JP3623162B2 - ウイルスの検出又は測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はウイルスの検出又は測定方法及びそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、種々のウイルス検出法は、血液や血液製剤中の感染性ウイルスの存在のスクリーニングや、疾患患者中のウイルスの有無の判定などに用いられている。しかしながら、それらの方法は、各種ウイルスによっても若干異なるが、必ずしも高感度、高特異性を有している場合だけではなく、たとえそうであっても、高コストであったり、ウイルス分離培養のように長時間を必要としたりするものが多い。以下、主にＣ型肝炎に関して述べ、本発明の背景技術とする。
【０００３】
Ｃ型肝炎は、長い間その原因因子が明らかではなかったが、その遺伝子がクローニングされ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３５９−３６２，１９８９）、その遺伝子を基に作られたリコンビナント抗原を用いた抗体測定による診断法が開発されたことにより（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３６２−３６４，１９８９）；特表平２−５００８８０号公報）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス、ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣ Ｖｉｒｕｓ）を原因因子とする、血液及び血液関連製剤を主たる感染経路とする感染症であることが明らかとなった。組換えコア抗原、組換えＮＳ３抗原を加えたいわゆる第２世代抗体検査法の開発により、ＨＣＶ感染者のほとんどを血清検査により判別する事が可能となった。このことにより国内献血による感染をほとんど絶つことが可能となった。
【０００４】
しかしＨＩＶ（ヒト免疫不全症ウイルス）などの一般的なウイルス感染症同様に、感染初期の抗体が生じて来るまでの期間、いわゆるウィンドピリオドと呼ばれる判別不能期間が存在し、売血が認められている地域などや国内の一部でも抗体検査では判別できなかった血液由来の成分により、依然として二次感染が起こるリスクが存在している。また抗体検査は、その原理から感染後治癒した既住者か、活動性の感染者か否かを判別することが出来ないことが問題である。
【０００５】
また現在Ｃ型肝炎の治療にはインターフェロン（ＩＦＮ）が用いられているが、ＩＦＮによりＨＣＶが駆除されて６ヶ月後にはＨＣＶ抗体価が低下することからＨＣＶ抗体価を測定することのみにて治療効果を判別することが可能であるとする研究者もいる。しかし抗体価の動きは抗原刺激低下後、すなわち抗原駆除後数カ月間以降でないと低下しないことから、抗体検査を行なうのみではＩＦＮ投与によりＨＣＶが駆除されたか否かを適時に的確に判別することが出来ない。すなわち治療のモニタリングを行なうためには、ＨＣＶに対する抗体ではなく、ＨＣＶそのものを検出する方法が必要である。
【０００６】
ＨＣＶは他のウイルスたとえばＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）などに比して血中ウイルス量が低い事、および生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、または動物などを宿主としてウイルスを増殖させることが出来ないため、ウイルス粒子（ウイルス抗原）を直接検出する方法を確立することが困難であった。そのためウイルス抗原を検出する代わりにＰＣＲ（ポリメレースチェーンリアクション）法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−１３５４，１９８５）や分岐鎖ＤＮＡプローブ法により、ウイルスゲノムＲＮＡを検出する方法が開発された。しかしウイルスゲノムを検出する方法は、ウイルス抗原を検出する方法と比較していくつかの問題点がある。
【０００７】
まず検出する物質がＲＮＡであるため保存安定性が低いため、血清の凍結融解操作により定量値が低下するなどの問題が指摘されている。そのため従来の血清検査法よりも検体の保存に留意する必要が生じる。また検体の輸送の際にも細心の注意をはらう必要が有る。
【０００８】
例えばＰＣＲ法を用いた検査法は、遺伝子断片を検出するには最も高感度な検出方法であるが、検体中からＨＣＶゲノムＲＮＡを抽出する際、またゲノムＲＮＡから鋳型ＤＮＡへの逆転写の際にロスを生じやすく安定した定量値を得るためには熟練を要すること、また増幅を行うことが重要な原理であるために、コンタミネーションを起こした際、高頻度に偽陽性を生ずるなどの問題があり、一度に大量の検体を処理することができない。また簡便とされる方法を用いても前処理時間が２時間以上も必要であり、多数回の遠心操作を含むなど煩雑である。加えて、このように操作が繁雑であるために、コンタミネーションの機会が増え、偽陽性検体の生じる可能性を増加させている。一方分岐鎖ＤＮＡプローブ法は検出感度が低く、結果が得られるまで約２０時間を要し（医学と薬学 ３１：９６１−９７０，１９９４）、感度、操作時間という点で課題が残されている。
【０００９】
上記のウイルスゲノムを検出する方法の問題点を解決するために、ウイルス抗原を直接検出する方法も開発された。特開平８−２９４２７に示されているように、ＨＣＶのコア抗原に対して特異性を有するモノクローナル抗体を用いて、血清中のコア抗原を検出する方法が開発された。本報は田中等（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２３：７４２−７４５，１９９５）および藤野等（医学と薬学 ３６：１０６５−１０７０，１９９６）に報告されているように血清中に存在するコア抗原を検出することにより、上記のウイルスゲノムを検出する方法同様に臨床的有用性を持つことが示されている。しかしながらウイルスゲノム検出法と同様にいくつかの点で大きな問題が残されている。
【００１０】
一点はＰＣＲ法と比較して感度が低いため、血清スクリーニングの最終検査に用いることが出来ないことである。田中等（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２３：７４２−７４５，１９９５）は，ＨＣＶ ＲＮＡ量として、１０４ 〜１０５ コピー／ｍｌ間が検出限界であることを示しており、藤野等（医学と薬学 ３６：１０６５−１０７０，１９９６）は、最も感度が高い検出方法であるＣＲＴ（コニペティテブリバーストランスクリプション）−ＰＣＲ法でＲＮＡ陽性に分類されるＣ型慢性肝炎患者１０２例の治療前血清において、６７％の陽性率であることを報告している。すなわち、感度の高いＣＲＴ−ＰＣＲ法と比較した場合に感度の面で大きく劣っている。
【００１１】
さらに測定のための検体処理の工程が繁雑であり、かつ時間がかかることがスクリーニングなどの用途に用いようとした際に問題となる。すなわち検体（血清）の処理のために、ウイルス粒子の濃縮と血清成分の除去のためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処理（４℃１時間）、遠心操作（１５分間）、上清の除去、尿素処理、アルカリ処理（３７℃３０分間）、中和剤添加といった多段階処理工程を必要とする。また強固に形成され、ＰＥＧにより粘性を増した沈殿の尿素処理による分散工程は、非常に熟練を要する作業である。そのため、再現性を得るためには熟練度が必要であり、また最低約２時間の処理時間が必要である。さらに遠心操作、上清除去等の工程があるために、自動化が困難で、かつ同時大量処理を困難にしており操作面においてもスクリーニングなどの大量処理を必要とする用途に適していない。
【００１２】
一方ウイルス抗原検出系は、以下の点で高感度ＰＣＲ法と比較して優れている点がある。すなわち検出過程で過度の増幅処理操作が加わらないため、コンタミネーションに対し、非常に寛容である。またＲＮＡのように不安定な物質を検出するのではなく、比較的安定な物質である抗原蛋白質を検出することから、検体の保存に過度の注意をはらう必要がなく、ＰＣＲ検体に求められる超低温槽のような特別な機器を用いる必要もなく、また検体の輸送も容易になる。
【００１３】
これらの特長は、例えば血液事業や健康診断の様に、多数の検体を測定する用途に適した要件である。しかしながら、既に指摘したように、開示されているコア抗原検出法は、前処理が煩雑で自動化に適していない、感度が低く例えば血液事業などの感度が求められる様な用途におけるゴールデンスタンダードになり得ないなどの理由により、多数の検体を扱ういわゆるスクリーニング用途に用いることが出来ず、ＰＣＲ法に対して優れている点を活かすことが出来ていない。また、臨床的に有用性が高い測定方法は、常に感度、特異性、再現性、操作性、低コストを課題とし、これらを全て満たすように鋭意開発していく必要性がある。ＨＣＶ以外のウイルス抗原の検出に関しても、特に多数の検体を測定するスクリーニング用途においては、ＰＣＲ法と比較して低感度であり、有用な前処理法やその抗原の露出がされないといった理由のために実用化されていないものが多い。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血液事業や健康診断のような、いわゆるスクリーニング用途の如き多数の検体を処理するのに適したウイルス抗原検出法を提供することである。すなわちＰＣＲ法と比較し同等の感度、特異度を持ち、前処理を簡便化すること、あるいは前処理操作をせずに容易に自動化などの大量処理システムに適用可能なウイルス抗原検出系を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の態様によれば、ウイルス粒子を破壊して、ウイルス抗原を十分に露出し、ウイルス抗原に対する抗体が存在する場合には該抗体を破壊して、ウイルス抗原を検出又は測定することによりウイルスを検出又は測定する手段を提供する。
従って、本発明は、（１）ウイルスを含む検体を、（１）陰イオン性界面活性剤及び、（２）両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤又は蛋白質変性剤のいずれかを含む処理液で処理することを特徴とするウイルス含有検体の処理方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、（２）ウイルスを含む検体を、（１）陰イオン性界面活性剤、（２）両イオン性界面活性剤、及び（３）非イオン性界面活性剤又は蛋白質変性剤のいずれかを含んだ処理液で処理することを特徴とするウイルス含有検体の処理方法を提供する。
本発明はまた、（３）ウイルスを含む検体を、（１）陰イオン性界面活性剤、（２）両イオン性界面活性剤、（３）非イオン性界面活性剤、及び（４）蛋白質変性剤を含んだ処理液で処理することを特徴とするウイルス含有検体の処理方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の検体処理方法を用いて、ウイルス抗原を特異的に認識するプローブを反応させることにより、ウイルス抗原の存在を検出又は定量することを特徴とするウイルスの測定方法を提供する。
本発明はさらに、前記（４）の免疫測定方法に用いるための、陰イオン性界面活性剤を含んで成る、検体中のウイルスの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬を提供する。
本発明はさらに、前記（４）の免疫測定方法に用いるための、後記のモノクローナル抗体を含んでなる、検体中のウイルスの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬を提供する。
【００１８】
本発明の第二の態様によれば、ウイルスに対する抗体がまだ生成していないウインドピリオドにおけるウイルス抗原の検出又は測定方法を提供する。この方法においては、ウイルス粒子を破壊してウイルス抗原を露出せしめるだけで十分であり、ウイルス抗原に対する血中の抗体を破壊する必要がない。
従って本発明はさらに、ウイルスの測定方法において、炭素原子数１０個以上のアルキル基と第２〜第４級アミンとを有する界面活性剤もしくは非イオン界面活性剤、又はこの両者の存在下で、ウイルス抗原をそのプローブとの結合により測定することを特徴とする方法を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、上記のウイルス抗原の中で、ＨＣＶコア抗原の検出のためのプローブとして適するモノクローナル抗体を生産するＨＣ１１−１４（ＦＥＲＭＢＰ−６００６），ＨＣ１１−１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００４），ＨＣ１１−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００２）、及びＨＣ１１−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００３）から成る群から選択されるハイブリドーマ細胞株を提供する。
本発明はまた、ＨＣ１１−１４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００６），ＨＣ１１−１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００４），ＨＣ１１−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００２），ＨＣ１１−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００３）から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の対象となるウイルスは、ゲノムＲＮＡ又はＤＮＡを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質又は脂質膜から構成される構造を有するウイルス粒子を形成するウイルスである。
ゲノムとしてＲＮＡを有する上記ウイルスの代表的例としてはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びＨＣＶ類縁ウイルスが挙げられる。
【００２１】
ＨＣＶ類縁ウイルスとしては、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス（黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、トガウイルス（アルファウイルス、ルビウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイルス）、ペスチウイルス（ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペストウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス）、オルソクソウイルス（ヒトインフルエンザウイルス、
【００２２】
トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ウシライノウイルス、ウマライノウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（ヒトコロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス、韓国型出血熱ウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、レオウイルス（ロタウイルス）、カリシウイルス（ノーウオークウイルス）、ブンヤウイルス（腎症候性出血熱ウイルス）、フィロウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス）などがあげられる。
【００２３】
また、ゲノムとしてＤＮＡを有する上記ウイルスの代表例としてはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、及びＨＢＶ類縁ウイルスが挙げられる。ＨＢＶ類縁ウイルスとしては、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、アラストリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイルス、豚パルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウイルス）、パポーバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、馬ヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、マレック病ウイルス）、アフリカ豚コレラウイルスなどがあげられる。
【００２４】
また、これらの他にも各種病原性のあるウイルスが知られているし、また未確認のウイルスもまだ存在しているが、それらのウイルス構造が前述のように、ゲノムＲＮＡ又はＤＮＡを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質や脂質膜から構成される構造をもつウイルス粒子を形成するウイルスであれば、本発明も処理方法により、免疫測定法に適した状態に遊離させることができることは明白である。
【００２５】
以下に、ＨＣＶコア抗原を中心に実施形態を述べる。
ＨＣＶは血中濃度が１０２ コピー／ｍｌ〜１０６ コピー／ｍｌと、ＨＢＶ（１０９ コピー／ｍｌ）と比較し低いことから、ウイルス抗原を検出するためには極めて高い感度を必要とする。
一般に抗体をプローブとする免疫学的な手法に代表される検出方法に於て、検出感度を増加させる方法としては、Ｉ）検出する抗原分子の分子数を上昇させる、ＩＩ）抗原に結合するプローブ、例えば抗体の分子数を上昇させる、ＩＩＩ）検出感度の下限を規定するプローブ、例えば抗体と抗原以外の物質との結合などに起因する非特異反応を減少させる、ＩＶ）検出に用いる標識物の検出感度を増加させる方法が考えられ、これらの方法を組み合わせることにより感度を上昇させることが可能となる。
【００２６】
抗原分子数を増加させる方法としては、Ｉ−１）検体の量を増加させる事が最も容易に考えられることであるが、一般的に用いられている反応系（例えば９６ｗｅｌｌイムノプレート）では最大添加可能な容量は３００μｌ程度であり自ずと上限が規定されるので、Ｉ−２）濃縮により反応系に加える分子数を増加させる方法が用いられる。
【００２７】
抗原に結合する検出のためのプローブ、例えば抗体の分子数を上昇させるためには、ＩＩ−１）複数のプローブ、例えば抗体を用いることにより認識エピトープの数を増加させる、ＩＩ−２）プローブ、例えば抗体と抗原との親和性（アフィニティー及びアビディティー）を上昇させることにより、単位時間あたりに結合する抗体の数を増加させる事が容易に考えつく手法である。ここで抗原とプローブ、例えば抗体の親和性を向上させる方法としては、反応系の緩衝液の組成を変化させる方法、プローブを改変する方法、これらの組み合わせが考えられる。ＩＩ−３）ビーズや磁性粒子などの表面積の広い担体に多量に抗体を結合させることによって、限られた量の抗原との反応面積を広くすることにより、多くの抗原を捕獲することも考えられる。
【００２８】
また感染症の場合は検体中に抗原と結合する高い親和性を示すヒト抗体が存在することが予想され、これらの抗体のエピトープが検出に用いるプローブ、例えば抗体のエピトープと重なることにより競合反応が起こり検出に用いる抗体数の減少につながることが予想されるため、この検体中の反応を阻害する抗体を除く事により抗原に結合する検出のための抗体の分子数を増加させる事につながる（ＩＩ−３）。
非特異反応を減少させる方法を一般化することは困難であるが、ＩＩＩ −１）緩衝液組成を変化させることによりプローブ、例えば抗体の抗原との親和性（アフィニティー及びアビディティー）を上昇させることにより非特異反応を軽減させる、ＩＩＩ −２）非特異反応の原因物質を除去するなどの方策が考えられる。
【００２９】
標識物の検出感度を上昇させる方法としては、ＩＶ−１）検出感度の高い標識物（放射性同位元素など）を用いる、ＩＶ−２）酵素や触媒を標識物に用いることにより信号を増幅させる、ＩＶ−３）酵素基質をより感度の高い基質に改変する、ＩＶ−４）酵素反応、化学反応の基質のシグナルを化学的、または電気的、機械的に増幅させる、ＩＶ−５）抗体当たりの標識物の数を増加させる、ＩＶ−６）シグナルの検出に用いる機器の感度を上昇させるなどの方法が考えられる。
【００３０】
開示されているＨＣＶコア抗原検出法の前処理法の工程を解析すると、検体にポリエチレングリコールを加えた後に遠心操作によりＨＣＶを沈殿として回収することにより抗原を濃縮する（Ｉ−２）ことと同時に血清成分の一部を除去する（ＩＩ−２）工程を行った後、尿素とアルカリ剤を含む溶液に再懸濁することにより検体中に存在するヒト抗体を不活化し（ＩＩ−３）ＨＣＶからコア抗原を遊離させる工程、非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）と中和剤を含む溶液を加えることによりモノクローナル抗体と反応させる溶液にする工程から成り立っている。
