 관련된 고려사항은 Agarwal, Biochim. Biophys. Acta 1489:53, 1999을 참고)이다. 특히 본 발명의 특정 구체예에서, 엑소뉴클레아제에 의한 절단을 감소시키기 위해 한 개이상의 자유 말단에 뉴클레오티드 유사체를 포함시켜 siRNA 구조를 안정화시키는 것이 바람직할 것이다. 데옥시뉴클레오티드 예를 들면, 한 개 이상의 자유 말단에 데옥시티미딘과 같은 피리미딘이 이와 같은 목적에 이용될 수 있을 것이다. 대안으로 또는 추가적으로, 목표 전사체와 siRNA의 한 개 가닥의 상호작용(또는 shRNAs의 스템의 일부분에 있는 한 개 가닥)에 의해 형성될 수 있는 임의 하이브리드와 비교하였을 때, 19bp 스템의 안정성을 증가 또는 감소시키기 위해 한 개 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함시키는 것도 바람직할 것이다.

본 발명의 특정 구체예에서, 다양한 뉴클레오티드 변형을 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥에 선별적으로 이용할 수도 있다. 예를 들면, 안티센스 가닥에는 변형 안된 비로뉴클레오티드를 이용하고, 센스 가닥의 일부 또는 전부에는 변형된 또는 변형 안된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 이용하는 것이 바람직할 수도 있다. 실시예 5에서 siRNA가 바이러스 mRNA, vRNA, cRNA를 표적으로 하는 지를 결정하기 위해 센스 가닥의 뉴클레오티드 2‘위치에 변형을 가지는 siRNA를 이용하는 것에 대해 설명하고 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 이중나선 부분에 유일하게 변형안된 리보뉴클레오티드를 이용하고, 안티센스 또는 센스 가닥의 돌출에는 변형된 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 한 개 또는 두 개 siRNA는 한 개 이상의 O-메틸화된 리보뉴클레오티드를 포함한다.

당분야에는 다양한 뉴클레오티드 유사체 및 뉴클레오티드 변형이 공지되어 있고, 하이브리드반응 및 뉴클레아제 저항에서 이들의 성질에 대해 조사되어 있다. 예를 들면, 염기, 당, 뉴클레오티드간의 연결부분에 다양한 변형을 선별된 위치에 도입하고, 변형안된 올리고뉴클레오티드와 비교하여 그 결과를 알 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 여러 측면에서 다양한 변형을 소개하는데, 예를 들면, 상보적 핵산에 하이브리드하는 능력, 안정성등을 변화시킨다. 예를 들면, 유용한 2'-변형에는 할로, 알콕시, 아릴옥시기가 포함된다. 미국 특허 6,403,779; 6,399,754; 6,225,460; 6,127,533; 6,031,086; 6,005,087; 5,977,089에서는 본 발명의 실행에 이용할 수 이는 다양한 뉴클레오티드 유사체 및 변형에 대해 설명하고 있다. Crooke, S. (ed.) "안티센스 Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications"(1st ed), Marcel Dekker; ISBN: 082470566 1; 1st edition (2001) and references therein 참고. 당업자는 여기에서 설명하는 검사방법 및 다른 적절한 검사 방법을 이용하여 유사체 및 변형에 대해 테스트하여 바이러스 유전자의 발현을 효과적으로 감소시키는 것을 선별할 수 있을 것이다. siRNA에 유용한 것으로 밝혀진 변형에 대해서는 참고문헌 137-139을 참고한다. 본 발명에는 이와 같은 변형을 이용하는 것도 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에서, 유사체 또는 변형으로 흡수성이 증가된 siRNA(예를 들면, 점막 층을 통한 흡수성의 증가, 구강 흡수도 증가 등), 혈류 또는 세포내 안정성의 증가, 세포막을 통과하는 능력 증가 등의 결과를 초래할 수 있다. 당업자는 유사체 또는 변형으로 Tm의 변형을 얻는데, 이는 siRNA 서열과 목표사이에 미스매치 내성을 증가시키면 효과적인 억제를 유도할 수도 있고, 또는 원하는 목표 전사체에 대한 특이성이 증가 또는 감소될 수도 있다.

당업자는 본 발명에서 이용할 수 있는 효과적인 siRNA 물질은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 아닌 한 개 이상의 모이어티(moeities)로 구성될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

일반적으로, 본 발명의 siRNA의 한 가닥에는 목표 전사체의 일부분에서 발견되는 것에 실질적으로 상보적인 부분(“저해 부분”)을 포함할 수도 있어 siRNA의 일부분 또는 한 가닥과 목표 전사체사이에 in vivo에서 정확한 하이브리드가 형성될 수 있다. shRNAs를 이용하는 본 발명의 구체예에서, 실질적으로 상보적인 부분에는 도 5B에서 설명하는 대부분 또는 모든 구조를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, siRNA 또는 shRNAsdml 관련 저해 부분은 목표 전사체와 완벽하게 상보성을 가진다; 다른 구체예에서는 siRNA/주형 이중나선내에 한 개 이상의 비-상보 부분이 포함된다. siRNA/주형 이중나선의 중앙 일부분에는 미스매치를 피하는 것이 바람직하다(예를 들면 Elbashir et al., EMBO J 20:6877, 2001, 참고).

일반적으로 적절한 siRNA는 목표 전사체내에 엑손 서열을 포함하는 목표 부위에 하이브리드한다. 인트론 서열과의 하이브리드 반응도 배제하지 않지만 일반적으로 포유류 세포에서는 적절하지 않다. 본 발명의 특정 구체예에서, siRNA는 배타적으로 엑손 서열과 하이브리드한다. 본 발명의 일부 구체예에서, siRNA는 단일 엑손내에 서열만을 포함하는 목표 부위와 하이브리드하고; 다른 구체예에서는 1차 전사체의 접합 또는 다른 변형에 의해 목표 부위가 만들어진다. 일반적으로 전사체의 접합 또는 분해를 유도하게 되는 siRNA와 하이브리드되는데 이용될 수 있는 임의 부위를 본 발명에서 이용할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 당업자는 일부 경우에, siRNA 하이브리드 반응 표적으로 목표 전사체의 특정 부위를 선별하는 것이 바람직하다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면, 분해가 바람직하지 않은 다른 전사체와 고융할 수 있는 목표 전사체의 부분은 피하는 것이 바람직하다. 일반적으로 5‘말단보다는 전사체의 3’말단에 근접한 코딩 부분이 적절하다.

다양한 방법으로 siRNAs를 선별할 수 있다. 일반적으로 상기에서 언급한 것과 같이, 본 발명의 siRNAs에는 목표 전사체의 일부분에서 발현되는 상보적인 또는 완벽하게 상보적인 부분(“저해 부분” 또는 “이중나선 영역”)을 포함하여, siRNA의 안티센스 가닥과 목표 전사체사이에 in vivo 하이브리드를 형성하게 하는 것이 바람직하다. 이와 같은 이중나선 영역("코어 부분“이라고도 함)에는 돌출이 포함되지 않는 것으로 보지만, 돌출이 있다면 목표 전사체에 상보적이 될 것이다. 적절하게는 완벽한 또는 실질적으로 상보적 부분에는 도 3, 4, 5에서 설명하는 대부분의 이중-나선 구조를 포함한다. siRNA의 관련 저해 부분은 목표 전사체에 완벽하게 상보적인 것이 바람직하다. 그러나, 한 개 이상의 비-상보 잔기를 가지는 siRNAs도 침묵을 중개하는 것으로 나타났는데, 저해 정도는 목표 전사체에 완벽하게 상보적인 이중나선을 가지는 siRNA를 이용하는 경우보다는 낮다.

일반적으로 siRNA 이중 나선의 3‘ 절반 부분에 미스메치는 siRNA 이중나선의 5’ 절반 부분에 있는 미스매치보다는 낮은 저해 효과를 유도하는 것으로 보인다.

설명을 위해, siRNA 코어 부분의 길이는 19개 뉴클레오티드로 하고 19개 뉴클레오티드 서열을 N19로 한다. 그러나, 코어 부분의 길이는 15 내지 29개 뉴클레오티드가 될 수도 있다. 또한, siRNA의 안티센스 가닥의 코어 부분(예를 들면, 목표 전사체에 상보적인 부분)이 목표 전사체에 완벽하게 상보적이도록(상기에서 언급한 것과 같이 한 개 이상의 미스매치는 용인할 수도 있지만) siRNA N19 저해 부분을 선택할 수 있다. 일반적으로, 통상적 경로를 통하여 목표 전사체의 발현을 감소시키는 최대 능력을 가지는 siRNA가 바람직한 경우에는 이중 나선 영역에서 미스매치를 피하는 것이 바람직하다. 그러나, 하기에서 설명하는 것과 같이, 목표 전사체의 발현을 감소키니는 최대 능력 이하를 가지는 siRNA를 선별하거나 또 다른 경로를 통하여 작용하는 siRNA를 이용하는 것도 적절한 방법이 될 수 있다. 이와 같은 상황에서는 siRNA의 이중 나선 부분에 한 개 이상의 미스매치를 포함시키는 것이 적절하다. 일반적으로 4개 잔기 미만 또는 저해 부분에 잔기의 15% 미만이 표적과 미스매치되는 것이 적절하다.

일부 경우에는 전체 안티센스 가닥(돌출이 있는 경우에 3‘ 돌출 포함)이 목표와 완벽하게 상보적인 siRNA 서열을 선택할 수도 있다. 그러나, 돌출이 목표 전사체에 상보적이거나 동일할 필요는 없다. 임의 원하는 서열(예를 들면 UU)를 siRNA의 안티센스 또는 센스 19bp 코어 부분에 간단하게 첨가하여 3’ 돌출을 만들수도 있다. 일반적으로 예를 들면, U, T, dT와 같은 한 개이상의 피리미딘을 포함하는 돌출을 이용한다. siRNA을 합성할 때, U보다는 T를 이용하는 것이 편리하고, T보다는 dT를 이용하는 것이 안정성을 증가시킨다. 상기에서 나타낸 바와 같이, 돌출은 선택사항이고, 존재한다고 해도 목표 서열과 임의 상관관계를 반드시 가질 필요는 없다. shRNAs는 한 개 3'말단만 가지기 때문에 siRNA를 형성하기 위한 프로세싱전에 유일한 3‘ 돌출을 가지는 것은 가능하다.

요약하면, 일반적으로 목표 전사체내에서 19nt와 같은 적절한 길이의 임의 코어 부분을 선별하고, 코어 부분에 실질적으로 또는 완벽하게 상보적인 서열을 가지는 안티센서 가닥을 가지고, siRNA의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 가지는 센스 가작을 가지는 siRNA을 선별할 수 있도록 siRNA를 만든다. 상기에서 설명한 것과 같이 3' 돌출을 서열에 첨가하여 siRNA 구조를 만들 수도 있다. 따라서, 안티센스 가닥의 돌출은 목표 전사체에 상보적이거나 목표 전사체에 있는 서열에 상응할 필요는 없다. 일반적으로 목표 전사체는 mRNA이고, siRNA 서열은 mRNA자체보다는 이중 가닥 cDNA의 상응하는 서열에 대해 선별되는데, 그 이유는 cDNA의 센스 가닥이 U대신에 T를 포함하는 것만 제외하면 mRNA와 동일하기 때문이다(인플루엔자 바이러스 복제 사이클 설명에서, 이중-가닥 cDNA는 생성되지 않고, 세포에 있는 cDNA는 단일 가닥이며, 이는 바이러스 mRNA에 상보적이다.)

임의 특정 목표 유전자의 발현을 저해 또는 감소시키는데 모든 siRNAs가 동일한 효과를 가지지는 않고(Holen, T., et al., Nucleic Acids Res., 30(8):1757-1766, 상이한 siRNA에의한 다양한 효과에 대해 보고함), 선택된 siRNA의 효과를 증가시키기 위한 다양한 사항을 고려할 수 있다. 예를 들면, 인트론 보다는 엑손내에서 목표 일부분을 선별하는 것이 바람직하다. 일반적으로 표적 부분의 3‘부분에 근접한 목표 부분이 목표 전사체의 5’말단 또는 중앙에 있는 목표 부분보다 적절하다. Technical Bulletin # 003-Revision B, "siRNA Oligonucleotides RNAi Applications", available from Dharmacon Research, Inc., Lafayette, CO 80026, RNA 시약 공급자에서 설명하는 원리에 따라 일반적으로 siRNA를 고안할 수 있다. Technical Bulletins #003(www.dharmacon.com/tech/tech0003.html(Dharmacon) 및 #004(www.dharmacon.com/tech/tech0004.html(Dharmacon)에는 siRNA 고안 변수, 합성등에 관련된 다양한 정도를 포함하고 있다. 이용할 수 있는 추가 고안 사항은 Semizarov. D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.100, N.11pp6347-6352에 기재되어 있다.

본 발명의 한 측면은 감염성 병원체의 다양한 균주, 서브 타입 등(이를 집합적으로 변이체라고 함)가 존재하고, 이들 게놈의 서열이 다양하다는 것을 인지하고, 상이한 변이체중에서 고도의 보존성이 높은 부분을 표적으로 하는 siRNA 및 shRNAs를 고안하는 것이 바람직하다. 특히, 충분한 수의 서열을 비교하고, 상당히 보존된 부분을 선별함으로써, 고도로 보존된 부분을 포함하는 이중 나선을 가진 단일 siRNA로 다중 변이체를 표적화시키는 것이 가능할 것이다. 일반적으로 이와 같은 부분은 siRNA의 전체 이중 나선 부분을 포함하는(19개 뉴클레오티드) 충분한 길이가 될 것이고, 선택적으로 한 개이상의 돌출을 포함할 수도 있고, 이중나선 전체 길이보다는 짧은 부분이 이용될 수도 있다(예를 들면 15, 16, 17, 18개 뉴클레오티드). 본 발명의 특정 구체예에 따르면 변이체간에 동일하다면 이부분은 다중 변이체들 사이에서 고도로 보존된 부분이 된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 부분(siRNA의 이중나선 부분에 포함되는 것으로 길이는 15, 16, 17, 18, 19개 뉴클레오티드)은 변이체에서 기껏해봐야 한 개 뉴클레오티드(예를 들면 0 또는 1개 뉴클레오티드)가 상이한 고도로 보존된 부분이다. 본 발명의 특정 구체예에서 이부분은 변이체에서 기껏해봐야 두 개 뉴클레오티드(예를 들면 0, 1, 또는 2개 뉴클레오티드)가 상이한 고도로 보존된 부분이다. 본 발명의 특정 구체예에서 이부분은 변이체에서 기껏해봐야 세 개 뉴클레오티드(예를 들면 0, 1, 2 또는 3개 뉴클레오티드)가 상이한 고도로 보존된 부분이다. 본 발명의 특정 구체예에서 siRNA에는 적어도 5개 변이체, 적어도 10개 변이체, 적어도 15개 변이체, 적어도 20개 변이체, 적어도 25개 변이체, 적어도 30개 변이체, 적어도 40개 변이체, 적어도 50개 변이체, 또는 그이상 변이체에서 고도로 보존된 부분을 표적으로 하는 이중나선 부분을 포함한다.

이 부분이 일련의 여러 변이체에서 고도로 보존된 부분인지를 결정하기 위해 다음의 방법을 이용한다. 일련의 서열을 기준 서열로 선택하는데, 예를 들면 다른 서열과 비교되는 서열로 선택한다. 일반적으로 기준 서열의 길이는 siRNA의 이중나선 일부분에 적절한 길이 예를 들면, 15, 16, 17, 18, 19개 뉴클레오티드 길이가 된다. 본 발명의 상이한 구체예에서, 기준 서열은 비교되는 서열에 있는 하나의 서열이거나 또는 일련의 서열에서 정한 위치에 가장 빈번하게 나타내는 뉴클레오티드로 그 위치를 결정하여 만든 콘센선스 서열이 될 수도 있다.

선택된 기준 서열을 가지고, 다중 변이체의 각 서열을 기준 서열과 비교한다. 기준 서열과 다중 변이체 각 서열과의 서열 차이를 이용하여 관심 부분이 변이체간에 보존된 서열인지를 결정하다. 상기에서 설명하는 것과 같이 본 발명의 다양한 구체예에서, 두 부분의 서열 차이가 0; 0 또는 1; 0, 1, 2; 0, 1, 2, 3가 되면 이 부분은 고도로 보존된 것으로 간주한다. 차이가 나는 위치에서 기준 서열과 동일한 또는 다른 서열과 동일한 것으로 siRNA 서열을 선택할 수 있다. 일반적으로 기준 서열에 있는 뉴클레오티드를 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 특정 구체예에서, 특히 비교되는 제2서열의 특정 위치에 있는 뉴클레오티드가 기준 서열에 있는 뉴클레오티드과 비교하여 더 빈번하게 서열에 나타난다면 siRNA 서열은 제 2 서열과 동일하도록 선택할 수 있다. 또한 본 발명의 특정 구체예에 따르면 차이가 있는 위치에서 콘센선스 뉴클레오티드(가장 빈번하게 발생하는 뉴클레오티드)기 기준 서열에서 발견되는 것과 상이하다면, 콘센선스 뉴클레오티드를 이용할 수도 있다. 이는 비교되는 임의 서열과 동일하지 않는 서열이 만들어질 수도 있음을 알아야 한다(기준 서열로 콘센선스 서열을 이용할 수도 있음)

실시예 1에서는 사람 기원의 6개 인플루엔자 A 바이러스와 서열 비교하고, 상이한 동물 숙주 기원(사람 포함)의 7개 인플루엔자 A 바이러스 서열과 비교하여 siRNA 서열을 선택하는 것을 설명한다. 고도로 보존된 부분을 선택하는데 있어서 상이한 여러 방법을 이용할 수 있다는 것은 인지할 수 있을 것이다. 그러나, 본 발명에는 어떤 방법으로 선별되었는가에는 상관하지 않고 여기에서 설명하는 기준에 맞는 고도로 보존된 부분에 근거하여 선택된 이중 나선 부분을 가지는 siRNA가 포함된다(선택적으로 siRNA에는 임의 돌출이 포함될 수도 있다). 또한 본 발명은 여기에서 설명하는 고도로 보존된 부분에 대한 기준에 맞지 않는 인플루엔자 바이러스 전사체의 일부분을 표적으로 하는 siRNAs도 포함된다는 것을 인지할 것이다. 이와 같은siRNAs는 고도로 보존된 부분을 표적으로 하는 것보다는 부적절하지만, 이들이 표적으로 하는 전사체 바이러스 생산을 저해하는데 있어서는 여전히 효과가 있다.

표 1A에는 각 바이러스 유전자 단편의 인플루엔자 바이러스 서열가운데 고도로 보존된 21개 뉴클레오티드 부분을 나타낸다. 표 1A의 서열은 T가 U대신에 사용된 것을 제외하고는 바이러스 mRNA에 있는 서열에 따라 5‘에서 3’ 방향으로 나열한 것이다. 숫자는 바이러스 게놈에서 서열 위치를 나타낸다. 예를 들면, PB2-117/137은 단편 PB2에서 위치 117부터 137까지 서열을 나타낸 것이다. 본 발명의 특정 구체예에 따르면, 이들 서열에 근거하여 siRNA를 고안하기 위해, 뉴클레오티드 3-21를 siRNA 센스 가닥 서열의 코어 부분으로 선택하였다. dTdT로 구성된 두개 nt 3'돌출을 각각 첨가하였다. 각 서열에서 뉴클레오티드 1-21에 상보적인 서열을 이에 상응하는 안티센스 가닥으로 선별하였다. 예를 들면, 고도로 보존된 서열 PA-44/64, 즉, AATGCTTCAATCCGATGATTG(SEQ ID NO: 22)을 근거하여 siRNA를 고안하기 위해서, 서열 TGCTTCAATCCGATGATTG(SEQ ID NO: 109)을 가지는 19nt 코어 부분을 선택하였다. dTdT로 구성된 두개 nt 3'돌출을 첨가하면(T는 U로 대체함) 서열 5'-UGCUUCAAUCCGAUGAUUGdTdT-3'(SEQ ID NO: 79)이 생성된다. 이것이 siRNA 센스 가닥의 서열이다. 안티센스 siRNA 가닥 서열(5'에서 3' 방향으로)는 SEQ ID NO: 22, 즉 CAAUCAUCGGAUUGAAGCAdTdT(SEQ ID NO: 80)에 상보적으로, T가 U로 대체되었고, 이때 두개 nt 3'돌출에서 T는 dT로 대체되었다. 센스와 안티센스 siRNA 서열은 표 1A에 있는 각 서열로부터 유사하게 수득할 수 있다. 표 2에서는 이와 같은 20개 siRNA 서열을 나타내었다.

표 1A의 각 서열에는 19개 nt 부분(nt 3-21)과 siRNA의 센스 가닥에는 존재하지 않지만, siRNA의 안티센스 가닥의 3‘돌출에 상보적인 처음 2개 nt 서열을 포함한다. 19 nt 부분은 센스 또는 안티센스 가닥 또는 이둘모두에서 상이한 3’ 돌출을 가지는 다양한 siRNA 분자를 고안하기 위한 센스 가닥으로 이용할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 표 1A에 나타낸 각 서열에서 뉴클레오티드 3 내지 21은 죄측에서 우측으로 5‘내지 3’ 방향으로 siRNA의 센스 서열에 상응한다. 상응하는 안티센스 서열은 나열된 서열의 뉴클레오티드 1 내지 21에 상응한다. 이들 서열을 가지는 센스와 안티센스 가닥의 하이브리드 반응(센스 가닥 서열에 3' OH 돌출을 첨가하고, 두 서열 모두에서 T를 U로 대체)으로 19개 염기쌍 코어 이중나선을 가지는 siRNA가 합성되는데, 각 서열에는 2 뉴클레오티드로 된 3’OH 돌출을 가진다.

그러나, 상기 설명에 따르면, 표 1A에 나타낸 서열을 이용하여 정확하게 이와 같은 구조를 가지지 않는 다양한 siRNA를 만들 수도 있다. 예를 들면 돌출 서열을 다양하게 할 수도 있고, siRNA가 효과적으로 유전자 발현을 저해하는데 한 개 또는 두 개 돌출의 존재가 필수적인 것은 아니다. 또한, siRNA의 이중나선 부분의 적절한 길이는 19개 뉴클레오티드이나 더 짧거나 더 긴 것도 효과가 있다. 따라서, 표 1A에 나타낸 고도로 보존된 서열에 따르 고안된 siRNAs에는 siRNA의 센스 가닥에 위치 3과 21 부분에 있는 이들 뉴클레오티드의 일부만을 포함할 수도 있다(값의 범위의 양단에 있는 수는 범위에 포함되는 것으로 간주한다).

표 1B에서는 인플루엔자 바이러스의 고도로 보존된 부분에 근거하여 추가로 고안된 siRNA를 나타낸 것이다. 센스와 안티센스 가닥은 5‘에서 3’ 방향으로 나타내었다. dTdT 3' 돌출을 각 가닥에 첨부한다. 표 1B에 있는 각 센스 가닥 서열의 뉴클레오티드 1 내지 19는 인플루엔자 바이러스전사체의 고도로 보존된 부분에 있는 서열과 동일하다. 상응하는 안티센스 서열은 센스 가닥에 상보적이다. 설명을 목적으로 "고도로 보존된 부분“은 표 1A에 나열된 임의 서열에서 뉴클레오티드 3-21를 말하거나 또는 표 1B에 나열된 센스 가닥중 뉴클레오티드 1 - 19를 말한다. 이들은 본 발명의 siRNA 또는 shRNAs에 형성된 이중 가닥내에 있는 부분이다. 이들 부분의 서열을 ”고도로 보존된 서열“이라고 한다.

본 발명은 표 1A 및 1B에 나열된 고도로 보존된 서열의 전부 또는 일부분을 포함하는 서열을 가지는 센스 가닥으로 구성된 siRNAs를 제공한다. 본 발명은 또한 표 1A 및 1B에 나열된 고도로 보존된 서열의 전부 또는 일부분을 포함하는 서열을 가지는 센스 가닥으로 구성된 shRNAs를 제공한다. 간단하게 하기 위해, 하기에서는 siRNAs를 설명한다. 그러나, 본 발명에는 표 1A 및 1B에 나열된 고도로 보존된 서열의 전부 또는 일부분을 포함하는 서열을 가지는 센스 가닥으로 구성된 shRNAs도 포함되는 것을 인지할 것이다.

일반적으로, 1A 및 1B에 나열된 고도로 보존된 서열에 따라 고안된siRNA 서열에는 보존된 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 적어도 12개 연속 뉴클레오티드, 좀더 적절하게는 적어도 15개 연속 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 17개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 19개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일반적으로 1A 및 1B에 나열된 고도로 보존된 서열에 따라 고안된 siRNA의 안티센스 서열에는 보존된 서열에 완벽하게 상보적인 적어도 10개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 적어도 12개 연속 뉴클레오티드, 좀더 적절하게는 적어도 15개 연속 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 17개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 19개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 본 발명에서는 목표 전사체에 상보적인 표 1A 또는 표 1B에 고도로 보존된 서열에서 1개 또는 그이상의 뉴클레오티드, 예를 들면 최고 9개 뉴클레오티드기 “변이”된 siRNA를 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에서, 1A 및 1B에 나열된 고도로 보존된 서열에 따라 고안된 siRNA의 센스 가닥의 서열에는 나열된 서열과 상이한 한 개 뉴클레오티드를 가지는 적어도 10개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 적어도 12개 연속 뉴클레오티드, 좀더 적절하게는 적어도 15개 연속 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 17개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 19개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 1A 및 1B에 나열된 고도로 보존된 서열에 따라 고안된 siRNA의 안티 센스 가닥의 서열에는 한 개 뉴클레오티드가 상이한 것을 제외하고는 고도로 보존된 서열의 일부분에 완벽하게 상보적인 적어도 10개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 적어도 12개 연속 뉴클레오티드, 좀더 적절하게는 적어도 15개 연속 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 17개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 19개 연속 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에서, 1A 및 1B에 나열된 고도로 보존된 서열에 따라 고안된 siRNA의 센스 가닥의 서열에는 나열된 서열과 상이한 두 개 뉴클레오티드를 가지는 적어도 10개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 적어도 12개 연속 뉴클레오티드, 좀더 적절하게는 적어도 15개 연속 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 17개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 19개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 1A 및 1B에 나열된 고도로 보존된 서열에 따라 고안된 siRNA의 안티 센스 가닥의 서열에는 두 개 뉴클레오티드가 상이한 것을 제외하고는 고도로 보존된 서열의 일부분에 완벽하게 상보적인 적어도 10개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 적어도 12개 연속 뉴클레오티드, 좀더 적절하게는 적어도 15개 연속 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 17개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 19개 연속 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에 따르면, siRNA은 적어도 두 개 종의 유기체에 자연적으로 감염되는 변이체간에 고도로 보존된 이중나선 부분을 포함한다. 본 발명의 특정예에서는 siRNA은 적어도 두 개 유기체에서 기인된 변이체간에 고도로 보존된 이중나선 부분을 포함한다. 본 발명의 특정예에서는 siRNA은 적어도 세 개 유기체, 적어도 4개 상이한 유기체, 적어도 5개 상이한 유기체에서 기인된 변이체간에 고도로 보존된 이중나선 부분을 포함한다. 종에는 사람, 말, 조류(오리, 병아리), 돼지 등이 포함된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 종은 사람이다. 많은 감염성 병원체의 경우에, 이미 확인된 다양한 인플루엔자 A 서브타입의 경우에, 특정 종의 숙주를 감염시키는 서브타입의 능력이 공지되어있다. 또한, 다양한 인플루엔자 서브타입 종은 서브타입의 이름에 반영되어 있다. 당업자는 감염성 병원체가 자연적으로 임의 특정 숙주 종을 감염시키는지 또는 물질이 기원이 되는 종을 감염시키는지는 인플루엔자 A 바이러스 서브타입에 이용된 방법 또는 문헌을 참고로 하여 결정할 수 있을 것이다. 다른 해에 분리한 변리체를 선별하거나 상이한 NA 및 HA 서보타입을 발현시키는 변리체를 분리하는 것이 바람직할 수도 있다. 예를 들면, 실시예 1에서 설명하는 것과 같은 siRNA/shRNAs의 이중 나선 부분의 고도로 보존된 서열을 선택하는데 이용되는 변이체에는 사람에서 분리된 변이체 뿐만 아니라 다양한 다른 동물에서 분리된 변이체도 포함된다. 변이체에는 다른 해에 분리된 바이러스도 포함되고, 모든 공지의 HA 및 NA 서브타입을 발현시키는 바이러스도 포함된다.

본 발명의 특정 구체예에 따르면, 감염성 병원체는 게놈이 독립적인 핵산 단편으로 구성되는데, 예를 들면 독립적인 다중 RNA 단편으로 구성되는 물질이 될 수도 있다. 일반적으로 이중나선 부분에는 다중 변이체간에 고도로 보존된 적어도 10개 연속 뉴클레오티드, 좀더 적절하게는 12개 연속 뉴클레오티드, 좀더 바람직하게는 적어도 15개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 적절하게는 이중나선 부분에는 다중 변이체간에 적어도 17개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서는 다중 변이체간에 적어도 19개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 이중나선 부분에 추가하여, siRNA에는 한 개 또는 그이상의 가닥에 3‘ 돌출을 가질 수 있다. siRNA의 센스 가닥에 돌출은(본 발명의 특정예에서 반드시 필요한 것은 아니지만) 목표 전사체의 3’ 부분에 있는 서열과 동일할 수도 있다. siRNA의 안티 센스 가닥에 돌출은(본 발명의 특정예에서 반드시 필요한 것은 아니지만) 목표 전사체의 5’ 부분에 있는 서열과 동일할 수도 있다. 여기에서 설명하는 것과 같이 돌출은 1개 뉴클레오티드, 2개 뉴클레오티드, 또는 그이상의 길이를 가질 수 있다.

이 분양의 당업자는 전술한 원칙에 따라 siRNA가 용융 온도 (Tm) 및 해리 온도 (Td) 범위를 나타낸다는 것을 이해할 것이다. Tm은 50%의 핵산 및 그것의 완벽한 보체가 용액 내에서 이중나선로 존재하는 온도로서 정의되며, Td는, 하나의 분자가 필터에 고정된 상태와 관련하여, 특정 염 농도, 그리고 총 가닥 농도에서 50% 의 올리고뉴클레오티드 및 그것의 완벽한 필터-결합 보체가 이중나선로 존재하는 온도로서 정의된다. 수용 가능한 Tm의 대표적인 예시는, 이 분야에 공지된 방법을 사용하여 쉽게 측정될 수 있으며, 또는 여기서 개시된 실시예의 siRNA 서열에 기초하여, 또는 실험에 의하여 또는 적절한 경험적 또는 이론적으로 유도된 방정식에 의하여 실험적으로 쉽게 측정된다.

실질적인 Tm을 측정하기 위한 통상적 방법의 하나는 LTV 분광광도계에서 열안정화된 셀(thermostatted 세포)을 사용하는 것이다. 만약 온도가 흡광도에 대하여(vs) 작도되는 경우, 두 평탄역(plateaus)을 갖는 S-형 곡선이 관찰될 것이다. 평탄역 사이의 중간의 흡광도가 Tm에 대응된다. Td에 대한 가장 간단한 방정식은 월레스 법칙(벽ace rule)이다: Td = 2(A+T) + 4(G+C) 벽ace, R.B.; Shaffer, J.; Murphy, R.F.; Bonner, J.; Hirose, T.; Itakura, K., Nucleic acids Res. 6, 3 543 (1979). 고정된 목표(target) 가닥의 성질은 목표 및 프로브자 용액 내에 유리된 경우의 값에 비하여 전체적으로 감소된 Tm을 나타낸다. 감소의 규모는 대략 7-8℃이다. 1가 양이온의 농도에 대한 대략적인 값 내에서 pH 5 ~ 9에서 50 뉴클레오티드보다 긴 서열에 대하여 가치있는 DNA에 대한 다른 유용한 방정식은 다음과 같다. : Tm=81.5 + 16.6logM + 41(XG+XC) - 500/L - 0.62F, 여기서 M은 1가 양이온의 몰 농도, XG 및 XC는 서열 내의 G 및 C 의 몰 분율, L은 이중나선의 가장 짧은 가닥의 길이, 그리고 F는 포름아마이드의 몰 농도 이다. (Howley, P.M; Israel, M.F.; Law, M-F.; Martin, M.A., J Biol. Chem. 254,4876). RNA에 대한 유사한 방정식은 다음과 같다: Tm = 79.8 + 18.5 log M + 58.4 (XG+XC) + 11.8(XG+XC)2 - 820/L - 0.35F. 그리고 DNA-RNA 하이브리드에 대한 방정식은: Tm = 79.8 + 18.5 log M + 58.4 (XG+XC) + 11.8(XG+XC)2 - 820/L - 0.50F이다. 이들 방정식은 고정된 목표 하이브리드를 위하여 유도된다. 몇몇 연구는 가장 근접한 상호작용에 대한 열역학적 기초를 이용하여 Tm에 대한 정확한 방정식을 유도하였다. DNA 및 RNA을 위한 방정식은: Tm = (1OOOΔH)/A + AS + Rln(Ct/4) - 273.15 + 16.6 ln[Na⁺], 여기서 ΔH (Kcal/mol)는 하이브리드에 대한 가장 근접 엔탈피 변화의 합이며, A (eu)는 헬릭스 개시를 위한 수정(corrections)을 함유하는 상수이다. AS (eu)는 가장 근접 엔트로피 변화의 합이고, R은 기체 상수 (1.987 cal deg^-1 mol^-1) 그리고 Ct는 가닥의 총 몰농도 이다. 만일 가닥이 자기 보수성(self complementary)이면, Ct/4는 Ct로 교체된다. 열역학적 매개변수를 위한 값은 문헌으로 부터 얻을 수 있다. DNA에 대하여는 Breslauer, et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 83, 3746-3750, 1986참조. RNA:DNA 이중나선의 경우는 Sugimoto, N., et al, Biochemistry, 34(3 5): 11211-6, 1995참조. RNA에 대하여는 Freier, S.M., et al., Proc. Natt. Acad. Sci. 83, 9373-9377,1986. Rychlik, W., et al., NucL Acids Res. 18(21), 64096412, 1990참조. Tm 계산을 위한 다양한 컴퓨터 프로그램이 널리 알려져 있다. 예컨대, URL www.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html의 웹사이트 참조.

특정 siRNA는 3' UTR 서열을 포함하거나 전체적으로 구성된 목표 부위에 하이브리드 된다. 이러한 siRNA는 siRNA/주형 이중나선 내의 다수의 미스매치를 허용한다. 그리고 특히 이중나선의 중앙 부위의 미스매치를 허용한다. 예를 들면, 하나 또는 두 가닥 모두가 도 6에 도시된 바와 같은 벌지(bulge)를 형성하는 하나 또는 그 이상의 "엑스트라" 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 완벽한 상보성(complementarity)의 스트레치(stretch)는 대체로 5 뉴클레오티드 이상의 길이, 예컨대, 6, 7, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이이며, 미스매치 부위는 예를 들면, 1, 2, 3, 또는 4 뉴클레오티드 길이이다. 목표 전사체와 하이브리드 되는 경우, 이러한 siRNA는 종종 미스매치 부위에 의하여 분리된 완벽한 상보성을 갖는 두 스트레치(stretch)를 포함한다. 다양한 구조가 가능하다. 예를 들면, siRNA는 다중의 이질성 영역(미스매치)를 포함할 것이다. 이 이질성 영역 (미스매치)은 대칭적일 필요는 없으며, 즉, 목표 그리고 siRNA 모두가 짝을 이루지 않는 뉴클레오티드를 포함하여야 하는 것은 아니다.

3' UTR에서의 siRNA/주형 이중나선 형성이 전통적 RNA 억제와 구별되나 그에 관련되는 메카니즘에 의하여 주형 전사체에 의하여 인코드되는 단백질의 발현을 억제하므로, 일부 미스매치는 바람직할 것이다. 특히, 주형 전사체의 3' UTR에 결합하는 siRNA가 전사체의 안정성을 감소시키기 보다는 전사체의 해독을 감소시킨다는 것을 제안하는 증거가 있다. 특히, 도 6에 도시된 바와 같이, 전술한 Drosophila 시스템에서 그리고 또한 다양한 유기체에서 siRNA를 생성하는 DICER 효소는 또한 stRNA(small, temporal RNA) 기질을 목표 전사체의 3' UTR와 결합하는 경우 전사체의 해독을 억제하는 억제제로 가공할 수 있는 것으로 알려져 있다. (Grishok, A., et al., 세포 106, 23-24, 2001; Hutvagner, G., et al., Science, 293, 834-838, 2001; Ketting, R., et al., genes Dev., 15, 2654-2659 참조). 본원 발명의 목적을 위하여, 한 가닥이 목표 전사체에 결합하여 그것의 발현을 감소시키는 (즉, 전사체의 농도를 감소시키고 및/또는 전사체에 의하여 인코드되는 폴리펩타이드의 합성을 감소시키는)는, 여기서 개시된 것과 같은 부분적으로 또는 완전한 이중-가닥의 짧은 RNA는 RNA가 분해의 촉발에 의하여, 해독의 억제에 의하여, 또는 다른 수단에 의하여 작용하는 지에 무관하게 siRNA로 간주된다. 본 발명의 특정의 바람직한 실시예에서, 전사체의 발현을 감소시키는 것은 전사체의 분해와 연관된다. 또한, 생체 안에서 (즉, 세포 또는 유기체 안에서) 가공되어 이러한 siRNA를 생성하는 전구체 구조물 (예컨대, 개시된 바와 같은 짧은 헤어핀 RNA) 이 본원 발명의 실시예 유용하다.

이 분야의 당업자는 본 발명의 RNAi-유도제가 생체 안에서의 또는 시험관 안에서의 화학적 합성, 효소적 또는 화학적 분열, 또는 생체 안에서의 또는 시험관 안에서의 주형 전사에 한정되지 않으나 이를 포함하는 기술에 따라 제조된다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 RNA-유도제는 자기 보수성 부분(즉, 세포 내에서 가공되어 siRNA를 산출할 수 있는 shRNA)을 포함하는 단일 RNA 분자로서, 또는 서로 하이브리드되는 두 가닥으로서 유도될 것이다. 예컨대, 두개의 분리된 21 nt RNA 가닥이 생성되며, 각각은 서로 상보적인 19 nt 부위를 함유하고, 개별적인 가닥은 서로 하이브리드 되어 도 5A에 도시된 것과 같은 구조를 생성할 것이다.

다른 방법으로는, 각각의 가닥은 시험관 안에서 또는 생체 안에서 프로모터로 부터 전사됨으로써 생성될 것이다. 예컨대, 각각 서로 상보적인 19 nt 부위를 함유하는 21 nt 전사체를 생성하는, 두 분리된 전사 잠재성 부위를 함유하는 구조체가 제공된다. 다른 방법으로는, 각각 적어도 부분적으로 서로 상보적인 두개의 다른 전사체가 생성되도록 배치된 반대의 프로모터 PI 및 P2 그리고 종결인자 tl 및 t2를 함유하는 단일 구조체가 사용될 수 있으며, 도 7에 도시된다.

다른 실시예에서, 본 발명의 RNA-유도제는 단일 전사체로서, 예를 들면 자기 보수성 부위를 인코팅하는 단일 전사 단위의 전사에 의하여 생성된다. 도 8은 본 발명의 이러한 일 실시예를 도시한다. 지시된 것과 같이, 제 1 및 제 2 상보성 부위를 포함하며, 선택적으로 루프 부위를 포팜하는 주형가 사용된다. 이러한 주형는 적절한 프로모터의 선택(그리고 선택적으로 다른 조절인자, 예컨대 종결인자)와 함께 시험관 안에서의 또는 생체 안에서의 전사에 사용될 것이다. 본원 발명은 하나 또는 그 이상의 siRNA 가닥을 인코딩하는 구조체를 포괄한다.

시험관 안에서의 전사는 T7, SP6, 및 T3 프로모터/중합효소 시스템 (예컨대, Promega, Clontech, new England Biolabs, 등으로 부터 상업적으로 입수 잠재성)을 포함하는 다양한 입수 잠재성 시스템을 사용하여 수행될 것이다. 이 분야의 당업자에 의하여 이해되는 바와 같이, T7 또는 T3 프로모터의 사용은 대체로 5' 말단에 2 G 잔기를 갖는 siRNA 서열을 요구하는 반면, SP6 프로모터의 사용은 대체로 그것의 5' 말단에 GA 서열을 갖는 siRNA 서열을 요구한다. T7, SP6, 또는 T3 프로모터를 포함하는 벡터가 이 분야에 공지되어 있으며 siRNA의 전사를 유도하도록 쉽게 변형될 수 있다. siRNA가 시험관 안에서 합성되는 경우, 그들은 대상에 전이 또는 전달되기 전에 하이브리드 될 것이다. 본 발명의 siRNA 조성물은 전체적으로 이중-가닥 (하이브리드된) 분자로 구성될 필요가 없다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들면, siRNA 조성물은 소 부분의 단일-가닥d RNA를 포함할 것이다. 이것은, 예를 들면, 하이브리드된 그리고 하이브리드되지 않은 분자 사이의 평형의 결과로서, 센스 및 안티센스 RNA 가닥의 동일하지 않은 비율 때문에, 자기 보수성 RNA의 모든 부분의 합성 전의 전사의 종결 때문에, 등등에 의하여 일어날 것이다. 일반적으로 바람직한 조성물은 적어도 대략 80%의 이중-가닥 RNA, 적어도 대략 90%의 이중가닥 RNA, 적어도 대략 95%의 이중-가닥 RNA, 또는 심지어 적어도 대략 99-100%의 이중-가닥 RNA를 포함한다. 그러나 siRNA 조성물은 효과적인 충분한 이중-가닥 RNA을 함유할 것을 조건으로 80% 미만의 하이브리드된 RNA을 함유할 것이다.

이 분야의 당업자는 본 발명의 siRNA 또는 shRNA 제제가 생체 안에서 생성되도록 하는 경우, 하나 또는 그 이상의 전사 단위의 전사를 통하여 생성되는 것이 일반적으로 바람직하다는 것을 이해할 것이다. 일차 전사체는 유전자 억제를 수행하는 최종 제제를 생성하기 위하여 선택적으로 가공될 것이다. (예컨대, 하나 또는 그 이상의 세포 효소에 의하여) 포유류 세포에서 관련 전사 단위의 발현을 허용하도록 적절한 프로모터 및/또는 조절 인자가 쉽게 선택될 수 있다는 것 또한 이해될 것이다. 본 발명의 일부 실시예에서, 조절 잠재성 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다; 다른 실시예에서, 구조적 발현이 바람직하다. siRNA 또는 siRNA 전구체의 합성(전사)를 지시하는 여기서 사용되는 "발현" 이라는 용어는 전사된 RNA의 해독을 의미하지 않음을 유의해야 한다.

본 발명의 일부 바람직한 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 siRNA 또는 shRNA 전사 단위의 생체 안에서의 발현을 유도하기 위하여 사용되는 프로모터는 RNA 중합효소 III (Pol III)를 위한 프로모터 이다. Pol III는 주형에서 4-5 T 잔기의 스트레치를 만자면 종결하는 소 전사체의 합성을 유도한다. U6 또는 H1 프로모터와 같은 특정 Pol III 프로모터는 전사된 부위에서 시스-작용(cis-acting) 조절 인자 (제 1 전사된 뉴클레오티드가 아닌)를 요구하지 않으며, 따라서 그들은 요구되는 siRNA 서열의 선택을 허용하므로 본 발명의 특정 실시예에 따르면 바람직하다. 자연에 존재하는 U6 프로모터의 경우, 제 1 전사된 뉴클레오티드는 구아노신이며, 자연에 존재하는 H1 프로모터의 경우, 제 1 전사된 뉴클레오티드는 아데닌이다. (예컨대, Yu, J., et al., Proc. Nad. 4cad. Sci., 99(9), 6047-6052 (2002); Sui, G., et al., Proc. Nad. Acad ScL, 99(8), 5515-5520 (2002); Paddison, P., et al., 유전자s and Dev., 16, 948-958 (2002); Brummelkarnp, T., et al., Science, 296, 550-553 (2002); Miyagashi, M. and Taira, K., Nat Biotech., 20, 497-5 00 (2002); Paul, C., et al., Nat. Biotech. 20, 505-508 (2002); Tuschl, T., et al., Nat. Biotech., 20, 446-448 (2002)참조). 따라서 본 발명의 일부 실시예에서, 예컨대, 전사가 U6 프로모터에 의하여 진행되는 경우, 바람직한 siRNA 서열의 5- 뉴클레오티드는 G이다. 본 발명의 다른 일부 실시예에서 예컨대, 전사가 Hl 프로모터에 의하여 진행되는 경우, 5' 뉴클레오티드는 A이다.

본 발명의 일부 실시예에 따르면, Pol II를 위한 프로모터 또한 예를 들면, in Xia, H., et aL, Nat. BiotechnoL, 20, pp. 1006.1010, 2002에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 여기 개시된 바에 따르면, 헤어핀서열이 전사 개시 부위에 가깝게 근접하여 병치되며 폴리A 카세트가 수반되어, 전사된 헤어핀의 비-돌출(no overhang)을 최소화 하는 구조체가 사용될 것이다. 본 발명의 일부 실시예에서 전술한 조건을 만족시킨다면 조직-특이성, 세포-특이성, 또는 유도 잠재성 Pol II 프로모터가 사용될 것이다. 또한, 본 발명의 일부 실시예에서 Pol I를 위한 프로모터가 예를 들면, (McCown 2003)에 개시된 바와 같이 사용될 것이다.

