JP2001124775A - インフルエンザａ型およびｂ型の存在を視覚的に検出するためのフロースルーアッセイ - Google Patents
インフルエンザａ型およびｂ型の存在を視覚的に検出するためのフロースルーアッセイInfo
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- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトインフルエンザＡ型またはＢ型を診断す
る方法であって、使用が比較的単純で安価な手法および
装置を提供する。 【解決手段】 本発明は、臨床検体中のヒトインフルエ
ンザＡ型抗原およびＢ型抗原を検出するための診断的試
験に関する。抗原は、インフルエンザＡ型またはＢ型に
特異的な抗体の存在を決定することによって検出する。
抗体ＡおよびＢは特徴的な酵素に結合し、抗原が存在す
る場合には酵素が１つ以上の基質と反応して検出可能な
反応生成物を生成する。
る方法であって、使用が比較的単純で安価な手法および
装置を提供する。 【解決手段】 本発明は、臨床検体中のヒトインフルエ
ンザＡ型抗原およびＢ型抗原を検出するための診断的試
験に関する。抗原は、インフルエンザＡ型またはＢ型に
特異的な抗体の存在を決定することによって検出する。
抗体ＡおよびＢは特徴的な酵素に結合し、抗原が存在す
る場合には酵素が１つ以上の基質と反応して検出可能な
反応生成物を生成する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検体中のヒト
インフルエンザＡ型およびＢ型抗原を検出するための診
断的試験に関する。抗原は、インフルエンザＡ型または
Ｂ型に特異的な抗体の存在を決定することによって検出
する。抗体ＡおよびＢは特徴的な酵素に結合し、抗原が
存在する場合には、酵素が１つ以上の基質と反応して検
出可能な反応生成物を生成する。
インフルエンザＡ型およびＢ型抗原を検出するための診
断的試験に関する。抗原は、インフルエンザＡ型または
Ｂ型に特異的な抗体の存在を決定することによって検出
する。抗体ＡおよびＢは特徴的な酵素に結合し、抗原が
存在する場合には、酵素が１つ以上の基質と反応して検
出可能な反応生成物を生成する。
【０００２】
【従来の技術】ウイルス感染の迅速な診断は、有効な医
療行為にとって不可欠な部分をなしている。ウイルスの
中には、抗体が生成されることのできる限定的な抗原を
有しているものがある。これらの抗体および抗原（例え
ば免疫反応物）は互いに結合することができる。その結
果、高い特異的反応機序を引き起こし、これを用いるこ
とによって、生物試料中の特定抗原の存在または濃度を
ｉｎ ｖｉｔｒｏで検出することができる。従って、イ
ムノアッセイは、抗原の測定およびビリオンの存在また
は不存在のその後の決定のために広く用いられてきた。
療行為にとって不可欠な部分をなしている。ウイルスの
中には、抗体が生成されることのできる限定的な抗原を
有しているものがある。これらの抗体および抗原（例え
ば免疫反応物）は互いに結合することができる。その結
果、高い特異的反応機序を引き起こし、これを用いるこ
とによって、生物試料中の特定抗原の存在または濃度を
ｉｎ ｖｉｔｒｏで検出することができる。従って、イ
ムノアッセイは、抗原の測定およびビリオンの存在また
は不存在のその後の決定のために広く用いられてきた。
【０００３】免疫反応物を用いたイムノアッセイ方法が
いくつか知られており、該方法中、免疫反応物の少なく
とも１つが、分析的に識別されるように、検出可能な成
分で標識されている。例えば、「サンドイッチ」または
「二部位」手法は、抗原と２つの抗体との間で三元複合
系を形成することを含む。このような手法において、複
合体形成を検出するための便利な方法は、固相支持体に
結合した標識されている１抗体および標識されていない
１抗原を供給して、複合体を容易に単離できるようにす
ることである。この例では、固相に結合した標識されて
いる抗体の量が、試験試料中の分析物の量に正比例す
る。
いくつか知られており、該方法中、免疫反応物の少なく
とも１つが、分析的に識別されるように、検出可能な成
分で標識されている。例えば、「サンドイッチ」または
「二部位」手法は、抗原と２つの抗体との間で三元複合
系を形成することを含む。このような手法において、複
合体形成を検出するための便利な方法は、固相支持体に
結合した標識されている１抗体および標識されていない
１抗原を供給して、複合体を容易に単離できるようにす
ることである。この例では、固相に結合した標識されて
いる抗体の量が、試験試料中の分析物の量に正比例す
る。
【０００４】別の手法は「拮抗的」アッセイである。拮
抗的アッセイの一例では、捕獲機序は不溶性固相に結合
した抗体を再度使用する、しかし、（標識された抗体と
いうよりも）標識された分析物は、固定化抗体に結合す
るために試験試料中に存在する分析物と拮抗する。同様
に、固定化分析物は、標識された抗体に関する分析物に
拮抗することができる。これらの拮抗的アッセイでは、
標識された試薬の捕獲された量が、試料中に存在する分
析物の量に反比例する。
抗的アッセイの一例では、捕獲機序は不溶性固相に結合
した抗体を再度使用する、しかし、（標識された抗体と
いうよりも）標識された分析物は、固定化抗体に結合す
るために試験試料中に存在する分析物と拮抗する。同様
に、固定化分析物は、標識された抗体に関する分析物に
拮抗することができる。これらの拮抗的アッセイでは、
標識された試薬の捕獲された量が、試料中に存在する分
析物の量に反比例する。
【０００５】アッセイ装置および手順は数多くあり、こ
こで、標識された試薬または相補結合要素（ディップス
ティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、テストストリップ（ｔ
ｅｓｔｓｔｒｉｐ）、フロー−スルーパッド、紙、繊維
マトリックスまたは他の固相材料などの固相上に固定さ
れている）に分析物が結合することによって、分析物の
存在が示される。そのような特異的結合反応の結果、固
相上に固定化されたものと遊離しているものとの間で標
識されている試薬の分配が生じる。通常試験試料中の分
析物の存在および量は、標識試薬が固相上に固定化され
た程度によって示される。
こで、標識された試薬または相補結合要素（ディップス
ティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、テストストリップ（ｔ
ｅｓｔｓｔｒｉｐ）、フロー−スルーパッド、紙、繊維
マトリックスまたは他の固相材料などの固相上に固定さ
れている）に分析物が結合することによって、分析物の
存在が示される。そのような特異的結合反応の結果、固
相上に固定化されたものと遊離しているものとの間で標
識されている試薬の分配が生じる。通常試験試料中の分
析物の存在および量は、標識試薬が固相上に固定化され
た程度によって示される。
【０００６】特異的結合アッセイの実施において多孔質
のテストストリップを使用することもまた、よく知られ
ている。サンドイッチアッセイ手順では、試験試料はテ
ストストリップの一部に塗布され、毛管現象によってス
トリップ材料を通って移動することができる。検出され
るまたは測定される分析物は、テストストリップを通り
抜け、分析物特異的結合要素が固定化されているテスト
ストリップ上の検出ゾーンへ移動する。分析物が検出ゾ
ーン中で結合している程度が測定される。
のテストストリップを使用することもまた、よく知られ
ている。サンドイッチアッセイ手順では、試験試料はテ
ストストリップの一部に塗布され、毛管現象によってス
トリップ材料を通って移動することができる。検出され
るまたは測定される分析物は、テストストリップを通り
抜け、分析物特異的結合要素が固定化されているテスト
ストリップ上の検出ゾーンへ移動する。分析物が検出ゾ
ーン中で結合している程度が測定される。
【０００７】試験溶液から分析物を除去するために、様
々な結合方法が用いられてきた。米国特許第４，０２
０，１５１号には、試験試料中の抗原または抗体を定量
するための固相アッセイが記述されている。試料抗原ま
たは抗体は、陰イオン交換樹脂などの固体支持体表面上
に直接吸収され、その後支持体は、試料抗原または抗体
と免疫反応性である標識特異的結合要素に露出される。
々な結合方法が用いられてきた。米国特許第４，０２
０，１５１号には、試験試料中の抗原または抗体を定量
するための固相アッセイが記述されている。試料抗原ま
たは抗体は、陰イオン交換樹脂などの固体支持体表面上
に直接吸収され、その後支持体は、試料抗原または抗体
と免疫反応性である標識特異的結合要素に露出される。
【０００８】他の方法は、二次的特異的結合要素の使用
を含む。米国特許第４，６２４，９３０には、抗原を３
つのレセプター（抗原および第二レセプターに結合する
第一および第三レセプター、並びに固体支持体に結合
し、第一レセプターに特異的に結合する第二レセプタ
ー）とインキュベートすることによって、多価抗原の存
在を決定する方法が記述されている。
を含む。米国特許第４，６２４，９３０には、抗原を３
つのレセプター（抗原および第二レセプターに結合する
第一および第三レセプター、並びに固体支持体に結合
し、第一レセプターに特異的に結合する第二レセプタ
ー）とインキュベートすることによって、多価抗原の存
在を決定する方法が記述されている。
【０００９】上述の原理を使用する装置の例が、米国特
許第５，８６６，３２２号、５，６６３，０５５号、
４，０９４，６４７号、４，２３５，６０１号、４，３
６１，５３７号、４，３６６，２４１号、４，７４０，
４６８号、４，８７９，２１５号、４，９５６，２７５
号、４，０５９，４０７号、３，８０２，８４２号、
３，９１５，６３９号、４，６８９，３０９号、４，１
６８，１４６号、４，４３５，５０５号、４，５９４，
３２７号、４，７５７，００４号、４，９５６，３０２
号、４，０２０，１５１号、４，１４５，４０６号、
４，２１１，７６３号、４，３６２，６９７号、４，５
１７，２８８号、４，６２４，９３０号、４，３４３，
８９６号、４，８８０，７５１号、４，２９８，６８５
号、４，９３５，１４７号、４，９４８，７２６号、
４，９５９，３０３号、４，９９０，４４２号、４，８
３９，２３１号、４，７８０，４０９号、および４，５
３０，９００号に記述されており、これらは参照により
本明細書に組み込まれる。
許第５，８６６，３２２号、５，６６３，０５５号、
４，０９４，６４７号、４，２３５，６０１号、４，３
６１，５３７号、４，３６６，２４１号、４，７４０，
４６８号、４，８７９，２１５号、４，９５６，２７５
号、４，０５９，４０７号、３，８０２，８４２号、
３，９１５，６３９号、４，６８９，３０９号、４，１
６８，１４６号、４，４３５，５０５号、４，５９４，
３２７号、４，７５７，００４号、４，９５６，３０２
号、４，０２０，１５１号、４，１４５，４０６号、
４，２１１，７６３号、４，３６２，６９７号、４，５
１７，２８８号、４，６２４，９３０号、４，３４３，
８９６号、４，８８０，７５１号、４，２９８，６８５
号、４，９３５，１４７号、４，９４８，７２６号、
４，９５９，３０３号、４，９９０，４４２号、４，８
３９，２３１号、４，７８０，４０９号、および４，５
３０，９００号に記述されており、これらは参照により
本明細書に組み込まれる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】前述の検討により理解
