JP2803019B2

JP2803019B2 - Ｈｃｖ関連抗体測定法

Info

Publication number: JP2803019B2
Application number: JP6117550A
Authority: JP
Inventors: 一茂飯沼; 徹山田; 裕章石井; 裕三井上; 多恵松村; 利章小林
Original assignee: ダイナボット株式会社
Priority date: 1994-05-06
Filing date: 1994-05-06
Publication date: 1998-09-24
Anticipated expiration: 2013-09-24
Also published as: JPH07301635A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、融合タンパク質として
遺伝子組換え法で産生された抗原を用いたところの試料
中のＨＣＶ抗原と免疫学的に反応性の抗体（以下、「Ｈ
ＣＶ関連抗体」ともいう）の測定法において用いられる
試薬で、偽陽性を抑制するため、ＣＫＳ又はそれと同等
の作用を有するものを含有していることを特徴とするＨ
ＣＶ関連抗体の測定用試薬及びそれを用いた測定法に関
する。

【０００２】

【従来技術及び解決すべき課題】免疫学的測定法は、人
の臨床における検査や病気の診断に広く利用される他、
動物においてもその臨床検査や病気の診断、さらにはそ
の他の広い範囲の測定対象物の分析、測定、定量、検出
などの分野において応用されている。この免疫学的測定
法は、抗原とその抗原に対する抗体との間の抗原抗体反
応を利用するものであるが、通常この抗原抗体反応の生
起していることの検出は可視的に判別したり、あるいは
検知することは困難であるので、その検知、検出を容易
にするため様々な手法が開発されてきている。こうして
免疫学的測定法として、例えば、ラジオイムノアッセ
イ、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、凝集反応免疫測
定法などが開発されてきて、現在広く利用されている。

【０００３】また、この抗原抗体反応にあずかる抗体あ
るいは抗原は、必要に応じて、例えば、寒天、アガロー
ス、セルロース、紙、ニトロセルロース、デキストラ
ン、ゼラチン、キチン、コラーゲン、綿などの生体由来
高分子あるいは天然物由来高分子、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド
などのアクリル樹脂、イオン交換樹脂、光架橋樹脂、テ
フロン、ポリアセタールなどの合成高分子、ガラスビー
ズ、シリカゲル、アルミナ、セラミック、カーボン、硫
酸マグネシウムなどの無機質材料などからなる、微粒
子、ビーズ、マイクロプレート、マイクロタイターウェ
ル、マイクロチューブ、ストリップ、メンブレン、ゲル
など、さらには赤血球、ラテックス粒子、乳剤などの固
定担体に固定しておき、この固定担体を、分析対象とし
ての抗体、抗原等を含有する試料と接触させ、こうして
固定担体に固定された抗原または抗体と、分析試料中の
抗体、抗原等とを特異的に結合反応せしめ、この特異的
に結合した分析対象物を検知することがなされる。

【０００４】ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、
発光又は螢光免疫測定法などでは、¹²⁵Ｉ、 ³Ｈなどの
放射性物質、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの酵
素、フルオレッセインなどの螢光色素、金コロイド、セ
レンコロイドなどの発光又は発色物質などで標識された
抗原あるいは抗体が試薬として用いられ、分析試料中の
抗体、抗原等と特異的に結合反応させて、その放射活
性、酵素活性あるいは螢光を測定して、試料中の抗体、
抗原等が存在していたか否かを判別している。

【０００５】凝集反応を利用した抗原あるいは抗体の測
定法は、一般には赤血球や細菌などの粒子状抗原と、そ
れに対する抗体とが特異的に結合反応して観察できるよ
うな凝集塊をつくる反応を利用するもので、この反応を
凝集反応といっている。例えば、試料中の抗体を検知す
るためには、上記したような粒子状抗原を試料と混合し
て反応させたとき、例えば、水性媒質の中で抗原抗体反
応により生じた凝集反応が観察されるか否かにより、試
料中に測定対象の抗体が存在しているか否かが判別され
る。この凝集反応を用いた測定法にあっては、一定量の
抗原に対し、一定の希釈列にあるところの既知濃度ある
いは量の抗体を加え、反応の結果得られる溶液の凝集反
応の程度を希釈倍数の逆数で表して評価されることもな
される。逆に一定量の抗体に対し、一定の希釈列にある
ところの既知濃度あるいは量の抗原を加え、反応の結果
得られる溶液の凝集反応の程度を希釈倍数の逆数で表し
て評価されることもなされるし、更に抗体に対する抗
体、すなわち二次抗体を用いて間接的な凝集反応を観察
することもなされる。

【０００６】凝集反応を用いた測定法にあっては、抗原
粒子そのものでなく、可溶性抗原を粒子状担体、例え
ば、赤血球、ポリスチレン粒子などのラテックス粒子な
どに結合させたいわゆる感作粒子抗原を用いることがな
される。このような感作粒子抗原を用いる凝集反応を用
いた測定法は、受身凝集反応免疫測定法とよばれる。

【０００７】特に最近では、社会的にその臨床的測定が
課題となっているものに、Ｃ型肝炎ウイルスと名付けら
れた非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス感染の試験法と診断が挙げ
られる。１９７０年代初めにはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢ
Ｖ）の試験法の開発が成されたが、そのような試験法に
よってもなお、感染性の肝炎の発生が抑止できないこと
から、そのＢ型肝炎ウイルス以外の肝炎ウイルスの存在
が検討された。このような肝炎は、輸血により伝播する
ことからその後広範な研究が成され、問題となる血液を
判別することが、大きな課題となった。

【０００８】ところで研究の過程で、Ａ型肝炎ウイルス
（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、サイトメガロウイルス、エプスタ
イン−バールウイルスに対する抗体が検出されないに
もかかわらず、他の潜在的な肝炎を誘発するような病歴
もない患者がみつかることから、このような患者を、非
Ａ非Ｂ型肝炎という総称で呼んだ。そしてＨＢＶに対し
ては優れた試験法の開発が成功していることから、現在
では輸血後肝炎の大部分が非Ａ非Ｂ型肝炎であるという
状況になっており、この意味でも非Ａ非Ｂ型肝炎の有効
な試験法の開発が求められた。このような中にあって、
慢性非Ａ非Ｂ型肝炎感染チンパンジーの血液から遺伝子
組換え法によりクローニングされた非Ａ非Ｂ型肝炎の因
子はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と名付けられた。

【０００９】こうしてこのＨＣＶに対する抗体を検出す
るための試験方法の開発が進められ、現在供血者のスク
リーニングやＣ型肝炎の診断の補助となる試験法が提供
されるに至っている。しかしながら、これまでの方法
は、依然として急性期の診断においてとか、その検出感
度、さらにはその特異性が必ずしも充分なものでなく、
そのうえ非特異的な反応が観察されるなどの問題を有し
ており、より感度、特異性に優れた測定法の開発が求め
られている。より早い時期でのＨＣＶ関連抗体の検出
は、有効な治療を進める上でも、医療の現場での安全性
を確保する上でも重要であり、また非Ａ非Ｂ型肝疾患に
おける検出率を高めたり、供血者のスクリーニングを確
実に行ないうるようにすることが強く求められている。

【００１０】こうした目的のため、ＨＣＶに対する抗体
を検出するための試験方法において用いられる抗原を、
遺伝子組換え法によりより効率よく製造するための方法
が開発されてきた。そして最近では、さらに遺伝子組換
え法により産生された複数のリコビナント抗原が用いら
れてくるようになると共に、その遺伝子組換え法でのリ
コビナント抗原の製造に、特定の制御領域、例えば、ｌ
ａｃオペロンのようなプロモーターを使用して製造する
試みがなされているが、多くは特に宿主細胞と導入遺伝
子とがその種において異なるような外来性の遺伝子を導
入していることから必ずしもその製造は容易ではない。
このような問題を解決するため、融合タンパク質として
リコビナント抗原を製造することが一般的に行なわれる
ようになってきた。

【００１１】従来、固体担体の表面上に存在する遊離結
合部位と試料中の分析対象物とが非特異的に結合し、こ
れが測定誤差の原因となるため、種々の対策が試みられ
てきた。このようなものの一つに、遊離結合部位をブロ
ックするようなブロッキング剤を使うことが提案されて
いる。また、上記のように遺伝子組換え法で得られたリ
コビナント抗原を用いてＨＣＶに対する抗体などを検出
する免疫学的測定法を行なう場合、非特異的反応を示す
ことが見出され、偽陽性を生ずるという問題が指摘され
ている。その対策の一つとして、例えば、ＨＢｃ抗原を
用いた測定系では、遺伝子組換え操作の施されていない
細菌の口径０．８ミクロンのフィルターを通過せしめて
得られた細菌成分抽出物を使用することも提案されてい
る（特公平３─５９３８２号公報）。

