JPS6151571A - オ−エスキ−病診断用抗原の単離・精製法 - Google Patents
オ−エスキ−病診断用抗原の単離・精製法Info
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- JPS6151571A JPS6151571A JP17381984A JP17381984A JPS6151571A JP S6151571 A JPS6151571 A JP S6151571A JP 17381984 A JP17381984 A JP 17381984A JP 17381984 A JP17381984 A JP 17381984A JP S6151571 A JPS6151571 A JP S6151571A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
本発明は、オーエスキー病（Ａｕｊｅｓｔｋｙ病）の診
断に用いる抗原の単離・精製法に関するものである。
断に用いる抗原の単離・精製法に関するものである。
オーエスキー病ハ、ヘルペスウィルス科のアルファへル
ーｅス亜科に属スるブタヘルペス１ウィルス（以下ＡＤ
Ｖと略称する）によってひきおこされる伝染病であシ、
ブタをはじめとして、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌなど種
々のは乳動物が感染する。
ーｅス亜科に属スるブタヘルペス１ウィルス（以下ＡＤ
Ｖと略称する）によってひきおこされる伝染病であシ、
ブタをはじめとして、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌなど種
々のは乳動物が感染する。
重病の感染診断法の一つとしては、対象とする個体より
採取した血清（以下検査血清というン中の抗体を検出す
る方法が知られている。すなわち、予めＡＤＶ ４Ｃ特
異的な抗原を作製しておいて、この抗原と反応する抗体
の有無（検出史には定量）を検査血清を対象として行な
う診断法である。
採取した血清（以下検査血清というン中の抗体を検出す
る方法が知られている。すなわち、予めＡＤＶ ４Ｃ特
異的な抗原を作製しておいて、この抗原と反応する抗体
の有無（検出史には定量）を検査血清を対象として行な
う診断法である。
一般的には、ウィルスに特異的な抗体を検出する方法と
して、ウィルス中和反応、免疫拡散法。
して、ウィルス中和反応、免疫拡散法。
補体結合反応、酵素象疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎ
ｋｅｄＩｍｍｕｎｏａｏｒｂ＠ｎｔ ａｓｓａｙ：以下
ＥＬＩＳＡと略称する）。
ｋｅｄＩｍｍｕｎｏａｏｒｂ＠ｎｔ ａｓｓａｙ：以下
ＥＬＩＳＡと略称する）。
ラジオイムノア、セイ等が知られるが、このうちウィル
スに特異的で感度が高く、シかも簡便で実用的に優れた
ものとしては後二者とされ、更に高価な設備の必要性、
半減期をもつアイソトープ〇長期保存上のｐ：（ζをも
つラジオイムノアッセイ法に比べ、ＥＬＩＳＡが最も有
用性あるものとされている。
スに特異的で感度が高く、シかも簡便で実用的に優れた
ものとしては後二者とされ、更に高価な設備の必要性、
半減期をもつアイソトープ〇長期保存上のｐ：（ζをも
つラジオイムノアッセイ法に比べ、ＥＬＩＳＡが最も有
用性あるものとされている。
本発明において対象とするオーエスキー病の診ｉＪ１法
の一つとしてこのｇＬＩｓＡを用いることについても、
既に遠心法による精製抗原を用い九トーマ・９氏等（ペ
テリナリーレコード、１０２巻、２６４頁： １９７８
） 、 ＥＨＴｅ波氏等（第９０回日本獣医学会発表
：１９１１０）等によって報告されている。
の一つとしてこのｇＬＩｓＡを用いることについても、
既に遠心法による精製抗原を用い九トーマ・９氏等（ペ
テリナリーレコード、１０２巻、２６４頁： １９７８
） 、 ＥＨＴｅ波氏等（第９０回日本獣医学会発表
：１９１１０）等によって報告されている。
ところで、前述しｔような種々の方法を用いて診断を行
なう場合には、測定感度を高めるためにＡＤＶに特異的
な抗原の精製がＭ、要であり、特にＥＬＩＳＡ ｒこお
いてはＡＤｖに特異的な抗原と検査血清中の抗体との反
ｉｏみならず、非特異的な反応をおく生じてこれが検査
測定値に影響する結果となるから、前記抗原のｆ＃製の
問題は−ＦｊＮ要となる。
なう場合には、測定感度を高めるためにＡＤＶに特異的
な抗原の精製がＭ、要であり、特にＥＬＩＳＡ ｒこお
いてはＡＤｖに特異的な抗原と検査血清中の抗体との反
ｉｏみならず、非特異的な反応をおく生じてこれが検査
測定値に影響する結果となるから、前記抗原のｆ＃製の
問題は−ＦｊＮ要となる。
前記非特異反応は、例えば、診断用ＯＡＤＶ特異抗原の