도 7 및 8에 도시된 것과 같은 siRNA 또는 shRNA의 합성을 위한 주형를 제공하는 구조체의 생체 안에서의 발현이 구조체를 예를 들면, DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 도입하고, 벡터를 포유류 세포에 도입함으로써 바람직하게 수행될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 실시예에서는 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 하나 또는 그 이상의 세포에 구조체를 전달할 수 있는 벡터를 선택하는 것이 바람직하지만, 다양한 벡터가 선택될 것이다. 본원 발명은 siRNA 및/또는 shRNA 전사 단위를 함유하는 벡터, 그리고 이러한 벡터를 함유하는 세포 또는 하나 또는 그 이상의 siRNA 또는 shRNA 가닥을 인코드하는 전사 단위를 함유하도록 조작된 세포를 포괄한다. 본 발명의 일부 바람직한 실시예에서, 본 발명의 벡터는 포유류 세포 (예컨대, 가축 포유류의 세포), 그리고 가장 바람직하게는 인간 세포에 구조체를 발현하는 siRNA 또는 shRNA의 전달에 적절한 유전자 치료 벡터이다. 이러한 벡터는 인플루엔자 바이러스에 노출되기 전이나 또는 그 후에 예방 또는 질병 및 바이러스 감염으로 인한 증상 처치를 위하여 대상에 투여될 것이다. 본 발명의 RNAi-유도 벡터는 이하에서 설명되는 다양한 운반제를 포함하는 조성물로 전달될 것이다.

본 발명은 그러므로 세포 내에 존재하여, 세포 내에서 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 전사체 의 발현을 억제하는 shRNA 또는 siRNA를 형성하도록 자가하이브리드 또는 상호 하이브리드되는 하나 또는 그 이상의 RNA의 전사를 유도하는 다양한 바이러스 및 비-바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명의 일부 실시예에서 2개의 분리된, 상보성 siRNA 가닥은, 각각 단일 siRNA 가닥의 전사를 지시하는 두 프로모터를 함유하는, 즉 siRNA를 위한 주형에 작동 가능하게(operably) 연결되어 전사가 일어나는, 단일 벡터를 사용하여 전사된다. 두 프로모터는 동일한 방향일 수 있으며, 이 경우 각각은 siRNA 가닥의 하나를 위한 주형에 작동 가능하게(operably) 연결된다. 다른 방법으로, 프로모터는 단일 주형를 플랭킹(flanking)하는 반대 방향일 수 있으며, 따라서 프로모터으로 부터의 전사는 두 상보성 RNA 가닥의 합성을 유도한다.

본 발명의 다른 실시예에서 두 상보성 부위 (예컨대, shRNA)를 포함하는 단일 RNA 분자의 전사를 진행하는 프로모터를 함유하는 벡터가 사용된다. 본 발명의 일부 실시예에서, 각각 두 상보성 부위를 포함하는 단일 RNA 분자의 전사를 진행하는 다중 프로모터를 함유하는 벡터가 사용된다. 다른 방법으로는, 단일 프로모터 또는 다중의 프로모터로 부터 다중의 상이한 shRNA가 전사된다. 다양한 배열이 가능하다. 예를 들면, 단일 프로모터는 다중의 자가-상보성 부위를 함유하며, 각각 복수의 스템루프 구조를 생성하도록 하이브리드되는 단일 RNA 전사체의 합성을 지시할 것이다. 이들 구조는 생체 안에서 예컨대, DICER에 의하여, 다중의 상이한 shRNA를 생성하도록 분열될 것이다. 이러한 전사체는 바람직하게는 전사체의 3' 말단에 종결 시그날을 함유하며, 그러나 개별적인 shRNA 단위 사이에는 함유하지 않는다는 것이 이해될 것이다. 또한, 다중의 siRNA가 생성될 수 있는 단일 RNA는 생체 안에서 생성될 필요는 없으나 대신 시험관 안에서의 전사를 사용하여 화학적으로 합성되거나 제조되며 외생적으로 제공된다는 것이 이해될 것이다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 벡터는 각각 shRNA를 형성하도록 하이브리드 되는 자기 보수성 RNA 분자의 합성을 지시하는 다중의 프로모터를 포함한다. 이 다중의 shRNA는 모두 동일한 전사체를 목적으로 하거나, 또는 상이한 전사체를 목표로 할 것이다. 바이러스 전사체의 조합이 표적화된다. 실시예 11은 본 발명의 일부 실시예에 따른 인플루엔자 바이러스 감염의 억제를 위한 DNA 벡터로부터 전사된 shRNA의 설계 및 테스트의 세부사항을 제공한다. 도 21 또한 참조. 일반적으로, 본 발명의 일부 실시예에 따르면, 세포 내에서 발현되는 siRNA 및/또는 shRNA는 대략 19 뉴클레오티드 길이의 염기-쌍 (이중나선) 부위를 포함한다.

이 분야의 당업자는 본원 발명에 따른 siRNA 또는 shRNA의 생체 안에서의 발현은 장기간(예컨대, 몇일 이상, 바람직하게는 적어도 몇주 내지 몇 개월, 보다 바람직하게는 적어도 일년 또는 더 오래, 가능하게는 평생)에 걸쳐서 siRNA 또는 shRNA를 제조하는 세포의 제조를 허용한다는 것을 이해할 것이다. 이러한 세포는 인플루엔자 바이러스로부터 영원히 보호될 것이다.

siRNA 및 shRNA의 세포내 발현을 제공하기 위한 조성물에 사용하기 위한 바람직한 바이러스 벡터는 예를 들면, 역전사바이러스 벡터 및 렌티바러스벡터를 포함한다. 예컨대, 표면(apical surface)으로 부터 완전한 기도 상피에 효과적으로 형질 도입하는 필로바이러스 외피 단백질-슈도타입(pseudotype) HIV 벡터에 기초한 벡터를 개시하는 Kobinger, G.P.,et al., Nat Biotechno/19(3):225-30, 2001, d참조. 또한, FUGW 렌티바이러스. 벡터를 개시하는 Lois, C., et al., Science, 295: 868-,872, Feb. 1, 2002; Somia, N., et al. J Virol. 74(9): 4420-4424, 2000; Miyoshi, H., et al., Science 283: 682-686, 1999; 그리고 미국 특허 제 6,013,516호 참조

본 발명의 일부 실시예에서 벡터는 세포 내에 존재하여, 세포 내에서 적어도 하나의 전사체의 발현을 억제하는 shRNA 또는 siRNA를 형성하도록 자가-하이브리도 또는 서로 하이브리드되는 하나 또는 그 이상의 RNA의 전사를 유도하는 렌티바이러스 벡터이다. 설명의 목적을 위하여 벡터는 Rubinson, D., et al, Nature 유전자tics, Vol. 33, pp. 401-406, 2003에 개시된 것과 같은 렌티바이러스 벡터로 가정한다. 그러나,다른 역전사바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 또한 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 운반 플라스미드 또는 렌티바이러스 입자, 예컨대, 세포를 감염시킬 수 있는 렌티 바이러스이다. 본 발명의 일부 실시예에서, 렌티바이러스 벡터는 프로모터에 작동 가능하게(operably) 연결된 핵산 조각을 포함하며, 따라서 프로모터로 부터의 전사 (즉, 프로모터에 의하여 지시되는 전사)는 목표 전사체에 표적화된 shRNA를 형성하기 위하여 하이브리드되는 상보성 부위를 포함하는 RNA의 합성을 유도한다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면, shRNA는 대략 19 뉴클레오티드 길이의 염기-쌍 부위를 포함한다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 RNA는 2 이상의 상보성 부위를 포함하여, 자가-하이브리드가 루프 또는 단일-가닥 부위에 의하여 분리된 다중의 염기-쌍 부위를 유도한다. 이 염기-쌍 부위는 같은 또는 상이한 서열을 가질 것이며, 따라서 단일 전사체의 동일한 또는 상이한 부위에 또는 상이한 전사체에 표적될 것이다.

본 발명의 일부 실시예에서, 렌티바이러스 벡터는 반대 방향의 두 프로모터에 의하여 플랭킹되는(flanked) 핵산 조각을 포함한다. 여기서 프로모터는 핵산 조각에 작동 가능하게(operably) 연결되며, 그러므로 프로모터로부터의 전사는 목표 전사체에 표적화된 siRNA를 형성하도록 서로 하이브리드되는 두 상보성 RNA를 합성한다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 siRNA는 대략 19 뉴클레오티드 길이의 염기-쌍 부위를 포함한다. 본 발명의 일부 실시예에서 렌티바이러스 벡터는 적어도 두 프로모터 및 적어도 두 핵산 조각을 포함하며, 여기서 각각 프로모터는 작동 가능하게(operably) 핵산 조각에 연결되어, 프로모터로부터의 전사는 목표 전사체에 표적되는 siRNA를 형성하도록 서로 하이브리드되는 두 상보성 RNA의 합성을 유도한다.

전술한 바와 같이, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 운반 플라스미드 또는 감염성 렌티바이러스 입자 (예컨대, 렌티바이러스 또는 슈도타입 렌티바이러스)이다. 렌티바이러스 운반 플라스미드, 렌티바이러스 입자, 그리고 렌티바이러스 발현 시스템에 대한 더 자세한 사항은 예컨대, 미국 특허 제 6,013,516호 및 참조번호 113-117 참조. 이분야에 공지된 바와 같이, 렌티바이러스는 RNA 게놈을 갖는다. 그러므로, 렌티바이러스 벡터가 렌티바이러스 입자, 예컨대, 감염성 렌티바이러스인 경우, 바이러스 게놈은 RNA 전사를 지시할 수 있는 DNA를 제조하기 위하여 역전사 및 제 2 가닥 합성을 수행하여야 한다. 또한, 여기서 프로모터, 조절 인자, 등과 같은 인자를 참조하는 경우, 본 발명의 이들 인자의 서열은 렌티바이러스 입자에서 RNA 형태로 존재하며, 본 발명의 렌티바이러스 운반 플라스미드에서 DNA 형태로 존재한다는 것을 이해하여야 한다. 더욱이, RNA의 합성을 위한 주형가 렌티바이러스 입자에 존재하는 RNA에 의하여 "제공되는" 경우, RNA는 RNA의 합성을 위한 주형로서 작용할 수 있는 DNA를 제조하기 위하여 (전사) 역전사 및 제 2 가닥 합성을 수행하여야 한다는 것을 이해하여야 한다. siRNA 또는 shRNA의 합성을 위한 주형를 제공하는 벡터는 이러한 합성이 일어나는 세포에 도입되는 경우 siRNA 또는 shRNA를 제공하는 것으로 간주된다.

본 발명의 siRNA 또는 shRNA는 사용 잠재성 방법으로 세포에 도입된다. 예컨대 siRNA, shRNA, 또는 그들을 인코드하는 벡터는 전통적인 형질전환 또는 전이 기술을 통하여 세포 내로 도입될 수 있다. 여기서 사용되는, "형질전환" 및 "전이" 라는 용어는 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공침, DEAE-덱스트란-매개된 전이, 리포펙션, 주입, 또는 전기 충격법(electroporation)을 포함하는 외부 핵산 (예컨대, DNA 또는 RNA)을 세포에 도입하기 위한 다양한 공지의 기술을 지시한다. 이하에서 설명되는 바와 같이, 본 발명의 일 측면은 세포 내로 siRNA 또는 shRNA 합성을 위한 주형를 제공하는 siRNA, shRNA, 그리고 또는 벡터 (DNA 벡터 또는 바이러스 벡터)를 도입하기 위하여, 양이온성 중합체; 아르기닌-풍부 펩티드, 히스티딘-풍부 펩티드, 그리고 양이온성 및 중성 지질을 포함하는 다양한 펩티드 분자 운반체; 다양한 비-양이온성 중합체; 리포좀; 탄수화물; 그리고 계면활성 물질에 제한되는 것은 아니나, 이들을 포함하는 다양한 운반제의 사용을 포함한다. 본 발명은 또한 이하에서 설명되는 바와 같이, 다양한 방법으로, 예컨대 운반제에 전달 증진 성분을 첨가함으로써 변형된, 운반제의 사용을 포괄한다.

본원 발명은 본 발명의 siRNA 또는 shRNA의 합성을 위한 주형를 제공하는 본 발명의 siRNA, shRNA, 또는 벡터를 함유하도록 조작된 세포를 포괄한다. 바람직하게는, 이 세포는 포유류 세포, 특히 인간 세포이다. 가장 바람직하게는 이 세포는 호흡기 상피 세포이다. 선택적으로, 이러한 세포는 또한 인플루엔자 바이러스 RNA를 함유한다. 본 발명의 일부 실시예에서, 이 세포는 유기체 중 비-인간 세포이다. 예를 들면, 본원 발명은 본 발명의 siRNA 또는 shRNA를 함유 또는 발현하도록 조작된 유전자 도입 동물을 포괄한다. 이러한 동물은 본 발명의 siRNA 및 shRNA의 기능 및/또는 활성의 연구, 및/또는 인플루엔자 바이러스 감염/복제 시스템의 연구에 유용하다. 여기서 사용되는 "유전자 도입 동물"은 하나 또는 그 이상의 세포가 전이유전자를 포함하는 인간이 아닌 동물이다. 전이유전자는 바람직하게는 유전자 도입 동물의 세포의 게놈에 통합되거나 여기에서 일어나는 외인성 DNA이거나 예컨대 내인성 크로모좀 DNA의 결실과 같은 재배열이다. 전이유전자는 유전자 도입 동물의 하나 또는 그 이상의 세포 타입 또는 조직에서 인코드된 siRNA 생성물의 발현을 지시할 수 있다. 바람직한 유전자 도입 동물은 인간이 아닌 포유류ㅡ 보다 바람직하게는 쥐 또는 마우스 같은 설치류이다. 유전자 도입 동물의 다른 예시에는 인간이 아닌 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭과 같은 새, 양서류 등이 포함된다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 가능성 인플루엔자 치료의 가능성을 테스트하기 위하여 동물 모델로서 다양한 유전자 도입 동물이 사용된다. (예컨대, 쥐과, 페렛, 또는 영장류)

III. 바이러스 RNA 축적의 광범위한 억제

유전자 발현의 RNAi-매개된 억제의 일반적 특성의 하나는 그것의 특이성이다. 다시 말해서, 특정 전사체 서열에 표적화된 siRNA는 대체로 다른 전사체의 분해를 초래하지 않는다. 그러나 실시예 6에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 NP, PA, 또는 PB I 전사체에 표적화된 siRNA는 NP 또는 PA 서열에 연관도지 않는 서열을 갖는 RNA를 포함하는 다른 바이러스 RNA의 감소된 농도를 초래한다는 것을 발견하였다. 또한, 실시예 5서 나타난 바와 같이, siRNA의 직접 목표는 바이러스 mRNA인 것으로 보이는 반면, NP, PA에 표적화된 siRNA의 투여는 NP 또는 PA mRNA의 축적 억제 이외에도 대응되는 vRNA 및 cRNA의 축적을 억제하였다. 실시예 7에 나타난 바와 같이, 이들 효과는 인터페론 반응 또는 바이러스 전사체의 바이러스-매개된 분해에 의한 것이 아니다. 더욱이, 이 효과는 다양한 세포성 전사체에 효과가 없거나 적었으므로 바이러스 전사체에 특이적이었다. 이 효과를 매개하는 잠재성 메카니즘이 실시예 6에서 논의된다. 정확한 메카니즘과 관계없이, 이러한 발견은 제 2 전사체에 표적화된 siRNA의 투여가 특정 조건 하에서 또한 제 1 전사체 또는 예를 들면, 제 2 전사체에 대한 동일성 또는 상동성이 현저히 부족한 제 1 전사체를 포함하는, siRNA가 표적되지 않은 전사체에 작용할 수 있다는 것을 증명한다. 특히, 이것은 제 2 전사체 (또는 가능하게는, 전사체 자체)에 의하여 인코드된 단백질이 제 1 전사체의 합성, 가공, 또는 안정성에 연관되는 경우에 일어난다.

따라서 본 발명은 제 2 전사체에 표적화된 siRNA를 투여하는 것을 포함하는 제 1 전사체의 억제 방법을 제공한다. 여기서 제 2 전사체의 억제는 제 1 전사체의 억제를 초래한다. . 일반적으로, 제 1 및 제 2 전사체는 표적화된 제 2 전사체의 적어도 일부분에 걸쳐서 비-동일성이며 비-상동성이다. 그러나 본 발명의 다양한 실시예에서 제 1 및 제 2 전사체는 표적화된 제 2 전사체의 일부분에 걸쳐서 상동성 또는 동일성 부위를 공유한다. (예컨대, siRNA의 19 뉴클레오티드 이중나선 부분에 대응되는 일부분). 만약 siRNA가 제 1 전사체에 적어도 5 연속 뉴클레오티드 동일성 부위를 포함하지 않으면, siRNA는 제 1 전사체에 표적되지 않는다. 일반적으로, 제 2 전사체에 표적화된 siRNA는 제 1 전사체에 표적되지 않는다. 만약 공유되는 상동성 또는 동일성 부위가 존재하는 경우, 이러한 부위는 목표 서열의 일부 또는 전부를 포함하나, 반드시 그래야 하는 것은 아니다. 적절한 제 2 전사체 (목표 전사체)는 RNA-결합 단백질 또는 RNA 안정화 역할을 하는 다른 단백질과 같은 단백질을 인코드하는 것들을 포함한다. 일반적으로, "억제"는 전사체의 용량 및 정도의 감소를 지시한다. 그러나 다른 억제 메카니즘 또한 포함된다. 억제 방법은 직접 또는 간접적이다.

실시예 6에 기술된 바와 같이, 이론에 억매이지 않으면서 본 발명자들은 NS, M, NS, PB 1, PB2, 및 PA 유전자 전사체의 mRNA, vRNA, 및 cRNA의 축적 정도를 감소시키기 위하여 NP에 표적화된 전사체의 능력은 아마도 이들 전사체의 결합 및 안정화에서의 NP 단백질의 중요성의 결과이며, NP-특이적 siRNA가 RNA 분해를 비-특이적으로 목표하기 때문이 아닐 것이라는 것을 제안한다. 또한, 이론에 억매이지 않으면서 본 발명자들은 NS, M, NS, PB 1, PB2, 및 PA 유전자 전사체의 mRNA, vRNA, 및 cRNA의 축적의 정도를 감소시키기 위한 PA에 표적화된 전사체의 능력은 아마도 바이러스 전사체의 합성에서 PA 단백질의 중요성의 결과일 것이며, PA-특이성 siRNA가 비-특이적으로 RNA 분해 목표하기 때문은 아닐 것이라는 것을 제안한다. PA-특이성 siRNA의 존재 하에서, 새롭게 5 전사된 PA mRNA는 분해되며, PA 단백질 합성의 억제를 초래한다. 인플루엔자 비리온 (1)당 대략 30 - 60 카피의 PA 단백질 (RNA 전사효소)이 존재함에도 불구하고, 새롭게 합성된 PA 단백질 없이, 더 이상의 바이러스 전사 및 복제 억제되는 것 같다. 특별히 표적되지 않은 전사체 정도의 감소를 일으키는 특정 siRNA의 능력은 다른 시스템에서는 증명되지 않은 것으로 생각된다.

본 발명자들은 다른 RNA 분자의 안정화 또는 RNA 합성에 작용하는 단백질을 인코드하는 목표 전사체는 감염성 병원체의 성장, 복제, 감염도, 등등의 억제를 위한 바람직한 목표라는 것을 인식하였다. 따라서 본 발명은 목표 전사체에 표적화된 siRNA를 투여하는 것을 포함하는 감염성 병원체의 성장, 감염도, 또는 복제의 억제 방법을 제공한다. 여기서 목표 전사체의 억제는 적어도 하나의 다른 전사체의 억제를 유도하며, 여기서 이러한 다른 전사체는 병원체-특이성이다. 목표 전사체는, 반드시 그래야 하는 것은 아니지만, 병원체-특이적 전사체이다. 적어도 하나의 다른 전사체는, 반드시 그래야 하는 것은 아니지만, 목표 전사체와 상동성 또는 동일성 부위를 공유한다. 만약 공유하는 상동성 또는 동일성 부위가 존재하는 경우, 이러한 부위는, 반드시 그래야 하는 것은 아니지만, 목표 서열의 일부 또는 전부를 포함한다. 적절한 목표 전사체는 RNA-결합 단백질 또는 RNA 안정화에 작용하는 다른 단백질과 같은 단백질을 인코드하는 것들을 포함한다. 적절한 목표 전사체는 또한 예컨대, 중합효소, 역전사효소, 등등과 같은 RNA 합성 또는 가공에 작용하는 것들을 포함한다.

여기서 개시된 결과는 일반적으로 병원체 특이성 핵산 (DNA 또는 RNA)에 결합하는 RNA 또는 DNA 결합 단백질을 인코드하는 전사체에 표적화된 siRNA는 일반적으로 표적화된 RNA의 정도를 단순히 감소시키기 보다는 광범위한 효과(예컨대, 다른 병원체-특이성 전사체에 대한 효과)를 갖는다는 것을 제안한다. 유사하게, 여기서 개시된 결과는 감염성 병원체의 중합효소 유전자 (RNA 중합효소, DNA 중합효소, 또는 역전사효소)에 표적화된 siRNA는 일반적으로 단순히 중합효소 RNA의 정도를 감소시키기 보다는 광범위한 효과(예컨대, 다른 병원체-특이성 전사체에 대한 효과)를 갖는다는 것을 제안한다.

숙주 세포의 것이 아닌 특히 감염성 병원체의 RNA를 안정화 하는 단백질을 인코드 하는 목표 전사체는 숙주 세포 전사체의 정도에 영향을 주지 않는 반면 병원체-특이성 전사체의 정도를 선택적으로 감소시키기 위한 기회를 제공한다. 따라서 이러한 siRNA의 전달은 숙주 유기체의 세포에 부작용을 일으키지 않을 것이다. 이러한 접근 방식은 숙주 세포의 것 보다는 특히 감염성 병원체의 RNA를 안정화하는 단백질을 인코드하는 전사체에 제한되지 않으며, 또한 숙주 세포 전사체보다는 병원체-특이성 전사체 (즉, 숙주 세포의 게놈보다는 병원체의 게놈의 일부인 주형를 갖는 전사체)의 가공, 합성, 및/또는 해독의 측면에서 특히 연관되는 단백질을 인코드하는 전사체에 적용된다. 이러한 단백질은, 다음에 한정되는 것은 아니나, 합성, 절단접합, 또는 캡핑 병원체-특이성 전사체에 연관되지만, 숙주 세포 전사체에 연관되지 않는 단백질을 포함한다.

IV. 억제 인플루엔자 바이러스를 억제하는 siRNA 및 shRNA의 확인 및 테스트

전술한 바와 같이, 본원 발명은 인플루엔자 바이러스 감염 및/또는 복제의 억제제로서 유용한 siRNA를 확인하는 시스템을 제공한다.

전술한 바와 같이, shRNA는 shRNA의 스템 구조로서 동일한 서열과 이중나선 부분을 갖는 siRNA를 제조하기 위하여 세포내에서 가공되므로, 이 시스템은 인플루엔자 바이러스 감염의 억제제로서 유용한 shRNA를 확인하기 위하여 동등하게 유용하다. 설명의 위한 목적으로 이 구역은 siRNA를 지시한다. 그러나 이 시스템은 또한 대응되는 shRNA를 포괄한다. 특히, 본원 발명은 바이러스 감염 및/또는 복제의 차단 및 억제를 위하여 바이러스 유전자에 표적화된 siRNA의 성공적인 제조를 입증한다. 여기서 개시된 기술 및 시약은 다른 유전자 또는 유전자 부위에 표적화된 잠재성 새로운 siRNA의 설계에 쉽게 적용될 수 있으며, 여기서 개시된 바와 같은 인플루엔자 바이러스 감염 및/또는 복제의 억제 활성이 테스트될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 계속 변이할 것이며 재배열이 수행될 것으로 예측되며 따라서 새로운, 상이하게 표적화된 siRNA를 계속 개발하고 테스트하는 것이 바람직할 것이다.

본 발명의 다양한 실시예에서, 잠재성 인플루엔자 바이러스 억제제는 인플루엔자 게놈 또는 그들의 일부분으로 전이되기 전에, 동시에, 또는 그 후에 (예컨대, 수 분, 수 시간, 또는 대부분 수 일 내) 또는 인플루엔자 바이러스로 감염되기 전, 동시에 또는 그 후에 후보 siRNA(s)를 세포에 도입함으로써 (예컨대, 외인성 투여로 또는 세포로 siRNA의 내인성 합성을 지시하는 벡터 또는 구조체를 도입함으로써) 테스트될 수 있다. 다른 방법으로는, 가능성 인플루엔자 바이러스 억제제는 인플루엔자 바이러스로 생산적으로 감염된 (즉, 후대 바이러스를 제조하는 세포) 세포에 후보 siRNA(s)를 도입함으로써 테스트될 수 있다.

목표 전사체 정도를 감소시키는 것에 대한 및/또는 바이러스 복제, 병원성, 및/또는 감염도와 같은 바이러스 생명 주기의 특성의 하나 또는 그 이상의 측면을 억제 또는 진압하는 것에 대한 후보 siRNA(s)의 능력이 그 후 평가된다. 예를 들면, 바이러스 입자의 제조 및/또는 바이러스 단백질의 제조, 등등이 이분야에 공지된 방법으로 직접적으로 또는 간접적으로 평가될 수 있다.

본 발명의 siRNA 조성물이 전달된 세포가 (테스트 세포) 유사한 또는 본 발명의 조성물을 받지 않은 비교 잠재성 세포(대조군 세포, 예컨대, siRNA를 받지 않거나 또는 GFP와 같은 비-바이러스 전사체에 표적화된 siRNA와 같은 대조군siRNA를 받은 세포)와 비교된다. 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 테스트 세포의 감수성은 감염에 대한 대조군 세포의 감수성과 비교될 수 있다. 바이러스 단백질(s) 및/또는 후대 바이러스의 제조가 테스트 세포에서 대조군 세포에 대하여 비교될 수 있다. 바이러스 감염도, 복제, 병원성, 등등의 다른 지표가 유사하게 비교될 수 있다. 표준의 시험관 안에서의 항바이러스 분석은 바이러스 프라그의 억제, 바이러스 세포 변성 효과 (CPE), 그리고 바이러스 헤마글루티닌 또는 다른 단백질, 바이러스 수율의 억제, 등등을 이용한다. CPE는 염료에 의하여 가시적으로 측정될 수 있다. 예컨대, Sidwell, R.W. and Smee, D.F, "인플루엔자 바이러스 억제제 연구를 위한 시험관 안에서의 그리고 생체 안에서의 분석 시스템" Antiviral Res 2000 Oct;48(l):1-16, 2000 참조. 일반적으로, 테스트 세포 및 대조군 세포는 동일한 종으로 부터의 유사한 또는 같은 세포 타입의 것이다. 예를 들면, 동일한 세포 주로 부터의 세포들의 비교될 수 있다. 테스트 세포가 일차 세포인 경우, 대체로 대조군 세포 또한 일차 세포이다. 대체로 동일한 인플루엔자 바이러스 균주가 테스트 세포 및 대조군 세포를 비교하기 위하여 사용된다.

예를 들면, 실시예 2에 개시된 바와 같이, 인플루엔자 바이러스 제조 억제 에 대한 후보 siRNA의 능력은 (i) 후보 siRNA를 세포에 전달하고 (인플루엔자 바이러스에 노출 전에, 동시에 또는 그 후에); (ii) 헤마글루티닌 분석법을 사용하여 바이러스 헤마글루티닌의 제조를 평가하고, 그리고 (iii) siRNA 존재 하에 제조된 헤마글루티닌의 용량을 siRNA 없이 제조된 용량과 비교함으로써 편리하게 측정된다. (이 테스트는 siRNA이 없는 대조군을 포함할 필요는 없으나 억제 없이 제조된 헤마글루티닌의 용량과 관련한 사전 정보를 이용한다.) 헤마글루티닌 용량의 감소는 바이러스 생성의 감소를 강력히 제안한다. 이 분석법은 모든 바이러스 전사체를 목표하는 siRNA의 테스트에 사용되며 바이러스 헤마글루티닌를 인코드하는 전사체를 목표하는 siRNA에 제한되는 것은 아니다.

목표 전사체의 정도를 감소시키는 것에 대한 후보 siRNA의 능력 또한 예를 들면, 노던 블럿(Northern blots), 뉴클레아제 보호 분석법s, 역전사 (RT)- PCR, 실시간 RT-PCR, 마이크로어레이 분석법, 등등을 사용하여 목표 전사체의 용량을 측정함으로써 평가된다. 목표 전사체에 의하여 (전사 단계 또는 또는 전사-후 단계에서)인코드되는 폴리펩타이드의 생성 억제에 대한 후보 siRNA 의 능력은 웨스턴 블럿, 면역분석법s, ELISA, 유세포분석기법, 단백질 마이크로어레이, 등등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항체-기초 접근 방법을 사용하여 측정된다. 일반적으로, 목표 전사체 또는 목표 전사체에 의하여 인코드되는 폴리펩타이드의 용량을 측정하는 모든 방법이 사용된다.

일반적으로, 특정한 바람직한 인플루엔자 바이러스 억제제는 억제제의 부재 하에서 존재하는 정도에 비하여 (예컨대, 비교할 수 있는 억제제가 부족한 대조군 세포) 목표 전사체의 정도를 적어도 약 2 배, 바람직하게는 적어도 약 4 배, 보다 바람직하게는 적어도 약 8 배, 적어도 약 16 배, 적어도 약 64 배 또는 그 이상의 정도로 감소시킨다. 일반적으로, 특정의 바람직한 인플루엔자 바이러스 억제제는 바이러스 복제를 억제하여, 억제제를 함유하는 세포에서 복제의 정도가 억제제를 함유하지 않는 대조군 세포보다 적어도 약 2 배, 바람직하게는 적어도 약 4 배, 보다 바람직하게는 적어도 약 8 배, 적어도 약 16 배, 적어도 약 64 배, 적어도 약 100 배, 적어도 약 200 배, 또는 그 이상으로 감소한다. 특히, 실시예 2에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 헤마글루티닌의 생성에 의하여 측정되는 바이러스 역가가 단일 투여량의 siRNA (PBI-2257)가 투여된 인플루엔자 바이러스 균주 A/PR/8/34 (HlNl)로 감염된 세포에서 256 배 이상 감소되었으며, 단일 투여량의 siRNA (NP-1496 및 다른)가 투여된 인플루엔자 바이러스 균주 A/WSN/33 (HlNl)로 감염된 세포에서 120배 이상 감소되었음을 보여주었다. MOI 0.001에서 프라그 분석법으로 측정되는 경우, 배가되는 억제는 더 컸다. 즉, 적어도 약 30,000 배. 심지어 MOI 0.1에서, NP-1496 억제된 바이러스 제조는 약 200-배였다.

특정의 바람직한 인플루엔자 바이러스 억제제는 바이러스 복제를 억제하여 siRNA의 투여 및 세포의 감염 후 적어도 24 시간, 적어도 36 시간, 적어도 48 시간, 또는 적어도 60 시간 동안 검출 잠재성 바이러스 역가의 발전이 방지된다. 특정의 바람직한 인플루엔자 바이러스 억제제는 siRNA 투여 후 적어도 24 시간, 적어도 36 시간, 적어도 48 시간, 또는 적어도 60 시간 동안 바이러스 복제를 방지하거나 (즉, 검출되지 않는 정도로 감소시키거나) 또는 현저히 감소시킨다. 본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 바이러스 복제의 현저한 감소는 siRNA의 부재 하에서 일어나는 정도의 대략 90% 미만으로 감소, siRNA의 부재 하에서 일어나는 정도의 대략 75% 미만으로 감소, siRNA의 부재 하에서 일어나는 정도의 대략 50% 미만으로 감소, siRNA의 부재 하에서 일어나는 정도의 대략 25% 미만으로 감소, 또는 siRNA의 부재 하에서 일어나는 정도의 대략 10% 미만으로의 감소이다. 바이러스 복제의 감소는 HA 역가의 측정에 한정되지 않는 모든 적절한 방법을 사용하여 측정될 것이다.

잠재성 인플루엔자 바이러스 억제제는 또한 개발된 다양한 동물 모델을 사용하여 테스트될 수 있다. 후보 siRNA(s), 구조체 또는 후보 siRNA를 함유하도록 조작된 숙주 세포, 또는 세포 내에서 이러한 siRNA의 합성을 지시할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물이 인플루엔자 바이러스로 감염 전에, 동시에 또는 감염 후에 동물에 투여된다. 바이러스 감염을 예방하는 및/또는 인플루엔자-관련 증상의 출현을 지연시키거나 예방하는 및/또는 그들의 중증도를 경감시키는 것에 대한 조성물의 능력이 잠재성 인플루엔자 억제제를 수여받지 않은 인플루엔자-감염된 동물에 비하여 평가되었다. 이러한 모델은 제한적인 것은 아니지만 인플루엔자 감염에 대한 쥐과, 닭, 페렛, 인간이 아닌 영장류 모델을 포함하며, 이들 모두는 이 분야에 공지되어 있으며 잠재성 인플루엔자 치료학 및 백신의 효능 테스트에 사용된다. 예를 들면 위에서 참고한 Sidwell, R.W. 및 Smee, D.F, 참조. 이러한 모델은 자연적으로 존재하는 인플루엔자 바이러스 균주 및/또는 특정 숙주 내에 존재하도록 변형 또는 적응된 균주 (예컨대, 쥐에서 복재를 위하여 적응된 WSN 또는 PR8 균주)의 사용과 관련된다. 시험관 안에서의 그리고 생체 안에서의 siRNA 조성물의 테스트를 위한 방법에 대한 더 상세한 논의는 실시예 6, 7, 8, 9, 및 10참조.

V. siRNA, shRNA, 및 RNAi-유도 벡터의 개선된 전달을 위한 조성물

본 발명자들은 일반적으로 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료를 포함하는 효과적인 RNAi 치료법은 손상되지 않은(intact) 유기체에서 siRNA, shRNA, 및/또는 RNAi-유도 벡터를 세포에 효과적으로 전달함으로써 개선될 것이라는 것을 인식하였다. 인플루엔자 바이러스의 경우, 이러한 제제는 인플루엔자 감염이 일반적으로 일어나는 호흡기 세포에 도입되어야 한다. 인간에서 사용하기 위하여, siRNA 또는 shRNA의 세포내 섭취를 촉진시키는 비-바이러스 방법을 적용하는 것이 바람직하다. 본 발명은 그러므로 손상되지 않은(intact) 유기체, 예컨대, 포유류 및 조류 세포에 siRNA, shRNA, 및/또는 RNAi-유도 벡터의 개선된 전달을 위한 다양한 비-바이러스 운반제를 포함하는 조성물을 제공한다. 여기서 사용되는 "전달"이라는 개념은, siRNA, shRNA, 또는 벡터의 세포 섭취 및 세포내 RNAi 설비에 적용 가능한 siRNA 또는 shRNA를 만드는 것과 연관된 다른 부수적인 단계(예컨대, 엔도좀으로부터 siRNA 또는 shRNA의 방출)이외에도, 체내로 들어오는 부위로 부터 세포가 작용하는 장소까지 siRNA, shRNA, 또는 RNAi-유도 벡터의 수송을 포함한다.

본 발명 그러므로 siRNA, shRNA와 같은 RNAi유도제, 또는 세포 내에서 siRNA 또는 shRNA의 제조를 유도하는 RNAi-유도 벡터를 포함하며, 여기서 siRNA 또는 shRNA는 인플루엔자 바이러스 전사체에 표적되며, 그리고 다음에 한정되지 않으나, 양이온성 중합체, 변형된 양이온성 중합체, 펩티드 분자 운반체 (아르기닌 또는 히스티딘-풍부 펩티드 포함), 지질 (양이온성 지질, 중성 지질, 그리고 이들의 조합 포함), 리포좀, 리포폴리플렉스, 비-양이온성 중합체, 폐에 도입하기에 적절한 계면활성제 등등을 포함하는 다양한 다양한 운반제를 포함하는 조성물을 포괄한다. (전술한 그리고 다른 곳의 "여기서" 이하의 절은 세포 내에서 벡터의 존재의 결과로서 제조되는 것 이외에 조성물 내의 siRNA 또는 shRNA을 지시하는 의도로 사용된다.) 일부 운반제는 세포 내에서 억제 인플루엔자 바이러스 전사의 억제를 위하여 세포 내로 siRNA, shRNA, 또는 RNAi-유도 벡터의 전달 또는 선택적인 전달을 증가시키기 위한 성분을 편입시키기 위하여 변형된다. 본 발명의 일부 실시예에서 운반제는 생분해성이다. 본원 발명에 적절한 일부 운반제는 이하에서 설명되며, 본 출원과 동일자로 출원된 미국 특허 출원 "Compositions and Methods for Delivery of Short Interfering RNA and Short Hairpin RNA to Mammals", 에도 설명되고 있으며 이것은 여기 참조문헌으로서 편입된다.

A. 양이온성 중합체 및 변형된 양이온성 중합체

양이온성 중합체-기초 시스템이 DNA 전이를 위한 담체로서 조사되었다 (35). 양이온성 중합체의 DNA의 세포 내 섭취를 증진시키는 능력은, 보다 효과적인 세포 이물 흡수를 위하여 DNA에 결합하여 큰 플라스미드 DNA 분자를 더욱 작은 DNA/중합체 복합체로 응축하는 그들의 능력으로 부터 부분적으로 도출되었다. DNA/양이온성 중합체 복합체는 또한 생물 접착제로서 작용하는데, 이는 그들이 세포 표면 글리코프로테인의 음으로 하전된 시알산과 정전기적으로 상호작용하기 때문이다. (36). 또한, 일부 양이온성 중합체는 분명히 엔도좀의 막 붕괴 증진시키며 그러므로 세포질로 DNA의 방출을 증진시킨다 (32). 본 발명은 그러므로 (i) 인플루엔자 바이러스 전사체에 표적화된 RNAi-유도 물질(entity) 및 (ii) 양이온성 중합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 포유류 대상에 인플루엔자 바이러스 전사체에 표적화된 RNA 유도 물질(entity)를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 목표 유전자 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 포유류 대상에 인플루엔자 바이러스 전사체를 목표하는 RNA-유도 물질(entity) 및 양이온성 중합체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 실시예에서 RNAi-유도 물질(entity)는 siRNA, shRNA, 또는 RNAi-유도 벡터이다.

일반적으로 양이온성 중합체는 예컨대, 대략 pH 7.0 ~ 7.6, 바람직하게는 대략 7.2 ~ 7.6, 보다 바람직하게는 대략 7의, 대략적인 생리학적 pH에서 양성으로 하전되는 중합체이다. 이러한 양이온성 중합체에는 다음에 제한되는 것은 아니나, 폴리리신 (PLL), 폴리아르기닌 (PLA), 폴리히스티딘, 예를 들면, (76)에 개시된 선형 PEI 및 저 분자량 PEI을 포함하는 폴리에틸렌이민 (PEI) (37), 폴리비닐피롤리돈 (PVP) (38), 그리고 키토산 (39, 40)이 포함된다. 이들 중합체의 일부는 일차 아민 그룹, 이민 그룹, 구아니딘 그룹 및/또는 이미다졸 그룹을 포함하는 것을 알 수 있을 것이다. 바람직한 양이온성 중합체는 상대적으로 낮은 독성을 가지면 높은 DNA 전이 효율을 갖는다.

적절한 양이온성 중합체는 또한 전술한 중합체의 소단위를 포함하는 공중합체, 예컨대, 리신-히스티딘 공중합체, 등등을 포함한다. 공중합체 내의 다양한 소단위의 퍼센트는 동일할 필요는 없으나 예컨대, 세포 독성은 줄이면서 핵산과 복합체를 형성하는 능력으로서의 성질을 최적화 하도록 선택될 것이다. 더욱이, 소단위는 규칙적인 방식으로 교대될 필요는 없다. 전술한 바람직한 성질과 관련하여 다양한 중합체를 평가하는 적절한 분석법이 실시예들에 개시되어 있다. 바람직한 양이온성 중합체는 또한 다양한 변형이 더 편입된 전술한것과 같은 중합체를 포함한다.

적절한 변형은 다음에 제한되는 것은 아니나. 아세틸, 숙시닐, 아실, 또는 이미다졸 그룹과 변형되는 것을 포함한다. (32).

이론에 억매이지 않고, PEI와 같은 양이온성 중합체는 DNA를 세포 표면에서 음이온성 프로테오글리칸과 상호 작용하여 세포 이물 흡수에 의하여 세포로 들어갈 수 있는 양성으로 하전된 입자로 농축 또는 응축하는 것으로 보인다. 이러한 중합체는 엔도좀 pH를 완충하고 DNA 분해를 방지하는 "양자 스폰지(proton sponge)"로서 작용하는 성질을 보유할 것이다.

연속적인 양자 유입 또한 엔도좀의 삼투성 팽창 및 파열을 유도하며, 이것은 DNA 입자를 세포질로 탈출시키는 메카니즘을 제공한다. (예컨대, 참조문헌 85-87; U.S.S.N. 6,013,240; 본 발명의 실시에 유용한 PEI 및 다른 양이온성 중합체에 대한 추가적 정보는 W09602655 참조) 본 발명의 일부 실시예에 따르면 상업적으로 입수 가능한 PEI 시약은 jetPEI^TM(Qbiogene, Carlsbad, CA), 선형의 PEI (U.S.S.N. 6,013,240)이 사용된다.

실시예 12에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 인플루엔자 바이러스 감염의 전 또는 후에 정맥 내로 투여되는 경우 쥐에서 인플루엔자 바이러스의 생선을 현저히 억제하는 인플루엔자 바이러스 RNA를 목표하는 siRNA 및 PEI, PLL, 또는 PLA를 포함하는 조성물을 제시하였다. 억제는 투여량에 의존적이며 상이한 인플루엔자 바이러스 RNA들에 표적화된 두 siRNA 가 사용되는 경우 부가적인 효과를 나타낸다. 따라서 siRNA는 PEI, PLL, 또는 PLA와 같은양이온성 중합체와 조합되는 경우 폐에 도달하여, 세포로 들어가 바이러스 복제 사이클을 효과적으로 억제한다. 이러한 발견은 siRNA를 사용하여(예를 들면, 바이러스 복제 사이클에서 바이러스 전사체 또는 중간체의 제조를 억제하여) 포유류에서 감염성 바이러스를 억제하는 효능을 보고하는 첫번째 보고서인 것으로 생각된다. .

체내의 견고한 기관 및 조직으로 정맥을 통하여 siRNA를 전달하고자 하는 다른 노력(예컨대, McCaffrey 2002; McCaffrey 2003; Lewis, D.L., et al.참조)는 유체 역학 전이로 알려진 기술을 적용하였으며, 이것은 쥐의 꼬리 정맥으로 유체의 다량을 빠르게 전달하는 것과 관련되며, 견고한 기관, 특히 간에서 현저한 용량의 플라스미드 DNA의 축적을 초래하는 것으로 나타났다. (Liu 1999; Zhang 1999; Zhang 2000). 이 기술은, 대략 200 μl의 유체를 주입하는 것과 관련된 전통적인 기술에 대하여(Liu 1999), 동물의 총 혈액 부피에 거의 등가의 유체 부피의 전달과 관련된다. 예컨대, 18-20 그램의 체중을 갖는 마우스에 대략 체중의 8-12%과 등가의 16ml. 또한, 유체 역학 전이의 접근방법을 사용하는 주입은 단시간의 간격으로 일어나며 (예컨대, 5 초), 이것은 주입된 전이유전자의 효과적인 발현을 위하여 필요하다. (Liu 1999). 운반 및 간에서의 주입된 전이 유전자가 고도로 발현되는 유체 역학 전이에 의한 메카니즘은 완전히 명백하지 않지만, 일시적 심장 울혈에 의하여 간 정맥을 통하여 간으로의 DNA 용액의 재유입에 의한 것으로 생각되어진다. (Zhang 2000). 인간에서의 치료적 목적을 위한 비교할만한 접근 방법은 그럴듯하지 않은 것으로 보여진다. 본 발명자들은 이와는 반대로, 전통적인 부피의 유체 (예컨대, 200 μl)를 사용하였으며 심지에 유체 역학 전이를 사용하여 발현이 가장 쉽게 얻어지는 부위인 간에서 주입된 전이 유전자의 최소한의 발현이 기재되는 조건 하에서 폐로의 siRNA의 효과적인 전달을 입증하였다.

