JP3487643B2 - 特異的ＩｇＭ抗体の測定法及びその試薬 - Google Patents
特異的ＩｇＭ抗体の測定法及びその試薬Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗ヒトＩｇＭ抗体試薬
を使用して、被検試料中の対象抗原に対する特異的Ｉｇ
Ｍ抗体を免疫学的に測定する方法において、被検試料を
少なくともＩｇＭまたはＩｇＭ含有水溶液により希釈す
ることを特徴とする特異的ＩｇＭ抗体測定試薬及びその
試薬を用いた測定方法に関する。
を使用して、被検試料中の対象抗原に対する特異的Ｉｇ
Ｍ抗体を免疫学的に測定する方法において、被検試料を
少なくともＩｇＭまたはＩｇＭ含有水溶液により希釈す
ることを特徴とする特異的ＩｇＭ抗体測定試薬及びその
試薬を用いた測定方法に関する。
【０００２】
【従来技術及び解決すべき課題】免疫学的測定法は、人
の臨床における検査や病気の診断に広く利用される他、
動物についてもその臨床検査や病気の診断、さらにはそ
の他の広い範囲の測定対象物の分析、測定、定量、検出
などの分野において応用されている。この免疫学的測定
法は、抗原とその抗原に対する抗体との間の抗原抗体反
応を利用するものであるが、通常この抗原抗体反応の生
起していることの検出は可視的に判別したり、あるいは
検知することは困難であるので、その検知、検出を容易
にするため様々な手法が開発されてきている。
の臨床における検査や病気の診断に広く利用される他、
動物についてもその臨床検査や病気の診断、さらにはそ
の他の広い範囲の測定対象物の分析、測定、定量、検出
などの分野において応用されている。この免疫学的測定
法は、抗原とその抗原に対する抗体との間の抗原抗体反
応を利用するものであるが、通常この抗原抗体反応の生
起していることの検出は可視的に判別したり、あるいは
検知することは困難であるので、その検知、検出を容易
にするため様々な手法が開発されてきている。
【０００３】そのうち特に急性期において生体内の免疫
反応によりに生じる特異的ＩｇＭ抗体を測定すること
は、例えば、ウイルス感染、病原菌感染などの初期感染
の診断に用いられて有用であることから注目されてい
る。ところが特異的ＩｇＭ抗体はリウマチ因子などの妨
害を受けたり、ＩｇＧなどの干渉を受けるため、その測
定が難しいという問題があった。このＩｇＭ測定を利用
する免疫学的測定法の代表的なものとしては、ＩｇＭ抗
体捕捉測定法が挙げられ、例えば、Ａ型肝炎ウイルス
（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ： ＨＡＶ）感
染の診断、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（Ｈｅｐａｔｉｔ
ｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ａｎｔｉｇｅｎ：Ｈ
Ｂｃ）、風疹、麻疹、ムンプスなどの診断などに利用さ
れている。
反応によりに生じる特異的ＩｇＭ抗体を測定すること
は、例えば、ウイルス感染、病原菌感染などの初期感染
の診断に用いられて有用であることから注目されてい
る。ところが特異的ＩｇＭ抗体はリウマチ因子などの妨
害を受けたり、ＩｇＧなどの干渉を受けるため、その測
定が難しいという問題があった。このＩｇＭ測定を利用
する免疫学的測定法の代表的なものとしては、ＩｇＭ抗
体捕捉測定法が挙げられ、例えば、Ａ型肝炎ウイルス
（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ： ＨＡＶ）感
染の診断、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（Ｈｅｐａｔｉｔ
ｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ａｎｔｉｇｅｎ：Ｈ
Ｂｃ）、風疹、麻疹、ムンプスなどの診断などに利用さ
れている。
【０００４】特に、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、１
９７３年フェインストン（Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ）等によ
りＡ型肝炎急性期患者の便材料のうちに発見され、１９
７７年には実験感染チンパンジー肝組織における増殖の
報告がされてのち、１９７９年には初代マーモセット肝
細胞及びアカゲザル胎児腎細胞での増殖が報告されて以
来、ＨＡＶを培養細胞系では初代及び株化アフリカミド
リザル腎細胞、ヒト二倍体細胞などにおいて増殖せしめ
ることが報告されている。
９７３年フェインストン（Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ）等によ
りＡ型肝炎急性期患者の便材料のうちに発見され、１９
７７年には実験感染チンパンジー肝組織における増殖の
報告がされてのち、１９７９年には初代マーモセット肝
細胞及びアカゲザル胎児腎細胞での増殖が報告されて以
来、ＨＡＶを培養細胞系では初代及び株化アフリカミド
リザル腎細胞、ヒト二倍体細胞などにおいて増殖せしめ
ることが報告されている。
【０００５】ところで、現在日本では、Ａ型肝炎ウイル
ス感染の発生は減少してはいるものの、若年層を中心に
抗ＨＡＶ抗体陰性者が増加するのに対して、一方では高
年齢者にはその陽性者が多く分布するという状況から、
成人ではＨＡＶに汚染された飲食物に接する機会が多く
なることに加えて、大人では一旦感染した場合、肝炎の
発症につながる恐れが高いことから、そのＨＡＶ感染を
防ぐ意味でも、正確かつ迅速なＨＡＶ感染の有無を検出
することが求められている。
ス感染の発生は減少してはいるものの、若年層を中心に
抗ＨＡＶ抗体陰性者が増加するのに対して、一方では高
年齢者にはその陽性者が多く分布するという状況から、
成人ではＨＡＶに汚染された飲食物に接する機会が多く
なることに加えて、大人では一旦感染した場合、肝炎の
発症につながる恐れが高いことから、そのＨＡＶ感染を
防ぐ意味でも、正確かつ迅速なＨＡＶ感染の有無を検出
することが求められている。
【０００６】また、ＨＡＶは糞便などによる経口感染を
その主な伝播経路とするため、環境衛生の不備な地域で
の感染の危険は大きく、最近では海外渡航の機会も増加
し、こうしてＨＡＶ感染の検査が、近親者間、従業員者
間などでの感染を防ぐ意味でも重要視されている。
その主な伝播経路とするため、環境衛生の不備な地域で
の感染の危険は大きく、最近では海外渡航の機会も増加
し、こうしてＨＡＶ感染の検査が、近親者間、従業員者
間などでの感染を防ぐ意味でも重要視されている。
【０００７】この急性期のＨＡＶ感染の検出のために
は、ＨＡＶ感染に伴って生体内の強い免疫反応により患
者の血液中に出現する抗ＨＡＶ抗体、特にＨＡＶに特異
的なＩｇＭ抗体を検出して行われており、この抗ＨＡＶ
（ＩｇＭ）抗体と免疫学的に反応性を有するＨＡＶ抗原
を試薬として用いる次のようなＩｇＭ抗体捕捉測定法が
開発されている。代表的なＩｇＭ抗体捕捉測定法にした
がう急性Ａ型肝炎の感染診断法は、ＩｇＭ抗体のμ−鎖
に特異性をもつ抗ヒトＩｇＭ抗体を使用し、その抗ヒト
ＩｇＭ抗体（μ−鎖特異抗体）で被覆した固相、例えば
下記に示すような固相担体を、測定試料と反応させ、次
にＨＡＶ抗原試薬と反応させ、最後に標識抗ＨＡＶ抗体
と反応させるというように順次反応させることにより行
われている。
は、ＨＡＶ感染に伴って生体内の強い免疫反応により患
者の血液中に出現する抗ＨＡＶ抗体、特にＨＡＶに特異
的なＩｇＭ抗体を検出して行われており、この抗ＨＡＶ
（ＩｇＭ）抗体と免疫学的に反応性を有するＨＡＶ抗原
を試薬として用いる次のようなＩｇＭ抗体捕捉測定法が
開発されている。代表的なＩｇＭ抗体捕捉測定法にした
がう急性Ａ型肝炎の感染診断法は、ＩｇＭ抗体のμ−鎖
に特異性をもつ抗ヒトＩｇＭ抗体を使用し、その抗ヒト
ＩｇＭ抗体（μ−鎖特異抗体）で被覆した固相、例えば
下記に示すような固相担体を、測定試料と反応させ、次
にＨＡＶ抗原試薬と反応させ、最後に標識抗ＨＡＶ抗体
と反応させるというように順次反応させることにより行
われている。
【０００８】ところが、このような急性期においては血
液、血清、血漿などの被検試料中の抗ＨＡＶ（ＩｇＭ）
抗体などの測定すべき特異的なＩｇＭ及び総ＩｇＭの濃
度は様々である。一般には、血液中の総ＩｇＭ量は通常
約０．４〜２ｍｇ／ｍｌ存在していることが知られてい
るが、上記した第一反応での抗ヒトＩｇＭ抗体で被覆し
た固相の抗体量が充分でない場合が起こるので、被検試
料を前希釈、例えば、高倍率の前希釈を行うことが必要
であるという問題がある。従来は、緩衝水溶液、生理食
塩水溶液などで被検試料を前希釈していた。こうすると
総ＩｇＭ抗体の量を減ずることになるが、総ＩｇＭ抗体
量に対する特異的ＩｇＭ量の比率を減ずることはできな
い。そのため、必要な測定範囲を得ることが困難である
という問題がある。また自動化された測定系において
は、希釈液量が制限されるという問題があり、測定範囲
が限定されしまうという問題があった。上記したように
より早い時期で特異的なＩｇＭ、例えば、ＨＡＶ関連抗
体を検出したり、前希釈の希釈倍率を低減せしめてより
広範囲の測定を可能にし、例えば、Ａ型肝疾患などの高
濃度領域における確実な測定法が、緊急的かつ強く求め
られている。
液、血清、血漿などの被検試料中の抗ＨＡＶ（ＩｇＭ）
抗体などの測定すべき特異的なＩｇＭ及び総ＩｇＭの濃
度は様々である。一般には、血液中の総ＩｇＭ量は通常
約０．４〜２ｍｇ／ｍｌ存在していることが知られてい
るが、上記した第一反応での抗ヒトＩｇＭ抗体で被覆し
た固相の抗体量が充分でない場合が起こるので、被検試
料を前希釈、例えば、高倍率の前希釈を行うことが必要
であるという問題がある。従来は、緩衝水溶液、生理食
塩水溶液などで被検試料を前希釈していた。こうすると
総ＩｇＭ抗体の量を減ずることになるが、総ＩｇＭ抗体
量に対する特異的ＩｇＭ量の比率を減ずることはできな
い。そのため、必要な測定範囲を得ることが困難である
という問題がある。また自動化された測定系において
は、希釈液量が制限されるという問題があり、測定範囲
が限定されしまうという問題があった。上記したように
より早い時期で特異的なＩｇＭ、例えば、ＨＡＶ関連抗
体を検出したり、前希釈の希釈倍率を低減せしめてより
広範囲の測定を可能にし、例えば、Ａ型肝疾患などの高
濃度領域における確実な測定法が、緊急的かつ強く求め
られている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記した
問題のないそして被検試料の必要な測定範囲を簡単に設
定でき、より早い時期で特異的なＩｇＭ、例えば、ＨＡ
Ｖ関連抗体を検出したり、前希釈の希釈倍率を低減せし
めてより広範囲の測定を可能にする自動化された測定系
に適した測定方法を見いだすべく、鋭意研究を行った結
果、簡単な方法によりそれらの問題を解決しうることを
見出し、本発明を完成した。
問題のないそして被検試料の必要な測定範囲を簡単に設
定でき、より早い時期で特異的なＩｇＭ、例えば、ＨＡ
Ｖ関連抗体を検出したり、前希釈の希釈倍率を低減せし
めてより広範囲の測定を可能にする自動化された測定系
に適した測定方法を見いだすべく、鋭意研究を行った結
果、簡単な方法によりそれらの問題を解決しうることを
見出し、本発明を完成した。
【００１０】本発明は、抗ヒトＩｇＭ抗体試薬を使用し
て、被検試料中の対象抗原に対する特異的ＩｇＭ抗体を
免疫学的に測定する方法において、被検試料を少なくと
もＩｇＭまたはＩｇＭ含有水溶液により希釈することを
特徴とする特異的ＩｇＭ抗体測定試薬及びその試薬を用
いた測定方法を提供する。本発明で用いられる測定対象
試料としては、全血、血清、血漿、唾液、生体粘液、な
どの生体由来材料をあげることができる。特に測定対象
試料としては、全血、血清、血漿が好ましく用いられ
る。本発明においては、また試料をヒトＩｇＭ含有フラ
クション、精製ヒトＩｇＭなどの水溶液を添加して、試
料中のＩｇＭ量に影響されること無く、目的の抗原に特
異的なＩｇＭ抗体を測定できるようにする。約０．００
５％のヒトＩｇＭを含有する水溶液の場合、その水溶液
で試料を約１０〜５００倍に、好ましくは約５０〜２０
０倍に、さらに好ましくは約７０〜１５０倍に、最も好
ましくは約８０〜１２０倍に希釈してもよい。ヒトＩｇ
Ｍの添加処理により、より広範囲の測定を達成すること
もできるし、測定試料調製の手間、例えば試料濃度の調
製などの測定範囲設定が簡易に行うことができるように
なり、自動化免疫測定系における適用が容易になる。
て、被検試料中の対象抗原に対する特異的ＩｇＭ抗体を
免疫学的に測定する方法において、被検試料を少なくと
もＩｇＭまたはＩｇＭ含有水溶液により希釈することを
特徴とする特異的ＩｇＭ抗体測定試薬及びその試薬を用
いた測定方法を提供する。本発明で用いられる測定対象
試料としては、全血、血清、血漿、唾液、生体粘液、な
どの生体由来材料をあげることができる。特に測定対象
試料としては、全血、血清、血漿が好ましく用いられ
る。本発明においては、また試料をヒトＩｇＭ含有フラ
クション、精製ヒトＩｇＭなどの水溶液を添加して、試
料中のＩｇＭ量に影響されること無く、目的の抗原に特
異的なＩｇＭ抗体を測定できるようにする。約０．００
５％のヒトＩｇＭを含有する水溶液の場合、その水溶液
で試料を約１０〜５００倍に、好ましくは約５０〜２０
０倍に、さらに好ましくは約７０〜１５０倍に、最も好
