WO2007074811A1 - Ａ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法 - Google Patents
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Definitions
- influenza viruses that have caused highly pathogenic avian influenza are the H5 and H7 subtypes of influenza A virus. Not all of these subtypes are highly toxic, but in Japan, if livestock is infected with these subtypes, regardless of whether they are toxic or weakly toxic, Have been!
- H5 subtypes, H7 subtypes, and H9 subtypes have been reported to infect humans with avian influenza! Of these, deaths were reported due to influenza virus! Only the H5N1 subtype was reported. H5N1 subtype infection has been reported to cause severe pneumonia leading to death.
- the highly pathogenic avian influenza caused by the H5N1 subtype was epidemic in Hong Kong in 1997, and in addition to the power of 2003, it was a pandemic in several Asian powers, and human infections and deaths were reported.
- Influenza virus infects the upper and lower respiratory tracts of humans. After a incubation period of 1 to 2 days, fever (38-39 ° C) and headache, back pain, muscle pain, general malaise, digestive symptoms Cause.
- fever 38-39 ° C
- headache back pain, muscle pain, general malaise, digestive symptoms
- the most common complication of influenza is pneumonia in the elderly and encephalitis in children's encephalopathy, especially encephalitis and encephalopathy in children, characterized by high fever, disturbance of consciousness, and convulsions. Rapid diagnosis and treatment is necessary because the time to onset of symptoms and death is extremely short.
- kits for rapidly detecting influenza virus antigens have been developed and started to spread. It has become possible to diagnose early as an infectious disease. Examples of such rapid diagnosis kits include those that use enzyme immunoassay (EIA) or immunochromatography as the principle, and those that detect only influenza A virus, and detect A and B together. There are some that detect A type and B type.
- influenza antigen tests are common to all types of A viruses Uses antibodies against nucleoproteins. Therefore, differential diagnosis between influenza A virus H5 subtype infection and H1N1 or H3N2 subtype infection is not possible.
- H5N1 subtype infection causes severe pneumonia and has a very high mortality rate.
- Differential diagnosis of H5 subtype infection at the time of initial diagnosis is important in formulating treatment strategies for patients.
- it is possible to take measures such as isolating patients at an early stage to prevent new infections, which is important in preventing further spread of H5N1 subtype infection.
- Patent Document 1 Japanese Translation of Special Publication 2004-509648
- Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 11-108932
- Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-215228
- influenza A virus H5N1 subtype causes severe pneumonia and has a high mortality rate.
- influenza A virus H5 subtype cannot be detected by distinguishing it from other influenza A virus infections using conventional influenza virus antigen detection reagents.
- An object of the present invention is to provide an influenza A virus comprising the influenza A virus H5N1 subtype Providing detection reagents that can quickly and easily differentially diagnose virus virulent strains, and detection methods using them, in particular sandwich immunoassays, especially immunochromatography and immunochromatography measuring devices The purpose is to do. Means for solving the problem
- all influenza A virus variants Does not react to the first antibody that reacts against type A and influenza A virus virulent strains! Reacts to all influenza A subtypes other than the virulent strain
- a third antibody that reacts with an antigen to which the first antibody reacts is prepared by preparing a membrane carrier having first and second capture sites formed by previously immobilizing the second antibody in place. And a first mixture of the test sample and a second mixture of the fourth antibody that reacts with the antigen to which the second antibody reacts and the test sample, respectively. Chromatographic development on the membrane carrier toward the second capture site, or chromatographic development on the membrane carrier toward the both capture sites, and the first mixture is chromatographed on the first carrier. Positive reaction with the first antibody at the capture site and the second capture part I Takeno chromatographic assay reaction with the second antibody is characterized in that to be able to detect Influenza A Virus virulent strain has to be negative is provide in.
- the first antibody that reacts with all influenza A virus subtypes does not react with the influenza A virus virulent strain.
- a second antibody that reacts against all influenza A virus subtypes other than the virulent strain, a third antibody that reacts with an antigen to which the first antibody reacts, and the second antibody At least a fourth antibody that reacts with an antigen to which the antibody reacts, and a membrane carrier, wherein the first and second antibodies are respectively fixed in advance at predetermined positions on the membrane carrier, and Forming a capture site, the third and fourth antibodies are labeled with an appropriate labeling substance, and the third and fourth antibodies are first and second from positions remote from both of the capture sites, respectively.
- Chromatographic development on the membrane carrier toward the second capture site Influenza A virus virulent strain detection I Takeno chromatography measurement device comprising is provided so as.
- the membrane carrier may be a single membrane carrier force comprising a first capture site and a second capture site spaced apart from each other, or the first antibody may be It may be composed of an immobilized first membrane carrier and a second membrane carrier on which the second antibody is immobilized, but the latter is preferred because of its superior reaction specificity.
- the third antibody is prepared on the first membrane carrier
- the fourth antibody is prepared on the second membrane carrier.
- measurement can be performed simply by injecting the test sample into each membrane carrier.
- the third and fourth antibodies are conveniently prepared by impregnating the impregnating members disposed on the first and second membrane carriers, respectively.
- the first antibody that reacts against all influenza A virus subtypes, and the strong poison that does not react against the influenza A virus virulent strain A second antibody that reacts against all influenza A virus subtypes other than the strain, and a third antibody that reacts with an antigen to which the first antibody reacts, A membrane carrier provided with a first capture site formed by fixing in advance at a predetermined position is prepared, a first mixed solution containing the second antibody and a test sample, and the third antibody and the above The second mixed solution containing the test sample is chromatographed on the membrane carrier toward the first capture site, respectively, and the reaction of the third antibody at the first capture site is positive and the second capture solution is positive.
- the membrane carrier may be prepared as a single type of membrane carrier on which the first antibody is immobilized.
- the chromatographic development of the first mixture and the chromatographic development of the second mixture are performed twice. Chromatographic development is required, and a total of two membrane carriers are required for each chromato development.
- a first antibody that reacts against all influenza A virus subtypes, and a sputum that does not react against an influenza A virus virulent strain A second antibody that reacts with all influenza A virus subtypes other than the virulent strain, a third antibody that reacts with an antigen with which the first antibody reacts, and a membrane carrier.
- the first antibody is previously fixed at a predetermined position of the membrane carrier to form a first capture site, and the second and third antibodies are labeled with an appropriate labeling substance, and
- the second and third antibodies are prepared so that they can be chromatographed on the membrane carrier from a position separated from the capture site toward the first capture site, respectively. Provided by chromatography measuring equipment It is.
- the membrane carrier is preferably composed of at least a first membrane carrier to which the first antibody is immobilized and a second membrane carrier to which the first antibody is immobilized.
- the measurement can be performed simply by injecting the test sample into both membrane carriers. This is convenient.
- the second and third antibodies are preferably prepared by impregnating the impregnating members disposed on the first and second membrane carriers, respectively.
- the detection method and measurement method of the present invention include commercially available immunochromatographic test strips or kits for differential measurement of type A and B influenza, such as Capillia (registered trademark) FluA + B (manufactured by Towns Co., Ltd.), It can be carried out in combination with a sandwich immunoassay device using the first antibody and the second antibody.
- Capillia registered trademark
- FluA + B manufactured by Towns Co., Ltd.
- a first antibody that reacts against all influenza A virus subtypes and an influenza A virus virulent strain The at least one second antibody that reacts against all influenza A virus subtypes other than the virulent strain, and a membrane carrier, wherein the second antibody is previously a membrane carrier.
- the first antibody is labeled with an appropriate labeling substance, and is separated from the first capture site to the first capture site.
- the first and second antibodies used in the present invention may be antibodies against influenza viruses, but are usually obtained as antibodies against influenza virus nucleoproteins.
- Each of the first and second antibodies may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. From the viewpoint of reaction specificity, the first and second antibodies are preferably monoclonal antibodies.
- the first antibody a known monoclonal antibody against the nucleoprotein of influenza A virus can be usually used.
- the second antibody was obtained in the course of studying reactivity against various influenza A virus subtypes, as well as various monoclonal antibodies against the influenza A virus nucleoprotein.
- the above polyclonal antibody is, for example, a DNA corresponding to a portion containing an amino acid residue constituting an epitope in a DNA sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6. Fragments are cloned, the cloned ⁇ gene is genetically expressed in a host such as Escherichia coli, and the expressed protein is extracted and purified. Using this purified protein as an antigen, animals are immunized according to conventional methods and obtained from the antiserum. be able to.
- a DNA fragment corresponding to a portion containing an amino acid residue constituting an epitope different from the influenza virus H5N1 subtype in the DNA sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is used.
- the first antibody and the second antibody for example, after immunizing an animal such as a mouse using the purified protein obtained as described above as an antigen, spleen cells and myeloma cells of the immunized animal are used.
- the fused cells obtained by cell fusion are selected with a HAT-containing medium and grown, and the grown strain is selected using the purified protein obtained as described above, for example, by enzyme-labeled immunization. By doing so, it can be obtained.
- the monoclonal antibody used as the second antibody does not react with an influenza A virus virulent strain, but is against all influenza A subtypes other than the virulent strain.
- Reactive monoclonal antibodies especially stored in all influenza A viruses except influenza virus virulence strains !, but epitopes that have been mutated and disappeared in influenza virus virulence strains, especially type A It recognizes the epitope of influenza virus nuclear protein.
- the influenza A virus epitope is mutated due to the substitution force of the amino acid sequence or the occurrence of a different sugar chain modification in the influenza virus H5N1. It is thought that it is not specifically recognized by.
- Such a monoclonal antibody has not been known so far and is novel.
- the present invention does not react against an influenza A virus virulent strain, but reacts against all influenza A virus subtypes other than the virulent strain.
- Monoclonal antibodies are provided.
- the monoclonal antibody does not react with the influenza A virus H5N1 subtype nucleoprotein, but reacts with all the influenza A virus subtype nucleoproteins other than the H5N1 subtype.
- the fourth antibody used in the sandwich immunoassay method such as the immunochromatography method may be an antibody that reacts with the antigen to which the second antibody reacts. It may be the same antibody as the second antibody or an antibody other than the second antibody. For example, when the antigen comprises a plurality of epitopes for the second antibody, the same antibody as the second antibody can be used as the fourth antibody. Therefore, the fourth antibody may be an antibody that reacts against all influenza A virus subtypes, or it may not react with an influenza A virus virulent strain but other than the virulent strain. It may be an antibody that reacts with all types of influenza A virus subtypes. The fourth antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
- the membrane carrier 3 is composed of an elongated strip-trocellulose membrane filter having a width of 5 mm and a length of 36 mm, and is attached to the middle of the adhesive sheet 1 having the same width.
- the membrane carrier 3 has its chromatographic start point side, that is, the left side in FIG. 1 (hereinafter referred to as “upstream side”.
- the opposite side that is, the chromatographic development direction side in FIG.
- the first antibody is immobilized at a position of 7.5 mm downstream from the end of the terminal, and captures the complex of the third antibody and a virus antigen such as a nucleoprotein of influenza A virus.
- a first capture site 41a is formed.
- a 5 mm ⁇ 15 mm band-shaped glass fiber nonwoven fabric is used as the impregnating member 2, but the invention is not limited to this.
- cellulose cloth filter paper, nitrocellulose membrane, etc.
- polyethylene Also, porous plastic cloth such as polypropylene can be used.
- the labeling substance for the third and fourth antibodies include a color labeling substance, an enzyme labeling substance, a radiation labeling substance, etc., as long as they are usable. Of these, it is preferable to use a colored labeling substance because it can be quickly and easily determined by observing the color change at the capturing site 4 with the naked eye.
- coloring labeling substance examples include metal colloids such as gold colloid and platinum colloid, synthetic latex such as polystyrene latex colored with pigments such as red and blue, and latex such as natural rubber latex. Of these, metal colloids such as gold colloid are particularly preferred.
- the immunochromatographic test strip 10 has a membrane carrier 3 stuck in the middle of the pressure-sensitive adhesive sheet 1, and the impregnation member 2 is placed on the upstream end of the membrane carrier 3.
- the downstream end can be overlapped and connected, and the upstream portion of the impregnated member 2 can be attached to the adhesive sheet 1 to create.
- Absorbing member 5 can be made of cotton cloth, filter paper, and porous plastic non-woven fabric that has strength such as polyethylene and polypropylene as long as it is made of a material that can absorb and hold liquid quickly. Filter paper is particularly suitable. .
- the immunochromatographic test strip 10 of FIG. 1 can be used as it is as a dipstick type measuring device, or alternatively, provided as a dipstick type measuring device lined or sandwiched with an appropriate plastic sheet. You can do it.
- the immunochromatographic test strip 10 shown in FIG. 1 is provided as a measuring device housed in a suitable plastic case with a test sample injection part and a judgment part opened above the sample addition member 6 and the capture part 4, respectively.
- the third and fourth antibodies are mixed with a test sample and a developing solvent in a suitable container separate from the immunochromatographic test strip 10, and then mixed.
- the detection sensitivity of the second capture site 41b tends to decrease.
- the sensitivity is preferably adjusted by a method such as increasing the amount of antibody immobilized on 41b to be greater than the amount of antibody immobilized on the first capture site 41a.
- test sample is not particularly limited, but, for example, Cloacas tube, tracheal tube, feces, nasal aspirate, nasal and throat swabs, blood (can be whole blood, serum, or plasma), Saliva, urine, organ emulsions and the like can be mentioned.
- the test sample may be diluted with an appropriate diluent such as a developing solvent and injected into the membrane carrier.
- a blood cell capturing membrane member When whole blood is used as a test sample, particularly when a colored labeling substance such as gold colloid is used as the labeling substance of the labeled antibody, a blood cell capturing membrane member may be disposed on the sample addition member. preferable.
- the blood cell trapping membrane member is preferably laminated between the impregnation member and the sample-added calorie member. This prevents the red blood cells from being spread on the membrane carrier, thereby facilitating confirmation of the accumulation of the colored label at the capture site of the membrane carrier.
- a carboxymethyl cellulose membrane is used as the blood cell capturing membrane member.
- the ion exchange filter paper CM (trade name) sold by Advantech Toyo Co., Ltd. or the Whatman Japan Co., Ltd.! An exchange cellulose paper etc. can be used.
- the mixed solution is added to each of the immunochromatographic test strips 10 and 20 shown in FIG.