、精製に伴なって、水溶液中に該抗原と共に他の蛋白質
（ＡＤＶが増殖する感染細胞由来の蛋白′ＪＪＫ、）が
随伴して含まれ、これが検査血清中Ｃ１ｆｆｆｌ々の抗
体と反応して現われる。
、精製に伴なって、水溶液中に該抗原と共に他の蛋白質
（ＡＤＶが増殖する感染細胞由来の蛋白′ＪＪＫ、）が
随伴して含まれ、これが検査血清中Ｃ１ｆｆｆｌ々の抗
体と反応して現われる。
本発明の目的は、ＡＤＶ Ｋ特異的な抗原および随伴さ
れる蛋白質を含む水溶液から、ＡＩ）Ｖに特異的な抗原
を単離・精製する方法を提供するところにある。
れる蛋白質を含む水溶液から、ＡＩ）Ｖに特異的な抗原
を単離・精製する方法を提供するところにある。
而して前記した目的を達成するためになされた本発明の
要旨とするところは、ＡＤＶ感染細胞を可溶化し不溶性
分を除去して得た溶解分画を出発材料として、前記ＡＤ
Ｖ Ｋ特異的な抗原を、陰イオン交換樹脂に吸着させ几
後緩衝液で選択的に溶出させることでＡＤＶ特異抗原を
含む分画を回収し、次いで、前記ＡＤＶの増殖に用いた
細胞に対する抗体を結合させた不溶性担体に、前記選択
溶出で回収させた分画溶液を接触させて、前記感染細胞
由来の随伴蛋白質を抗原−抗体反応にょシ分離除去する
ことを特徴とするオーエスキー病診断用抗原の単離・Ｆ
ｆＩ製法にある。
要旨とするところは、ＡＤＶ感染細胞を可溶化し不溶性
分を除去して得た溶解分画を出発材料として、前記ＡＤ
Ｖ Ｋ特異的な抗原を、陰イオン交換樹脂に吸着させ几
後緩衝液で選択的に溶出させることでＡＤＶ特異抗原を
含む分画を回収し、次いで、前記ＡＤＶの増殖に用いた
細胞に対する抗体を結合させた不溶性担体に、前記選択
溶出で回収させた分画溶液を接触させて、前記感染細胞
由来の随伴蛋白質を抗原−抗体反応にょシ分離除去する
ことを特徴とするオーエスキー病診断用抗原の単離・Ｆ
ｆＩ製法にある。
本発明における特徴は、抗原精製の常法にょシネ溶性分
を除去し７！ｅ ＡＤＶ感染細胞からの溶解分画を得（
第１ステツプ）、これを出発材料として陰イオン交換樹
脂を用いた吸着−溶出の精製工程（第２ステツプ）と、
ＡＤＶを増殖させた細胞由来の蛋白質に対する特異的な
抗原−抗体反応を行なわせるアフィニティクロママ、ト
グラフィの原理に従った生物化学的なｆ７７製工程（第
３ステ、デ）を組合せたところＫある。第３ステツプに
おいて使用される抗体は、 ＡＤＶを感染させて増殖さ
せる細胞の正常ｍ胞（ＡＤＶ非感染ｍ ＪＪｉりを高度
に免疫した異種個体からの高度免疫血清を用い、同免疫
血清から免疫グロブリン分画を塩析法、電気泳動法１等
電点分画法等によりｆｆｆ製して得られる。
を除去し７！ｅ ＡＤＶ感染細胞からの溶解分画を得（
第１ステツプ）、これを出発材料として陰イオン交換樹
脂を用いた吸着−溶出の精製工程（第２ステツプ）と、
ＡＤＶを増殖させた細胞由来の蛋白質に対する特異的な
抗原−抗体反応を行なわせるアフィニティクロママ、ト
グラフィの原理に従った生物化学的なｆ７７製工程（第
３ステ、デ）を組合せたところＫある。第３ステツプに
おいて使用される抗体は、 ＡＤＶを感染させて増殖さ
せる細胞の正常ｍ胞（ＡＤＶ非感染ｍ ＪＪｉりを高度
に免疫した異種個体からの高度免疫血清を用い、同免疫
血清から免疫グロブリン分画を塩析法、電気泳動法１等
電点分画法等によりｆｆｆ製して得られる。
また前記抗体は、生物活性を失なわせることなく水不溶
性とする既知の種々の手法を用い、好ましくは共有結合
によりネ溶性担体に結合される。
性とする既知の種々の手法を用い、好ましくは共有結合
によりネ溶性担体に結合される。
不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂、セルｏ−ス誘
導体、′Ｘ天ダル、タンパク質の不溶性のブリマー谷の
有機、無機の水不溶性のものが適宜使用される。
導体、′Ｘ天ダル、タンパク質の不溶性のブリマー谷の
有機、無機の水不溶性のものが適宜使用される。
本発明の第２ステツプにおいて便用される陰イオン交換
樹脂としては、ＡＤ’／ ％異抗原を十分に吸着−溶出
するものが使用され、例えば、ジエチルアミノエチル（
ＤＥＡＥ）基で置換されたセルロースｒル、アガロース
ｒル等、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基で置換された
セルロースケ９ル、アガロースダル等が使用される。
樹脂としては、ＡＤ’／ ％異抗原を十分に吸着−溶出
するものが使用され、例えば、ジエチルアミノエチル（
ＤＥＡＥ）基で置換されたセルロースｒル、アガロース
ｒル等、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）基で置換された
セルロースケ９ル、アガロースダル等が使用される。
以下本発明を下記操作手順に示した一例の精製操作概要