【００１２】しかしながら、遺伝子組換え法で得られた
リコビナント抗原を用いてＨＣＶに対する抗体、すなわ
ちＨＣＶ関連抗体を検出する免疫学的測定法において
は、依然として非特異的反応を防ぐことが出来ないとい
う問題がある。上記したように正確にＨＣＶ関連抗体を
検出したり、非Ａ非Ｂ型肝疾患における検出率を高めた
り、供血者のスクリーニングを確実に行なうためには、
この非特異的反応に起因する偽陽性を無くすことが緊急
的かつ強く求められている。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＣＶ抗
原と免疫学的に反応性の抗体（ＨＣＶ関連抗体）を遺伝
子組換え法で得られたリコビナント抗原を用いて正確に
測定する方法を見いだすべく、鋭意研究を行った結果、
簡単な方法により、再現性のあるかつより感度が高く、
そして非特異的反応を抑えて、その非特異的反応に起因
する偽陽性を無くすことのできる方法及び試薬の開発に
成功し、本発明を完成した。

【００１４】本発明者らは、遺伝子組換え法で産生され
た抗原を用いた試料中のＨＣＶ関連抗体の測定法におい
て、ＣＫＳ（ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−マンノオ
クチュロソネート・シチジル・トランスフェラーゼ又は
ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ）又はそれと実質的に同等
の作用を有するものを用いることにより、急性期の診断
において優れ、その検出感度が高く、さらにはそのＣ型
肝炎、特にＨＣＶ関連抗体に対して特異性が高く、その
うえ非特異的な反応が観察されることのない結果の得ら
れることを見出した。

【００１５】また、そのＣＫＳあるいはその関連タンパ
ク質に加え、ＳＯＤ（スーパーオキサイド・ディスムタ
ーゼ）又はそれと実質的に同等の作用を有するものを用
いることにより、さらに急性期の診断において優れ、そ
の検出感度が高く、さらにはそのＣ型肝炎、特にＨＣＶ
関連抗体に対して特異性が高く、そのうえより有効に非
特異的な反応を抑制できることを見出した。こうした遺
伝子組換え法で抗原を産生するにあたっては、抗原は融
合タンパク質として効率よく得られるものであり、通常
産生された融合タンパク質は開裂などにより遊離タンパ
ク質の形態にされているが、融合部分はその全部または
一部が抗原に結合したままであることもできる。

【００１６】こうして本発明によれば、遺伝子組換え法
で産生された抗原を用いたところの試料中のＨＣＶ関連
抗体の測定試薬において、偽陽性を抑制するため、ＣＫ
Ｓ又はそれと実質的に同等の作用を有するものが配合さ
れていることを特徴とするＨＣＶ関連抗体の測定試薬及
びそれを用いた試料中のＨＣＶ関連抗体の測定法が提供
される。また本発明によれば、遺伝子組換え法で産生さ
れた抗原を用いたところの試料中のＨＣＶ関連抗体の測
定試薬において、偽陽性を抑制するため、ＣＫＳ又はそ
れと実質的に同等の作用を有するもの、及びＳＯＤ又は
それと実質的に同等の作用を有するものが、配合されて
いることを特徴とするＨＣＶ関連抗体の測定試薬及びそ
れを用いた試料中のＨＣＶ関連抗体の測定法が提供され
る。

【００１７】より具体的な態様においては、本発明は、
ＨＣＶｃ１００−３リコビナント抗原，ｐＨＣＶ−３
１リコビナント抗原（ＨＣＶの非構造タンパク質部分の
抗原：２６６個のアミノ酸部分を含有）及びｐＨＣＶ−
３４リコビナント抗原（ＨＣＶの構造タンパク質部分の
コア領域の抗原：１５０個のアミノ酸部分を含有）を用
いた試料中のＨＣＶ関連抗体の免疫測定法において、偽
陽性を抑制するため、ＣＫＳ又はそれと実質的に同等の
作用を有するものを配合してあることを特徴とするＨＣ
Ｖ関連抗体の測定試薬及びそれを用いた試料中のＨＣＶ
関連抗体の測定法が提供される。

【００１８】好ましい態様においては、本発明は、ＣＫ
Ｓ融合タンパク質として得られたＨＣＶリコビナント抗
原を用いた試料中のＨＣＶ関連抗体の免疫測定法におい
て、偽陽性を抑制するため、ＣＫＳ又はそれと実質的に
同等の作用を有するものを配合してあることを特徴とす
るＨＣＶ関連抗体の測定試薬及びそれを用いた試料中の
ＨＣＶ関連抗体の測定法が提供される。より好ましい態
様においては、本発明は、ＨＣＶｃ１００−３リコビ
ナント抗原，ｐＨＣＶ−３１リコビナント抗原及びｐＨ
ＣＶ−３４リコビナント抗原を用いた試料中のＨＣＶ関
連抗体の受身凝集反応免疫測定法において、偽陽性を抑
制するため、ＣＫＳ又はそれと実質的に同等の作用を有
するものが配合されていることを特徴とするＨＣＶ関連
抗体の測定試薬及びそれを用いた試料中のＨＣＶ関連抗
体の測定法が提供される。

【００１９】特に好ましい態様においては、本発明は、
ＣＫＳ融合タンパク質として得られたＨＣＶリコビナン
ト抗原を用いた試料中のＨＣＶ関連抗体の受身凝集反応
免疫測定法において、偽陽性を抑制するため、ＣＫＳ又
はそれと実質的に同等の作用を有するものが配合されて
いることを特徴とするＨＣＶ関連抗体の測定試薬及びそ
れを用いた試料中のＨＣＶ関連抗体の測定法が提供され
る。

【００２０】本発明で用いられるＣＫＳ又はそれと実質
的に同等の作用を有するものは、ＣＫＳの全アミノ酸配
列からなるもの、ＣＫＳのアミノ酸配列の一部からなる
ものであって遺伝子組換え法で産生されたものであるこ
とができ、遺伝子組換え法で融合タンパク質の産生に用
いられるプラスミドにより産生されるＣＫＳ相当タンパ
ク質と実質的に同等の作用を有するものが挙げられる。
本発明で用いられるＣＫＳと実質的に同等の作用を有す
るものは、例えばＣＫＳの全２４８個のアミノ酸配列の
うち最初の２３９個のアミノ酸配列をもつものあるいは
そのタンパク質を菌体から分離精製処理する際生ずる断
片タンパク質、遺伝子組換え法で融合タンパク質の産生
に用いられるＣＫＳ遺伝子によりコードされたＣＫＳ由
来ペプチド断片などが挙げられる。

【００２１】本発明で用いられるＣＫＳ又はそれと実質
的に同等の作用を有するものは、例えば次のようにして
得られる。大腸菌ｌａｃプロモーター部位を修飾した配
列とＣＫＳをコードしているｋｄｓＢ遺伝子とを含有す
るプラスミドｐＴＢ２０１を構築する。先ず、プラスミ
ドｐＷＭ111 からプラスミドｐＷＭ145 を構築する。

【００２２】例えば、マンデッキ等（Mandecki et al.
Gene 43: 131, 1986) により開示されたようにプラスミ
ドｐＷＭ111 を大腸菌ＪＭ８３（ａｒａ，（ｌａｃ−，
ｐｒｏＡＢ），ｒｐｓｌ，ｏ８Ｏ，ｌａｃｚＭ１５）か
ら標準アルカリ抽出法、次にセシウムクロライド濃度勾
配法による精製そして約７０％のエタノールによる沈殿
処理後、遠心処理して単離する。単離されたプラスミド
ｐＷＭ111 を次に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで
開裂せしめ、単離して得たＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩベク
ター断片と、単離して得たＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩプロ
モーター断片に代えて図１の配列のオリゴヌクレオチド
とをＴ４リガーゼによりライゲーション処理し、ついで
大腸菌ＪＭ１０３（ｓｕｐＥ，ｔｈｉ，（ｌａｃ−，ｐ
ｒｏＡＢ），ｅｎｄａ，ｒｐｓｌ，ｓｂｃＢ１５，[F',
ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃｉｑＺＭ１５）のコ
ンペテント細胞を形質転換せしめ、形質転換大腸菌から
プラスミドｐＷＭ145 が得られる。

【００２３】一方、大腸菌Ｋ−１２からプラスミドｐＲ
Ｇ１を単離し、それから大腸菌酵素ＣＫＳ（ＣＴＰ：Ｃ
ＭＰ−３−デオキシ−マンノオクチュロソネート・シチ
ジル・トランスフェラーゼ又はＣＭＰ−ＫＤＯシンセタ
ーゼ）をコードしているｋｄｓＢ遺伝子を分離し、プラ
スミドｐＴＢ２０１を構築する。例えば、プラスミドｐ
ＲＧ１をＨｐａＩＩで消化処理し、次にバクテリアル・
アルカリフォスファターゼ（ＢＲＬ）でもって脱燐酸化
処理し、約１．７ｋｂのｋｄｓＢ遺伝子断片を得る。次
に図２の合成オリゴヌクレオチドをＢＲＬＴ４キナー
ゼを用い標識し、ＨｐａＩＩｋｄｓＢ遺伝子断片とライ
ゲーション処理し、ＢＲＬＴ４キナーゼを用い燐酸化
処理する。ついでＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩでもっ
て同時に消化処理し、約１ｋｂの断片を得る。