ましくは約８０〜１２０倍に希釈してもよい。ヒトＩｇ
Ｍの添加処理により、より広範囲の測定を達成すること
もできるし、測定試料調製の手間、例えば試料濃度の調
製などの測定範囲設定が簡易に行うことができるように
なり、自動化免疫測定系における適用が容易になる。
【００１１】測定対象試料は、必要に応じ上記処理の前
に、緩衝剤、希釈液、キレート化剤、保存剤などを添加
して用いることができる。試料は、場合によって５０〜
５００倍に希釈してもよい。緩衝剤、希釈液又は希釈剤
としては、水、リン酸又はリン酸塩緩衝液、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、例
えば生理食塩水などの塩化ナトリウム液、Ｎ−（２−ヒ
ドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスル
ホン酸）（ＨＥＰＥＳ）液、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビ
ス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＢＥＳ）液、３−
（シアノヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸
（ＣＡＰＳ）液、３−（モルホリノ）プロパンスルホン
酸（ＭＯＰＳ）液、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエ
チル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）液、Ｎ
−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタ
ンスルホン酸（ＴＥＳ）液、Ｎ−（２−アセトアミド）
−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）液、アミノ
酸液などが挙げられる。これらは単独でも、任意に組合
わせて配合しても用いることができる。キレート化剤と
しては、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エ
チレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）
−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などが
挙げられる。これらキレート化剤は、約０．０１ｍＭ〜
約２０ｍＭの範囲で用いることができる。
に、緩衝剤、希釈液、キレート化剤、保存剤などを添加
して用いることができる。試料は、場合によって５０〜
５００倍に希釈してもよい。緩衝剤、希釈液又は希釈剤
としては、水、リン酸又はリン酸塩緩衝液、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、例
えば生理食塩水などの塩化ナトリウム液、Ｎ−（２−ヒ
ドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスル
ホン酸）（ＨＥＰＥＳ）液、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビ
ス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＢＥＳ）液、３−
（シアノヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸
（ＣＡＰＳ）液、３−（モルホリノ）プロパンスルホン
酸（ＭＯＰＳ）液、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエ
チル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）液、Ｎ
−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタ
ンスルホン酸（ＴＥＳ）液、Ｎ−（２−アセトアミド）
−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）液、アミノ
酸液などが挙げられる。これらは単独でも、任意に組合
わせて配合しても用いることができる。キレート化剤と
しては、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エ
チレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）
−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などが
挙げられる。これらキレート化剤は、約０．０１ｍＭ〜
約２０ｍＭの範囲で用いることができる。
【００１２】また、試料は、必要に応じ肝炎陰性のヒト
血清、血漿、ヒトＩｇＭを含有する水溶液で希釈処理す
ることもできる。より具体的な態様においては、本発明
は、試料を一旦緩衝剤、希釈液又は希釈剤などの水溶液
で幾分か希釈し、つぎに試料を少なくともＩｇＭまたは
ＩｇＭ含有水溶液により希釈した後、試料中の抗ウイル
ス特異的ＩｇＭ抗体などの特定の抗原に特異性をもつＩ
ｇＭ抗体を、抗ヒトＩｇＭ抗体で被覆した固相担体など
と反応させて試料中のＩｇＭ抗体を固相抗ヒトＩｇＭ抗
体と免疫学的に反応させ、（ａ）つぎにウイルスなどの
特定の抗原試薬を免疫学的に反応させ、得られた反応生
成物に化学発光標識抗ウイルス抗体などの標識抗体を免
疫学的に反応させるか、または（ｂ）ウイルスなどの特
定の抗原試薬を標識剤で標識した標識抗原を免疫学的に
反応させることからなることを特徴とする特異的ＩｇＭ
抗体の測定法及びその測定法に用いる試薬が提供され
る。特に好ましい測定系の例としては、ＨＡＶ感染の急
性期に生ずる、ＩｇＭ型の抗ＨＡＶ抗体を患者の血液を
測定することにより急性Ａ型肝炎の感染を診断する方法
が挙げられる。このＩｇＭ型の抗ＨＡＶ抗体を特異的に
測定する系では、μ−鎖特異性の抗ヒトＩｇＭ抗体で被
覆した固相、例えば下記に示すような固相担体を、測定
試料と反応させ、次にＨＡＶ抗原試薬と反応させ、最後
に標識抗ＨＡＶ抗体と反応させるというように順次反応
させることにより行われる。
血清、血漿、ヒトＩｇＭを含有する水溶液で希釈処理す
ることもできる。より具体的な態様においては、本発明
は、試料を一旦緩衝剤、希釈液又は希釈剤などの水溶液
で幾分か希釈し、つぎに試料を少なくともＩｇＭまたは
ＩｇＭ含有水溶液により希釈した後、試料中の抗ウイル
ス特異的ＩｇＭ抗体などの特定の抗原に特異性をもつＩ
ｇＭ抗体を、抗ヒトＩｇＭ抗体で被覆した固相担体など
と反応させて試料中のＩｇＭ抗体を固相抗ヒトＩｇＭ抗
体と免疫学的に反応させ、（ａ）つぎにウイルスなどの
特定の抗原試薬を免疫学的に反応させ、得られた反応生
成物に化学発光標識抗ウイルス抗体などの標識抗体を免
疫学的に反応させるか、または（ｂ）ウイルスなどの特
定の抗原試薬を標識剤で標識した標識抗原を免疫学的に
反応させることからなることを特徴とする特異的ＩｇＭ
抗体の測定法及びその測定法に用いる試薬が提供され
る。特に好ましい測定系の例としては、ＨＡＶ感染の急
性期に生ずる、ＩｇＭ型の抗ＨＡＶ抗体を患者の血液を
測定することにより急性Ａ型肝炎の感染を診断する方法
が挙げられる。このＩｇＭ型の抗ＨＡＶ抗体を特異的に
測定する系では、μ−鎖特異性の抗ヒトＩｇＭ抗体で被
覆した固相、例えば下記に示すような固相担体を、測定
試料と反応させ、次にＨＡＶ抗原試薬と反応させ、最後
に標識抗ＨＡＶ抗体と反応させるというように順次反応
させることにより行われる。
【００１３】本発明に従ったＩｇＭ型の抗ＨＡＶ抗体を
特異的に測定する系で用いられるＨＡＶ抗原試薬は、イ
ン・ビトロの細胞培養法で得られたウイルス抗原を用い
ている。それは感染細胞を溶菌化して得られた細胞ライ
ゼートから分離されたＨＡＶ抽出物あるいはそれから誘
導されたものが挙げられる。そのＨＡＶ抽出物は、例え
ばアフリカミドリザル腎培養細胞、ヒト肝臓腫瘍セルラ
インＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｈｅｐ．Ｇ２などのＨＡＶ感
染細胞であって培養しうるもので、さらに好ましくは大
量にＨＡＶを産生しうるセルライン細胞を、公知の生育
培地、例えばイーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ
ＭＥＭ）、ダルベッコ最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓ ＭＥＭ）、ＰＲＭ１−１６４０（Ｇｉｂｃｏ
社）、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ）、Ｎ−（２−ヒドロキ
シエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン
酸）（ＨＥＰＥＳ）緩衝液添加イーグルＭＥＭ、リン酸
緩衝化Ｌ−１５−ａ培地、ハンクス液（Ｈａｎｋｓ’
ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）など
の生育培地で、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペ
ンシリン、トレプトマイシンなどの抗生物質、酵母抽出
液、バクトペプトン、ラクトアルブミン加水分解物、そ
の他細胞成長因子などを添加したものの中で培養し、次
にこうして得られた細胞培養物から次のようにして得ら
れる。
特異的に測定する系で用いられるＨＡＶ抗原試薬は、イ
ン・ビトロの細胞培養法で得られたウイルス抗原を用い
ている。それは感染細胞を溶菌化して得られた細胞ライ
ゼートから分離されたＨＡＶ抽出物あるいはそれから誘
導されたものが挙げられる。そのＨＡＶ抽出物は、例え
ばアフリカミドリザル腎培養細胞、ヒト肝臓腫瘍セルラ
インＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｈｅｐ．Ｇ２などのＨＡＶ感
染細胞であって培養しうるもので、さらに好ましくは大
量にＨＡＶを産生しうるセルライン細胞を、公知の生育
培地、例えばイーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ
ＭＥＭ）、ダルベッコ最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓ ＭＥＭ）、ＰＲＭ１−１６４０（Ｇｉｂｃｏ
社）、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ）、Ｎ−（２−ヒドロキ
シエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン
酸）（ＨＥＰＥＳ）緩衝液添加イーグルＭＥＭ、リン酸
緩衝化Ｌ−１５−ａ培地、ハンクス液（Ｈａｎｋｓ’
ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）など
の生育培地で、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペ
ンシリン、トレプトマイシンなどの抗生物質、酵母抽出
液、バクトペプトン、ラクトアルブミン加水分解物、そ
の他細胞成長因子などを添加したものの中で培養し、次
にこうして得られた細胞培養物から次のようにして得ら
れる。
【００１４】つまり、上記のようにして得られた細胞培
養物から栄養培地を除去し、ついで細胞を生理的食塩
水、燐酸塩などで緩衝化された溶液などで、必要に応じ
ＥＤＴＡなどのキレート化剤を添加したもので洗浄す
る。こうして単離・収穫された細胞を、代表的にはＥＤ
ＴＡなどのキレート化剤及びポリオキシエチレンエーテ
ル（代表的なものは、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００などの商品名で入手しうる）などの非イオン界面活
性剤を含む燐酸塩などで緩衝化された溶液、例えば１ｍ
ＭのＥＤＴＡ及び０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
を含む燐酸塩緩衝化溶液、あるいはデオキシコール酸塩
を含む燐酸塩などで緩衝化された溶液でもって溶菌処理
し、こうして得られた細胞ライゼートを、必要に応じ、
例えば約１０〜１５分間インキュベーション処理し、つ
ぎに遠心処理、例えば約１，０００〜２０，０００×
ｇ、好ましくは約２，０００〜１０，０００×ｇで、約
５〜６０分間、好ましくは約１０〜３０分間遠心処理
し、ＨＡＶ抽出物を得ることができる。このように、細
胞ライゼートからその核由来物質、細胞オルガネラ、破
砕物などを遠心分離処理して除き、Ａ型肝炎ウイルスが
得られている。ＨＡＶ抽出物は、例えば米国特許明細書
第４，７２１，６７５号に記載のようにしても得られ
る。ＨＡＶ抽出物は、必要に応じ、例えばクロロホルム
抽出法、酵素処理法、蔗糖濃度勾配遠心分離法などでさ
らに精製することもできる。
養物から栄養培地を除去し、ついで細胞を生理的食塩
水、燐酸塩などで緩衝化された溶液などで、必要に応じ
ＥＤＴＡなどのキレート化剤を添加したもので洗浄す
る。こうして単離・収穫された細胞を、代表的にはＥＤ
ＴＡなどのキレート化剤及びポリオキシエチレンエーテ