されるように、診断の分野では重要な動きがある。それ
は使用するのが比較的単純で安価な手法および装置の必
要性が、常に大きくなっていることである。
されるように、診断の分野では重要な動きがある。それ
は使用するのが比較的単純で安価な手法および装置の必
要性が、常に大きくなっていることである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】（発明の要約）本発明
は、ヒトインフルエンザＡ型またはＢ型を診断する方法
であって、ａ）インフルエンザＡ型ウイルスまたはイン
フルエンザＢ型ウイルスを含んでいる疑いのある試験試
料を準備する工程、ｂ）試験試料を、ウイルス抗原が結
合する固相に接触させる工程、ｃ）固相を、第一酵素へ
結合している抗インフルエンザＡ型抗体および第二酵素
へ結合している抗インフルエンザＢ型抗体と接触させる
工程、ｄ）固相を第一酵素と第二酵素の基質に接触させ
る工程、およびｅ）少なくとも１つの酵素の作用によっ
て固相上に付着した発色沈殿物を視覚的に検出すること
により、ウイルス抗原の存在または量を決定する工程を
含む方法に関する。
は、ヒトインフルエンザＡ型またはＢ型を診断する方法
であって、ａ）インフルエンザＡ型ウイルスまたはイン
フルエンザＢ型ウイルスを含んでいる疑いのある試験試
料を準備する工程、ｂ）試験試料を、ウイルス抗原が結
合する固相に接触させる工程、ｃ）固相を、第一酵素へ
結合している抗インフルエンザＡ型抗体および第二酵素
へ結合している抗インフルエンザＢ型抗体と接触させる
工程、ｄ）固相を第一酵素と第二酵素の基質に接触させ
る工程、およびｅ）少なくとも１つの酵素の作用によっ
て固相上に付着した発色沈殿物を視覚的に検出すること
により、ウイルス抗原の存在または量を決定する工程を
含む方法に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】（発明の詳細な説明）本発明は、
臨床検体中のヒトインフルエンザＡ型およびＢ型の存在
を検出するために使用することができる。本発明中で試
験される臨床試料は、通常、洗浄液、去痰、吸引または
スワッブ検体として、集められた鼻、咽頭、鼻咽頭また
は呼吸性の分泌物である。
臨床検体中のヒトインフルエンザＡ型およびＢ型の存在
を検出するために使用することができる。本発明中で試
験される臨床試料は、通常、洗浄液、去痰、吸引または
スワッブ検体として、集められた鼻、咽頭、鼻咽頭また
は呼吸性の分泌物である。
【００１３】本発明中で利用できる試薬は、Ｄｉｒｅｃ
ｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕ Ａ製品付記の中で記載
されている通りに調製でき、これは参照により本明細書
に組み込まれる。ただし、好ましい実施形態中では、チ
メロサールはアジ化ナトリウムの代わりになる。
ｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕ Ａ製品付記の中で記載
されている通りに調製でき、これは参照により本明細書
に組み込まれる。ただし、好ましい実施形態中では、チ
メロサールはアジ化ナトリウムの代わりになる。
【００１４】本発明の好ましい実施形態において使用で
きる試薬の種類の例、およびそれらの使用方法を、以下
のよう説明する。
きる試薬の種類の例、およびそれらの使用方法を、以下
のよう説明する。
【００１５】試薬Ａ（抽出試薬）――アジ化ナトリウム
の代わりに０.２％チメロサールを使用できることを除
いて、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕキット
のものと同様。
の代わりに０.２％チメロサールを使用できることを除
いて、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕキット
のものと同様。
【００１６】抽出、１．６％ムコリチック剤および６．
４％洗浄剤、０.２％チメロサール（防腐剤）含む。
４％洗浄剤、０.２％チメロサール（防腐剤）含む。
【００１７】試薬１――変更なし（アジドなし） 洗浄、１５０ｍＭクエン酸
【００１８】試薬２――アジ化ナトリウムの代わりに
０.２％チメロサールを使用できることを除いて、Ｄｉ
ｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕキットのものと同
様。
０.２％チメロサールを使用できることを除いて、Ｄｉ
ｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕキットのものと同
様。
【００１９】洗浄、５０ｍＭトリスおよびウサギＩｇ
Ｇ、０.２％チメロサール（防腐剤）含む。
Ｇ、０.２％チメロサール（防腐剤）含む。
【００２０】試薬３――トリスバッファーで希釈した、
アルカリフォスファターゼ結合抗−インフルエンザＡ型
モノクローナル抗体（２）およびホースラディッシュペ
ルオキシダーゼ結合抗−インフルエンザＢ型モノクロー
ナル抗体（１）（Ｐｉｅｒｃｅ３１４９７）。
アルカリフォスファターゼ結合抗−インフルエンザＡ型
モノクローナル抗体（２）およびホースラディッシュペ
ルオキシダーゼ結合抗−インフルエンザＢ型モノクロー
ナル抗体（１）（Ｐｉｅｒｃｅ３１４９７）。
【００２１】試薬４――アジ化ナトリウムの代わりに
０.２％チメロサールを使用できることを除いて、Ｄｉ
ｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕキットのものと同
様。
０.２％チメロサールを使用できることを除いて、Ｄｉ
ｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕキットのものと同
様。
【００２２】洗浄、５％ブタノール、２Ｍウレアおよび
１００ｍＭヘペス、０.２％チメロサール（防腐剤）を
含む。
１００ｍＭヘペス、０.２％チメロサール（防腐剤）を
含む。
【００２３】試薬５――アジ化ナトリウムの代わりに
０.２％チメロサールを使用できることを除いて、Ｄｉ
ｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕキットのものと同
様。
０.２％チメロサールを使用できることを除いて、Ｄｉ
ｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕキットのものと同
様。
【００２４】洗浄、５０ｍＭトリスおよび１５０ｍＭＮ
ａＣｌ、０.２％チメロサール（防腐剤）を含む。
ａＣｌ、０.２％チメロサール（防腐剤）を含む。
【００２５】試薬６――アルカリフォスファターゼ基質
（コケ（Ｍｏｓｓ）、Ｉｎｃ．製品番号ＩＮＴＨ−１０
００）
（コケ（Ｍｏｓｓ）、Ｉｎｃ．製品番号ＩＮＴＨ−１０
００）
【００２６】試薬７――ＫＰＬ、ＨＲＰ基質（５０−７
７−００）ＴＭＢ膜ペルオキシダーゼ基質システム。
７−００）ＴＭＢ膜ペルオキシダーゼ基質システム。
【００２７】好ましい一実施形態では、本発明中で利用
できる抗原は、インフルエンザＢ型にはＢ Ｌｅｅ ４
０株、およびインフルエンザＡ型にはインフルエンザＡ
型ウイルスのサブタイプＨ１Ｎ１である。
できる抗原は、インフルエンザＢ型にはＢ Ｌｅｅ ４
０株、およびインフルエンザＡ型にはインフルエンザＡ
型ウイルスのサブタイプＨ１Ｎ１である。
【００２８】本発明で利用される固相装置は、例えばＤ
ｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）試験キットから選択し
てもよい。
ｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）試験キットから選択し
てもよい。
【００２９】抗−インフルエンザＡ型抗体および抗−イ
ンフルエンザＢ型抗体が酵素と結合していてもよいこと
は、当業者にはよく知られていることである。そのよう
な酵素には、例えば、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、およびベータ−グルクロニダーゼが
含まれる。
ンフルエンザＢ型抗体が酵素と結合していてもよいこと
は、当業者にはよく知られていることである。そのよう
な酵素には、例えば、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、およびベータ−グルクロニダーゼが
含まれる。
【００３０】図１から４は、本発明によるアッセイをお
おまかに表わした図である。
おまかに表わした図である。
【００３１】図面には、本発明のアッセイが、以下のス
キームに従って行われることが示されている： １．試料を抽出した後、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商
標）インフルエンザ検出装置（１）のフローコントロー
ラ（２）に塗布する。フローコントローラ（２）には三
角の開口部（３）が装備されており、試料はその開口部
（３）を通ってナイロン膜（４）へ流れる。ナイロン膜
（４）は吸収材料上に支持され、したがって、該サンプ
ルは、抗原をナイロン膜（４）に非特異的に三角形の形
で結合させつつナイロン膜（４）を通り抜け、吸収材料
へも流れ込む。
キームに従って行われることが示されている： １．試料を抽出した後、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商
標）インフルエンザ検出装置（１）のフローコントロー
ラ（２）に塗布する。フローコントローラ（２）には三
角の開口部（３）が装備されており、試料はその開口部
（３）を通ってナイロン膜（４）へ流れる。ナイロン膜
（４）は吸収材料上に支持され、したがって、該サンプ
ルは、抗原をナイロン膜（４）に非特異的に三角形の形
で結合させつつナイロン膜（４）を通り抜け、吸収材料
へも流れ込む。
【００３２】２．三角の開口部（３）のついたフローコ
ントローラ（２）を装置（１）から除去する。ナイロン
膜（４）のついた装置（１）には円形の開口部（６）が
装備されている。
ントローラ（２）を装置（１）から除去する。ナイロン
膜（４）のついた装置（１）には円形の開口部（６）が
装備されている。
【００３３】３．次に、洗浄溶液を装置（１）のナイロ
ン膜（４）に塗布する。
ン膜（４）に塗布する。
【００３４】４．次に、酵素に結合した抗インフルエン
ザ抗体を含んでいるトリスバッファー希釈剤を塗布す
る。インフルエンザ抗原が存在するときは、抗体はそこ
へ三角形の形で結合する。
ザ抗体を含んでいるトリスバッファー希釈剤を塗布す
る。インフルエンザ抗原が存在するときは、抗体はそこ
へ三角形の形で結合する。
【００３５】５．洗浄溶液を塗布し、次に酵素に適した
基質を塗布する。インフルエンザ抗原が存在するとき
は、発色した三角形（７）がみえる。
基質を塗布する。インフルエンザ抗原が存在するとき
は、発色した三角形（７）がみえる。
【００３６】好ましくは、アッセイは識別試験によって
インフルエンザＡ型およびインフルエンザＢ型を検出す
る。上記工程４で、溶液には異なる酵素に結合したイン
フルエンザＡ型抗体およびインフルエンザＢ型抗体が供
給される。特異的抗原の存在は、生成された三角形の色
によって検出される。
インフルエンザＡ型およびインフルエンザＢ型を検出す
る。上記工程４で、溶液には異なる酵素に結合したイン
フルエンザＡ型抗体およびインフルエンザＢ型抗体が供