に従って更に詳細に説明する。
に従って更に詳細に説明する。
トエスキー病ウィルス（ＡＤＶ）抗原の精製（ｉ）ａＤ
ｖｇ染ＢＨＫ細胞 ↓ （ｉｉ）感染後４８〜７２時間の細胞 ↓ （ｉｉｉ）１％非非才オフ性界活性剤を含む５０ｒｎＭ
） ＩＪスー塩ｒＲ，ｐＨ８，６に懸濁 ↓ （ｉＶ）超音波処理２分 ↓ （■）６０００ｒｐｍで１０分遠心 ↓ （ｖｌ）上清 イー 上記の（ｉ）〜（■１）は、ＡＤＶ特異抗原を含み、か
つ不溶性分を除い良溶解分画を作製する工程を示しでお
シ、丑ずＡＤＶ’感染細胞を組は培養（（１）、（１１
））した後、これをガラスジ１ノート等Ｃ培養基体から
剥し、非イオン性界面活性ムリを含む緩衝液（例えばト
リスｋＭに緩行液〕にｇ潤させ、超音波処：Ｆｌ！ＧＶ
）の後遠心法（）により不溶性分を除いた上清（■１）
として溶解分画を回収する（以下これを「溶液込）」と
呼ぶ）。
ｖｇ染ＢＨＫ細胞 ↓ （ｉｉ）感染後４８〜７２時間の細胞 ↓ （ｉｉｉ）１％非非才オフ性界活性剤を含む５０ｒｎＭ
） ＩＪスー塩ｒＲ，ｐＨ８，６に懸濁 ↓ （ｉＶ）超音波処理２分 ↓ （■）６０００ｒｐｍで１０分遠心 ↓ （ｖｌ）上清 イー 上記の（ｉ）〜（■１）は、ＡＤＶ特異抗原を含み、か
つ不溶性分を除い良溶解分画を作製する工程を示しでお
シ、丑ずＡＤＶ’感染細胞を組は培養（（１）、（１１
））した後、これをガラスジ１ノート等Ｃ培養基体から
剥し、非イオン性界面活性ムリを含む緩衝液（例えばト
リスｋＭに緩行液〕にｇ潤させ、超音波処：Ｆｌ！ＧＶ
）の後遠心法（）により不溶性分を除いた上清（■１）
として溶解分画を回収する（以下これを「溶液込）」と
呼ぶ）。
ここでは、感染細胞としてＢＨＫ ２１細胞（ノームス
ク−しんｎ細胞）を用いた例のものを示しているが、人
ＤＶに感受性の高い細胞であれば、同様に利用できる。
ク−しんｎ細胞）を用いた例のものを示しているが、人
ＤＶに感受性の高い細胞であれば、同様に利用できる。
かかる細胞について例示すれば、初代培養細胞：豚腎（
ｓｚｅｎｔ−Ｉｖａｎｙ １９６０） ＋ウサギ腎（Ｉ
ｌａｒｓｋｉら１９５５）、大野（Ｔｏｒｌｏｌｌｅｌ
９５８ ） ＊羊’ｆ’ｆ （Ｃｅｅｃａｒａｌｌ
ａｎｄ Ｄ＊ｌ Ｎａｚｚａ １９５８ ） ＋生育（
Ｇｎｇｌｉｎｒｄｉら１９６０）、猫腎（Ｈｏｒｖａｔ
ｈ ａｎｄ Ｐａｐｐ１９６７）、サル腎（Ｋａｒａｋ
ｊｎｒｔｏ ａｎｄ Ｒｏｈｄｅ ９５７ ） ｒ周腎
（Ｐｅｔｒｅｓｅｕら１９６９）、７！し、ト腎（Ｉｌ
ｕｒｒｏｗｓ１９６（３）、ｊ４胎児線維芽細胞（Ｉｖ
ａｎｏｖｌｃｓ １９５５ ）％継代Ｉ用μｇ ： Ｐ
Ｉ（−１５＋ Ｈｅｐ２ （いずれもＭｃＦｅｒａｎら
１９７２ ） ＋Ｖｅｒｏ、 Ｈｅ１ｃｎ （Ｓｃｈｅ
ｒｅｒ ａｎｄ ５ｙｖｅｒｔｏｎ１９５４ ） ｒ
ＢＨＫ−２１（Ｓｔｏｌｃｅｒ ａｎｄ ＭｃＰｂｅｒ
ｓｏｎ １９６４）＋ＨｍＬｕ、ＣＰＫ等でちる。
ｓｚｅｎｔ−Ｉｖａｎｙ １９６０） ＋ウサギ腎（Ｉ
ｌａｒｓｋｉら１９５５）、大野（Ｔｏｒｌｏｌｌｅｌ
９５８ ） ＊羊’ｆ’ｆ （Ｃｅｅｃａｒａｌｌ
ａｎｄ Ｄ＊ｌ Ｎａｚｚａ １９５８ ） ＋生育（
Ｇｎｇｌｉｎｒｄｉら１９６０）、猫腎（Ｈｏｒｖａｔ
ｈ ａｎｄ Ｐａｐｐ１９６７）、サル腎（Ｋａｒａｋ
ｊｎｒｔｏ ａｎｄ Ｒｏｈｄｅ ９５７ ） ｒ周腎
（Ｐｅｔｒｅｓｅｕら１９６９）、７！し、ト腎（Ｉｌ
ｕｒｒｏｗｓ１９６（３）、ｊ４胎児線維芽細胞（Ｉｖ
ａｎｏｖｌｃｓ １９５５ ）％継代Ｉ用μｇ ： Ｐ
Ｉ（−１５＋ Ｈｅｐ２ （いずれもＭｃＦｅｒａｎら
１９７２ ） ＋Ｖｅｒｏ、 Ｈｅ１ｃｎ （Ｓｃｈｅ
ｒｅｒ ａｎｄ ５ｙｖｅｒｔｏｎ１９５４ ） ｒ
ＢＨＫ−２１（Ｓｔｏｌｃｅｒ ａｎｄ ＭｃＰｂｅｒ
ｓｏｎ １９６４）＋ＨｍＬｕ、ＣＰＫ等でちる。
増殖したＡＤｖ感染細胞を懸濁させる緩衝液としては、
トリス−塩酸緩（ｉ１ｔ？液、リン酸緩衝液等が用いら
れるが、最終製品の希釈程度、処理の容易化。
トリス−塩酸緩（ｉ１ｔ？液、リン酸緩衝液等が用いら
れるが、最終製品の希釈程度、処理の容易化。
確実化等を考慮して、通常感染細胞に対し緩衝液を容積
比１／３程度とすることがよい。緩衝液は中性付近（例
えば５０ｍＭ）リス−塩酸：ｐＨ８，６）で好ましく使
用される。
比１／３程度とすることがよい。緩衝液は中性付近（例
えば５０ｍＭ）リス−塩酸：ｐＨ８，６）で好ましく使
用される。
次ぎに、前記のようにして得た「溶液（ト）」は、ＡＤ
Ｖ特異抗原と反対極性をもつ陰イオン交換樹脂に対し、
通常のカラム操作かパッチ法によｆｉ、ＡＤＶ特異抗原
を吸着させ、次いで例えば緩衝液においてＮａＣｔが０
〜１ ｍｏｌｅ／ｅまで変化する濃度勾配溶出法により
、ＡＤｖ特異抗原を含むフラクションを分画する（第２
ステップ：得られた分画を「溶液（Ｂ）」と呼ぶ）６前