본 발명은 그러므로 전통적인 주입 기술, 예컨대, 전통적인 압력 및/또는 전통적인 부피의 유체를 사용하는 기술을 사용하여 대상의 혈관 시스템 내로 목표 전사체에 표적화된 RNAi 유도 물질(entity)을 포함하는 조성물을 도입하는 단계를 포함하는 대상 포유류 내의 세포에서 바이러스 전사체, 예컨대 , '인플루엔자 바이러스 전사체의 발현 억제 방법을 제공한다. RNAi-유도 물질(entity)는 siRNA, shRNA, 또는 RNAi-유도 벡터이다. 본 발명의 일부 바람직한 실시예에서 이 조성물은 양이온성 중합체를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 이 조성물은 투입 대상의 체중의 10% 미만과 등가의 유체 부피로 도입된다. 본 발명의 일부 실시예에서 이 유체 부피는 투입 대상의 체중의 5%미만, 2%미만, 1%미만, 또는 0.l% 미만이다. 본 발명의 일부 실시예에서, 이 방법은 간 이외의 체 조직 또는 기관의 세포에 유효용량의 siRNA 또는 shRNA의 전달을 달성한다. 본 발명의 일부 바람직한 실시예에서 이 조성물은 예컨대, 정맥 주사에 의하여 정입. 그러나 이 조성물은 또한 카테터(catheter), 정맥유치라인(indwelling 정맥 line), 등과 같은 장치를 사용하여 전달되도록 동맥으로 투여될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일부 실시예에서 RNAi-유도 물질(entity)는 바이러스의 제조를 억제한다.

실시예 15에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 또한 양이온성 중합체 PLL 및 PLA가 siRNA와 복합체를 형성할 수 있으며 배양된 세포에서 기능성 siRNA의 흡수(uptake)를 촉진하는 것을 보여주었다. PLL 및 NP-1496의 복합체 또는 PLA 및 NP-1496 siRNA의 복합체로의 전이는 세포에서 인플루엔자 바이러스의 제조를 억제하였다. 이들 결과와 전술한 마우스에서의 결과들은 대상의 체내의 포유류 세로포 siRNA를 전달하기 위하여 양이온성 중합체 및 siRNA의 혼합물을 사용하는 것의 가능성을 입증한다. 실시예 15에 개시된 접근 방법은 부가적인 중합체, 특히 세포 독성을 감소시키고, 초기에 효과적인 것을 최적화 하기 위하여 그룹 (예컨대, 아실, 숙시닐, 아세틸, 또는 이미다졸 그룹) 의 첨가에 의하여 변형된 중합체를 테스트하는데 사용될 것이다. 일반적으로, 일부 바람직한 변형은 양이온성 중합체의 양성 전하의 감소를 유도한다. 일부 바람직한 변형은 일차 아민을 2차 아민으로 전환시킨다. 이러한 부가적 그룹을 편입기키는 양이온성 중합체의 변형 방법은 이 분야에 공지되어 있다. (예컨대, 참조문헌 32 참조). 예를 들면, 다양한 잔기의 ε-아미노 그룹이 예컨대, 중합체의 합성 후 필요한 변형 그룹과 공액(conjugation)에 의하여 치환된다. 일반적으로, RNAi-유도 물질(entity)의 전달을 증진시키는 중합체의 능력을 너무 감소시키지 않으면서, 치환되지 않은 중합체에 비하여 적절한 세포 독성 감소를 얻기 위하여 충분한 %치환을 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 일부 실시예에서는 중합체에서 25% ~ 75%의 잔기가 치환된다. 본 발명의 일부 실시예에서는 중합체의 대략 50%의 잔기가 치환된다. 유사한 효과가 적절히 선택된 단량체 소단위, 즉, 일부 소단위가 필요한 변형을 이미 편입하는 소단위의 공중합체를 초기에 형성함으로써 얻어짐에 유의한다.

다양한 부가적인 양이온성 중합체 또한 사용된다. 디아크릴레이트 및 아민 단량체로 부터 신규한 양이온성 중합체 및 올리고머의 커다란 라이브러리가 개발되었으며 DNA 전이에서 테스트되었다. 이들 중합체는 여기서 폴리(β-아미노 에스테르) (PAE) 중합체로서 지시된다. 예를 들면, 7 디아크릴레이트 단량체 및 20 아민 단량체로 부터의 140 중합체의 라이브러리가 개시되었으며 (34) 보다 큰 라이브러리가 유사한 또는 같은 방법학을 사용하여 제조될 수 있다. 이 라이브러리의 140 멤버에서, 70가지는 충분히 수용성인 것으로 밝혀졌다. (2 mg/ml, 25 mM 아세테이트 완충제, pH = 5.0). 70가지의 수용성 중합체중 56개는 전기 이동도 위상 변화(electrophoretic mobility shift)에서 나타난 바와 같이 DNA와 상호작용 하였다. 가장 중요하게는, 56 중합체중 2가지는 COS-7 세포로 DNA 전이를 유도하였다. 이 신규한 중합체의 전이 효율은 PEI보다 4~8배 높았으며 리포펙타민 2000보다 낫거나 동일하였다. 본 발명은 그러므로 적어도 하나의 siRNA 분자 및 양이온성 중합체를 포함하며, 여기서 양이온성 중합체는 폴리(P-아미노 에스테르)를 포함하는 조성물, 그리고 이러한 조성물을 투여함으로써 목표 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 폴리(베타-아미노 에스테르)는 2002년 9월 19일에 Langer et al.이 출원한 "생분해성 폴리(베타-아미노 에스테르) 및 그 용도"라는 제목의 미국 특허 출원 제 20020131951호, 그리고 Anderson (2003)에서 더 상세히 설명된다. RNAi-유도 물질의 전달을 촉진하기 위하여 사용되는 양이온성 중합체는 변형되어 중합체를 구성하는 주요 단량체 소단위가 아닌 하나 또는 그 이상의 잔기를 편입할 수 있음을 유의하여야 한다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 교대 잔기가 중합체의 말단에 첨가되거나, 또는 중합체가 중합체를 구성하는 주요 단량체 이외의 잔기에 의하여 결합될 수 있다.

본 발명의 RNAi-유도 물질의 전달을 증진시키기 위하여 또한 사용되는 부가적인 양이온성 중합체는 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머, 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트 (pDMAEMA), 그리고 이것의 4차 아민 아날로그 폴리(2-트리메틸아미노)에틸 메타크릴레이트 (pTMAEMA), 폴리 [a-(4-아미노부틸)-L-글라이콜릭 애시드 (PAGA), 그리고 폴리 (4-하이드록시-l-프롤린 에스테르)를 포함한다. 이들 제제의 상세한 설명은 Han (2000) 참조.

B. 펩티드 분자 운반체

연구들은 다양한 펩티드가 핵산의 운반제로서 사용할 수 있다는 것을 보여준다. (여기서 사용되는 폴리펩타이드는 만약 대략 50 아미노 산 길이보다 짧으면 "펩티드"로 간주된다. ) 예를 들면, HIV Tat 단백질 (42, 43), 단순포진 바이러스의 VP22 단백질(44), 그리고 Drosophila의 Antennapedia 단백질 (45)을 포함하는 전사 인자는 세포 표면으로 부터 원형질막을 침투할 수 있다. 11-34 아미노 산 잔기로 구성되는 막 투과를 담당하는 이 펩티드 조각들은 아르기닌이 매우 풍부하며, 종종 아르기닌 풍부 펩티드 (ARPs) 또는 페네트라틴(penetratins)으로 지시된다. 훨씬 큰 폴리펩타이드에 공유결합되는 경우, ARP는 원형질막을 가로질러 융합된 폴리펩타이드를 운반할 수 있다. (46-48). 유사하게, 올리고뉴클레오티드가 ARP에 공유적으로 결합되는 경우, 이들은 세포에 의하여 훨씬 빨리 흡수된다. (49, 50). 최근의 연구는 8개의 아르기닌의 중합체가 이 막통과 운반에 충반하다는 것을 보여준다. (51). 양이온성 중합체와 같이, ARP 또한 양성으로 하전되어 있으며 siRNA과 결합할 수 있어, 아마도 siRNA가 ARP에 공유적으로 결합될 필요가 없다는 것을 제안한다.

본 발명은 그러므로 적어도 하나의 RNAi-유도 물질(entity), 여기서 RNAi-유도 물질는 인플루엔자 바이러스 전사체에 표적됨, 그리고 펩티드 분자 운반체를 포함하는 조성물, 그리고 이러한 조성물을 투여함으로써 목표 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 인플루엔자의 감염 위험이 있거나 감염된 대상에 이러한 조성물을 투여하는 것을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 처치 및/또는 예방 방법을 제공한다. 펩티드 분자 운반체는 참조문헌 46 - 51, 120, 및 134-136에 개시된 것들 및 이 분야의 당업자에게 명백한 그들의 변형체를 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 아르기닌-풍부 펩티드는 아르기닌 잔기만으로 구성된 펩티드를 포함한다.

일반적으로, 바람직한 펩티드 분자 운반체는 대략 50 아미노산 미만의 길이이다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면, 펩티드 분자 운반체는 대략 7 ~ 34 아미노산 길이를 갖는 펩티드이다. 많은 바람직한 펩티드은 아르기닌이 풍부하다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 펩티드는 만약 적어도 20%, 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60% 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%. 또는 적어도 90% 아르기닌을 포함하면 아르기닌-풍부하다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 펩티드 분자 운반체는 6 ~ 20 아르기닌 잔기를 포함하는 아르기닌-풍부 펩티드이다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 아르기닌-풍부 펩티드는 6 ~ 20 아르기닌 잔기로 구성된다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 siRNA 및 펩티드 분자 운반체는 공유적으로 결합되는 반면, 본 발명의 다른 실시예에서는 siRNA 및 펩티드 분자 운반체는 혼합되나 서로 공유적으로 결합되지 않는다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 히스티딘-풍부 펩티드가 사용된다. (88). 본 발명에 따르면 히스티딘-풍부 펩티드는 아르기닌-풍부 펩티드에서 설명된 길이 및 히스티딘 잔기의 퍼센트를 나타낸다. 본 발명은 그러므로 적어도 하나의 RNAi-유도 물질(entity), 여기서 RNAi-유도 물질는 인플루엔자 바이러스 전사체에 표적됨, 그리고 히스티딘-풍부 펩티드를 포함하는 조성물 및 이러한 조성물을 투여함으로써 목표 전사체의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 인플루엔자의 감염 위험이 있거나 감염된 대상에 이러한 조성물을 투여하는 것을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.

대상에서 세포에 RNAi-유도 물질의 전달을 증진시키는 부가적인 펩티드 또는 변형된 펩티드 또한 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들면, 일반적으로 8 ~ 대략 50 리신 잔기를 함유하는 리신-풍부 펩티드의 패밀리가 개시되었다. (McKenzie 2000). 이들 펩티드는 조직배양에서 세포에 의한 핵산의 흡수를 증진시킬 수 있으나, 그들은 보다 긴 폴리펩타이드, 예컨대 50 리신 잔기를 포함하는 PLL에 비하여 대상의 체내에서 핵산에 대하여 덜 효과적인 전달 매체(vehicle)이다. 이것은 체내에서 핵산/펩티드 복합체의 불충분한 안정성에 부분적으로 근거한다. 펩티드 내의 다양한 위치에 다중의 시스테인을 삽입하는 것은 플라스미드 DNA에 결합 후 펩티드간 이황화 결합을 형성하기 위하여 자발적으로 산화되는 저 분자량 DNA 응축 펩티드를 유도한다. 이들 가교된 DNA 전달 매체는 가교되지 않은 펩티드 DNA 응축물에 비하여 세포에 플라스미드를 전달하기 위하여 사용되는 경우 유전자 발현의 보다 효과적인 유도제였다. (McKenzie 2002). 또한, 디설파이드 결합의 형성을 위하여 설프하이드릴 잔기를 포함하는 펩티드가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 편입할 수 있으며, 이것은 혈청 단백질에 비특이성 결합을 감소시키는 것으로 생각된다. (Park 2002).

갈락토오스 또는 만노오스 잔기와 같은 성분을 포함하는 글리코펩티드 또한 이하에서 상세히 설명되는 바와 같이 본원 발명에 따른 RNAi-유도 물질의 선택적 흡수를 증진시키기위하여 사용된다. 이러한 글리코펩티드는 또한 디설파이드 결합의 형성을 위한 설프하이드릴 그룹을 포함한다. (Park 2002). 본 발명은 세포내 이입 소포(endocytic vesicle)로 부터 핵산의 탈출을 증진시키는 다양한 제제의 투여를 포괄한다. 이러한 제제는 클로로퀸 (Zhang 2003) 및 부피바케인(Satishchandran 2000)을 포함한다. 이 탈출-증진 제제는 전신적으로, 구강으로 및/또는 국소적으로 (예컨대 바람직한 작용부에 또는 근접하게)투여된다. 그들은 본 발명의 siRNA, shRNA, 또는 RNAi-유도 벡터와 함께 또는 분리되어 전달된다.

C. 부가적인 중합체 운반제

본 발명은 본 발명의 RNAi-유도 물질 및 전술한 것 이외에, 변형된 중합체를 포함하는 다양한 중합체 운반제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 세포 내에서 인플루엔자 바이러스 전사체의 발현을 억제하는 방법 및 이 조성물을 투여함으로써인플루엔자 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 적절한 운반제는 세포로 DNA의 전달을 증진시키는 것으로 나타나는 다양한 제제를 포함한다. 이들은 예컨대 폴리(L-히스티딘)-그라크트-폴리(L-리신) 중합체 (Benns 2000), 폴리히스티딘-PEG (Putnam 2003), 폴레이트-PEG-그라프트-폴리에틸렌이민 (Benns 2002), 폴리에틸렌이미, 덱스트란 설페이트 (Tiyaboonchai 2003), 등등과 같은 전술한 것과 같은 양이온성 중합체의 변형된 버젼을 포함한다. 중합체는 가지형 또는 선형일 수 있으며 접목(graft; 그라프트)되거나 또는 접목되지 않은 것이다. 본 발명에 따르면 중합체는 본 발명의 RNAi-유도 물질와 복합체를 형성하며, 이것은 그 후 대상에 투여된다. 복합체는 나노입자 또는 나노복합물로 지시된다. 중합체는 보체 활성화 및 다른 원형질 단백질의 결합을 감소시키는 데 유용한 PEG 또는 다른 친수성 중합체를 편입하여 변형될 것이다. 양이온성 중합체는 다중 변형된다. 예를 들면, 양이온성 중합체는 중합체의 음성 전하를 감소시키는 성분(예컨대, 이미다졸)을 편입하도록 변형되고 또한 PEG과 같은 제 2 성분으로 더 변형된다.

또한, 전술한 양이온성 중합체와 구별되는 다양한 중합체 및 중합체 매트릭또한 사용된다. 이러한 중합체는 다수의 비-양이온성 중합체, 즉 생리학적 pH에서 양성 전하를 갖지 않는 중합체를 포함한다. 이러한 중합체는 특정한 장점, 예컨대 감소된 세포독성과 같은 일정한 장점을 가지며 일부 경우 FDA 승인되었다. 다수의 적절한 중합체가 다른 배경에서 약물 및 유전자 전달을 증진시키는 것으로 나타났다. 이러한 중합체에는 예를 들면, 폴리(락티드) (PLA), 폴리(글리콜라이드) (PLG), 그리고d 폴리(DL-락티드-co-글리콜라이드) (PLGA) (Panyarn 2002)가 있으며, 이들은 본 발명의 RNAi-유도 물질의 전달을 위하여 나노입자로 제제될 수 있다. 공중합체 및 전술한 것의 조합 또한 사용된다. 본 발명의 일부 실시예에서 양이온성 중합체는 siRNA, shRNA, 또는 벡터를 응축하기 위하여 사용되며, 응축된 복합체는 PLGA 또는 다른 비-양이온성 중합체에 의하여 보호된다. 사용될 수 있는 다른 중합체에는 폴리비닐 알코올, 또는 폴리(N-에틸 비닐피리디늄 브로마이드와 같은 응축하지 않는 중합체를 포함하며, 이것은 플루로닉(Pluronic) 85와 복합된다. 본 발명에서 사용되는 다른 중합체는 양이온성 및 비-양이온성 중합체의 조합을 포함한다. 예를 들면, 폴리(락틱-co-글리콜릭 애시드) (PLGA)-그라프트된 폴리(L-리신) (Jeong 2002) 그리고 PLA, PLG, 또는 PLGA 및 전술한 바와 같은 양이온성 중합체 또는 변형된 양이온성 중합체를 포함하는 다른 조합이 사용된다.

D. 전달-증진 성분을 편입하는 운반제

본 발명은 목표 전사체의 억제에 바람직한, 세포에 제제의 전달을 증진시키는 및/또는 세포에 제제의 선택적 전달을 증진시키는 성분의 편입을 위한 운반제의 변형을 포괄한다. 다음을 포함하나 그에 제한되지 않는 다양한 성분이 사용된다. : (i) 특히 억제가 요구되는 세포 내에서 발현되는 분자에 결합하는 항체 또는 항체 단편 (예컨대, 호흡기 상피 세포); (ii) 특히 억제가 요구되는 세포에 의하여 발현되는 분자에 결합하는 리간드. 바람직하게는 이 분자는 세포의 표면에서 발현된다. 모노클로날 항체가 일반적으로 바람직하다. 호흡기 상피 세포의 경우, 적절한 성분은 특히 p2Y2 퓨리노셉터, 브래디키닌수용체, 유로키나아제 플라스미노겐 활성화제 R와 같은 수용체에 결합하는 항체를 포함하며, 또는 세르핀 효소 복합체가 호흡기 상피 세포에 전달 및 선택성을 증가시키기 위하여 전술한 다양한 운반제에 공액된다. 유사하게, 이들 다양한 분자의 리간드는 호흡기 상피 세포에 전달 및 선택성을 증가시키기 위하여 운반제에 공액된다. 예컨대, (Ferrari 2002)참조. 본 발명의 일부 바람직한 실시예에서 항체 또는 리간드의 결합은 결합된 복합체의 내재화(internalization)를 유도한다. 본 발명의 일부 실시예에서 전달 증진 제제 (예컨대, 항체, 항체 단편, 또는 리간드)는 RNAi-유도 벡터 (예컨대, a DNA 벡터)에 공액되어 전달을 증가시키거나 또는 선택성을 증진시킨다. 여기서 개시되는 항체 또는 리간드를 핵산 또는 다양한 운반제에 공액시키는 방법은 이 분야에 공지되어 있다. 예컨대, "Cross-Linking", Pierce Chemical Technical Library, www.piercenet.com에서 입수 가능, 그리고 최초 출판된 1994-95 Pierce Catalog 및 여기서 참조된 참조문헌 그리고 Wong SS, Chemistly of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press Publishers, Boca Raton, 1991. 참조.

E. 폐에 도입을 위한 적절한 계면활성제

천연의, 내인성 계면활성제 인지질, 중성 지질, 및 폐포 가스와 폐의 폐포 표면 사이에 막을 형성하여 폐포 내의 표면장력을 감소시킴으로써 폐포의 붕괴를 감소시키는 단백질 (계면활성제 단백질 A, B, C, 및 D)로 구성되는 화합물이다. (77-84). 계면활성제 분자는폐포 벽을 덮는 전체 세포를 적시는 액체 박막 내에 퍼진다. 여기서 이들은 본질적으로 단-분자의, 모두 스며드는 층을 형성한다. 미성숙 유아에서 계면활성제 결핍은 종종 호흡기 장애 증후군 (RDS)을 초래한다. 따라서, 다양한 계면활성제 제조는 이 상태의 치료 및/또는 예방을 위하여 개발되어 왔다. 계면활성제는 동물 폐 세척 및 인간 양막 유체로 부터 추출되거나 또는 합성 물질로부터 제조될 수 있다. (예컨대, U.S.S.N. 4,338,301; 4,397,839; 4,312,860; 4,826,821; 5,110,806 참조). 다양한 제제의 계면활성제가 상업적으로 이용가능하며, Infasurf^® (ONY, Inc., Amherst, NY 제조); Survanta^®(Ross Labs, Abbott Park, IL), 그리고 Exosurf Neonatal^®(GlaxoSmithKIine, Research Trianμle Park, NC)가 포함된다.

여기서 사용되는 "폐에 도입하기에 적절한 계면활성제"라는 관용구는 상업적으로 입수 가능한 계면활성제 제품에서 사용되는 특정 제제 및 전술한 특허 출원에서 개시되고 청구되는 본 발명의 조성물 및 그 등가물을 포함한다. 본 발명의 일부 실시예에서 이 관용구는 전체 계면활성제에 대하여 10-20% 단백질 및 80~90% 지질을 포함하는 제제를 포함한다. 이 지질은 약 10%의 중성 지질(예컨대, 트리글리세라이드, 콜레스테롤) 및 약 90% 인지질로 구성된다. 총 인지질에 대하여 포스파티딜콜린 함량은 86%이며, "%" 및 "부" 는 건조물질에 기초한다. (U.S.S.N. 4,388,301 및 4,397,839 참조).

본 발명의 일부 실시예에서 이 관용구는 합성 조성물을 포함하며, 이것은 완전히 또는 실질적으로 단백질이 없다. 예컨대, 본질적으로 디팔미토일 포스파티딜콜린 및 지방 알코올로 구성되는 또는 포함하는 조성물이다. 여기서 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC)은 계면활성제 조성물의 주요 성분을 구성하며, 지방 알코올은 소수 성분을 포함하고, 선택적으로 타일로옥사폴과 같은 비-독성 비이온성 표면 활성 제제를 포함한다. (U.S.S.N. 4,312,860; 4,826,821; 및 5,110,806 참조) 이분야의 당업자는 전술한 특허 및 문서에 개시된 테스트를 참조하여 특정 계면활성제 조성물이 폐로의 도입에 적절한지를 결정할 수 있을 것이다. 이론에 억매이지 않고, 계면활성제의 폐포에 퍼져 그것을 덮는 능력 및 계면활성제의 조성물 자체가 폐 내에서 세포에 의하여 siRNA 및/또는 벡터의 흡수를 촉진하는 것이 가능하다.

Infasurf는 기관내 설치(intratracheal installation)만을 위하여 의도된 멸균, 비-발열성 폐 계면활성제이다. 이것은 송아지 폐로 부터 추출된 천연 계면활성제이며, 인지질, 중성 지질, 그리고 소수성 계면활성제-연관된 단백질 B 및 C를 포함한다. Infasurf는 호흡기 장애 증후군의 치료에 투여하도록 미국 식약청에서 승인받았으며 따라서 안전하고 호흡기 및 폐에 투여를 위하여 허용되는 매체이다. Survanta 또한 소의 폐로 부터 유도된 추출물이며, Exosurf Neonatal은 디팔미토일포스파티딜콜린, 세틸 알코올, 및 타일로옥사폴을 함유하는 단백질-없는 합성 폐 계면활성제이다. 이들 계면활성제 제제 모두 또한 호흡기 장애 증후군의 치료용으로 U.S.F.D.A.에 의하여 승인받았다.

실시예 14에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 인플루엔자 RNA에 표적화된 shRNA의 합성을 위하여 주형로 작용하는 DNA 벡터가 Infasurf와 혼합되고 비강 내 설치에 의하여 마우스에 투여되는 경우 인플루엔자 바이러스 제조를 억제할 수 있다는 것을 보여주었다. 또한, 실시예 13에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 동일한 shRNA을 발현하는 렌티바이러스로 감염되는 것이 조직 배양 세포에서 인플루엔자 바이러스를 억제한다는 것을 보여주었다. 이들 결과는 인플루엔자 바이러스 RNA에 표적화된 shRNA가 세포로 전달될 수 있으며 인플루엔자 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적인 siRNA로 가공될 수 있다는 것을 입증한다. 이들 결과는 또한 Infasurf와 같은 계면활성 물질, 예컨대 천연 폐 계면활성제에 유사한 조성 및/또는 성질을 갖는 물질은 폐로 shRNA의 전달에 적절한 매체라는 것을 입증한다. 또한, 이 결과는 인플루엔자 바이러스에 표적화된 siRNA 또한 폐 및/또는 호흡기 경로로 전달되는 경우 효과적으로 인플루엔자 바이러스 제조를 억제하는 것을 강력히 제안한다. 본 발명은 그러므로 (i) 적어도 하나의 RNAi-유도 물질(entity) , 여기서 RNAi-유도 물질(entity)은 인플루엔자 바이러스 전사체에 표적화 되며, 그리고(ii) 폐로 도입하는데 적절한 계면활성제 물질을 포함하는 조성물을 제공한다. 계면활성제 및 RNAi-유도 물질(entity)을 포함하는 본 발며의 조성물은 설치, 흡입제제, 에어로졸 스프레이, 등을 포함하는 다양한 방법에 의하여 폐로 도입된다. 조성물은 100% 미만의 계면활성제를 함유함에 유의해야 한다. 예를 들면, 조성물은 중량으로 대략 10 ~ 25% 계면활성제, 대략 25 ~ 50% 계면활성제, 대략 50 ~ 75% 계면활성제, 대략 75 ~ 100% 계면활성제를 함유한다. 본 발명은 인플루엔자의 감염 위험이 있거나 감염된 대상에 전술한 조성물을 투여하는 것을 포함하는 인플루엔자를 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. .

F. 폐로 RNAi-유도물질을 전달하기 위한 부가적 제제

본 발명은 호흡 상피 세포로 본 발명의 RNAi-유도 물질의 전달을 증진시키기 위한 다양한 부가적 제제 및 방법의 사용을 포괄한다. 이 방법들은 칼슘 킬레이션을 일으키기 위하여 EGTA와 함께 전달 또는 투여 전에 벡터의 CaPO₄ 침전을 포함한다. 세제 및 요변성 용액과 함께 투여하는 것 또한 사용된다. 퍼플루오로 수소를 불소로 치환한 화합물(Perfluorochemical) 액체 또한 전달 매체로서 사용된다. 이들 방법의 더욱 상세한 설명 및 유전자 운반에서의 적합성에 대하여는 (Weiss 2002)참조. 또한, 본 발명은 폐로 본 발명의 RNAi-유도 물질을 전달하기 위하여 편입하는 단백질/폴리에틸렌이민 복합체의 사용을 포괄한다. 이러한 복합체는 알부민 (또는 다른 수용성 단백질)과 조합된 폴리에틸렌이민을 포함한다. 유전자 운반을 위한 플라스미드를 함유하는 유사한 복합체는 혈관 내 투여 후 폐 조직으로 전달을 유도함을 나타내었다. (Orson 2002). 본 발명의 RNAi-유도 물질을 포함하는 단백질/PEI 복합체는 또한 폐 내부가 아닌 세포로의 전달 증진에 사용된다. .

G. 지질

실시예 3에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 올리고펙타민^TM으로 알려진 지질 제제의 존재 하에서 인플루엔자 바이러스 전사체에 표적화된 siRNA를 주사에 의하여 손상되지 않은(intact) 닭 배아(embryos)에 투여하는 것은 효과적으로 인플루엔자 바이러스 제조를 억제하며, 올리고펙타민 부재 하에 동일한 siRNA 을 투여하는 것은 효과적인 억제를 유도하지 않음을 보여주었다. 이들 결과는 손상되지 않은(intact) 유기체에서 siRNA의 효능의 증진에 대한 지질 운반제의 용도를 입증한다. 본 발명은 그러므로 (i) 적어도 하나의 RNAi-유도 물질(entity), 여기서 RNAi-유도 물질(entity) 은 인플루엔자 바이러스 전사체에 표적화됨, 그리고 (ii) 지질을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 제조의 억제 방법 및 대상에 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 인플루엔자의 감염을 치료하는 방법을 제공한다.

VI. 인플루엔자 바이러스 감염/복제의 분석

전술한 바와 같이, 본원 발명의 RNAi-유도 물질의 한 용도는 인플루엔자 바이러스 감염/복제 사이클 및 숙주 세포에 대한 다양한 바이러스 단백질의 효과를 분석하고 특정하는 것이다. siRNA 및 shRNA는 대사, 생합성, 사이토킨 유리 등과 같은 숙주세포 기능 또는 활성에 영향을 주는 하나 또는 그 이상의 단계의 바이러스 감염 및/또는 복제 사이클 및/또는 바이러스 유전자와 연관된 다양한 바이러스 유전자에 표적화되도록 설계된다. siRNA, shRNA, 또는 RNAi-유도 벡터는 바이러스 감염 전에, 중간에, 또는 후에 세포로 도입되며, 그들의 감염/복제 사이클의 다양한 단계 및 세포 활성 및 기능에 대한 효과가 필요에 따라 평가된다.

VII. 치료적 용도

전술한바와 같이, 본원 발명의 RNAi-유도 물질을 포함하는 조성물은 인플루엔자 바이러스 감염 또는 복제를 억제 또는 감소시키기 위하여 사용된다. 이러한 용도에서, 본 발명의 조성물의 유효 용량이 인플루엔자 바이러스에 노출되기 전에, 동시에 또는 그 후에 세포 또는 유기체로 전달된다. 바람직하게는, RNAi-유도 물질(entity)의 용량은 인플루엔자 바이러스 감염의 하나 또는 그 이상의 증상을 감소시키거나 지연시키기에 충분한 것이다. 이 구역의 목적을 설명하기 위하여 본 발명의 siRNA로 지시되나, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 전사체에 표적화된 다른 RNAi-유도 물질을 위한 유사한 용도를 포괄한다.

본 발명의 siRNA-함유 조성물은 단일 목표 전사체의 단일 부위에 표적화된 단일 siRNA 종을 포함하거나, 또는 하나 또는 그 이상의 목표 전사체의 하나 또는 그 이상의 부위에 표적화된 복수의 상이한 siRNA 종을 포함한다. 실시예 8은 단독으로 또는 조합하여 인플루엔자 바이러스 제조의 억제에 우월한 siRNA의 조직적 확인을 위한 일반적 접근방법을 개시한다.

본 발명의 일부 실시예에서, 상이한 유전자에 표적화된 상이한 siRNA 종의 집합을 함유하는 조성물을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들면, 상이한 바이러스 전사체에 대항하여 유도된 다양한 siRNA을 사용하여 바이러스 생명주기에서 다중의 시점에서 바이러스를 공격하는 것이 바람직할 것이다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 이 siRNA 조성물은 각 바이러스 게놈 조각에 표적화된 siRNA를 함유한다.

본 발명의 일부 실시예에 따르면, 본 발명의 siRNA 조성물은 단일 바이러스 전사체에 표적화된 하나 이상의 siRNA 종을 함유한다. 하나의 실시예로서, 목표 전사체의 코딩 부위에 표적화된 적어도 하나의 siRNA 및 3' UTR에 표적화된 적어도 하나의 siRNA를 포함하는 것이 바람직하다. 이 전략은 관련된 전사체에 의하여 인코드되는 생성물이 생성되지 않으리라는 것을 더욱 보장할 것이다. 이것은 조성물 내의 적어도 하나의 siRNA가 분해를 위하여 전사체를 목표할 것이며, 적어도 하나의 다른 것이 분해를 방지하는 전사체의 해독을 억제하기 때문이다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 다중의 siRNA 올리고뉴클레오티드를 투여하는 접근 방식과, 단일 벡터가 억제 다중의 목표를 억제하는 siRNA 또는 복수의 siRNA를 산출하기 위하여 가공되는 RNA의 합성을 유도하는 접근방식을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 "치료적 칵테일"을 포괄한다. 더 상세한 설명은 실시예 11 참조. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 이 조성물은 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 A 전사체 및 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 B 전사체에 표적화된 siRNA를 포함한다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 이 조성물은 특정 조각의 동일한 부분을 목표하는 상이한 서열을 갖는 다중의 siRNA를 포함한다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 조성물은 상이한 인플루엔자 바이러스 균주 또는 아형을 억제하는 다중의 siRNA를 포함한다.

본 발명자들이 예를 들면, 전이된 유전자, 통합된 전이유전자, 통합된 바이러스 게놈, 감염성 분자 클론, 등등에 대하여, HA의 현저히 감소된 생성으로 부터 증명되는 바와 같이, 전체 감염성 바이러스를 사용하여 인플루엔자 바이러스 복제의 효과적인 siRNA매개된 억제를 입증하였다는 것은 명백하다.

전술한 바와 같이 인플루엔자 바이러스가 항원의 대변이(antigenic shift) 및 항원 소변이(antigenic drift) 모두를 거친다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, 치료적 제제에 대한 내성의 출현이 일어날 것이다. 따라서 본 발명의 조성물이 얼마동안 사용된 후, 돌연변이 및/또는 재배열이 일어나서 제공되는 특정 siRNA로 억제되지 않는 변이체가 출현할 것이 기대된다. 본원 발명은 그러므로 진화되는 치료적 제도를 기획한다. 예를 들면, 특정의 경우에 특정 돌연 변이 또는 재배열에 반응하는 하나 또는 그 이상의 새로운 siRNA가 선택될 수 있다. 예컨대, 어떤 돌연변이가 발생하건 또는 새로 획득된 RNA 조각을 목표하건, 편입을 제외하고 기원이 같은 새로운 siRNA를 설계하는 것이 종종 가능하다. ; 다른 경우, 동일한 전사체 내의 새로운 서열을 목표하는 것이 바람직할 것이다. ; 또 다른 경우, 완전히 새로운 전사체를 목표하는 것이 바람직할 것이다.

하나 또는 그 이상의 증상 또는 감염의 특징을 억제, 경감, 또는 예방하기 위하여 본 발명의 siRNA의 투여를 하나 또는 그 이상의 다른 항-바이러스 제제와 조합하는 것이 종종 바람직하다. 본 발명의 바람직한 일부 실시예에서, 본 발명의 siRNA는 아만타딘 또는 리만타딘 (모두 바이러스 캡슐제거와 연관된 이온 채널 M2 단백질을 억제함), 및/또는 자나미비르, 오셀타미비르, 페라미비르 (BCX-1812, RWJ-270201) Ro64-0796 (GS 4104) 또는 RWJ-270201 (이들 모두는 NA 억제제이며 원형질막으로 부터 바이러스 입자의 적절한 방출을 억제함)와 같은 하나 또는 그 이상의 15 - 다른 항바이러스 제제와 조합된다. 본 발명의 siRNA 조성물의 투여는 또한 예를 들면, 다양한 공지된 인플루엔자 백신 (예컨대, 인플루엔자 바이러스 또는 바이러스 항원 그리고 DNA 백신을 이용하느 전통적인 백신)를 포함하는 하나 또는 그 이상의 다양한 제제와 조합된다. 인플루엔자 치료 또는 예방을 위한 연구 및 다양한 제제에 대한 상세한 설명은 Palese, P. and Garcia-Sastre, 2002; Cheung and Lieberman, 2002, L6uscher-Mattli, 2000; 및 Stiver, 2003참조. 본 발명의 다른 실시예에서, "조합되는" 또는 "조합하여"는 동일한 시점에 또는 동일한 혼합물로 전달되어야만 하는 것은 아니지만, siRNA가 다른 제제로서 동일한 혼합물에 존재하거나 또는 개인을 위하여 다른 제제와 siRNA를 모두 포함하는 치료 제도를 의미한다. 본 발명의 일부 실시예에 따르면 항바이러스 제제는 아만타딘, 리만타딘, Relenza, 또는 Tarniflu와 같이 미국 식약청으로 부터 승인받은 제제이다.

본 발명의 siRNA 백신접종에 대한 상보성 전략을 제공하며 현재 입수 가능하거나 또는 개발중인 다양한 백신을 접종되지 않은 또는 접정한 개인에게 투여될 것이다. (Palese, P. and Garcfa-Sastre, A., J Clin. Invest., 110(l): 9-13, 2002참조). 현재 미국에서 제제되는 백신은 불활성화된 바이러스를 함유하며, 근육내 주사로 투여되어야 한다. 백신은 3부로 이루어지며 인플루엔자 B 타입 이외에 현재 유행되는 인플루엔자 A(H3N2 및HINI)의 아형으로 부터의 대표적인 균주를 함유한다. 각 계절 특이성 처방은 그 계절의 백신에 사용하기 위한 특정 균주를 식별한다. 다른 백신 접근 방식은 비강내 분사로 투여될 수 있는 약독화 (cold-adapted) 생 인플루엔자 바이러스; 바이러스 게놈의 결실 또는 다른 변이를 함유하는 유전 조작 생 인플루엔자 바이러스 백신; 플라스미드 DNA가 하나 또는 그 이상의 바이러스 단백질을 인코드 하며, 근육내로 또는 국소적으로 투여될 수 있는 복제-결함 인플루엔자 바이러스, 및 DNA 백신을 포함한다. (예컨대, Macklin, M.D., et al., J 1 5 Virol, 72(2):1491-6, 1998; Mum, L., et al., Adv Drug Deliv Rev, 51(1-3):81-96, 2001; Ulmer, J., Vaccine, 20: S74-S76, 2002 참조). 면역기능 약화 환자 및 노인은 특히 RNAi-기초 치료의 이익을 얻을 것이며, 이는 이러한 치료의 효능은 효과적인 면역 반응을 요구하지 않기 때문이다라는 점에 유의하여야 한다.

본 발명의 일부 실시예에서, 인플루엔자 바이러스로 감염된 세포에, 또는 적어도 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 세포에(예컨대, 시알산-함유 수용체를 발현하는 세포) 본 발명의 siRNA 조성물을 목표 투여 하는 것이 바람직하다. 다른 실시예에서, 전달 방법의 선택이 최대의 폭을 갖도록 하는 것이 바람직할 것이다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 치료적 절차는 인플루엔자 바이러스에 노출 전에, 동시에 또는 그 후에 유효 용량의 siRNA를 투여하는 것과 연관되다. 예를 들면, 감염되지 않은 개인은 인플루엔자에 노출 전에 본 발명의 조성물로 "면역"된다. ; 위험한 개인 (예컨대, 노인, 면역 기능이 약화된 개인, 의심되는 사람 등등, 또는 인플루엔자 바이러스에 감염된 것으로 알려진, 등등의 사람과 최근에 접촉한 사람)은 실질적으노 의심 또는 노출과 동시에 치료될 수 있다. (예컨대, 48 시간 이내에, 바람직하게는 24 시간이내에, 그리고 보다 바람직하게는 12 시간 이내에) 물론 감염된 개인도 언제나 본 발명의 치료를 받을 수 있다.

유전자 치료 절차는 인플루엔자 바이러스 감염 전에, 실질적으로 동시에, 또는 그 후에 대상에 억제성 siRNA의 발현을 지시할 수 있는 유효 용량의 유전자 치료 벡터를 투여하는 것과 연관된다. 전술한 것을 대체하거나 조합하여 사용되는 또 다른 접근 방법은 대상으로 부터 세포의 집단, 예컨대, 스템 세포 또는 면역 시스템 세포를 분리하고 , 선택적으로 조직 배양에서 세포를 팽창시키고, 그리고 세포 시험관 안에서 세포에 억제성 siRNA의 발현을 지시할 수 있는 유전자 치료 벡터를 투여하는 것이다. 이 세포는 그 후 대상에 재투여 된다. 선택적으로, siRNA 를 발현하는 세포(따라서 인플루엔자 바이러스 감염에 저항성으로 된)가 대상에 도입하기 전에 시험관 안에서 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서, 세포 라인으로부터 또는 대상이 아닌 개인으로 부터의 세포 집단이 사용될 수 있다. 대상으로 부터 스템 세포, 면역 시스템 세포, 등을 분리하고 대상으로 복귀시키는 방법은 이 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 화학치료를 받고 있는 환자에서 예컨대, 골수 이식, 말초 혈액 스템 세포 이식, 등에 사용된다.

또 다른 접근 방법에서, 구강 유전자 치료가 사용된다. 예를 들면, 미국 특허 제6,248,720호는 프로모터의 조절하에 있는 유전자가 마이크로입자에 보호되어 함유되고 작동 형식으로 세포에 세포로 전달되며, 이로써 비-침습적인 유전자 전달을 달성하는 방법 및 조성물을 개시한다. 마이크로 입자의 구강 내 투여 후, 이 유전자는 흡수성 소장 상피 세포를 포함하는 상피 세포 내로 흡수되며, 소화관 연관된 림프 조직으로 흡수되고, 점액 상피로 부터 원거리의 세포로 까지 운반된다. 여기서 설명된 바와 같이, 마이크로입자는 점액 상피로 부터 원거리 부위에 유전자를 전달할 수 있다. 즉 상피 장벽을 가로질러 전신 순환으로 들어감으로써 다른 부위의 세포를 전이할 수 있다.

전술한 바와 같이, 인플루엔자 바이러스는 인간 이외에도 광범위한 다양한 종을 감염시킨다. 본원 발명은 인간이 아닌 종, 특히 닭, 돼지 그리고 말과 같은 종의 치료를 위한 본 발명의 siRNA 조성물의 용도를 포함한다.

VIII. 약제학적 제제

본 발명의 조성물은 비경구 (예컨대, 정맥), 경피, 피하, 구강, 비강, 기관지, 안과, 피부 (국소), 경점막, 직장, 그리고 질 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는 가능한 경로에 의하여 전달되도록 제제된다. 바람직한 전달 경로는 비경구, 경점막, 비강, 기관지, 및 구강을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 대체로 약제학적으로 수용 가능한 담체와 조합하여, siRNA 또는 전달 후 siRNA의 제조를 유도하는 벡터와 같은 다른 제제(s)를 포함한다. 여기서 사용되는 "약제학적으로 수용 가능한 담체"는 약제학적 투여와 양립할 수 있는 용제, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균 제제, 등장 및 흡수 지연 제제, 등을 포함한다. 보충적 활성 화합물 또한 조성물에 편입될 수 있다.

약제학적 조성물은 의도된 투여 경로와 조화되도록 제제된다. 비경구 (예컨대, 정맥), 근육내, 경피, 또는 피하 용도에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음 성분을 포함한다. : 주사용수, 생리적 식염수 용액, 고정 오일(fixed oils), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용제와 같은 멸균 희석제 ; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아 제제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세틱 애시드와 같은 킬레이팅 제제; 아세테이트, 사이트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 그리고 소듐 클로라이드 또는 덱스트로오스와 같은 긴장성(tonicity) 조절 제제. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 비경구 제제는 유리나 플라스틱으로 만든 앰퓰, 일회용 주사기 또는 다중 투여량 바이알에 포장될 수 있다.

적절한 주사용 약제학적 조성물은 대체로 멸균 주사 용액 또는 분산의 즉석의 제조를 위한 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥 투여의 경우, 적절한 담체는 생리학적 식염주, 정균수, Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 조성물 멸균되어야 하며, 손쉬은 주사성(syringability)이 존재하는 정도의 유체이어야 한다. 바람직한 약제학적 제제는 제조 및 저장 조건에서 안정하며,

박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다.

일반적으로, 관련 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 그리고 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용제 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들면, 분산의 경우 레시틴과 같은 코팅의 사용,요구되는 입자 크기의 유지, 그리고 계면활성제의 사용에 의하여 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아 및 항진균 제제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로졸, 등에 의하여 달성될 수 있다. 많은 경우, 조성물 내에 예를 들면, 당, 만니톨, 솔비톨 소듐 클로라이드와 같은 폴리알코올과 같은 등장 제제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사된 조성물의 지연된 흡수는 조성물 내에 예를 들면 알루니늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함함으로써 얻을 수 있다.

멸균 주사 용액은 위에 열거된 하나 또는 조합과 적절한 용제 내에서 필요한 용량의 활성 화합물을 편입시킴으로써, 그리고 필요에 따라 필터 멸균이 수반됨으로써 제조될 수 있다. 바람직하게는 주사용 용액은 내독소가 없다. 일반적으로, 분산은 기본적 분산 매질 및 위에 열거된 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 매체에 활성 화합물을 편입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균 필터된 용액으로 부터 활성 성분과 부가적인 바람직한 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조이다.

구강용 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 구강 치료적 투여에서, 활성 화합물은 첨가제와 편입될 수 있으며 정제, 트로키, 또는 캡슐, 예컨대, 젤라틴 캡슐의 형태로 사용된다. 구강 조성물은 또한 구강 세정제로서 사용하기 위하여 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 약제학적으로 병존 가능한 결합 제제, 및/또는 보조 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키 등등은 다음의 성분, 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다. : 미정질 셀룰로오스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토오스와 같은 첨가제, 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스와 같은 윤활제; 콜로이드성 실리콘 디옥사이드와 같은 활제; 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 실리실레이트 또는 오렌지향과 같은 가향제. 구강 전달용 제제는 바람직하게는 위장관 내에서의 안정성 및/또는 흡수를 증진시키기 위한 제제를 편입한다.

흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명의 siRNA, shRNA, 또는 벡터는 바람직하게는 예컨대, 이산화산소와 같은 가스 또는 네불라이져와 같은, 적절한 분사제를 함유하는 디스펜서 또는 압축 용기로 부터의 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 본원 발명은 특히 비강 스프레이를 사용하여 siRNA 조성물을 전달하는 것을 기획한다. 인플루엔자 바이러스에 대항하여 유도된 DNA백신의 비강 내 투여는 CD8 T 세포 반응을 유도하는 것으로 나타나며, 이것은 호흡기 내의 적어도 일부 세포는 이 경로로 전달되는 경우 DNA를 흡수할 수 있음을 지시한다. (예컨대, K. Okuda, A. Ihata, S. Watabe, E. Okada, T. Yamakawa, K. Hamajima, J. Yang, N. Ishii, M. Nakazawa, K. Okuda, K. Ohnari, K. Nakajima, K.-Q. Xin, "Protective immunity against influenza A viruses induced by immunization with DNA Plasmid containg influenza M gene", Vaccine 19:3 68 1 3691, 2001 참조). siRNA는 백신에 사용되는 것과 같은 플라스미드 DNA보다 훨씬 작으며, 이것은 siRNA의 보다 많은 흡수가 일어날 것이라는 것을 제안한다. 또한, 본 발명의 일부 실시예에 따르면, 기도에서 세포에 의하여 핵산의 흡수를 촉진시키기 위한 운반제가 약제학적 조성물에 포함된다. (예컨대, S.-O. Han, R. 1. Mahato, Y. K. Sung, S. W. Kim, "Development of biomaterials for gene therapy", Molecular therapy 2:302317, 2000. 참조) 본 발명의 일부 실시예에 따르면 siRNA 조성물은 실시예 10에 보다 상세히 설명된 바와 같이 에어로졸 투여를 위하여 큰 다공성 입자로서 제제된다.