給される。特異的抗原の存在は、生成された三角形の色
によって検出される。
【００３７】識別試験では、インフルエンザＡ型抗体に
結合したアルカリフォスファターゼおよびインフルエン
ザＢ型抗体に結合したホースラディッシュペルオキシダ
ーゼを利用してもよい。上記工程５で、アルカリフォス
ファターゼの基質を添加すると、インフルエンザＡ型抗
原が存在するときは、オレンジ色の三角形が生じる。好
ましい実施形態では、アルカリフォスファターゼの基質
混合物は、ブロモクロロインドリルりん酸およびｐ−イ
ンドニトロートトラゾリウム（ｐ−ｉｎｄｏｎｉｔｒｏ
ｔｅ ｔｒａｚｏｌｉｕｍ）であってよい。インフルエ
ンザＡ型抗原が存在しないときは、ナイロン膜は未着色
のままである。次に、ホースラディッシュペルオキシダ
ーゼの基質を加える。好ましい実施形態では、ホースラ
ディッシュペルオキシダーゼの基質混合物は、３，
３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジンおよび過酸
化水素であってよい。インフルエンザＢ型抗原が存在す
るときは、青い三角形が生じる。インフルエンザＢ型抗
原が存在しないときは、ナイロン膜は未着色のままであ
る。試薬を連続して添加する必要をなくすため、インフ
ルエンザＡ型基質およびインフルエンザＢ型基質は、１
つの試薬として混ぜておくのが最も好ましい。
結合したアルカリフォスファターゼおよびインフルエン
ザＢ型抗体に結合したホースラディッシュペルオキシダ
ーゼを利用してもよい。上記工程５で、アルカリフォス
ファターゼの基質を添加すると、インフルエンザＡ型抗
原が存在するときは、オレンジ色の三角形が生じる。好
ましい実施形態では、アルカリフォスファターゼの基質
混合物は、ブロモクロロインドリルりん酸およびｐ−イ
ンドニトロートトラゾリウム（ｐ−ｉｎｄｏｎｉｔｒｏ
ｔｅ ｔｒａｚｏｌｉｕｍ）であってよい。インフルエ
ンザＡ型抗原が存在しないときは、ナイロン膜は未着色
のままである。次に、ホースラディッシュペルオキシダ
ーゼの基質を加える。好ましい実施形態では、ホースラ
ディッシュペルオキシダーゼの基質混合物は、３，
３’，５，５’−テトラメチル−ベンジジンおよび過酸
化水素であってよい。インフルエンザＢ型抗原が存在す
るときは、青い三角形が生じる。インフルエンザＢ型抗
原が存在しないときは、ナイロン膜は未着色のままであ
る。試薬を連続して添加する必要をなくすため、インフ
ルエンザＡ型基質およびインフルエンザＢ型基質は、１
つの試薬として混ぜておくのが最も好ましい。
【００３８】
【実施例】（実施例１）本実施例では、ヒトインフルエ
ンザＡ型またはヒトインフルエンザＢ型の存在を検出す
るための識別方法を、本発明アッセイの以下の工程に従
い説明する：
ンザＡ型またはヒトインフルエンザＢ型の存在を検出す
るための識別方法を、本発明アッセイの以下の工程に従
い説明する：
【００３９】１．この実験では、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ
（登録商標）Ｆｌｕキット中に用意されている装置を使
用した。
（登録商標）Ｆｌｕキット中に用意されている装置を使
用した。
【００４０】２．抗原調製は、サブタイプＨ１Ｎ１のイ
ンフルエンザＡ型ウイルスの調製およびインフルエンザ
Ｂ型 Ｌｅｅ ４０の調製から成る。
ンフルエンザＡ型ウイルスの調製およびインフルエンザ
Ｂ型 Ｌｅｅ ４０の調製から成る。
【００４１】ネガティブコントロールには、０．２％ア
ジ化ナトリウムを含む洗浄剤処理された卵液体（非感
染）を使用した。
ジ化ナトリウムを含む洗浄剤処理された卵液体（非感
染）を使用した。
【００４２】３．試薬溶液は、アジ化ナトリウムの変わ
りにチメロサールを使用したことを除いてＤｉｒｅｃｔ
ｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕ Ａキットと同様に調製し
た。溶液を、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕ
Ａキットの製品付記に詳述されている容積で、スポイ
トバイアル中に分注した。
りにチメロサールを使用したことを除いてＤｉｒｅｃｔ
ｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕ Ａキットと同様に調製し
た。溶液を、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕ
Ａキットの製品付記に詳述されている容積で、スポイ
トバイアル中に分注した。
【００４３】４．Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）製
品付記に記述されているように、ネガティブコントロー
ル、インフルエンザＡ型抗原およびインフルエンザＢ型
抗原を、抽出試薬Ａと別々に混合した；抗原およびネガ
ティブコントロールを、それぞれ四（４）滴チューブに
分注し、続けて試薬Ａを八（８）滴分注した。
品付記に記述されているように、ネガティブコントロー
ル、インフルエンザＡ型抗原およびインフルエンザＢ型
抗原を、抽出試薬Ａと別々に混合した；抗原およびネガ
ティブコントロールを、それぞれ四（４）滴チューブに
分注し、続けて試薬Ａを八（８）滴分注した。
【００４４】５．抽出したインフルエンザＡ型抗原を装
置に１滴ずつ分注し、完全に吸収させた。
置に１滴ずつ分注し、完全に吸収させた。
【００４５】６．ウェルが一杯になるまで試薬１を装置
に添加し、完全に吸収させた。
に添加し、完全に吸収させた。
【００４６】７．フローコントローラを取り、試薬２
（四（４）滴）を装置の膜に塗布した。試薬は完全に吸
収させた。