【００２４】こうして得られたｋｄｓＢ遺伝子を、プラ
スミドｐＷＭ145 をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩでも
って同時に消化処理し、つぎに脱燐酸化処理して得られ
た断片と、ライゲーション処理する。大腸菌ＪＭ１０３
のコンペテント細胞を形質転換せしめ、形質転換大腸菌
からプラスミドｐＴＢ２０１を得る。次にこのプラスミ
ドｐＴＢ２０１で形質転換された大腸菌は、例えばアン
ピシリンを含有するＬＢ培地中で培養され、ＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−D −チオガラクトシド）で誘導処
理され、得られた菌体から産生ＣＫＳが、精製処理して
得られる。

【００２５】上記プラスミドｐＴＢ２０１は、ＢｑｌＩ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩでもって消化処理され、約３．６
ｋｂのベクター断片を与える。この約３．６ｋｂのベク
ター断片を図３の二つの合成オリゴヌクレオチドから成
るリンカーとライゲーション処理する。大腸菌ＪＭ１０
９（ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ９６，ｔｈｉ，ｈｓｄＲ１
７，ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡ１，−，（ｌａｃ−，ｐｒ
ｏＡＢ），[F',ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌａｃｉｑ
ＺＭ１５）のコンペテント細胞を形質転換せしめ、形質
転換大腸菌からプラスミドｐＴＢ２１０を得る。このプ
ラスミドｐＴＢ２１０で形質転換された大腸菌は、例え
ばアンピシリンを含有するＬＢ培地中で培養され、ＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−チオ−β−ガラクトシド）で誘導
処理され、得られた菌体から産生ＣＫＳが、精製処理し
て得られる。

【００２６】このプラスミドｐＴＢ２１０は、大腸菌Ｘ
Ｌ−１Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社：Stratagene）の
コンペテント細胞中に導入され形質転換せしめられ、形
質転換された細胞を培養して大量に得ることができる。
同様にプラスミドｐＴＢ２０１及びプラスミドｐＴＢ２
１０から外来遺伝子の発現に適するように、制限酵素、
合成オリゴヌクレオチドリンカー、リガーゼなどを用い
て誘導されたＣＫＳ融合タンパク質発現系プラスミドを
作製することが可能であり、そのプラスミドを用いて遺
伝子組換え法によりＣＫＳ又はそれと実質的に同等の作
用を有するものが得られる。

【００２７】こうして得られたＣＫＳリコビナントタン
パク質は、大腸菌などの細胞をホモジュナイザー、ワー
リングブレンダー、フレンチプレス、超音波破砕機など
の機械的方法、リゾチームなどの酵素による方法、凍結
融解や浸透圧による物理的方法あるいはドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ：商品
名）、トライトンＸ（ＴｒｉｔｏｎＸ：商品名）など
の界面活性剤、アセトン、ブタノールなどの有機溶媒、
ＥＤＴＡなどのキレート化剤などを用いる化学的方法な
どにより破砕して得られる。細胞を破砕する際、懸濁液
中にプロテアーゼ阻害剤などを添加しておくこともでき
る。

【００２８】超音波処理は、例えば、懸濁溶液試料を１
０〜６０ｋＨｚの音波（超音波）を出すことのできる超
音波振動子に適用することにより細胞を破壊することの
できる装置にかけて行うことができ、そのような装置と
しては棒状の超音波振動子を試料に浸す型のものや、超
音波振動子を取り付けたカップ状の容器に試料をいれ処
理する型のものや、連続処理が可能なように循環式にさ
れた型のもの、さらにはビーズなどと共に試料を処理で
きるようにしたもの等が挙げられる。こういった超音波
破砕装置は、大岳製作所（株）、セントラル科学貿易
（株）、セイコー電子工業（株）などから市販されてい
る。超音波処理は、細胞を破砕するに十分な時間処理す
ることにより行われ、使用試料の量や使用出力に応じて
適宜適当に選ぶことができ、通常約１分間から約２時間
の範囲で選ぶことができる。

【００２９】得られた粗タンパク質液を、例えば硫酸ア
ンモニウムなどのタンパク質沈殿剤などを用いての塩
析、エタノールなどの有機溶媒による沈殿法、界面活性
剤などを用いての抽出、透析、密度勾配遠心などの遠心
分離法、限外濾過法、イオン交換樹脂、イオン交換セル
ロース、イオン交換セファデックス、アルミナ、ハイド
ロキシアパタイトなどによる吸着、カラムクロマトグラ
フィー、電気泳動法、デキストランゲル、ポリアクリル
アミドゲル、ポリエチレングリコールジメタクリル酸ゲ
ル、アガロースゲル、多孔質シリカガラス、分子ふるい
法、モノクローナル抗体などを利用したアフィニティク
ロマトグラフィーにより分離、精製することができる。
これらの分離、精製処理は、測定時の非特異的反応を抑
制して、偽陽性を排除しうるように選ぶことができ、任
意に適した方法を選んで組み合わせて行うことができ
る。

【００３０】本発明で用いられるＣＫＳ又はそれと実質
的に同等の作用を有するものは、宿主細胞として大腸菌
を用いて得られるものであることができ、例えば、リコ
ビナントＣＫＳタンパク質の発現ベクターであるプラス
ミドを、大腸菌に導入し、形質転換処理され、こうして
形質転換された大腸菌を培養し、リコビナントＣＫＳタ
ンパク質を発現させ、得られた培養液より単離精製処理
して得られたものが好ましい。また、このＣＫＳ又はそ
れと実質的に同等の作用を有するものは、リコビナント
ＣＫＳタンパク質の発現ベクターで形質転換された大腸
菌を培養し、リコビナントＣＫＳタンパク質を発現させ
て得られた培養液よりの菌体を、プロテアーゼ阻害剤存
在下破砕し、得られたリコビナントＣＫＳタンパク質を
含む液から、蛋白質沈殿剤によりタンパク質を沈殿させ
たものを透析したものを精製処理して得られたものであ
ることができる。

【００３１】さらに、ＣＫＳ又はそれと実質的に同等の
作用を有するものは、リコビナントＣＫＳタンパク質の
発現ベクターで形質転換された大腸菌を培養し、リコビ
ナントＣＫＳタンパク質を発現させて得られた培養液よ
りの菌体をプロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られた
リコビナントＣＫＳタンパク質を含む液から蛋白質沈殿
剤によりタンパク質を沈殿させたものを透析し、それを
イオン交換クロマトグラフィーにより、次いでゲル濾過
クロマトグラフィーにより精製処理して得られたもので
あってよい。このリコビナントＣＫＳタンパク質の発現
ベクターは、好ましくはｐＴＢ２０１，ｐＴＢ２１０、
ｐＴＢ２６０，ｐＴＢ２７０又はそれらから制限酵素及
び／又は合成オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子組換え
法で修飾されて誘導されたプラスミドであることができ
る。

【００３２】本発明で用いられるＣＫＳ又はそれと実質
的に同等の作用を有するものは、具体的な例では、例え
ば、リコビナントＣＫＳタンパク質の発現ベクターであ
るプラスミドｐＴＢ２１０などを、大腸菌ＸＬ−１Ｂ
ｌｕｅ（ストラタジーン社：Stratagene）などの宿主細
胞に導入し、形質転換処理され、こうして形質転換され
た大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１などを適切な培地中で
培養し、リコビナントＣＫＳタンパク質を発現させる。
この得られた培養液より、発現させたリコビナントＣＫ
Ｓタンパク質を含む菌体を遠心分離により集め、集めた
菌体をＥＤＴＡ、トライトンＸ−１００及びプロテアー
ゼ阻害剤などを含むトリス緩衝液などの緩衝液に懸濁
し、機械的に破砕する。この菌体破砕液より、遠心分離
及び約０．２μｍのフィルターを用いた濾過により不溶
物を除き、リコビナントＣＫＳタンパク質を含む水抽出
液を得る。

【００３３】上記で得られた、リコビナントＣＫＳタン
パク質を含む水抽出液から、約４．８Ｍ又はそれ以上の
濃度の硫酸アンモニアなどの蛋白質沈殿剤により、リコ
ビナントＣＫＳタンパク質を含むタンパク質を沈殿さ
せ、この沈殿させたタンパク質を、０．５ｍＭジチオス
レイトール（ＤＴＴ）水溶液などの媒質に懸濁し、この
懸濁液を０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．６）などの緩
衝液中で透析し、粗精製リコビナントＣＫＳタンパク質
を得る。

【００３４】上記で得られた、粗精製リコビナントＣＫ
Ｓタンパク質を、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−５ＰＷ（東
ソー）などを用いたイオン交換クロマトグラフィーによ
り分画精製し、次いでＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ
ＸＬ（東ソー）などを用いたゲル濾過クロマトグラフィ
ーにより分画し、精製リコビナントＣＫＳタンパク質を
得ることができる。本発明においては、ＣＫＳ又はそれ
と実質的に同等の作用を有するものは、希釈剤に添加さ
れて用いることもでき、その場合の使用量は約０．００
０１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０
０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましく
は約０．００５ｍｇ／ｍｌ〜約０．１ｍｇ／ｍｌ、最も
好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．１ｍｇ／ｍｌ
の濃度となるようにして用いることができる。

