JP2008535496A - 呼吸器ウィルス感染用ＲＮＡｉ治療因子 - Google Patents

Abstract

【課題】
【解決手段】
呼吸器ウィルスの産生を阻害する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であって、前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が約１５から約５０のヌクレオチド長であり、前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、呼吸器ウィルスの核酸配列内の保存部位、又はその変異に対して同一な核酸配列を具えるｓｉＲＮＡ分子及びその使用が、本明細書に開示されている。
【選択図】図２

Description

配列リスト
本出願の配列リストは、印刷された紙コピーの代わりに、コンパクトディスクに記録されて提出された。ディスクは２００６年９月１日に記録され、ＣＲＦ“ＣＯＰＹ１，”“ＣＯＰＹ２，”及び“ＣＯＰＹ３，”と表示される。各ディスクは、“０．５２５ＰＣＴ．ＡＰＰ”という名称の１．６８ＭＢファイルのみを含む。このファイルの全体を参照することにより本出願に含める。

技術分野
本発明は、一般に、ウィルス感染の治療及び予防分野に関する。本発明は更に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、具体的には、抗ウィルスｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの使用分野に関する。

発明の背景
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、植物及び動物において広く認められる遺伝子調節機構であり、この機構では、標的ｍＲＮＡが、配列特異的やり方で分解される（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５，４８５−４９０（２００１）；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．＆ Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１２，２２５−２３２（２００２）；Ｆｉｒｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６−８１１（１９９８）；Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０１，２５−３３（２０００））。標的ｍＲＮＡは、宿主のｍＲＮＡであってもよいし、或いは、宿主の病原体、例えば、ウィルス病原体のｍＲＮＡであってもよい。

病原性ウィルス伝染病は、世界的に最も広く蔓延する伝染病の内のいくつかを占める。このようなウィルスの一族がインフルエンザファミリーである。１９１８年のインフルエンザＡウィルスの大流行では、推定２千万から４千万人の人々が亡くなっている。アメリカ合衆国においても、毎年、２万から４万の人々が、インフルエンザＡウィルス感染、又はその合併症で亡くなっている。流行期には、インフルエンザ関連の入院患者の数は、一回の冬時期に３万を超す場合がある。インフルエンザウィルス感染に対して優れた治療はなく、既存のワクチンの価値は限られている。これは、一部は、抗原シフト及びドリフトという性質のためである。ヒト及び他の動物に対して病原となる他のいくつかのウィルスについても、その治療又は予防は同様の困難に直面している。

天然のＲＮＡ分解過程は、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼであるダイサーによって開始される。ダイサーは、小型干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる、２１から２５ヌクレオチド長の二本鎖に、長いｄｓＲＮＡ前駆体を変換する、進行的切断を促進する（Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０１，２５−３３（２０００）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５，１８８−２００（２００１）；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０４，２９３−２９６（２０００）；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９，３６３−３６６（２００１））。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識し、切断する大型のタンパク複合体に組み込まれる（Ｎｙｋａｎｅｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０７，３０９−３２１（２００１））。哺乳類細胞にｄｓＲＮＡを導入しても、効率的な、ダイサー介在ｓｉＲＮＡの産生をもたらさず、従ってＲＮＡｉを誘発しないことが、一つの研究グループによって報告されている（Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２５２，９５−１０５（２０００）；Ｕｉ−Ｔｅｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４７９，７９−８２（２０００））。細胞におけるｓｉＲＮＡの熟成にダイサーが必要であるという要件は、合成ポリヌクレオチドｓｉＲＮＡ二本鎖（例えば、２１ヌクレオチド配列）を導入することによって回避することが可能であり、この合成ｓｉＲＮＡは、種々の哺乳類細胞においてトランスフェクト遺伝子及び内因性遺伝子の発現を抑制する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８（２００１））。

発明の概要
本発明の上記及び他の目的、利点、及び特徴は、下記に更に詳述される、本発明の詳細を読むことによって当業者には明白となろう。ある範囲の値が提示される場合、文脈が明らかに別様に指示しない限り、その範囲の上限と下限の間の、各中間値も、下限単位の１０分の１まで特異的に開示されるものと理解しなければならない。任意の言及値の間のより小さい各値、或いは、言及範囲の中の中間値、及び、該言及範囲おける、他の任意の言及又は中間値も、本発明の範囲に含まれる。これらより小さい範囲の上限及び下限も、それぞれ独立に該範囲に含めてもよいし、除外してもよく、且つ、より小さい範囲に含まれる限界の内のどちらか一方、又は、その両方とも含まれる、或いは、その両方とも含まれない各範囲も、本発明に含まれ、前記範囲の特異的に除外された限界にも従う。言及範囲が、限界の一方、又は両方を含む場合、これら含められた限界の一方、又は両方を除外する範囲も本発明の中に含まれる。

本発明の一つの態様は、呼吸器ウィルスの転写体を標的とするＲＮＡｉ誘発性実体であり、前記ＲＮＡｉ誘発性実体は、約１５から約６０のヌクレオチド長であり、ウィルスタンパクをコードする核酸の一部に対して少なくとも約８４%相同である第１核酸配列と；第１核酸部分に対して少なくとも８４％相補的である第２核酸配列と；を具える。
本発明の一つの実施例では、ＲＮＡｉ誘発性実体は、約１５から約４０のヌクレオチド長であり、ウィルスタンパクをコードする核酸の一部に対して少なくとも約８９％相同である第１核酸配列と；第１核酸部分に対して少なくとも８９％相補的である第２核酸配列と；を具える。本発明の別の実施例では、ＲＮＡｉ誘発性実体は、約１５と約４０の間のヌクレオチド長を持ち、ウィルスタンパクをコードする核酸の一部に対し少なくとも約９４％相同である第１核酸配列；及び、第１核酸部分に対して少なくとも９４％相補的である第２核酸配列を具える。別の実施例では、ＲＮＡｉ誘発性実体は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。本発明の別の実施例では、核酸は、３′オーバーハングを具える。関連実施例では、オーバーハングは、デオキシチミジンを具える。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパクは、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスからなる群より選択されるウィルスから得られる。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパクは、呼吸器ウィルスタンパクである。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパクは、インフルエンザウィルスタンパクである。本発明の別の実施例では、ＲＮＡｉ誘発性実体はｓｈＲＮＡであり、更に、ヘアピンループ構造体を形成する第３核酸配列を具える。関連実施例では、ヘアピンループ構造体は、４から１１のヌクレオチドを具える。

本発明の別の態様は、約１６から約３５のヌクレオチド長である分離核酸配列で、該核酸配列は、ウィルスタンパクをコードするウィルス核酸配列の一部、又はその相補体に対し、その長さにそって少なくとも約８５％同一である。本発明のある実施例では、ウィルスタンパクは、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスからなる群より選択されるウィルスから得られる。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパクは、呼吸器ウィルスタンパクである。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパクは、インフルエンザウィルスタンパクである。

本発明の別の態様は、インフルエンザウィルスタンパク転写体を標的とするＲＮＡｉ誘発性実体であり、前記ＲＮＡｉ誘発性実体は、約１５から約６０のヌクレオチド長であり、配列番号１から１０７０９からなる群より選択される核酸配列、その相補体、少なくとも１６ヌクレオチド長を有するか、又は、前記核酸配列に対して少なくとも８０%相同であるヌクレオチド配列を有する断片、及び、第１核酸配列に対して少なくとも８０％相補的である第２核酸配列を具える。本発明のある実施例では、第２核酸配列は、前記第１核酸部分に対して少なくとも約９０％相補的である。本発明の別の実施例では、ＲＮＡｉ誘発性実体は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。本発明の別の実施例では、ＲＮＡｉ誘発性実体は、ｓｈＲＮＡであり、更に、ヘアピンループ構造体を形成する第３核酸配列を具える。関連実施例では、ヘアピンループ構造体は、４から１１のヌクレオチドを具える。

本発明の別の態様は、ウィルスタンパク転写体の保存部位を標的とするｓｉＲＮＡであり、前記ＲＮＡｉ誘発性実体は、約１５と約６０の間のヌクレオチド長である。本発明のある実施例では、保存部位は、約３００ヌクレオチド長であり、前記ウィルスタンパク遺伝子の３′末端を具える。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパクは、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスからなる群より選択されるウィルスから得られる。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパクは、呼吸器ウィルスタンパクである。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパクは、インフルエンザウィルスタンパクである。

本発明の別の態様は、第１ウィルスタンパクをコードする第１遺伝子、及び、第２ウィルスタンパクをコードする第２遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡである。本発明のある実施例では、第１及び第２ウィルス遺伝子は、同じウィルスの異なる株由来である。本発明の別の実施例では、第１及び第２ウィルス遺伝子は、二つの異なるウィルス由来である。関連実施例では、一のウィルスはインフルエンザウィルスである。

本発明の別の態様は、ウィルスタンパクをコードする二又はそれ以上の遺伝子の発現を少なくとも約２５％低減するｓｉＲＮＡである。

本発明の別の態様は、その配列が、ウィルスタンパクをコードする核酸の標的部分を具える転写体を標的とするＲＮＡｉ誘発因子である。本発明のある実施例では、ＲＮＡｉ誘発因子は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパクは、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスからなる群より選択されるウィルスから得られる。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパクは、呼吸器ウィルスタンパクである。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパクは、インフルエンザタンパクである。

本発明の別の態様は、第１ｓｉＲＮＡ及び第２ｓｉＲＮＡを具える組成物であって、ウィルスタンパクをコードする遺伝子の発現を抑制する組成物である。本発明のある実施例では、第１ｓｉＲＮＡは、第１ウィルスタンパクをコードする第１遺伝子の発現を抑制し、第２ｓｉＲＮＡは、第２ウィルスタンパクをコードする第２遺伝子の発現を抑制する。本発明の関連実施例では、第１及び第２ｓｉＲＮＡは、前記第１及び第２遺伝子の発現を少なくとも約２５％抑制する。本発明の別の関連実施例では、第１及び第２ウィルス遺伝子は、同じウィルス種の異なる株由来である。本発明の別の関連実施例では、第１及び第２ウィルス遺伝子は、同じウィルス属の二つのウィルス種由来である。本発明の別の関連実施例では、第１及び第２遺伝子は、同じウィルス科の二つのウィルス由来である。本発明の別の実施例では、組成物は更に、第３ウィルスタンパクをコードする第３遺伝子の発現を少なくとも約２５％低減する第３ｓｉＲＮＡを具える。ある関連実施例では、組成物は更に陽イオン性ポリマーを具える。

本発明の別の態様は、前記遺伝子の少なくとも一部においてウィルスタンパク遺伝子を検出するプライマー又はプローブを具える診断キットであって、前記一部が保存部位である診断キットである。

本発明の別の態様は、ウィルス感染哺乳類細胞において標的ウィルス遺伝子の発現を抑制する方法であって、ウィルスタンパク遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡに前記細胞を接触させ、前記ｓｉＲＮＡが、前記哺乳類細胞の細胞原形質に進入し、前記ウィルスタンパク遺伝子の発現を少なくとも約２５％低減するステップを具える方法である。本発明のある実施例では、ウィルスタンパクは、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスからなる群より選択されるウィルスから得られる。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパク遺伝子は、呼吸器ウィルスタンパク遺伝子である。本発明の別の実施例では、ウィルスタンパク遺伝子は、インフルエンザウィルスタンパク遺伝子である。

本発明の別の態様は、ｓｉＲＮＡを、該ｓｉＲＮＡを必要とする被験体に送達する方法であって、ウィルスタンパク遺伝子の発現を少なくとも約２５％低減する、ｓｉＲＮＡの有効量を具える組成物を前記被験体に投与することを具える方法である。本発明のある実施例では、ｓｉＲＮＡは、被験体の体重当たり約０．１ｍｇ／ｋｇと、被験体の体重当たり約２０ｍｇ／ｋｇの間の濃度で前記被験体に送達される。本発明の別の実施例では、ｓｉＲＮＡは、被験体の体重当たり約０．１ｍｇ／ｋｇと、被験体の体重当たり約１０ｍｇ／ｋｇの間の濃度で前記被験体に送達される。本発明の別の実施例では、被験体の体重当たり約０．１ｍｇ／ｋｇと、被験体の体重当たり約５０ｍｇ／ｋｇの間の濃度で前記被験体に送達される。本発明の別の実施例では、ｓｉＲＮＡは、ウィルスタンパク遺伝子の発現を少なくとも約２５％低減する。本発明の別の実施例では、ｓｉＲＮＡは、表１から９に列挙される核酸配列を具える。本発明の別の実施例では、組成物は更に、陽イオン性ポリマーを具える。本発明の別の実施例では、組成物は、吸引、鼻腔内、経口、又は静脈内を通じて投与される。

本発明の別の態様は、被験体のウィルス感染を予防又は治療する方法であって、ウィルスのタンパク遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを具える治療化合物を該被験体に投与することを具える方法である。本発明のある実施例では、ｓｉＲＮＡ又は前記ｓｈＲＮＡは、約１５から約６０のヌクレオチド長であり：ウィルスタンパクをコードする核酸の一部に対して少なくとも約８５％相同である第１核酸配列と；第１核酸部分に対して少なくとも８５％相補的である第２核酸配列と；を具える。本発明の別の実施例では、ｓｉＲＮＡが二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が約１５から約５０ヌクレオチドであり、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、呼吸器ウィルスの核酸配列中の保存部位、又はその変異種に対して同一の核酸配列を具える。本発明の別の実施例では、呼吸器ウィルスは、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスからなる群より選択される。本発明の別の実施例では、核酸配列は核タンパク遺伝子をコードする。本発明の別の実施例では、呼吸器ウィルスはインフルエンザウィルスであり、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０７１０から１０７５１から成る群より選択されない。本発明の別の実施例では、治療化合物は、陽イオン性ポリマーを具える。

本発明の別の態様は、哺乳類被験体の呼吸器系におけるウィルスの産生を抑制するための薬剤の製造におけるｓｉＲＮＡ分子の使用であって、該ウィルスのタンパク遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを該被験体に投与するステップを具える使用である。本発明のある実施例では、ｓｉＲＮＡ又は前記ｓｈＲＮＡは、約１５から約６０のヌクレオチド長であり、且つ、ウィルスタンパクをコードする核酸の一部に対して少なくとも約８５%相同である第１核酸配列と；第１核酸部分に対して少なくとも８４％相補的である第２核酸配列と；を具える。本発明の別の実施例では、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が約１５から約５０ヌクレオチドであり、前記二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、呼吸器ウィルスの核酸配列中の保存部位、又はその変異種に対して同一の核酸配列を具える。本発明の別の実施例では、呼吸器ウィルスは、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスからなる群より選択される。本発明の別の実施例では、核酸配列はタンパク（ＮＰ）遺伝子をコードする。本発明の別の実施例では、呼吸器ウィルスはインフルエンザウィルスであり、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０７１０から１０７５１から成る群より選択されない。本発明の別の実施例では、呼吸器ウィルスはインフルエンザウィルスであり、ｓｉＲＮＡは、配列番号１から１０７０９からなる群より選択される。

本発明の別の態様は、二又はそれ以上のウィルスのウィルスタンパク転写体中に存在するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ標的配列を同定する方法であって：ａ）ウィルスから、ウィルスタンパクをコードする核酸配列を調製するステップと；ｂ）前記核酸配列の標的部分であって、前記部分が約１９ヌクレオチドを具え、３個を超える連続グアニンヌクレオチド、又は３個を超える連続シトシンヌクレオチドを具えない標的部分を同定するステップと；ｃ）一又はそれ以上の回数ステップ（ａ）及び（ｂ）を繰り返し、各繰り返しで様々なウィルスを用いて、これによって前記ウィルスタンパク転写体上にｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ標的配列を同定するステップと；を具える方法である。本発明のある実施例では、核酸配列は、タンパク配列の保存部位を具える。本発明の別の実施例では、方法は、前記標的配列に結合するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを生成するステップを更に具える。

本発明の別の態様は、ウィルス感染を診断する方法であって、被験体が、ＲＮＡｉ誘発性実体による阻害に対して感受性を有するウィルスに感染したかどうかを決定するステップを具える方法である。本発明のある実施例では、方法は、被験体に対しＲＮＡｉ誘発実体を投与するステップを具える。

本発明の別の態様は、インフルエンザウィルス感染を治療又は予防する方法であって、治療又は予防を要する被験体にＲＮＡｉ誘発性実体を投与するステップを具える方法である。

本発明の別の態様は、呼吸器ウィルスの産生を阻害する二本鎖ｓｉＤＮＡ分子であり、前記二本鎖ｓｉＤＮＡ分子の各鎖が約１５から約５０ヌクレオチドであり、前記二本鎖ｓｉＤＮＡ分子の一方の鎖が、呼吸器ウィルスの核酸配列中の保存部位、又はその変異種に対して同一の核酸配列を具える。本発明のある実施例では、呼吸器ウィルスは、呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスからなる群より選択される。関連実施例では、核酸配列はあるタンパク（ＮＰ）遺伝子をコードする。本発明の別の実施例では、呼吸器ウィルスはインフルエンザウィルスであり、ｓｉＲＮＡは、配列番号１０７１０から１０７５１から成る群より選択されない。本発明の別の実施例では、呼吸器ウィルスはインフルエンザウィルスであり、ｓｉＲＮＡは、配列番号１から１０７０９からなる群より選択される。

発明の詳細な説明
本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の細胞内現象に基づく。その現象では、標的ＲＮＡに対して相補的な部分を含む細胞中の二本鎖ＲＮＡの存在が、配列特異的なやり方で標的ＲＮＡの発現を阻害する。一般に、阻害は、標的の切断、又はその翻訳の阻害によってもたらされる。ＲＮＡｉは、病原体感染のような攻撃に対する正常な細胞反応であるが、これは、そのような感染によってかく乱されたシステムを安静状態に戻すのに有効な機構でもある。更に、ＲＮＡｉは、細胞のシグナル伝達経路を特異的に破壊するのに用いることも可能である。

ＲＮＡｉ活性を高める二本鎖ＲＮＡ構造体は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを生成するように処理することが可能な他の二本鎖構造体（ｄｓＲＮＡ）（又は、標的転写体の発現をＲＮＡ干渉によって阻害する他の小型ＲＮＡ分子）である。ＲＮＡ誘発性実体、例えば、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、被験体に、又はその分離細胞に導入して、特定のシグナル伝達経路を変調するようにしてもよい。更にこれらのｄｓＲＮＡは、異常な細胞シグナル伝達によって特徴づけられる疾患又は障害を予防・治療するための有用な治療剤である。例えば、哺乳類に感染するウィルスは、宿主細胞の細胞機関を乗っ取ることによって複製する。従って、ウィルス産生を制御するウィルスシグナル伝達経路を破壊するためにＲＮＡｉ技術を用いることは有用である。

あるウィルス遺伝子調節が、ウィルスのライフサイクルの二つの段階において必須であることが知られている。従来技術はこれまで、ｓｉＲＮＡの効果的標的としてウィルスのポリメラーゼに注目してきた。ポリメラーゼがウィルスの複製に必要だからである。例えば、ＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）は、転写及び複写の両方に必要不可欠のポリペプチドである。これによって次のような推測が生まれた。即ち、ＰｄＲＰサブユニットを沈黙させることによって、全ＲＮＡ合成のほぼ完全な欠如が実現されるであろうから、ウィルス産生の強烈な阻害がもたらされるであろうと言うのである。実際、予想通りの結果が、ＲＳＶ、水泡性胃炎ウィルス、及びパラインフルエンザウィルスで観察された（Ｂａｒｉｋ Ｓ．「非セグメント型マイナス鎖ＲＮＡウィルス複製のｓｉＲＮＡによる調節（Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｎｏｎｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｉＲＮＡ）」Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．２００４ Ｊｕｎ １；１０２（１）：２７−３５；ａｎｄ Ｂｉｔｋｏ ｅｔ ａｌ．，「配列特異的二本鎖小型干渉ＲＮＡによる細胞原形質遺伝子の表現形沈黙化、及び、野生型マイナス鎖ＲＮＡウィルスの逆行性遺伝学におけるその応用（Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ）」ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１；１（１）：３４．Ｅｐｕｂ ２００１ Ｄｅｃ ２０．参照）。別のウィルスタンパク、核タンパク、カプシド、又は核カプシドと色々の名称で呼ばれるものも、例えば、ウィルス転写及び複製に関与することが認められている。しかし、核タンパクについて行われたアンチセンス実験から、このポリペプチドをコードする転写体は、ポリメラーゼほど適切な標的とはならないことが示された（Ｈａｔｔａ ｅｔ ａｌ．「未修飾、リン酸チオエート化、リポソーム封入オリゴヌクレオチドによる、インフルエンザウィルスポリメラーゼ及び核タンパク遺伝子の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ，ａｎｄ ｌｉｐｏｓｏｍａｌｌｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９６ Ｊｕｎ １４；２２３（２）：３４１−６；及び、Ｍｉｚｕｔａ ｅｔ ａｌ．，「ウィルスＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インフルエンザＡに感染したマウスの生存率を改善する（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｍｉｃｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌｕｅｎｚｅ Ａ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９ Ｊｕｎ；１７（６）：５８３−７を参照）。ｓｉＲＮＡによる最近の実験は、核タンパクも、ｓｉＲＮＡの可能な標的として研究すべきであることを示唆している。Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，「ｓｉＲＮＡは、ヒト細胞に対し細胞内抗ウィルス免疫を付与する（Ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｃｏｎｆｅｒｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ），Ｎａｔｕｒｅ．２００２ Ｊｕｌ ２５；４１８（６８９６）：４３０−４；Ｆｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．「ＲＮＡ干渉による、マールブルグウィルスタンパク発現及びウィルス放出の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｒｂｕｒｇ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｒｅｌｅａｓｅ）」，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００５ Ａｐｒ；８６（Ｐｔ４）：１１８１−８；及び、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，「ｓｉＲＮＡによる、コクサッキーウィルスＢ３複製の阻害は、ウィルスプラス鎖の中央領域における完全な配列一致を必要とする（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ Ｂ３ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｐｅｒｆｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍａｔｃｈ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ）」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５ Ｆｅｂ；７９（４）：２１５１−９）。本発明は、ウィルスシグナル伝達経路を破壊し、ウィルス複製を阻害するために、ウィルス核タンパク配列に向けられたｓｉＲＮＡの使用を示す。更に本発明者等は、別のウィルスタンパク、即ち、核タンパク又は核カプシドタンパクの抑制又は沈黙化も、ポリメラーゼ活性の抑制と同様の作用を及ぼすことを確認した。従って、核タンパク転写体も、ｓｉＲＮＡにとって好適な標的である。

いかなる理論にも縛りつけられることを望むものではないが、ＮＰ ｓｉＲＮＡの広範な作用は、ＮＰ特異的ｓｉＲＮＡがＲＮＡ分解を非特異的に標的するためではなく、ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡの結合及び安定化におけるＮＰの重要性の結果であるようである。例えば、インフルエンザウィルスにおけるＮＰ遺伝子セグメントは、ｖＲＮＡにもｃＲＮＡにも結合することが可能な１本鎖ＲＮＡ結合核タンパクをコードする。ウィルスのライフサイクルの間、ＮＰ ｍＲＮＡは最初に転写され、翻訳される。ＮＰタンパクの主要な機能は、ＲＮＡ転写、複製、及びパッケージングのためにウィルスゲノムをカプシドの中に取り込むことである。ＮＰタンパクが欠如すると、ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡの全長合成は共に大きく阻害される。ＮＰ ｓｉＲＮＡが、ＮＰ ＲＮＡの分解を誘発すると、ＮＰタンパクの合成が損なわれ、そのため十分なＮＰタンパクが不足するので、その後の他のウィルス遺伝子セグメントの複製に影響を及ぼす。このようにして、ＮＰ ｓｉＲＮＡは、極めて早期の段階でウィルス産生を強力に抑制することが可能である。従って、ウィルス核タンパクは多機能性を有するために、ＲＮＡｉ依存性治療法の有用な標的となり、このため、単一遺伝子を抑制することによって、ウィルスのライフサイクルの複数の異なる段階で介入する機会が与えられる。

ゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡ）の複製と違って、感染宿主細胞ではＮＰタンパク分子の数がｍＲＮＡ合成を調節すると仮定されている。従来の研究は、ＮＰタンパクにおける温度感受性突然変異を用いて、ｃＲＮＡ合成は、インビトロでもインビボでも温度感受性であるが、ｍＲＮＡ合成はそうではないことを示した。ＮＰタンパクは、発生期のｃＲＮＡ及びｖＲＮＡ転写体の伸長及び停止抵抗に必要であることが示された。本明細書に提示される結果から、ウィルスＮＰ特異的ｓｉ ＲＮＡは、感染細胞における全てのウィルスＲＮＡの蓄積を抑制することが示される。いかなる理論にも縛りつけられることを望むものではないが、ＮＰ特異的ｓｉ ＲＮＡの存在下では、新たに転写されるＮＰ ｍＲＮＡが分解され、これが、ウィルス感染後のＮＰタンパク合成の阻害をもたらすと考えられる。新たに合成されるＮＰが無いために、新たなウィルス転写及び複製が、従って、新規ビリオンの産生が阻害される。

以下に、本発明の特徴及び、その他の詳細を、付属の図面及び特許請求の範囲に指摘される内容を参照しながら更に具体的に説明する。本明細書に説明される特定の実施例は、例示のためであって、本発明の限定として示されるものではないことを理解しなければならない。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施例に採用することが可能である。別様に指示しない限り、全ての部及びパーセントは重量に基づく。

定義
便宜のために、明細書、実施例、及び付属の特許請求の範囲で使用されるいくつかの用語をここに集める。別様に定義しない限り、本明細書に使用される全ての技術及び科学用語は、本発明の関わる当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。しかしながら、これらの定義が、従来技術で流布する意味から変動する程度に、下記の定義も変動することを承知しなければならない。

「ヌクレオチド」は、窒素系塩基、糖分子、及びリン酸基を具える。「ヌクレオシド」は、糖分子と結合した窒素系塩基（核酸塩基）である。天然の核酸では、リン酸基は、隣接ヌクレオシドに共有的に結合しポリマーを形成する。核酸は、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）、ヌクレオシド類縁体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−イオドウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、介在塩基、修飾糖類（例えば、２′−フルオロリボース、リボース、２′−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含んでもよい。

用語「ＲＮＡ」又は「ＲＮＡ分子」又は「リボ核酸分子」は、リボヌクレオチドから成るポリマーを指す。用語「ＤＮＡ」又は「ＤＮＡ分子」又は「デオキシリボ核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドから成るポリマーを指す。ＤＮＡ及びＲＮＡは、天然に合成されてもよい（例えば、それぞれ、ＤＮＡ又はＲＮＡの、ＤＮＡ複製又は転写によって）。ＲＮＡは、転写後修飾されてもよい。また、ＤＮＡ及びＲＮＡは化学的に合成されてもよい。用語「標的ｍＲＮＡ」又は「標的転写体」は、本明細書で用いられる場合同義語である。

用語「ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）」は、ＲＮＡの選択的細胞内分解（遺伝子沈黙化とも呼ばれる）を指す。また、ＲＮＡｉは、ミクロＲＮＡ、又はミクロＲＮＡのように動作するｓｉＲＮＡによる翻訳抑制も具える。ＲＮＡｉは、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を導入するか、又は、ｓｉＲＮＡを細胞内で産生する（例えば、プラスミド又は導入遺伝子を通じて）ことによって起動し、一又はそれ以上の標的遺伝子の発現を沈黙させることが可能である。それとは別に、ＲＮＡｉは、外来ＲＮＡ（例えば、ウィルスＲＮＡ）を排除するために細胞において自然に発生する。天然のＲＮＡｉは、分解機構を他の認識ＲＮＡ配列へ向ける、前駆体ｄｓＲＮＡのダイサー指令による断片化を介して進行する。

「小型干渉性ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）」、これは、従来技術で「短鎖干渉性ＲＮＡ」とも呼ばれるが、ＲＮＡ干渉を指令又は仲介することが可能な、約１０から６０ヌクレオチド（又はヌクレオチド類縁体）を具えるＲＮＡ（又はＲＮＡ類縁体）を具える。用語「ｓｉＲＮＡ」は、二本鎖ｓｉＲＮＡ及び１本鎖ｓｉＲＮＡの両方を具える。一般に、本明細書で用いる用語「ｓｉＲＮＡ」は、二本鎖ｓｉＲＮＡ（１本鎖ＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡに対し）を指す。「短鎖ヘアピンＲＮＡ」（「ｓｈＲＮＡ」）という用語は、ヘアピン構造に折り畳まれ、少なくとも一つのヌクレオチドから成る１本鎖部分（「ループ」）を具えるｓｉＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡ類縁体）、例えば、ハイブリダイズされる少なくとも二つの相補的部分を具えるＲＮＡ分子、又は、ハイブリダイズして、ＲＮＡｉを仲介するのに十分な長さを有する二本鎖（二重）構造を形成することが可能なＲＮＡ分子、及び、通常約１から１０のヌクレオチド長を持ち、ｓｈＲＮＡの二重部分を形成する領域を接続するループを形成する、少なくとも１本鎖の部分を指す。二重部分は、片方の鎖又は両方の鎖に、一又はそれ以上のミスマッチ、及び／又は、一又はそれ以上の不対ヌクレオチドから成る一又はそれ以上のバルジを含んでもよいが、通常はそのようなミスマッチ及び／又はバルジを含まない。理論に縛られることを望むものではないが、ｓｈＲＮＡは、保存的細胞ＲＮＡｉ機関によって処理されてｓｉＲＮＡに変換されると考えられている。ｓｈＲＮＡは、該ｓｈＲＮＡの一部（ｓｈＲＮＡのアンチセンス鎖、又はガイド鎖とも呼ばれる）に対して相補的な標的転写体の発現を阻害することが可能である。一般に、ｓｈＲＮＡのガイド鎖と標的転写体の間に形成される二重鎖の特徴は、ｓｉＲＮＡのガイド鎖と標的転写体の間に形成される二重鎖のものと近似する。本発明のある実施例では、ｓｈＲＮＡの５′末端はリン酸基を有するが、別の実施例では有さない。本発明のある実施例では、ｓｈＲＮＡの３′末端はヒドロキシル基を有する。

用語「ＲＮＡｉ誘発性実体」又は「ＲＮＡｉ仲介剤」とは、細胞におけるその存在がＲＮＡｉをもたらし、該ＲＮＡｉ仲介剤が標的とするＲＮＡの発現低下をもたらすＲＮＡ分子（ヒトの手によって修飾されない、又は、ヒトの手によってその場所に輸送されたものではない天然の分子とは別の）を指す。ＲＮＡｉ仲介剤は、例えば、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡであってもよい。本発明のある実施例では、ｓｉＲＮＡは、ミクロＲＮＡと呼ばれる内因性の小型ＲＮＡによって利用される翻訳抑制経路を介して標的ＲＮＡの発現を抑制する鎖を含んでもよい。本発明のある実施例では、ｓｈＲＮＡは、このミクロＲＮＡ翻訳抑制経路を通じて標的ＲＮＡの発現を抑制するｓｉＲＮＡを生成するように細胞内で処理されてもよい。「標的ＲＮＡ」は、標的ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡであるかどうかとは無関係に、「標的転写体」と呼んでもよい。「標的ＲＮＡ」と「標的転写体」は、本明細書では相互交換的に使用される。ＲＮＡｉ誘発剤という用語は、細胞におけるその存在がＲＮＡｉをもたらし、該ＲＮＡｉ仲介剤が標的とするＲＮＡの発現低下をもたらすＲＮＡ分子ＲＮＡｉ仲介剤及びベクター（前述のように、ヒトの手によって修飾されない天然分子とは別物の）を具える。

「ＲＮＡｉ誘発性ベクター」は、細胞におけるその存在が、自己ハイブリダイズするか、又は、相互にハイブリダイズし合ってＲＮＡｉ仲介剤を形成するベクターを含む。本発明の様々な実施例では、この用語は、細胞におけるその存在が、自己ハイブリダイズするか、又は、相互にハイブリダイズし合って一又はそれ以上のＲＮＡｉの産生をもたらすプラスミド、例えば、ＤＮＡベクター（その配列が、ウィルス由来の配列要素を具える）、又は、ウィルス（ヒトの手によって修飾されない天然分子とは別物の）を具える。一般に、ベクターは、発現シグナル（単数又は複数）に動作可能的に結合する核酸を含み、そのため、ベクターが細胞内にある時、互いにハイブリダイズするか、又は自己ハイブリダイズしてＲＮＡｉ仲介剤を形成する一又はそれ以上のＲＮＡ分子が転写される。このようにして、ベクターは、ＲＮＡｉ仲介剤の細胞内合成のための鋳型を提供する。ＲＮＡｉを誘発するには、ウィルスゲノムの細胞への進入（例えば、ウィルスエンベロープと細胞膜との融合に続く）は、細胞におけるウィルスの存在を構成するのに十分と考えられる。更に、ＲＮＡｉを誘発するには、ベクターが細胞内に導入されるか、細胞に進入するか、又は、親細胞から受け継がれるかすれば、ベクターがその後細胞内で修飾されるか、又は処理されるのとは無関係に、ベクターは細胞内に存在すると考えられる。ＲＮＡｉ誘発性ベクターは、細胞における該ベクターの存在が、互いにハイブリダイズするか、又は自己ハイブリダイズして、転写体を標的とするＲＮＡｉ仲介剤を形成する一又はそれ以上のＲＮＡの産生をもたらす場合、即ち、細胞における該ベクターの存在が、転写体を標的する一又はそれ以上のＲＮＡｉ介在因子の産生をもたらす場合、該転写体を標的すると見なされる。「誘発」という用語の使用は、ＲＮＡｉ仲介剤が、一般にＲＮＡｉを必ず活性化又は上方調整するということを示すものではなく、単に、細胞におけるベクターの存在は、該細胞においてＲＮＡｉ仲介剤の産生を招き、ｍＲＮＡ発現のＲＮＡｉ介在性低下をもたらすことを示すことを意図するにすぎない。

ＲＮＡｉ誘発性実体は、（１）該仲介剤が、１５から２９ヌクレオチド長、例えば、１５、より好ましくは少なくとも約１７、更により好ましくは少なくとも約１８又は１９から約２１から２３、又は２４から２９ヌクレオチド長の評価ウィンドウを上回る標的転写体に対して実質的に相補的な鎖を具える場合、本明細書に記載される目的のためには、標的転写体を標的とすると見なされる。例えば、本発明の種々の実施例では、仲介剤は、１５から２９ヌクレオチド長の評価ウィンドウ、例えば、少なくとも１５、より好ましくは少なくとも約１７、更により好ましくは少なくとも約１８又は１９から約２１から２３、又は２４から２９ヌクレオチド長の評価ウィンドウを上回る標的転写体に対して、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、８４％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％厳密な配列相補性を有する鎖を具える。或いは、（２）ＲＮＡｉ仲介剤の一側鎖は、小型（＜５０ヌクレオチド）ＲＮＡ分子のインビトロハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件において、及び／又は、哺乳類細胞の細胞原形質又は核の中に典型的に見出される条件下において、標的転写体にハイブリダイズする。更に、ミクロＲＮＡ翻訳抑制経路を介して作用する仲介剤の場合、仲介剤と標的によって形成される二重鎖は、少なくとも１個のバルジ及び／又はミスマッチを具える。本発明のある実施例では、ガイド鎖と標的転写体によって形成される二重鎖におけるＧＵ又はＵＧペアは、ＲＮＡｉが転写体を標的とするかどうかを決める目的のためには、ミスマッチとは見なされない。

細胞におけるその存在が、転写体を標的とするＲＮＡｉの産生をもたらすＲＮＡｉ誘発性ベクターも、該転写体を標的とすると見なされる。転写体を標的する作用は、該転写体の合成を指令する遺伝子の発現を低下又は抑制することであるから、転写体を標的するＲＮＡｉも、該転写体の合成を指令する遺伝子を標的すると見なされる。最も、遺伝子そのもの（例えば、細胞の場合はゲノムＤＮＡ）は、仲介剤、又は細胞の沈黙化機関の成分と相互作用を持たないと考えられる。従って、転写体を標的とするＲＮＡｉ又はベクターは、該転写体の合成の鋳型を提供する遺伝子を標的とすると理解される。

ウィルスの「核タンパク」（「カプシドタンパク」又は「核カプシドタンパク」とも呼ばれる）は、ウィルスＲＮＡを隔離し、且つ、ウィルス転写に影響を及ぼすウィルスポリペプチドである。ウィルスの核タンパクは、核酸／タンパク複合体（即ち、リボ核酸タンパク（ＲＮＰ）複合体）を形成することが可能である。核タンパクはまた、二本鎖ウィルスでは“ＮＳ”とも呼ばれる（例えば、ＮＳ−６）。核タンパクは、一般に、ウィルスゲノムとは接触せず、隔離もしない外方のカプシドタンパクとは区別される。「核タンパクｍＲＮＡ」、「ＮＰ ｍＲＮＡ」「核タンパク転写体」、及び「ＮＰ転写体」は、本明細書に記載されるウィルス核タンパク又はその機能的等価物をコードする任意のｍＲＮＡを含むと理解される。

当業者であれば了解されるように、ウィルス核タンパクの一又はそれ以上の機能を果たすタンパクは、対象となる特定のウィルスに依存していくつかの別々の名称で呼ばれる。例えば、インフルエンザのようなある種のウィルスの場合、該タンパクは核タンパク（ＮＰ）という名で知られ、他のいくつかの１本鎖ＲＮＡウィルスの場合、同様の役割を果たすタンパクは、核カプシド（ＮＣ、又はＮ）タンパクと呼ばれる。更に別のウィルスでは、ゲノム核酸と相互作用を持ち、且つ、ウィルス粒子において構造的役割を果たす類似のタンパクは、カプシド（Ｃ）タンパクと見なされる。

本明細書で用いる用語「核タンパクｍＲＮＡ」、“ＮＰ ｍＲＮＡ，”「核タンパク転写体」、及び「ＮＰ転写体」は、本明細書に記載される、ウィルス核タンパク、又はその機能的等価物をコードする任意のｍＲＮＡを具えると理解される。核タンパク遺伝子を具える任意のウィルス、又はその機能的等価物は、ｓｉＲＮＡ標的として好適である。非限定的例として、いくつかの群の標的ウィルスを更に詳細に本明細書で説明する。

「被験体」は、生きている生物、例えば、ヒト類、サル類、雌ウシ類、ヒツジ類、ウマ類、ブタ類、雄ウシ類、ヤギ類、イヌ類、ネコ類、マウス類、ラット類、それらから得た培養細胞類、及びそれらから得たトランスジェニック生物種を具える。ある好ましい実施例では、被験体はヒトである。被験体は、患者と同義語である。治療される被験体に対する本発明の組成物の投与は、被験体の病態を治療するのに有効な、既知の手順、用量、及び期間に渡って実行することが可能である。治療効果を実現するのに必要な治療化合物の有効量は、年齢、性別、及び被験体の体重、被験体における外来因子を治療する治療化合物の能力のような要因に応じて変動してよい。投与スケジュールは、最適治療反応が実現されるように調整されてもよい。例えば、いくつかに分割された用量が、毎日投与されてもよいし、或いは、治療状況の緊急性の表示と比例して減少させてもよい。

本明細書で、数字と関連して用いられる「ほぼ」又は「約」という用語は、別様に言及しない限り、又は文脈から明らかに別様と判断されない限り、一般に、どちらの方向にも５％の範囲内に納まる数字を含むものとされる（ただし、その数字が、可能な数値の１００%を超える場合を除く）。範囲が言及される場合は、別様に支持しないかぎり、又は文脈から明らかに別様と判断されない限り、末端点は該範囲に含まれる。

用語「相補的」とは、本明細書において、従来技術で許容される意味と一致して、特定の塩基同士、ヌクレオシド同士、ヌクレオチド同士、又は核酸同士の間の厳密な対合を満たす能力を指す。例えば、アデニン（Ａ）とウリジン（Ｕ）は相補的であり；アデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ）は相補的であり；且つ、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）は相補的であり、これらは、従来技術では、ワトソン−クリック塩基対合と呼ばれる。第１核酸配列のある位置におけるヌクレオシドが、第２核酸配列の対向位置のヌクレオシドに対して相補的である場合、これらのヌクレオシド同士は、相補的塩基対を形成し、両核酸は、前記位置において相補的である。当業者であれば、核酸は、互い違いの平行状態に整列されること（即ち、一方の核酸は５′−３′方向に、一方、他方は、３′−５′方向に整列）を了解するであろう。二つの核酸、又はその部分の相補性の程度は、その二つの核酸又はその部分を、最大の相補性を実現するよう互い違い平行に整列させた場合に、両鎖における、相補的塩基対を形成するヌクレオチドの全数を、評価ウィンドウにおけるヌクレオチドの全数のパーセントとして決定することによって評価される。例えば、ＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号１１４２４）及びＴＴＴＧＴＴＡＴ（配列番号１１４２５）は、７５％相補的である。なぜなら、合計１６の内、相補的塩基対に納まるのは１２ヌクレオチドだからである。評価ウィンドウにおいて少なくとも７０％相補的である核酸は、そのウィンドウの上では実質的に相補的と見なされる。具体的には、評価ウィンドウが１５−１６ヌクレオチド長ならば、実質的に相補的な核酸は、ウィンドウ内において０から３個のミスマッチを持ってもよく、ウィンドウが１７ヌクレオチド長ならば、実質的に相補的な核酸は、ウィンドウ内に０から４個のミスマッチを持ってもよく、ウィンドウが１８ヌクレオチド長ならば、実質的に相補的な核酸は、ウィンドウ内に０から５個のミスマッチを持ってもよく、ウィンドウが１９ヌクレオチド長ならば、実質的に相補的な核酸は、ウィンドウ内に０から６個のミスマッチを持ってもよい。ある実施例では、ミスマッチは、連続位置にはない。ある実施例では、ウィンドウは、２ヌクレオチド長よりも長い連続ミスマッチを含まない。好ましい実施例では、１５から１９ヌクレオチドから成る評価ウィンドウは、０から１のミスマッチを含み（好ましくは０）、２０から２９ヌクレオチドの評価ウィンドウは、０から２のミスマッチを具える（好ましくは０から１、より好ましくは０）。

「実質的に純粋な」とは、元々それに随伴する成分から分離された化合物、例えば、薬剤、タンパク、又はポリペプチドを含む。通常、化合物は、サンプル中の全体物質の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは９９％（容量で、湿潤又は乾燥重量で、又はモル％又はモル分数で）が、対象とする化合物である場合、該化合物は実質的に純粋である。純度は、任意の適切な方法で測定してよい。例えば、ペプチドの場合は、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、又はＨＰＬＣ分析である。化合物、例えば、タンパクも、それが、天然状態で随伴する成分を実質的に含まない場合、又は、天然状態でそれに随伴する生得の汚染物質から分離されている場合、実質的に純化されている。「実質的に純粋」という用語の意味の中に含まれるものは、均一に純粋な化合物、例えば、タンパク又はポリペプチドであって、サンプル中の全体タンパクの少なくとも９５％（容量で、湿潤又は乾燥重量で、又はモル％又はモル分数で）が、対象のタンパク又はペプチドである。