- the mixed solution passes through the sample addition member 6 and mixes with the labeled antibody in the impregnation member 2.
- the immunochromatographic test strip 10 forms a complex of the virus antigen and anti-B influenza virus antibody by the antigen-antibody reaction. .
- This complex is chromatographed in the membrane carrier 3 to reach the capture site 4 and is captured by an antigen-antibody reaction with the anti-influenza B virus antibody immobilized at 4 lb of the capture site, giving a positive result.
- the first capture site 41a is not captured by the immobilized first antibody and gives a negative result.
- a complex of the virus antigen and the fourth antibody is not formed, and both of them are independently chromatographed in the membrane carrier 3 to reach the second capture site 41c. Is not captured by the second antibody immobilized thereon but gives a negative result.
- the infection is a highly virulent strain, an influenza A virus other than a virulent strain, or an influenza B virus infection Can be identified.
- the immunochromatographic test strip 10 shown in FIG. 2 a commercially available immunochromatographic test strip or kit for differential measurement of influenza A and B influenza such as Capilia (registered trademark) FluA + B (manufactured by Towns Co., Ltd.) is used. It can also be used as it is. Therefore, only the immunochromatographic test strip 20 of FIG. 2 can be supplied separately so that the detection method or measurement method of the present invention can be carried out in combination with such a commercially available test strip or kit.
- Capilia registered trademark FluA + B
- the immunochromat test strip 10 exhibits a positive result at the first capture site 41a as in FIG. 4 lb gives a negative result.
- the immunochromatographic test strip 20 a complex was formed between the virulent strain virus antigen and the labeled antibody, but it was not captured by the second antibody immobilized at the second capture site 41c, resulting in a negative result.
- influenza A virus other than the virulent strain is present in the mixed solution, the immunochromatographic test strip 10 gives a positive result at the first capture site 41 as in FIG. 2, but the capture site 41b Shows a negative result.
- the immunochromatographic test strip 20 a complex of the virus antigen and the labeled antibody is formed, and is chromatographed in the membrane carrier 3 to reach the second capture site 41c, where it is fixed to the second capture site 41c. It is captured by the antibody and gives a positive result.
- the susceptibility of the virulence strain or the sensitivity of influenza A virus other than the virulence strain It can be discriminated whether it is infected with dyed influenza B virus.
- the device of FIG. 3 may be in the form of being housed in a suitable case.
- the apparatus of Fig. 4 has the same configuration as that of Fig. 2 except that the immunochromatographic test strips 10 and 20 include a single adhesive tape 1 and a single sample addition member 6. Yes. That is, both membrane carriers 3 of the immunochromatographic test strips 10 and 20 are arranged substantially in a straight line so as to face each other. Specifically, the immunochromatographic test strips 10 and 20 are arranged in a straight line so that the upstream ends of the two impregnated members 2 face each other with an appropriate interval, that is, in opposite directions.
- the single sample addition member 6 is arranged so as to be connected across both the impregnating members 2. Alternatively, the membrane supports of the immunochromatographic test strips 10 and 20 may be arranged radially so that they extend at an angle to each other.
- the mixed solution After preparing a mixed solution containing the test sample in the same manner as described above with reference to FIG. 2, add the common sample to the immunochromatographic test strips 10 and 20 shown in FIG. When injected on the member 6, the mixed solution passes through the sample addition member 6 and is mixed with the labeled antibody in the impregnating member 2 of both test strips 10 and 20.
- the result of the first capture site 41a, the second capture site 41c, and the capture site 41b indicates whether the infection is a virulent strain or an influenza A virus other than the virulent strain. It can be discriminated whether it is influenza B virus infection.
- the apparatus of FIG. 4 may be configured to be housed in a suitable case.
- the impregnation member 2 may be common to the test strips 10 and 20.
- the third and fourth antibodies can be constructed according to the embodiment of FIG.
- the apparatus shown in FIG. 4 adjusts the sensitivity of the first and second capture sites 41a and 41b as the apparatus shown in FIG. 1 because the mixed solution containing the test sample penetrates the test strips 10 and 20 evenly. Convenient in terms of not necessary.
- the apparatus of FIG. 2 can be modified to an apparatus for carrying out the embodiment of the present invention using the second antibody as a labeled antibody.
- Such an apparatus is the same as that shown in FIG.
- the first antibody is immobilized on the second capture site 41c of the test strip 20, and the first antibody is used instead of the fourth antibody as the labeled antibody to be impregnated in the impregnation member 2 of the strip 20.
- It can be constructed by using two antibodies.
- the structure of the Imunoguchi-Mato test strip 10 is exactly the same as that of FIG.
- the immunochromatographic test strip 10 gives a positive result at the first capture site 41 as in FIG. 2, but the capture site 41b Shows a negative result.
- the immunochromatographic test strip 20 a complex of the virus antigen and the labeled antibody is formed, and is chromatographed in the membrane carrier 3 to reach the capture site 41.
- the first capture site 41c It is captured by the antibody and gives a positive result.
- the apparatus in FIG. 4 can also be modified to an apparatus for carrying out the embodiment of the present invention using the second antibody as a labeled antibody by making the same changes as described above. That is, in the apparatus of FIG. 4, the first antibody is immobilized in place of the second antibody at the second capture site 41c of the immunochromatographic test strip 20, and the labeling antibody impregnated in the impregnation member 2 of the strip 20 is immobilized.
- the body can be modified by using the second antibody instead of the fourth antibody.
- the structure of the immunochromatographic test strip 10 is exactly the same as that shown in FIG.
- the mixed solution After preparing a mixed solution containing the test sample by the same method as described above with reference to FIG. 2, the mixed solution is applied to the modified immunochromatographic test strips 10 and 20 of FIG. When injected onto the common sample addition member 6, the mixed solution passes through the sample addition member 6 and is mixed with the labeled antibody in the impregnation member 2 of both test strips 10 and 20.
- the result of the first capture site 41a, the second capture site 41c, and the capture site 41b indicates whether the virulence strain is infected or A-type influenza other than the virulence strain. It is possible to differentiate between the infectivity of enza virus and the infection with influenza B virus.
- Example 1 (Cloning of recombinant nucleoprotein (NP) genes of influenza A and B viruses)
- a / Puerto Rico / 8/34 (H1N1), which is influenza virus type A
- B / Lee / 40 which is influenza virus type B
- RNA extraction reagent (TRIzol Reagent, Invitrogen) was added to this virus to extract each viral RNA.
- a reverse transcription reaction was performed from the extracted RNA to prepare an NP gene cDNA.
- Uni 12 Primer: 5′-AGCAAAAGCAGG-3, (SEQ ID NO: 1) was used as a primer used for the reverse transcription reaction.
- influenza A virus recombinant NP protein (FluA NP) and influenza B virus recombinant NP protein (FluB NP) obtained in Example 2 as antigens
- monoclonal antibodies against anti-FluA NP and FluB NP (anti-FluA NP antibody and Anti-FluB NP antibody) was created.
- Production of the monoclonal antibody was performed according to a conventional method.
- Each 100 g of recombinant NP protein and equal amount of Adjuvant Complete Freund (Difco) were mixed, and mice (BALB / c, 5 weeks old, Japan SLC) were immunized 3 times, and the spleen cells were used for cell fusion. Using.
- Sp2 / 0-Agl4 cells (Shulman et al., 1978), mouse myeloma cells, were used for cell fusion.
- Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco) L-glutamine 0 • 3 mg / ml
- penicillin G potassium 100 units / ml
- streptomycin sulfate 100 ⁇ g / ml
- gentacin 40 ⁇ g / ml gentacin 40 ⁇ g / ml
- JRH fetal calf serum
- Antibody production in the culture supernatant was confirmed by enzyme-linked antibody method (ELISA) using A (H1N1) immobilized plate, and inactivated Influenza B virus was used as a solid phase for screening of anti-FluB NP antibody.
- ELISA enzyme-linked antibody method
- the antibody production in the culture supernatant was confirmed by the same method using the prepared plate.
- anti-F1 uA NP antibody-producing cells F / 211 were inoculated into the peritoneal cavity of mice, and ascites containing anti-FluA NP antibody was obtained. Furthermore, IgG was purified using a protein G adsorbent by a conventional method to obtain each antibody.
- Anti-FluA NP antibody derived from antibody-producing cell B / 347 obtained in (1) above (hereinafter referred to as anti-FluA NP antibody B / 347), anti-FluB NP antibody derived from antibody-producing cell F / 171 (hereinafter referred to as anti-FluB) NP antibody F / 171) and anti-FluA NP antibody derived from antibody-producing cell F / 211 (hereinafter, anti-FluA NP antibody F / 21 1) were labeled with colloidal gold according to the following procedure.
- This colloidal gold-labeled antibody was suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (PH7.4) containing 10% sucrose '1% BSA' 0.5% Triton-X100 and colloidal gold-labeled anti-FluA NP antibody B / 347 A solution was prepared. Further, 1 ⁇ g of protein equivalent weight of anti-FluB NP antibody F / 171 was bound to the surface of gold colloid particles by the above method to prepare a colloidal gold labeled anti-FluB NP antibody F / 171 solution. Furthermore, 1 ⁇ g of protein equivalent weight of anti-FluA NP antibody F / 211 was bound to the gold colloid particle surface by the above method. A colloidal gold-labeled anti-FluA NP antibody F / 211 solution was prepared.
- Example 4 Using the immunochromatography measuring apparatus prepared in Example 4, reactivity tests against 15 subtypes of type A influenza virus were performed.
- a test sample a chorioallantoic fluid obtained by proliferating various subtypes of type A influenza virus in the laying eggs was prepared using a sample dilution solution. Then, the test sample 1501 was dropped with a micropipette onto the sample addition member 6 of the test strip obtained in Example 4 and chromatographed. After standing at room temperature for 15 minutes, the first capture site 41a and The captured amount of the complex of the virus antigen captured at the second capture site 41c and the colloidal gold labeled antibody was observed with the naked eye. The amount of capture is increased or decreased in proportion to the amount of reddish purple. (No coloration), Shi (weak coloration), + (clear coloration), + + (clearer coloration) , + + + (Significant coloration) was classified into five stages.
- the immunochromatographic measuring apparatus described in Example 4 shows reactivity with all influenza virus types A at the first capture site 41a, and at the second capture site 41c. It was found that there was no reactivity with influenza virus H5N1 only! This is because anti-FluA NP antibody F / 211 used as the labeled antibody of test strip 20 does not react with influenza A virus H5N 1 subtype, but all influenza A except for H5N 1 subtype It indicates that the antibody reacts against a virus subtype.