ル（代表的なものは、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００などの商品名で入手しうる）などの非イオン界面活
性剤を含む燐酸塩などで緩衝化された溶液、例えば１ｍ
ＭのＥＤＴＡ及び０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
を含む燐酸塩緩衝化溶液、あるいはデオキシコール酸塩
を含む燐酸塩などで緩衝化された溶液でもって溶菌処理
し、こうして得られた細胞ライゼートを、必要に応じ、
例えば約１０〜１５分間インキュベーション処理し、つ
ぎに遠心処理、例えば約１，０００〜２０，０００×
ｇ、好ましくは約２，０００〜１０，０００×ｇで、約
５〜６０分間、好ましくは約１０〜３０分間遠心処理
し、ＨＡＶ抽出物を得ることができる。このように、細
胞ライゼートからその核由来物質、細胞オルガネラ、破
砕物などを遠心分離処理して除き、Ａ型肝炎ウイルスが
得られている。ＨＡＶ抽出物は、例えば米国特許明細書
第４，７２１，６７５号に記載のようにしても得られ
る。ＨＡＶ抽出物は、必要に応じ、例えばクロロホルム
抽出法、酵素処理法、蔗糖濃度勾配遠心分離法などでさ
らに精製することもできる。
【００１５】こうして得られたＨＡＶ抽出物は、つぎに
公知の方法又はそれを修飾した方法によりその感染性を
不活性化するための処理がなされる。不活性化処理は、
例えばホルマリン液で処理する、例えば約３７℃で約２
５〜４５％ホルマリン溶液の約１：３０００〜１：７０
００希釈下、例えば、１：４０００希釈下にインキュベ
ーション処理することにより行うことができるが、その
他適切な方法を公知のものの中から選んで適用すること
が出来る。この処理は、例えば、２週間行うこともで
き、さらにそれより短い時間あるいは長い時間でもよ
い。この処理の際の処理液においては、必要に応じ、緩
衝剤、希釈液又は希釈剤、キレート化剤、保存剤などを
添加して用いることもできる。
公知の方法又はそれを修飾した方法によりその感染性を
不活性化するための処理がなされる。不活性化処理は、
例えばホルマリン液で処理する、例えば約３７℃で約２
５〜４５％ホルマリン溶液の約１：３０００〜１：７０
００希釈下、例えば、１：４０００希釈下にインキュベ
ーション処理することにより行うことができるが、その
他適切な方法を公知のものの中から選んで適用すること
が出来る。この処理は、例えば、２週間行うこともで
き、さらにそれより短い時間あるいは長い時間でもよ
い。この処理の際の処理液においては、必要に応じ、緩
衝剤、希釈液又は希釈剤、キレート化剤、保存剤などを
添加して用いることもできる。
【００１６】緩衝剤、希釈液又は希釈剤としては、水、
リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、生理食塩水などの塩化ナトリウ
ム液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’
−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）液、ピペラ
ジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩ
ＢＥＳ）液、３−（シアノヘキシルアミノ）−１−プロ
パンスルホン酸（ＣＡＰＳ）液、３−（モルホリノ）プ
ロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）液、アミノ酸液などが挙
げられる。これらは単独でも、任意に組合わせて配合し
ても用いることができる。キレート化剤としては、エチ
レンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコ
ール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられ
る。
リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、生理食塩水などの塩化ナトリウ
ム液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’
−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）液、ピペラ
ジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩ
ＢＥＳ）液、３−（シアノヘキシルアミノ）−１−プロ
パンスルホン酸（ＣＡＰＳ）液、３−（モルホリノ）プ
ロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）液、アミノ酸液などが挙
げられる。これらは単独でも、任意に組合わせて配合し
ても用いることができる。キレート化剤としては、エチ
レンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコ
ール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられ
る。
【００１７】本発明によれば、こうして得られた感染性
が不活性化されたＨＡＶ抽出物は、それをそのままＨＡ
Ｖ抗原として用いることもできるし、さらにそれをつぎ
に界面活性剤で処理し得られたものも用いることがで
き、こうした界面活性剤処理ＨＡＶ抽出物は好ましいも
のとして使用できる。界面活性剤としては、適切なもの
を公知又は市販のもののうちから選んで用いることがで
き、特にアニオン性界面活性剤が適している。
が不活性化されたＨＡＶ抽出物は、それをそのままＨＡ
Ｖ抗原として用いることもできるし、さらにそれをつぎ
に界面活性剤で処理し得られたものも用いることがで
き、こうした界面活性剤処理ＨＡＶ抽出物は好ましいも
のとして使用できる。界面活性剤としては、適切なもの
を公知又は市販のもののうちから選んで用いることがで
き、特にアニオン性界面活性剤が適している。
【００１８】アニオン性界面活性剤としては、ステアリ
ン酸カリウムなどの炭素数１２〜１８の高級脂肪酸のア
ルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩、胆汁酸のアルカ
リ金属塩、炭素数１２〜１８の高級脂肪酸のトリエタノ
ールアミンなどの有機塩基塩、ラウリル硫酸ナトリウム
（ＬＤＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの
炭素数１２〜１８の高級脂肪酸又は高級アルコールの硫
酸エステル、アルキルスルホン酸塩、アルキルベンゼン
スルホン酸ナトリウムなどのアルキルアリールスルホン
酸塩などが挙げられ、特にＬＤＳ、ＳＤＳは著効を示
す。アルカリ金属としては、ナトリウム、カリウム、リ
チウムなど、アルカリ土類金属としては、カルシウム、
マグネシウムなどが挙げられる。
ン酸カリウムなどの炭素数１２〜１８の高級脂肪酸のア
ルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩、胆汁酸のアルカ
リ金属塩、炭素数１２〜１８の高級脂肪酸のトリエタノ
ールアミンなどの有機塩基塩、ラウリル硫酸ナトリウム
（ＬＤＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの
炭素数１２〜１８の高級脂肪酸又は高級アルコールの硫
酸エステル、アルキルスルホン酸塩、アルキルベンゼン
スルホン酸ナトリウムなどのアルキルアリールスルホン
酸塩などが挙げられ、特にＬＤＳ、ＳＤＳは著効を示
す。アルカリ金属としては、ナトリウム、カリウム、リ
チウムなど、アルカリ土類金属としては、カルシウム、
マグネシウムなどが挙げられる。
【００１９】これら界面活性剤は、共存する蛋白質の量
に応じて、その使用量を選ぶことが好ましく、例えば約
０．００１％ｖ／ｖ〜約１０％ｖ／ｖの範囲で用いるこ
とができる。特に好ましくはＳＤＳを用い、約０．０５
％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ、より好ましくは共存する他の
蛋白質が存在しない場合には約０．５％ｖ／ｖ〜約１．
０％ｖ／ｖの範囲で用いることができる。
に応じて、その使用量を選ぶことが好ましく、例えば約
０．００１％ｖ／ｖ〜約１０％ｖ／ｖの範囲で用いるこ
とができる。特に好ましくはＳＤＳを用い、約０．０５
％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ、より好ましくは共存する他の
蛋白質が存在しない場合には約０．５％ｖ／ｖ〜約１．
０％ｖ／ｖの範囲で用いることができる。
【００２０】界面活性剤でＨＡＶ抽出物を処理するにあ
たっては、必要に応じＨＡＶ抽出物を緩衝剤、希釈液又
は希釈剤などで希釈し、所要濃度を与える界面活性剤溶
液と混合するか、懸濁する。こうして得られた混合物
は、必要に応じ攪拌処理されることができる。また場合
によっては、混合物中にガラスビーズなどを加えて攪拌
処理してもよい。攪拌処理は、測定感度を改善しうるも
のであれば、例えば穏やかな混合のみで済ますこともで
きるし、激しい攪拌混合であることもできる。処理温度
は、室温で行うこともできるし、冷却下行うこともでき
るし、３７℃あるいはそれ以上の温度とすることも測定
感度を改善しうるものであれば、採用できる。界面活性
剤で処理されたＨＡＶ抽出物は、そのまま次の処理に使
用できるし、あるいは一旦保存したのち次の処理に使用
できるし、また必要に応じ遠心分離などの分離処理を
し、さらに必要に応じ洗浄などの処理をして後次の処理
に使用できる。これらの処理は、測定時の非特異吸着を
抑制し、感度を改善しうるように選ぶことができる。
たっては、必要に応じＨＡＶ抽出物を緩衝剤、希釈液又
は希釈剤などで希釈し、所要濃度を与える界面活性剤溶
液と混合するか、懸濁する。こうして得られた混合物
は、必要に応じ攪拌処理されることができる。また場合
によっては、混合物中にガラスビーズなどを加えて攪拌
処理してもよい。攪拌処理は、測定感度を改善しうるも
のであれば、例えば穏やかな混合のみで済ますこともで
きるし、激しい攪拌混合であることもできる。処理温度
は、室温で行うこともできるし、冷却下行うこともでき
るし、３７℃あるいはそれ以上の温度とすることも測定
感度を改善しうるものであれば、採用できる。界面活性
剤で処理されたＨＡＶ抽出物は、そのまま次の処理に使
用できるし、あるいは一旦保存したのち次の処理に使用
できるし、また必要に応じ遠心分離などの分離処理を
し、さらに必要に応じ洗浄などの処理をして後次の処理
に使用できる。これらの処理は、測定時の非特異吸着を
抑制し、感度を改善しうるように選ぶことができる。
【００２１】本発明の界面活性剤処理の際の処理液にお
いては、緩衝剤、希釈液又は希釈剤、キレート化剤、保
存剤などを添加して用いることができる。緩衝剤、希釈
液又は希釈剤としては、水、リン酸又はリン酸塩緩衝
液、Ｔｒｉｓ緩衝液、例えば生理食塩水などの塩化ナト
リウム液、ＨＥＰＥＳ液、ＰＩＢＥＳ液、ＣＡＰＳ液、
ＭＯＰＳ液、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）
−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）液、Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスル
ホン酸（ＴＥＳ）液、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−
アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）液、アミノ酸液な
どが挙げられる。これらは単独でも、任意に組合わせて
配合して用いることができる。キレート化剤としては、
ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどが挙げられる。
いては、緩衝剤、希釈液又は希釈剤、キレート化剤、保
存剤などを添加して用いることができる。緩衝剤、希釈
液又は希釈剤としては、水、リン酸又はリン酸塩緩衝
液、Ｔｒｉｓ緩衝液、例えば生理食塩水などの塩化ナト
リウム液、ＨＥＰＥＳ液、ＰＩＢＥＳ液、ＣＡＰＳ液、
ＭＯＰＳ液、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）
−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）液、Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスル
ホン酸（ＴＥＳ）液、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−
アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）液、アミノ酸液な
どが挙げられる。これらは単独でも、任意に組合わせて
配合して用いることができる。キレート化剤としては、
ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどが挙げられる。
【００２２】本発明によれば、ＨＡＶ抽出物は、必要に
応じて、その感染性を不活性化する前に上記界面活性剤
で処理し、つぎに得られた界面活性剤で処理されたＨＡ
Ｖを、公知の方法又はそれを修飾した方法により不活性
化処理してもよい。不活性化処理は、上記と同様にして