전신 투여 또한 경점막 또는 경피 수단을 통하여 가능하다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 장벽을 침투하는데 적절한 침투제가 제제에 사용된다.

이러한 침투제는 일반적으로 이 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 경점막 투여를 위한, 세제, 담즙 염, 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이를 통하여 또는 좌약의 사용으로 수행될 수 있다. 경피 투여를 위하여, 활성 화합물은 일반적으로 이 분야에 공지된 바와 같이 연고, 고약, 젤, 또는 크림으로 제제될 수 있다.

이 화합물은 또한 직장 전달을 위하여 좌약의 형태(예컨대,코코아 버터 및 다른 글리세라이드와 같은 전통적인 좌약 기제로) 또는 보유 관장(retention enemas)의 형태로 제조될 수 있다.

전술한 전달에 이외에도, 본 발명의 일부 실시예에서, 활성 화합물 (siRNA, shRNA, 또는 벡터)은 이식 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어된 방출 제제와 같은 체내로 부터 빨리 제거되는 것으로부터 화합물을 보호하는 담체와 함께 제제된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜릭 애시드, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락틱 애스드와 같은 생분해성, 생물학적으로 병존 가능한 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 방법은 이 분야의 당업자에게 명백할 것이다. 이 물질들 또한 Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc로 부터 상업적으로 입수할 수 있다. 리포좀 현탁액 (바이러스 항원에 모노클로날 항체로 감염된 세포에 표적화된 리포좀을 포함하는) 또한 약제학적으로 수용 가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 예를 들면, 미국 특허 제 4,522,811호에 개시된 이 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.

구강 또는 비경구 조성물을 투여가 쉽고 균일한 용량의 투여용량 단위로 제제하는 것이 바람직하다. 여기서 사용된 투여용량 단위 형태는 치료할 대상을 위하여 균일한 투여 용량으로서 조정된 물리적으로 분리된 단위를 지시한다. ; 각각 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 바람직한 치료 효과를 생성할 수 있도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 용량을 함유한다.

이러한 화합물의 독성 및 치료적 효능은 세포 배양 및 실험 동물에서 예컨대, LD₅₀ (집단의 50%의 치사 투여량) 및 ED₅₀ (집단의 50%의 치료적으로 효과적인 투여량)을 측정하기 위한 표준 약제학적 절차에 의하여 측정될 수 있다. 독성 및 치료적 효과 사이의 투여량 비율은 치료 지수이며, LD₅₀/ ED₅₀ 비율로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물도 사용될 수 있으나, 감염되지 않는 세포에 대한 손상 가능성을 최소화 하기 위하여, 이로써 부작용을 감소시키기 위하여 작용되는 조직의 부위에 이러한 화합물을 목표하는 전달 시스템의 설계에 주의를 기울여야 한다.

세포 배양 분석법 및 동물 연구에서 얻은 데이터는 인간을 위한 투여 용량의 범위의 제제에 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여 용량은 바람직하게는 독성이 없거나 거의 없는 ED₅₀을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여용량은 이용되는 투여 경로 및 투여 용량에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 화합물의 경우, 치료적으로 효과적인 투여량은 초기에 세포 배양 분석법으로 부터 측정될 수 있다. 투여량은 세포 배양에서 측정된 것과 같은 IC₅₀ (즉, 증상의 최대 1/2을 달성하는 테스트 화합물의 농도)를 포함하는 순환 원형질 농도를 동물 모델에서 달성하기 위하여 제제될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 보다 정확한 투여량을 측정하기 위하여 사용될 수 있다. 원형질 내의 농도가 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래피법으로 측정될 수 있다.

치료적으로 유효 용량의 약제학적 조성물은 대체로 약 0.001 ~ 30 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.01 ~ 25 mg/kg 체중, 보다 바람직하게는 약 0.1 ~ 20 mg/kg 체중, 그리고 더욱더 바람직하게는 약 1 ~ 10 mg/kg, 2 ~ 9 mg/kg, 3 ~ 8 mg/kg, 4 ~ 7 mg/kg, 또는 5 ~ 6 mg/kg 체중 범위이다. 약제학적 조성물은 필요에 따라 다양한 간격으로 다양한 기간에 걸쳐서 투여될 수 있다. 예컨대, 하루에 여러번, 매일, 매 2일마다, 약 1 ~ 10 주에 한번, 2 ~ 8 주, 약 3 ~ 7 주, 약 4, 5, 또는 6 주, 등등. 당업자는 질병 또는 장애의 심각성, 사전 치료, 치료 대상의 일반적 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질병 등을 포함하는(이에 제한되지 않음) 특정 인자가 대상을 효과적을 치료하기 위하여 필요한 투여용량 및 횟수에 영향을 줄 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 개시된 바와 같은 siRNA, shRNA, 또는 벡터로 대상을 치료하는 것은 단일 치료 또는 많은 경우, 일련의 치료를 포함할 수 있다.

예시적 투여량은 본 발명의 siRNA /Kg of 대상 또는 샘플 중량의 mg 또는 μg 용량을 포함한다. (예컨대, 약 1 μg /Kg ~ 약 5 00 mg/Kg, 약 100 μg /Kg ~ 약 5 mg/Kg, 또는 약 1 μg /Kg ~ 약 50 μg /Kg.) 국소 투여 (예컨대, 비강 내)의 경우, 투여량은 사용되는 것보다 훨씬 작다. 적절한 siRNA의 투여량은 siRNA의 효능에 따르며, 그리고 예를 들면, 미리 선택된 바람직한 반응이 얻어질 때까지 투여량의 증가를 통하여 선택적으로 특정 수령자에 맞추어진다는 것을 이해하여야 한다. 특정 동물 대상에 대한 특정 투여량의 정도는 사용되는 특정 화합물의 활성, 체중, 투여 대상의 일반적 건강, 성별, 그리고 식이, 투여 시간, 투여 경로, 분비율, 약물의 조합, 그리고 조정되는 발현 또는 활성도를 포함하는 다양한 인자에 따른다는 것을 이해해야 한다.

전술한 바와 같이, 본원 발명은 말, 돼지 및 조류를 포함하며, 이에 제한되지 않는 인간 이외의 동물의 치료를 위하여 본 발명의 siRNA 조성물을 사용하는 것을 포함한다. 투여의 방법 및 투여량은 수의 약학 및 약물의 공지된 원칙에 따른다. 예를 들면, Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8th edition, Iowa State University Press; ISBN. 0813817439.2001에 안내되어 있다.

전술한 바와 같이, siRNA 또는 shRNA의 전사를 위한 주형로서 작용하는 핵산 분자는 유전자 치료 벡터로서 사용되는 벡터에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 유전자 치료 벡터는 대상에 예를 들면, 정맥 주입, 국소 투여, 또는 정위방사선(stereotactic) 주입으로 전달될 수 있다. (예컨대, Chen et al. (1994) Proc. Nad. Acad. ScL US,4 91:3054-3057 참조). 본 발명의 일부 실시예에서 유전자 치료 벡터 및 운반제를 포함하는 조성물은 구강으로 또는 흡입제로, 그리고 캡슐화 또는 분해, 등으로 부터 그들을 보호하도록 조작됨으로써 전달된다. 유전자 치료 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 수용 가능한 희석제를 포함할 수 있거나 또는 유전자 전달 매체가 임베드(imbedded)된 서방 매트릭스를 포함할 수 있다. 다른 방법으로는, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예컨대, 역전사바이러스 또는 렌티바이러스 벡터의 재조합 세포로 부터 손상되지 않은(intact) 상태로 제조될 수 있는 경우, 약제학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 또는 그 이상의 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 용기, 팩, 또는 디스펜서에 투여 방법의 설명과 함께 포함될 수 있다.

부가적인 실시예

여기서 제공되는 많은 것들은 인플루엔자 바이러스 이외의 감염성 병원체로 감염된 것에 대하여 쉽게 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 본원 발명은 그러므로 감염성 병원체의 생명 주기와 연관된 하나 또는 그 이상의 병원체-특이성 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 RNAi-유도 물질(entity) (예컨대, siRNA, shRNA, 또는 RNAi-유도 벡터)의 투여를 통하여 감염 및/또는 복제를 억제하는 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본원 발명은 몸 밖으로 부터 쉽게 접근 가능한 세포를 감염시키는 감염성 병원체에 의한 감염 및/또는 복제를 억제하는 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 세포에는 피부 세포 및 점액 세포가 포함된다. 예컨대, 호흡기, 비뇨 생식관, 그리고 눈의 세포.

이들 상태는 바이러스, 프로토조아, 및/또는 진균 병원체에 의한 감염을 포함한다. 개시된 바와 같은 본 발명의 siRNA 조성물을 이용하어 치료하기에 적절한 호흡기 감염 한타바이러스, 아데노바이러스, 단순포진 바이러스, 및d coccidiomycosis, 그리고 histoplasmosis 감염을 포함한다. 본 발명의 siRNA 조성물을 이용하어 치료하기에 적절한 비뇨기 관 및 피부 감염은 다음에 제한되는 것은 아니나, 파필로마 바이러스 (다른 상태 보다 자궁 경부암을 일으킴), 및 헤르페스 바이러스를 포함한다.

특히, RNAi-기초한 치료는 (i) 효과적인 백신이 존재하지 않고 ; 및/또는 (ii) 다른 효과적인 약물이 존재하지 않고 및/또는 존재하는 치료적 제도가 길거나 또는 어려운; 및/또는 (iii) 보다 오랜 치료를 요구하는 또는 백신 효과가 없는 유전적 변화가 일어난 병원체의 경우의 감염에 특히 적절함에 유의해야 한다. 이들 병원체는 생물학적 무기의 용도에 대한 후보인 많은 것들을 포함하며, 그러므로 예방 및 치료를 위하여 효과적인 방법을 개발하는 것이 큰 관심사이다. 파동편모충은 유전자 재조합을 통하여 표면 항원을 빈번히 바꾼다. 새로운 표면 항원을 인코드하는 전사체에 표적화된 siRNA 및 shRNA의 빠른 설계를 가능하게 하는 능력에 의하여 부여된 유연성은 표면 항원을 빨리 바꿀 수 있는 유기체에 의한 질병에 적절한 RNAi-기초한 치료를 제안하며, 따라서 면역 시스템에 기초한 접근방법을 회피한다.

각각의 경우, 당업자는 병원체의 효과적인 감염, 생존, 복제, 성숙, 등등을 위하여 필요한 또는 중요한 하나 또는 그 이상의 병원체-특이성 전사체를 선택할 것이다. 병원체-특이성 전사체는 RNAi을 위한 목표로서 작용하기 위하여 충분히 긴 영역에 걸쳐 감염되지 않은 숙주 세포에서 보통 발견되는 전사체의 서열과 다른 서열을 갖는 전사체를 의미한다. 일반적으로, 이러한 부위는 적어도 15 뉴클레오티드 길이이다. 숙주 세포 mRNA로 부터 유도된 서열을 포함하는 인플루엔자 바이러스 mRNA는 병원체-특이성 전사체로 간주됨을 유의하여야 한다. 병원체-특이성 전사체는 감염성 병원체의 게놈에 존재하겨나 또는 감염 과정에서 부수적으로 제조된다. 하나 또는 그 이상의 siRNA가 그 후 여기서 제공되는 기준에 따라 설계될 것이다.

목표 전사체의 발현을 진압하는 후보 siRNA의 능력 및/또는 치료적 제제로서 siRNA의 가능한 효능은 목표 전사체(s)의 발현을 억제할 수 있는 및/또는 감염성 병원체의 감염도, 병원성, 복제, 등을 감소시키거나 예방하는 siRNA를 선택하기 위하여 적절한 시험관 안에서 및/또는 생체 안에서의 (예컨대, 동물) 모델을 사용하여 시험한다. 적절한 모델은 감염성 병원체에따라 변화될 것이며 이 분야의 당업자에 의하여 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들면, 특정 감염성 병원체 및 특정 목적을 위하여 숙주 세포를 제공하는 것이 필요할 것이며, 다른 경우 숙주 세포 없이 siRNA의 제제에 대한 효과가 평가된다. 전술한 바와 같이 인플루엔자 감염에 대하여, siRNA가 하나 또는 그 이상의 감염 및/또는 복제 사이클의 단계에 연관된 다양한 병원체-특이성 유전자에 표적되도록 설계된다. 이러한 siRNA는 감염 전, 도중, 후에 세포에 도입되며, 다양한 단계의 감염/복제 사이클에 대한 그들의 효과는 필요에 따라 평가된다.

본 발명자들이 예를 들면 전이된 유전자, 통합된 전이유전자, 통합된 바이러스 게놈, 감염성 분자 클론, 등에 대하여, 전체 감염성 바이러스를 사용하여 감염성 병원체의 침입 및 복제 그리고 목표 전사체의 발현의 효과적인 RNAi매개된 억제를 입증한다는 것이 명백하다. 본 발명은 감염성 병원체에 의한 복제, 병원성, 또는 감염과 연관된 병원체 특이성 전사체에 표적화된 RNAi-유도 물질(entity)을 포괄한다. 바람직한 본 발명에 따른 표적화된 병원체-특이성 전사체는 병원체의 게놈 및/또는 병원체의 생명주기 동안 제조되는 다른 전사체를 포함한다. 바람직한 목표는 감염성 병원체에 특이성이며 숙주 세포에서 발견되지 않는 전사체를 포함한다. 예를 들면, 바람직한 목표는 병원체-특이성 중합효소, 시그마 인자, 전사 인자를 포함한다. 이러한 분자는 이 분야에 공지되어 있으며, 이 분야의 당업자는 병원체의 생명 주기에 대한 지식에 기초하여 적절한 목표를 선택할 수 있을 것이다. ㅇ와 관련하여, 유용한 정보는 예컨대, Fields' Virology, 4th ed., Knipe, D. et al. (eds.) Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2001; Marr, I 0 J., et al., Molecular Medical Parasitology; and Georgi's Parasitologyfor Veterinarians, Bowman, D., et al, W.B. Saunders, 2003에서 제공된다.

본 발명의 일부 실시예에서 바람직한 전사체는 특히 감염성 병원체의 병독성과 관련된 것이다. 예컨대, 병독성 유전자의 발현 생성물. 병독성 유전자를 확인하는 다양한 방법이 공지되어 있으며, 다수의 이러한 유전자가 확인되었다. 병원성 및 비병원성 바이러스, 박테리아 등의 수많은 게놈 서열의 이용은 병독성 유전자의 확인을 촉진시킨다. 유사하게, 병원성 및 비-병원성 균주를 위한 및/또는 생명 주기 병원체에서 단일 단계의 단일 균주를 위한 유전자 및 단백질 발현 프로필의 확인 및 비교 방법은 발현이 병독성인 유전자의 확인을 가능하게 한다. 예컨대, Winstanley, "Spot the difference: applications of subtractive hybridisation to the study of bacterial pathogens", JMed Microbiol 2002 Jun;51(6):459-67; Schoolnik, G, "Functional and comparative genomics of pathogenic bacteria", Curr Opin Microbiol 2002 Feb;5(l):20-6 참조. 예를 들면, 숙주 세포에 독성인 단백지을 인코드하는 병원체 유전자는 병독성 유전자로 간주되며, RNAi를 위한 바람직한 목표이다. 전통적 치료에 대하여 저항성인 병원체 관련 전사체 또한 본 발명의 일부 실시예에서 바람직한 목표이다. 이와 관련하여, 본 발명의 일부 실시예에서 목표 전사체가 병원체 게놈에 의하여 인코드될 필요는 없으나, 대신 병원체 내의 플라스미드 또는 다른 엑스트라크로모좀 인자에 의하여 인코드 된다는 것에 유의하여야 한다.

본 발명의 일부 실시예에서, 바이러스는 RS(Respiratory syncytial) 바이러스 이외의 바이러스이다. 본 발명의 일부 실시예에서 바이러스는 폴리오바이러스이외의 바이러스 이다.

RNAi-유도 물질은 전술한 바와 같이 (예컨대, 두 상보성 RNA 가닥, 헤어핀, 구조, 등등) 다양한 구조이다. 그들은 화학적으로 합성되거나, 시험관 안에서의 전사에 의하여 제조되거나, 또는 숙주 세포 내에서 제조된다.

실시예

실시예 1: 인플루엔자 A 바이러스를 억제하는 siRNA의 설계

인플루엔자 바이러스 균주의 세트로 부터 게놈 서열이 비교되었으며, 가장 보존적인 각각의 조각의 부위가 확인되었다. 이 바이러스 그룹은 새, 돼지, 말, 그리고 인간에서 유래된 바이러스를 포함하였다. 비교를 수행하기 위하여, 상이한 해에 분리된 상이한 동물 (인간이 아닌) 종으로부터의 인플루엔자 A 바이러스의 12 ~ 15 균주로 부터 개별적인 조각의 서열 및 상이한 해에 분리된 인간으로부터의 12 ~ 15 균주가 정렬되었다. 이 균주들은 광범위한 HA 및 NA 아형을 포괄하도록 선택되었다. 상이한 균주 중에서 0, 1, 또는 2 뉴클레오티드가 다른 부위가 선택되었다. 예를 들면, 다음의 균주가 NP 전사체를 목표하는 siRNA의 선택에 사용되었다. 각각 균주 이름 앞의 등록 번호는 NP 서열의 등록 번호를 지시하며 비교되는 서열의 일부분은 뉴클레오티드 번호로 지시된다.

다음 리스트의 번호 순서는 : 등록 번호, 균주 이름, 비교된 서열의 부분, 해, 아형이다. 다른 게놈 조각을 위한 등록 번호는 상이하지만, 전술한 데이터베이스에서 쉽게 찾을 수 있다.

비교되는 균주는 :

도 9는 6개의 인플루엔자 A 변이체 (이들 모두는 인간 숙주의 기원을 가짐) 중에서 고도로 보존된 PA 전사체의 특정 부위의 선택의 실시예를 도시한다. 여기서 만약 그들이 0, 1, 또는 2 뉴클레오티드가 다르면 고도로 보존된 것으로 간주된다. (이들 서열은 RNA가 아닌 DNA로서 나열되었으며 그러므로 U가 아닌 T를 함유한다 는 것에 유의해야 한다.) 균주 A/푸에르토리코/8/34 (HlNI)의 서열이 기본 서열로서, 다른 서열이 비교되는 서열로 선택되었다. 다른 세트의 멤버는 A/WSN/33 (HlNl), A/레닌그라드/134/17/57 (H2N2), A/홍콩/l/68 (H3N2), A/홍콩/481/97 (H5Nl), 그리고 A/홍콩/1073/99 (H9N2)이었다. 도면은 컴퓨터 프로그램 CLUSTAL W (1.4)에 의하여 생성된 다중의 서열 정렬을 제공한다. 기본 서열과 다른 뉴클레오티드에는 음영이 있다.

도 1O은

고도로 보존된 5가지 인플루엔자 A 변이체 (모두는 상이한 동물 숙주의 기원을 갖는다) 그리고 또한 인간 숙주의 기원을 갖는 두 균주 중에서 PA 전사체의 특정 부위를 선택하는 실시예를 도시한다. 이 부위들은 만약 0, 1, 또는 2 뉴클레오티드가 다르면 고도로 보존된 것을 간주된다. (이들 서열은 RNA가 아닌 DNA로서 나열되었으며 그러므로 U가 아닌 T를 함유한다는 것에 유의해야 한다.) 균주 A/푸에르토리코/8/34 (HlNI)의 서열이 기본 서열, 즉, 다른 서열이 비교되는 서열로서 선택되었다. 세트의 다른 멤버는 A/WSN/33 (HINI), A/닭/FPV/로스톡(Rostock)/34 (H7Nl), A/칠면조/캘리포니아/189/66 (H9M2), A/말/런던/1416/73 (H7N7), A/균혹(gall)/메릴랜드/704/77 (HI3N6), 그리고 A/돼지/홍콩/9/98 (H9N2)였다. 기본 서열과 다른 뉴클레오타드는 음영으로 표시된다.

도 9 및 10의 서열비교에서, 서열의 대부분은 고도로 보존된것의 기준에 부합하므로 많은 상이한 고도로 보존된 부위가 선택될 수 있다는 것에 유의하여야 한다. 그러나 5' 말단에 AA를 갖는 서열은 상보성 (안티센스) siRNA 가닥에서 19 뉴클레오티드 코어 서열 및 2 뉴클레오티드 3' UU 돌출을 제공한다. 그러므로 고도로 보존된 부위들은 5' 말단에 AA를 갖는 21 뉴클레오티드 부분을 확인하기 위하여 스캔되었으며, 따라서 siRNA의 안티센스 가닥에 존재하는 상보성 뉴클레오티드는 UU이다. 예를 들면, 각각 음영 서열은 5' 말단에 AA를 갖는다. 결과물인 siRNA 분자의 안티센스 가닥의 UU 3' 돌출은 표 2에 도시된 바와 같이 TT 또는 dTdT로 교체될 것이다. 그러나 안티센스 가닥의 2 nt 3' 돌출이 UU일 필요는 없다.

보다 상세한 설명으로서, 도 12는 인간 또는 동물 숙주의 기원을 갖는 12개의 인플루엔자 A 바이러스 아형 또는 분리체 중에서 NP 서열의 3'부위의 일부분 사이의 서열 비교를 도시한다 밑줄친 서열 및 밑줄친 서열 아래의 서열의 대응되는 일부분이 siRNA NP-1496을 설계하기 위하여 사용되었다. (이하 참조)- 이들 서열은 도 12에서 지시된다. 기본 서열은 균주 A/푸에르토리코/8/34의 서열이다. 음영된 문자는 기본 서열과 다른 뉴클레오티드를 지시한다.

표 1은 7개의 다른 바이러스 유전자 조각 이외에 PA 조각에 비교되는 인플루엔자 바이러스 서열 중에서 고도로 보존된 21 뉴클레오티드 부위를 나열한다. 이들 서열의 많은 경우는 그들의 5' 말단에 AA를 갖는 추가적인 기준에 부합하여 상보성 가닥에서 3' UU 돌출을 유도한다. PA 조각에서, 하나 또는 두 뉴클레오티드 차이가 존재하는 경우, siRNA의 서열은 A/WSN/33(HINI) 균주에 기초한 서열 PA-2087/2107 AAGCAATTGAGGAGTGCCTGA (SEQ ID NO: 30)을 제외하고는 A/PR8/34 (HINI) 균주에 기초하였다. 6개의 서열의 5개에서 위치 20에 G를 함유하는 반면 기본 서열은 A를 함유하는 것에 유의해야 한다. 따라서 이 경우 기본 서열의 서열이 siRNA 설계에 사용되지 않았다.

표 1 A에 나열된 서열에 기초하여 siRNA를 설계하기 위하여, 뉴클레오티드 3-21가 siRNA 센스 가닥 서열의 코어부위로서 선택되었으며, dTdT로 구성되는 두 nt 3' 돌출이 각각 결과물인 서열에 첨가되었다. 각 서열의 뉴클레오티드 1-21에 상보적인 서열이 대응되는 안티센스 가닥으로서 선택되었다. 예를 들면, 고도로 보존된 서열 PA-44/64, 즉, AATGCTTCAATCCGATGATTG (SEQ ID NO. 22)에 기초한 siRNA를 설계하기 위하여, TGCTTCAATCCGATGATTG (SEQ ID NO: 109)을 갖는19 nt 코어 부위가 선택되었다. dTdT로 구성된 두 nt 3' 돌출이 첨가되었으며, 결과물인(T를 U로 교체한 후) 서열 5' UGCUUCAAUCCGAUGAUUGdTdT- Y(SEQ ID NO: 79)가 유도되었으며, 이것은 siRNA 센스 가닥의 서열이었다. 대응되는 안티센스 siRNA 가닥 서열의 서열은 SEQ ID NO: 22, 즉, CAAUCAUCGGAUUGAAGCAdTdT (SEQ ID NO: 80)에 상보적이며, 여기서 T는 2 nt 3' 돌출을 제외하고는(여기서T는 dT로 교체됨) U로 교체되었다.

표 1B는 인플루엔자 바이러스 전사체의 부가적인 고도로 보존된 부위에 기초하여 설계된 siRNA를 나열한다. 표 1 B에서 "센스 가닥"으로 지시되는 서열의 첫번째 19 nt 서열은 고도로 보존된 부위의 서열이다. 센스 가닥 siRNA 서열은 3' 말단에 dTdT 돌출을 가지는 것으로 타나는데, 이것은 인플루엔자 바이러스 서열에 대응되지 않으며 siRNA의 선택적 특징이다. 대응되는 안티센스 가닥 또한 나타나며, 또한 선택적 특징으로서 3' 말단에 편입된 dTdT 돌출이 나타난다. 명명법은 표 1 B에서와 같으며, 예를 들면, PB2-4/22 센스는 센스 가닥이 PB2 전사체의 뉴클레오티드 4-22의 서열을 갖는 siRNA를 지시한다. PB2-4/22 안티센스는 PB2-4/22 센스에 대응되는 상보성 안티센스 가닥을 지시한다. 절단접합 부위에 걸친 전사체의 부위를 목표하는 siRNA의 경우, 절단접합되지 않는 전사체 내의 위치가 지시된다. 예를 들면, M-44-52/741-750은 절단접합된 mRNA에서 표적화된 게놈 서열의 44-52 및 741-750에 대응되는 뉴클레오티드를 지시한다.

도 9 및 1O의 음영 영역은 고도로 보존되는 것을 위한 기준에 부합되는 21 뉴클레오티드 부위의 부분을 지시한다. siRNA는 전술한 바와 같이 이들 서열에 기초하여 설계되었다. 테스트된 실제의 siRNA 서열이 표 2에 나열된다.

표 1A: 인플루엔자 A 바이러스 감염을 간섭하는 siRNA의 설계를 위한 보존된 영역

표 1B: 인플루엔자 A 바이러스 감염을 간섭하는 siRNA의 설계를 위한 보존된 영역

실시예 2: 바이러스 RNA 중합효소 또는 핵단백질을 표적하는 siRNA는 인플루엔자 A 바이러스 생산을 저해한다.

재료와 방법

세포 배양액. Dr. Peter Palese(Mount Sinai School of Medicine, New York, NY)로부터 제공된 Madin-Darby 개 신장 세포(MDCK)는 1O% 열-불활화된 FCS, 2 mM L-글루타민, 100 unit/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 성장시켰다. 세포는 37℃, 5% C0₂에서 성장시켰다. 전기천공(electroporation)을 위하여, 세포는 혈청-없는 RPMI 1640 배지에 유지시켰다. 바이러스 감염은 감염 배지(DMEM, 0.3% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma, St. Louis, MO), 10 mM Hepes, 100 unit/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신)에서 실행하였다.

바이러스. Dr. Peter Palese(Mount Sinai School of Medicine, New York, NY)로부터 제공된 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34(PR8)와 A/WSN/33(WSN), 아형 H1N1은 37℃, 10-일-미발달 계란(Charles River laboratories, MA)에서 48시간동안 성장시켰다. 요막액(allantoic fluid)은 바이러스 접종이후 48시 시점에 수집하고 -80℃에서 보관하였다.

siRNA. siRNA은 상기한 바와 같이 설계하였다. 실시예 1에 기술된 선별 기준에 따라, siRNA은 RNA 시약의 공급업자인 Dharmacon Research, Inc.(Lafayette, CO 80026)으로부터 입수가능한 Technical Bulletin #003- Revision B, "siRNA Oligonucleotides for RNAi Applications"에 기술된 원리에 따라 설계하였다. Dharmacon으로부터 입수가능한 Technical Bulletins #003( www.dharmacon.com/tech/techOO3B.html)과 #004(www.dharmacon.com/tech.tech004.htmI)에서는 siRNA 설계 매개변수, 합성 등에 관련된 다양한 정보를 제공한다. 검사된 센스와 안티센스 서열은 표 2에 기재한다.

표 2: siRNA 서열

모든 siRNA는 2'ACE 보호 화학을 이용하여 Dharmacon Research(Lafayette, CO)에 의해 합성되었다. siRNA 가닥은 제조업자의 사용설명서에 따라 탈보호하고 동몰 비율로 혼합하며 95℃로 가열하여 어닐링시키고 35℃까지 30초마다 1℃씩, 5℃까지 1분마다 1℃씩 온도를 서서히 감소시켰다.

siRNA 전기천공. MDCK 세포의 로그-단계(Log-phase) 배양액은 트립신처리하고 세척하며 혈청-없는 RPM1 1640에서 2 x 10⁷ 세포/㎖로 재부유시켰다. 0.5 ㎖ 세포는 0.4 cm 쿠벳에 위치시키고 400 V, 975 μF에서 2.5 nmol siRNA로 Gene Pulser 장치(Bio-Rad)에서 전기천공하였다. 전기천공 효율은 생존 세포의 대략 30-40%이었다. 전기천공된 세포는 10% FCS를 함유하는 DMEM 배지에서 6웰 평판의 3 웰에 분할하고 37℃, 5% C0₂에서 배양하였다.

바이러스 감염. 전기천공이후 6 내지 8시 시점에, 혈청-함유 배지는 세척하고 적절한 감염 중복도(multiplicity of infection)에서 100 ㎕의 PR8 또는 WSN 바이러스를 상기 웰에 접종하는데, 이들 각각은 대략 10⁶ 세포를 포함하였다. 세포는 1,000 PFU(1개 바이러스/1,000개 세포; M01 = 0.001) 또는 10,000 PFU(1개 바이러스/100개 세포; M01 = 0.01)의 바이러스로 감염시켰다. 실온에서 1시간 배양이후, 4 ㎍/mI of 트립신을 함유하는 2 ㎖ 감염 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포를 37℃, 5% C0₂에서 배양하였다. 지정된 시점에서, 상층액은 감염된 배양액으로부터 수집하고, 바이러스 역가는 난 적혈구(50 ㎕, 0.5%, Charles River laboratories, MA)의 혈구응집(hemagglutination)으로 측정하였다

바이러스 역가 측정. 상층액은 감염이후 24, 36, 48, 60시간 기점에 수집하였다. 바이러스 역가는 Knipe DM, Howley, PM, Fundamental Virology, 4th edition, p34에 기술된 표준 헤마글루티닌 분석으로 측정하였다. 혈구응집 분석은 V-바닥 96-웰 평판에서 실행하였다. 각 시료의 연속 2배 희석액은 난 적혈구(Charles River Laboratories)의 동등 부피의 0.5% 현탁액과 함께 얼음 위에서 1시간동안 배양하였다. 적혈구의 부착된 균질층을 보유하는 웰은 양성으로 기록하였다. 플라크 분석을 위하여, 각 시료의 연속 10배 희석액은 Fundamental Virology, 4th edition, p.32에 기술된 바와 같이 바이러스 역가를 측정하였다.

결과

인플루엔자 바이러스 복제의 억제에서 siRNA의 이용가능성을 조사하기 위하여, 다양한 인플루엔자 바이러스 A RNA를 대상으로 하였다. 구체적으로, 쉽게 감염되고 인플루엔자 바이러스를 조사하는데 폭넓게 이용되는 MDCK 세포주를 활용하였다. 각 siRNA는 전기천공으로 MDCK 세포 개체군에 개별적으로 도입하였다.

GFP(센스: 5'- GGCUACGUCCAGGAGCGCAUU -3'(SEQ ID NO: 110); 안티센스: 5'- UGCGCUCCUGGACGUAGCCUU -3'(SEQ ID NO. 111))를 표적하는 siRNA는 대조로 사용하였다. 상기 siRNA는 GFP-949로 지칭한다. 후속 실험(아래의 실시예)에서, 양 가닥의 3' 말단에서 돌출된 UU는 결과에 대한 영향없이 dTdT로 대체되었다. 대조로서 가성 전기천공을 또한 실행하였다. 전기천공이후 8시 시점에, 세포는 0.1 또는 0.01 MOI에서 인플루엔자 A 바이러스 PR8 또는 WSN로 감염시키고 표준 혈구응집 분석을 이용하여 다양한 시점(24, 36, 48, 60 시간)에서 바이러스 생산을 분석하였다. GFP 발현은 표준 방법을 이용한 유세포분석법으로 분석하였다. 도 11A와 11B에서는 실험 결과를 비교하는데, 여기서 인플루엔자 바이러스 A 균주 A/Puerto Rico/8/34(HlNl)(도 11A) 또는 인플루엔자 바이러스 A 균주 A/WSN/33(HlN1)(도 11B)의 복제를 저해하는 개별 siRNA의 능력은 HA 역가를 측정하여 결정하였다. 따라서, 높은 HA 역가는 저해 부재를 지시하는 반면, 낮은 HA 역가는 유효한 저해를 지시한다. MDCK 세포는 0.01 MOI에서 감염시켰다. 이들 실험을 위하여, PB1 분절(PB1-2257/2277)을 표적하는 siRNA, PB2 분절(PB2-2240/2260)을 표적하는 siRNA, PA 분절(PA-2087/2107(G))을 표적하는 siRNA 및 NP 게놈과 전사체(NP-231/251, NP-390/410, NP-1496/1516)를 표적하는 3가지 상이한 siRNA를 검사하였다. 주의: 도 11A와 11B에서 기호는 siRNA의 5' 뉴클레오티드만을 표시한다.

도 11A와 11B에서 기호는 아래와 같다: 채워진 사각형은 siRNA를 포함하지 않는 대조 세포를 표시한다. 열린 사각형은 GFP 대조 siRNA를 포함하는 세포를 표시한다. 채워진 원은 siRNA PB1-2257/2277을 포함하는 세포를 표시한다. 열린 원은 siRNA PB2-2240/2260을 포함하는 세포를 표시한다. 열린 삼각형은 siRNA PA-2087/2107(G)을 포함하는 세포를 표시한다. X 기호는 siRNA NP-231/251을 포함하는 세포를 표시한다. + 기호는 siRNA NP-390/410을 포함하는 세포를 표시한다. 닫힌 삼각형은 siRNA NP-1496/1516을 포함하는 세포를 표시한다. 주의: 그래프에서 특정 기호는 중첩된다. 가령, 도 11B에서 열린 삼각형과 닫힌 삼각형은 중첩된다. 설명을 위하여, 각 지점에서 수치를 제시하는 표 3과 4를 참고한다.

도 11A와 11B(표 3과 4)에 도시된 바와 같이, siRNA의 부재(가성 TF)하에 또는 대조(GFP) siRNA의 존재하에, 바이러스의 역가는 시간의 추이에서 증가하였고 감염이후 대략 48-60시 시점에 피크에 도달하였다. 대조적으로, siRNA의 존재하에 60시 시점에서 바이러스 역가는 현저하게 낮았다. 가령, 균주 WSN에서 HA 역가(바이러스 수준을 반영한다)는 대조에서보다 siRNA PB2-2240 또는 NP-231의 존재하에 대략 절반이었다. 특히, siRNA NP-1496의 존재하에 양 균주에서 바이러스 수준은 감지 한계(10,000 PFU/㎖) 미만이었다. 이는 PR8 균주에서 60배이상, WSN 균주에서 120배 이상의 계수에 의한 감소를 나타낸다. 또한, siRNA PA-2087(G) 존재하에 바이러스 수준은 균주 WSN에서 감지 한계(10,000 PFU/㎖) 미만이었고, 균주 PR8에서 극히 낮았다. siRNA에 의한 바이러스 생산의 억제는 측정된 가장 최초 시점에서도 명백하였다. 감지되지 않은 수준으로 바이러스 생산의 억제(HA 역가 측정에서)를 비롯한 효과적인 억제는 감염이후 72시 시점에도 관찰되었다.

표 5에서는 배수적 저해로 표시된 MDCK 세포에서 60시 시점에 siRNA 저해 분석의 결과를 요약한다. 따라서, 낮은 수치는 저해 부재를 지시하고, 높은 수치는 유효한 저해를 지시한다. 바이러스 유전자 내에서 siRNA의 위치는 유전자 명칭 이후의 숫자에 의해 표시된다. 본 명세서에서 상기 숫자는 유전자에서 siRNA의 출발 뉴클레오티드를 나타낸다. 가령, NP-1496은 NP 서열의 뉴클레오티드 1496에서 첫 번째 뉴클레오티드가 시작되는 NP에 특이적인 siRNA를 지시한다. 도시된 수치(배수적 저해)는 가성 트랜스펙션에 의한 헤마글루티닌 단위를 지정된 siRNA 트랜스펙션에 의한 헤마글루티닌 단위로 나누어 계산한다; 수치 1은 저해 없음을 의미한다.

인플루엔자 바이러스 게놈의 6가지 분절(PB2, PB1, PA, NP, M, NS)을 표적하는 총 20개의 siRNA를 MDCK 세포주 체계에서 검사하였다(표 5). 검사된 대략 15%의 siRNA(PB1-2257, PA-2087G, NP-1496)는 PR8 또는 WSN 바이러스의 사용 여부에 상관없이 강한 효과를 보이는데, 대부분의 경우에 MOI=0.001에서 100배 이상, MOI=0.01에서 16 내지 64배의 계수로 바이러스 생산을 저해한다. 특히, siRNA NP-1496 또는 PA-2087이 사용되는 경우에는 저해가 매우 현저하여 배양 상층액에서 헤마글루티닌 활성이 감지되지 않았다. 이들 강력한 siRNA는 3가지 서로 다른 바이러스 유전자 분절: RNA 전사효소 복합체에 관여하는 PB1과 PA 및 단일-가닥 RNA 결합 핵단백질인 NP를 표적한다. 다른 체계에서 조사 결과와 일관되게, 이들 siRNA에 의해 표적된 서열 모두 코딩 영역의 3-프라임 말단에 상대적으로 근접 위치한다(도 13).

대략 40%의 siRNA가 바이러스 생산을 현저하게 저해하긴 했지만, 저해 정도는 특정 매개변수에 따라 변하였다. 대략 15%의 siRNA는 PR8 또는 WSN 바이러스의 사용 여부에 상관없이, 바이러스 생산을 강력하게 저해하였다. 하지만, 특정 siRNA의 경우에, 저해 정도는 PR8 또는 WSN이 사용되는 지에 따라 다소 변하였다. 일부 siRNA, 예를 들면, PB2-2240, PB1-129, NP-231, M37은 초기 시점(감염이후 24 내지 36시) 또는 낮은 감염도(MOI=0.001)에서만 바이러스 생산을 현저하게 저해하였다. 이들 siRNA는 서로 다른 바이러스 분절을 표적하고, 상응하는 서열은 코딩 영역의 3-프라임 말단 또는 5-프라임 말단에 근접하여 위치한다(도 13과 표 5).

대략 45%의 siRNA는 바이러스 역가에 별다른 영향을 주지 못하였는데, 이는 이들이 MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산을 간섭하는데 무효하다는 것을 지시한다. 특히, NS 유전자 분절을 표적하는 4개의 siRNA 모두 저해 효과를 보이지 않았다.

바이러스 역가를 더욱 정확하게 산정하기 위하여, 가성 트랜스펙션 또는 NP-1496 트랜스펙션이 실행된 바이러스-감염된 세포로부터 수득된 배양 상층액에서 플라크 분석을 실시하였다(60시 시점). 대략 6 x 10⁵ pfu/㎖가 가성 상층액에서 감지된 반면, 희석되지 않은 NP-1496 상층액에서는 플라크가 감지되지 않았다(도 11C). 플라크 분석의 감지 한계가 2O pfu(플라크 형성 단위)/㎖이기 때문에, NP-1496에 의한 바이러스 생산의 저해는 적어도 30,000배이다. 0.1의 MOl에서도, NP-1496은 대략 2OO배의 계수로 바이러스 생산을 저해하였다.

siRNA의 효능을 측정하기 위하여, 일정량의 NP-1496은 MDCK 세포에 트랜스펙션시키고, 이후 PR8 바이러스로 감염시켰다. 배양 상층액에서 바이러스 역가는 헤마글루티닌 분석법으로 측정하였다. siRNA의 양이 감소함에 따라, 도 11D에 도시된 바와 같이 배양 상층액에서 바이러스 역가가 증가하였다. 하지만, 25 pmol 정도의 siRNA가 트랜스펙션에 사용되면, 가성 트랜스펙션에 비하여 대략 4배의 바이러스 생산 저해가 감지되었는데, 이는 인플루엔자 바이러스 생산의 저해에서 NP-1496 siRNA의 효능을 지시한다.

치료를 위하여, siRNA는 확립된 바이러스 감염을 효과적으로 저해할 수 있어야 한다. 전형적인 인플루엔자 바이러스 감염에서, 감염이후 대략 4시 시점에 새로운 비리온이 방출되기 시작한다. siRNA가 확립된 감염에 따른 새로 방출된 바이러스에 의한 감염을 감소 또는 제거할 수 있는 지를 확인하기 위하여, MDCK 세포를 2시간동안 PR8 바이러스로 감염시키고, 이후 NP-1496 siRNA로 트랜스펙션시켰다. 도 11E에 도시된 바와 같이, 바이러스 역가는 가성 트랜스펙션이후 시간의 추이에서 점진적으로 증가하는 반면, NP-1496 트랜스펙션된 세포에서 바이러스 역가는 약간 증가하였다. 따라서, 바이러스 감염이후 siRNA 투여가 유효하다.

이를 종합하면, 이들 결과는 (i) 특정 siRNA가 인플루엔자 바이러스 생산을 강력하게 저해할 수 있고; (ii) 인플루엔자 바이러스 생산이 NP, PA, PB1 단백질을 인코딩하는 유전자를 비롯한 서로 다른 바이러스 유전자에 특이적인 siRNA에 의해 저해될 수 있고; (Ⅲ) siRNA 저해가 siRNA의 투여 이전에, 투여와 동시에 또는 투여 이후에 감염된 세포에서 진행될 수 있음을 보여준다.

표 3: siRNA에 의한 바이러스 균주 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 생산의 저해

표 4: siRNA에 의한 바이러스 균주 A/WSN/33(H1N1) 생산의 저해

표 5: MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산에 대한 20개의 siRNA의 효과

실시예 3: 바이러스 RNA 중합효소 또는 핵단백질을 표적하는 계란에서 siRNA는 인플루엔자 A 바이러스 생산을 저해한다.

재료와 방법

SiRNA-올리고펙타민 복합체 형성 및 계란 닭 배아 접종.

siRNA는 상기한 바와 같이 제조하였다. 계란은 표준 조건하에 유지시켰다. 30 ㎕ 올리고펙타민(Oligofectamine)(제품 번호: 12252011, Life Technologies, now Invitrogen)은 30 ㎕ Opti-MEM I(Gibco)와 혼합하고 실온에서 5분동안 배양하였다. 2.5 nmol(10 ㎕) siRNA는 30 ㎕ Opti-MEM I과 혼합하고 희석된 올리고펙타민에 첨가하였다. siRNA와 올리고펙타민은 실온에서 30분동안 배양하였다. 10일령 계란은 100 ㎕ PR8 바이러스(5000 pfu/㎖)와 함께 siRNA-올리고펙타민 복합체로 접종하였다. 이들 계란은 지정된 시가동안 37℃에서 배양하고 요막액을 수집하였다. 요막액에서 바이러스 역가는 상기한 바와 같이 HA 분석법으로 검사하였다.

결과

MDCK 세포에서 결과를 확증하기 위하여, 수정된 계란에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해하는 siRNA의 능력을 또한 분석하였다. 계란에는 전기천공을 이용할 수 없기 때문에, 시험관내에서 DNA 올리고뉴클레오티드와 siRNA의 세포내 흡수를 용이하게 하는 것으로 확인된 지질-기초한 약물인 올리고펙타민을 사용하였다(25).

간단히 말하면, 도 14A에 개략적으로 도시한 바와 같이 PR8 바이러스 단독(500 pfu) 또는 바이러스 + siRNA-올리고펙타민 복합체를 10일령 계란의 요막강에 주사하였다. 요막액은 헤마글루티닌 분석법으로 바이러스 역가를 측정하기 위하여 17시간후 수집하였다. 도 14B에 도시된 바와 같이, 바이러스가 단독으로 주사되는 경우에(올리고펙타민의 존재하에), 높은 바이러스 역가가 쉽게 감지되었다. GFP-949의 동시-주사는 바이러스 역가에 별다른 영향을 주지 않았다(올리고펙타민이 없는 경우에도 바이러스 역가에서 유의한 감소는 관찰되지 않았다).

인플루엔자 바이러스에 특이적인 siRNA의 주사는 MDCK 세포에서 관찰된 결과와 일치하는 결과를 보였다: MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해한 동일한 siRNA(NP-1496, PA2087, PB1-2257)가 계란에서도 바이러스 생산을 저해한 반면, MDCK 세포에서 효과가 덜했던 siRNA(NP-231, M-37, PB1-129)는 수정된 계란에서 무효하였다. 따라서, siRNA는 수정된 계란에서 인플루엔자 바이러스 생산을 간섭하는 데에도 유효하다.