記陰イオン交換樹脂としては、具体的には例えば、ＱＡ
Ｅ −５ｓｐｈａｄｅｘ Ａ −５０、Ａ −２５、Ｄ
ＥＡＥ −Ｓｅｐ’ｈａｄｒｘ Ａ −５０、ＤＥＡＦ
、−５ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ、ＤＥΔＦａ −５
ｅｐｈａｃｅｌ 、ＩＤＥＡＥ −５ｅｐｈａｄｅｘＡ
−２ｓ（以下Ｉ’ｈａｒｍａｃｌｎ社製）、ＡＧＩ−
Ｘ２．Ｘ４゜Ｘ８、ＡＣ３−Ｘ８．ＸＩＯｌＡＧＭＰ
−１、旧６− Ｒａｘ９．５、ＡＣ３−Ｘ４Ａ（以上Ｂ
ｉｏ −Ｒｅｄ社製）等が使用される。
Ｖ特異抗原と反対極性をもつ陰イオン交換樹脂に対し、
通常のカラム操作かパッチ法によｆｉ、ＡＤＶ特異抗原
を吸着させ、次いで例えば緩衝液においてＮａＣｔが０
〜１ ｍｏｌｅ／ｅまで変化する濃度勾配溶出法により
、ＡＤｖ特異抗原を含むフラクションを分画する（第２
ステップ：得られた分画を「溶液（Ｂ）」と呼ぶ）６前
記陰イオン交換樹脂としては、具体的には例えば、ＱＡ
Ｅ −５ｓｐｈａｄｅｘ Ａ −５０、Ａ −２５、Ｄ
ＥＡＥ −Ｓｅｐ’ｈａｄｒｘ Ａ −５０、ＤＥＡＦ
、−５ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ、ＤＥΔＦａ −５
ｅｐｈａｃｅｌ 、ＩＤＥＡＥ −５ｅｐｈａｄｅｘＡ
−２ｓ（以下Ｉ’ｈａｒｍａｃｌｎ社製）、ＡＧＩ−
Ｘ２．Ｘ４゜Ｘ８、ＡＣ３−Ｘ８．ＸＩＯｌＡＧＭＰ
−１、旧６− Ｒａｘ９．５、ＡＣ３−Ｘ４Ａ（以上Ｂ
ｉｏ −Ｒｅｄ社製）等が使用される。
前記「溶液（Ｂ）」中には、ＡＤＶ特異抗原の他に、前
記例の堀合にはＢＨＫ細胞由来の蛋白質が共に含まれて
おり、これがＥＬＩＳＡの測定結果に影響することは既
に述べた。
記例の堀合にはＢＨＫ細胞由来の蛋白質が共に含まれて
おり、これがＥＬＩＳＡの測定結果に影響することは既
に述べた。
そこで本発明においては、「溶液（Ｂ）」に対し、アフ
ィニティクロマトグラフィの原理に従りてＢ）ｔｌ（細
胞由来の蛋白質のみを生物化学的に分離して除去し、Ａ
ＤＶ特異抗原を単離・精製した最終産物を得るようＫし
ている（第３ステップ：得られた最終産物を「溶液（Ｃ
）」と呼ぶ）・第３ステツプにおいては、抗ＢＨＫ細胞
抗体を不溶性担体に結合させて一般的にはカラム操作を
用いて「溶液（Ｂ）」を接触させる方法が好ましく採用
される。
ィニティクロマトグラフィの原理に従りてＢ）ｔｌ（細
胞由来の蛋白質のみを生物化学的に分離して除去し、Ａ
ＤＶ特異抗原を単離・精製した最終産物を得るようＫし
ている（第３ステップ：得られた最終産物を「溶液（Ｃ
）」と呼ぶ）・第３ステツプにおいては、抗ＢＨＫ細胞
抗体を不溶性担体に結合させて一般的にはカラム操作を
用いて「溶液（Ｂ）」を接触させる方法が好ましく採用
される。
以下本発明を実施例に従って説明する。
実施例１
（１）培養面積１１００ｃｒｎ２のローラー、＋６ ）
ル１９本にＢＨＫ ２１細胞を単層培養し、これにＡＤ
Ｖのインディアナ株（Ｉｎｄｉａｎａ株）を感染させ３
７℃で４８時間培養する。
ル１９本にＢＨＫ ２１細胞を単層培養し、これにＡＤ
Ｖのインディアナ株（Ｉｎｄｉａｎａ株）を感染させ３
７℃で４８時間培養する。
細胞培養培地は２チラシ胎児血清を含むイーグルＢ避培
地を使用した。
地を使用した。
培養後ラバーポリスマ／゛で感染細胞をガラス壁よ）は
がし、４℃１５００ ｒｐｍで１０分間遠心し、遠心板
上清を除去して沈殿の細胞を回収した。ここで回収され
た細胞の容積は２８ ｍｔであった。
がし、４℃１５００ ｒｐｍで１０分間遠心し、遠心板
上清を除去して沈殿の細胞を回収した。ここで回収され
た細胞の容積は２８ ｍｔであった。
次いでこれに１チの非・ｆオン性界面活性剤を含む５０
ｍ ｍｏ１１１７ｅ ）リス塩Ｂ２ （ｐ＋ｔｓ、６
）の３４ ｍｌ （ａｕ胞容櫃の３倍量）を加え、水中
で２分間超音波をかけ、これを６００ Ｏｒｐｍで１０
分間遠心し７ｃ後、上ｆ）ｔと、して「溶液μ）」を得
た□前記において非イオン性界面活性剤としてＮ Ｐ２
Ｏを使用したが、これはＴｒｉｔｏｎＸｌｏｏ ＋Ｔｗ
ｅｃｎ８０、〜Ｖ、Ｒ，１３９９、Ｌｕｂｒｏｌ Ｗ等
信のものでよい。
ｍ ｍｏ１１１７ｅ ）リス塩Ｂ２ （ｐ＋ｔｓ、６
）の３４ ｍｌ （ａｕ胞容櫃の３倍量）を加え、水中
で２分間超音波をかけ、これを６００ Ｏｒｐｍで１０
分間遠心し７ｃ後、上ｆ）ｔと、して「溶液μ）」を得
た□前記において非イオン性界面活性剤としてＮ Ｐ２
Ｏを使用したが、これはＴｒｉｔｏｎＸｌｏｏ ＋Ｔｗ
ｅｃｎ８０、〜Ｖ、Ｒ，１３９９、Ｌｕｂｒｏｌ Ｗ等
信のものでよい。
（２） この上前を陰イオン交換樹脂（ＤＥΔＥ−８
ｅｐｈａｃｅｌ ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社農：商品名）