【００３１】
既に上記に指摘したように遠心操作、沈殿の再懸濁操作が操作上煩雑な過程であり、熟練度を必要とする過程である。従って本発明の達成目標は、これらの操作上の問題点を解決したコア抗原検出系である。
ＨＣＶそれ自体はいまだその姿が明らかとなっていないが、そのゲノム構造、類縁のウイルス粒子の構造、一般的なウイルスに関する情報から、ＨＣＶ粒子はゲノムＲＮＡがコア抗原によりパッキングされ、それを取り囲むように脂質膜にアンカリングしているＥ１，Ｅ２／ＮＳ１抗原からなる外被蛋白質によって囲まれた状態で存在するものと推定される。
【００３２】
そのためコア抗原を検出するためには外被を取り除き、コア抗原の検出に用いるプローブ、例えば抗体が結合できるようにする必要がある。またウイルス粒子は血中ではＬＤＬ（低密度リポ蛋白質）などに囲まれた複合構造を取っていることが報告されており、さらに外被蛋白質に対する抗体も存在することから、ウイルス粒子と抗外被蛋白質抗体との免疫複合体としても存在することが予想される。すなわち検出する抗原の分子数を増加させるためには、ウイルス粒子から効率よく外被やウイルス粒子を取り囲む夾雑物を取り除き、かつコア抗原分子を効率よく遊離させることことが重要である。ＨＣＶ以外のウイルスに関してもほぼ同様のことが言え、ウイルス抗原を効率よく遊離させることが必要となる。
【００３３】
従って、本発明は、検体（血清）中のウイルス抗原を、遠心分離のような煩雑な操作によって濃縮することなく、プローブを用いた検出に適した状態にさせる処理方法に関する。
さらに上記のように検体中には検出に用いるプローブ、例えば抗体と結合を競合するヒト抗体が高力価で存在するため、これを取り除く操作が、感度上昇のために重要である。
従って本発明の１つの態様においては、検体中のウイルス抗原を簡易に遊離させる処理方法を用い、検体中に存在するヒト抗体をも同時に不活化させる処理方法に関する。
【００３４】
本発明によって示される処理方法を用いることにより、検体中に存在するウイルス抗原は、プローブ、例えば抗体との免疫複合体を形成するのに適した状態でウイルス粒子または免疫複合体から遊離し、同時に検出反応を阻害する検体中に存在するヒト抗体をも同時に不活化させることにより、例えば抗体のようなプローブを用いた免疫測定法によって容易にかつ感度高く検出することが可能となる。
【００３５】
検出に用いるプローブ、例えば抗体はウイルスの抗原に特異的に結合するもので有り、一定の高い親和性を示し、反応系に加えた際に非特異反応などを誘発しないようなものであればかまわないが、実施例４に示す様に、一次反応に用いるプローブの一つはＨＣＶコア抗原のＣ端側を認識し結合できるものが含まれていることが好ましい。ここでＨＣＶコア抗原のＣ端側とは、配列番号２に示す配列の８１番目から１６０番目の配列、もしくはその一部をいう。さらにここにＨＣＶコア抗原のＮ端側に対するプローブが含まれていても良い。ここでＨＣＶコア抗原のＮ端側とは、配列番号２に示す配列１０番目から７０番目の配列、もしくはその一部をいう。
【００３６】
ここでプローブとは、マウス、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウシなどの実験動物を免疫して得られるポリクローナル抗体、免疫した個体から、脾臓細胞を分離し、ミエローマ細胞と融合させることによって得られるハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体、または脾臓細胞、血中白血球をＥＢウイルスによって不死化させた細胞の産生するモノクローナル抗体、ＨＣＶに感染しているヒトもしくはチンパンジーなどが産生している抗体；マウス、ヒトなどのイムノグロブリンのｃＤＮＡもしくは染色体ＤＮＡから得られる可変領域遺伝子断片、またはイムノグロブリンのｃＤＮＡもしくは染色体ＤＮＡの一部と人工的に作製した配列とを組み合わせることによって構成される可変領域遺伝子断片、人工的な遺伝子配列を用いて構成される可変領域遺伝子断片またはこれらを材料に遺伝子組換え手法によって作製される可変領域遺伝子断片を、イムノグロブリン定常領域遺伝子断片を組み合わせることによって構成される組換え抗体遺伝子によって形質転換された細胞が産生する組換え抗体；
【００３７】
上記の可変領域遺伝子断片と例えばバクテリオファージの構造蛋白質と融合させて作られるファージ抗体、上記の可変聴域遺伝子断片を他の適用な遺伝子断片例えばｍｙｃ遺伝子の一部などと組み合わせることにより構成される組換え抗体遺伝子によって形質転換された細胞が産生する組換え抗体、トリプシン分子に可変領域を人工的に導入することによって産生されるプローブ、レセプターなどの蛋白質に特異的に結合する分子を人工的に改変することによって得られるプローブ、その他コンビナトリアルケミストリー技術によって作製されたプローブなど、コア抗原に高い特異性、親和性を示す分子であればそれを用いることが出来る。
【００３８】
さらに本発明はウイルス抗原を含む検体から、上記のウイルスコア抗原とプローブ、例えば抗体との免疫複合体を形成するのに適した状態にするため、ウイルス粒子または免疫複合体から遊離し、同時に検出反応を阻害する検体中に存在するヒト抗体をも同時に不活化させる処理剤によって検体を処理する工程、遊離したコア抗原を例えば抗体のようなプローブを用いた免疫測定法によって検出並びに定量するアッセイ方法、並びに検査キットを提供する。
【００３９】
本発明によって示される検体処理剤と処理方法
本発明における検体には、全血、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液などの生物学的体液、および肝組織などが含まれる。
本発明においては、検体を煩雑な操作なく、プローブ例えばモノクローナル抗体と結合反応させるのに適した状態に検体中のコア抗原を処理する方法が最も重要な要件である。すなわち、抗原分子数を増加させるために、ウイルス粒子中などに含まれるコア抗原を効率よく遊離させることが重要になる。
【００４０】
既にＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によっても知られているように、ほとんどの蛋白質はＳＤＳ存在下の熱処理により変性し、共有結合によって結合している分子以外はモノマーになる。すなわち、測定検体にＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤を含む処理剤を添加すると、ウイルスを破壊すると同時に検体中の抗コア抗体をも変性させ、検体中のコア抗原を遊離させることが可能である。このことは、実施例７に示す様に、ＳＤＳを含む処理剤で処理した検体中のＨＣＶコア抗原を、ゲル濾過を用いた分子量解析にかけると、理論上から予想される単量体の位置に検出されることからも確認された。
【００４１】
また柏熊等（Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９０ ７９−８９，１９９６）によって報告されているように、組換えＨＣＶ発現細胞抽出液からなる検体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロット法によりＨＣＶコア抗原を検出すると、単量体と思われる分子量の位置にその免疫活性が検出される。ＳＤＳを含む変性剤を検体に加えることにより、抗原を効率よく遊離させ抗原分子数を増加させることができることはこの分野に属するものであれば容易に考え得る。
【００４２】
しかしながらよく知られているようにＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤は蛋白質変性作用が大きいため、その存在下でそのままプローブ、例えば抗体との免疫複合体形成反応に加えると、抗体をも変性させ、その機能を失わせ感度低下を導く。また、ＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤処理によってエピトープ構造が失われることが知られており、その結果として抗体の結合が弱められ、感度が低下する。これらの感度低下につながる影響を除くため、ＳＤＳ処理後何らかの方法で変性作用を弱める必要が有る。
【００４３】
陰イオン界面活性剤を含む界面活性剤は、例えば透析、限外濾過、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換法、沈殿法、膜転写法などにより除くことが出来ることが知られており、上記のようにウェスタンブロット法、ゲル濾過法により抗原が検出可能であることは、ＳＤＳ処理後、なんらかの操作を加えることにより抗原抗体反応を行なわせることが可能であることを示している。しかしながら、これらの処理を行なうことは、何れも時間と煩雑な操作を必要とするため本発明の目的に適した方法ではない。
【００４４】
また過剰量の反応液によって希釈することにより、変性作用を示さない濃度まで低下させることにより反応に影響を与えない様に出来るが、この方法では反応液が増加し、例えばマイクロタイターウェルを用いる測定方法などの加えるサンプル量に制約が有る免疫測定法に適用できないため、本発明の目的に適していないことは明らかである。
そこで本発明者は、陰イオン性界面活性剤を含む処理剤を添加し、さらに何らかの添加剤を加えることにより、陰イオン性界面活性剤による変性効果を、抗体などのプローブに影響を与えないように弱めることが出来ないか、また同時に陰イオン性界面活性剤によるＨＣＶコア抗原遊離作用を増強することができないかを検討した。
【００４５】
ここで本発明者は、ＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤以外の界面活性剤を含む処理剤を添加することにより、ＳＤＳの固相化抗体に対する変性作用を弱め、その結果ＳＤＳを含む処理剤のみと比較して、感度を上昇させることが出来ることを見いだした。また、ＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤を含む処理剤に、それ以外の界面活性剤や尿素などの水素イオン結合を弱める薬剤を同時に加えた処理剤とした場合にも、同様の効果を認めるとともに、ウイルス粒子からのＨＣＶコア抗原遊離および検体中抗コア抗原抗体の不活化を強くすることによって、ＨＣＶコア抗原の遊離がさらに増強されることを見いだした。さらにＳＤＳとその他の界面活性剤を含む処理剤を添加した後熱処理工程を行なうことにより、より高感度にＨＣＶコア抗原を検出できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【００４６】
ここで、検体の処理に用いる陰イオン性界面活性剤はＳＤＳ以外でも、セチル硫酸ナトリウムや他のアルキル化硫酸エステル、ドデシルスルホン酸ナトリウムのようなアルキル化スルホン酸塩、アルキルアリルスルホン酸塩などでも可能であり、陰イオン性界面活性剤以外に加える界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ（３−〔３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホン酸），ＣＨＡＰＳＯ（３−〔コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、ドデシル−Ｎ−ベタインなどの両イオン性界面活性剤やＴｒｉｔｏｎＸ１００などのポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル類、ＮＰ４０などのポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル類、Ｔｗｅｅｎ８０などのポリオキシエチレンソルビトールエステル類、Ｂｒｉｊ５８のようなポリオキシエチレンドデシルエーテル類、オクチルグルコシドといった非イオン性界面活性剤が適当で有り、好ましくはＣＨＡＰＳなどの両イオン性界面活性剤とＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００などの非イオン性界面活性剤を含む。また、ここに尿素、チオ尿素などの蛋白質の高次構造を壊す様な作用を示す薬剤（蛋白質変性剤）を加えることも効果的である。
【００４７】
処理の際の濃度は、ＳＤＳは０．５％以上、ＣＨＡＰＳは、０．１％以上、尿素は１Ｍ以上、ＴｒｉｔｏｎＸ１００は０．１％以上０．７５％以下で使用することがより好ましい。
以上のような検体の処理温度は、通常一般実験室で用いられている範囲である４℃以上１００℃以下であればよいが、非イオン性界面活性剤添加の場合は、その曇点に注意が必要である。好ましくは、３７℃以上であり、さらに血清の非働化に一般的に用いられている５０〜６０℃処理が効果的である。
【００４８】
本発明の処理方法を用いることにより、ＨＣＶと同様の構造を持つウイルス粒子を含む検体から、ウイルス抗原を、抗体などをプローブとして用いるいわゆる免疫測定方法に適した状態に遊離させることが出来ることは明らかである。ここでＨＣＶと同様の構造を持つウイルスとは、ゲノムＲＮＡ，ＤＮＡをパッキングする蛋白質と、それを取り囲む膜タンパク質と脂質膜から構成される構造を持つウイルス粒子を形成するウイルスであり、例えばＨＣＶの類縁のウイルスであるフラビウイルス類、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのレトロウイルスなどが含まれる。さらにゲノムとしてＤＮＡを持つものであっても同様の構造を持つものが含まれる。
【００４９】
さらに、ＲＮＡウイルスであるＨＣＶや、ＤＮＡウイルスであるＨＢＶはともにこれらのゲノムＲＮＡやＤＮＡを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質や脂質膜からなる構造をもつウイルス粒子を形成するウイルスである。いずれの態様においても、本発明の処理法を用いることにより、ＨＣＶやＨＢＶだけでなく、これらと同じような構造をもつウイルス粒子を破壊して、ウイルスの抗原を十分に露出させ、その抗原を検出または測定することによりそのウイルスを検出または測定することをも提供する。
【００５０】
ヘモグロビンによる妨害の除去
測定用試料として血清等を使用する場合、該試料に含まれる赤血球が、前記の前処理の間に溶血してヘモグロビンが放出され、この変性ヘモグロビンが測定を妨害する場合がある。従って本発明の第一の態様においては、このような測定の妨害を除去することが好ましい。このための添加剤として、尿素、イミダゾール環含有化合物及びインドール環含有化合物の内少なくとも１種を添加するのが好ましいことを見い出した。
【００５１】
イミダゾール環含有化合物としてはイミダゾール、ヒスチジン、イミダゾールアクリル酸、イミダゾールカルボキシアルデヒド、イミダゾールカルボキサミド、イミダゾールジオン、イミダゾールジチオカルボン酸、イミダゾールジカルボン酸、イミダゾールメタノール、イミダゾリジンチオン、イミダゾリドン、ヒスタミン、イミダゾピリジン等が挙げられる。
【００５２】
また、インドール環含有化合物としては、トリプトファン、インドールアクリル酸、インドール、インドール酢酸、インドール酢酸ヒドラジド、インドール酢酸メチルエステル、インドール酪酸、インドールアセトニトリル、インドールカルビノール、インドールカルボキシアルデヒド、インドールカルボン酸、インドールエタノール、インドール乳酸、インドールメタノール、インドールプロピオン酸、インドールピルビン酸、インドリルメチルケトン、インドーマイシン、インドールアセトン、インドメタシン、インドプロフェン、インドラミン等が挙げられる。
【００５３】
添加量としては尿素は０．５Ｍ〜５Ｍの濃度が適当であり、インドールアクリル酸は５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度が適当であり、その他の添加物は０．０５Ｍ〜０．５Ｍの濃度が適当である。
【００５４】
ウイルス抗原の露出
本発明の第二の態様によれば、ウインドピリオドにおいて採取した試料中のウイルス抗原の検出方法に関し、この方法においてはウイルス抗原に対する抗体はまだ生成していないので、ウイルス粒子を破壊してウイルス抗原を露出させるだけで十分であり、試料中に存在する抗体を破壊する必要はない。従って、前に説明した試料の前処理は必要でなく、測定反応液中に、ウイルス抗原を露出するためのウイルス粒子破壊剤が存在すれば十分である。ここで述べるウイルス抗原とは、ウイルス粒子内部に存在する抗原を意味し、コア抗原はその代表である。
【００５５】
ウイルス粒子は、ゲノムである核酸とコア抗原が複合体を形成して粒子を形成し、その粒子を脂質膜とエンベロープタンパク質からなる外膜が覆った構造をしていると考えられているものが多い。さらに血液中では低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）やウイルスに対する抗体などとの複合体を形成して存在していると考えられている。そのため、血液中に存在するウイルス粒子のままでは、プローブは、ウイルス粒子内部に存在するコア抗原に代表されるウイルス抗原を認識し結合することが出来ない。故にコア抗原を検出するためには、コア抗原を取り囲むこれらの構造物を除去するなどの処理をして、コア抗原がプローブに認識されるようにする必要がある。
【００５６】
すなわち本発明においては、検体中に含まれるウイルス粒子中のコア抗原を、コア抗原を認識するためのプローブが認識できるように露呈させる反応条件、反応させる系からなる反応方法、および反応させる系を含む試薬をも提供する。
本発明が提供する系における抗原検出に適した反応系とは、ウイルス抗原エピトープに対する抗体の機能を失わせない程度のマイルドな条件でありながら、検体中に存在する複雑な構造体であるウイルス粒子から、ウイルス抗原を認識するプローブである抗体の認識する領域を十分に露呈させる条件からなる系である。
【００５７】
すでに超遠心法にて分離したウイルス粒子（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，７３：６６７−６７２））、ポリエチレングリコールによって凝集沈殿させたＨＣＶ粒子をＴｗｅｅｎ８０やＴｒｉｔｏｎＸ１００の様な非イオン性の界面活性剤によって処理することにより（Ｋａｓｈｉｗａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ：１９０：７９−８９）、コア抗原が検出可能であることが示されているが、前者においてはその検出感度が不十分であり、十分に抗原が露呈されているかは疑問である。また後者においては他の処理剤を加えることにより抗体を失活させており、界面活性剤の効果そのものについては触れられていない。
【００５８】
本発明においては、始めに界面活性剤を基本に条件を検討し、反応液を界面活性剤を中心とした組成にすることにより、すでに報告されているＨＣＶ抗原検出系のように、遠心操作や加熱などの操作からなる前処理法を適用することなく、単に反応液中で検体を希釈することのみにより、ウイルスパーティクル中の抗原を効率良く検出することが可能となった。
効果的にウイルス粒子中からコア抗原を抽出し、かつ血清中の様々な物質との相互反応を抑制し、効率よくプローブと抗原とが反応できる条件を与えることが必要である。この際の効果的な界面活性剤としては、炭素原子数１０個以上のアルキル基と第２、第３もしくは第４級アミンを同一分子内に有する界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００５９】
前記アルキル基と第２、第３又は第４アミンを有する界面活性剤において、アルキル基は好ましくは直鎖アルキル基であり、その炭素原子数は好ましくは１０個以上、さらに好ましくは１０〜２０個である。アミンとしては第３級アミン又は第４級アミン（アンモニウム）が好ましい。具体的な界面活性剤としては、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、セチルトリメチルアンモニウム塩、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸、３−（テトラデシルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸、ドデシルピリミジウム塩、セチルピリジウム塩、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０）、ドデシル−Ｎ−ベタイン等が挙げられる。ドデシル−Ｎ−サルコシン酸及びドデシルトリメチルアンモニウム塩が好ましい。
【００６０】
前記の非イオン性界面活性剤としては１２〜１４の間の親水疎水比を有するものが好ましく、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル類、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４など、あるいはポリオキシエチレンノニファニルエーテル類、例えばＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、Ｎｉｋｋｏｌ ＮＰ等が好ましい。
本発明においては、上記２つのタイプの界面活性剤を単独で用いてもよいが、併用するのが一層好ましく、併用により相乗効果が得られる。
さらに、尿素など、水環境を変化させるような因子を加えてもよい。
【００６１】