（四（４）滴）を装置の膜に塗布した。試薬は完全に吸
収させた。
【００４７】８．四（４）滴の試薬３（抗−インフルエ
ンザＡ型／アルカリフォスファターゼおよび抗−インフ
ルエンザＢ型／ペルオキシダーゼ）を膜上に分注し、試
薬が完全に吸収された後に装置を二（２）分間放置し
た。
ンザＡ型／アルカリフォスファターゼおよび抗−インフ
ルエンザＢ型／ペルオキシダーゼ）を膜上に分注し、試
薬が完全に吸収された後に装置を二（２）分間放置し
た。
【００４８】９．装置ウェルが一杯になるまで試薬４を
分注し、完全に吸収させた。
分注し、完全に吸収させた。
【００４９】１０．試薬５（四（４）滴）をウェル上に
分注し、試薬を吸収させた。
分注し、試薬を吸収させた。
【００５０】１１．試薬６（四（４）滴）、アルカリフ
ォスファターゼの基質を膜上に分注し、装置を五（５）
分間放置した。非常に濃いオレンジの三角形が観察され
た。
ォスファターゼの基質を膜上に分注し、装置を五（５）
分間放置した。非常に濃いオレンジの三角形が観察され
た。
【００５１】１２．試薬７（四（４）滴）、ペルオキシ
ダーゼ基質を分注し、装置を五（５）分間放置した。三
角形の色に変化はなかった。
ダーゼ基質を分注し、装置を五（５）分間放置した。三
角形の色に変化はなかった。
【００５２】１３．試薬５（四（４）滴）を膜上に分注
し、完全に吸収させた。
し、完全に吸収させた。
【００５３】（実施例２） （工程５で）インフルエンザＡ型抗原の代りにインフル
エンザＢ型抗原を利用する点を除いては、実施例１（工
程１〜１３）と同様に実験を繰り返した。この場合に、
工程１１では三角形は観察されなかった。工程１２にお
いて、紺青色の三角形が観察された。
エンザＢ型抗原を利用する点を除いては、実施例１（工
程１〜１３）と同様に実験を繰り返した。この場合に、
工程１１では三角形は観察されなかった。工程１２にお
いて、紺青色の三角形が観察された。
【００５４】実験は、工程５においてネガティブコント
ロール溶液を用いて繰り返した。この場合、工程１１ま
たは工程１２において三角形は観察されなかった。
ロール溶液を用いて繰り返した。この場合、工程１１ま
たは工程１２において三角形は観察されなかった。
【００５５】本発明は、多くの異なる形態の実施形態に
よって充足され、本発明の好ましい実施形態が詳述され
ている。本発明の開示は明細書中の代表的なものであ
り、本発明がそれらにより制限されるものではないこと
が理解されるであろう。
よって充足され、本発明の好ましい実施形態が詳述され
ている。本発明の開示は明細書中の代表的なものであ
り、本発明がそれらにより制限されるものではないこと
が理解されるであろう。
【図１】図１は、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）
（ベクトン ディッキンソン）インフルエンザ検出装置
のフローコントローラに試料を塗布している状態を表す
図である。
（ベクトン ディッキンソン）インフルエンザ検出装置
のフローコントローラに試料を塗布している状態を表す
図である。
【図２】図２は、洗浄用液をフローコントローラに塗布
している状態を表す図である。
している状態を表す図である。
【図３】図３は、インフルエンザＡ型抗原の存在を示す
ポジティブな試験結果を表す図である。
ポジティブな試験結果を表す図である。
【図４】図４は、インフルエンザＡ型抗原の不存在を示
すネガティブな試験結果を表す図である。
すネガティブな試験結果を表す図である。
１ 装置 ２ フローコントローラ ３ 三角の開口部 ４ ナイロン膜 ６ 円形の開口部 ７ 発色した三角形
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 デービッド ミラニック アメリカ合衆国 55082 ミネソタ州 ス ティルウォーター ユニット ４ビー 60 ストリート ノース 14847 (72)発明者 スティーブン ジェイ． ラベル アメリカ合衆国 21093 メリーランド州 ルーテルビル オールド エルム コー ト １
Claims (10)
- 【請求項１】 ヒトインフルエンザＡ型またはＢ型を診
断するための方法であって、 ａ）インフルエンザＡ型ウイルスまたはインフルエンザ
Ｂ型ウイルスを含んでいる疑いのある試験試料を準備す
る工程と、 ｂ）試験試料を、ウイルス抗原が結合する固相に接触さ
せる工程と、 ｃ）固相を、第一酵素へ結合している抗インフルエンザ
Ａ型抗体および第二酵素へ結合している抗インフルエン
ザＢ型抗体と接触させる工程と、 ｄ）固相を第一酵素と第二酵素の基質に接触させる工程
と、 ｅ）第一酵素と第二酵素の少なくとも一方の作用によっ
て固相上に付着した発色沈殿物を視覚的に検出すること
により、ウイルス抗原の存在または量を決定する工程と
を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 第一酵素がペルオキシダーゼ、ウレアー
ゼ、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、およびベータ−グルクロニダー
ゼからなる群から選択され、第二酵素がペルオキシダー
ゼ、ウレアーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、およびベータ−グ
ルクロニダーゼからなる群から選択されることを特徴と
する請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 固相として、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登
録商標）インフルエンザキット中に用意されている装置
