JPH11108932A - ウイルスの検出又は測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ウイルスを簡便で高感度に検出または測定す
る方法の提供。 【解決手段】 ウイルスを含む検体を、（１）陰イオン
性界面活性剤、及び（２）両イオン性界面活性剤、非イ
オン性界面活性剤又は蛋白質変性剤のいずれかを含む処
理液で処理することを特徴とするウイルス含有検体の処
理方法；並びにこの方法の実施のためのモノクローナル
抗体及びそれを生産するハイブリドーマ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はウイルスの検出又は
測定方法及びそのための試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、種々のウイルス検出法は、血液や
血液製剤中の感染性ウイルスの存在のスクリーニング
や、疾患患者中のウイルスの有無の判定などに用いられ
ている。しかしながら、それらの方法は、各種ウイルス
によっても若干異なるが、必ずしも高感度、高特異性を
有している場合だけではなく、たとえそうであっても、
高コストであったり、ウイルス分離培養のように長時間
を必要としたりするものが多い。以下、主にＣ型肝炎に
関して述べ、本発明の背景技術とする。

【０００３】Ｃ型肝炎は、長い間その原因因子が明らか
ではなかったが、その遺伝子がクローニングされ（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４４：３５９−３６２，１９８９）、そ
の遺伝子を基に作られたリコンビナント抗原を用いた抗
体測定による診断法が開発されたことにより（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４４：３６２−３６４，１９８９）；特表平
２−５００８８０号公報）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイル
ス、ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣ Ｖｉｒｕｓ）を原因因子と
する、血液及び血液関連製剤を主たる感染経路とする感
染症であることが明らかとなった。組換えコア抗原、組
換えＮＳ３抗原を加えたいわゆる第２世代抗体検査法の
開発により、ＨＣＶ感染者のほとんどを血清検査により
判別する事が可能となった。このことにより国内献血に
よる感染をほとんど絶つことが可能となった。

【０００４】しかしＨＩＶ（ヒト免疫不全症ウイルス）
などの一般的なウイルス感染症同様に、感染初期の抗体
が生じて来るまでの期間、いわゆるウィンドピリオドと
呼ばれる判別不能期間が存在し、売血が認められている
地域などや国内の一部でも抗体検査では判別できなかっ
た血液由来の成分により、依然として二次感染が起こる
リスクが存在している。また抗体検査は、その原理から
感染後治癒した既住者か、活動性の感染者か否かを判別
することが出来ないことが問題である。

【０００５】また現在Ｃ型肝炎の治療にはインターフェ
ロン（ＩＦＮ）が用いられているが、ＩＦＮによりＨＣ
Ｖが駆除されて６ヶ月後にはＨＣＶ抗体価が低下するこ
とからＨＣＶ抗体価を測定することのみにて治療効果を
判別することが可能であるとする研究者もいる。しかし
抗体価の動きは抗原刺激低下後、すなわち抗原駆除後数
カ月間以降でないと低下しないことから、抗体検査を行
なうのみではＩＦＮ投与によりＨＣＶが駆除されたか否
かを適時に的確に判別することが出来ない。すなわち治
療のモニタリングを行なうためには、ＨＣＶに対する抗
体ではなく、ＨＣＶそのものを検出する方法が必要であ
る。

【０００６】ＨＣＶは他のウイルスたとえばＨＢＶ（Ｂ
型肝炎ウイルス）などに比して血中ウイルス量が低い
事、および生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、または動物
などを宿主としてウイルスを増殖させることが出来ない
ため、ウイルス粒子（ウイルス抗原）を直接検出する方
法を確立することが困難であった。そのためウイルス抗
原を検出する代わりにＰＣＲ（ポリメレースチェーンリ
アクション）法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−
１３５４，１９８５）や分岐鎖ＤＮＡプローブ法によ
り、ウイルスゲノムＲＮＡを検出する方法が開発され
た。しかしウイルスゲノムを検出する方法は、ウイルス
抗原を検出する方法と比較していくつかの問題点があ
る。

【０００７】まず検出する物質がＲＮＡであるため保存
安定性が低いため、血清の凍結融解操作により定量値が
低下するなどの問題が指摘されている。そのため従来の
血清検査法よりも検体の保存に留意する必要が生じる。
また検体の輸送の際にも細心の注意をはらう必要が有
る。

【０００８】例えばＰＣＲ法を用いた検査法は、遺伝子
断片を検出するには最も高感度な検出方法であるが、検
体中からＨＣＶゲノムＲＮＡを抽出する際、またゲノム
ＲＮＡから鋳型ＤＮＡへの逆転写の際にロスを生じやす
く安定した定量値を得るためには熟練を要すること、ま
た増幅を行うことが重要な原理であるために、コンタミ
ネーションを起こした際、高頻度に偽陽性を生ずるなど
の問題があり、一度に大量の検体を処理することができ
ない。また簡便とされる方法を用いても前処理時間が２
時間以上も必要であり、多数回の遠心操作を含むなど煩
雑である。加えて、このように操作が繁雑であるため
に、コンタミネーションの機会が増え、偽陽性検体の生
じる可能性を増加させている。一方分岐鎖ＤＮＡプロー
ブ法は検出感度が低く、結果が得られるまで約２０時間
を要し（医学と薬学 ３１：９６１−９７０，１９９
４）、感度、操作時間という点で課題が残されている。

【０００９】上記のウイルスゲノムを検出する方法の問
題点を解決するために、ウイルス抗原を直接検出する方
法も開発された。特開平８−２９４２７に示されている
ように、ＨＣＶのコア抗原に対して特異性を有するモノ
クローナル抗体を用いて、血清中のコア抗原を検出する
方法が開発された。本報は田中等（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ
Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２３：７４２−７４５，１９
９５）および藤野等（医学と薬学 ３６：１０６５−１
０７０，１９９６）に報告されているように血清中に存
在するコア抗原を検出することにより、上記のウイルス
ゲノムを検出する方法同様に臨床的有用性を持つことが
示されている。しかしながらウイルスゲノム検出法と同
様にいくつかの点で大きな問題が残されている。

【００１０】一点はＰＣＲ法と比較して感度が低いた
め、血清スクリーニングの最終検査に用いることが出来
ないことである。田中等（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐ
ａｔｏｌｏｇｙ ２３：７４２−７４５，１９９５）
は，ＨＣＶ ＲＮＡ量として、１０⁴ 〜１０⁵ コピー／
ml間が検出限界であることを示しており、藤野等（医学
と薬学 ３６：１０６５−１０７０，１９９６）は、最
も感度が高い検出方法であるＣＲＴ（コニペティテブリ
バーストランスクリプション）−ＰＣＲ法でＲＮＡ陽性
に分類されるＣ型慢性肝炎患者１０２例の治療前血清に
おいて、６７％の陽性率であることを報告している。す
なわち、感度の高いＣＲＴ−ＰＣＲ法と比較した場合に
感度の面で大きく劣っている。

【００１１】さらに測定のための検体処理の工程が繁雑
であり、かつ時間がかかることがスクリーニングなどの
用途に用いようとした際に問題となる。すなわち検体
（血清）の処理のために、ウイルス粒子の濃縮と血清成
分の除去のためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処
理（４℃１時間）、遠心操作（１５分間）、上清の除
去、尿素処理、アルカリ処理（３７℃３０分間）、中和
剤添加といった多段階処理工程を必要とする。また強固
に形成され、ＰＥＧにより粘性を増した沈殿の尿素処理
による分散工程は、非常に熟練を要する作業である。そ
のため、再現性を得るためには熟練度が必要であり、ま
た最低約２時間の処理時間が必要である。さらに遠心操
作、上清除去等の工程があるために、自動化が困難で、
かつ同時大量処理を困難にしており操作面においてもス
クリーニングなどの大量処理を必要とする用途に適して
いない。

【００１２】一方ウイルス抗原検出系は、以下の点で高
感度ＰＣＲ法と比較して優れている点がある。すなわち
検出過程で過度の増幅処理操作が加わらないため、コン
タミネーションに対し、非常に寛容である。またＲＮＡ
のように不安定な物質を検出するのではなく、比較的安
定な物質である抗原蛋白質を検出することから、検体の
保存に過度の注意をはらう必要がなく、ＰＣＲ検体に求
められる超低温槽のような特別な機器を用いる必要もな
く、また検体の輸送も容易になる。

【００１３】これらの特長は、例えば血液事業や健康診
断の様に、多数の検体を測定する用途に適した要件であ
る。しかしながら、既に指摘したように、開示されてい
るコア抗原検出法は、前処理が煩雑で自動化に適してい
ない、感度が低く例えば血液事業などの感度が求められ
る様な用途におけるゴールデンスタンダードになり得な
いなどの理由により、多数の検体を扱ういわゆるスクリ
ーニング用途に用いることが出来ず、ＰＣＲ法に対して
優れている点を活かすことが出来ていない。また、臨床
的に有用性が高い測定方法は、常に感度、特異性、再現
性、操作性、低コストを課題とし、これらを全て満たす
ように鋭意開発していく必要性がある。ＨＣＶ以外のウ
イルス抗原の検出に関しても、特に多数の検体を測定す
るスクリーニング用途においては、ＰＣＲ法と比較して
低感度であり、有用な前処理法やその抗原の露出がされ
ないといった理由のために実用化されていないものが多
い。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、血液
事業や健康診断のような、いわゆるスクリーニング用途
の如き多数の検体を処理するのに適したウイルス抗原検
出法を提供することである。すなわちＰＣＲ法と比較し
同等の感度、特異度を持ち、前処理を簡便化すること、
あるいは前処理操作をせずに容易に自動化などの大量処
理システムに適用可能なウイルス抗原検出系を提供する
ことである。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明の第一の態様によ
れば、ウイルス粒子を破壊して、ウイルス抗原を十分に
露出し、ウイルス抗原に対する抗体が存在する場合には
該抗体を破壊して、ウイルス抗原を検出又は測定するこ
とによりウイルスを検出又は測定する手段を提供する。
従って、本発明は、（１）ウイルスを含む検体を、
（１）陰イオン性界面活性剤及び、（２）両イオン性界
面活性剤、非イオン性界面活性剤又は蛋白質変性剤のい
ずれかを含む処理液で処理することを特徴とするウイル
ス含有検体の処理方法を提供する。

【００１６】本発明はまた、（２）ウイルスを含む検体
を、（１）陰イオン性界面活性剤、（２）両イオン性界
面活性剤、及び（３）非イオン性界面活性剤又は蛋白質
変性剤のいずれかを含んだ処理液で処理することを特徴
とするウイルス含有検体の処理方法を提供する。本発明
はまた、（３）ウイルスを含む検体を、（１）陰イオン
性界面活性剤、（２）両イオン性界面活性剤、（３）非
イオン性界面活性剤、及び（４）蛋白質変性剤を含んだ
処理液で処理することを特徴とするウイルス含有検体の
処理方法を提供する。