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Abstract
【課題】 インフルエンザウイルス強毒株を特異的に迅速かつ簡便に検出できる方法および測定器具を提供する。 【解決手段】 全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体を用い、第一の抗体との反応が陽性で且つ第二の抗体との反応が陰性である抗原を免疫測定法によって検出することからなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法。
Description
明 細 書
A型インフルエンザウイルス強毒株の検出法
技術分野
[0001] 本発明は、 A型インフルエンザウイルス強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイ ルス亜型に対して反応する抗体を用 V、た A型インフルエンザウイルス強毒株の検出 法、詳しくは、サンドイッチ式免疫測定法、特に、ィムノクロマトグラフィー測定法およ びィムノクロマトグラフィー測定装置に関するものであり、高病原性鳥インフルエンザ ウィルスなどのインフルエンザウイルス強毒株の感染を迅速かつ簡便に診断するた めに有用な検出法に関する。
背景技術
[0002] 高病原性鳥インフルエンザは、鶏などに高致死性の病原性を示すインフルエンザゥ ィルスによる感染症で、家きんペストとも呼ばれ、わが国では家畜伝染病予防法の法 定伝染病に指定されており、世界獣医事務局 (OIE)ではリスト A疾病として掲げられ ている。
[0003] 今までに高病原性鳥インフルエンザを引き起こしたインフルエンザウイルスはインフ ルェンザ A型ウィルスの H5亜型及び H7亜型のみである。これらの亜型が総て強毒 性であるわけではないが、わが国では、強毒性及び弱毒性であるかにかかわらずこ れらの亜型に家畜が感染した場合、すべて屠殺処分することとされて!/ヽる。
[0004] また人への鳥インフルエンザ感染は H5亜型、 H7亜型および H9亜型の感染が報告 されて!/、る。このうちインフルエンザウイルスが原因で死亡者が報告されて!、るのは H 5N1亜型のみである。 H5N1亜型感染は重篤な肺炎を引き起こし、死に至ることが 報告されている。
H5N1亜型による高病原性鳥インフルエンザは、 1997年に香港で流行し、さらに、 2 003年力 現在までアジアの数力国で大流行し、人への感染及び死亡例も報告され た。
現在、 H5N1亜型の人への感染は世界規模で問題となっており、 H1N1亜型、 H3 N2亜型に続く新型インフルエンザとして世界規模で警戒されている。
[0005] 2005年 11月 17日の WHOの報告によると、ヒトのインフルエンザ H5N1亜型感染確 定症例数は 130例であり、内死亡者は 67例である。 2004年 12月以降、ヒトへの感 染確定症例数は急激に増加し、死亡例数も増加している。 H5N1ウィルスに感染後 の死亡率は 51. 3% (67Z130)である。
上記からも明らかなように、 H5N1亜型の人への感染が現実となりつつある現在、 H5 N1亜型感染を迅速に発見することは、大規模なインフルエンザ感染拡大を防ぐ上で 重要な課題である。また迅速に診断することは治療にぉ 、ても重要である。
[0006] 鳥における高病原性鳥インフルエンザ診断は、現状では、ウィルス感染が疑われる 病鳥から気管スヮブまたはクロアカスヮブ (総排泄腔スヮブ）を採取し、これを発育鶏 卵に接種して培養した後、ウィルスを分離する方法により行われている。しかし、この 方法は、結果が得られるまでに数日を要し、迅速に結果が求められない点で不利で ある。また、近年開発された遺伝子検査 (PCR法、 LAMP法)を用いることにより、結果 を得るまでに要する時間は大幅に短縮されるが、かかる遺伝子検査には特別な機器 及び技術を要するため、養鶏現場等で検査を行うことは出来ない。
[0007] インフルエンザウイルスはヒト上気道、下気道などに感染し、 1〜2日の潜伏期をおい た後、発熱 (38〜39°C)と共に頭痛、腰痛、筋肉痛、全身倦怠、消化器症状などを 引き起こす。インフルエンザで最も問題となる合併症は高齢者の肺炎と小児の脳炎' 脳症で、特に小児の脳炎 ·脳症は高熱、意識障害、痙攣を特徴とし、極めて予後が 悪いうえに初発症状から中枢神経系症状の発現及び死に至る期間が極めて短いの で、迅速な診断と処置が必要である。
[0008] 従来は、上記のような臨床症状のみでインフルエンザ様疾患として診断されることが 多かったが、近年、インフルエンザウイルス抗原を迅速に検出するキットが開発され 普及し始めたことから、インフルエンザウイルス感染症として早期に診断することが可 能となってきた。このような迅速診断キットとしては、酵素免疫法 (EIA)やィムノクロマ トグラフィー測定法を原理として用いたものが挙げられ、 A型インフルエンザウイルス のみを検出するもの、 A型と B型をまとめて検出するもの、 A型と B型をそれぞれ検出 するものなどがある。
しかしながら現在行われているインフルエンザ抗原検査は A型ウィルス全てに共通な
核タンパク (ヌクレオプロテイン）に対する抗体を使用している。そのためインフルェン ザ A型ウィルスである H5亜型感染と H1N1または H3N2亜型感染との鑑別診断が できない。
[0009] H5N1亜型感染は重篤な肺炎を引き起こし、且つ死亡率が非常に高い。初期診断 時に H5亜型感染を鑑別診断することは、患者に対する治療方針を立てる上でも重 要である。さらに新たな感染を防ぐために患者を早期に隔離するなどの処置を講ずる ことができ、更なる H5N1亜型感染の拡大を防ぐ上でも重要である。
また、近年開発された遺伝子検査（PCR法、 LAMP法）を用いることにより、 H5N1 亜型を鑑別して検出することは可能であるが特別な機器及び技術を要するため簡便 な方法ではない。
[0010] 特許文献 1：特表 2004-509648号公報
特許文献 2：特開平 11-108932号公報
特許文献 3：特開 2001-215228号公報
非特干文献 1 : Hinshaw VSら, 「Specinc antibody responses and generation of antigen ic variants in chickens immunized against a virulent avian influenza virus」 , Avian Di s. 1990, 34(1): 80-6
特許文献 2 : Kaverin NVら, 「Structure of antigenic sites on the haemagglutinin mol ecule of H5 avian influenza virus and phenotypic variation escape mutantsj , J. Gen. Virol. 2002, 83(ptl0): 2497-505
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] このように、インフルエンザウイルスは感染が速ぐ発見が遅れると広い範囲にわたつ て急速に蔓延するので、感染をできる限り早期に、且つ、迅速に発見する必要がある
。特に A型インフルエンザウイルス H5N1亜型は重篤な肺炎を引き起こし、死亡率も 高い。しかしながら、現在のところ、 A型インフルエンザウイルス H5亜型は従来のイン フルェンザウィルス抗原検出試薬では他の A型インフルエンザウイルス感染と鑑別し て検出することはできない。
本発明の目的は、 A型インフルエンザウイルス H5N1亜型を含む A型インフルエンザ
ウィルス強毒株を迅速かつ簡便に鑑別診断できる検出試薬、及びそれを用いた検出 法、とりわけ、サンドイッチ式免疫測定法、特に、ィムノクロマトグラフィー測定法およ びィムノクロマトグラフィー測定装置を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0012] 本発明者等は、 A型インフルエンザウイルスを免疫原としてマウスを免疫して各種抗 体を取得し、これらの抗体をィムノクロマトグラフィー測定装置にお 、て試験する過程 で、インフルエンザウイルス強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に 対して反応するモノクローナル抗体を取得することに成功し、当該抗体を免疫測定法 、特にサンドイッチ式免疫測定法、とりわけィムノクロマトグラフィー測定法で使用する ことにより、 A型インフルエンザウイルス強毒株を検出し得ることを見出し、本発明を完 成するに至った。
[0013] すなわち、本発明の一局面によれば、全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対し て反応する第一の抗体、及び、 A型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しな V、が、該強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第 二の抗体を用い、第一の抗体との反応が陽性で且つ第二の抗体との反応が陰性で ある抗原を免疫測定法によって検出することからなる A型インフルエンザウイルス強 毒株の検出法が提供される。
[0014] この検出法における免疫測定法としては、特に限定されるものではないが、サンドィ ツチ式免疫測定法、とりわけ ELISA (Enzyme— linked immunosorbent assay) 法、ィムノクロマトグラフィー測定法などが好まし 、。
したがって、本発明の上記検出法の好ましい実施形態によれば、前記免疫測定法は 、前記第一の抗体とこの第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と を用いたサンドイッチ式免疫測定法、及び Z又は、前記第二の抗体と該第二の抗体 が反応する抗原に対して反応する第四の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法 から構成される。これらのサンドイッチ式免疫測定法は、前記第一の抗体および第二 または第四の抗体を担体に固定して実施すると好都合である。この場合、担体として 膜担体を使用すると、ィムノクロマトグラフィー測定法を実施することができる。
[0015] したがって、本発明の更に他の局面によれば、全ての A型インフルエンザウイルス亜
型に対して反応する第一の抗体、及び、 A型インフルエンザウイルス強毒株に対して 反応しな!ヽが、該強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反 応する第二の抗体をそれぞれ予め所定位置に固定せしめて形成された第一及び第 二の捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記第一の抗体が反応する抗原に対して 反応する第三の抗体と被験試料との第一の混合液、及び、前記第二の抗体が反応 する抗原に対して反応する第四の抗体と前記被験試料との第二の混合液を、それぞ れ第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめるか、また は、第一の混合液を前記捕捉部位の双方に向けて前記膜担体にてクロマト展開せし め、前記第一の捕捉部位における第一の抗体との反応が陽性で且つ第二の捕捉部 位における第二の抗体との反応が陰性であることをもって A型インフルエンザウィル ス強毒株を検出できるようにしたことを特徴とするィムノクロマトグラフィー測定法が提 供される。
[0016] また、本発明の更に他の局面によれば、全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対 して反応する第一の抗体と、 A型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しな ヽ 力 該強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二 の抗体と、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と、前記第 二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体と、膜担体とを少なくとも備え 、前記第一及び第二の抗体はそれぞれ予め膜担体の所定位置に固定されて第一及 び第二の捕捉部位を形成し、前記第三及び第四の抗体は適当な標識物質で標識さ れ、かつ、前記第三及び第四の抗体は前記捕捉部位の双方から離隔した位置から それぞれ第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なよう に用意されてなる A型インフルエンザウイルス強毒株検出用ィムノクロマトグラフィー 測定装置が提供される。
[0017] 前記膜担体は、第一の捕捉部位と第二の捕捉部位とを互いに離隔させて備えてなる 単一の膜担体力もなるものであってもよぐまたは、第一の抗体が固定された第一の 膜担体と、第二の抗体が固定された第二の膜担体とからなるものであってもよいが、 後者の方が反応特異性に優れているので好ましい。後者の場合、第三の抗体は第 一の膜担体上に用意しておき、第四の抗体は第二の膜担体上に用意しておくと、そ
れぞれの膜担体に被験試料を注入するだけで測定が行えるので好都合である。第 三及び第四の抗体は、それぞれ、第一及び第二の膜担体上に配置された含浸部材 に含浸させて用意しておくと好都合である。
上記第一の膜担体と第二の膜担体とを備える場合、第一の膜担体及び前記第二の 膜担体は何れも細長形状すなわち帯状形状を備えるものとし、両膜担体の含浸部材 を互いに所定の間隔をお 、て離隔させ、両膜担体を相互に並行して配置させてなる 、所謂ィムノクトマト法テストストリップの形態にすることができる。別法として、第一の 膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状すなわち帯状形状を備えるものと し、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させ、両膜担体を放射 方向に又は反対方向に配置させてなる、所謂ィムノクトマト法テストストリップ又はィム ノクトマト法テストキットの形態にすることがきる。
上記した方法及び装置は、すべて、上記第二の抗体を担体に固定しておく方法であ る。し力しながら、本発明の好ましい実施形態によれば、上記第二の抗体を担体に固 定しな 、方法を採用することもできる。
すなわち、本発明の他の局面によれば、全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対 して反応する第一の抗体と、 A型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しな ヽ 力 該強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二 の抗体と、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体とを用い、 前記第一の抗体を予め所定位置に固定せしめて形成された第一の捕捉部位を備え る膜担体を用意し、前記第二の抗体と被験試料とを含む第一の混合液、及び、前記 第三の抗体と前記被験試料とを含む第二の混合液を、それぞれ第一の捕捉部位に 向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記第一の捕捉部位における前記第三 の抗体の反応が陽性で且つ前記第一の捕捉部位における前記第二の抗体の反応 が陰性であることをもって A型インフルエンザウイルス強毒株を検出できるようにした ことを特徴とするィムノクロマトグラフィー測定法が提供される。この測定法では、膜担 体は第一の抗体が固定された一種類の膜担体を用意すればよいが、第一の混合液 のクロマト展開と第二の混合液のクロマト展開の 2回のクロマト展開を必要とし、各クロ マト展開用に、膜担体を合計 2枚必要とする。
[0019] また、本発明の他の局面によれば、全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して 反応する第一の抗体と、 A型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しな ヽが、 該強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗 体と、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と、膜担体とを 少なくとも備え、前記第一の抗体は予め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉 部位を形成し、前記第二及び第三の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前 記第二及び第三の抗体は前記捕捉部位から離隔した位置からそれぞれ第一の捕捉 部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなる A型インフル ェンザウィルス強毒株検出用ィムノクロマトグラフィー測定装置が提供される。
上記測定装置において、膜担体は、第一の抗体が固定された第一の膜担体と、第一 の抗体が固定された第二の膜担体とから少なくとも構成することが好ましい。そして、 第二の抗体を第一の膜担体上に用意しておき、第三の抗体を第二の膜担体上に用 意しておくと、両膜担体に被験試料を注入するだけで測定が行えるので好都合であ る。第二及び第三の抗体は、それぞれ、第一及び第二の膜担体上に配置された含 浸部材に含浸させて用意しておくことが好ましい。
[0020] 本発明の検出法及び測定方法は、キヤピリア (登録商標) FluA+B (株式会社タウンズ 製)などの市販の A型及び B型インフルエンザ鑑別測定用のィムノクロマト法テストスト リップまたはキットと、上記第一の抗体及び第二の抗体を用いたサンドイッチ式免疫 測定装置とを組み合わせて実施できる。
したがって、力かる実施形態のために、本発明の他の局面によれば、全ての A型イン フルェンザウィルス亜型に対して反応する第一の抗体と、 A型インフルエンザウィル ス強毒株に対して反応しな ヽが、該強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス 亜型に対して反応する第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第二の抗体は 予め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉部位を形成し、前記第一の抗体は 適当な標識物質で標識され、かつ、前記第一の捕捉部位から離隔した位置から該第 一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなる A 型インフルエンザウイルス強毒株検出用ィムノクロマトグラフィー測定装置が提供され る。