を充填したカラムＫかけて、０．２チ非イオン性界而活
性剤を含む５０ ｍｍｏｌＡ） ！Ｊス塩酸で前記樹脂
に吸着しない成分を洗い流した後、同緩衝液と１ｍｏム
ＫＣＩを含む同緩衝液との間で作製されたＫＣＩの直線
の度勾配で前記樹脂に吸着している成分を選択的に溶出
させ、免疫拡散法によりＡＤＶ特異抗原の認められた分
画として「溶液（Ｂ）」を得た。第１図はこの結果を示
して：ｆ？シ、図中矢印で示した分画にＡＤＶ特異抗原
が回収されている。
ｅｐｈａｃｅｌ ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社農：商品名）
を充填したカラムＫかけて、０．２チ非イオン性界而活
性剤を含む５０ ｍｍｏｌＡ） ！Ｊス塩酸で前記樹脂
に吸着しない成分を洗い流した後、同緩衝液と１ｍｏム
ＫＣＩを含む同緩衝液との間で作製されたＫＣＩの直線
の度勾配で前記樹脂に吸着している成分を選択的に溶出
させ、免疫拡散法によりＡＤＶ特異抗原の認められた分
画として「溶液（Ｂ）」を得た。第１図はこの結果を示
して：ｆ？シ、図中矢印で示した分画にＡＤＶ特異抗原
が回収されている。
（３）次ぎに１下記精製法により作製した抗ＢＨＫ２１
細胞抗体を結合させたセルロースを充填したカラムに、
前記「溶液（Ｂ）」をかけて室温で３０分間反応させ、
０．５ｍｏｌＡＮａＣ４を含む０．１ ｍｏ＆ ＮｈＨ
Ｃ０３ＩＪｉ衝液（ｐｉｉｓ、ａンにより、前記抗８１
（２１細胞抗体に反応しない部分を溶出させて「溶液ｐ
」を得た・以上のｈテ製ステップ（ｉ） 、 （２）
＊ （３） ＆ｃよりて得られた各［溶液（５）、 （
Ｂ） 、 （Ｃ） Ｊの回収容量は下記表１の通フであ
る。
細胞抗体を結合させたセルロースを充填したカラムに、
前記「溶液（Ｂ）」をかけて室温で３０分間反応させ、
０．５ｍｏｌＡＮａＣ４を含む０．１ ｍｏ＆ ＮｈＨ
Ｃ０３ＩＪｉ衝液（ｐｉｉｓ、ａンにより、前記抗８１
（２１細胞抗体に反応しない部分を溶出させて「溶液ｐ
」を得た・以上のｈテ製ステップ（ｉ） 、 （２）
＊ （３） ＆ｃよりて得られた各［溶液（５）、 （
Ｂ） 、 （Ｃ） Ｊの回収容量は下記表１の通フであ
る。
抗ＢＨＫ抗体のｆｔ’？製：
培養Ｂ［２１ｍ胞をリン酸塩緩衝液で洗浄後・同緩衝液
に懸濁したものをウサギに免疫しＢＨＫ２１細胞に対す
る高度免疫血清を作製する。同免疫血清の免疫グロブリ
ン分画を塩析法で精製する。
に懸濁したものをウサギに免疫しＢＨＫ２１細胞に対す
る高度免疫血清を作製する。同免疫血清の免疫グロブリ
ン分画を塩析法で精製する。
すなわち、抗ＢＨＫウサギ血清に等ｆｆ１ｃｖ飽和硫酸
ア／モニウムを加え、室温で３０分静置した後１１００
００ｒｐで３０分遠心して沈殿を回収する。これに元の
血清と同斂のリン酸塩緩衝液（資料参照）を加え溶解し
たものに半量の飽和硫酸アンモニウムを加え室温で３０
分静置し次後同様に遠心して沈殿を回収する。この操作
をもう一度跪り返す。
ア／モニウムを加え、室温で３０分静置した後１１００
００ｒｐで３０分遠心して沈殿を回収する。これに元の
血清と同斂のリン酸塩緩衝液（資料参照）を加え溶解し
たものに半量の飽和硫酸アンモニウムを加え室温で３０
分静置し次後同様に遠心して沈殿を回収する。この操作
をもう一度跪り返す。
回収した沈殿を元の血清ＩＩｋｏ１／１２ｊｉＯリン酸
塩緩衝液に溶解した後同緩衝液で透析した。
塩緩衝液に溶解した後同緩衝液で透析した。
得られた分画をシアノ−ｒンブロマイドで活性化した不
溶性担体に共有結合させる。ここで用いた不溶性担体は
シアノ−ｒンプロマイドセファローズである。
溶性担体に共有結合させる。ここで用いた不溶性担体は
シアノ−ｒンプロマイドセファローズである。
以上のようにして得られた最終産物（「溶液（：：）Ｊ
）をタフ ｔ４り＠ｌｃｌ、て２μ９１５０ ＩＩＩず
つプラスチックプレートに吸着させ、健康ブタ血清とＡ
ＤＶ感染血清についてＥＬＩＳＡを用いて、ｖｉｆＩａ
度を調べた（分光光度計ＤＵ −８８ｐｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｔｏｍｅｔｅｒ：Ｂｅｃｋｍｍｎ社製により波長４０
５ ｎｍのＯＤ値を測定、第２図参照、ただし抗ＡＤＶ
の測定値はフルスケール）。
）をタフ ｔ４り＠ｌｃｌ、て２μ９１５０ ＩＩＩず
つプラスチックプレートに吸着させ、健康ブタ血清とＡ
ＤＶ感染血清についてＥＬＩＳＡを用いて、ｖｉｆＩａ
度を調べた（分光光度計ＤＵ −８８ｐｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｔｏｍｅｔｅｒ：Ｂｅｃｋｍｍｎ社製により波長４０
５ ｎｍのＯＤ値を測定、第２図参照、ただし抗ＡＤＶ
の測定値はフルスケール）。