【００１７】本発明はさらに（４）前記（１）〜（３）
のいずれかに記載の検体処理方法を用いて、ウイルス抗
原を特異的に認識するプローブを反応させることによ
り、ウイルス抗原の存在を検出又は定量することを特徴
とするウイルスの測定方法を提供する。本発明はさら
に、前記（４）の免疫測定方法に用いるための、陰イオ
ン性界面活性剤を含んで成る、検体中のウイルスの有無
を判別するキット、定量するキット又は診断薬を提供す
る。本発明はさらに、前記（４）の免疫測定方法に用い
るための、後記のモノクローナル抗体を含んでなる、検
体中のウイルスの有無を判別するキット、定量するキッ
ト又は診断薬を提供する。

【００１８】本発明の第二の態様によれば、ウイルスに
対する抗体がまだ生成していないウインドピリオドにお
けるウイルス抗原の検出又は測定方法を提供する。この
方法においては、ウイルス粒子を破壊してウイルス抗原
を露出せしめるだけで十分であり、ウイルス抗原に対す
る血中の抗体を破壊する必要がない。従って本発明はさ
らに、ウイルスの測定方法において、炭素原子数１０個
以上のアルキル基と第２〜第４級アミンとを有する界面
活性剤もしくは非イオン界面活性剤、又はこの両者の存
在下で、ウイルス抗原をそのプローブとの結合により測
定することを特徴とする方法を提供する。

【００１９】本発明はさらに、上記のウイルス抗原の中
で、ＨＣＶコア抗原の検出のためのプローブとして適す
るモノクローナル抗体を生産するＨＣ１１−１４（ＦＥ
ＲＭＢＰ−６００６），ＨＣ１１−１０（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６００４），ＨＣ１１−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６０
０２）、及びＨＣ１１−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００
３）から成る群から選択されるハイブリドーマ細胞株を
提供する。本発明はまた、ＨＣ１１−１４（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６００６），ＨＣ１１−１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−
６００４），ＨＣ１１−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００
２），ＨＣ１１−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００３）から
成る群から選択されるハイブリドーマによって産生され
るモノクローナル抗体を提供する。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明の対象となるウイルスは、
ゲノムＲＮＡ又はＤＮＡを包む構造蛋白質と、それを取
り囲む膜蛋白質又は脂質膜から構成される構造を有する
ウイルス粒子を形成するウイルスである。ゲノムとして
ＲＮＡを有する上記ウイルスの代表的例としてはＣ型肝
炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びＨＣＶ類縁ウイルスが挙げ
られる。

【００２１】ＨＣＶ類縁ウイルスとしては、Ｃ型肝炎ウ
イルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイル
ス、Ｇ型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイ
ルス（黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイ
ルス、デングウイルス）、トガウイルス（アルファウイ
ルス、ルビウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイル
ス）、ペスチウイルス（ブタコレラウイルス、ウシ下痢
ウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザ
ウイルス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、
ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペス
トウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウ
イルス、ムンプスウイルス）、オルソクソウイルス（ヒ
トインフルエンザウイルス、

【００２２】トリインフルエンザウイルス、ウマインフ
ルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス）、ラ
ブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイル
ス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキ
ーウイルス、エコーウイルス、ウシエンテロウイルス、
ブタエンテロウイルス、サルエンテロウイルス、マウス
脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ウシライノウ
イルス、ウマライノウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型肝
炎ウイルス）、コロナウイルス（ヒトコロナウイルス、
ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マウス肝炎ウイル
ス、豚伝染性胃腸炎ウイルス）、アレナウイルス（リン
パ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス、韓国型出血
熱ウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒト成人白
血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ白血病肉
腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイル
ス）、レオウイルス（ロタウイルス）、カリシウイルス
（ノーウオークウイルス）、ブンヤウイルス（腎症候性
出血熱ウイルス）、フィロウイルス（エボラウイルス、
マールブルグウイルス）などがあげられる。

【００２３】また、ゲノムとしてＤＮＡを有する上記ウ
イルスの代表例としてはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、
及びＨＢＶ類縁ウイルスが挙げられる。ＨＢＶ類縁ウイ
ルスとしては、ポックスウイルス（ワクシニアウイル
ス、アラストリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウ
イルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイルス、豚パ
ルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、
ネコ白血球減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウ
イルス）、パポーバウイルス（パピローマウイルス、ポ
リオーマウイルス）、アデノウイルス、ヘルペスウイル
ス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水
痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、馬ヘルペスウイル
ス、ネコヘルペスウイルス、マレック病ウイルス）、ア
フリカ豚コレラウイルスなどがあげられる。

【００２４】また、これらの他にも各種病原性のあるウ
イルスが知られているし、また未確認のウイルスもまだ
存在しているが、それらのウイルス構造が前述のよう
に、ゲノムＲＮＡ又はＤＮＡを包む構造蛋白質と、それ
を取り囲む膜蛋白質や脂質膜から構成される構造をもつ
ウイルス粒子を形成するウイルスであれば、本発明も処
理方法により、免疫測定法に適した状態に遊離させるこ
とができることは明白である。

【００２５】以下に、ＨＣＶコア抗原を中心に実施形態
を述べる。ＨＣＶは血中濃度が１０² コピー／ml〜１０
⁶ コピー／mlと、ＨＢＶ（１０⁹コピー／ml）と比較し
低いことから、ウイルス抗原を検出するためには極めて
高い感度を必要とする。一般に抗体をプローブとする免
疫学的な手法に代表される検出方法に於て、検出感度を
増加させる方法としては、Ｉ）検出する抗原分子の分子
数を上昇させる、II）抗原に結合するプローブ、例えば
抗体の分子数を上昇させる、III)検出感度の下限を規定
するプローブ、例えば抗体と抗原以外の物質との結合な
どに起因する非特異反応を減少させる、IV）検出に用い
る標識物の検出感度を増加させる方法が考えられ、これ
らの方法を組み合わせることにより感度を上昇させるこ
とが可能となる。

【００２６】抗原分子数を増加させる方法としては、Ｉ
−１）検体の量を増加させる事が最も容易に考えられる
ことであるが、一般的に用いられている反応系（例えば
９６ｗｅｌｌイムノプレート）では最大添加可能な容量
は３００μｌ程度であり自ずと上限が規定されるので、
Ｉ−２）濃縮により反応系に加える分子数を増加させる
方法が用いられる。

【００２７】抗原に結合する検出のためのプローブ、例
えば抗体の分子数を上昇させるためには、II−１）複数
のプローブ、例えば抗体を用いることにより認識エピト
ープの数を増加させる、II−２）プローブ、例えば抗体
と抗原との親和性（アフィニティー及びアビディティ
ー）を上昇させることにより、単位時間あたりに結合す
る抗体の数を増加させる事が容易に考えつく手法であ
る。ここで抗原とプローブ、例えば抗体の親和性を向上
させる方法としては、反応系の緩衝液の組成を変化させ
る方法、プローブを改変する方法、これらの組み合わせ
が考えられる。II−３）ビーズや磁性粒子などの表面積
の広い担体に多量に抗体を結合させることによって、限
られた量の抗原との反応面積を広くすることにより、多
くの抗原を捕獲することも考えられる。

【００２８】また感染症の場合は検体中に抗原と結合す
る高い親和性を示すヒト抗体が存在することが予想さ
れ、これらの抗体のエピトープが検出に用いるプロー
ブ、例えば抗体のエピトープと重なることにより競合反
応が起こり検出に用いる抗体数の減少につながることが
予想されるため、この検体中の反応を阻害する抗体を除
く事により抗原に結合する検出のための抗体の分子数を
増加させる事につながる（II−３）。非特異反応を減少
させる方法を一般化することは困難であるが、III −
１）緩衝液組成を変化させることによりプローブ、例え
ば抗体の抗原との親和性（アフィニティー及びアビディ
ティー）を上昇させることにより非特異反応を軽減させ
る、III −２）非特異反応の原因物質を除去するなどの
方策が考えられる。

【００２９】標識物の検出感度を上昇させる方法として
は、IV−１）検出感度の高い標識物（放射性同位元素な
ど）を用いる、IV−２）酵素や触媒を標識物に用いるこ
とにより信号を増幅させる、IV−３）酵素基質をより感
度の高い基質に改変する、IV−４）酵素反応、化学反応
の基質のシグナルを化学的、または電気的、機械的に増
幅させる、IV−５）抗体当たりの標識物の数を増加させ
る、IV−６）シグナルの検出に用いる機器の感度を上昇
させるなどの方法が考えられる。

【００３０】開示されているＨＣＶコア抗原検出法の前
処理法の工程を解析すると、検体にポリエチレングリコ
ールを加えた後に遠心操作によりＨＣＶを沈殿として回
収することにより抗原を濃縮する（Ｉ−２）ことと同時
に血清成分の一部を除去する（II−２）工程を行った
後、尿素とアルカリ剤を含む溶液に再懸濁することによ
り検体中に存在するヒト抗体を不活化し（II−３）ＨＣ
Ｖからコア抗原を遊離させる工程、非イオン性界面活性
剤（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）と中和剤を含む溶液を加
えることによりモノクローナル抗体と反応させる溶液に
する工程から成り立っている。

【００３１】既に上記に指摘したように遠心操作、沈殿
の再懸濁操作が操作上煩雑な過程であり、熟練度を必要
とする過程である。従って本発明の達成目標は、これら
の操作上の問題点を解決したコア抗原検出系である。Ｈ
ＣＶそれ自体はいまだその姿が明らかとなっていない
が、そのゲノム構造、類縁のウイルス粒子の構造、一般
的なウイルスに関する情報から、ＨＣＶ粒子はゲノムＲ
ＮＡがコア抗原によりパッキングされ、それを取り囲む
ように脂質膜にアンカリングしているＥ１，Ｅ２／ＮＳ
１抗原からなる外被蛋白質によって囲まれた状態で存在
するものと推定される。

【００３２】そのためコア抗原を検出するためには外被
を取り除き、コア抗原の検出に用いるプローブ、例えば
抗体が結合できるようにする必要がある。またウイルス
粒子は血中ではＬＤＬ（低密度リポ蛋白質）などに囲ま
れた複合構造を取っていることが報告されており、さら
に外被蛋白質に対する抗体も存在することから、ウイル
ス粒子と抗外被蛋白質抗体との免疫複合体としても存在
することが予想される。すなわち検出する抗原の分子数
を増加させるためには、ウイルス粒子から効率よく外被
やウイルス粒子を取り囲む夾雑物を取り除き、かつコア
抗原分子を効率よく遊離させることことが重要である。
ＨＣＶ以外のウイルスに関してもほぼ同様のことが言
え、ウイルス抗原を効率よく遊離させることが必要とな
る。

【００３３】従って、本発明は、検体（血清）中のウイ
ルス抗原を、遠心分離のような煩雑な操作によって濃縮
することなく、プローブを用いた検出に適した状態にさ
せる処理方法に関する。さらに上記のように検体中には
検出に用いるプローブ、例えば抗体と結合を競合するヒ
ト抗体が高力価で存在するため、これを取り除く操作
が、感度上昇のために重要である。従って本発明の１つ
の態様においては、検体中のウイルス抗原を簡易に遊離
させる処理方法を用い、検体中に存在するヒト抗体をも
同時に不活化させる処理方法に関する。

【００３４】本発明によって示される処理方法を用いる
ことにより、検体中に存在するウイルス抗原は、プロー
ブ、例えば抗体との免疫複合体を形成するのに適した状
態でウイルス粒子または免疫複合体から遊離し、同時に
検出反応を阻害する検体中に存在するヒト抗体をも同時
に不活化させることにより、例えば抗体のようなプロー
ブを用いた免疫測定法によって容易にかつ感度高く検出
することが可能となる。