[0021] また、同様の実施形態のために、本発明の他の局面によれば、全ての A型インフル ェンザウィルス亜型に対して反応する第一の抗体と、 A型インフルエンザウイルス強 毒株に対して反応しな ヽが、該強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜 型に対して反応する第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は予 め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は適 当な標識物質で標識され、かつ、前記第一の捕捉部位から離隔した位置から該第一 の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなる A型ィ ンフルェンザウィルス強毒株検出用ィムノクロマトグラフィー測定装置が提供される。
[0022] 本発明で使用する上記第一及び第二の抗体は、それぞれ、インフルエンザウイルス に対する抗体であればよいが、通常、インフルエンザウイルスの核タンパクに対する 抗体として得られる。上記第一及び第二の抗体は、それぞれ、ポリクローナル抗体で あっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクロ一 ナル抗体であることが好ま 、。
上記第一の抗体としては、通常、 A型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する 公知のモノクローナル抗体を用いることができる。
上記第二の抗体は、 A型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する各種モノクロ ーナル抗体にっ ヽて、各種 A型インフルエンザウイルス亜型に対する反応性を研究 する過程で得られたものである。
[0023] 上記ポリクローナル抗体は、第一の抗体の場合、例えば、配列番号 6に記載されるァ ミノ酸配列をコードする DNA配列のうち、ェピトープを構成するアミノ酸残基を含む 部分に対応する DNA断片をクローユングし、当該クローンィ匕遺伝子を大腸菌などの 宿主で遺伝子工学的に発現させて発現蛋白を抽出および精製し、この精製蛋白を 抗原として常法に従って動物を免疫し、その抗血清から取得することができる。第二 の抗体の場合、例えば、配列番号 6に記載されるアミノ酸配列をコードする DNA配 列のうち、インフルエンザウイルス H5N1亜型と異なるェピトープを構成するアミノ酸 残基を含む部分に対応する DNA断片をクローニングし、当該クローン化遺伝子を大 腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて発現蛋白を抽出および精製し、この 精製蛋白を抗原として常法に従って動物を免疫し、その抗血清力 取得することがで
きる。
モノクローナル抗体は、第一及び第二の抗体の場合、例えば、上記と同様に得られ た精製蛋白を抗原としてマウスのような動物を免疫したのち、この免疫された動物の 脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞を HAT含有培地で セレクトした後に増殖せしめ、増殖せしめた株を前記のようにして得られた精製蛋白 を使用して、たとえば、酵素標識免疫法などにより選別することで、取得することがで きる。
[0024] 上記第二の抗体として使用されるモノクローナル抗体は、 A型インフルエンザウィル ス強毒株に対して反応しな ヽが、該強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス 亜型に対して反応するモノクローナル抗体であり、とりわけ、インフルエンザウイルス 強毒株以外の全ての A型インフルエンザに保存されて!、るが、インフルエンザウィル ス強毒株において変異して消失しているェピトープ、とりわけ、 A型インフルエンザゥ ィルスの核タンパクのェピトープを認識するものである。力かる A型インフルエンザゥ ィルスのェピトープは、インフルエンザウイルス H5N1型においては、アミノ酸配列が 置換されている力、または、異なる糖鎖修飾が生じたことにより変異しているため、上 記第二の抗体によって特異的に認識されないものと考えられる。このようなモノクロ一 ナル抗体は従来知られておらず、新規である。
[0025] したがって、本発明の他の局面によれば、 A型インフルエンザウイルス強毒株に対し て反応しな 、が、該強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して 反応するモノクローナル抗体が提供される。とりわけ、該モノクローナル抗体は、 A型 インフルエンザウイルス H5N1亜型の核タンパクに対して反応しないが、該 H5N1亜 型以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応するもの である。
[0026] 本発明にお 、て、ィムノクロマトグラフィー測定法などのサンドイッチ式免疫測定法で 使用する第三の抗体は、第一の抗体が反応する抗原に対して反応する抗体であれ ばよぐ第一の抗体と同一の抗体あってもよぐ第一の抗体以外の抗体であってもよ い。例えば、該抗原が第一の抗体に対するェピトープを複数備える場合は、第三の 抗体として第一の抗体と同一の抗体を使用できる。したがって、第三の抗体は、全て
の A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であってよい。また、第三 の抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、反応特異性の点 力 、モノクローナル抗体、特にインフルエンザウイルスの核タンパクに対するモノクロ ーナル抗体であることが好まし 、。
[0027] 本発明にお 、て、ィムノクロマトグラフィー測定法などのサンドイッチ式免疫測定法で 使用する第四の抗体は、第二の抗体が反応する抗原に対して反応する抗体であれ ばよぐ第二の抗体と同一の抗体あってもよぐ第二の抗体以外の抗体であってもよ い。例えば、該抗原が第二の抗体に対するェピトープを複数備える場合は、第四の 抗体として第二の抗体と同一の抗体を使用できる。したがって、第四の抗体は、全て の A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であってよぐまたは、 A型 インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しな ヽが、該強毒株以外の全ての A型ィ ンフルェンザウィルス亜型に対して反応する抗体であってもよい。また、第四の抗体 は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、反応特異性の点から、モ ノクローナル抗体、特にインフルエンザウイルスの核タンパクに対するモノクローナル 抗体であることが好まし 、。第四の抗体が全ての A型インフルエンザウイルス亜型に 対して反応する抗体である場合、第四の抗体は第三の抗体と同じ抗体であってもよ い。
[0028] 現在のところ、 A型インフルエンザウイルス亜型として H (へマグルチュン）蛋白につ いては 16種類、 N (ノイラミダーゼ）蛋白については 9種の亜型が知られており、理論 上は 16 X 9 = 144種の亜型が考えられる力 一般的には、このうち、 Hl〜15亜型の 代表例に対して反応する抗体が「全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反 応する抗体」と理解されている。したがって、本明細書において、「全ての A型インフ ルェンザウィルス亜型」とは、現在知られている Hl〜15亜型の代表例を意味し、具 体的には、本明細書の後記表 2に挙げられた株を意味する。同様に、「強毒株以外 の全ての A型インフルエンザウイルス亜型」とは、 Hl〜15亜型の代表例、具体的に は、本明細書の後記表 2に挙げられた株力も強毒株を除いた株を意味する。「強毒 株」とは、 H5N1亜型、並びに、 H5N2亜型及び H7N1型の強毒株を意味する。また 、 A型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する抗体は、 B型及び C型インフルェ
ンザウィルスの何れの核タンパクとも交差反応性を示さないものであり、同様に、本発 明の第一及び第二の抗体も、 B型及び C型インフルエンザウイルスの何れの核タンパ クとも交差反応性を示さな 、ものである。
[0029] また、本明細書において、「抗体との反応が陽性」とは、抗原が抗体と抗原抗体反応 することを意味し、「抗体との反応が陰性」とは、抗原が抗体と抗原抗体反応しないこ とを意味する。
また、本明細書において、抗体力 S「 A型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応 しない」とは、抗体が A型インフルエンザウイルス H5N1亜型並びに H5N2亜型及び H7N1型の強毒株力 なる群より選ばれた少なくとも 1種の何れの部分とも全く抗原 抗体反応しないか、抗原抗体反応してもわずかであり、その使用状態、例えば、膜担 体などに固定した時に抗原抗体反応を示さない場合も包含する。
発明の効果
[0030] 本発明によれば、全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体を第 一の抗体として用い、 A型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該 強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体を第二 の抗体として用いることによって、第一の抗体との反応が陽性で且つ第二の抗体との 反応が陰性である抗原を免疫測定法によって検出すること可能となる。この検出法は 、インフルエンザウイルス強毒株を選択的すなわち特異的に検出するために使用で き、ヒト、鳥等のインフルエンザウイルス強毒株による感染症の診断に広く適用できる
[0031] また、本発明のィムノクロマトグラフィー測定法およびィムノクロマトグラフィー測定装 置によれば、特殊な機器及び熟練した技術を必要とすることなぐ病院、養鶏現場等 において簡便かつ迅速にインフルエンザウイルス強毒株の検出及び該ウィルスによ る感染を診断することが可能となる。
発明を実施するための最良の形態
[0032] 本発明のィムノクロマトグラフィー測定法を実施するために使用できる測定装置は、 公知のィムノクロマト法テストストリップの構成に準拠して容易に実施できる。以下、そ の具体例を図面に基づいて説明する。
[0033] (1)単一のィムノクロマト法テストストリップを用いる実施形態
ィムノクロマト法テストストリップの具体例としては、例えば図 1に示されるテストストリツ プ 10が挙げられる。図 1において、数字 1は粘着シート、 2は含浸部材、 3は膜担体、 4は捕捉部位、 5は吸収用部材、 6は試料添加用部材を示している。
図示の例では、膜担体 3は、幅 5mm、長さ 36mmの細長い帯状の-トロセルロース製メ ンブレンフィルターからなり、同幅の粘着シート 1の中程に貼り付けられている。膜担 体 3には、そのクロマト展開始点側、すなわち図 1の左側（以下「上流側」と記す。なお 、その逆の側、すなわち図 1におけるクロマト展開方向側すなわち右側は以下「下流 側」と記す。）の末端から下流側に 7.5mmの位置に第一の抗体が固定され、第三の抗 体と A型インフルエンザウイルスの核タンパク等のウィルス抗原との複合体を捕捉す るための第一の捕捉部位 41aが形成されている。さらに、膜担体 3の上流側の末端か ら下流側に 10.5mmの位置に第二の抗体が固定され、第四の抗体（図 1の装置では、 後述のとおり、第三の抗体と同一であってもよい）と強毒株以外の A型インフルエンザ ウィルスの核タンパク等のウィルス抗原との複合体を捕捉するための第二の捕捉部 位 41bが形成されている。さらに、膜担体 3の上流側の末端から下流側に 15.0mmの 位置に所謂コントロールライン 42が設けられている。このコントロールライン 42は、分 析対象物質の存否に係わらず反応が行われたことを確認するためのものであり、通 常、前記第三及び Z又は第四の抗体と免疫学的に特異的に結合する物質 (分析対 象物質を除く）を膜担体 3に固定ィ匕することによって形成することができる。例えば、 第三及び Z又は第四の抗体としてマウス抗体を用いた場合は、該マウス抗体に対す る抗体を用いることがでさる。
[0034] 図 1の装置では、膜担体 3は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いている 力 被験試料に含まれる分析対象物質をクロマト展開可能で、かつ、捕捉部位 4を形 成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよぐ他のセルロース 類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
図 1の装置において、第一の抗体としては、全ての A型インフルエンザウイルス亜型 の核タンパクに対して反応するモノクローナル抗体を用いることが好まし 、。第二の 抗体としては、強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型の核タンパク〖こ
対して反応するモノクローナル抗体を用いることが好ま 、。
[0035] 本発明において、第三の抗体は、第一の抗体が反応する抗原に反応する抗体であり 、好ましくは、全ての A型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応する 抗体であり、多くの場合、第一の抗体と同一の抗体を用いることができる。また、第四 の抗体は、第二の抗体が反応する抗原に反応する抗体であり、例えば、全ての A型 インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応するモノクローナル抗体、及 び、強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応 するモノクローナル抗体を用いることができる。すなわち、第四の抗体は、第一の抗 体と同一の抗体であってもよぐまた、第二の抗体と同一の抗体であってもよぐまた、 第三の抗体と同一の抗体であってもよい。図 1の装置では、第三及び第四の抗体とし ては、全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する互いに同一または異 なる抗体が用いられ、多くの場合、第三及び第四の抗体として第一の抗体と同一の モノクローナル抗体を使用することができる。
[0036] 第三及び第四の抗体は、ィムノクロマト法テストストリップ 10とは別体の適当な容器内 で、被験試料及び展開溶媒と混合して混合液とした後、この混合液を図示のィムノク 口マト法テストストリップ 10の試料添加用部材 6に注入して膜担体 3をクロマト展開さ せてもよい。しかし、被験試料と展開溶媒とを混合して調製した混合液を試料添加用 部材 6に注入した時、第三及び第四の抗体が、該混合液と混合して膜担体 3へクロマ ト展開されるように、ィムノクロマト法テストストリップ 10と一体ィ匕して配置しておくことが 好ましい。このために、図 1の装置では、第三及び第四の抗体は、適当な標識物質で 予め標識された状態で、膜担体 3の上流側の端部に連接した含浸部材 2に含浸させ てィムノクロマト法テストストリップ 10の一部を構成している。なお、本明細書において 、標識された状態の第三の抗体及び Z又は第四の抗体を標識抗体と称することがあ る。
図示の例では、含浸部材 2として、 5mm X 15mmの帯状のガラス繊維不織布を用いて いるが、これに限定されるものではなぐ例えば、セルロース類布 (濾紙、ニトロセル口 ース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用でき る。
[0037] 第三及び第四の抗体の標識物質としては、使用可能なものであればいかなる物質で あってもよぐ呈色標識物質、酵素標識物質、放射線標識物質などが挙げられる。 このうち、捕捉部位 4での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定 できる点から、呈色標識物質を用いることが好まし 、。
呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および 青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックス や、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コ ロイドが特に好ましい。
含浸部材 2は、標識抗体の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、 これを乾燥させることなどによって作製できる。
[0038] ィムノクロマト法テストストリップ 10は、図 1に示されるように、膜担体 3を粘着シート 1の 中程に貼着し、該膜担体 3の上流側の末端の上に、含浸部材 2の下流側の末端を重 ね合わせて連接するとともに、この含浸部材 2の上流側部分を粘着シート 1に貼着し て作成できる。
さらに、図 1の装置では、含浸部材 2の上面に試料添加用部材 6の下流側部分を載 置するとともに、該試料添加用部材 6の上流側部分を粘着シート 1に貼着しており、ま た、膜担体 3の下流側部分の上面に吸収用部材 5の上流側部分を載置するとともに 、該吸収用部材 5の下流側部分を粘着シート 1に貼着せしめてィムノクロマト法テスト ストリップ 10を構成して 、る。
[0039] 試料添加用部材 6としては、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレン などのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布な どのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布を用いることができる。
吸収用部材 5は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよぐ綿布 、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等力もなる多孔質プラスチック不織布等を 挙げることができる力 特に濾紙が最適である。
[0040] 図 1のィムノクロマト法テストストリップ 10は、そのまま、ディップスティック形式の測定 装置として用いることもでき、別法としては、適当なプラスチックシートで裏打ち又はサ ンドイッチしたディップスティック形式の測定装置として提供してもよ ヽ。好ましくは、