「投与」は、本発明の組成物が、その意図された機能、例えば、ウィルス疾患の治療又は予防を実行可能とする投与ルートを含む。様々な投与ルートが可能であり、そのようなものとして、例えば、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注入）、経口（例えば、食事様）、吸入（例えば、肺へのエアロゾル）、局所、鼻腔、直腸、又は、治療される疾患又は状態に応じて徐放性微小担体が挙げられるが、しかし必ずしもこれらに限られるわけではない。吸入及び非経口投与が、好ましい投与方式である。投与される化合物の処方は、選択された投与ルートに応じて変動する（例えば、溶液、乳液、ゲル、エアロゾル、カプセル）。投与される化合物を具える適切な組成物は、生理学的に許容可能なビヒクル又は担体、及び、最適なアジュバント及び防腐剤において調製される。溶液又は乳剤の場合、好適な担体としては、例えば、水性、又はアルコール／水性液、乳剤又は縣濁液が挙げられ、例えば、生食液及び緩衝媒体、滅菌水、クリーム、軟膏、オイル、ペースト、及び固相担体が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸添加リンゲル液、又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、各種添加剤、防腐剤、又は液、栄養又は電解質補充剤が挙げられる（一般に、Ｒｅｍｉｎｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ，Ｅｄ．（１９８０）参照）。

「有効量」とは、本発明の組成物について、それが、その意図された機能、例えば、ウィルス感染を、本明細書に記載されるやり方で、部分的に、又は完全に治療又は予防することを可能とする該組成物の量を含む。この有効量は、いくつかの要因、例えば、生物学的活性、年齢、体重、性別、一般的健康状態、治療される病体の重度を始め、適切な製薬学的性質に依存する。例えば、活性物質の投与は、体重当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日であってもよい。例えば、ｓｉＲＮＡは、該物質を必要とする被験体に、体重当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で送達される。活性物質の治療的有効量は、単回投与又は複数回投与として適切なルートを通じて投与される。更に、活性成分の用量は、治療又は予防状況の緊急性の表示と比例して増やしても、減らしてもよい。

「製薬学的に許容可能な担体」とは、化合物の活性と適合し、被験体にとって生理学的に許容可能な、任意の、全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤を具える。製薬学的に許容可能な担体の例は、正常なバッファー生食液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）である。製薬学的活性物質のためにこのような媒体及び薬剤を用いることは従来技術でよく知られる。通常用いられる、何かの媒体又は薬剤が、治療的化合物と不適合であるということでない限り、薬剤投与のために好適な組成物においてそのような媒体又は薬剤を使用することは考慮の対象になる。補充的活性化合物も組成物の中に組み込むことが可能である。

「添加成分」は、下記の内の一又はそれ以上を具えるが、ただしそれらに限定されない。即ち、賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；顆粒化剤及び崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味剤；芳香剤；着色剤；防腐剤；生理的に分解可能な組成物、例えば、ゼラチン；水性ビヒクル及び溶媒；油状ビヒクル及び溶媒；懸濁剤；分散又は湿潤剤；乳化剤；粘滑剤；緩衝液；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；及び製薬学的に許容可能なポリマー又は疎水性材料である。本発明の製薬組成物の中に含めてもよい、他の「添加成分」は従来技術で既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載される。

「保存部位」
ウィルスの保存部位とは、ある任意の領域について、既知の全ての配列の約７０％を超えるものの中に存在することが認められる部位又は配列である。保存部位に対して配列同一性を有するｓｉＲＮＡの組は、既知のウィルス配列のそれぞれについて、その１９マー配列断片を得て、各配列断片が、ウィルス配列セットのそれぞれの内部において正確なマッチとして存在する、各配列断片の頻度を評価することによって求められる。第１ウィルス配列は、位置１から位置１９まで延びる１９マー配列断片を含み、もう一つは位置２から２０まで、もう一つは位置３から２１まで、こうして、１９ヌクレオチド部位が、その鎖の末端となるまで続ける。

同様にして、第２、第３、及び第４ウィルス配列が、リストの中の最後のウィルス配列に至るまで途切れることなく抽出される。次に、配列断片が、漸増する配列断片表に加えられていき、各１９マー断片を含むウィルス配列数のカウントが記録される。断片頻度は、各特異的１９マー断片を含むウィルス配列のパーセントとして表される。本発明のｓｉＲＮＡのセットは、既知配列の大多数よりも大きな、好ましくは既知配列の約７０％を超える配列同一性を有するものである。

「インフルエンザウィルスの保存部位」は、２００３年９月２９日に出願された米国特許出願第１０／６７４，１５９号、公開番号ＵＳ−２００４−０２４２５１８−Ａ１（Ｊ．Ｃｈｅｎ．Ｑ．Ｇｅ ａｎｄ Ｍ．Ｅｉｓｅｎ，「インフルエンザ治療法（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」に開示され、下記の表＿にも明記される（配列番号第６９から１０８）配列を含まない。インフルエンザウィルスの保存部位は、２００５年８月８日に出願された係属中の米国特許出願第１１／１０２０９７号（前述の出願の一部継続出願）のいくつかの実施例を排除する可能性がある。なお、この出願の全体を参照することにより本出願に含める。

「保存部位の変種」は、標的ＲＮＡと、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンスガイド配列との間で容認される、少数のミスマッチを具える。従って、ウィルスにおいて高度に保存される部位を標的とする単一ｓｉＲＮＡ二重鎖は、該保存部位に対しただ一つ、又は少数のミスマッチを有する、僅かに変異する変種に対しては多くの場合活性を有する。我々は、下記の実施例１５にも述べるように、アルゴリスムにウィルスミスマッチ・データを用い、任意のｓｉＲＮＡ二重鎖によって標的とすることが可能な、インフルエンザＡウィルスの可能な配列変種のリストを拡大した。

ＲＮＡｉ標的としての核タンパク
本発明は、被験体、例えば、ヒト、又は非ヒト哺乳動物においてウィルス複製又は感染を治療又は予防するためにＲＮＡｉを用いる組成物及び方法を提供する。ウィルスはＲＮＡウィルスであることが好ましい。例えば、ＲＮＡウィルスは、マイナス鎖ウィルスである。それとは別に、ウィルスは、プラス鎖ウィルス、又は二本鎖（ｄｓ）ウィルスであってもよい。好ましい標的ＲＮＡは、核タンパク（また核カプシドとも呼ばれる）転写体、又は、ウィルス核タンパクの機能を実現するウィルス遺伝子の転写体である。核タンパク遺伝子、又は、その機能的等価物を具えるウィルスであれば、いずれのウィルスであってもｓｉＲＮＡの標的として好適である。非限定的例として、いくつかの標的ウィルスの群を、本明細書に更に詳細に述べる。

マイナス鎖ＲＮＡウィルス
マイナス鎖ＲＮＡウィルスは、ｍＲＮＡに対し相補的センスに配列されるウィルスゲノムを有する。従って、宿主細胞へ進入後の、マイナス鎖ＲＮＡウィルスの最初の活動の一つは、ウィルスｍＲＮＡの転写及び産生である。このために、ビリオンは、ウィルスの核タンパク（Ｎ又はＮＰ、時に核カプシドタンパクとも呼ばれる）と緊密に連結するウィルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）から成るＮ−ＲＮＡ構造を保持する。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、インフルエンザウィルスの場合のように、直接Ｎ−ＲＮＡに結合するか、或いは、パラミクソウィルス及びラブドウィルスのリンタンパクのように、補因子の助けを借りて結合するかのいずれかである。裸のｖＲＮＡではなく、生得のＮ−ＲＮＡが転写の実際の鋳型となり、核タンパクは、ポリメラーゼによる効率的な読み取りのために、Ｎ−ＲＮＡのヌクレオチド塩基の露出を担当する。

ｓｓＲＮＡ（−）ウィルスの発現及び複製に見られる共通性は、恐らくビリオン核タンパク（Ｎ又はＮＰ）サブユニット同士の結合によって誘発される、ＲｄＲｐの明瞭な転写及び複製機能である。従って、ＲＮＡ（−）もＲＮＡ（＋）も、複製複合体においてＮタンパクと複合体を形成することが認められる。

本発明において有用なマイナス鎖ＲＮＡウィルスとしては、ヒト呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）、ヒトメタニューモウィルス（ｈＭＰＶ）、おたふく風邪ウィルス、麻疹ウィルス、ヘンドラウィルス、ニューカッスル病ウィルス、インフルエンザウィルス、水泡性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）、デルタ肝炎ウィルス、マールブルグウィルス、エボラウィルス、ハンターンウィルス、シンノンブレウィルス、ラッサ熱ウィルス、ラクロスウィルス（Ｌａｃｒｏｓｓｅ ｖｉｒｕｓ）、リフトバレー熱ウィルス、ブニヤムウェラウイルス、サシチョウバエ熱シシリアウィルス、サビアウィルス、グアナリトウィルス、マチュポウィルス、フニンウィルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス（ＬＣＭＶ）、及びパラインフルエンザウィルスが挙げられる。他の好適なマイナス鎖ＲＮＡウィルスも当業者には既知である。例示のウィルス核タンパク核酸配列の、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号として、Ｕ４１０７１、ＮＣ＿００５０７７、Ｋ０３３６２、ＮＣ＿００２０４５、ＮＣ＿００３４４３、ＮＣ＿００１７８１、ＡＹ２９７７４８、ＡＦ３８９１１９、ＡＹ７０５３７３、ＡＹ３５４４５８、ＮＣ＿００１６０８、ＡＢ０２７５２３、及びＬ３７９０４が挙げられる。

インフルエンザ
インフルエンザウィルスは、オルトミクソウイルス科のエンベロープに包まれたマイナス鎖ＲＮＡウィルスである。このウィルスは、インフルエンザウィルスＡ、Ｂ、及びＣに分類されるが、この内、インフルエンザウィルスＡが最も病原性が高く、動物株毎に再集合を起こすことが可能な唯一のタイプと考えられている。不活性化ウィルスに基づく現在のワクチンは、６５歳未満の健康な個人の約７０から８０％において病気を予防することが可能である。しかしながら、このパーセントは、高齢者又は免疫不全者でははるかに低くなる。更に、ワクチン投与に関連する出費及び副作用の可能性のため、この対処法は最善のものではなくなっている。現在、インフルエンザの治療及び／又は予防のために、アメリカ合衆国では４種類の抗ウィルス剤が承認されている。即ち、アマンタジン、リマナジン、ザナミビル、及びオセルタミビルであるが、それらの使用は、副作用、適応性、及び耐性株出現の可能性によって制限される。従って、インフルエンザ感染の治療及び予防のための効果的治療の開発は依然として求められている。

インフルエンザ核カプシドタンパク又は核タンパク（ＮＰ）は、ＲＮＡセグメントと相互作用をもってＲＮＰを形成する主要な構造タンパクである。これは、インフルエンザＡウィルスのＲＮＡセグメント５によってコードされ、１５６５ヌクレオチド長を有する。ＮＰは４９８個のアミノ酸を具える。ＮＰタンパクは、ウィルス複製にとって必須である。感染細胞におけるＮＰタンパク分子の数は、ゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡ）複製に対するｍＲＮＡ合成レベルを調節すると考えられている（１）。従来の研究は、ＮＰタンパクにおける温度感受性突然変異を用いて、ｍＲＮＡではなく、ｃＲＮＡ合成が、インビトロでもインビボでも温度感受性であることを示した（２８，２９）。ＮＰタンパクはまた、発生期のｃＲＮＡ及びｖＲＮＡ転写体の伸長及び抗停止にも必要であることが示された（２９，３０）。本発明者らは、ＮＰ−特異的ｓｉＲＮＡが、感染細胞における全てのウィルスＲＮＡの蓄積を抑制することを見出した。恐らく、ＮＰ−特異的ｓｉＲＮＡの存在下では、新たに転写されるＮＰ ｍＲＮＡが分解され、そのためＮＰタンパク合成の抑制がもたらされると考えられる。新たに合成されるＮＰが無い場合、新規ビリオン産生の場合と同様、それ以上のウィルス転写及び複製は阻止される。

パラインフルエンザウィルス
パラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ）はエンベロープで被われ、非セグメント状のマイナス鎖ＲＮＡゲノムを有し、モノネガウィルス目パラミクソウィルス科に属する。パラインフルエンザウィルスは、パラミクソウィルス亜科の３種の属の内の二つを具える。即ち、レスピロウィルス（ｈＰＩＶ１及びｈＰＩＶ３）、及びルブラウィルス（ｈＰＩＶ２及びｈＰＩＶ４）である。ＰＩＶは、幼児及び児童における下気道疾患の一般的原因としてＲＳＶに次ぐ。ＰＩＶは、生涯に渡って、通常、上気道疾患（例えば、風邪、及び／又は咽喉炎）として現れる感染を繰り返し引き起こす可能性がある。ＰＩＶはまた、下気道疾患（例えば、肺炎、気管支炎、及び細気管支炎）を、特に高齢者、及び免疫系を冒された患者の間に引き起こす可能性がある。クループに対しては対症療法のみが用いられるだけである。利用可能な、特異的抗ウィルス治療は無い。核カプシド（ＮＰ）タンパクは、５０９から５５７アミノ酸長を持ち、アミノ酸配列は比較的よく保存される。ＮＰは、ゲノム及びアンチゲノムＲＮＡをカプシドの中に包み、各ＮＰモノマーは６個のヌクレオチドと連結する。ＲＮＡ複製は、ＮＰによる、発生期ＲＮＡの合成的カプシド被覆に依存する。ＮＰ分子のＮ−末端７５％は、比較的十分に保存される部分である。この部分は、Ｐとの可溶性複合体の形成のみならず、その後他のＮＰモノマー、及びＲＮＡと連結して核カプシドの形成にも関与する。

呼吸器合胞体ウィルス
呼吸器多核体ウィルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウィルス科ニューモウィルス属に属する、マイナスセンスの、エンベロープに被われるＲＮＡウィルスである。ＲＳＶは、生まれて最初の２ヵ年以内にほとんど全ての児童の上及び下気道に感染するが、同時に、高齢者の罹患率及び死亡率の有力原因でもある。ＲＳＶ細気管支炎に罹患した幼児は、その後の人生で喘鳴及び喘息を発症する確率が高くなる。この病気は、ＵＲＴ症状で始まり、１−２日で急速に進行し瀰漫性小気道病に至る。ＲＳＶはまた、生涯に渡って繰り返し感染を引き起こし、それは通常、中等から重度の風邪様症状を伴う。一方、重度の下気道疾患がいずれの年齢でも起こる場合があるが、特に、高齢者、又は、心臓、肺、又は免疫系が冒された人々には起こりやすい。

ＲＳＶに対する効果的治療及びワクチンの実現に関し研究が、ほぼ４０年間続けられているがほとんど成功していない。最近では、ＲＳＶに対しワクチンは臨床的には認められていない。核カプシド（Ｎ）タンパクは、ＲＮＡゲノムのカプシド被覆に与る主要構造タンパクであり、ゲノムの複製及び転写に必須である。該タンパクは、１１７６ヌクレオチド長である。

ヒトメタニューモウィルス
ヒトメタニューモウィルス（ｈＭＰＶ）は、パラミクソウィルス科の一員である。このウィルスは、マイナスセンスＲＮＡウィルスで、二つの遺伝型（Ａ及びＢ）に分類され、ニューモウィルス亜科のメタニューモウィルス属に割り当てられる。このウィルスは、幼い児童、老齢患者、及び免疫不全宿主における急性気道感染症の原因となる。このウィルス感染に伴う臨床症候群は、中等から重度の呼吸器障害及び急性喘鳴を始め、細気管支炎及び肺炎を具える。核カプシド（Ｎ）遺伝子は１２０６ヌクレオチド長を持ち、ＲＳＶのＮとほぼ同じ活性を有する。

プラス鎖ＲＮＡウィルス
プラス鎖ＲＮＡウィルスは、全体的に、又は部分的に翻訳可能なゲノムを持ち、そのため、通常、裸のＲＮＡと同じぐらい感染性が高い。これらのウィルスは、ウィルスゲノムの発現を調節するために、キャップ独立性の翻訳開始、ポリタンパク処理、及びＲＮＡ複製の諸機構を利用する。

いくつかのウィルスが、ヒト及び動物において病気を引き起こす。ポリオウィルスは、過去において世界中で重度のポリオを誘発し、この病気を根絶しようと努める発展途上国に対し財政的負担をもたらした。ヒトのライノウィルスは、効果的な治療又は予防のない、最も蔓延するウィルス疾患の一つである鼻風邪をもたらす。口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）、即ち、アフトウィルスは、最近、羊及び牛に大流行をもたらし、ヨーロッパの農業に重大な財政危機を引き起こした。コクサッキーウィルスは、口蹄疫症候群、心筋症、及び、眼球結膜炎のような疾患の原因となる（主に、幼い児童）。肝炎ウィルスであるＡ型肝炎ウィルスは、肝臓病の主要原因であることが知られる。

本発明に有用なプラス鎖ＲＮＡウィルスとしては、ヒトアストロウィルス、ノーウォーク様ウィルス、コロナウィルス、Ａ、Ｃ、及びＥ型肝炎ウィルス、黄熱病ウィルス、ポリオウィルス、ライノウィルス、脳心筋炎ウィルス、ヒトパレコウィルス（Ｈｕｍａｎ ｐａｒｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ−１、デングウィルス、西ナイルウィルス、口蹄疫ウィルス、風疹ウィルス、及び黄色熱ウィルスが挙げられる。他の、好適なプラス鎖ＲＮＡウィルスは、当業者には既知である。例示のプラス鎖ウィルスウィルス核タンパク核酸配列の、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号として、ＡＹ３９１７７７、ＡＪ３１３０３０、ＮＣ＿００１４７４、ＡＹ６６０００２、Ｄ８３６４５（カプシド）、Ｘ０３７００（カプシド）、及びＬ２４９１７（カプシド）が挙げられる。

ヒトコロナウィルス
コロナウィルス科の一員であるヒトコロナウィルス（ＨＣｏＶｓ）は、鼻風邪の最大３分の１の原因となる、環境に普遍的に広がるウィルスである。このウィルスは、エンベロープに包まれるウィルスで、最大３１ｋｂのプラス鎖ＲＮＡを有する。このサイズは、全てのＲＮＡウィルスの内で知られる最大のゲノムを表す。ヒトコロナウィルスは、全鼻風邪の１０から３０％の原因となる。全ての年齢群が冒され、感染率は、全ての年齢群において均等であることが示されている。感染は、治療を要するほどではなく、きわめて穏やかである。幼い児童及び老人では、比較的重度の下気道感染が報告されている。類似の、また、異なるウィルス株による再感染は一般的である。一つのコロナウィルス群に対する抗体は、別の群のウィルスによる感染、又は、同じ群であっても、４ヶ月後の感染に対しては防御しない。

西ナイルウィルス
フラビウィルス科の一員である西ナイルウィルス（ＷＮＶ）は、最近、アメリカ合衆国全体に蔓延し、その感染は、２００３年に、９０００を超える症例、及び２００の死亡例をもたらした。このウィルスは、米国では、ウィルス性脳炎の最も一般的な原因となっている。西ナイルウィルスの脳炎は、人獣共通伝染病である。このウィスルのライフサイクルは、宿主として鳥類、媒介動物として蚊を具える。ヒトは偶発的宿主となるが、ウィルス血症は低度で、一過性であるため、ウィルスのライフサイクルを支えるには十分ではない。しかしながら、血液、臓器移植、及び哺乳によるヒトからヒトへの伝染が報告されている。最近の流行における重度の神経学的疾患の頻度は、従来西ナイル熱と関連されるものよりももっと神経毒性の高いウィルス株の存在を示唆する。神経学的症状がいくつか記述されているが、最も特徴的な症状は、脱力をともなう脳炎である。これまで、治療的介入は、西ナイルウィルスの治療において一貫した臨床効力を全く示してこなかった。

ライノウィルス
ヒトライノウィルスは、鼻風邪、及び、関連する上気道合併症の主要原因因子である。このウィルスは、百を超える血清型を有するので、以前ライノウィルスに暴露したことがあってもそれはほとんど免疫学的保護とはならず、そのため感染率は高くなる（Ｈａｙｄｅｎ ＦＧ．「ライノウィルス及び下気道（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｗｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ）」，Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ．２００４；１４（１）：１７−３１）。しかしながら、感染は、喘息患者、高齢者、及び免疫不全患者では、短期の、自己限定性疾患を引き起こす。このウィルスは、ピコルナウィルス科に属するエンベロープを被らない、プラス鎖ＲＮＡウィルスであり、約７２００ヌクレオチドのゲノムを有する。このウィルスのゲノムは、宿主の細胞原形質中に放出されると、直接ｍＲＮＡとして機能する（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ＫＬ，Ｌｅｍｏｎ ＳＭ．「ライノウィルスタイプ１４ゲノムは、ウィルス複製に必要なＲＮＡ構造を内部に具える（Ｔｈｅ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １４ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ ｌｏｃａｔｅｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｈａｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」，ＲＮＡ；４：１５６９−８４）。

ライノウィルスは、エアロゾル又は直接接触によって伝染する。接種の主要部位は鼻腔粘膜である。ただし、結膜も、程度は低いものの関与する（Ｔａｎ ＷＣ．「喘息悪化におけるウィルス（Ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ａｓｔｈｍａ ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎｓ）」，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｕｌｍ Ｍｅｄ．２００５；１１：２１−６）。ウィルスは呼吸器上皮に付着し、局所に広がる。このウィルスに対するヒトの主要な受容体は、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）である（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ Ｍ．「呼吸器感染と喘息：現代の治療戦略（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｓｔｈｍａ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ．２００４；９：８３１−７）。いくつかのＲＶ血清型も、ヒトの上皮細胞におけるＩＣＡＭ−１発現を上方調整し、感染感受性を高める（Ｐａｐｉ Ａ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ ＮＧ，Ｓｔａｎｃｉｕ ＬＡ，Ｄｅｇｉｔｚ Ｋ， Ｈｏｌｇａｔｅ ＳＴ，Ｊｏｈｓｔｏｎ ＳＬ．「呼吸器上皮細胞におけるライノウィルス誘発性細胞間接着分子１の上方調整及びプロモータ活性化に及ぼす、デスロラタジン及びロラタジンの作用（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｅｓｌｏｒａｔａｄｉｎｅ ａｎｄ ｌｏｒａｔａｄｉｎｅ ｏｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１０８：２２１−８）。このウィルスは、鼻腔通路及び上方の気管・気管支樹状部では頻繁に複製するが、下気道では比較的稀である。ウィルス血症はめったにないが、ウィルスは大量に放出される。ウィルス放出は二、三日起こり、その後、風邪症状が患者によって認められ、病気の２から７日目にピークに達し、３から４週間も長く続くことがある。

上気道のライノウィルス感染は、喘息の悪化と関連しており、研究から、これは、アレルゲン暴露又は大気汚染との、加重的又は協働的相互作用によって引き起こされることが示唆されている（Ｔａｎ、上記）。ライノウィルスに対する抗ウィルス免疫不全は、ウィルス排除不全をもたらし、従って症状が長引くことになる。Ｔｈ−２サイトカインは、ヒトライノウィルス受容体の上方調整に重要な役割を演じていることが知られるが、ライノウィルス感染後における喘息患者の病気悪化の原因となっている可能性がある（Ｂｉａｎｃｏ Ａ，Ｓｅｔｈｉ ＳＫ，Ａｌｌｅｎ ＪＴ，Ｋｎｉｇｈｔ ＲＡ，Ｓｐｉｔｅｒｉ ＭＡ．「Ｔｈ２サイトカインは、主要群のヒトライノウィルス受容体、ＩＣＡＭ−１の上皮細胞発現に優勢な影響を及ぼす（Ｔｈ２ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｅｘｅｒｔ ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｇｏｕｐ ｈｕｍａｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩＣＡＭ−１）」．Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ．１９９８；１２：６１９−２６）。

デングウィルス
デングは、世界中の熱帯・亜熱帯地域を襲うウィルス風土病である。デング熱（ＤＦ）、及び、デング熱のより重度の病態、デング出血熱（ＤＨＦ）及びデングショック症候群（ＤＳＳ）は公衆衛生上の大問題であり、近年急激に増大している。この病気は、アフリカ、アメリカ、東地中海、東南アジア、及び西太平洋における百を超える国々における風土病であって、２５０億を超える人々を脅かしている（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．１９９８「デング及びデング出血熱（Ｄｅｎｇｕｅ ａｎｄ ｄｅｎｇｕｅ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ）」，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１１：４８０−４９６）。世界保健機構は、毎年、５千万から１億のデングウィルス感染症例があり、これは、毎年、２５万から５０万のＤＨＦ例をもたらし、２万４千人の死亡を招くと推定している（Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｒ．Ｖ．，ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｖａｕｇｈｎ．２００２．「デング：拡大する問題（Ｄｅｎｇｕｅ： ａｎ ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｂｌｅｍ）」，ＢＭＪ ３２４：１５６３−１５６５；Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．１９９７．「デング出血熱：診断、治療、予防、及び駆除（Ｄｅｎｇｕｅ ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ）」，２ｎｄ ｅｄ．Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。

デングウィルスは、蚊によって媒介されるフラビウィルスであり、世界の熱帯及び亜熱帯地域において最も蔓延するアルボウィルスである（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．１９９７．「デング及びデング出血熱：その歴史及び、全世界規模の公衆衛生問題としての再流行（Ｄｅｎｇｕｅ ａｎｄ ｄｅｎｇｕｅ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ：ｉｔｓ ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｒｅｓｕｒｇｅｎｃｅ ａｓ ａ ｇｌｏｂａｌ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ ｐｒｏｂｌｅｍ）」，ｐ．１−２２．Ｉｎ Ｄ．Ｊ．Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｇ．Ｋｕｎｏ（ｅｄ．），Ｄｅｎｇｕｅ ａｎｄ ｄｅｎｇｕｅ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ．ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）。デングウィルスは、プラス鎖、カプセル封入型ＲＮＡウィルスである。ゲノムＲＮＡは、約１１ｋｂ長であり、核カプシド即ちコアタンパク（Ｃ）、膜関連タンパク（Ｍ）、エンベロープタンパク（Ｅ）をコードする三つの構造タンパク遺伝子、及び、七つの非構造的（ＮＳ）タンパク遺伝子から構成される。タンパクは、約３，０００個のアミノ酸から成るポリタンパクとして合成され、これが、翻訳中及び翻訳後に、ウィルス及び宿主のプロテアーゼによって処理される（Ｄｅｕｂｅｌ，Ｖ．，Ｒ．Ｍ．Ｋｉｎｎｅｙ，ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｔｒｅｎｔ．１９８８．「デング２型ウィルス、ジャマイカ遺伝子型の非構造的タンパクのヌクレオチド配列、及び誘導されたアミノ酸配列：全長ゲノムの比較分析（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ２ ｖｉｒｕｓ，Ｊａｍａｉｃａ ｇｅｎｏｔｙｐｅ：ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｇｅｎｏｍｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６５：２３４−２４４）」）。４種の異なる血清型、血清型１から４がある。一つの血清型による感染は、他の血清型に対する保護を与えない。むしろ、一般に、デングウィルスの各種血清型による二次感染、或いは二次又は複数感染による感染は、抗体依存性強化のためＤＨＦ−ＤＳＳの主要危険因子となっている（Ｈａｌｓｔｅａｄ，Ｓ．Ｂ．１９８８．「デングの病原性：分子生物学への挑戦（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４７６−４８１）。現在、このウィルスに対しては有効なワクチンがある。

このウィルスは、不顕感染、感冒様の、穏やかで目立たぬ発熱、及び古典的ＤＦから、比較的重度のＤＨＦ−ＤＳＳに至るまで、広範な病気を引き起こす。そのため、罹患率及び死亡率は高い（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．１９９８「デング及びデング出血熱（Ｄｅｎｇｕｅ ａｎｄ ｄｅｎｇｕｅ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ）」，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１１：４８０−４９６）。

二本鎖ＲＮＡウィルス
ｄｓＲＮＡウィルスは多元発生起源である。レオウィルスは、ｄｓＲＮＡウィルスの内で最もよく調べられているものの一つである。この科の代表的なものは、植物、動物、及び昆虫に感染し、昆虫媒介物のみならず、交互に、動物又は植物の宿主にも感染するようである。ウィルスは全て二重、又は三重のカプシド構造を持ち、該カプシド構造の最外層は、細胞内進入の際に脱ぎ捨てられる。細胞原形質中の裸のコア粒子は、該粒子が合成され、翻訳される間に、細胞原形質へ導かれたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）活性を介して、キャップ被覆、非アデニル化ゲノムセグメント長のモノシストロンｍＲＮＡを転写することが可能である。ウィルス産物は、ウィロプラスマとして蓄積する。ウィルスの構造及びポリメラーゼタンパク、及びｍＲＮＡの連合は、未熟粒子の集合をもたらし、その中で、ｍＲＮＡは転写されて、該ｍＲＮＡと塩基対を形成する、マイナス鎖ＲＮＡ分子を生成する。中間及び内部カプシドタンパクの重要性は、ロタウィルスの例で具体的に説明される。

本発明において有用な二本鎖ＲＮＡウィルスとしては、ロタウィルス、レオウィルス、哺乳類オルトウィルス、及びコロラドダニ熱ウィルスが挙げられる。他の好適な二本鎖ＲＮＡウィルスも当業者には既知である。例示の二本鎖ウィルス核タンパク核酸配列に対するＧｅｎｂａｎｋアクセス番号は、Ｋ０２０８６（ＶＰ６）及びＸ１４９４２（ＶＰ２）を具える。

ロタウィルス
ロタウィルスは、レオウィルス科の一員であるが、幼児及び幼い児童における急性胃腸炎の重要な原因である（Ｋａｐｉｋｉａｎ，Ａ．Ｚ．２００１「ロタウィルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）」，ｐ．１７８７−１８３３．Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ／Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）。このウィルスは、３層の同心のタンパク層から構成される正二十面体で、ゲノムは、１１セグメントの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）から成る（Ｐｒａｓａｄ，Ｂ．Ｖ．１９８８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９：２６９−２７５）。感染性三重層粒子（ＴＬＰ）は、糖タンパクＶＰ７及びスパイクタンパクＶＰ４から構成される。中間層は、ＶＰ６ ３マーによって形成され、内層は、コア格子タンパクＶＰ２によって形成される。ＶＰ２格子の頂点に位置するのは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）及びｍＲＮＡ−キャッピング酵素ＶＰ３の個別のコピーである（Ｌａｗｔｏｎ，Ｊ．Ａ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７３５３）。

ＶＰ６は、ウィルスの中間層を形成し、外層タンパクＶＰ７及びＶＰ４、内層タンパクＶＰ４及びＶＰ７、及び内層タンパクＶＰ２との相互作用を通じて、ウィルスの２主要機能、即ち、細胞進入及び内因性転写を統合する。ＶＰ６自体は、酵素機能を全く欠如するが、ゲノムの内因性転写にとって必須である。Ｃｒｙｏ−ＥＭ研究から、発生期のｍＲＮＡ転写体は、特異的に、ＶＰ６層におけるＩ型チャンネルを通じて生まれることが示されている（Ｌａｗｔｏｎ，Ｊ．Ａ．，２０００，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．５５，１８５−２２９）。ＶＰ６層の擬似原子モデルに基づく突然変異分析によって、ＶＰ２におけるＶＰ６ ３マーの適切な集合が、内因性転写には絶対的要件であることが示された。部位特異的アミノ酸置換は、部分的に、又は完全に、トランスクリプターゼ活性を阻止する（Ｃｈａｒｐｉｌｉｅｎｎｅ，Ａ．，２００２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６，７８２２−７８３１）。カプシド層（ロタウィルスのＶＰ６層に相当）のチャンネルを介する転写体の生成は、ｄｓＲＮＡウィルスにおいて共通の主題であるようである。この層の領域は、転写体反応の基質の排出口としても機能することが示されている。

ＶＰ２は、外側ではＶＰ６層と、内側ではゲノムＲＮＡと相互作用を有する最内層を形成する。ＶＰ２は、そのＮ−末端残基を通じてＲＮＡ−結合能力を示す。このＲＮＡ−結合性を通じて、ＶＰ２は、ＲＮＡ鎖の間に適切な空間を維持し、転写時、ゲノムＲＮＡが転写複合体の周囲を動き回ることを可能とする点において重要な役割を果たす（Ｐｅｓａｖｅｎｔｏ，Ｊ．Ｂ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９８，１３８１−１３８６）。従って、ＶＰ２の主要機能の一つは、内因性転写に至る、ゲノムの構造的統制を指令することである。

ＲＮＡ誘発性実体−ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ分子
本発明は、ｓｉＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子の製造法、及び、ｓｉＲＮＡ分子の使用法（例えば、予防及び／又は治療法、ならびに研究法）をその特徴とする。ｓｉＲＮＡ分子は、約１０から６０、又はそれ以上のヌクレオチド（又はヌクレオチド類縁体）、約１５から２５ヌクレオチド（又はヌクレオチド類縁体）、又は約１９から２３ヌクレオチド（又はヌクレオチド類縁体）の長さを有していてもよい。ｓｉＲＮＡ分子は、約１０から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のヌクレオチド（又はヌクレオチド類縁体）の長さを持ってもよい。好ましい実施例では、ｓｉＲＮＡ分子は、１９ヌクレオチド長を有する。上記の範囲の中に含まれる全ての範囲及び値は、本発明の範囲内にあることを理解しなければならない。一般に、長いｄｓＲＮＡ（６０ヌクレオチドを超える）は、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞の細胞死（「インターフェロン反応」と呼ばれる）を誘発することが判明しているので、短いものに比べ好ましくない。ｓｉＲＮＡは、リン酸基を５′末端に、約１又は２個のヌクレオチドから成る短いオーバーハングを３′末端に具えることが好ましい。ある好ましい実施例では、ＲＮＡｉ誘発性実体は、短いヘアピンｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又は発現されたｓｈＲＮＡであってもよい。このようなｓｈＲＮＡ及び該ｓｉＲＮＡの製造法が、実施例において論じられる。別の実施例では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ複合体において一又はそれ以上のタンパクと連結されていてもよい。

本発明のｓｉＲＮＡは、少なくとも部分的にウィルス転写体に結合させ、しかも結合を、宿主機関によって該標的ウィルス転写体の破壊をもたらすやり方で行うことによって、宿主におけるウィルス遺伝子の発現を抑制するために供給される。従って、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、本明細書において定義される通りのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を仲介するのに十分なほど、ウィルス核タンパク遺伝子の一部に対して相補的な配列である配列を具える。即ち、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ機関又は過程を通じて標的ＲＮＡの分解を誘発するのに十分なほど特異的な配列を有する。ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖の各残基が、標的分子の残基に対して相補的となるように設計されてもよい。それとは別に、前記分子を活性化するために、及び／又は、前記分子の処理活性を強化するために置換を分子の中で実行してもよい。置換は、鎖の内部で行ってもよいし、或いは、各鎖の残基に対して行ってもよい。

ｓｉＲＮＡによって導かれる標的ＲＮＡ切断反応は、高度に配列特異的である。一般に、抑制のためには、標的遺伝子の一部と同一であるヌクレオチド配列を具えるｓｉＲＮＡが好ましい。本発明のｓｉＲＮＡは、一般に、二本鎖分子として供給されるが、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の同一性及び相補性は、標的転写体に対して決められる。従って、本明細書で用いる場合、ウィルス核タンパクをコードする核酸の一部に対して同一な核酸配列の開示は、二本鎖ｓｉＲＮＡの両鎖を具える。しかしながら、本発明を実行するためには、ｓｉＲＮＡ及び標的遺伝子の間の１００％の配列同一性は必要ないことが認識される。従って、本発明は、遺伝子突然変異、ウィルス株多型、又は進化的分化によって予想される配列変動を容認可能であるという利点を有する。例えば、標的配列に対し、挿入、欠失、及び単一点突然変異を具えるｓｉＲＮＡも、抑制のために効果的である。それとは別に、ヌクレオチド類縁体置換又は挿入を有するｓｉＲＮＡ配列も抑制のために効果的である。更に、ｓｉＲＮＡの必ずしも全ての位置が、標的認識に対し等しく寄与するわけではない。ｓｉＲＮＡの中心部のミスマッチは最も重要であり、標的ＲＮＡの切断を事実上中断する場合がある。一方、ｓｉＲＮＡの３′ヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３′ヌクレオチド）は、通常、標的認識の特異性には目立って寄与しない。特に、標的ＲＮＡに対して相補的なｓｉＲＮＡ配列（例えば、ガイド配列）の３′残基は一般に、標的ＲＮＡ切断にとって必要不可欠ではない。

必ずしも全てのｓｉＲＮＡが、任意の特定の標的遺伝子の発現の低下又は抑制において等しく効果的ではないことが従来技術で知られている（例えば、異なるｓｉＲＮＡの効力に変動のあることを報告する、Ｈｏｌｅｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０（８）：１７５７−１７６６を参照）。選択されたｓｉＲＮＡが効果的となる確率を高めるように、様々な配慮が用いられてよい。例えば、イントロンではなく、エキソンの中に標的部分を選択することが好ましい。ｓｉＲＮＡは、一般に、ＲＮＡ試薬の市販業者である、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ８００２６による、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃００３−Ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｂ，「ＲＮＡｉ応用のためのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ＲＮＡｉ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、及びＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃４に従って設計されてもよい。Ｄｈａｒｍａｃｏｎから発行される「ＲＮＡｉ技術参考文献及び応用ガイド（ＲＮＡｉ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ）」は、ｓｉＲＮＡ設計パラメータ、合成等に関する様々な情報を具える。なお参照することによりこれを本明細書に含める。更に採用してもよい他の設計配慮が、Ｓｅｍｉｚａｒｏｖ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．１１，ｐｐ．６３４７−６３５２に記載されている。

配列同一性は、従来技術で既知の、配列比較及び整列アルゴリスムによって決定してもよい。二つの核酸配列（又は、二つのアミノ酸配列）の同一性パーセントを求めるには、その二つの配列を、最適比較のために整列させる（例えば、最適整列を実現するよう、第１配列又は第２配列の中にギャップが導入される）。次に、対応ヌクレオチド（又はアミノ酸）位置におけるヌクレオチド同士（又はアミノ酸残基同士）が比較される。第１配列における位置が、第２配列の対応位置のものと同じ残基によって占められている場合、これらの分子は、その位置において同一である。二つの配列間の同一性パーセントは、両配列によって共有される同一位置の数の関数であり（即ち、相同性％は、同一位置の数を位置の総数で割り、それを１００倍したものに等しい）、選択的に、導入したギャップの数、及び／又は、導入したギャップの長さに関してスコアに罰点を与える。

二つの配列の間の配列の比較、及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリスムを用いることによって実現される。一つの実施例では、十分な同一性を有する配列の一部では整列が得られるが、低度の同一性を有する部分ではそうならない（即ち、ローカル整列）。配列同士の比較のために利用される局所的整列アルゴリスムの好ましい、非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−６８（１９９０）のアルゴリスムで、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−７７（１９９３）のように修正されたものである。このようなアルゴリスムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）の中に取り込まれる。別の実施例では、適当なギャップを挿入することによって整列を最適化し、同一性パーセントは、整列された長さ（即ち、ギャップ入り整列）に渡って決定される。比較用としてギャップ入り整列を得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７）に記載されるようなギャップ入りＢＬＡＳＴを利用してもよい。別の実施例では、整列は、適当なギャップを導入することによって最適化され、同一性パーセントは、整列された配列の全長に渡って決定される（即ち、グローバル整列）。配列同士のグローバル比較のために利用される数学的アルゴリスムの、好ましい、非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリスムである。このようなアルゴリスムが、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮアルゴリスム（バージョン２）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ重み残基表、１２のギャップ長ペナルティ、及び、４のギャップペナルティを用いてもよい。

ｓｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖）と、標的遺伝子の一部との間において、８０％を超える配列同一性、例えば、８４％、８９％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％でも、配列同一性のあることが好ましい。約１９−２５ヌクレオチドから成るｓｉＲＮＡを考えた場合、例えば、少なくとも１６から２１個の同一ヌクレオチドが好ましく、より好ましくは少なくとも１７から２２個の同一ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも１８から２３個、又は１９から２４個の同一ヌクレオチドである。言い換えると、約１９から２５ヌクレオチド長を有するｓｉＲＮＡでは、約４個以下のミスマッチを有するｓｉＲＮＡが好ましく、好ましくは３個以下のミスマッチ、より好ましくは２個以下のミスマッチ、更に好ましくは１個以下のミスマッチである。例えば、ｓｉＲＮＡは、標的配列に対し、１、２、３、又は４個のミスマッチを有するアンチセンス鎖を具える。

代替として、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子転写体の一部とハイブリダイズすることのできる（例えば、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４，１ｍＭ ＥＤＴＡ，５０℃又は７０℃でハイブリダイゼーション１２から１６時間、その後洗浄）ヌクレオチド配列を具えるものと機能的に定義してもよい。別の好ましいハイブリダイゼーション条件として、７０℃で１Ｘ ＳＳＣ、又は５０℃で１Ｘ ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、次いで７０℃で０．３Ｘ ＳＳＣで洗浄か、或いは、７０℃で４Ｘ ＳＳＣ、又は５０℃で４Ｘ ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、次いで６７℃で１Ｘ ＳＳＣで洗浄が挙げられる。その長さが５０塩基対未満が予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５から１０℃低くなければならない。なお、Ｔｍは、下記の方程式によって決められる。長さが１８塩基対未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８と４９の間の塩基対を有するハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）（６００／Ｎ）である。前式において、Ｎはハイブリッドにおける塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーションバッファーにおけるナトリウムイオンの濃度（１Ｘ ＳＳＣ＝０．１６５Ｍにおける［Ｎａ＋］）である。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件に関する更に別の例が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，１９８９，「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ９ａｎｄ１０，ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ いん Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ａｎｄ ６．３−６．４）に提示されている。なお、これらの文献を引用することにより本明細書に含める。同一ヌクレオチド配列の長さは、少なくとも約１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７、３０、３２、３５、３７、４０、４２、４５、４７、又は５０塩基であってもよい。

一つの実施例では、本発明のＲＮＡ分子は、血清、又は細胞培養用の培養媒体における安定性を改善するために修飾される。安定性を強化するために、３′残基を、分解に対して安定化させてもよい。例えば、それらの残基が、プリンヌクレオチド、例えば、アデノシン又はグアニンから成るように選択されてもよい。それとは別に、ピリミジンヌクレオチドの修飾された類縁体による置換、例えば、ウリジンの２′−デオキシチミジンによる置換は容認され、ＲＮＡ干渉の効率に影響を及ぼさない。例えば、２′ヒドロキシル基の欠如は、組織培養液におけるｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を顕著に強化する可能性がある。