を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記ウイルス抗原が、インフルエンザＡ
型抗原またはインフルエンザＢ型抗原であることを請求
項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記インフルエンザＢ型抗原が、Ｂ Ｌ
ｅｅ ４０株であることを特徴とする請求項４に記載の
方法。 - 【請求項６】 前記インフルエンザＡ型抗原が、サブタ
イプＨ１Ｎ１のインフルエンザＡ型ウイルスであること
を特徴とする請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】 インフルエンザＡ型抗体が、アルカリフ
ォスファターゼに結合していることを特徴とする請求項
１に記載の方法。 - 【請求項８】 インフルエンザＢ型抗体が、ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼに結合していることを特徴と
する請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 インフルエンザＡ型抗体が、ベータ−グ
ルクロニダーゼに結合していることを特徴とする請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１０】 インフルエンザＢ型抗体が、ベータ−
グルクロニダーゼに結合していることを特徴とする請求
項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US38760999A | 1999-08-31 | 1999-08-31 | |
| US09/387609 | 1999-08-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001124775A true JP2001124775A (ja) | 2001-05-11 |
Family
ID=23530642
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000264194A Pending JP2001124775A (ja) | 1999-08-31 | 2000-08-31 | インフルエンザａ型およびｂ型の存在を視覚的に検出するためのフロースルーアッセイ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1081496A1 (ja) |
| JP (1) | JP2001124775A (ja) |
| AU (1) | AU5347000A (ja) |
| CA (1) | CA2314546A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2004109015A (ja) * | 2002-09-19 | 2004-04-08 | Fujirebio Inc | 体液試料分離装置および体液試料分離方法 |
| WO2004081568A1 (ja) | 2003-03-10 | 2004-09-23 | Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd. | 検体の検査方法及びその検査方法に用いる検体収容用容器 |
| WO2005007697A1 (ja) * | 2003-07-23 | 2005-01-27 | Fujirebio Inc. | 抗インフルエンザａ型ウイルスモノクローナル抗体及び該抗体を用いる免疫測定器具 |
| JP2006215044A (ja) * | 2006-03-31 | 2006-08-17 | Denka Seiken Co Ltd | 簡易メンブレンアッセイ法及びキット |
| JP2008535496A (ja) * | 2005-04-08 | 2008-09-04 | ナステック ファーマスーティカル カンパニー インク． | 呼吸器ウィルス感染用ＲＮＡｉ治療因子 |
| JP2009002961A (ja) * | 2008-08-22 | 2009-01-08 | Denka Seiken Co Ltd | 簡易メンブレンアッセイ法及びキット |
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| JP2012233928A (ja) * | 2012-09-07 | 2012-11-29 | Denka Seiken Co Ltd | 簡易メンブレンアッセイ法及びキット |
| JP2015111152A (ja) * | 2015-03-03 | 2015-06-18 | デンカ生研株式会社 | 簡易メンブレンアッセイ法及びキット |
| JP2017078723A (ja) * | 2017-01-19 | 2017-04-27 | デンカ生研株式会社 | 簡易メンブレンアッセイ法及びキット |
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| US9481912B2 (en) | 2006-09-12 | 2016-11-01 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples |
| US8080645B2 (en) | 2007-10-01 | 2011-12-20 | Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc | Biological specimen collection/transport compositions and methods |