また「溶液（Ｂ）」についても同様の試験測定を行なう
と共に、これらの「溶ｔ（Ｂ）Ｊおよび「溶液（Ｃ）Ｊ
について、ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリル
アシドデル電気泳動にかけた。これらの語以上の結果か
ら、本実施例において得られたＡＤＶ特異抗原を含む「
溶液（Ｃ）」は、ＡＤＶの増殖に用いられたＢ［２１細
胞由来の蛋白質を実質的に含有せず、したがって検査血
清中の抗体との間でＡＤＶ Ｋ非特異的な反応は起らな
いため、ＡＩＷノド感染個体についてのみかけ上の陽性
反応は現われず、診断用抗原としての有用性は極めて高
いこと力ぶ分かった◎ 実施例２ 培養細胞２５ＩＩＬｔからパッチ法を用いて精製抗原を
得ｆＣａ すなわち、ステップ（１） Ｉ （２）は実施例１と同
様の操作ニヨり処理し、ステ、デ（２）で得ｆｃ ［溶
？Ｉ［（Ｂ）Ｊを、抗ＢＨＫ ２１細胞抗体を結合させ
たセルロースＯ中に「溶液（Ｂ）」を加え、室温で約３
０分攪拌した後混合液を遠心して上清を採取する。この
上清を抗ＢＨＫ ２１細胞抗体と反応しなかった「溶液
Ｃ」とし訃 これらＯ溶液について実施例１と同様１ｃ ＥＬＩＳＡ
により精製度を調べた結果を下記表２に示した。
と共に、これらの「溶ｔ（Ｂ）Ｊおよび「溶液（Ｃ）Ｊ
について、ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリル
アシドデル電気泳動にかけた。これらの語以上の結果か
ら、本実施例において得られたＡＤＶ特異抗原を含む「
溶液（Ｃ）」は、ＡＤＶの増殖に用いられたＢ［２１細
胞由来の蛋白質を実質的に含有せず、したがって検査血
清中の抗体との間でＡＤＶ Ｋ非特異的な反応は起らな
いため、ＡＩＷノド感染個体についてのみかけ上の陽性
反応は現われず、診断用抗原としての有用性は極めて高
いこと力ぶ分かった◎ 実施例２ 培養細胞２５ＩＩＬｔからパッチ法を用いて精製抗原を
得ｆＣａ すなわち、ステップ（１） Ｉ （２）は実施例１と同
様の操作ニヨり処理し、ステ、デ（２）で得ｆｃ ［溶
？Ｉ［（Ｂ）Ｊを、抗ＢＨＫ ２１細胞抗体を結合させ
たセルロースＯ中に「溶液（Ｂ）」を加え、室温で約３
０分攪拌した後混合液を遠心して上清を採取する。この
上清を抗ＢＨＫ ２１細胞抗体と反応しなかった「溶液
Ｃ」とし訃 これらＯ溶液について実施例１と同様１ｃ ＥＬＩＳＡ
により精製度を調べた結果を下記表２に示した。
辰 ２
本実施例においても、「溶液（Ｃ） ＪはＡＤＶの増殖
に用いられたＢＨＫ ２１細胞由来の蛋白質を実質的に
含有しないことが分かった。
に用いられたＢＨＫ ２１細胞由来の蛋白質を実質的に
含有しないことが分かった。
精製診断用抗原の評価試験
まずプラスチ、り製プレートに吸着させる前記実施例Ｉ
Ｋおける「溶液（Ｃ）」の至適０度を検討したところ、
第３図に示すようにり／・母夕景にして２μ！１５０ｐ
Ｌ以上で検査血清中のＡＤＶ特異抗体を安定的に検出す
ることができることが分かつた。次ぎにこの条件でＡＤ
Ｖ％異抗体の定量測定が可能かどうかを調べたところ、
第４図に示すようにＡＤＶ感染血清の希釈倍数ＳＯＯか
ら３２００までに定量性のあることが分つ之。更にこれ
らの条件の下で健康ブタの血清ならびにＡＤＶ感染ブタ
血清についてＥＬＩＳＡでＡＩＷ特異抗体の検出を野外
試験として試みた（これら両血清はウィルス中和反応で
それぞれ陰性、陽性であることが確かめられたものを用
いた）。
Ｋおける「溶液（Ｃ）」の至適０度を検討したところ、
第３図に示すようにり／・母夕景にして２μ！１５０ｐ
Ｌ以上で検査血清中のＡＤＶ特異抗体を安定的に検出す
ることができることが分かつた。次ぎにこの条件でＡＤ
Ｖ％異抗体の定量測定が可能かどうかを調べたところ、
第４図に示すようにＡＤＶ感染血清の希釈倍数ＳＯＯか
ら３２００までに定量性のあることが分つ之。更にこれ
らの条件の下で健康ブタの血清ならびにＡＤＶ感染ブタ
血清についてＥＬＩＳＡでＡＩＷ特異抗体の検出を野外
試験として試みた（これら両血清はウィルス中和反応で
それぞれ陰性、陽性であることが確かめられたものを用
いた）。
１％ウシ血清アルブミ７を含むリン酸塩緩衝液であらか
じめ１００倍に希釈されに両血清を２μ９１５０ｐｌの
「溶液（Ｃ） Ｊを吸着させ几プラスチック製プレート
の各穴にそれぞれ５０ ｐｌずつ加え、３７℃で１時間
反応させた後ｏ、ｏｓｓの界面活性剤を含む生理食塩水
で洗浄、次いでゾロティ／Ａにホースラディシュ・ぐ−
オキシダーゼを共有結合させたコンシュｆ−）を各穴あ
友り２５ｐｌずつ加え、３７℃で２０分間反応させる。
じめ１００倍に希釈されに両血清を２μ９１５０ｐｌの
「溶液（Ｃ） Ｊを吸着させ几プラスチック製プレート
の各穴にそれぞれ５０ ｐｌずつ加え、３７℃で１時間
反応させた後ｏ、ｏｓｓの界面活性剤を含む生理食塩水