실시예 4: SiRNA는 mRNA 수준에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해한다.

재료와 방법

SiRNA 제조는 상기한 바와 같이 실행하였다.

RNA 추출, 역전사, 실시간 PCR. lX10⁷ MDCK 세포는 2.5 nmol의 NP-1496으로 전기천공하거나 가성 전기천공하였다(siRNA 없음). 8시간후, 인플루엔자 A PR8 바이러스는 MOI=O.1로 세포에 접종하였다. 감염이후 1, 2, 3-시 시점에, 상층액은 제거하고, 세포는 Trizol 시약(Gibco)으로 용해시켰다. RNA는 제조업자의 사용설명서에 따라 정제하였다. 역전사(RT)는 제조업자의 사용설명서에 따라 20-㎕ 반응 혼합물에서 200 ng의 전체 RNA, 특정 프라이머(아래 참조), Onmiscript 역전사효소 키트(Qiagen)를 이용하여 37℃에서 1시간동안 실행하였다. mRNA, NP vRNA, NP cRNA, NS vRNA 또는 NS cRNA에 특이적인 프라이머는 아래와 같았다:

mRNA, dT18 = 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO: 112)

NP vRNA, NP-367: 5'-CTCGTCGCTTATGACAAAGAAG-3'(SEQ ID NO: 113).

NP cRNA, NP-1565R:

5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT-3'(SEQ ID NO: 114).

NS vRNA, NS-527: 5'-CAGGACATACTGATGAGGATG-3'(SEQ ID NO: 115).

NS cRNA, NS-89OR:

5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3'(SEQ ID NO: 116).

1 ㎕의 RT 반응 혼합물(즉, 역전사)과 서열-특이적 프라이머는 SYBR Green I 이중-가닥 DNA 결합 염료를 포함하는 SYBR Green PCR master 혼합물(AB Applied Biosystems)을 이용한 실시간 PCR에 사용하였다. PCR은 ABI PRISM 7000 서열 감지 시스템(AB applied Biosystem)은 주기적으로 실행하고 ABI PRISM 7000 SDS 소프트웨어(AB Applied Biosystems)로 분석하였다. PCR 반응은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 이후 95℃에서 15초와 60℃에서 1분의 50회 주기로 실행하였다. 주기 시간은 0.2 형광 단위를 판독하여 분석하였다. 모든 반응물은 중복 실행하였다. 중복 실행에서 1.0 이상 변하는 주기 시간은 폐기하였다. 이후, 중복 주기 시간은 평균하고 β-액틴의 주기 시간을 감하여 정규화된 수치를 얻었다.

PCR 프라이머는 아래와 같았다:

NP RNA의 경우:

NP-367: 5'-CTCGTCGCTTATGACAAAGAAG-3'(SEQ ID NO: 117).

NP-46OR: 5'-AGATCATCATGTGAGTCAGAC-3'(SEQ ID NO: 118).

NS RNA의 경우:

NS-527: 5'-CAGGACATACTGATGAGGATG-3'(SEQ ID NO: 119).

NS-617R: 5'-GTTTCAGAGACTCGAACTGTG-3'(SEQ ID NO: 120).

결과

상기한 바와 같이, 인플루엔자 바이러스의 복제동안 vRNA는 전사되고 cRNA(이는 더 많은 vRNA 합성을 위한 주형으로 기능한다) 및 mRNA(이는 단백질 합성을 위한 주형으로 기능한다)를 생성한다(1). RNAi가 서열-특이적 방식으로 mRNA의 분해를 표적하긴 하지만(16-18), vRNA와 cRNA 역시 siRNA의 목표가 될 수 있는데, 그 이유는 인플루엔자 A 바이러스의 vRNA가 뉴클레아제에 민감하기 때문이다(1). 다양한 RNA 종의 분해에 대한 siRNA의 효과를 조사하기 위하여, 서열-특이적 프라이머를 이용한 역전사, 이후 실시간 PCR을 이용하여 vRNA, cRNA, mRNA 의 수준을 정량하였다. 도 16에서는 인플루엔자 바이러스 vRNA, mRNA, cRNA의 상관관계를 도시한다. 도 16A와 16B에 도시된 바와 같이, cRNA가 vRNA의 정확한 보체인 반면, mRNA는 5' 말단에 캡 구조와 숙주 세포 mRNA로부터 유래된 10개 내지 13개 추가의 뉴클레오티드를 보유하고, vRNA 분절의 5' 말단으로부터 하류의 15개 내지 22개 뉴클레오티드 부위에 상보적인 부위에서 시작되는 폴리A 서열을 3' 말단에 보유한다. 따라서, vRNA 및 cRNA에 비하여, mRNA는 3' 말단에 15개 내지 22개 뉴클레오티드가 부재한다. 3가지 바이러스 RNA 종을 구별하기 위하여, vRNA, cRNA, mRNA에 특이적인 프라이머를 제 1 역전사 반응에 사용하였다(도 16B). mRNA의 경우, 폴리 dT18을 프라이머로 사용하였다. cRNA의 경우, mRNA에서 소실되는 RNA의 3' 말단에 상보적인 프라이머를 사용하였다. vRNA의 경우, vRNA에 상보적이고 5' 말단에 너무 근접하지 않는다면 RNA에서 유래된 임의의 프라이머가 사용될 수 있다. RNA중 하나에서만 전사된 생성 cDNA는 실시간 PCR로 증폭하였다.

인플루엔자 바이러스 감염이후, 대략 4시 시점에 새로운 비리온이 패킹되고 방출되기 시작한다. 1차 mRNA와 cRNA 전사에 대한 siRNA의 효과를 측정하기 위하여, RNA는 감염 초기에 분리하였다. 간단히 말하면, NP-1496은 MDCK 세포로 전기천공시켰다. 가성 전기천공(siRNA 없음) 역시 실행하였다.

6 내지 8시간후, 세포는 MOI=O.1에서 PR8 바이러스로 감염시켰다. 이후, 세포는 감염이후 1, 2, 3시 시점에 용해시키고 RNA를 분리하였다. mRNA, vRNA, cRNA의 수준은 각 RNA 종에 대한 프라이머를 이용한 역전사, 이후 실시간 PCR로 분석하였다.

도 17에서는 감염이전 대략 6-8시 시점에 가성 트랜스펙션되거나 siRNA NP-1496으로 트랜스펙션된 세포에서, 바이러스 감염이후 다양한 시점에서 바이러스 NP와 NS RNA 종의 양을 보여준다. 도 17에 도시된 바와 같이, 감염이후 1시 시점에, NP siRNA 트랜스펙션된 시료와 트랜스펙션되지 않은 시료 사이의 NP mRNA 양에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 감염이후 2시 시점에, 가성 트랜스펙션 군에서 NP mRNA 수준은 38배 증가한 반면, siRNA로 트랜스펙션된 세포에서 NP mRNA 수준은 증가하지 않았다(심지어 약간 감소하였다). 감염이후 3시 시점에 mRNA 전사체 수준은 가성 트랜스펙션에서 지속적으로 상승한 반면, siRNA 처리를 받은 세포에서 NP mRNA의 지속적인 감소가 관찰되었다. NP vRNA와 cRNA는 가성 트랜스펙션에서 vRNA와 cRNA의 양적 증가가 감염후 3시 시점에서만 유의하다는 점을 제외하고 유사한 패턴을 보였다. 임의의 이론에 한정됨 없이, 이는 인플루엔자 바이러스의 생명주기에 기인하는 것으로 생각되는데, 여기서 최초 mRNA 전사는 cRNA와 vRNA 합성에 앞서 진행된다.

이들 결과는 헤마글루티닌 분석 또는 플라크 분석으로 원형의 살아있는 바이러스의 결과와 일관되게 모든 NP RNA 종의 양 역시 NP siRNA 처리에 의해 유의하게 감소한다는 것을 지시한다. siRNA가 주로 mRNA의 분해를 매개하는 것으로 알려져 있긴 하지만, 본 실험의 데이터는 NP cRNA와 vRNA의 siRNA-매개된 분해의 가능성을 배제하지 않는데, 아래에 기술된 결과는 NP mRNA 감소의 결과로서 NP 단백질 수준 감소가 NP cRNA 및/또는 vRNA의 감소된 안정성을 유발한다는 것을 암시한다.

실시예 5: RNA 간섭의 목표 확인

재료와 방법

변형되지 않은 siRNA의 SiRNA 제조는 상기한 바와 같이 실행하였다. 센스 또는 안티센스 가닥, 또는 둘 모두의 모든 뉴클레오티드 잔기에서 2'-하이드록실기가 2'-O-메틸기로 치환된 변형된 RNA 올리고뉴클레오티드 역시 Dharmacon에 의해 합성되었다. 변형된 올리고뉴클레오티드는 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드에서 기술된 바와 같이 탈보호하고 어닐링시켰다. siRNA 이중나선은 겔 전기영동으로 이중나선 형성의 완결을 분석하였다.

세포 배양, siRNA 트랜스펙션, 바이러스 감염. 이들은 상기한 바와 동일하게 실행하였다. 간단히 말하면, 변형된 NP-1496 siRNA가 포함된 실험을 위하여, MDCK 세포는 야생형(wt)과 변형된(m) 가닥으로부터 형성된 NP-1496 siRNA(2.5 mnol)로 먼저 트랜스펙션시키고, 8시간후 0.1의 MOI에서 PR8 바이러스로 감염시켰다. 배양 상층액에서 바이러스 역가는 감염후 24시 시점에 분석하였다. M-37 siRNA가 포함된 실험을 위하여, MDCK 세포는 M-37 siRNA(2.5 mnol)로 트랜스펙션시키고, 0.01 MOI에서 PR8 바이러스로 감염시키며 감염후 1, 2, 3시 시점에 RNA 분리를 위하여 수집하였다. M-37 센스와 안티센스 서열에 대하여 표 2를 참조한다.

RNA 추출, 역전사, 실시간 PCR은 상기한 바와 동일하게 실행하였다. 역전사에 이용되는 mRNA, M-특이적 vRNA, M-특이적 cRNA에 특이적인 프라이머는 아래와 같았다:

mRNA, dT₁₈ = 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO: 112)

M vRNA: 5'-CGCTCAGACATGAGAACAGAATGG-3'(SEQ ID NO: 161)

M cRNA: 5'- ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT-3'(SEQ ID NO: 162).

M RNA에 대한 PCR 프라이머는 아래와 같았다:

M 선행: 5'- CGCTCAGACATGAGAACAGAATGG - 3'(SEQ ED NO: 163)

M 역행: 5'- TAACTAGCCTGACTAGCAACCTC - 3'(SEQ ID NO: 164)

결과

siRNA가 mRNA에 더하여 vRNA 및/또는 cRNA을 간섭하는 지를 조사하기 위하여, 센스(S 또는 +) 또는 안티센스(AS 또는 -) 가닥이 변형된 NP-1496 siRNA를 합성하였다. 모든 뉴클레오티드 잔기에서 2'-하이드록실기를 2'-O-메틸기로 치환하는 변형은 이중나선 형성을 위한 염기쌍에 영향을 주지 않지만, 변형된 RNA 가닥은 RNA 간섭을 더 이상 지원하지 않는다. 다시 말하면, 센스 가닥이 변형되지만 안티센스 가닥이 야생형인 siRNA(mS:wtAS)는 센스 가닥에 상보적인 서열이 아닌 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 보유하는 RNA의 분해를 지원한다. 대조적으로, 센스 가닥이 야생형이지만 안티센스 가닥이 변형된 siRNA(wtS:mAS)는 센스 가닥에 상보적인 서열을 보유하는 RNA의 분해를 지원하지만 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 보유하는 RNA의 분해를 지원하지 않는다. 이런 현상은 동시 분할 특허 출원 Ser. No. 60/446,387, "Reducing RNAi Background"에서 더욱 상세하게 기술한다.

MDCK 세포는 가성 트랜스펙션 또는 NP-1496 siRNA 트랜스펙션을 실행하는데, 여기서 센스 가닥(mS:wtAS) 또는 안티센스 가닥(wtS:mAS)이 변형되고 다른 가닥은 야생형이다. 세포는 또한, 양 가닥이 변형된 NP-1496 siRNA(mS:mAS)로 트랜스펙션시켰다. 이후, 세포는 PR8 바이러스로 감염시키고, 상층액에서 바이러스 역가를 측정하였다. 도 18A에 도시된 바와 같이, 높은 바이러스 역가는 가성 트랜스펙션된 배양액에서 감지되었다. 예상된 바와 같이, 매우 낮은 바이러스 역가는 야생형 siRNA(wtS:wtAS)로 트랜스펙션된 배양액에서 감지되지만, 양 가닥이 변형된 siRNA(mS:mAS)로 트랜스펙션된 배양액에서도 높은 바이러스 역가가 감지되었다. 안티센스 가닥이 변형된 siRNA(wtAS:mAS)로 트랜스펙션된 배양액에서 바이러스 역가는 높은 반면, 센스 가닥만 변형된 siRNA(mS:wtAS)로 트랜스펙션된 배양액에서 바이러스 역가는 낮았다. 임의의 이론에 한정됨 없이, 인플루엔자 바이러스 생산을 저해하기 위한 siRNA 이중나선의 야생형 안티센스(-) 가닥의 필요는 RNA 간섭의 목표가 mRNA(+), cRNA(+), 또는 둘 모두임을 암시한다.

이들 가능성을 확증하기 위하여, 상응하는 mRNA, vRNA, cRNA의 축적에 대한 siRNA의 효과를 검사하였다. 한 무리의 동시 감염된 세포에서 전사를 추적하기 위하여, siRNA-트랜스펙션된 MDCK 세포는 감염후 1, 2, 3시 시점(새로운 비리온의 방출과 재-감염이전에)에 RNA 분리를 위하여 수집하였다. 바이러스 mRNA, vRNA, cRNA는 먼저 특정 프라이머를 이용한 역전사로 cDNA로 개별적으로 전환시켰다. 이후, 각 cDNA의 수준을 실시간 PCR로 정량하였다. 도 18B에 도시된 바와 같이, M-특이적 siRNA M-37이 이용되는 경우에, 감염후 1-2시 시점에 M-특이적 mRNA는 거의 감지되지 않았다.

감염후 3시 시점에, M-특이적 mRNA는 M-37의 부재하에 용이하게 감지되었다. M-37로 트랜스펙션된 세포에서, M-특이적 mRNA의 수준은 대략 50% 정도 감소하였다. 대조적으로, M-특이적 vRNA와 cRNA의 수준은 M-37의 존재에 의해 저해되지 않았다. 임의의 이론에 제한됨 없이, 이들 결과는 바이러스 mRNA가 아마도 siRNA-매개된 간섭의 목표임을 지시한다.

실시예 6: 바이러스 RNA 축적에 대한 특정 siRNA의 광범위한 효과

결과

SiRNA 제조는 상기한 바와 같이 실행하였다.

RNA 추출, 역전사, 실시간 PCR은 실시예 3에 기술된 바와 같이 실행하였다. mRNA, NP vRNA, NP cRNA, NS vRNA, NS cRNA, M vRNA 또는 M cRNA에 특이적인 프라이머는 실시예 4와 5에 기술된 바와 동일하였다. 역전사에 이용되는 PB1 vRNA, PB1 cRNA, PB2 vRNA, PB2 cRNA, PA vRNA 또는 PA cRNA에 특이적인 프라이머는 아래와 같았다:

PB1 vRNA: 5'-GTGCAGAAATCAGCCCGAATGGTTC-3'(SEQ ID NO: 165)

PB1 cRNA: 5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT-3'(SEQ ID NO: 166)

PB2 vRNA: 5'-GCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTG-3'(SEQ ID NO: 167)

PB2 cRNA: 5'-ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT-3'(SEQ ID NO: 168)

PA vRNA: 5'-GCTTCTTATCGTTCAGGCTCTTAGG-3'(SEQ ID NO:169)

PA cRNA: 5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT-3'(SEQ ID NO: 170)

PB1, PB2, PA RNA에 대한 PCR 프라이머는 아래와 같았다:

PB1 선행: 5'-CGGATTGATGCACGGATTGATTTC-3'(SEQ ID NO: 171)

PB1 역행: 5'-GACGTCTGAGCTCTTCAATGGTGGAAC-3'(SEQ ID NO. 172).

PB2 선행: 5'-GCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTG-3'(SEQ ID NO: 173)

PB2 역행: 5'-AATCGCTGTCTGGCTGTCAGTAAG-3'(SEQ ID NO: 174)

PA 선행: 5'-GCTTCTTATCGTTCAGGCTCTTAGG-3'(SEQ ID NO: 175)

PA 후행: 5'-CCGAGAAGCATTAAGCAAAACCCAG-3'(SEQ ID NO: 176)

결과

NP-1496이 NP 유전자 분절의 분해를 특이적으로 표적하는 지의 여부 또는 NP 이외의 다른 바이러스 RNA의 수준 역시 영향을 받는 지의 여부를 확인하기 위하여, NS에 특이적인 프라이머를 RT와 실시간 PCR에 이용하여 실시예 4에서 상기한 바와 같이 서로 다른 NS RNA 종(mRNA, vRNA, cRNA)의 양을 측정하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, NS mRNA, vRNA, cRNA에서 변화는 NP RNA에서 관찰되는 패턴과 동일한 패턴을 보였다. 감염후 3시 시점에, 가성 트랜스펙션된 세포에서 모든 NS RNA 종의 유의한 증가가 관찰된 반면, NP-1496 siRNA를 포함하는 세포에서 NS RNA 수준의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 이런 결과는 서로 다른 바이러스 RNA의 전사와 복제가 적어도 NP RNA에 관하여 협력적으로 조절된다는 것을 지시한다. 협력적 조절은 한 전사체의 수준이 직접적 또는 간접적으로 다른 전사체의 수준에 영향을 준다는 것을 의미한다. 특정한 기전은 수반되지 않는다. NP 전사체가 siRNA 처리에 의해 분해되는 경우, 다른 바이러스 RNA의 수준 역시 감소한다.

다른 바이러스 RNA에 대한 NP siRNA의 효과를 더욱 탐구하기 위하여, NP-1496으로 처리된 세포에서 모든 바이러스 유전자의 mRNA, vRNA, cRNA의 축적을 측정하였다. 도 19A(상부 패널)에 도시된 바와 같이, NP-특이적 mRNA는 감염후 1-2시 시점에 낮았다. 감염후 3시 시점에, NP mRNA는 NP-1496의 부재하에 용이하게 감지된 반면, NP-1496의 존재하에 NP mRNA의 수준은 배경 수준으로 유지되었는데, 이는 siRNA가 특정 mRNA의 축적을 저해한다는 것을 지시한다. 도 19A(중간과 하부 패널)에 도시된 바와 같이, NP-특이적이고 NS-특이적인 vRNA와 cRNA의 수준은 NP-1496의 존재에 의해 상당히 감소하였다. 이들 결과는 실시예 4에 기술된 결과를 확증한다. 이에 더하여, NP-1496-처리된 세포에서, M, NS, PB1, PB2, PA 유전자의 mRNA, vRNA, cRNA의 축적 역시 저해되었다(도 19B, 19C, 19H). 게다가, 광범위한 저해 효과는 PA-2087에서도 관찰되었다. 도 19E, 19F, 19G에서 좌측의 상부, 중간, 하부 패널은 도 19A, 19B, 19C에 제시된 바와 동일한 결과를 보이는데, 이는 NP-1496 siRNA에 의한 바이러스 mRNA 전사 및 바이러스 vRNA와 cRNA 복제의 저해를 입증한다. 도 19E, 19F, 19G에서 우측의 상부, 중간, 하부 패널은 동일 농도에서 PA-2087 siRNA로 실행된 동일한 실험의 결과를 제시한다. 도 19E의 우측 상부, 중간, 하부 패널에 도시된 바와 같이, 감염후 3시 시점에 PA, M, NS mRNA는 PA-2087의 부재하에 용이하게 감지되는 반면, PA-2087의 존재는 PA, M, NS mRNA의 축적을 저해하였다. 도 19F의 우측 상부, 중간, 하부 패널에 도시된 바와 같이, 감염후 3시 시점에 PA, M, NS vRNA는 PA-2087의 부재하에 용이하게 감지되는 반면, PA-2087의 존재는 PA, M, NS vRNA의 축적을 저해하였다. 도 19G의 우측 상부, 중간, 하부 패널에 도시된 바와 같이, 감염후 3시 시점에 PA, M, NS cRNA는 PA-2087의 부재하에 용이하게 감지되는 반면, PA-2087의 존재는 PA, M, NS cRNA의 축적을 저해하였다. 이에 더하여, 도 19H에서는 NP-특이적 siRNA가 PB1-(상부 패널), PB2-(중간 패널), PA-(하부 패널) 특이적 mRNA의 축적을 저해한다는 것을 보여준다.

임의의 이론에 제한됨 없이, 본 발명자들은 NP siRNA의 광범위한 효과가 NP-특이적 siRNA가 RNA 분해를 비-특이적으로 표적하기 때문이 아닌 vRNA와 cRNA의 결합과 안정화에서 NP의 중요성에 기인한 것으로 제안한다. 인플루엔자 바이러스에서 NP 유전자 분절은 단일-가닥 RNA 결합 핵단백질을 인코딩하는데, 이는 vRNA와 cRNA 모두에 결합할 수 있다(참조: 도 15). 바이러스 생명 주기동안, NP mRNA는 가장 먼저 전사되고 번역된다. NP 단백질의 일차적 기능은 RNA 전사, 복제, 패킹을 위하여 바이러스 게놈을 단백질 막으로 둘러싸는 것이다. NP 단백질의 부재하에, vRNA와 cRNA 모두의 전장 합성은 상당히 손상된다. NP siRNA가 NP RNA의 분해를 유도하는 경우에, NP 단백질 합성은 손상되고 이로 인한 충분한 NP 단백질의 부재는 다른 바이러스 유전자 분절의 복제에 영향을 주게 된다. 이런 방식으로, NP siRNA는 매우 초기 단계에서 바이러스 생산을 강력하게 저해할 수 있다.

감염된 세포에서 NP 단백질 분자의 숫자는 mRNA 합성 vs. 게놈 RNA(vRNA와 cRNA) 복제의 수준을 조절하는 것으로 가정되고 있다(1). NP 단백질에서 온도-감수성 돌연변이를 이용하여, 기존의 연구에서는 mRNA가 아닌 cRNA 합성이 생체와 시험관내 모두에서 온도 감수성임을 확인하였다(70, 71). NP 단백질은 미성숙 cRNA와 vRNA 전사체의 신장과 종결방지에 요구되는 것으로 밝혀졌다(71, 72). 앞서 제시한 이들 결과는 NP-특이적 siRNA가 감염된 세포에서 모든 바이러스 RNA의 축적을 저해한다는 것을 입증한다. 임의의 이론에 제한됨 없이, NP-특이적 siRNA의 존재하에, 새로 전사된 NP mRNA가 분해되고, 결과적으로 바이러스 감염이후 NP 단백질 합성이 저해되는 것으로 생각된다. 새로 합성된 NP가 없으면, 추가적인 바이러스 전사와 복제 및 새로운 비리온 생산이 저해된다.

유사하게, PA-특이적 siRNA의 존재하에, 새로 합성된 PA mRNA가 분해되고, 결과적으로 PA 단백질 합성이 저해된다. 인플루엔자 비리온당 30-60개 사본수의 RNA 전사효소의 존재에도 불구하고(1), 새로 합성된 RNA 전사효소가 없으면 추가적인 바이러스 전사와 복제는 저해될 가능성이 높다. PB1에 특이적 siRNA에서 유사한 결과가 달성되었다. 대조적으로, 세포기질(M) 단백질은 바이러스 감염의 후기 단계(late phase)까지 필요하지 않다(1). 따라서, M-특이적 siRNA는 M-특이적 mRNA의 축적을 저해하긴 하지만 vRNA, cRNA 또는 다른 바이러스 RNA의 축적을 저해하지 못한다. 이를 종합하면, 이들 조사 결과는 인플루엔자 바이러스 RNA 전사와 복제에서 새로 합성된 핵단백질과 중합효소 단백질에 대한 필수적인 요구를 입증한다.

NP-, PA-, PB1 - 특이적 siRNA가 mRNA 축적 및 다른 바이러스 RNA 전사를 간섭하는 mRNA-와 바이러스-특이적 기전은 이들 siRNA가 인플루엔자 바이러스 감염의 특히 강력한 저해물질임을 암시한다. 특히, 이들 결과는 일반적으로, 병원체-특이적 핵산(DNA 또는 RNA)에 정상적으로 결합하는 RNA 또는 DNA 결합 단백질을 인코딩하는 전사체를 표적하는 siRNA가 표적된 RNA의 수준을 단순히 감소시키기 보다는 광범위한 효과(예, 다른 병원체-특이적 전사체에 대한 효과)를 보인다는 것을 암시한다. 유사하게, 이들 결과는 일반적으로, 감염성 병원체의 중합효소 유전자(RNA 중합효소, DNA 중합효소 또는 역전사효소)를 표적하는 siRNA가 중합효소 RNA의 수준을 단순히 감소시키기 보다는 광범위한 효과(예, 다른 병원체-특이적 전사체에 대한 효과)를 보인다는 것을 암시한다.

실시예 7: siRNA에 의한 바이러스 RNA 축적의 광범위한 저해는 인터페론 반응 또는 바이러스-유도된 RNA 분해에 기인하지 않는다.

재료와 방법

RNA 수준의 측정. RNA 수준은 표준 조건하에 PCR을 이용하여 측정하였다. 아래의 PCR 프라이머가 γ-액틴 RNA의 측정에 이용되었다.

γ-액틴 선행: 5'-TCTGTCAGGGTTGGAAAGTC-3'(SEQ ID NO: 177)

γ-액틴 역행: 5'-AAATGCAAACCGCTTCCAAC-3'(SEQ ID NO: 178)

Vero 세포의 배양 및 인산화된 PKR의 측정은 아래에 언급된 참고문헌에 기술된 표준 기술에 따라 실행하였다.

결과

바이러스 RNA 축적의 광범위한 저해에 대한 한가지 가능 원인은 siRNA의 존재하에 감염된 세포의 인터페론 반응이다(23, 65, 66). 따라서, 모든 α, β, ω 유전자를 비롯한 전체 IFN 좌위가 결실된 Vero 세포에서 상기한 실험을 반복하였다(67, 68)(Q.G. and J.C. 비공개 데이터). MDCK 세포에서처럼, NP-, M-, NS-특이적 mRNA의 축적은 NP-1496에 의해 저해되었다(도 19D). 이에 더하여, β-액틴, γ-액틴, GAPDH를 비롯한 세포 유전자로부터 전사체의 수준에 대한 siRNA의 효과를 PCR로 분석하였다. siRNA의 존부하에 전사체 수준에서 유의한 차이는 감지되지 않는데(도 18C 하부 패널은 γ-액틴 mRNA에 대한 M-37 siRNA의 효과 부재를 보여준다), 이는 siRNA의 저해 효과가 바이러스 RNA에 특이적임을 지시한다. 이들 결과는 특정 siRNA에 의한 바이러스 RNA 축적의 광범위한 저해가 세포 인터페론 반응에 기인하지 않음을 암시한다.

인플루엔자 바이러스 감염이후, dsRNA의 존재 역시 분해를 위하여 RNA를 표적하는 세포 경로를 활성화시킨다(23). 이런 경로의 활성화에 대한 siRNA의 효과를 검사하기 위하여, 이런 경로의 가장 중요한 성분인 인산화된 단백질 키나아제 R(PKR)의 수준을 분석하였다(23). 바이러스 감염의 부재하에 NP-1496로 MDCK 세포의 트랜스펙션은 활성화된 PKR의 수준에 영향을 주지 않았다(데이터 제시하지 않음), 인플루엔자 바이러스에 의한 감염은 기존 연구와 일관되게, 인산화된 PKR의 수준을 증가시켰다(65, 66, 69). 하지만, 이런 증가는 NP-1496의 존부에 상관없이 동일하였다(데이터 제시하지 않음). 따라서, 바이러스 RNA 축적의 광범위한 저해는 siRNA의 존재하에 강화된 바이러스-유도된 분해에 기인하지 않는다.

실시예 8: 단독으로 또는 공동으로 인플루엔자 바이러스 생산을 저해하는 우수한 능력을 지닌 siRNA의 체계적 확인

본 실시예에서는 인플루엔자 바이러스 생산을 저해하는 우수한 능력을 지닌 siRNA의 체계적 확인 방법을 기술한다. 본 실시예에서는 siRNA에 주목하지만, 이중나선 일부분이 아래에 기술된 siRNA의 이중나선 일부분과 동일하고 상기한 바와 같이 서열이 변하는 루프(loop)를 보유하는 shRNA의 평가에도 동일한 방법이 적용될 수 있다.

이론적 근거: 예방과 치료 목적으로, 인플루엔자 바이러스 생산을 저해하는 우수한 능력을 보이는 siRNA를 확인하는 것이 바람직하다. 상기한 바와 같이, 20개의 siRNA를 설계하고 검사하였는데, 이들 중에서 19개가 5' 말단에 AA 이중-뉴클레오티드를 보유하는 고도로 보존된 서열에 기초하였다. 상기 위치에서 AA 이중-뉴클레오티드의 존재가 초기에는 siRNA 기능에 중요한 것으로 생각되었지만, 최근의 연구 결과는 상기 위치에서 다른 뉴클레오티드를 보유하는 서열에 기초한 siRNA가 동등하게 유효하기 때문에(22, 28), 이들이 필요하지 않다는 것을 지시한다. 따라서, AA로 시작하는 서열에 기초하여 설계된 추가적인 siRNA를 설계하고 검사하여 인플루엔자 바이러스 생산을 효과적으로 저해하는 다른 siRNA를 확인해야 한다.

몇몇 강력한 저해 siRNA의 이용가능성은 이들의 병용을 가능하게 한다. 폴리오바이러스의 siRNA 저해에 대한 최근의 한 연구에서는 단일 siRNA의 사용이 siRNA에 의해 표적될 수 없는 기존의 변이 폴리오바이러스의 외생을 유도한다는 것을 확인하였다(24). 인플루엔자 바이러스가 높은 비율로 돌연변이하는 것으로 알려져 있기 때문에(4), 단일 siRNA의 사용은 저항성 바이러스의 외생을 조장하고, 따라서 일정한 기간이후 siRNA의 무효를 초래할 수 있다. 다른 한편, 2가지 이상의 서로 다른 siRNA, 특히 서로 다른 바이러스 RNA에 특이적인 siRNA가 동시에 사용되면 저항성 바이러스가 출현할 가능성은 1 크기 자리수(order of magnitude) 이상 감소한다. 따라서, siRNA는 가장 효과적인 조합을 찾기 위하여 2가지 이상의 조합으로 검사된다.

본 실시예에서는 아래의 목적을 달성하는 체계적인 방식을 기술한다:

1). 인플루엔자 바이러스 게놈의 전체 보존된 영역이 비-중복 siRNA에 의해 1회 포함되도록 siRNA를 설계하고 검사한다.

2). 높은 중복 감염도(MOI)를 갖는 siRNA를 선별함으로써 가장 강력한 저해 siRNA를 확인한다.

3). 저항성 바이러스의 출현을 예방하는데 효과적인 siRNA의 가장 강력한 조합을 확인한다.

추가적인 siRNA의 설계와 검사. 실시예 1에 기술된 siRNA에 포함되지 않는 바이러스 게놈의 보존된 영역에 특이적 추가적인 siRNA를 설계한다. 2가지 이유로 비-중복 RNA가 선택된다. 첫째, 중복 siRNA의 동시 적용은 목표 서열의 일부가 공유되기 때문에 가장 효과적인 조합을 제공하지 못한다. 중복 영역에서 돌연변이는 양 siRNA를 무효화시킨다. 둘째, 광범위한 스크린동안, 중복 siRNA의 숫자가 너무 많기 때문에 일정한 기간내에 검사하기가 어렵다. 목적은 PA, PB1, PB2. NP, M, NS 각각에 대한 적어도 하나의 강력한 siRNA를 수득하는 것이다(RNA 절단접합에 의해, M과 NS 유전자는 각각 2개의 단백질을 인코딩한다. 가능하면, 동일 유전자로부터 양 전사체에 특이적인 siRNA를 설계한다). NP, PA, PB1에 특이적인 강력한 siRNA는 이미 확인되었다(표 5). 이런 이유로, 초점은 P132, M, NS에 특이적인 추가의 siRNA 후보를 검사하는데 집중된다. 비-중복 siRNA 검사에서 이들 유전자에 대한 강력한 siRNA가 확인되지 않으면, 중복 siRNA 후보를 검사한다. 6가지 유전자 각각에 특이적인 강력한 저해 siRNA의 이용가능성은 가장 강력한 조합의 확인을 가능하게 한다.

추가적인 비-중복 siRNA를 설계하기 위하여, AA 이중-뉴클레오티드가 요구되지 않는다는 점을 제외하고 실시예 1 및 상세한 설명에 기술된 동일한 기준을 이용하였다. 이들 기준에 기초하여, 대략 40개의 siRNA를 검사하는 것이 바람직할 것으로 추정된다. 단일 가닥 RNA RNA 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 합성하고 상보적인 가닥에 어닐링시킨다. 생성된 siRNA 이중나선은 헤마글루티닌 분석법에 의한 측정으로, MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산(PR8, WSN, 또는 둘 모두)을 간섭하는 능력을 검사하였다. 상기 세포주에서 효과적인 siRNA는 계란에서 추가로 평가한다. 세포와 배아 모두에서 양 아형의 바이러스에 일관된 저해 효과를 보이는 siRNA가 추후 평가에 바람직하다.

siRNA의 효능 비교. 인플루엔자 바이러스 생산을 유의하게 저해하는 siRNA가 확인되면, 동일한 분석법에서 이들의 효능을 비교하여 가장 강력한 siRNA를 확인한다. MDCK 세포를 이용한 상기한 대부분의 분석에서, 바이러스 0.001 또는 0.1의 MOI로 사용되었다. 헤마글루티닌 분석에서 2가지 시료(NP-1496과 PA-2087)에서 바이러스 역가가 감지되지 않았고, 플라크 분석에서 한 시료(NP-1496)에서 바이러스 역가가 감지되지 않았다. 이들 siRNA, 특히 동일 유전자에 특이적인 siRNA의 효능을 구별하기 위하여, MDCK 세포를 감염시키는데 이용된 MOI를 0.1 이상으로 증가시킨다. siRNA는 계란에서도 검사하였다. 플라크 분석법을 이용하여 바이러스 역가를 더욱 정확하게 측정한다.

이에 더하여, siRNA의 효능은 트랜스펙션에 사용된 siRNA의 양을 적정하여 비교한다. 간단히 말하면, 서로 다른 양의 siRNA(예, 0.025, 0.05, 0.1, 0.25 nmol)를 MDCK 세포(1 x 10⁷)에 전기천공하였다. 세포는 고정된 MOI(예, 0.01)에서 PR8 또는 WSN 바이러스로 감염시키고, 배양 상층액은 60시간후에 수집하고 혈구응집으로 바이러스 역가를 측정한다. 이들 실험의 결과는 각 siRNA의 상대적 효능 및 최대 저해에 필요한 최소량을 결정하는데 유용하다. 후자는 각 siRNA가 아래에 기술된 조합에서 얼마의 양으로 사용될 지를 결정하는데 유용하다.

siRNA의 가장 강력한 조합 확인. 단일 siRNA에 의한 간섭을 회피할 수 있는 변이체 바이러스의 출현을 예방하기 위하여, 2개이상의 서로 다른 siRNA의 동시 사용을 고려할 수 있다. 8가지 바이러스 유전자에 대한 강력한 siRNA가 확인되면, 조합에서 이들의 효능을 검사한다. 적절하게는, 적어도 2가지 유전자를 표적하는 강력한 siRNA를 확인한다. 더욱 적절하게는, 적어도 3, 4, 5, 6, 7 또는 8가지 모든 유전자를 표적하는 강력한 siRNA를 확인한다. 하지만, 처음에는 8가지 미만, 예를 들면, 5가지 또는 6가지 유전자로 검사를 한정하는 것이 바람직하다. 이들 연구에서, 아래의 고려사항이 중요하다; 동일 혼합물에 사용된 서로 다른 siRNA의 총수, ii) “칵테일”에 사용된 각 siRNA의 최소량, Ⅲ) 가장 강력한 조합을 확인하는 가장 강력한 가장 효율적인 방법.

인플루엔자 바이러스의 돌연변이 비율은 감염 주기당 1.5 x 10^-5/뉴클레오티드로 추정된다(4). 서로 다른 유전자에 특이적인 2개의 siRNA가 동시에 사용되면, 저항성 바이러스의 출현 가능성은 2.25 x 10^-10이다. siRNA가 특히 안티센스 가닥의 말단(28)과 3' 절반에서 1개 뉴클레오티드 미스매치를 빈번하게 관용할 수 있는 점을 고려하면(26), 2개의 siRNA의 동시 사용은 저항성 바이러스의 출현을 예방하는데 매우 유효하다. 조합으로 3개의 siRNA를 사용하면 충분하다. 이런 계산은 혼합물에서 siRNA가 독립적으로 작용한다는 가정에 기초한다. 초기에는 siRNA 단독을 이용하여 앞서 측정된 인플루엔자 바이러스 생산의 최대 저해에 필요한 siRNA의 최소량을 이들 조합에 이용한다. 일부 연구에서, 포유동물 세포와 초파리(Drosophila)에서 RNAi 조직이 제한적인 것으로 확인되었다(27, 29, 30). 이것이 인플루엔자 바이러스 생산에서 RNA 간섭의 원인이 될 수 있기 때문에, 조합에서 각 siRNA에 대한 감소된 양, 예를 들면, 2개의 조합에서 siRNA의 반-극대량을 검사한다.

첫째, 2개의 siRNA의 검사 조합을 체계적으로 검사한다. 이런 전략의 장점은 2개의 siRNA의 가장 강력한 조합뿐만 아니라 3개의 siRNA의 조합에서 강력한 성분을 산출한다는 점이다. 서로 다른 유전자 또는 바이러스 생명 주기의 상이한 단계에 특이적인 2개의 siRNA의 조합이 잠재적인 상승적 효과로 인하여 좀더 바람직하긴 하지만, 전사효소의 상이한 성분에 특이적인 siRNA의 조합을 검사하는 것도 가치가 있는데, 그 이유는 이들이 풍부하지 않은 단백질이고 바이러스 생산에 필수적이기 때문이다. 각 유전자(PA, PB1, PB2, NP, M, NS)에 대한 하나의 강력한 siRNA가 확인되었다고 가정하면, 2개의 siRNA의 모든 가능한 조합을 포함시키기 위하여 15가지 조합을 검사하는 것이 필요하다.

siRNA는 개별적으로 또는 2개의 조합으로 전기천공에 의해 MDCK 세포에 도입된다. 8시간후, 세포는 미리-결정된 MOI에서 PR8 또는 WSN 바이러스로 감염시키고, 배양 상층액은 혈구응집으로 바이러스 역가를 분석하기 위하여 60시간후 수집한다. 헤마글루티닌 단위가 실질적으로 적은 시료에서 정확한 역가는 플라크 분석법으로 측정한다. siRNA의 조합은 계란에서 분석하여 상기 세포주로부터 결과를 확증한다.

이런 일련의 실험으로부터 결과는 2개의 siRNA의 조합에서 상대적 효능 및 2개의 siRNA의 조합이 상승적 효과를 나타내는 지를 제시한다. 가령, NP-1496과 PA-2087의 조합이 NP-1496 + PA-2087의 개별적인 부가 효과보다 높은 효과를 나타내는 경우에, 이런 조합은 상승적 효과를 나타내게 된다. 이들 결과는 3개의 siRNA의 어떤 조합이 최적의 효과를 나타내는 지를 지시한다. 가령, NP-1496과 PA-2087의 조합이 NP-1496 또는 PA-2087 단독보다 더욱 유효하고, PA-2087과 PB1-2257의 조합이 PA-2087 또는 PB1-2257 단독보다 더욱 유효하다고 가정하는 경우에, NP-1496, PA-2087, PB1-2257을 함유하는 칵테일에서 3개의 siRNA가 특히 유효할 수 있다. MDCK 세포와 계란 배아에서 유효할 가능성이 가장 높은 적어도 3개의 siRNA 칵테일의 효능을 측정한다. 2개의 siRNA의 조합으로부터 결과가 유용하지 않으면, 3개의 siRNA 칵테일의 효능은 2개의 siRNA 칵테일을 검사하는 경우에서처럼 체계적으로 검사한다. 모든 가능성을 포함하기 위하여, 10가지의 서로 다른 조합을 검사해야 한다.

요약하면, 제안된 실험으로부터 얻은 결과는 8가지 인플루엔자 바이러스 유전자의 보존된 영역으로부터 가장 강력한 siRNA 및 인플루엔자 바이러스 생산의 저해에서 이들의 가장 유효한 조합을 확증하게 된다.

실시예 9: siRNA의 세포 흡수를 조장하는 비-바이러스 운반제의 평가

본 실시예에서는 다양한 비-바이러스 운반제에서 siRNA의 세포 흡수를 강화시키는 능력에 대한 검사를 기술한다. 후속 실시예는 아래에 기술된 바와 같이 검사된 다수의 중합체로 양성 결과를 보이는 데이터를 제공한다. 다른 운반제 역시 유사하게 검사한다.

양이온성 중합체. DNA의 세포내 흡수를 촉진하는 양이온성 중합체의 능력은 효율적인 세포내이입을 위하여 DNA에 결합하고 대형 플라스미드 DNA 분자를 좀더 작은 DNA/중합체 복합체로 압축하는 이들의 능력으로부터 부분적으로 기인하는 것으로 생각된다. siRNA 이중나선은 짧은데(예, 21개 뉴클레오티드 길이), 이는 이들이 더 이상 압축될 수 없음을 암시한다. siRNA 전구물질, 예를 들면, shRNA 역시 상대적으로 짧다. 하지만, 음으로 하전된 siRNA에 결합하고 음으로 하전된 세포 표면과 상호작용하는 양이온성 중합체의 능력은 siRNA와 shRNA의 세포 흡수를 조장한다. 따라서, 공지된 양이온성 중합체, 예를 들면, PLL, 변형된 PLL(예, 아실, 숙시닐, 아세틸 또는 이미다졸 기로 변형된 PLL(32)), 폴리에틸렌이민(PEI)(37), 폴리비닐피롤리돈(PVP)(38), 키토산(39,40)은 siRNA와 shRNA의 운반제로서 유망한 후보이다.

이에 더하여, Robert Langer's laboratory에서 개발된 신규한 양이온성 중합체와 올리고머 역시 운반제로서 유망한 후보이다. DNA 트랜스펙션에 사용하기 위하여 디아크릴레이트와 아민 단량체로부터 신규한 양이온성 중합체와 올리고머의 대형 라이브러리를 합성하고 검사하는 효율적인 전략이 개발되었다. 이들 중합체는 폴리(β-아민 에스테르)(PAE) 중합체로 지칭하였다. 첫 번째 연구에서, 7개 디아크릴레이트 단량체와 20개 아민 단량체로부터 140개의 단량체 라이브러리를 합성하고 검사하였다(34). 140개 구성원 중에서, 70개는 충분한 수용성(2 ㎎/㎖, 25 mM 아세트산염 완충액, pH = 5.0)을 보였다. 70개의 수용성 중합체 중에서 56개는 전기영동 이동성 시프트(electrophoretic mobility shift)에 의해 입증된 바와 같이 DNA와 상호작용하였다. 가장 중요하게는, 56개의 중합체 중에서 2개가 DNA의 COS-7 세포로의 트랜스펙션을 매개하였다. 이들 신규한 중합체의 트랜스펙션 효율은 PEI보다 4-8배 높았고 리포펙틴 2000 이상이었다.

최초 연구이후, 2,400 양이온성 중합체 라이브러리가 구축되고 선별되었으며, 효율적인 DNA 트랜스펙션을 촉진하는 대략 40개의 중합체가 수득되었다(118). 구조적 변이가 DNA 결합 및 트랜스펙션 효율에 상당한 영향을 줄 수 있기 때문에(33), 여러 중합체에서 siRNA의 세포 흡수를 촉진하는 능력을 검사하는 것이 바람직하다. 게다가, 생체 체계, 다시 말하면, 포유동물 개체에서 특정 중합체가 생체내 성능, 흡수도, 대사, 배출(ADME)에 관한 연구 결과로서 배제될 수도 있다. 따라서, 완전한 유기체에서 검사가 중요하다.