【００３５】本発明で用いられるＳＯＤ又はそれと実質
的に同等の作用を有するものは、ＳＯＤの全アミノ酸配
列からなるもの、ＳＯＤのアミノ酸配列の一部からなる
ものであって遺伝子組換え法で産生されたものであるこ
とができ、遺伝子組換え法で融合タンパク質の産生に用
いられるプラスミドにより産生されるＳＯＤ相当タンパ
ク質と実質的に同等の作用を有するものが挙げられる。
本発明で用いられるＳＯＤと実質的に同等の作用を有す
るものは、例えばＳＯＤの全アミノ酸配列のうちの一部
のアミノ酸配列をもつものあるいはそのタンパク質を酵
母などの菌体から分離精製処理する際生ずる断片タンパ
ク質、遺伝子組換え法で融合タンパク質の産生に用いら
れるＳＯＤ遺伝子によりコードされたＳＯＤ由来ペプチ
ド断片などが挙げられる。

【００３６】本発明で用いられるＳＯＤ又はそれと実質
的に同等の作用を有するものは、例えば次のようにして
得られる。ＰＮＡＳ，８０：５４６５−６９及びＮｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，１２：９３４９−６３
に開示のＤＮＡ配列を、Ｇｅｎｅ（１９８８）６８：１
０１−１０７に開示の方法で修飾し、こうして得られた
ＳＯＤアミノ酸配列をコードする遺伝子を酵母のソルビ
トール・デヒドロゲナーゼ遺伝子の制御遺伝子に結合
し、酵母プラスミドに組み込む。得られたＳＯＤをコー
ドする遺伝子を持つプラスミド、例えばＳＯＤ８−３を
炭素源としてソルビトールを用いて生育する酵母変異株
に導入して、形質転換体を得る。この形質転換体酵母を
培地中で培養し、得られた菌体から産生ＳＯＤを、精製
処理して得られる。

【００３７】また、ＥＰ−Ａ１−３１８，２１６号に記
載のＳＯＤ融合タンパク質発現系プラスミドを用いて酵
母を形質転換せしめ、得られた形質転換体酵母を培地中
で培養し、得られた菌体から産生ＳＯＤ断片タンパク質
を、精製処理して得られる。同様にＥＰ−Ａ１−３１
８，２１６号に記載のＳＯＤ融合タンパク質発現系プラ
スミドから外来遺伝子の発現に適するように、制限酵
素、合成オリゴヌクレオチドリンカー、リガーゼなどを
用いて誘導されたＳＯＤ融合タンパク質発現系プラスミ
ドを作製することが可能であり、そのプラスミドを用い
て遺伝子組換え法によりＳＯＤ又はそれと実質的に同等
の作用を有するものが得られる。

【００３８】こうして得られたＳＯＤリコビナントタン
パク質を取得するには、先ず酵母などの細胞を、例えば
上記ＣＫＳに関して記載したようにして破砕する。次に
得られた粗タンパク質液を、例えば上記ＣＫＳに関して
記載したようにして塩析、沈殿法、抽出、透析、遠心分
離法、限外濾過法、カラムクロマトグラフィーなどによ
り分離、精製して目的ＳＯＤが得られる。これらの分
離、精製処理は、測定時の非特異的反応を抑制して、偽
陽性を排除しうるように選ぶことができ、任意に適した
方法を選んで組み合わせて行うことができる。

【００３９】本発明で用いられるＳＯＤ又はそれと実質
的に同等の作用を有するものは、宿主細胞として酵母を
用いて得られるものであることができ、例えば、リコビ
ナントＳＯＤタンパク質の発現ベクターであるプラスミ
ドを、酵母に導入し、形質転換処理され、こうして形質
転換された酵母を培養し、リコビナントＳＯＤタンパク
質を発現させ、得られた培養液より単離精製処理して得
られたものが好ましい。また、このＳＯＤ又はそれと実
質的に同等の作用を有するものは、リコビナントＳＯＤ
タンパク質の発現ベクターで形質転換された酵母を培養
し、リコビナントＳＯＤタンパク質を発現させて得られ
た培養液よりの菌体をプロテアーゼ阻害剤存在下破砕
し、得られたリコビナントＳＯＤタンパク質を含む液か
ら、加熱処理によりタンパク質を沈殿させたタンパク質
抽出液を精製処理して得られたものであることができ
る。

【００４０】さらに、ＳＯＤ又はそれと実質的に同等の
作用を有するものは、リコビナントＳＯＤタンパク質の
発現ベクターで形質転換された酵母を培養し、リコビナ
ントＳＯＤタンパク質を発現させて得られた培養液より
の菌体を、プロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られた
リコビナントＳＯＤタンパク質を含む液から、加熱処理
によりタンパク質を沈殿させたタンパク質抽出液をイオ
ン交換クロマトグラフィーによりにより精製処理して得
られたものであってよい。このリコビナントＳＯＤタン
パク質の発現ベクターは、ＳＯＤ８−３又はそれらから
制限酵素及び／又は合成オリゴヌクレオチドを用いて遺
伝子組換え法で修飾されて誘導されたプラスミドである
ことができる。また、本発明においては、その目的に合
致するならＳＯＤ又はそれと実質的に同等の作用を有す
るものとして、ヒト胎盤由来のＳＯＤタンパク質及びウ
シ赤血球由来のＳＯＤタンパク質、またはそれらの誘導
体から成る群から選ばれたものであることもできよう。

【００４１】本発明で用いられるＳＯＤ又はそれと実質
的に同等の作用を有するものは、具体的な例では、例え
ば、リコビナントＳＯＤタンパク質の発現ベクターであ
るプラスミドＳＯＤ８−３などを、ソルビトール要求性
の酵母変異株などの宿主細胞に導入し、形質転換処理
し、この形質転換酵母などの宿主細胞を適切な培地中で
培養し、リコビナントＳＯＤタンパク質を発現させる。
この培養液より、発現させたリコビナントＳＯＤタンパ
ク質を含む菌体を遠心分離により集め、集めた菌体をＥ
ＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤を含むトリス緩衝液など
の緩衝液に懸濁し、機械的に破砕する。この菌体破砕液
より、遠心分離により不溶物を除いた上清液を、例え
ば、攪拌しながら約８５〜９５℃で約５分間というよう
な条件下熱処理し、約４５〜６５℃まで冷やした後、遠
心分離及び約０．２μｍ又はそれ以下のフィルターを用
いた濾過により不溶物を除き、リコビナントＳＯＤタン
パク質を含む抽出液を得る。

【００４２】この抽出液を６０ｍＭ塩化ナトリウムを含
む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）などの適切な緩
衝液で希釈した後、陰イオン交換クロマトグラフィー
（例えば、Ｑセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、
ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）などにかけ
る。このカラムは、例えば、６０ｍＭ塩化ナトリウム液
などで洗浄し、酵母菌体由来の不純物を除いた後、３５
０ｍＭ塩化ナトリウムなどによりリコビナントＳＯＤタ
ンパク質を溶出することができる。この溶出液を、必要
に応じ限外濾過などにより濃縮し、約０．２μｍ又はそ
れ以下のフィルターを用いて濾過して、粗精製リコビナ
ントＳＯＤタンパク質が得られる。必要に応じさらに、
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィーなどにより精製できる。

【００４３】本発明においては、ＳＯＤ又はそれと実質
的に同等の作用を有するものは、希釈剤に添加されて用
いることもでき、その場合の使用量は約０．０００１ｍ
ｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．００１ｍ
ｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約
０．００５ｍｇ／ｍｌ〜約０．１ｍｇ／ｍｌ、最も好ま
しくは約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．１ｍｇ／ｍｌの濃
度となるようにして用いることができる。

【００４４】本発明で用いられる遺伝子組換え法で産生
された抗原は、例えば遺伝子組換え技術を適用し、天然
ＨＣＶから分子クローニングにより得られたＤＮＡ配列
あるいは既に知られたＨＣＶゲノム配列から、酵素など
を用いたり、化学合成により得られたＤＮＡ配列を、微
生物あるいは動物、植物、昆虫などで発現させて得られ
たリコビナント抗原である。このリコビナント抗原とし
ては、ＨＣＶゲノムの別々の抗原領域を発現させた組換
えタンパク質（リコビナントタンパク質）の少なくとも
１種であることができる。本発明で用いられる遺伝子組
換え法で産生された抗原としては、好ましくは融合タン
パク質として得られるものである。