図 1のィムノクロマト法テストストリップ 10は、試料添加用部材 6と捕捉部位 4の上方に それぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製ケース内に収 容された測定装置として提供される。上述のとおり、本発明において、第三及び第四 の抗体は、ィムノクロマト法テストストリップ 10とは別体の適当な容器内で、被験試料 及び展開溶媒と混合して混合液とした後、この混合液をィムノクロマト法テストストリツ プ 10の試料添加用部材 6に注入して膜担体 3をクロマト展開させてもよいので、ィムノ クロマト法テストストリップ 10をケース内に収容させた場合、第三及び第四の抗体は、 含浸部材 2に含浸させてケース内に収容してもよいし、また、該ケースとは別体の適 当な容器内に収容してケース外に収容してぉ 、てもよ 、。
[0041] カゝくして、 A型インフルエンザウイルス H5N1亜型などの強毒株感染が疑われる患者 の生体試料など力 なる被験試料を必要に応じて適当な展開溶媒と混合してクロマト 展開可能な混合液を得た後、当該混合液を図 1に示されるィムノクロマト法テストスト リップ 10の試料添加用部材 6上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材 6を 通過して含浸部材 2にお 、て、標識抗体と混合する。
その際、該混合液中に A型インフルエンザウイルス強毒株が存在すれば、抗原抗体 反応により該強毒株ウィルスのウィルス抗原と標識抗体との複合体が形成される。 この複合体は、膜担体 3中をクロマト展開されて捕捉部位 4に到達し、第一の捕捉部 位 41aに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈する 力、第二の捕捉部位 41bに固定された第二の抗体には捕捉されず陰性の結果を呈 する。これに対し、該混合液中に強毒株以外の A型インフルエンザウイルスが存在す れば、第一の捕捉部位 41a及び第二の捕捉部位 41bの両方において陽性の結果が 示される。したがって、第一及び第二の捕捉部位の結果を総合することで、強毒株の 感染カゝ、強毒株以外の A型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
[0042] 陽性か陰性力の判定は、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用され ていれば、当該呈色標識物質の集積により第一及び第二の捕捉部位 41a, 41bが 発色するので、直ちに、判定することができる。
図 1の装置においては、第二の捕捉部位 41bが第一の捕捉部位 41aの下流側にあ るので、第二の捕捉部位 41bの検出感度が落ちる傾向があるので、第二の捕捉部位
41bに固定する抗体の量を第一の捕捉部位 41aに固定する抗体の量よりも多くする などの方法で、感度調整することが好ましい。
[0043] 被験試料としては、特に制限はないが、例えば、クロアカスヮブ、気管スヮブ、糞便、 鼻腔吸引液、鼻腔ぬぐい液および咽頭ぬぐい液、血液 (全血でも、血清でも、血漿で もよい)、唾液、尿、臓器乳剤等が挙げられる。被験試料は、展開溶媒などの適当な 希釈液で希釈して膜担体に注入してもよ ヽ。
なお、全血を被験試料として用いるときで、特に標識抗体の標識物質として金コロイ ドなどの呈色標識物質が用いられる場合、前記試料添加用部材に血球捕捉膜部材 を配置しておくことが好ましい。血球捕捉膜部材は、前記含浸部材と前記試料添カロ 用部材との間に積層することが好ましい。これにより、赤血球が膜担体に展開される のが阻止されるので、膜担体の捕捉部位における呈色標識の集積の確認が容易に なる。血球捕捉膜部材としては、カルボキシメチルセルロース膜が用いられ、具体的 には、アドバンテック東洋株式会社から販売されているイオン交換濾紙 CM (商品名） や、ワットマンジャパン株式会社から販売されて!、るイオン交換セルロースペーパー などを用いることができる。
[0044] (2) 2つのィムノクロマト法テストストリップを用いる実施形態
図 2の装置は、 2本のィムノクロマト法テストストリップ 10及び 20からなるィムノクロマト グラフィー測定装置である。各ィムノクロマト法テストストリップ 10及び 20は、捕捉部位 4及び標識抗体の構成を除いて図 1のィムノクロマト法テストストリップ 10の構成と同 様である。図 2のィムノクロマト法テストストリップ 10は、膜担体 3の上流側の末端から 7 .5mmの位置に第一の抗体が固定され、第三の抗体と分析対象物質との複合体を捕 捉するための第一の捕捉部位 41aが形成されている点は図 1と同様であるが、膜担 体 3の上流側の末端から 10.5mmの位置に抗 B型インフルエンザウイルス抗体が固定 され、 B型インフルエンザウイルスを検出する捕捉部位 41bが設けられて ヽる点で図 1と異なる。そして、ィムノクロマト法テストストリップ 10の含浸部材 2には、標識された 第三の抗体及び標識された抗 B型インフルエンザウイルス抗体が、標識抗体として含 浸されている。ここで、第三の抗体としては、多くの場合、第一の抗体と同様の抗体が 使用できる。抗 B型インフルエンザウイルス抗体としては、公知のィムノクロマトグラフ
ィー測定装置に使用されている抗体が使用できる。
図 2のィムノクロマト法テストストリップ 20は、膜担体 3の上流側の末端力 9.0mmの位 置に第二の抗体が固定され、第四の抗体と分析対象物質との複合体を捕捉するた めの第二の捕捉部位 41cが形成されている点で図 1のィムノクロマト法テストストリップ 10と異なる。そして、ィムノクロマト法テストストリップ 20の含浸部材 2には、標識され た第四の抗体が、標識抗体として含浸されている。ここで、第四の抗体としては、第 二の抗体と同様の抗体が使用されて!ヽるが、第一の抗体と同様の抗体を使用しても よい。
[0045] カゝくして、図 1を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、 当該混合液を図 2に示されるィムノクロマト法テストストリップ 10及び 20のそれぞれの 試料添加用部材 6上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材 6を通過して含 浸部材 2において、標識抗体と混合する。
その際、該混合液中に A型インフルエンザウイルス強毒株が存在すれば、ィムノクロ マト法テストストリップ 10においては、抗原抗体反応により該強毒株ウィルス抗原と第 三の抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体 3中をクロマト展開されて 捕捉部位 4に到達し、第一の捕捉部位 41aに固定された第一の抗体と抗原抗体反 応して捕捉され陽性の結果を呈するが、捕捉部位 41bに固定された抗 B型インフル ェンザウィルス抗体には捕捉されず陰性の結果を呈する。ィムノクロマト法テストストリ ップ 20にお 、ては、該強毒株ウィルス抗原と第四の抗体との複合体は形成されず、 両者はそれぞれ単独に膜担体 3中をクロマト展開されて第二の捕捉部位 41cに到達 するが、そこに固定された第二の抗体に捕捉されず陰性の結果を呈する。
[0046] これに対し、該混合液中に強毒株以外の A型インフルエンザウイルスが存在すれば 、ィムノクロマト法テストストリップ 10においては、抗原抗体反応によりそのウィルス抗 原と第三の抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体 3中をクロマト展開 されて捕捉部位 4に到達し、第一の捕捉部位 41aに固定された第一の抗体と抗原抗 体反応して捕捉され陽性の結果を呈するが、捕捉部位 41bに固定された抗 B型イン フルェンザウィルス抗体には捕捉されず陰性の結果を呈する。ィムノクロマト法テスト ストリップ 20においても、該ウィルス抗原と第四の抗体との複合体が形成され、膜担
体 3中をクロマト展開されて第二の捕捉部位 41cに到達し、そこに固定された第二の 抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈する。
[0047] また、該混合液中に B型インフルエンザウイルスが存在すれば、ィムノクロマト法テスト ストリップ 10においては、抗原抗体反応によりそのウィルス抗原と抗 B型インフルェン ザウィルス抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体 3中をクロマト展開さ れて捕捉部位 4に到達し、捕捉部位 4 lbに固定された抗 B型インフルエンザウイルス 抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈するが、第一の捕捉部位 41a〖こ 固定された第一の抗体には捕捉されず陰性の結果を呈する。ィムノクロマト法テスト ストリップ 20においては、該ウィルス抗原と第四の抗体との複合体が形成されず、両 者はそれぞれ単独に膜担体 3中をクロマト展開されて第二の捕捉部位 41cに到達す るが、そこに固定された第二の抗体に捕捉されず陰性の結果を呈する。
したがって、第一の捕捉部位 41a、第二の捕捉部位 41c及び捕捉部位 41bにおける 結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外の A型インフルエンザウイルスの感染か 、 B型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
[0048] 図 2の装置は、 2つのィムノクロマト法テストストリップ 10及び 20を少なくとも備えてい ればよぐ 2つのストリップが 1つのケースに収容されたものであっても、各ストリップが 数本ずつ各ケースに収容され、使用時に 1つずつ取り出して使用するような形態のも のであってもよい。前者の場合、 1つのケース中に、ィムノクロマト法テストストリップ 10 及び 20の両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させ、両膜担体を 相互に並行して配置させた一体製品としてもよい。
なお、図 2のィムノクロマト法テストストリップ 10としては、キヤピリア (登録商標） FluA+B (株式会社タウンズ製)などの市販の A型及び B型インフルエンザ鑑別測定用のィム ノクロマト法テストストリップまたはキットをそのまま用いることもできる。したがって、か カゝる市販のテストストリップまたはキットと併用して本発明の検出法又は測定法を実施 できるように、図 2のィムノクロマト法テストストリップ 20のみを単品で供給することもで きる。
[0049] 図 3の装置は、ィムノクロマト法テストストリップ 10及び 20が共通する単一の含浸部材 2及び試料添加用部材 6を備える以外、図 2の構成と同様の構成を備えている。すな
わち、ィムノクロマト法テストストリップ 10及び 20の両膜担体 3は、互いに隣接してほ ぼ平行に配置され、上流側の末端に幅広の（幅約 12mm)の単一の含浸部材 2が両 膜単体 3にまたがって連接されている。この含浸部材 2には、第三の抗体と第四の抗 体と抗 B型インフルエンザウイルス抗体とが上記と同様にクロマト展開可能なように配 置されるが、この態様では、図 1の装置と同様に、第三の抗体及び第四の抗体の何 れも全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体を使用することが 好ましぐ好都合には、何れも第一の抗体と同じ抗体とすることができる。
[0050] カゝくして、図 2を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、 当該混合液を図 3に示されるィムノクロマト法テストストリップ 10及び 20に共通の試料 添加用部材 6上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材 6を通過して含浸部 材 2において、標識抗体と混合する。
その際、該混合液中に A型インフルエンザウイルス強毒株が存在すれば、ィムノクロ マト法テストストリップ 10においては、図 2と同様に第一の捕捉部位 41aにおいて陽 性の結果を呈し、捕捉部位 4 lbでは陰性の結果を呈する。ィムノクロマト法テストストリ ップ 20においては、該強毒株ウィルス抗原と標識抗体との複合体が形成されるが、 第二の捕捉部位 41cに固定された第二の抗体に捕捉されず陰性の結果を呈する。 該混合液中に強毒株以外の A型インフルエンザウイルスが存在すれば、図 2と同様 に、ィムノクロマト法テストストリップ 10においては、第一の捕捉部位 41で陽性の結果 を呈するが、捕捉部位 41bでは陰性の結果を呈する。ィムノクロマト法テストストリップ 20においては、該ウィルス抗原と標識抗体との複合体が形成され、膜担体 3中をクロ マト展開されて第二の捕捉部位 41cに到達し、そこに固定された第二の抗体に捕捉 され、陽性の結果を呈する。
[0051] また、該混合液中に B型インフルエンザウイルスが存在すれば、図 2と同様に、ィムノ クロマト法テストストリップ 10においては、捕捉部位 41bで陽性の結果を呈する力 第 一の捕捉部位 41aで陰性の結果を呈する。ィムノクロマト法テストストリップ 20におい ては、図 2と同様に、第二の捕捉部位 41cにおいて陰性の結果を呈する。
したがって、前記第一の捕捉部位 41a、第二の捕捉部位 41c及び捕捉部位 41bにお ける結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外の A型インフルエンザウイルスの感
染カ B型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
図 3の装置は、適当なケースに収容した形態のものであってもよい。
[0052] 図 4の装置は、ィムノクロマト法テストストリップ 10及び 20が共通する単一の粘着テー プ 1及び単一の試料添加用部材 6を備える以外、図 2の構成と同様の構成を備えて いる。すなわち、ィムノクロマト法テストストリップ 10及び 20の両膜担体 3は、相互に反 対向きにほぼ一直線状に配置されている。具体的には、ィムノクロマト法テストストリツ プ 10及び 20は、両者の含浸部材 2の上流側端部が適当な間隔をお 、て相互に対 向するようにすなわち反対方向に一直線上に配置されており、単一の試料添加用部 材 6が両含浸部材 2の間にまたがって連接するように配置されている。別法として、ィ ムノクロマト法テストストリップ 10及び 20の両膜担体が互いに角度を為して延在する ように、放射方向に配置してもよい。
カゝくして、図 2を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、 当該混合液を図 4に示されるィムノクロマト法テストストリップ 10及び 20に共通の試料 添加用部材 6上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材 6を通過して両テスト ストリップ 10及び 20の含浸部材 2において、標識抗体と混合する。そして、図 2と同 様に、前記第一の捕捉部位 41a、第二の捕捉部位 41c及び捕捉部位 41bにおける 結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外の A型インフルエンザウイルスの感染か 、 B型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
[0053] 図 4の装置は、適当なケースに収容した形態のものであってもよい。
図 4の装置の変形として、粘着シート 1及び試料添加用部材 6の他に、含浸部材 2を テストストリップ 10及び 20に共通のものとしてもよい。この場合、図 3の態様に準じて 第三及び第四の抗体を構成して実施することができる。
図 4の装置は、上記被験試料を含む混合液がテストストリップ 10及び 20に均等に浸 透するので、図 1の装置のように第一及び第二の捕捉部位 41a, 41bの感度調整を する必要がな 、点で好都合である。
[0054] (3)第二の抗体を標識抗体として用いる実施形態
図 2の装置は、第二の抗体を標識抗体として用いた本発明の態様を実施するための 装置に改変することができる。かかる装置は、図 2の装置において、ィムノクロマト法
テストストリップ 20の第二の捕捉部位 41cに第二の抗体の代わりに第一の抗体を固 定し、該ストリップ 20の含浸部材 2に含浸させておく標識抗体として第四の抗体の代 わりに第二の抗体を使用することによって構成できる。かかる装置において、ィムノク 口マト法テストストリップ 10の構成は図 2のものと全く同じである。
カゝくして、図 2を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、 当該混合液を上記改変した図 2の装置のィムノクロマト法テストストリップ 10及び 20の それぞれの試料添加用部材 6上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材 6を 通過して含浸部材 2にお 、て、標識抗体と混合する。
[0055] その際、該混合液中に A型インフルエンザウイルス強毒株が存在すれば、ィムノクロ マト法テストストリップ 10においては、図 2と同様に第一の捕捉部位 41aにおいて陽 性の結果を呈し、捕捉部位 4 lbでは陰性の結果を呈する。ィムノクロマト法テストストリ ップ 20においては、該強毒株ウィルス抗原と標識抗体との複合体が形成されず、両 者はそれぞれ単独に膜担体 3中をクロマト展開されて第二の捕捉部位 41cに到達し 、強毒株ウィルス抗原は第二の捕捉部位 41cに固定された第一の抗体に捕捉される 力 標識抗体が結合していないので、陰性の結果を呈する。
該混合液中に強毒株以外の A型インフルエンザウイルスが存在すれば、図 2と同様 に、ィムノクロマト法テストストリップ 10においては、第一の捕捉部位 41で陽性の結果 を呈するが、捕捉部位 41bでは陰性の結果を呈する。ィムノクロマト法テストストリップ 20においては、該ウィルス抗原と標識抗体との複合体が形成され、膜担体 3中をクロ マト展開されて捕捉部位 41に到達し、第二の捕捉部位 41cにて第一の抗体に捕捉 され、陽性の結果を呈する。
[0056] また、該混合液中に B型インフルエンザウイルスが存在すれば、図 2と同様に、ィムノ クロマト法テストストリップ 10においては、捕捉部位 41bで陽性の結果を呈する力 第 一の捕捉部位 41aでは陰性の結果を呈する。ィムノクロマト法テストストリップ 20にお いては、第二の捕捉部位 41cにおいて陰性の結果を呈する。
したがって、前記第一の捕捉部位 41a、第二の捕捉部位 41c及び捕捉部位 41bにお ける結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外の A型インフルエンザウイルスの感 染カ B型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
[0057] 図 4の装置も、上記と同様の変更を行うことで、第二の抗体を標識抗体として用いた 本発明の態様を実施するための装置に改変することができる。すなわち、図 4の装置 において、ィムノクロマト法テストストリップ 20の第二の捕捉部位 41cに第二の抗体の 代わりに第一の抗体を固定し、該ストリップ 20の含浸部材 2に含浸させておく標識抗 体として第四の抗体の代わりに第二の抗体を使用することによって改変することがで きる。なお、ィムノクロマト法テストストリップ 10の構成は図 4のものと全く同じである。