종합하면, 적어도 50개의 양이온성 중합체를 siRNA 트랜스펙션 실험에서 검사하였다. 이들 대부분은 상기한 바와 같이 PAE와 이미다졸기-변형된 PLL이다. PEI, PVP, 키토산은 상업적 업자로부터 구입할 수 있다. 이들 중합체를 신속하고 효율적으로 선별하기 위하여, 세포를 성공적으로 트랜스펙션시킨 PAE 중합체 라이브러리는 용액으로 96-웰 평판에 이전하였다. 이런 표준 96 웰 형식에 중합체의 보관은 무균 Labcyte EDR 384S/96S 마이크로피펫터(micropipettor) 로봇을 이용한 반-자동화 선별의 직접적인 개발을 가능하게 한다. 중합체의 양을 적정하여(siRNA의 미리 결정된 양을 이용하여) 적절한 중합체 siRNA 비율과 가장 효율적인 전달 조건을 정의한다. 특정 분석에 따라, 이런 반-자동화 선별은 아래에 기술된 바와 같이 약간 수정될 수 있다.

siRNA/중합체 복합체의 특성화. siRNA의 세포내 흡수를 조장하는 다양한 양이온성 중합체는 siRNA와 복합체를 형성할 수 있어야 한다. 이런 문제는 기존 문헌에 기술된 프로토콜과 유사한 프로토콜에 따라 전기영동 이동성 시프트 분석(EMSA)으로 검사하였다(34). 간단히 말하면, NP-1496 siRNA는 마이크로피펫터 로봇을 이용하여 96-웰 평판에서 1:0.1, 1:0.3, 1:0.9, 1:2.7, 1:8.1, 1:24.3(siRNA/중합체, w/w)의 비율로 50여개의 각 중합체와 혼합한다. 혼합물은 다중채널 피펫터를 이용하여 최대 500개의 시료를 분석할 수 있는 4% 아가로스 겔 면봉에 적하한다. siRNA의 이동 패턴은 브롬화에티듐 염색으로 가시화시킨다. 중합체의 존재하에 siRNA의 이동성이 감소하면, siRNA는 상기 중합체와 복합체를 형성한다. siRNA:중합체의 비율에 기초하여, 중화 비율을 확인하는 것이 가능하다. siRNA에 결합하지 않는 중합체는 덜 바람직하고, siRNA에 결합하는 중합체에 추가 조사를 집중한다.

이미다졸기-변형된 PLL, PEI, PVP, 키토산 및 일부 PAE 중합체의 세포독성을 단독으로 또는 세포주에서 DNA와의 복합체에서 측정한다. 세포독성이 결합된 분자에 따라 변하기 때문에, siRNA와 복합된 다양한 중합체와 변형된 중합체의 세포독성을 MDCK 세포에서 측정한다. 간단히 말하면, NP-1496은 상기한 바와 같이 무균 Labcyte 마이크로피펫터 로봇을 이용하여 서로 다른 함량의 중합체와 혼합한다. 복합체는 96-웰 평판에서 4시간동안 MDCK 세포에 가한다. 이후, 중합체-함유 배지는 정상적인 성장 배지로 교체한다. 24시간후, 세포의 대사 활성을 MTT 분석법으로 96-웰 형식에서 측정한다(41). 최소량에서 90% 이상의 세포를 사멸시키는 중합체는 덜 바람직하고, 최소량에서 90% 이상의 세포를 사멸시키지 않는 중합체에 추가 조사를 집중한다.

일부 경우에 DNA/중합체 조성물을 이용하여 유사한 연구를 실행하였는데, RNA/중합체 조성물에서와 유사한 결과(예, 세포독성, 세포 흡수의 촉진)가 달성되는 지를 확인하는 것이 중요하다.

배양된 세포에 의한 siRNA 흡수. siRNA/중합체 복합체가 특성화되면, 2가지 상이한 분석 시스템을 이용하여 배양 세포에서 siRNA의 세포 흡수를 촉진하는 능력을 검사한다. 첫 번째 방식에서, GFP-특이적 siRNA(GFP-949)는 GFP-발현 MDCK 세포에서 검사하는데, 그 이유는 GFP 발현에서 감소가 형광 강도를 측정함으로써 용이하게 정량화되기 때문이다. 간단히 말하면, 상기한 바와 동일한 비율에서 GFP-949/중합체를 96-웰 평판에서 MDCK 세포에 가한다. 음성 대조로서, NP-1496 또는 siRNA 없음을 이용한다. 양성 대조로서, GFP-949를 전기천공으로 세포에 도입한다. 36시간후, 세포는 96-웰 평판에서 용해시키고, 용해질의 형광 강도는 형광 평판 판독기로 측정하였다. siRNA의 세포 흡수를 촉진하는 다양한 중합체의 능력은 GFP 강도의 전반적인 감소로 확인된다. 대안으로, 세포는 96-웰 형식에서 시료를 취급하기 위하여 구비된 유세포분석기를 이용하여 GFP 발현을 분석한다. siRNA의 세포 흡수를 촉진하는 다양한 중합체의 능력은 GFP 강도가 감소한 세포의 비율 및 GFP 강도에서 감소 정도로 확인된다. 이들 분석으로부터 결과는 최대 효율의 트랜스펙션을 위한 최적의 siRNA:중합체 비율을 제공한다.

두 번째 방식에서, MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산의 저해를 직접 측정한다. 상기한 바와 같이, 다양한 비율에서 NP-1496 siRNA/중합체는 96-웰 평판에서 MDCK 세포에 가한다. 양성 대조로서 siRNA는 전기천공으로 MDCK 세포에 도입한다. 음성 대조로서 GFP-949 또는 siRNA 없음을 이용한다. 8시간후, 세포는 미리결정된 MOI에서 PR8 또는 WSN 바이러스로 감염시킨다. 배양 상층액은 60일후 수집하고 헤마글루티닌 분석으로 96-웰 평판에서 희석없이 바이러스를 분석한다. 최초 분석에서 낮은 바이러스 역가를 보인(따라서, siRNA/중합체 조성물이 바이러스 생산을 저해한다) 웰로부터 상층액은 희석하고 혈구응집으로 분석한다. 감염된 세포가 궁극적으로 용해되기 때문에, 대사 활성의 상대적 수준 역시 바이러스 감염 저해의 지표를 제공한다.

바이러스 역가 또는 대사 활성이 처리되지 않은 배양액보다 siRNA/중합체로 처리된 배양액에서 실질적으로 낮은 경우, 상기 중합체가 siRNA 트랜스펙션을 촉진한다고 결론한다. siRNA가 전기천공으로 도입된 배양액에서 바이러스 역가를 비교하여, siRNA와 siRNA/중합체 조성물의 상대적 트랜스펙션 효율을 산정한다.

최초 2번의 선별로부터 가장 효과적인 양이온성 중합체는 siRNA와 중합체를 모두 적정함으로써 96-웰 평판에서 바이러스 감염 분석으로 확증한다. 달성된 결과에 기초하여, 24-웰 평판과 6-웰 평판에 담긴 MDCK 세포에서 추가로 분석한다. 가장 효과적인 중합체는 실시예10에 기술된 바와 같이 생쥐에서 추가 분석으로 선별한다.

대안적 방식. 배양된 세포에서 siRNA의 세포내 흡수의 효과적인 촉진을 위한 양이온성 중합체의 대안으로서, siRNA 트랜스펙션 실험에서 아르기닌-풍부한 펩티드를 조사한다. ARP가 음으로 하전된 인지질과 상호작용하여 혈장막을 직접 침투하는 것으로 생각되는 반면(48), 현재 사용되는 대부분의 양이온성 중합체는 세포내이입에 의해 DNA의 세포 흡수를 촉진하는 것으로 생각되기 때문에, siRNA의 세포내 흡수 촉진에서 ARP의 효능을 조사한다. 양이온성 중합체와 유사하게, ARP와 폴리아르기닌(PLA) 역시 양으로 하전되고 siRNA에 결합할 수 있는데, 이는 siRNA를 ARP 또는 PLA에 공유 결합시키는 것이 불필요하다는 것을 암시한다. 이런 이유로, ARP 또는 PLA는 양이온성 중합체와 유사하게 처리한다. siRNA의 세포 흡수를 촉진하는 Tat 및 상이한 길이의 PLA(Sigma)로부터 ARP의 능력은 상기한 바와 같이 측정한다.

실시예 1O: 생쥐에서 siRNA와 siRNA/운반제 조성물의 검사

이론적 근거: 생쥐의 호흡기에서 세포에 의한 siRNA 재흡수를 촉진하는 확인된 중합체의 능력을 평가하고, 인플루엔자 바이러스 감염의 예방과 치료에서 siRNA의 효능을 조사한다. 생쥐에서 입증된 인플루엔자 바이러스 감염의 siRNA 저해는 예로써 siRNA의 비강내 또는 폐 투여에 의해 사람에서 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료에서 잠재적 효용을 증명한다. siRNA를 세포에 효과적으로 전달하고 인플루엔자 바이러스 감염을 효과적으로 치료 또는 예방하는 siRNA-함유 조성물을 확인하는 방법은 본 실시예에서 기술한다. 명료하게 하기 위하여, 본 실시예에서는 siRNA/중합체 조성물의 검사를 기술한다. 다른 siRNA/운반제 조성물, 예를 들면, siRNA/양이온성 중합체 조성물, siRNA/아르기닌-풍부한 펩티드 조성물 등의 검사에 유사한 방법을 이용할 수 있다.

투여 루트. 인플루엔자 바이러스가 상부 기도와 폐에서 상피 세포를 감염시키기 때문에, 호흡기에서 siRNA를 상피 세포로 전달하는 방법에 집중한다. 여러 다양한 방법, 예를 들면, 주입(instillation), 에어로졸(액체와 건성-분말) 흡입, 기관지내 투여, 정맥내 주사를 이용하여 소형 분자 약물, 단백질, DNA/중합체 복합체를 생쥐의 상부 기도 및/또는 폐에 전달한다. 주입의 경우, 생쥐는 약간 마취시키고 직립으로 유지시킨다. 소량(일반적으로, 30-50㎕)의 치료제(즉, siRNA/중합체 복합체)는 액체가 흡입되는 콧구멍으로 서서히 투여한다. 동물은 짧은 기간동안 직립으로 유지시켜 주입된 액체가 폐에 도달할 수 있도록 한다(53). 주입은 치료제를 상부 기도와 폐 모두에 전달하는데 유효하고 동일 생쥐에 수회 반복될 수 있다.

에어로졸의 경우, 액체와 건성-분말은 일반적으로 상이하게 투여된다. 액체 에어로졸은 분무기에 의해 생쥐가 위치하는 밀폐된 플라스틱 케이지에 생성된다(52). 에어로졸은 동물이 호흡할 때 흡입되기 때문에, 이런 방법은 비효율적이고 부정확하다. 건성-분말 에어로졸은 일반적으로, 마취된 생쥐에 강제된 환기로 투여된다. 상기 방법은 에어로졸 입자가 크고 다공성이면 매우 효과적일 수 있다(31). 기관지내 투여를 위하여, 치료제를 함유하는 용액은 튜브를 통하여 마취된 생쥐의 폐에 주사한다(54). 이는 폐로의 전달에 매우 효과적이긴 하지만, 상부 기도를 거치지 않는다. 단백질 및 폴리에틸렌이민과 복합된 소량의 DNA(~1 ㎍)의 정맥내 주사는 폐의 간질 조직에서 내피 세포를 트랜스펙션시키는 것으로 밝혀졌다(55). 이런 고려사항에 기초하여, siRNA/중합체 복합체는 먼저 주입으로 생쥐에 투여한다. 대형 다공성 입자를 이용한 정맥내 전달과 에어로졸 전달 역시 탐구한다. 이에 더하여, 정맥내와 복강내 주사를 비롯한 다른 전달 방법 역시 검사한다.

호흡기에서 세포에 의한 siRNA 재흡수. 실시예 9에서 기술된 바와 같이 확인된 가장 효과적인 중합체들은 생쥐의 호흡기에서 siRNA의 세포내 재흡수를 촉진하는 능력을 검사한다. 조사를 용이하게 하기 위하여, GFP-발현 유전자도입 생쥐에서 GFP-특이적 siRNA(GFP-949)에 의한 GFP 발현의 저해를 이용한다. 초기에 GFP-특이적 siRNA를 사용하는 이점은 이런 분석의 간단함과 정확성이 생쥐에서 효과적인 중합체의 확인을 가속화시킬 수 있기 때문이다. 이에 더하여, 달성된 결과는 생체내에서 siRNA를 흡수하는 세포의 부위와 유형을 제공한다. 후자 정보는 호흡기에서 상피 세포로 siRNA의 최적 전달을 위한 운반제와 투여 방법을 수정하는데 유용하다.

간단히 말하면, 점진적 용량(graded dose)의 GFP-949/중합체 복합체(실시예 9에서 확인된 바와 같이 가장 효과적인 비율에서)를 주입으로 GFP 유전자도입 생쥐에 투여한다. 대조로서, 생쥐에 siRNA 단독, 또는 중합체 단독, 또는 없음, 또는 비-특이적 siRNA/중합체 복합체를 투여한다. 상부 기도와 폐로부터 조직은 siRNA 투여이후 36 내지 48시 시점에 수집하고 OCT에 담그고 동결한다. 단편은 형광 현미경하에 GFP 강도를 위하여 가시화시키고, 인접 단편은 헤마톡실린/에오신(H/E)으로 염색한다. 대안으로, 조직은 파라포름알데하이드에 고정시키고 OCT에 담근다. 일부 단편은 H&E로 염색하고, 인접 단편은 BRP-공액된 항-GFP 항체로 염색한다. 조직학적 오버레이(overlay)와 GFP 영상(또는 항-GFP 염색)은 GFP 발현이 저해된 세포 부위 또는 유형을 확인할 수 있다. 증가된 민감도를 위하여, 조직은 공초점 검경으로 검사하여 GFP 강도가 감소한 부위를 확인한다.

주입에 의한 DNA 트랜스펙션으로부터 조사 결과에 기초하여(52, 56), siRNA는 호흡기의 내강 표면에서 상피 세포에 의해 주로 흡수될 것으로 예상된다. GFP 강도에서 유의한 감소가 대조 생쥐와 비교하여 GFP-949/중합체 처리된 생쥐에서 관찰되는 경우, 이는 특정 중합체가 생체내에서 siRNA의 세포 흡수를 촉진한다는 것을 지시한다.

생쥐에서 인플루엔자 바이러스 감염의 siRNA 저해. GFP 유전자도입 생쥐에서 상기 GFP-949 연구 이외에, 생쥐에서 siRNA 재흡수 촉진에서 가장 효과적인 중합체들은 인플루엔자 바이러스에 특이적인 siRNA, 예를 들면, NP-1496 또는 2-3개의 siRNA “칵테일”을 이용하여 검사한다. 최초 연구에서, siRNA/중합체 복합체와 인플루엔자 바이러스는 주입에 앞서 siRNA/중합체 복합체와 바이러스를 혼합함으로써 동일 일자에 도입한다. 점진적 용량(graded dose)의 siRNA/중합체 복합체와 PR8 바이러스(미리 결정된 분량에서)를 사용한다. 대조로서, 생쥐에 siRNA 단독, 또는 중합체 단독, 또는 없음, 또는 GFP-949/중합체를 제공한다. 감염이후 다양한 시점(예, 2-3 일, 또는 그 이상, 예를 들면, 수일 내지 수주 또는 그 이상)에서, 비강 세척액을 제조하고 동결과 해동으로 폐액을 균질화시켜 바이러스를 용리시킨다. 세척액과 폐액에서 바이러스 역가는 혈구응집으로 측정한다. 역가가 혈구응집 분석법으로 감지하기에 너무 낮으면, 바이러스는 혈구응집 분석에 앞서 MDCK 세포에서 증폭시킨다. 바이러스 역가의 더욱 정확한 측정을 위하여, 선택된 시료에서 플라크 분석을 실행한다.

단일 분량의 siRNA/중합체가 인플루엔자 감염을 저해하는데 유효하지 않으면, siRNA(상대적으로 높은 용량에서)의 복수 투여를 조사하여 복수 투여가 더욱 유효한 지를 확인한다. 가령, 최초 siRNA/중합체와 바이러스 투여이후, 생쥐에 2일동안 매 12시간마다 siRNA/중합체를 제공한다(4회 투약). 폐액과 비강 세척액에서 바이러스 역가는 최초 주사이후 다양한 시점에서 측정하였다.

이들 실험으로부터 결과는 siRNA가 상부 기도와 폐에서 인플루엔자 바이러스 감염을 저해하는데 유효한 지를 입증하고, 가장 효과적인 단일 분량을 제공한다. siRNA/중합체의 복수 투여는 인플루엔자 바이러스 감염의 치료에서 단일 투여보다 더욱 효과적일 것으로 예상된다. siRNA/중합체 전달을 위한 상이한 방식, 예를 들면, 아래에 기술된 방식뿐만 아니라 다른 중합체 또는 운반제를 탐구한다.

대형 다공성 입자를 이용한 siRNA 중합체 전달. 상부 기도와 폐로의 다른 효율적인 전달 방법은 Robert Langer 그룹에 의해 최초로 개발된 대형 다공성 입자를 이용한다. 액체-기초한 주입과 대조적으로, 후자 방법은 치료제를 운반하는 대형 다공성 입자(건성-분말)의 흡입에 기초한다. 최초 연구에서, 이들은 치료제와 폴리(락트산-글리콜산)(PLGA) 또는 폴리(락트산-리신-그래프트-리신)(PLAL-Lys)의 이중-에멀젼 용매 증발이 대형 다공성 입자의 생성을 유도한다는 것을 확인하였다(31). 이들 입자는 0.4 gram/㎤ 미만의 질량 밀도와 5 ㎛를 초과하는 평균 직경을 보유한다. 이들은 낮은 밀도로 인하여 폐 깊숙이 효율적으로 흡입될 수 있다(57). 쥐에 의한 대형 다공성 인슐린-함유 입자의 흡입은 소형 비다공성 입자의 4시간에 비하여 96시간동안 인슐린의 상승된 전신 수준 및 전신 글루코오스 수준의 억제를 유도한다.

흡입용으로 FDA-승인되거나 폐에 내인성인(또는 둘 모두인) 부형제를 이용하여 대형 다공성 입자를 생산하는 과정이 개발되었다(58). 이런 과정에서, 수용성 부형제(즉, 락토오스, 알부민 등)와 치료제는 증류수에 용해시켰다. 용액은 Niro Atomizer Portable Spray Dryer(Niro, Inc., Colombus, MD)에 공급하여 건조 분말을 생산하는데, 상기 분말은 3 내지 15 ㎛의 평균 기하학적 직경 및 0.04 내지 0.6 g/㎤의 탭 밀도(tap density)를 보유한다.

분무-건조 방법을 이용하여 치료제가 siRNA/중합체로 대체된 점을 제외하고 Langer에 의해 기술된 siRNA/중합체를 함유하는 대형 다공성 저-밀도 입자를 생산한다. 생성된 입자는 기존 문헌(31, 58)에 기술된 바와 같이 다공성, 밀도, 크기를 특성화한다. 상기한 기준에 도달한 입자는 Harvard 환풍기를 이용한 강제 환기로 마취된 동물에 투여한다. GFP 또는 인플루엔자 바이러스에 특이적인 siRNA를 사용하는 지에 따라, 상기한 바와 같이 상이한 분석을 실시한다. 대형 다공성 입자로 특이적인 siRNA/중합체가 제공된 생쥐에서 GFP 발현 또는 바이러스 역가가 대조 생쥐에서보다 유의하게 낮은 경우, 대형 다공성 입자를 통한 에어로졸 흡입은 siRNA 전달을 위한 효과적인 방법으로 생각된다.

siRNA/중합체 복합체의 예방적, 치료적 적용. 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 예방제 또는 치료제로서 siRNA/중합체 복합체의 효능을 검사한다. 단일 분량의 siRNA/중합체 복합체가 유효하다고 가정하면, 투여이후 siRNA/중합체 복합체가 인플루엔자 감염을 간섭하는데 유효한 시간을 사정한다. siRNA/중합체 복합체는 주입 또는 대형 다공성 에어로졸(상기한 바와 같이 더욱 유효한 방법)로 생쥐에 투여한다. 생쥐는 즉시, 또는 1, 2 또는 3일후 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 감염이후 24 내지 48시 시점에 비강 세척액과 폐액에서 바이러스 역가를 측정한다. siRNA가 3일후에 여전히 유효한 것으로 확인되면, 생쥐는 siRNA/중합체 투여이후 4, 5, 6, 7일에 감염시키고, 조직은 감염후 24시 시점에 수집하여 바이러스 역가를 분석한다. 이들 실험으로부터 결과는 투여이후 siRNA가 얼마나 오랫동안 생쥐에서 바이러스 생산을 간섭하는데 유효한 지를 제시하고 사람에서 사용을 가능하게 한다.

siRNA의 치료 효능을 평가하기 위하여, 생쥐는 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 감염이후 상이한 시점에서 siRNA/중합체 복합체를 제공한다. 구체적으로, 생쥐는 비강내 감염시키고, 즉시, 또는 1, 2 또는 3일후 siRNA/중합체의 효과량을 제공한다. 대조로서, 생쥐에 감염 직후에 GFP-949 또는 siRNA 없음을 제공한다. 비강 세척액과 폐액에서 바이러스 역가는 siRNA 투여이후 24 또는 48시 시점에 측정한다.

이에 더하여, 생쥐는 치사량의 인플루엔자 바이러스로 감염시키고 5가지 군(군당 5-8마리)으로 분할한다. 1 군은 효과량의 siRNA/중합체 복합체를 즉시 제공한다. 2 내지 4 군은 효과량의 siRNA/중합체 복합체를 각각 감염후 1일 내지 3일에 제공한다. 5 군은 감염 직후에 GFP-특이적 siRNA를 제공하고 대조로 이용한다. 감염된 생존의 생존을 추적한다. 이들 실험으로부터 결과는 감염이후 siRNA의 투여가 생쥐에서 얼마나 오랫동안 치료 효과를 발휘하는 지를 제시한다.

실시예 11: DNA 벡터 또는 렌티바이러스에 의해 제공된 주형으로부터 전사된 siRNA에 의한 인플루엔자 바이러스 감염의 저해

이론적 근거. 인플루엔자 바이러스 감염의 유효한 siRNA 치료는 생체내에서 적절한 세포로 충분량의 siRNA를 전달하는 능력에 좌우된다. 저항성 바이러스의 출현을 예방하기 위하여, 2-3개의 siRNA를 함께 사용하는 것이 바람직하다. 2-3개 siRNA의 동일 세포로의 동시 전달은 효율적인 전달 시스템을 요한다. 상기한 방식의 대안으로, siRNA 전구물질이 전사될 수 있고 효과적인 siRNA로 가공될 수 있는 DNA 벡터의 이용을 탐구한다.

상기한 바와 같이, DNA 벡터로부터 전사된 siRNA는 동일 세포로 도입된 합성 siRNA와 동일한 정도로 CD8α발현을 저해할 수 있다. 구체적으로, CD8α유전자를 표적하는 5개의 siRNA중 하나(CD8-61)는 생쥐 CD8⁺CD4⁺ T 세포주에서 CD4가 아닌 CD8 발현을 저해하는 것으로 밝혀졌다(27). CD8-61 siRNA의 다양한 헤어핀 유도체를 검사함으로써, CD8-61F가 CD8-61과 유사한 저해 활성을 갖는다는 것을 확인하였다(도 20A와 20B)(59). 헤어핀 구조로 인하여, CD8-61F는 CD8-61F가 H1 RNA 프로모터에 의해 구동된 DNA 벡터인 pSLOOP Ⅲ에 작제하였다(도 20C). H1 RNA 프로모터는 밀집되고(60) 중합효소 Ⅲ(pol Ⅲ)에 의해 전사되었다. Pol Ⅲ 프로모터를 이용하였는데, 그 이유는 상기 프로모터가 기존 문헌에서 밝힌 바와 같이 짧은 RNA를 전사하고 siRNA-형 침묵(silencing)을 발생시키는데 사용되었기 때문이다(61). DNA 벡터를 검사하기 위하여 CD8α 발현 벡터로 트랜스펙션된 HeLa 세포를 이용하였다. 도 20D에 도시된 바와 같이, CD8α-발현 HeLa 세포로 pSLOOP Ⅲ-CD8-61F 플라스미드의 일시적인 트랜스펙션은 합성 CD8-61 siRNA로 트랜스펙션된 HeLa 세포와 동일한 정도로 CD8α 발현을 감소시켰다. 대조적으로, 프로모터-없는 벡터의 트랜스펙션은 CD8α 발현을 유의하게 감소시키지 않았다. 이들 결과는 RNA 헤어핀이 DNA 벡터로부터 전사될 수 있고 RNA 침묵을 위하여 siRNA로 가공될 수 있음을 입증한다. 유사한 방식을 이용하여, 인플루엔자 바이러스에 특이적인 siRNA 전구물질을 발현하는 DNA 벡터를 설계할 수 있다.

배양된 세포에서 DNA 주형으로부터 전사된 siRNA의 조사. DNA 벡터로부터 siRNA 전구물질을 발현하기 위하여, siRNA 이중나선으로 가공될 수 있는 siRNA(인플루엔자 바이러스에 특이적인)의 헤어핀 유도체를 설계한다. 이에 더하여, 2개이상의 siRNA 전구물질이 전사될 수 있는 벡터를 생산한다. 이들 조사를 가속화시키기 위하여, GFP를 발현하는 MDCK 세포에 GFP-949와 NP-1496 siRNA를 사용한다. CD8-61F 설계이후, 각각 GFP-949H와 NP-1496H라고 하는 GFP-949와 NP1496의 헤어핀 유도체를 합성한다(도 21A).

GFP-949와 GFP-949H 모두 GFP-발현 MDCK 세포에 전기천공한다. NP-1496 또는 가성 전기천공은 음성 대조로 이용한다. 24시간과 48시간후, 세포는 유세포분석법으로 GFP 발현을 분석한다. GFP-양성 세포의 비율과 GFP 수준의 강도가 GFP-949H를 포함하는 배양액에서 유의하게 감소되면, 헤어핀 유도체의 효능이 입증되게 된다. 이의 효능은 표준 GFP-949를 포함하는 세포에서 GFP 강도를 비교하여 나타낸다.

유사하게, NP-1496과 NP-1496H는 MDCK 세포에 전기천공한다. GFP-949 또는 가성 전기천공은 음성 대조로 이용한다. 트랜스펙션후 8시 시점에, 세포는 PR8 또는 WSN 바이러스로 감염시킨다. 배양 상층액에서 바이러스 역가는 감염후 60시 시점에 혈구응집으로 측정한다. 바이러스 역가가 NP-1496H를 포함하는 배양액에서 유의하게 감소되면, 헤어핀 유도체는 바이러스 생산을 저해한다. 이들 헤어핀 유도체는 CD8-61F 연구에 기초하여 작용할 것으로 예상된다. 그렇지 않으면, 기존 문헌(59, 61, 62)에 기술된 바와 유사한 상이한 설계의 헤어핀 유도체를 합성하고 검사한다.

DNA 벡터의 설계 및 배양된 세포에서 이들의 검사. GFP-949H와 NP-1496H가 작용하는 것으로 확인되면, 상응하는 발현 벡터를 작제한다. GFP-949H와 NP-1496H는 pSLOOP Ⅲ 벡터에서 H1 프로모터 뒤에 개별적으로 클론한다(도 21C 상부). 생성된 벡터는 전기천공으로 GFP-발현 MDCK 세포에 일시적으로 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션된 세포는 GFP 강도를 분석하거나 바이러스로 감염시키고 바이러스 생산을 분석한다. 높은 수준의 siRNA 전구물질 발현을 유도하는 것으로 확인된 U6 Pol M 프로모터 및 다른 프로모터를 검사하여 siRNA 전구물질 전사에 적합한 프로모터를 확인한다.

단일 siRNA 전구물질을 전사하는 벡터가 유효한 것으로 확인되면, 2개의 siRNA 전구물질을 전사할 수 있는 벡터를 작제한다. 이를 위하여, GFP-949H와 NP-1496H는 5' 말단에 GFP949H와 3' 말단에 NP-1496H, 또는 다른 방식으로 직렬로 pSLOOP Ⅲ 벡터에 클론한다(도 21C, 중간). 생성된 벡터에서, 2개의 siRNA 전구물질이 헤어핀 구조에 존재하는 여분의 뉴클레오티드에 의해 연결된다. 2개의 siRNA가 단일 전사체로부터 가공될 수 있는 지가 알려져 있지 않기 때문에, GFP-949H와 NP-1496H가 개별 프로모터에 의해 전사되는 벡터를 또한 작제한다(도 21C, 바닥).

MDCK 세포에서 트랜스펙션 효율이 대략 50%이기 때문에, 일시적인 트랜스펙션은 2개의 siRNA 전구물질을 인코딩하는 벡터를 평가하는데 이상적이지 않다. 이런 이유로, 안정적인 형질감염체(transfectant)는 GFP-발현 MDCK 세포를 선형 벡터 + neo-저항성 벡터로 전기천공하여 확립한다. DNA를 다중 형질감염체로부터 분리하여 서던 블랏팅으로 siRNA 발현 벡터의 존재를 확증한다. 양성 형질감염체는 GFP 발현을 분석하여 안정적으로 통합된 벡터로부터 전사된 GFP-특이적 siRNA가 GFP 발현을 저해할 수 있는 지를 확인한다. GFP 발현이 저해된 이들 형질감염체는 PR8 또는 WSN 바이러스로 감염시키고, 바이러스 역가는 혈구응집으로 측정한다. 상당한 비율의 형질감염체에서 GFP 발현과 바이러스 생산이 모두 저해된다는 조사 결과는 2개의 siRNA 전구물질이 단일 DNA 벡터로부터 전사되고 가공될 수 있다는 것을 확립한다.

단일 siRNA 전구물질이 전사되는 벡터 작제는 기존 문헌에서 유사한 방식이 성공적으로 이용되었기 때문에, 직접적으로 실행한다(59). 여러 연구 결과에서 2개의 유전자가 동일한 프로모터와 종결 서열을 이용한 동일 벡터로부터 독립적으로 전사될 수 있는 것으로 확인되었기 때문에, 2개의 siRNA 전구물질이 동일한 벡터로부터 전사될 수 있다. 후자 방식에서, siRNA 전구물질은 독립적으로 전사된다. 생성된 dsRNA 전구물질의 길이는 50개 뉴클레오티드 미만이다. 대조적으로, 2개의 siRNA 전구물질이 직렬로 전사되는 경우에(도 21B와 21C), 생성된 dsRNA 전구물질은 50개 뉴클레오티드보다 길다. 50개 뉴클레오티드보다 긴 dSRNA의 존재는 포유동물 세포에서 인터페론 반응을 활성화시킨다(22, 23). 따라서, 동일 벡터로부터 2개의 siRNA 전구물질의 독립적 전사의 다른 이점은 인터페론 반응을 회피하는 것이다. 인터페론은 바이러스 감염을 저해하여 유용할 수도 있지만, 이런 반응은 많은 대사 경로를 차단시켜 세포 기능을 간섭한다(63).

인터페론 반응이 다양한 DNA 벡터로 트랜스펙션된 MDCK 세포에서 유도되는 지를 확인하기 위하여 전체와 인산화된 dsRNA-의존성 단백질 키나아제(PKR)의 수준을 분석하는데, 그 이유는 PKR의 인산화가 인터페론 반응에 요구되기 때문이다(23). 벡터-트랜스펙션 세포와 가성-트랜스펙션된 세포로부터 제조된 세포 용해질은 SDS-PAGE에서 분획한다. 단백질은 막으로 이전하고, 상기 막은 인산화된 PKR 또는 전체 PKR에 특이적인 항체로 탐침한다. 이런 분석이 충분히 민감하지 않으면, 면역침전, 이후 웨스턴 블랏팅을 실행한다. 활성화된 PKR의 수준에서 차이가 관찰되지 않으면, DNA 벡터로부터 전사된 dsRNA 전구물질은 인터페론 반응을 활성화시키지 않는다. siRNA의 세포내 합성에 바람직한 DNA 벡터는 인터페론 반응을 활성화시키지 않고, 따라서 본 발명은 이런 벡터를 제공한다.

생쥐에서 DNA 벡터의 조사. DNA 벡터로부터 전사된 siRNA가 MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해할 수 있는 것으로 확인되었기 때문에, 생쥐에서 이들의 효능을 조사하였다. 도입된 플라스미드 DNA의 세포 게놈으로의 통합을 최소화시키기 위하여, 초나선 DNA를 일시적인 발현에 이용한다. 일시적인 발현의 다른 장점은 아마도 통합이전에 세포당 플라스미드 사본수가 높기 때문에 발현 수준이 높게 나타난다는 점이다. 생쥐에서 DNA 트랜스펙션을 조장하기 위하여, 유전자 치료를 위하여 개발된 양이온성 중합체, 예를 들면, 실시예 8에 기술된 바와 같은 이미다졸기-변형된 PLL, PEI, PVP, PAE를 사용한다.

구체적으로, GFP-949H 또는 NP-1496H 단독 또는 NP-1496H와 GFP-949H 둘 모두를 발현하는 DNA 벡터는 미리결정된 비율로 특정 중합체와 혼합한다. 점진적 용량의 복합체 + PR8 또는 WSN 바이러스는 마취된 GFP 유전자도입 생쥐에 주입으로 도입한다. 대조로서, 생쥐에 DNA 단독 또는 중합체 단독을 제공하거나 아무것도 제공하지 않는다. 감염후 2일과 3일 시점에, 비강 세척액과 폐액을 수집하고 실시예 10에 기술된 바와 같이 바이러스 역가를 분석한다. 이에 더하여, 상부 기도와 폐 단편에서 GFP 발현의 감소를 검사한다.

DNA/중합체 복합체는 예로써 초기에 바이러스와 함께 여러 번, 후속 2일동안 하루에 한번 투여한다. 복수 투여의 효과는 감염후 3일 시점에 검사한다. 이에 더하여, 2-3개의 인플루엔자-특이적 siRNA 전구물질을 인코딩하는 DNA 벡터를 작제하고, 생쥐에서 인플루엔자 감염을 저해하는 이들의 효능을 검사한다.

렌티바이러스. 상기한 구조체는 렌티바이러스 전이 플라스미드에 삽입하고 감염성 렌티바이러스의 생산에 이용한다. 따라서, 렌티바이러스는 바이러스로 감염된 세포 내에서 shRNA의 합성을 위한 주형을 제공한다. 인플루엔자 바이러스의 생산을 저해하는 렌티바이러스 벡터의 능력은 DNA 벡터에 대하여 상기한 바와 같이 조직 배양액과 생쥐에서 검사한다. 렌티바이러스는 본 발명에 따른 임의의 운반제 또는 렌티바이러스나 다른 바이러스 유전자 치료 벡터의 투여용으로 기존에 사용된 운반제를 이용하여 생쥐에 투여할 수 있다.

실시예 12: siRNA에 의한 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산의 저해

본 실시예에서는 인플루엔자 바이러스로 감염 이전에 또는 감염 이후에 인플루엔자 바이러스 NP 또는 PA 전사체를 표적하는 siRNA의 투여가 생쥐에서 인플루엔자 바이러스의 생산을 저해한다는 것을 보여주는 실험을 기술한다. 이런 저해는 용량-의존하고, 2가지 상이한 인플루엔자 바이러스로부터 발현된 전사체를 표적하는 2개의 siRNA가 함께 투여되는 경우에 부가적 효과를 입증한다.

재료와 방법

SiRNA 제조. 이는 상기한 바와 같이 실행한다.

SiRNA 전달. siRNA(30 또는 60 ㎍의 GFP-949, NP-1496 또는 PA-2087)는 올리고뉴클레오티드 양이온성 중합체 트랜스펙션 시약인 jetPEI^TM N/P 비율 = 5(Qbiogene, hic., Carlsbad, CA; Cat. No. GDSP20130; N/P는 jetPEI 시약에서 뉴클레오티드 인산염당 질소 잔기의 총수를 의미한다) 또는 폴리-L-리신(MW(vis) 52,000; MW(LALLS) 41,800, Sigma Cat. No. P2636)과 함께 실온에서 20분동안 5% 글루코오스에 배양하였다. 혼합물(생쥐당 200 ㎕)은 생쥐의 후안구 정맥에 정맥내 주사하였다(n =4). 200 ㎕의 5% 글루코오스는 대조(처리없음) 생쥐에 주사하였다. 생쥐는 siRNA 주사 또는 비강내 감염이전에 2.5% 아베르틴(Avertin)으로 마취시켰다.

바이러스 감염. B6 생쥐(표준 실험실 조건에 유지됨)는 바이러스-함유 완충액(생쥐당 30 ㎕(12,000 pfu))을 피펫으로 생쥐의 코에 떨어뜨림으로써 PR8 바이러스로 비강내 감염시켰다.

바이러스 역가의 측정. 생쥐는 감염이후 다양한 시점에서 죽이고, 폐액을 수집하였다. 폐액은 균질화시키고, 균질액은 2회 동결-해동하여 바이러스를 방출시켰다. 감염된 폐액에 존재하는 PR8 바이러스는 MDCK 세포의 감염으로 적정하였다. 편평-바닥 96-웰 평판은 웰당 3x10⁴ MDCK 세포로 접종하고, 24시간후 혈청-함유 배지를 제거하였다. 희석되지 않거나 1x1O^-1 내지 1x1O^-7 희석된 25 ㎕의 폐 균질액은 삼중 웰에 접종하였다. 1시간 배양이후, 4 ㎍/㎖ 트립신을 함유하는 175 ㎕ 감염 배지를 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 48시간 배양이후, 바이러스의 존부는 감염된 세포로부터 상층액에 의한 닭 RBC의 혈구응집으로 확인하였다. V-바닥 96-웰 평판에서 혈구응집 분석을 실시하였다. 상층액의 연속 2배 희석액은 동등 부피의 닭 적혈구(Charles River Laboratories)의 0.5% 현탁액(vol/vol)과 혼합하고 얼음 위에서 1시간동안 배양하였다. 적혈구의 부착된 균질층을 보유하는 웰은 양성으로 기록하였다. 바이러스 역가는 Reed와 Muench 방법으로 웰의 50%를 감염시키는 희석 종점(dilution end point)(TCID₅₀)의 내삽으로 측정하였다. 임의의 두 군으로부터 데이터는 본 명세서에 기술된 모든 실험에서 유의성을 평가하는데 이용된 스튜던트 t-검증으로 비교하였다.

결과

도 22A에서는 바이러스 NP 전사체를 표적하는 siRNA가 감염이전에 투여되는 경우에 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해한다는 것을 입증하는 실험의 결과를 보여준다. 30 또는 60 ㎍의 GFP-949 또는 NP-1496 siRNA는 jetPEI와 함께 배양하고 재료와 방법에서 상기한 바와 같이 생쥐에 정맥내 주사하였다. 3시간후, 생쥐는 PR8 바이러스(생쥐당 12,000 pfu)로 비강내 감염시켰다. 폐액은 감염후 24시 시점에 수집하였다. 도 22A에 도시된 바와 같이, siRNA가 투여되지 않은 생쥐(NT; 채워진 사각형) 또는 GFP를 표적하는 siRNA가 투여된 생쥐(GFP 60 ㎍; 열린 사각형)에 대한 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 4.2이었다. NP를 표적하는 30 ㎍ siRNA와 jetPEI로 전처리된 생쥐(NP 30 ㎍; 열린 원)에서, 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 3.9이었다. NP를 표적하는 60 ㎍ siRNA와 jetPEI로 전처리된 생쥐(NP 60 ㎍; 채워진 원)에서, 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 3.2이었다. 처리를 받지 않은 군과 60 ㎍ NP siRNA가 투여된 군 사이에 폐 균질액에서 바이러스 역가의 차이는 유의하였다(P = 0.0002). 개별 생쥐에 대한 데이터는 표 6A에 제시한다(NT = 처리없음).

도 22B에서는 바이러스 NP 전사체를 표적하는 siRNA가 감염이전에 양이온성 중합체 PLL을 함유하는 조성물로 정맥내 투여되는 경우에 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해한다는 것을 입증하는 다른 실험의 결과를 보여준다. 30 또는 60 ㎍의 GFP-949 또는 NP-1496 siRNA는 PLL과 함께 배양하고 재료와 방법에서 상기한 바와 같이 생쥐에 정맥내 주사하였다. 3시간후, 생쥐는 PR8 바이러스(생쥐당 12,000 pfu)로 비강내 감염시켰다. 폐액은 감염후 24시 시점에 수집하였다. 도 22B에 도시된 바와 같이, siRNA가 투여되지 않은 생쥐(NT; 채워진 사각형) 또는 GFP를 표적하는 siRNA가 투여된 생쥐(GFP 60 ㎍; 열린 사각형)에 대한 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 4.1이었다. NP를 표적하는 60 ㎍ siRNA와 PLL로 전처리된 생쥐(NP 60 ㎍; 열린 원)에서, 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 3.0이었다. 60 ㎍ GFP가 투여된 군과 60 ㎍ NP siRNA가 투여된 군 사이에 폐 균질액에서 바이러스 역가의 차이는 유의하였다(P = 0.001). 개별 생쥐에 대한 데이터는 표 6A에 제시한다(NT = 처리없음). 이들 데이터는 인플루엔자 NP 전사체를 표적하는 siRNA가 바이러스 감염이전에 투여되는 경우에 폐액에서 바이러스 역가를 감소시킨다는 것을 지시한다. 이들은 또한, 양이온성 중합체와 siRNA의 혼합물이 정맥내 주사에 의해 투여되는 경우에 유체역학적 트랜스펙션과 같은 기술을 요하지 않으면서 폐액에서 인플루엔자 바이러스의 저해에 유효한 약물임을 지시한다.

표 6A. siRNA에 의한 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산의 저해

도 22C에서는 바이러스 NP 전사체를 표적하는 siRNA가 감염이전에 투여되는 경우에 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해한다는 것을 입증하는 세 번째 실험의 결과를 보여주고, 양이온성 중합체의 존재가 siRNA의 저해 효능을 유의하게 증가시킨다는 것을 입증한다. 60 ㎍의 GFP-949 또는 NP-1496 siRNA는 인산염 완충액(PBS) 또는 jetPEI와 함께 배양하고 재료와 방법에서 상기한 바와 같이 생쥐에 정맥내 주사하였다. 3시간후, 생쥐는 PR8 바이러스(생쥐당 12,000 pfu)로 비강내 감염시켰다. 폐액은 감염후 24시 시점에 수집하였다. 도 22C에 도시된 바와 같이, siRNA가 투여되지 않은 생쥐(NT; 열린 사각형)에 대한 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 4.1인 반면, PBS에 담긴 GFP를 표적하는 siRNA가 투여된 생쥐(GFP PBS ; 열린 삼각형)에 대한 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 4.4이었다. PBS에 담긴 NP를 표적하는 60 ㎍ siRNA로 전처리된 생쥐(NP PBS; 열린 원)에서, 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 4.2인데, 이는 처리없음 또는 GFP를 표적하는 siRNA 처리에 비하여 효능에서 적절한 증가를 나타낸다. jetPEI에 담긴 GFP를 표적하는 60 ㎍ siRNA로 전처리된 생쥐(GFP PEI; 열린 원)에서, 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 4.2이었다. 하지만, jetPEI에 담긴 NP를 표적하는 60 ㎍ siRNA로 전처리된 생쥐(NP PEI; 닫힌 원)에서, 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 3.9이었다. NP를 표적하는 60 ㎍ siRNA와 jetPEI로 전처리된 생쥐(NP PEI; 채워진 원)에서, 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 3.2이었다. PBS에 담긴 GFP siRNA가 투여된 군과 PBS에 담긴 NP siRNA가 투여된 군 사이에 폐 균질액에서 바이러스 역가의 차이는 유의하고(P = 0.04), jetPEI와 함께 GFP siRNA가 투여된 군과 jetPEI와 함께 NP siRNA가 투여된 군 사이에 폐 균질액에서 바이러스 역가의 차이는 고도로 유의하였다(P = 0.003). 개별 생쥐에 대한 데이터는 표 6B에 제시한다(NT = 처리없음).

표 6B. 양이온성 중합체와 함께 증가된 효능을 보이는 siRNA에 의한 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산의 저해

도 23에서는 인플루엔자 바이러스 전사체를 표적하는 siRNA가 부가적 효과를 보인다는 것을 입증하는 실험의 결과를 보여준다. 60 ㎍의 NP-1496 siRNA, 60 ㎍ PA-2087 siRNA, 또는 60 ㎍ NP-1496 siRNA + 60 ㎍ PA-2087 siRNA는 jetPEI와 함께 배양하고 재료와 방법에서 상기한 바와 같이 생쥐에 정맥내 주사하였다. 3시간후, 생쥐는 PR8 바이러스(생쥐당 12,000 pfu)로 비강내 감염시켰다. 폐액은 감염후 24시 시점에 수집하였다. 도 23에 도시된 바와 같이, siRNA가 투여되지 않은 생쥐(NT; 채워진 사각형)에 대한 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 4.2이었다. NP를 표적하는 60 ㎍ siRNA가 투여된 생쥐(NP 60 ㎍; 열린 원)에서 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 3.2이었다. PA를 표적하는 60 ㎍ siRNA가 투여된 생쥐(PA 60 ㎍; 열린 삼각형)에서 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 3.4이었다. NP를 표적하는 60 ㎍ siRNA + PA를 표적하는 60 ㎍ siRNA가 투여된 생쥐(NP + PA; 채워진 원)에서 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 2.4이었다. 처리되지 않은 군과 60 ㎍ NP siRNA, 60 ㎍ PA siRNA, 또는 60 ㎍ NP siRNA + 60 ㎍ siRNA로 처리된 군 사이에 폐 균질액에서 바이러스 역가의 차이는 유의하였다(각각, P = 0.003, 0.01, 0.001). 60 ㎍ NP siRNA 또는 60 ㎍ PA siRNA가 투여된 군과 60 ㎍ NP siRNA + 60 ㎍ PA siRNA가 투여된 군 사이에 폐 균질액에서 바이러스 역가의 차이는 유의하였다(P = 0.01). 개별 생쥐에 대한 데이터는 표 7에 제시한다(NT = 처리없음). 이들 데이터는 인플루엔자 NP 또는 PA 전사체를 표적하는 siRNA 전처리가 인플루엔자 바이러스로 후속 감염된 생쥐의 폐액에서 바이러스 역가를 감소시킨다는 것을 지시한다. 이들은 또한, 서로 다른 바이러스 전사체를 표적하는 siRNA의 조합이 부가적 효과를 보인다는 것을 지시하는데, 이는 서로 다른 전사체를 표적하는 siRNA의 병용 치료가 동등한 효능을 달성하는데 요구되는 단일 siRNA의 함량에 비하여 각 siRNA 용량의 감소를 가능하게 한다는 것을 암시한다. 서로 다른 전사체를 표적하는 siRNA가 상승적 효과(즉, 부가적 효과를 초과하는 효과)를 보일 수도 있다. 강력한 siRNA 및 siRNA 조합의 확인을 위한 이런 체계적 방식을 이용하여 siRNA가 상승적 효과를 보이는 siRNA 조성물을 확인할 수 있다.

