JP2011106834A - 免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】競合イムノアッセイを含むＨＢｃ抗体の免疫測定において、ＨＢｃ抗原中のＨＢｃ抗体との結合部位をブロックして免疫反応を妨害する妨害物質の影響を可能な限り抑制すること。
【解決手段】Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原とそれに対する抗体との免疫反応を用いて生物学的試料中のＢ型肝炎ウイルスコア抗原又はそれに対する抗体を測定する免疫測定法において、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原を予めタンパク質変性剤によって処理することにより、前記課題を解決する。
【選択図】なし

Description

本願発明は、生体由来試料中のＢ型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗原とそれに対する抗体（以下、Ｂ型肝炎ウイルスを「ＨＢＶ」、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原をＨＢｃ抗原、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原に対する抗体をＨＢｃ抗体という）との免疫反応を用いて生物学的試料中のＨＢｃ抗原又はＨＢｃ抗体を測定する免疫測定法の改良に関するものである。

血液等の生体由来試料中に存在する抗体等の抗原性物質を、当該抗原性物質と免疫反応を生じる抗体や抗原を用いて測定する免疫測定法が公知であり、疾患と関連してその濃度が上昇等する抗原性物質を測定することにより、当該疾患の診断等が行われている。これまでに多種態様の抗原性物質が知られているが、以下では具体的に、ＨＢＶについて説明する。

ＨＢＶは、直径４２ｎｍの二重構造をもつ球形粒子で、エンベロープ（外皮）とコア（芯）から形成されている。ＨＢｃ抗体は、このＢ型肝炎ウイルスのコア部分を形成する抗原（ＨＢｃ抗原）に対する抗体である。

ＨＢｃ抗体は、ＨＢＶ感染初期から感染後長期間にわたり血中に存在することが知られている。ＨＢｃ抗体には、ＩｇＭ型とＩｇＧ型の２タイプがあり、急性Ｂ型肝炎では発症後１２週までＩｇＭ型の陽性が認められ、ＩｇＭ型が測定されなくなった後も長期にわたりＩｇＧ型の陽性が認められる（非特許文献１）。

またＨＢｃ抗体は、ＨＢＶの表面抗原（ＨＢｓ抗原）が出現した後に測定され、急性Ｂ型肝炎においてはＨＢｓ抗原の消失後、ＨＢｓ抗体が出現するころまで継続して測定されるため、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗原に対する抗体（ＨＢｓ抗体）が測定されないときのＨＢＶ感染の測定の手がかりとなる（非特許文献２）。

更にＨＢｃ抗体は、急性Ｂ型肝炎時に抗体価が高くなることから、Ｂ型慢性肝炎の急性発症と急性Ｂ型肝炎の診断識別に効果がある（非特許文献３）。

以上のようにＨＢｃ抗体の測定は、Ｂ型肝炎の病態把握・感染予防に有効とされ、輸血後の感染防止を目的に輸血用血液のスクリーニング検査としても実施されている。

ＨＢｃ抗体の免疫測定は、いわゆる競合原理を利用する競合イムノアッセイが多い。これは、例えば水不溶性の担体に結合したＨＢｃ抗原中の抗体結合部位に対して、酵素や化学発光物質等といった検出可能な標識物質を結合したＨＢｃ抗体（以下、標識ＨＢｃ抗体という）と生体由来試料中の測定されるべきＨＢｃ抗体とを競合的に反応させるものである。水不溶性担体と結合した標識ＨＢｃ抗体の割合は、生体由来試料中の測定されるべきＨＢｃ抗体の量に反比例して増加するので、ＨＢｃ抗体の量を阻害率（陰性コントロールと生体由来試料の測定値の差から算出）等して決定する。なお、免疫測定に用いられるＨＢｃ抗原は、ＨＢＶから変性剤（ＳＤＳ）や還元剤（ジチオスレイトール、メルカプトエタノール）等を用いて調整する場合もあるが、一般的には大腸菌や酵母等を用いて製造した遺伝子組換え体を用いることが多い。