本発明の好ましい実施例では、ＲＮＡ分子は、少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド類縁体を含んでもよい。ヌクレオチド類縁体は、標的特異的活性、例えば、ＲＮＡｉ仲介活性がほとんど影響されない位置、例えば、ＲＮＡ分子の５′末端及び／又は３′末端の領域に配されてもよい。特に、末端部は、修飾されたヌクレオチド類縁体を取り込むことによって安定化されてもよい。好ましいヌクレオチド類縁体としては、糖及び／又はバックボーン（即ち、リン酸基−糖バックボーン）を修飾されたリボヌクレオチドが挙げられる。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素又は硫黄ヘテロ原子の内の少なくとも１個を具えるように修飾されてもよい。好ましいバックボーン修飾リボヌクレオチドでは、隣接リボヌクレオチドに接続されるホスホジエステル基は、修飾基、例えば、ホスホロチオアート基によって置換される。好ましい糖修飾リボヌクレオチドでは、２′ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、又はＯＮから選ばれる基によって置換される。前式において、Ｒは、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩである。

また好ましいのは、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、即ち、天然の核酸塩基の代わりに、非天然核酸塩基を具えるリボヌクレオチドである。塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性を阻止するように修飾されてもよい。例示の修飾核酸塩基としては、５−位において修飾されたウリジン及び／又はシチジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位において修飾されたアデノシン及び／又はグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−、及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシンが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。上記修飾体は組み合わせてもよいことに注意しなければならない。

ある実施例では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも一つのヌクレオチドを、修飾ヌクレオチドによって置換することによって修飾される。核タンパク転写体の標的配列と比べた場合、ｓｉＲＮＡは一又はそれ以上のミスマッチを含んでもよく、その場合でも、ＲＮＡｉを仲介することは可能である。

本発明の、核タンパク指向性ｓｉＲＮＡの、ＲＮＡｉを仲介する能力は、本明細書に提示されるウィルス遺伝子の内のあるもの、例えば、インフルエンザウィルス遺伝子の速やかな突然変異率を考慮すると特に有利である。本発明者等は、ＲＮＡｉ標的としての核タンパク遺伝子の使用を提示する。なぜなら、本発明者等は、核タンパク遺伝子は、一般に、他のウィルス遺伝子に比べ突然変異率が低いことを認めたからである。更に、本発明の実施例では、ｓｉＲＮＡは、ウィルス核タンパク遺伝子の保存領域を標的とする。本発明は、例えば、患者特異的ｓｉＲＮＡ又はプラスミドを合成することによって、及び／又は、核タンパク遺伝子にそってゆらぐいくつかのｓｉＲＮＡを導入することによって、この能力を更にてこ入れするいくつかの実施例を考慮している。一つの実施例では、下記に更に詳細に論じられるように、核タンパク遺伝子の、高度に及び／又は中等度に保存される領域が標的とされる。別の実施例では、被験体から生物サンプルが得られる。本明細書で用いる場合、生物サンプルは、ウィルス核酸を具える被験体から得られる任意の材料である。例えば、宿主被験体の、一又はそれ以上の感染細胞が調達され、その中のウィルス核タンパク遺伝子のゲノムが配列決定され、或いは、他のやり方で分析され、一又はそれ以上の対応するｓｉＲＮＡ、プラスミド、又はトランスジーンが選択又は合成される。

ｓｉＲＮＡの製造
一つの実施例では、ｓｉＲＮＡが、インビボか、又はインビトロで合成される。細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼが、インビボで転写を仲介してもよいし、或いは、クローンされたＲＮＡポリメラーゼを、インビボ、又はインビトロにおける転写のために使用してもよい。インビボにおいてトランスジーンから、又は発現構築体から転写を行う場合には、ｓｉＲＮＡを転写するために、調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、又はスプライスドナー及びアクセプター）を用いてもよい。抑制は、器官、組織、又は細胞タイプにおける特異的転写；環境条件の刺激（例えば、感染、ストレス、温度、化学的誘発剤）；及び／又は、ある発達段階又は年齢において転写を加工することによって標的してもよい。組み換え構築体のｓｉＲＮＡを発現するトランスジェニック生物を、接合体、胎生幹細胞、又は、適切な生物から得られた多能細胞の中に該構築体を導入することによって産生してもよい。

更に、ｓｉＲＮＡは、細胞内の多数のＲＮＡを切断するのに使用可能であるばかりでなく、ｓｉＲＮＡは、宿主細胞の酵素によって細胞内で複製及び増幅させることも可能である。Ａｌｂｅｒｔｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ４５２（４ｔｈ Ｅｄ．２００２）。

ＲＮＡは、酵素的に、及び／又は、部分的／完全有機合成によって産生してもよく、インビトロ酵素又は有機合成によって任意の修飾リボヌクレオチドを導入してもよい。一つの実施例では、ｓｉＲＮＡは化学的に調製される。ＲＮＡ分子の合成法は、従来技術で既知であり、特に、化学的合成法は、Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕｌ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４（１９９８）に記載される。別の実施例では、ｓｉＲＮＡは、酵素的に調製される。例えば、ｓｉＲＮＡは、所望の標的ＲＮＡに対して十分な相補性を有する長いｄｓＲＮＡを酵素的に処理することによって調製することが可能である。長いｄｓＲＮＡの処理は、インビトロで実現することが可能である。例えば、適切な細胞分解物を用い、次いで、ｄｓ−ｓｉＲＮＡを、ゲル電気泳動又はゲルろ過によって精製することが可能である。ある例示の実施例では、ＲＮＡは、溶媒又は樹脂による抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせによって精製される。それとは別に、ＲＮＡは、サンプル処理による損失を回避するために、精製を全くすることなく、又は最小にとどめて使用してもよい。

ｓｉＲＮＡはまた、合成ＤＮＡ鋳型から、又は組み替え細菌から分離されたＤＮＡプラスミドから酵素的転写することによって調製することも可能である。通常、ファージＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが用いられる（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ＆ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８０：５１−６２（１９８９））。ＲＮＡは、保存のために乾燥させてもよいし、或いは、水溶液に溶解してもよい。溶液は、アニーリングを抑制するため、及び／又は、１本鎖の安定化を促進するためにバッファー又は塩を含んでもよい。

ｓｉＲＮＡ
本発明の別の態様は、ＲＮＡｉを仲介するために、核タンパク遺伝子ゲノムの一部に対し十分な相補性を有する配列を具える、一又はそれ以上のｓｉＲＮＡを含むベクターを含む。ベクターは、ｓｉＲＮＡの一又はそれ以上のコピーを発現することによって、ＲＮＡｉを治療的に、又は予防的に起動するようインビボで投与されてもよい。一つの実施例では、合成ｓｈＲＮＡが、プラスミドベクターの中で発現される。別の実施例では、プラスミドはインビボで複製される。別の実施例では、ベクターは、ウィルスベクター、例えば、レトロウィルスベクターであってもよい。このようなプラスミドの例、及びこのようなプラスミドを作製する方法が、実施例に具体的に説明される。ベクター及びプラスミドの使用は、ベクターの方が、合成ｓｉＲＮＡよりも安定であり、従って、ｓｉＲＮＡの長期の発現を実行する点で有利である。

ある標的ウィルスは急速に突然変異し、１個ではあってもヌクレオチドのミスマッチをもたらし、それが、ある場合には、ＲＮＡｉを阻害することがある。従って、一つの実施例では、ＲＮＡｉを仲介するのに十分な相同性が保持される確率を高めるために、複数のｓｉＲＮＡを発現するベクターが考慮される。これらのｓｉＲＮＡは、核タンパク遺伝子に沿ってずらされるか、或いは、核タンパク遺伝子の一つ領域に集合される。例えば、複数のｓｉＲＮＡは、約２００ヌクレオチド長で、その３′末端を具える核タンパク遺伝子のある領域に向けられる。一つの実施例では、ベクターによって発現される一又はそれ以上のｓｉＲＮＡはｓｈＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、核タンパク遺伝子の一部、又は核タンパク遺伝子の異なる標的部分に沿ってずらしてもよい。一つの実施例では、ベクターは、約３種のｓｉＲＮＡ、好ましくは約５種のｓｉＲＮＡをコードする。ｓｉＲＮＡは、核タンパク遺伝子の保存領域を標的としてもよい。

ＲＮＡ、ベクター、及び宿主細胞の導入法
本発明の介在因子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ベクター、トランスジーン）を導入するための物理的方法としては、該因子を具える溶液の注入、該因子によって被われる粒子の発射、該因子を含む溶液に細胞又は生物を浸すこと、又は、該因子の存在下における細胞膜の電気穿孔が挙げられる。ウィルス粒子にパッケージしたウィルス構築体を用いたならば、細胞に対する発現構築体の効率的な導入と、発現構築体によってコードされる、ｓｉＲＮＡを具えるＲＮＡの転写の両方が十分達成される。細胞に核酸を導入するための、従来技術で既知の方法、例えば、脂質介在担体輸送、化学薬品介在輸送、例えば、リン酸カルシウム等も使用が可能である。従って、ｓｉＲＮＡは、一又はそれ以上の活性、例えば、細胞によるｓｉＲＮＡの取り込みを強化する活性、２本のｓｉＲＮＡ鎖が互いにアニールするのを抑制する活性、単一鎖を安定化する活性、又はその他のやり方で標的遺伝子の抑制を増強する活性を実行する成分とともに導入されてもよい。

介在因子は、細胞の中に（細胞内）直接導入されてもよいし、又は、細胞外の腔又は細胞間スペースに、生物の循環の中に導入されてもよいし、又は、細胞又は生物は、ＲＮＡを具える溶液に浸すことによって導入されてもよい。介在因子を導入してもよい部位として、血管又は血管外循環、血液又はリンパ系、脳脊髄液が挙げられる。

細胞は、介在因子輸送時に、標的に感染されてもよく、又は、介在因子の輸送後に標的ウィルスに暴露されてもよい。細胞は、いずれの生物から得られたものでも、いずれの生物に含まれるものであってもよい。細胞は、生殖系列又は体細胞、全能性又は多能性、分裂中又は非分裂中、実質又は上皮、恒久系統又は形質変換等から得られたものであってもよい。細胞は幹細胞又は分化細胞であってもよい。

特定の標的遺伝子、及び送達される二本鎖ＲＮＡ材料の用量に応じて、この過程は、標的遺伝子の部分的又は完全な機能消失をもたらす可能性がある。標的細胞の、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％以上における遺伝子発現の低下又は消失が例として示される。遺伝子発現の抑制とは、ウィルスタンパク、ＲＮＡ、及び／又はＤＮＡのレベルにおける消失（又は観察できる低下）を指す。特異的とは、他の遺伝子、特に宿主細胞の遺伝子に対して作用を示すことなく、標的遺伝子を抑制することが可能な能力を指す。抑制の結果は、細胞又は生物の外面性質を調べることによって、或いは、生化学的技術、例えば、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイによる逆転写遺伝子発現監視、抗体結合、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、組み込みアッセイ、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、その他の免疫アッセイ、及び蛍光活性化細胞分析（ＦＡＣＳ）によって確認される。

細胞系統又は全体生物におけるＲＮＡ介在抑制では、そのタンパク産物が簡単に定量されるリポーター又は薬剤耐性遺伝子を用いて、遺伝子発現を定量すると好都合である。このようなリポーター遺伝子としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、及びそれらの誘導体が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、プロマイシン、及びテトラサイクリンに対する耐性を付与する多数の選択性マーカーが市販されている。アッセイに応じて遺伝子発現量を定量することによって、本発明に従って治療されない細胞と比較した場合の、１０％、３３％、５０％、９０％、９５％、又は９９％を超える抑制の程度を定量することが可能である。ｓｉＲＮＡ投与後、注入材料の用量をより少なくし、時間をより長くすると、より少ない割合の細胞の抑制がもたらされる（例えば、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％、又は９５％）。

細胞における遺伝子発現の定量によって、標的ＲＮＡの蓄積レベル、又は標的タンパクの翻訳レベルにおける類似の抑制量が明らかにされる。例として、抑制効率が、細胞において産生される遺伝子量を評価することによって定量される。その際、ＲＮＡは、抑制性二本鎖ＲＮＡ用として使用された領域の外側のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブによって検出してもよいし、或いは、翻訳ポリペプチドを、その領域のポリペプチド配列に対して惹起した抗体によって検出してもよい。

ｓｉＲＮＡは、少なくとも細胞当たり１コピーの送達を可能とする量として導入される。それよりも高い用量（例えば、細胞当たり、少なくとも５、１０、１００、５００、又は１０００コピー）の材料の方がより効率的な抑制をもたらすと思われるが、それよりも低い用量であっても、特定の用途では有用である可能性がある。

診断法及びキット
本発明は、伝染病、例えば、ウィルスによる感染症のＲＮＡ依存性治療が、治療を必要とする被験体が、一又はそれ以上のＲＮＡｉ誘発性実体による抑制に対して感受性を持つかどうかを決める診断工程を含むことが好ましい、とする認識を含む。「抑制に対して感受性を持つ」とは、感染媒介因子の一又はそれ以上の生物学的活性が、被験体に対するＲＮＡｉ誘発性実態を投与することによって効果的に抑制されることを意味する。感染媒介因子の複製、病原性、伝染性、及び／又は産生が抑制されることが好ましい。例えば、該因子の複製、病原性、伝染性、又は産生が、ＲＮＡｉ誘発性実体を耐忍される用量で被験体に投与した場合、少なくとも２５％抑制されることが好ましい。抑制は、治療的に有用な作用を及ぼすのに十分であることが好ましい。

感染に罹った被験体に対して好適なＲＮＡｉ誘発性実体の選択を可能とするよう、個別の要求に応じて処方される本発明の診断法の例示には、非限定的例として、インフルエンザウィルスが用いられる。しかしながら、本明細書に開示される方法は、本明細書に記載される任意のウィルス、又は、当業者に認識されると考えられる任意のウィルスに対しても適切であることを理解しなければならない。選択されたＲＮＡｉ誘発性実体はまた、当然のことながら、予防のためにも、例えば、感染した個人と接触した個人に対し、その個人が、感染症状を発症したかどうかとは無関係に投与されてもよい。

従って、本発明は、ウィルス感染を診断する方法、及び、被験体がウィルスに感染しているかどうかを決めるための方法を提供する。ある実施例では、方法は、ウィルス核タンパク転写体を標的とする、本発明の、一又はそれ以上のＲＮＡｉ誘発性実体によって抑制されるウィルスに、被験体が感染されているかどうかを決めることを含む。例えば、サンプル（例えば、喀痰、唾液、鼻腔洗浄液、鼻腔内綿棒採取、咽頭内綿棒採取、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、バイオプシー標本等）を、ウィルス感染、例えば、インフルエンザが疑われる被験体から入手する。サンプルに一又はそれ以上の処理工程を実施する。そのような処理サンプルは、どのようなものでも、被験体から得られたものと見なされる。サンプルは、それが、ウィルス特異的核酸、特に、核タンパク転写体を含むかどうかを決めるために分析される。「ウィルス特異的核酸」は、ウィルスを起源とする、又はウィルスから得られた任意の核酸又はその相補体であって、サンプル中のウィルスの存在のインディケータとなり得、且つ、選択的に、ウィルス株及び／又はウィルス遺伝子の配列の同定に使用される核酸又はその相補体である。この核酸に対し、その分離後、処理工程を実施してもよい。例えば、核酸に対し逆転写、増幅、切断等を行ってもよい。ある実施例では、サンプル中に存在するウィルス特異的核酸の配列、又はその相補体は、ＲＮＡｉ誘発性因子、例えば、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのアンチセンス又はセンス鎖と比較される。「比較」という言葉は、広い意味で、配列を評価する任意の方法、例えば、配列が、参照配列に対し同じか、又は、一又はそれ以上の箇所において異なるかを定めることが可能な方法、又は、相違の程度を評価する方法を指すために使用される。

多種多様な核酸系アッセイの内のどれでも使用が可能である。ある実施例では、診断アッセイは、都合よく、及び／又は高度に保存される標的部分、又はその相補体、又は、都合よく、及び／又は高度に保存される標的部分、又はその相補体の断片を含む核酸を利用する。ある実施例では、核酸は、例えば、後述のようなアッセイにおける増幅プライマー、又はハイブリダイゼーションプローブとして使用される。

ある実施例では、サンプル中のインフルエンザ特異的核酸が増幅される。恒温標的増幅法としては、転写体介在性増幅（ＴＭＡ）、自己持続配列増幅（３ＳＲ）、核酸配列依存性増幅（ＮＡＳＢＡ）、及びそれらの改変種が挙げられる。検出又は比較は、従来技術で既知の種々の方法、例えば、増幅依存性アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、プライマー伸長アッセイ（例えば、異なるインフルエンザウィルス株の対応標的部分が、遺伝子の異なる対立遺伝子と近似する場合の、対立遺伝子特異的プライマー伸長）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（米国特許第５，１８５，２４３、５，６７９，５２４、及び５，５７３，９０７号）、切断アッセイ、ヘテロ二重鎖追跡分析（ＨＴＡ）アッセイ等を用いて実施される。例として、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（米国特許第５，７２３，５９１号）が挙げられる。標的増幅ではなく、シグナル又はプローブ増幅に依存する核酸検出システムであるサイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）（米国特許第５，０１１，７６９、５，４０３，７１１、５，６６０，９８８、及び４，８７６，１８７号）も採用が可能である。侵襲的切断アッセイ、例えば、Ｅｉｓ，Ｐ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６７３，２００１によって記載されるＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）アッセイ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）も、インフルエンザ特異的核酸を検出するのに使用することが可能である。分子ビーコンに依存するアッセイ（米国特許第６，２７７，６０７、６１５０，０９７、６，０３７，１３０号）、又は、蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に依存するアッセイを使用してもよい。分子ビーコンとは、完全にマッチする鋳型と結合すると立体配座の変化を受けるオリゴヌクレオチドヘアピンである。

ある実施例では、アッセイは、サンプル中のインフルエンザ特異的核酸が、ＲＮＡｉ誘発性実体のセンス鎖又はアンチセンス鎖と同一か、又は異なる部分を含むかどうかを決める。選択的に、相違があれば、その正確な違いが特定される。この情報を用いて、インフルエンザウィルスが、ＲＮＡｉ誘発性実体による抑制に対して感受性を持つかどうかが決定される。前述に加えて、感染性因子の検出及び／又は遺伝子型決定に好適なアッセイが、「分子微生物学：診断原理と応用（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ： Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」，Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｄ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．）Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，２００４に記載される。

診断アッセイは、本明細書に記載される核酸から選ばれる任意のものを用いてよい。本発明のある実施例では、核酸は、核タンパク転写体に対し、実質的に相補的ではない、又は実質的に同一ではない核酸部分を含む。例えば、核酸は、プライマー結合部位（例えば、汎用配列決定用プライマー、又は増幅プライマー）、ハイブリダイゼーションタグ（例えば、他の核酸を含むサンプルから核酸を分離するために使用されるもの）等を含んでもよい。本発明のある実施例では、核酸は、非ヌクレオチド成分を含む。この非ヌクレオチド成分は、核酸の末端ヌクレオチド、例えば、３′末端のヌクレオチドに付着されてもよい。この成分は、核酸が分解されるのを保護してもよい。ある実施例では、非ヌクレオチド成分は、検出可能な成分、例えば、蛍光染料、放射性原子、蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ペアの一員、消光剤等である。ある実施例では、非ヌクレオチド成分は、ジゴキシン、２，４−ジニトロフェニル（ＴＥＧ）等のようなハプテンである。ある実施例では、非ヌクレオチド成分は、核酸分離に有用なタグである。

本発明のある実施例では、核酸は、支持体、例えば、微粒子、例えば、任意に磁気性であってもよいビーズに付着される。本発明は更に、本発明の複数の核酸、例えば、少なくとも１０、２０、５０個等の核酸を含むアレイを提供する。核酸は、支持体、例えば、事実上平坦な支持体、例えば、ガラススライドに共有的に、又は非共有的に付着される。例えば、米国特許第５，７４４，３０５、５，８００，９９２、６，６４６，２４３号を参照されたい。

実験から得られた情報、又は、核タンパク遺伝子の中のある特定配列を有するウィルスを取り扱った、以前の経験から得られた情報を用いて、任意のＲＮＡｉ誘発性実体、又はそれらの任意の組み合わせによる抑制に対し、該ウィルスが感受性を持つかどうかを決めてもよい。感受性情報はまた、ウィルスの核タンパク配列と、抑制因子のアンチセンス鎖の間に存在すると予想されるミスマッチの効果にもとづく理論的予測を含んでもよい。

本発明は、ウィルス感染を検出するための診断キットを提供する。キットのあるものは、本発明の一又はそれ以上の核酸を含む。キットのあるものは、ＲＮＡｉに対し好ましい標的部分を含む、核タンパクウィルス転写体の一部を検出するために使用される一又はそれ以上の核酸を含む。キットは、プローブ、プライマー、配列特異的オリゴヌクレオチド、酵素、基質、抗体、ヌクレオチドの集団、バッファー、陽性対照、及び陰性対照から成る群より選択される一又はそれ以上の品目を含んでもよい。ヌクレオチドは標識されてもよい。例えば、蛍光標識ヌクレオチド、例えば、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰの、一又はそれ以上の集団が準備されてもよい。

プローブは、標的タンパクの全て又は一部、例えば、高度に、又は好適に保存される核タンパク標的部分、又はその成分を含む標的タンパクを含む核酸、或いは、標的部分と少なくとも８０％同一又は相補的である、例えば、１００％同一又は相補的である核酸であってもよい。ある実施例では、複数のプローブが提供される。これらのプローブは一又はそれ以上の位置において異なり、それらの位置における核タンパクウィルス転写体の厳密な配列を決定するために用いられる。例えば、これらのプローブは、転写体に対し異なるやり方でハイブリダイズしてもよい（例えば、プローブが、転写体の標的部分に対して１００％相補的である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる）。本発明のキットは、標本採取材料、例えば、綿棒、チューブ等を含んでもよい。キットの成分は、個別の容器又はチューブに納められてもよい。これらの容器又はチューブは、一般に、キットの使用案内と共に、容器、例えば、市販に好適なプラスチック又は発泡スチロールに納めて提供される。

治療法
本発明は、ウィルスに対する危険性を持つ（感受性を持つ）被験体、又はウィルスを保有する被験体を治療するための予防法及び治療法の両方を提供する。本明細書で「治療」又は「治療する」とは、ウィルスを保有する患者に対し、ウィルス又はウィルスの症状を（に）、治癒、平癒、寛解、解除、変更、救済、緩和、改善、又は影響する目的で、治療因子（例えば、ｓｉＲＮＡ、又は該ｓｉＲＮＡをコードするベクター又はトランスジーン）を塗布又は投与すること、或いは、ウィルスを保有する患者から得られた分離組織又は細胞系統に対し、治療因子を塗布又は投与することと定義される。この「治療」又は「治療する」という用語は、本明細書においては、予防的に因子を投与するという意味において、例えば、ウィルスに備えて接種する意味においても使用される。

予防法及び治療法の両方に関して言えば、これらの処置法は、薬理ゲノミクスの分野において得られた知識に基づいて、個別の要求に特異的に合わせてもよいし、修飾してもよい。本明細書で用いる「薬理ゲノミクス」とは、臨床開発途上の薬剤及び市販の薬剤に対する、ゲノミクス技術の応用、例えば、遺伝子の配列決定、統計的遺伝学、及び、遺伝子発現分析の応用を指す。更に具体的には、上記用語は、患者の遺伝子がどのようにして、薬剤に対する彼ないし彼女の反応（例えば、患者の「薬剤反応表現型」又は「薬剤反応遺伝子型」）を決めるかを探る研究を指す。従って、本発明のもう一つの局面は、本発明の標的遺伝子分子を用いて個別の要求に合わせた予防又は治療法を設計する方法、或いは、その個別の薬剤反応遺伝子型に基づく個別の要求に合わせた予防又は治療法の設計法を提供する。

関連実施例では、二つ以上の異なるＲＮＡｉ誘発因子の集団が、ウィルスに対し宿主となっている可能性のある被験体に投与される。一つの実施例では、二つ以上のＲＮＡｉ誘発因子の集団は、その配列が、ある特定のウィルスの種々の株における、同じ高度に保存される領域に対し事実上相補的である（好ましくは１００％相補的）ガイド鎖を含む因子を含む。もう一つの実施例では、二つ以上のＲＮＡｉ誘発因子の集団は、その配列が、同じウィルス株における、別々の、高度に保存される領域に対し事実上相補的である（好ましくは１００％相補的）ガイド鎖を含む因子を含む。更にもう一つの実施例では、二つ以上のＲＮＡｉ誘発因子の集団は、その配列が、ある特定のウィルス、例えば、インフルエンザウィルスの種々の株における、同じ高度に保存される領域に対し事実上相補的である（好ましくは１００％相補的）ガイド鎖を含む因子を含み、且つ、ＲＮＡｉ誘発因子は、同じウィルス株における、別々の、高度に保存される領域に対し事実上相補的である（好ましくは１００％相補的）ガイド鎖を含む因子を含む。

予防法
一つの局面において、本発明は、本明細書において論じられるｓｉＲＮＡ、又はベクター、又はトランスジーンの内の任意のものを含む予防的に有効な因子を、被験体に投与することによって、ウィルスによる感染、又はウィルス感染と関連する病態から、該被験体を予防するための方法を提供する。予防因子の投与は、ウィルス感染が予防されるように、ウィルス感染に特有の症状の出現前に行われる。

ある好ましい実施例では、予防的に有効な因子は、標的ウィルスに対する暴露前に被験体に投与される。もう一つの実施例では、因子は、感染の進行を遅延又は抑制するために、又は、健康な細胞のＤＮＡ、又はウィルス前駆体を含まない細胞のＤＮＡに対するそのウィルスの組み込みを阻止するために、標的ウィルスに対する暴露後に被験体に投与される。標的ウィルスの形成は抑制又は阻止されることが好ましい。それに加えて、又はそれとは別に、標的ウィルスの複製は抑制又は阻止されることが好ましい。一つの実施例では、ｓｉＲＮＡは、標的ウィルスＲＮＡを、その複製の初期段階で、例えば、細胞に進入直後に分解する。このようにして、因子は、被験体の健康な細胞を感染から防ぐ。もう一つの実施例では、ｓｉＲＮＡは、複製の後期段階でウィルスＲＮＡを分解する。上記方法においては、本明細書で論じられる任意の戦略、例えば、ウィルス核タンパク遺伝子に対し、ＲＮＡｉを仲介するのに十分な相補性を持つ、複数のｓｉＲＮＡを発現するベクターの投与を採用してもよい。

治療法
本発明のもう一つの局面は、治療目的のために、標的遺伝子の発現、タンパクの発現又は活性を変調する方法に関する。従って、例示の実施例では、本発明の変調法は、ウィルスに感染した細胞を、該ウィルスゲノムの一部に対して特異的な治療因子（例えば、ｓｉＲＮＡ、又は該ｓｉＲＮＡをコードするベクター又はトランスジーン）に接触させることを含み、接触は、ＲＮＡｉがその仲介によって起動されるにように行われる。これらの変調法は、体外で（例えば、細胞を因子と共に培養することによって）行ってもよいし、或いはそれとは別に、体内で（例えば、被験体に因子を投与することによって）行ってもよい。方法は体外で行い、次に、その産物を被験体に導入してもよい（例えば、遺伝子治療）。

本発明の治療法は、一般に、ウィルス（例えば、インフルエンザ）に感染した被験体に因子を投与することによって、ＲＮＡｉを開始することを含む。因子は、一又はそれ以上のｓｉＲＮＡ、一又はそれ以上のｓｉＲＮＡ複合体、一又はそれ以上のｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡを含む）を発現するベクター、又は、一又はそれ以上のｓｉＲＮＡをコードするトランスジーンを含んでもよい。本発明の治療法は、ウィルス産生（例えば、ウィルス力価、又はウィルス前駆体力価）を、約３０から５０倍、好ましくは約６０から８０倍、より好ましくは約（又は少なくとも）９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、又は１０００倍低下させることが可能である。

更に、本発明の治療因子及び方法は、転写後対処法（例えば、リボザイム及び／又はアンチセンスＲＮＡによる対処法）との併用療法において使用が可能である。

二重予防・治療法
ある好ましい方法では、標的ウィルスに暴露されたことのある被験体において、該標的ウィルスに対する二重併用攻撃が実行される。このようにして、感染被験体は、複製の初期段階で宿主細胞のゲノム中に取り込まれる前に、ウィルスを分解することによって予防的に処置されると共に、更に、標的ウィルスが既に複製を開始してしまった細胞ではウィルスの複製を遅らせることによって治療的に処置される。

当業者であれば、個別の患者において所望の「有効レベル」を実現するために、使用される組成物の厳密な処方に対し、適切な用量、スケジュール、及び投与法を簡単に決めることが可能である。また、当業者であれば、適切な患者のサンプル（例えば、血液及び／又は組織）の直接分析（例えば、分析化学分析）、又は間接分析（例えば、ウィルス感染の代行インディケータ）を通じて本発明の化合物の「有効レベル」について適切なインディケータを用いることが可能である。

本発明の予防的又は治療的製薬組成物は、ウィルス感染を治療的に処置する場合、本発明によるベクターと組み合わせて他の製剤を含むことも可能である。前述したものに加えて使用が可能な添加製剤の代表的例としては、ウィルス感染に使用が可能な、抗ウィルス化合物、免疫調節剤、免疫刺激剤、抗生物質、及び他の薬剤、及び治療処方（代替治療薬と認められているものを含む）が挙げられる。免疫調節剤及び免疫刺激剤としては、種々のインターロイキン、ＣＤ４、サイトカイン、抗体製剤、血液輸血、及び細胞輸血が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。

製薬組成物
本発明は、後述するように、ウィルス感染の予防及び治療処置のための、前述のＲＮＡｉ誘発性実体の使用に関する。従って、本発明の因子は、投与に好適な製薬組成物の中に組み込まれる。このような組成物は、通常、該因子、及び薬学的に許容可能な担体を含む。

本発明の製薬組成物は、その意図される投与ルートに適合するように処方される。投与ルートの例としては、経口、吸引、鼻腔内、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、及び筋肉内）、経皮（局所）、及び経粘膜投与が挙げられる。非経口、皮内、又は皮下投与のために使用される溶液又は懸濁液は、下記の成分を含んでもよい。即ち、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生食液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロプレングリコール、又はその他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸又は重亜硫酸ソーダ；キレート剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）；バッファー、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩；及び浸透圧調節剤、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、例えば、塩酸又は水酸化ナトリウムによって調節される。非経口製剤は、アンプル、ディスポーザブル注射筒、ガラス又はプラスチック製の複数用量用バイアルの中に封入されてもよい。

注入使用に好適な製薬組成物は、滅菌された水溶液（水に可溶な場合）又は懸濁液と、滅菌注入液又は懸濁液の現場調製用滅菌粉末を含む。静脈内注入の場合、好適な担体として、生理的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＥ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ニュージャージー州）、又はリン酸バッファー生食液（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれにしろ、組成物は、滅菌性で、簡単に注射筒から注入可能であるほどに流動性を持っていなければならない。組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、微生物、例えば、細菌及び真菌の汚染作用に冒されないように防腐されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及び、好適なそれらの混合液を含む溶媒、又は分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合は要求される粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持される。微生物作用の阻止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クルロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等）によって実現することが可能である。多くの場合、組成物の中に等張剤（例えば、糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、及び塩化ナトリウム）を含めることが好ましい。注入組成物の長期の吸収は、組成物の中に、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることによって実現される。

注入用滅菌水は、必要量の活性化合物を、上に列挙した一つの成分、又は複数の成分の混合物と共に、適切な溶媒に含め、要すれば、ろ過滅菌を実施することによって調製される。一般に、分散液は、基本的分散媒体、及び、上に列挙したものの内から必要な、他の成分を含む滅菌ビヒクルに活性成分を含めることによって調製される。滅菌注入液調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥及び凍結乾燥で、これによって、以前に滅菌ろ過した溶液から、活性成分プラス所望の任意の添加成分から成る粉末が得られる。

吸引投与とは、ＲＮＡｉ誘発性実体が、鼻又は口から吸引され肺へ導かれることによって呼吸器系に直接導入されることを意味する。実体は、生の形のままでもよいし、或いは、担体と一緒であってもよい。ある実施例では、ＲＮＡｉ誘発因子は、呼吸器系を冒す病態、例えば、呼吸器ウィルス感染を治療又は予防するが、他方で、血液への吸収が最小となるように、従って、ＲＮＡｉ誘発因子が全身に送達されるのを最小とするのに有効な量として投与される。特に、本発明は、好ましくは、適切な推進剤、例えば、二酸化炭素のような気体を含む加圧容器又は投薬器、又は噴霧器から発射されるエアロゾルの形で送達されるＲＮＡｉ誘発性実体を含む乾燥粉末組成物を提供する。ある実施例では、送達システムは、被験体（例えば、動物又はヒト）の大型の気道（気管及び気管支）の中に、及び／又は、肺の奥深くに（細気管支及び／又は肺胞）組成物を送達するのに好適である。本発明はまた、鼻腔噴霧を用いてＲＮＡｉ含有実体を含む組成物を送達することを含む。本発明のある実施例では、製薬組成物の中に、呼吸器系の細胞による核酸の取り込みを促進する送達剤が含まれる。一方、本発明人等は更に、ＲＮＡｉ誘発性実体は、特異的送達剤がなくとも気道を通じて呼吸器系に送達されるとインフルエンザウィルスを効果的に抑制することが可能であることを発見した。例えば、ＲＮＡｉ誘発因子は、乾燥形（例えば、乾燥粉末）で、事実上ＲＮＡｉ誘発因子のみから成る組成物として、或いは、事実上水のみから成る、選択的に、塩（例えば、ＮａＣｌ、リン酸塩）、バッファー、及び／又は、アルコールを含む水から成る水性媒体に溶解した生のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡとして、更に肺に送達されてもよい。

本発明はまた、肺循環による、ＲＮＡｉ含有実体の全身循環送達の手段も提供する。呼吸器病の場合、循環への転送が最小となることが好ましい。

経口組成物は、一般に、不活性希釈剤又は食用可能な担体を含む。組成物は、ゼラチンカプセルに封入されてもよいし、或いは、錠剤に圧縮されてもよい。経口治療投与のためには、活性化合物は賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ、又はカプセルの形で使用される。経口組成物はまた、含そう剤用流体担体を用いて調製されてもよい。その際、流体担体に溶解した化合物は、口内に入れられ、鋭くかき回され、吐き出されるか、飲みこまれる。製薬学的に適合する結合剤及び／又は補助材料を、組成物の一部として含めてもよい。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、下記の成分、又は類似の性質の化合物の内の任意のものを含んでもよい。即ち、微細結晶セルロース、トラガカントゴム、又はゼラチンのような結合剤；でん粉又はラクトース、アルギニン酸のような崩壊剤、プリモゲル、又はコーンでん粉のような賦形剤；ステアリン酸マグネシウム又はステローツのような潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑沢剤；スクローズ又はサッカリンのような甘味剤；又は、薄荷、サリチル酸メチル、又はオレンジ芳香のような芳香剤である。

全身投与も、経粘膜又は経皮手段によって実行することが可能である。経粘膜又は経皮投与の場合、処方において、浸透すべき障壁に合った浸透剤が使用される。このような浸透剤は一般的に従来技術で既知であるが、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔噴霧又は坐剤の使用によって実行される。経皮投与の場合、活性化合物は、従来技術で一般に知られるように、軟膏、塗布剤、ゲル、又は、クリームとして処方される。

一つの実施例では、活性化合物は、該化合物を体内から速やかに排除するのを防止する担体と共に、例えば、埋設剤及び微細封入送達システムを含む放出調節処方として調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸も使用が可能である。このような処方物の調製法は当業者には明白である。材料は、Ａｌｚａ社及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社から購入することが可能である。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクロナール抗体によって、感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、薬学的に許容可能な担体として使用される。これらは、当業者に既知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載される方法に従って調製することが可能である。

投与が容易であること、及び用量の均一性のために、吸引、経口、又は非経口組成物は、単位剤形として処方すると特に有利である。本明細書で用いる単位剤形とは、治療される被験体にとって単位剤形として好適な、物理的に独立した単位を指す。各単位は、必要な製薬担体と連動して所望の治療効果を発揮するよう計算された、指定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形用仕様は、活性化合物の特有の性質と実現される特定の治療効果、及び、個別の被験体の治療のために活性化合物を混合処方する技術に内在する制限によって指定され、また、それらの要因に直接依存する。

そのような化合物の毒性及び治療効力は、細胞培養体又は実験動物を用いた標準的製薬手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致命的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に対して治療的に有効な用量）を定める手順によって決められる。毒性作用と治療作用の間の用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比と表される。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、非感染細胞にたいする傷害の可能性を最小にし、副作用を低減するよう、感染組織部位に化合物を標的する送達システムの設計には注意しなければならない。

細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータを用いて、ヒトにおいて使用される用量範囲を定めることが可能である。このような化合物の用量は、毒性をほとんど、又は全く持たず、ＥＤ５０を含む循環濃度範囲内に納まることが好ましい。用量は、用いられる剤形、及び利用される投与ルートに応じてこの範囲内を変動してよい。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療的有効量は、先ず細胞培養又は非ヒト動物アッセイによって推定することが可能である。細胞培養で決定されたＥＤ５０（即ち、最大の半分の反応を実現する試験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を実現する用量が、動物モデルにおいて処方される。この情報を用いて、ヒトにおける有効用量が更に正確に決められる。血漿におけるレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定されてもよい。

製薬組成物は、容器、パック、又は投薬器の中に、投与指示書と共に包装される。

実施例
実施例１：ウィルス核タンパクの同定
高度に保存される部位とは、利用可能な全てのヒトインフルエンザ配列の大多数において存在することが認められる部位又は配列と考えられる。１９マー保存配列と近似するヒトインフルエンザ分離株に見られる１９マー配列であって、僅かに１個又は数個のヌクレオチド変化の分だけ異なる変異種が同定される。これらも重要である。なぜなら、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘発沈黙化複合体）は、そのガイド（アンチセンス）鎖が、標的ｍＲＮＡ配列に対して大部分相補的ではあるが、厳密な相補性と比べると１個又は数ヌクレオチドの変化を持つｓｉＲＮＡ二重鎖であっても、それを用いてＲＮＡｉ活性を高めることが可能だからである。

別々の８個のＲＮＡセグメントが、インフルエンザウィルスゲノムを構成する。全ての分析は、これらのウィルスセグメントのそれぞれについて別々に実行された。従って、例えば、保存部位の探索は、ウィルスセグメント＃１に対しては、セグメント＃１から得られる配列のみを用いて実施した。

８個のウィルスセグメントそれぞれのインフルエンザウィルスＡの配列は、インフルエンザ配列データベース（Ｍａｃｋｅｎ，Ｃ．，Ｌｕ，Ｈ．，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｊ．，＆ Ｂｏｙｋｉｎ，Ｌ．，「サーベイランス及びワクチン選択におけるデータベースの価値（Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｉｎ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．）」，ｉｎ Ｏｐｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ＩＶ．Ａ．Ｄ．Ｍ．Ｅ．Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ，Ｎ．Ｃｏｘ ＆ Ａ．Ｗ．Ｈａｍｐｓｏｎ（Ｅｄｓ．）Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，１０３−１０６）から得た。このリストを、全長配列（”Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｃｄｓ”（完全コード）の表示を持つもの、又は完全コード遺伝子長の＞９５％の長さを持つもの）以外の全てを排除するようにスクリーニングし、任意の標的配列における１９マー断片の適合を、配列短縮化のために見落とすことがないようにした。配列は更に、実験株を排除するようにスクリーニングした（ただし、ＰＲ８及びＷＮＶの実験株は、試験に用いたので例外とした）。その理由は、実験株は、比較的多数の、人工的に誘発された突然変異を有する可能性が高いからである。これによって、各ウィルスセグメントから２−１１個の配列が排除された。最後に、全ての配列が依然として最新であることを確かめるために、配列を、ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド配列データベース
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に対し交差照合した。表１は、前述の基準に合致し、後続の分析に使用された、ヒトのインフルエンザ配列のＧｅｎＢａｎｋアクセス番号を列挙する。

表１−１：本分析に用いられたＰＢ２配列（セグメント１）に対するＧｅｎＢａｎｋアクセス番号

表１−２：本分析に用いられたＰＢ１配列（セグメント２）に対するＧｅｎＢａｎｋアクセス番号

表１−３：本分析に用いられたＰＡ配列（セグメント３）に対するＧｅｎＢａｎｋアクセス番号

表１−４：本分析に用いられたＨＡ配列（セグメント４）に対するＧｅｎＢａｎｋアクセス番号

表１−５：本分析に用いられたＮＰ配列（セグメント５）に対するＧｅｎＢａｎｋアクセス番号

表１−６：本分析に用いられたＮＡ配列（セグメント６）に対するＧｅｎＢａｎｋアクセス番号

表１−７：本分析に用いられたＭＰ配列（セグメント７）に対するＧｅｎＢａｎｋアクセス番号

表１−８：本分析に用いられたＮＳ配列（セグメント８）に対するＧｅｎＢａｎｋアクセス番号

対象とするインフルエンザＡウィルス配列のそれぞれから得られる全ての１９マー配列断片を抽出し、さらに各配列断片が、インフルエンザＡウィルスの各配列の中に、厳密な適合体として存在するかどうかを表に列挙することによって、高度に保存される１９マー配列断片が特定された。このようにして、第１ウィルス配列は、位置１から位置１９まで延びる１９マー配列断片を含み、もう一つは、位置２から位置２０まで、もう一つは位置３から位置２１まで、等と続く。同様に、第２、第３、及び第４ウィルス配列が、リストの最終ウィルス配列に至るまで抽出される（表１）。

次に、配列断片が、配列断片から成る増大する表に加えられ、各１９マー断片を含むインフルエンザウィルス配列の数が次々にカウントされる。最後に、断片頻度が、各特異的１９マー断片を含むインフルエンザウィルス配列のパーセントとして表される。表２は、もっとも保存的な１９マー配列断片（７０％まで）、及びそれらの出現頻度を列挙する。