【００４５】さらに好ましくはこのリコビナント抗原は
ＣＫＳ又はＳＯＤあるいはそれらの関連タンパク質の融
合タンパク質として得られるものである。例えば、宿主
細胞として大腸菌を用いてＣＫＳ融合タンパク質発現系
の遺伝子産物として得られるもの及び宿主細胞として酵
母を用いてＳＯＤ融合タンパク質発現系の遺伝子産物と
して得られるものが挙げられる。

【００４６】前者のものとしては、特開平４─２５３９
９８公報や特開平４─２８１７９２公報に記載のものが
挙げられ、さらには例えばｐＨＣＶ−２３リコビナント
抗原、ｐＨＣＶ−２９リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−３
１リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−３４リコビナント抗
原、ｐＨＣＶ−４５リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−４８
リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−４９リコビナント抗原、
ｐＨＣＶ−５０リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−５１リコ
ビナント抗原、ｐＨＣＶ−５７リコビナント抗原、ｐＨ
ＣＶ−５８リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−１０１リコビ
ナント抗原、ｐＨＣＶ−１０２リコビナント抗原、ｐＨ
ＣＶ−１０３リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−１０４リコ
ビナント抗原、ｐＨＣＶ−１０５リコビナント抗原、ｐ
ＨＣＶ−１０７リコビナント抗原、あるいはそれらをペ
プチダーゼや化学的開裂試薬で処理などし、プロセッシ
ングして得られたペプチド、例えばＣＫＳ遺伝子由来ペ
プチド部分の切断してあるものなどが挙げられる。

【００４７】ＳＯＤ融合タンパク質発現系の遺伝子産物
としては、ＥＰ−Ａ１−３１８，２１６号に記載のＨＣ
Ｖｃ１００−３、あるいはそれらをペプチダーゼや化
学的開裂試薬で処理などし、プロセッシングして得られ
たペプチド、例えばＳＯＤ遺伝子由来ペプチド部分の切
断してあるものなどが挙げられる。また、本発明では好
適に複数のリコビナント抗原を混合して用いることがで
きる。好ましくは、本発明で用いられる抗原は、ＨＣＶ
ｃ１００−３リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−３１リコ
ビナント抗原及びｐＨＣＶ−３４リコビナント抗原から
なるものが使用できる。

【００４８】本発明において試料中のＨＣＶ抗原と免疫
学的に反応性の抗体を測定するにあたっては、ラジオイ
ムノアッセイ、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、化学
又は生物発光免疫測定法、及び凝集反応免疫測定法など
の方法によることができる。特に凝集反応免疫測定法、
例えば受身凝集反応免疫測定法は好ましい方法である。

【００４９】本発明において試料中のＨＣＶ抗原と免疫
学的に反応性の抗体を測定するにあたっては、抗原抗体
反応にあずかる抗原は、必要に応じて、例えば、寒天、
アガロース、セルロース、紙、ニトロセルロース、デキ
ストラン、ゼラチン、キチン、コラーゲン、綿などの生
体由来高分子あるいは天然物由来高分子、ポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリアクリ
ルアミドなどのアクリル樹脂、イオン交換樹脂、光架橋
樹脂、テフロン、ポリアセタールなどの合成高分子、ガ
ラスビーズ、シリカゲル、アルミナ、セラミック、カー
ボン、硫酸マグネシウムなどの無機質材料などからな
る、微粒子、ビーズ、マイクロプレート、マイクロタイ
ターウェル、マイクロチューブ、ストリップ、メンブレ
ン、トレイ、ゲルなど、さらには赤血球、ラテックス粒
子、乳剤などの固定担体に固定しておき、この固定担体
を、分析対象としての抗体等を含有する試料と接触さ
せ、こうして固定担体に固定された抗原と、分析試料中
の抗体等とを特異的に結合反応せしめ、この特異的に結
合した分析対象物を検知することによりおこなうことが
できる。

【００５０】ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、
化学又は生物発光免疫測定法、螢光免疫測定法などで
は、 ¹²⁵Ｉ、 ³Ｈなどの放射性物質、西洋わさびペルオ
キシダーゼ、β−D −ガラクトシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼなどの酵素、フルオレッセインなどの螢光
色素、金コロイド、セレンコロイドなどの発光又は発色
物質などで標識された抗原あるいは二次抗体が試薬とし
て用いられ、分析試料中の抗体、複合体等と特異的に結
合反応せしめられ、その放射活性、酵素活性あるいは螢
光などを測定して、試料中の抗体等が存在していたか否
かを判別することができる。

【００５１】凝集反応を利用した測定法では、一般には
可溶性抗原を粒子状担体、例えば、赤血球、ポリスチレ
ン粒子などのラテックス粒子などに結合させたいわゆる
感作粒子抗原などの粒子状抗原と、それに対する抗体と
が特異的に結合反応して観察できるような凝集塊をつく
る反応を利用する。例えば、試料中の抗体を検知するた
め、上記したような粒子状抗原を試料と混合して反応さ
せ、例えば、水性媒質の中で抗原抗体反応により生じた
凝集反応が観察されるか否かにより、試料中に測定対象
の抗体が存在しているか否かが判別される。この凝集反
応を用いた測定法にあっては、一定量の抗原に対し、一
定の希釈列にある既知濃度あるいは量の抗体を加え、反
応の結果得られる溶液の凝集反応の程度を希釈倍数の逆
数で表して評価されることがなされる。逆に一定量の抗
体に対し、一定の希釈列にある既知濃度あるいは量の抗
原を加え、反応の結果得られる溶液の凝集反応の程度を
希釈倍数の逆数で表して評価されることもなされるし、
更に抗体に対する抗体、すなわち二次抗体を用いて間接
的な凝集反応を観察することもなされる。受身凝集反応
免疫測定法は、本発明に従い、例えば、ＨＣＶに対する
抗体の測定に用いられ、優れた作用効果が得られる。

【００５２】固体担体、粒子状担体あるいは標識などと
抗原とを結合あるいは吸着させるには、当該分野で汎用
されている方法を用いることができ、例えばイオン相互
作用、疎水相互作用、共有結合などの物理的吸着や化学
的結合により行うことができる。例えば、架橋剤として
は、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジ
ル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、スク
シンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘ
キサン−１−カルボキシレート、スクシンイミジル
（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、スクシン
イミジル４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート
などが挙げられる。

【００５３】固体担体、粒子状担体などの例としては、
上記したようなものが挙げられ、例えば寒天、アガロー
ス、架橋アガロース、架橋アルギン酸、架橋グアガム、
ニトロセルロースやカルボキシルセルロースなどのセル
ロースエステルあるいは混合セルロースエステル、ゼラ
チン、架橋ゼラチン、ラテックス、ゴム、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジ
エン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリ
アクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタ
クリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、
アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共
重合体などのポリエステル、ポリアミド、ポリウレタ
ン、ポリエポキシ樹脂などの天然あるいは合成の修飾あ
るいは非修飾の重合炭水化物、重合炭化水素など、それ
らの架橋誘導体など、ガラス、例えば活性化ガラス、シ
リカゲル、カオリン、タルク、シリカ−アルミナ、アル
ミナ、硫酸バリウムなどの無機材料などからなる群から
選ばれたものを、多孔性のゲル、微粒子などにしたもの
が挙げられる。

【００５４】本発明においては、測定は競合アッセイ、
中和アッセイ、固相アッセイ、クロマトグラムアッセ
イ、サンドイッチアッセイなどに適したようにしておこ
なうこともできる。本発明で用いられる測定対象試料と
しては、全血、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ液、リン
パ球、唾液、尿、汗、涙、糞便、生体粘液、生検組織、
細胞培養上清液などの生物由来材料をあげることができ
る。これら測定対象試料は、必要に応じ濃縮したり、希
釈して用いられるが、普通希釈剤などで希釈して用いる
ことが好ましい。本発明においては、検知用試薬とし
て、４−ヒドロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレン
ジアミン、テトラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・
ペルオキシダーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニ
トロフェニルガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダ
ーゼ、ウンベリフェリルホスフェート、ニトロフェニル
ホスフェート、ＮＡＤＰなどとアルカリフォスファター
ゼ、グルコース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの
酵素試薬、放射性物質試薬、フルオレッセインイソチオ
シアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネー
トなどを用いている螢光試薬、発光試薬、化学発光試
薬、金コロイド、銀コロイド、セレンコロイドなどのコ
ロイド標識試薬、磁性体試薬、ビオチン標識抗ビオチン
抗体などのハプテン標識抗ハプテン抗体検出系試薬など
を用いることができる。

【００５５】本発明の測定系においては、界面活性剤、
緩衝剤、希釈液又は希釈剤、ブロッキング剤、キレート
化剤、保存剤などを用いることができる。界面活性剤と
しては、陰イオン型界面活性剤、陽イオン型界面活性
剤、両性界面活性剤、非イオン型界面活性剤のうちから
選んで用いることが出来る。陰イオン型界面活性剤とし
ては、炭素数１２〜１８の高級脂肪酸のアルカリ金属
塩、炭素数１２〜１８の高級脂肪酸のトリエタノールア
ミンなどの有機塩基塩、炭素数１２〜１８の高級脂肪酸
又は高級アルコールの硫酸エステル、アルキルスルホン
酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩などが挙げられ
る。陽イオン型界面活性剤としては、アルキル基、アリ
ール基、複素環基などを有する第四級アンモニウム化合
物などが挙げられる。