| US8097419B2 (en) | 2006-09-12 | 2012-01-17 | Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc | Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009 |
| US8652782B2 (en) | 2006-09-12 | 2014-02-18 | Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting, identifying and quantitating mycobacterial-specific nucleic acids |
| US11041215B2 (en) | 2007-08-24 | 2021-06-22 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences |
| US9683256B2 (en) | 2007-10-01 | 2017-06-20 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Biological specimen collection and transport system |
| CA2697373C (en) | 2007-08-27 | 2019-05-21 | Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc | Immunogenic compositions and methods |
| US10004799B2 (en) | 2007-08-27 | 2018-06-26 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Composite antigenic sequences and vaccines |
| WO2009085355A2 (en) | 2007-10-01 | 2009-07-09 | Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc | Biological specimen collection and transport system and methods of use |
| US11041216B2 (en) | 2007-10-01 | 2021-06-22 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples |
| CA2863083C (en) | 2012-01-26 | 2023-09-19 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Composite antigenic sequences and vaccines |
| EP3294448A4 (en) | 2015-05-14 | 2018-12-12 | Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC | Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples |
| CN114276440B (zh) * | 2020-09-27 | 2022-12-27 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 针对乙型流感病毒的抗体和检测试剂盒 |
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|---|---|---|---|---|
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| DE3225027A1 (de) * | 1982-07-05 | 1984-01-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunchemisches messverfahren |
| WO1990004182A1 (en) * | 1988-10-14 | 1990-04-19 | Virovahl S.A. | A method for simultaneous detection of different types of antibodies and/or antigens produced by individual cells |
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-
2000
- 2000-07-24 EP EP00115833A patent/EP1081496A1/en not_active Withdrawn
- 2000-07-26 CA CA 2314546 patent/CA2314546A1/en not_active Abandoned
- 2000-08-17 AU AU53470/00A patent/AU5347000A/en not_active Abandoned
- 2000-08-31 JP JP2000264194A patent/JP2001124775A/ja active Pending
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|---|---|
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| CA2314546A1 (en) | 2001-02-28 |
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