[0058] カゝくして、図 2を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、 当該混合液を上記改変した図 4のィムノクロマト法テストストリップ 10及び 20に共通の 試料添加用部材 6上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材 6を通過して両 テストストリップ 10及び 20の含浸部材 2において、標識抗体と混合する。そして、上記 改変した図 2の装置と同様に、前記第一の捕捉部位 41a、第二の捕捉部位 41c及び 捕捉部位 41bにおける結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外の A型インフル ェンザウィルスの感染力、 B型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。 実施例
[0059] 下記の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限 定されるものではない。
[0060] 実施例 1 (A型および B型インフルエンザウイルスの組換え核タンパク（NP)遺伝子の クローニング）
インフルエンザウイルス A型である A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)およびインフルエンザ ウィルス B型である B/Lee/40を発育鶏卵に接種し、培養した。数日後に漿尿液を採 取しウィルスを得た。このウィルスに RNA抽出試薬（TRIzol Reagent, Invitrogen)を加 え、それぞれのウィルス RNAを抽出した。抽出した RNAから逆転写反応を行い NP遺 伝子の cDNAを作製した。逆転写反応に用いたプライマーとして Uni 12 Primer： 5' - AGCAAAAGCAGG-3，（配列番号 1)を用いた。
[0061] 得られた A/Puerto Rico/8/34および B/Lee/40の NP遺伝子 cDNAよりポリメラーゼ連 鎖反応（PCR)法を用いて NP遺伝子を増幅した。プライマーとして A/Puerto Rico/8/3 4においては、 sense primer: 5，— GGAATTCCATATGGCGTCCCAAGGCACC— 3 ' ( 配列番号 2)および antisense primer: 5， - CCGCTCGAGTTAATTGTCGTACTCCTC
TGC-3' (配列番号 3)を用いた。また B/Lee/40においては、 sense primer: 5，- CGG GATCCATATGTCCAACATGGATATTG-3 ' (配列番号 4)および antisense primer: 5 ' -CCGCTCGAGTTAATAATCGAGGTCATCATA-3 ' (配列番号 5)を用いた。用 ヽたプライマーはベクター pET15bに糸且み込むァこめに upper primerと lower primerにそ れぞれ Nde Iと Xho Iサイトを付カロした。
得られた PCR産物の一部を DNA電気泳動で増幅を確認した後、それぞれの増幅産 物を制限酵素 Ndelおよび Xbalにて切断し、同じ制限酵素で切断したベクター pET15b に挿人した。
[0062] (組換え核タンパク (NP蛋白）の発現と精製）
目的遺伝子が挿入された実施例 1のベクター pET15bで E.coli BL21CodonPlusを形質 転換し、アンピシリン選択培地上で培養し、コロニーを得た。アンピシリン (100 g/ml) とクロラムフエ-コール (25 μ g/ml)を含む L-Broth中にてー晚培養を行った後、アンピ シリン (100 g/ml)を含む L- brothに培養液をカ卩えた。 37°Cにて 3時間の培養を行った 後、 1 M IPTGを最終濃度 1 mMになるように添加し組換え NP蛋白の発現を誘導した 。 IPTGによるタンパク質の発現は SDS-PAGEにて確認した。
遠心分離により回収した菌体を可溶化バッファーに懸濁させた。さらに PMSFおよびリ ゾチーム処理を行 ヽ完全に溶菌させた。得られた溶液の遠心上清力ゝら組換え NP蛋 白を Ni-NTA榭脂を用いたカラムに通し精製した。この精製蛋白を PBSに対して透析 し、 目的の糸且換え NP蛋白とした。
[0063] 実施例 3 (モノクローナル抗体の作製)
実施例 2で得られた A型インフルエンザウイルス組換え NP蛋白（FluA NP)および B型 インフルエンザウイルス組換え NP蛋白（FluB NP)を抗原として、 FluA NPおよび FluB NPに対するモノクローナル抗体 (抗 FluA NP抗体および抗 FluB NP抗体）を作出した 。モノクローナル抗体の作出は常法に従って行った。それぞれ 100 gの組換え NP蛋 白と等量の Adjuvant Complete Freund (Difco)を混合して、マウス（BALB/c、 5週齢、 日本 SLC)に 3回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。
細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞である Sp2/0-Agl4細胞（Shulmanら、 1978)を用 いた。細胞の培養には、 Dulbecco' s Modified Eagle Medium (Gibco)〖こ L—グルタミン 0
•3mg/ml、ペニシリン Gカリウム 100単位/ ml、硫酸ストレプトマイシン 100 μ g/ml, Genta cin 40 μ g/mlを添カ卩し（DMEM)、これに牛胎児血清 (JRH)を 10%となるように加えた培 養液を用いた。
[0064] 細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞と Sp2/0-Agl4細胞を混合し、そこに Polyethylen e glycol solution (Sigma)を添カ卩することにより行った。細胞融合は HAT- DMEM (0.1m M bodium Hypoxanthine、 0.4 μ M Aminopeterinおよび 0.016mM Tymidine (uibco ¾r 含む血清カロ DMEM)で培養し、抗 FluA NP抗体のスクリーニングには、不活化した Infl uenza Virus, Type A (H1N1)を固相化したプレートを用いた酵素結合抗体法（ELISA )により培養上清中の抗体産生を確認した。また抗 FluB NP抗体のスクリーニングには 不活化した Influenza B virusを固相化したプレートを用い、同様の方法にて培養上清 中の抗体産生を確認した。
[0065] 抗体産生陽性の細胞を HT- DMEM[0.1mM Sodium Hypoxanthineおよび 0.016mM T hymidine (Gibco)を含む血清加 DMEM]で培養し、さらに血清加 DMEMで培養を続け た。 ELISA法により抗体産生能の高い細胞を選択しクローユングした。クロー-ングし た細胞は、 2,6,10,14- Tetramethylpentadecane (Sigma)を接種してぉ 、たマウス（BAL B/c、リタイア、 日本 SLC)に腹腔内接種し、腹水を採取した。さらに、常法によりプロ ティン G吸着体を用いた IgG精製を行い、モノクローナル抗体を得た。作出したモノク ローナノレ饥'体のアイソタイプは、 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents (Sig ma)を用いて ELISAで同定した。
[0066] 最終的に FluA NPに対するモノクローナル抗体産生細胞 3クローン F/169、 B/347及 び F/211が得られた。このうち、抗体産生細胞 F/211は、下記の実施例に示されるよう に、結果的に、 A型インフルエンザウイルス H5N1亜型に対して反応しないが、該 H5 N 1亜型以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体 (本発 明の第二の抗体）を産生するクローンであった。 FluB NPに対するモノクローナル抗 体産生細胞が 4クローン得られ、以下、 F/171のみを用いた。
[0067] ィムノクロマトグラフィー測定装置の作製）
(1)抗 FluA NP抗体、抗 FluB NP抗体および H5N1亜型に対し反応性を示さない抗 F1 uA NP抗体の調製
実施例 1で得られた抗 FluA NP抗体産生細胞 F/169および B/347のそれぞれを、マウ ス腹腔に接種し、抗 FluA NP抗体を含んだ腹水を得た。また抗 FluB NP抗体産生細 胞 F/171を、マウス腹腔に接種し、抗 FluB NP抗体を含んだ腹水を得た。さらに、抗 F1 uA NP抗体産生細胞 F/211を、マウス腹腔に接種し、抗 FluA NP抗体を含んだ腹水を 得た。さらに、常法によりプロテイン G吸着体を用いた IgG精製を行い、それぞれの抗 体を得た。
[0068] (2)金コロイド溶液の調製
加熱によって沸騰させた超純水 99mlに、 l% (v/w)塩化金酸水溶液 lmlを加え、さらに 、その 1分後に l% (v/w)クェン酸ナトリウム水溶液 1.5mlをカ卩えて加熱し 5分間沸騰さ せた後、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液に 200mM炭酸カリウム水溶液を 加えて PH9.0に調製し、これに超純水をカ卩えて全量を 100mlとして金コロイド溶液を得 た。
[0069] (3)余コロイド標識杭体溶液の調製
上記（1)にて得られた抗体産生細胞 B/347由来の抗 FluA NP抗体（以下、抗 FluA NP 抗体 B/347)、抗体産生細胞 F/171由来の抗 FluB NP抗体（以下、抗 FluB NP抗体 F/ 171)および抗体産生細胞 F/211由来の抗 FluA NP抗体（以下、抗 FluA NP抗体 F/21 1)を下記の手順でそれぞれ金コロイド標識した。
抗 FluA NP抗体 B/347の蛋白換算重量 3 μ gと上記（2)の金コロイド溶液 lmlとを混合 し、室温で 2分間静置してこの抗体のことごとくを金コロイド粒子表面に結合させた後 、金コロイド溶液における最終濃度が 1%になるように 10%BSA水溶液をカ卩え、この金コ ロイド粒子の残余の表面をことごとくこの BSAでブロックして、金コロイド標識抗 FluA N P抗体 B/347溶液を調製した。この溶液を遠心分離 (5600XG、 30分間）して金コロイド 標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド 標識抗体を 10%サッカロース ' 1%BSA'0.5%トリトン（Triton) -X100を含有する 50mMトリ ス塩酸緩衝液 (PH7.4)に懸濁して金コロイド標識抗 FluA NP抗体 B/347溶液を調製し た。また抗 FluB NP抗体 F/171の蛋白換算重量 1 μ gを上記方法にて金コロイド粒子 表面に結合させ金コロイド標識抗 FluB NP抗体 F/171溶液を調製した。さらに抗 FluA NP抗体 F/211の蛋白換算重量 1 μ gを上記方法にて金コロイド粒子表面に結合させ
金コロイド標識抗 FluA NP抗体 F/211溶液を調製した。
[0070] (4)ィムノクロマトグラフィー測定装置の作製
図 4に示されるィムノクロマトグラフィー測定装置を下記の手順で作製した。
(4-1)膜担体の第一の捕捉き β^:の形成
幅 5mm、長さ 36mmの細長!/、帯状の-トロセルロース膜を膜担体 3として用意した。 抗 FluA NP抗体 F/169 1.0mg/mlが含有されてなる溶液 0.5 μ 1を、この膜担体 3の上 流側の末端から 5.0mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥させ、 A型ィ ンフルェンザウィルス抗原と標識抗体との複合体の捕捉部位 41a (第一の捕捉部位) を形成した。また、抗 FluB NP抗体 F/171 1.0mg/mlが含有されてなる溶液 0.5 μ 1を、 この膜担体 3の上流側の末端力 8.0mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で 乾燥し、 B型インフルエンザウイルス抗原と標識抗体との複合体の捕捉部位 41bを形 成した。
[0071] (4-2)蹬相.体の第二の捕栴き の形成
上記 (4-1)で用いた膜担体と同様の膜担体 3をもう一つ用意した。
抗 FluA NP抗体 F/169 1.0mg/mlが含有されてなる溶液 0.5 μ 1を、この膜担体 3の上 流側の末端から 5.0mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥させ、インフ ルェンザウィルス抗原と標識抗体との複合体の捕捉部位 41c (第二の捕捉部位)を 形成した。
[0072] (4-3)余コロイド 識杭体含浔き β材の作製
5mmX15mmの帯状のガラス繊維不織布に、上記（3)で得られた金コロイド標識抗 Flu A NP抗体 B/347溶液および金コロイド標識抗 FluB NP抗体 F/171溶液を混合した溶 液 37.5 1を含浸せしめ、これを室温で乾燥させて標識抗体含浸部材とした。また別 の 5mmX15mmの帯状のガラス繊維不織布に、金コロイド標識抗 FluA NP抗体 F/211 溶液 37.5 1を含浸せしめ、これを室温で乾燥させて標識抗体含浸部材とした。前者 の標識抗体含浸部材をテストストリップ 10の含浸部材 3として用い、後者の標識抗体 含浸部材をテストストリップ 20の含浸部材 3として用い、上記 (4— 1)で得られた膜担 体をテストストリップ 10の膜担体 3として用い、上記 (4— 2)で得られた膜担体をテスト ストリップ 20の膜担体 3として用い、その他、各テストストリップの試料添加用部材 6と
して綿布を、吸収用部材 5として濾紙を用いて、図 4と同様の配置のィムノクロマトダラ フィー測定装置を作製した。
[0073] 実施例 5 (インフルエンザウイルス H5N1株（Yamaguchi株）との反応性試験）
実施例 4にて作製したィムノクロマトグラフィー測定装置を使用し、インフルエンザウイ ルス H5N1株（A/chichen/Yamaguchi/7/04、 Yamaguchi株）に対する反応性試験を実 施した。また、インフルエンザウイルス H3N2 (A/Aichi/2/68、 Aichi株）を対照として用 いた。被験試料として、上記インフルエンザウイルス株をそれぞれ発育鶏卵にて増殖 させて得た漿尿液を、検体希釈液で調製したものを用いた。そして、被験試料 150 1 を実施例 4にて得られたテストストリップの試料添加用部材 6にマイクロピペットで滴下 してクロマト展開し、室温で 15分放置後、第一の捕捉部位 41aおよび第二の捕捉部 位 41cで捕捉されたウィルス抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で 観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、 (着色なし)、士（微弱な着色)、 + (明確な着色)、 + + (より明確な着色)、 + + + ( 顕著な着色）の 5段階に区分して判定した。なお、上記 Yamaguchi株の漿尿液の HA 価は 1024であり、上記 Aichi株の漿尿液の HA価は 2048であった。結果を表 1に示し た。
[0074] [表 1]
A型ィンフルェンザウィルス H 5 N 1亜型に対する反応性試験
表 1の結果より、第二の捕捉部位 41cでは、陽性コントロールとして用いた Aichi株 (H 3N2)と比較して、 Yamaguchi株（H5N1)に対する反応性がほとんど確認されなかった 。このことから、テストストリップ 20の標識抗体として用いた抗 FluA NP抗体 F/211は、 Yamaguchi株（H5N1)に対して反応せず、 A型インフルエンザウイルス H5N1亜型に 対して特異的に反応しないことが示唆された。これに対し、第一の捕捉部位 41aでは
Aichi株 (H3N2)および Yamaguchi株（H5N1)に対し同等の反応性が得られた。
[0076] 実施例 6 (A型インフルエンザウイルス各種亜型との反応性試験）
実施例 4にて作製したィムノクロマトグラフィー測定装置を使用し、 A型インフルェン ザウィルスの 15種類の亜型に対する反応性試験を実施した。被験試料として、 A型ィ ンフルェンザウィルスの各種亜型を発育鶏卵にて増殖させて得た漿尿液を、検体希 釈液で調製したものを用いた。そして、被験試料 150 1を実施例 4にて得られたテス トストリップの試料添加用部材 6にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で 1 5分放置後、第一の捕捉部位 41aおよび第二の捕捉部位 41cで捕捉されたウィルス 抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その 量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、 （着色なし)、士（微弱な着 色)、 + (明確な着色)、 + + (より明確な着色)、 + + + (顕著な着色)の 5段階に区 分して判定した。
[0077] なお、 A型インフルエンザウイルス亜型として、 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)、 A/Hok kaido/11/02 (H1N1), A/Singapore/ 1/57 (H2N2)、 A/Aichi/2/68 (H3N2)、 A/Hok kaido/1/03 (H3N2)、 A/duck/Czech/56 (H4N6)、 A/duck/Pennsylvania/ 1028/83 ( H5N2)、 A/Hong Kong/ 156/97 (H5N1)、 A/Hong Kong/483/97 (H5N1)、 A/turey/ Massachusetts/3740/65 (H6N2)、 A/seal/Massachusetts/1/80 (H7N7)、 A/turey/ Ontario/67 (H8N4)、 A/turey/Wisconsin/66 (H9N2)、 A/chicken/Germany/N/49 ( H10N7)、 A/duck/England/56 (H11N6)、 A/duck/Alberta/60/76 (H12N5)、 A/gull/ Maryland/704/77 (H13N6)、 A/mallard/Astrakhan/263/82 (H14N5)、 A/duck/Aust ralia/341/83 (H15N8)を試験に供した。結果を表 2に示す。