本発明によって示されるプローブとしてのモノクローナル抗体
本発明でいうＨＣＶの構造蛋白質遺伝子断片とは、ＨＣＶの構造蛋白質遺伝子のコア領域を含む遺伝子断片であり、少なくともＨＣＶのＮ末端の１番目から１６０番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片である。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片である。
【００６２】
本発明でいうＨＣＶ抗原活性を有するポリペプチドとは、抗ＨＣＶ抗体と免疫学的に反応する融合ポリペプチドもしくはポリペプチドを意味し、本発明のハイブリドーマならびにそれから得られるモノクローナル抗体の作製に利用するための抗原として用いることができる。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性を有する融合ポリペプチドもしくは配列番号１のアミノ酸配列の一部を含むＨＣＶ抗原活性を有するポリペプチドであり、そのＮ末端あるいはＣ末端に余分なアミノ酸配列が付加されたものであってもよい。
【００６３】
本発明の上記融合ポリペプチドならびに配列番号３〜６に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対するモノクローナル抗体類は、当業者により容易に作製することができる。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の作製は良く知られている。例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスなどの腹腔内あるいは皮内に、上記融合ポリペプチドもしくはポリペプチド（以下、本抗原）を単独もしくはＢＳＡ，ＫＬＨなどと結合させた抗原として、単純あるいはフロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で、追加免疫として本抗原を尾静脈内に投与し、無菌的に脾臓を摘出した後、適当なマウス骨髄腫細胞株と細胞融合し、ハイブリドーマを得る。本方法は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従って行なうことができる。
【００６４】
上記方法により得られたハイブリドーマ細胞株を適当な培養液中で培養し、その後、本抗原に対して特異的な反応を示す抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択してクローン化する。抗体産生ハイブリドーマのクローニングには限界希釈法のほか軟寒天法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６）などを利用することができる。そして、産生されたモノクローナル抗体をプロテインＡなどを用いたカラムクロマトグラフィーなどの方法により精製する。
上記のモノクローナル抗体以外にもプローブとして用いる分子は作製することが出来る。例えば組換え抗体についてはＨｏｏｇｅｎｂｏｏｎの総説などに詳しく記載されている（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：６２−７０，１９９７）。
【００６５】
プローブを用いた検出系
本発明に従って調製されたモノクローナル抗体は、ウイルス構造蛋白質の検出および定量用に、エンザイム−リンクイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノドットアッセイ、ラジオイムノアッセイ、凝集に基づいたアッセイ、あるいは他のよく知られているイムノアッセイ法で検査試薬として用いることができる。また、検出に標識化抗体が使用される場合は、標識化合物としては例えば蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、酵素、染色物質などが使用される。
【００６６】
例えば、検体（血清）中のウイルス抗原を検出するためにサンドイッチ反応系を原理とした方法を用いる場合、使用すべき診断キットは、固体支持体（例えばマイクロタイターウェルの内壁）に被覆された本発明の１種類以上のモノクローナル抗体および標識物質と結合させた１種類以上のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む。固体支持体に固相化するモノクローナル抗体および標識するモノクローナル抗体の組み合わせは自由であり、高感度の得られる組み合わせを選択できる。
【００６７】
使用できる固体支持体としてはポリスチレンやポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリビニール製のマイクロタイタープレート、試験管、キャピラリー、ビーズ（ラテックス粒子や赤血球、金属化合物など）、膜（リポソームなど）、フィルターなどが挙げられる。
【００６８】
【発明の効果】
本発明により示される方法により、抗体などをプローブとして検出するいわゆる免疫測定方法に適した状態に、ウイルス粒子から簡便にウイルス抗原を遊離させることが可能となる。また本発明によって示される方法によってウイルス粒子を含む検体を処理することにより、抗体などをプローブとして抗原を検出するいわゆる免疫測定方法により、ウイルス抗原を簡便にかつ感度よく検出、及び定量することが可能となる。また本発明によって示される検体処理方法を用いた免疫測定方法を用いた、検体中のウイルスの有無を判別するキット、定量するキット及び診断薬を作製することが可能となる。
【００６９】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例証するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１．ＨＣＶ由来ポリペプチドの発現および精製
（Ａ）発現プラスミドの構築
ＨＣＶのコア領域に相当する発現プラスミドは以下の方法で構築した。Ｃ１１−Ｃ２１クローンおよびＣ１０−Ｅ１２クローン（特開平６−３８７６５）をｐＵＣ１１９に組み込んで得られたプラスミドｐＵＣ・Ｃ１１−Ｃ２１およびｐＵＣ・Ｃ１０−Ｅ１２の各ＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＮａＣｌ，１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＣｌａＩ酵素〕中、および〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５単位のＣｌａＩおよび１５単位のＫｐｎＩ酵素〕中で各々３７℃１時間消化し、その後０．８％アガロースゲル電気泳動を行ない、約３８０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片および約９２０ｂｐのＣｌａＩ−ＫｐｎＩ断片を精製した。
【００７０】
この２つのＤＮＡ断片とｐＵＣ１１９をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したベクターに１０×リガーゼ用緩衝液〔６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６６ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１００ｍＭジチオスレトール、１ｍＭ ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ １μｌ（３５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温し、連結反応を行なった。このプラスミドを用い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、プラスミドｐＵＣ・Ｃ２１−Ｅ１２を得た。
【００７１】
このプラスミドｐＵＣ・Ｃ２１−Ｅ１２ ＤＮＡ１ｎｇを２つのプライマー（５′−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡ−３′（配列番号：７），５′−ＴＴＡＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣ−３′（配列番号：８））を用いＰＣＲを行なった。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐＴＭ （ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ製）のキットを用いＤＮＡ変性９５℃１．５分、アニーリング５０℃２分、ＤＮＡ合成７０℃３分の条件で行ない、得られたＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、グラスパウダー法（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ）で精製した。
【００７２】
一方、ｐＵＣ１９を制限酵素ＳｍａＩで消化し、ＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ断片を１０×リガーゼ用緩衝液〔６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６６ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭジチオスレトール、１ｍＭ ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ １μｌ（３５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温し、連結反応を行なった。このプラスミドを用い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、プラスミドｐＵＣｌ９・Ｃ２１−Ｅ１２・ＳｍａＩを得た。
【００７３】
このプラスミドＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔１５０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃１時間消化反応を行ない、その後０．８％アガロースゲル電気泳動を行ない、約４９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を分離し、これをグラスパウダー法で精製した。
【００７４】
次に発現ベクターであるＴｒｐ・ＴｒｐＥ（特開平５−８４０８５）のＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔１５０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃で１時間消化し、その反応液に水３９μｌを加え、７０℃で５分間熱処理した後にバクテリアアルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）１μｌ（２５０単位／μｌ）を加えて３７℃で１時間保温した。
【００７５】
この反応液にフェノールを加えてフェノール抽出を行ない、得られた水層をエタノール沈殿し、沈殿物を乾燥した。得られたＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ処理ベクターＤＮＡ１μｇと上述のコア１４０断片を１０×リガーゼ用緩衝液〔６６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６６ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１００ｍＭジチオスレトール、１ｍＭ ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ １μｌ（３５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温し、連結反応を行なった。
【００７６】
この反応液の１０μｌを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は塩化カルシウム法〔Ｍａｎｄｅｌ， Ｍ．とＨｉｇａ， Ａ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５３， １５９−１６２ （１９７０） 〕により作られる。形質転換大腸菌を２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート（１％トリプトン、０．５％ＮａＣｌ，１．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーを１白金耳取り、２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、一晩３７℃で培養した。１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法〔Ｍａｎｎｉａｔｉｓ ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （１９８２）〕により行なった。
【００７７】
得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔１５０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃、１時間消化し、アガロースゲル電気泳動を行なって、約４９０ｂｐのＥｏｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片が生じるＴｒｐ・ＴｒｐＥコア１６０発現プラスミドを選別した。
【００７８】
（Ｂ）クローンコア１６０でコードされるポリペプチドの発現および精製
発現プラスミドＴｒｐ・ＴｒｐＥコア１６０をもつ大腸菌ＨＢ１０１株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌの２ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で９時間培養する。この培養液１ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＭ９−ＣＡ培地（０．６％Ｎａ２ ＨＰＯ４ ，０．５％ＫＨ２ ＰＯ４ ，０．５％ＮａＣｌ，０．１％ＮＨ４ Ｃｌ，０．１ｍＭ ＣａＣｌ２ ，２ｍＭ ＭｇＳＯ４ ，０．５％カザミノ酸、０．２％グルコース）に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３の時に終濃度４０ｍｇ／ｌになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに１６時間培養した。この培養液を遠心分離して菌体を集めた。
【００７９】
菌体に２０ｍｌの緩衝液Ａ〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，３０ｍＭ ＮａＣｌ〕を加えて懸濁し、再び遠心分離を行なって発現菌体２．６ｇを得た。得られた菌体を緩衝液Ａ １０ｍｌ中に懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を破砕した後に遠心分離を行ない、ＨＣＶ ｃＤＮＡでコードされるポリペプチドとＴｒｐＥの融合ポリペプチドを含む不溶性画分を得た。その画分に１０ｍｌの６Ｍ尿素を含む緩衝液Ａを加えて融合ポリペプチドを可溶化抽出した。可溶化した抽出物をＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーにかけて、融合ポリペプチドの精製を行なった。
【００８０】
実施例２．ハイブリドーマの作製法
前記方法により調製した融合ポリペプチド（ＴｒｐＣ１１）を６Ｍ尿素溶解後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）に終濃度が０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、等量のアジュバント（タイターマックス）と混和し、ＴｒｐＣ１１懸濁液とした。ＴｒｐＣ１１濃度が０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌとなるように調製した該懸濁液を４〜６週令のＢＡＬＢ／ｃ系マウスに腹腔内投与した。２週間ごとに同様の免疫を行いさらに約２週間後、生理食塩水に溶解したＴｒｐＣ１１ １０μｇを尾静脈内に投与した。
【００８１】
最終追加免疫後３日目に、この免疫動物より無菌的に脾臓を摘出し、ハサミで切片としてさらにメッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０Ａｇ１４を前記と同様に洗浄後、該細胞２．５６×１０７ 個と脾臓細胞１．６４×１０８ 個を５０ｍｌ容の遠心管に入れ混合した。２００×ｇ、５分間遠心分離を行ない、上清を除去し、３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００（メルク社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを加え、さらにＲＰＭＩ−１６４０培地１０ｍｌを加えて細胞融合させた。
【００８２】
融合細胞は、遠心分離（２００×ｇ、５分間）によってＰＥＧを除いた後、９６ウエルプレートを用いて、１０％ウシ胎児血清ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（以下、ＨＡＴと省略）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で約１０日間培養してハイブリドーマのみを増殖させた。その後、目的の抗体を産生するクローンをＥＬＩＳＡ法により検索し、所望の反応特異性を有する本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。
【００８３】
得られたハイブリドーマについて、常法の限界希釈法に従い、単一クローン化を行ない、得られたハイブリドーマをＨＣ１１−１４，ＨＣ１１−１０、およびＨＣ１１−３、およびＨＣ１１−７と命名した。該４種類のハイブリドーマは、工業技術院生工学工業技術研究所に平成９年７月４日付でそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ−６００６，ＦＥＲＭ ＢＰ−６００４，ＦＥＲＭ ＢＰ−６００２及びＦＥＲＭ ＢＰ−６００３として寄託された。
【００８４】
実施例３．モノクローナル抗体の作製法
実施例２に記載の方法により得られたハイブリドーマをプリスタン等で処理したマウス腹腔に移植し、腹水中に産生されてくるモノクローナル抗体を取得した。該モノクローナル抗体の精製は、プロテインＡを結合させたセファロースカラムによりＩｇＧフラクションを分離した。
【００８５】
前記５種類のハイブリドーマから産生されたそれぞれのモノクローナル抗体、Ｃ１１−１４，Ｃ１１−１０，Ｃ１１−７およびＣ１１−３のアイソタイプは、ウサギ抗マウスＩｇ各アイソタイプ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を用いたイムノアッセイにより、Ｃ１１−１０，Ｃ１１−７がＩｇＧ２ａ，Ｃ１１−１４，Ｃ１１−３がＩｇＧ１であることが明らかとなった。得られた４種類のモノクローナル抗体について、ＨＣＶ・コア領域由来の配列によって合成した２０アミノ酸からなる合成ペプチドを用いてエピトープ解析を行なった結果、表１に示す如くコア領域の一部を特異的に認識するモノクローナル抗体であることがわかった。
【００８６】
【表１】
【００８７】
実施例４．検体処理条件検討
１）ＳＤＳ濃度検討
健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌに、種々の濃度に溶解したＳＤＳと０．６％ＣＨＡＰＳを含んだ処理液を１００μｌ添加した。５６℃に設定している保温箱に入れて３０分間処理をおこない、その８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時のＳＤＳ濃度をとり、図１に示した。
【００８８】
２）ＣＨＡＰＳ濃度検討
健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌに、種々の濃度に溶解したＣＨＡＰＳと５％ＳＤＳを含んだ処理液を１００μｌ添加した。５６℃に設定している保温箱に入れて３０分間処理をおこない、その８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時のＣＨＡＰＳ濃度をとり、図２に示した。
【００８９】
３）尿素濃度検討
健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌに、種々の濃度に溶解した尿素を含んだ処理液（５％ＳＤＳ，０．６％ＣＨＡＰＳ）を１００μｌ添加した。５６℃に設定している保温箱に入れて３０分間処理をおこない、その８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時の尿素濃度をとり、図３に示した。
【００９０】
４）ＴｒｉｔｏｎＸ１００濃度検討