表２−１：表１−１に掲載されるインフルエンザＡセグメント１（ＰＢ２）配列の少なくとも７０％として存在する１９マー保存配列

表２−２：表１−２に掲載されるインフルエンザＡセグメント２（ＰＢ１）配列の少なくとも７０％として存在する１９マー保存配列

表２−３：表１−３に掲載されるインフルエンザＡセグメント３（ＰＡ）配列の少なくとも７０％として存在する１９マー保存配列

表２−４：表１−４に掲載されるインフルエンザＡセグメント２（ＨＡ）配列の少なくとも７０％として存在する１９マー保存配列

表２−５：表１−５に掲載されるインフルエンザＡセグメント２（ＮＰ）配列の少なくとも７０％として存在する１９マー保存配列

表２−６：表１−６に掲載されるインフルエンザＡセグメント２（ＮＡ）配列の少なくとも７０％として存在する１９マー保存配列

表２−７：表１−７に掲載されるインフルエンザＡセグメント２（Ｍ１およびＭ２）配列の少なくとも７０％として存在する１９マー保存配列

表２−８：表１−８に掲載されるインフルエンザＡセグメント２（ＮＳ１およびＮＳ２）配列の少なくとも７０％として存在する１９マー保存配列

我々の研究は、標的ＲＮＡと、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンスガイド鎖の間の少数のミスマッチは、ＲＮＡｉ機構が耐忍することが可能であることを示す。従って、インフルエンザにおける高度の保存部位を標的とする単一のｓｉＲＮＡ二重鎖は、該高度の保存部位に対して僅かに１個又は数個のミスマッチを含む軽微な変異種に対しては、多くの場合依然として活性を有する。我々は、任意のｓｉＲＮＡ二重鎖によって標的とすることが可能なインフルエンザウィルスＡの配列変異のリストを更に拡張するためにこの所見を利用した。

表３では、実験室スクリーニング実験で特定された上位９個のｓｉＲＮＡ部位が、表２０から抽出された。

表３： 実験室スクリーニング実験で特定された上位９個のｓｉＲＮＡ部位で、表２０−１から表２０−６で定義されるインフルエンザＡから得られる僅少の変動を含む１９マー保存配列を示す。

イヌ腎臓由来上皮細胞（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）（ＭＤＣＫ）を用いた。電気穿孔のために、細胞を、血清無添加ＲＰＭＩ １６４０媒体にて飼養した。ウィルス感染は、ウィルス培養液中で行った。インフルエンザＡ／ＰＲ／３４（ＰＲ８）及びＡ／ＷＳＮ／３３（ＷＳＮ）、サブタイプＨ１Ｎ１を用いた。試験したセンス及びアンチセンス鎖を表４に掲げる。

表４：ｓｉＲＮＡ配列

全てのｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，コロラド州）によって２′ＡＣＥ保護化学を用いて合成され、電気穿孔によって細胞に導入された。電気穿孔後６から８時間で、血清含有培養液を洗い流し、適切な感染倍数のＰＲ８又はＷＳＮウィルスが、ウェルに接種された。細胞は、１，０００ＰＦＵのウィルス（１，０００細胞当たり１ウィルス、ＭＯＩ＝０．００１）、又は１０，０００ＰＦＵのウィルス（１００細胞当たり１ウィルス、ＭＯＩ＝０．０１）のいずれかによって感染させた。室温で１時間インキュベーションした後、４μｇ／ｍｌのトリプシンを含む２ｍｌの感染培養液を各ウェルに加え、細胞をインキュベートし、表示の時間に、感染培養体から上清を採取し、ウィルス力価をニワトリ赤血球の凝集によって定量した。

上清を、感染の２４、３６、４８、及び６０時間後に採取した。ウィルス力価は、Ｋｎｉｐｅ ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ，ＰＭ，「基礎ウィルス学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３４−３５に記載する通り標準的血球凝集を用いて測定した。赤血球凝集アッセイは、Ｖ型底部９６ウェルプレートにて行った。各サンプルの連続２倍希釈液を、等量のニワトリ赤血球の０．５％懸濁液（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に氷上でインキュベートした。接着性の均一な赤血球層を含むウェルは陽性とした。プラークアッセイでは、各サンプルの連続１０倍希釈液について、従来技術においてよく知られるやり方で、「基礎ウィルス学」第４版３２ページに記載の通りにウィルス力価の定量を行った。

インフルエンザウィルス複製の抑制にｓｉＲＮＡを使用することの実行性を調べるために、種々のインフルエンザＡのＲＮＡを標的とした。具体的に言うと、簡単に感染されて、広くインフルエンザの実験に用いられるＭＤＣＫ細胞を用いた。

各ｓｉＲＮＡは、電気穿孔によってＭＤＣＫ細胞集団の中に個別に導入された。ＧＦＰ（センス：５′−ＧＧＣＵＡＣＧＵＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＵＵ−３′（配列番号１０７５２）；アンチセンス：５′−ＵＧＣＧＣＵＣＣＵＧＧＡＣＧＵＡＧＣＣＵＵ−３′（配列番号１０７５３））を標的とするｓｉＲＮＡを対照として用いた。このｓｉＲＮＡをＧＦＰ−９４９と呼ぶ。後続の実験において（下記の実施例に記載される）、両鎖の３′末端におけるオーバーハングは、ｄＴｄＴによって置換した。この置換は結果に影響を及ぼさない。模擬電気穿孔も対照として実施した。電気穿孔の８時間後、０．１又は０．０１のＭＯＩにおいてインフルエンザＡウィルスＰＲ８又はＷＳＮによって細胞を感染させ、その後、様々な時点（２４、３６、４８、６０時間）で標準的血球凝集アッセイを用いてウィルス産生について分析した。ＧＦＰ発現は、標準法によるフローサイトメトリーによって定量した。

図１１Ａ及び１１Ｂは、インフルエンザウィルスＡ株Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（図１１Ａ）、又はインフルエンザウィルスＡ株Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（図１１Ｂ）の複製を抑制する、個別のｓｉＲＮＡの能力を、ＨＡ力価を測定することによって定量した実験において、二つの結果を比較する。従って、高いＨＡ力価は、抑制の欠乏を示し、一方、低いＨＡ力価は効果的抑制を示す。ＭＤＣＫ細胞は、０．０１のＭＯＩにおいて感染させた。これらの実験において、試験したｓｉＲＮＡは、一つのｓｉＲＮＡはＰＢ１セグメント（ＰＢ１−２２５７／２２７７）を標的とし、一つのｓｉＲＮＡはＰＡセグメント（ＰＡ−２０８７／２１０７（Ｇ））を標的とし、三つの異なるｓｉＲＮＡは、ＮＰゲノム及び転写体（ＮＰ−２３１／２５１，ＮＰ−３９０／４１０、及びＮＰ−１４９６／１５１６）を標的とした。図１１Ａ及び１１Ｂの説明は、ｓｉＲＮＡの５′ヌクレオチドのみを掲載していることに注意されたい。

図１１Ａ及び１１Ｂの記号は下記の通りである：黒塗り四角は、ｓｉＲＮＡの導入を受けていない対照細胞を表す。白抜き四角は、ＧＦＰ対照ｓｉＲＮＡの導入を受けた細胞を表す。黒塗り円は、ｓｉＲＮＡ ＰＢ１−２２５７／２２７７の導入を受けた細胞を表す。白抜き円は、ｓｉＲＮＡ ＰＢ２−２２４０／２２６０の導入を受けた細胞を表す。白抜き三角は、ｓｉＲＮＡ ＰＡ−２０８７／２１０７（Ｇ）の導入を受けた細胞を表す。Ｘ記号は、ｓｉＲＮＡ ＮＰ−２３１／２５１の導入を受けた細胞を表す。＋記号は、ｓｉＲＮＡ ＮＰ−３９０／４１０の導入を受けた細胞を表す。黒塗り三角は、ｓｉＲＮＡ ＮＰ−１４９６／１５１６の導入を受けた細胞を表す。グラフにおいて、いくつかの記号が時に重なり合っていることに注意されたい。例えば、図１１Ｂでは、白抜き三角と黒塗り三角とが重なり合っている。

ｓｉＲＮＡ（模擬ＴＦ）が存在しない場合、又は、対照（ＧＦＰ）ｓｉＲＮＡの存在下では、ウィルス力価は、時間と共に増加し、感染後ほぼ４８から６０時間でピークに達する。一方、ｓｉＲＮＡの存在下では、その種類を問わず、ウィルス力価は６０時間後では有意に低くなった。例えば、ＷＳＮ株では、ＨＡ力価（ウィルスのレベルを反映する）は、ｓｉＲＮＡ ＰＢ２−２２４０又はＮＰ−２３１の存在下では、対照に比べほぼ半分の大きさであった。特に、両細菌株において、ｓｉＲＮＡ ＮＰ−１４９６の存在下では、ウィルスレベルは、検出レベル（１０，０００ＰＦＵ／ｍｌ）以下であった。このことは、ＰＢ８株では６０倍、及び、ＷＳＮ株では１２０倍を上回る係数の減少を表す。ウィルスのレベルはまた、ｓｉＲＮＡ ＰＡ−２０８７（Ｇ）の存在下では、ＷＳＮ株では検出限界（１０，０００ＰＦＵ／ｍｌ）以下となり、ＰＲ８株でも極端に低くなった。ｓｉＲＮＡによる、ウィルス産生の抑制は、測定した最も早い時点においても明白であった。検出レベル（ＨＡ力価で定量）以下の、ウィルス産生の抑制を含む効果的抑制は、感染後７２時間という長い時点においても観察された。

表５は、ＭＤＣＫ細胞において６０時間で見られたｓｉＲＮＡ抑制アッセイの結果を、抑制倍数で表してまとめたものである。従って、低い値は抑制の不足を示し、一方、高い値は、効果的抑制を示す。ウィルス遺伝子内のｓｉＲＮＡの位置は、遺伝子名に続く数字によって示される。本明細書の他の場所でもそうであるように、数字は、遺伝子におけるｓｉＲＮＡの開始ヌクレオチドを表す。例えば、ＮＰ−１４９６は、ＮＰに対して特異的なｓｉＲＮＡであって、最初のヌクレオチドが、ＮＰ配列のヌクレオチド１４９６からスタートするｓｉＲＮＡを示す。表示の数値（抑制倍数）は、模擬トランスフェクションにおける血球凝集単位を、表示のｓｉＲＮＡによるトランスフェクションにおいて得られる血球凝集単位で割ることによって計算される。数値１は抑制無しを表す。

インフルエンザウィルスゲノムの６セグメント（ＰＢ２、ＰＢ１、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ）を標的とする合計２０種のｓｉＲＮＡが、ＭＤＣＫ細胞系統システムにおいて試験された（表５）。試験したｓｉＲＮＡの内の約１５％（ＰＢ１−２２５７、ＰＡ−２０８７Ｇ、及びＮＰ−１４９６）は強力な作用を示した。即ち、使用したものがＰＲ８であれＷＳＮであれ、多くの場合ＭＯＩ＝０．００１において１００倍以上、ＭＯＩ＝０．０１において１６から６４倍ウィルス産生を抑制した。特に、ｓｉＲＮＡ ＮＰ−１４９６又はＰＡ−２０８７を用いた場合、抑制は極めて著明となり、培養液上清に検出可能な血球凝集活性が見られなかった。これらの強力なｓｉＲＮＡは、三つの異なるウィルス遺伝子セグメントを標的とする。即ち、ＲＮＡ転写酵素複合体に関与するＰＢ１とＰＡ、及び、核タンパクに結合する１本鎖ＲＮＡであるＮＰである。他のシステムにおける所見と一致して、これらのｓｉＲＮＡによって標的とされる配列は全て、コード領域の、３−プライム末端の比較的近傍に配置される（図１２）。

ｓｉＲＮＡの約４０％が、ウィルス産生を有意に抑制したが、抑制の程度は、いくつかのパラメータに依存して変動した。ｓｉＲＮＡの約１５％は、使用されたものがＰＲ８であるとＷＳＮウィルスであるとを問わず、ウィルス産生を強力に抑制した。しかしながら、いくつかのｓｉＲＮＡの場合、ＰＲ８又はＷＳＮのどちらを用いたのかに応じて抑制の程度が変動した。いくつかのｓｉＲＮＡ、例えば、ＰＢ２−２２４０、ＰＢ１−１２９、ＮＰ−２３１、及びＭ−３７は、ごく早期の時点で（感染後２４から３６時間）ウィルス産生を抑制するか、又は、比較的低い感染用量（ＭＯＩ＝０．００１）においてのみウィルス産生を抑制した。これらのｓｉＲＮＡは、異なるウィルスセグメントを標的とするが、対応配列は、コード領域の３−プライム末端、又は５−プライム末端近傍に位置する（図１２）。表５Ａ及び５Ｂは、アッセイの結果を表す。ｓｉＲＮＡの約４５％は、ウィルス力価に対し目立った作用を示さなかった。これは、これらのｓｉＲＮＡが、ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウィルス産生の干渉において有効ではなかったことを示す。特に、ＮＳ遺伝子セグメントを標的とする４種のｓｉＲＮＡはいずれも全く抑制作用を示さなかった。

更に正確にウィルス力価を推定するために、模擬トランスフェクション又はＮＰ−１４９６によるトランスフェクションを受けた、ウィルス感染細胞から得られた培養上清についてプラークアッセイを行った。模擬上清では約６×１０^５ｐｆｕ／ｍｌが検出されたが、一方、未希釈のＮＰ−１４９６上清ではプラークは全く検出されなかった（図１１Ｃ）。プラークアッセイの検出限界は約２０ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍｌなので、ＮＰ−１４９６によるウィルス産生の抑制は、少なくとも約３０，０００倍である。０．１ＭＯＩにおいても、ＮＰ−１４９６は、ウィルス産生を約２００倍抑制した。

ｓｉＲＮＡの効力を定量するために、段階量のＮＰ−１４９６をＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトさせ、次いで、ＰＲ８ウィルスを感染させた。ｓｉＲＮＡの量が低下するにつれて、培養上清におけるウィルス力価は、図１１Ｄに示すように上昇した。しかしながら、トランスフェクションのために僅か２５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを用いた場合でも、模擬トランスフェクションに比べ、ウィルス産生に約４倍の抑制が検出された。これは、インフルエンザウィルス産生の抑制におけるＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡの効力を示す。

治療のためには、ｓｉＲＮＡは、既存のウィルス感染を効果的に抑制可能であることが望ましい。典型的なインフルエンザウィルス感染では、感染後約４時間に新しいビリオンの放出が始まる。ｓｉＲＮＡが、既存の感染の存在下に、新たに放出されたウィルスによる感染を低下又は根絶することができるかどうかを定めるために、ＭＤＣＫ細胞をＰＲ８ウィルスに感染させ、次に、ＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡにトランスフェクトさせた。模擬トランスフェクション後では、ウィルス力価は、時間と共に着実に上昇したのに対し、他方、ＮＰ−１４９６トランスフェクト細胞では僅かしか上昇しなかった。上記から、ウィルス感染後のｓｉＲＮＡ投与は有効である。

以上まとめると、上記結果は、（ｉ）あるｓｉＲＮＡは、インフルエンザウィルス産生を強力に抑制することが可能である；（ｉｉ）インフルエンザウィルス産生は、例えば、ＮＰ、ＰＡ、及びＰＢ１タンパクをコードするものを含む、種々のウィルス遺伝子に対し特異的なｓｉＲＮＡによって抑制される；及び（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡ抑制は、以前に感染した細胞において起こるのみならず、ｓｉＲＮＡの投与と同時に、又は投与後に感染した細胞においても起こる。

実施例２：ウィルスＲＮＡポリメラーゼ又は核タンパクを標的するｓｉＲＮＡは、ニワトリ胚においてインフルエンザＡウィルス産生を抑制する。
材料及び方法
ｓｉＲＮＡ−オリゴフェクタミン複合体の形成及びニワトリ胚の接種。
ｓｉＲＮＡは前述の通りに調製した。鶏卵を標準条件下に維持した。３０μｌのオリゴフェクタミン（製品番号：１２２５２０１１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，現在Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を、３０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）と混合し、室温で５分インキュベートした。２．５ｎｍｏｌ（１０μｌ）のｓｉＲＮＡを、３０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉと混合し、希釈オリゴフェクタミンに加えた。このｓｉＲＮＡ及びオリゴフェクタミンを室温で３０分インキュベートした。１０日齢鶏卵に、ｓｉＲＮＡ−オリゴフェクタミン複合体を、１００μｌのＰＲ８ウィルス（５０００ｐｆｕ／ｍｌ）と共に接種した。この鶏卵を、表示の時間３７℃でインキュベートし、羊水を採取した。羊水におけるウィルス力価を、前述のようにＨＡアッセイで測定した。

結果
ＭＤＣＫ細胞における結果を確かめるために、ｓｉＲＮＡの、ニワトリ有精卵におけるインフルエンザウィルス産生の抑制能力についても定量した。鶏卵には電気穿孔を用いることができないので、インビトロにおいて、ＤＮＡオリゴヌクレオチドのみならず、ｓｉＲＮＡの細胞内取り込みを促進することが示されている脂質系介在因子、オリゴフェクタミンを用いた（２５）。手短に言うと、ＰＲ８ウィルス単独（５００ｐｆｕ）、又は、ウィルス、プラス、ｓｉＲＮＡ−オリゴフェクタミン複合体を、図１３Ａに模式的に示すように１０日齢の鶏卵の羊膜腔に注入した。１７時間後に羊水を採取し、血球凝集アッセイによってウィルス力価を測定した。図１３Ｂに示すように、ウィルスを単独注入した場合（オリゴフェクタミンの存在下に）、高いウィルス力価が容易に検出された。ＧＦＰ−９４９の共同注入は、ウィルス力価に有意な影響を及ぼさなかった。（オリゴフェクタミンを排除しても、ウィルス力価の有意な低下は観察されなかった）。

インフルエンザウィルスに対して特異的なｓｉＲＮＡを注入すると、ＭＤＣＫ細胞において観察されたものと一致する結果が示された。即ち、ＭＤＣＫ細胞においてインフルエンザウィルスの産生を抑制した、同じｓｉＲＮＡ（ＮＰ−１４９６、ＰＡ２０８７、及びＰＢ１−２２５７）が、鶏卵においてもウィルス産生を抑制したが、一方、ＭＤＣＫ細胞において比較的効果的でなかったｓｉＲＮＡ（ＮＰ−２３１、Ｍ−３７、及びＰＢ１−１２９）は、ニワトリ有精卵でも無効であった。上記から、ｓｉＲＮＡは、ニワトリ有精卵においてもインフルエンザウィルス産生の干渉において有効である。

実施例３：ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡレベルでインフルエンザウィルスの産生を抑制する。
材料及び方法
ｓｉＲＮＡ調製は、前述の通りに実行した。
ＲＮＡ抽出、逆転写、及びリアルタイムＰＣＲ．
１×１０^７ＭＤＣＫ細胞に対し、２．５ｎｍｏｌのＮＰ−１４９６を電気穿孔によって導入するか、又は、模擬電気穿孔（ｓｉＲＮＡ無し）した。８時間後、該細胞にＰＲ８ウィルスをＭＯＩ＝０．１で接種した。感染後、１、２、及び３時間後の時点で、上清を取り出し、細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ）で分解した。ＲＮＡを、メーカーの指示に従って精製した。２０μｌの反応混合液において、２００ｎｇの全体ＲＮＡ、特異的プライマー（下記参照）、及び、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、メーカーの指示に従って逆転写（ＲＴ）を３７℃で１時間実行した。ｍＲＮＡ、ＮＰ ｖＲＮＡ、ＮＰ ｃＲＮＡ、ＮＳ ｖＲＮＡ、又はＮＳ ｃＲＮＡそれぞれに対して特異的なプライマーは下記の通りである：
ｍＲＮＡ，ｄＴ_１８＝５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３′（配列番号１０７５４）
ＮＰ ｖＲＮＡ，ＮＰ−３６７：５′−ＣＴＣＧＴＣＧＣＴＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＧ−３′（配列番号１０７５５）
ＮＰ ｃＲＮＡ，ＮＰ−１５６５Ｒ：５′−ＡＴＡＴＣＧＴＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＧＴＡＴＴＴＴＴ−３′（配列番号１０７５６）
ＮＳ ｖＲＮＡ，ＮＳ−５２７：５′−ＣＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧ−３′（配列番号１０７５７）
ＮＳ ｃＲＮＡ，ＮＳ−８９０Ｒ：５′−ＡＴＡＴＣＧＴＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＧＴＧＴＴＴＴ−３′（配列番号１０７５８）。

１μｌのＲＴ反応混合液（即ち、逆転写を実行して得たサンプル）、及び配列特異的プライマーを用い、ＳＹＢＲグリーンＩ２本鎖ＤＮＡ結合染料を含むＳＹＢＲ緑色ＰＣＲマスターミックス（ＡＢ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるリアルタイムＰＣＲを実行した。ＰＣＲは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７０００配列検出システム（ＡＢ ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）においてサイクルを繰り返し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７０００ＳＤＳソフトウェア（ＡＢ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて分析した。ＰＣＲ反応は、５０℃で２分、９５℃で１０分、次に９５℃で１５秒、及び６０℃で１分を５０サイクルで行った。サイクル時間は、０．２蛍光単位の読み取り値で分析した。反応は全て二重に行った。二重標本の間で１．０を超える変動を示したサイクル時間は棄却した。次に、二重のサイクル時間を平均し、β−アクチンのサイクル時間をこの平均から引き、正規化値とした。

ＰＣＲプライマーは下記の通り。
ＮＰ ＲＮＡの場合、
ＮＰ−３６７：５′−ＣＴＣＧＴＣＧＣＴＴＡＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＧ−３′（配列番号１０７５５）
ＮＰ−４６０Ｒ：５′−ＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＣ−３′（配列番号１０７５９）
ＮＳ ＲＮＡの場合
ＮＳ−５２７：５′−ＣＡＧＧＡＣＡＴＡＣＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧ−３′（配列番号１０７５７）
ＮＳ−６１７Ｒ：５′−ＧＴＴＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＧＴＧ−３′（配列番号１０７６０）

結果
前述のように、インフルエンザウィルスの複製時、ｖＲＮＡは転写されてｃＲＮＡ及びｍＲＮＡを生成する。ｃＲＮＡは、更にｖＲＮＡ合成のための鋳型となり、ｍＲＮＡは、タンパク合成のための鋳型となる。ＲＮＡｉは、配列特異的なやり方でｍＲＮＡの分解に狙いを定めることが知られるが（１６から１８）、ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡも、ｓｉＲＮＡにとって標的となる可能性がある。なぜなら、インフルエンザウィルスＡのｖＲＮＡは、ヌクレアーゼに対し感受性を有するからである（１）。ｓｉＲＮＡの、各種ＲＮＡ分子の分解に及ぼす作用を調べるために、配列特異的プライマーによる逆転写、次いでリアルタイムＰＣＲを用いてｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びｍＲＮＡのレベルを定量した。図１５は、インフルエンザウィルスのｖＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＲＮＡの間の関係を示す。図１５に示すように、ｃＲＮＡは、ｖＲＮＡの正確な相補体であるが、ｍＲＮＡは、３′末端にポリＡ配列を含む。このポリＡ配列は、ｖＲＮＡセグメントの５′末端から、１５から２２ヌクレオチド下流の部位に対して相補的な部位から始まる。従って、ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡに比べて、ｍＲＮＡは、３′末端において１５から２２ヌクレオチドを欠く。この３つのウィルスＲＮＡ分子を区別するために、第１逆転写反応において、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ，及びｍＲＮＡに対して特異的なプライマーを用いた。ｍＲＮＡについては、ポリｄＴ１８をプライマーとして用いた。ｃＲＮＡの場合は、ｍＲＮＡから消えた、該ＲＮＡの３′末端に対して相補的なプライマーを用いた。ｖＲＮＡについては、プライマーは、ｖＲＮＡに対し相補的である限り、該ＲＮＡにそってほとんど任意の場所であってもよいが、５′末端にあまり近接しないものがよい。前記ＲＮＡのいずれか１つのみから転写されたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで増幅した。

インフルエンザウィルス感染後約４時間までに、新しいビリオンがパッケージされ、放出され始める。ｓｉＲＮＡの、ｍＲＮＡ及びｃＲＮＡ転写の第１波に及ぼす作用を定めるために、ＲＮＡを感染後早期に分離した。簡単に言うと、ＮＰ−１４９６を、ＭＤＣＫ細胞中に電気穿孔によって導入した。模擬電気穿孔（ｓｉＲＮＡ無し）も行った。６から８時間後、細胞に、ＰＲ８ウィルスをＭＯＩ＝０．１で感染させた。次に、細胞を、感染後１、２、及び３時間で分解し、ＲＮＡを分離した。各ＲＮＡ分子に対するプライマーによる逆転写、次いでリアルＰＣＲを実行することによって、ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡのレベルを定量した。

図１６は、模擬トランスフェクトされた、又は、ウィルス感染の約６−８時間前にｓｉＲＮＡ ＮＰ−１４９６によってトランスフェクトされた細胞において、ウィルスによる感染後の種々の時間において観察されるウィルスＮＰ、及びＮＳ ＲＮＡ分子の量を示す。図１６に示すように、感染１時間後では、ＮＰ ｓｉＲＮＡトランスフェクションが有った細胞、無かった細胞の間に、ＮＰ ｍＲＮＡの量に有意差は無かった。感染後早くも２時間後、模擬トランスフェクション群ではＮＰ ｍＲＮＡが３８倍上昇したのに対し、一方、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトさせた細胞では、ＮＰ ｍＲＮＡは全く上昇しなかった（或いは、低下すらしていた）。感染３時間後では、模擬トランスフェクションではｍＲＮＡ転写体レベルが上昇を続けているのに対し、ｓｉＲＮＡ処理を受けた細胞では、ＮＰ ｍＲＮＡ量の連続的低下が観察された。ＮＰ ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡは、模擬トランスフェクションにおけるｖＲＮＡ及びｃＲＮＡの量の増加が、感染３時間後にやっと目立つ程度になることを除いては類似のパターンを示した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、これは、恐らく、初回のｍＲＮＡ転写が、ｃＲＮＡ及び更にｖＲＮＡ合成の前に起こるインフルエンザウィルスのライフサイクルによるものと思われる。

上記結果は、血球凝集アッセイ又はプラークアッセイによって、生の、生きた細胞を測定して得た結果と同様、全てのＮＰ ＲＮＡ分子の量も、ＮＰ ｓｉＲＮＡによる処理によって有意に低下することを示した。ｓｉＲＮＡは主にｍＲＮＡの分解を仲介することが知られているけれども、この実験のデータは、ＮＰ ｃＲＮＡ及びｖＲＮＡのｓｉＲＮＡ介在性分解の可能性も排除しない。ただし、後述の結果は、ＮＰ ｍＲＮＡ低下によるＮＰタンパクレベルの減少が、ＮＰ ｃＲＮＡ及び／又はｖＲＮＡの安定性の低下をもたらすことを示唆する。

実施例４：ＲＮＡ干渉の標的の特定
材料及び方法
未修飾のｓｉＲＮＡの調製は前述の通りに実行した。センス又はアンチセンス鎖の一方、又は両方の各ヌクレオチド残基において、２′ヒドロキシル基が、２′−Ｏ−メチル基によって置換される、修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドも、Ｄｈａｒｍａｃｏｎによって合成された。修飾オリゴヌクレオチドは、未修飾オリゴヌクレオチドに関して前述した通りに脱保護され、相補鎖にアニールされた。ｓｉＲＮＡ二重鎖を、二重鎖形成の完全性についてゲル電気泳動によって分析した。

細胞培養、ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション、及びウィルスによる感染。
これらを事実上前述の通りに行った。簡単に言うと、修飾ＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡに関する実験では、先ず、ＭＤＣＫ細胞を、野生型（ｗｔ）及び修飾（ｍ）鎖から形成されたＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡ（２．５ｎｍｏｌ）でトランスフェクトし、８時間後、０．１のＭＯＩでＰＲ８で感染した。感染の２４時間後、培養上清のウィルス力価を定量した。Ｍ−３７ ｓｉＲＮＡに関わる実験では、ＭＤＣＫ細胞にＭ−３７ ｓｉＲＮＡ（２．５ｎｍｏｌ）をトランスフェクトし、０．０１のＭＯＩでＰＲ８を感染させ、感染後１、２、及び３時間においてＲＮＡ分離のために標本採取した。Ｍ−３７のセンス及びアンチセンス配列については表２を参照されたい。

ＲＮＡ抽出、逆転写、及びリアルタイムＰＣＲを事実上前述の通りに行った。逆転写のために用いた、ｍＲＮＡ、Ｍ−特異的ｖＲＮＡ，及びＭ−特異的ｃＲＮＡに対して特異的なプライマーは下記の通りであった：
ｍＲＮＡ，ｄＴ_１８＝５′−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３′（配列番号１０７５４）
Ｍ ｖＲＮＡ：５′−ＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＡＴＧＧ−３′（配列番号１０７６１）
Ｍ ｃＲＮＡ：５′−ＡＴＡＴＣＧＴＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＴＴＴＴＴ−３′（配列番号１０７６２）
Ｍ ＲＮＡ用のＰＣＲプライマーは下記の通りであった：
Ｍ順行：５′−ＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＡＴＧＧ−３′（配列番号１０７６１）
Ｍ逆行：５′−ＴＡＡＣＴＡＧＣＣＴＧＡＣＴＡＧＣＡＡＣＣＴＣ−３′（配列番号１０７６３）

結果
ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの外に、ｖＲＮＡ及び／又はｃＲＮＡに干渉する可能性を調べるために、センス（Ｓ，又は＋）、又はアンチセンス（ＡＳ，又は−）鎖を修飾したＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡを合成した。各ヌクレオチド残基において２′−ヒドロキシル基の代わりに２′−Ｏ−メチル基を置換させる修飾は、二重鎖形成の塩基対には影響することはないが、この修飾ＲＮＡ鎖はもはやＲＮＡ干渉を支持しない。言い換えると、センス鎖は修飾されたが、アンチ鎖は野生型（ｍＳ：ｗｔＡＳ）であるｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖に対して相補的な配列を有するＲＮＡの分解は支持するが、センス鎖に対して相補的な鎖の分解は支持しない。逆に、センス鎖が野生型であるが、アンチセンス鎖が修飾されているｓｉＲＮＡは（ｗｔＳ：ｍＡＳ）、センス鎖に対して相補的な配列を有するＲＮＡの分解は支持するが、センス鎖に対して相補的な配列を有するＲＮＡの分解は支持しない。

ＭＤＣＫ細胞に模擬トランスフェクトするか、又は、ＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。その際、ｓｉＲＮＡは、センス鎖（ｍＳ：ｗｔＡＳ）、又はアンチセンス鎖（ｗｔＳ：ｍＡＳ）のいずれか一方が修飾されており、他方は野生型であった。細胞はまた、両方の鎖が修飾されている（ｍＳ：ｍＡＳ）ＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトした。次に、細胞にＰＲ８ウィルスを感染させ、上清のウィルス力価を測定した。図１７Ａに示すように、高いウィルス力価が、模擬トランスフェクションを受けた培養液において検出された。予想通り、極めて低いウィルス力価が、野生型ｓｉＲＮＡ（ｗｔＳ：ｗｔＡＳ）によってトランスフェクトされた培養体において検出されたが、しかし、高いウィルス力価が、両鎖が修飾された（ｍＳ：ｍＡＳ）ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされた培養体に検出された。ウィルス力価は、アンチセンス鎖が修飾された（ｗｔＡＳ：ｍＡＳ）ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされた培養体では高く、一方、センス鎖だけが修飾された（ｍＳ：ｗｔＡＳ）ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトされた培養体では、ウィルス力価は低かった。どのようなものであれ、理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、インフルエンザウィルスの産生を抑制するのにｓｉＲＮＡ二重鎖の、野生型アンチセンス（−）鎖が必要であることは、ＲＮＡ干渉の標的は、ｍＲＮＡ（＋）又はｃＲＮＡ（＋）、又はその両方であると考える。

これらの可能性を更に区別するために、対応するｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡの蓄積に及ぼすｓｉＲＮＡの作用を調べた。同時に感染した細胞集団における転写を追跡するために、ｓｉＲＮＡトランフェクトＭＤＣＫ細胞を、感染の１、２、及び３時間後（新しいビリオンの放出及び再感染の起こる前に）にＲＮＡ分離のために採取した。先ず、ウィルスのｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡを、特異的プライマーによる逆転写によって独立にｃＤＮＡに変換した。次に、各ｃＤＮＡのレベルをリアルタイムＰＣＲによって定量した。図１７Ｂに示すように、Ｍ−特異的ｓｉＲＮＡ Ｍ−３７を用いると、感染後１又は２時間後ではＭ−特異的ｍＲＮＡはほとんど検出されなかった。感染後３時間では、Ｍ−３７無添加の場合は、Ｍ−特異的ｍＲＮＡは簡単に検出された。Ｍ−３７によってトランスフェクトされた細胞では、Ｍ−特異的ｍＲＮＡのレベルは約５０％低下した。一方、Ｍ−特異的ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡは、Ｍ−３７の存在によって抑制されなかった。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、上記結果は、恐らくウィルスｍＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ介在性干渉の標的であることを示唆する。

実施例５：あるｓｉＲＮＡの、ウィルスＲＮＡの蓄積に及ぼす作用
材料及び方法
ｓｉＲＮＡの調製は前述のように実行した。プライマーは、ｍＲＮＡ、ＮＰ ｖＲＮＡ、ＮＰ ｃＲＮＡ、ＮＳ ｖＲＮＡ、ＮＳ ｃＲＮＡ、Ｍ ｖＲＮＡ、又はＭ ｃＲＮＡのいずれかに対して特異的である。ＰＢ１ ｖＲＮＡ、ＰＢ１ ｃＤＮＡ、ＰＢ２ ｖＲＮＡ、ＰＢ２ ｃＲＮＡ、ＰＡ ｖＲＮＡ、又はＰＡ ｃＲＮＡに対して特異的であり、逆転写に使用されたプライマーは下記の通りであった：
ＰＢ１ ｖＲＮＡ：５′−ＧＴＧＣＡＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＣＧＡＡＴＧＧＴＴＣ−３′（配列番号１０７６４）
ＰＢ１ ｃＲＮＡ：５′−ＡＴＡＴＣＧＴＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＴＴＴ−３′（配列番号１０７６５）
ＰＢ２ ｖＲＮＡ：５′−ＧＣＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＡＡＴＧＴＧ−３′（配列番号１０７６６）
ＰＢ２ ｃＲＮＡ：５′−ＡＴＡＴＧＧＴＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＴＣＧＴＴＴ−３′（配列番号１０７６７）
ＰＡ ｖＲＮＡ：５′−ＧＣＴＴＣＴＴＡＴＣＧＴＴＣＡＧＧＣＴＣＴＴＡＧＧ−３′（配列番号１０７６８）
ＰＡ ｃＲＮＡ：５′−ＡＴＡＴＣＧＴＣＴＣＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡＡＧＧＴＡＣＴＴ−３′（配列番号１０７６９）
ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ ＲＮＡに対するＰＣＲプライマーは下記の通り。
ＰＢ１順行：５′−ＣＧＧＡＴＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＡＴＴＧＡＴＴＴＣ−３′（配列番号１０７７０）
ＰＢ１逆行：５′−ＧＡＣＧＴＣＴＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣ−３′（配列番号１０７７１）
ＰＢ２順行：５′−ＧＣＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＡＡＴＧＴＧ−３′（配列番号１０７６６）
ＰＢ２逆行：５′−ＡＡＴＣＧＣＴＧＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＧ−３′（配列番号１０７７２）
ＰＡ順行：５′−ＧＣＴＴＣＴＴＡＴＣＧＴＴＣＡＧＧＣＴＣＴＴＡＧＧ−３′（配列番号１０７６８）
ＰＡ逆行：５′−ＣＣＧＡＧＡＡＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＧ−３′（配列番号１０７７３）

結果
ＮＰ−１４９６は、ＮＰ遺伝子セグメントの分解を特異的に標的とするのか、或いは、ＮＰ以外の他のウィルスＲＮＡのレベルもまた影響を受けるのかどうかを決めるために、ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲのためにＮＳに対して特異的なプライマーを用い、前述のように種々のＮＳ ＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ，ｖＲＮＡ，ｃＲＮＡ）の量を測定した。図１８に示すように、ＮＳ ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡの変化は、ＮＰ ＲＮＡについて観察されたものと同じパターンを示した。感染後３時間では、模擬トランスフェクト細胞では、全てのＮＳ ＲＮＡ分子において著明な上昇が認められるのに対し、ＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡを導入された細胞では、ＮＳ ＲＮＡレベルに目立った変化は見られなかった。この結果は、異なるウィルスＲＮＡの転写及び複写も、少なくともＮＰ ＲＮＡに関して相互関連性に調節されていることを示す。相互関連性の調節とは、一つの転写体のレベルが、もう一つの転写体のレベルに、直接的又は間接的に影響を及ぼすことを意味する。特定の機構を意味するものではない。ＮＰ転写体がｓｉＲＮＡ処理によって分解されると、他のウィルスＲＮＡのレベルも抑えられる。

ＮＰ ｓｉＲＮＡの他のウィルスＲＮＡに対する作用を更に調べるために、全てウィルス遺伝子のものであるｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡの蓄積を、ＮＰ−１４９６によって処理された細胞において測定した。図１８Ａに示すように（上段パネル）、ＮＰ−特異的ｍＲＮＡは、感染１又は２時間後では低かった。感染３時間後、ＮＰ ｍＲＮＡは、ＮＰ−１４９６無添加では簡単に検出されたのに、一方、ＮＰ−１４９６の存在下では、ＮＰ ｍＲＮＡのレベルは、バックグラウンドレベルに留まったままだった。これは、ｓｉＲＮＡが、特異的ｍＲＮＡの蓄積を抑制することを示す。図１８Ａに示すように（中段及び下段パネル）、ＮＰ−特異的及びＮＳ−特異的ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡも、ＮＰ−１４９６の存在下に大きく抑制された。これらの結果は、前述の結果を裏付ける。更に、ＮＰ−１４９６処理細胞では、Ｍ、ＮＳ、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ遺伝子のｍＲＮＡ，ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡの蓄積もまた抑制された（図１８Ｂ、１８Ｃ，及び１８Ｄ）。更に、この広範な抑制作用は、ＰＡ−２０８７についても観察された。図１８Ｅ、１８Ｆ、及び１８Ｇにおける左側の上段、中段、及び下段パネルは、図１８Ａ，１８Ｂ、及び１８Ｃに示されたものと同じ結果を表示し、ＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡによるウィルスｍＲＮＡ転写の抑制、及びウィルスｖＲＮＡ及びｃＲＮＡ複製の抑制を示す。図１８Ｅ、１８Ｆ，及び１８Ｇの右側の上段、中段、及び下段パネルは、同じ濃度のＰＡ−２０８７ ｓｉＲＮＡを用いて行った同じ実験の結果を表す。図１８Ｅの、それぞれ、右側上段、中段、及び下段パネルに示すように、感染３時間後において、ＰＡ−２０８７無添加では、ＰＡ、Ｍ、及びＮＳ ｍＲＮＡは簡単に検出されるのに、一方、ＰＡ−２０８７が存在すると、ＰＡ、Ｍ、及びＮＳ ｍＲＮＡの転写は抑制された。図１８Ｆの、それぞれ、右側上段、中段、及び下段パネルに示すように、感染３時間後において、ＰＡ−２０８７無添加では、ＰＡ、Ｍ、及びＮＳ ｖＲＮＡは簡単に検出されるのに、一方、ＰＡ−２０８７が存在すると、ＰＡ、Ｍ、及びＮＳ ｖＲＮＡの蓄積は抑制された。図１８Ｇの、それぞれ、右側上段、中段、及び下段パネルに示すように、感染３時間後において、ＰＡ−２０８７無添加では、ＰＡ、Ｍ、及びＮＳ ｃＲＮＡは簡単に検出されるのに、一方、ＰＡ−２０８７が存在すると、ＰＡ、Ｍ、及びＮＳ ｃＲＮＡの蓄積は抑制された。更に、図１８Ｈは、ＮＰ−特異的ｓｉＲＮＡが、ＰＢ１−（上段パネル）、ＰＢ２−（中段パネル）、及びＰＡ−（下段パネル）特異的ｍＲＮＡの蓄積を抑制することを示す。

いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、ＮＰ ｓｉＲＮＡのこの広範な結果は、恐らく、ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡの結合及び安定化におけるＮＰの重要性の結果によるもので、ＮＰ−特異的ｓｉＲＮＡが、非特異的にＲＮＡ分解を標的とするためではないだろうと考える。インフルエンザウィルスのＮＰ遺伝子セグメントは、ｖＲＮＡとｃＲＮＡ両方に結合することが可能な１本鎖ＲＮＡ結合性核タンパクをコードする（図１４参照）。ウィルスのライフサイクルにおいて、ＮＰ ｍＲＮＡは最初に転写され、翻訳される。ＮＰタンパクの主要機能は、ＲＮＡ転写、複製、及びパッケージングのためにウィルスゲノムをカプシドの中に包み込むことである。ＮＰタンパクが無いと、ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡ両方の完全合成が大きく阻害される。ＮＰ ｓｉＲＮＡが、ＮＰ ＲＮＡの分解を誘発すると、ＮＰタンパクの合成が阻害され、十分なＮＰタンパクの欠損が生じ、これはその後他のウィルス遺伝子複製にも悪影響を及ぼす。このようにして、ＮＰ ｓｉＲＮＡは、ごく初期の段階においてウィルス産生を強力に抑制する。

感染細胞中のＮＰタンパク分子の数が、ｍＲＮＡ合成レベル、対、ゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡ）複製を調節すると仮定されている（１）。従来の研究は、ＮＰタンパクにおける温度感受性突然変異を用いて、ｃＲＮＡ合成は、インビトロでもインビボでも温度感受性であるが、ｍＲＮＡ合成はそうではないことを示した（７０，７１）。ＮＰタンパクは、発生期のｃＲＮＡ及びｖＲＮＡ転写体の伸長及び停止抵抗に必要であることが示された（７１，７２）。上に提示される結果から、ＮＰ特異的ｓｉ ＲＮＡは、感染細胞における全てのウィルスＲＮＡの蓄積を抑制することが示された。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、ＮＰ特異的ｓｉ ＲＮＡの存在下では、新たに転写されるＮＰ ｍＲＮＡが分解され、これが、ウィルス感染後のＮＰタンパク合成の抑制をもたらすと考えられる。新たに合成されるＮＰが無いために、更なるウィルス転写及び複製が、従って、新規ビリオンの産生が抑制される。

同様に、ＰＡ特異的の存在下では、新たに転写されるＰＡ ｍＲＮＡが分解され、これは、ＰＡタンパク合成の抑制をもたらす。インフルエンザビリオン当たり３０から６０コピーのＲＮＡ転写酵素が存在するにも拘わらず、新たに合成されるＲＮＡ転写酵素が無いと、新たな転写及び複製も抑制されるようである。同様の結果は、ＰＢ１に対して特異的なｓｉＲＮＡについても得られた。一方、基質（Ｍ）タンパクは、ウィルス感染の後期に至るまで必要とされない（１）。従って、Ｍ−特異的ｓｉＲＮＡは、Ｍ−特異的ｍＲＮＡの蓄積は抑制するが、ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ，又は他のウィルスＲＮＡは抑制しない。以上まとめると、上記所見は、インフルエンザウィルスＲＮＡの転写及び複製においては、新規合成の核タンパク及びポリメラーゼタンパクが必要不可欠であることを示す。ＮＰ−、ＰＡ−、及びＰＢ１−特異的ｓｉＲＮＡが、それを通じてｍＲＮＡ蓄積及び他のウィルスＲＮＡ転写に干渉する、ｍＲＮＡ−及びウィルス−特異的機構は、特にインフルエンザウィルス感染の強力な抑制因子であると考えられる。