[0078] 表 2から明らかなように、テストストリップ 10の第一の捕捉部位 41aにおいては、試験 に供したウィルス株全てにぉ 、て顕著な着色が確認され、捕捉部位 41bにお 、ては いずれのウィルス亜型においても着色は見られなかった。一方、テストストリップ 20の 第二の捕捉部位 41cにおいては、試験に供したインフルエンザウイルス A型のうち、 H 5N1株、 A/Hong Kong/156/97 (H5N1)、 A/Hong Kong/483/97 (H5N1)においての み着色が確認されな力つた力 試験に供した他のウィルス株および H5N2亜型である A/duck/Pennsylvania/ 1028/83 (H5N2)においては顕著な呈色が確認された。従つ
て、実施例 4記載のィムノクロマトグラフィー測定装置は、第一の捕捉部位 41aにおい ては全てのインフルエンザウイルス A型に対して反応性を示し、第二の捕捉部位 41 c にお 、てはインフルエンザウイルス H5N1型に対してのみ反応性を示さな!/、ことがわ かった。これは、テストストリップ 20の標識抗体として用いた抗 FluA NP抗体 F/211が、 A型インフルエンザウイルス H5N 1亜型に対して反応しな 、が、該 H5N 1亜型以外 の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であることを示すも のである。
[0079] したがって、インフルエンザ感染を疑われた患者力 採取された検体を実施例 4記載 のィムノクロマトグラフィー測定装置に供した場合、第一の捕捉部位 41a及び第二の 捕捉部位 41cにおける呈色が確認された場合、インフルエンザウイルス H1N1感染ま たは H3N2感染が確認され、一般的なインフルエンザ感染であることが疑われる。また 、第一の捕捉部位 41aにおける呈色が確認されるが、第二の捕捉部位 41cにおける 呈色が確認されない場合は、インフルエンザウイルス H5N1感染が疑われる。したが つて、この装置を用いることにより、感染ウィルスの種類に応じて、患者に対し適切な 処置を施すとともに、感染拡大を防ぐように勤める事が可能となる。なお、捕捉部位 4 lbにおける B型判定部位に呈色が認められた場合は、インフルエンザウイルス B型感 染の疑いと判定し、どちらの判定部位にも呈色が認められな力つた場合はインフルェ ンザ感染陰性である。
[0080] したがって、本発明に従 、、全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応す る第一の抗体、及び、 A型インフルエンザウイルス H5N1亜型に対して反応しないが 、該 H5N1亜型以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第 二の抗体を組み合わせて使用することにより、インフルエンザウイルス H5N1感染を検 出することが可能である。
[0081] [表 2]
A型インフルエンザウイルス各種亜型に対する反応性試験
実施例 4にて作製したィムノクロマトグラフィー測定装置を使用し、 A型インフルェン ザウィルスの 8種類に対する反応性試験を実施した。被験試料として、 A型インフル ェンザウィルス各種を発育鶏卵にて増殖させて得た漿尿液を、検体希釈液で 10倍、 100倍、 1000倍及び 10000倍に希釈したものを用いた。そして、被験試料 150 1を 実施例 4にて得られたテストストリップの試料添加用部材 6にマイクロピペットで滴下し てクロマト展開し、室温で 15分放置後、第一の捕捉部位 41aおよび第二の捕捉部位 41cで捕捉されたウィルス抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観 察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、一 ( 着色なし)、士（微弱な着色)、 + (明確な着色)、 + + (より明確な着色)、 + + + (顕 著な着色)、 + + + + (より顕著な着色)の 6段階に区分して判定した。
[0083] なお、 A型インフルエンザウイルスとして、 A/Vietnam/ 1194/04 (H5N1)、 A/Hong Kon g/483/97 (H5N1)、 A/Chicken/Suphanburi/1/04 (H5N1)、 A/Whooperswan/Mongoli a/3/05 (H5N1)、 A/Chicken/Ibaraki /1/05 (H5N2)、 A/Swan/Hokkaido/51/96 (H5N 3)、 A/Chicken/Italy/99 (H7N1)、および A/Chicken/Netherlands/03 (H7N7)を試験 に供した。このうち、 A/Swan/Hokkaido/51/96 (H5N3)および A/Chicken/Netherlands /03 (H7N7)以外は強毒株として知られているものである。結果を、各亜型の漿尿液の HA価とともに、表 3— 1〜表 3— 4に示す。
[0084] [表 3-1]
A型インフルエンザウイルスに対する反応性試験
[0085] [表 3-2]
A型インフルエンザウイルスに対する反応性試験
[0086] [表 3- 3]
A型インフルエンザウイルスに対する反応性試験
[0087] [表 3-4]
A型インフルエンザウイルスに対する反応性試験
[0088] 表 3— 1〜表 3— 4から明らかなように、 1000倍以下の希釈培率において、テストスト リップ 10の第一の捕捉部位 41aにおいては、試験に供したウィルス株全てにおいて 着色が確認された。一方、テストストリップ 20の第二の捕捉部位 41cにおいては、試 験に供したインフルエンザウイルス A型のうち、 H5N1亜型の全種及び H5N2亜型強 毒株である A/Chicken/Ibaraki /1/05 (H5N2)については着色が確認されず、 H7N1 亜型強毒株である A/Chicken/Italy/99 (H7N1)につ!/、ては希釈倍率 1000倍以上で 着色が確認されな力つた力 試験に供した他のウィルス株については、 1000倍以下 の希釈培率において、顕著な呈色が確認された。従って、実施例 4記載のィムノクロ マトグラフィー測定装置は、 A型インフルエンザウイルス強毒株の検出に有効であり、 好ましくは H5N1亜型及び H5N2亜型強毒株の検出に有効であり、特に好ましくは、 H5N1亜型の検出に有効であることが示された。
産業上の利用可能性
[0089] 本発明は、全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及
び、 A型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全て の A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体を用い、第一の抗 体との反応が陽性で且つ第二の抗体との反応が陰性である抗原を免疫測定法によ つて検出することからなる A型インフルエンザウイルス強毒株の検出法、特に、サンド イッチ式免疫測定法、ィムノクロマトグラフィー測定法および測定装置を提供するもの であり、インフルエンザウイルス強毒株に属するウィルスを特異的に簡単な方法で迅 速に検出できるので、当該ウィルスに起因するヒト、鳥等の疾病を迅速かつ簡便に診 断するために有用である。
図面の簡単な説明
[0090] [図 l]aは 1本のィムノクロマト法テストストリップから構成された本発明のィムノクロマト グラフィー測定装置の具体例を示す平面図、 bは aで示された装置の縦断面図。
[図 2]2本のィムノクロマト法テストストリップ力も構成された本発明のィムノクロマトダラ フィー測定装置の具体例を示す平面図。
[図 3]2本のィムノクロマト法テストストリップ力も構成された本発明のィムノクロマトダラ フィー測定装置の他の具体例を示す平面図。
[図 4]aは 2本のィムノクロマト法テストストリップ力 構成された本発明のィムノクロマト グラフィー測定装置の更に別の具体例を示す平面図、 bは aで示された装置の縦断 面図。
符号の説明
[0091] 1 粘着シート
2 含浸部材
3 膜担体
4 捕捉部位
5 吸収用部材
6 試料添加用部材
10 ィムノクロマト法テストストリップ
20 ィムノクロマト法テストストリップ
Claims
[1] 全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、 A型ィ ンフルェンザウィルス強毒株に対して反応しな ヽが、該強毒株以外の全ての A型イン フルェンザウィルス亜型に対して反応する第二の抗体を用い、第一の抗体との反応 が陽性で且つ第二の抗体との反応が陰性である抗原を免疫測定法によって検出す ることからなる A型インフルエンザウイルス強毒株の検出法。
[2] 前記免疫測定法が、前記第一の抗体とこの第一の抗体が反応する抗原に対して反 応する第三の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法、及び Z又は、前記第二の 抗体と該第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体とを用いたサンド イッチ式免疫測定法力 なることを特徴とする請求項 1に記載の検出法。
[3] 前記第一の抗体および第二または第四の抗体を担体に固定しておく請求項 2に記 載の検出法。
[4] 前記第三の抗体が全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体で あり、前記第四の抗体が A型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しな 、が、 該強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であ る請求項 3に記載の検出法。
[5] 前記第三及び第四の抗体が全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応す る互いに同一または異なる抗体である請求項 3に記載の検出法。
[6] 前記第一、第二、第三及び第四の抗体力インフルエンザウイルスの核タンパクに対 するモノクローナル抗体である請求項 1乃至 5の何れか 1項に記載の検出法。
[7] A型インフルエンザウイルス強毒株は、 H5N1亜型、並びに、 H5N2亜型及び H7N 1型の強毒株力 なる群より選ばれた少なくとも 1種である請求項 6に記載の検出法。
[8] A型インフルエンザウイルス強毒株は、 H5N1亜型である請求項 7に記載の検出法。
[9] 全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、 A型ィ ンフルェンザウィルス強毒株に対して反応しな ヽが、該強毒株以外の全ての A型イン フルェンザウィルス亜型に対して反応する第二の抗体をそれぞれ予め所定位置に固 定せしめて形成された第一及び第二の捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記第 一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と被験試料との第一の混合
液、及び、前記第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体と前記被 験試料との第二の混合液を、それぞれ第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担 体にてクロマト展開せしめる力、または、第一の混合液を前記捕捉部位の双方に向 けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記第一の捕捉部位における第一の抗体 との反応が陽性で且つ第二の捕捉部位における第二の抗体との反応が陰性である ことをもって A型インフルエンザウイルス強毒株を検出できるようにしたことを特徴とす るィムノクロマトグラフィー測定法。
[10] 前記第三の抗体が全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体で あり、前記第四の抗体が A型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しな 、が、 該強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であ る請求項 9に記載の測定法。
[11] 前記第三及び第四の抗体が全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応す る互いに同一または異なる抗体である請求項 9に記載の測定法。
[12] 前記第一、第二、第三及び第四の抗体力インフルエンザウイルスの核タンパクに対 するモノクローナル抗体である請求項 9乃至 11の何れか 1項に記載の測定法。
[13] A型インフルエンザウイルス強毒株は、 H5N1亜型、並びに、 H5N2亜型及び H7N 1型の強毒株力もなる群より選ばれた少なくとも 1種である請求項 12に記載の測定法
[14] A型インフルエンザウイルス強毒株は、 H5N1亜型である請求項 13に記載の測定法
[15] 前記第三及び第四の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されて!、る請求項 9 に記載の測定法。
[16] 前記膜担体が-トロセルロース膜である請求項 15に記載の測定法。
[17] 全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、 A型インフ ルェンザウィルス強毒株に対して反応しな ヽが、該強毒株以外の全ての A型インフ ルェンザウィルス亜型に対して反応する第二の抗体と、前記第一の抗体が反応する 抗原に対して反応する第三の抗体と、前記第二の抗体が反応する抗原に対して反 応する第四の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一及び第二の抗体はそれ
ぞれ予め膜担体の所定位置に固定されて第一及び第二の捕捉部位を形成し、前記 第三及び第四の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第三及び第四の抗 体は前記捕捉部位の双方力 離隔した位置力 それぞれ第一及び第二の捕捉部位 に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなる A型インフルェン ザウィルス強毒株検出用ィムノクロマトグラフィー測定装置。
[18] 前記第三の抗体が全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体で あり、前記第四の抗体が A型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しな 、が、 該強毒株以外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であ る請求項 17に記載の測定装置。
[19] 前記第三及び第四の抗体が全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応す る互いに同一または異なる抗体である請求項 17に記載の測定装置。
[20] 前記第一、第二、第三及び第四の抗体力インフルエンザウイルスの核タンパクに対 するモノクローナル抗体である請求項 17乃至 19の何れか 1項に記載の測定装置。
[21] A型インフルエンザウイルス強毒株は、 H5N1亜型、並びに、 H5N2亜型及び H7N
1型の強毒株力 なる群より選ばれた少なくとも 1種である請求項 20に記載の測定装 置。
[22] A型インフルエンザウイルス強毒株は、 H5N1亜型である請求項 21に記載の測定装 置。
[23] 前記膜担体は、第一の捕捉部位と第二の捕捉部位とを互いに離隔させて備えてなる 単一の膜担体力もなる請求項 17に記載の測定装置。
[24] 前記膜担体は、第一の抗体が固定された第一の膜担体と、第二の抗体が固定され た第二の膜担体とからなる請求項 17に記載の測定装置。
[25] 前記第三の抗体は前記第一の膜担体上に用意されており、前記第四の抗体は前記 第二の膜担体上に用意されている請求項 24に記載の測定装置。
[26] 前記第三及び第四の抗体は、それぞれ、前記第一及び第二の膜担体上に配置され た含浸部材に含浸されて用意されている請求項 25に記載の測定装置。
[27] 前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の 含浸部材を互いに所定の間隔をお 、て離隔させて相互に並行して配置されて 、る
請求項 26に記載の測定装置。
[28] 前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の 含浸部材を互 、に所定の間隔をお 、て離隔させて放射方向に又は反対方向に配置 されている請求項 26に記載の測定装置。
[29] 前記第三及び第四の抗体が全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応す る互いに同一または異なる抗体であり、第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担 体にてクロマト展開可能なように用意されている請求項 24に記載の測定装置。
[30] 前記第三及び第四の抗体は膜担体上に用意されている請求項 29に記載の測定装 置。
[31] 前記第三及び第四の抗体は膜担体上に配置された含浸部材に含浸されて用意され ている請求項 30に記載の測定装置。
[32] 前記第三及び第四の抗体は同一の抗体であり、前記含浸部材は第一の膜担体と第 二の膜担体の双方に連接して 、る請求項 31に記載の測定装置。
[33] 前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の 含浸部材を互いに所定の間隔をお 、て離隔させて相互に並行して配置されて 、る 請求項 32に記載の測定装置。
[34] 前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の 含浸部材を互 、に所定の間隔をお 、て離隔させて放射方向に又は反対方向に配置 されている請求項 32に記載の測定装置。
[35] 前記第三及び第四の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項 1
7に記載の測定装置。
[36] 前記膜担体はニトロセルロース膜である請求項 35に記載の測定装置。
[37] 前記膜担体はケース内に収容されてなる請求項 17に記載の測定装置。
[38] 前記第三の抗体及び Z又は第四の抗体はケース外又はケース内に収容されて 、る 請求項 37に記載の測定装置。
[39] 全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、 A型インフ ルェンザウィルス強毒株に対して反応しな ヽが、該強毒株以外の全ての A型インフ ルェンザウィルス亜型に対して反応する第二の抗体と、前記第一の抗体が反応する