よく、例えば約３７℃で約３７％ホルマリン溶液の１：
４０００希釈下にインキュベーション処理することによ
り行うことができる。
応じて、その感染性を不活性化する前に上記界面活性剤
で処理し、つぎに得られた界面活性剤で処理されたＨＡ
Ｖを、公知の方法又はそれを修飾した方法により不活性
化処理してもよい。不活性化処理は、上記と同様にして
よく、例えば約３７℃で約３７％ホルマリン溶液の１：
４０００希釈下にインキュベーション処理することによ
り行うことができる。
【００２３】より具体的な態様において、本発明で用い
られるＨＡＶ抗原試薬は、イン・ビトロの細胞培養法で
得られた細胞ライゼートから得られたＨＡＶ抽出物を約
０．５％ｖ／ｖ〜約１．０％ｖ／ｖの範囲の濃度のドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）液と混合し、つぎに必要
に応じ、例えば室温で３時間インキュベーション処理
し、ＳＤＳ処理ＨＡＶ抽出物を得ることによって提供さ
れるものであることもできる。本発明では、少なくとも
ＩｇＭまたはＩｇＭ含有水溶液処理工程と組合せ、その
該得られたＳＤＳ処理ＨＡＶ抽出物を用いた試料中のＨ
ＡＶ抗体の免疫測定試薬及びそれを用いた試料中の抗体
の測定法も提供される。
られるＨＡＶ抗原試薬は、イン・ビトロの細胞培養法で
得られた細胞ライゼートから得られたＨＡＶ抽出物を約
０．５％ｖ／ｖ〜約１．０％ｖ／ｖの範囲の濃度のドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）液と混合し、つぎに必要
に応じ、例えば室温で３時間インキュベーション処理
し、ＳＤＳ処理ＨＡＶ抽出物を得ることによって提供さ
れるものであることもできる。本発明では、少なくとも
ＩｇＭまたはＩｇＭ含有水溶液処理工程と組合せ、その
該得られたＳＤＳ処理ＨＡＶ抽出物を用いた試料中のＨ
ＡＶ抗体の免疫測定試薬及びそれを用いた試料中の抗体
の測定法も提供される。
【００２４】本発明における特異的ＩｇＭ抗体を測定す
るにあたっては、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定
法、螢光免疫測定法、及び化学発光免疫測定法などの方
法によることができる。特に化学発光免疫測定法、例え
ばＩｇＭ捕捉固相化学発光免疫測定法は自動化された測
定ができ好ましい方法である。
るにあたっては、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定
法、螢光免疫測定法、及び化学発光免疫測定法などの方
法によることができる。特に化学発光免疫測定法、例え
ばＩｇＭ捕捉固相化学発光免疫測定法は自動化された測
定ができ好ましい方法である。
【００２５】本発明において試料中の特異的ＩｇＭ抗体
を測定するにあたっては、抗原抗体反応にあずかる抗原
や抗体は、必要に応じて、例えば、寒天、アガロース、
セルロース、紙、ニトロセルロース、デキストラン、ゼ
ラチン、キチン、コラーゲン、綿などの生体由来高分子
あるいは天然物由来高分子、ポリスチレン、ポリエチレ
ン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドなどの
アクリル樹脂、イオン交換樹脂、光架橋樹脂、テフロ
ン、ポリアセタールなどの合成高分子、ガラスビーズ、
シリカゲル、アルミナ、セラミック、カーボン、硫酸マ
グネシウムなどの無機質材料などからなる、微粒子、ビ
ーズ、マイクロプレート、マイクロタイターウェル、マ
イクロチューブ、トリップ、メンブレン、トレイ、ゲル
など、さらには赤血球、ラテックス粒子、乳剤などの固
体担体に固定しておき、この固定担体を、分析対象とし
ての抗体等を含有する試料と接触させ、こうして固定担
体に固定された抗原と、分析試料中の抗体等とを特異的
に結合反応せしめ、この特異的に結合した分析対象物を
検知することによりおこなうことができる。
を測定するにあたっては、抗原抗体反応にあずかる抗原
や抗体は、必要に応じて、例えば、寒天、アガロース、
セルロース、紙、ニトロセルロース、デキストラン、ゼ
ラチン、キチン、コラーゲン、綿などの生体由来高分子
あるいは天然物由来高分子、ポリスチレン、ポリエチレ
ン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミドなどの
アクリル樹脂、イオン交換樹脂、光架橋樹脂、テフロ
ン、ポリアセタールなどの合成高分子、ガラスビーズ、
シリカゲル、アルミナ、セラミック、カーボン、硫酸マ
グネシウムなどの無機質材料などからなる、微粒子、ビ
ーズ、マイクロプレート、マイクロタイターウェル、マ
イクロチューブ、トリップ、メンブレン、トレイ、ゲル
など、さらには赤血球、ラテックス粒子、乳剤などの固
体担体に固定しておき、この固定担体を、分析対象とし
ての抗体等を含有する試料と接触させ、こうして固定担
体に固定された抗原と、分析試料中の抗体等とを特異的
に結合反応せしめ、この特異的に結合した分析対象物を
検知することによりおこなうことができる。
【００２６】好ましい態様において、本発明では試料と
反応せしめられる抗ヒトＩｇＭ抗体結合固体担体あるい
は粒子状担体などとしては、ポリスチレン製のビーズ、
ポリスチレン製の微小粒子などを用いることができる。
また、抗体としては、ヒトＩｇＭに対する抗体であれば
特に限定されることなく用いることができる。抗体は常
法により得ることができ、例えば村松繁、他編、実験生
物学講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０
年、日本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学
研究法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、
新生化学実験講座１２、分子免疫学ＩＩＩ、抗原・抗体
・補体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に
準じて、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、ラ
ット、マウスなどを免疫するなどして得たり、モノクロ
ーナル抗体であることもでき、これらは単独でもあるい
はこれらを組合せて用いることは任意にできる。これら
抗体は、必要なら、ペプシン、パパインなどの酵素で消
化して、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ’として使用してもよ
い。抗ヒトＩｇＭ抗体としては、好ましくはμ鎖に対し
て特異的に反応する抗体、抗μ鎖−ヒトＩｇＭ抗体が挙
げられ、これらはマウスミエローマ細胞を用いて細胞融
合技術を利用して得られたモノクローナル抗体であって
もよいことはいうまでもない。また、抗ＨＡＶ抗体は、
高力価を有するヒトＨＡＶ陽性血清又は血漿から得られ
たものが利用できるが、上記したようにモノクローナル
抗体であってもよいことはいうまでもない。抗ＨＢｃ抗
体は、ウイルス培養物から得ることもできるが、遺伝子
組換えの手法を用い、大腸菌、酵母などで発現させた組
換え抗原であることもできる。
反応せしめられる抗ヒトＩｇＭ抗体結合固体担体あるい
は粒子状担体などとしては、ポリスチレン製のビーズ、
ポリスチレン製の微小粒子などを用いることができる。
また、抗体としては、ヒトＩｇＭに対する抗体であれば
特に限定されることなく用いることができる。抗体は常
法により得ることができ、例えば村松繁、他編、実験生
物学講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０
年、日本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学
研究法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、
新生化学実験講座１２、分子免疫学ＩＩＩ、抗原・抗体
・補体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に
準じて、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、ラ
ット、マウスなどを免疫するなどして得たり、モノクロ
ーナル抗体であることもでき、これらは単独でもあるい
はこれらを組合せて用いることは任意にできる。これら
抗体は、必要なら、ペプシン、パパインなどの酵素で消
化して、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ’として使用してもよ
い。抗ヒトＩｇＭ抗体としては、好ましくはμ鎖に対し
て特異的に反応する抗体、抗μ鎖−ヒトＩｇＭ抗体が挙
げられ、これらはマウスミエローマ細胞を用いて細胞融
合技術を利用して得られたモノクローナル抗体であって
もよいことはいうまでもない。また、抗ＨＡＶ抗体は、
高力価を有するヒトＨＡＶ陽性血清又は血漿から得られ
たものが利用できるが、上記したようにモノクローナル
抗体であってもよいことはいうまでもない。抗ＨＢｃ抗
体は、ウイルス培養物から得ることもできるが、遺伝子
組換えの手法を用い、大腸菌、酵母などで発現させた組
換え抗原であることもできる。
【００２７】ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、
螢光免疫測定法、化学発光免疫測定法などでは、
125Ｉ、 3Ｈなどの放射性物質、西洋わさびペルオキシ
ダーゼ、β−D −ガラクトシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼなどの酵素、フルオレッセインなどの螢光色
素、アクリジニウムエステル類などの化学発光色素、金
コロイド、セレンコロイドあるいは有色ラテックス粒子
などの有色物質などで標識された抗原あるいは二次抗体
が試薬として用いられ、分析試料中の抗体、複合体等と
特異的に結合反応せしめられ、その放射活性、酵素活
性、化学発光あるいは色の有無などを測定して、試料中
の抗体等が存在していたか否かを判別することができ
る。本発明においては、特に化学発光標識法、例えばア
クリジニウムエステル類あるいは螢光標識法、例えば発
光ランタニドなどで標識された二次抗体試薬を用いる螢
光あるいは化学発光免疫測定法は自動化された測定がで
き好ましい方法である。特にアクリジニウムエステル類
で標識された二次抗体試薬を用いる化学発光免疫測定法
は自動化された測定ができ好ましい。
螢光免疫測定法、化学発光免疫測定法などでは、
125Ｉ、 3Ｈなどの放射性物質、西洋わさびペルオキシ
ダーゼ、β−D −ガラクトシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼなどの酵素、フルオレッセインなどの螢光色
素、アクリジニウムエステル類などの化学発光色素、金
コロイド、セレンコロイドあるいは有色ラテックス粒子
などの有色物質などで標識された抗原あるいは二次抗体
が試薬として用いられ、分析試料中の抗体、複合体等と
特異的に結合反応せしめられ、その放射活性、酵素活
性、化学発光あるいは色の有無などを測定して、試料中
の抗体等が存在していたか否かを判別することができ
る。本発明においては、特に化学発光標識法、例えばア
クリジニウムエステル類あるいは螢光標識法、例えば発
光ランタニドなどで標識された二次抗体試薬を用いる螢
光あるいは化学発光免疫測定法は自動化された測定がで
き好ましい方法である。特にアクリジニウムエステル類
で標識された二次抗体試薬を用いる化学発光免疫測定法
は自動化された測定ができ好ましい。
【００２８】アクリジニウムエステル類としては、例え
ば特開昭６２−３９５９８号公報、特開昭６２−６１９
６９号公報、特開昭６３−５７５７２号公報、特開昭６
３−１０１３６８号公報、特開昭６３−１１２５６４号
公報、特開平１−１９９９４９号公報、特開平１−２６
１４６１号公報、特開平２−９６５６７号公報、特開平
２−１３３４６９号公報、特開平２−５０３２６８号公
報、特開平２−５０１７７２号公報、欧州特許公開出願
第００８２６３６号、英国特許明細書第１，４６１，８
７７号、米国特許明細書第３，５３９，５７４号などに
記載のＮ−アルキル又はアリールアクリジニウム−９−
カルボン酸エステルなどが挙げられる。
ば特開昭６２−３９５９８号公報、特開昭６２−６１９
６９号公報、特開昭６３−５７５７２号公報、特開昭６
３−１０１３６８号公報、特開昭６３−１１２５６４号
公報、特開平１−１９９９４９号公報、特開平１−２６
１４６１号公報、特開平２−９６５６７号公報、特開平
２−１３３４６９号公報、特開平２−５０３２６８号公
報、特開平２−５０１７７２号公報、欧州特許公開出願
第００８２６３６号、英国特許明細書第１，４６１，８
７７号、米国特許明細書第３，５３９，５７４号などに
記載のＮ−アルキル又はアリールアクリジニウム−９−
カルボン酸エステルなどが挙げられる。
【００２９】特に、特開昭６３−１１２５６４号公報、
米国特許明細書第３，５３９，５７４号などに記載の１
０−アルキル・Ｎ−アルキル又はアリール−スルホニル
−Ｎ−アルキル又はアリールスルホニルアクリジニウム
−９−カルボキサミド、Ｎ−メチルアクリジニウム−９
−カルボン酸エステルなどは代表的な化学発光標識とし
て挙げられる。アクリジニウム標識の場合、測定前にト
リガー試薬処理、例えば過酸化水素、例えば約０．０１