표 7. 생쥐에서 인플루엔자 바이러스에 대한 siRNA의 부가적 효과

도 24에서는 바이러스 NP 전사체를 표적하는 siRNA가 감염이후 투여되는 경우에 인플루엔자 바이러스 생산을 저해한다는 것을 입증하는 실험의 결과를 보여준다. 생쥐는 PR8 바이러스(500 pfu)로 비강내 감염시킨다. 60 ㎍의 GFP-949 siRNA, 60 ㎍ PA-2087 siRNA, 60 ㎍ NP-1496 siRNA, 또는 60 ㎍ NP siRNA + 60 ㎍ PA siRNA는 jetPEI와 함께 배양하고, 5시간후 재료와 방법에서 상기한 바와 같이 생쥐에 정맥내 주사하였다. 폐액은 siRNA의 투여후 28시 시점에 수집하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, siRNA가 투여되지 않은 생쥐(NT; 채워진 사각형) 또는 GFP-특이적 siRNA GFP-949가 투여된 생쥐(GFP, 열린 사각형)에 대한 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 3.0이었다. PA를 표적하는 60 ㎍ siRNA가 투여된 생쥐(PA 60 ㎍; 열린 삼각형)에서 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 2.2이었다. NP를 표적하는 60 ㎍ siRNA가 투여된 생쥐(NP 60 ㎍; 열린 원)에서 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 2.2이었다. 60 ㎍ NP siRNA + 60 ㎍ PA siRNA가 투여된 생쥐(PA + NP; 채워진 원)에서 폐 균질액의 평균 Log₁₀TCID₅₀은 1.8이었다. 처리되지 않은 군과 60 ㎍ PA siRNA, 60 ㎍ NP siRNA, 또는 60 ㎍ NP siRNA + 60 ㎍ siRNA로 처리된 군 사이에 폐 균질액에서 바이러스 역가의 차이는 유의하였다(각각, P = 0.09, 0.02, 0.003). NP siRNA가 투여된 군과 PA siRNA + NP siRNA가 투여된 군 사이에 폐 균질액에서 바이러스 역가의 차이는 0.2의 P 값을 보였다. 개별 생쥐에 대한 데이터는 표 8에 제시한다(NT = 처리없음). 이들 데이터는 인플루엔자 NP 및/또는 PA 전사체를 표적하는 siRNA가 바이러스 감염이후에 투여되는 경우에 폐액에서 바이러스 역가를 감소시킨다는 것을 지시한다.

표 8. siRNA에 의한 감염된 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산의 저해

실시예 13: shRNA 생산을 위한 주형을 제공하는 렌티바이러스의 투여에 의한 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산의 저해

재료와 방법

세포 배양. Vero 세포는 1 ㎖의 DMEM-1O%FCS에서 웰당 4x1O⁵ 세포로 24-웰 평판에 접종하고 37℃, 5% C0₂에서 배양하였다

shRNA 생산을 위한 주형을 제공하는 렌티바이러스의 생산. NP-1496a shRNA(참조: 도 25A)의 합성을 위한 주형으로 기능하는 올리고뉴클레오티드는 도 25에서 개략적으로 도시한 바와 같이 렌티바이러스 벡터 pLL3.7(Rubinson, D., et al, Nature Genetics, Vol. 33, pp. 401-406, 2003)의 U6 프로모터와 종결 서열 사이에 클론하였다. 올리고뉴클레오티드는 pLL3.7의 다중 클로닝 부위 내에서 HpaI과 XhoI 사이에 삽입하였다. 상기 렌티바이러스 벡터는 트랜스펙션된/감염된 세포의 용이한 모니터링을 위하여 EGFP를 또한 발현한다. 렌티바이러스는 NP-1496a shRNA의 생산을 위한 주형을 포함하는 DNA 벡터를 동시-트랜스펙션시키고 이들 벡터를 293T 세포로 패킹하여 생산하였다. 48시간후, 렌티바이러스를 함유하는 배양 상층액은 수집하고 4℃에서 2000 rpm으로 7분동안 회전시키며, 이후 0.45 ㎛ 필터를 통하여 여과하였다. Vero 세포는 24-웰 평판에 웰당 1 x 10⁵로 접종하였다. 하룻밤 배양이후, 삽입체를 보유하는 세포를 함유하는 배양 상층액(0.25 ㎖ 또는 1.0 ㎖)을 8 ㎍/㎖ 폴리브렌(polybrene)의 존재하에 웰에 첨가하였다. 이후, 평판은 실온에서 2500 rpm으로 1시간동안 원심분리하고 배양으로 환원시켰다. 감염후 24시 시점에, 생성된 Vero 세포주(Vero-NP 0.25, Vero-NP-1.0)는 부모(감염되지 않은) Vero 세포와 함께 유세포분석법으로 GFP 발현을 분석하였다. NP-1496a는 센스 부분의 3' 말단에서 추가의 뉴클레오티드(A) 및 안티센스 부분의 5' 말단에서 상보적 뉴클레오티드(U)의 우연한 포함으로 인하여 NP-1496과 구별되고, 이로 인하여 NP-1496에서처럼 19개 길이보다는 20개 nt 길이인 이중나선 일부분을 산출한다(표 2). 본 발명의 한 구체예에 따라, NP-1496a 서열보다는 NP-1496 서열이 사용된다. 이에 더하여, NP-1496a shRNA의 루프 부분은 도 21에 도시된 NP-1496 shRNA의 루프 부분과 구별된다.

인플루엔자 바이러스 감염 및 바이러스 역가의 측정. 대조 Vero 세포 및 삽입체를 보유하는 렌티바이러스로 감염된 Vero 세포(Vero-NP 0.25, Vero-NP-1.0)는 0.04, 0.2, 1의 MOI로 PR8 바이러스로 감염시켰다. 상층액에서 인플루엔자 바이러스 역가는 실시예 12에 기술된 바와 같이 감염후 48시 시점에 혈구응집(HA) 분석으로 측정하였다.

결과

NP-1496a shRNA의 생산을 위한 주형을 보유하는 렌티바이러스는 Vero 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해하는 능력을 검사하였다. NP-1496a shRNA는 상기한 NP-1496a siRNA와 동일한 서열을 보유하는 이중-가닥 부분을 보유하는 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 2개의 상보적 영역을 포함한다. 도 25B에 도시된 바와 같이, Vero 세포와 함께 렌티바이러스-함유 상층액의 하룻밤 배양은 EGFP의 발현을 유도하였는데, 이는 렌티바이러스에 의한 Vero 세포의 감염을 지시한다. 음영 곡선은 대조 세포(감염되지 않음)에서 형광 강도를 의미한다. 1 ㎖ 상층액이 사용되는 경우에, 거의 모든 세포가 EGFP 양성이었고, 평균 형광 강도는 높게 나타났다(1818)(Vero-NP-1.0). O.25 ㎖ 상층액을 사용하는 경우에, 대부분의 세포(~95%)는 EGFP 양성이었고, 평균 형광 강도는 다소 낮았다(503)(Vero-NP-0.25).

이후, 부모 Vero 세포와 렌티바이러스-감염된 Vero 세포는 0.04, 0.2, 0.1의 MOI에서 인플루엔자 바이러스로 감염시키고, 바이러스 역가는 인플루엔자 바이러스 감염후 48시 시점에 분석하였다. MOI를 증가시키면, 바이러스 역가는 부모 Vero 세포 배양액의 상층액에서 상승하였다(도 25C). 대조적으로, Vero-NP-1.0 세포 배양액의 상층액에서 바이러스 역가는 매우 낮게 유지되었는데, 이는 인플루엔자 바이러스 생산이 이들 세포에서 저해되었음을 지시한다. 유사하게, Vero-NP-0.25 세포 배양액에서 인플루엔자 바이러스 생산 역시 부분적으로 저해되었다. 바이러스 역가는 표 9에 제시한다. 이들 결과는 렌티바이러스 벡터로부터 발현된 NP-1496 shRNA가 siRNA로 가동되어 Vero 세포에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해할 수 있음을 암시한다. 저해 정도는 세포당 바이러스 감염의 정도(EGFP 수준에 의해 확인됨)에 비례하는 것으로 보인다.

표 9. 조직 배양된 세포에서 발현된 siRNA에 의한 인플루엔자 바이러스 생산의 저해

실시예 14: siRNA 전구물질이 전사될 수 있는 DNA 벡터의 비강내 투여에 의한 생쥐에서 인플루엔자 생산의 저해

재료와 방법

shRNA의 주형으로 기능하는 플라스미드의 작제. NP-1496a shRNA가 발현되는 플라스미드의 작제는 실시예 13에서 기술한다.

PB1-2257 shRNA 또는 RSV-특이적 shRNA의 합성을 위한 주형으로 기능하는 올리고뉴클레오티드는 실시예 13에 기술되고 NP-1496a shRNA에 대하여 도 25A에서 개략적으로 도시된 바와 같이 렌티바이러스 벡터 pLL3.7의 U6 프로모터와 종결 서열 사이에 클론하였다. 이들 올리고뉴클레오티드 서열은 아래와 같았다:

NP-1496a 센스:

5'-TGGATCTTATTTCTTCGGAGATTCAAGAGATCTCCGAAGAAATAAGATCCTTTTTTC-3'(SEQ ID NO: 179)

NP-1496a 안티센스:

5'-TCGAGAAAAAAGGATCTTATTTCTTCGGAGATCTCTTGAATCTCCGAAGAAATAAGATCCA-3'(SEQ ID NO: 180)

PB1-2257 센스:

5'-TGATCTGTTCCACCATTGAATTCAAGAGATTCAATGGTGGAACAGATCTTTTTTC-3')(SEQ ID NO: 181)

PB1-2257 안티센스:

5'-TCGAGAAAAAAGATCTGTTCCACCATTGAATCTCTTGAATTCAATGGTGGAACAGATCA-3'(SEQ ID NO: 182)

RSV 센스:

5'-TGCGATAATATAACTGCAAGATTCAAGAGATCTTGCAGTTATATrATCGTTTTTTC-3'(SEQ ID NO: 183)

RSV 안티센스:

5'-TCGAGAAAAAACGATAATATAACTGCAAGATCTCTTGAATCTTGCAGTTATATTATCGCA-3'(SEQ ED NO: 184)

상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 벡터로부터 발현된 RSV shRNA는 생체내에서 가공되어 아래 서열의 센스와 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA를 산출한다:

센스: 5'-CGATAATATAACTGCAAGA-3'(SEQ ID NO: 185)

안티센스: 5'-TCTTGCAGTTATATTATCG-3'(SEQ ID NO: 186)

PA-특이적 헤어핀은 아래의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 유사하게 작제할 수 있다:

PA-2087 센스:

5'-TGCAATTGAGGAGTGCCTGATTCAAGAGATCAGGCACTCCTCAATTGCTTTTTTC-3'(SEQ ID NO: 187)

PA-2087 안티센스:

5'-TCGAGAAAAAAGCAATTGAGGAGTGCCTGATCTCTTGAATCAGGCACTCCTCAATTGCA-3'(SEQ ID NO: 270)

바이러스 감염과 바이러스 역가의 측정. 이들은 실시예 12에서 기술한 바와 같이 실행하였다.

DNA 전달. NP-1496a shRNA, PB1-2257 shRNA 또는 RSV-특이적 shRNA(각각 60 ㎍)의 발현을 위한 주형으로 기능할 수 있는 플라스미드 DNA는 40 ㎕ Infasurf? (ONY, Inc., Amherst NY) 및 20 ㎕의 5% 글루코오스와 함께 개별적으로 혼합하고 상기한 바와 같이 생쥐 군(군당 4마리)에 비강내 투여하였다. 40 ㎕ Infasurf와 20 ㎕의 5% 글루코오스의 혼합물은 비처리(NT) 생쥐 군에 투여하였다. 13시간후, 생쥐는 PR8 바이러스(생쥐당 12000 pfu)로 비강내 감염시켰다. 감염후 24시 시점에, 폐액을 수집하고, 바이러스 역가를 측정하였다.

결과

생쥐에서 인플루엔자 바이러스 감염을 저해하는 DNA 벡터로부터 발현된 shRNA의 능력을 검사하였다. 이들 실험을 위하여, 플라스미드 DNA는 폐액에서 유전자 전달을 촉진하는 것으로 밝혀진 운반제와 유사한 소 폐로부터 추출된 천연 계면활성제인 Infasurf와 혼합하였다(74). DNA/Infasurf 혼합물은 피펫을 이용하여 혼합물에 코에 떨어뜨림으로써 생쥐에 주입하였다. 3시간후, 생쥐는 PR8 바이러스(생쥐당 12000 pfu)로 감염시켰다. 인플루엔자 바이러스 감염후 24시 시점에, 폐액을 수집하고, MDCK/헤마글루티닌 분석법으로 바이러스 역가를 측정하였다.

도 26에 도시된 바와 같이, 바이러스 역가는 임의의 플라스미드 DNA가 투여되지 않은 생쥐 또는 호흡기 합포체 바이러스(RSV)-특이적 shRNA를 발현하는 DNA 벡터가 투여된 생쥐에서 높게 나타났다. 다소 낮은 바이러스 역가는 NP-1496a shRNA 또는 PB1-2257 shRNA를 발현하는 플라스미드 DNA가 제공된 생쥐에서 관찰되었다. 바이러스 역가는 양 인플루엔자-특이적 플라스미드 DNA: NP-1496a shRNA를 발현하는 플라스미드 DNA와 PB1-2257 shRNA를 발현하는 플라스미드 DNA를 함께 투여된 생쥐에서 더욱 유의하게 감소하였다. 처리되지 않은 생쥐(NT; 열린 사각형) 또는 RSV-특이적 shRNA를 인코딩하는 플라스미드가 투여된 생쥐(RSV; 채워진 사각형)에 대한 폐 균질액의 평균 log₁₀TCID₅₀은 각각 4.O 또는 4.1이었다. NP-1496a shRNA에 대한 주형으로 기능할 수 있는 플라스미드가 투여된 생쥐(NP; 열린 원)에서 폐 균질액의 평균 log₁₀TCID₅₀은 3.4이었다. PB1-2257 shRNA에 대한 주형으로 기능할 수 있는 플라스미드가 투여된 생쥐(PB; 열린 삼각형)에서 폐 균질액의 평균 log₁₀TCID₅₀은 3.8이었다. NP와 PB shRNA에 대한 주형으로 기능할 수 있는 플라스미드가 투여된 생쥐(NP + PB1; 채워진 원)에서 폐 균질액의 평균 log₁₀TCID₅₀은 3.2이었다. 처리되지 않거나 RSV-특이적 shRNA 플라스미드가 투여된 군과 NP shRNA 플라스미드, PB1 shRNA 플라스미드, 또는 NP와 PB1 shRNA 플라스미드가 투여된 군 사이에 폐 균질액에서 바이러스 역가의 차이는 각각 0.049, 0.124, 0.004의 P 값을 보였다. 개별 생쥐에 대한 데이터는 표 10에 제시한다(NT = 처리없음). PBS 또는 jetPEI가 존재하지만 Infasurf가 부재하는 조건에서 NP shRNA가 아닌 NP-1496 siRNA의 비강내 투여를 수반하는 예비 실험은 인플루엔자 바이러스의 유효한 저해를 유도하지 못하였다. 이들 결과는 DNA 벡터로부터 발현된 shRNA가 siRNA로 가공될 수 있고 생쥐에서 인플루엔자 바이러스 생산을 저해할 수 있다는 것을 보여주고, Infasurf가 shRNA가 발현될 수 있는 플라스미드의 전달에 적합한 운반체임을 입증한다. 특히, 이들 데이터는 인플루엔자 NP 및/또는 PB1 전사체를 표적하는 shRNA가 바이러스 감염후 투여되는 경우에 폐액에서 바이러스 역가를 감소시킨다는 것을 지시한다.

표 10. 생쥐에서 발현된 shRNA에 의한 인플루엔자 바이러스 생산의 저해

실시예 15: 양이온성 중합체는 siRNA의 세포 흡수를 촉진한다.

재료와 방법

시약. 2가지 상이한 평균 분자량의 폴리-L-리신[폴리-L-리신(MW(vis) 52,000; MW(LALLS) 41,800, Cat. No. P2636)과 폴리-L-리신(MW(vis) 9,400; MW(LALLS) 8,400, Cat. No. P2636], 폴리-L-아르기닌(MW 15,000-70,000 Cat. No. P7762), 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT)는 Sigma로부터 구입하였다. 설명을 위하여, LALLS 방법으로 분자량을 추정하지만, 중합체가 크기에서 일부 이질성을 보이기 때문에 분자량은 근사값이다.

겔 지체 분석. siRNA-중합체 복합체는 10 ㎕ siRNA(10 mM Hepes 완충액에서 10 pmol, pH 7.2) 및 다양한 양의 중합체를 함유하는 10 ㎕ 중합체 용액을 혼합하여 형성하였다. 복합체는 실온에서 30분동안 형성되도록 하고, 이후 20 ㎕를 40% 아가로즈 겔에서 이동시켰다. 밴드는 에티듐-브로마이드 염색으로 가시화시켰다.

세포독성 분석. siRNA-중합체 복합체는 10 mM Hepes 완충액, pH 7.2에서 동등량(50 pmol) siRNA 및 다양한 양의 중합체를 함유하는 중합체 용액을 실온에서 30분동안 혼합하여 형성하였다. 세포독성은 MTT 분석법으로 평가하였다. 세포는 1-% 소 태아 혈청(FCS)을 함유하는 0.2 ㎖ DMEM에서 웰당 30,000 세포로 96-웰 평판에 접종하였다. 37℃에서 하룻밤 배양이후, 배지는 제거하고 0.18 ㎖ OPTI-MEM(GIBCO/BRL)으로 교체하였다. 20 ㎕ Hepes 완충액에 담긴 siRNA중합체 복합체를 이들 세포에 첨가하였다. 37℃에서 6시간 배양이후, 중합체-함유 배지는 제거하고 DMEM-10% FCS로 교체하였다. 24시간후, 제조업자의 사용설명서에 따라 MTT 분석법을 이용하여 세포의 대사 활성을 측정하였다. 실험은 삼중으로 실행하고, 데이터는 평균하였다.

세포 배양, 트랜스펙션, siRNA-중합체 복합체 형성, 바이러스 역가 측정, Vero 세포는 10% 열-불활화된 FCS, 2 mM L-글루타민, 100 unit/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 37℃, 5% C0₂/95% 대기하에 성장시켰다. 트랜스펙션 실험을 위하여, 대수기(logarithmic-phase) Vero 세포는 1 ㎖DMEM-1O%FCS에서 웰당 4 x 10⁵ 세포로 24-웰에 접종하였다. 37℃에서 하룻밤 배양이후, siRNA-중합체 복합체는 10 mM Hepes 완충액(pH 7.2)에 담긴 50 ㎕ siRNA(400 pmol(대략 700 ng)을 50 ㎕ 중합체 첨가하고 교반하여 형성하였다. siRNA와 중합체 사이에 완전한 복합체 형성을 달성하기 위하여, 상이한 농도의 중합체를 사용하였다. 혼합물은 실온에서 30분동안 배양하여 복합체 형성을 완결시켰다. 복합체를 첨가하기 직전에, 세포-성장 배지는 제거하고 OPTI-MEM I(Life Technologies)로 교체하였다.

세포를 복합체와 함께 37℃, 5% C0₂에서 6시간동안 배양한 이후, 복합체-함유 배지를 제거하고, DMEM, 0.3% BSA(Sigma), 10 mM Hepes, 100 unit/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 구성된 감염 배지(MOI = 0.04)에 담긴 200 ㎕의 PR8 바이러스를 각 웰에 첨가하였다. 지속적으로 교반하면서 실온에서 1시간동안 배양한 이후, 4 ㎍/ 트립신을 함유하는 0.8 ㎖ 감염 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포를 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 감염후 상이한 시점에서, 상층액은 감염된 배양액으로부터 수집하고, 상기한 바와 같이 혈구응집(HA) 분석법으로 바이러스 역가를 측정하였다.

리포펙타민 2000(Life Technology)에 의한 siRNA의 트랜스펙션은 부착성 세포주에 대한 제조업자의 사용설명서에 따라 실행하였다. 간단히 말하면, 대수기(logarithmic-phase) Vero 세포는 1 ㎖ DMEM-10%FCS에서 웰당 4 x 10⁵ 세포로 24-웰 평판에 접종하고 37℃, 5% C0₂에서 배양하였다. 다음날, OPTI-MEM I에 담긴 50 ㎕의 희석된 리포펙타민 2000을 50 ㎕의 siRNA(OPTI-MEM I에서 400 pmol)에 첨가하여 복합체를 형성하였다. 세포는 세척하고 혈청-없는 배지에서 배양하였다. 복합체는 세포에 첨가하고, 세포는 37℃에서 6시간동안 배양하고, 이후 세척하고 상기한 바와 같이 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다. 감염후 상이한 시점에서, 상층액은 감염된 배양액으로부터 수집하고, 상기한 바와 같이 혈구응집(HA) 분석법으로 바이러스 역가를 측정하였다.

결과

siRNA와 복합체를 형성하고 배양된 세포에 의한 siRNA의 흡수를 촉진하는 폴리-L-리신(PLL)과 폴리-L-아르기닌(PLA)의 능력을 검사하였다. PLL 및/또는 PLA가 siRNA와 복합체를 형성하는 지를 확인하기 위하여, 고정량(fixed amount)의 NP-1496 siRNA를 증가하는 함량의 중합체와 혼합하였다. 이후, 중합체/siRNA 복합체의 형성은 4% 아가로즈 겔에서 전기영동으로 가시화시켰다. 중합체의 양이 증가함에 따라, siRNA의 전기영동 이동성이 지체되었는데(도 27A와 27B), 이는 복합체 형성을 지시한다. 도 27A와 27B에서는 각각 siRNA와 PLL(41.8K) 또는 PLA 사이의 복합체 형성을 나타낸다. 각 패널에 사용된 중합체의 양은 좌측에서 우측으로 증가한다. 도 27A와 27B의 각 패널에서, 밴드는 좌측 레인에서 관찰될 수 있는데, 이는 복합체 형성의 부재 및 siRNA의 겔로의 진입과 후속적인 이동을 지시한다.

우측으로 이동함에 따라 밴드가 소멸되는데, 이는 복합체 형성 및 복합체가 겔에 진입하고 이동하지 못함을 지시한다.

siRNA/중합체 복합체의 세포독성을 조사하기 위하여, 상이한 비율로 siRNA와 PLL 또는 PLA의 혼합물을 96-웰 평판에서 Vero 세포 배양액에 첨가하였다. 세포의 대사 활성은 MTT 분석법으로 측정하였다(74). 실험은 삼중으로 실행하고, 데이터는 평균하였다. 세포 생존능은 PLL(MW ~42K)의 양이 증가함에 따라 유의하게 감소한 반면, PLL(~8K)은 유의하게 낮은 독성을 보였는데, 4:1 정도의 PLL/siRNA 비율에서 독성이 최소화되거나 나타나지 않았다(도 28A; 원 = PLL(MW ~8K); 사각형 = PLL(MW ~42K)). 세포 생존능은 도 28B에 도시된 바와 같이 PLA/siRNA 비율이 증가함에 따라 감소하지만, 4.5:1 정도의 PLA/siRNA 비율에서 80% 이상으로 유지되었다. 도 28A와 28B에 도시된 데이터는 표 11과 12에 제시한다. 표 11에서 숫자는 처리되지 않은 세포의 생존능 %와 비교하여, 중합체/siRNA 복합체 처리이후 세포의 생존능 %를 지시한다(ND = 실행되지 않음). 표 12에서 숫자는 PLA/siRNA 비율, 생존 %, 표준 편차를 지시한다.

표 11. PLL/siRNA 복합체의 세포독성(생존 %)

표 12. PLA/siRNA 복합체의 세포독성(생존 %)

PLL 또는 PLA가 siRNA의 세포 흡수를 촉진하는 지를 확인하기 위하여, 다양한 함량의 중합체와 NP-1496은 모든 siRNA가 중합체와 복합되는 비율로 혼합하였다. 각 경우에 동등량의 siRNA를 사용하였다. 다소 낮은 중합체/siRNA 비율은 ~8K PLL보다는 ~42K PLL에 이용하였는데, 그 이유는 후자가 세포에 더 많은 독성을 나타냈기 때문이다. 복합체는 Vero 세포에 첨가하고, 6시간후 배양액은 PR8 바이러스로 감염시켰다. 배양후 상이한 시점에서, 배양 상층액은 수집하고 HA 분석법으로 바이러스 역가를 분석하였다. 도 29A는 다양한 트랜스펙션 처리를 받은 세포(원 = 처리없음; 사각형 = 리포펙타민; 채워진 삼각형 = PLL(PLL/siRNA 비율 = 2에서 ~42K); 열린 삼각형 = PLL(PLL/siRNA 비율 = 8에서 -8K)에서 시간에 따른 바이러스 역가의 도표이다. 도 29A에 도시된 바와 같이, 바이러스 역가는 비-트랜스펙션된 배양액에서 시간에 따라 증가하였다. 바이러스 역가는 NP-1496/리포펙타민으로 트랜스펙션된 배양액에서 유의하게 낮았고 PLL/NP-1496 복합체로 처리된 배양액에서 더욱 낮았다. 도 29A에 도시된 데이터는 표 13에 제시한다(NT = 처리없음; LF2K 리포펙타민). PLL:siRNA 비율은 괄호안에 표시한다.

PLA는 중합체/siRNA 비율의 범위에서 유사하게 검사하였다. 도 29B는 다양한 트랜스펙션 처리를 받은 세포(채워진 사각형 = 가성 트랜스펙션; 채워진 원 = 리포펙타민; 열린 사각형 = PLA/siRNA 비율 = 1에서 PLA; 열린 원 = PLA/siRNA 비율 = 2에서 PLA; 열린 삼각형 = PLA/siRNA 비율 = 4에서 PLA; 채워진 사각형 = PLA/siRNA 비율 = 8에서 PLA)에서 시간에 따른 바이러스 역가의 도표이다. 도 29B에 도시된 바와 같이, 바이러스 역가는 대조(가성-트랜스펙션된) 배양액 및 1:1 비율의 PLA/siRNA로 처리된 배양액에서 시간에 따라 증가하였다. 바이러스 역가는 NP-1496/리포펙타민으로 트랜스펙션된 배양액에서 유의하게 낮았고 4:1 이상의 PLA/siRNA 비율로 복합체를 보유하는 PLA/siRNA 복합체로 처리된 배양액에서 더욱 낮았다. 도 29B에 도시된 데이터는 표 14에 제시한다

표 13. 중합체/siRNA 복합체에 의한 인플루엔자 바이러스 생산의 저해

표 14. 중합체/siRNA 복합체에 의한 인플루엔자 바이러스 생산의 저해

따라서, 양이온성 중합체는 세포주에서 siRNA의 세포 흡수를 촉진하고 인플루엔자 바이러스 생산을 저해하며 광범위하게 사용되고 있는 트랜스펙션 시약 리포펙타민보다 훨씬 유효하다. 이들 결과는 siRNA의 세포 흡수를 촉진하는 다른 양이온성 중합체가 용이하게 확인될 수 있음을 또한 암시하고, 이들의 확인 방법을 제공한다. PLL과 PLA는 이런 노력을 위한 양성 대조로서 기능할 수 있다.

등가물

당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명의 특정 구체예에 대한 다수의 개변이 가능하다. 본 발명의 범위는 상기한 내용에 한정되지 않으며 첨부된 특허청구범위에 의해서만 정의된다.

참고문헌

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Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PA segment <400> 85 ugaucccugg guuuugcuut t 21 <210> 86 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PA segment <400> 86 aagcaaaacc cagggaucad tdt 23 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PA segment <400> 87 ugcuucuugg uucaacucct t 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PA segment <400> 88 ggaguugaac caagaagcat t 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NP segment <400> 89 uagagagaau ggugcucuct t 21 <210> 90 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NP segment <400> 90 gagagcacca uucucucuad tdt 23 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NP segment <400> 91 uaaggcgaau cuggcgccat t 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NP segment <400> 92 uggcgccaga uucgccuuat t 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to infuenza virus type A NP segment <400> 93 ggaucuuauu ucuucggagt t 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NP segment <400> 94 cuccgaagaa auaagaucct t 21 <210> 95 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza type A M segment <400> 95 ccgaggucga aacguacgud tdt 23 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 96 acguacguuu cgaccucggt t 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 97 cagauugcug acucccagct t 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 98 gcugggaguc agcaaucugt t 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 99 uggcuggauc gagugagcat t 21 <210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 100 ugcucacucg auccagccad tdt 23 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 101 gaauaucgaa aggaacagcd tdt 23 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 102 gcuguuccuu ucgauauuct t 21 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 103 cggcuucgcc gagaucagaa t 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 104 ucugaucucg gcgaagccga t 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 105 guccuccgau gaggacucct t 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 106 ggaguccuca ucggaggact t 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 107 ugauaacaca guucgaguct t 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 108 gacucgaacu guguuaucat t 21 <210> 109 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 109 tgcttcaatc cgatgattg 19 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aequoria victoria green fluorescent protein <400> 110 ggcuacgucc aggagcgcau u 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Aequoria victoria green fluorescent protein <400> 111 ugcgcuccug gacguagccu u 21 <210> 112 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mRNA <400> 112 tttttttttt tttttttt 18 <210> 113 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP v RNA <400> 113 ctcgtcgctt atgacaaaga ag 22 <210> 114 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP cRNA <400> 114 atatcgtctc gtattagtag aaacaagggt attttt 36 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NS vRNA <400> 115 caggacatac tgatgaggat g 21 <210> 116 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NS cRNA <400> 116 atatcgtctc gtattagtag aaacaagggt gtttt 35 <210> 117 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP RNA <400> 117 ctcgtcgctt atgacaaaga ag 22 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP RNA <400> 118 agatcatcat gtgagtcaga c 21 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NS RNA <400> 119 caggacatac tgatgaggat g 21 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NS RNA <400> 120 gtttcagaga ctcgaactgt g 21 <210> 121 <211> 2233 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 121 agcgaaagca ggtactgatc caaaatggaa gattttgtgc gacaatgctt caatccgatg 60 attgtcgagc ttgcggaaaa aacaatgaaa gagtatgggg aggacctgaa aatcgaaaca 120 aacaaatttg cagcaatatg cactcacttg gaagtatgct tcatgtattc agatttccac 180 ttcatcaatg agcaaggcga gtcaataatc gtagaacttg gtgatcctaa tgcacttttg 240 aagcacagat ttgaaataat cgagggaaga gatcgcacaa tggcctggac agtagtaaac 300 agtatttgca acactacagg ggctgagaaa ccaaagtttc taccagattt gtatgattac 360 aaggaaaata gattcatcga aattggagta acaaggagag aagttcacat atactatctg 420 gaaaaggcca ataaaattaa atctgagaaa acacacatcc acattttctc gttcactggg 480 gaagaaatgg ccacaaaggc cgactacact ctcgatgaag aaagcagggc taggatcaaa 540 accaggctat tcaccataag acaagaaatg gccagcagag gcctctggga ttcctttcgt 600 cagtccgaga gaggagaaga gacaattgaa gaaaggtttg aaatcacagg aacaatgcgc 660 aagcttgccg accaaagtct cccgccgaac ttctccagcc ttgaaaattt tagagcctat 720 gtggatggat tcgaaccgaa cggctacatt gagggcaagc tgtctcaaat gtccaaagaa 780 gtaaatgcta gaattgaacc ttttttgaaa acaacaccac gaccacttag acttccgaat 840 gggcctccct gttctcagcg gtccaaattc ctgctgatgg atgccttaaa attaagcatt 900 gaggacccaa gtcatgaagg agagggaata ccgctatatg atgcaatcaa atgcatgaga 960 acattctttg gatggaagga acccaatgtt gttaaaccac acgaaaaggg aataaatcca 1020 aattatcttc tgtcatggaa gcaagtactg gcagaactgc aggacattga gaatgaggag 1080 aaaattccaa agactaaaaa tatgaaaaaa acaagtcagc taaagtgggc acttggtgag 1140 aacatggcac cagaaaaggt agactttgac gactgtaaag atgtaggtga tttgaagcaa 1200 tatgatagtg atgaaccaga attgaggtcg cttgcaagtt ggattcagaa tgagttcaac 1260 aaggcatgcg aactgacaga ttcaagctgg atagagcttg atgagattgg agaagatgtg 1320 gctccaattg aacacattgc aagcatgaga aggaattatt tcacatcaga ggtgtctcac 1380 tgcagagcca cagaatacat aatgaagggg gtgtacatca atactgcctt acttaatgca 1440 tcttgtgcag caatggatga tttccaatta attccaatga taagcaagtg tagaactaag 1500 gagggaaggc gaaagaccaa cttgtatggt ttcatcataa aaggaagatc ccacttaagg 1560 aatgacaccg acgtggtaaa ctttgtgagc atggagtttt ctctcactga cccaagactt 1620 gaaccacaca aatgggagaa gtactgtgtt cttgagatag gagatatgct tctaagaagt 1680 gccataggcc aggtttcaag gcccatgttc ttgtatgtga ggacaaatgg aacctcaaaa 1740 attaaaatga aatggggaat ggagatgagg cgttgtctcc tccagtcact tcaacaaatt 1800 gagagtatga ttgaagctga gtcctctgtc aaagagaaag acatgaccaa agagttcttt 1860 gagaacaaat cagaaacatg gcccattgga gagtctccca aaggagtgga ggaaagttcc 1920 attgggaagg tctgcaggac tttattagca aagtcggtat ttaacagctt gtatgcatct 1980 ccacaactag aaggattttc agctgaatca agaaaactgc ttcttatcgt tcaggctctt 2040 agggacaatc tggaacctgg gacctttgat cttggggggc tatatgaagc aattgaggag 2100 tgcctaatta atgatccctg ggttttgctt aatgcttctt ggttcaactc cttccttaca 2160 catgcattga gttagttgtg gcagtgctac tatttgctat ccatactgtc caaaaaagta 2220 ccttgtttct act 2233 <210> 122 <211> 2183 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 122 agcgaaagca ggtactgatt caaaatggaa gattttgtgc gacaatgctt caatccgatg 60 attgtcgagc ttgcggaaaa ggcaatgaaa gagtatggag aggacctgaa aatcgaaaca 120 aacaaatttg cagcaatatg cactcacttg gaagtgtgct tcatgtattc agattttcac 180 ttcatcgatg agcaaggcga gtcaatagtc gtagaacttg gcgatccaaa tgcacttttg 240 aagcacagat ttgaaataat cgagggaaga gatcgcacaa tagcctggac agtaataaac 300 agtatttgca acactacagg ggctgagaaa ccaaagtttc taccagattt gtatgattac 360 aagaagaata gattcatcga aattggagta acaaggagag aagttcacat atactatctg 420 gaaaaggcca ataaaattaa atctgagaag acacacatcc acattttctc attcactggg 480 gaggaaatgg ccacaaaggc cgactacact ctcgatgaag aaagcagggc taggatcaaa 540 accaggctat tcaccataag acaagaaatg gctagcagag gcctctggga ttcctttcgt 600 cagtccgaga gaggcgaaga gacaattgaa gaaagatttg aaatcacagg aacaatgcgc 660 aagcttgccg accaaagtct cccgccaaac ttctccagcc ttgaaaattt tagagcctat 720 gtggatggat tcgaaccgaa cggctacatt gagggcaagc tttctcaaat gtccaaagaa 780 gtaaatgcta gaattgaacc ttttttgaaa tcaacaccac gaccacttag acttccggat 840 gggcctccct gttctcagcg gtccaaattc ctgctgatgg atgccttaaa attaagcatt 900 gaggacccaa gtcatgaggg agaggggata ccgctatatg atgcaatcaa atgcatgaga 960 acattctttg gatggaagga acccaatgtt gttaaaccac acgaaaaggg aataaatcca 1020 aattatcttc tgtcatggaa gcaagtactg gcagaactgc aggacattga gaatgaggag 1080 aaaattccaa ggactaaaaa tatgaagaaa acgagtcagt taaagtgggc acttggtgag 1140 aacatggcac cagaaaaggt agactttgac gattgtaaag atgtaggcga tttgaagcaa 1200 tatgatagtg atgaaccaga attgaggtcg cttgcaagtt ggattcagaa tgagttcaac 1260 aaggcatgtg aactgaccga ttcaagctgg atagagctcg atgagattgg agaagatgcg 1320 gctccaattg aacacattgc aagcatgaga aggaattatt tcacagcaga ggtgtctcat 1380 tgcagagcca cagaatacat aatgaagggg gtgtacatca atactgcctt gcttaatgca 1440 tcctgtgcag caatggatga tttccaatta attccaatga taagcaagtg tagaactaag 1500 gagggaaggc gaaagaccaa tttgtacggt ttcatcataa aaggaagatc ccacttaagg 1560 aatgacaccg atgtggtaaa ctttgtgagc atggagtttt ccctcactga cccaagactt 1620 gaaccacaca aatgggagaa gtactgtgtt cttgaggtag gagatatgct tctaagaagt 1680 gccataggcc atgtgtcaag gcctatgttc ttgtatgtga ggacaaatgg aacctcaaaa 1740 attaaaatga aatgggggat ggaaatgagg cgttgcctcc ttcagtcact tcaacaaatc 1800 gagagtatga ttgaagctga gtcctctgtc aaggagaaag acatgaccaa agagttcttt 1860 gaaaacaaat cagaaacatg gcccgttgga gagtccccca aagtcggtat tcaacagctt 1920 gtatgcatct ccacaactgg aaggattttc 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1380 tgcagagcca cagaatatat aatgaagggg gtatacatta atactgcctt gcttaatgca 1440 tcctgtgcag caatggacga tttccaacta attcccatga taagcaaatg tagaactaaa 1500 gagggaaggc gaaagaccaa tttatatggt ttcatcataa aaggaagatc tcacttaagg 1560 aatgacaccg acgtggtaaa ctttgtgagc atggagtttt ctctcactga cccaagactt 1620 gagccacaca aatgggagaa gtactgtgtt cttgagatag gagatatgct actaagaagt 1680 gccataggcc aggtgtcaag gcccatgttc ttgtatgtga ggacaaatgg aacatcaaag 1740 attaaaatga aatggggaat ggagatgagg cgttgcctcc ttcagtcact ccaacaaatc 1800 gagagtatga ttgaagccga gtcctctgtc aaggagaaag acatgaccaa agagtttttc 1860 gagaataaat cagaaacatg gcccattgga gagtccccca aaggagtgga agaaggttcc 1920 attgggaagg tctgcaggac tttattagcc aagtcggtat tcaatagcct gtatgcatct 1980 ccacaattag aaggattttc agctgaatca agaaaactgc ttcttgtcgt tcaggctctt 2040 agggacaatc ttgaacctgg gacctttgat cttggggggc tatatgaagc aattgaggag 2100 tgcctgatta atgatccctg ggttttgctt aatgcgtctt ggttcaactc cttcctaaca 2160 catgcattaa gatagttgtg gcaatgctac tatttgctat ccatactgtc caaaaaagta 2220 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131 agcaaaagca ggtactgatc caaaatggaa gactttgtgc gacaatgctt caatccaatg 60 atcgtcgagc ttgcggaaaa ggcgatgaaa gaatatggag aggacccgaa aattgaaaca 120 aacaaatttg cagcaatatg cactcacttg gaagtctgct tcatgtactc ggatttccac 180 tttattaatg aactgggcga gtcagtgatc atagagtctg gtgatccaaa tgctcttttg 240 aagcacagat ttgaaatcat tgaagggaga gatcgaacaa tggcatggac agtagtgaac 300 agtatctgca acaccacaag agctgaaaaa cccaagttcc tcccagattt gtacgactat 360 aaagagaaca ggtttgttga aattggtgtg acaaggagag aagttcacat atactacttg 420 gagaaagcca acaaaataaa gtctgagaaa acacatattc acattttctc atttacagga 480 gaggaaatgg ctacaaaagc ggattatacc cttgatgaag aaagtagagc caggatcaaa 540 accagactat tcaccataag acaagaaatg gccagcagag gcctttggga ctcctttcgt 600 cagtccgaga gaggcgaaga gacaattgaa gaaagatttg aaatcacagg gacaatgcgc 660 aggcttgccg attacagtct cccaccgaac ttctccagcc attttcaaag acaacacccc 720 ggccactcag gacaccgggt ggtccaccct gttatcagcg atccaaattc ttgctgatgg 780 atgctctgaa atttagcatt gaggatccaa gtcacgaggg agagggaata ccgctgtatg 840 atgccatcaa 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acagcagatt gaaagcatga ctgaagctga gtcctcagtc aaagaaaagg 1740 acatgaccaa agaattcttt gagaacaaat cggagacatg gcctatagga gagtccccca 1800 aaggagtgga agaaggctca atcgggaaag tttgcaggac cttgttagca aaatctgtgt 1860 ttaacagttt atatgcatct ccacaactcg aagggttttc agctgaatct aggaaaatac 1920 ttctcattgt tcaggccctt agggacaacc tggaacctgg aacctttgat attggggggc 1980 tatatgaatc aattgaggag tgtctgatta atgatccctg ggttttgctc aatgcatctt 2040 ggttcaactc cttccttaca catgcactaa agtagttgtg gcaatgctac tatttgctat 2100 ccatactgtc caaaaaagta ccttgtttct act 2133 <210> 132 <211> 2233 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 132 agcaaaagca ggtactgatt caaaatggaa gactttgtgc gacaatgctt caatccaatg 60 atcgtcgagc ttgcggaaaa ggcaatgaaa gaatatggag aggatccaaa aatcgagaca 120 aacaaattcg ctgcaatatg cacacacctg gaagtgtgtt tcatgtattc agacttccat 180 ttcattgatg aacggggtga gtcgataatt gttgagtctg gtgatccaaa tgcactctta 240 aaacatcgat ttgaaataat cgaaggaaga gaccgtacta tggcctggac agtggtgaat 300 agcatttgca 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ggactttgaa gattgcaagg atgtcagcga tttgaaacag 1200 tatgacagcg atgagccaga acaaaggtcg ctagcaagtt gggtccaaag tgaattcaac 1260 aaagcttgtg aattgactga ttcaagctgg atagaactcg atgaaatagg ggaaaatgtc 1320 gccccaatcg agcatattgc aagcatgagg aggaattatt ttacagctga agtgtctcac 1380 tgcagggcaa cagagtacat aatgaaggga gtgtacataa actcagcttt actcaacgcc 1440 tcttgtgcag ccatggatga ttttcagttg atcccaatga taagcaaatg cagaaccaaa 1500 gaaggacgac ggaaaacaaa tttgtatgga ttcatcataa agggaaggtc tcatttgagg 1560 aatgatactg atgtggtgaa ttttgtgagc atggaatttt ctcttactga ccctagatta 1620 gaaccacaca agtgggagaa gtattgtgtc cttgaaatag gggatatgct cctacgaact 1680 gcaataggcc aagtttcaag acccatgttt ctgtatgtga caaccaatgg aacttccaag 1740 atcaaaatga aatggggtat ggagatgagg cgttgtcttc ttcaatccct ccagcaaatc 1800 gaaagcatga ttgaggccga gtcctctgtc aaggaaaaag acatgactaa agaattcttt 1860 gaaaacaagt cggagacatg gcccattgga gaatcaccca aaggagtaga agaaggttcc 1920 attgggaaag tatgcaggac tctgctagca aagtctgtat tcaacagctt gtatgcatct 1980 ccacaacttg aaggtttttc agctgagtca agaaagctgc ttctcattgt tcaggcactt 2040 agggacaacc tggaacctgg caccttcgat cttggggggc tatatgaagc aattgaggag 2100 tgcctgatta atgatccctg ggttttgctt aatgcatctt ggttcaactc cttcctcaca 2160 catgcactga aatagttgtg gcaatgctac tatttgctat acatcctgtc caaaaaagta 2220 ccttgtttct act 2233 <210> 133 <211> 1635 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 133 agcaaaagca gggcaaggat caaaactagg ctgttcacca taagacagga actggctagc 60 aggggtctat gggattcctt tcgtcagtcc gagagaggcg aagagacaat tgaagaaaga 120 tttgaaatca caggaacaat gcgcaggctt gccgaccaaa gtctcccacc gaatttctcc 180 agccttgaaa attttagagc ctatgtggat ggattcgaac cgaacggctg cattgagggc 240 aagctttctc agatgtcaaa agaagtaacg gccagaattg agccctttct taaaacaaca 300 ccacgtcctc taagactgcc gggtggacct ccctgttccc aaaggtcaaa attcttactg 360 atggatgctc tgaaattaag cattgaggac ccgagtcatg agggagaggg gataccgctg 420 tatgatgcga tcaaatgcat gaaaacattt ttcggctgga aagagcccaa aattatcaag 480 tcacatgaga agggtataaa cccaaattat ctcctagctt ggaagcaggt 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1380 cctaagggag tggaggaagg ctccatcggg aaggtgtgca ggaccttact agcaaagtct 1440 gtgttcaaca gcttgtatgc atctccacaa ctcgaggggt tttcagctga atcaagaaaa 1500 ctgttactca ttgttcaggc acttagggac aacctggaac ctggaacctt cgacattgaa 1560 ggactgtatg aagcaattga ggagtgcctg attaatgatc cctgggtttt gcttaatgca 1620 tcttggttca actcc 1635 <210> 134 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 134 ttcggacgaa aaggcagcga gcccgatcgt gccttccttt gacatgagta atgaaggatc 60 ttatttcttc ggagacaatg cagaggagta cgacaatta 99 <210> 135 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 135 tctcggacga aaaggcagcg agcccgatcg tgccctcctt tgacatgagt aatgaaggat 60 cttatttctt cggagacaat gcagaggagt acgacaatta 100 <210> 136 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 136 tctcggacta aaaggcaacg aaccccatcg tgccctcttt tgacatgagt aatgaaggat 60 cttatttctt cggagacaat gcagaggagt acgacaatta 100 <210> 137 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 137 tctcggacga aaaggcagcg aacccgatcg tgccctcttt tgacatgagt aatgaaggat 60 cttatttctt cggagacaat gcagaggagt acgacaatta 100 <210> 138 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 138 tctcagacga aaaggcaacg aacccgatcg tgccctcttt tgacatgagt aatgaaggat 60 cttatttctt cggagacaat gcagaggagt acgacaatta 100 <210> 139 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 139 tctcagacga aaaggcaacg aacccgatcg tgccttcctt tgacatgagt aatgaaggat 60 cttatttctt cggagacaat gcagaggaat atgacaattg 100 <210> 140 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 140 tctcggacga aaaggcgacg aacccgatcg tgccttcctt tgacatgagt aacgagggat 60 cttatttctt cggagacaat gcagaggaat atgacaatta 100 <210> 141 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 141 tctcggacga aaaggcaacg aacccgatcg tgccttcctt tgacatgagc aatgaagggt 60 cttatttctt cggagacaat gctgaggagt ttgacagtta 100 <210> 142 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 142 tctcagacga aaaggcaacg aacccgatcg tgccttcctt tgacatgagt aatgagcgat 60 cttatttctt cggagacaat gctgaggagt atgacaattg 100 <210> 143 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 143 tctcggacga aaaggcaacg aacccgatcg tgccttcctt tgacatgagt aatgaaggat 60 cttatttctt cggagacaat gcataggagt atgacaatta 100 <210> 144 <211> 100 <212> DNA <213> Influenza virus type A NP segment <400> 144 tctcggacga aaaggcaacg aacccgatcg tgccttcctt tgacatgagt aacgaagggt 60 cttatttctt cggagacaat gcagaggaat atgacaatta 100 <210> 145 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Influenza virus type A NP segment <400> 145 aguagaaaca agg 13 <210> 146 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A vRNA <400> 146 ccugcuuucg cu 12 <210> 147 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 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<223> construct targeted to influenza virus type A NP segment and green fluorescent protein <400> 160 cgggguugcg cuccuggacg uagccgcagc gggguggauc uuauuucuuc ggaggcaggu 60 ccacuccgaa gaaauaagau ccuucccugu ccaggcuacg uccaggagcg cauucccug 119 <210> 161 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M vRNA <400> 161 cgctcagaca tgagaacaga atgg 24 <210> 162 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M cRNA <400> 162 atatcgtctc gtattagtag aaacaaggta gttttt 36 <210> 163 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M RNA <400> 163 cgctcagaca tgagaacaga atgg 24 <210> 164 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M RNA <400> 164 taactagcct gactagcaac ctc 23 <210> 165 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PB1 vRNA <400> 165 gtgcagaaat cagcccgaat ggttc 25 <210> 166 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PB1 cRNA <400> 166 atatcgtctc gtattagtag aaacaaggca ttt 33 <210> 167 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PB2 vRNA <400> 167 gcgaaaggag agaaggctaa tgtg 24 <210> 168 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PB2 cRNA <400> 168 atatggtctc gtattagtag aaacaaggtc gttt 34 <210> 169 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA vRNA <400> 169 gcttcttatc gttcaggctc ttagg 25 <210> 170 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA cRNA <400> 170 atatcgtctc gtattagtag aaacaaggta ctt 33 <210> 171 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PB 1 RNA <400> 171 cggattgatg cacggattga tttc 24 <210> 172 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PB 1 RNA <400> 172 gacgtctgag ctcttcaatg gtggaac 27 <210> 173 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PB2 RNA <400> 173 gcgaaaggag agaaggctaa tgtg 24 <210> 174 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PB2 RNA <400> 174 aatcgctgtc tggctgtcag taag 24 <210> 175 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA RNA <400> 175 gcttcttatc gttcaggctc ttagg 25 <210> 176 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA RNA <400> 176 ccgagaagca ttaagcaaaa cccag 25 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> gamma action <400> 177 tctgtcaggg ttggaaagtc 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> gamma action <400> 178 aaatgcaaac cgcttccaac 20 <210> 179 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligenucleotide for plasmid construction <400> 179 tggatcttat ttcttcggag attcaagaga tctccgaaga aataagatcc ttttttc 57 <210> 180 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligenucleotide for plasmid construction <400> 180 tcgagaaaaa aggatcttat ttcttcggag atctcttgaa tctccgaaga aataagatcc 60 a 61 <210> 181 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligenucleotide for plasmid construction <400> 181 tgatctgttc caccattgaa ttcaagagat tcaatggtgg aacagatctt ttttc 55 <210> 182 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligenucleotide for plasmid construction <400> 182 tcgagaaaaa agatctgttc caccattgaa tctcttgaat tcaatggtgg aacagatca 59 <210> 183 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligenucleotide for plasmid construction <400> 183 tgcgataata taactgcaag attcaagaga tcttgcagtt atattatcgt tttttc 56 <210> 184 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligenucleotide for plasmid construction <400> 184 tcgagaaaaa acgataatat aactgcaaga tctcttgaat cttgcagtta tattatcgca 60 <210> 185 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> respiratory syncitial virus siRNA <400> 185 cgataatata actgcaaga 19 <210> 186 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> respiratory syncitial virus siRNA <400> 186 tcttgcagtt atattatcg 19 <210> 187 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligenucleotide for plasmid construction <400> 187 tgcaattgag gagtgcctga ttcaagagat caggcactcc tcaattgctt ttttc 55 <210> 188 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to infuenza virus type A NP segment <400> 188 ggaucuuauu ucuucggaga tt 22 <210> 189 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NP segment <400> 189 ucuccgaaga aauaagaucc tt 22 <210> 190 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 190 gaaagcaggu caauuauaut t 21 <210> 191 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 191 auauaauuga ccugcuuuct t 21 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 192 gucaauuaua uucaauaugt t 21 <210> 193 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 193 cauauugaau auaauugact t 21 <210> 194 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 194 cucgcacccg cgagauacut t 21 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 195 aguaucucgc gggugcgagt t 21 <210> 196 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 196 auaaucaaga aguacacaut t 21 <210> 197 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 197 auguguacuu cuugauuaud tdt 23 <210> 198 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB 2 segment <400> 198 ugaaauggau gauggcaaut t 21 <210> 199 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 199 auugccauca uccauuucat t 21 <210> 200 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 200 cuggucaugc agaucucagt t 21 <210> 201 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 201 cugagaucug caugaccagt t 21 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 202 uaugcaaggc ugcaaugggt t 21 <210> 203 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 203 cccauugcag ccuugcauad tdt 23 <210> 204 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 204 caucgucaau gaugugggat t 21 <210> 205 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A PB2 segment <400> 205 ucccacauca uugacgaugt t 21 <210> 206 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PB1 segment <400> 206 aaauaccugc agaaaugcut t 21 <210> 207 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PB1 segment <400> 207 agcauuucug cagguauuud tdt 23 <210> 208 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PB1 segment <400> 208 aacaauauga uaaacaaugt t 21 <210> 209 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PB1 segment <400> 209 cauuguuuau cauauuguud tdt 23 <210> 210 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 210 cgaaagcagg uacugauccd tdt 23 <210> 211 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus typ A PA segment <400> 211 ggaucaguac cugcuuucgt t 21 <210> 212 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 212 aggcuauuca ccauaagacd tdt 23 <210> 213 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 213 gucuuauggu gaauagccut t 21 <210> 214 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 214 gggauuccuu ucgucagucd tdt 23 <210> 215 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 215 gacugacgaa aggaauccct t 21 <210> 216 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 216 gcaucuugug cagcaauggt t 21 <210> 217 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 217 ccauugcugc acaagaugct t 21 <210> 218 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 218 guuguggcag ugcuacuaut t 21 <210> 219 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 219 auaguagcac ugccacaact t 21 <210> 220 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 220 uacuauuugc uauccauact t 21 <210> 221 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A PA segment <400> 221 guauggauag caaauaguat t 21 <210> 222 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 222 uagauaauca cucacugagt t 21 <210> 223 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 223 cucagugagu gauuaucuad tdt 23 <210> 224 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 224 cgucccaagg caccaaacgt t 21 <210> 225 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 225 cguuuggugc cuugggacgt t 21 <210> 226 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 226 auuucuucgg agacaaugcd tdt 23 <210> 227 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 227 gcauugucuc cgaagaaaut t 21 <210> 228 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 228 ugcagaggag uacgacaaud tdt 23 <210> 229 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 229 auugucguac uccucugcad tdt 23 <210> 230 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 230 gagtaatgaa ggatcttatt t 21 <210> 231 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A NP segment <400> 231 ataagatcct tcattactcd tdt 23 <210> 232 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 232 cgaaagcagg uagauauugt t 21 <210> 233 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 233 caauaucuac cugcuuucgt t 21 <210> 234 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 234 uagauauuga aagaugagud tdt 23 <210> 235 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 235 acucaucuuu caauaucuad tdt 23 <210> 236 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 236 ucauggaaug gcuaaagact t 21 <210> 237 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 237 gucuuuagcc auuccaugat t 21 <210> 238 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 238 accaauccug ucaccucugt t 21 <210> 239 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 239 cagaggugac aggauuggud tdt 23 <210> 240 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 240 uguguucacg cucaccgugd tdt 23 <210> 241 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 241 cacggugagc gugaacacat t 21 <210> 242 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 242 cagugagcga ggacugcagt t 21 <210> 243 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 243 cugcaguccu cgcucacugt t 21 <210> 244 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 244 gacgcuuugu ccaaaaugcd tdt 23 <210> 245 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 245 gcauuuugga caaagcguct t 21 <210> 246 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 246 gucaggcuag gcaaauggut t 21 <210> 247 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 247 accauuugcc uagccugacd tdt 23 <210> 248 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 248 uucuugaaaa uuugcaggcd tdt 23 <210> 249 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 249 gccugcaaau uuucaagaad tdt 23 <210> 250 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 250 ucauugggau cuugcacuud tdt 23 <210> 251 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> influenza virus type A M segment <400> 251 aagugcaaga ucccaaugat t 21 <210> 252 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 252 uguggauucu ugaucgucud tdt 23 <210> 253 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 253 agacgaucaa gaauccacat t 21 <210> 254 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 254 ugucagcaua gagcuggagt t 21 <210> 255 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 255 cuccagcucu augcugacat t 21 <210> 256 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 256 gtcgaaacgc ctatcagaad tdt 23 <210> 257 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A M segment <400> 257 uucugauagg cguuucgact t 21 <210> 258 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 258 aaaagcaggg ugacaaagat t 21 <210> 259 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 259 ucuuugucac ccugcuuuut t 21 <210> 260 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 260 gcagggugac aaagacauad tdt 23 <210> 261 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type NS segment <400> 261 uaugucuuug ucacccugcd tdt 23 <210> 262 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 262 ggaugucaaa aaugcaguut t 21 <210> 263 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 263 aacugcauuu uugacaucct t 21 <210> 264 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 264 agagauucgc uuggagaagt t 21 <210> 265 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 265 cuucuccaag cgaaucucut t 21 <210> 266 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 266 caguaaugag aaugggagat t 21 <210> 267 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 267 ucucccauuc ucauuacugt t 21 <210> 268 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza NS segment <400> 268 uuguggauuc uugaucguct t 21 <210> 269 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NS segment <400> 269 gacgaucaag aauccacaat t 21 <210> 270 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligenucleotide for plasmid construction <400> 270 tcgagaaaaa agcaattgag gagtgcctga tctcttgaat caggcactcc tcaattgca 59 <210> 271 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> targeted to influenza virus type A NP segment <400> 271 ggaucuuauu ucuucggaga uucaagagau cuccgaagaa auaagauccu u 51