健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌに、種々の濃度に溶解したＴｒｉｔｏｎＸ１００を含んだ処理液（５％ＳＤＳ，０．６％ＣＨＡＰＳ，６Ｍ尿素）を１００μｌ添加した。５６℃に設定している保温箱に入れて３０分間処理をおこない、その８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時のＴｒｉｔｏｎＸ１００濃度をとり、図４に示した。
【００９１】
５）反応温度検討
健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌに、処理液（５％ＳＤＳ，０．６％ＣＨＡＰＳ，６Ｍ尿素、０．７５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を１００μｌ添加した。４℃、室温（２３℃）、３７℃，４５℃，５６℃，７０℃で３０分間処理をおこない、その８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法を用いて検討した結果を図５に示した。
【００９２】
測定法
血清処理法の検討で得られた試料は各々以下の測定法を用いて評価した。すなわち、抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（抗体Ｃ１１−３とＣ１１−７の等量混合）を終濃度が計６μｇ／ｍｌになるように０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社製）１ウエルにつき１００μｌずつ分注した。４℃で一晩静置後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）０．３５ｍｌを用いて２回洗浄し、０．５％カゼイン−Ｎａを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３５）（以下ブロッキング液）、０．３５ｍｌを添加し、さらに室温で２時間静置した。
【００９３】
ブロッキング液除去後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１％ＢＳＡ，０．５％カゼイン−Ｎａ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）１６０μｌと各々の血清処理法で得られた測定試料をそれぞれのウエルに加え、室温で２時間反応させ、洗浄液３００μｌで５回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識したモノクローナル抗体（Ｃ１１−１０とＣ１１−１４の等量混合）１００μｌを添加して室温で３０分間反応させた。反応後、上記洗浄液３００μｌで５回洗浄し、基質（オルトフェニレンジアミン、以下ＯＰＤ）溶液１００μｌを加え室温で３０分間反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌを添加し、波長６３０ｎｍの吸光度を対照として波長４９２ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４９２）を測定した。
【００９４】
図１〜４から、各々の処理条件の最適化が行われたが、未処理検体ではコア抗原の検出が困難であったが、このような簡易な処理を行うことによって、劇的にコア抗原の検出が可能となった。特に、処理反応時のＳＤＳ濃度は０．５％以上で、ＣＨＡＰＳ濃度は０．１％以上で、尿素濃度は１Ｍ以上で、ＴｒｉｔｏｎＸ１００濃度は０．１〜０．７５％で使用することで、４℃から７０℃の範囲で、良好にコア抗原を検出できることが示された。
【００９５】
実施例５．構造領域コア抗原の検出および測定法（１）
血清１００μｌに、処理液（５％ＳＤＳ，０．６％ＣＨＡＰＳ，６Ｍ尿素、０．７５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を１００μｌ添加した。５６℃に設定している保温箱に入れて３０分間処理をおこない、その１２０μｌを測定試料とした。
抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（Ｃ１１−３とＣ１１−７等量混合）を終濃度が計６μｇ／ｍｌになるように０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社製）１ウエルにつき１００μｌずつ分注した。４℃で一晩静置後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｎＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）０．３５ｍｌを用いて２回洗浄し、ブロッキング液０．３５ｍｌを添加し、さらに室温で２時間静置した。
【００９６】
ブロッキング液を除去後、反応緩衝液１２０μｌと前述した処理法で得た測定試料をそれぞれのウエルに加え、室温で２時間反応させた。洗浄液３００μｌで５回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識したモノクローナル抗体（Ｃ１１−１０とＣ１１−１４：等量混合）１００μｌを添加して室温で３０分間反応させた。洗浄液３００μｌで５回洗浄し、基質（ＯＰＤ）溶液１００μｌを加え室温で４５分間反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌを添加し、波長６３０ｎｍの吸光度を対照として波長４９２ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４９２）を測定した。尚、標準血清として、パネル血清５０を１Ｕ／ｍｌとして、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で段階的に希釈したものについて同様に処理をおこない測定した。
【００９７】
図６に、標準血清として使用したパネル血清５０の希釈直線を示した。試料中コア抗原が濃度依存的に測定されており、約０．５ｍＵ／ｍｌの検出が可能であった。すなわち、本発明の極めて簡易な検体処理法とモノクローナル抗体を組み合わせて用いることにより、ＨＣＶコア抗原を検出または定量できることが明らかとなった。
【００９８】
実施例６．ＨＣＶ構造領域コア抗原の検出および定量（２）
アルカリフォスファターゼ標識モノクローナル抗体を用いた方法
固相担体として９６ウエル黒マイクロプレート（ヌンク社）を、標識抗体としてアルカリフォスファターゼ標識モノクローナル抗体を、基質としてＣＤＰｓｔａｒ（増感剤としてエメラルドＩＩ）を使用した。標準血清として使用したパネル血清５０の希釈直線を図７に示したが、試料中コア抗原が濃度依存的に測定されており、約０．５ｍＵ／ｍｌの検出が可能であった。このアルカリフォスファターゼ標識モノクローナル抗体を用いた測定法を用いても、ＨＣＶコア抗原を検出または定量できることが明らかとなった。
【００９９】
実施例７．血清処理と測定法で認識されている分子形の解析
パネル血清１３の０．２５ｍｌを各々の血清処理法で処理し、ゲルロカカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ，１ｘ３０）で分画し、それらのフラクション中の抗コア免疫活性を測定し、その結果を図８に示した。分子量約２０〜３０ｋＤａの分子を認識していると考えられ、ウイルス中のコア抗原は前述した前処理によって、ウイルス破壊および血清中に存在する抗コア抗体の不活化により、遊離されていることが示された。
【０１００】
実施例８．血清試料中のＨＣＶ構造領域コア抗原の測定法
ＰＣＲ法であるアンプリコアＨＣＶモニターキット（ロッシュ社）を用いて、ＨＣＶ−ＲＮＡ量が１０３ 〜１０７ コピー／ｍｌと測定された血清と健常人血清を用い、前述の方法で、血清中のＨＣＶコア抗原の定量を行なった。
また、標準血清として、パネル５０血清（１Ｕ／ｍｌと設定）を１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）にて段階的に希釈し、同様に処理したものを用い、表２にその測定結果を示した。今回測定した検体のうち、健常人検体は全て検出限界以下であり、ＰＣＲ法陽性例の全てを検出できた。このときの相関性を図９に示したが、ＰＣＲ法との相関係数も０．８以上となり高い相関性を示した。
【０１０１】
【表２】
【０１０２】
実施例９．溶血血清による感度低下を抑えるための添加剤の検討
血清成分の感度に与える影響を検討したところ、ヘモグロビンを加えると著しく感度が低下することが確認された。ＳＤＳ，ＣＨＡＰＳ又はＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む前処理剤による前処理により、ヘモグロビンが変性し、遊離したヘムの影響である可能性が考えられた。そこで変性ヘモグロビンの影響を軽減することのできうる添加剤を検討した。
【０１０３】
ＨＣＶコア抗原陽性血清（パネル血清Ｎｏ３）に、高濃度ヘモグロビン（国際試薬製：干渉チェック）を添加してモデル検体を作製し、前述の前処理剤に尿素を添加して、実施例６に準じてコア抗原測定をおこない、尿素の添加効果を検討した。コントロールとしたヘモグロビン無添加群のコア抗原活性量を１００％としたときの４３０ｍｇ／ｄｌヘモグロビン添加群のコア抗原活性量を表３にあらわした。尿素無添加のときのヘモグロビン添加群のコア抗原活性量は約３０％に減少したが、添加尿素量の増加により、ヘモグロビン添加群のコア抗原活性量が増加し、ヘモグロビンによる干渉作用が減じていることが確認された。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
一方各種アミノ酸と、ヘムとの相互作用や、アミノ基やカルボキシル基による緩衝能効果も考えられたため、各種アミノ酸を添加し、その効果を調べた。結果を表４に示した。
【０１０６】
【表４】
【０１０７】
干渉の抑制効果がもっとも認められたものはトリプトファン及びヒスチジンであった。これらの干渉抑制効果の濃度依存性を検討した結果を表５に示した。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
ヘムはヘモグロビン中でヒスチジンの側鎖により配位され、ヘモグロビン中に保持されていることから、この効果は側鎖によるものであることが示唆された。そこでヒスチジンの側鎖であるイミダゾール、トリプトファンの側鎖であるインドール環を含むインドールアクリル酸の効果を検討した。結果を表６に示した。
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
インドール、およびインドールアクリル酸を反応液中に加えた場合、アミノ酸を加えた場合と同様に濃度依存的なヘモグロビンの干渉抑制効果が認められた。このことから反応液にイミダゾール環を含む物質、たとえばヒスチジンまたはインドール環を含む物質、たとえばトリプトファンを加えることにより、ヘモグロビンを含む検体でも感度良くコア抗原を検出できることが分かった。
上記の各種添加剤を組み合わせた場合の効果を検討した。結果を表７に示した。ヒスチジンとトリプトファンを組み合わせることにより、９０％以上回復し、尿素を組み合わせることによりさらに検出感度が上昇した。
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
実施例１０．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア抗原の検出
前記種々の実施例に記載の処理法が、他のウイルス中の構造蛋白質の検出に応用可能かどうか検討した。
ＨＢＶコア抗原に対するモノクローナル抗体（特殊免疫研究所）を３μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈して、９６ウエルマイクロプレートに１００μｌずつ分注した。４℃で一晩静置した後、りん酸緩衝液で洗浄し、１％ＢＳＡ溶液を３５０μｌずつ分注した。室温で２時間静置したのち、１％ＢＳＡ溶液を吸引除去し、反応液２００μｌを添加した。
【０１１４】
組換えＨＢＶコア抗原をスタンダードとして用い、Ｂ型肝炎と診断され、ＨＢｅ抗原が陽性で抗ＨＢｅ抗体が陰性である患者血清５例と健常人血清１０例を検体として用いた。検体１００μｌに、処理試薬（７．５％ＳＤＳ，０．７５％ＣＨＡＰＳ，０．１５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を５０μｌ添加し５６℃で３０分間処理した。処理後、その５０μｌを反応液が満たされたウエルに添加し、室温で９０分間反応させた。
【０１１５】
比較（前処理無し）として、各サンプル１００μｌに精製水５０μｌで希釈しその５０μｌを反応に用いた。洗浄液で５回洗浄後、ビオチン標識抗ＨＢＶコアモノクローナル抗体（ＨＢｃ−２，ＨＢｃ−５，ＨＢｃ−１４等量混合）を添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄後、アビジン標識アルカリフォスファターゼを添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄後、ＣＤＰｓｔａｒ（増感剤としてエメラルドＩＩを使用）を添加し、室温で１５分間反応させ、その相対発光強度を測定した。
【０１１６】
段階的に希釈した組換えＨＢＶコア抗原の標準曲線を図１０に示し、測定されたサンプル中のコア抗原量を表８に示した。検出限界は、２１ｎｇ／ｍｌで、コア抗原陽性と陰性を振り分けるカットオフ値は６０ｎｇ／ｍｌとしたところ、健常人血清では、１０例全て前処理、無前処理どちらにおいてもコア抗原は陰性となり、Ｂ型肝炎患者血清においては、無前処理では検出されなかったが、前処理をおこなうことにより全例でコア抗原が陽性と判定された。
【０１１７】
Ｂ型肝炎患者血清においては、前処理によって、ウイルス粒子の破壊および抗ＨＢｃ抗体が不活化され、検出可能になったと考えられる。以上のように、ＨＣＶのみならず、ゲノムとしてＤＮＡをもつたとえばＨＢＶなどのウイルスの構造蛋白質を検出する際においても、この検体前処理は有用であることが確認された。ＨＣＶの類縁のウイルスであるフラビウイルス類、ＨＩＶなどのレトロウイルスにおいても同様のことが推察できることはいうまでもない。
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
実施例１１．抗原を前処理操作なしで効率的に検出させるための方法
ＨＣＶを含む検体を界面活性剤を加えた反応液に希釈し、ＨＣＶコア抗原の検出される効率を検討した。
なおＨＣＶコア抗原の検出は、ＨＣＶコア抗原に対するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）で行った。実施例３で得られたモノクローナル抗体のうち、Ｃ１１−３とＣ１１−７をコア抗原を補足する抗体として用い、Ｃ１１−１０及びＣ１１−１４を補足されたコア抗原を検出するための抗体として用いた。
【０１２０】
ＥＩＡは基本的には以下の条件で行った。モノクローナル抗体Ｃ１１−３及びＣ１１−７を酢酸緩衝液にそれぞれ４μｇ／ｍｌとなるよう希釈した溶液をミクロタイタープレートに加え、４℃一夜保温した。燐酸緩衝液で洗浄し１％ＢＳＡを含む燐酸緩衝液を加えることによるブロッキング操作を施した。そこに反応液１００μｌ、検体１００μｌを加え、撹拌後、室温で１．５時間反応させた。低濃度の界面活性剤を加えた燐酸緩衝液で洗浄することにより未反応物を除いた後、アルカリフォスファターゼで標識したモノクローナル抗体Ｃ１１−１０及びＣ１１−１４を加え、室温３０分反応させた。
【０１２１】
反応終了後、未反応物を低濃度の界面活性剤を加えた燐酸緩衝液で洗浄することにより除き、基質液（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ／ｅｍｅｒａｌｄｌｌ）を加え室温２０分反応後、発光量を測定した。
前記反応液中に各種界面活性剤を加えその効果を検討した。ＨＣＶに対する抗体の力価が検出感度以下であり、ほとんどＨＣＶに対する抗体を含まないと考えられるＨＣＶ抗原陽性血清を用いて、発光量の多寡によるコア抗原活性を健常人血清の発光量を１．０としたときの、それに対する反応比で表わした。その結果を表９及び表１０に示す。
【０１２２】
【表９】
【０１２３】
【表１０】
【０１２４】
この結果から、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００に代表されるように、ＨＬＢ値が１２〜１４間を示す非イオン性界面活性剤の添加により、ＨＣＶ抗原陽性血清では、健常人血清と比較して発光量が増大し、検出感度が上昇することが判明した。また、同様にドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウムやドデシルトリメチルアンモニウムに代表されるように、炭素原子数１０個以上の直鎖アルキル基と第２、第３又は４級アミンを同時にその構造にもつ界面活性剤の添加により、ＨＣＶ抗原陽性血清における検出感度が上昇することも判明した。炭素数８以下のアルキル基をもつ前記界面活性剤はこのような感度上昇効果は認められなかった。また、これらの２種類の界面活性剤を混合（表８では２％ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウムと２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を混合）添加することにより、さらにＨＣＶ抗原陽性血清における検出感度が上昇することも判明した。
【０１２５】
実施例１２．ＨＣＶ感染後の抗ＨＣＶ抗体出現前（ウインドピリオド期）の検体中のコア抗原検出
市販セロコンヴァージョンパネルＰＨＶ９０５（Ｂ．Ｂ．Ｉ．ｉｎｃ．）を、一次反応液中に２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００及び２％のドデシルＮ−サルコシン酸ナトリウムを添加し、実施例１１に準じて測定した。ここで用いたＰＨＶ９０５パネルは、観察開始後２１日目（血清Ｎｏ．ＰＨＶ９０５−７）に抗ＨＣＶ抗体検査（オルソＥＩＡ．３．０）で陽転化を示したものであり、その抗体価はカットオフインデックス（Ｓ／ＣＯ）で表され、１．０以上が陽性と判定される。ＨＣＶコア抗原活性（発光量）は、健常人血清の発光量を１．０として、それに対する比率（Ｓ／Ｎ）で表した。
【０１２６】
表１１に示したように、まだ抗ＨＣＶ抗体が陽性となる前にコア抗原活性が認められ、この界面活性剤の添加により、ウイルス粒子からコア抗原性が露呈し、固相化されたモノクローナル抗体と反応し、検出できていることが確認された。
【０１２７】
【表１１】
【０１２８】
【配列表】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【図面の簡単な説明】
【図１】検体処理においてＳＤＳ添加濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，５０を使用した。
【図２】検体処理においてＣＨＡＰＳ添加濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，５０を使用した。
【図３】検体処理において尿素添加濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，４４，５０を使用した。
【図４】検体処理におけるＴｒｉｔｏｎＸ１００添加温度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，４４，５０を使用した。
【図５】検体処理中の温度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，４４，５０を使用した。
【図６】標準血清のパネル血清を５０を１Ｕ／ｍｌとして段階的に希釈し、検体処理した試料を本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ反応系の希釈検量線と検出感度を示す図である。
【図７】標準血清のパネル血清５０を１Ｕ／ｍｌとして段階的に希釈し、検体処理した試料をサンドイッチイムノアッセイ反応系で測定したときの希釈検量線と検出感度を示す図である。基質に発光物質を用いている。
【図８】パネル血清１３を、検体処理をおこなってから、ゲルロカカラムを用いて分画し、その分画中のコア抗原免疫活性を測定したものである。分子量は、ＩｇＧは約１５０ｋＤ、アルブミンは約６８ｋＤである。
【図９】ＰＣＲ陽性検体を、本発明の検体処理後その遊離したコア抗原活性を測定した値とアンプリコアＨＣＶモニター（ＰＣＲ法）で求めたＨＣＶ−ＲＮＡ量との相関性を示す図である。
【図１０】組換えＢ型肝炎（ＨＢＶ）コア抗原を本発明の方法により測定した場合の標準曲線を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明はウイルスの検出又は測定方法及びそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、種々のウイルス検出法は、血液や血液製剤中の感染性ウイルスの存在のスクリーニングや、疾患患者中のウイルスの有無の判定などに用いられている。しかしながら、それらの方法は、各種ウイルスによっても若干異なるが、必ずしも高感度、高特異性を有している場合だけではなく、たとえそうであっても、高コストであったり、ウイルス分離培養のように長時間を必要としたりするものが多い。以下、主にＣ型肝炎に関して述べ、本発明の背景技術とする。