％〜約０．１％の過酸化水素水溶液、及び水酸化ナトリ
ウム、例えば約０．０５Ｎ〜約０．５Ｎの水酸化ナトリ
ウム水溶液で処理してから、ルミノメーターなどを用い
て測定を行うことができる。
米国特許明細書第３，５３９，５７４号などに記載の１
０−アルキル・Ｎ−アルキル又はアリール−スルホニル
−Ｎ−アルキル又はアリールスルホニルアクリジニウム
−９−カルボキサミド、Ｎ−メチルアクリジニウム−９
−カルボン酸エステルなどは代表的な化学発光標識とし
て挙げられる。アクリジニウム標識の場合、測定前にト
リガー試薬処理、例えば過酸化水素、例えば約０．０１
％〜約０．１％の過酸化水素水溶液、及び水酸化ナトリ
ウム、例えば約０．０５Ｎ〜約０．５Ｎの水酸化ナトリ
ウム水溶液で処理してから、ルミノメーターなどを用い
て測定を行うことができる。
【００３０】発光ランタニドとしては、例えば欧州特許
公開出願第００６８８７５号、米国特許明細書第４，３
７４，１２０号、米国特許明細書第４，２８３，３８２
号、米国特許明細書第４，２５９，３１３号、米国特許
明細書第４，３５２，７５１号、米国特許明細書第４，
４３２，９０７号、欧州特許公開出願第０１０３５５８
号などに記載のアミノカルボン酸基を持つ発光ランタニ
ドをキレート化できるものなどが挙げられる。また測定
前にレーザー光などによる励起処理をして測定を容易に
することもできる。勿論、標識剤は上記のものに限定さ
れること無く、測定に使用される機器、場所などを考慮
し、適宜当該分野で使用することが知られているものの
中から目的に応じ選択して用いることができる。
公開出願第００６８８７５号、米国特許明細書第４，３
７４，１２０号、米国特許明細書第４，２８３，３８２
号、米国特許明細書第４，２５９，３１３号、米国特許
明細書第４，３５２，７５１号、米国特許明細書第４，
４３２，９０７号、欧州特許公開出願第０１０３５５８
号などに記載のアミノカルボン酸基を持つ発光ランタニ
ドをキレート化できるものなどが挙げられる。また測定
前にレーザー光などによる励起処理をして測定を容易に
することもできる。勿論、標識剤は上記のものに限定さ
れること無く、測定に使用される機器、場所などを考慮
し、適宜当該分野で使用することが知られているものの
中から目的に応じ選択して用いることができる。
【００３１】固体担体、粒子状担体あるいは標識などと
抗原あるいは抗体などとを結合あるいは吸着させるに
は、当該分野で汎用されている方法を用いることがで
き、例えばイオン相互作用、疎水相互作用、共有結合な
どの物理的吸着や化学的結合により行うことができる。
例えば、架橋剤としては、グルタルアルデヒド、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−ス
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルメルカプト
アセテート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、
Ｎ−スクシンイミジル ６−マレイミドヘキサノエー
ト、Ｎ−スクシンイミジル ４−ヨードアセチルアミノ
ベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル３−（ｐ−ヒドロ
キシフェニル）プロピオンネート、Ｎ−スクシンイミジ
ル ｍ−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジ
ル ４−マレイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジル
（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ−スクシ
ンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレー
トなどが挙げられる。
抗原あるいは抗体などとを結合あるいは吸着させるに
は、当該分野で汎用されている方法を用いることがで
き、例えばイオン相互作用、疎水相互作用、共有結合な
どの物理的吸着や化学的結合により行うことができる。
例えば、架橋剤としては、グルタルアルデヒド、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−ス
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルメルカプト
アセテート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、
Ｎ−スクシンイミジル ６−マレイミドヘキサノエー
ト、Ｎ−スクシンイミジル ４−ヨードアセチルアミノ
ベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル３−（ｐ−ヒドロ
キシフェニル）プロピオンネート、Ｎ−スクシンイミジ
ル ｍ−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジ
ル ４−マレイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジル
（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ−スクシ
ンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレー
トなどが挙げられる。
【００３２】固体担体、粒子状担体などの例としては、
上記したようなものが挙げられ、例えば寒天、アガロー
ス、架橋アガロース、架橋アルギン酸、架橋グアガム、
ニトロセルロースやカルボキシルセルロースなどのセル
ロースエステルあるいは混合セルロースエステル、ゼラ
チン、架橋ゼラチン、ラテックス、ゴム、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジ
エン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリ
アクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタ
クリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、
アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共
重合体などのポリエステル、ポリアミド、ポリウレタ
ン、ポリエポキシ樹脂などの天然あるいは合成の修飾あ
るいは非修飾の重合炭水化物、重合炭化水素など、それ
らの架橋誘導体など、ガラス、例えば活性化ガラス、シ
リカゲル、カオリン、タルク、シリカ−アルミナ、アル
ミナ、硫酸バリウムなどの無機材料などからなる群から
選ばれたものを、多孔性のゲル、微粒子などにしたもの
が挙げられる。本発明においては、測定は競合アッセ
イ、サンドイッチアッセイ、中和アッセイ、固相アッセ
イ、クロマトグラムアッセイなどに適したようにしてお
こなうこともできる。
上記したようなものが挙げられ、例えば寒天、アガロー
ス、架橋アガロース、架橋アルギン酸、架橋グアガム、
ニトロセルロースやカルボキシルセルロースなどのセル
ロースエステルあるいは混合セルロースエステル、ゼラ
チン、架橋ゼラチン、ラテックス、ゴム、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジ
エン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリ
アクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタ
クリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、
アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共
重合体などのポリエステル、ポリアミド、ポリウレタ
ン、ポリエポキシ樹脂などの天然あるいは合成の修飾あ
るいは非修飾の重合炭水化物、重合炭化水素など、それ
らの架橋誘導体など、ガラス、例えば活性化ガラス、シ
リカゲル、カオリン、タルク、シリカ−アルミナ、アル
ミナ、硫酸バリウムなどの無機材料などからなる群から
選ばれたものを、多孔性のゲル、微粒子などにしたもの
が挙げられる。本発明においては、測定は競合アッセ
イ、サンドイッチアッセイ、中和アッセイ、固相アッセ
イ、クロマトグラムアッセイなどに適したようにしてお
こなうこともできる。
【００３３】本発明においては、標識用試薬として、４
−ヒドロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミ
ン、テトラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオ
キシダーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフ
ェニルガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、
ウンベリフェリルホスフェート、ニトロフェニルホスフ
ェート、ＮＡＤＰなどとアルカリフォスファターゼ、グ
ルコース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試
薬、放射性物質試薬、フルオレッセインイソチオシアネ
ート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ア
クリジニウムエステル類、発光ランタニドなどを用いて
いる螢光試薬、発光試薬、化学発光試薬、金コロイド、
銀コロイド、セレンコロイドなどのコロイド標識試薬、
磁性体試薬、ビオチン標識抗ビオチン抗体などのハプテ
ン標識抗ハプテン抗体検出系試薬などを用いることがで
きる。上記したように本発明においては、特に化学発光
標識試薬、例えばアクリジニウムエステル類あるいは螢
光標識試薬、例えば発光ランタニドなどで標識された二
次抗体試薬を用いると、測定は自動化され好ましい。
−ヒドロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミ
ン、テトラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオ
キシダーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフ
ェニルガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、
ウンベリフェリルホスフェート、ニトロフェニルホスフ
ェート、ＮＡＤＰなどとアルカリフォスファターゼ、グ
ルコース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試
薬、放射性物質試薬、フルオレッセインイソチオシアネ
ート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ア
クリジニウムエステル類、発光ランタニドなどを用いて
いる螢光試薬、発光試薬、化学発光試薬、金コロイド、
銀コロイド、セレンコロイドなどのコロイド標識試薬、
磁性体試薬、ビオチン標識抗ビオチン抗体などのハプテ
ン標識抗ハプテン抗体検出系試薬などを用いることがで
きる。上記したように本発明においては、特に化学発光
標識試薬、例えばアクリジニウムエステル類あるいは螢
光標識試薬、例えば発光ランタニドなどで標識された二
次抗体試薬を用いると、測定は自動化され好ましい。
【００３４】本発明の測定系においては、前記以外の界
面活性剤、緩衝剤、希釈液又は希釈剤、ブロッキング
剤、キレート化剤、保存剤などを含有させるようにして
用いることができる。好ましいこの界面活性剤として
は、ポリオキシエチレンソルビタン（代表的なものは、
Ｔｗｅｅｎ ２０などの商品名で入手しうる）、ポリオ
キシエチレンエーテル（代表的なものは、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００などの商品名で入手しうる）、オクチルフ
ェノール・エチレンオキサイド縮合物（代表的なもの
は、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０などの商品名で入手しう
る）などが挙げられる。
面活性剤、緩衝剤、希釈液又は希釈剤、ブロッキング
剤、キレート化剤、保存剤などを含有させるようにして
用いることができる。好ましいこの界面活性剤として
は、ポリオキシエチレンソルビタン（代表的なものは、
Ｔｗｅｅｎ ２０などの商品名で入手しうる）、ポリオ
キシエチレンエーテル（代表的なものは、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００などの商品名で入手しうる）、オクチルフ
ェノール・エチレンオキサイド縮合物（代表的なもの
は、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０などの商品名で入手しう
る）などが挙げられる。
【００３５】緩衝剤、希釈液又は希釈剤としては、上記
したような水、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、生理食
塩水など、ＨＥＰＥＳ液、ＰＢＥＳ液、ＣＡＰＳ液、Ｍ
ＯＰＳ液、アミノ酸液などが挙げられる。これらは単独