【００３５】検出に用いるプローブ、例えば抗体はウイ
ルスの抗原に特異的に結合するもので有り、一定の高い
親和性を示し、反応系に加えた際に非特異反応などを誘
発しないようなものであればかまわないが、実施例４に
示す様に、一次反応に用いるプローブの一つはＨＣＶコ
ア抗原のＣ端側を認識し結合できるものが含まれている
ことが好ましい。ここでＨＣＶコア抗原のＣ端側とは、
配列番号２に示す配列の８１番目から１６０番目の配
列、もしくはその一部をいう。さらにここにＨＣＶコア
抗原のＮ端側に対するプローブが含まれていても良い。
ここでＨＣＶコア抗原のＮ端側とは、配列番号２に示す
配列１０番目から７０番目の配列、もしくはその一部を
いう。

【００３６】ここでプローブとは、マウス、ウサギ、ニ
ワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウシなどの実験動物を免疫して
得られるポリクローナル抗体、免疫した個体から、脾臓
細胞を分離し、ミエローマ細胞と融合させることによっ
て得られるハイブリドーマの産生するモノクローナル抗
体、または脾臓細胞、血中白血球をＥＢウイルスによっ
て不死化させた細胞の産生するモノクローナル抗体、Ｈ
ＣＶに感染しているヒトもしくはチンパンジーなどが産
生している抗体；マウス、ヒトなどのイムノグロブリン
のｃＤＮＡもしくは染色体ＤＮＡから得られる可変領域
遺伝子断片、またはイムノグロブリンのｃＤＮＡもしく
は染色体ＤＮＡの一部と人工的に作製した配列とを組み
合わせることによって構成される可変領域遺伝子断片、
人工的な遺伝子配列を用いて構成される可変領域遺伝子
断片またはこれらを材料に遺伝子組換え手法によって作
製される可変領域遺伝子断片を、イムノグロブリン定常
領域遺伝子断片を組み合わせることによって構成される
組換え抗体遺伝子によって形質転換された細胞が産生す
る組換え抗体；

【００３７】上記の可変領域遺伝子断片と例えばバクテ
リオファージの構造蛋白質と融合させて作られるファー
ジ抗体、上記の可変聴域遺伝子断片を他の適用な遺伝子
断片例えばｍｙｃ遺伝子の一部などと組み合わせること
により構成される組換え抗体遺伝子によって形質転換さ
れた細胞が産生する組換え抗体、トリプシン分子に可変
領域を人工的に導入することによって産生されるプロー
ブ、レセプターなどの蛋白質に特異的に結合する分子を
人工的に改変することによって得られるプローブ、その
他コンビナトリアルケミストリー技術によって作製され
たプローブなど、コア抗原に高い特異性、親和性を示す
分子であればそれを用いることが出来る。

【００３８】さらに本発明はウイルス抗原を含む検体か
ら、上記のウイルスコア抗原とプローブ、例えば抗体と
の免疫複合体を形成するのに適した状態にするため、ウ
イルス粒子または免疫複合体から遊離し、同時に検出反
応を阻害する検体中に存在するヒト抗体をも同時に不活
化させる処理剤によって検体を処理する工程、遊離した
コア抗原を例えば抗体のようなプローブを用いた免疫測
定法によって検出並びに定量するアッセイ方法、並びに
検査キットを提供する。

【００３９】本発明によって示される検体処理剤と処理
方法 本発明における検体には、全血、血漿、血清、尿、唾
液、脳脊髄液などの生物学的体液、および肝組織などが
含まれる。本発明においては、検体を煩雑な操作なく、
プローブ例えばモノクローナル抗体と結合反応させるの
に適した状態に検体中のコア抗原を処理する方法が最も
重要な要件である。すなわち、抗原分子数を増加させる
ために、ウイルス粒子中などに含まれるコア抗原を効率
よく遊離させることが重要になる。

【００４０】既にＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ポ
リアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によ
っても知られているように、ほとんどの蛋白質はＳＤＳ
存在下の熱処理により変性し、共有結合によって結合し
ている分子以外はモノマーになる。すなわち、測定検体
にＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤を含む処理剤を添加
すると、ウイルスを破壊すると同時に検体中の抗コア抗
体をも変性させ、検体中のコア抗原を遊離させることが
可能である。このことは、実施例７に示す様に、ＳＤＳ
を含む処理剤で処理した検体中のＨＣＶコア抗原を、ゲ
ル濾過を用いた分子量解析にかけると、理論上から予想
される単量体の位置に検出されることからも確認され
た。

【００４１】また柏熊等（Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９０ ７９−８９，１９９
６）によって報告されているように、組換えＨＣＶ発現
細胞抽出液からなる検体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分
離し、ウェスタンブロット法によりＨＣＶコア抗原を検
出すると、単量体と思われる分子量の位置にその免疫活
性が検出される。ＳＤＳを含む変性剤を検体に加えるこ
とにより、抗原を効率よく遊離させ抗原分子数を増加さ
せることができることはこの分野に属するものであれば
容易に考え得る。

【００４２】しかしながらよく知られているようにＳＤ
Ｓ等の陰イオン性界面活性剤は蛋白質変性作用が大きい
ため、その存在下でそのままプローブ、例えば抗体との
免疫複合体形成反応に加えると、抗体をも変性させ、そ
の機能を失わせ感度低下を導く。また、ＳＤＳ等の陰イ
オン性界面活性剤処理によってエピトープ構造が失われ
ることが知られており、その結果として抗体の結合が弱
められ、感度が低下する。これらの感度低下につながる
影響を除くため、ＳＤＳ処理後何らかの方法で変性作用
を弱める必要が有る。

【００４３】陰イオン界面活性剤を含む界面活性剤は、
例えば透析、限外濾過、ゲル濾過法、電気泳動法、イオ
ン交換法、沈殿法、膜転写法などにより除くことが出来
ることが知られており、上記のようにウェスタンブロッ
ト法、ゲル濾過法により抗原が検出可能であることは、
ＳＤＳ処理後、なんらかの操作を加えることにより抗原
抗体反応を行なわせることが可能であることを示してい
る。しかしながら、これらの処理を行なうことは、何れ
も時間と煩雑な操作を必要とするため本発明の目的に適
した方法ではない。

【００４４】また過剰量の反応液によって希釈すること
により、変性作用を示さない濃度まで低下させることに
より反応に影響を与えない様に出来るが、この方法では
反応液が増加し、例えばマイクロタイターウェルを用い
る測定方法などの加えるサンプル量に制約が有る免疫測
定法に適用できないため、本発明の目的に適していない
ことは明らかである。そこで本発明者は、陰イオン性界
面活性剤を含む処理剤を添加し、さらに何らかの添加剤
を加えることにより、陰イオン性界面活性剤による変性
効果を、抗体などのプローブに影響を与えないように弱
めることが出来ないか、また同時に陰イオン性界面活性
剤によるＨＣＶコア抗原遊離作用を増強することができ
ないかを検討した。

【００４５】ここで本発明者は、ＳＤＳ等の陰イオン性
界面活性剤以外の界面活性剤を含む処理剤を添加するこ
とにより、ＳＤＳの固相化抗体に対する変性作用を弱
め、その結果ＳＤＳを含む処理剤のみと比較して、感度
を上昇させることが出来ることを見いだした。また、Ｓ
ＤＳ等の陰イオン性界面活性剤を含む処理剤に、それ以
外の界面活性剤や尿素などの水素イオン結合を弱める薬
剤を同時に加えた処理剤とした場合にも、同様の効果を
認めるとともに、ウイルス粒子からのＨＣＶコア抗原遊
離および検体中抗コア抗原抗体の不活化を強くすること
によって、ＨＣＶコア抗原の遊離がさらに増強されるこ
とを見いだした。さらにＳＤＳとその他の界面活性剤を
含む処理剤を添加した後熱処理工程を行なうことによ
り、より高感度にＨＣＶコア抗原を検出できることを見
いだし、本発明を完成させるに至った。

【００４６】ここで、検体の処理に用いる陰イオン性界
面活性剤はＳＤＳ以外でも、セチル硫酸ナトリウムや他
のアルキル化硫酸エステル、ドデシルスルホン酸ナトリ
ウムのようなアルキル化スルホン酸塩、アルキルアリル
スルホン酸塩などでも可能であり、陰イオン性界面活性
剤以外に加える界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ（３−
〔３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−
プロパンスルホン酸），ＣＨＡＰＳＯ（３−〔コラミド
プロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１
−プロパンスルホン酸）、ドデシル−Ｎ−ベタインなど
の両イオン性界面活性剤やＴｒｉｔｏｎＸ１００などの
ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル類、
ＮＰ４０などのポリオキシエチレンノニルフェニルエー
テル類、Ｔｗｅｅｎ８０などのポリオキシエチレンソル
ビトールエステル類、Ｂｒｉｊ５８のようなポリオキシ
エチレンドデシルエーテル類、オクチルグルコシドとい
った非イオン性界面活性剤が適当で有り、好ましくはＣ
ＨＡＰＳなどの両イオン性界面活性剤とＴｒｉｔｏｎ−
Ｘ１００などの非イオン性界面活性剤を含む。また、こ
こに尿素、チオ尿素などの蛋白質の高次構造を壊す様な
作用を示す薬剤（蛋白質変性剤）を加えることも効果的
である。

【００４７】処理の際の濃度は、ＳＤＳは０．５％以
上、ＣＨＡＰＳは、０．１％以上、尿素は１Ｍ以上、Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ１００は０．１％以上０．７５％以下で使
用することがより好ましい。以上のような検体の処理温
度は、通常一般実験室で用いられている範囲である４℃
以上１００℃以下であればよいが、非イオン性界面活性
剤添加の場合は、その曇点に注意が必要である。好まし
くは、３７℃以上であり、さらに血清の非働化に一般的
に用いられている５０〜６０℃処理が効果的である。

【００４８】本発明の処理方法を用いることにより、Ｈ
ＣＶと同様の構造を持つウイルス粒子を含む検体から、
ウイルス抗原を、抗体などをプローブとして用いるいわ
ゆる免疫測定方法に適した状態に遊離させることが出来
ることは明らかである。ここでＨＣＶと同様の構造を持
つウイルスとは、ゲノムＲＮＡ，ＤＮＡをパッキングす
る蛋白質と、それを取り囲む膜タンパク質と脂質膜から
構成される構造を持つウイルス粒子を形成するウイルス
であり、例えばＨＣＶの類縁のウイルスであるフラビウ
イルス類、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのレト
ロウイルスなどが含まれる。さらにゲノムとしてＤＮＡ
を持つものであっても同様の構造を持つものが含まれ
る。

【００４９】さらに、ＲＮＡウイルスであるＨＣＶや、
ＤＮＡウイルスであるＨＢＶはともにこれらのゲノムＲ
ＮＡやＤＮＡを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋
白質や脂質膜からなる構造をもつウイルス粒子を形成す
るウイルスである。いずれの態様においても、本発明の
処理法を用いることにより、ＨＣＶやＨＢＶだけでな
く、これらと同じような構造をもつウイルス粒子を破壊
して、ウイルスの抗原を十分に露出させ、その抗原を検
出または測定することによりそのウイルスを検出または
測定することをも提供する。