Claims (200)

1. 아래와 같이 구성되는 조성물

   목표 전사체를 표적하는 siRNA 또는 shRNA, 여기서, 목표 전사체는 병원체-특이적 전사체이고, 상기 전사체는 감염성 병원체에 의한 감염이나 복제에 관여한다.
2. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체는 다중 독립적 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 핵산 분자는 RNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 2 항에 있어서, RNA 분자는 단일-가닥인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체의 다중 변이체가 존재하고, 상기 병원체는 유전자 재배열(genetic reassorment)되는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체의 다중 변이체가 존재하고, siRNA 또는 shRNA는 이중나선 영역을 포함하고, 상기 영역의 안티센스 가닥 또는 안티센스 일부분은 목표 mRNA의 일부분에 완전히 상보적이고, 상기 일부분은 적어도 10개 뉴클레오티드 길이이고 복수의 변이체 사이에서 고도로 보존된 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 감염성 병원체의 다중 변이체가 존재하고, siRNA 또는 shRNA는 이중나선 영역을 포함하고, 상기 영역의 안티센스 가닥 또는 안티센스 일부분은 목표 mRNA의 일부분에 완전히 상보적이고, 상기 일부분은 적어도 12개 뉴클레오티드 길이이고 복수의 변이체 사이에서 고도로 보존된 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 6 항에 있어서, 감염성 병원체의 다중 변이체가 존재하고, siRNA 또는 shRNA는 이중나선 영역을 포함하고, 상기 영역의 안티센스 가닥 또는 안티센스 일부분은 목표 mRNA의 일부분에 완전히 상보적이고, 상기 일부분은 적어도 15개 뉴클레오티드 길이이고 복수의 변이체 사이에서 고도로 보존된 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 6 항에 있어서, 감염성 병원체의 다중 변이체가 존재하고, siRNA 또는 shRNA는 이중나선 영역을 포함하고, 상기 영역의 안티센스 가닥 또는 안티센스 일부분은 목표 mRNA의 일부분에 완전히 상보적이고, 상기 일부분은 적어도 17개 뉴클레오티드 길이이고 복수의 변이체 사이에서 고도로 보존된 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 6 항에 있어서, 감염성 병원체의 다중 변이체가 존재하고, siRNA 또는 shRNA는 이중나선 영역을 포함하고, 상기 영역의 안티센스 가닥 또는 안티센스 일부분은 목표 mRNA의 일부분에 완전히 상보적이고, 상기 일부분은 적어도 19개 뉴클레오티드 길이이고 복수의 변이체 사이에서 고도로 보존된 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제 8 항에 있어서, 서로 다른 변이체에서 동일한 일부분은 변이체 사이에서 고도로 보존된 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제 8 항에 있어서, 서로 다른 변이체에서 최대 1개의 뉴클레오티드에 의해 상이한 일부분은 변이체 사이에서 고도로 보존된 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 8 항에 있어서, 서로 다른 변이체에서 최대 2개의 뉴클레오티드에 의해 상이한 일부분은 변이체 사이에서 고도로 보존된 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제 8 항에 있어서, 일부분은 적어도 5개의 변이체 사이에서 고도로 보존된 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제 8 항에 있어서, 일부분은 적어도 10개의 변이체 사이에서 고도로 보존된 것을 특징으로 하는 조성물.
16. 제 8 항에 있어서, 일부분은 적어도 15개의 변이체 사이에서 고도로 보존된 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제 8 항에 있어서, 일부분은 적어도 20개의 변이체 사이에서 고도로 보존된 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체는 호흡기 상피 세포를 감염시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
19. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물.
20. 제 19 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물.
21. 제 19 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물.
22. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체 숙주 세포 mRNA 번역을 저해하는 것을 특징으로 하는 조성물.
23. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체는 숙주 세포를 감염시키고, siRNA 또는 shRNA는 숙주 세포에 의한 상기 병원체의 생산을 적어도 2배 저해할 만큼 충분한 수준으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
24. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체는 숙주 세포를 감염시키고, siRNA 또는 shRNA는 숙주 세포에 의한 상기 병원체의 생산을 적어도 5배 저해할 만큼 충분한 수준으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
25. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체는 숙주 세포를 감염시키고, siRNA 또는 shRNA는 숙주 세포에 의한 상기 병원체의 생산을 적어도 10배 저해할 만큼 충분한 수준으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
26. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체는 숙주 세포를 감염시키고, siRNA 또는 shRNA는 숙주 세포에 의한 상기 병원체의 생산을 적어도 50배 저해할 만큼 충분한 수준으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
27. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체는 숙주 세포를 감염시키고, siRNA 또는 shRNA는 숙주 세포에 의한 상기 병원체의 생산을 적어도 100s배 저해할 만큼 충분한 수준으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
28. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체는 숙주 세포를 감염시키고, siRNA 또는 shRNA는 숙주 세포에 의한 상기 병원체의 생산을 적어도 200배 저해할 만큼 충분한 수준으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
29. 제 1 항에 있어서, 목표 전사체는 바이러스 RNA 중합효소의 아단위를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 조성물.
30. 제 1 항에 있어서, 목표 전사체는 헤마글루티닌 또는 뉴우라미니다제를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 조성물.
31. 제 1 항에 있어서, 감염성 병원체는 인플루엔자 바이러스이고, 목표 전사체는 헤마글루티닌, 뉴우라미니다제, 막 단백질 1, 막 단백질 2, 비구조성 단백질 1, 비구조성 단백질 2, 중합효소 단백질 PB1, 중합효소 단백질 PB2, 중합효소 단백질 PA, 중합효소 단백질 NP에서 선택되는 단백질을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 조성물.
32. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 감염성 병원체의 복제를 저해할 만큼 충분한 수준으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
33. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이의 염기쌍 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
34. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 적어도 19개 뉴클레오티드 길이의 염기쌍 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
35. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 적어도 15개 뉴클레오티드 길이의 염기쌍 영역 및 적어도 하나의 단일-가닥 3 프라임 돌출(overhang)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
36. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 목표 전사체의 영역에 완전히 상보적인 일부분을 포함하고, 상기 일부분은 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 조성물.
37. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 최대 1개의 뉴클레오티드를 제외하고 목표 전사체의 영역에 완전히 상보적인 일부분을 포함하고, 상기 일부분은 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 조성물.
38. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 최대 2개의 뉴클레오티드를 제외하고 목표 전사체의 영역에 완전히 상보적인 일부분을 포함하고, 상기 일부분은 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 조성물.
39. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 68 서열의 뉴클레오티드 3 내지 21에 제시된 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
40. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 68 서열의 뉴클레오티드 3 내지 21에 제시된 적어도 12개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
41. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 68 서열의 뉴클레오티드 3 내지 21에 제시된 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
42. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 68 서열의 뉴클레오티드 3 내지 21에 제시된 적어도 17개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
43. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 68 서열의 뉴클레오티드 3 내지 21에 제시된 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
44. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 68 서열의 뉴클레오티드 3 내지 21에 제시된 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 10개의 연속 뉴클레오티드 사이에서 1-2개 뉴클레오티드가 상기 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
45. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 68 서열의 뉴클레오티드 3 내지 21에 제시된 적어도 12개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 12개의 연속 뉴클레오티드 사이에서 1-2개 뉴클레오티드가 상기 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
46. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 68 서열의 뉴클레오티드 3 내지 21에 제시된 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 15개의 연속 뉴클레오티드 사이에서 1-2개 뉴클레오티드가 상기 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
47. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 68 서열의 뉴클레오티드 3 내지 21에 제시된 적어도 17개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 17개의 연속 뉴클레오티드 사이에서 1-2개 뉴클레오티드가 상기 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
48. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 68 서열의 뉴클레오티드 3 내지 21에 제시된 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 19개의 연속 뉴클레오티드 사이에서 1-2개 뉴클레오티드가 상기 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
49. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266 또는 268 서열의 뉴클레오티드 1 내지 19에 제시된 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
50. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266 또는 268 서열의 뉴클레오티드 1 내지 19에 제시된 적어도 12개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
51. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266 또는 268 서열의 뉴클레오티드 1 내지 19에 제시된 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
52. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266 또는 268 서열의 뉴클레오티드 1 내지 19에 제시된 적어도 17개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
53. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266 또는 268 서열의 뉴클레오티드 1 내지 19에 제시된 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
54. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266 또는 268 서열의 뉴클레오티드 1 내지 19에 제시된 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 10개의 연속 뉴클레오티드 사이에서 1-2개 뉴클레오티드가 상기 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
55. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266 또는 268 서열의 뉴클레오티드 1 내지 19에 제시된 적어도 12개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 12개의 연속 뉴클레오티드 사이에서 1-2개 뉴클레오티드가 상기 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
56. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266 또는 268 서열의 뉴클레오티드 1 내지 19에 제시된 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 15개의 연속 뉴클레오티드 사이에서 1-2개 뉴클레오티드가 상기 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
57. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266 또는 268 서열의 뉴클레오티드 1 내지 19에 제시된 적어도 17개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 17개의 연속 뉴클레오티드 사이에서 1-2개 뉴클레오티드가 상기 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
58. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 코어 이중나선 영역을 포함하고, 상기 코어 이중나선 영역의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266 또는 268 서열의 뉴클레오티드 1 내지 19에 제시된 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 19개의 연속 뉴클레오티드 사이에서 1-2개 뉴클레오티드가 상기 서열과 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
59. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 센스와 안티센스 가닥이나 일부분을 포함하고, 이들의 서열은 각각 SEQ ID NO: 77과 78의 뉴클레오티드 1-19에 의해 제시되고 한 말단 또는 양 말단에 3' 돌출(overhang)이 선택적으로 존재하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
60. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 센스와 안티센스 가닥이나 일부분을 포함하고, 이들의 서열은 각각 SEQ ID NO: 71과 72의 뉴클레오티드 1-19에 의해 제시되고 한 말단 또는 양 말단에 3' 돌출(overhang)이 선택적으로 존재하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
61. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 센스와 안티센스 가닥이나 일부분을 포함하고, 이들의 서열은 각각 SEQ ID NO: 83과 84의 뉴클레오티드 1-19에 의해 제시되고 한 말단 또는 양 말단에 3' 돌출(overhang)이 선택적으로 존재하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
62. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 센스와 안티센스 가닥이나 일부분을 포함하고, 이들의 서열은 각각 SEQ ID NO: 89과 90의 뉴클레오티드 1-19에 의해 제시되고 한 말단 또는 양 말단에 3' 돌출(overhang)이 선택적으로 존재하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
63. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 센스와 안티센스 가닥이나 일부분을 포함하고, 이들의 서열은 각각 SEQ ID NO: 91과 92의 뉴클레오티드 1-19에 의해 제시되고 한 말단 또는 양 말단에 3' 돌출(overhang)이 선택적으로 존재하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
64. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 센스와 안티센스 가닥이나 일부분을 포함하고, 이들의 서열은 각각 SEQ ID NO: 93과 94의 뉴클레오티드 1-19에 의해 제시되고 한 말단 또는 양 말단에 3' 돌출(overhang)이 선택적으로 존재하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
65. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 센스와 안티센스 가닥이나 일부분을 포함하고, 이들의 서열은 각각 SEQ ID NO: 188과 189의 뉴클레오티드 1-20에 의해 제시되고 한 말단 또는 양 말단에 3' 돌출(overhang)이 선택적으로 존재하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
66. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 NP-1496, NP-1496a, PA-2087, PB1-2257, PB1-129, PB2-2240, M-37, M-598 또는 이들의 변이체의 이중나선 일부분에서 선택되는 이중나선 일부분을 포함하고, 상기 변이체는 상응하는 siRNA로부터 최대 1개의 뉴클레오티드에 의해 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
67. 제 66 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA 이중나선 일부분은 NP-1496의 이중나선 일부분과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
68. 제 66 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA 이중나선 일부분은 NP-1496a의 이중나선 일부분과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
69. 제 1 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 5'에서 3' 방향으로 SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 188의 첫 19개 뉴클레오티드에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
70. 제 1 항에 따른 siRNA 또는 shRNA의 유사체에 있어서, 상기 유사체는 적어도 한가지 변형을 보유한다는 점에서 siRNA 또는 shRNA와 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
71. 제 70 항에 있어서, 변형은 siRNA의 증가된 안정성을 유도하거나, siRNA의 흡수도를 강화시키거나, siRNA의 세포 진입을 강화시키거나, 또는 이들의 임의 조합을 유도하는 것을 특징으로 하는 유사체.
72. 제 70 항에 있어서, 변형은 염기, 당 또는 뉴클레오시드간 연쇄를 변화시키는 것을 특징으로 하는 유사체.
73. 제 70 항에 있어서, 변형은 뉴클레오티드 2' 변형이 아닌 것을 특징으로 하는 유사체.
74. 제 70 항에 있어서, 변형은 뉴클레오티드 2' 변형인 것을 특징으로 하는 유사체.
75. 제 1 항에 따른 siRNA 또는 shRNA의 유사체에 있어서, 상기 유사체는 적어도 하나의 리보뉴클레오티드가 디옥시리보뉴클레오티드에 의해 치환된다는 점에서 siRNA와 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
76. 복수의 단일-가닥 RNA를 함유하는 조성물에 있어서, 상기 RNA는 서로 혼성화되어 제 1 항의 조성물을 형성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
77. 제 76 항에 있어서, 단일-가닥 RNA는 대략 21개 내지 23개 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 조성물.
78. 제 1 항에 따른 복수의 siRNA 또는 shRNA를 함유하는 조성물.
79. 제 78 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA는 서로 다른 인플루엔자 바이러스 전사체에 표적되는 것을 특징으로 하는 조성물.
80. 제 78 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA의 적어도 일부는 동일한 인플루엔자 바이러스 전사체의 서로 다른 영역에 표적되는 것을 특징으로 하는 조성물.
81. 제 1 항에 따른 siRNA 또는 shRNA에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염에 취약한 세포 내에서 siRNA 또는 shRNA의 존재가 적어도 2가지 인플루엔자 균주에 의한 감염에 대한 상기 세포의 취약성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 siRNA 또는 shRNA.
82. 제 1 항에 따른 siRNA 또는 shRNA에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염에 취약한 개체 내에서 siRNA 또는 shRNA의 존재가 적어도 2가지 인플루엔자 균주에 의한 감염에 대한 상기 개체의 취약성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 siRNA 또는 shRNA.
83. 제 1 항에 따른 siRNA 또는 shRNA를 포함하는 세포.
84. 제 1 항에 따른 siRNA 또는 shRNA의 합성을 위한 주형을 제공하는 벡터.
85. 제 84 항에 있어서, 벡터는 숙주 세포에서 활성을 보이는 발현 신호에 작동가능하게 연결된 핵산을 포함하고, 숙주 세포에 도입되면 제 1 항에 따른 siRNA 또는 shRNA가 숙주 세포 내에서 생산되는 것을 특징으로 하는 벡터.
86. 숙주 세포에서 활성을 보이는 발현 신호에 작동가능하게 연결된 핵산을 포함하고, 숙주 세포에 도입되면 감염성 병원체에 특이적인 전사체를 표적하는 숙주 세포 내에서 siRNA 또는 shRNA가 생산되고, 상기 전사체는 병원체에 의한 감염이나 복제에 관여하는 것을 특징으로 하는 벡터.
87. 제 86 항에 있어서, 감염성 병원체는 바이러스이고, 상기 바이러스의 다중 변이체가 존재하고, 상기 바이러스가 유전자 재배열(genetic reassortment) 또는 혼합(mixing)되는 것을 특징으로 벡터.
88. 제 87 항에 따른 벡터를 포함하는 세포
89. 제 87 항에 따른 벡터를 포함하는 유전자도입 동물.
90. 제 87 항에 있어서, 바이러스는 다중 독립적 핵산 분자를 포함하는 바이러스인 것을 특징으로 하는 벡터.
91. 제 87 항에 있어서, 감염성 병원체는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 벡터.
92. 제 91 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스에 의한 감염에 대한 세포의 취약성을 감소시키거나 인플루엔자 바이러스 생산을 저해하는 siRNA 또는 shRNA의 하나이상 가닥의 전사를 위한 주형을 제공하는 것을 특징으로 하는 벡터.
93. 제 91 항에 있어서, 목표 -전사체의 분해는 인플루엔자 바이러스 감염이나 복제의 한가지이상 애스펙트(aspect)를 지연, 예방 또는 저해하는 것을 특징으로 하는 벡터.
94. 제 92 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA 이중나선 일부분은 NP-1496, NP-1496a, PA-2087, PB1-2257, PB1-129, PB2-2240, M-37, M-598 또는 이들의 변이체의 이중나선 일부분에서 선택되고, 상기 변이체는 센스 일부분, 안티센스 일부분, 또는 둘 모두에서 상응하는 siRNA로부터 최대 1개의 뉴클레오티드에 의해 상이한 것을 특징으로 하는 벡터.
95. 제 94 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA 이중나선 일부분은 NP-1496의 이중나선 일부분과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
96. 제 94 항에 있어서, siRNA 이중나선 일부분은 NP-1496a의 이중나선 일부분과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
97. 제 94 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 5'에서 3' 방향으로 SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 188의 첫 19개 뉴클레오티드에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
98. 제 86 항에 있어서, 핵산은 RNA 중합효소 Ⅲ용 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 벡터.
99. 제 98 항에 있어서, 프로모터는 U6 또는 H1 프로모터인 것을 특징으로 하는 벡터.
100. 제 86 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터에서 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
101. 제 86 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
102. 제 86 항에 있어서, DNA 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
103. 제 86 항에 있어서, 바이러스인 것을 특징으로 하는 벡터.
104. 제 86 항에 있어서, 렌티바이러스인 것을 특징으로 하는 벡터.
105. 감염성 병원체에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 감염성 병원체 대한 개체의 노출 이전에, 노출과 동시에, 또는 노출 이후에, 제 86 항에 따른 벡터 또는 제 88 항에 따른 세포를 함유하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
106. 제 105 항에 있어서, 감염성 병원체는 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
107. 제 105 항에 있어서, 감염성 병원체는 호흡기 상피 세포를 감염시키는 것을 특징으로 하는 방법.
108. 제 105 항에 있어서, 감염성 병원체는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
109. 제 105 항에 있어서, 조성물은 정맥내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
110. 제 105 항에 있어서, 조성물은 비강내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
111. 제 105 항에 있어서, 조성물은 흡입으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
112. 아래와 같이 구성되는 제약학적 조성물:

     제 1 항에 따른 조성물;

     제약학적으로 수용가능한 담체.
113. 제 112 항에 있어서, 에어로졸로 제조되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
114. 제 112 항에 있어서, 비강 스프레이로 제조되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
115. 제 112 항에 있어서, 정맥내 투여용으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
116. 제 112 항에 있어서, 감염성 병원체는 인플루엔자 바이러스이고, 제 2 항-인플루엔자 약물을 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
117. 제 116 항에 있어서, 제 2 항-인플루엔자 약물은 미국 식품의약국의 승인을 받은 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
118. 바이러스 저해물질을 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:

     후보 siRNA 또는 shRNA를 보유하는 세포를 제공하고, 이들의 서열은 바이러스 감염동안 생산된 적어도 한가지 전사체와 상보적인 영역을 보유하고, 상기 전사체는 전사체의 분해가 바이러스 감염이나 복제의 한가지이상 애스펙트(aspect)를 지연, 예방 또는 저해하는 것으로 특성화되고;

     세포에서 상기 바이러스에 의한 감염이나 복제를 감지하고;

     바이러스 감염성이나 복제를 저해하는 siRNA 또는 shRNA를 확인하고, 상기 siRNA 또는 shRNA는 바이러스 저해물질이다.
119. 제 118 항에 있어서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
120. 제 118 항에 있어서, 세포는 siRNA 또는 shRNA의 부재하에 적어도 하나의 바이러스 전사체를 생산하는 것으로 특성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
121. 제 118 항에 있어서, 세포를 바이러스 게놈으로 트랜스펙션시키거나 세포를 바이러스로 감염시키는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
122. 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법에 있어서, 상기 방법은 바이러스에 대한 개체의 노출 이전에, 노출과 동시에, 또는 노출 이후에, RNAi-유도 물질(inducing entity)의 효과량을 함유하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계로 구성되고, 상기 RNAi-유도 물질은 바이러스 감염동안 생산된 전사체에 표적되고, 상기 전사체는 전사체의 수준 감소가 바이러스 감염이나 복제의 한가지이상 애스펙트(aspect)를 지연, 예방 또는 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
123. 제 122 항에 있어서, 바이러스는 호흡기 상피 세포를 감염시키는 것을 특징으로 하는 방법.
124. 제 122 항에 있어서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
125. 제 122 항에 있어서, 조성물은 호흡기에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
126. 제 122 항에 있어서, 조성물은 통상적인 정맥내 전달 방법에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
127. 제 122 항에 있어서, RNAi-유도 물질의 부재하에 바이러스는 감염성 바이러스의 생산을 초래하는 완전 생명 주기가 진행될 수 있고, siRNA 또는 shRNA의 존재는 상기 바이러스의 생산을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
128. 제 122 항에 있어서, RNAi-유도 물질은 NP-1496, NP-1496a, PA-2087, PB1-2257, PB1-129, PB2-2240, M-37, M-598 또는 이들의 변이체의 이중나선 일부분에서 선택되는 이중나선 일부분을 포함하고, 상기 변이체는 센스 일부분, 안티센스 일부분, 또는 둘 모두에서 상응하는 siRNA로부터 최대 1개의 뉴클레오티드에 의해 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
129. 제 128 항에 있어서, 이중나선 일부분은 NP-1496의 이중나선 일부분과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
130. 제 128 항에 있어서, 이중나선 일부분은 NP-1496a의 이중나선 일부분과 동일한 것을 특징으로 하는 조성물.
131. 이중나선 일부분을 보유하는 siRNA 또는 shRNA를 설계하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:

     목표 전사체의 일부분을 확인하고, 상기 일부분은 감염성 병원체의 복수의 변이체 사이에서 고도로 보존되고 적어도 15개 연속 뉴클레오티드를 포함하고;

     상기 일부분 서열을 siRNA 또는 shRNA 센스 가닥이나 일부분의 이중나선 일부분에 대한 서열로서 선택한다.
132. 제 131 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA 센스 가닥이나 일부분의 이중나선 일부분에 대한 서열로서 상기 일부분에 상보적인 서열을 선택하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
133. 제 132 항에 있어서, siRNA 이중나선의 센스와 안티센스에서 적어도 하나에 3' 돌출을 부가하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
134. 제 131 항에 있어서, 복수의 변이체는 적어도 10개의 변이체로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
135. 제 131 항에 있어서, 복수의 변이체는 적어도 15개의 변이체로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
136. 제 131 항에 있어서, 복수의 변이체는 적어도 20개의 변이체로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
137. 제 131 항에 있어서, 일부분은 대략 19개의 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
138. 제 131 항에 있어서, 일부분은 변이체 사이에 최고 1개의 뉴클레오티드가 상이한 경우에 복수에 변이체 사이에서 고도로 보존된 것으로 간주되는 것을 특징으로 하는 방법.
139. 제 131 항에 있어서, 감염성 병원체는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
140. 제 131 항에 있어서, 감염성 병원체는 재정렬될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
141. 제 131 항에 있어서, 변이체는 적어도 2개의 변이체를 보유하고, 이들 각각은 서로 다른 종의 숙주를 감염시키는 것을 특징으로 하는 방법.
142. 제 141 항에 있어서, 종에는 사람, 돼지, 말, 새에서 선택되는 적어도 2가지 종이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
143. 제 131 항에 있어서, 변이체는 적어도 2개의 변이체를 보유하고, 이들 각각은 서로 다른 종의 숙주에서 기원하는 것을 특징으로 하는 방법.
144. 제 143 항에 있어서, 종에는 사람, 돼지, 말, 새에서 선택되는 적어도 2가지 종이 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
145. 제 131 항에 따른 방법으로 설계된 siRNA 또는 shRNA를 함유하는 조성물.
146. 제 143 항에 있어서, 전사체의 수준을 감소 또는 저하시키는 방법에 있어서, 전사체는 vRNA 또는 cRNA이고, 적어도 일부분이 vRNA 또는 cRNA 전사체에 상보적이거나 동일한 서열을 보유하는 mRNA 전사체를 표적하는 RNAi-유도 물질을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법
147. 제 1 전사체를 저해하는 방법에 있어서, 상기 방법은 제 2 전사체를 표적하는 RNAi-유도 물질을 투여하는 단계로 구성되고, 제 2 전사체의 저해는 제 1 전사체의 저해를 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
148. 제 147 항에 있어서, 제 1 전사체의 수준은 RNAi-유도 물질의 부재시 수준에 비하여 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
149. 제 147 항에 있어서, 제 2 전사체의 수준은 RNAi-유도 물질의 부재시 수준에 비하여 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
150. 제 147 항에 있어서, 제 1과 제 2 전사체의 수준은 RNAi-유도 물질의 부재시 수준에 비하여 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
151. 제 147 항에 있어서, RNAi-유도 물질은 제 1 전사체에 특이적으로 표적화되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
152. 제 147 항에 있어서, 제 2 전사체는 RNA 안정성을 유지시키는 기능을 하는 단백질을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
153. 제 147 항에 있어서, 단백질은 핵산 결합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
154. 제 153 항에 있어서, 핵산 결합 단백질은 RNA 결합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
155. 제 147 항에 있어서, 제 2 전사체는 중합효소를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
156. 제 155 항에 있어서, 중합효소는 RNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
157. 제 155 항에 있어서, 중합효소는 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
158. 제 155 항에 있어서, 중합효소는 역전사효소인 것을 특징으로 하는 방법.
159. 제 147 항에 있어서, 제 1과 제 2 전사체 중에서 적어도 하나는 병원체-특이적 전사체이고, 상기 병원체는 감염성 병원체인 것을 특징으로 하는 방법.
160. 제 147 항에 있어서, 제 1과 제 2 전사체는 병원체-특이적 전사체이고, 상기 병원체는 감염성 병원체인 것을 특징으로 하는 방법.
161. 제 160 항에 있어서, 감염성 병원체는 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
162. 제 161 항에 있어서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
163. 제 162 항에 있어서, 제 2 전사체는 바이러스 NP 단백질 또는 바이러스 PA 단백질을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 방법.
164. 제 163 항에 있어서, 제 1 전사체는 M 단백질, HA 단백질, PB1 단백질, PB2 단백질, NS 단백질에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
165. 아래와 같이 구성되는 조성물:

     RNAi-유도 물질, 상기 RNAi-유도 물질은 인플루엔자 바이러스 전사체에 표적화되고;

     양이온성 중합체, 변형된 양이온성 중합체, 펩티드 분자 전달물질, 폐 도입에 적합한 계면활성제, 중성이나 양이온성 지질, 리포솜, 비-양이온성 중합체, 변형된 비-양이온성 중합체, 부피바케인(bupivacaine), 클로로퀸(chloroquine)에서 선택되는 운반제(delivery agent).
166. 제 165 항에 있어서, 운반제는 목표 세포로의 전달을 강화시키는 전달-강화 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
167. 제 165 항에 있어서, 전달-강화 부분은 목표 세포에 의해 발현되는 분자에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편 또는 리간드로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
168. 제 167 항에 있어서, 목표 세포는 호흡기 상피 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
169. 제 165 항에 있어서, 전달-강화 부분은 운반제의 분해, 제거 또는 비특이적 결합을 감소시키는 부분인 것을 특징으로 하는 조성물.
170. 제 165 항에 있어서, RNAi-유도 물질은 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
171. 제 170 항에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
172. 제 165 항에 있어서, RNAi-유도 물질은 DNA 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
173. 제 165 항에 있어서, RNAi-유도 물질은 바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물.
174. 제 173 항에 있어서, RNAi-유도 물질은 렌티바이러스인 것을 특징으로 하는 조성물
175. 제 165 항에 있어서, RNAi-유도 물질은 siRNA인 것을 특징으로 하는 조성물
176. 제 165 항에 있어서, RNAi-유도 물질은 shRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
177. 제 165 항에 있어서, RNAi-유도 물질은 RNAi-유도 벡터이고, 세포 내에서 상기 벡터의 존재는 인플루엔자 바이러스 전사체에 표적화된 siRNA 또는 shRNA의 생산을 유도하는 것을 특징으로 하는 조성물.
178. 제 165 항에 있어서, RNAi-유도 물질은 siRNA 또는 shRNA 또는 RNAi-유도 벡터이고, 세포 내에서 상기 벡터의 존재는 siRNA 또는 shRNA의 생산을 유도하고, siRNA 또는 shRNA는 목표 전사체의 영역에 완전히 상보적인 일부분을 포함하고, 상기 일부분은 적어도 15개 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 조성물.
179. 제 165 항에 있어서, RNAi-유도 물질은 siRNA 또는 shRNA 또는 RNAi-유도 벡터이고, 세포 내에서 상기 벡터의 존재는 siRNA 또는 shRNA의 생산을 유도하고, siRNA 또는 shRNA는 NP-1496, NP-1496a, PA-2087, PB1-2257, PB1-129, PB2-2240, M-37, M-598 또는 이들의 변이체의 이중나선 일부분에서 선택되는 이중나선 일부분을 포함하고, 상기 변이체는 센스 일부분, 안티센스 일부분, 또는 둘 모두에서 상응하는 siRNA 또는 shRNA로부터 최대 1개의 뉴클레오티드에 의해 상이한 것을 특징으로 하는 조성물.
180. 제 179 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA 이중나선 일부분은 NP-1496의 이중나선 일부분인 것을 특징으로 하는 조성물.
181. 제 179 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA NP-1496a의 이중나선 일부분인 것을 특징으로 하는 조성물.
182. 제 165 항에 있어서, RNAi-유도 물질은 siRNA 또는 shRNA 또는 RNAi-유도 벡터이고, 세포 내에서 상기 벡터의 존재는 siRNA 또는 shRNA의 생산을 유도하고, siRNA 또는 shRNA의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 5'에서 3' 방향으로 SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 188의 첫 19개 뉴클레오티드에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
183. 제 182 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 93 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
184. 제 182 항에 있어서, siRNA 또는 shRNA의 센스 가닥이나 일부분의 서열은 SEQ ID NO: 188 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
185. 제 165 항에 있어서, 운반제는 야이온성 중합체, 변형된 양이온성 중합체, 폐 도입에 적합한 계면활성제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
186. 제 185 항에 있어서, 양이온성 중합체는 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐피롤리돈, 키토산, 폴리(β-아미노 에스테르) 중합체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
187. 제 186 항에 있어서, 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민인 것을 특징으로 하는 조성물.
188. 제 185 항에 있어서, 변형된 양이온성 중합체는 중합체의 양이온성 성질을 감소시키기 위하여 선택된 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
189. 제 188 항에 있어서, 변형은 아세틸, 이미다졸, 숙시닐, 아실에서 선택되는 작용기를 이용한 치환인 것을 특징으로 하는 조성물.
190. 제 185 항에 있어서, 변형된 양이온성 중합체의 잔기중 25% 내지 75%가 변형되는 것을 특징으로 하는 조성물.
191. 제 190 항에 있어서, 변형된 양이온성 중합체의 잔기중 50%가 변형되는 것을 특징으로 하는 조성물.
192. 제 185 항에 있어서, 운반제는 폐 도입에 적합한 계면활성제인 것을 특징으로 하는 조성물.
193. 제 192 항에 있어서, 계면활성제는 Infasure?, Survantao?, 또는 Exosurf?인 것을 특징으로 하는 조성물
194. 인플루엔자 바이러스 복제, 병원성 또는 감염성을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 제 65 항에 따른 조성물을 인플루엔자 바이러스 감염의 위험이 높거나 인플루엔자 바이러스에 감염된 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
195. 제 194 항에 있어서, 조성물은 근육내 주사, 흡입, 비강내, 에어로졸에서 선택되는 루트로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
196. 제 194 항에 있어서, 조성물은 정맥내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
197. 제 196 항에 있어서, 조성물은 통상적인 정맥내 투여 기술로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
198. 제 194 항에 있어서, 조성물은 흡입으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
199. 제 194 항에 있어서, 조성물은 비강내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
200. 제 194 항에 있어서, 조성물은 에어로졸로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.