【０００３】
Ｃ型肝炎は、長い間その原因因子が明らかではなかったが、その遺伝子がクローニングされ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３５９−３６２，１９８９）、その遺伝子を基に作られたリコンビナント抗原を用いた抗体測定による診断法が開発されたことにより（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３６２−３６４，１９８９）；特表平２−５００８８０号公報）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス、ＨｅｐａｔｉｔｉｓＣ Ｖｉｒｕｓ）を原因因子とする、血液及び血液関連製剤を主たる感染経路とする感染症であることが明らかとなった。組換えコア抗原、組換えＮＳ３抗原を加えたいわゆる第２世代抗体検査法の開発により、ＨＣＶ感染者のほとんどを血清検査により判別する事が可能となった。このことにより国内献血による感染をほとんど絶つことが可能となった。
【０００４】
しかしＨＩＶ（ヒト免疫不全症ウイルス）などの一般的なウイルス感染症同様に、感染初期の抗体が生じて来るまでの期間、いわゆるウィンドピリオドと呼ばれる判別不能期間が存在し、売血が認められている地域などや国内の一部でも抗体検査では判別できなかった血液由来の成分により、依然として二次感染が起こるリスクが存在している。また抗体検査は、その原理から感染後治癒した既住者か、活動性の感染者か否かを判別することが出来ないことが問題である。
【０００５】
また現在Ｃ型肝炎の治療にはインターフェロン（ＩＦＮ）が用いられているが、ＩＦＮによりＨＣＶが駆除されて６ヶ月後にはＨＣＶ抗体価が低下することからＨＣＶ抗体価を測定することのみにて治療効果を判別することが可能であるとする研究者もいる。しかし抗体価の動きは抗原刺激低下後、すなわち抗原駆除後数カ月間以降でないと低下しないことから、抗体検査を行なうのみではＩＦＮ投与によりＨＣＶが駆除されたか否かを適時に的確に判別することが出来ない。すなわち治療のモニタリングを行なうためには、ＨＣＶに対する抗体ではなく、ＨＣＶそのものを検出する方法が必要である。
【０００６】
ＨＣＶは他のウイルスたとえばＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）などに比して血中ウイルス量が低い事、および生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、または動物などを宿主としてウイルスを増殖させることが出来ないため、ウイルス粒子（ウイルス抗原）を直接検出する方法を確立することが困難であった。そのためウイルス抗原を検出する代わりにＰＣＲ（ポリメレースチェーンリアクション）法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−１３５４，１９８５）や分岐鎖ＤＮＡプローブ法により、ウイルスゲノムＲＮＡを検出する方法が開発された。しかしウイルスゲノムを検出する方法は、ウイルス抗原を検出する方法と比較していくつかの問題点がある。
【０００７】
まず検出する物質がＲＮＡであるため保存安定性が低いため、血清の凍結融解操作により定量値が低下するなどの問題が指摘されている。そのため従来の血清検査法よりも検体の保存に留意する必要が生じる。また検体の輸送の際にも細心の注意をはらう必要が有る。
【０００８】
例えばＰＣＲ法を用いた検査法は、遺伝子断片を検出するには最も高感度な検出方法であるが、検体中からＨＣＶゲノムＲＮＡを抽出する際、またゲノムＲＮＡから鋳型ＤＮＡへの逆転写の際にロスを生じやすく安定した定量値を得るためには熟練を要すること、また増幅を行うことが重要な原理であるために、コンタミネーションを起こした際、高頻度に偽陽性を生ずるなどの問題があり、一度に大量の検体を処理することができない。また簡便とされる方法を用いても前処理時間が２時間以上も必要であり、多数回の遠心操作を含むなど煩雑である。加えて、このように操作が繁雑であるために、コンタミネーションの機会が増え、偽陽性検体の生じる可能性を増加させている。一方分岐鎖ＤＮＡプローブ法は検出感度が低く、結果が得られるまで約２０時間を要し（医学と薬学 ３１：９６１−９７０，１９９４）、感度、操作時間という点で課題が残されている。
【０００９】
上記のウイルスゲノムを検出する方法の問題点を解決するために、ウイルス抗原を直接検出する方法も開発された。特開平８−２９４２７に示されているように、ＨＣＶのコア抗原に対して特異性を有するモノクローナル抗体を用いて、血清中のコア抗原を検出する方法が開発された。本報は田中等（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２３：７４２−７４５，１９９５）および藤野等（医学と薬学 ３６：１０６５−１０７０，１９９６）に報告されているように血清中に存在するコア抗原を検出することにより、上記のウイルスゲノムを検出する方法同様に臨床的有用性を持つことが示されている。しかしながらウイルスゲノム検出法と同様にいくつかの点で大きな問題が残されている。
【００１０】
一点はＰＣＲ法と比較して感度が低いため、血清スクリーニングの最終検査に用いることが出来ないことである。田中等（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２３：７４２−７４５，１９９５）は，ＨＣＶ ＲＮＡ量として、１０４ 〜１０５ コピー／ｍｌ間が検出限界であることを示しており、藤野等（医学と薬学 ３６：１０６５−１０７０，１９９６）は、最も感度が高い検出方法であるＣＲＴ（コニペティテブリバーストランスクリプション）−ＰＣＲ法でＲＮＡ陽性に分類されるＣ型慢性肝炎患者１０２例の治療前血清において、６７％の陽性率であることを報告している。すなわち、感度の高いＣＲＴ−ＰＣＲ法と比較した場合に感度の面で大きく劣っている。
【００１１】
さらに測定のための検体処理の工程が繁雑であり、かつ時間がかかることがスクリーニングなどの用途に用いようとした際に問題となる。すなわち検体（血清）の処理のために、ウイルス粒子の濃縮と血清成分の除去のためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処理（４℃１時間）、遠心操作（１５分間）、上清の除去、尿素処理、アルカリ処理（３７℃３０分間）、中和剤添加といった多段階処理工程を必要とする。また強固に形成され、ＰＥＧにより粘性を増した沈殿の尿素処理による分散工程は、非常に熟練を要する作業である。そのため、再現性を得るためには熟練度が必要であり、また最低約２時間の処理時間が必要である。さらに遠心操作、上清除去等の工程があるために、自動化が困難で、かつ同時大量処理を困難にしており操作面においてもスクリーニングなどの大量処理を必要とする用途に適していない。
【００１２】
一方ウイルス抗原検出系は、以下の点で高感度ＰＣＲ法と比較して優れている点がある。すなわち検出過程で過度の増幅処理操作が加わらないため、コンタミネーションに対し、非常に寛容である。またＲＮＡのように不安定な物質を検出するのではなく、比較的安定な物質である抗原蛋白質を検出することから、検体の保存に過度の注意をはらう必要がなく、ＰＣＲ検体に求められる超低温槽のような特別な機器を用いる必要もなく、また検体の輸送も容易になる。
【００１３】
これらの特長は、例えば血液事業や健康診断の様に、多数の検体を測定する用途に適した要件である。しかしながら、既に指摘したように、開示されているコア抗原検出法は、前処理が煩雑で自動化に適していない、感度が低く例えば血液事業などの感度が求められる様な用途におけるゴールデンスタンダードになり得ないなどの理由により、多数の検体を扱ういわゆるスクリーニング用途に用いることが出来ず、ＰＣＲ法に対して優れている点を活かすことが出来ていない。また、臨床的に有用性が高い測定方法は、常に感度、特異性、再現性、操作性、低コストを課題とし、これらを全て満たすように鋭意開発していく必要性がある。ＨＣＶ以外のウイルス抗原の検出に関しても、特に多数の検体を測定するスクリーニング用途においては、ＰＣＲ法と比較して低感度であり、有用な前処理法やその抗原の露出がされないといった理由のために実用化されていないものが多い。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血液事業や健康診断のような、いわゆるスクリーニング用途の如き多数の検体を処理するのに適したウイルス抗原検出法を提供することである。すなわちＰＣＲ法と比較し同等の感度、特異度を持ち、前処理を簡便化すること、あるいは前処理操作をせずに容易に自動化などの大量処理システムに適用可能なウイルス抗原検出系を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の態様によれば、ウイルス粒子を破壊して、ウイルス抗原を十分に露出し、ウイルス抗原に対する抗体が存在する場合には該抗体を破壊して、ウイルス抗原を検出又は測定することによりウイルスを検出又は測定する手段を提供する。
従って、本発明は、（１）ウイルスを含む検体を、（１）陰イオン性界面活性剤及び、（２）両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤又は蛋白質変性剤のいずれかを含む処理液で処理することを特徴とするウイルス含有検体の処理方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、（２）ウイルスを含む検体を、（１）陰イオン性界面活性剤、（２）両イオン性界面活性剤、及び（３）非イオン性界面活性剤又は蛋白質変性剤のいずれかを含んだ処理液で処理することを特徴とするウイルス含有検体の処理方法を提供する。
本発明はまた、（３）ウイルスを含む検体を、（１）陰イオン性界面活性剤、（２）両イオン性界面活性剤、（３）非イオン性界面活性剤、及び（４）蛋白質変性剤を含んだ処理液で処理することを特徴とするウイルス含有検体の処理方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の検体処理方法を用いて、ウイルス抗原を特異的に認識するプローブを反応させることにより、ウイルス抗原の存在を検出又は定量することを特徴とするウイルスの測定方法を提供する。
本発明はさらに、前記（４）の免疫測定方法に用いるための、陰イオン性界面活性剤を含んで成る、検体中のウイルスの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬を提供する。
本発明はさらに、前記（４）の免疫測定方法に用いるための、後記のモノクローナル抗体を含んでなる、検体中のウイルスの有無を判別するキット、定量するキット又は診断薬を提供する。
【００１８】
本発明の第二の態様によれば、ウイルスに対する抗体がまだ生成していないウインドピリオドにおけるウイルス抗原の検出又は測定方法を提供する。この方法においては、ウイルス粒子を破壊してウイルス抗原を露出せしめるだけで十分であり、ウイルス抗原に対する血中の抗体を破壊する必要がない。
従って本発明はさらに、ウイルスの測定方法において、炭素原子数１０個以上のアルキル基と第２〜第４級アミンとを有する界面活性剤もしくは非イオン界面活性剤、又はこの両者の存在下で、ウイルス抗原をそのプローブとの結合により測定することを特徴とする方法を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、上記のウイルス抗原の中で、ＨＣＶコア抗原の検出のためのプローブとして適するモノクローナル抗体を生産するＨＣ１１−１４（ＦＥＲＭＢＰ−６００６），ＨＣ１１−１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００４），ＨＣ１１−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００２）、及びＨＣ１１−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００３）から成る群から選択されるハイブリドーマ細胞株を提供する。
本発明はまた、ＨＣ１１−１４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００６），ＨＣ１１−１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００４），ＨＣ１１−３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００２），ＨＣ１１−７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６００３）から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体を提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の対象となるウイルスは、ゲノムＲＮＡ又はＤＮＡを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質又は脂質膜から構成される構造を有するウイルス粒子を形成するウイルスである。
ゲノムとしてＲＮＡを有する上記ウイルスの代表的例としてはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、及びＨＣＶ類縁ウイルスが挙げられる。
【００２１】
ＨＣＶ類縁ウイルスとしては、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス（黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、トガウイルス（アルファウイルス、ルビウイルス、アルテリウイルス、ルベラウイルス）、ペスチウイルス（ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス）、パラミクソウイルス（パラインフルエンザウイルス１，２，３，４、イヌジステムパ−ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、リンダペストウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス）、オルソクソウイルス（ヒトインフルエンザウイルス、
【００２２】
トリインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、ヒトライノウイルス、ウシライノウイルス、ウマライノウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（ヒトコロナウイルス、ニワトリ伝染性気管支炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス、韓国型出血熱ウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、レオウイルス（ロタウイルス）、カリシウイルス（ノーウオークウイルス）、ブンヤウイルス（腎症候性出血熱ウイルス）、フィロウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス）などがあげられる。
【００２３】
また、ゲノムとしてＤＮＡを有する上記ウイルスの代表例としてはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、及びＨＢＶ類縁ウイルスが挙げられる。ＨＢＶ類縁ウイルスとしては、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、アラストリウムウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス）、パルボウイルス（ヒトパルボウイルス、豚パルボウイルス、牛パルボウイルス、犬パルボウイルス、ネコ白血球減少症ウイルス、ミンクアリューシャン病ウイルス）、パポーバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、馬ヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、マレック病ウイルス）、アフリカ豚コレラウイルスなどがあげられる。
【００２４】
また、これらの他にも各種病原性のあるウイルスが知られているし、また未確認のウイルスもまだ存在しているが、それらのウイルス構造が前述のように、ゲノムＲＮＡ又はＤＮＡを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質や脂質膜から構成される構造をもつウイルス粒子を形成するウイルスであれば、本発明も処理方法により、免疫測定法に適した状態に遊離させることができることは明白である。
【００２５】
以下に、ＨＣＶコア抗原を中心に実施形態を述べる。
ＨＣＶは血中濃度が１０２ コピー／ｍｌ〜１０６ コピー／ｍｌと、ＨＢＶ（１０９ コピー／ｍｌ）と比較し低いことから、ウイルス抗原を検出するためには極めて高い感度を必要とする。
一般に抗体をプローブとする免疫学的な手法に代表される検出方法に於て、検出感度を増加させる方法としては、Ｉ）検出する抗原分子の分子数を上昇させる、ＩＩ）抗原に結合するプローブ、例えば抗体の分子数を上昇させる、ＩＩＩ）検出感度の下限を規定するプローブ、例えば抗体と抗原以外の物質との結合などに起因する非特異反応を減少させる、ＩＶ）検出に用いる標識物の検出感度を増加させる方法が考えられ、これらの方法を組み合わせることにより感度を上昇させることが可能となる。
【００２６】
抗原分子数を増加させる方法としては、Ｉ−１）検体の量を増加させる事が最も容易に考えられることであるが、一般的に用いられている反応系（例えば９６ｗｅｌｌイムノプレート）では最大添加可能な容量は３００μｌ程度であり自ずと上限が規定されるので、Ｉ−２）濃縮により反応系に加える分子数を増加させる方法が用いられる。
【００２７】
抗原に結合する検出のためのプローブ、例えば抗体の分子数を上昇させるためには、ＩＩ−１）複数のプローブ、例えば抗体を用いることにより認識エピトープの数を増加させる、ＩＩ−２）プローブ、例えば抗体と抗原との親和性（アフィニティー及びアビディティー）を上昇させることにより、単位時間あたりに結合する抗体の数を増加させる事が容易に考えつく手法である。ここで抗原とプローブ、例えば抗体の親和性を向上させる方法としては、反応系の緩衝液の組成を変化させる方法、プローブを改変する方法、これらの組み合わせが考えられる。ＩＩ−３）ビーズや磁性粒子などの表面積の広い担体に多量に抗体を結合させることによって、限られた量の抗原との反応面積を広くすることにより、多くの抗原を捕獲することも考えられる。
【００２８】
また感染症の場合は検体中に抗原と結合する高い親和性を示すヒト抗体が存在することが予想され、これらの抗体のエピトープが検出に用いるプローブ、例えば抗体のエピトープと重なることにより競合反応が起こり検出に用いる抗体数の減少につながることが予想されるため、この検体中の反応を阻害する抗体を除く事により抗原に結合する検出のための抗体の分子数を増加させる事につながる（ＩＩ−３）。
非特異反応を減少させる方法を一般化することは困難であるが、ＩＩＩ −１）緩衝液組成を変化させることによりプローブ、例えば抗体の抗原との親和性（アフィニティー及びアビディティー）を上昇させることにより非特異反応を軽減させる、ＩＩＩ −２）非特異反応の原因物質を除去するなどの方策が考えられる。
【００２９】
標識物の検出感度を上昇させる方法としては、ＩＶ−１）検出感度の高い標識物（放射性同位元素など）を用いる、ＩＶ−２）酵素や触媒を標識物に用いることにより信号を増幅させる、ＩＶ−３）酵素基質をより感度の高い基質に改変する、ＩＶ−４）酵素反応、化学反応の基質のシグナルを化学的、または電気的、機械的に増幅させる、ＩＶ−５）抗体当たりの標識物の数を増加させる、ＩＶ−６）シグナルの検出に用いる機器の感度を上昇させるなどの方法が考えられる。
【００３０】
開示されているＨＣＶコア抗原検出法の前処理法の工程を解析すると、検体にポリエチレングリコールを加えた後に遠心操作によりＨＣＶを沈殿として回収することにより抗原を濃縮する（Ｉ−２）ことと同時に血清成分の一部を除去する（ＩＩ−２）工程を行った後、尿素とアルカリ剤を含む溶液に再懸濁することにより検体中に存在するヒト抗体を不活化し（ＩＩ−３）ＨＣＶからコア抗原を遊離させる工程、非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）と中和剤を含む溶液を加えることによりモノクローナル抗体と反応させる溶液にする工程から成り立っている。
【００３１】
既に上記に指摘したように遠心操作、沈殿の再懸濁操作が操作上煩雑な過程であり、熟練度を必要とする過程である。従って本発明の達成目標は、これらの操作上の問題点を解決したコア抗原検出系である。