で洗浄、次いでゾロティ／Ａにホースラディシュ・ぐ−
オキシダーゼを共有結合させたコンシュｆ−）を各穴あ
友り２５ｐｌずつ加え、３７℃で２０分間反応させる。
反応後前記洗浄液で洗浄後・ぐ−オキシダーゼの基質で
ある過酸化水素水（Ｉ（２０２）（！： 、モノクロー
ク０ンである２、２−アジメゾ−３−エチルペンチアシ
リ／サルフオン酸（ＡＢＴＳ）の混合溶液を各穴あたり
５０μｌずつ加え、室温で３０分間反応させた後その発
色を分光光反吐で測定した。その結果第５図に示すよう
に健康ブタ由来の血清は４０５ ｎｍの波長で測定し几
吸光寂は０．２を超えることはないのに、ＡＤＶ感染血
清の吸光度は総べて０．３を下まわることはな力為つ几
。
ある過酸化水素水（Ｉ（２０２）（！： 、モノクロー
ク０ンである２、２−アジメゾ−３−エチルペンチアシ
リ／サルフオン酸（ＡＢＴＳ）の混合溶液を各穴あたり
５０μｌずつ加え、室温で３０分間反応させた後その発
色を分光光反吐で測定した。その結果第５図に示すよう
に健康ブタ由来の血清は４０５ ｎｍの波長で測定し几
吸光寂は０．２を超えることはないのに、ＡＤＶ感染血
清の吸光度は総べて０．３を下まわることはな力為つ几
。
これよシ吸光度０．３を基準にしてこの値を上まわるも
のはＡＤＶに感染し次ブタであることが分カリ、本実施
例に得られた診断用抗原の有効性が野外試験において確
認された。
のはＡＤＶに感染し次ブタであることが分カリ、本実施
例に得られた診断用抗原の有効性が野外試験において確
認された。
以上述べた如く、本発明方法によれば、得られ九最終産
物としてＯ診断用抗原は、ＥＬＩＳＡによって極めて精
度高（ＡＤ’／ Ｃ１感染有無を判定できるものとなり
、そＯ有用性は極めて大なるものである。
物としてＯ診断用抗原は、ＥＬＩＳＡによって極めて精
度高（ＡＤ’／ Ｃ１感染有無を判定できるものとなり
、そＯ有用性は極めて大なるものである。
第１図はＡＤ’／抗原を含む溶液のＫＣＬ濃度勾配法に
よる溶出・臂ターンを示す図、第２図は「溶液（Ｂ）」
および「溶液（Ｃ）」についての抗ＡＤ’／ 、抗ＢＨ
ＣＯ含有を測定し次結果を示す図、第３図および第４図
は［溶液（Ｃ） Ｊ （Ｄ至適濃度、定量性について０
検討試＠Ｏ結果を示す図、第５図は「溶液ｐ」を用いた
ｇＬＩｓＡによる診断試験の例を示す回である。 Ｑ− 第２図 ００ ａｔ ４０５ｙ＋ｍ 第３図 第４図 ｓｅｒｕｍ ｄＬｌｕｔｕＤｎ 第５図 健Ｒ７タ血清サンアル 愁宗Ｊタ皿肩
すノノル手続補正書： １、事件の表示 昭和蚕９年特 Ｈｒ願第７７３ｇ１ ？号氏 名（名称
）乾宙シ去人日ネ４Ｌ件勿禾斗学２石牙宏戸ｑ４、代理
入 ＆ 補正の内容 別紙のとおり 補 正 書 本願明細書中下記事項を抽圧いたします。 記 １、第２頁１５行目Ｋ 「酵素免疫測定法」とあるを 「酵素免疫測定法」と訂正する。 ２、第８頁１行目Ｋ 「Ｈｅ１ｅａ Ｊとあるを 「ＨｃＬａ Ｊと訂正する。 ３、第９頁４行目に 「Ｂｉｏ −Ｒａｄ社製」とあるを 「Ｂｉｏ −Ｒａｄ社製」と訂正する。 ４、第１７頁１６行目に ［抗ＢＥ（ＣＪとあるを 「抗ＢＨＫ Ｊと訂正する。
よる溶出・臂ターンを示す図、第２図は「溶液（Ｂ）」
および「溶液（Ｃ）」についての抗ＡＤ’／ 、抗ＢＨ
ＣＯ含有を測定し次結果を示す図、第３図および第４図
は［溶液（Ｃ） Ｊ （Ｄ至適濃度、定量性について０
検討試＠Ｏ結果を示す図、第５図は「溶液ｐ」を用いた
ｇＬＩｓＡによる診断試験の例を示す回である。 Ｑ− 第２図 ００ ａｔ ４０５ｙ＋ｍ 第３図 第４図 ｓｅｒｕｍ ｄＬｌｕｔｕＤｎ 第５図 健Ｒ７タ血清サンアル 愁宗Ｊタ皿肩
すノノル手続補正書： １、事件の表示 昭和蚕９年特 Ｈｒ願第７７３ｇ１ ？号氏 名（名称
）乾宙シ去人日ネ４Ｌ件勿禾斗学２石牙宏戸ｑ４、代理
入 ＆ 補正の内容 別紙のとおり 補 正 書 本願明細書中下記事項を抽圧いたします。 記 １、第２頁１５行目Ｋ 「酵素免疫測定法」とあるを 「酵素免疫測定法」と訂正する。 ２、第８頁１行目Ｋ 「Ｈｅ１ｅａ Ｊとあるを 「ＨｃＬａ Ｊと訂正する。 ３、第９頁４行目に 「Ｂｉｏ −Ｒａｄ社製」とあるを 「Ｂｉｏ −Ｒａｄ社製」と訂正する。 ４、第１７頁１６行目に ［抗ＢＥ（ＣＪとあるを 「抗ＢＨＫ Ｊと訂正する。
Claims (1)
- ブタヘルペス１ウィルス感染細胞を可溶化し不溶性分を
除去して得た溶解分画を出発材料として、前記ウィルス
に特異的な抗原を、陰イオン交換樹脂に吸着させた後緩
衝液で選択的に溶出させることで該ウィルス特異抗原を
含む分画を回収し、次いで、前記ブタヘルペス１ウィル
スの増殖に用いた細胞に対する抗体を結合させた不溶性
担体に、前記選択溶出で回収させた分画溶液を接触させ
て、前記感染細胞由来の随伴蛋白質を抗原−抗体反応に
より分離除去することを特徴とするオーエスキー病診断