【００５６】両性界面活性剤としては、ポリアミノモノ
カルボン酸、炭素数１２〜１８の高級アルキルアミノ
酸、ラウリルジメチルベタインなどのアミノ酸のＮ−ト
リアルキル置換体などが挙げられる。非イオン型界面活
性剤としては、モノステアリン酸グリセリンなどの炭素
数１２〜１８の高級脂肪酸の多価アルコールエステル、
高級脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、高級脂肪酸
のソルビタンエステル、高級脂肪酸とポリオキシエチレ
ン及びソルビタンエーテルとのエステル、ポリオキシエ
チレンラウリルアルコールなどの高級アルコールとポリ
オキシエチレンとのエーテル、ポリオキシエチレンとポ
リオキシプロピレンとのエーテルなどが挙げられる。好
ましい界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビ
タン（代表的なものは、Ｔｗｅｅｎ２０などの商品名
で入手しうる）、ポリオキシエチレンエーテル（代表的
なものは、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの商品名で入
手しうる）、オクチルフェノール・エチレンオキサイド
縮合物（代表的なものは、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０な
どの商品名で入手しうる）、ドデシル硫酸ナトリウム、
Ｎ−ラウリルザルコシンなどが挙げられる。これら界面
活性剤は、約０．００１％ｖ／ｖ〜約１０％ｖ／ｖの範
囲で用いることができる。

【００５７】緩衝剤、希釈液又は希釈剤としては、水、
リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、例えば生理食塩水などの塩化ナ
トリウム液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）液、ピペラジン−
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）液、３−（シ
アノヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸）液、
３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸液、アミノ酸液
などが挙げられる。これらは単独でも、任意に配合して
も用いることができる。キレート化剤としては、エチレ
ンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコー
ル−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙げられ
る。これらキレート化剤は、約０．０１ｍＭ〜約２０ｍ
Ｍの範囲で用いることができる。保存剤としては、例え
ばナトリウムアジド、エチルパラベンなどが挙げられ
る。その他、本発明の測定系には、各種動物の血清、例
えば牛血清、牛血清アルブンミン（ＢＳＡ）、牛胎児血
清（ＦＣＳ）、ヤギ血清、卵白アルブンミン、ゼラチ
ン、各種乳タンパク質、例えばスキムミルク、カゼイ
ン、カゼイン分解物、ホエータンパク質など、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリドンなどからなる群か
ら選ばれたものを添加することができる。これらは、約
０．０１％ｖ／ｖ〜約５０％ｖ／ｖの範囲で添加するこ
とができる。

【００５８】本発明においては、測定は好ましくは水性
媒体中で行うことができるが、場合によっては免疫学的
反応を一時的に水性媒体中で行うようにされていてもよ
い。水性媒体は、好ましくは約５．０〜９．０のｐＨに
調整されて行うことができ、より好ましくは緩衝液中で
行うこともできる。水性媒体の塩濃度は、比較的低いほ
うが好ましく、例えば生理的に等張化されているものが
好ましい。本発明においては、もちろんリンパ球破砕
物、例えばヒトＴ−リンパ球抽出液、大腸菌抽出液、酵
母抽出液、マウス細胞培養液抽出液などの細胞抽出物を
添加することもできる。これらのものは、約０．００１
％ｖ／ｖ〜約２０％ｖ／ｖの範囲で添加することもでき
る。本発明においては、試薬は単一の容器あるいは複数
の容器に入れてあり、使用にあたり配合されて用いるよ
うになっていてもよい。

【００５９】

【実施例】次に実施例を示して、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこの具体例により限定されるもの
でなく、その思想に従うかぎり各種の形態で実施できる
ことは理解されるべきである。

【００６０】実施例１（１）酵母水抽出物ディフコラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，米国）社から酵母水抽出物を入手した。（２）大腸菌水抽出液の調製リコンビナントタンパク質を発現するための、遺伝子組
換え操作が行われていない大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ
（ストラタジーン社：Stratagene）を培養し、培養液よ
り菌体を遠心分離により集め、こうして得られた菌体を
ＥＤＴＡ、トライトンＸ−１００及びプロテアーゼ阻害
剤を含むトリス緩衝液に懸濁し、機械的に破砕した。こ
の菌体破砕液より、遠心分離及び０．２μｍのフィルタ
ーを用いた濾過により不溶物を除き、大腸菌ＸＬ−１水
抽出物を得た。また、リコンビナントタンパク質を発現
するための、遺伝子組換え操作が行われていない大腸菌
ＪＭ１０３を培養し、上記の大腸菌ＸＬ−１水抽出物の
場合と同様な抽出操作により、大腸菌ＪＭ１０３水抽出
物を得た。このようにして得られる大腸菌ＸＬ−１水抽
出物及び大腸菌ＪＭ１０３水抽出物は、米国アボット社
より入手しうる。

【００６１】（３）リコビナントＣＫＳタンパク質を含
む大腸菌水抽出液の調製リコビナントＣＫＳタンパク質の発現ベクターであるプ
ラスミドｐＴＢ２１０を、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ
（ストラタジーン社：Stratagene）に導入し、形質転換
処理され、こうして形質転換された大腸菌ｐＴＢ２１０
／ＸＬ−１を得た。この大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１
を培養し、リコビナントＣＫＳタンパク質を発現させ
た。この培養液より、発現させたリコビナントＣＫＳタ
ンパク質を含む菌体を遠心分離により集め、集めた菌体
をＥＤＴＡ、トライトンＸ−１００及びプロテアーゼ阻
害剤を含むトリス緩衝液に懸濁し、機械的に破砕した。
この菌体破砕液より、遠心分離及び０．２μｍのフィル
ターを用いた濾過により不溶物を除き、リコビナントＣ
ＫＳタンパク質を含む大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水
抽出液を得た。このようにして得られるリコビナントＣ
ＫＳタンパク質を含む大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水
抽出液は、米国アボット社より入手しうる。

【００６２】（４）粗精製リコビナントＣＫＳタンパク
質の調製上記（３）で得られた、リコビナントＣＫＳタンパク質
を含む大腸菌ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液から、
４．８Ｍ以上の濃度の硫酸アンモニアにより、リコビナ
ントＣＫＳタンパク質をを含むタンパク質を沈殿させ
た。この沈殿させたタンパク質を、０．５ｍＭジチオス
レイトール（ＤＴＴ）水溶液に懸濁し、この懸濁液を
０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．６）中で透析し、粗精
製リコビナントＣＫＳタンパク質を得た。このようにし
て得られる粗精製リコビナントＣＫＳタンパク質は、米
国アボット社より入手しうる。

【００６３】（５）精製リコビナントＣＫＳタンパク質
の調製上記（４）で得られた、粗精製リコビナントＣＫＳタン
パク質を、ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー）
を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、次いで
ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ（東ソー）を用い
たゲル濾過クロマトグラフィーにより分画し、精製リコ
ビナントＣＫＳタンパク質を得た。

【００６４】（６）粗精製ＳＯＤタンパク質の調製リコビナントＳＯＤタンパク質の発現ベクターであるプ
ラスミドＳＯＤ８−３を、ソルビトール要求性の酵母変
異株に導入し、形質転換処理した。この形質転換酵母を
培養し、リコビナントＳＯＤタンパク質を発現させた。
この培養液より、発現させたリコビナントＳＯＤタンパ
ク質を含む菌体を遠心分離により集め、集めた菌体をＥ
ＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤を含むトリス緩衝液に懸
濁し、機械的に破砕した。この菌体破砕液より、遠心分
離により不溶物を除いた上清液を、攪拌しながら８５〜
９５℃で５分間熱処理し、４５〜６５℃まで冷やした
後、遠心分離及び０．２μｍのフィルターを用いた濾過
により不溶物を除き、リコビナントＳＯＤタンパク質を
含む抽出液を得た。

【００６５】この抽出液を６０ｍＭ塩化ナトリウムを含
む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈した後、
陰イオン交換カラム（Ｑセファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）に
かけた。このカラムを６０ｍＭ塩化ナトリウム液で洗浄
し、酵母菌体由来の不純物を除いた後、３５０ｍＭ塩化
ナトリウムによりリコビナントＳＯＤタンパク質を溶出
した。この溶出液を、限外濾過により濃縮し、０．２μ
ｍのフィルターを用いて濾過して、粗精製リコビナント
ＳＯＤタンパク質を得た。このようにして得られる粗精
製リコビナントＳＯＤタンパク質は、米国アボット社よ
り入手しうる。

【００６６】（７）精製ＳＯＤタンパク質カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社より、ヒト
胎盤由来の精製ＳＯＤタンパク質及びウシ赤血球由来の
精製ＳＯＤタンパク質を、それぞれ入手した。