【００５０】ヘモグロビンによる妨害の除去 測定用試料として血清等を使用する場合、該試料に含ま
れる赤血球が、前記の前処理の間に溶血してヘモグロビ
ンが放出され、この変性ヘモグロビンが測定を妨害する
場合がある。従って本発明の第一の態様においては、こ
のような測定の妨害を除去することが好ましい。このた
めの添加剤として、尿素、イミダゾール環含有化合物及
びインドール環含有化合物の内少なくとも１種を添加す
るのが好ましいことを見い出した。

【００５１】イミダゾール環含有化合物としてはイミダ
ゾール、ヒスチジン、イミダゾールアクリル酸、イミダ
ゾールカルボキシアルデヒド、イミダゾールカルボキサ
ミド、イミダゾールジオン、イミダゾールジチオカルボ
ン酸、イミダゾールジカルボン酸、イミダゾールメタノ
ール、イミダゾリジンチオン、イミダゾリドン、ヒスタ
ミン、イミダゾピリジン等が挙げられる。

【００５２】また、インドール環含有化合物としては、
トリプトファン、インドールアクリル酸、インドール、
インドール酢酸、インドール酢酸ヒドラジド、インドー
ル酢酸メチルエステル、インドール酪酸、インドールア
セトニトリル、インドールカルビノール、インドールカ
ルボキシアルデヒド、インドールカルボン酸、インドー
ルエタノール、インドール乳酸、インドールメタノー
ル、インドールプロピオン酸、インドールピルビン酸、
インドリルメチルケトン、インドーマイシン、インドー
ルアセトン、インドメタシン、インドプロフェン、イン
ドラミン等が挙げられる。

【００５３】添加量としては尿素は０．５Ｍ〜５Ｍの濃
度が適当であり、インドールアクリル酸は５mM〜５０mM
の濃度が適当であり、その他の添加物は０．０５Ｍ〜
０．５Ｍの濃度が適当である。

【００５４】ウイルス抗原の露出 本発明の第二の態様によれば、ウインドピリオドにおい
て採取した試料中のウイルス抗原の検出方法に関し、こ
の方法においてはウイルス抗原に対する抗体はまだ生成
していないので、ウイルス粒子を破壊してウイルス抗原
を露出させるだけで十分であり、試料中に存在する抗体
を破壊する必要はない。従って、前に説明した試料の前
処理は必要でなく、測定反応液中に、ウイルス抗原を露
出するためのウイルス粒子破壊剤が存在すれば十分であ
る。ここで述べるウイルス抗原とは、ウイルス粒子内部
に存在する抗原を意味し、コア抗原はその代表である。

【００５５】ウイルス粒子は、ゲノムである核酸とコア
抗原が複合体を形成して粒子を形成し、その粒子を脂質
膜とエンベロープタンパク質からなる外膜が覆った構造
をしていると考えられているものが多い。さらに血液中
では低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）やウイルスに対す
る抗体などとの複合体を形成して存在していると考えら
れている。そのため、血液中に存在するウイルス粒子の
ままでは、プローブは、ウイルス粒子内部に存在するコ
ア抗原に代表されるウイルス抗原を認識し結合すること
が出来ない。故にコア抗原を検出するためには、コア抗
原を取り囲むこれらの構造物を除去するなどの処理をし
て、コア抗原がプローブに認識されるようにする必要が
ある。

【００５６】すなわち本発明においては、検体中に含ま
れるウイルス粒子中のコア抗原を、コア抗原を認識する
ためのプローブが認識できるように露呈させる反応条
件、反応させる系からなる反応方法、および反応させる
系を含む試薬をも提供する。本発明が提供する系におけ
る抗原検出に適した反応系とは、ウイルス抗原エピトー
プに対する抗体の機能を失わせない程度のマイルドな条
件でありながら、検体中に存在する複雑な構造体である
ウイルス粒子から、ウイルス抗原を認識するプローブで
ある抗体の認識する領域を十分に露呈させる条件からな
る系である。

【００５７】すでに超遠心法にて分離したウイルス粒子
（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，７３：６６７−６７２））、ポリ
エチレングリコールによって凝集沈殿させたＨＣＶ粒子
をＴｗｅｅｎ８０やＴｒｉｔｏｎＸ１００の様な非イオ
ン性の界面活性剤によって処理することにより（Ｋａｓ
ｈｉｗａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ：１９０：７９
−８９）、コア抗原が検出可能であることが示されてい
るが、前者においてはその検出感度が不十分であり、十
分に抗原が露呈されているかは疑問である。また後者に
おいては他の処理剤を加えることにより抗体を失活させ
ており、界面活性剤の効果そのものについては触れられ
ていない。

【００５８】本発明においては、始めに界面活性剤を基
本に条件を検討し、反応液を界面活性剤を中心とした組
成にすることにより、すでに報告されているＨＣＶ抗原
検出系のように、遠心操作や加熱などの操作からなる前
処理法を適用することなく、単に反応液中で検体を希釈
することのみにより、ウイルスパーティクル中の抗原を
効率良く検出することが可能となった。効果的にウイル
ス粒子中からコア抗原を抽出し、かつ血清中の様々な物
質との相互反応を抑制し、効率よくプローブと抗原とが
反応できる条件を与えることが必要である。この際の効
果的な界面活性剤としては、炭素原子数１０個以上のア
ルキル基と第２、第３もしくは第４級アミンを同一分子
内に有する界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤が挙
げられる。

【００５９】前記アルキル基と第２、第３又は第４アミ
ンを有する界面活性剤において、アルキル基は好ましく
は直鎖アルキル基であり、その炭素原子数は好ましくは
１０個以上、さらに好ましくは１０〜２０個である。ア
ミンとしては第３級アミン又は第４級アミン（アンモニ
ウム）が好ましい。具体的な界面活性剤としては、ドデ
シル−Ｎ−サルコシン酸、ドデシルトリメチルアンモニ
ウム塩、セチルトリメチルアンモニウム塩、３−（ドデ
シルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸、
３−（テトラデシルジメチルアンモニオ）−１−プロパ
ンスルホン酸、ドデシルピリミジウム塩、セチルピリジ
ウム塩、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ
−１０）、ドデシル−Ｎ−ベタイン等が挙げられる。ド
デシル−Ｎ−サルコシン酸及びドデシルトリメチルアン
モニウム塩が好ましい。

【００６０】前記の非イオン性界面活性剤としては１２
〜１４の間の親水疎水比を有するものが好ましく、ポリ
オキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル類、例え
ばＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４な
ど、あるいはポリオキシエチレンノニファニルエーテル
類、例えばＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、ＴｒｉｔｏｎＮ１
０１、Ｎｉｋｋｏｌ ＮＰ等が好ましい。本発明におい
ては、上記２つのタイプの界面活性剤を単独で用いても
よいが、併用するのが一層好ましく、併用により相乗効
果が得られる。さらに、尿素など、水環境を変化させる
ような因子を加えてもよい。

【００６１】本発明によって示されるプローブとしての
モノクローナル抗体 本発明でいうＨＣＶの構造蛋白質遺伝子断片とは、ＨＣ
Ｖの構造蛋白質遺伝子のコア領域を含む遺伝子断片であ
り、少なくともＨＣＶのＮ末端の１番目から１６０番目
のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配
列を有するＤＮＡ断片である。具体的には、配列番号２
のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片
である。

【００６２】本発明でいうＨＣＶ抗原活性を有するポリ
ペプチドとは、抗ＨＣＶ抗体と免疫学的に反応する融合
ポリペプチドもしくはポリペプチドを意味し、本発明の
ハイブリドーマならびにそれから得られるモノクローナ
ル抗体の作製に利用するための抗原として用いることが
できる。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を含む
ＨＣＶ抗原活性を有する融合ポリペプチドもしくは配列
番号１のアミノ酸配列の一部を含むＨＣＶ抗原活性を有
するポリペプチドであり、そのＮ末端あるいはＣ末端に
余分なアミノ酸配列が付加されたものであってもよい。

【００６３】本発明の上記融合ポリペプチドならびに配
列番号３〜６に示されるアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドに対するモノクローナル抗体類は、当業者により
容易に作製することができる。ハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体の作製は良く知られている。例えば、
ＢＡＬＢ／ｃマウスなどの腹腔内あるいは皮内に、上記
融合ポリペプチドもしくはポリペプチド（以下、本抗
原）を単独もしくはＢＳＡ，ＫＬＨなどと結合させた抗
原として、単純あるいはフロイント完全アジュバント等
のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗
体価が上昇した時点で、追加免疫として本抗原を尾静脈
内に投与し、無菌的に脾臓を摘出した後、適当なマウス
骨髄腫細胞株と細胞融合し、ハイブリドーマを得る。本
方法は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従
って行なうことができる。

【００６４】上記方法により得られたハイブリドーマ細
胞株を適当な培養液中で培養し、その後、本抗原に対し
て特異的な反応を示す抗体を産生するハイブリドーマ細
胞株を選択してクローン化する。抗体産生ハイブリドー
マのクローニングには限界希釈法のほか軟寒天法（Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７
６）などを利用することができる。そして、産生された
モノクローナル抗体をプロテインＡなどを用いたカラム
クロマトグラフィーなどの方法により精製する。上記の
モノクローナル抗体以外にもプローブとして用いる分子
は作製することが出来る。例えば組換え抗体については
Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｎの総説などに詳しく記載されてい
る（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，１５：６２−７０，１９９７）。

【００６５】プローブを用いた検出系 本発明に従って調製されたモノクローナル抗体は、ウイ
ルス構造蛋白質の検出および定量用に、エンザイム−リ
ンクイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イ
ムノドットアッセイ、ラジオイムノアッセイ、凝集に基
づいたアッセイ、あるいは他のよく知られているイムノ
アッセイ法で検査試薬として用いることができる。ま
た、検出に標識化抗体が使用される場合は、標識化合物
としては例えば蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、
酵素、染色物質などが使用される。

【００６６】例えば、検体（血清）中のウイルス抗原を
検出するためにサンドイッチ反応系を原理とした方法を
用いる場合、使用すべき診断キットは、固体支持体（例
えばマイクロタイターウェルの内壁）に被覆された本発
明の１種類以上のモノクローナル抗体および標識物質と
結合させた１種類以上のモノクローナル抗体またはその
フラグメントを含む。固体支持体に固相化するモノクロ
ーナル抗体および標識するモノクローナル抗体の組み合
わせは自由であり、高感度の得られる組み合わせを選択
できる。

【００６７】使用できる固体支持体としてはポリスチレ
ンやポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリビニール
製のマイクロタイタープレート、試験管、キャピラリ
ー、ビーズ（ラテックス粒子や赤血球、金属化合物な
ど）、膜（リポソームなど）、フィルターなどが挙げら
れる。