でも、任意に配合しても用いることができる。キレート
化剤としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどが挙げられる。
したような水、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、生理食
塩水など、ＨＥＰＥＳ液、ＰＢＥＳ液、ＣＡＰＳ液、Ｍ
ＯＰＳ液、アミノ酸液などが挙げられる。これらは単独
でも、任意に配合しても用いることができる。キレート
化剤としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどが挙げられる。
【００３６】保存剤としては、例えばナトリウムアジ
ド、エチルパラベンなどが挙げられる。その他、本発明
の測定系には、各種動物の血清、例えばウシ血清、ウシ
血清アルブンミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）、ヤギ血清、卵白アルブンミン、ゼラチン、各種乳
蛋白質、例えばスキムミルク、カゼイン、カゼイン分解
物、ホエー蛋白質など、ポリビニルアルコール、ポリビ
ニルピロリドンなどからなる群から選ばれたものを添加
することができる。
ド、エチルパラベンなどが挙げられる。その他、本発明
の測定系には、各種動物の血清、例えばウシ血清、ウシ
血清アルブンミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）、ヤギ血清、卵白アルブンミン、ゼラチン、各種乳
蛋白質、例えばスキムミルク、カゼイン、カゼイン分解
物、ホエー蛋白質など、ポリビニルアルコール、ポリビ
ニルピロリドンなどからなる群から選ばれたものを添加
することができる。
【００３７】本発明においては、試薬は単一の容器ある
いは複数の容器に入れてあり、使用にあたり配合されて
用いるようになっていてもよい。ＩｇＭ抗体測定の代表
的なＨＡＶ感染診断のための測定系のより具体的な態様
においては、本発明は、試料を適当な濃度に生理食塩水
などで希釈し、例えば約８０〜１２０倍、好ましくは約
１００倍に希釈し、ついで適当な量のヒトＩｇＭ溶液及
び抗ヒトＩｇＭ抗体結合固体担体あるいは粒子状担体な
どを反応させ、次に（１）ＨＡＶ感染培養細胞から収穫
されたＨＡＶ抽出物又は（２）このＨＡＶ抽出物を少な
くとも界面活性剤、例えばＳＤＳで処理して得られたＨ
ＡＶ抗原と免疫学的に反応させ、得られた反応生成物に
化学発光標識抗ＨＡＶ抗体、例えばアクリジニウム標識
抗ＨＡＶ抗体を免疫学的に反応させ、過酸化水素溶液及
び水酸化ナトリウム溶液からなるトリガー試薬と反応さ
せた後検知を行うことを特徴とするＨＡＶ抗体の測定法
が提供されうる。
いは複数の容器に入れてあり、使用にあたり配合されて
用いるようになっていてもよい。ＩｇＭ抗体測定の代表
的なＨＡＶ感染診断のための測定系のより具体的な態様
においては、本発明は、試料を適当な濃度に生理食塩水
などで希釈し、例えば約８０〜１２０倍、好ましくは約
１００倍に希釈し、ついで適当な量のヒトＩｇＭ溶液及
び抗ヒトＩｇＭ抗体結合固体担体あるいは粒子状担体な
どを反応させ、次に（１）ＨＡＶ感染培養細胞から収穫
されたＨＡＶ抽出物又は（２）このＨＡＶ抽出物を少な
くとも界面活性剤、例えばＳＤＳで処理して得られたＨ
ＡＶ抗原と免疫学的に反応させ、得られた反応生成物に
化学発光標識抗ＨＡＶ抗体、例えばアクリジニウム標識
抗ＨＡＶ抗体を免疫学的に反応させ、過酸化水素溶液及
び水酸化ナトリウム溶液からなるトリガー試薬と反応さ
せた後検知を行うことを特徴とするＨＡＶ抗体の測定法
が提供されうる。
【００３８】イン・ビトロの細胞培養法で得られたウイ
ルス抗原を用いて、試料中の該抗原と免疫学的に反応性
の抗体を測定する場合、感染細胞を溶菌化して得られた
細胞ライゼートから一旦分離されたＨＡＶ抽出物を、さ
らに界面活性剤で処理したものを、ＨＡＶ抗原試薬とし
て用いると、予想外にも抗原活性に悪影響を与えること
無く、測定感度を大幅に上昇させることができる。
ルス抗原を用いて、試料中の該抗原と免疫学的に反応性
の抗体を測定する場合、感染細胞を溶菌化して得られた
細胞ライゼートから一旦分離されたＨＡＶ抽出物を、さ
らに界面活性剤で処理したものを、ＨＡＶ抗原試薬とし
て用いると、予想外にも抗原活性に悪影響を与えること
無く、測定感度を大幅に上昇させることができる。
【００３９】本発明においては、特異的ＩｇＭ抗体を測
定する公知の免疫学的測定法にそれを利用可能であり、
例えば、ウイルス感染、病原性微生物感染などにより生
ずる特異抗体測定系に応用できると考えられる。ウイル
スとしては、単純ヘルペス、帯状ヘルペス、水痘ウイル
ス、ムンプス、麻疹、風疹、ＡＩＤＳウイルス（ＨＩ
Ｖ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）などが挙げられ、病原性微生物などとして
は、ジフテリア菌（Corynebacteium diphtheriae）、破
傷風菌（Clostridium tetani）、コレラ菌（Vibrio cho
lerae ）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum ）、
ウェルシュ菌（Clostridium perfringens ）、黄色ブド
ウ球菌（Staphylococcus aureus ）、例えば、MRSA、赤
痢菌（Shigella dysenteriae）、百日咳菌（Bordetella
perussis ）、チフス菌（Salmonellatyphi）、パラチ
フスＡ菌（Salmonella paratyphi）、腸炎菌（Salmonel
la enteritidis）、結核菌（Mycobacterium tuberculos
is）などが挙げられる。
定する公知の免疫学的測定法にそれを利用可能であり、
例えば、ウイルス感染、病原性微生物感染などにより生
ずる特異抗体測定系に応用できると考えられる。ウイル
スとしては、単純ヘルペス、帯状ヘルペス、水痘ウイル
ス、ムンプス、麻疹、風疹、ＡＩＤＳウイルス（ＨＩ
Ｖ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）などが挙げられ、病原性微生物などとして
は、ジフテリア菌（Corynebacteium diphtheriae）、破
傷風菌（Clostridium tetani）、コレラ菌（Vibrio cho
lerae ）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum ）、
ウェルシュ菌（Clostridium perfringens ）、黄色ブド
ウ球菌（Staphylococcus aureus ）、例えば、MRSA、赤
痢菌（Shigella dysenteriae）、百日咳菌（Bordetella
perussis ）、チフス菌（Salmonellatyphi）、パラチ
フスＡ菌（Salmonella paratyphi）、腸炎菌（Salmonel
la enteritidis）、結核菌（Mycobacterium tuberculos
is）などが挙げられる。
【００４０】
【実施例】次に実施例を示して、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこの具体例により限定されるもの
でなく、その思想に従うかぎり各種の形態で実施できる
ことは理解されるべきである。
説明するが、本発明はこの具体例により限定されるもの
でなく、その思想に従うかぎり各種の形態で実施できる
ことは理解されるべきである。
【００４１】実施例１
ＩｇＭの調製
市販のヒトＩｇＭ溶液（米国ケミコン・インターナショ
ナル社製〔Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ，ＵＳＡ．〕）を使用の前に０．１％アジ化ナトリ
ウムを含有する０．０２Ｍのトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液
（ｐＨ８．５）中に希釈し、ＩｇＭ試薬とした。
ナル社製〔Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ，ＵＳＡ．〕）を使用の前に０．１％アジ化ナトリ
ウムを含有する０．０２Ｍのトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液
（ｐＨ８．５）中に希釈し、ＩｇＭ試薬とした。
【００４２】抗ヒトμ−ＩｇＭ抗体被覆微粒子の調製
ヤギから得られたヒトＩｇＭのμ鎖に対して特異性をも
つポリクローナル抗体( 米国ジャクソン・イムノ・リサ
ーチ・ラボ社製〔Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ．，ＵＳＡ．〕）をカルボキシ
ル化ポリスチレンラテックス微粒子( 米国セラダイン社
製〔Ｓｅｒａｄｙｎ，ＵＳＡ．〕；０．２μｍ）に以下
に記載の方法で結合した。まず、０．０１５ＭのＭＥＳ
（２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸）緩衝液
（ｐＨ４．７）中の１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ；１６ｍｇ／
ｍｌ）を用いてポリクローナル抗体抗ヒトＩｇＭ抗体
（１６０ｍｇ／ｍｌ）を室温で１．５時間かけて結合し
た。次に１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０及び０．９％
ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）を用いて洗浄した。最終的には、０．０５％ゼ
ラチン、０．１％ツイーン２０、０．９％ＮａＣｌ及び
０．１％アジ化ナトリウムを含有する０．０１Ｍのトリ
ス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ｐＨ７．４）中に貯蔵した。被
覆微粒子の固形分の％が、０．０６２５％になるように
貯蔵バッファーで希釈し、抗ヒトμ−ＩｇＭ抗体被覆微
粒子試薬とした。
つポリクローナル抗体( 米国ジャクソン・イムノ・リサ
ーチ・ラボ社製〔Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ．，ＵＳＡ．〕）をカルボキシ
ル化ポリスチレンラテックス微粒子( 米国セラダイン社
製〔Ｓｅｒａｄｙｎ，ＵＳＡ．〕；０．２μｍ）に以下
に記載の方法で結合した。まず、０．０１５ＭのＭＥＳ
（２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸）緩衝液
（ｐＨ４．７）中の１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ；１６ｍｇ／
ｍｌ）を用いてポリクローナル抗体抗ヒトＩｇＭ抗体
（１６０ｍｇ／ｍｌ）を室温で１．５時間かけて結合し
た。次に１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０及び０．９％
ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）を用いて洗浄した。最終的には、０．０５％ゼ
ラチン、０．１％ツイーン２０、０．９％ＮａＣｌ及び
０．１％アジ化ナトリウムを含有する０．０１Ｍのトリ
ス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ｐＨ７．４）中に貯蔵した。被
覆微粒子の固形分の％が、０．０６２５％になるように
貯蔵バッファーで希釈し、抗ヒトμ−ＩｇＭ抗体被覆微
粒子試薬とした。
【００４３】アクリジニウム標識抗ＨＡＶ抗体の調製
β−アラニンアクリジニウム（１ｍｇ）を無水ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）（１００μｌ）中に溶解し、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５．７５ｍｇ
／ｍｌ、５０μｌ）及びＥＤＡＣ（９．６ｍｇ／ｍｌ、
５０μｌ）を連続して添加し、暗所、２５℃で４８時間
攪拌することにより活性化した。プロテインＡ精製モノ
クローナル抗ＨＡＶ抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を含有してい
る、０．９％ＮａＣｌ及び０．５％ＣＨＡＰＳを含む
０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に活性化アクリ
ジニウムを加え（抗体の４倍のモル数）、反応混合物を
室温中で１０分間攪拌した。緩衝液を０．１％ＣＨＡＰ
Ｓ、０．１％アジ化ナトリウム及び０．９％ＮａＣｌを
含有する０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）に置
き換えた後、調製物を遠心分離にかけ、上清を置換後の
ものと同じ緩衝液で平衡化したバイオシル ＳＥＣ ２
５０（米国バイオラド社製〔Ｂｉｏｌａｄ，ＵＳＡ．〕
のＨＰＬＣカラム上のクロマトグラフィーにかけた。そ
れぞれのフラクション（１ｍｌ）を３６９ｎｍ及び２８
０ｎｍでの紫外分光分析により分析し、アクリジニウム
の結合量を決定した。結合体を濃縮フラクション（約１
００μｇ／ｍｌ）中、約４℃で貯蔵し、使用前に１％カ