上記のような競合イムノアッセイでは、生体由来試料中に含まれる物質によって免疫反応が妨害されると測定値が低くなり、算出されるＨＢｃ抗体量が増加して偽陰性と判断される危険がある。妨害の態様として考えられるのは、ＨＢｃ抗原又はＨＢｃ抗体と複合体を形成する物質であるが、実際、γ−グロブリン、アルブミン、α１−アンタイトリプシン等の種々の血清蛋白質に代表される血液中の成分がＨＢｃ抗原と複合体を形成し、ＨＢｃ抗体との結合部位をブロックして免疫反応を妨害する可能性が報告されている（非特許文献４）。いずれにせよ、より正確な免疫測定を実施するためには、反応を妨害する物質の影響を可能な限り抑制することが重要である。

西岡幹夫，Ｂ型肝炎ウイルス感染症における血中抗原抗体系とその解釈、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅｓ，２４（２），１０６−１０８，１９８６） Ｈ．Ｉｉｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｎｔｉ−ＨＢｃ ｔｉｔｅｒ ａｎｄ ＨＢＶ ＤＮＡ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｕｎｉｔｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ＨＢｓＡｇ，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ，６３，１０７−１１１，１９９２ 三宅和彦・山中正己，慢性肝炎の診断の実際・血清生化学，免疫学的検査でどの程度まで診断できるか，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，４（７），１０８０−１０８３，１９８７ 今井光信，ＨＢｅ抗原の本態，肝胆膵，９（４），４８７−４８９，１９８４

そこで本願発明が解決しようとする課題は、競合イムノアッセイを含むＨＢｃ抗体の免疫測定において、ＨＢｃ抗原中のＨＢｃ抗体との結合部位をブロックして免疫反応を妨害する妨害物質の影響を可能な限り抑制することにある。

本願発明は、ＨＢｃ抗原とＨＢｃ抗体との免疫反応を用いて生物学的試料中のＨＢｃ抗原又はＨＢｃ抗体を測定する免疫測定法において、ＨＢｃ抗原を予めタンパク質変性剤によって処理することを特徴とする、免疫測定方法である。以下、本発明を詳細に説明する。

本願発明は、ＨＢｃ抗原とＨＢｃ抗体との免疫反応を用いて生物学的試料中のＨＢｃ抗原又はＨＢｃ抗体を測定する免疫測定、言い換えればＨＢｃ抗原とＨＢｃ抗体との免疫反応を利用する免疫測定であれば、いかなる態様の測定に対しても適用することができる。すなわち、前述した競合測定法はもとより、その他にも例えばＨＢｃ抗原を固定した担体と標識した抗ヒト抗体を使用するサンドイッチ測定方法、例えば標識物と結合したＨＢｃ抗体と担体に結合したＨＢｃ抗体との組合せによるＨＢｃ抗原のサンドイッチ測定方法、例えば抗ヒト抗体を固定した担体と標識したＨＢｃ抗原を使用するサンドイッチ測定方法等にも適用することができる。また競合測定方法又はサンドイッチ測定方法のいずれにおいても、いわゆる１ステップ又は２ステップのいずれにも適用することができる。

一般的に免疫測定では、例えばアルカリフォスファターゼ等の酵素を標識として使用するが、本願発明においても従来公知の種々の標識を利用することができる。例えば酵素、蛍光物質、ラジオアイソトープ、発光物質等を何らの制限なしに使用することができる。

本願発明は、また更に、例えばビオチン−アビジン等の結合を利用して間接的に標識を結合するものであっても良い。

一般的な免疫測定では、免疫反応の後に免疫反応複合体中に取り込まれた標識物と遊離の標識物を分離するために、いわゆるＢ／Ｆ分離を実施するが、そのため担体を利用する。従来から常用されている担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン又はデキストラン等の原料によって構成された、ビーズ、チューブ又はプレート状であるが、本願発明では担体を使用するか否かを含め、使用するとした場合のその形状や寸法等を自由に決定することができる。