【００６８】

【発明の効果】本発明により示される方法により、抗体
などをプローブとして検出するいわゆる免疫測定方法に
適した状態に、ウイルス粒子から簡便にウイルス抗原を
遊離させることが可能となる。また本発明によって示さ
れる方法によってウイルス粒子を含む検体を処理するこ
とにより、抗体などをプローブとして抗原を検出するい
わゆる免疫測定方法により、ウイルス抗原を簡便にかつ
感度よく検出、及び定量することが可能となる。また本
発明によって示される検体処理方法を用いた免疫測定方
法を用いた、検体中のウイルスの有無を判別するキッ
ト、定量するキット及び診断薬を作製することが可能と
なる。

【００６９】

【実施例】以下の実施例は本発明を例証するものである
が、これによって本発明の範囲を制限するものではな
い。実施例１．ＨＣＶ由来ポリペプチドの発現および精製 （Ａ）発現プラスミドの構築 ＨＣＶのコア領域に相当する発現プラスミドは以下の方
法で構築した。Ｃ１１−Ｃ２１クローンおよびＣ１０−
Ｅ１２クローン（特開平６−３８７６５）をｐＵＣ１１
９に組み込んで得られたプラスミドｐＵＣ・Ｃ１１−Ｃ
２１およびｐＵＣ・Ｃ１０−Ｅ１２の各ＤＮＡ１μｇを
制限酵素反応液２０μｌ〔５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１mM ジチオスレ
イトール、１００mM ＮａＣｌ，１５単位のＥｃｏＲＩ
および１５単位のＣｌａＩ酵素〕中、および〔１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ₂ ，
１mMジチオスレイトール、５０mM ＮａＣｌ，１５単位
のＣｌａＩおよび１５単位のＫｐｎＩ酵素〕中で各々３
７℃１時間消化し、その後０．８％アガロースゲル電気
泳動を行ない、約３８０bpのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片
および約９２０bpのＣｌａＩ−ＫｐｎＩ断片を精製し
た。

【００７０】この２つのＤＮＡ断片とｐＵＣ１１９をＥ
ｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したベクターに１０×リ
ガーゼ用緩衝液〔６６０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５），６６mM ＭｇＣｌ₂ ，１００mMジチオスレトー
ル、１mM ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ １μｌ（３
５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で
一晩保温し、連結反応を行なった。このプラスミドを用
い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、プラスミドｐＵＣ
・Ｃ２１−Ｅ１２を得た。

【００７１】このプラスミドｐＵＣ・Ｃ２１−Ｅ１２
ＤＮＡ１ngを２つのプライマー（５′−ＧＡＡＴＴＣＡ
ＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡ−３′（配列番
号：７），５′−ＴＴＡＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣ
ＧＧＡＣ−３′（配列番号：８））を用いＰＣＲを行な
った。ＰＣＲはGeneAmpTM (DNA Amplification Reagent
Kit, Perkin Elmer Cetus製）のキットを用いＤＮＡ変
性９５℃１．５分、アニーリング５０℃２分、ＤＮＡ合
成７０℃３分の条件で行ない、得られたＤＮＡ断片を
０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、グラス
パウダー法（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ）で精製した。

【００７２】一方、ｐＵＣ１９を制限酵素ＳｍａＩで消
化し、ＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ断片を１０×リ
ガーゼ用緩衝液〔６６０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５），６６mM ＭｇＣｌ２，１００mMジチオスレトー
ル、１mM ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ １μｌ（３
５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で
一晩保温し、連結反応を行なった。このプラスミドを用
い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、プラスミドｐＵＣ
ｌ９・Ｃ２１−Ｅ１２・ＳｍａＩを得た。

【００７３】このプラスミドＤＮＡ１μｇを制限酵素反
応液２０μｌ〔１５０mM ＮａＣｌ，６mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．５），６mM ＭｇＣｌ₂ ，１５単位のＥ
ｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃
１時間消化反応を行ない、その後０．８％アガロースゲ
ル電気泳動を行ない、約４９０bpのＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片を分離し、これをグラスパウダー法で精製し
た。

【００７４】次に発現ベクターであるＴｒｐ・ＴｒｐＥ
（特開平５−８４０８５）のＤＮＡ１μｇを制限酵素反
応液２０μｌ〔１５０mM ＮａＣｌ，６mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．５），６mM ＭｇＣｌ₂ ，１５単位のＥ
ｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃
で１時間消化し、その反応液に水３９μｌを加え、７０
℃で５分間熱処理した後にバクテリアアルカリ性ホスフ
ァターゼ（ＢＡＰ）１μｌ（２５０単位／μｌ）を加え
て３７℃で１時間保温した。

【００７５】この反応液にフェノールを加えてフェノー
ル抽出を行ない、得られた水層をエタノール沈殿し、沈
殿物を乾燥した。得られたＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ処理
ベクターＤＮＡ１μｇと上述のコア１４０断片を１０×
リガーゼ用緩衝液〔６６０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５），６６mM ＭｇＣｌ₂ ，１００mMジチオスレトー
ル、１mM ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ １μｌ（３
５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で
一晩保温し、連結反応を行なった。

【００７６】この反応液の１０μｌを用いて大腸菌ＨＢ
１０１株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸
菌株は塩化カルシウム法〔Mandel, M.とHiga, A., J. M
ol.Biol., 53, 159-162 (1970) 〕により作られる。形
質転換大腸菌を２５μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ
プレート（１％トリプトン、０．５％ＮａＣｌ，１．５
％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート
上に生じた菌のコロニーを１白金耳取り、２５μｇ／ml
のアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、一晩３７℃で培
養した。１．５mlの菌培養液を遠心して集菌し、プラス
ミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法〔Mann
iatis ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
（1982）〕により行なった。

【００７７】得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを制限酵
素反応液２０μｌ〔１５０mM ＮａＣｌ，６mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH７．５），６mM ＭｇＣｌ₂ ，１５単位
のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３
７℃、１時間消化し、アガロースゲル電気泳動を行なっ
て、約４９０bpのＥｏｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片が生じる
Ｔｒｐ・ＴｒｐＥコア１６０発現プラスミドを選別し
た。

【００７８】（Ｂ）クローンコア１６０でコードされる
ポリペプチドの発現および精製 発現プラスミドＴｒｐ・ＴｒｐＥコア１６０をもつ大腸
菌ＨＢ１０１株を５０μｇ／mlのアンピシリンを含む３
mlの２ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキ
ス、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で９時間培養
する。この培養液１mlを５０μｇ／mlのアンピシリンを
含む１００mlのＭ９−ＣＡ培地（０．６％Ｎａ₂ ＨＰＯ
₄ ，０．５％ＫＨ₂ ＰＯ₄ ，０．５％ＮａＣｌ，０．１
％ＮＨ₄ Ｃｌ，０．１mM ＣａＣｌ₂ ，２mM ＭｇＳＯ
₄ ，０．５％カザミノ酸、０．２％グルコース）に植え
継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３の時に終
濃度４０mg／ｌになるようにインドールアクリル酸を加
え、さらに１６時間培養した。この培養液を遠心分離し
て菌体を集めた。

【００７９】菌体に２０mlの緩衝液Ａ〔５０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（pH８．０），１mM ＥＤＴＡ，３０mM Ｎ
ａＣｌ〕を加えて懸濁し、再び遠心分離を行なって発現
菌体２．６ｇを得た。得られた菌体を緩衝液Ａ １０ml
中に懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を破砕した後に
遠心分離を行ない、ＨＣＶ ｃＤＮＡでコードされるポ
リペプチドとＴｒｐＥの融合ポリペプチドを含む不溶性
画分を得た。その画分に１０mlの６Ｍ尿素を含む緩衝液
Ａを加えて融合ポリペプチドを可溶化抽出した。可溶化
した抽出物をＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたイオン交
換カラムクロマトグラフィーにかけて、融合ポリペプチ
ドの精製を行なった。

【００８０】実施例２．ハイブリドーマの作製法 前記方法により調製した融合ポリペプチド（ＴｒｐＣ１
１）を６Ｍ尿素溶解後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１
０mMリン酸緩衝液（pH７．３）に終濃度が０．２〜１．
０mg／mlとなるように希釈し、等量のアジュバント（タ
イターマックス）と混和し、ＴｒｐＣ１１懸濁液とし
た。ＴｒｐＣ１１濃度が０．１〜０．５mg／mlとなるよ
うに調製した該懸濁液を４〜６週令のＢＡＬＢ／ｃ系マ
ウスに腹腔内投与した。２週間ごとに同様の免疫を行い
さらに約２週間後、生理食塩水に溶解したＴｒｐＣ１１
１０μｇを尾静脈内に投与した。

【００８１】最終追加免疫後３日目に、この免疫動物よ
り無菌的に脾臓を摘出し、ハサミで切片としてさらにメ
ッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ−
１６４０培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄
腫細胞株ＳＰ２／０Ａｇ１４を前記と同様に洗浄後、該
細胞２．５６×１０⁷ 個と脾臓細胞１．６４×１０⁸個
を５０ml容の遠心管に入れ混合した。２００×ｇ、５分
間遠心分離を行ない、上清を除去し、３７℃に保温した
５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００（メ
ルク社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１mlを加え、
さらにＲＰＭＩ−１６４０培地１０mlを加えて細胞融合
させた。

【００８２】融合細胞は、遠心分離（２００×ｇ、５分
間）によってＰＥＧを除いた後、９６ウエルプレートを
用いて、１０％ウシ胎児血清ヒポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジン（以下、ＨＡＴと省略）を含むＲ
ＰＭＩ−１６４０培地中で約１０日間培養してハイブリ
ドーマのみを増殖させた。その後、目的の抗体を産生す
るクローンをＥＬＩＳＡ法により検索し、所望の反応特
異性を有する本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを得た。

【００８３】得られたハイブリドーマについて、常法の
限界希釈法に従い、単一クローン化を行ない、得られた
ハイブリドーマをＨＣ１１−１４，ＨＣ１１−１０、お
よびＨＣ１１−３、およびＨＣ１１−７と命名した。該
４種類のハイブリドーマは、工業技術院生工学工業技術
研究所に平成９年７月４日付でそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ
−６００６，ＦＥＲＭ ＢＰ−６００４，ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−６００２及びＦＥＲＭ ＢＰ−６００３として寄託
された。

【００８４】実施例３．モノクローナル抗体の作製法 実施例２に記載の方法により得られたハイブリドーマを
プリスタン等で処理したマウス腹腔に移植し、腹水中に
産生されてくるモノクローナル抗体を取得した。該モノ
クローナル抗体の精製は、プロテインＡを結合させたセ
ファロースカラムによりＩｇＧフラクションを分離し
た。

【００８５】前記５種類のハイブリドーマから産生され
たそれぞれのモノクローナル抗体、Ｃ１１−１４，Ｃ１
１−１０，Ｃ１１−７およびＣ１１−３のアイソタイプ
は、ウサギ抗マウスＩｇ各アイソタイプ抗体（Ｚｙｍｅ
ｄ社製）を用いたイムノアッセイにより、Ｃ１１−１
０，Ｃ１１−７がＩｇＧ２ａ，Ｃ１１−１４，Ｃ１１−
３がＩｇＧ１であることが明らかとなった。得られた４
種類のモノクローナル抗体について、ＨＣＶ・コア領域
由来の配列によって合成した２０アミノ酸からなる合成
ペプチドを用いてエピトープ解析を行なった結果、表１
に示す如くコア領域の一部を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体であることがわかった。