抗原に対して反応する第三の抗体とを用い、前記第一の抗体を予め所定位置に固 定せしめて形成された第一の捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記第二の抗体と 被験試料とを含む第一の混合液、及び、前記第三の抗体と前記被験試料とを含む 第二の混合液を、それぞれ第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せ しめ、前記第一の捕捉部位における前記第三の抗体の反応が陽性で且つ前記第一 の捕捉部位における前記第二の抗体の反応が陰性であることをもって A型インフル ェンザウィルス強毒株を検出できるようにしたことを特徴とするィムノクロマトグラフィー 測定法。
[40] 前記第三の抗体が全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体で ある請求項 39に記載の測定法。
[41] 前記第一、第二及び第三の抗体力 Sインフルエンザウイルスの核タンパクに対するモノ クローナル抗体である請求項 39または 40に記載の測定法。
[42] A型インフルエンザウイルス強毒株は、 H5N1亜型、並びに、 H5N2亜型及び H7N
1型の強毒株力 なる群より選ばれた少なくとも 1種である請求項 41に記載の測定法
[43] A型インフルエンザウイルス強毒株は、 H5N1亜型である請求項 42に記載の測定法
[44] 前記第二及び第三の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されて!、る請求項 3 9に記載の測定法。
[45] 前記膜担体が-トロセルロース膜である請求項 44に記載の測定法。
[46] 全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、 A型インフ ルェンザウィルス強毒株に対して反応しな ヽが、該強毒株以外の全ての A型インフ ルェンザウィルス亜型に対して反応する第二の抗体と、前記第一の抗体が反応する 抗原に対して反応する第三の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は 予め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉部位を形成し、前記第二及び第三 の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第二及び第三の抗体は前記捕捉 部位力 離隔した位置力 それぞれ第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロ マト展開可能なように用意されてなる A型インフルエンザウイルス強毒株検出用ィムノ
クロマトグラフィー測定装置。
[47] 前記第三の抗体が全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体で ある請求項 46に記載の測定装置。
[48] 前記第一、第二及び第三の抗体力 Sインフルエンザウイルスの核タンパクに対するモノ クローナル抗体である請求項 46または 47に記載の測定装置。
[49] A型インフルエンザウイルス強毒株は、 H5N1亜型、並びに、 H5N2亜型及び H7N
1型の強毒株力 なる群より選ばれた少なくとも 1種である請求項 48に記載の測定装 置。
[50] A型インフルエンザウイルス強毒株は、 H5N1亜型である請求項 49に記載の測定装 置。
[51] 前記膜担体は、第一の抗体が固定された第一の膜担体と、第一の抗体が固定され た第二の膜担体とからなる請求項 46に記載の測定装置。
[52] 前記第二の抗体は前記第一の膜担体上に用意されており、前記第三の抗体は前記 第二の膜担体上に用意されている請求項 51に記載の測定装置。
[53] 前記第二及び第三の抗体は、それぞれ、前記第一及び第二の膜担体上に配置され た含浸部材に含浸されて用意されている請求項 52に記載の測定装置。
[54] 前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の 含浸部材を互いに所定の間隔をお 、て離隔させて相互に並行して配置されて 、る 請求項 53に記載の測定装置。
[55] 前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の 含浸部材を互 、に所定の間隔をお 、て離隔させて放射方向に又は反対方向に配置 されている請求項 53に記載の測定装置。
[56] 前記第二及び第三の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されて!、る請求項 4
6に記載の測定装置。
[57] 前記膜担体はニトロセルロース膜である請求項 56に記載の測定装置。
[58] 前記膜担体はケース内に収容されてなる請求項 46に記載の測定装置。
[59] 前記第二の抗体及び Z又は第三の抗体はケース外又はケース内に収容されている 請求項 58に記載の測定装置。
[60] 全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、 A型インフ ルェンザウィルス強毒株に対して反応しな ヽが、該強毒株以外の全ての A型インフ ルェンザウィルス亜型に対して反応する第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、 前記第二の抗体は予め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉部位を形成し、 前記第一の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第一の捕捉部位から離 隔した位置力 該第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なよう に用意されてなる A型インフルエンザウイルス強毒株検出用ィムノクロマトグラフィー 測定装置。
[61] 全ての A型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、 A型インフ ルェンザウィルス強毒株に対して反応しな ヽが、該強毒株以外の全ての A型インフ ルェンザウィルス亜型に対して反応する第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、 前記第一の抗体は予め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉部位を形成し、 前記第二の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第一の捕捉部位から離 隔した位置力 該第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なよう に用意されてなる A型インフルエンザウイルス強毒株検出用ィムノクロマトグラフィー 測定装置。
[62] A型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全ての A 型インフルエンザウイルス亜型に対して反応するモノクローナル抗体。
[63] A型インフルエンザウイルス強毒株の核タンパクに対して反応しないが、該強毒株以 外の全ての A型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応するものであ る請求項 62に記載のモノクローナル抗体。
[64] A型インフルエンザウイルス強毒株は、 H5N1亜型、並びに、 H5N2亜型及び H7N
1型の強毒株力もなる群より選ばれた少なくとも 1種である請求項 63に記載のモノクロ ーナノレ抗体。
[65] A型インフルエンザウイルス強毒株は、 H5N1亜型である請求項 64に記載のモノクロ ーナノレ抗体。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010261912A (ja) * | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Bl:Kk | ヒトインフルエンザウイルスｈ３亜型の免疫学的検出法 |
| EP2309264A1 (en) * | 2008-06-06 | 2011-04-13 | National University Corporation University Of Toyama | Device for detection of influenza virus |
| JP2012112879A (ja) * | 2010-11-26 | 2012-06-14 | National Center For Global Health & Medicine | 免疫検査試薬、それを用いる検査装置及び検査方法 |
| CN105403700A (zh) * | 2012-04-05 | 2016-03-16 | 株式会社比尔生命 | 结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒 |
| JP6469937B1 (ja) * | 2018-03-30 | 2019-02-13 | 株式会社バイオメディカル研究所 | 検査キットおよび検査方法 |
| WO2019187271A1 (ja) * | 2018-03-30 | 2019-10-03 | 株式会社バイオメディカル研究所 | 検査キットおよび検査方法 |
| JP2020147503A (ja) * | 2019-03-11 | 2020-09-17 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7226429B2 (en) | 2003-01-17 | 2007-06-05 | Aethlon Medical, Inc. | Method for removal of viruses from blood by lectin affinity hemodialysis |
| CN103917638A (zh) * | 2011-09-08 | 2014-07-09 | Nexusdx股份有限公司 | 多级分析物检定 |
| CN103483448B (zh) * | 2012-06-08 | 2017-09-08 | 厦门大学 | 特异结合高致病性禽流感病毒的抗体 |
| KR101587645B1 (ko) * | 2014-07-08 | 2016-01-22 | 주식회사 녹십자엠에스 | 멀티 인플루엔자 검출용 키트 및 이를 이용하여 인플루엔자를 검출하는 방법 |
| CN108802402A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-11-13 | 重庆大学 | 一种快速鉴别呼吸道感染类型的试剂盒及其应用 |
| CN113049818A (zh) * | 2021-01-11 | 2021-06-29 | 广东菲鹏生物有限公司 | 一种鉴别突变型抗原的方法及试剂 |
| CN113777299B (zh) * | 2021-09-15 | 2023-07-21 | 杭州宝临生物科技有限公司 | 免疫层析检测试剂条包含其的试剂盒及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11108932A (ja) | 1997-08-04 | 1999-04-23 | Tonen Corp | ウイルスの検出又は測定方法 |
| JP2000253876A (ja) * | 1999-03-08 | 2000-09-19 | Dnavec Research Inc | センダイウイルスベクターを用いたワクチンおよびワクチンタンパク質 |
| JP2004509648A (ja) | 2000-10-05 | 2004-04-02 | ホンコン ディーエヌエー チップス リミティド | 非病原性又は病原性インフルエンザａサブタイプｈ５ウイルス検出キット |
| WO2005007697A1 (ja) | 2003-07-23 | 2005-01-27 | Fujirebio Inc. | 抗インフルエンザａ型ウイルスモノクローナル抗体及び該抗体を用いる免疫測定器具 |
| JP2006067979A (ja) * | 2004-09-06 | 2006-03-16 | Bl:Kk | インフルエンザａ型ウイルスの免疫検出法 |
| JP2006265197A (ja) * | 2005-03-25 | 2006-10-05 | Daikin Ind Ltd | 抗原性人工ポリペプチド |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1081496A1 (en) * | 1999-08-31 | 2001-03-07 | Becton, Dickinson and Company | Flow-through assay for visually detecting the presence of influenza A and B |
| US20040265800A1 (en) * | 2003-06-30 | 2004-12-30 | Sysmex Corporation | Sample pretreatment solution for immunological test and method for using the same |
-
2006
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11108932A (ja) | 1997-08-04 | 1999-04-23 | Tonen Corp | ウイルスの検出又は測定方法 |
| JP2001215228A (ja) | 1997-08-04 | 2001-08-10 | Sentan Seimei Kagaku Kenkyusho:Kk | ウイルスの検出又は測定方法 |
| JP2000253876A (ja) * | 1999-03-08 | 2000-09-19 | Dnavec Research Inc | センダイウイルスベクターを用いたワクチンおよびワクチンタンパク質 |
| JP2004509648A (ja) | 2000-10-05 | 2004-04-02 | ホンコン ディーエヌエー チップス リミティド | 非病原性又は病原性インフルエンザａサブタイプｈ５ウイルス検出キット |
| WO2005007697A1 (ja) | 2003-07-23 | 2005-01-27 | Fujirebio Inc. | 抗インフルエンザａ型ウイルスモノクローナル抗体及び該抗体を用いる免疫測定器具 |
| JP2006067979A (ja) * | 2004-09-06 | 2006-03-16 | Bl:Kk | インフルエンザａ型ウイルスの免疫検出法 |
| JP2006265197A (ja) * | 2005-03-25 | 2006-10-05 | Daikin Ind Ltd | 抗原性人工ポリペプチド |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| HINSHAW V.S. ET AL.: "Specific antibody responses and generation of antigenic variants in chickens immunized against a virulent avian influenza virus", AVIAN DIS., vol. 34, no. 1, 1990, pages 80 - 6 |
| KAVERIN N.V. ET AL.: "Structure of antigenic sites on the haemagglutinin molecule of H5 avian influenza virus and phenotypic variation escape mutants", J. GEN. VIROL., vol. 83, 2002 |
| PHILPOTT: "Neutralizing epitopes of the H5 hemagglutinin from a virulent avian influenza viruses and their relationship to pathogenicity", J. VIROL., vol. 63, no. 8, August 1989 (1989-08-01), pages 3453 - 3458, XP003002755 * |
| See also references of EP1970707A4 |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2309264A1 (en) * | 2008-06-06 | 2011-04-13 | National University Corporation University Of Toyama | Device for detection of influenza virus |
| JPWO2009148150A1 (ja) * | 2008-06-06 | 2011-11-04 | 国立大学法人富山大学 | インフルエンザウィルス検出用デバイス |
| EP2309264A4 (en) * | 2008-06-06 | 2011-11-23 | Univ Toyama Nat Univ Corp | FLU VIRUS DETECTION DEVICE |
| JP2010261912A (ja) * | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Bl:Kk | ヒトインフルエンザウイルスｈ３亜型の免疫学的検出法 |
| JP2012112879A (ja) * | 2010-11-26 | 2012-06-14 | National Center For Global Health & Medicine | 免疫検査試薬、それを用いる検査装置及び検査方法 |
| CN105403700A (zh) * | 2012-04-05 | 2016-03-16 | 株式会社比尔生命 | 结核菌群的免疫学检测方法和试剂盒 |
| JP6469937B1 (ja) * | 2018-03-30 | 2019-02-13 | 株式会社バイオメディカル研究所 | 検査キットおよび検査方法 |
| WO2019187271A1 (ja) * | 2018-03-30 | 2019-10-03 | 株式会社バイオメディカル研究所 | 検査キットおよび検査方法 |
| JP2020147503A (ja) * | 2019-03-11 | 2020-09-17 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法 |
| JP7308477B2 (ja) | 2019-03-11 | 2023-07-14 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法 |
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