実施例６：いくつかのｓｉＲＮＡによるインフルエンザウィルスＲＮＡ蓄積に対する広範な抑制は、インターフェロン反応、又はウィルス誘発ＲＮＡ分解によるものではない。
ＲＮＡレベルは、標準条件下にＰＣＲを用いて測定した。γ−アクチンＲＮＡの測定には下記のＰＣＲプライマーを用いた。
γ−アクチン順行：５′−ＴＣＴＧＴＣＡＧＧＧＴＴＧＧＡＡＡＧＴＣ−３′（配列番号１０７７４）
γ−アクチン逆行：５′−ＡＡＡＴＧＣＡＡＡＣＣＧＣＴＴＣＣＡＡＣ−３′（配列番号１０７７５）

前述のウィルスＲＮＡ蓄積に対する広範な抑制に関して可能な一つの原因は、ｓｉＲＮＡの存在下における感染細胞のインターフェロン反応である（２３、６５、６６）。このため、全てのα、β、及びω遺伝子を含む、全ＩＦＮ座位を欠失させたベロ細胞（６７，６８）（Ｑ．Ｇ．ａｎｄ Ｊ．Ｃ．未発表データ）において上記の実験を繰り返した。ＭＤＣＫ細胞の場合と全く同様に、ＮＰ−、Ｍ−、及びＮＳ−特異的ｍＲＮＡの蓄積は、全てＮＰ−１４９６によって抑制された（図１８Ｄ）。更に、β−アクチン、γ−アクチン、及びＧＡＰＤＨを含む、細胞遺伝子転写体のレベルに対するｓｉＲＮＡの作用を、ＰＣＲを用いて定量した。ｓｉＲＮＡの無添加又は添加において転写体レベルに有意差は検出されず、ｓｉＲＮＡの抑制作用は、ウィルスＲＮＡに対して特異的であることを示した。これらの結果は、いくつかのｓｉＲＮＡによるウィルスＲＮＡ蓄積の広範な抑制は、細胞インターフェロンの反応の結果ではないことを示す。

インフルエンザウィルスの感染後におけるｄｓＲＮＡの存在も、分解のためにＲＮＡを標的とする細胞経路を活性化する（２３）。この経路の活性化に及ぼすｓｉＲＮＡの作用を調べるため、我々は、該経路の最も重要な成分であるリン酸化タンパクキナーゼＲ（ＰＫＲ）のレベルを定量した（２３）。ウィルス感染無しで、ＮＰ−１４９６をＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトしても、活性化ＰＫＲのレベルは影響されなかった（データ示さず）。インフルエンザウィルスによる感染は、従来の研究（６５、６６、６９）と一致して、リン酸化ＰＫＲレベルの上昇をもたらさなかった。一方、上昇は、ＮＰ−１４９６添加又は無添加において同じであった（データ示さず）。以上から、ウィルスＲＮＡ蓄積の広範な抑制は、ｓｉＲＮＡ存在下におけるウィルス誘発性分解の強調によるものではない。

実施例７：マウスにおけるインフルエンザウィルス産生のｓｉＲＮＡによる抑制
本実験は、インフルエンザウィルスのＮＰ又はＰＡ転写体を標的とするｓｉＲＮＡの投与が、該投与がインフルエンザウィルスの感染前又は感染後のいずれに行われても、マウスにおいてインフルエンザウィルスの産生を抑制することを示す実験を記載する。該抑制は用量依存性で、それぞれ異なるインフルエンザウィルス遺伝子から発現された転写体を標的とする二つのｓｉＲＮＡを一緒に投与した場合、加重作用を示す。

材料及び方法
ｓｉＲＮＡ調製。
これは前述の通りに行った。
ｓｉＲＮＡ送達。
ｓｉＲＮＡ（３０又は６０μｇのＧＦＰ−９４９、ＮＰ−１４９６、又はＰＡ−２０８７）は、オリゴヌクレオチド陽イオンポリマートランスフェクション試薬、Ｎ／Ｐ比＝５用ｊｅｔＰＥＴ（登録商標）（Ｏｂｉｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州、カタログ番号ＧＤＳＰ２０１３０，Ｎ／Ｐは、ｊｅｔＰＥＩ／ｓｉＲＮＡ混合物におけるリン酸ヌクレオチド当たりの窒素数を指す）、又は、ポリＬ−リシン（ＭＷ（ｖｉｓ）５２，０００；ＭＷ（ＬＡＬＬＳ）４１，８００、Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｐ２６３６）と、５％グルコース溶液中で、室温で２０分インキュベートした。この混合物を、一群当たり４匹のマウスに対し、１匹につき２００μｌを、後眼窩静脈内に注入した。対照（未処置）マウスには、２００μｌの５％グルコースを注入した。マウスを、ｓｉＲＮＡ感染前又は鼻腔内感染前に、２．５％アベルチンによって麻酔した。

ウィルス感染。
Ｂ６マウス（標準的実験条件下に維持）を、ＰＲ８ウィルスによって鼻腔内感染させた。感染は、ウィルス含有バッファーを、ピペットにより、１匹のマウス当たり３０μｌ（１２，０００ｐｆｕ）をマウスの鼻腔に滴下することにより行った。

ウィルス力価の定量。
感染後種々の時点でマウスを屠殺し、肺を採取した。肺を細かく破砕し、ホモジェネートを凍結し、二度解凍しウィルスを放出させた。感染肺に存在するＰＲ８ウィルスは、ＭＤＣＫ細胞に感染させることによってその力価を測定した。平底９６ウェルプレートに、ウェル当たり３×１０^４個のＭＤＣＫ細胞を撒き、２４時間後、血清含有培養液を除去した。未希釈の、又は、１×１０^−１から１×１０^−７に希釈した、２５μｌの肺ホモジェネートを、三重のウェルに接種した。１時間のインキュベーション後、４μｇ／ｍｌのトリプシンを含む、１７５μｌの感染培養液を各ウェルに加えた。３７℃で４８時間のインキュベーション後、ウィルスの有無を、感染細胞の上清による、ニワトリＰＢＣの血球凝集に基づいて定量した。血球凝集定量は、Ｖ底９６ウェルプレートで実行した。上清の連続２倍希釈を、等量の０．５％（容量／容量）ニワトリ赤血球縣濁液（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混合し、氷上で１時間インキュベートした。赤血球の、接着性均一層を含むウェルは陽性と判定した。ウィルス力価は、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈの方法に従って、ウェルの５０％に感染した、希釈終末点（ＴＣＩＤ_５０）を内挿することによって求めた。従って、より低いＴＣＩＤ_５０は、より低いウィルス力価を反映する。任意の二つの群間のデータは、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって比較した。この検定は、本明細書に記載される実験全体を通じて有意性を評価するために用いられた。

図１９Ａは、ウィルスＮＰ転写体を標的とするｓｉＲＮＡは、感染前に投与されるとマウスにおけるインフルエンザウィルスの産生を抑制することを実証する実験結果を示す。材料及び方法で前述したように、３０又は６０μｇのＧＦＰ−９４９又はＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡをｊｅｔＰＥＩとインキュベートし、マウスに静注した。３時間後、マウスを、鼻腔を通じて、マウス当たり１２０００ｐｆｕのＰＲ８ウィルスで感染した。感染の２４時間後肺を採取した。図１９Ａに示すように、ｓｉＲＮＡ処置を受けなかったマウスにおける肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値（ＮＴ；黒塗り四角）、又は、ＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡを受容したマウス肺ホモジェネートの対応平均値（ＧＦＰ６０μｇ；白抜き四角）は４．２であった。ＮＰを標的とするｓｉＲＮＡ３０μｇ、及びｊｅｔＰＥＩであらかじめ処置されたマウスでは（ＮＰ３０μｇ；白抜き円）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は３．９であった。ＮＰを標的とする６０μｇのｓｉＲＮＡ、及びｊｅｔＰＥＩであらかじめ処置されたマウスでは（ＮＰ６０μｇ；黒塗り円）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は３．２であった。処置を受けなかった群と、６０μｇのＮＰ ｓｉＲＮＡを受容した群の間に見られる、この肺ホモジェネートのウィルス力価の差は、Ｐ＝０．０００２で有意であった。個別のマウスのデータは表６Ａに示す（ＮＴ＝処置無し）。

図１９Ｂは、ウィルスＮＰ転写体を標的とするｓｉＲＮＡは、陽イオンポリマーＰＬＬを含む組成物において感染前に静注されるとインフルエンザウィルスの産生を抑制することを示す、別の実験結果を示す。材料及び方法で前述したように、３０又は６０μｇのＧＦＰ−９４９又はＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡをＰＬＬとインキュベートし、マウスに静注した。３時間後、マウスを、鼻腔を通じて、マウス当たり１２０００ｐｆｕのＰＲ８ウィルスで感染した。感染の２４時間後肺を採取した。図１９Ｂに示すように、ｓｉＲＮＡ処置を受けなかったマウスにおける肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値（ＮＴ；黒塗り四角）、又は、ＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡを受容したマウス肺ホモジェネートの対応平均値（ＧＦＰ６０μｇ；白抜き四角）は４．１であった。ＮＰを標的とするｓｉＲＮＡ６０μｇ、及びＰＬＬであらかじめ処置されたマウスでは（ＮＰ６０μｇ；白抜き円）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は３．０であった。６０μｇのＧＦＰを受容した群と、６０μｇのＮＰ ｓｉＲＮＡを受容した群の間に見られる、この肺ホモジェネートのウィルス力価の差は、Ｐ＝０．０００１で有意であった。個別のマウスのデータは表６Ａに示す（ＮＴ＝処置無し）。これらのデータは、インフルエンザＮＰ転写体を標的とするｓｉＲＮＡは、ウィルス感染前に投与されると、肺におけるウィルス力価を下げることを示す。データはまた、ｓｉＲＮＡと陽イオン性ポリマーとの混合物は、流体力学的トランスフェクションを要することなく静注投与されることによって、肺におけるインフルエンザウィルスを効果的に抑制することを示す。

表６Ａ．陽イオン性ポリマーと併用されるｓｉＲＮＡによるマウスにおけるインフルエンザウィルス産生の抑制

図１９Ｃは、ウィルスＮＰ転写体を標的とするｓｉＲＮＡは、感染前に投与されると、マウスにおいてインフルエンザウィルスの産生を抑制することを示す第三の実験結果を示し、且つ、陽イオン性ポリマーの存在は、ｓｉＲＮＡの抑制効力を有意に増強することを実証する。材料及び方法で前述したように、６０μｇのＧＦＰ−９４９又はＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡをリン酸バッファー生食液（ＰＢＳ）又はｊｅｔＰＥＩとインキュベートし、マウスに静注した。３時間後、マウスを、鼻腔を通じて、マウス当たり１２０００ｐｆｕのＰＲ８ウィルスで感染した。感染の２４時間後肺を採取した。図１９Ｃに示すように、ｓｉＲＮＡ処置を受けなかったマウスにおける肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値（ＮＴ；白抜き四角）は４．１であり、一方、ＰＢＳに溶解したＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡを受容したマウスでは（ＧＦＰ ＰＢＳ；白抜き三角）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は４．４であった。ＰＢＳに溶解したＮＰを標的とするｓｉＲＮＡ６０μｇであらかじめ処置されたマウスでは（ＮＰ ＰＢＳ；黒塗り三角）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は４．２であり、処置無し、又は、ＧＦＰ標的ｓｉＲＮＡによる処置に比べ、ほんの僅かな効力の上昇を示した。ｊｅｔＰＥＩに溶解したＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ６０μｇであらかじめ処置されたマウスでは（ＧＦＰ ＰＥＩ；白抜き円）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は４．２であった。一方、ｊｅｔＰＥＩに溶解したＮＰを標的とするｓｉＲＮＡ６０μｇを受容したマウスでは（ＮＰ ＰＥＩ；黒塗り円）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は３．２であった。ＰＢＳに溶解したＧＦＰ ｓｉＲＮＡを受容した群と、ＰＢＳに溶解したＮＰ ｓｉＲＮＡを受容した群の間に見られる、この肺ホモジェネートのウィルス力価の差は、Ｐ＝０．０４で有意であった。一方、ｊｅｔＰＥＩと共にＧＦＰ ｓｉＲＮＡを受容した群と、ｊｅｔＰＥＩと共に、ＮＰ ｓｉＲＮＡを受容した群の間に見られる、この肺ホモジェネートのウィルス力価の差は、Ｐ＝０．００３で高度に有意であった。個別のマウスのデータは表６Ｂに示す（ＮＴ＝処置無し）。

表６Ｂ．ｓｉＲＮＡによる、マウスにおけるインフルエンザウィルス産生の抑制は、陽イオン性ポリマーによって効力の上昇を示す

更に、感染後のいろいろの時点において、ｓｉＲＮＡのインフルエンザウィルス産生の抑制能力を評価するために、感染の前後のいろいろな時点で投与して実験を行った。

１２０ｕｇのｓｉＲＮＡを、ウィルス感染の１２時間前に投与したことを除いては、前述の通りにｓｉＲＮＡを投与した。表６Ｃは、ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０として表した結果を示す。ＮＰ−処置を、対照群と比較した場合のＰ値は、０．０４９であった。

表６Ｃ

別の実験では、ｓｉＲＮＡ（６０ｕｇ）を、感染の３時間前に投与した。１５００ｐｆｕのＰＲ８ウィルスを鼻腔内に投与した。感染の４８時間後感染肺を採取した。表６Ｄは、ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０として表した結果を示す。ＮＰ−処置を、対照群と比較した場合のＰ値は、０．０３であった。

表６Ｄ

別の実験では、ｓｉＲＮＡ（１２０ｕｇ）を、ＰＲ８（１５００ｐｆｕ）感染の２４時間後に投与した。感染の５４時間後感染肺を採取し、ウィルス力価を測定した。表６Ｅは、ｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０として表した結果を示す。ＮＰ−処置を、対照群と比較した場合のＰ値は、０．０３であった。

表６Ｅ

他のポリマーも、効果的なｓｉＲＮＡ送達剤となることが示されている。図１９Ｄは、ＮＰを標的とするｓｉＲＮＡ（ＮＰ−１４９６）が、ポリ（ベータアミノエステル）（Ｊ２８）と共に静注されると、マウスにおいてインフルエンザウィルス産生を抑制することを示すプロットである。図１９Ｅは、ＮＰを標的とするｓｉＲＮＡ（ＮＰ−１４９６）が、ポリ（ベータアミノエステル）（Ｊ２８又はＣ３２）と共に腹腔投与されると、マウスにおいてインフルエンザウィルス産生を抑制することを示すプロットである。一方、対照ＲＮＡ（ＧＦＰ）は、有意な作用を持たない。実験は、ポリマーのｓｉＲＮＡに対する比が重量／重量比（例えば、６０：１ｗ／ｗ）であることを除いては、事実上前述の通り行った。ポリマーとｓｉＲＮＡは、混合し、１２，０００ｐｆｕのＰＲ８ウィルスによる鼻腔内感染の３時間前に、マウスに対し静脈内又は鼻腔内投与された。２４時間後、肺を採取し、ＨＡアッセイを実行した。Ｊ２８及びＣ３２に存在するアミン及びビス（アクリル酸エステル）モノマーは、米国特許出願番号第１０／４４６，４４４号に記載され、図示されている。このポリマーは、Ｒｏｂｅｒｔ Ｌａｎｇｅｒ博士の恵与による。

図２０は、異なるインフルエンザウィルス転写体を標的とするｓｉＲＮＡが加重作用を示すことを実証する実験結果を示す。６０μｇのＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡ、６０μｇのＰＡ−２０８７ ｓｉＲＮＡ、又は６０μｇのＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡ−２０８７ ｓｉＲＮＡを、材料及び方法で前述したように、ｊｅｔＰＥＩとインキュベートし、マウスに静注した。３時間後、マウスに、マウス当たり１２０００ｐｆｕのＰＲ８ウィルスを鼻腔内に注入した。図２０に示すように、ｓｉＲＮＡ処置を受けなかったマウスにおける肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値（ＮＴ；黒塗り四角）は４．２であった。ＮＰを標的とするｓｉＲＮＡ６０μｇを受容したマウスでは（ＮＰ６０μｇ；白抜き円）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は３．２であった。ＰＡを標的とするｓｉＲＮＡ６０μｇを受容したマウスでは（ＰＡ６０μｇ；白抜き三角）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は３．４であった。ＮＰを標的とするｓｉＲＮＡ６０μｇ＋ＰＡを標的とするｓｉＲＮＡ６０μｇを受容したマウスでは（ＮＰ＋ＰＡ；黒塗り円）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は２．４であった。処置を受けなかった群と、６０μｇのＮＰ ｓｉＲＮＡ、６０μｇのＰＡ ｓｉＲＮＡ，又は６０μｇのＮＰ ｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡ ｓｉＲＮＡを受容した群との間に見られる、この、肺ホモジェネートのウィルス力価の差は、それぞれ、Ｐ＝０．００３、０．０１、及び０．０００１で有意であった。６０μｇのＮＰ ｓｉＲＮＡ又は６０μｇのＮＰ ｓｉＲＮＡを受容した群と、６０μｇのＮＰ ｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡ ｓｉＲＮＡを受容した群の間に見られる、この、肺ホモジェネートのウィルス力価の差は、Ｐ＝０．０１で有意であった。個別のマウスのデータは表７に示す（ＮＴ＝処置無し）。これらのデータは、インフルエンザのＮＰ又はＰＡ転写体を標的とするｓｉＲＮＡによる前処置は、その後にインフルエンザウィルスによって感染されるマウスの肺においてウィルスを抑えることを示す。データは更に、異なるウィルス転写体を標的とする複数のｓｉＲＮＡの混合物は、加重作用を示すことを示す。これは、異なる転写体を標的とするｓｉＲＮＡの組み合わせは、等しい効力を実現するのに必要とされる単一ｓｉＲＮＡの量に比べ、各ｓｉＲＮＡの用量を低減させることが可能となることを示唆する。

表７：マウスにおけるインフルエンザウィルスに対するｓｉＲＮＡの加重作用

図２１は、ウィルスＮＰ転写体を標的とするｓｉＲＮＡは、感染後投与されると、マウスにおけるインフルエンザウィルスの産生を抑制することを示す実験結果を示す。マウスは、５００ｐｆｕのＰＲ８ウィルスによって鼻腔を通じて感染させた。６０μｇのＧＦＰ−９４９ ｓｉＲＮＡ、６０μｇのＰＡ−２０８７ ｓｉＲＮＡ、６０μｇのＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡ、又は６０μｇのＮＰ ｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡ ｓｉＲＮＡを、材料及び方法で前述したように、ｊｅｔＰＥＩとインキュベートし、５時間後マウスに静注した。ｓｉＲＮＡの投与の２８時間後、肺を採取した。図２１に示すように、ｓｉＲＮＡ処置を受けなかったマウスにおける肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値（ＮＴ；黒塗り四角）、又は、ＧＦＰ−特異的ｓｉＲＮＡを受容したマウスでは（ＧＦＰ；白抜き円）、同平均値は３．０であった。ＰＡを標的とするｓｉＲＮＡ６０μｇを受容したマウスでは（ＰＡ６０μｇ；白抜き三角）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は２．２であった。ＮＰを標的とするｓｉＲＮＡ６０μｇを受容したマウスでは（ＮＰ６０μｇ；白抜き三角）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は２．２であった。６０μｇ ＮＰ ｓｉＲＮＡ６０μｇ＋６０μｇ ＰＡ ｓｉＲＮＡ６０μｇを受容したマウスでは（ＰＡ＋ＮＰ；黒塗り円）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は１．８であった。処置を受けなかった群と、６０μｇのＰＡ ｓｉＲＮＡ、６０μｇのＮＰ ｓｉＲＮＡ，又は６０μｇのＮＰ ｓｉＲＮＡ＋６０μｇのＰＡ ｓｉＲＮＡを受容した群との間に見られる、この、肺ホモジェネートのウィルス力価の差は、それぞれ、Ｐ＝０．０９、０．０２、及び０．００３で有意であった。ＮＰ ｓｉＲＮＡを受容した群と、ＰＡ＋ＮＰ ｓｉＲＮＡを受容した群の間に見られる、この、肺ホモジェネートのウィルス力価の差は、０．２のＰ値を有していた。個別のマウスのデータは表８に示す（ＮＴ＝処置無し）。これらのデータは、インフルエンザのＮＰ及び／又はＰＡ転写体を標的とするｓｉＲＮＡは、ウィルス感染後に投与されると、肺におけるウィルス力価を下げることを示す。

表８．感染マウスにおけるインフルエンザウィルス産生の、ｓｉＲＮＡによる抑制

実施例８：ｓｈＲＮＡ産生用鋳型となるレンチウィルスの投与による、細胞におけるインフルエンザウィルス産生の抑制
ＮＰ−１４９６ａ ｓｈＲＮＡの合成用鋳型となるオリゴヌクレオチド（図２２Ａ参照）を、図２２Ａに模式的に描かれるように、レンチウィルスベクターｐＬＬ３．７のＵ６プロモーターと終止配列の間にクローンした（Ｒｕｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３３，ｐｐ．４０１−４０６，２００３）。オリゴヌクレオチドは、ｐＬＬ３．７のポリクローニング部位内のＨｐａＩとＸｈｏＩ制限部位との間に挿入された。このレンチウィルスはまた、トランスフェクトされた／感染した細胞の監視を簡単にするためにＥＧＦＰを発現する。レンチウィルスは、ＮＰ−１４９６ａ ｓｈＲＮＡ産生用鋳型、及びパッケージングベクターを含むＤＮＡベクターと共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることによって産生される。４８時間後、レンチウィルスを含む培養上清を収集し、４℃で２０００ｒｐｍで７分遠心し、０．４５ｕｍフィルターでろ過した。ベロ細胞は、２４ウェルプレートにおいてウェル当たり１×１０^５個撒いた。一晩培養後、挿入体を含む培養上清を、８ｕｇ／ｍｌのポリブレンの存在下にウェルに加えた。次に、プレートを２５００ｒｐｍで遠心し、室温で１時間放置し、培養に復帰した。感染の２４時間後、えられたベロ細胞系統（ベロ−ＮＰ−０．２５及びベロ−ＮＰ−１．０）を、親のベロ細胞（未感染）と共にフローサイトメトリーによって、ＧＦＰ発現について分析した。ＮＰ−１４９６ａは、センス部分の３′末端における添加ヌクレオチド（Ａ）、及び、アンチセンス部分の５′末端における相補的ヌクレオチド（Ｕ）の偶発的挿入によって、ＮＰ−１４９６のように１９では無く、２０ヌクレオチド長の二重鎖部分が得られるので、ＮＰ−１４９６とは異なることに注意しなければならない。（表２参照）。本発明の別の実施態様によれば、ＮＰ−１４９６ａ配列ではなく、ＮＰ−１４９６配列が使用される。更に、ＮＰ−１４９６ａ ｓｈＲＮＡのループ部分は、ＮＰ−１４９６ ｓｈＲＮＡのものとは異なる。

対照ベロ細胞、及び、挿入体を含むレンチウィルスに感染したベロ細胞（ベロ−ＮＰ−０．２５及びベロ−ＮＰ−１．０）を、ＭＯＩ０．０４、０．２、及び１においてＰＲ８ウィルスで感染させた。前述のように、感染４８時間後に、上清におけるインフルエンザウィルスの力価をＨＡアッセイによって定量した。

ＮＰ−１４９６ａ ｓｈＲＮＡの産生のための鋳型を含むレンチウィルスを、ベロ細胞におけるインフルエンザウィルス抑制能力について試験した。ＮＰ−１４９６ａ ｓｈＲＮＡは、前述のＮＰ−１４９６ａ ｓｉＲＮＡと同じ配列を持つ２本鎖部分を含むステムループ構造を形成することが可能な２本の相補的部分を含む。図２２Ｂに示すように、ベロ細胞とレンチウィルス含有上清を一晩インキュベートすると、ＥＧＦＰが発現し、レンチウィルスによるベロ細胞の感染を示した。影付き曲線は、対照細胞（未感染）における平均蛍光強度を表す。１ｍｌの上清を用いると、ほとんど全ての細胞がＥＧＦＰ陽性となり、平均蛍光強度は高くなった（１８１８）（ベロ−ＮＰ−１．０）。０．２５ｍｌの上清を用いると、大抵の細胞（∼９５％）がＥＧＦＰ陽性となるが、平均蛍光強度はより低かった（５０３）（ベロ−ＮＰ−０．２５）。

次に、親ベロ細胞及びレンチウィルス感染ベロ細胞を、ＭＯＩ０．０４、０．２、及び０．１でインフルエンザウィルスに感染させ、インフルエンザウィルス感染の４８時間後にウィルス力価を定量した。ＭＯＩを増していくと、親ベロ細胞培養体の上清におけるウィルス力価は上昇した（図２２Ｃ）。一方、ベロ−ＮＰ−１．０細胞培養体の上清ではウィルス力価はきわめて低いレベルに留まったままであった。これは、これらの細胞ではインフルエンザウィルス産生が抑制されることを示す。同様に、ベロ−ＮＰ−０．２５細胞培養体におけるインフルエンザウィルス産生も部分的に抑制された。このウィルス力価を表９に示す。上記結果は、レンチウィルスベクターを通じて発現されたＮＰ−１４９６ ｓｈＲＮＡは処理されてｓｉＲＮＡとなり、これが、ベロ細胞においてインフルエンザウィルスの産生を抑制することを示唆する。抑制の程度は、細胞当たりのウィルス感染の程度（ＥＧＦＰレベルによって示される）に比例するようである。

表９．培養細胞において発現されるｓｉＲＮＡによるインフルエンザウィルス産生の抑制

実施例９：ｓｉＲＮＡ前駆体が転写されるＤＮＡベクターの鼻腔内投与によるマウスにおけるインフルエンザウィルス産生の抑制
ＮＰ−１４９６ａ ｓｈＲＮＡが発現されるプラスミドの構築は上に述べた。ＮＰ−１４９６ａ ｓｈＲＮＡに関して前述し、且つ図２２Ａに模式的に示したように、ＰＢ１−２２５７ ｓｈＲＮＡ、又はＲＳＶ−特異的ｓｈＲＮＡの合成用鋳型として働くオリゴヌクレオチドを、レンチウィルスベクターｐＬＬ３．７のＵ６プロモーターと終止配列との間でクローンした。オリゴヌクレオチドの配列は下記の通りであった。

ＮＰ−１４９６ａセンス：
５′−ＴＧＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣ−３′（配列番号１０７７６）
ＮＰ−１４９６ａアンチセンス：
５′−ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＣＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＣＣＡ−３′（配列番号１０７７７）
ＰＢ１−２２５７センス
５′−ＴＧＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＣＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＣＴＴＴＴＴＴＣ−３′（配列番号１０７７８）
ＰＢ１−２２５７アンチセンス
５′−ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＣＡＴＴＧＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＣＡ−３′（配列番号１０７７９）
ＲＳＶセンス
５′−ＴＧＣＧＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＴＡＴＣＧＴＴＴＴＴＴＣ−３′（配列番号１０７８０）
ＲＳＶアンチセンス
５′−ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＴＡＴＣＧＣＡ−３′（配列番号１０７８１）

上記オリゴヌクレオチドを含むベクターを通じて発現されるＲＳＶ ｓｈＲＮＡは、インビボで処理されて、下記の配列を持つセンス及びアンチセンス鎖を有するｓｉＲＮＡを生成する：

センス：５′−ＣＧＡＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡ−３（配列番号１０７８２）
アンチセンス：５′−ＴＣＴＴＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＴＡＴＣＧ−３′（配列番号１０７８３）

下記のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＡ特異的ヘアピンが同様にして構築される。

ＰＡ−２０８７センス：
５′−ＴＧＣＡＡＴＴＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＡＡＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＣ−３′（配列番号１０７８４）
ＰＡ−２０８７アンチセンス：
５′−ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＡＴＴＧＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＴＣＡＡＴＴＧＣＡ−３′（配列番号１０７８５）

ＮＰ−１４９６ａ ｓｈＲＮＡ、ＰＢ１−２２５７ ｓｈＲＮＡ、又はＲＳＶ−特異的ＲＮＡの発現のための鋳型となるプラスミドＤＮＡ（それぞれ６０μｇ）を、個別に４０μｌのＩｎｆａｓｕｒｆ（ＯＮＹ，Ｉｎｃ．，Ａｍｈｅｒｓｔ，ニューヨーク州）及び２０μｌの５％グルコースと混合し、前述の通り、各群４匹のマウスから成るマウス群の鼻腔内に投与した。無処置（ＮＴ）群では、４０μｌのＩｎｆａｓｕｒｆと２０μｌの５％グルコースの混合物をマウスに投与した。これらのマウスに、前述のように、１３時間後、マウス当たり１２０００ｐｆｕのＰＲ８ウィルスを感染した。感染１２時間後、肺を採取し、ウィルス力価を定量した。

ＤＮＡベクターを通じて発現されるｓｈ ＲＮＡのマウスにおけるインフルエンザウィルス感染を抑制する能力を試験した。この実験のために、プラスミドＤＮＡをＩｎｆａｓｕｒｆと混合した。Ｉｎｆａｓｕｒｆは、ビヒクルと近似し、従来から肺における遺伝子転送を促進することが知られる、ウシ胎児肺から得られた天然上清抽出物である（７４）。このＤＮＡ／Ｉｎｆａｓｕｒｆの混合物を、ピペットを用いて鼻腔に滴下することによってマウスに導入した。１３時間後、マウスを、マウス当たり１２０００ｐｆｕのＰＲ８ウィルスで感染した。インフルエンザウィルス感染の２４時間後、肺を採取し、ＭＤＣＫ／血球凝集アッセイにてウィルス力価を定量した。

図２３に示すように、プラスミドＤＮＡを全く与えられなかったマウス、又は、呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）特異的ｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡベクターを与えられたマウスでは、ウィルス力価が高かった。マウスに、ＮＰ−１４９６ ｓｈＲＮＡ又はＰＢ１−２２５７ ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡを与えた場合、より低いウィルス力価が観察された。マウスに、両方のインフルエンザ特異的プラスミドＤＮＡ、即ち、一方は、ＮＰ−１４９６ａ ｓｈＲＮＡを発現し、他方はＰＢ１−２２５７ ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡを一緒に与えると、ウィルス力価は更に有意に減少した。
処置を受けなかった（ＮＴ；白抜き四角）マウス、又は、ＲＳＶ−特異的ｓｈＲＮＡをコードするプラスミドを受容したマウス（ＲＳＶ；黒塗り四角）では、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は４．０又は４．１であった。ＮＰ−１４９６ａ ｓｈＲＮＡの鋳型となるプラスミドを受容したマウス（ＮＰ；白抜き円）では、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は３．４であった。ＰＢ１−２２５７ ｓｈＲＮＡの鋳型となるプラスミドを受容したマウス（ＰＢ；白抜き三角）では、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は３．８であった。ＮＰ及びＰＢ ｓｈＲＮＡの鋳型となるプラスミドを受容したマウス（ＮＰ＋ＰＢ１；黒塗り円）では、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は３．２であった。処置を全く受けなかった群、又はＲＳＶ−特異的プラスミドを受容した群と、ＮＰ ｓｈＲＮＡプラスミド、ＰＢ１ ｓｈＲＮＡプラスミド、又はＮＰ及びＰＢ１ ｓｈＲＮＡプラスミドを受容した群との間に見られた肺ホモジェネートのウィルス力価の差は、それぞれ、０．０４９、０．１２４、及び０．００４のＰ値を有していた。個別のマウスのデータを表１０に示す（ＮＴ＝無処置）。これらの結果は、ＤＮＡベクターを通じて発現されるｓｈＲＮＡは処理されてｓｉＲＮＡに変換され、マウスにおけるインフルエンザウィルスの産生を抑制することを示し、且つ、Ｉｎｆａｓｕｒｆが、ｓｈＲＮＡが発現されるプラスミドの輸送にとって好適なビヒクルであることを実証する。特に、これらのデータは、インフルエンザＮＰ及び／又はＰＢ１点車体を標的とするｓｈＲＮＡが、ウィルス感染後に投与されると肺のウィルス力価を下げることを示す。

表１０．マウスにおいて発現されたｓｈＲＮＡによるインフルエンザウィルス産生の抑制

実施例１０Ａ：ｓｉＲＮＡの血管系又は気道輸送による肺のルシフェラーゼ活性の抑制
ｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから入手し、前述のように脱保護し、アニールした。ＮＰ（ＮＰ−１４９６）、ＰＡ（ＰＡ−２０８７）、ＰＢ１（ＰＢ１−２２５７）に対するｓｉＲＮＡ配列は前述した通り。Ｌｕｃ−特異的ｓｉＲＮＡは、（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，ＡＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１８：３８−３９）に記載される通りである。

ｐＣＭＶ−ｌｕｃ ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、窒素／リン酸モル比（Ｎ／Ｐ比）１０においてＰＥＩ（Ｏｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｅｂａｄ，カリフォルニア州）と室温で２０分混合した。静脈内投与の場合、６０μｇのＤＮＡを含む、２００μｌの混合物を、８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）眼窩後部に注入した。気管内（ｉ．ｔ．）投与の場合、３０μｇ又は６０μｇのＤＮＡを含む５０μｌの混合物を、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍｏｄｅｌ ＩＡ−ＩＣ吸入器を用いて麻酔下のマウスの肺に投与した。

ｓｉＲＮＡ−ＰＥＩ組成物は、６０μｇのｌｕｃ−特異的、又はＧＦＰ−特異的ｓｉＲＮＡを、ｊｅｔＰＥＩとＮ／Ｐ比５において、室温で２０分混合することによって形成した。静脈内投与の場合、表示量のｓｉＲＮＡを含む２００μｌの混合物を、眼窩後部に注入した。肺内投与の場合、５０μｌを気管内に送達した。

ｐＣＭＶ−ｌｕｃ ＤＮＡ投与後の様々な時点で、肺、脾臓、肝臓、心臓、及び腎臓を採取し、細胞溶解剤（Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，オレゴン州）中で均一となるまで破砕した。発光は、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって分析し、Ｏｐｔｏｃｏｍｐ（登録商標）Ｉ ルミノメーター（ＭＧＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈａｍｄｅｎ，コネチカット州）によって測定した。ホモジェネートにおけるタンパク濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定した。

マウスにおけるＰＥＩ−仲介核酸輸送の組織分布を決定するために、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を静注し、２４時間後、各種器官についてＬｕｃ活性を測定した。活性は肺において最も高く、Ｌｕｃ活性は少なくとも４日間検出されたが、一方、心臓、肝臓、脾臓、及び腎臓では、レベルは１００から１０００倍低く、注入後に検出される時間はより短かった。ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を気管内に滴下すると、この場合も肺に著明なｌｕｃ活性が検出されたが、静脈投与後よりも低いレベルであった。

ＰＥＩが、静脈内投与後、肺によるｓｉＲＮＡの取り込みをどれだけ促進することが可能なのかを試験するため、マウスに先ずｐＣＭＶ−ｌｕｃ ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を気管内投与によって与え、次いで、ＰＥＩと複合体を形成するＬｕｃ−特異的ｓｉＲＮＡ、ＰＥＩと複合体を形成する、対照のＧＦＰ−特異的ｓｉＲＮＡ、又は、同じ容量の５％グルコースを静注した。２４時間後、Ｌｕｃ ｓｉＲＮＡを受容したマウスでは、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡを与えられたマウス、又は無処置のマウスよりも、Ｌｕｃ活性が１７倍低かった。Ｌｕｃ ｓｉＲＮＡは、ＤＮＡベクターによってトランスフェクトされた同じ肺細胞においてのみＬｕｃ発現を抑制することが可能なので、上記結果は、ｓｉＲＮＡ−ＰＥＩ混合物の静注は、肺における標的転写体の効果的な抑制を実現することを示す。

ＰＥＩが、肺内投与後、肺によるｓｉＲＮＡの取り込みをどれだけ促進することが可能なのかを試験するため、マウスに先ずｐＣＭＶ ＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を静注し、次いで、ＰＥＩと混合されるＬｕｃ−特異的ｓｉＲＮＡ、ＰＥＩと混合される対照のＧＦＰ−特異的ｓｉＲＮＡ、又は、同じ容量の５％グルコースを気管内投与した。２４時間後、ルシフェラーゼ活性を肺ホモジェネートにおいて定量した。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡによって処置されたマウスでは、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡで処置されたマウスよりも、Ｌｕｃ活性が６．８倍低かった。これらの結果は、ｓｉＲＮＡ−ＰＥＩ混合物の肺内投与は、肺細胞における標的転写体の効果的な抑制を実現することを示す。

実施例１０Ｂ：ｓｉＲＮＡの呼吸器系輸送による、肺のシクロフィリンＢの抑制
シクロフィリンＢは、哺乳類において広く発現される内因性遺伝子である。呼吸器系に直接輸送されるｓｉＲＮＡが、内因性遺伝子の発現をどれだけ抑制することが可能なのかを評価するため、交雑系Ｂｌａｃｋｓｗｉｓｓマウス（約３０ｇ又はそれ以上の体重）を、イソフルオラン／酸素で麻酔し、シクロフィリンＢを標的とするｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｄ−００１１３６−０１−２０ ｓｉＣＯＮＴＲＯＬシクロフィリンＢ ｓｉＲＮＡ（ヒト／マウス／ラット））、又は対照のＧＦＰ−９４９ ｓｉＲＮＡ（２ｍｇ／ｋｇ）を、各ｓｉＲＮＡについて２匹のマウスから成る群に対して鼻腔内投与した。投与２４時間後肺を採取した。肺からＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーを用いて逆転写を行った。次に、シクロフィリンＢ及びＧＡＰＤＨ Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてリアルタイムＰＣＲを実行した。結果（表１１−１）は、シクロフィリンＢを標的とするｓｉＲＮＡによってシクロフィリンＢの７０％が沈黙化されることを示した。

表１１：肺におけるシクロフィリンＢの抑制

表１１−２：ＮＰ遺伝子における標的部分

実施例１１：生のｓｉＲＮＡの呼吸器系への直接輸送によるインフルエンザウィルスの抑制
材料及び方法
ｓｉＲＮＡの調製、ウィルス感染、肺の採取、及びインフルエンザウィルス力価の定量は前述のように行った。マウスをイソスフルオラン（吸引投与）にて麻酔した。ｓｉＲＮＡは、５０μｌの容量として鼻腔内滴下によって輸送した。ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定を用いて計算した。

結果
リン酸バッファー生食液（ＰＢＳ）に溶解したｓｉＲＮＡ（ＮＰ−１４９６）を、マウスの群（群当たりマウス５匹）に投与した。ｓｉＲＮＡ投与の３時間後、インフルエンザウィルス（２０００ＰＦＵ）で感染した。感染２４時間後肺を採取し、ウィルス力価を測定した。予備実験において、マウスをアベルチンで麻酔し、２ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを、鼻腔内滴下によって投与した。対照と比べた場合のウィルス力価の低下が観察された。ただし、その差は統計的有意なレベルに達しなかった（データ示さず）。

第２の実験では、ＢｌａｃｋＳｗｉｓｓマウスを、イソフルオラン／Ｏ_２を用いて麻酔した。種々のｓｉＲＮＡ量のＰＢＳ液をマウスに対し、各マウス５０μｌずつ鼻腔内投与した。三つの異なる群（１群当たり５匹のマウス）に対し、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ用量のｓｉＲＮＡのＰＢＳ溶液を、鼻腔内滴下によって与えた。ＰＢＳのみを与えた第４群を対照とした。３時間後、マウスを再びイソフルオラン／Ｏ_２を用いて麻酔し、３０ｕｌのＰＲ８ウィルス（２０００ｐｆｕ＝４×致死量）を該マウスに鼻腔内投与した。感染の２４時間後、マウスの肺を採取し、均一に破砕し、前述のようにＴＣＩＤ_５０を評価することによってウィルス力価を測定した。肺ホモジェネートについて、１０倍希釈ではなく、連続５倍希釈を行った。

三つの処置群それぞれにおけるマウス、及び対照の間には、ウィルス力価において、有意で、且つ用量依存性の差が見られた（表１２）。対照と比較した場合の、ウィルス力価の低下は、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇを受容した群において、それぞれ、３．４５倍（ｐ＝０．０１２５）、４．１６倍（ｐ＝０．００６３）、及び４．６２倍（ｐ＝０．００５７）であった。

以上まとめると、上記結果は、輸送を強化する特別な仲介剤が無くとも、水性媒体に溶解されて呼吸器系に輸送されたｓｉＲＮＡが効力を持つことを実証する。

表１２：生のｓｉＲＮＡの鼻腔内輸送は、インフルエンザウィルス生産を抑制する

実施例１２：呼吸器系に対する生のｓｉＲＮＡの直接輸送によるマウスにおけるインフルエンザウィルス生産の抑制
本実施例は、前述の結果を確認し、且つ、輸送強化剤無添加で、水性媒体に溶解したＮＰ標的ｓｉＲＮＡの呼吸器系投与によって、肺のインフルエンザウィルスの生産が抑制されることを示す。ＰＢＳに溶解した、６μｇ、１５ｕｇ、３０μｇ、及び６０μｇのＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡ、又は６０μｇのＧＦＰ−９４９ ｓｉＲＮＡを、ほぼ前述の通りにマウスに対し鼻腔内に滴下した。ただし、前述と異なるのは、ｓｉＲＮＡ輸送の２時間後に、マウス当たり１０００ｐｆｕのＰＲ８ウィルスを鼻腔内投与してマウスを感染した。感染の２４時間後肺を採取した。ＮＰ−特異的ｓｉＲＮＡは、輸送剤が無くとも、水性媒体に溶解された状態で鼻腔内滴下によって投与されてもインフルエンザ抑制に有効であった。三つの処置群のそれぞれと対照との間には、ウィルス力価において、有意で、用量依存性の差が見られた（表１３）。

表１３：生のｓｉＲＮＡによる肺のインフルエンザウィルス生産の抑制

実施例１３：修飾されたｓｉＲＮＡは、効果的沈黙化を仲介する
修飾されたヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡの沈黙化能力を探るために、センス及びアンチセンス鎖を含むＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡであって、各鎖において交互のリボヌクレオチドに２′−Ｏ−メチル修飾を含むｓｉＲＮＡを合成し、ＮＰ−１４９６ｓｉＲＮＡの未修飾体と比較して調べた。２′−Ｏ−メチル修飾ＮＰ１４９６ ｓｉＲＮＡ配列は下記の通りであった（２′−Ｏ−メチルは、修飾されたヌクレオチドの前の”ｍ”として示される）：