【００８６】

【表１】

【００８７】実施例４．検体処理条件検討 １）ＳＤＳ濃度検討 健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌ
に、種々の濃度に溶解したＳＤＳと０．６％ＣＨＡＰＳ
を含んだ処理液を１００μｌ添加した。５６℃に設定し
ている保温箱に入れて３０分間処理をおこない、その８
０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法による結果
を、横軸に処理反応時のＳＤＳ濃度をとり、図１に示し
た。

【００８８】２）ＣＨＡＰＳ濃度検討 健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌ
に、種々の濃度に溶解したＣＨＡＰＳと５％ＳＤＳを含
んだ処理液を１００μｌ添加した。５６℃に設定してい
る保温箱に入れて３０分間処理をおこない、その８０μ
ｌを測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、
横軸に処理反応時のＣＨＡＰＳ濃度をとり、図２に示し
た。

【００８９】３）尿素濃度検討 健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌ
に、種々の濃度に溶解した尿素を含んだ処理液（５％Ｓ
ＤＳ，０．６％ＣＨＡＰＳ）を１００μｌ添加した。５
６℃に設定している保温箱に入れて３０分間処理をおこ
ない、その８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定
法による結果を、横軸に処理反応時の尿素濃度をとり、
図３に示した。

【００９０】４）ＴｒｉｔｏｎＸ１００濃度検討 健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌ
に、種々の濃度に溶解したＴｒｉｔｏｎＸ１００を含ん
だ処理液（５％ＳＤＳ，０．６％ＣＨＡＰＳ，６Ｍ尿
素）を１００μｌ添加した。５６℃に設定している保温
箱に入れて３０分間処理をおこない、その８０μｌを測
定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に
処理反応時のＴｒｉｔｏｎＸ１００濃度をとり、図４に
示した。

【００９１】５）反応温度検討 健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌ
に、処理液（５％ＳＤＳ，０．６％ＣＨＡＰＳ，６Ｍ尿
素、０．７５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を１００μｌ添
加した。４℃、室温（２３℃）、３７℃，４５℃，５６
℃，７０℃で３０分間処理をおこない、その８０μｌを
測定試料とした。以下に記す測定法を用いて検討した結
果を図５に示した。

【００９２】測定法 血清処理法の検討で得られた試料は各々以下の測定法を
用いて評価した。すなわち、抗ＨＣＶコア抗原モノクロ
ーナル抗体（抗体Ｃ１１−３とＣ１１−７の等量混合）
を終濃度が計６μｇ／mlになるように０．１Ｍ炭酸緩衝
液（pH９．６）で希釈し、９６ウエルマイクロプレート
（ヌンク社製）１ウエルにつき１００μｌずつ分注し
た。４℃で一晩静置後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１
０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．３）０．３５mlを
用いて２回洗浄し、０．５％カゼイン−Ｎａを含む１０
mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．３５）（以下ブロッ
キング液）、０．３５mlを添加し、さらに室温で２時間
静置した。

【００９３】ブロッキング液除去後、０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，１％ＢＳＡ，０．５％カゼイン−Ｎａ，０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１００mMリン酸ナトリウム緩衝
液（pH７．３）１６０μｌと各々の血清処理法で得られ
た測定試料をそれぞれのウエルに加え、室温で２時間反
応させ、洗浄液３００μｌで５回洗浄し、さらにペルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）標識したモノクローナル抗体（Ｃ
１１−１０とＣ１１−１４の等量混合）１００μｌを添
加して室温で３０分間反応させた。反応後、上記洗浄液
３００μｌで５回洗浄し、基質（オルトフェニレンジア
ミン、以下ＯＰＤ）溶液１００μｌを加え室温で３０分
間反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌを添加し、波
長６３０nmの吸光度を対照として波長４９２nmにおける
吸光度（ＯＤ４９２）を測定した。

【００９４】図１〜４から、各々の処理条件の最適化が
行われたが、未処理検体ではコア抗原の検出が困難であ
ったが、このような簡易な処理を行うことによって、劇
的にコア抗原の検出が可能となった。特に、処理反応時
のＳＤＳ濃度は０．５％以上で、ＣＨＡＰＳ濃度は０．
１％以上で、尿素濃度は１Ｍ以上で、ＴｒｉｔｏｎＸ１
００濃度は０．１〜０．７５％で使用することで、４℃
から７０℃の範囲で、良好にコア抗原を検出できること
が示された。

【００９５】実施例５．構造領域コア抗原の検出および
測定法（１） 血清１００μｌに、処理液（５％ＳＤＳ，０．６％ＣＨ
ＡＰＳ，６Ｍ尿素、０．７５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）
を１００μｌ添加した。５６℃に設定している保温箱に
入れて３０分間処理をおこない、その１２０μｌを測定
試料とした。抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（Ｃ
１１−３とＣ１１−７等量混合）を終濃度が計６μｇ／
mlになるように０．１Ｍ炭酸緩衝液（pH９．６）で希釈
し、９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社製）１ウエ
ルにつき１００μｌずつ分注した。４℃で一晩静置後、
０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０nMリン酸ナトリウム緩
衝液（pH７．３）０．３５mlを用いて２回洗浄し、ブロ
ッキング液０．３５mlを添加し、さらに室温で２時間静
置した。

【００９６】ブロッキング液を除去後、反応緩衝液１２
０μｌと前述した処理法で得た測定試料をそれぞれのウ
エルに加え、室温で２時間反応させた。洗浄液３００μ
ｌで５回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標
識したモノクローナル抗体（Ｃ１１−１０とＣ１１−１
４：等量混合）１００μｌを添加して室温で３０分間反
応させた。洗浄液３００μｌで５回洗浄し、基質（ＯＰ
Ｄ）溶液１００μｌを加え室温で４５分間反応させた
後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌを添加し、波長６３０nmの
吸光度を対照として波長４９２nmにおける吸光度（ＯＤ
４９２）を測定した。尚、標準血清として、パネル血清
５０を１Ｕ／mlとして、１％ＢＳＡを含む１０mMリン酸
ナトリウム緩衝液（pH７．３）で段階的に希釈したもの
について同様に処理をおこない測定した。

【００９７】図６に、標準血清として使用したパネル血
清５０の希釈直線を示した。試料中コア抗原が濃度依存
的に測定されており、約０．５ｍＵ／mlの検出が可能で
あった。すなわち、本発明の極めて簡易な検体処理法と
モノクローナル抗体を組み合わせて用いることにより、
ＨＣＶコア抗原を検出または定量できることが明らかと
なった。

【００９８】実施例６．ＨＣＶ構造領域コア抗原の検出
および定量（２） アルカリフォスファターゼ標識モノクローナル抗体を用
いた方法 固相担体として９６ウエル黒マイクロプレート（ヌンク
社）を、標識抗体としてアルカリフォスファターゼ標識
モノクローナル抗体を、基質としてＣＤＰｓｔａｒ（増
感剤としてエメラルドII）を使用した。標準血清として
使用したパネル血清５０の希釈直線を図７に示したが、
試料中コア抗原が濃度依存的に測定されており、約０．
５ｍＵ／mlの検出が可能であった。このアルカリフォス
ファターゼ標識モノクローナル抗体を用いた測定法を用
いても、ＨＣＶコア抗原を検出または定量できることが
明らかとなった。

【００９９】実施例７．血清処理と測定法で認識されて
いる分子形の解析 パネル血清１３の０．２５mlを各々の血清処理法で処理
し、ゲルロカカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ，１
ｘ３０）で分画し、それらのフラクション中の抗コア免
疫活性を測定し、その結果を図８に示した。分子量約２
０〜３０ｋＤａの分子を認識していると考えられ、ウイ
ルス中のコア抗原は前述した前処理によって、ウイルス
破壊および血清中に存在する抗コア抗体の不活化によ
り、遊離されていることが示された。

【０１００】実施例８．血清試料中のＨＣＶ構造領域コ
ア抗原の測定法 ＰＣＲ法であるアンプリコアＨＣＶモニターキット（ロ
ッシュ社）を用いて、ＨＣＶ−ＲＮＡ量が１０³ 〜１０
⁷ コピー／mlと測定された血清と健常人血清を用い、前
述の方法で、血清中のＨＣＶコア抗原の定量を行なっ
た。また、標準血清として、パネル５０血清（１Ｕ／ml
と設定）を１％ＢＳＡを含む１０mMリン酸ナトリウム緩
衝液（pH７．３）にて段階的に希釈し、同様に処理した
ものを用い、表２にその測定結果を示した。今回測定し
た検体のうち、健常人検体は全て検出限界以下であり、
ＰＣＲ法陽性例の全てを検出できた。このときの相関性
を図９に示したが、ＰＣＲ法との相関係数も０．８以上
となり高い相関性を示した。

【０１０１】

【表２】

【０１０２】実施例９．溶血血清による感度低下を抑え
るための添加剤の検討 血清成分の感度に与える影響を検討したところ、ヘモグ
ロビンを加えると著しく感度が低下することが確認され
た。ＳＤＳ，ＣＨＡＰＳ又はＴｒｉｔｏｎＸ１００を含
む前処理剤による前処理により、ヘモグロビンが変性
し、遊離したヘムの影響である可能性が考えられた。そ
こで変性ヘモグロビンの影響を軽減することのできうる
添加剤を検討した。

【０１０３】ＨＣＶコア抗原陽性血清（パネル血清Ｎｏ
３）に、高濃度ヘモグロビン（国際試薬製：干渉チェッ
ク）を添加してモデル検体を作製し、前述の前処理剤に
尿素を添加して、実施例６に準じてコア抗原測定をおこ
ない、尿素の添加効果を検討した。コントロールとした
ヘモグロビン無添加群のコア抗原活性量を１００％とし
たときの４３０mg／dlヘモグロビン添加群のコア抗原活
性量を表３にあらわした。尿素無添加のときのヘモグロ
ビン添加群のコア抗原活性量は約３０％に減少したが、
添加尿素量の増加により、ヘモグロビン添加群のコア抗
原活性量が増加し、ヘモグロビンによる干渉作用が減じ
ていることが確認された。

【０１０４】

【表３】

【０１０５】一方各種アミノ酸と、ヘムとの相互作用
や、アミノ基やカルボキシル基による緩衝能効果も考え
られたため、各種アミノ酸を添加し、その効果を調べ
た。結果を表４に示した。

【０１０６】

【表４】

【０１０７】干渉の抑制効果がもっとも認められたもの
はトリプトファン及びヒスチジンであった。これらの干
渉抑制効果の濃度依存性を検討した結果を表５に示し
た。

【０１０８】

【表５】

【０１０９】ヘムはヘモグロビン中でヒスチジンの側鎖
により配位され、ヘモグロビン中に保持されていること
から、この効果は側鎖によるものであることが示唆され
た。そこでヒスチジンの側鎖であるイミダゾール、トリ
プトファンの側鎖であるインドール環を含むインドール
アクリル酸の効果を検討した。結果を表６に示した。