ゼインナトリウム、０．１％ツイーン２０、０．１％ア
ジ化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．９％ＮａＣ
ｌを含有する０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）
で希釈し、アクリジニウム標識抗ＨＡＶ抗体試薬とし
た。
ホルムアミド（ＤＭＦ）（１００μｌ）中に溶解し、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５．７５ｍｇ
／ｍｌ、５０μｌ）及びＥＤＡＣ（９．６ｍｇ／ｍｌ、
５０μｌ）を連続して添加し、暗所、２５℃で４８時間
攪拌することにより活性化した。プロテインＡ精製モノ
クローナル抗ＨＡＶ抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を含有してい
る、０．９％ＮａＣｌ及び０．５％ＣＨＡＰＳを含む
０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に活性化アクリ
ジニウムを加え（抗体の４倍のモル数）、反応混合物を
室温中で１０分間攪拌した。緩衝液を０．１％ＣＨＡＰ
Ｓ、０．１％アジ化ナトリウム及び０．９％ＮａＣｌを
含有する０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）に置
き換えた後、調製物を遠心分離にかけ、上清を置換後の
ものと同じ緩衝液で平衡化したバイオシル ＳＥＣ ２
５０（米国バイオラド社製〔Ｂｉｏｌａｄ，ＵＳＡ．〕
のＨＰＬＣカラム上のクロマトグラフィーにかけた。そ
れぞれのフラクション（１ｍｌ）を３６９ｎｍ及び２８
０ｎｍでの紫外分光分析により分析し、アクリジニウム
の結合量を決定した。結合体を濃縮フラクション（約１
００μｇ／ｍｌ）中、約４℃で貯蔵し、使用前に１％カ
ゼインナトリウム、０．１％ツイーン２０、０．１％ア
ジ化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．９％ＮａＣ
ｌを含有する０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）
で希釈し、アクリジニウム標識抗ＨＡＶ抗体試薬とし
た。
【００４４】ＨＡＶ抗原の調製
ＨＡＶは栄養培地中のバース−アレキサンダー細胞（Ｂ
ａｒｔｈ−ＡｌｅｘａｎｄｅｒＣｅｌｌｓ）を用いて培
養した。培養細胞に、０．５％トライトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）Ｘ−１００を含有しかつ５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．
９％ＮａＣｌを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）を混合し、３６℃で１６〜６８時間攪拌した後、遠
心分離にかけ、上清を捨てることにより、ＨＡＶ抽出物
をホルムアルデヒド希釈倍率で１：４０００となるよう
に添加した後、３６℃で３日間攪拌して、ＨＡＶの感染
性を不活性化した。不活性化したＨＡＶ抽出物は、１％
牛血清アルブミン、０．０５％ツイーン２０、０．１％
アジ化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．９％Ｎａ
Ｃｌを含有する０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）で希釈し、ＨＡＶ抗原試薬とした。ＨＡＶ抗原試薬
は使用時まで４℃で貯蔵した。
ａｒｔｈ−ＡｌｅｘａｎｄｅｒＣｅｌｌｓ）を用いて培
養した。培養細胞に、０．５％トライトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）Ｘ−１００を含有しかつ５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．
９％ＮａＣｌを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）を混合し、３６℃で１６〜６８時間攪拌した後、遠
心分離にかけ、上清を捨てることにより、ＨＡＶ抽出物
をホルムアルデヒド希釈倍率で１：４０００となるよう
に添加した後、３６℃で３日間攪拌して、ＨＡＶの感染
性を不活性化した。不活性化したＨＡＶ抽出物は、１％
牛血清アルブミン、０．０５％ツイーン２０、０．１％
アジ化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．９％Ｎａ
Ｃｌを含有する０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）で希釈し、ＨＡＶ抗原試薬とした。ＨＡＶ抗原試薬
は使用時まで４℃で貯蔵した。
【００４５】アッセイ
ＨＡＶＡＢ−Ｍ陽性パネル試料を生理食塩水で希釈し
た。希釈試料をＩｇＭ試薬（３０μｌ）を用いてさらに
５倍に希釈した。比較としてＨＡＶＡＢ−Ｍ陰性パネル
試料を生理食塩水で希釈した後に、ＩｇＭを希釈する際
に用いた緩衝液を用いてさらに５倍に希釈した。希釈し
た試料（１２５μｌ）を容器に入れ、これに抗ヒトμ−
ＩｇＭ抗体被覆微粒子試薬（３０μｌ）を添加し、３７
℃で２０分間反応させた。反応した微粒子をガラス繊維
フィルターで捕捉し、０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．５）（３００μｌ）で２回洗浄した。次にＨＡＶ抗
原試薬（３０μｌ）をフィルター表面に添加し、３７℃
で２０分間フィルター表面に捕捉されている微粒子と反
応させた。フィルターを０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．５）（１００μｌ）で１回、そして同緩衝液（３０
０μｌ）で１回洗浄した。次にアクリジニウム標識抗Ｈ
ＡＶ抗体試薬（３０μｌ）をフィルター表面に添加し、
３７℃で１０分間フィルター表面に捕捉されている微粒
子と反応させた。フィルターを０．１Ｍのホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．５）（１００μｌ）で１回、そして同緩衝液
（３００μｌ）で１回洗浄した。
た。希釈試料をＩｇＭ試薬（３０μｌ）を用いてさらに
５倍に希釈した。比較としてＨＡＶＡＢ−Ｍ陰性パネル
試料を生理食塩水で希釈した後に、ＩｇＭを希釈する際
に用いた緩衝液を用いてさらに５倍に希釈した。希釈し
た試料（１２５μｌ）を容器に入れ、これに抗ヒトμ−
ＩｇＭ抗体被覆微粒子試薬（３０μｌ）を添加し、３７
℃で２０分間反応させた。反応した微粒子をガラス繊維
フィルターで捕捉し、０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．５）（３００μｌ）で２回洗浄した。次にＨＡＶ抗
原試薬（３０μｌ）をフィルター表面に添加し、３７℃
で２０分間フィルター表面に捕捉されている微粒子と反
応させた。フィルターを０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．５）（１００μｌ）で１回、そして同緩衝液（３０
０μｌ）で１回洗浄した。次にアクリジニウム標識抗Ｈ
ＡＶ抗体試薬（３０μｌ）をフィルター表面に添加し、
３７℃で１０分間フィルター表面に捕捉されている微粒
子と反応させた。フィルターを０．１Ｍのホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．５）（１００μｌ）で１回、そして同緩衝液
（３００μｌ）で１回洗浄した。
【００４６】このフィルターを化学発光読取り機に移
し、この中で０．２５ＮのＮａＯＨ中の０．４％過酸化
水素を含むトリガー溶液（５０μｌ）をフィルターに送
り込んだ。微粒子に結合したアクリジニウムが発光し、
生じた光の量を測定した。低いＨＡＶＡＢ−Ｍ陽性パネ
ル試料の濃度では、ＩｇＭ試薬による希釈処理では２１
３６の発光量（光子カウント）で、ＩｇＭ試薬添加無し
では１３２９９の発光量（光子カウント）であり、中程
度のＨＡＶＡＢ−Ｍ陽性パネル試料の濃度では、ＩｇＭ
試薬による希釈処理では５０１０の発光量（光子カウン
ト）で、ＩｇＭ試薬添加無しでは１６７８８の発光量
（光子カウント）であり、高いＨＡＶＡＢ−Ｍ陽性パネ
ル試料の濃度では、ＩｇＭ試薬による希釈処理では１２
５３１の発光量（光子カウント）で、ＩｇＭ試薬添加無
しでは１８０２９の発光量（光子カウント）であった。
し、この中で０．２５ＮのＮａＯＨ中の０．４％過酸化
水素を含むトリガー溶液（５０μｌ）をフィルターに送
り込んだ。微粒子に結合したアクリジニウムが発光し、
生じた光の量を測定した。低いＨＡＶＡＢ−Ｍ陽性パネ
ル試料の濃度では、ＩｇＭ試薬による希釈処理では２１
３６の発光量（光子カウント）で、ＩｇＭ試薬添加無し
では１３２９９の発光量（光子カウント）であり、中程
度のＨＡＶＡＢ−Ｍ陽性パネル試料の濃度では、ＩｇＭ
試薬による希釈処理では５０１０の発光量（光子カウン
ト）で、ＩｇＭ試薬添加無しでは１６７８８の発光量
（光子カウント）であり、高いＨＡＶＡＢ−Ｍ陽性パネ
ル試料の濃度では、ＩｇＭ試薬による希釈処理では１２
５３１の発光量（光子カウント）で、ＩｇＭ試薬添加無
しでは１８０２９の発光量（光子カウント）であった。
【００４７】実施例２
ＳＤＳ処理ＨＡＶ抗原の調製
ＨＡＶは栄養培地中のバース−アレキサンダー細胞（Ｂ
ａｒｔｈ−ＡｌｅｘａｎｄｅｒＣｅｌｌｓ）を用いて培
養した。培養細胞に、０．５％トライトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）Ｘ−１００を含有しかつ５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．
９％ＮａＣｌを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）を混合し、３６℃で１６〜６８時間攪拌した後、遠
心分離にかけ、上清を捨てることにより、ＨＡＶ抽出物
をホルムアルデヒド希釈倍率で１：４０００となるよう
に添加した後、３６℃で３日間攪拌して、ＨＡＶの感染
性を不活性化した。不活性化したＨＡＶ抽出物にＳＤＳ
を添加し、室温で２４時間攪拌して、ＳＤＳ処理ＨＡＶ
抽出物を得た。ＳＤＳ処理ＨＡＶ抽出物は、０．１％の
アジ化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．９％Ｎａ
Ｃｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希
釈して、ＳＤＳ処理ＨＡＶ抗原試薬とした。ＳＤＳ処理
ＨＡＶ抗原試薬は使用時まで４℃で貯蔵した。
ａｒｔｈ−ＡｌｅｘａｎｄｅｒＣｅｌｌｓ）を用いて培
養した。培養細胞に、０．５％トライトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）Ｘ−１００を含有しかつ５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．
９％ＮａＣｌを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）を混合し、３６℃で１６〜６８時間攪拌した後、遠
心分離にかけ、上清を捨てることにより、ＨＡＶ抽出物
をホルムアルデヒド希釈倍率で１：４０００となるよう
に添加した後、３６℃で３日間攪拌して、ＨＡＶの感染
性を不活性化した。不活性化したＨＡＶ抽出物にＳＤＳ
を添加し、室温で２４時間攪拌して、ＳＤＳ処理ＨＡＶ
抽出物を得た。ＳＤＳ処理ＨＡＶ抽出物は、０．１％の
アジ化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．９％Ｎａ
Ｃｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で希
釈して、ＳＤＳ処理ＨＡＶ抗原試薬とした。ＳＤＳ処理
ＨＡＶ抗原試薬は使用時まで４℃で貯蔵した。
【００４８】アッセイ
実施例１と同様にして、ＨＡＶＡＢ−Ｍ陽性パネル試料
を生理食塩水で希釈した。希釈試料をＩｇＭ試薬（３０
μｌ）を用いてさらに５倍に希釈した。比較としてＨＡ
ＶＡＢ−Ｍ陰性パネル試料を生理食塩水で希釈した後
に、ＩｇＭを希釈する際に用いた緩衝液を用いてさらに
５倍に希釈した。希釈した試料（１２５μｌ）を容器に
入れ、これに抗ヒトμ−ＩｇＭ抗体被覆微粒子試薬（３
０μｌ）を添加し、３７℃で２０分間反応させた。反応
した微粒子をガラス繊維フィルターで捕捉し、０．１Ｍ
のホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）（３００μｌ）で２回洗
浄した。次にＳＤＳ処理ＨＡＶ抗原試薬（３０μｌ）を
フィルター表面に添加し、３７℃で２０分間フィルター
表面に捕捉されている微粒子と反応させた。フィルター
を０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）（１００μ
ｌ）で１回、そして同緩衝液（３００μｌ）で１回洗浄
した。次にアクリジニウム標識抗ＨＡＶ抗体試薬（３０
μｌ）をフィルター表面に添加し、３７℃で１０分間フ
ィルター表面に捕捉されている微粒子と反応させた。フ
ィルターを０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）（１