【００６７】実施例２ＨＣＶ関連抗原を感作した赤血球の調製ＨＣＶ関連抗原と免疫学的に反応性の抗体を、受身赤血
球凝集反応（ＰＨＡ）を用いて測定するため、ＨＣＶ関
連抗原を感作した赤血球を次のようにして調製した。Ｈ
ＣＶ関連抗原として、ＨＣＶｃ１００−３リコビナ
ント抗原、ｐＨＣＶ−３１リコビナント抗原及びｐＨ
ＣＶ−３４リコビナント抗原の混合物をヒト赤血球に
感作し、感作血球濃度が１．０（ｖ／ｖ）％になるよう
に生理食塩水（ｐＨ７．０）に溶解した。また、この感
作血球溶解液に、非特異反応の吸収剤として、実施例１
の（１）〜（７）で得た酵母水抽出物、大腸菌ＸＬ−１
水抽出物、大腸菌ＪＭ１０３水抽出物、大腸菌ｐＴＢ２
１０／ＸＬ−１水抽出液、粗精製リコビナントＳＯＤタ
ンパク質、ヒト胎盤由来の精製ＳＯＤタンパク質、ウシ
赤血球由来の精製ＳＯＤタンパク質、粗精製リコビナン
トＣＫＳタンパク質、又は精製リコビナントＣＫＳタン
パク質をそれぞれ添加した。添加した濃度は、酵母水抽
出物は０．１（ｗ／ｖ）％、大腸菌水抽出物や大腸菌ｐ
ＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液は０．１（ｖ／ｖ）％、
粗精製リコビナントＳＯＤタンパク質、ヒト胎盤由来の
精製ＳＯＤタンパク質、ウシ赤血球由来の精製ＳＯＤタ
ンパク質、粗精製リコビナントＣＫＳタンパク質、及び
精製リコビナントＣＫＳタンパク質は、それぞれ２０μ
ｇ／ｍｌになるようにした。

【００６８】実施例３ＨＣＶ関連抗原を感作した赤血球の調製実施例２と同様にして、ＨＣＶ関連抗原と免疫学的に反
応性の抗体を、受身赤血球凝集反応（ＰＨＡ）を用いて
測定するため、ＨＣＶ関連抗原を感作した赤血球を調製
した。ＨＣＶ関連抗原として、ＨＣＶｃ１００−３
リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−３１リコビナント抗原
又はｐＨＣＶ−３４リコビナント抗原を用いた。これ
らのＨＣＶ関連抗原をそれぞれ単独でヒト赤血球に感作
し、感作血球濃度が１．０（ｖ／ｖ）％になるように生
理食塩水（ｐＨ７．０）に溶解した。また、この感作血
球溶解液に、非特異反応の吸収剤として、実施例１の
（１）〜（７）で得た酵母水抽出物、大腸菌ＸＬ−１水
抽出物、大腸菌ＪＭ１０３水抽出物、大腸菌ｐＴＢ２１
０／ＸＬ−１水抽出液、粗精製リコビナントＳＯＤタン
パク質、ヒト胎盤由来の精製ＳＯＤタンパク質、ウシ赤
血球由来の精製ＳＯＤタンパク質、粗精製リコビナント
ＣＫＳタンパク質、又は精製リコビナントＣＫＳタンパ
ク質をそれぞれ添加した。添加した濃度は、実施例２の
場合と同様にした。

【００６９】実施例４ＣＫＳ及びＳＯＤの非特異的反応の抑制効果の測定ＨＣＶ関連抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法にお
ける、ＣＫＳ及びＳＯＤの非特異的反応の抑制効果を、
受身赤血球凝集反応（ＰＨＡ、１５〜３０℃で２時間イ
ンキュベーション）を用いて測定した。（１）先ず、実施例２で得られた、何も非特異反応の吸
収剤の添加してない感作血球を用いて、健常人の血清検
体５０００例についてＰＨＡアッセイをおこなった。こ
のＰＨＡアッセイで凝集反応が観察された偽陽性検体と
して２０例を得た。次にこの偽陽性検体２０例につい
て、実施例２で得られた、各種（酵母水抽出物、大腸菌
ＸＬ−１水抽出物、大腸菌ＪＭ１０３水抽出物、大腸菌
ｐＴＢ２１０／ＸＬ−１水抽出液、粗精製リコビナント
ＳＯＤタンパク質、ヒト胎盤由来の精製ＳＯＤタンパク
質、ウシ赤血球由来の精製ＳＯＤタンパク質、粗精製リ
コビナントＣＫＳタンパク質、又は精製リコビナントＣ
ＫＳタンパク質）の非特異反応の吸収剤を添加した感作
血球を用いて、ＰＨＡアッセイを行った。得られた結果
を表１に示す。

【００７０】

【表１】

【００７１】（２）次に、実施例３で得られた、何も非
特異反応の吸収剤の添加してない感作血球、及び実施例
３で得られた、各種（酵母水抽出物、大腸菌ＸＬ−１水
抽出物、大腸菌ＪＭ１０３水抽出物、大腸菌ｐＴＢ２１
０／ＸＬ−１水抽出液、粗精製リコビナントＳＯＤタン
パク質、ヒト胎盤由来の精製ＳＯＤタンパク質、ウシ赤
血球由来の精製ＳＯＤタンパク質、粗精製リコビナント
ＣＫＳタンパク質、又は精製リコビナントＣＫＳタンパ
ク質）の非特異反応の吸収剤を添加した感作血球を用い
て、上記の偽陽性検体２０例について、ＰＨＡアッセイ
を行った。得られた結果を表２に示す。

【００７２】

【表２】

【００７３】表１及び表２に示したように、ＣＫＳタン
パク質又はＳＯＤタンパク質を含む吸収剤を添加するこ
とにより、偽陽性検体が吸収され陰性化した。また、Ｃ
ＫＳタンパク質及びＳＯＤタンパク質の両者を含む吸収
剤を同時に添加することにより、全ての偽陽性検体が吸
収され陰性化した。一方、酵母水抽出物やリコンビナン
トタンパク質を発現するための遺伝子組換え操作が行わ
れていない大腸菌の水抽出液の添加によっては、偽陽性
検体は全く陰性化しなかった。このようにＣＫＳタンパ
ク質又はＳＯＤタンパク質を含む感作血球溶解液を用い
ることにより、非特異的反応を吸収して、顕著に偽陽性
を抑制できることが明らかとなった。また、上記実施例
とは別の実験において、上記実施例で使用した各種の非
特異反応の吸収剤を、上記実施例で使用した各種の感作
血球溶解液に添加しても、ＨＣＶ関連抗体の測定には影
響しなかった。従って、ＣＫＳタンパク質又はＳＯＤタ
ンパク質を含有する感作血球溶解液を用いることによ
り、ＨＣＶ関連抗体の測定を損なうこと無く、非特異的
反応のみを吸収して、偽陽性を抑制し、ＨＣＶ関連抗体
に対するより特異性の高いアッセイ試薬となることが明
らかとなった。

【００７４】

【発明の効果】ＣＫＳタンパク質を用いることにより、
遺伝子組換え法で産生された抗原を用いた、試料中のＨ
ＣＶ抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定において、非
特異的反応の発生を効果的に中和でき、より特異性に優
れた測定ができる。また、ＣＫＳタンパク質に加えて、
ＳＯＤタンパク質を一緒に用いることにより、より優れ
たＨＣＶ抗原と免疫学的に反応性の抗体測定系が提供で
き、臨床検査においての有用性が高いし、より早い時期
でＨＣＶ関連抗体を検出したり、非Ａ非Ｂ型肝疾患にお
ける検出率を高めたり、供血者のスクリーニングを確実
に行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＴＢ２０１作製に用いた修飾用の合成ｌａ
ｃＰプロモーター領域のＤＮＡ配列を示す。

【図２】ｐＴＢ２０１作製に用いたｋｄｓＢ遺伝子の
５’端の合成領域のＤＮＡ配列を示す。

【図３】ｐＴＢ２１０作製に用いたリンカーのＤＮＡ
配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１Ｇ０１Ｎ 33/543 ５８１Ｊ５８１Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者井上裕三千葉県松戸市岩瀬618 エステートピアＯＮＥ 201号 (72)発明者松村多恵千葉県千葉市美浜区磯辺１−40−１ (72)発明者小林利章千葉県松戸市稔台60 アーネス敏201号 (56)参考文献特公平３−59382（ＪＰ，Ｂ２) 特表平６−506770（ＪＰ，Ａ) 特表平６−510289（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/576 G01N 33/53