本願発明で使用する蛋白質変性剤は、一般的に蛋白質変性剤として使用されるものであれば特に制限はなく、例えば種々の界面活性剤等であっても良い。中でもラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素、グアニジン塩酸塩が特に好ましい蛋白質変性剤として例示できる。本願発明は、かかる蛋白質変性剤を使用して、生体由来試料中のＨＢｃ抗原又はＨＢｃ抗体を測定するための試薬として供されるＨＢｃ抗原を処理し、そして特に好ましくはかかる試薬中のＨＢｃ抗原の処理に加えて、生体試料中の測定されるべきＨＢｃ抗原についても前記蛋白質変性剤による処理を行うものである。

蛋白質変性剤による処理としては、処理すべきＨＢｃ抗原に対して前記のような蛋白質変性剤を含む溶液を添加し、例えば室温条件下で２時間程度放置した後、溶液に適当な蛋白質を含む溶液を添加して蛋白質変性剤の濃度を低下（中和）させる、等の手法を採用することができる。使用する蛋白質変性剤の量（濃度）に特に制限はないが、後の過程で蛋白質の変性効果が残存しない程度にまで中和可能な濃度であれば良い。例えばＳＤＳであれば、０．０５％程度を使用することが例示できる。

本願発明によれば、後の実施例で詳細に示したように、ＨＢｃ抗原とＨＢｃ抗体との免疫反応を用いて生物学的試料中のＨＢｃ抗原又はＨＢｃ抗体を測定する場合に、ＨＢｃ抗原又はＨＢｃ抗体と複合体を形成する物質により、ＨＢｃ抗原中のＨＢｃ抗体と結合する部位がブロックされ、免疫反応が妨害されてしまう危険性を減少することができる。特に競合イムノアッセイでは、生体由来試料中に含まれる物質によって免疫反応が妨害されると測定値が低くなり、算出されるＨＢｃ抗体量が増加して偽陰性と判断される危険があるため、本願の免疫反応の妨害の可能性を減少できるという効果は、偽陰性が発生する可能性を抑制する上で効果的である。

以下に本願発明を更に詳細に説明するために実施例を記載するが、これら実施例は本願発明を限定するものではない。

なお実施例では、免疫測定装置として市販の自動免疫測定装置（東ソー（株）製、ＡＩＡ（登録商標）−１８００）を用い、１ステップ競合法によりＨＢｃ抗体の測定を行った。

具体的には、ＨＢｃ抗体（２）を固定化した担体およびアルカリ性フォスファターゼにて標識されたＨＢｃ抗体（１）を含む溶液とＨＢｃ抗原を含む反応カップに試験試料（血清）を添加し３７℃にて攪拌保温した（反応カップは、ＨＢｃ抗体（１）とＨＢｃ抗原が凍結乾燥状態で封入したものである）。その後、未反応物をＢ／Ｆ分離により除去し、ＨＢｃ抗原を介して担体に結合したＨＢｃ抗体（１）を、４メチルウンベリフェリルりん酸塩を添加し、単位時間当たりの４メチルウンベリフェロンの生成（ｎＭ／秒）を蛍光測定した。本生成度はアルカリ性フォスファターゼ量に比例するものである。

上記測定の結果は、陰性コントロール（試験試料中にＨＢｃ抗体が存在しない時の測定値）を基準にし、ＨＢｃ抗体が存在することで抑制される度合（＝ＩＮＨ％）で示した。

この計算で５０％に等しいか又は５０％より大きい値を示した場合は、便宜的に陽性と判断した。

本実施例における陰性群は、Ｂ型肝炎の他のマーカーもＢ型肝炎の病歴もない供血者からインフォームドコンセントを得て採取したものであり、その中で５０％以上の強いＨＢｃ抗体様の反応性を示したものを偽陽性群とした。