ＨＣＶそれ自体はいまだその姿が明らかとなっていないが、そのゲノム構造、類縁のウイルス粒子の構造、一般的なウイルスに関する情報から、ＨＣＶ粒子はゲノムＲＮＡがコア抗原によりパッキングされ、それを取り囲むように脂質膜にアンカリングしているＥ１，Ｅ２／ＮＳ１抗原からなる外被蛋白質によって囲まれた状態で存在するものと推定される。
【００３２】
そのためコア抗原を検出するためには外被を取り除き、コア抗原の検出に用いるプローブ、例えば抗体が結合できるようにする必要がある。またウイルス粒子は血中ではＬＤＬ（低密度リポ蛋白質）などに囲まれた複合構造を取っていることが報告されており、さらに外被蛋白質に対する抗体も存在することから、ウイルス粒子と抗外被蛋白質抗体との免疫複合体としても存在することが予想される。すなわち検出する抗原の分子数を増加させるためには、ウイルス粒子から効率よく外被やウイルス粒子を取り囲む夾雑物を取り除き、かつコア抗原分子を効率よく遊離させることことが重要である。ＨＣＶ以外のウイルスに関してもほぼ同様のことが言え、ウイルス抗原を効率よく遊離させることが必要となる。
【００３３】
従って、本発明は、検体（血清）中のウイルス抗原を、遠心分離のような煩雑な操作によって濃縮することなく、プローブを用いた検出に適した状態にさせる処理方法に関する。
さらに上記のように検体中には検出に用いるプローブ、例えば抗体と結合を競合するヒト抗体が高力価で存在するため、これを取り除く操作が、感度上昇のために重要である。
従って本発明の１つの態様においては、検体中のウイルス抗原を簡易に遊離させる処理方法を用い、検体中に存在するヒト抗体をも同時に不活化させる処理方法に関する。
【００３４】
本発明によって示される処理方法を用いることにより、検体中に存在するウイルス抗原は、プローブ、例えば抗体との免疫複合体を形成するのに適した状態でウイルス粒子または免疫複合体から遊離し、同時に検出反応を阻害する検体中に存在するヒト抗体をも同時に不活化させることにより、例えば抗体のようなプローブを用いた免疫測定法によって容易にかつ感度高く検出することが可能となる。
【００３５】
検出に用いるプローブ、例えば抗体はウイルスの抗原に特異的に結合するもので有り、一定の高い親和性を示し、反応系に加えた際に非特異反応などを誘発しないようなものであればかまわないが、実施例４に示す様に、一次反応に用いるプローブの一つはＨＣＶコア抗原のＣ端側を認識し結合できるものが含まれていることが好ましい。ここでＨＣＶコア抗原のＣ端側とは、配列番号２に示す配列の８１番目から１６０番目の配列、もしくはその一部をいう。さらにここにＨＣＶコア抗原のＮ端側に対するプローブが含まれていても良い。ここでＨＣＶコア抗原のＮ端側とは、配列番号２に示す配列１０番目から７０番目の配列、もしくはその一部をいう。
【００３６】
ここでプローブとは、マウス、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウシなどの実験動物を免疫して得られるポリクローナル抗体、免疫した個体から、脾臓細胞を分離し、ミエローマ細胞と融合させることによって得られるハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体、または脾臓細胞、血中白血球をＥＢウイルスによって不死化させた細胞の産生するモノクローナル抗体、ＨＣＶに感染しているヒトもしくはチンパンジーなどが産生している抗体；マウス、ヒトなどのイムノグロブリンのｃＤＮＡもしくは染色体ＤＮＡから得られる可変領域遺伝子断片、またはイムノグロブリンのｃＤＮＡもしくは染色体ＤＮＡの一部と人工的に作製した配列とを組み合わせることによって構成される可変領域遺伝子断片、人工的な遺伝子配列を用いて構成される可変領域遺伝子断片またはこれらを材料に遺伝子組換え手法によって作製される可変領域遺伝子断片を、イムノグロブリン定常領域遺伝子断片を組み合わせることによって構成される組換え抗体遺伝子によって形質転換された細胞が産生する組換え抗体；
【００３７】
上記の可変領域遺伝子断片と例えばバクテリオファージの構造蛋白質と融合させて作られるファージ抗体、上記の可変聴域遺伝子断片を他の適用な遺伝子断片例えばｍｙｃ遺伝子の一部などと組み合わせることにより構成される組換え抗体遺伝子によって形質転換された細胞が産生する組換え抗体、トリプシン分子に可変領域を人工的に導入することによって産生されるプローブ、レセプターなどの蛋白質に特異的に結合する分子を人工的に改変することによって得られるプローブ、その他コンビナトリアルケミストリー技術によって作製されたプローブなど、コア抗原に高い特異性、親和性を示す分子であればそれを用いることが出来る。
【００３８】
さらに本発明はウイルス抗原を含む検体から、上記のウイルスコア抗原とプローブ、例えば抗体との免疫複合体を形成するのに適した状態にするため、ウイルス粒子または免疫複合体から遊離し、同時に検出反応を阻害する検体中に存在するヒト抗体をも同時に不活化させる処理剤によって検体を処理する工程、遊離したコア抗原を例えば抗体のようなプローブを用いた免疫測定法によって検出並びに定量するアッセイ方法、並びに検査キットを提供する。
【００３９】
本発明によって示される検体処理剤と処理方法
本発明における検体には、全血、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液などの生物学的体液、および肝組織などが含まれる。
本発明においては、検体を煩雑な操作なく、プローブ例えばモノクローナル抗体と結合反応させるのに適した状態に検体中のコア抗原を処理する方法が最も重要な要件である。すなわち、抗原分子数を増加させるために、ウイルス粒子中などに含まれるコア抗原を効率よく遊離させることが重要になる。
【００４０】
既にＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によっても知られているように、ほとんどの蛋白質はＳＤＳ存在下の熱処理により変性し、共有結合によって結合している分子以外はモノマーになる。すなわち、測定検体にＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤を含む処理剤を添加すると、ウイルスを破壊すると同時に検体中の抗コア抗体をも変性させ、検体中のコア抗原を遊離させることが可能である。このことは、実施例７に示す様に、ＳＤＳを含む処理剤で処理した検体中のＨＣＶコア抗原を、ゲル濾過を用いた分子量解析にかけると、理論上から予想される単量体の位置に検出されることからも確認された。
【００４１】
また柏熊等（Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９０ ７９−８９，１９９６）によって報告されているように、組換えＨＣＶ発現細胞抽出液からなる検体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロット法によりＨＣＶコア抗原を検出すると、単量体と思われる分子量の位置にその免疫活性が検出される。ＳＤＳを含む変性剤を検体に加えることにより、抗原を効率よく遊離させ抗原分子数を増加させることができることはこの分野に属するものであれば容易に考え得る。
【００４２】
しかしながらよく知られているようにＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤は蛋白質変性作用が大きいため、その存在下でそのままプローブ、例えば抗体との免疫複合体形成反応に加えると、抗体をも変性させ、その機能を失わせ感度低下を導く。また、ＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤処理によってエピトープ構造が失われることが知られており、その結果として抗体の結合が弱められ、感度が低下する。これらの感度低下につながる影響を除くため、ＳＤＳ処理後何らかの方法で変性作用を弱める必要が有る。
【００４３】
陰イオン界面活性剤を含む界面活性剤は、例えば透析、限外濾過、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換法、沈殿法、膜転写法などにより除くことが出来ることが知られており、上記のようにウェスタンブロット法、ゲル濾過法により抗原が検出可能であることは、ＳＤＳ処理後、なんらかの操作を加えることにより抗原抗体反応を行なわせることが可能であることを示している。しかしながら、これらの処理を行なうことは、何れも時間と煩雑な操作を必要とするため本発明の目的に適した方法ではない。
【００４４】
また過剰量の反応液によって希釈することにより、変性作用を示さない濃度まで低下させることにより反応に影響を与えない様に出来るが、この方法では反応液が増加し、例えばマイクロタイターウェルを用いる測定方法などの加えるサンプル量に制約が有る免疫測定法に適用できないため、本発明の目的に適していないことは明らかである。
そこで本発明者は、陰イオン性界面活性剤を含む処理剤を添加し、さらに何らかの添加剤を加えることにより、陰イオン性界面活性剤による変性効果を、抗体などのプローブに影響を与えないように弱めることが出来ないか、また同時に陰イオン性界面活性剤によるＨＣＶコア抗原遊離作用を増強することができないかを検討した。
【００４５】
ここで本発明者は、ＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤以外の界面活性剤を含む処理剤を添加することにより、ＳＤＳの固相化抗体に対する変性作用を弱め、その結果ＳＤＳを含む処理剤のみと比較して、感度を上昇させることが出来ることを見いだした。また、ＳＤＳ等の陰イオン性界面活性剤を含む処理剤に、それ以外の界面活性剤や尿素などの水素イオン結合を弱める薬剤を同時に加えた処理剤とした場合にも、同様の効果を認めるとともに、ウイルス粒子からのＨＣＶコア抗原遊離および検体中抗コア抗原抗体の不活化を強くすることによって、ＨＣＶコア抗原の遊離がさらに増強されることを見いだした。さらにＳＤＳとその他の界面活性剤を含む処理剤を添加した後熱処理工程を行なうことにより、より高感度にＨＣＶコア抗原を検出できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【００４６】
ここで、検体の処理に用いる陰イオン性界面活性剤はＳＤＳ以外でも、セチル硫酸ナトリウムや他のアルキル化硫酸エステル、ドデシルスルホン酸ナトリウムのようなアルキル化スルホン酸塩、アルキルアリルスルホン酸塩などでも可能であり、陰イオン性界面活性剤以外に加える界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ（３−〔３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホン酸），ＣＨＡＰＳＯ（３−〔コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、ドデシル−Ｎ−ベタインなどの両イオン性界面活性剤やＴｒｉｔｏｎＸ１００などのポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル類、ＮＰ４０などのポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル類、Ｔｗｅｅｎ８０などのポリオキシエチレンソルビトールエステル類、Ｂｒｉｊ５８のようなポリオキシエチレンドデシルエーテル類、オクチルグルコシドといった非イオン性界面活性剤が適当で有り、好ましくはＣＨＡＰＳなどの両イオン性界面活性剤とＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００などの非イオン性界面活性剤を含む。また、ここに尿素、チオ尿素などの蛋白質の高次構造を壊す様な作用を示す薬剤（蛋白質変性剤）を加えることも効果的である。
【００４７】
処理の際の濃度は、ＳＤＳは０．５％以上、ＣＨＡＰＳは、０．１％以上、尿素は１Ｍ以上、ＴｒｉｔｏｎＸ１００は０．１％以上０．７５％以下で使用することがより好ましい。
以上のような検体の処理温度は、通常一般実験室で用いられている範囲である４℃以上１００℃以下であればよいが、非イオン性界面活性剤添加の場合は、その曇点に注意が必要である。好ましくは、３７℃以上であり、さらに血清の非働化に一般的に用いられている５０〜６０℃処理が効果的である。
【００４８】
本発明の処理方法を用いることにより、ＨＣＶと同様の構造を持つウイルス粒子を含む検体から、ウイルス抗原を、抗体などをプローブとして用いるいわゆる免疫測定方法に適した状態に遊離させることが出来ることは明らかである。ここでＨＣＶと同様の構造を持つウイルスとは、ゲノムＲＮＡ，ＤＮＡをパッキングする蛋白質と、それを取り囲む膜タンパク質と脂質膜から構成される構造を持つウイルス粒子を形成するウイルスであり、例えばＨＣＶの類縁のウイルスであるフラビウイルス類、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのレトロウイルスなどが含まれる。さらにゲノムとしてＤＮＡを持つものであっても同様の構造を持つものが含まれる。
【００４９】
さらに、ＲＮＡウイルスであるＨＣＶや、ＤＮＡウイルスであるＨＢＶはともにこれらのゲノムＲＮＡやＤＮＡを包む構造蛋白質と、それを取り囲む膜蛋白質や脂質膜からなる構造をもつウイルス粒子を形成するウイルスである。いずれの態様においても、本発明の処理法を用いることにより、ＨＣＶやＨＢＶだけでなく、これらと同じような構造をもつウイルス粒子を破壊して、ウイルスの抗原を十分に露出させ、その抗原を検出または測定することによりそのウイルスを検出または測定することをも提供する。
【００５０】
ヘモグロビンによる妨害の除去
測定用試料として血清等を使用する場合、該試料に含まれる赤血球が、前記の前処理の間に溶血してヘモグロビンが放出され、この変性ヘモグロビンが測定を妨害する場合がある。従って本発明の第一の態様においては、このような測定の妨害を除去することが好ましい。このための添加剤として、尿素、イミダゾール環含有化合物及びインドール環含有化合物の内少なくとも１種を添加するのが好ましいことを見い出した。
【００５１】
イミダゾール環含有化合物としてはイミダゾール、ヒスチジン、イミダゾールアクリル酸、イミダゾールカルボキシアルデヒド、イミダゾールカルボキサミド、イミダゾールジオン、イミダゾールジチオカルボン酸、イミダゾールジカルボン酸、イミダゾールメタノール、イミダゾリジンチオン、イミダゾリドン、ヒスタミン、イミダゾピリジン等が挙げられる。
【００５２】
また、インドール環含有化合物としては、トリプトファン、インドールアクリル酸、インドール、インドール酢酸、インドール酢酸ヒドラジド、インドール酢酸メチルエステル、インドール酪酸、インドールアセトニトリル、インドールカルビノール、インドールカルボキシアルデヒド、インドールカルボン酸、インドールエタノール、インドール乳酸、インドールメタノール、インドールプロピオン酸、インドールピルビン酸、インドリルメチルケトン、インドーマイシン、インドールアセトン、インドメタシン、インドプロフェン、インドラミン等が挙げられる。
【００５３】
添加量としては尿素は０．５Ｍ〜５Ｍの濃度が適当であり、インドールアクリル酸は５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度が適当であり、その他の添加物は０．０５Ｍ〜０．５Ｍの濃度が適当である。
【００５４】
ウイルス抗原の露出
本発明の第二の態様によれば、ウインドピリオドにおいて採取した試料中のウイルス抗原の検出方法に関し、この方法においてはウイルス抗原に対する抗体はまだ生成していないので、ウイルス粒子を破壊してウイルス抗原を露出させるだけで十分であり、試料中に存在する抗体を破壊する必要はない。従って、前に説明した試料の前処理は必要でなく、測定反応液中に、ウイルス抗原を露出するためのウイルス粒子破壊剤が存在すれば十分である。ここで述べるウイルス抗原とは、ウイルス粒子内部に存在する抗原を意味し、コア抗原はその代表である。
【００５５】
ウイルス粒子は、ゲノムである核酸とコア抗原が複合体を形成して粒子を形成し、その粒子を脂質膜とエンベロープタンパク質からなる外膜が覆った構造をしていると考えられているものが多い。さらに血液中では低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）やウイルスに対する抗体などとの複合体を形成して存在していると考えられている。そのため、血液中に存在するウイルス粒子のままでは、プローブは、ウイルス粒子内部に存在するコア抗原に代表されるウイルス抗原を認識し結合することが出来ない。故にコア抗原を検出するためには、コア抗原を取り囲むこれらの構造物を除去するなどの処理をして、コア抗原がプローブに認識されるようにする必要がある。
【００５６】
すなわち本発明においては、検体中に含まれるウイルス粒子中のコア抗原を、コア抗原を認識するためのプローブが認識できるように露呈させる反応条件、反応させる系からなる反応方法、および反応させる系を含む試薬をも提供する。
本発明が提供する系における抗原検出に適した反応系とは、ウイルス抗原エピトープに対する抗体の機能を失わせない程度のマイルドな条件でありながら、検体中に存在する複雑な構造体であるウイルス粒子から、ウイルス抗原を認識するプローブである抗体の認識する領域を十分に露呈させる条件からなる系である。
【００５７】
すでに超遠心法にて分離したウイルス粒子（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，７３：６６７−６７２））、ポリエチレングリコールによって凝集沈殿させたＨＣＶ粒子をＴｗｅｅｎ８０やＴｒｉｔｏｎＸ１００の様な非イオン性の界面活性剤によって処理することにより（Ｋａｓｈｉｗａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ：１９０：７９−８９）、コア抗原が検出可能であることが示されているが、前者においてはその検出感度が不十分であり、十分に抗原が露呈されているかは疑問である。また後者においては他の処理剤を加えることにより抗体を失活させており、界面活性剤の効果そのものについては触れられていない。
【００５８】
本発明においては、始めに界面活性剤を基本に条件を検討し、反応液を界面活性剤を中心とした組成にすることにより、すでに報告されているＨＣＶ抗原検出系のように、遠心操作や加熱などの操作からなる前処理法を適用することなく、単に反応液中で検体を希釈することのみにより、ウイルスパーティクル中の抗原を効率良く検出することが可能となった。
効果的にウイルス粒子中からコア抗原を抽出し、かつ血清中の様々な物質との相互反応を抑制し、効率よくプローブと抗原とが反応できる条件を与えることが必要である。この際の効果的な界面活性剤としては、炭素原子数１０個以上のアルキル基と第２、第３もしくは第４級アミンを同一分子内に有する界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００５９】
前記アルキル基と第２、第３又は第４アミンを有する界面活性剤において、アルキル基は好ましくは直鎖アルキル基であり、その炭素原子数は好ましくは１０個以上、さらに好ましくは１０〜２０個である。アミンとしては第３級アミン又は第４級アミン（アンモニウム）が好ましい。具体的な界面活性剤としては、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、セチルトリメチルアンモニウム塩、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸、３−（テトラデシルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸、ドデシルピリミジウム塩、セチルピリジウム塩、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０）、ドデシル−Ｎ−ベタイン等が挙げられる。ドデシル−Ｎ−サルコシン酸及びドデシルトリメチルアンモニウム塩が好ましい。
【００６０】
前記の非イオン性界面活性剤としては１２〜１４の間の親水疎水比を有するものが好ましく、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル類、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１１４など、あるいはポリオキシエチレンノニファニルエーテル類、例えばＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、Ｎｉｋｋｏｌ ＮＰ等が好ましい。
本発明においては、上記２つのタイプの界面活性剤を単独で用いてもよいが、併用するのが一層好ましく、併用により相乗効果が得られる。
さらに、尿素など、水環境を変化させるような因子を加えてもよい。
【００６１】
本発明によって示されるプローブとしてのモノクローナル抗体
本発明でいうＨＣＶの構造蛋白質遺伝子断片とは、ＨＣＶの構造蛋白質遺伝子のコア領域を含む遺伝子断片であり、少なくともＨＣＶのＮ末端の１番目から１６０番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片である。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片である。
【００６２】