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子組換え法で産生された抗原を用い
た、試料中のＨＣＶ抗原と免疫学的に反応性の抗体の測
定法において、ＣＫＳ又はそれと実質的に同等の抗原決
定基を有するものを測定系に添加して、偽陽性を抑制す
ることを特徴とするＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項２】遺伝子組換え法で産生された抗原が、融
合タンパク質として得られるものである請求項１記載の
ＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項３】遺伝子組換え法で産生された抗原が、遺
伝子組換え法でＣＫＳ又はＳＯＤあるいはそれらの関連
タンパク質の融合タンパク質として得られるものである
請求項１又は２記載のＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項４】遺伝子組換え法で産生された抗原が、宿
主細胞として大腸菌を用いて得られるものである請求項
１〜３のいずれか一記載のＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項５】遺伝子組換え法で産生された抗原が、宿
主細胞として酵母を用いて得られるものである請求項１
〜３のいずれか一記載のＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項６】ＣＫＳ又はそれと実質的に同等の抗原決
定基を有するものが、宿主細胞として大腸菌を用いて得
られるものである請求項１〜５のいずれか一記載のＨＣ
Ｖ関連抗体の測定法。
【請求項７】ＣＫＳ又はそれと実質的に同等の抗原決
定基を有するものが、リコビナントＣＫＳタンパク質の
発現ベクターであるプラスミドを大腸菌に導入して形質
転換処理され、こうして形質転換された大腸菌を培養し
てリコビナントＣＫＳタンパク質を発現させ、得られた
培養液より単離精製処理して得られたものである請求項
１〜６のいずれか一記載のＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項８】ＣＫＳ又はそれと実質的に同等の抗原決
定基を有するものが、リコビナントＣＫＳタンパク質の
発現ベクターで形質転換された大腸菌を培養し、リコビ
ナントＣＫＳタンパク質を発現させて得られた培養液よ
りの菌体をプロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られた
リコビナントＣＫＳタンパク質を含む液から蛋白質沈殿
剤により沈殿させたタンパク質沈殿物を透析し、それを
精製処理して得られたものである請求項１〜７のいずれ
か一記載のＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項９】ＣＫＳ又はそれと実質的に同等の抗原決
定基を有するものが、リコビナントＣＫＳタンパク質の
発現ベクターで形質転換された大腸菌を培養し、リコビ
ナントＣＫＳタンパク質を発現させて得られた培養液よ
りの菌体をプロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られた
リコビナントＣＫＳタンパク質を含む液から蛋白質沈殿
剤によりタンパク質を沈殿させ、ついで透析したものを
イオン交換クロマトグラフィーにより精製処理して得ら
れたものである請求項１〜８のいずれか一記載のＨＣＶ
関連抗体の測定法。
【請求項１０】ＣＫＳ又はそれと実質的に同等の抗原
決定基を有するものが、リコビナントＣＫＳタンパク質
の発現ベクターで形質転換された大腸菌を培養し、リコ
ビナントＣＫＳタンパク質を発現させて得られた培養液
よりの菌体をプロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られ
たリコビナントＣＫＳタンパク質を含む液から蛋白質沈
殿剤によりタンパク質を沈殿させ、ついで透析したもの
をさらにゲル濾過クロマトグラフィーにより精製処理し
て得られたものである請求項１〜８のいずれか一記載の
ＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項１１】リコビナントＣＫＳタンパク質の発現
ベクターが、ｐＴＢ２０１，ｐＴＢ２１０、ｐＴＢ２６
０，ｐＴＢ２７０又はそれらから制限酵素及び／又は合
成オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子組換え法で修飾さ
れて誘導されたプラスミドである請求項７〜１０のいず
れか一記載のＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項１２】遺伝子組換え法で産生された抗原を用
いた、試料中のＨＣＶ抗原と免疫学的に反応性の抗体の
測定法において、ＣＫＳ又はそれと実質的に同等の抗原
決定基を有するもの、及びＳＯＤ又はそれと実質的に同
等の抗原決定基を有するものを測定系に添加して、偽陽
性を抑制することを特徴とするＨＣＶ関連抗体の測定
法。
【請求項１３】ＳＯＤ又はそれと実質的に同等の抗原
決定基を有するものが、宿主細胞として酵母を用いて得
られるリコビナント蛋白質である請求項１２記載のＨＣ
Ｖ関連抗体の測定法。
【請求項１４】ＳＯＤ又はそれと実質的に同等の抗原
決定基を有するものが、リコビナントＳＯＤタンパク質
の発現ベクターであるプラスミドを、酵母に導入し形質
転換処理され、こうして形質転換された酵母を培養し、
リコビナントＳＯＤタンパク質を発現させ、得られた培
養液より単離精製処理して得られたものである請求項１
２又は１３記載のＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項１５】ＳＯＤ又はそれと実質的に同等の抗原
決定基を有するものが、リコビナントＳＯＤタンパク質
の発現ベクターで形質転換された酵母を培養しリコビナ
ントＳＯＤタンパク質を発現させて得られた培養液より
の菌体を、プロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られた
リコビナントＳＯＤタンパク質を含む液から加熱処理に
よりタンパク質を沈殿させたタンパク質抽出液を、精製
処理して得られたものである請求項１２〜１４のいずれ
か一記載のＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項１６】ＳＯＤ又はそれと実質的に同等の抗原
決定基を有するものが、リコビナントＳＯＤタンパク質
の発現ベクターで形質転換された酵母を培養しリコビナ
ントＳＯＤタンパク質を発現させて得られた培養液より
の菌体を、プロテアーゼ阻害剤存在下破砕し、得られた
リコビナントＳＯＤタンパク質を含む液から加熱処理に
よりタンパク質を沈殿させたタンパク質抽出液を、イオ
ン交換クロマトグラフィーにより精製処理して得られた
ものである請求項１２〜１５のいずれか一記載のＨＣＶ
関連抗体の測定法。
【請求項１７】リコビナントＳＯＤタンパク質の発現
ベクターが、ＳＯＤ８−３又はそれらから制限酵素及び
／又は合成オリゴヌクレオチドを用いて遺伝子組換え法
で修飾されて誘導されたプラスミドである請求項１４〜
１６のいずれか一記載のＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項１８】ＳＯＤ又はそれと実質的に同等の抗原
決定基を有するものが、ヒト胎盤由来のＳＯＤタンパク
質及びウシ赤血球由来のＳＯＤタンパク質から成る群か
ら選ばれたものである請求項１２記載のＨＣＶ関連抗体
の測定法。
【請求項１９】遺伝子組換え法で産生された抗原が、
遺伝子組換え法で融合タンパク質として得られる複数の
ＨＣＶ関連抗原からなる請求項１〜１８のいずれか一記
載のＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項２０】遺伝子組換え法で産生された抗原が、
ＨＣＶｃ１００−３リコビナント抗原、ｐＨＣＶ−３
１リコビナント抗原及びｐＨＣＶ−３４リコビナント抗
原のＨＣＶ関連抗原からなる請求項１〜１９のいずれか
一記載のＨＣＶ関連抗体の測定法。
【請求項２１】遺伝子組換え法で産生された抗原を用
いた試料中のＨＣＶ抗原と免疫学的に反応性の抗体の測
定試薬において、偽陽性を抑制するため、ＣＫＳ又はそ
れと実質的に同等の抗原決定基を有するものが配合され
ていることを特徴とするＨＣＶ関連抗体の測定試薬。
【請求項２２】遺伝子組換え法で産生された抗原を用
いた試料中のＨＣＶ抗原と免疫学的に反応性の抗体の測
定試薬において、偽陽性を抑制するため、ＣＫＳ又はそ
れと実質的に同等の抗原決定基を有するもの、及びＳＯ
Ｄ又はそれと実質的に同等の抗原決定基を有するもの
が、配合されていることを特徴とするＨＣＶ関連抗体の
測定試薬。
【請求項２３】測定試薬が、ラジオイムノアッセイ、
酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、化学又は生物発光免
疫測定法、及び凝集反応免疫測定法からなる群から選ば
れたものにおいて用いられるものであることを特徴とす
る請求項２１又は２２記載のＨＣＶ関連抗体の測定試
薬。
【請求項２４】測定試薬が、競合アッセイ、中和アッ
セイ、固相アッセイ、クロマトグラムアッセイ、及びサ
ンドイッチアッセイからなる群から選ばれたものにおい
て用いられるものであることを特徴とする請求項２１〜
２３のいずれか一記載のＨＣＶ関連抗体の測定試薬。
【請求項２５】試料が、全血、血清、血漿、脳脊髄
液、リンパ液、リンパ球、唾液、尿、汗、涙、糞便、生
体粘液、生検組織、及び細胞培養上清液からなる群から
選ばれたものであることを特徴とする請求項２１〜２４
のいずれか一記載のＨＣＶ関連抗体の測定試薬。
【請求項２６】検知用試薬として、酵素試薬、放射性
物質試薬、螢光試薬、発光試薬、化学発光試薬、コロイ
ド標識試薬、磁性体試薬、及びハプテン標識抗ハプテン
抗体検出系試薬からなる群から選ばれたものを用いるも
のであることを特徴とする請求項２１〜２５のいずれか
一記載のＨＣＶ関連抗体の測定試薬。
【請求項２７】請求項１〜２０のいずれか一記載のＨ
ＣＶ関連抗体の測定法に用いるものである請求項２１〜
２６のいずれか一記載のＨＣＶ関連抗体の測定試薬。