センス：５′−ＧｍＧＡｍＵＣｍＵＵｍＡＵｍＵＵｍＣＵｍＵＣｍＧＧｍＡＧｄＴｄＴ−３′（配列番号１０７９２）
アンチセンス：５′−ｍＣＵｍＣＣｍＧＡｍＡＧｍＡＡｍＡＵｍＡＡｍＧＡｍＵＣｍＣｄＴｄＴ−３′（配列番号１０７９３）

この２′−Ｏ−メチル修飾ＮＰ１４９６ ｓｉＲＮＡ、及び未修飾のＮＰ１４９６ ｓｉＲＮＡを、２４ウェルプレートにおいて、メーカーの指示に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてベロ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、培養液を吸引した。この細胞に、２００μｌのＰＲ８ウィルスをＭＯＩ０．１で接種した。感染の２４、３６、及び４８時間後、培養上清を収集した。ウィルス力価を前述の通りに定量した。結果を表１４に示す。

表１４：ｓｉＲＮＡ修飾体によるインフルエンザウィルス生産の効果的抑制

実施例１４：呼吸器系に対する生のｓｉＲＮＡの経口気管輸送によるインフルエンザウィルスの抑制
ｓｉＲＮＡの調製、ウィルス感染、肺採取、及びインフルエンザウィルス力価の定量は前述のように行った。マウスは、アベルチン（腹腔注入によって投与）を用いて麻酔した。１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを、１７５μｌの容量として経口気管注入によって輸送した。

ｓｉＲＮＡ（ＮＰ−１４９６）、１ｍｇ／ｋｇ、及び、５％グルコースに溶解した３０ｕｌのＩｎｆａｓｕｒｆを、マウスの群（１群当たり５匹のマウス）に投与した。マウスを、ｓｉＲＮＡ投与の３時間後、インフルエンザウィルス（２０００ＰＦＵ）で感染した。感染の２４時間後肺を採取し、ウィルス力価を測定した。

第２の実験では、ＢｌａｃｋＳｗｉｓｓマウスを、アベルチンを腹腔投与することによって麻酔した。マウスに対し、ＰＢＳに溶解したＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡ及びＧＦＰ−９４９ ｓｉＲＮＡを、それぞれ５０μｌずつ気管内に投与した。ＰＢＳのみを与えた第３群をコントロールとした。３時間後、マウスを再びイソフルオラン／Ｏ_２を用いて麻酔し、３０ｕｌのＰＲ８ウィルス（２０００ｐｆｕ＝４ｘ致死量）を該マウスに鼻腔内投与した。感染の２４時間後、マウスの肺を採取し、均一に破砕し、前述のようにＴＣＩＤ_５０を評価することによってウィルス力価を測定した。肺ホモジェネートについて、１０倍希釈ではなく、連続５倍希釈を行った。

以上まとめると、上記結果は、輸送を強化する特別な仲介剤が無くとも、水性媒体に溶解されて呼吸器系に輸送されたｓｉＲＮＡが効力を有することを実証する。

実施例１５：広範なインフルエンザウィルス類を標的とするｓｉＲＮＡを選択するためのヌクレオチド突然変異認容実験
本実施例は、そのアンチセンス鎖が、抑制領域内の標的転写体に対し（例えば、標的転写体に対して相補的な１９塩基対領域内において）１００％未満の相補性を有するｓｉＲＮＡでも効果的な沈黙化を仲介することを示す。結果は、本明細書に記載されるＲＮＡｉ因子は、広範囲のインフルエンザ株を、たとえその配列が標的部分のＰＲ８から変動するものであっても効果的に抑制することを実証する。

二重ルシフェラーゼアッセイを用い、１９ヌクレオチド抑制領域内において、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖に対し１００％相補的ではないインフルエンザウィルスであっても、該ｓｉＲＮＡがその発現を抑制することができるかどうかを評価した。ヒト及びニワトリインフルエンザ株を整列させて得られるミスマッチ（ＰＲ８を標準として用いた）を、部位指向性突然変異キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＤＮＡベクター（ｐｓｉＣＨＥＣＫ）に導入した。即ち、インフルエンザ標的部位が、一種以上のヒト又はニワトリインフルエンザウィルス株に認められる差異に相当する特異的差異と一致する１個又は２個の差異を、ＰＲ８配列に対して含むように修飾された。

表１５は、ウィルスのＮＰ標的（ＮＰ−１４９６の標的）における変動は、ＲＮＡｉ活性をほとんど下げないことを実証する実験結果を示す。（掲げたデータは、３重観測値の平均である）。アンチセンス鎖の５′又は３′末端近傍、又は中央付近の位置におけるミスマッチは調べなかった。

表１５：アンチセンス鎖及び標的領域間ミスマッチのＮＰ−１４９６による沈黙化に及ぼす作用

ウィルスのＰＡ標的（ＰＡ−２０８７又はＰＡ−８２８２の標的）における変動は、ＲＮＡｉ活性をほとんど下げない。１５７のヒトインフルエンザウィルス株の内７株に認められたＧ１８からＡ１８への突然変異は、ＲＮＡ干渉活性に実質的な影響を及ぼした。アンチセンス鎖の５′又は３′末端近傍、又は中央付近の位置におけるミスマッチは調べなかった。アンチセンス鎖の抑制領域と標的の間に２個のミスマッチがあると、沈黙化は約７０から７５％低下したが、それでも有用な程度の沈黙化は依然として観察された（表１６）。

表１６：アンチセンス鎖及び標的領域間ミスマッチのＰＡ−２０８７又はＰＡ−８２４２による沈黙化に及ぼす作用

表１７は、ウィルスのＰＢ２標的（ＰＢ２−３８１７の標的）における変動は、ＲＮＡｉ活性をほとんど下げないことを実証する実験結果を示す。（掲げたデータは、３重観測値の平均である）。

表１７：アンチセンス鎖及び標的領域間ミスマッチのＰＢ２−３８１７による沈黙化に及ぼす作用

表１８は、ウィルスのＰＢ１標的（ＰＢ１−６１２４の標的）における変動は、ＲＮＡｉ活性をほとんど下げないことを実証する実験結果を示す。（掲げたデータは、３重観測値の平均である）。アンチセンス鎖の５′又は３′末端近傍、又は中央付近の位置におけるミスマッチを調べた。アンチセンス鎖の抑制領域と標的の間に２個のミスマッチがあると沈黙化は約７０から７５％低下したが、それでも有用な程度の沈黙化は依然として観察された。

表１８−１：アンチセンス鎖及び標的領域間ミスマッチの、ＰＢ１−６１２４による沈黙化に及ぼす作用

表１８−２：アンチセンス鎖及び標的領域間ミスマッチのＰＢ１−６１２９による沈黙化に及ぼす作用

上記の表に示した結果の外に、本実施例は更に、本発明の１０個の例示のｓｉＲＮＡ二重鎖が、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列と、ウィルス転写体の標的領域のヌクレオチド配列との間の複数のミスマッチを耐忍することを示す。本実施例では、２１個の以前に特定されたｓｉＲＮＡについて、標的配列の突然変異を耐忍する能力が定量された。このことを実行するために、全てのヒト及びニワトリインフルエンザ遺伝子配列（ｗｗｗ．ｌａｎ１．ｆｌｕ．ｇｏｖｕから入手可能）の標的部位を、ＰＲ８株を参照に用いて配列させた。一塩基多型（ＳＮＰ）を特定し、これを部位指向性突然変異法を用いて二重ルシフェラーゼリポーター構築体に導入した。次に、対照配列（ＰＲ８）、又は変異体を含む発現ベクターを、５０ｎＭの適切な標的ｓｉＲＮＡと共にベロ細胞にトランスフェクトし、各ｓｉＲＮＡの、ヌクレオチドミスマッチを耐忍する能力を定量した。

２１個のｓｉＲＮＡの内、１０個のｓｉＲＮＡは、高度の沈黙化（沈黙化％）を示し、標的部位多型に対して極めて寛容であった。表１９は、１０個のｓｉＲＮＡに関するパーセント沈黙化データをまとめたものである（ＩＮＦｓｉ−１からＩＮＦｓｉ−８まで、及びＧ１４９９及びＧ４２７６）。各ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列が示され、部位指向性突然変異法の標的とされるヌクレオチドが、ボールド体で表示され、下線が引かれる。「ミスマッチ」コラムは、ｓｉＲＮＡ内部の元のヌクレオチド、及び括弧でくくったその位置を元のヌクレオチドを置換したヌクレオチド（変異ヌクレオチド）と共に図示する。パーセント沈黙化は、元の（ＰＲ８）沈黙化において観察された沈黙化のパーセンテージとして表される。従って、１００％の相対的沈黙化は、ｓｉＲＮＡが正確にマッチする標的配列（ＰＲ８）を沈黙化させる能力に比べて、ミスマッチが該ｓｉＲＮＡの機能性に全く影響を及ぼさないことを示す。パーセント相対的沈黙化にいくらかでも低下が見られるとすれば、それは標的配列におけるミスマッチに対するｓｉＲＮＡの感度の大きさを表す（即ち、低いパーセントは、ｓｉＲＮＡの機能性の低下と等しい；この文脈では、「機能性」は、ｓｉＲＮＡのその標的ＲＮＡを分解する能力と定義される）。

表１９．ｓｉＲＮＡの、天然に生じる標的部位の点突然変異に対する感受性

表１９に示すように、ＳＮＰを含む７０個のニワトリ／ヒトの標的の内、僅かに１９個だけが３０％を超えてｓｉＲＮＡの機能性を破壊した。これらの突然変異体の内２個で、ＩＮＦｓｉ−２は位置９に変異を有する（ｓｉＲＮＡ ＩＮＦｓｉ−２では変異−９であり、ｓｉＲＮＡ ＩＮＦｓｉ−１では変異−４である）。この位置は、ＲＩＳＣ仲介性切断部位に隣接し、塩基対ミスマッチに特に敏感であることが予想されている。驚くべきことに、２個の標的部位多型を含む４個の変異体の内３個が、標的切断レベルにおける著明な低下を示した（例えば、ｓｉＲＮＡ ＩＮＦｓｉ−４）。個々まちまちの多型を抱える変異体はいずれもｓｉＲＮＡの機能性を有意に阻害しなかった。

上記データは、１０個のｓｉＲＮＡは、大部分のヒト及びニワトリ・インフルエンザウィルス株に対し広範な標的性を示すことを明らかにする。これは、これら１０個のｓｉＲＮＡが、効果的なＲＮＡｉ治療のための多数遺伝子標的戦略として大きな可能性を秘めることを実証する。

表２０では、表２の最も高度に保存された配列を、インフルエンザＡウィルス配列変異種の他のメンバーから得られた更に追加の１９マー配列に対しをマッチさせた。この追加の１９マー配列は、ただ一つ、又は数個のヌクレオチドミスマッチを有するために一次１９マー配列とは異なっている。表２０の１９マー配列は、表２に示す高度に保存された１９マー配列断片を参照配列として用いて、表１に記載される配列リストを探索することによって得られる。各１９マー参照配列について、標的インフルエンザＡウィルス配列のそれぞれの中に、最も緊密にマッチする１９マー断片である標的断片が見出された。最も緊密にマッチする標的断片とは、参照断片と標的断片との間のヌクレオチド差の数が最も少ないものである。もしも二つの標的断片が、参照断片に対して同じ数のヌクレオチド差を有する場合は、標的断片のセンス鎖と、参照断片のアンチセンス鎖との間に、より多くのゆらぎ塩基対を形成することが可能な標的断片を優先的に選択する。

表２０−１：表１−１に掲載されたインフルエンザＡのセグメント１（ＰＢ２）から選択された、保存されるが僅かな変異を含む１９マー配列。保存配列は、掲載されたウィルス配列と少なくとも８９％においてマッチし、変異種は、参照配列に対し３個以下のヌクレオチド変化を含む。

表２０−２：表１−２に掲載されたインフルエンザＡのセグメント２（ＰＢ１）から選択された、保存されるが僅かな変異を含む１９マー配列。保存配列は、掲載されたウィルス配列と少なくとも８９％においてマッチし、変異種は、参照配列に対し３個以下のヌクレオチド変化を含む。

表２０−３：表１−３に掲載されたインフルエンザＡのセグメント３（ＰＡ）から選択された、保存されるが僅かな変異を含む１９マー配列。保存配列は、掲載されたウィルス配列と少なくとも８９％においてマッチし、変異種は、参照配列に対し３個以下のヌクレオチド変化を含む。

表２０−４：表１−５に掲載されたインフルエンザＡのセグメント５（ＮＰ）から選択された、保存されるが僅かな変異を含む１９マー配列。保存配列は、掲載されたウィルス配列と少なくとも８９％においてマッチし、変異種は、参照配列に対し３個以下のヌクレオチド変化を含む。

表２０−５：表１−７に掲載されたインフルエンザＡのセグメント７（Ｍ１及びＭ２）から選択された、保存されるが僅かな変異を含む１９マー配列。保存配列は、掲載されたウィルス配列と少なくとも８９％においてマッチし、変異種は、参照配列に対し３個以下のヌクレオチド変化を含む。

表２０−６：表１−８に掲載されたインフルエンザＡのセグメント８（ＮＳ１及びＮＳ２）から選択された、保存されるが僅かな変異を含む１９マー配列。保存配列は、掲載されたウィルス配列と少なくとも８９％においてマッチし、変異種は、参照配列に対し３個以下のヌクレオチド変化を含む。

実施例１６：ｓｉＲＮＡの静脈内輸送は、インビボにおいてインフルエンザウィルス生産を抑制する。
本実施例は、ウィルスのＮＰ転写体を標的とするｓｉＲＮＡの感染後における静脈内投与が、マウスにおいてインフルエンザウィルスの複製を有意に抑制したことを実証する（図２）。下記は、例示のヒトインフルエンザウィルスの、保存された標的配列のリストである（アクセス番号ＡＦ３８９１１９から得られたもの）。

下記は、複数の動物種のインフルエンザＮＰ遺伝子断片を表す配列リストである。太字領域は、これらの配列間で共有される保存領域である。

ウィルス標的ｓｉＲＮＡの予防的使用を試験するために、ＮＰ−１４９６（ＩＮＦｓｉ−９）を、陽イオン性輸送ポリマーｊｅｔＰＥＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静注（ＩＶ）した。３時間後、感染を起動するために、マウスに、１×１０^４ ＰＲ^８ウィルス粒子を接種し（鼻腔内）、感染２４時間後屠殺し、ＭＤＣＫ赤血球凝集アッセイを用いて肺ホモジェネートのウィルス力価について定量した。

図２に示すように、ｓｉＲＮＡ治療を受けなかったマウスの肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値（ＮＴ；黒塗り四角）、又は、ＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡの投与を受けたマウス肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値（ＧＦＰ ６０μｇ；白塗り四角）は４．２であった。ＮＰを標的とするｓｉＲＮＡ ３０μｇとｊｅｔＰＩＥによってあらかじめ治療されたマウスでは（ＮＰ ３０μｇ；白塗り円）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は３．９であった。ＮＰを標的とするｓｉＲＮＡ ６０μｇとｊｅｔＰＩＥによってあらかじめ治療されたマウスでは（ＮＰ ６０μｇ；黒塗り円）、肺ホモジェネートのｌｏｇ_１０ＴＣＩＤ_５０の平均値は３．２であった。治療を全く受けなかったグループと、６０μｇ ＮＰ ｓｉＲＮＡの投与を受けたグループの間に見られた、肺ホモジェネートにおけるウィルス力価の差は、Ｐ＝０．０００２で有意であった。

既存のインフルエンザ感染に対する薬剤治療としてｓｉＲＮＡを評価するために、マウスに鼻腔内を通じてＰＲ８に感染させ、５時間後、ＮＰ−１４９６／ｊｅＰＥＩ又はＰＡ−２０８７／ｊｅｔＰＥ混合物を静注した。感染２８時間後、肺のウィルス力価を、ＭＤＣＫ−ＨＡアッセイにて定量した。全ての治療例は、未処置、感染マウスに比べウィルス力価を有意に下げた。ＮＰ−１４９６で治療したマウスでは、ウィルス力価の用量−反応性低下が観察された（図３）。感染後２４時間でも、ｓｉＲＮＡの抑制作用がマウスで見られた。

更に、設計されたｓｉＲＮＡは、ニワトリインフルエンザウィルスの致死的チャレンジからマウスを保護することも可能である。対照（ＧＦＰを標的とする）ｓｉＲＮＡを注入し（２×）、次いで、致死量のＨ１Ｎ１（ＰＲ８）、又はＨ７Ｎ７ウィルスでチャレンジしたマウスは、連続的に体重を失い、図４に示すように７から１０日目に感染に斃れた。一方、ｓｉＲＮＡ ＮＰ−１４９６及びＰＡ−２０８７の併用を投与された感染マウスは、最小の体重減少から回復した。マウスの少なくとも５０％が、致死量のＨ７Ｈ７チャレンジを生き延び、８７％が致死量のＨ５Ｎ１チャレンジを生き延び、且つ、１００％がＨ１Ｎ１チャレンジを生き延びた。従って、インフルエンザウィルスゲノムの保存領域に対して特異的なｓｉＲＮＡは、極めて病原性の高いニワトリインフルエンザウィルスに対する保護を含め、広範な保護を付与する（図４）。

実施例１７ａ：ｓｉＲＮＡの鼻腔内輸送は、マウスにおいてインフルエンザ生産を抑制する。
本実施例は、ウィルスＮＰ転写体を標的とするｓｉＲＮＡの、予防的鼻腔内投与は、マウスにおいてインフルエンザウィルス複製を抑制し、且つ、ウィルスＲＮＡレベルを用量依存性に低減することを実証する。

インフルエンザは通常、上部気道及び肺に感染し、複製する。従って、アクセスしやすいため、局所投与、即ち、薬剤の鼻腔内及び／又は肺輸送が、インフルエンザの予防及び治療には理想的であるはずである。具体的に言うと、ｓｉＲＮＡの鼻腔内及び／又は肺投与は、インフルエンザウィルス感染を治療するのに下記の理由で好都合である。即ち、１）局所輸送ルートを用いると、局所高濃度のｓｉＲＮＡが容易に実現されるので、全身輸送に比べると必要とされるｓｉＲＮＡの量が少ない、及び２）鼻腔内及び／又は肺内輸送法は非侵襲的である。このようなわけで、マウスインフルエンザモデルでは、ｓｉＲＮＡの鼻腔内輸送を続けて用いた。

従来の、無視できる沈黙作用しかもたらさない、生のｓｉＲＮＡの静注輸送と違って、鼻腔内投与ｓｉＲＮＡ（未修飾、ＰＢＳ又は生食液に溶解）は、肺で検出され、肺組織における内因性遺伝子発現を沈黙化し、又はウィルス生産を抑制することが可能である。インフルエンザ標的性ｓｉＲＮＡの非侵襲的輸送の効力を試験するために、ＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡ（ＰＢＳ溶解）を鼻腔内投与した。ＢＡＬＢ／ｃマウスに対し、ＰＢＳに溶解した表示量のＮＰ特異的ｓｉＲＮＡ、又はＰＢＳ対照を鼻腔内投与した。２時間後、全てのマウスを、鼻腔内にＰＲ８血清型（１０００ｐｆｕ／マウス）を投与して感染させた。感染２４時間後、肺を採取し、ＭＤＣＫ−ＨＡアッセイによって肺ホモジェネートのウィルス力価を測定した。ＰＢＳ及びｓｉＲＮＡグループの間のＰ値は、０．５、１、及び２ｍｇ／ｋｇ ｓｉＲＮＡ治療グループにおいて統計的有意を示した。データを図５に示す。

担体が無い場合でも、生のＮＰ標的ｓｉＲＮＡは、マウス肺におけるウィルス生産の抑制に効果的であった（図５、感染後２４時間）。抑制は用量依存性で、２ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ、感染の２時間前に輸送されると、７倍の低下が観察された。

ＮＰ標的ｓｉＲＮＡの鼻腔内輸送の作用を、効力を測定するために標的ｍＲＮＡ発現（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）及びウィルス力価（ＭＤＣＫ−ＨＡ）を用いて、比較的高濃度（１０ｍｇ／ｋｇ、感染の３時間前に輸送）において調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスに対し、対照、及びＮＰ−標的ｓｉＲＮＡを鼻腔内投与した（１０ｍｇ／ｋｇ、ＰＢＳに溶解）。３時間後、全てのマウスを、鼻腔内にＰＲ８ウィルス（５０ｐｆｕ／マウス）を投与して感染させた。感染２４及び４８時間後、肺を採取し、左肺から全体ＲＮＡを分離した。全体ｍＲＮＡを、ｄＴ１８プライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写した。ＰＢ１特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを実行し、ウィルスのｍＲＮＡレベルを定量した。内部対照としてＧＡＰＤＨを用いた。右及び中央肺を均一に破砕し、ウィルス力価をＭＤＣＫ−ＨＡアッセイによって測定した。感染４８時間後のサンプルのウィルス力価を図６に示す。ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いたところ、ＰＢＳと、ＮＰ ｓｉＲＮＡ処置グループとの間には統計的な有意差が認められた（ｐ＝０．０１）。感染の２４時間後のサンプルにおける力価は、あまりに低すぎて検出することができなかった。これは、恐らく、ｓｉＲＮＡの指向性抑制によるものと考えられる。

結果を図６に示す。図６は、正規化された定量的ＰＣＲ結果、及びウィルス力価定量結果を比較する。感染２４時間後に測定されたウィルスｍＲＮＡレベルは、５５．２％抑制を示したが、感染４８時間後では、ほんの僅少な抑制しか観察されなかった。一方、マウス肺サンプルのＭＤＣＫ−ＨＡアッセイは、２日目に８４．６％のウィルス力価の抑制を示した。生きたウィルス粒子を測定するＭＤＣＫ−ＨＡアッセイに比べ、ウィルスｍＲＮＡの定量化は、ウィルス複製における早期の変化を反映する点でより感受性が高いと考えられる。従って、２日目のウィルスｍＲＮＡ抑制の減少は、恐らく、その時期にはマウス肺におけるＲＮＡｉ作用が低下したためと考えられる。

更に、マウスにおけるインフルエンザウィルスに対する作用を、鼻腔内輸送される、ＮＰ転写体を標的とする生のｓｉＲＮＡと、インフルエンザ治療薬タミフルとの間で比較した。ＧＦＰ対照ｓｉＲＮＡについて観察されるウィルス力価のレベルに比べ、鼻腔内輸送された生のｓｉＲＮＡも、タミフル治療も、インフルエンザウィルスの力価を下げた。

ｓｉＲＮＡ Ｇ１４９８（ＩＮＦｓｉ−８）の鼻腔内投与後、マウスにおけるＮＰ−ウィルス転写体標的作用によるウィルス力価に及ぼす作用についても調べた。このＧ１４９８ ｓｉＲＮＡは、インビトロにおいてウィルス力価を下げる著明な能力を示したので、更にインビボにおけるその特性解明のために選ばれた。この実験の対照は、ルシフェラーゼを標的とする未修飾ｓｉＲＮＡであった（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ；Ｌｕｃ）。本実験には、１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ（Ｔａｃｏｎｉｃ）マウスで、１８から２２グラムの体重範囲を有するものが使用された。実験群毎に１０匹のマウスを割り当てた。マウスには、ＰＢＳに溶解したＧ１４９８ ｓｉＲＮＡを、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、及び３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。対照群にも同じものを投与した。ただし、対照には２ｍｇ／ｋｇ用量の投与は行わなかった。Ｇ１４９８群及びＬｕｃ ｓｉＲＮＡ対照群の両方を、ｓｉＲＮＡ投与４時間後、ＰＢＳに溶解した３０μｌ液として３０ｐｆｕでＰＲ８インフルエンザウィルスを感染させた。感染４８時間後、マウスの肺を採取し、それらのウィルス力価を、ＴＣＩＤ_５０アッセイによってＭＤＣＫ細胞を用いて測定した。

結果を図７に示す。このＴＣＩＤ_５０アッセイの結果は、２ｍｇ／ｋｇのＧ１４９８ ｓｉＲＮＡは、マウス肺においてインフルエンザ生産を８６％まで抑制し、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇでは９０．６％まで、２０ｍｇ／ｋｇでは９６．６％まで、３０ｍｇ／ｋｇでは９５．２％まで抑制することを示す。ＰＢＳ単独、又はＬｕｃ対照ｓｉＲＮＡ実験群と比較すると、Ｇ１４９８ ｓｉＲＮＡを鼻腔内に投与されたマウスは全体として有意な差を示した（Ｐ＜０．００１）。ＰＢＳを受容したマウスは、全体として、Ｌｕｃ ｓｉＲＮＡを受容したマウス群と比較して有意差を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。３０ｍｇ／ｋｇでＧ１４９８ ｓｉＲＮＡの投与を受けた各実験群は、ＰＢＳ群、又はＬｕｃ ｓｉＲＮＡ対照実験群とは有意に異なっていた（Ｐ＜０．０５）。最後に、この範囲のＧ１４９８ ｓｉＲＮＡ用量を受容したマウスでは、著明な投与反応は観察されなかった。

実施例１７ｂ：ｓｉＲＮＡの鼻腔内輸送は、非インフルエンザマウスモデルにおいてシクロフィリンＢ発現を抑制する。
本実施例は、鼻腔内投与を介しての、気道細胞による生のｓｉＲＮＡの取り込みが、インフルエンザ感染細胞の特異的現象では無いことを実証する。更に、鼻腔内に輸送された生のｓｉＲＮＡも、健康なマウスの肺における内因性遺伝子の発現、即ちシクロフィリンＢの発現を抑制した。ＰＢＳに溶解した、１０ｍｇ／ｋｇのシクロフィリンＢ特異的ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）又はＧＦＰ ｓｉＲＮＡ、又はＰＢＳ対照を鼻腔内に投与した。群毎に５匹のマウスを割り当てた。肺サンプルから全体ＲＮＡを分離し、ｄＴ１８プライマーを用いて逆転写を行った。標的ｍＲＮＡレベルを定量するために、リアルタイムＰＣＲにおいてシクロフィリンＢ特異的プライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いた。対照としてＧＡＰＤＨ特異的プライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）も用いた。

図８に示すように、肺のシクロフィリンＢ ｍＲＮＡは、マウスが鼻腔内に１０ｍｇ／ｋｇのシクロフィリンＢ ｓｉＲＮＡを受容した後２４時間で７０％抑制された。これらのデータは、鼻腔内投与による生のｓｉＲＮＡの気道細胞による取り込みは、インフルエンザ感染細胞に特異的ではないことを示す。健康な動物の健康な細胞における内因性遺伝子の沈黙化は、鼻腔内輸送された生のｓｉＲＮＡによっても実現される。この所見は、沈黙化が感染のない場合にも起こるわけであるから、予防のためのｓｉＲＮＡの有用性にとって重要な意味を有する。

実施例１８：マウスにおける、コクリエートｓｉＲＮＡ処方の鼻腔内投与に続くインフルエンザウィルス力価の低下
本実施例は、コクリエート輸送処方（ＢＤＳＩ，ノースカロライナ州）に溶解したＧ１４９８ ｓｉＲＮＡの鼻腔内投与が、マウスにおいて、生のｓｉＲＮＡに比べインフルエンザウィルスの抑制を強化することを示す。本実施例において試験した処方を下記の表２１に示す。

表２１．マウスの鼻腔内に投与された処方

上掲の処方は、インフルエンザによる感染の５時間後に鼻腔内投与された。全体肺のウィルス力価を感染の４８時間後に測定した。５匹の、生の非脂質化であるＵ−ｆｌｕ群を除き、各実験群には１０匹のマウスを割り当てた。

肺のウィルス力価成績を図９に示す。グラフの各ドットは一匹の動物を表す。統計は、一元配置分散分析によって行った。星印のついた数字は、平均値が、対照（プラシーボ、又はバッファー）に対して有意な差を有することを示す。図８のデータは、コクリエート輸送処方と共に鼻腔内投与されたＧ１４９８ ｓｉＲＮＡの方が、生のＧ１４９８ ｓｉＲＮＡ及び対照（バッファーのみ、又はコクリエートプラシーボ）に比べ、より大きなウィルス力価の低下を示すことを表す。コクリエート処方、又は生のｓｉＲＮＡを投与された全ての群において、ある程度の毒性が観察された。

実施例１９：マウスにおける、コクリエートｓｉＲＮＡ処方の静注後におけるインフルエンザウィルス力価の低下
本実施例は、コクリエート輸送処方に溶解したＧ１４９８ ｓｉＲＮＡの静脈内投与が、マウスにおいて、生のｓｉＲＮＡに比べインフルエンザウィルスの抑制を強化することを示す。試験した処方を下記の表２１に示す。

表２２．マウスの静脈内に投与された処方

上掲の処方は、インフルエンザによる感染の５時間後に静脈内投与された。全体の肺のウィルス力価を感染の４８時間後に測定した。５匹の、生の非脂質化Ｕ−ｆｌｕ群を除き、各実験群には１０匹のマウスを割り当てた。

肺のウィルス力価の結果を図１０Ａに示す。グラフ上の各ドットは、１匹の動物を表す。統計処理は一元配置分散分析によって実行した。星印のついた数字は、平均値が、対照（プラシーボ、又はバッファー）に対して有意な差を有することを示す。図９のデータは、コクリエート輸送処方と共に静脈内に投与されたＧ１４９８ ｓｉＲＮＡの方が、対照（バッファーのみ、又はコクリエートプラシーボ）に比べ、より大きなウィルス力価の低下を示すことを表す。更に、鼻腔内投与されたＵ−ｆｌｕ処方も肺のウィルス力価を下げた。

コクリエート処方に輸送されるｓｉＲＮＡの静脈内投与についても、用量反応プロフィールが得られた。試験された処方を下記の表２３に示す。

表２３．用量−反応実験のためにマウスの静脈内に投与された処方

上掲の処方は、インフルエンザによる感染の５時間後に鼻腔内投与された。全体肺のウィルス力価を感染の４８時間後に測定した。各実験群には１０匹のマウスを割り当てた。

肺のウィルス力価の結果を図１０Ｂに示す。グラフ上の各ドットは、１匹の動物を表す。統計処理は一元配置分散分析によって実行した。星印のついた数字は、平均値が、対照（プラシーボ、又はバッファー）に対して有意な差を有することを示す。図１０のデータは、コクリエート輸送処方と共に静脈内に投与されたＧ１４９８ ｓｉＲＮＡの方が、バッファー対照に比べ、より大きなウィルス力価の低下を示すことを表す。更に、用量−反応も観察した。コクリエート処方に溶解したＧ１４９８ ｓｉＲＮＡの用量が増加するにつれて、マウス肺のウィルス力価により大きな低下が観察された。

上記表２３に挙げたものと同じ処方を、同じプロトコール及び手順に従ってマウスに胃管輸送し、マウス肺のウィルス力価を測定した。肺のウィルスの力価測定結果を図１０Ｂに示す。前述したように、各ドットは１匹の動物を表す。試験処方の間に統計的有意差は観察されなかった。更に、実験群のいずれにも毒性は観察されなかった。

実施例２０：インフルエンザ感染前後のマウス肺におけるローダミン−コクリエートの分布
本実施例は、ｓｉＲＮＡ無添加、ローダミン−コクリエート処方の鼻腔内投与は、静脈内又は経口投与に比べ、ローダミンの広範な分布を示すことを明らかにする。本実施例の目的にそって、ローダミンをｓｉＲＮＡ無添加コクリエートに封入した。ローダミン−コクリエート処方は、インフルエンザ感染の４時間前、又は４時間後のいずれかにおいて、鼻腔内（４０ｍｇ／ｍｌ、５０μｌ／マウス）、静脈内（１０ｍｇ／ｍｌ、２００μｌ／マウス）、又は胃管輸送（１０ｍｇ／ｍｌ、２００μｌ／マウス）を通じて投与した。最後の注入又は感染の５時間後、マウスの肺組織を採取し、ドライアイスで凍結し、薄切して分析した。凍結切片は、核を見るためにＤＡＰＩにて染色し、画像観察した。

インフルエンザ感染前後の結果は全ての群において同様であった。しかしながら、ローダミン−コクリエート処方の鼻腔内投与を受けた群の肺切片ではローダミンの広い分布が認められた。静脈内投与を受けた群では、若干のローダミン凝集が見られたものの、分布陽性シグナルは限局していた。胃管輸送によるものでは陽性シグナルが得られなかった。これらの結果は、呼吸器ウィルスの感染治療のためには、鼻腔内投与によると、肺におけるコクリエート処方が十分に行き渡るために最善の結果が実現されることを示す。

実施例２１：パラインフルエンザ由来ｓｉＲＮＡの生成と試験
パラインフルエンザウィルスの核タンパクを、前述の方法によって、又は公知の配列から特定した。前述の方法を用いて、パラインフルエンザウィスル核タンパクをコードする核酸の中にｓｉＲＮＡが特定された。

表２４Ａ−Ｂは、パラインフルエンザウィルス核タンパクｓｉＲＮＡ標的配列である１９−ヌクレオチド配列を列挙する。ここに示された１９ヌクレオチド領域は、センス及びアンチセンス鎖のどちらか、又はその両方において、選択的に様々な３′オーバーハングを有する各種ｓｉＲＮＡ分子を設計するためのセンス鎖として有用である。従って、当業者であれば、表２４Ａ−Ｂに掲載される各配列から、様々なセンス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列が得られることが了解されるであろう。

表２４Ａ−Ｂ、及び、本明細書に示される、ウィルス由来（前述のインフルエンザウィルスを除き）の標的配列を開示する他の表も全て、「標的保存配列」と呼ばれる、標的配列のサブセットも開示する。これらの標的保存配列は、複数のウィルスの核タンパク配列の中に高率に保存される。

表２４Ａ−Ｂ、及び、本明細書に示される、非分節性ゲノムを有するマイナス鎖ウィルス由来の標的配列を開示する他の表も全て、ウィルス核タンパク遺伝子の５′ヌクレオチドの位置を開示する。

インビトロ分析
肺上皮細胞系統Ａ５４９細胞を、様々な濃度のｓｉＲＮＡでトランスフェクトさせることにする。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照を、対照ｓｉＲＮＡとして用いることにする。リポフェクタミン２０００を、トランスフェクション試薬として用い、メーカーの指示に従うこととする。４時間後、トランスフェクトされたＡ５４９細胞に、ヒトのパラインフルエンザウィルス（ｈＰＩＶ）を感染させることにする。適切な時点で、細胞を採取し、ＲＮＡを分離する。Ｈｉｎｏ等（５）の記載する通りに、ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲを実行する。ｓｉＲＮＡトランスフェクトされ、ＰＩＶ感染された培養物上清を採取する。ウィルス力価を測定するために、上清の２倍血清希釈液を０．０５％モルモット赤血球（６）と混ぜ合わせることによって赤血球凝集アッセイを実行する。更に、Ａ５４９細胞を先ずｈＰＩＶに感染させ、適切な時点で各種濃度のｓｉＲＮＡでトランスフェクトする。適切な時点で細胞を採取し、上清を採取する。細胞からＲＮＡを分離し、前述のように遺伝子特異的プライマーを用いてＲＴ及びリアルタイムＰＣＲを実行し、ｓｉＲＮＡの沈黙化作用を定量する。前述の赤血球凝集アッセイの外に、リアルタイムＰＣＲに、ウィルスの非標的遺伝子特異的プライマー（例えばポリメラーゼ）を用いて、ウィルス複製の低下を測定する。

インビボ分析
麻酔下のＢａｌｂ／ｃマウスに、処方付きで、又は処方無しで、ｓｉＲＮＡの修飾体、又は未修飾体の２−１０ｍｇ／ｋｇ用量を鼻腔内投与する。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照を同じ用量で投与する。適切な時点で、動物を、１０^７個のヒトパラインフルエンザ３型に感染させる。ウィルス感染後様々な時点で動物を屠殺し、肺組織を採取する。ウィルスの核カプシド遺伝子に関してリアルタイムＰＣＲを実行し、ウィルス複製を定量する（５）。我々はまた肺ホモジェネートを用いて、前述の赤血球凝集アッセイを用いてウィルス力価を定量する（６）。ｓｉＲＮＡの治療効果を調べるため、先ず、動物にｈＰＩＶ−３を感染させ、次に、最適時点で、ｈＰＩＶ特異的ｓｉＲＮＡ及び対照ｓｉＲＮＡを投与する。肺組織におけるウィルス感染を前述の方法によって監視する。

実施例２２．ｈＭＰＶウィルス由来ｓｉＲＮＡの生成と試験
ヒトＭＰＶウィルスの核タンパクを、前述の方法、又は一般に公開される配列を用いて特定した。ｓｉＲＮＡが、前述の方法を用い、ＭＰＶウィルスの核タンパクをコードする核酸の中に特定された。

表２５は、ｓｉＲＮＡのヒトメタニューモウィルス核タンパク標的配列である、１９−ヌクレオチド領域を掲げる。図１Ａは、ヒトメタニューモウィルス核タンパク配列の整列組、及びそれから得られるコンセンサス配列を示す。ここに示された１９ヌクレオチド領域は、センス及びアンチセンス鎖のどちらか、又はその両方に様々な３′オーバーハングを任意に有していてもよい、各種ｓｉＲＮＡ分子を設計するためのセンス鎖として有用である。従って、当業者であれば、表２５に掲げられる各配列から様々なセンス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を得ることが可能であることが了解されよう。

インビトロ分析
各種濃度のｓｉＲＮＡと組み合わせた電気穿孔の後、又は前のいずれかの適切な時点で、指定の感染倍数（ＭＯＩ）にてｈＭＰＶによってサル腎臓上皮細胞系統ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を感染させる。対照ｓｉＲＮＡとして、Ｄｈａｒｍａｃｏｎから購入したＳｉ対照を用いる。適切な時点で、細胞を採取し、全ＲＮＡを分離する。オリゴｄＴをプライマーとして、第１鎖ｃＤＮＡを逆転写によって合成する。次に、Ｂｏｉｖｉｎ等（１）の記載する方法に従って、（１）ウィルス標的遺伝子特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを実行し、ｓｉＲＮＡの沈黙化作用を定量する。リアルタイムＰＣＲにおいて、ウィルスの非標的遺伝子特異的プライマー（例えばポリメラーゼ）を用いて、ウィルス複製の低下を測定する。Ｔｒｉｐｐ等（２）の記載する方法に従って、ウィルスプラークアッセイによってウィルス力価を定量する。

インビボ分析
麻酔下のＢａｌｂ／ｃマウスに、処方付きで、又は処方無しで、ｓｉＲＮＡの修飾体、又は未修飾体の２−１０ｍｇ／ｋｇ用量を鼻腔内投与する。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照を同じ用量で投与する。適切な時点で、動物を、１０^６個のヒトメタニューモウィルスに感染させる。ウィルス感染後様々な時点で動物を屠殺し、肺組織を採取する。Ｎ遺伝子に関してリアルタイムＰＣＲを実行し、インビトロアッセイに記載されるやり方でウィルス複製を定量する（１）。我々はまた肺ホモジェネートを利用し、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞によるプラークアッセイにてウィルス力価を定量する（１６）。ｓｉＲＮＡの治療効果を調べるため、先ず、動物にｈＭＰＶを感染させ、次に、最適時点で、ｈＭＰＶ特異的ｓｉＲＮＡ及び対照ｓｉＲＮＡを投与する。肺組織におけるウィルス感染を前述の方法によって監視する。

実施例２３．ＲＳＶウィルス由来のｓｉＲＮＡの生成及び試験
ＲＳＶウィルスの核タンパクを、前述の方法、又は一般に公開される配列を用いて特定した。ｓｉＲＮＡが、実施例２に記載される方法を用い、ＲＳＶウィルスの核タンパクをコードする核酸の中に特定された。

表２６は、ｓｉＲＮＡのヒトＲＳウィルス核タンパク標的配列である、１９−ヌクレオチド領域を掲げる。ここに示された１９ヌクレオチド領域は、センス及びアンチセンス鎖のどちらか、又はその両方に様々な３′オーバーハングを任意に有していてもよい、各種ｓｉＲＮＡ分子を設計するためのセンス鎖として有用である。従って、当業者であれば、表２６に掲げられる各配列から様々なセンス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を得ることが可能であることが了解されよう。

インビトロ分析
肺上皮細胞系統Ａ５４９細胞を、様々な濃度のｓｉＲＮＡでトランスフェクトさせる（３）。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照を、対照ｓｉＲＮＡとして用いる。リポフェクタミン２０００を、トランスフェクション試薬として用い、メーカーの指示に従う。４時間後、トランスフェクトされたＡ５４９細胞に、ｈＲＳＶを感染させる。適切な時点で、細胞を採取し、ＲＮＡを分離する。前述の通りに、ＲＴ及びリアルタイムＰＣＲを実行する。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、ＲＳＶに感染された細胞の培養上清を連続希釈し、この希釈液を用いてＡ５４９細胞を感染し、ウィルスプラークアッセイにてウィルス力価を定量する（４）。更に、Ａ５４９細胞を先ずＲＳＶに感染させ、適切な時点で各種濃度のｓｉＲＮＡでトランスフェクトする。適切な時点で細胞を採取し、ＲＮＡを分離する。前述のように遺伝子特異的プライマーを用いてＲＴ及びリアルタイムＰＣＲを実行し、ｓｉＲＮＡの沈黙化作用を定量する。リアルタイムＰＣＲにおいて、ウィルスの非標的遺伝子特異的プライマー（例えばポリメラーゼ）を用いて、ウィルス複製の低下を測定する。

インビボ分析
麻酔下のＢａｌｂ／ｃマウスに、ＰＢＳに溶解した、ＮＰ−特異的、ＲＳＶ−特異的ｓｉＲＮＡを、２ｍｇ／ｋｇで、マウス当たり５０ｕｌとして鼻腔内投与する。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照のＰＢＳ溶液を同じ用量で投与する。感染４日後、マウスの肺組織を採取し、ホモジェナイズする。肺ホモジェネートの１０倍連続希釈液を用いてＡ５４９細胞を感染させる。細胞病理学的作用を、感染の３から５日後に監視する（４）。ウェルの５０％が細胞病理作用を呈した希釈液をＴＣＩＤ５０と判断する。ｓｉＲＮＡの治療効果を調べるため、先ず、動物にｈＰＩＶ−３を感染させ、次に、最適時点で、ＲＳＶ特異的ｓｉＲＮＡ及び対照ｓｉＲＮＡを投与する。肺組織におけるウィルス感染を前述の方法によって監視する。

実施例２４．コロナウィルス由来のｓｉＲＮＡの生成及び試験
コロナウィルスの核タンパクを、前述の方法、又は一般に公開される配列を用いて特定した。ｓｉＲＮＡが、前述の方法を用い、コロナウィルスの核タンパクをコードする核酸の中に特定された。

表２７は、ｓｉＲＮＡのヒトコロナウィルス核タンパク標的配列である、１９−ヌクレオチド領域を掲げる。ここに示された１９ヌクレオチド領域は、センス及びアンチセンス鎖のどちらか、又はその両方に様々な３′オーバーハングを任意に有していてもよい、各種ｓｉＲＮＡ分子を設計するためのセンス鎖として有用である。従って、当業者であれば、表２７に掲げられる各配列から様々なセンス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を得ることが可能であることが了解されよう。