本発明でいうＨＣＶ抗原活性を有するポリペプチドとは、抗ＨＣＶ抗体と免疫学的に反応する融合ポリペプチドもしくはポリペプチドを意味し、本発明のハイブリドーマならびにそれから得られるモノクローナル抗体の作製に利用するための抗原として用いることができる。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＶ抗原活性を有する融合ポリペプチドもしくは配列番号１のアミノ酸配列の一部を含むＨＣＶ抗原活性を有するポリペプチドであり、そのＮ末端あるいはＣ末端に余分なアミノ酸配列が付加されたものであってもよい。
【００６３】
本発明の上記融合ポリペプチドならびに配列番号３〜６に示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対するモノクローナル抗体類は、当業者により容易に作製することができる。ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の作製は良く知られている。例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスなどの腹腔内あるいは皮内に、上記融合ポリペプチドもしくはポリペプチド（以下、本抗原）を単独もしくはＢＳＡ，ＫＬＨなどと結合させた抗原として、単純あるいはフロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で、追加免疫として本抗原を尾静脈内に投与し、無菌的に脾臓を摘出した後、適当なマウス骨髄腫細胞株と細胞融合し、ハイブリドーマを得る。本方法は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従って行なうことができる。
【００６４】
上記方法により得られたハイブリドーマ細胞株を適当な培養液中で培養し、その後、本抗原に対して特異的な反応を示す抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を選択してクローン化する。抗体産生ハイブリドーマのクローニングには限界希釈法のほか軟寒天法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６）などを利用することができる。そして、産生されたモノクローナル抗体をプロテインＡなどを用いたカラムクロマトグラフィーなどの方法により精製する。
上記のモノクローナル抗体以外にもプローブとして用いる分子は作製することが出来る。例えば組換え抗体についてはＨｏｏｇｅｎｂｏｏｎの総説などに詳しく記載されている（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：６２−７０，１９９７）。
【００６５】
プローブを用いた検出系
本発明に従って調製されたモノクローナル抗体は、ウイルス構造蛋白質の検出および定量用に、エンザイム−リンクイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノドットアッセイ、ラジオイムノアッセイ、凝集に基づいたアッセイ、あるいは他のよく知られているイムノアッセイ法で検査試薬として用いることができる。また、検出に標識化抗体が使用される場合は、標識化合物としては例えば蛍光物質、化学発光物質、放射性物質、酵素、染色物質などが使用される。
【００６６】
例えば、検体（血清）中のウイルス抗原を検出するためにサンドイッチ反応系を原理とした方法を用いる場合、使用すべき診断キットは、固体支持体（例えばマイクロタイターウェルの内壁）に被覆された本発明の１種類以上のモノクローナル抗体および標識物質と結合させた１種類以上のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む。固体支持体に固相化するモノクローナル抗体および標識するモノクローナル抗体の組み合わせは自由であり、高感度の得られる組み合わせを選択できる。
【００６７】
使用できる固体支持体としてはポリスチレンやポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリビニール製のマイクロタイタープレート、試験管、キャピラリー、ビーズ（ラテックス粒子や赤血球、金属化合物など）、膜（リポソームなど）、フィルターなどが挙げられる。
【００６８】
【発明の効果】
本発明により示される方法により、抗体などをプローブとして検出するいわゆる免疫測定方法に適した状態に、ウイルス粒子から簡便にウイルス抗原を遊離させることが可能となる。また本発明によって示される方法によってウイルス粒子を含む検体を処理することにより、抗体などをプローブとして抗原を検出するいわゆる免疫測定方法により、ウイルス抗原を簡便にかつ感度よく検出、及び定量することが可能となる。また本発明によって示される検体処理方法を用いた免疫測定方法を用いた、検体中のウイルスの有無を判別するキット、定量するキット及び診断薬を作製することが可能となる。
【００６９】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例証するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１．ＨＣＶ由来ポリペプチドの発現および精製
（Ａ）発現プラスミドの構築
ＨＣＶのコア領域に相当する発現プラスミドは以下の方法で構築した。Ｃ１１−Ｃ２１クローンおよびＣ１０−Ｅ１２クローン（特開平６−３８７６５）をｐＵＣ１１９に組み込んで得られたプラスミドｐＵＣ・Ｃ１１−Ｃ２１およびｐＵＣ・Ｃ１０−Ｅ１２の各ＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１ｍＭ ジチオスレイトール、１００ｍＭ ＮａＣｌ，１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＣｌａＩ酵素〕中、および〔１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭ ＮａＣｌ，１５単位のＣｌａＩおよび１５単位のＫｐｎＩ酵素〕中で各々３７℃１時間消化し、その後０．８％アガロースゲル電気泳動を行ない、約３８０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片および約９２０ｂｐのＣｌａＩ−ＫｐｎＩ断片を精製した。
【００７０】
この２つのＤＮＡ断片とｐＵＣ１１９をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化したベクターに１０×リガーゼ用緩衝液〔６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６６ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１００ｍＭジチオスレトール、１ｍＭ ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ １μｌ（３５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温し、連結反応を行なった。このプラスミドを用い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、プラスミドｐＵＣ・Ｃ２１−Ｅ１２を得た。
【００７１】
このプラスミドｐＵＣ・Ｃ２１−Ｅ１２ ＤＮＡ１ｎｇを２つのプライマー（５′−ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＧＡＡＴＣＣＴＡＡＡ−３′（配列番号：７），５′−ＴＴＡＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣ−３′（配列番号：８））を用いＰＣＲを行なった。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐＴＭ （ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ製）のキットを用いＤＮＡ変性９５℃１．５分、アニーリング５０℃２分、ＤＮＡ合成７０℃３分の条件で行ない、得られたＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、グラスパウダー法（Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ）で精製した。
【００７２】
一方、ｐＵＣ１９を制限酵素ＳｍａＩで消化し、ＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ断片を１０×リガーゼ用緩衝液〔６６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６６ｍＭ ＭｇＣｌ２，１００ｍＭジチオスレトール、１ｍＭ ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ １μｌ（３５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温し、連結反応を行なった。このプラスミドを用い大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、プラスミドｐＵＣｌ９・Ｃ２１−Ｅ１２・ＳｍａＩを得た。
【００７３】
このプラスミドＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔１５０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃１時間消化反応を行ない、その後０．８％アガロースゲル電気泳動を行ない、約４９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を分離し、これをグラスパウダー法で精製した。
【００７４】
次に発現ベクターであるＴｒｐ・ＴｒｐＥ（特開平５−８４０８５）のＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔１５０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃で１時間消化し、その反応液に水３９μｌを加え、７０℃で５分間熱処理した後にバクテリアアルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）１μｌ（２５０単位／μｌ）を加えて３７℃で１時間保温した。
【００７５】
この反応液にフェノールを加えてフェノール抽出を行ない、得られた水層をエタノール沈殿し、沈殿物を乾燥した。得られたＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ処理ベクターＤＮＡ１μｇと上述のコア１４０断片を１０×リガーゼ用緩衝液〔６６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６６ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１００ｍＭジチオスレトール、１ｍＭ ＡＴＰ〕５μｌ，Ｔ４リガーゼ １μｌ（３５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温し、連結反応を行なった。
【００７６】
この反応液の１０μｌを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。形質転換に用いる感受性大腸菌株は塩化カルシウム法〔Ｍａｎｄｅｌ， Ｍ．とＨｉｇａ， Ａ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５３， １５９−１６２ （１９７０） 〕により作られる。形質転換大腸菌を２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート（１％トリプトン、０．５％ＮａＣｌ，１．５％寒天）上に塗布し、３７℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌のコロニーを１白金耳取り、２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に移し、一晩３７℃で培養した。１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法〔Ｍａｎｎｉａｔｉｓ ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （１９８２）〕により行なった。
【００７７】
得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを制限酵素反応液２０μｌ〔１５０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６ｍＭ ＭｇＣｌ２ ，１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中で３７℃、１時間消化し、アガロースゲル電気泳動を行なって、約４９０ｂｐのＥｏｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片が生じるＴｒｐ・ＴｒｐＥコア１６０発現プラスミドを選別した。
【００７８】
（Ｂ）クローンコア１６０でコードされるポリペプチドの発現および精製
発現プラスミドＴｒｐ・ＴｒｐＥコア１６０をもつ大腸菌ＨＢ１０１株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌの２ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で９時間培養する。この培養液１ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＭ９−ＣＡ培地（０．６％Ｎａ２ ＨＰＯ４ ，０．５％ＫＨ２ ＰＯ４ ，０．５％ＮａＣｌ，０．１％ＮＨ４ Ｃｌ，０．１ｍＭ ＣａＣｌ２ ，２ｍＭ ＭｇＳＯ４ ，０．５％カザミノ酸、０．２％グルコース）に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３の時に終濃度４０ｍｇ／ｌになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに１６時間培養した。この培養液を遠心分離して菌体を集めた。
【００７９】
菌体に２０ｍｌの緩衝液Ａ〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ，３０ｍＭ ＮａＣｌ〕を加えて懸濁し、再び遠心分離を行なって発現菌体２．６ｇを得た。得られた菌体を緩衝液Ａ １０ｍｌ中に懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を破砕した後に遠心分離を行ない、ＨＣＶ ｃＤＮＡでコードされるポリペプチドとＴｒｐＥの融合ポリペプチドを含む不溶性画分を得た。その画分に１０ｍｌの６Ｍ尿素を含む緩衝液Ａを加えて融合ポリペプチドを可溶化抽出した。可溶化した抽出物をＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたイオン交換カラムクロマトグラフィーにかけて、融合ポリペプチドの精製を行なった。
【００８０】
実施例２．ハイブリドーマの作製法
前記方法により調製した融合ポリペプチド（ＴｒｐＣ１１）を６Ｍ尿素溶解後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）に終濃度が０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌとなるように希釈し、等量のアジュバント（タイターマックス）と混和し、ＴｒｐＣ１１懸濁液とした。ＴｒｐＣ１１濃度が０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌとなるように調製した該懸濁液を４〜６週令のＢＡＬＢ／ｃ系マウスに腹腔内投与した。２週間ごとに同様の免疫を行いさらに約２週間後、生理食塩水に溶解したＴｒｐＣ１１ １０μｇを尾静脈内に投与した。
【００８１】
最終追加免疫後３日目に、この免疫動物より無菌的に脾臓を摘出し、ハサミで切片としてさらにメッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０Ａｇ１４を前記と同様に洗浄後、該細胞２．５６×１０７ 個と脾臓細胞１．６４×１０８ 個を５０ｍｌ容の遠心管に入れ混合した。２００×ｇ、５分間遠心分離を行ない、上清を除去し、３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００（メルク社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌを加え、さらにＲＰＭＩ−１６４０培地１０ｍｌを加えて細胞融合させた。
【００８２】
融合細胞は、遠心分離（２００×ｇ、５分間）によってＰＥＧを除いた後、９６ウエルプレートを用いて、１０％ウシ胎児血清ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（以下、ＨＡＴと省略）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で約１０日間培養してハイブリドーマのみを増殖させた。その後、目的の抗体を産生するクローンをＥＬＩＳＡ法により検索し、所望の反応特異性を有する本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。
【００８３】
得られたハイブリドーマについて、常法の限界希釈法に従い、単一クローン化を行ない、得られたハイブリドーマをＨＣ１１−１４，ＨＣ１１−１０、およびＨＣ１１−３、およびＨＣ１１−７と命名した。該４種類のハイブリドーマは、工業技術院生工学工業技術研究所に平成９年７月４日付でそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ−６００６，ＦＥＲＭ ＢＰ−６００４，ＦＥＲＭ ＢＰ−６００２及びＦＥＲＭ ＢＰ−６００３として寄託された。
【００８４】
実施例３．モノクローナル抗体の作製法
実施例２に記載の方法により得られたハイブリドーマをプリスタン等で処理したマウス腹腔に移植し、腹水中に産生されてくるモノクローナル抗体を取得した。該モノクローナル抗体の精製は、プロテインＡを結合させたセファロースカラムによりＩｇＧフラクションを分離した。
【００８５】
前記５種類のハイブリドーマから産生されたそれぞれのモノクローナル抗体、Ｃ１１−１４，Ｃ１１−１０，Ｃ１１−７およびＣ１１−３のアイソタイプは、ウサギ抗マウスＩｇ各アイソタイプ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を用いたイムノアッセイにより、Ｃ１１−１０，Ｃ１１−７がＩｇＧ２ａ，Ｃ１１−１４，Ｃ１１−３がＩｇＧ１であることが明らかとなった。得られた４種類のモノクローナル抗体について、ＨＣＶ・コア領域由来の配列によって合成した２０アミノ酸からなる合成ペプチドを用いてエピトープ解析を行なった結果、表１に示す如くコア領域の一部を特異的に認識するモノクローナル抗体であることがわかった。
【００８６】
【表１】
実施例４．検体処理条件検討
１）ＳＤＳ濃度検討
健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌに、種々の濃度に溶解したＳＤＳと０．６％ＣＨＡＰＳを含んだ処理液を１００μｌ添加した。５６℃に設定している保温箱に入れて３０分間処理をおこない、その８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時のＳＤＳ濃度をとり、図１に示した。
【００８８】
２）ＣＨＡＰＳ濃度検討
健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌに、種々の濃度に溶解したＣＨＡＰＳと５％ＳＤＳを含んだ処理液を１００μｌ添加した。５６℃に設定している保温箱に入れて３０分間処理をおこない、その８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時のＣＨＡＰＳ濃度をとり、図２に示した。
【００８９】
３）尿素濃度検討
健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌに、種々の濃度に溶解した尿素を含んだ処理液（５％ＳＤＳ，０．６％ＣＨＡＰＳ）を１００μｌ添加した。５６℃に設定している保温箱に入れて３０分間処理をおこない、その８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時の尿素濃度をとり、図３に示した。
【００９０】
４）ＴｒｉｔｏｎＸ１００濃度検討
健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌに、種々の濃度に溶解したＴｒｉｔｏｎＸ１００を含んだ処理液（５％ＳＤＳ，０．６％ＣＨＡＰＳ，６Ｍ尿素）を１００μｌ添加した。５６℃に設定している保温箱に入れて３０分間処理をおこない、その８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法による結果を、横軸に処理反応時のＴｒｉｔｏｎＸ１００濃度をとり、図４に示した。