【０１１０】

【表６】

【０１１１】インドール、およびインドールアクリル酸
を反応液中に加えた場合、アミノ酸を加えた場合と同様
に濃度依存的なヘモグロビンの干渉抑制効果が認められ
た。このことから反応液にイミダゾール環を含む物質、
たとえばヒスチジンまたはインドール環を含む物質、た
とえばトリプトファンを加えることにより、ヘモグロビ
ンを含む検体でも感度良くコア抗原を検出できることが
分かった。上記の各種添加剤を組み合わせた場合の効果
を検討した。結果を表７に示した。ヒスチジンとトリプ
トファンを組み合わせることにより、９０％以上回復
し、尿素を組み合わせることによりさらに検出感度が上
昇した。

【０１１２】

【表７】

【０１１３】実施例１０．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
コア抗原の検出 前記種々の実施例に記載の処理法が、他のウイルス中の
構造蛋白質の検出に応用可能かどうか検討した。ＨＢＶ
コア抗原に対するモノクローナル抗体（特殊免疫研究
所）を３μｇ／mlとなるように０．１Ｍ炭酸緩衝液（pH
９．６）で希釈して、９６ウエルマイクロプレートに１
００μｌずつ分注した。４℃で一晩静置した後、りん酸
緩衝液で洗浄し、１％ＢＳＡ溶液を３５０μｌずつ分注
した。室温で２時間静置したのち、１％ＢＳＡ溶液を吸
引除去し、反応液２００μｌを添加した。

【０１１４】組換えＨＢＶコア抗原をスタンダードとし
て用い、Ｂ型肝炎と診断され、ＨＢｅ抗原が陽性で抗Ｈ
Ｂｅ抗体が陰性である患者血清５例と健常人血清１０例
を検体として用いた。検体１００μｌに、処理試薬
（７．５％ＳＤＳ，０．７５％ＣＨＡＰＳ，０．１５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を５０μｌ添加し５６℃で
３０分間処理した。処理後、その５０μｌを反応液が満
たされたウエルに添加し、室温で９０分間反応させた。

【０１１５】比較（前処理無し）として、各サンプル１
００μｌに精製水５０μｌで希釈しその５０μｌを反応
に用いた。洗浄液で５回洗浄後、ビオチン標識抗ＨＢＶ
コアモノクローナル抗体（ＨＢｃ−２，ＨＢｃ−５，Ｈ
Ｂｃ−１４等量混合）を添加し、室温で３０分間反応さ
せた。洗浄液で５回洗浄後、アビジン標識アルカリフォ
スファターゼを添加し、室温で３０分間反応させた。洗
浄液で５回洗浄後、ＣＤＰstar（増感剤としてエメラル
ドＩＩを使用）を添加し、室温で１５分間反応させ、そ
の相対発光強度を測定した。

【０１１６】段階的に希釈した組換えＨＢＶコア抗原の
標準曲線を図１０に示し、測定されたサンプル中のコア
抗原量を表８に示した。検出限界は、２１ng／mlで、コ
ア抗原陽性と陰性を振り分けるカットオフ値は６０ng／
mlとしたところ、健常人血清では、１０例全て前処理、
無前処理どちらにおいてもコア抗原は陰性となり、Ｂ型
肝炎患者血清においては、無前処理では検出されなかっ
たが、前処理をおこなうことにより全例でコア抗原が陽
性と判定された。

【０１１７】Ｂ型肝炎患者血清においては、前処理によ
って、ウイルス粒子の破壊および抗ＨＢｃ抗体が不活化
され、検出可能になったと考えられる。以上のように、
ＨＣＶのみならず、ゲノムとしてＤＮＡをもつたとえば
ＨＢＶなどのウイルスの構造蛋白質を検出する際におい
ても、この検体前処理は有用であることが確認された。
ＨＣＶの類縁のウイルスであるフラビウイルス類、ＨＩ
Ｖなどのレトロウイルスにおいても同様のことが推察で
きることはいうまでもない。

【０１１８】

【表８】

【０１１９】実施例１１．抗原を前処理操作なしで効率
的に検出させるための方法 ＨＣＶを含む検体を界面活性剤を加えた反応液に希釈
し、ＨＣＶコア抗原の検出される効率を検討した。なお
ＨＣＶコア抗原の検出は、ＨＣＶコア抗原に対するモノ
クローナル抗体を用いたサンドイッチ酵素免疫アッセイ
（ＥＩＡ）で行った。実施例３で得られたモノクローナ
ル抗体のうち、Ｃ１１−３とＣ１１−７をコア抗原を補
足する抗体として用い、Ｃ１１−１０及びＣ１１−１４
を補足されたコア抗原を検出するための抗体として用い
た。

【０１２０】ＥＩＡは基本的には以下の条件で行った。
モノクローナル抗体Ｃ１１−３及びＣ１１−７を酢酸緩
衝液にそれぞれ４μｇ／mlとなるよう希釈した溶液をミ
クロタイタープレートに加え、４℃一夜保温した。燐酸
緩衝液で洗浄し１％ＢＳＡを含む燐酸緩衝液を加えるこ
とによるブロッキング操作を施した。そこに反応液１０
０μｌ、検体１００μｌを加え、撹拌後、室温で１．５
時間反応させた。低濃度の界面活性剤を加えた燐酸緩衝
液で洗浄することにより未反応物を除いた後、アルカリ
フォスファターゼで標識したモノクローナル抗体Ｃ１１
−１０及びＣ１１−１４を加え、室温３０分反応させ
た。

【０１２１】反応終了後、未反応物を低濃度の界面活性
剤を加えた燐酸緩衝液で洗浄することにより除き、基質
液（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ／ｅｍｅｒａｌｄｌｌ）を加え室
温２０分反応後、発光量を測定した。前記反応液中に各
種界面活性剤を加えその効果を検討した。ＨＣＶに対す
る抗体の力価が検出感度以下であり、ほとんどＨＣＶに
対する抗体を含まないと考えられるＨＣＶ抗原陽性血清
を用いて、発光量の多寡によるコア抗原活性を健常人血
清の発光量を１．０としたときの、それに対する反応比
で表わした。その結果を表９及び表１０に示す。

【０１２２】

【表９】

【０１２３】

【表１０】

【０１２４】この結果から、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００に
代表されるように、ＨＬＢ値が１２〜１４間を示す非イ
オン性界面活性剤の添加により、ＨＣＶ抗原陽性血清で
は、健常人血清と比較して発光量が増大し、検出感度が
上昇することが判明した。また、同様にドデシル−Ｎ−
サルコシン酸ナトリウムやドデシルトリメチルアンモニ
ウムに代表されるように、炭素原子数１０個以上の直鎖
アルキル基と第２、第３又は４級アミンを同時にその構
造にもつ界面活性剤の添加により、ＨＣＶ抗原陽性血清
における検出感度が上昇することも判明した。炭素数８
以下のアルキル基をもつ前記界面活性剤はこのような感
度上昇効果は認められなかった。また、これらの２種類
の界面活性剤を混合（表８では２％ドデシル−Ｎ−サル
コシン酸ナトリウムと２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を混
合）添加することにより、さらにＨＣＶ抗原陽性血清に
おける検出感度が上昇することも判明した。

【０１２５】実施例１２．ＨＣＶ感染後の抗ＨＣＶ抗体
出現前（ウインドピリオド期）の検体中のコア抗原検出 市販セロコンヴァージョンパネルＰＨＶ９０５（Ｂ．
Ｂ．Ｉ．ｉｎｃ．）を、一次反応液中に２％のＴｒｉｔ
ｏｎ Ｘ１００及び２％のドデシルＮ−サルコシン酸ナ
トリウムを添加し、実施例１１に準じて測定した。ここ
で用いたＰＨＶ９０５パネルは、観察開始後２１日目
（血清Ｎｏ．ＰＨＶ９０５−７）に抗ＨＣＶ抗体検査
（オルソＥＩＡ．３．０）で陽転化を示したものであ
り、その抗体価はカットオフインデックス（Ｓ／ＣＯ）
で表され、１．０以上が陽性と判定される。ＨＣＶコア
抗原活性（発光量）は、健常人血清の発光量を１．０と
して、それに対する比率（Ｓ／Ｎ）で表した。

【０１２６】表１１に示したように、まだ抗ＨＣＶ抗体
が陽性となる前にコア抗原活性が認められ、この界面活
性剤の添加により、ウイルス粒子からコア抗原性が露呈
し、固相化されたモノクローナル抗体と反応し、検出で
きていることが確認された。

【０１２７】

【表１１】

【０１２８】

【配列表】

ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ ＜１１０＞ Ｔｏｎｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＜１２０＞ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｒ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｐａｔ
ｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＜１６０＞ ８ ＜２１０＞ １ ＜２１１＞ １７７ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ ＜４００＞ １ Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly Ser Leu Asp Arg Asp Pro Glu 5 10 15 Phe Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr 20 25 30 Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 35 40 45 Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg 50 55 60 Ala Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg 65 70 75 80 Pro Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro 85 90 95 Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly 100 105 110 Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp 115 120 125 Pro Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr 130 135 140 Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Phe Arg Val Gly Ala Phe 145 150 155 160 Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu 165 170 175 Asp

【０１２９】＜２１０＞ ２ ＜２１１＞ １６０ ＜２１２＞ ＴＲＰ ＜２１３＞ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ ＜４００＞ ２ Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Phe Arg Val Gly Ala Phe Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160

【０１３０】＜２１０＞ ３ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ ＜４００＞ ３ Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu 5 10 15 Leu Pro Arg Arg 20

【０１３１】＜２１０＞ ４ ＜２１１＞ １０ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ ＜４００＞ ４

【０１３２】＜２１０＞ ５ ＜２１１＞ ２１ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２２３＞ ＜４００＞ ５ Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg His Arg 5 10 15 Ser Arg Asn Val Gly 20

【０１３３】＜２１０＞ ６ ＜２１１＞ ２０ ＜２１２＞ ＰＲＴ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ ＜２３０＞ ＜４００＞ ６ Asp Pro Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Lle Asp Thr Leu 5 10 15 Thr Cys Gly Phe 20

【０１３４】＜２１０＞ ７ ＜２１１＞ ２４ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ Ｐｒｏｂｅ ＜２３０＞ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ＜４００＞ ７ gaattcatgg gcacgaatcc taaa 24

【０１３５】＜２１０＞ ８ ＜２１１＞ ２１ ＜２１２＞ ＤＮＡ ＜２１３＞ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＜２２０＞ Ｐｒｏｂｅ ＜２３０＞ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ＜４００＞ ８ ttagtcctcc agaacccgga c 21

【図面の簡単な説明】

【図１】検体処理においてＳＤＳ添加濃度による効果を
検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａ
ｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，５０を
使用した。

【図２】検体処理においてＣＨＡＰＳ添加濃度による効
果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒ
ｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，５
０を使用した。

【図３】検体処理において尿素添加濃度による効果を検
討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａ
ｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，４４，
５０を使用した。

【図４】検体処理におけるＴｒｉｔｏｎＸ１００添加温
度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血
清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血
清１３，４４，５０を使用した。

【図５】検体処理中の温度による効果を検討した結果を
示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣ
Ｖ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，４４，５０を使用し
た。

【図６】標準血清のパネル血清を５０を１Ｕ／mlとして
段階的に希釈し、検体処理した試料を本発明のモノクロ
ーナル抗体を用いたサンドイッチ反応系の希釈検量線と
検出感度を示す図である。