肺上皮細胞系統Ａ５４９細胞を、様々な濃度のｓｉＲＮＡによってトランスフェクトする。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照を、対照ｓｉＲＮＡとして用いる。リポフェクタミン２０００を、トランスフェクション試薬として用い、メーカーの指示に従う。４時間後、トランスフェクトされたＡ５４９細胞に、コロナウィルスを感染させる。適切な時点で、細胞を採取し、ＲＮＡを分離する。前述のようにＲＴ及びリアルタイムＰＣＲを実行する（８）。ｓｉＲＮＡにトランスフェクトされ、コロナウィルスに感染された培養物上清を採取する。上清の２倍連続希釈液を０．０５％ニワトリ赤血球（９）と混ぜ合わせることによって赤血球凝集アッセイを実行する。更に、Ａ５４９細胞を先ずヒトコロナウィルスに感染させ、適切な時点で各種濃度のｓｉＲＮＡでトランスフェクトする。最適時点で細胞を採取し、上清を収集する。細胞からＲＮＡを分離し、前述のように遺伝子特異的プライマーを用いてＲＴ及びリアルタイムＰＣＲを実行し、ｓｉＲＮＡの沈黙化作用を定量する。前述の赤血球凝集アッセイの外に、リアルタイムＰＣＲに、ウィルスの非標的遺伝子特異的プライマー（例えばポリメラーゼ）を用いて、ウィルス複製の低下を測定する。

実施例２５．西ナイルウィルス由来のｓｉＲＮＡの生成及び試験
西ナイルウィルスの核タンパクを、前述の方法、又は一般に公開される配列を用いて特定した。ｓｉＲＮＡが、前述の方法を用い、西ナイルウィルスの核タンパクをコードする核酸の中に特定された。

表２８は、ｓｉＲＮＡのヒト西ナイルウィルス核タンパク標的配列ｓｉＲＮＡである、１９−ヌクレオチド領域を掲げる。ここに示された１９ヌクレオチド領域は、センス及びアンチセンス鎖のどちらか、又はその両方に様々な３′オーバーハングを任意に有していてもよい各種ｓｉＲＮＡ分子を設計するためのセンス鎖として有用である。従って、当業者であれば、表２８に掲げられる各配列から様々なセンス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を得ることが可能であることが了解されよう。

ウィルスストックの生産のために、ベロ細胞を、ＡＴＣＣ又はＣＤＣから入手した西ナイルウィルス（ＷＮＶ）株にて０．１−１の感染倍数で感染させ、２％ＦＢＳ添加培養液で培養する。培養上清を採取し、感染後７２−９６時間で、細胞の５０−７０％が細胞病理学的作用（ＣＰＥ）を示した時点で洗浄した。ストックにおける感染性ウィルスの濃度は、９６ウェルプレートにおいてベロ細胞に滴定を行って定量し、ｍｌ当たりＩＤ_５０として計算した。１ＩＤ_５０は、１感染単位（ｉ．ｕ．）と等価である。

もっとも強力なｓｉＲＮＡ配列を見つけ出すために、我々は、先ず、ベロ細胞、又は、他の任意の適切な細胞系統、例えば、幼生ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞系統（ＢＨＫ−２１）を、様々な濃度の、いくつかのｓｉＲＮＡでトランスフェクト／電気穿孔する。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照を、対照ｓｉＲＮＡとして用いる。トランスフェクション／電気穿孔後の適切な時点で、最適ＭＯＩの西ナイルウィルスによって細胞を感染する。感染後の様々な時点で、細胞を採取し、上清を収集する。ｓｉＲＮＡのウィルス感染／複製に及ぼす作用を評価するために、細胞からＲＮＡを分離し、逆転写して、ｃＤＮＡの第１鎖を作製する。ＷＮＶ Ｎ遺伝子のために、Ｎ遺伝子特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを実行し（１０）、増幅産物を対照と比較してｓｉＲＮＡの作用を評価する。更に、発表されたプロトコール（１１）を用いて、ウィルス力価アッセイにおいて培養上清を試験する。ベロ又はＢＨＫ−２細胞を、先ず、ＷＮＶにて感染し、適切な時点で各種濃度のｓｉＲＮＡでトランスフェクトする。適切な時点で、細胞を採取し、ＲＮＡを分離する。前述のように遺伝子特異的プライマーを用いてＲＴ及びリアルタイムＰＣＲを実行し、ｓｉＲＮＡの沈黙化作用を定量する。ウィルスの非標的遺伝子特異的プライマー（例えば、ポリメラーゼ）もリアルタイムＰＣＲに用いて、ウィルス複製の低下を測定する。前述の方法を用いてウィルス力価を定量する。

インビボ分析
ＢＡＳＢ／ｃマウスは、ＷＮＶ複製を効果的に支援することが明らかにされている。我々は、細胞培養アッセイにおいて強力と認められたｓｉＲＮＡを評価するためにこの株を利用することを考える。具体的には、我々は、マウスに対し、処方付きで、又は処方無しで、ｓｉＲＮＡの修飾体、又は未修飾体の２−１０ｍｇ／ｋｇ用量を静脈内に投与する。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照を同じ用量で投与する。適切な時点で、動物を、ＷＮＶに感染させる。様々な時点でこれらの動物から脳組織及び血液を収集し、血液及び脳におけるウィルス濃度を、ベロ又はＢＨＫ−２１細胞におけるプラーク測定によって定量する。この予防法とは別に、我々は、動物に先ずウィルスを感染し、次いでｓｉＲＮＡ治療を施す、治療モデルを実行することを計画する。血液及び脳組織におけるウィルス感染を前述の方法によって監視する。

実施例２６．デングウィルス由来のｓｉＲＮＡの生成及び試験
デングウィルスの核タンパクを、前述の方法、又は一般に公開される配列を用いて特定した。ｓｉＲＮＡが、前述の方法を用い、デングウィルスの核タンパクをコードする核酸の中に特定された。

表２９は、ｓｉＲＮＡのデングウィルス核タンパク標的配列である、１９−ヌクレオチド領域を掲げる。ここに示された１９ヌクレオチド領域は、センス及びアンチセンス鎖のどちらか、又はその両方に様々な３′オーバーハングを任意に有していてもよい各種ｓｉＲＮＡ分子を設計するためのセンス鎖として有用である。従って、当業者であれば、表２９に掲げられる各配列から様々なセンス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を得ることが可能であることが了解されよう。

インビトロ分析
（ＤＥＮ１−４）は、Ｃ６／３６蚊細胞系統において継代される。遺伝子沈黙化におけるｓｉＲＮＡの効率を試験するために、我々は、様々な濃度のいくつかのｓｉＲＮＡでベロ細胞をトランスフェクト／電気穿孔する。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照を、対照ｓｉＲＮＡとして用いる。トランスフェクション／電気穿孔後の適切な時点で、最適ＭＯＩのデングウィルス（ＤＥＮ１−４）によって細胞を感染する。感染後の様々な時点で、細胞を採取し、上清を収集する。ｓｉＲＮＡのウィルス感染／複製に及ぼす作用を評価するために、細胞からＲＮＡを分離し、逆転写して、ｃＤＮＡの第１鎖を作製する。デングの核カプシド／カプシド遺伝子のために、遺伝子特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを実行し、増幅産物を対照と比較してｓｉＲＮＡの作用を評価する（１）。ウィルスの非標的遺伝子特異的プライマー（例えば、プレＭ）もリアルタイムＰＣＲに用いて、ウィルス複製の低下を測定する。前述の方法を用いてウィルス力価を定量する。培養上清を、ベロ細胞又はＢＨＫ−２１細胞によるウィルス力価アッセイにおいて試験し（１２）、ウィルス力価を定量する。我々は更に、ベロ細胞のＤＥＮ感染後、ウィルス感染／複製におけるこれらのｓｉＲＮＡの作用を、前述の方法によって試験する。

ｓｉＲＮＡのインビボ評価には、２型デング（ＤＥＮ２）に対して比較的感受性の高いことが明らかにされているＡ／Ｊマウスを用いる。我々は、マウスに対し、処方付きで、又は処方無しで、ｓｉＲＮＡの修飾体、又は未修飾体の２−１０ｍｇ／ｋｇ用量を静脈内に投与する。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照を同じ用量で投与する。適切な時間後、動物を、ＤＥＮ−２ウィルスに静注によって感染させる（マウス当たり１ｘ１０^８ｐ．ｆ．ｕ．）。ｓｉＲＮＡのデング−２ウィルスに対する作用は、血液から抽出したＲＮＡにおいてデングウィルス特異的プライマーによるＰＣＲ分析によって検出する（１６）。我々はまた、このサンプルにおいて、ベロ細胞を用いてウィルスプラークアッセイを行う（１２）。この予防法とは別に、我々は、動物に先ずウィルスを感染し、次いでｓｉＲＮＡ治療を施す、治療モデルを実行することを計画する。脳組織におけるウィルス感染を前述の方法によって監視する。

実施例２７．ライノウィルス由来のｓｉＲＮＡの生成及び試験
ライノウィルスの核タンパクを、前述の方法、又は一般に公開される配列を用いて特定した。ｓｉＲＮＡが、前述の方法を用い、ライノウィルスの核タンパクをコードする核酸の中に特定された。

表３０は、ｓｉＲＮＡのライノウィルス−１６核タンパク標的配列である、１９−ヌクレオチド領域を掲げる。ここに示された１９ヌクレオチド領域は、センス及びアンチセンス鎖のどちらか、又はその両方に様々な３′オーバーハングを任意に有していてもよい、各種ｓｉＲＮＡ分子を設計するためのセンス鎖として有用である。従って、当業者であれば、表３０に掲げられる各配列から様々なセンス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を得ることが可能であることが了解されよう。

インビトロ分析
ライノウィルスに対するｓｉＲＮＡの効力は、ヒトのＨｅＬａ細胞において試験される。ＨｅＬａ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８を添加したアールの塩含有ＭＥＭで育成する。細胞を、ヒトライノウィルス１６の保存液によって２００プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌで感染させる。感染細胞を１時間インキュベートしウィルスを細胞に吸着させる。インキュベーション後、細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトさせる。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照を、対照ｓｉＲＮＡとして用いる。トランスフェクション後、適切な時点で細胞を採取し、上清を収集し、ウィルス複製をリアルタイムＰＣＲで定量する（１３）。リアルタイムＰＣＲに、ウィルスの非標的遺伝子特異的プライマー（例えばポリメラーゼ）を用いて、ウィルス複製の低下を測定する。上清を、ＨｅＬａ細胞単層におけるウィルスプラークアッセイに利用する（１４）。我々は更に、前述の方法に従って、細胞を先ずｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、次にヒトのライノウィルスで感染して、ｓｉＲＮＡの、ウィルス複製に対する抑制作用を調べる計画である。

実施例２８．ロタウィルス由来のｓｉＲＮＡの生成及び試験
ロタウィルスの核タンパクを、前述の方法、又は一般に公開される配列を用いて特定した。ｓｉＲＮＡが、前述の方法を用い、ロタウィルスの核タンパクをコードする核酸の中に特定された。

表３１は、ｓｉＲＮＡのロタウィルス（ＶＰ６）核タンパク標的配列である、１９−ヌクレオチド領域を掲げる。ここに示された１９ヌクレオチド領域は、センス及びアンチセンス鎖のどちらか、又はその両方に様々な３′オーバーハングを任意に有していてもよい各種ｓｉＲＮＡ分子を設計するためのセンス鎖として有用である。従って、当業者であれば、表３１に掲げられる各配列から様々なセンス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を得ることが可能であることが了解されよう。

インビトロ分析
アカゲザル腎臓細胞系統ＭＡ１０４を用いてウィルスを組織培養において継代し、大規模なウィルスストックを作製する。各種濃度の異なるｓｉＲＮＡでトランスフェクトする前に、又は後に、ＭＡ１０４細胞を最適用量のウィルスで感染させる。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照を、対照ｓｉＲＮＡとして用いる。適切な時点で細胞を採取し、２段階凍結−解凍サイクルで細胞を分解し、分解産物を、１０ｕｇ／ｍｌのトリプシンによって３７℃で３０分処理する。ウィルス調製品の感染力価を、Ｐａｎｄｏ等（１５）の記載するイムノペルオキシダーゼ焦点アッセイによって定量する。

ロタウィルスのインビボ複製に対するｓｉＲＮＡの効力を、マウスのロタウィルス感染モデルにおいて評価する。このために、マウスに対し、処方付きで、又は処方無しで、ｓｉＲＮＡの修飾体、又は未修飾体の２から１０ｍｇ／ｋｇ用量を経口的に、又は静脈内に投与する。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社から入手したｓｉ対照を同じ用量で投与する。最適用量のロタウィルスを、ｓｉＲＮＡの投与の前又は後に、経口胃管を通じてマウスに投与する。適切な時間後、例えば、ウィルス接種の２日後、各マウスの結腸遠位部を、ロタウィルス誘発下痢に特有の、明るい黄色液状内容物の有無について調べ、更に腸管全体を収集し、酵素イムノアッセイ又はＲＴ−ＰＣＲによってロタウィルス抗原を定量する。

実施例２９．インビトロにおけるヒトライノウィルス複製のｓｉＲＮＡ介在性抑制
本実施例は、本発明の例示のｓｉＲＮＡ分子が、インビトロにおいてヒトライノウィルス（ＨＲＶ）の複製を効果的に抑制することを示す。３３個のｓｉＲＮＡについて（その配列については下記の表３２参照）、大型或いは小型いずれかのＡＴＣＣ（米国基準菌株保存機関）ＨＲＶに対する抑制能力に関してスクリーニングした。ＨＲＶを標的とするように選択された３３個のｓｉＲＮＡは、ＨＲＶゲノムの「保存された」領域（単複）を表す。これらのｓｉＲＮＡは、公開されるＧｅｎｂａｎｋのＨＲＶヌクレオチド配列を分析し、その配列を整列させ、その中から「保存」領域を抽出することによって選択したものである。スクリーニングは、先ず、オハイオＨｅＬａ−Ｉ細胞（ＯＨ−Ｉ細胞）に、３３個のｓｉＲＮＡの内の一つをトランスフェクトし、次いで、ヒトライノウィルスの、２種の異なる血清型を感染させて行った。ウィルス産生の低下は、生存ウィルスを推定するＴＩＣＤ_５０（組織培養感染用量）アッセイによって測定する。ＴＩＣＤ_５０値の低下は、生存ウィルス集団サイズの減少、従ってウィルス複製の低下を示す。本実施例の意図からすると、ＴＩＣＤ_５０値の減少が大きければ大きいほど、より強力なウィルス複製抑制能力を有するｓｉＲＮＡであることを示す。

表３２．ヒトライノウィルスを標的とする３３個のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列

この実験のために、２種類のＨＲＶ血清型を試験した。即ち、１０１個の番号のついたＨＲＶ血清型の９０％を含む大型受容体群に属し、細胞に侵入するのにＩＣＡＭ−１細胞表面受容体を利用する１６型ＨＲＶ、及び、小型受容体群に属し、細胞侵入のために、低密度脂質タンパク受容体スーパーファミリーのいくつかのメンバーを用いる１Ａ型ＨＲＶである。これら３３個のｓｉＲＮＡのそれぞれについて、２つのライノウィルス血清型、ＨＲＶ−１６及びＨＲＶ−１Ａのウィルス産生に対する、その抑制作用を評価した。使用前、ｓｉＲＮＡ構築体は全て、５ｐｍｏｌ／μｌの濃度において−７０℃で保存した。本実施例では、プレコナリル及びルプリントリビルを陽性対照として用いたが、これらは、ウィルス複製を効果的に抑制することが知られる。プレコナリルは、１μｇ又は１０μｇの濃度で与えたが、一方、ルプリントリビルは、０．１μｇで与えた。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標）から入手したｓｉ対照を陰性対照として用いる。ｓｉＲＮＡトランスフェクション無しのウィルス感染も対照として実行する（「ウィルス対照１」、「ウィルス対照２」等と表示）。

先ず、トランスフェクション過程（即ち、細胞数、及び、ｓｉＲＮＡ含有リポフェクタミン（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、及び感染過程（即ち、リポフェクタミン（登録商標）２０００がライノウィルス複製に及ぼす影響）を最適化するために対照実験を行った。トランスフェクション過程を最適化するために、２枚の２４ウェルプレートのウェルに、ウェル当たり７５，０００又は１００，０００個のＯＨ−Ｉ細胞を撒いた。陽性ｓｉＲＮＡ対照の標的転写体分解効力に対する、各種濃度のリポフェクタミン２０００（１μｌ／ウェル、１．４μｌ／ウェル、又は１．８μｌ／ウェル）の陰性影響（沈黙化の程度）を定量した。陰性ｓｉＲＮＡ対照も用いた。トランスフェクション後、ＲＮＡを細胞から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを実行した。更にリアルタイムＰＣＲを用いて、１ウェル当たり７５，０００及び１００，０００個のＯＨ−Ｉ細胞を撒いた２４ウェルプレートのトランスフェクション中に見られる沈黙化の程度を定量した。予期した通り、結果は、細胞数が少ないほどより大きな沈黙化が見られることを示した。従って、本実施例に記載されるトランスフェクションは、より大きな細胞数（１００，０００ ＯＨ−Ｉ細胞）の方で行った。

感染過程を最適化するために、２枚の２４ウェルプレートのウェルに、ウェル当たり５０，０００、７５，０００、又は１００，０００個のＯＨ−Ｉ細胞を撒いた。１枚の２４ウェルプレート上の細胞には、１０ＴＣＩＤ_５０のＨＲＶ−１６を感染させ、一方、第２プレート上の細胞には１８０ＴＣＩＤ_５０のＨＲＶ−１６を感染させた。３種類の異なる細胞播種集団全てに対し、０μｌ、１μｌ、１．４μｌ、又は１．８μｌのリポフェクタミン（登録商標）２０００を投与した。次に、サンプルを、感染後２４、４８、及び７２時間において採取し、ウィルス産生を測定した。２４時間では、全ての例で（リポフェクタミン２０００の添加、無添加によらず）、低い方のウィルス接種（１０ＴＣＩＤ_５０）では、高い方の接種（１８０ＴＣＩＤ_５０）に比べ、より低い力価が得られた。４８時間では、全ての例で、両方のウィルス接種が、感染の２４時間後に観察された産生量に比べ、高いウィルス産生をもたらした。リポフェクタミンを添加しない場合、結果は、試験した細胞数の範囲内では、細胞数はウィルス産生に影響を及ぼさないことを示した。感染後２４、４８、及び７２時間において測定されたウィルス産生で見ると、試験したリポフェクタミン濃度はＨＲＶ感染又は増殖に干渉しなかった。前述の結果から、本実施例におけるその後の感染は、低い濃度のウィルス接種体（１０ＴＣＩＤ_５０）によって行い、且つ、トランスフェクションは、１．４μｌ／ウェルのリポフェクタミン２０００によって行った。

トランスフェクションは下記のように行った：先ず、５％ウシ胎児血清、５％胎児クローン血清、１％Ｌ−グルタミン、及び抗生物質を添加したＥａｇｌｅの最小必須培地（ＥＭＥＭ）に懸濁したＯＨ−Ｉ細胞を、１００，０００ ＯＨ−Ｉ細胞／ウェルの割合で２４−ウェルプレートに撒いた。細胞を、５％ＣＯ_２インキュベータにて３７℃で一晩インキュベートした。ｓｉＲＮＡトランスフェクション時における細胞シートの集密度は、約５０から６０％であった。第二に、前記一晩のインキュベーション後、各ｓｉＲＮＡについて、リポフェクタミン２０００（ＬＦ２Ｋ）保存液を作製した。これらの保存液を、２４ウェルプレート上のＯＨ−Ｉ細胞に該溶液を移送する前に、９６ウェルプレートにおいて作製した。各ＬＦ２Ｋ保存液は、ウェル当たり５０μｌの総合容量を有し、１．４μｌのＬＦ２Ｋ及び４８．６μｌのＯｐｔｉｍｅｍを含んでいた。この溶液を穏やかに渦巻き攪拌し、用時まで氷上に置いた。第三に、２００μｌのＬＦ２Ｋ−Ｏｐｔｉｍｅｍ希釈液を、９６深底ウェルプレートのＡ、Ｃ、及びＥ列の各ウェルに加えた。容量１８０μｌのＯｐｔｉｍｅｍを、列Ｂ、Ｄ、及びＦ列の各ウェルに加えた。ｓｉＲＮＡ液を渦巻き攪拌し、短時間マイクロ遠心で回転し、氷上に置いた。各ｓｉＲＮＡの２０μｌサンプルを、９６深底ウェルプレートのＢ、Ｄ、及びＦ列の適正なウェルに加え、パイペッティングにより３回穏やかに混ぜ合わせた。従って、トランスフェクションプロトコールのこの時点では、Ｂ、Ｄ、及びＦ列のウェルは、２００μｌの容量（１８０μｌのＯｐｔｉｍｅｍプラス２０μｌのｓｉＲＮＡ液）を有する。次に、Ａ列のウェルの液体をＢ列の対応ウェルに移し、Ｃ列のウェルの液体をＤ列の対応するウェルに移し、Ｅ列のウェルの液体をＦ列の対応するウェルに移す。この液体移送の結果、Ｂ、Ｄ、及びＦ列のウェルにｓｉＲＮＡ−ＬＦ２Ｋ混合物が得られた。各列からの液体転送後、パイペッティングを５回繰り返すことによってウェルを混ぜ合わせた（交差汚染を避けるため、通例としてピペットの先端は交換する）。次に、９６深底ウェルプレートに固く蓋をし、室温で３０分インキュベートする。最後に、３０分のインキュベーション後、ＯＨ−Ｉ細胞含有２４ウェルプレートを、インキュベータから取り出し、全てのウェルから培養液を吸引した。抗生物質無添加の、１０％ＥＭＥＭの４００μｌサンプルを各ウェルに加え、次いで、１００μｌのｓｉＲＮＡ−ＬＦ２Ｋ混合物を加えた。各ｓｉＲＮＡについて三重に試験したので、２４ウェルプレートにおける三つの別々のウェルが、同じｓｉＲＮＡを含む１００μｌのｓｉＲＮＡ−ＬＦ２Ｋ混合物の投与を受けた。次に、このトランスフェクションプレート（２４ウェルプレート）を、５％ＣＯ_２下、３５℃で５時間インキュベートした。

５時間のトランスフェクションインキュベーション後、全ての培養液を全てのウェルから吸引した。その際、各異なるｓｉＲＮＡ−ＬＦ２Ｋ混合物の間において、交差汚染を避けるためにピペットの先端を交換した。次に、１００μｌの２Ｘウィルス（ＨＲＶ−１６のためには１０^６希釈を用い、ＨＲＶ−１Ａのためには１０^５．５希釈を用いた）、及び、抗生物質又はＭｇＣｌ_２無添加の２％ＭｃＣｏｙ １００μｌを各ウェルに加えることによって、２種の血清型ＨＲＶのどちらかに細胞を感染させた。ウィルスを、３４℃で１時間ＯＨ−Ｉ細胞とインキュベートした。次に、ウィルス培養液をウェルから吸引し、全てのウェルを、ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で二度濯ぎ、抗生物質及びＭｇＣｌ_２添加の２％ＭｃＣｏｙ １．５ｍｌを改めて供給した。２４−ウェルプレート上の、プレコナリル又はルプリントリビルのみを投与されたウェルには、改めて７５０μｌの２×薬剤、及び２％ＭｃＣｏｙ ７５０μｌを供給し、３４℃で２４時間インキュベートした。上清の全体容量は１ウェル当たり１．５ｍｌであった。プレコナビル又はルプリントリビルのいずれかと培養した細胞は、ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしなかった。

各ｓｉＲＮＡ及び対照を表す各ウェルから４００μｌの上清サンプルを、トランスフェクションの２４、４８、及び７２時間後に採取し、その後の定量に備えてプールした。サンプルは−７０℃で保存した。２４時間及び７２時間採取サンプルについて１０倍連続希釈液を作製し、４重に定量した（１希釈当たり４ウェル、１ウェル当たり１００μｌ）。定量済みサンプルを、９６ウェルプレートで培養したＯＨ−Ｉ細胞とインキュベートした。７日間に渡って、細胞病理学的作用（ＣＰＥ）についてＯＨ−Ｉ細胞を観察した。２４時間採取サンプルは１０^０から１０^５希釈度において試験し、７２時間採取サンプルは１０^０から１０^７希釈度において試験した。ウィルス産生減少アッセイのために使用されるウィルスを凍結し、ＴＣＩＤ_５０で表した接種量を決めるために還元力価定量を行った。標的接種量は、単層当たり１０から３２ＴＣＩＤ_５０であった。

結果を、表３３、３４、３５にまとめる。表３３は、ｓｉＲＮＡにトランスフェクトされ、その後ＨＲＶ−１６血清型に感染したＯＨ−Ｉ細胞における、ｓｉＲＮＡ１から２５までのデータを要約する。表３４は、ｓｉＲＮＡにトランスフェクトされ、その後ＨＲＶ−１Ａ血清型に感染したＯＨ−Ｉ細胞におけるｓｉＲＮＡ１から２５までのデータを要約する。表３５は、ｓｉＲＮＡにトランスフェクトされ、その後ＨＲＶ−１６又はＨＲＶ−１Ａ血清型に感染したＯＨ−Ｉ細胞におけるｓｉＲＮＡ２１及び２４から３３までのデータを要約する。表３３及び３４の掲げるデータは、全体として、四つの異なる群に分類される。各群は、対照と組み合わせた（即ち、ウィルウ対照１は群１と、ウィルス対照２は群２と、等など）トランスフェクション及び感染プロトコールの下に置かれたｓｉＲＮＡサブセットを表す。各群は、同じトランスフェクション及び感染プロトコールの下に置かれ、同じウィルス対照を有する。群の異なるのは、ただ、各群の試験されたｓｉＲＮＡのサブセットが一緒に試験されていないということだけである。各群のウィルス対照は、群内のｓｉＲＮＡがウィルス複製を下げたかどうかを判断するための、比較のための基礎値として用いた。同様に、表３５に示したデータも、全体として四つの異なる群に分類される。各群は細い二重線で区分される。表３５の四つの群は、表３３及び３４の四つの群とは表示の上で全く関連がない。表３５の四つの群は、ウィルス対照と、使用したＨＲＶによって表される。例えば、一つの群は、ＨＲＶ−１６血清型と共に「ウィルス対照１」を含む。

１０から３２ＴＣＩＤ_５０のＴＣＩＤ_５０が達成された。全ての場合において、陽性対照のプレコナリル及びルプリントリビルは、ウィルス対照に比べて抑制的であり、２４時間で２ｌｏｇ_１０以上、７２時間で５ｌｏｇ_１０の低下をもたらした。本実施例では、ｓｉＲＮＡは、それが、ウィルス対照と比べて、ウィルス力価を、１．０ｌｏｇ_１０以上下げた時、ウィルス産生を有意に下げたと見なされた。そりよりも低下が高度の場合、それは特異的抑制を示すものと考えられる。ＨＲＶ−１６に対して試験された３３個のｓｉＲＮＡの内、６個のｓｉＲＮＡ（１０、１３、１４、１５、１７、及び１８）が、ウィルス対照に比べ、２４時間においてウィルス産生の有意の低下（１．５から１．７５ｌｏｇ_１０／ｍｌ）を示した（表３３及び３５）。７２時間では、１２個のｓｉＲＮＡ（７から１７まで、及び１９）が、ウィルス力価を１．５から２．０ｌｏｇ_１０／ｍｌ下げ、一つのｓｉＲＮＡは、ウィルス力価を２．５ｌｏｇ_１０下げた。

ＨＲＶ−１Ａに対して試験された３３個の構築体の内、２個のｓｉＲＮＡ（７及び８）が、２４時間において、ウィルス対照に比べ、力価の１．２５ｌｏｇ_１０低下を示し、７２時間では、それぞれ、１．５及び１．７５ｌｏｇ_１０だけウィルス力価を下げた（表３４及び３５）。更に、ｓｉＲＮＡ６番は、７２時間でウィルス力価を１．２５ｌｏｇ_１０下げた。試験した残りのｓｉＲＮＡについては、ＨＲＶ−１６に対しても、ＨＲＶ−１Ａに対しても実質的な抑制を示さなかった。

表３３．ｓｉＲＮＡ介在による、ヒトライノウィルス−１６力価のインビトロ低下

ウィルス対照は、ｓｉＲＮＡトランスフェクションを伴わない、ウィルスによる細胞の感染である。

表３４．ｓｉＲＮＡ介在による、ヒトライノウィルス−１Ａ力価のインビトロ低下

表３５．ｓｉＲＮＡ介在による、ヒトライノウィルス−１Ａ及びヒトライノウィルス−１６力価のインビトロ低下

以上まとめると、両陽性プロトコールは、期待通り、プレコナビルは１μｇで、ルプリントリビルは１０μｇで、２４時間及び７２時間においてＨＲＶの両血清型を著明に抑制した。ｓｉＲＮＡ１０、１３−１５、１７、及び１８は、２４時間で、ｓｉＲＮＡ７から１９は、７２時間で、ＨＲＶ−１６のウィルス力価を、ウィルス対照に比べて少なくとも１．０ｌｏｇ_１０下げた。ｓｉＲＮＡ７及び８は２４時間において、ｓｉＲＮＡ４から６は７２時間において、ＨＲＶ−１Ａウィルス力価を、ウィルス対照に比べて少なくとも１．０ｌｏｇ_１０下げた。

表３３、３４、及び３５のデータは、選択されたｓｉＲＮＡは、インビトロにおいてヒトライノウィルスの複製を効果的に下げることが可能であることを示す。

実施例３０．ヒトメタニューモウィルスの、ｓｉＲＮＡ介在によるインビトロ分解
本実施例は、本発明の例示のｓｉＲＮＡが、インビトロにおいて、ヒトメタニューモウィルス（ｈＭＰＶ）の標的転写体（ＲＮＡ）のＲＮＡコピー数を著明に下げることを示す。ある特定のウィルス転写体の、ウィルスＲＮＡコピー数の低下は、ウィルス複製の低下と相関する。従って、ウィルス複製の低下は、新規ウィルス粒子の産生を抑える、及び／又は阻止するので、抑制はしないまでも、再感染を抑え、患者におけるウィルス誘発性病的現象を極小に止める。

本実施例は、二重ルシフェラーゼアッセイシステムを用いて、２００個のｓｉＲＮＡに対して行った初回スクリーニングを説明する。このシステムは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性の低下によって間接的に測定される標的ＲＮＡレベルを効果的に低下させるｓｉＲＮＡを特定するためのものである。更に、本実施例は、２００個のｓｉＲＮＡに対する初回スクリーニングから選択された５７個の特定ｓｉＲＮＡの二次スクリーニングについて説明する。二次スクリーニングは、標的ｈＭＰＶ ＲＮＡレベルを効果的に低下させるｓｉＲＮＡの特徴を直接に明らかにするために行われた。

下記の表３６は、二重ルシフェラーゼアッセイによる初回スクリーニングを受けた２００個のｓｉＲＮＡを記載する。ｈＭＰＶ ＲＮＡを標的とするよう選択された、この２００個のｓｉＲＮＡは、次のｈＭＰＶ遺伝子、即ち、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２−１遺伝子、Ｍ２−２遺伝子、又はＬ遺伝子の内の一つの「逆向き」領域（単複）を表す。これらのｓｉＲＮＡは、ｈＭＰＶゲノムの、一般公開されるＧｅｎｂａｎｋヌクレオチド配列（アクセス番号ＡＹ２９７７４８．１）を分析し、整列させることによってそれらの配列の中から「保存」領域を抽出することによって選んだ。初回スクリーニングでは、各ｓｉＲＮＡは、１０ｎＭ濃度において三重に試験した。

表３６．二重ルシフェラーゼアッセイによってスクリーニングされたｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列

下記の表３７は、二重ルシフェラーゼアッセイの結果を要約する。蛍ルシフェラーゼは、トランスフェクションの内部対照、及びルシフェラーゼアッセイ対照を表す（即ち、蛍ルシフェラーゼ転写体はｓｉＲＮＡの標的ではない）。ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、ｈＭＰＶ標的配列と融合される。ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性の低下は、細胞内におけるｈＭＰＶ標的配列転写体当たりのｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ数の減少を示す。従って、本アッセイによれば、ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性測定値の低下が大きければ大きいほど、より強力なｓｉＲＮＡであることを示す。ｓｉＲＮＡの効力は、表３７では沈黙化パーセント（沈黙化％）で示し、１００ｘ［１−（平均Ｒｅｎｉｌｌａ ｓｉＲＮＡ／平均蛍ｓｉＲＮＡ）／（平均Ｒｅｎｉｌｌａ ｓｉ対照／平均蛍ｓｉ対照）］として計算した。パーセントが高ければ高いほど、より強力なｓｉＲＮＡと相関する。

表３７．標的ＲＮＡ分解効力に関してスクリーニングされた２００個のｓｉＲＮＡの、二重ルシフェラーゼアッセイ結果

ＮＤはデータ無しである。

本実施例及び表３７に掲げたデータの目的では、標的Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに対し４０％以上の沈黙化を示すｓｉＲＮＡを効果的ｓｉＲＮＡと見なした。表３７のデータに基づき、下記の５７個のｓｉＲＮＡを効果的ｓｉＲＮＡと見なした。即ち、１、６、１７、１８、２８、３２、３３、３４、４５、４７、４８、５９、６０、６４、６６、７０、７３、７８、８０、８１、８５、８７、８８、８９、９０、９３、９５、９８、９９、１０２、１０５、１１８、１２１、１２２、１２６、１３０、１３８、１３９、１４１、１４３、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５６、１５７、１５８、１６３、１６４、１６８、１６９、１８４、１９７、及び１９８である。この５７個の、有効と特定されたｓｉＲＮＡについて、５７個の内のどれが、直接、標的とするｈＭＰＶの転写体の分解を効果的に誘発するのかを決めるために、二次スクリーニングにおいてそれらの特徴を解明した。

５７個のｓｉＲＮＡ（配列については下記の表３８を参照）を、下記の標的ウィルス遺伝子の内の一つから転写される、標的ｈＭＰＶ ＲＮＡの分解誘発能力についてスクリーングした。標的ウィルス遺伝子は、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｍ２−１遺伝子、Ｍ２−２遺伝子、又はＬ遺伝子である。一般に、本実施例用として培養細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、感染する方法は既に上に開示される。

Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標）のｓｉ対照を、対照ｓｉＲＮＡとして用いた。ウィルスＲＮＡのコピー数は、定量的リアルタイムＰＣＲを用い、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされ、ｈＭＰＶ感染した細胞から分離されたＲＮＡの複製変化を、既知の基準、即ち、既知のコピー数を有する鋳型を用いて実施したリアルタイムＰＣＲで得られる複製変化と比較することによって定量した（Ｄｅｆｆｒａｓｎｅｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３，４８８−９０（２００５））。ウィルスＲＮＡを、１４０μｌの感染細胞培養体上清から抽出し、逆転写及びリアルタイムＰＣＲの開始材料として用いた。ウィルスＲＮＡコピー数が低いほどより強力なｓｉＲＮＡであることを示す。更に、抑制パーセントが大きいほどより強力なｓｉＲＮＡであることを示す。

表３８．ヒトメタニューモウィルス遺伝子転写体を標的とする５７ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列

表９８のデータは、１０ｎＭ ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後におけるｓｉＲＮＡ標的ｈＭＰＶ転写体のウィルスＲＮＡコピー数に対する５７個の異なるｓｉＲＮＡの個別の作用をまとめたものである。各「ＰＣＲ結果群」は、リアルタイムＰＣＲによってまとめて分析した５７個のｓｉＲＮＡサブセットの結果を表す。表３９のデータでは、１０個の「ＰＣＲ結果群」がある。ウィルスＲＮＡコピー数の平均値は、３回の別々のＰＣＲから得られた。各ｓｉＲＮＡの、ウィルスＲＮＡのコピー数低下能力は、抑制パーセント（「抑制％」）として表した。５７個の異なるｓｉＲＮＡそれぞれの抑制パーセント（「抑制％」）を計算するために、「ＰＣＲ結果群」の中の各ｓｉＲＮＡのウィルスＲＮＡコピー数の平均値を、同じ「ＰＣＲ結果群」のｓｉ対照におけるウィルスＲＮＡコピー数の平均値で割った。この数字を、表３９の「ｓｉＲＮＡ：ｓｉ対照比」という題名のついたコラムの下に表す。この数字を、１００を掛けてパーセントに変換し、次に、得られた積を１００％から差し引いて、各ｓｉＲＮＡの抑制パーセントを得た（「抑制パーセント」という題名のついたコラムを参照）。比較的高い抑制パーセントは、そのｓｉＲＮＡが、標的とするｈＭＰＶ転写体のウィルスＲＮＡコピー数を低下する能力が大きいこと、従って、ウィルス複製のより強力な抑制因子である可能性の高いことを示す。負の抑制パーセントは、対照ｓｉＲＮＡに比べ、ウィルスＲＮＡコピー数の増加を示す。

表３９．１０ｎＭ ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後における、ｈＭＰＶ標的転写体のＲＮＡコピー数に対する、５７個の異なるｓｉＲＮＡの作用

表３９のデータは、１９個のｓｉＲＮＡが、１０ｎＭ濃度において、ウィルス遺伝子転写体に対して５０％以上の抑制を示したことを明らかにする。そのｓｉＲＮＡは、Ｎ転写体を標的とする６個のｓｉＲＮＡ、Ｐ転写体を標的とする２個のｓｉＲＮＡ、Ｍ転写体を標的とする１個のｓｉＲＮＡ、Ｍ２転写体を標的とする１個のｓｉＲＮＡ、及びＬ転写体を標的とする９個のｓｉＲＮＡを含む。１０個のＰＣＲ結果群におけるｓｉＲＮＡ無し対照は、−３８４％から６３％の範囲を有する抑制パーセントを示した。ｓｉ対照におけるウィルスＲＮＡのコピー数数値を、各ＰＣＲ結果群の基礎値として用い、これを０％抑制に正規化した。１０ｎＭ濃度においてトランスフェクトされた５７個のｓｉＲＮＡは、１８６％から９７％に渡る抑制パーセントを示した。これは、標的転写体のＲＮＡコピー数を低下させることが可能ｓｉＲＮＡを特定するには、ウィルス標的転写体の「保存」領域のヌクレオチド配列に基づく選択ではまだ十分ではないことを示す。５０％以上の抑制％を示すｓｉＲＮＡを、１０ｎＭ濃度においてウィルスＲＮＡのコピー数を低下させるのに有効であると見なした（６０％及び６３％の抑制を示した、２個のｓｉＲＮＡ無し対照は該当せずとし、考慮に入れなかった）。５０％以上の抑制を示したｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ１、６、３２、３３、４５、４８、５９、６０、７０、９８、１１８、１２６、１４３、１４９、１５０、１５１、１６３、１６４、１６８、及び１９７を含んでいた。

表４０のデータは、５７個の異なるｓｉＲＮＡにおいて、１００ｎＭ ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後の細胞におけるｓｉＲＮＡ標的ｈＭＰＶ転写体のウィルスＲＮＡコピー数に及ぼす前記ｓｉＲＮＡの個別の作用を示す（表３９に掲げた前のデータ組と比べると、ｓｉＲＮＡ濃度が１０倍大きい）。各ＰＣＲ結果群は、リアルタイムＰＣＲによって一緒に分析された５７個のｓｉＲＮＡサブセットの結果を表す。表４０のデータについては、６個のＰＣＲ結果群がある。各ｓｉＲＮＡの、ウィルスＲＮＡのコピー数低下効力は、抑制パーセント（「抑制％」）として表した。ウィルスＲＮＡコピー数平均値は、２回の別々のＰＣＲから得た。５７個の異なるｓｉＲＮＡそれぞれの抑制パーセント（「抑制％」）を計算するために、「ＰＣＲ結果群」の中の各ｓｉＲＮＡのウィルスＲＮＡコピー数の平均値を、同じ「ＰＣＲ結果群」のｓｉ対照におけるウィルスＲＮＡコピー数の平均値で割った。この数字を、表４０の「ｓｉＲＮＡ：ｓｉ対照比」という題名のついたコラムの下に表す。この数字を、１００を掛けてパーセントに変換し、次に、得られた積を１００％から差し引いて、各ｓｉＲＮＡの抑制パーセントを得た（「抑制パーセント」という題名のついたコラムを参照）。比較的高い抑制パーセントは、そのｓｉＲＮＡが、標的とするｈＭＰＶ転写体のウィルスＲＮＡコピー数を低下する能力が大きいこと、従って、ウィルス複製のより強力な抑制因子である可能性の高いことを示す。負の抑制パーセントは、対照ｓｉＲＮＡに比べ、ウィルスＲＮＡコピー数の増加を示す。

表４０．１００ｎＭ ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後における、ｈＭＰＶ標的転写体のＲＮＡコピー数に対する、５７個の異なるｓｉＲＮＡの作用

表４０のデータは、２７個のｓｉＲＮＡが、インビトロにおいて、ｈＭＰＶウィルス遺伝子の発現に対し５０％以上の抑制を示したことを明らかにする。そのｓｉＲＮＡは、Ｎ転写体を標的とする５個のｓｉＲＮＡ、Ｐ転写体を標的とする２個のｓｉＲＮＡ、Ｆ転写体を標的とする２個のｓｉＲＮＡ、Ｍ２転写体を標的とする３個のｓｉＲＮＡ、及びＬ転写体を標的とする１５個のｓｉＲＮＡを含む。全体として、表４３に示す細胞トランスフェクション／ウィルス感染の定量的ＰＣＲの結果は、ルシフェラーゼリポーターアッセイ結果と一致した。５個のＰＣＲ結果群におけるｓｉ対照は、−８７％から３２％の範囲を有する抑制パーセントを示した。これは、抑制パーセントを計算するための基礎値として用いられた表４２のｓｉ対照と好対照をなす。このデータ組では、Ｎｏ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ無添加）を各ＰＣＲ結果群の基礎値とし、０％抑制に正規化した。１００ｎＭ濃度においてトランスフェクトされた５７個のｓｉＲＮＡは、−２０８％から９７％に渡る抑制パーセントを示した。この場合も、標的転写体のＲＮＡコピー数を低下させることが可能ｓｉＲＮＡを特定するには、ウィルス標的転写体の「保存」領域のヌクレオチド配列に基づく選択ではまだ十分ではないことを示している。ｓｉ対照に観察される抑制パーセント（即ち、３２%抑制）に基づき、５０％以上の抑制％を示すｓｉＲＮＡだけを、１００ｎＭ濃度においてウィルスＲＮＡのコピー数を低下させるのに有効であると見なした。５０％以上の抑制を示したｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ１、３２、３３、４５、４７、５９、６０、８７、８９、９８、１０２、１０５、１１８、１２２、１２６、１３０、１４９、１５０、１５１、１５７、１５８、１６３、１６４、１６８、１８４、１９７、及び１９８を含んでいた。