００μｌ）で１回、そして同緩衝液（３００μｌ）で１
回洗浄した。
を生理食塩水で希釈した。希釈試料をＩｇＭ試薬（３０
μｌ）を用いてさらに５倍に希釈した。比較としてＨＡ
ＶＡＢ−Ｍ陰性パネル試料を生理食塩水で希釈した後
に、ＩｇＭを希釈する際に用いた緩衝液を用いてさらに
５倍に希釈した。希釈した試料（１２５μｌ）を容器に
入れ、これに抗ヒトμ−ＩｇＭ抗体被覆微粒子試薬（３
０μｌ）を添加し、３７℃で２０分間反応させた。反応
した微粒子をガラス繊維フィルターで捕捉し、０．１Ｍ
のホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）（３００μｌ）で２回洗
浄した。次にＳＤＳ処理ＨＡＶ抗原試薬（３０μｌ）を
フィルター表面に添加し、３７℃で２０分間フィルター
表面に捕捉されている微粒子と反応させた。フィルター
を０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）（１００μ
ｌ）で１回、そして同緩衝液（３００μｌ）で１回洗浄
した。次にアクリジニウム標識抗ＨＡＶ抗体試薬（３０
μｌ）をフィルター表面に添加し、３７℃で１０分間フ
ィルター表面に捕捉されている微粒子と反応させた。フ
ィルターを０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）（１
００μｌ）で１回、そして同緩衝液（３００μｌ）で１
回洗浄した。
【００４９】このフィルターを化学発光読取り機に移
し、この中で０．２５ＮのＮａＯＨ中の０．４％過酸化
水素を含むトリガー溶液（５０μｌ）をフィルターに送
り込んだ。微粒子に結合したアクリジニウムが発光し、
生じた光の量を測定した。得られた結果を図１に示す。
図１中横軸は試料を生理食塩水で希釈したとき（一回目
の希釈）の試料の濃度で、全く希釈していないものを１
とした。図１よりヒトＩｇＭ含有液で希釈することによ
り、すぐれた希釈直線性が得られることが判明した。
し、この中で０．２５ＮのＮａＯＨ中の０．４％過酸化
水素を含むトリガー溶液（５０μｌ）をフィルターに送
り込んだ。微粒子に結合したアクリジニウムが発光し、
生じた光の量を測定した。得られた結果を図１に示す。
図１中横軸は試料を生理食塩水で希釈したとき（一回目
の希釈）の試料の濃度で、全く希釈していないものを１
とした。図１よりヒトＩｇＭ含有液で希釈することによ
り、すぐれた希釈直線性が得られることが判明した。
【００５０】こうして、血清中にＩｇＭが多量に存在
し、試料血清を多量の希釈液で希釈したとしても、使用
担体結合抗体の量がＩｇＭ量に対して十分な量無い（例
えば、ＨＡＶ感染者などでは、感染時には血中ＩｇＭ量
が数倍から十数倍程度も増加してしまう）と、該担体結
合抗体は全ＩｇＭのうち一部の血中ＩｇＭとしか結合で
きなくなり、こうして担体結合抗体と結合できる抗ＨＡ
Ｖ−ＩｇＭ抗体（以下、単に「ＨＡＶ−Ｍ」という。）
の量は、結局ＨＡＶ−Ｍ量／血中総ＩｇＭ量に比例した
ものとなってしまうことがわかった。つまりいくら試料
を希釈してもあるいはいくら試料を濃縮しても担体に結
合するＨＡＶ−Ｍ量は常に一定となってしまう。一方、
試料をヒトＩｇＭ含有液で希釈すると担体結合抗体と結
合できるＨＡＶ−Ｍ量は、ＨＡＶ−Ｍ量／（血中総Ｉｇ
Ｍ量＋添加ＩｇＭ量）に比例したものとなり、血中総Ｉ
ｇＭ量に関係なく添加ＩｇＭ量に応じて担体結合抗体と
結合できるＨＡＶ−Ｍ量を調節できる。こうして試料中
のＩｇＭ量に関係なく、測定ＨＡＶ−Ｍ量を希釈直線性
のあるようにした測定系を組み立てることができる。こ
うして定性的測定でよいなら、ＩｇＭを添加しないで測
定するとか、定量化したい場合にはＩｇＭを添加するこ
とにより測定ＨＡＶ−Ｍ量の希釈直線性を容易に達成で
きる。
し、試料血清を多量の希釈液で希釈したとしても、使用
担体結合抗体の量がＩｇＭ量に対して十分な量無い（例
えば、ＨＡＶ感染者などでは、感染時には血中ＩｇＭ量
が数倍から十数倍程度も増加してしまう）と、該担体結
合抗体は全ＩｇＭのうち一部の血中ＩｇＭとしか結合で
きなくなり、こうして担体結合抗体と結合できる抗ＨＡ
Ｖ−ＩｇＭ抗体（以下、単に「ＨＡＶ−Ｍ」という。）
の量は、結局ＨＡＶ−Ｍ量／血中総ＩｇＭ量に比例した
ものとなってしまうことがわかった。つまりいくら試料
を希釈してもあるいはいくら試料を濃縮しても担体に結
合するＨＡＶ−Ｍ量は常に一定となってしまう。一方、
試料をヒトＩｇＭ含有液で希釈すると担体結合抗体と結
合できるＨＡＶ−Ｍ量は、ＨＡＶ−Ｍ量／（血中総Ｉｇ
Ｍ量＋添加ＩｇＭ量）に比例したものとなり、血中総Ｉ
ｇＭ量に関係なく添加ＩｇＭ量に応じて担体結合抗体と
結合できるＨＡＶ−Ｍ量を調節できる。こうして試料中
のＩｇＭ量に関係なく、測定ＨＡＶ−Ｍ量を希釈直線性
のあるようにした測定系を組み立てることができる。こ
うして定性的測定でよいなら、ＩｇＭを添加しないで測
定するとか、定量化したい場合にはＩｇＭを添加するこ
とにより測定ＨＡＶ−Ｍ量の希釈直線性を容易に達成で
きる。
【００５１】
【発明の効果】被検試料を少なくともＩｇＭまたはＩｇ
Ｍ含有水溶液により希釈することで、試料中のＩｇＭ抗
体の測定において、必要な測定範囲を得ることができ、
より優れた測定ができる。さらに希釈液量の制限を回避
し、自動化された広範囲の測定系を組み立てることが可
能となった。より早い時期（急性期）で特異的なＩｇ
Ｍ、例えば、ＨＡＶ関連抗体を検出したり、前希釈の希
釈倍率を低減せしめてより広範囲の測定を可能にし、例
えば、Ａ型肝疾患などの診断・検出を確実に行なうこと
が可能になる。
Ｍ含有水溶液により希釈することで、試料中のＩｇＭ抗
体の測定において、必要な測定範囲を得ることができ、
より優れた測定ができる。さらに希釈液量の制限を回避
し、自動化された広範囲の測定系を組み立てることが可
能となった。より早い時期（急性期）で特異的なＩｇ
Ｍ、例えば、ＨＡＶ関連抗体を検出したり、前希釈の希
釈倍率を低減せしめてより広範囲の測定を可能にし、例
えば、Ａ型肝疾患などの診断・検出を確実に行なうこと
が可能になる。
【図１】 試料濃度と発光量との関係を示す。
Claims (10)
- 【請求項１】 抗ヒトＩｇＭ抗体試薬を使用して、被検
試料中の対象抗原に対する特異的ＩｇＭ抗体を免疫学的
に測定する方法において、被検試料を少なくともＩｇＭ
またはＩｇＭ含有水溶液により希釈することを特徴とす
る特異的ＩｇＭ抗体の測定法。 - 【請求項２】 特異的ＩｇＭ抗体が感染初期のＩｇＭ抗
体である請求項１記載の特異的ＩｇＭ抗体の測定法。 - 【請求項３】 特異的ＩｇＭ抗体が感染初期のＨＡＶに
対するＩｇＭ抗体又はＨＢｃに対するＩｇＭ抗体である
請求項１又は２記載の特異的ＩｇＭ抗体の測定法。 - 【請求項４】 測定対象試料が、全血、血清、または血
漿である請求項１〜３のいずれか一記載の特異的ＩｇＭ
抗体の測定法。 - 【請求項５】 （１）測定対象試料を必要に応じ緩衝
剤、希釈液又は希釈剤の水溶液で希釈し、つぎに試料を
少なくともＩｇＭまたはＩｇＭ含有水溶液により希釈し
た後、試料中の測定対象特異性ＩｇＭ抗体を、抗ヒトＩ
ｇＭ抗体結合固体担体と反応させて試料中のＩｇＭ抗体
を固相抗ヒトＩｇＭ抗体と免疫学的に反応させ、（２）
（ａ）得られた反応生成物に特定の抗原試薬を免疫学的
に反応させ、さらに抗原試薬に対する抗体を標識剤で標
識した標識抗体を免疫学的に反応させるか、又は（ｂ）
得られた反応生成物に特定の抗原試薬を標識剤で標識し
た標識抗原を免疫学的に反応させることからなることを
特徴とする請求項１〜４のいずれか一記載の特異的Ｉｇ
Ｍ抗体の測定法。 - 【請求項６】 標識抗体が、アクリジニウム標識抗ＨＡ
Ｖ抗体又はアクリジニウム標識抗ＨＢｃ抗体である請求
項５記載の特異的ＩｇＭ抗体の測定法。 - 【請求項７】 対象抗原が、ＨＡＶ抗原又はＨＢｃ抗原
である請求項１〜６のいずれか一記載の特異的ＩｇＭ抗
体の測定法。 - 【請求項８】 ＨＡＶ抗原試薬が、イン・ビトロの細胞
培養法で得られたＨＡＶ抗原を界面活性剤で処理したも
のである請求項１〜７のいずれか一記載の特異的ＩｇＭ
抗体の測定法。 - 【請求項９】 界面活性剤が、アニオン性界面活性剤で
ある請求項８記載の特異的ＩｇＭ抗体の測定法。 - 【請求項１０】 アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）である請求項９記載の特異的Ｉ
ｇＭ抗体の測定法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15646894A JP3487643B2 (ja) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | 特異的ＩｇＭ抗体の測定法及びその試薬 |
| PCT/JP1995/001191 WO1995034812A1 (fr) | 1994-06-16 | 1995-06-15 | Procede de dosage d'un anticorps d'une immunoglobuline m specifique et reactif approprie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15646894A JP3487643B2 (ja) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | 特異的ＩｇＭ抗体の測定法及びその試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH085633A JPH085633A (ja) | 1996-01-12 |
| JP3487643B2 true JP3487643B2 (ja) | 2004-01-19 |
Family
ID=15628412
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15646894A Expired - Fee Related JP3487643B2 (ja) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | 特異的ＩｇＭ抗体の測定法及びその試薬 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3487643B2 (ja) |
| WO (1) | WO1995034812A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| ATE412904T1 (de) | 1998-07-30 | 2008-11-15 | Advanced Life Science Inst Inc | Verfahren zur bestimmung von hepatitis c viren |
| CN102980997B (zh) * | 2012-06-23 | 2014-11-05 | 北京新兴四寰生物技术有限公司 | EB病毒衣壳抗原IgM抗体胶体金法检测试剂及其制备方法 |
| JP6198298B2 (ja) * | 2013-04-02 | 2017-09-20 | 国立感染症研究所長 | 百日咳の血清診断方法 |
| CN112198318B (zh) * | 2020-07-15 | 2021-07-20 | 南京岚煜生物科技有限公司 | 抗体标准品赋值和抗体检测试剂最低检出限确定的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3700049A1 (de) * | 1987-01-02 | 1988-07-14 | Biotest Serum Institut Gmbh | Verfahren zum immunologischen nachweis von mykobakterien im sputum sowie monoklonale antikoerper zur durchfuehrung des verfahrens |
| EP0392332A3 (de) * | 1989-04-12 | 1992-01-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay und Reagentien dafür |
| JPH0552842A (ja) * | 1991-08-21 | 1993-03-02 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Ｈｌａ−ｄｐ抗原の型判定法 |
| JPH05255264A (ja) * | 1992-03-13 | 1993-10-05 | Sanyo Chem Ind Ltd | 標識剤および標識されたリガンドの製法 |
-
1994
- 1994-06-16 JP JP15646894A patent/JP3487643B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-15 WO PCT/JP1995/001191 patent/WO1995034812A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH085633A (ja) | 1996-01-12 |
| WO1995034812A1 (fr) | 1995-12-21 |
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