【図７】標準血清のパネル血清５０を１Ｕ／mlとして段
階的に希釈し、検体処理した試料をサンドイッチイムノ
アッセイ反応系で測定したときの希釈検量線と検出感度
を示す図である。基質に発光物質を用いている。

【図８】パネル血清１３を、検体処理をおこなってか
ら、ゲルロカカラムを用いて分画し、その分画中のコア
抗原免疫活性を測定したものである。分子量は、ＩｇＧ
は約１５０ｋＤ、アルブミンは約６８ｋＤである。

【図９】ＰＣＲ陽性検体を、本発明の検体処理後その遊
離したコア抗原活性を測定した値とアンプリコアＨＣＶ
モニター（ＰＣＲ法）で求めたＨＣＶ−ＲＮＡ量との相
関性を示す図である。

【図１０】組換えＢ型肝炎（ＨＢＶ）コア抗原を本発明
の方法により測定した場合の標準曲線を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 飯田 久美子 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 木村 達治 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内 (72)発明者 八木 慎太郎 埼玉県入間郡大井町西鶴ヶ岡１丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルスを含む検体を、（１）陰イオン
   性界面活性剤及び、（２）両イオン性界面活性剤、非イ
   オン性界面活性剤又は蛋白質変性剤のいずれかを含む処
   理液で処理することを特徴とするウイルス含有検体の処
   理方法。
2. 【請求項２】 ウイルスを含む検体を、（１）陰イオン
   性界面活性剤、（２）両イオン性界面活性剤、及び
   （３）非イオン性界面活性剤又は蛋白質変性剤のいずれ
   かを含んだ処理液で処理することを特徴とするウイルス
   含有検体の処理方法。
3. 【請求項３】 ウイルスを含む検体を、（１）陰イオン
   性界面活性剤、（２）両イオン性界面活性剤、（３）非
   イオン性界面活性剤、及び（４）蛋白質変性剤を含んだ
   処理液で処理することを特徴とするウイルス含有検体の
   処理方法。
4. 【請求項４】 前記処理液が、尿素、イミダゾール環含
   有化合物又はインドール環含有化合物をさらに含有す
   る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記イミダゾール環含有化合物が、イミ
   ダゾール、ヒスチジン、イミダゾールアクリル酸、イミ
   ダゾールカルボキシアルデヒド、イミダゾールカルボキ
   サミド、イミダゾールジオン、イミダゾールジチオカル
   ボン酸、イミダゾールジカルボン酸、イミダゾールメタ
   ノール、イミダゾリジンチオン、イミダゾリドン、ヒス
   タミン又はイミダゾピリジンである、請求項４に記載の
   方法。
6. 【請求項６】 前記インドール環含有化合物が、トリプ
   トファン、インドールアクリル酸、インドール、インド
   ール酢酸、インドール酢酸ヒドラジド、インドール酢酸
   メチルエステル、インドール酪酸、インドールアセトニ
   トリル、インドールカルビノール、インドールカルボキ
   シアルデヒド、インドールカルボン酸、インドールエタ
   ノール、インドール乳酸、インドールメタノール、イン
   ドールプロピオン酸、インドールピルビン酸、インドリ
   ルメチルケトン、インドーマイシン、インドールアセト
   ン、インドメタシン、インドプロフェン又はインドラミ
   ン酸である、請求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の検
   体処理方法を用いて、ウイルス抗原を特異的に認識する
   プローブを反応させることにより、ウイルス抗原の存在
   を検出又は定量することを特徴とするウイルスの測定方
   法。
8. 【請求項８】 前記ウイルスが、ゲノムＲＮＡ又はＤＮ
   Ａを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質又は脂
   質膜から構成される構造を有するウイルス粒子を形成す
   るウイルスである請求項１〜７のいずれか１項に記載の
   方法。
9. 【請求項９】 前記ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈ
   ＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝
   炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス（黄熱
   ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デン
   グウイルス）、トガウイルス（アルファウイルス、ルビ
   ウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイルス）、ペス
   チウイルス（ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイル
   ス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイル
   ス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、ニュー
   カッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペストウイ
   ルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイル
   ス、ムンプスウイルス）、オルソクソウイルス（ヒトイ
   ンフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、
   ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイ
   ルス）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内
   炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コ
   クサッキーウイルス、エコーウイルス、ウシエンテロウ
   イルス、ブタエンテロウイルス、サルエンテロウイル
   ス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ウ
   シライノウイルス、ウマライノウイルス、口蹄疫ウイル
   ス、Ａ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（ヒトコロナ
   ウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マウス肝
   炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス）、アレナウイル
   ス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス、韓
   国型出血熱ウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒ
   ト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ
   白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウ
   イルス）、レオウイルス（ロタウイルス）、カリシウイ
   ルス（ノーウオークウイルス）、ブンヤウイルス（腎症
   候性出血熱ウイルス）、フィロウイルス（エボラウイル
   ス、マールブルグウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢ
   Ｖ）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、アラス
   トリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス）、
   パルボウイルス（ヒトパルボウイルス、豚パルボウイル
   ス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球
   減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウイルス）、
   パポーバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウ
   イルス）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘ
   ルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹
   ウイルス、ＥＢウイルス、馬ヘルペスウイルス、ネコヘ
   ルペスウイルス、マレック病ウイルス）又はアフリカ豚
   コレラウイルスである請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記ウイルスがＣ型肝炎ウイルス（Ｈ
    ＣＶ）又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である、請求項
    １〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 【請求項１１】 ＨＣ１１−１４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６
    ００６），ＨＣ１１−１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００
    ４），ＨＣ１１−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００２）、及
    びＨＣ１１−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００３）から成る
    群から選択されるハイブリドーマ細胞株。
12. 【請求項１２】 ＨＣ１１−１４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６
    ００６），ＨＣ１１−１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００
    ４），ＨＣ１１−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００２），Ｈ
    Ｃ１１−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００３）から成る群か
    ら選択されるハイブリドーマによって産生されるモノク
    ローナル抗体。
13. 【請求項１３】 請求項７〜１０のいずれか１項に記載
    の免疫測定方法に用いるための、陰イオン性界面活性剤
    を含んで成る、検体中のウイルスの有無を判別するキッ
    ト、定量するキット又は診断薬。
14. 【請求項１４】 請求項７〜１０のいずれか１項に記載
    の免疫測定方法に用いるための、請求項１２に記載のモ
    ノクローナル抗体を含んでなる、検体中のウイルスの有
    無を判別するキット、定量するキット又は診断薬。
15. 【請求項１５】 尿素、イミダゾール環含有化合物又は
    インドール環含有化合物をさらに含んで成る請求項１３
    又は１４に記載の診断キット又は診断薬。
16. 【請求項１６】 前記イミダゾール環含有化合物がイミ
    ダゾール、ヒスチジン、イミダゾールアクリル酸、イミ
    ダゾールカルボキシアルデヒド、イミダゾールカルボキ
    サミド、イミダゾールジオン、イミダゾールジチオカル
    ボン酸、イミダゾールジカルボン酸、イミダゾールメタ
    ノール、イミダゾリジンチオン、イミダゾリドン、ヒス
    タミン又はイミダゾピリジンである、請求項１５に記載
    の診断キット又は診断薬。
17. 【請求項１７】 前記インドール環含有化合物がトリプ
    トファン、インドールアクリル酸、インドール、インド
    ール酢酸、インドール酢酸ヒドラジド、インドール酢酸
    メチルエステル、インドール酪酸、インドールアセトニ
    トリル、インドールカルビノール、インドールカルボキ
    シアルデヒド、インドールカルボン酸、インドールエタ
    ノール、インドール乳酸、インドールメタノール、イン
    ドールプロピオン酸、インドールピルビン酸、インドリ
    ルメチルケトン、インドーマイシン、インドールアセト
    ン、インドメタシン、インドプロフェン又はインドラミ
    ン酸である、請求項１５に記載の診断キット又は診断
    薬。
18. 【請求項１８】 ウイルスの測定方法において、炭素原
    子数１０個以上のアルキル基と第２、第３又は第４級ア
    ミンとを有する界面活性剤もしくは非イオン性界面活性
    剤、又はこの両者の存在下で、ウイルス抗原を、そのプ
    ローブとの結合により測定することを特徴とする方法。
19. 【請求項１９】 前記アルキル基と第２、第３又は第４
    級アミンとを有する界面活性剤が、炭素原子数１０〜２
    ０個のアルキル基と第３級又は第４級アミンとを有する
    界面活性剤である、請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記第３級又は第４級アミン界面活性
    剤が、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸、セチルもしくはド
    デシルトリメチルアンモニウム塩、３−（ドデシルジメ
    チルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸、ドデシル
    ピリミジウム塩、又はデカノイル−Ｎ−メチルグルカミ
    ド（ＭＥＧＡ−１０）である、請求項１８又は１９に記
    載の方法。
21. 【請求項２１】 前記非イオン性界面活性剤が、１２〜
    １４の親水疎水比（ＨＬＢ）を有する界面活性剤であ
    る、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記非イオン性界面活性剤が、ポリオ
    キシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、又はポリ
    オキシエチレンノニルフェニルエーテルである請求項１
    ８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記ウイルス抗原のためのプローブ
    が、ウイルス抗原に対する抗体である、請求項１８〜２
    ２のいずれか１項に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記ウイルスが、ゲノムＲＮＡ又はＤ
    ＮＡを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質又は
    脂質膜から構成される構造を有するウイルス粒子を形成
    するウイルスである請求項１８〜２３のいずれか１項に
    記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス
    （ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ
    型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス
    （黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイル
    ス、デングウイルス）、トガウイルス（アルファウイル
    ス、ルビウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイル
    ス）、ペスチウイルス（ブタコレラウイルス、ウシ下痢
    ウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザ
    ウイルス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、
    ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペス
    トウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウ
    イルス、ムンプスウイルス）、オルソクソウイルス（ヒ
    トインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイル
    ス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザ
    ウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性
    口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイル
    ス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ウシエン
    テロウイルス、ブタエンテロウイルス、サルエンテロウ
    イルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイル
    ス、ウシライノウイルス、ウマライノウイルス、口蹄疫
    ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（ヒト
    コロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マ
    ウス肝炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス）、アレナ
    ウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイル
    ス、韓国型出血熱ウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬ
    Ｖ：ヒト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイル
    ス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウ
    ス肉腫ウイルス）、レオウイルス（ロタウイルス）、カ
    リシウイルス（ノーウオークウイルス）、ブンヤウイル
    ス（腎症候性出血熱ウイルス）、フィロウイルス（エボ
    ラウイルス、マールブルグウイルス）、Ｂ型肝炎ウイル
    ス（ＨＢＶ）、ポックスウイルス（ワクシニアウイル
    ス、アラストリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウ
    イルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイルス、豚パ
    ルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、
    ネコ白血球減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウ
    イルス）、パポーバウイルス（パピローマウイルス、ポ
    リオーマウイルス）、アデノウイルス、ヘルペスウイル
    ス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水
    痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、ウマヘルペスウイ
    ルス、ネコヘルペスウイルス、マレック病ウイルス）又
    はアフリカ豚コレラウイルスである請求項２４に記載の
    方法。
26. 【請求項２６】 前記ウイルスがＨＣＶ又はＨＢＶであ
    る、請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の方法。