用抗原の単離・精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17381984A JPS6151571A (ja) | 1984-08-21 | 1984-08-21 | オ−エスキ−病診断用抗原の単離・精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17381984A JPS6151571A (ja) | 1984-08-21 | 1984-08-21 | オ−エスキ−病診断用抗原の単離・精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6151571A true JPS6151571A (ja) | 1986-03-14 |
Family
ID=15967737
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17381984A Pending JPS6151571A (ja) | 1984-08-21 | 1984-08-21 | オ−エスキ−病診断用抗原の単離・精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6151571A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03138565A (ja) * | 1989-10-18 | 1991-06-12 | Viral Antigence Inc | 仮性狂犬病抗体に関する受動的凝集アツセイ |
| US5661023A (en) * | 1994-03-22 | 1997-08-26 | The Immune Response Corporation | Production and purification of retroviral particles using tentacle anion exchange |
| CN1304177C (zh) * | 2001-10-22 | 2007-03-14 | 索尼公司 | 机器人装置及其控制方法 |
| CN103792366A (zh) * | 2014-01-21 | 2014-05-14 | 内蒙古必威安泰生物科技有限公司 | 口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5747480A (en) * | 1980-07-05 | 1982-03-18 | Fisons Ltd | Enzyme production and purification |
-
1984
- 1984-08-21 JP JP17381984A patent/JPS6151571A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5747480A (en) * | 1980-07-05 | 1982-03-18 | Fisons Ltd | Enzyme production and purification |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03138565A (ja) * | 1989-10-18 | 1991-06-12 | Viral Antigence Inc | 仮性狂犬病抗体に関する受動的凝集アツセイ |
| US5661023A (en) * | 1994-03-22 | 1997-08-26 | The Immune Response Corporation | Production and purification of retroviral particles using tentacle anion exchange |
| US6080571A (en) * | 1994-03-22 | 2000-06-27 | The Immune Response Corporation | Highly efficient production and isolation of viral particles utilizing tentacle anion exchange |
| CN1304177C (zh) * | 2001-10-22 | 2007-03-14 | 索尼公司 | 机器人装置及其控制方法 |
| CN103792366A (zh) * | 2014-01-21 | 2014-05-14 | 内蒙古必威安泰生物科技有限公司 | 口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法 |
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