表３９及び４０のデータは、選択されたｓｉＲＮＡは、１０ｎＭ又は１００ｎＭ濃度のいずれか、又はその両方の濃度において、標的ｈＭＰＶ転写体のウィルスＲＮＡのコピー数を効果的に抑制する能力を示すことを実証する。

実施例３１：複数ウィルス標的
本実施例は、ｈＭＰＶ標的ＲＮＡの著明な分解を仲介することが可能なｓｉＲＮＡはまた、ＲＳＶウィルスのＲＮＡも分解することが可能であることを示す。全体的な細胞培養及びトランスフェクションプロトコールは前述のものを用いた。ウィルスＲＮＡのコピー数は、定量的リアルタイムＰＣＲを用い、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされ、ｈＭＰＶ感染した細胞から分離されたＲＮＡの複製変化を、既知の基準、即ち、既知のコピー数を有する鋳型を用いて実施したリアルタイムＰＣＲで得られる複製変化と比較することによって定量した（Ｄｅｆｆｒａｓｎｅｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３，４８８−９０（２００５））。ウィルスＲＮＡコピー数が低いほど、より強力なｓｉＲＮＡであることを示す。更に、抑制パーセントが大きいほど、より強力なｓｉＲＮＡであることを示す。

ｈＭＰＶのＬ転写体のウィルスコピー数を効果的に低下させる能力を示したｓｉＲＮＡ１１８、１２６、１５０、１５１、及び１５８について、ＲＳＶ標的ＲＮＡに対して同じことをするその能力について評価した。各ｓｉＲＮＡは、１０ｎＭ濃度においてトランスフェクトされた。データを下記の表４１に示す。

表４１．１０ｎＭ ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後における、ＲＳＶ標的転写体のＲＮＡコピー数に対する、６個の異なるｓｉＲＮＡの作用

表４１の結果は、ｓｉＲＮＡ１５８が、ＲＳＶコピー数を約２０％抑制すると測定されたように、ＲＳＶ転写体を分解する能力を示すことが明らかにする。これらのデータは、様々なウィルス科から得られるウィルス転写体を分解することが可能な、複数ウィルスを標的とするｓｉＲＮＡの作製が可能であることを示す。

これまで、本発明は、その特異的実施態様を参照しながら説明してきたわけであるが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を加え、等価物で置換することが可能であることを当業者達は理解しなければならない。更に、ある特定の状況、材料、材料の組成、工程、工程の一つのステップ又は複数のステップに適応させるために、本発明の目的、精神、及び範囲に対し数多くの改変を実施することが可能である。そのような改変は全て、本明細書に付属する特許請求の範囲の中に含まれることが意図される。

図１は、本発明の標的ウィルスの整列された核酸配列のＡ−Ｋシリーズを示す。図１Ａは、配列番号１１，４２６−１１，４３０を、それぞれ、出現の順序に従って開示する。 図１は、本発明の標的ウィルスの整列された核酸配列のＡ−Ｋシリーズを示す。図１Ｂは、配列番号１１，４３１−１１，４３４を、それぞれ、出現の順序に従って開示する。 図１は、本発明の標的ウィルスの整列された核酸配列のＡ−Ｋシリーズを示す。図１Ｃは、配列番号１１，４３５−１１，４４０を、それぞれ、出現の順序に従って開示する。 図１は、本発明の標的ウィルスの整列された核酸配列のＡ−Ｋシリーズを示す。図１Ｄは、配列番号１１，４４１−１１，４４３を、それぞれ、出現の順序に従って開示する。 図１は、本発明の標的ウィルスの整列された核酸配列のＡ−Ｋシリーズを示す。図１Ｅは、配列番号１１，４４４−１１，４４６を、それぞれ、出現の順序に従って開示する。 図１は、本発明の標的ウィルスの整列された核酸配列のＡ−Ｋシリーズを示す。図１Ｆは、配列番号１１，４４７−１１，４５０を、それぞれ、出現の順序に従って開示する。 図１は、本発明の標的ウィルスの整列された核酸配列のＡ−Ｋシリーズを示す。図１Ｇは、配列番号１１，４５１−１１，４５４を、それぞれ、出現の順序に従って開示する。 図１は、本発明の標的ウィルスの整列された核酸配列のＡ−Ｋシリーズを示す。図１Ｈは、配列番号１１，４５５−１１，４５８を、それぞれ、出現の順序に従って開示する。 図１は、本発明の標的ウィルスの整列された核酸配列のＡ−Ｋシリーズを示す。図１Ｉは、配列番号１１，４５９−１１，４６１を、それぞれ、出現の順序に従って開示する。 図１は、本発明の標的ウィルスの整列された核酸配列のＡ−Ｋシリーズを示す。図１Ｊは、配列番号１１，４６２−１１，４６５を、それぞれ、出現の順序に従って開示する。 図１は、本発明の標的ウィルスの整列された核酸配列のＡ−Ｋシリーズを示す。図１Ｋは、配列番号１１，４６６−１１，４７０を、それぞれ、出現の順序に従って開示する。 図２は、マウスにおいて、インフルエンザ特異的ｓｉＲＮＡの投与によって、インフルエンザウィルスの産生が抑制されることを示す。マウスに対し、ｊｅＰＥＩと複合体を形成するＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡ又はＧＦＰ ｓｉＲＮＡの漸増量を静注した。３時間後、マウスに、インフルエンザＡのＰＲ８変異種を感染させた。感染２４時間後、肺ホモジェネートをＭＤＣＫ−ＨＡアッセイに用いウィルス力価を測定した。群間のＰ値は統計的有意を示す。 図３は、ｓｉＲＮＡの治療的投与が、マウスにおいてインフルエンザウィルスの産生を抑制することを示す。インフルエンザ感染の５時間後、マウスに、ｊｅｔＰＥＩと複合体を形成するＮＰ−ｓｉＲＮＡ、又はＰＡ−ｓｉＲＮＡを静注した。感染の２８時間後、ＭＤＣＫ−ＨＡアッセイによって肺ホモジェネートにおいてウィルス力価を測定した。各データポイントは１匹のマウスを表す。群間のＰ値は統計的有意を示す。 図４は、インフルエンザ特異的ｓｉＲＮＡによる治療は、極めて病原性の高いＨ５及びＨ７ニワトリインフルエンザウィルスＡによる致命的チャレンジに対して、広範な交差保護を与えることを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり８匹）に、ウィルスチャレンジの１日前に５０μｇのｓｉＲＮＡを静注投与し、ウィルスチャレンジの当日にさらに２０μｇのｓｉＲＮＡを鼻腔内投与した。１０回の、ＬＤ５０用量の、鼻腔内投与によるウィルスチャレンジ後、１６日間にわたってマウスの体重と生存率を監視した。黒塗り円、ＧＦＰ−特異的ｓｉＲＮＡ；白塗り円、ＮＰプラスＰＡ−特異的ｓｉＲＮＡ。 図５は、ＰＢＳに溶解した、表示量のＮＰ特異的ｓｉＲＮＡ、又はＰＢＳ対照の鼻腔内投与によって治療されたＢＡＬＢ／ｃマウスを示す。２時間後、全てのマウスを、ＰＲ８血清型によって鼻腔内感染した（１０００ｐｆｕ／マウス）。感染の２４時間後、肺を採取し、ＭＤＣＫ−ＨＡアッセイによって肺ホモジェネートにおいてウィルス力価を測定した。ＰＢＳ群とｓｉＲＮＡ群の間のＰ値は、０．５、１、及び２ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ治療群について統計的に有意であることを示す。 図６は、対照ｓｉＲＮＡ及びＮＰ−標的ｓｉＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、ＰＢＳ溶液）を鼻腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウスを示す。３時間後、全てのマウスを、ＰＲ８血清型によって鼻腔内感染した（５０ｐｆｕ／マウス）。感染の２４及び４８時間後、肺を採取し、左肺から全ＲＮＡを分離した。全ｍＲＮＡを、ｄＴ１８プライマーを用い逆転写してｃＤＮＡとした。ＰＢ１特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを実行し、ウィルスのｍＲＮＡレベルを定量した。内部対照としてＧＡＰＤＨを用いた。右及び中央肺をホモジェナイズし、ＭＤＣＫ−ＨＡアッセイによってウィルス力価を測定した。感染の４８時間後のサンプルのウィルス力価を図に示す（スチューデントのｔ検定を用いたところ、ＰＢＳ処置群及びＮＰ ｓｉＲＮＡ処置群の間に統計的有意差が見出された（ｐ＝０．０１））。感染２４時間後のサンプルの力価は低すぎて検出できなかった。これは、恐らくｓｉＲＮＡ指令の抑制によるものと考えられる。 図７は、ＰＢＳに溶解した、１０ｍｇ／ｋｇのシクロフィリンＢ特異的ｓｉＲＮＡ、又はＧＦＰ ｓｉＲＮＡ，又はＰＢＳ対照の鼻腔内投与によって治療されたＢＡＬＢ／ｃマウスを示す。１群当たり５匹のマウスがいる。２４時間後、肺を採取した。この肺サンプルから全ＲＮＡを精製し、ｄＴ１８プライマーを用いて逆転写を行った。リアルタイムＰＣＲにおいてシクロフィリンＢ特異的プライマーを用いて、標的ｍＲＮＡレベルを定量した。このＰＣＲ反応には、対照としてＧＡＰＤＨ特異的プライマーも用いた。 図８は、コクリエートｓｉＲＮＡ処方の鼻腔内投与によるインビボにおけるインフルエンザウィルスの抑制を示す。 図９は、コクリエートｓｉＲＮＡ処方の静注投与によるインビボにおけるインフルエンザウィルスの抑制を示す。 図１０Ａは、インフルエンザウィルス抑制のために、コクリエート処方において輸送されるｓｉＲＮＡ静注投与の用量−反応プロフィールを示す。 図１０Ｂは、コクリエートｓｉＲＮＡ処方の経口胃管投与によってインビボにおいて誘発されるインフルエンザウィルス抑制を示す。 図１１Ａ−Ｃは、ｓｉＲＮＡは、ＭＤＣＫ細胞においてインフルエンザウィルス産生を抑制することを示す実験結果を示す。各種ウィルス転写物を標的とする６個の異なるｓｉＲＮＡを、電気穿孔によってＭＤＣＫの中に導入し、８時間後、細胞をウィルスで感染した。図１１Ａは、各種ｓｉＲＮＡの存在下又は不在下において、或いは、対照ｓｉＲＮＡの存在下に、０．０１の感染効率（ＭＯＩ）でウィルス株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）（ＰＲ８）を感染した後、様々な時間において赤血球凝集反応によって測定した培養上清のウィルス力価の時間経過を示す。 図１１Ａ−Ｃは、ｓｉＲＮＡは、ＭＤＣＫ細胞においてインフルエンザウィルス産生を抑制することを示す実験結果を示す。各種ウィルス転写物を標的とする６個の異なるｓｉＲＮＡを、電気穿孔によってＭＤＣＫの中に導入し、８時間後、細胞をウィルスで感染した。図１１Ｂは、各種ｓｉＲＮＡの存在下又は不在下において、或いは、対照ｓｉＲＮＡの存在下に、０．０１のＭＯＩでウィルス株Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）（ＷＳＮ）を感染した後、様々な時間において赤血球凝集反応によって測定した培養上清のウィルス力価の時間経過を示す。 図１１Ａ−Ｃは、ｓｉＲＮＡは、ＭＤＣＫ細胞においてインフルエンザウィルス産生を抑制することを示す実験結果を示す。各種ウィルス転写物を標的とする６個の異なるｓｉＲＮＡを、電気穿孔によってＭＤＣＫの中に導入し、８時間後、細胞をウィルスで感染した。図１１Ｃは、擬似トランフェクトするか、又はｓｉＲＮＡ ＮＰ−１４６でトランスフェクトしたウィルス感染細胞から得られた培養上清におけるウィルス力価を示すプラークアッセイを示す。 図１１Ｄは、様々な用量のｓｉＲＮＡにおけるインフルエンザウィルス産生の抑制を示す。ＭＤＣＫ細胞に、表示量のＮＰ−１４９６ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、次いで、０．０１ＭＯＩでＰＲ８ウィルスを感染させた。感染の４８時間後ウィルスの力価を測定した。２回の実験の内の一方から得られた代表的データを示す。 図１２は、インフルエンザウィルスの遺伝子セグメントに対する、各種ｓｉＲＮＡの相対的位置が、インフルエンザウィルス抑制の効力と相関することを示す。 図１３Ａは、ｓｉＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ／輸送剤組成物注入のための区域を示す、発達途上のニワトリ胚の模式図を示す。 図１３Ｂは、各種ｓｉＲＮＡが、発達途上のニワトリ胚においてインフルエンザウィルス産生を抑制する能力を持つことを示す。 図１４は、核タンパクと、ウィルスＲＮＡ分子との相互作用を示す模式図である。 図１５は、インフルエンザウィルスｖＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＲＮＡ（鋳型ＲＮＡ）の間の相違、及びこれらのＲＮＡ間の関係を示す模式図である。 図１６は、感染の６から８時間前に、擬似トランスフェクトされるか、又はｓｉＲＮＡ ＮＰ−１４９６によってトランスフェクトされた細胞において、ウィルス感染後の様々な時間で見られるウィルスのＮＰ及びＮＳ ＲＮＡの量を示す。 図１７Ａは、インフルエンザウィルス産生の抑制には、二重鎖ｓｉＲＮＡにおいて野生型（ｗｔ）アンチセンス鎖が必要であることを示す。ＭＤＣＫ細胞を先ず、ｗｔ及び修飾（ｍ）鎖から形成されるｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、８時間後、０．１ＭＯＩでＰＲ８ウィルスを感染した。感染２４時間後、培養上清におけるウィルス力価を定量した。 図１７Ｂは、Ｍ−特異的ｓｉＲＮＡが、特異的ｍＲＮＡの蓄積を抑制することを示す。ＭＤＣＫ細胞にＭ−３７をトランスフェクトし、０．０１ＭＯＩでＰＲ８ウィルスを感染し、感染後１、２、及び３時間後に細胞を採取し、ＲＮＡを分離した。Ｍ−特異的ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーによる逆転写、次いでリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウィルスＲＮＡ分子のレベルを、同じサンプル中のガンマ−アクチンｍＲＮＡ（最下段パネル）のレベルに対し正規化した。ＲＮＡの相対レベルは、平均±Ｓ．Ｄ．として示す。２回の実験の内の一方から得られた代表的データを示す。 図１８Ａ−Ｄは、ＮＰ−特異的ｓｉＲＮＡが、ＮＰ−ばかりでなく、Ｍ−、及びＮＳ−特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡの蓄積を抑制することを示す。ＭＤＣＫ（Ａ−Ｃ）及びベロ（Ｄ）細胞に、ＮＰ−１４９６をトランスフェクトし、０．１ＭＯＩでＰＲ８ウィルスを感染し、感染の１、２、及び３時間後に採取して、ＲＮＡを分離した。ＮＰ、Ｍ、及びＮＳに対して特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーによる逆転写、次いでリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウィルスＲＮＡ分子のレベルを、同じサンプル中のガンマ−アクチンｍＲＮＡ（図示せず）のレベルに対し正規化した。ＲＮＡの相対レベルを示す。３回の実験の内の一つから得られた代表的データを示す。 図１８Ａ−Ｄは、ＮＰ−特異的ｓｉＲＮＡが、ＮＰ−ばかりでなく、Ｍ−、及びＮＳ−特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡの蓄積を抑制することを示す。ＭＤＣＫ（Ａ−Ｃ）及びベロ（Ｄ）細胞に、ＮＰ−１４９６をトランスフェクトし、０．１ＭＯＩでＰＲ８ウィルスを感染し、感染の１、２、及び３時間後に採取して、ＲＮＡを分離した。ＮＰ、Ｍ、及びＮＳに対して特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーによる逆転写、次いでリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウィルスＲＮＡ分子のレベルを、同じサンプル中のガンマ−アクチンｍＲＮＡ（図示せず）のレベルに対し正規化した。ＲＮＡの相対レベルを示す。３回の実験の内の一つから得られた代表的データを示す。 図１８Ａ−Ｄは、ＮＰ−特異的ｓｉＲＮＡが、ＮＰ−ばかりでなく、Ｍ−、及びＮＳ−特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡの蓄積を抑制することを示す。ＭＤＣＫ（Ａ−Ｃ）及びベロ（Ｄ）細胞に、ＮＰ−１４９６をトランスフェクトし、０．１ＭＯＩでＰＲ８ウィルスを感染し、感染の１、２、及び３時間後に採取して、ＲＮＡを分離した。ＮＰ、Ｍ、及びＮＳに対して特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーによる逆転写、次いでリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウィルスＲＮＡ分子のレベルを、同じサンプル中のガンマ−アクチンｍＲＮＡ（図示せず）のレベルに対し正規化した。ＲＮＡの相対レベルを示す。３回の実験の内の一つから得られた代表的データを示す。 図１８Ａ−Ｄは、ＮＰ−特異的ｓｉＲＮＡが、ＮＰ−ばかりでなく、Ｍ−、及びＮＳ−特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡの蓄積を抑制することを示す。ＭＤＣＫ（Ａ−Ｃ）及びベロ（Ｄ）細胞に、ＮＰ−１４９６をトランスフェクトし、０．１ＭＯＩでＰＲ８ウィルスを感染し、感染の１、２、及び３時間後に採取して、ＲＮＡを分離した。ＮＰ、Ｍ、及びＮＳに対して特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーによる逆転写、次いでリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウィルスＲＮＡ分子のレベルを、同じサンプル中のガンマ−アクチンｍＲＮＡ（図示せず）のレベルに対し正規化した。ＲＮＡの相対レベルを示す。３回の実験の内の一つから得られた代表的データを示す。 図１８Ｅ−Ｇにおいて、各図の右側は、ＰＡ−特異的ｓｉＲＮＡが、ＰＡ−ばかりでなく、Ｍ−、及びＮＳ−特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡの蓄積を抑制することを示す。ＭＤＣＫ細胞にＰＡ−１４９６をトランスフェクトし、０．１ＭＯＩでＰＲ８ウィルスを感染し、感染の１、２、及び３時間後に採取して、ＲＮＡを分離した。ＰＡ、Ｍ、及びＮＳに対して特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーによる逆転写、次いでリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウィルスＲＮＡ分子のレベルを、同じサンプル中のガンマ−アクチンｍＲＮＡ（図示せず）のレベルに対し正規化した。ＲＮＡの相対レベルを示す。 図１８Ｅ−Ｇにおいて、各図の右側は、ＰＡ−特異的ｓｉＲＮＡが、ＰＡ−ばかりでなく、Ｍ−、及びＮＳ−特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡの蓄積を抑制することを示す。ＭＤＣＫ細胞にＰＡ−１４９６をトランスフェクトし、０．１ＭＯＩでＰＲ８ウィルスを感染し、感染の１、２、及び３時間後に採取して、ＲＮＡを分離した。ＰＡ、Ｍ、及びＮＳに対して特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーによる逆転写、次いでリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウィルスＲＮＡ分子のレベルを、同じサンプル中のガンマ−アクチンｍＲＮＡ（図示せず）のレベルに対し正規化した。ＲＮＡの相対レベルを示す。 図１８Ｅ−Ｇにおいて、各図の右側は、ＰＡ−特異的ｓｉＲＮＡが、ＰＡ−ばかりでなく、Ｍ−、及びＮＳ−特異的ｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、及びｃＲＮＡの蓄積を抑制することを示す。ＭＤＣＫ細胞にＰＡ−１４９６をトランスフェクトし、０．１ＭＯＩでＰＲ８ウィルスを感染し、感染の１、２、及び３時間後に採取して、ＲＮＡを分離した。ＰＡ、Ｍ、及びＮＳに対して特異的なｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びｖＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーによる逆転写、次いでリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウィルスＲＮＡ分子のレベルを、同じサンプル中のガンマ−アクチンｍＲＮＡ（図示せず）のレベルに対し正規化した。ＲＮＡの相対レベルを示す。 図１８Ｈは、ＮＰ−特異的ｓｉＲＮＡが、ＰＢ１−（上段パネル）、ＰＢ２−（中断パネル）、及びＰＡ−（下段パネル）特異的ｍＲＮＡを抑制することを示す。ＭＤＣＫ細胞にＮＰ−１４９６をトランスフェクトし、０．１ＭＯＩでＰＲ８ウィルスを感染し、感染の１、２、及び３時間後に採取して、ＲＮＡを分離した。ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ ｍＲＮＡに対して特異的なｍＲＮＡのレベルを、ＲＮＡ特異的プライマーによる逆転写、次いでリアルタイムＰＣＲによって測定した。各ウィルスＲＮＡ分子のレベルを、同じサンプル中のガンマ−アクチンｍＲＮＡ（図示せず）のレベルに対し正規化した。ＲＮＡの相対レベルを示す。 図１９Ａは、ｓｉＲＮＡが、インフルエンザウィルスの感染前に陽イオンポリマーＰＥＩと一緒に投与されると、マウスにおけるインフルエンザウィルスの産生を抑制することを示すプロットである。黒塗り四角（処置せず）；白抜き四角（ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ）；白抜き円（３０ｍｕ．ｇ ＮＰ ｓｉＲＮＡ）；黒塗り円（６０ｍｕ．ｇ ＮＰ ｓｉＲＮＡ）である。各符号は個別の動物を表す。異なる群間のｐ値を示す。 図１９Ｂは、ｓｉＲＮＡが、インフルエンザウィルスの感染前に陽イオンポリマーＰＬＬと一緒に投与されると、マウスにおけるインフルエンザウィルスの産生を抑制することを示すプロットである。黒塗り四角（処置せず）；白抜き四角（ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ）；黒塗り円（６０ｍｕ．ｇ ＮＰ ｓｉＲＮＡ）である。各符号は個別の動物を表す。異なる群間のｐ値を示す。 図１９Ｃは、ｓｉＲＮＡが、インフルエンザウィルスの感染前に陽イオンポリマーｊｅｔＰＥＩと一緒に投与されると、ＰＢＳに溶解して投与されるよりも、マウスにおけるインフルエンザウィルスの産生をより効果的に抑制することを示すプロットである。白抜き四角（処置せず）；白抜き三角（ＰＢＳに溶解したＧＦＰ ｓｉＲＮＡ）；黒塗り三角（ＰＢＳに溶解したＮＰ ｓｉＲＮＡ）；白抜き円（ＧＦＰ ｓｉＲＮＡのｊｅｔＰＥＩとの共同投与）；黒塗り円（ＮＰ ｓｉＲＮＡのｊｅｔＰＥＩとの共同投与）である。各符号は個別の動物を表す。異なる群間のｐ値を示す。 図２０は、インフルエンザウィルスＮＰ及びＰＡ転写体を標的とするｓｉＲＮＡが、インフルエンザウィルスによる感染前に一緒に投与されると、加重作用を呈することを示すプロットである。黒塗り四角（処置せず）；白抜き円（６０ｍｕ．ｇ ＮＰ ｓｉＲＮＡ）；白抜き三角（６０ｍｕ．ｇ ＰＡ ｓｉＲＮＡ）；黒塗り円（６０ｍｕ．ｇ ＮＰ ｓｉＲＮＡ＋６０ｍｕ．ｇ ＰＡ ｓｉＲＮＡ）。各符号は個別の動物を表す。異なる群間のｐ値を示す。 図２１は、ｓｉＲＮＡが、マウスにおいて、インフルエンザウィルスによる感染前に投与されると、インフルエンザウィルスの産生を抑制することを示すプロットである。黒塗り四角（処置せず）；白抜き四角（６０ｍｕ．ｇ ＰＡ ｓｉＲＮＡ）；白抜き円（６０ｍｕ．ｇ ＮＰ ｓｉＲＮＡ）；黒塗り円（６０ｍｕ．ｇ ＮＰ ｓｉＲＮＡ＋６０ｍｕ．ｇ ＰＡ ｓｉＲＮＡ）。各符号は個別の動物を表す。異なる群間のｐ値を示す。 図２２Ａは、ｓｈＲＮＡを発現するレンチウィルスベクターの模式図である。ｓｈＲＮＡの転写はＵ６プロモーターによって開始される。ＥＧＦＰの発現は、ＣＭＶプロモーターによって開始される。ＳＩＮ−ＬＴＲ、．ＰＳＩ．，ｃＰＰＴ、及びＷＲＥは、レンチウィルス成分である。ＮＰ−１４９６ ｓｈＲＮＡの配列を示す。 図２２Ｂは、図２２Ｂに描かれるレンチウィルスが、ＥＧＦＰを用量依存的に発現することを示すフローサイトメトリー結果のプロットを示す。レンチウィルスは、ＮＰ−１４９６ａ ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡベクターを共同トランスフェクトし、ベクターを２９３Ｔ細胞にパッケージすることによって産生される。培養上清（０．２５ｍｌ又は１．０ｍｌ）を用いてベロ細胞を感染した。得られたベロ細胞系統（ベロ−ＮＰ−０．２５及びベロ−ＮＰ−１．０）、及び、対照（未感染）ベロ細胞を、ＧＦＰ発現に関して、フローサイトメトリーによって分析した。ベロ−ＮＰ−０．２５（図の上段）と、ベロ−ＮＰ−１．０（図の下段）の平均蛍光強度を示す。影付き曲線は、対照（未感染）ベロ細胞の平均蛍光強度を表す。 図２２Ｃは、ＮＰ−１４９６ ｓｈＲＮＡを発現するベロ細胞におけるインフルエンザウィルス産生の抑制を示すプロットである。ＮＰ−１４９６ ｓｈＲＮＡを発現する親ベロ細胞を、０．０４、０．２、及び１のＭＯＩでＰＲ８ウィルスに感染させた。上清のウィルス力価を、感染の４８時間後赤血球凝集（ＨＡ）アッセイによって定量した。 図２３は、インフルエンザウィルス転写体を標的とするｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡベクターを投与することによって、マウスにおけるインフルエンザウィルス産生が抑制されることを示すプロットである。ＲＳＶ、ＮＰ−１４９６（ＮＰ）、又はＰＢ１−２２５７（ＰＢ１）ｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ６０ｍｕ．ｇを４０ｍｕ．ｌのＩｎｆａｓｕｒｆと混ぜ合わせ、点滴によってマウスに投与した。未処置（ＮＴ）群では、マウスに５％グルコース６０ｍｕ．ｌを点滴した。１３時間後、マウスに１マウス当たり１２０００ｐｆｕのＰＲ８ウィルスを鼻腔を通じて感染した。感染の２４時間後、肺のウィルス力価を、ＭＤＣＫ／赤血球凝集アッセイによって測定した。各データポイントは１匹のマウスを表す。異なる群間のｐ値を示す。

Claims (81)

1. 呼吸器系ウィルス転写体を標的とするＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ＲＮＡｉ誘発性実体が約１５から約６０のヌクレオチド長であり：
   ａ．ウィルスタンパクをコードする核酸の一部に対し少なくとも約８４%同一である第１核酸配列と；
   ｂ．第１核酸部分に対して少なくとも８４％相補的である第２核酸配列と；
   を具えることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
2. 請求項１に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ＲＮＡｉ誘発性実体が約１５から約４０のヌクレオチド長であり：
   ａ．ウィルスタンパクをコードする核酸の一部に対し少なくとも約８９％同一である第１核酸配列と；
   ｂ．第１核酸部分に対して少なくとも８９％相補的である第２核酸配列と；
   を具えることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
3. 請求項１に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ＲＮＡｉ誘発性実体が約１５から約４０のヌクレオチド長であり：
   ａ．ウィルスタンパクをコードする核酸の一部に対し少なくとも約９４％同一である第１核酸配列と；
   ｂ．第１核酸部分に対して少なくとも９４％相補的である第２核酸配列と
   を具えることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
4. 請求項１に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ＲＮＡｉ誘発性実体がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
5. 請求項１に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記核酸が３’オーバーハングを具えることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
6. 請求項５に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記３’オーバーハングがデオキシチミジンを具えることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
7. 請求項１に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ウィルスタンパクが、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスから成る群より選択されるウィルスから得られることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
8. 請求項１に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ウィルスタンパクが、呼吸器ウィルスタンパクであることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
9. 請求項１に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ウィルスタンパクが、インフルエンザウィルスタンパクであることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
10. 請求項１に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ＲＮＡｉ誘発性実体がｓｈＲＮＡであり、ヘアピンループ構造体を形成する第３核酸配列を更に具えることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
11. 請求項１０に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ヘアピンループ構造体が、４から１１個のヌクレオチドを具えることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
12. ウィルスタンパクをコードするウィルス核酸配列の一部、又はその相補体に対し、その長さに沿って少なくとも約８５％同一であることを特徴とする約１６から約３５のヌクレオチド長である分離核酸配列。
13. 請求項１２に記載の核酸において、前記ウィルスタンパクが、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスから成る群より選択されるウィルスから得られることを特徴とする核酸。
14. 請求項１２に記載の核酸において、前記ウィルスタンパクが呼吸器ウィルスタンパクであることを特徴とする核酸。
15. 請求項１２に記載の核酸において、前記ウィルスタンパクがインフルエンザウィルスタンパクであることを特徴とする核酸。
16. インフルエンザウィルスタンパク転写体を標的とするＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ＲＮＡｉ誘発性実体が約１５から約６０のヌクレオチド長であり：
    ａ．配列番号１から１０７０９からなる群より選択される核酸配列、又は前記核酸配列に対して少なくとも８０％相同な核酸配列を具える第１核酸配列と；
    ｂ．第１核酸配列に対して少なくとも８０％相補的である第２核酸配列と；
    を具えることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
17. 請求項１６に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記第２核酸配列が、前記第１核酸部分に対して少なくとも約９０％相補的であることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
18. 請求項１６に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ＲＮＡｉ誘発性実体がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
19. 請求項１６に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ＲＮＡｉ誘発性実体がｓｈＲＮＡであり、ヘアピンループ構造体を形成する第３核酸配列を更に具えることを特徴とする、ＲＮＡｉ誘発性実体。
20. 請求項１９に記載のＲＮＡｉ誘発性実体において、前記ヘアピンループ構造体が、４から１１のヌクレオチドを具えることを特徴とするＲＮＡｉ誘発性実体。
21. ウィルスタンパク転写体の保存部位を標的とするｓｉＲＮＡにおいて、前記ＲＮＡｉ誘発性実体が約１５から約６０のヌクレオチド長であることを特徴とするウィルスタンパク転写体の保存部位を標的とするｓｉＲＮＡ。
22. 請求項２１に記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記保存部位が、約３００ヌクレオチド長であり、前記ウィルスタンパク遺伝子の３’末端を具えることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
23. 請求項２１に記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記ウィルスタンパクが、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスから成る群より選択されるウィルスから得られることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
24. 請求項２１に記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記ウィルスタンパクが呼吸器ウィルスタンパクであることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
25. 請求項２１に記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記ウィルスタンパクがインフルエンザウィルスタンパクであることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
26. 第１ウィルスタンパクをコードする第１遺伝子、及び、第２ウィルスタンパクをコードする第２遺伝子の発現を抑えるｓｉＲＮＡ。
27. 請求項２６に記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記第１及び第２ウィルス遺伝子が、同じウィルスの異なる株由来であることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
28. 請求項２６に記載のｓｉＲＮＡにおいて、前記第１及び第２ウィルス遺伝子が、二つの異なるウィルス由来であることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
29. 請求項２８に記載のｓｉＲＮＡにおいて、一のウィルスがインフルエンザウィルスであることを特徴とするｓｉＲＮＡ。
30. ウィルスタンパクをコードする二又はそれ以上の遺伝子の発現を、少なくとも約２５％低減することを特徴とするｓｉＲＮＡ。
31. ＲＮＡｉ誘発因子において、その配列が、ウィルスタンパクをコードする核酸の標的部分を具える転写体を標的とするＲＮＡｉ誘発因子。
32. 請求項３１に記載のＲＮＡｉ誘発因子において、前記ＲＮＡｉ誘発因子がｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであることを特徴とするＲＮＡｉ誘発因子。
33. 請求項３１に記載のＲＮＡｉ誘発因子において、前記ウィルスタンパクが、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスから成る群より選択されるウィルスから得られることを特徴とするＲＮＡｉ誘発因子。
34. 請求項３１に記載のＲＮＡｉ誘発因子において、前記ウィルスタンパクが呼吸器ウィルスタンパクであることを特徴とするＲＮＡｉ誘発因子。
35. 請求項３１に記載のＲＮＡｉ誘発因子において、前記ウィルスタンパクがインフルエンザタンパクであることを特徴とするＲＮＡｉ誘発因子。
36. 組成物が第１ｓｉＲＮＡ及び第２ｓｉＲＮＡを具え、各々が、ウィルスタンパクをコードする遺伝子の発現を低減することを特徴とする組成物。
37. 請求項３６に記載の組成物において、前記第１ｓｉＲＮＡが、第１ウィルスタンパクをコードする第１遺伝子の発現を抑え、前記第２ｓｉＲＮＡが、第２ウィルスタンパクをコードする第２遺伝子の発現を抑えることを特徴とする組成物。
38. 請求項３７に記載の組成物において、前記第１及び第２ｓｉＲＮＡが、前記第１及び第２遺伝子の発現を少なくとも約２５％低減することを特徴とする組成物。
39. 請求項３７に記載の組成物において、前記第１及び第２ウィルス遺伝子が、同じウィルス種の異なる株由来であることを特徴とする組成物。
40. 請求項３７に記載の組成物において、前記第１及び第２ウィルス遺伝子が、同じウィルス属の二つのウィルス種由来であることを特徴とする組成物。
41. 請求項３７に記載の組成物において、前記第１及び第２遺伝子が、同じウィルス科の二つのウィルス由来であることを特徴とする組成物。
42. 請求項３６に記載の組成物が、第３ウィルスタンパクをコードする第３遺伝子の発現を少なくとも約２５％低減する第３ｓｉＲＮＡを更に具えることを特徴とする組成物。
43. 請求項４２に記載の組成物が、陽イオン性ポリマーを更に具えることを特徴とする組成物。
44. 診断キットが前記遺伝子の少なくとも一部においてウィルスタンパク遺伝子を検出するプライマー又はプローブを具え、前記一部が保存部位であることを特徴とする診断キット。
45. ウィルス感染哺乳類細胞における標的ウィルス遺伝子の発現を抑える方法において、ウィルスタンパク遺伝子の発現を抑えるｓｉＲＮＡと前記細胞を接触させて、前記ｓｉＲＮＡが、前記哺乳類細胞の細胞原形質に進入し、前記ウィルスタンパク遺伝子の発現を少なくとも約２５％低減するようにするステップを具えることを特徴とする方法。
46. 請求項４５に記載の方法において、前記ウィルスタンパクが、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスから成る群より選択されるウィルスから得られることを特徴とする方法。
47. 請求項４５に記載の方法において、前記ウィルスタンパク遺伝子が、呼吸器ウィルスタンパク遺伝子であることを特徴とする方法。
48. 請求項４５に記載の方法において、前記ウィルスタンパク遺伝子が、インフルエンザウィルスタンパク遺伝子であることを特徴とする方法。
49. ｓｉＲＮＡを、該ｓｉＲＮＡを必要とする被験体に送達する方法において、前記ｓｉＲＮＡの有効量を具える組成物を前記被験体に投与するステップを具え、ウィルスタンパク遺伝子の発現を少なくとも約２５％低減することを特徴とする方法。
50. 請求項４９に記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡが、被験体の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇから被験体の体重の約２０ｍｇ／ｋｇの濃度で前記被験体に送達されることを特徴とする方法。
51. 請求項４９に記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡが、被験体の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇから被験体の体重の約１０ｍｇ／ｋｇの濃度で前記被験体に送達されることを特徴とする方法。
52. 請求項４９に記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡが、被験体の体重の約０．１ｍｇから被験体の体重の約５０ｍｇの濃度で前記被験体に送達されることを特徴とする、請求項４９による方法。
53. 請求項４９に記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡが、ウィルスタンパク遺伝子の発現を少なくとも約２５％低減することを特徴とする方法。
54. 請求項４９に記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１から１０７０９から成る群より選択される核酸配列を具えることを特徴とする方法。
55. 請求項４９に記載の方法において、前記組成物が、陽イオン性ポリマーを更に具えることを特徴とする方法。
56. 請求項４９に記載の方法において、前記組成物が、吸引、鼻腔内、経口、又は静脈内を通じて投与されることを特徴とする方法。
57. 被験体のウィルス感染を予防又は治療する方法が、ウィルスのタンパク遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを具える治療化合物を該被験体に投与するステップを具えることを特徴とする方法。
58. 請求項５７に記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡ又は前記ｓｈＲＮＡが、約１５から約６０のヌクレオチド長であり：
    ａ．ウィルスタンパクをコードする核酸の一部に対して少なくとも約８５％同一である第１核酸配列と；
    ｂ．第１核酸部分に対して少なくとも８５％相補的である第２核酸配列と；
    を具えることを特徴とする方法。
59. 請求項５７に記載の方法において、前記ｓｉＲＮＡが、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が約１５から約５０ヌクレオチドであり、前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、前記呼吸器ウィルスの核酸配列中の保存部位、又はその変異種に対して同一の核酸配列を具えることを特徴とする方法。
60. 請求項５７に記載の方法において、前記呼吸器ウィルスが、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスから成る群より選択されることを特徴とする方法。
61. 請求項５７に記載の方法において、前記核酸配列が核タンパク遺伝子をコードすることを特徴とする方法。
62. 請求項５７に記載の方法において、前記呼吸器ウィルスがインフルエンザウィルスであり、前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１０７１０から１０７５１から成る群より選択されないことを特徴とする方法。
63. 請求項５７に記載の方法において、前記治療化合物が、陽イオン性ポリマーを具えることを特徴とする方法。
64. 哺乳類被験体の呼吸器系におけるウィルスの産生を阻害するための薬剤の製造におけるｓｉＲＮＡ分子の使用において、被験体に対する該ウィルスのタンパク遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを具える治療化合物を、該被験体に投与するステップを具えることを特徴とする使用。
65. 請求項６４に記載のｓｉＲＮＡ分子の使用において、前記ｓｉＲＮＡ分子が約１５から約６０のヌクレオチド長であり：
    ａ．ウィルスタンパクをコードする核酸の一部に対して少なくとも約８５%同一である第１核酸配列と；
    ｂ．第１核酸部分に対して少なくとも８４％相補的である第２核酸配列と；
    を具えることを特徴とするｓｉＲＮＡ分子の使用。
66. 請求項６４に記載のｓｉＲＮＡ分子の使用において、前記ｓｉＲＮＡが、二本鎖ｓｉＲＮＡ分子であり、前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が約１５から約５０ヌクレオチドであり、前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、前記呼吸器ウィルスの核酸配列中の保存部位、又はその変異種に対して同一の核酸配列を具えることを特徴とするｓｉＲＮＡ分子の使用。
67. 請求項６４に記載のｓｉＲＮＡ分子の使用において、前記呼吸器ウィルスが、ヒト呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスから成る群より選択されることを特徴とするｓｉＲＮＡ分子の使用。
68. 請求項６４に記載のｓｉＲＮＡ分子の使用において、前記核酸配列がタンパク（ＮＰ）遺伝子をコードすることを特徴とするｓｉＲＮＡ分子の使用。
69. 請求項６４に記載のｓｉＲＮＡ分子の使用において、前記呼吸器ウィルスがインフルエンザウィルスであり、ｓｉＲＮＡが、配列番号１０７１０から１０７５１から成る群より選択されないことを特徴とするｓｉＲＮＡ分子の使用。
70. 請求項６４に記載のｓｉＲＮＡ分子の使用において、前記呼吸器ウィルスがインフルエンザウィルスであり、ｓｉＲＮＡが、配列番号１から１０７０９から成る群より選択されることを特徴とするｓｉＲＮＡ分子の使用。
71. 二又はそれ以上のウィルスのウィルスタンパク転写体中に存在するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ標的配列を同定する方法において：
    ａ．ウィルスから、ウィルスタンパクをコードする核酸配列を調製するステップと；
    ｂ．前記核酸配列の標的部分であって、前記部分が約１９ヌクレオチドを具え、３個を超える連続グアニンヌクレオチド、又は３個を超える連続シトシンヌクレオチドを具えない標的部分を同定するステップと；
    ｃ．ステップ（ａ）及び（ｂ）を一又はそれ以上の回数繰り返し、各繰り返しで様々なウィルスを用いて、これによって、前記ウィルスタンパク転写体上にｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ標的配列を同定するステップと；
    を具えることを特徴とする方法。
72. 請求項７１に記載の方法において、前記核酸配列が、タンパク配列の保存部位を具えることを特徴とする方法。
73. 請求項７１に記載の方法が、前記標的配列に結合するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを生成するステップを更に具えることを特徴とする方法。
74. ウィルス感染を診断する方法において、前記被験体が、請求項１に記載のＲＮＡｉ誘発性実体による阻害に対して感受性を有するウィルスに感染したかどうかを決定するステップを具えることを特徴とする方法。
75. 請求項７１に記載の方法が、前記被験体に対してＲＮＡｉ誘発実体を投与するステップを更に具えることを特徴とする方法。
76. インフルエンザウィルス感染を治療又は予防する方法において、治療又は予防を要する被験体に、請求項１に記載のＲＮＡｉ誘発性実体を投与するステップを具えることを特徴とする方法。
77. 呼吸器ウィルスの産生を阻害する二本鎖ｓｉＤＮＡ分子において、前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖が約１５から約５０ヌクレオチドであり、前記ｓｉＲＮＡ分子の一方の鎖が、前記呼吸器ウィルスの核酸配列中の保存部位、又はその変異種に対して同一の核酸配列を具えることを特徴とする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子。
78. 請求項７７に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡにおいて、前記呼吸器ウィルスが、呼吸器合胞体ウィルス、ヒト・メタニューモウィルス、ヒト・パラインフルエンザウィルス１、ヒト・パラインフルエンザウィルス２、ヒト・パラインフルエンザウィルス３、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ａ、ヒト・パラインフルエンザウィルス４ｂ、ライノウィルス、及びインフルエンザウィルスから成る群より選択されることを特徴とする二本鎖ｓｉＲＮＡ。
79. 請求項７８に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子において、前記核酸配列が、タンパク（ＮＰ）遺伝子をコードすることを特徴とする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子。
80. 請求項７８に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子において、前記呼吸器ウィルスがインフルエンザウィルスであり、前記ｓｉＲＮＡが、配列番号１０７１０から１０７５１から成る群より選択されないことを特徴とする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子。
81. 請求項７８に記載の二本鎖ｓｉＲＮＡ分子において、前記呼吸器ウィルスがインフルエンザウィルスであり、ｓｉＲＮＡが、配列番号１から１０７０９から成る群より選択されることを特徴とする二本鎖ｓｉＲＮＡ分子。

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