【００９１】
５）反応温度検討
健常人血清およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性血清１００μｌに、処理液（５％ＳＤＳ，０．６％ＣＨＡＰＳ，６Ｍ尿素、０．７５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を１００μｌ添加した。４℃、室温（２３℃）、３７℃，４５℃，５６℃，７０℃で３０分間処理をおこない、その８０μｌを測定試料とした。以下に記す測定法を用いて検討した結果を図５に示した。
【００９２】
測定法
血清処理法の検討で得られた試料は各々以下の測定法を用いて評価した。すなわち、抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（抗体Ｃ１１−３とＣ１１−７の等量混合）を終濃度が計６μｇ／ｍｌになるように０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社製）１ウエルにつき１００μｌずつ分注した。４℃で一晩静置後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）０．３５ｍｌを用いて２回洗浄し、０．５％カゼイン−Ｎａを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３５）（以下ブロッキング液）、０．３５ｍｌを添加し、さらに室温で２時間静置した。
【００９３】
ブロッキング液除去後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１％ＢＳＡ，０．５％カゼイン−Ｎａ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）１６０μｌと各々の血清処理法で得られた測定試料をそれぞれのウエルに加え、室温で２時間反応させ、洗浄液３００μｌで５回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識したモノクローナル抗体（Ｃ１１−１０とＣ１１−１４の等量混合）１００μｌを添加して室温で３０分間反応させた。反応後、上記洗浄液３００μｌで５回洗浄し、基質（オルトフェニレンジアミン、以下ＯＰＤ）溶液１００μｌを加え室温で３０分間反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌを添加し、波長６３０ｎｍの吸光度を対照として波長４９２ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４９２）を測定した。
【００９４】
図１〜４から、各々の処理条件の最適化が行われたが、未処理検体ではコア抗原の検出が困難であったが、このような簡易な処理を行うことによって、劇的にコア抗原の検出が可能となった。特に、処理反応時のＳＤＳ濃度は０．５％以上で、ＣＨＡＰＳ濃度は０．１％以上で、尿素濃度は１Ｍ以上で、ＴｒｉｔｏｎＸ１００濃度は０．１〜０．７５％で使用することで、４℃から７０℃の範囲で、良好にコア抗原を検出できることが示された。
【００９５】
実施例５．構造領域コア抗原の検出および測定法（１）
血清１００μｌに、処理液（５％ＳＤＳ，０．６％ＣＨＡＰＳ，６Ｍ尿素、０．７５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を１００μｌ添加した。５６℃に設定している保温箱に入れて３０分間処理をおこない、その１２０μｌを測定試料とした。
抗ＨＣＶコア抗原モノクローナル抗体（Ｃ１１−３とＣ１１−７等量混合）を終濃度が計６μｇ／ｍｌになるように０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社製）１ウエルにつき１００μｌずつ分注した。４℃で一晩静置後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｎＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）０．３５ｍｌを用いて２回洗浄し、ブロッキング液０．３５ｍｌを添加し、さらに室温で２時間静置した。
【００９６】
ブロッキング液を除去後、反応緩衝液１２０μｌと前述した処理法で得た測定試料をそれぞれのウエルに加え、室温で２時間反応させた。洗浄液３００μｌで５回洗浄し、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識したモノクローナル抗体（Ｃ１１−１０とＣ１１−１４：等量混合）１００μｌを添加して室温で３０分間反応させた。洗浄液３００μｌで５回洗浄し、基質（ＯＰＤ）溶液１００μｌを加え室温で４５分間反応させた後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌを添加し、波長６３０ｎｍの吸光度を対照として波長４９２ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４９２）を測定した。尚、標準血清として、パネル血清５０を１Ｕ／ｍｌとして、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で段階的に希釈したものについて同様に処理をおこない測定した。
【００９７】
図６に、標準血清として使用したパネル血清５０の希釈直線を示した。試料中コア抗原が濃度依存的に測定されており、約０．５ｍＵ／ｍｌの検出が可能であった。すなわち、本発明の極めて簡易な検体処理法とモノクローナル抗体を組み合わせて用いることにより、ＨＣＶコア抗原を検出または定量できることが明らかとなった。
【００９８】
実施例６．ＨＣＶ構造領域コア抗原の検出および定量（２）
アルカリフォスファターゼ標識モノクローナル抗体を用いた方法
固相担体として９６ウエル黒マイクロプレート（ヌンク社）を、標識抗体としてアルカリフォスファターゼ標識モノクローナル抗体を、基質としてＣＤＰｓｔａｒ（増感剤としてエメラルドＩＩ）を使用した。標準血清として使用したパネル血清５０の希釈直線を図７に示したが、試料中コア抗原が濃度依存的に測定されており、約０．５ｍＵ／ｍｌの検出が可能であった。このアルカリフォスファターゼ標識モノクローナル抗体を用いた測定法を用いても、ＨＣＶコア抗原を検出または定量できることが明らかとなった。
【００９９】
実施例７．血清処理と測定法で認識されている分子形の解析
パネル血清１３の０．２５ｍｌを各々の血清処理法で処理し、ゲルロカカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ，１ｘ３０）で分画し、それらのフラクション中の抗コア免疫活性を測定し、その結果を図８に示した。分子量約２０〜３０ｋＤａの分子を認識していると考えられ、ウイルス中のコア抗原は前述した前処理によって、ウイルス破壊および血清中に存在する抗コア抗体の不活化により、遊離されていることが示された。
【０１００】
実施例８．血清試料中のＨＣＶ構造領域コア抗原の測定法
ＰＣＲ法であるアンプリコアＨＣＶモニターキット（ロッシュ社）を用いて、ＨＣＶ−ＲＮＡ量が１０３ 〜１０７ コピー／ｍｌと測定された血清と健常人血清を用い、前述の方法で、血清中のＨＣＶコア抗原の定量を行なった。
また、標準血清として、パネル５０血清（１Ｕ／ｍｌと設定）を１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）にて段階的に希釈し、同様に処理したものを用い、表２にその測定結果を示した。今回測定した検体のうち、健常人検体は全て検出限界以下であり、ＰＣＲ法陽性例の全てを検出できた。このときの相関性を図９に示したが、ＰＣＲ法との相関係数も０．８以上となり高い相関性を示した。
【０１０１】
【表２】
実施例９．溶血血清による感度低下を抑えるための添加剤の検討
血清成分の感度に与える影響を検討したところ、ヘモグロビンを加えると著しく感度が低下することが確認された。ＳＤＳ，ＣＨＡＰＳ又はＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む前処理剤による前処理により、ヘモグロビンが変性し、遊離したヘムの影響である可能性が考えられた。そこで変性ヘモグロビンの影響を軽減することのできうる添加剤を検討した。
【０１０３】
ＨＣＶコア抗原陽性血清（パネル血清Ｎｏ３）に、高濃度ヘモグロビン（国際試薬製：干渉チェック）を添加してモデル検体を作製し、前述の前処理剤に尿素を添加して、実施例６に準じてコア抗原測定をおこない、尿素の添加効果を検討した。コントロールとしたヘモグロビン無添加群のコア抗原活性量を１００％としたときの４３０ｍｇ／ｄｌヘモグロビン添加群のコア抗原活性量を表３にあらわした。尿素無添加のときのヘモグロビン添加群のコア抗原活性量は約３０％に減少したが、添加尿素量の増加により、ヘモグロビン添加群のコア抗原活性量が増加し、ヘモグロビンによる干渉作用が減じていることが確認された。
【０１０４】
【表３】
一方各種アミノ酸と、ヘムとの相互作用や、アミノ基やカルボキシル基による緩衝能効果も考えられたため、各種アミノ酸を添加し、その効果を調べた。結果を表４に示した。
【０１０６】
【表４】
干渉の抑制効果がもっとも認められたものはトリプトファン及びヒスチジンであった。これらの干渉抑制効果の濃度依存性を検討した結果を表５に示した。
【０１０８】
【表５】
ヘムはヘモグロビン中でヒスチジンの側鎖により配位され、ヘモグロビン中に保持されていることから、この効果は側鎖によるものであることが示唆された。そこでヒスチジンの側鎖であるイミダゾール、トリプトファンの側鎖であるインドール環を含むインドールアクリル酸の効果を検討した。結果を表６に示した。
【０１１０】
【表６】
インドール、およびインドールアクリル酸を反応液中に加えた場合、アミノ酸を加えた場合と同様に濃度依存的なヘモグロビンの干渉抑制効果が認められた。このことから反応液にイミダゾール環を含む物質、たとえばヒスチジンまたはインドール環を含む物質、たとえばトリプトファンを加えることにより、ヘモグロビンを含む検体でも感度良くコア抗原を検出できることが分かった。
上記の各種添加剤を組み合わせた場合の効果を検討した。結果を表７に示した。ヒスチジンとトリプトファンを組み合わせることにより、９０％以上回復し、尿素を組み合わせることによりさらに検出感度が上昇した。
【０１１２】
【表７】
実施例１０．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コア抗原の検出
前記種々の実施例に記載の処理法が、他のウイルス中の構造蛋白質の検出に応用可能かどうか検討した。
ＨＢＶコア抗原に対するモノクローナル抗体（特殊免疫研究所）を３μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈して、９６ウエルマイクロプレートに１００μｌずつ分注した。４℃で一晩静置した後、りん酸緩衝液で洗浄し、１％ＢＳＡ溶液を３５０μｌずつ分注した。室温で２時間静置したのち、１％ＢＳＡ溶液を吸引除去し、反応液２００μｌを添加した。
【０１１４】
組換えＨＢＶコア抗原をスタンダードとして用い、Ｂ型肝炎と診断され、ＨＢｅ抗原が陽性で抗ＨＢｅ抗体が陰性である患者血清５例と健常人血清１０例を検体として用いた。検体１００μｌに、処理試薬（７．５％ＳＤＳ，０．７５％ＣＨＡＰＳ，０．１５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を５０μｌ添加し５６℃で３０分間処理した。処理後、その５０μｌを反応液が満たされたウエルに添加し、室温で９０分間反応させた。
【０１１５】
比較（前処理無し）として、各サンプル１００μｌに精製水５０μｌで希釈しその５０μｌを反応に用いた。洗浄液で５回洗浄後、ビオチン標識抗ＨＢＶコアモノクローナル抗体（ＨＢｃ−２，ＨＢｃ−５，ＨＢｃ−１４等量混合）を添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄後、アビジン標識アルカリフォスファターゼを添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄後、ＣＤＰｓｔａｒ（増感剤としてエメラルドＩＩを使用）を添加し、室温で１５分間反応させ、その相対発光強度を測定した。
【０１１６】
段階的に希釈した組換えＨＢＶコア抗原の標準曲線を図１０に示し、測定されたサンプル中のコア抗原量を表８に示した。検出限界は、２１ｎｇ／ｍｌで、コア抗原陽性と陰性を振り分けるカットオフ値は６０ｎｇ／ｍｌとしたところ、健常人血清では、１０例全て前処理、無前処理どちらにおいてもコア抗原は陰性となり、Ｂ型肝炎患者血清においては、無前処理では検出されなかったが、前処理をおこなうことにより全例でコア抗原が陽性と判定された。
【０１１７】
Ｂ型肝炎患者血清においては、前処理によって、ウイルス粒子の破壊および抗ＨＢｃ抗体が不活化され、検出可能になったと考えられる。以上のように、ＨＣＶのみならず、ゲノムとしてＤＮＡをもつたとえばＨＢＶなどのウイルスの構造蛋白質を検出する際においても、この検体前処理は有用であることが確認された。ＨＣＶの類縁のウイルスであるフラビウイルス類、ＨＩＶなどのレトロウイルスにおいても同様のことが推察できることはいうまでもない。
【０１１８】
【表８】
実施例１１．抗原を前処理操作なしで効率的に検出させるための方法
ＨＣＶを含む検体を界面活性剤を加えた反応液に希釈し、ＨＣＶコア抗原の検出される効率を検討した。
なおＨＣＶコア抗原の検出は、ＨＣＶコア抗原に対するモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）で行った。実施例３で得られたモノクローナル抗体のうち、Ｃ１１−３とＣ１１−７をコア抗原を補足する抗体として用い、Ｃ１１−１０及びＣ１１−１４を補足されたコア抗原を検出するための抗体として用いた。
【０１２０】
ＥＩＡは基本的には以下の条件で行った。モノクローナル抗体Ｃ１１−３及びＣ１１−７を酢酸緩衝液にそれぞれ４μｇ／ｍｌとなるよう希釈した溶液をミクロタイタープレートに加え、４℃一夜保温した。燐酸緩衝液で洗浄し１％ＢＳＡを含む燐酸緩衝液を加えることによるブロッキング操作を施した。そこに反応液１００μｌ、検体１００μｌを加え、撹拌後、室温で１．５時間反応させた。低濃度の界面活性剤を加えた燐酸緩衝液で洗浄することにより未反応物を除いた後、アルカリフォスファターゼで標識したモノクローナル抗体Ｃ１１−１０及びＣ１１−１４を加え、室温３０分反応させた。
【０１２１】
反応終了後、未反応物を低濃度の界面活性剤を加えた燐酸緩衝液で洗浄することにより除き、基質液（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ／ｅｍｅｒａｌｄｌｌ）を加え室温２０分反応後、発光量を測定した。
前記反応液中に各種界面活性剤を加えその効果を検討した。ＨＣＶに対する抗体の力価が検出感度以下であり、ほとんどＨＣＶに対する抗体を含まないと考えられるＨＣＶ抗原陽性血清を用いて、発光量の多寡によるコア抗原活性を健常人血清の発光量を１．０としたときの、それに対する反応比で表わした。その結果を表９及び表１０に示す。
【０１２２】
【表９】
【表１０】
この結果から、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００に代表されるように、ＨＬＢ値が１２〜１４間を示す非イオン性界面活性剤の添加により、ＨＣＶ抗原陽性血清では、健常人血清と比較して発光量が増大し、検出感度が上昇することが判明した。また、同様にドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウムやドデシルトリメチルアンモニウムに代表されるように、炭素原子数１０個以上の直鎖アルキル基と第２、第３又は４級アミンを同時にその構造にもつ界面活性剤の添加により、ＨＣＶ抗原陽性血清における検出感度が上昇することも判明した。炭素数８以下のアルキル基をもつ前記界面活性剤はこのような感度上昇効果は認められなかった。また、これらの２種類の界面活性剤を混合（表８では２％ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウムと２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を混合）添加することにより、さらにＨＣＶ抗原陽性血清における検出感度が上昇することも判明した。
【０１２５】
実施例１２．ＨＣＶ感染後の抗ＨＣＶ抗体出現前（ウインドピリオド期）の検体中のコア抗原検出
市販セロコンヴァージョンパネルＰＨＶ９０５（Ｂ．Ｂ．Ｉ．ｉｎｃ．）を、一次反応液中に２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００及び２％のドデシルＮ−サルコシン酸ナトリウムを添加し、実施例１１に準じて測定した。ここで用いたＰＨＶ９０５パネルは、観察開始後２１日目（血清Ｎｏ．ＰＨＶ９０５−７）に抗ＨＣＶ抗体検査（オルソＥＩＡ．３．０）で陽転化を示したものであり、その抗体価はカットオフインデックス（Ｓ／ＣＯ）で表され、１．０以上が陽性と判定される。ＨＣＶコア抗原活性（発光量）は、健常人血清の発光量を１．０として、それに対する比率（Ｓ／Ｎ）で表した。
【０１２６】
表１１に示したように、まだ抗ＨＣＶ抗体が陽性となる前にコア抗原活性が認められ、この界面活性剤の添加により、ウイルス粒子からコア抗原性が露呈し、固相化されたモノクローナル抗体と反応し、検出できていることが確認された。
【０１２７】
【表１１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】検体処理においてＳＤＳ添加濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，５０を使用した。
【図２】検体処理においてＣＨＡＰＳ添加濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，５０を使用した。
【図３】検体処理において尿素添加濃度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，４４，５０を使用した。
【図４】検体処理におけるＴｒｉｔｏｎＸ１００添加温度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，４４，５０を使用した。
【図５】検体処理中の温度による効果を検討した結果を示す図である。健常人血清（ｎｏｒｍａｌ）およびＨＣＶ−ＲＮＡ陽性パネル血清１３，４４，５０を使用した。
【図６】標準血清のパネル血清を５０を１Ｕ／ｍｌとして段階的に希釈し、検体処理した試料を本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ反応系の希釈検量線と検出感度を示す図である。
【図７】標準血清のパネル血清５０を１Ｕ／ｍｌとして段階的に希釈し、検体処理した試料をサンドイッチイムノアッセイ反応系で測定したときの希釈検量線と検出感度を示す図である。基質に発光物質を用いている。
【図８】パネル血清１３を、検体処理をおこなってから、ゲルロカカラムを用いて分画し、その分画中のコア抗原免疫活性を測定したものである。分子量は、ＩｇＧは約１５０ｋＤ、アルブミンは約６８ｋＤである。
【図９】ＰＣＲ陽性検体を、本発明の検体処理後その遊離したコア抗原活性を測定した値とアンプリコアＨＣＶモニター（ＰＣＲ法）で求めたＨＣＶ−ＲＮＡ量との相関性を示す図である。
【図１０】組換えＢ型肝炎（ＨＢＶ）コア抗原を本発明の方法により測定した場合の標準曲線を示す。
Claims (5)
- Ｃ型肝炎ウイルスコア抗原の測定方法であって、
（１）Ｃ型肝炎ウイルスのコア抗原を含む検体を、炭素原子数 10 個以上のアルキル基と第３又は第４級アミンとを有する界面活性剤の存在下で、該抗原に対するプローブと結合させる工程、および
（２）結合した該抗原を検出する工程
を含む方法。 - 前記アルキル基と第３又は第４級アミンとを有する界面活性剤が、炭素原子数10〜20個のアルキル基と第３又は第４級アミンとを有する界面活性剤である、請求項１に記載の方法。
- 前記界面活性剤が両イオン性界面活性剤である、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記第３又は第４級アミンを有する界面活性剤が、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸、セチルもしくはドデシルトリメチルアンモニウム塩、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸、ドデシルピリミジウム塩、又はデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（MEGA−10）である請求項１に記載の方法。
- 前記抗原に対するプローブが、Ｃ型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
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