ＨＢｃ抗原液をＨＢｃ抗原１００〜２５０μｇ／ｍＬ、０．０５％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ９．５）となるよう調整し、十分に混合した後４℃において２時間以上放置した。反応を停止させるため、バッファーによりｐＨ９．０に調整された５％ＢＳＡ及び６％ペプタイドを含む溶液で１０倍以上に希釈し、４℃にて保存した（使用するまでに１週間以上保存する場合−８０℃にて保存）。以上のＳＤＳによる処理を行ったものを抗原Ｂとし、行わないものを抗原Ａとした。

抗原Ａ、抗原Ｂをそれぞれ用い先述したように反応試薬を作製し（それぞれ試薬Ａ、試薬Ｂとする）、ＳＤＳ処理の効果を以下の要領で評価した。
（ａ）偽陽性群を含む陰性検体の測定
表１は、健常人検体２６例（ＨＢｃ抗体陰性検体２０例と、ＨＢｃ抗体陽性（偽陽性検体）検体６例を測定した結果である。図１は、表１の結果から試薬Ａ、Ｂの測定値分布をヒストグラムに示したものである。表１、図１からわかるように試薬Ａで測定すると、５０％以上のＩＮＨ％を示していた偽陽性検体が試薬Ｂで測定すると３０％付近のＩＮＨ％を示すようになり、全体的にばらついていた値が０％付近に収束していることがわかる。抗原をＳＤＳにより前処理することで陰性検体中の成分による影響が非常に小さくなり偽陽性検体がなくなるという効果が得られることが分かる。なお、本例で測定した擬陽性検体（６例）は、約１０００人の健常人に由来する生体由来試料から、擬陽性を示したものを、インフォームドコンセントを得て収集したものである。

（ｂ）ＨＢｃ抗体陽性血清希釈列による比較
表２は、ＨＢｃ抗体陽性血清を陰性血清で５０倍、１００倍、２００倍、５００倍に希釈して調整した希釈列を試薬Ａ，Ｂで測定した結果である。表２からわかるように両試薬は同等の阻害率を示しており、ＨＢｃ抗原をＳＤＳ処理することによっては試験の感度および検出能に影響を受けないことがわかる。

（ｃ）感度パネル（ＢＯＳＴＯＮ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡ，ＩＮＣ． Ａｎｔｉ−ＨＢｃ Ｔｏｔａｌ Ｍｉｘｅｄ Ｔｉｔｅｒ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｐａｎｅｌ）の測定
表３に、ＢＯＳＴＯＮ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡ，ＩＮＣ． Ａｎｔｉ−ＨＢｃ Ｔｏｔａｌ Ｍｉｘｅｄ Ｔｉｔｅｒ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｐａｎｅｌ（ＰＨＧ２０１）を試薬Ａ、Ｂで測定した時の結果である。両試薬とも判定は完全に一致し、同等の阻害率を示した。

実施例１の結果（試薬Ａ、Ｂによる抗体陰性検体の測定結果をヒストグラムに示した図）である。黒のバー（左側）は試薬Ａ、グレーのバー（右側）は試薬Ｂの結果を示す。

Claims (3)

1. Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原とそれに対する抗体との免疫反応を用いて生物学的試料中のＢ型肝炎ウイルスコア抗原又はそれに対する抗体を測定する免疫測定法において、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原を予めタンパク質変性剤によって処理することを特徴とする、免疫測定方法。
2. タンパク質変性剤がラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素、グアニジン塩酸塩等の蛋白質を変性できる試薬である請求項１に記載の方法。
3. 予め蛋白質変性剤によって処理されるＢ型肝炎ウイルスコア抗原が大腸菌又は酵母を用いて製造された遺伝子組換え体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。

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